влияние введения прогестерона новорожденным крысам на

УДК 612.018.2 : 612.82 - 092.9
Ю.Б. Колмакова1, Р.В. Учакина2, Б.Я. Рыжавский1
ВЛИЯНИЕ ВВЕДЕНИЯ ПРОГЕСТЕРОНА НОВОРОЖДЕННЫМ
КРЫСАМ НА ПОКАЗАТЕЛИ РАЗВИТИЯ МОЗГА,
ГОНАД И НАДПОЧЕЧНИКОВ
Дальневосточный государственный медицинский университет1,
680000, ул. Муравьева-Амурского, 35, тел.: 8(4212)-32-63-93, e-mail: [email protected];
НИИ охраны материнства и детства СО РАМН2,
680022, ул. Воронежская, 49, кор. 1, г. Хабаровск
Гестагены (прогестины, прогестагены) представляют собой стероидные гормоны и оказывают мощное
специфическое действие на метаболические процессы
в клетках, являются необходимыми системными детерминаторами и регуляторами основных процессов жизнедеятельности целого организма — координированного
роста, дифференцировки, размножения, адаптации, поведения. Они также играют важную роль в эмбриональном
развитии головного мозга [3, 8].
Прогестерон — естественный стероидный гормон
желтого тела, плаценты и коры надпочечников. Во время
беременности уровень прогестерона в организме женщины повышается в 10 раз, в то же время у различных беременных его концентрация варьирует в несколько раз,
что оказывает неодинаковое влияние на плод. После рождения у младенца в течение 1 дн. уровень прогестерона
снижается в 100 раз, что является физиологическим для
доношенного ребенка. Недоношенный ребенок на более
ранней стадии развития лишается плацентарной поставки прогестерона. В исследованиях A. Trotter, заключавшихся в поддерживании внутриматочных плазменных
уровней прогестерона у недоношенных младенцев, показано нормальное психомоторное развитие младенцев, получавших прогестерон, тогда как младенцы в группе без
гормональной терапии показали тенденцию к замедленному развитию [9]. Отсюда очевидно, что нужны дальнейшие исследования для определения важности роли
прогестерона для постнатального развития недоношенных младенцев. Прогестагены обладают способностью
влиять на нейрогормоны и нейропептиды, содержащиеся
в мозге, путем связывания с рецепторами прогестерона
в ЦНС. Центральные стероидочувствительные системы
(рецепторы), участвующие в механизме обратной связи, сосредоточены в гипоталамической области мозга.
Настроение, сексуальное поведение, питание, болевые
ощущения и гипоталамо-гипофизарно-яичниковая система регулируются β-эндорфинами, вырабатываемыми
гипоталамусом. Применение прогестерона и некоторых
гестагенов увеличивает уровень β-эндорфинов [2].
В головном мозге человека и животных имеются
участки, в которых сосредоточены рецепторы к половым стероидам — эстрогенам, прогестагенам, андрогенам. Половые стероиды оказывают активирующее, реже
— тормозное действие на возбудимость нейронов и нейросекреторных клеток, регулируя половое поведение,
либидо, секрецию гонадотропных гормонов гипофиза.
Последняя осуществляется в тоническом режиме у мужчин и в циклическом — у женщин, что является результа-
Рез ю ме
Изучалось влияние введения прогестерона крысятам
в возрасте 1; 3; 5; 7 и 9 дн. (30 мг/кг) на показатели поведения в 25- и 30-дневном возрасте, а также морфометрические характеристики неокортекса и содержание в
крови половых стероидов в 40-дневном возрасте. У самок
опытной группы отмечено достоверное снижение массы
тела. И у самцов, и у самок экспериментальной группы
были уменьшены масса мозга и полушария и увеличена
плотность расположения нейронов во II и V слоях переднетеменной (ПТД) и собственно теменной (СТД) долей.
Тестирование поведения животных в 25-дневном возрасте показало уменьшение исследовательской активности в
подопытной группе. В 30-дневном возрасте у подопытных
самцов отмечено снижение исследовательской активности, а у самок — ее возрастание.
Ключевые слова: мозг, развитие, прогестерон.
