РАННЯЯ ДИАГНОСТИКА СТЕЛЬНОСТИ КОРОВ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ИФА

УДК 619:636.082.45507:636
РАННЯЯ ДИАГНОСТИКА СТЕЛЬНОСТИ КОРОВ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ИФА
Жанна Васильевна Самсонова, к.х.н., старший научный сотрудник, [email protected]
Александр Павлович Осипов, к.х.н., доцент
Алексей Михайлович Егоров, д.б.н., профессор, академик РАМН, главный научный сотрудник
Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова, тел. 8 (495) 9391671
Татьяна Николаевна Рыбина, техник искусственного осеменения
Николай Викторович Киреев, ветеринарный врач
ООО "АПК Никулино", Московская область, тел. 8 (495) 9960842
Для ранней диагностики стельности коров использовали метод иммуноферментного анализа. Стельность
определяли на основании выявляемой концентрации гормона прогестерона в пробах молока, отобранных на
21й день после их осеменения. Чувствительность метода составила 100 %, специфичность – 67 % и
диагностическая точность – 86 %. Ключевые слова: стельность, крупный рогатый скот, молоко,
иммуноферментный анализ, прогестерон.
Early pregnancy diagnosis in cows by ELISA
J.V. Samsonova, A.P. Osipov, A.M. Egorov, T.N. Rybina, N.V. Kireev
Enzymelinked immunosorbent assay was used for early pregnancy diagnosis in cows. Pregnancy was diagnosed on
the basis of progesterone concentration recovered from whole milk samples taken on day 21 post insemination. The
sensitivity of the method was estimated as 100 %, specificity – 67 % and diagnostic accuracy – 86 %. Key words:
pregnancy, cattle, whole milk, enzymelinked immunosorbent assay, progesterone.
го определения прогестерона в лабора
торных условиях, а также их более про
стые и быстрые варианты для использо
вания непосредственно в хозяйствах [9].
В России отечественные ИФА тестси
стемы [6, 7] используют лишь в ряде
регионов, и они до сих пор не получили
широкого распространения [3, 5].
Цель данной работы – применить
метод ИФА в конкретном хозяйстве и
оценить его диагностическую значи
мость.
Материалы и методы. Для ранней
диагностики стельности использовали
пробы цельного молока, отобранные на
21й день после осеменения у коров гол
штинофризской молочной породы с
августа 2011 г. по ноябрь 2012 г. Всего
протестировали 101 образец от 82
животных. У некоторых из них пробы
брали по 2 (11 гол.) или 3 раза (2 гол.)
после последующих циклов осеменения.
Отбирали их вручную в чистую посуду
сразу после окончания дневной дойки
(не позднее чем через 1,5 ч), затем
замораживали до температуры не менее
минус 20 0С и в последующем доставля
ли в лабораторию. Пробы анализирова
ли с использованием метода ИФА. В
качестве контроля на 65 – 75е сут после
осеменения животных также проверяли
ректально.
Сокращение сервиспериода прино
сит
значительный
экономический
эффект молочным хозяйствам. Достичь
этого можно с помощью методов ранней
диагностики стельности. Существует
ряд методов, каждый из которых имеет
свои преимущества и недостатки [1, 2,
4, 5 – 7]. В России наиболее распростра
ненным до сих пор остается ректальное
исследование. Самыми быстрыми явля
ются иммунохимические методы анали
за, например, иммуноферментный
(ИФА). Он позволяет определить стель
ность коров по концентрации видонес
пецифического гормона прогестерона в
молоке или сыворотке крови уже на 19 –
21е сут [5 – 7], а традиционное ректаль
ное исследование или УЗИдиагностика
– только на 60 – 90е или 32 – 37е сут
после осеменения соответственно.
Уровень прогестерона в молоке
изменяется циклично [4]. В момент ову
ляции (или течки) содержание гормона
находится на уровне менее 2 нг/мл,
затем постепенно возрастает до макси
мума (около 10 – 20 нг/мл) на 13 – 15е
сут и быстро снижается к концу цикла.
