010736 - 1 - Группа изобретений относится к лекарственному

010736
Группа изобретений относится к лекарственному средству и способу его получения из органов животных, в частности к выделению биологически активного вещества из яичников и получению лекарственной формы для парентерального введения, которая может использоваться в медицине как средство,
нормализующее репродуктивную функцию у женщин.
Известны способы получения биологически активных веществ из органического сырья (мочи беременных женщин, мочи женщин в постменопаузе, сыворотки крови жеребых кобыл) с целью восстановления репродуктивной функции у женщин (Gemzell С.A., Diczjalusy E., Tillinger K.G. Clinical effect of
human pituitary follicle stimulating hormone (FSH). J. Clin. Metab., 1958, vol. 18, p. 1333-1342). К недостаткам известных веществ можно отнести то, что они обладают сильно выраженным гормональным действием, дают кратковременный эффект и многочисленные осложнения (эндокринные нарушения, многоплодная беременность и др.).
Многие авторы выделяют в качестве нарушения репродуктивной функции у женщин развитие климактерического синдрома (Чен П.Т.К., Гоулдстайн М., Роузенвэкс З. Секреты репродуктивной медицины./Пер. с англ. Э.А. Акчурина. Под общей ред. акад. РАМН, проф. В.И. Кулакова. - М.: Изд-во «МЕДпресс-информ», 2006, 448 с). Климактерический синдром, климактерический невроз, патологический
климакс - все это разные названия одного и того же состояния, развивающегося у женщин (примерно у
60%) в возрасте от 42 до 55 лет. В этом возрасте происходит физиологическое выключение репродуктивной функции. Это связано, прежде всего, с перестройкой работы гипоталамуса и гипофиза, что влечет за
собой изменение соотношения ряда гормонов, в том числе ФСГ и ЛГ (Сметник В.П., Тумилович Л.Г.
Неоперативная гинекология: Руководство для врачей. Изд. 3-е. - М.: МИА, 2002, 591 с). К наиболее часто
встречающимся (65-80%) симптомам климактерических расстройств относятся вазомоторные и эмоционально-психические, которые сопровождаются нарушением гормонального статуса, их объединяют понятием «типичный климактерический синдром».
Известно вещество, восстанавливающее репродуктивную функцию, полученное из яичников животных (патент РФ № 2056853,1993, A61K 35/48), являющееся наиболее близким аналогом-прототипом
для предлагаемого средства и способа его получения. Согласно способу, описанному в патенте
РФ № 2056853, обработку измельченных яичников животных проводят уксусной кислотой при pH 2,54,0 в течение 24-36 ч, при температуре 0-4°C с добавлением 0,3-0,7 г/л хлористого цинка. Осаждение полипептидов проводят ацетоном в количестве 8-12 объемов на 1 объем экстракта при температуре минус
(2-4)°C в течение 10-16 ч. Осадок отделяют фильтрованием, сушат, после чего вновь растворяют в дистиллированной воде, фильтруют и лиофилизируют. Этот способ позволяет получить комплекс полипептидов с молекулярной массой 1000-10000 Да. К недостаткам известного способа следует отнести извлечение в процессе экстракции из ткани яичников большого количества (более 70%) веществ не пептидной
природы, которые, являясь примесями, не определяют биологическую активность выделенного активного вещества, а также его низкий выход.
Настоящим изобретением поставлена и решена задача разработки способа получения средства,
нормализующего репродуктивную функцию у женщин, в виде лекарственной формы для парентерального введения, выделенного из яичников телят не старше 12-месячного возраста или свиней, техническим
результатом которого является оптимальная технология выделения пептидного комплекса с содержанием низкомолекулярной фракции от 70 до 90% с молекулярной массой входящих в него пептидных компонентов в пределах от 70 до 712 Да и получение водного раствора экстракта с концентрацией полипептидов 2,5-2,9 мг/мл, позволяющая не только очистить получаемый продукт от примесей, но и увеличить
его выход.
Экспериментальная проверка показала, что предлагаемый способ обеспечивает фармацевтическую
стабильность, максимальную биологическую ценность и терапевтическую эффективность средства, нормализующего репродуктивную функцию у женщин, выполненного в виде лекарственной формы для парентерального введения, что подтверждено результатами экспериментов, приводимыми в примерах, иллюстрирующих изобретение.