Yu.B. Kolmakova, R.V. Uchakina, B.Ya. Ryzhavskii
EFFECT OF PROGESTERONE INJECTIONS
TO NEWBORN RATS ON INDICES OF BRAIN,
GONADS AND ADRENAL DEVELOPMENT
Far Eastern state Medical University;
Mother and Child Care Institute of Siberian Branch
of Russian Academy for Medical sciences, Khabarovsk
Summar y
We have studied the effect of progesterone injections to rats
at the age of 1; 3; 5; 7 and 9 days (30 mg/kg) on behavioral
indices at the age of 25- and 30 days, and on morphometrical
characteristics of neocortex and content of sexual steroids in
blood at the age of 40 days. Reduction of body mass was noted
in female rats of experimental group, male and female rats of
experimental group had a reduced mass of brain and cerebral
hemisphere and increased number of neurons in visual field
in II and V layers of anterior parietal and parietal lobus. Behavioral test of animals at the age of 25 day showed reduced
research activity in experimental group. At the age of 30 days
experimental male rats showed reduced research activity but
female rats — increased one.
Key words: brain, olevelopment, progesterone.
том внутриутробного гормонального программирования
(импринтинга) реактивности нервных центров, т.е. половой дифференциации мозга (ПДМ) [10].
96
составили крысята, которым внутрибрюшинно в том
же возрасте вводили на эквиобъемные дозы персиковое
масло. В 25- и 30-дневном возрасте поведение животных
тестировалось в приподнятом крестообразном лабиринте (ПКЛ) в течение 3 мин. Регистрировались по времени
(t) и числу (n) «элементарные» компоненты поведения:
принюхивания, свешивания, стойки, движения, груминг,
пребывание в открытых и закрытых рукавах. По перечисленным компонентам поведения определялись интегральные характеристики: исследовательская активность
и уровень тревожности, рассчитанные по временным (t),
частотным (n) характеристикам, а также по совокупности
временных и частотных (с) характеристик [6].
40-дневных крысят опытной и контрольной групп
забивали декапитацией одновременно, в утренние часы.
Массу тела, головного мозга, правого полушария, надпочечников и гонад определяли на электронных весах.
Головной мозг фиксировали в жидкости Карнуа. Затем
его разрезали в переднетеменной (ПТД) и собственно
теменной (СТД) долях строго перпендикулярно длиннику и верхней поверхности левого полушария, пользуясь
схемами [7], и заливали в парафин. Срезы толщиной 7
мкм окрашивали галлоцианином по Эйнарсону [1]. Измерение толщины коры головного мозга проводили в трех
участках на препаратах ПТД и СТД при помощи окуляр-микрометра MOB-15, при увеличении объектива ×8.
Определение плотности расположения нейронов производили во II и V слоях переднетеменной и собственно теменной долей при помощи окуляра ×10, при увеличении
объектива ×40. Для исследования всех перечисленных
показателей в каждом слое у каждого крысенка отбирали
по 25 нейронов из 5 стандартных полей зрения. Иммуноферментным методом в сыворотке крови крыс определяли концентрации эстрадиола и прогестерона (у самок) и
тестостерона (у самцов). Статистический анализ количественных данных проводили с помощью пакета программ
Statistica 6.0. Вычислялись среднее значение и медиана показателей, так как ряды являлись асимметричными.
Таблица 1
Влияние введения новорожденным крысам
прогестерона на показатели развития головного мозга,
гонад и надпочечников
Показатели
40-дневные
контрольные
40-дневные
экспериментальные
самцы
самки
самцы
самки
Масса:
- тела, г
84,4±7,4
(87,9)
84,7±2,5
(83,6)
82,9±6,9
(82,6)
73,7±4,4*
(69,6)
- мозга, мг
1534±30
(1549)
1505±17
(1506)
1421±63
(1486)
1373±29*
(1392)
- полушария, мг
540±10,1
(534)
523±9,6
(519)
491±20
(483)
484±16*
(489)
- гонад, мг
421±60,8
(415)
16,4±1,9
(16,5)
372±56
(312)
16,7±0,6
(17,0)
- надпочечников, мг
11,3±0,9
(11,5)
10,4±0,7
(10,0)
11,3±1,4
(9,0)
10,7±1,0
(11,0)
Концентрация:
- тестостерона
1,36±0,2
(1,4)
-
2,2±0,5
(2,1)
-
- эстрадиола
-
110,8±12,7
(117,3)
-
89,8±11,9
(80,4)
- прогестерона
-
3,4±1,0
(2,4)
-
2,0±0,2
(2,2)
Толщина коры, мкм:
- переднетеменная
доля
1568±52
(1532)
1599±36
(1602)
1423±28*
(1402)
1549±54
(1564)
- собственно
теменная доля
1211±28
(1207)
1288±33
(1317)
1214±33
(1245)
1189±40
(1133)
Число нейронов в
поле зрения:
- переднетеменная
доля:
- II слой
17,3±0,7
(17,5)
18,5±0,6
(19,1)
20,5±1,4*
(19,4)
22,7±0,7*
(22,8)
- V слой
7,8±0,2
(7,8)
7,9±0,2
(8,1)
9,1±0,6*
(9,8)
10,0±0,3*
(10,0)
Собственно
теменная доля:
- II слой
18,8±1,0
(18,8)
17,6±0,4
(17,6)
20,0±0,8
(20,8)
21,4±1,3*
(25,8)
- V слой
8,2±0,2
(8,4)
8,1±0,2
(8,0)
9,2±0,6
(9,6)
10,1±0,4*
(10,2)
Примечание.* — различия между экспериментальной и контрольной
группами достоверны; в скобках — медиана.