Если животное становится стельным, то
его высокая концентрация сохраняется.
За рубежом существует большой
выбор ИФА тестсистем как для количе
ственного, так и для полуколичественно
46
Для определения концентрации про
гестерона в молоке применяли разрабо
танную в МГУ имени М.В. Ломоносова
тестсистему на основе твердофазного
конкурентного ИФА, состоящую из набо
ра жидких, полностью готовых к исполь
зованию реагентов, и ИФА планшета.
Анализируемые образцы (10 мкл) тести
ровали относительно калибровочной
кривой, полученной для стандартных
растворов, содержащих известные
количества прогестерона. К стельным
относили животных, в молоке которых
концентрация гормона была 7 нг/мл и
выше. Предел обнаружения метода
составлял 0,3 нг/мл прогестерона в
молоке. Это позволяет использовать
данную тестсистему не только для
диагностики стельности, но и для оценки
функционального состояния репродук
тивной системы животного, например,
для определения момента половой
охоты. Производительность анализа –
41 проба за 1,5 ч.
Результаты
исследований
и
обсуждение. При выявлении беремен
ности у коров методом ИФА в 29 % слу
чаев результат был отрицательным, что
в последующем подтверждали ректаль
ным методом (см. таблицу). Следующую
половую охоту у животных без патоло
гий репродуктивной системы (киста
яичника, гипофункция яичников) наблю
дали через 17 – 85 сут после осемене
ния, т.е. их статус был неизвестен до
даты проведения ректального исследо
вания. Таким образом, метод ИФА
позволяет выявлять не стельных живот
ных уже на 21е сут после осеменения
без ожидания наступления следующей
половой охоты.
Беременность у коров по прогестеро
ну с последующим подтверждением рек
тальным методом диагностировали
более чем у половины образцов (58 проб
или 57 % от их общего числа). Для 14
образцов (14 % от общего числа)
результаты, полученные обоими метода
ми, не совпадали. Так, ИФА показал
высокую концентрацию прогестерона в
молоке данных животных на 21е сут
после осеменения и соответственно их
отнесли в группу стельных коров, однако
ректальные исследования, проведенные
значительно позже (65 – 75 сут), не под
твердили ее наличие. Причинами такого
несовпадения могут быть лютеиновые
кисты, при которых отмечают повыше
ние уровня прогестерона, препятствую
щее наступлению беременности, либо
эмбриональная смертность, наступив
шая в период от 21х до 65 – 75х сут
после осеменения (момента проведения
ректального исследования).
Кроме того, у трех животных из этой
группы ректально выявили кисты яич
ника. Среди коров без патологий сле
дующую половую охоту наблюдали с
42х по 69е сут после осеменения. В
связи с этим необходимо проводить
Результаты определения стельности коров с использованием метода ИФА
и контрольного ректального исследования*
Ректальное исследование
(65 – 75 сут после осеменения)
Не стельные
Стельные
Всего
ИФА исследование (21е сут после осеменения)
Не стельные
Стельные
Всего
29 (А)
Правильные
14 (В)
Ложноположительные
43 (A+B)
0 (C)
Ложноотрицательные
58 (D)
Правильные
58 (C+D)
29 (A+C)
72 (B+D)
101
(A+B+C+D)
*Критерии достоверности метода ИФА в проведенном исследовании:
чувствительность – 100 % (D/C+D); специфичность – 67 % (A/A+B); прогностическая ценность положительного
результата – 81% (D/B+D); прогностическая ценность отрицательного результата – 100 % (A/A+C); диагностическая
точность – 87 % (A+D/A+B+C+D).
47
контрольный отбор и проверку проб
молока в конце полового цикла, т.е. на
каждые 21е сут после осеменения (не
менее 2 – 3 раз), что позволит быстро и
еще до проведения ректального иссле
дования выявить особей, у которых
произошла эмбриональная смерт
ность. При эмбриональной смертности
концентрация прогестерона в молоке
будет низкая.