Другим аспектом изобретения является средство, нормализующее репродуктивную функцию у
женщин, в виде лекарственной формы для парентерального введения, представляющее собой пептидный
комплекс с содержанием низкомолекулярной фракции от 70 до 90% с молекулярной массой входящих в
него пептидных компонентов в пределах от 70 до 712 Да, с концентрацией полипептидов 2,5-2,9 мг/мл,
технический результат которого заключается в том, что выделенное вещество отличается от известных
веществ, полученных ранее из яичников животных, по молекулярной массе (от 1000 до 10000 Да) входящих в него пептидных компонентов (патент РФ № 2056853), а также по его нетоксичности и апирогенности за счет полной очистки от примесей.
В ходе исследований в экспериментах на животных выявлено, что полученный водный раствор
средства с концентрацией полипептидов 2,5-2,9 мг/мл является терапевтически эффективной дозой, что
позволяет считать показанным использование средства при различных видах патологии половой системы
у женщин. Это подтверждается приводимыми ниже примерами.
-1-
010736
В процессе проведения исследований была установлена важность следующих стадий способа получения средства, нормализующего репродуктивную функцию у женщин, выполненного в виде лекарственной формы для парентерального введения (далее - препарат):
повторное осаждение образовавшегося гомогенизированного осадка двукратными объемами ацетона не менее 2 раз и последующее промывание на нутч-фильтре двукратными объемами ацетона до получения осадка светло-серого цвета, что свидетельствует о полной очистке осадка от примесей, таких как
липидные, белковые, фосфолипидные и др.;
получение водного раствора экстракта в концентрации полипептидов 2,5-2,9 мг/мл; его центрифугирование, фильтрование с последующей ультрафильтрационной очисткой на установке при противодавлении не более 1,0 кгс/см2 через материалы с задерживающей способностью 15000 Да и добавлении в
ультрафильтрат гликокола до конечной концентрации 10-20 мг/мл при pH 5,6-6,6;
стерилизующая фильтрация, ампулирование и автоклавирование в течение 8 мин при температуре
120°C и атмосферном давлении 1,1 кгс/см2, что обеспечивает стабильность препарата при сохранении
терапевтической эффективности.
Режим и время автоклавирования были установлены экспериментально.
Указанный технический результат достигается тем, что средство, нормализующее репродуктивную
функцию у женщин, выполнено в виде лекарственной формы для парентерального введения и представляет собой пептидный комплекс с содержанием низкомолекулярной фракции от 70 до 90% с молекулярной массой входящих в него пептидных компонентов в пределах от 70 до 712 Да, с концентрацией полипептидов 2,5-2,9 мг/мл и получено из яичников телят не старше 12-месячного возраста или свиней путем
экстракции уксусной кислотой в присутствии хлористого цинка.
Указанный технический результат достигается также тем, что предлагаемый способ получения
средства, нормализующего репродуктивную функцию у женщин, характеризуется тем, что яичники телят
не старше 12-месячного возраста или свиней замораживают при температуре не менее минус 40°C, выдерживают при температуре минус (20-22)°C в течение не менее двух месяцев, затем измельчают, добавляют 3% раствор уксусной кислоты в объемном соотношении 1:5 при температуре 20±5°C, экстракцию
проводят при постоянном перемешивании, после получения однородной взвеси в нее добавляют 1% раствор хлористого цинка в объемном соотношении 50:1, охлаждают при постоянном перемешивании до
температуры 7-16°C, затем перемешивают по 1 ч через каждые 4 ч отстаивания в течение 48 ч, экстракт
отделяют от балластных веществ сепарированием, к экстракту добавляют ацетон в объемном соотношении 1:5, выдерживают при температуре 3-5°C в течение 4 ч, образовавшийся гомогенизированный осадок повторно осаждают ацетоном не менее 2 раз, затем осадок, содержащий активное вещество, промывают на нутч-фильтре двукратными объемами охлажденного до температуры 7-16°C ацетона до получения осадка светло-серого цвета, протирают через металлическое сито, высушивают, растворяют в дистиллированной воде при комнатной температуре и постоянном перемешивании до концентрации полипептидов 2,5-2,9 мг/мл, раствор центрифугируют, фильтруют, подвергают ультрафильтрационной очистке на установке при противодавлении не более 1,0 кгс/см2 через материалы с задерживающей способностью 15000 Да, в ультрафильтрат добавляют гликокол до его конечной концентрации 10-20 мг/мл при
pH 5,6-6,6, раствор подвергают стерилизующей фильтрации под давлением не более 2,0 кгс/см2, разливают в ампулы по 2 мл и автоклавируют в течение 8 мин при температуре 120°C и атмосферном давлении 1,1 кгс/см2.
Сущность изобретения поясняется фигурой и таблицами.
На фигуре показано влияние препарата на развитие эксплантатов яичников.
В табл. 1 представлено влияние препарата на морфологические и биохимические показатели периферической крови морских свинок при изучении токсичности.
В табл. 2 показано влияние препарата на уровень гормонов аденогипофиза в сыворотке крови у
больных с климактерическим синдромом.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами:
пример 1 - способ получения препарата;
пример 2, подтверждающий биологическую активность препарата;
пример 3 - изучение токсичности препарата;
пример 4, подтверждающий терапевтическую эффективность препарата, выполненного в виде лекарственной формы для парентерального введения.
Пример 1. Способ получения препарата.
В качестве сырья используются яичники телят (не старше 12-месячного возраста) или свиней,
которые замораживают при температуре не менее минус 40°C и выдерживают при температуре
минус (20-22)°C в течение не менее двух месяцев.
В реактор для экстракции перекачивают 350 л 3% раствора уксусной кислоты и охлаждают до температуры 20±5°C, затем в реактор при постоянном перемешивании загружают 70 кг измельченного до
получения гомогенной массы сырья. Экстракцию проводят при постоянном перемешивании, после получения однородной взвеси добавляют в нее 1% раствор хлористого цинка в объемном соотношении 50:1,
-2-
010736
охлаждают при постоянном перемешивании до температуры 7-16°C, затем перемешивают по 1 ч через
каждые 4 ч отстаивания в течение 48 ч. Экстракт отделяют от балластных веществ сепарированием при
5000±500 об/мин в течение 1 ч. К экстракту добавляют ацетон в объемном соотношении 1:5. Выдерживают при температуре 3-5°C в течение 4 ч. Образовавшийся осадок гомогенизируют и повторно осаждают ацетоном не менее 2 раз. Затем осадок, содержащий активное вещество, промывают на нутч-фильтре
двукратными объемами охлажденного до температуры 7-16°C ацетона до получения осадка светлосерого цвета. Промытый осадок протирают через металлическое сито, выкладывают тонким слоем в эмалированные кюветы, закрывают двойным слоем хлопчатобумажной ткани и высушивают при периодическом помешивании в вытяжном шкафу до полного удаления запаха ацетона.
Выход активного вещества (порошка биологически активного пептидного комплекса, выделенного
из яичников) составляет 60 г на 1 кг исходного сырья.
Полученный порошок растворяют в дистиллированной воде при постоянном перемешивании при
комнатной температуре в течение 40 мин до концентрации пептидов 2,5-2,9 мг/мл. Полученный раствор
центрифугируют при 3000±200 об/мин в течение 20±5 мин. Центрифугат фильтруют через фильтр типа
AP-15 или аналогичный.
Фильтрат подвергают ультрафильтрационной очистке на установке для ультрафильтрации при противодавлении не более 1,0 кгс/см2 через материалы с задерживающей способностью 15000 Да. В ультрафильтрат добавляют расчетную навеску гликокола до его конечной концентрации 10-20 мг/мл, перемешивают до полного растворения гликокола при сохранении pH 5,6-6,6. Раствор подвергают стерилизующей фильтрации, которую проводят под давлением, не превышающим 2,0, кгс/см2. Полученный раствор
разливают в ампулы по 2,0 мл и автоклавируют, причем ампулы с препаратом подвергают стерилизации
в течение 8 мин при температуре 120°C и атмосферном давлении не более 1,1 кгс/см2.
Препарат представляет собой бесцветный, прозрачный раствор и содержит пептидный комплекс с
концентрацией полипептидов 2,5-2,9 мг/мл.
Тестирование на отсутствие высокомолекулярных белковых компонентов осуществляют путем добавления к содержимому 1 ампулы препарата 1 мл 10%-ного раствора трихлоруксусной кислоты. Прозрачность раствора свидетельствует об отсутствии высокомолекулярных белковых компонентов.