Для оценки диагностической значи
мости метода ИФА вычислили основ
ные критерии достоверности (см.
таблицу). Поскольку тест не выявил
ложноотрицательных результатов, чув
ствительность метода в данных иссле
дованиях составила 100 %. При этом
получили 14 ложноположительных
результатов, уровень специфичности
теста равен 67 %. Прогностическая
ценность положительного результата –
81 %, а отрицательного – 100 %. Диаг
ностическая точность ИФА (доля пра
вильно определенных положительных и
отрицательных результатов от общего
числа определений) составила 86 %.
Наиболее важным результатом при
использовании ИФА для ранней диагно
стики беременности является высокая
чувствительность и прогностическая
ценность отрицательного результата.
Именно 100%ное раннее выявление не
стельных животных среди всех осеме
ненных, а значит, и особей с патологией,
их своевременное лечение, в первую
очередь позволит сократить сервиспе
риод. Это принесет хозяйству значи
тельный экономический эффект за счет
уменьшения затрат на содержание бес
плодных коров и получения дополни
тельных удоев молока и телят.
Заключение. Метод ИФА можно
успешно использовать для ранней диаг
ностики стельности. На примере данно
го хозяйства показано выявление не
стельных коров на 21е сут после осеме
нения. Метод не травмирует животное,
поскольку в качестве исследуемого
материала берется молоко. При наличии
лаборатории его можно применять
непосредственно в хозяйствах.
Для беременных особей необходимо
проводить повторный отбор проб моло
ка для ИФА на каждые 21е сут после
осеменения. Это позволит контролиро
вать текущую стельность и выявлять
эмбриональную смертность на ранних
сроках.
Метод ИФА также следует активно
использовать для оценки функциональ
ного состояния репродуктивной систе
мы крупного рогатого скота. В частно
сти, для подтверждения половой охоты и
овуляции, выявления патологии половых
органов (гипофункция яичников, киста,
персистентное желтое тело) у проблем
ных животных.
ЛИТЕРАТУРА
1. Богданов И.И., Богданова М.А., Фомин
А.Н. Иммунологический экспресстест на бере
менность и бесплодие коров // Вестник ветери
нарии. 2011. Т. 59. № 4. С. 11,12.
2. Пащенко Е., Шевцов Ф. Диагностика
стельности // Молочное и мясное скотоводство.
2008. № 5. С. 28, 29.
3. Преображенский О.П. Современные мето
ды диагностики и бесплодия животных // Вете
ринария. 2003. № 7. С. 32, 33.
4. Середин В.А. Цикл воспроизводства,
половой цикл и его регуляция // Вестник ветери
нарии. 2007. Т. 40 – 41. № 1– 2. С. 24 – 51.
5. Сковородин Е.Н., Игуменова Н.А. Мето
ды ранней диагностики стельности // Известия
Оренбургского государственного аграрного
университета. 2011. Т. 2. № 30. С. 89 – 91.
6. Прядко А.Г., Новик Т.В., Ивашкевич О.П.,
Ботяновский А.Г. Разработка набора реактивов
для иммуноферментного анализа прогестерона
в молоке коров с целью ранней диагностики
стельности // Эпизоотология, иммунология,
фармакология и санитария. 2007. № 4. С. 66 –
72.
7. Шевелев Н., Матрешина Н., Краснов В.
Метод ИФА в диагностике бесплодия // Живот
новодство России. 2008. № 1. С. 47,48.
8. Laing J.A., Heap R.B. The concentration of
progesterone in the milk of cows during the repro
ductive cycle // Br. Vet. J. 1971. 127:19 – 22.
9. PosthumaTrumpie G.A., van Amerongen A.,
Korf J., van Berkel W.J.H. Perspectives for onsite
monitoring of progesterone // Tr. Biotechnol. 2009.
27:652 – 660.
48