Для определения в препарате пептидных связей к его раствору добавляют биуретовый реактив. Окрашивание раствора в фиолетовый цвет свидетельствует об имеющихся в препарате пептидных связях. С
целью определения в препарате полипептидов и их фракций используют методы ультрафиолетовой
спектрофотометрии, гель-хроматографии, масс-спектрометрии, высокоэффективной жидкостной хроматографии и электрофореза в полиакриламидном геле.
Ультрафиолетовый спектр раствора препарата снимают в области длин волн от 250 до 350 нм: максимум поглощения отмечается при длине волны 270±5 нм.
Молекулярную массу полипептидов, входящих в препарат, определяют следующими методами:
методом гель-хроматографии на сефадексах G-25 и G-50 («Pharmacia», Швеция). Для калибровки
колонки 1,6×60 см используют Peptide Molecuar Weight Kit MS III («Serva», Германия);
методом масс-спектрометрии. Спектры получают на времяпролетном масс-спектрометре Voyager
DE Biospectrometry с лазерной десорбцией и ионизацией с помощью матрицы (MALDI-TOF) при относительной интенсивности азотного лазера 2300-2400, ускоряющем напряжении 25000 В, времени задержки
90 нс и давлении в вакуумной камере 2,6×106 тор;
методом электрофореза в 15%-ном полиакриламидном геле в сравнении со стандартным набором
маркерных белков.
Перечисленными выше методами установлено, что в состав препарата входят полипептиды с молекулярной массой от 70 до 712 Да.
С помощью обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии в градиенте ацетонитрила (сорбент «Lichrosorb C18», колонка 2×62 мм) установлено, что в состав препарата входят преимущественно низкомолекулярные фракции - от 70 до 90%, а высокомолекулярные компоненты в препарате отсутствуют.
Пирогенность препарата определяют на кроликах общепринятым методом (ГФ XI, вып. 2, с. 183)
при тест-дозе препарата 0,25 мг на 1 кг массы животного в 1,0 мл изотонического 0,9% раствора натрия
хлорида для инъекций. Показано, что препарат является апирогенным.
Таким образом, вышеизложенным способом получен препарат - лекарственная форма для парентерального введения, представляющая собой пептидный комплекс с содержанием низкомолекулярной
фракции от 70 до 90%, с молекулярной массой входящих в него пептидных компонентов в пределах
от 70 до 712 Да, с концентрацией полипептидов 2,5-2,9 мг/мл.
Пример 2. Влияние препарата на развитие эксплантатов яичников.
Эксперименты проведены на 45 фрагментах яичников крыс линии «Wistar» массой тела 150-200 г.
Питательная среда для культивирования эксплантатов состояла из 35% раствора Игла, 25% фетальной
сыворотки теленка, 35% раствора Хенкса, 5% куриного эмбрионального экстракта, в среду добавляли
глюкозу (0,6%), инсулин (0,5 ед./мл), пенициллин (100 ед./мл), глютамин (2 мМ). Фрагменты яичников
-3-
010736
помещали в эту среду и культивировали на коллагеновой подложке в чашках Петри в термостате при
36,7°C в течение 2 суток. В экспериментальную среду добавляли препарат в концентрациях 1, 10, 50, 100,
200 и 400 нг/мл. Критерием биологической активности служил индекс площади (ИП) - соотношение
площади всего эксплантата вместе с зоной роста к исходящей площади фрагмента яичников. Значения
ИП выражали в процентах, контрольное значение ИП принималось за 100%.
На фигуре показано влияние препарата на развитие эксплантатов яичников.
Установлено, что через 1 сутки культивирования происходило распластывание эксплантатов на
коллагеновой подложке и начиналось выселение пролиферирующих и мигрирующих клеток по периферии эксплантата. На 3-и сутки культивирования при концентрации препарата 50 нг/мл наблюдалось достоверное повышение ИП эксплантатов на 41% по сравнению с контрольными значениями ИП. При исследовании эксплантатов яичников на более длительных сроках культивирования (7 дней) было выявлено аналогичное стимулирующее действие препарата в той же концентрации.
Таким образом, в отношении яичников препарат оказывал тканеспецифическое действие, проявляющееся в стимуляции роста эксплантатов.
Пример 3. Изучение токсичности препарата.
Общетоксическое действие препарата исследовали в соответствии с требованиями «Руководства по
экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ» (2000): острой
токсичности при однократном введении препарата, а также подострой и хронической токсичности при
длительном введении препарата.
Исследование по изучению острой токсичности проведено на 66 белых беспородных мышах-самцах
массой тела 18-20 г. Животные были рандомизированно разделены на 6 равных групп. Препарат вводили
животным однократно внутримышечно в дозах 35, 50, 100, 150, 200 мг/кг в 0,25 мл стерильного 0,9%
раствора NaCl. Животным контрольной группы в том же объеме вводили 0,9% раствор NaCl. Исследования по изучению подострой токсичности проведены на 70 белых беспородных крысах-самцах массой
тела 170-190 г. Ежедневно однократно животным подопытных групп вводили препарат внутримышечно
в течение 90 дней в дозах 1, 10, 100 мг/кг в 0,5 мл стерильного 0,9% раствора NaCl. Животным контрольной группы вводили в том же объеме стерильный 0,9% раствор NaCl. До введения препарата на 30-, 60- и
90-е сутки после начала введения препарата у животных исследовали морфологический состав и свойства периферической крови. При завершении эксперимента исследовали биохимические и коагулологические показатели крови.
Исследования по изучению хронической токсичности проводили в течение 6 месяцев, исходя из
длительности рекомендуемого клинического назначения препарата, на 84 морских свинках-самцах массой 250-280 г. Животные подопытных групп получали ежедневно однократно внутримышечно препарат
в течение 6 месяцев в дозах 1, 10, 100 мг/кг в 0,5 мл стерильного 0,9% раствора NaCl. В контрольной
группе животным вводили по аналогичной схеме стерильный 0,9% раствор NaCl в том же объеме. У животных в периферической крови общепринятыми методами определяли количество эритроцитов, гемоглобина, ретикулоцитов, тромбоцитов, лейкоцитов, лейкоцитарную формулу, скорость оседания эритроцитов (СОЭ), резистентность эритроцитов. Наряду с этим определяли содержание в сыворотке крови
общего белка по методу Лоури, калия и натрия методом плазменной спектрофотометрии. После завершения эксперимента проводили патоморфологическое исследование головного и спинного мозга, спинномозговых ганглиев, щитовидной железы, паращитовидных желез, надпочечников, семенников, гипофиза, сердца, легких, аорты, печени, почки, мочевого пузыря, поджелудочной железы, желудка, тонкой
кишки, толстой кишки, тимуса, селезенки, лимфатических узлов, костного мозга.
При изучении острой токсичности установлено, что однократное введение исследуемого препарата
животным в дозе, превышающей терапевтическую, рекомендованную для клинического применения,
более чем в 5000 раз, не вызывает токсических реакций, что свидетельствует о большой терапевтической
широте препарата.
Изучение подострой и хронической токсичности препарата свидетельствует об отсутствии побочных эффектов при длительном применении препарата в дозах, превышающих терапевтическую в 3003000 раз. При исследовании влияния препарата на морфологический состав и биохимические показатели
периферической крови морских свинок через 3 и 6 месяцев после начала введения препарата достоверного изменения показателей не выявлено (табл. 1).
При оценке общего состояния животных, морфологических и биохимических показателей периферической крови, морфологического состояния внутренних органов, состояния сердечно-сосудистой и
дыхательной систем, функции печени и почек патологические изменения в организме не обнаружены.
Следовательно, препарат, полученный предлагаемым способом, при длительном введении животным не обладает токсическими свойствами, препятствующими дальнейшему его применению в качестве
лекарственного средства, выполненного в виде лекарственной формы для парентерального введения.
Пример 4. Эффективность применения препарата у женщин с климактерическим синдромом.
Изучение эффективности применения препарата проводили с участием 43 женщин в возрасте
45-55 лет с климактерическим синдромом. Больные предъявляли жалобы на "приливы" жара к голове и
верхней части туловища, гипергидроз, повышенную раздражительность, эмоциональную лабильность.
-4-
010736
Среди объективной симптоматики преобладали признаки кольпита, уретроцистита, атрофии вульвы. В
ряде случаев отмечались симптомы развития остеопороза.
Пациенток рандомизированно разделили на 2 группы. В основную группу вошли 28 пациенток, которым вводили препарат в дозе 5 мг в 2,0 мл физиологического раствора внутримышечно однократно
ежедневно в течение 10 дней.
Контрольная группа включала 15 женщин, получавших инъекции физиологического раствора по
аналогичной схеме. Пациентки, получавшие ранее гормонозаместительную терапию, в исследование не
включались.
В динамике оценивали жалобы больных, проводили общеклиническое исследование крови и мочи,
биохимическое изучение крови, ультразвуковое исследование яичников. Содержание гормонов (АКТГ,
ТТГ, ФСГ и ЛГ) в сыворотке крови определяли радиоиммунологическим методом.
Установлено, что применение препарата у больных с климактерическим синдромом способствовало
улучшению общего состояния, что проявлялось в уменьшении количества "приливов", улучшении сна,
аппетита, повышении работоспособности.
При лабораторном исследовании показателей гормонального статуса отмечено достоверное снижение содержания ФСГ, что вызвало повышение индекса ЛГ/ФСГ до нижних границ возрастных физиологических колебаний. Отмечалась также тенденция к снижению АКТГ и ТТГ. В табл. 2 отражено нарушение соотношения гормонов ФСГ и ЛГ, нормализуемое применением предлагаемого средства.
Нормализация гормональных показателей у пациенток основной группы после применения препарата коррелировала с улучшением клинических проявлений климактерического синдрома и свидетельствовала о восстановлении адекватной адаптационной реакции стареющего организма в ответ на возрастное снижение функции яичников. При исследовании не выявлено побочного действия и осложнений.
Таким образом, полученные результаты клинического исследования свидетельствуют о лечебной
эффективности препарата и целесообразности его применения в комплексном лечении климактерического синдрома в эффективной терапевтической дозе 5 мг (2,5 мг/мл) внутримышечно однократно ежедневно в течение 10 дней.
-5-
010736
Таблица 1
Таблица 2
*P<0,05 по сравнению с показателем до лечения.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Средство, нормализующее репродуктивную функцию у женщин, представляющее собой лекарственную форму для парентерального введения в виде раствора пептидного комплекса с содержанием низкомолекулярной фракции от 70 до 90%, с молекулярной массой входящих в него пептидных компонентов в пределах от 70 до 712 Да, с концентрацией полипептидов 2,5-2,9 мг/мл и полученное из яичников
телят не старше 12-месячного возраста или свиней путем экстракции уксусной кислотой в присутствии
хлористого цинка.
2. Способ получения средства по п.1, характеризующийся тем, что яичники телят не старше 12месячного возраста или свиней замораживают при температуре не менее минус 40°C, выдерживают при
температуре минус (20-22)°C в течение не менее двух месяцев, затем измельчают, добавляют 3% раствор
уксусной кислоты в объемном соотношении 1:5 при температуре 20±5°C, экстракцию проводят при постоянном перемешивании, после получения однородной взвеси в нее добавляют 1% раствор хлористого
цинка в объемном соотношении 50 объемов однородной взвеси к 1 объему 1% раствора хлористого цинка, охлаждают при постоянном перемешивании до температуры 7-16°C, затем перемешивают по 1 ч через каждые 4 ч отстаивания в течение 48 ч, экстракт отделяют от балластных веществ сепарированием, к
экстракту добавляют ацетон в объемном соотношении сырье:ацетон, равном 1:5, выдерживают при температуре 3-5°C в течение 4 ч, образовавшийся гомогенизированный осадок повторно осаждают ацетоном
не менее 2 раз, затем осадок, содержащий активное вещество, промывают на нутч-фильтре двукратными
объемами охлажденного до температуры 7-16°C ацетона до получения осадка светло-серого цвета, про-6-
010736
тирают через металлическое сито, высушивают, растворяют в дистиллированной воде при комнатной
температуре и постоянном перемешивании до концентрации полипептидов 2,5-2,9 мг/мл, раствор центрифугируют, фильтруют, подвергают ультрафильтрационной очистке на установке при противодавлении не более 1,0 кгс/см2 через материалы с задерживающей способностью 15000 Да, в ультрафильтрат
добавляют гликокол до его конечной концентрации 10-20 мг/мл при pH 5,6-6,6, раствор подвергают стерилизующей фильтрации под давлением не более 2,0 кгс/см2, разливают в ампулы по 2 мл и автоклавируют в течение 8 мин при температуре 120°C и атмосферном давлении 1,1 кгс/см2.
*P<0,05 по сравнению с показателем в контроле, принятым за 100%
Евразийская патентная организация, ЕАПВ
Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2/6
-7-