Результаты и обсуждение
Анализ динамики роста крысят, которым вводили
прогестерон, показал, что масса тела у самцов не имела
достоверных отличий от контрольной в 7-, 14-, 21-, 28- и
40-дневном возрасте. У самок опытной группы в 40-дневном возрасте отмечалось достоверное снижение массы
тела. Масса мозга в 40-дневном возрасте у самцов составила 1421±63 против 1534±30 мг в контроле (р>0,05). У
самок эти показатели равнялись 1373±29 и 1505±17 мг
соответственно (р<0,05), т.е. имелось достоверное уменьшение этого показателя. Вместе с меньшей массой мозга
регистрировалось также снижение массы полушария как
у самцов (491±19,9 против 540±10,1 мг; р>0,05), так и у
самок (484±16,3 против 523±9,6 мг; р<0,05).
Изучение параметров, отражающих развитие неокортекса, численность его нейронов обнаружило, что толщина коры ПТД у самцов опытной группы была уменьшена
(1423±28 мкм, в контроле — 1568±52 мкм; р<0,05), в
СТД этот показатель практически не различался в сравниваемых группах — 1214±33 и 1211±28 мкм соответственно. При этом плотность расположения нейронов как
в ПТД, так и в СТД была большей у самцов опытной
группы во II и V слоях. В неокортексе подопытных самок
Критический период ПДМ у внутриутробного плода,
т.е. период максимальной чувствительности развивающегося мозга к действию половых стероидов, соответствует
среднему триместру беременности. Именно в это время
наиболее вероятно появление отклонений ПДМ, однако
последний месяц I триместра и начало III триместра беременности тоже входят в зону риска. У некоторых лабораторных животных, например белых крыс, критический
период ПДМ сдвинут к концу беременности и распространяется на первые 10-12 дн. после рождения [4].
Материалы и методы исследования
Исследовано потомство 3 интактных самок белых
крыс (n=28), содержавшихся в стандартных условиях
вивария при естественном освещении. Все животные
были потомками 4-5-месячных самок и самцов, корм и
воду получали ad libitum. Беременных самок помещали в
индивидуальные клетки. Каждый помет был разделен на
две группы: 1 группу (n=14) составили крысята, которым
внутрибрюшинно вводили на 1; 3 дн. жизни по 0,15 мл
раствора прогестерона и на 5; 7 и 9 дн. по 0,2 мл раствора
прогестерона в дозе 30 мг/кг массы тела; 2 группу (n=14)
97
Таблица 2
Влияние введения новорожденным крысам прогестерона на поведение в ПКЛ в 25- и 30-дневном возрасте
Показатели
25-дневные
контрольные
25-дневные
экспериментальные
30-дневные
контрольные
30-дневные
экспериментальные
самцы
самки
самцы
самки
самцы
самки
самцы
самки
Время, с:
- бездействие
7,9±2,2
(5,2)
4,0±0,6
(3,8)
6,3±1,5
(5,1)
3,9±0,6
(3,6)
5,5±0,8
(4,8)
3,2±0,5
(2,6)
3,8±0,5
(3,8)
3,8±0,8
(4,1)
- стойки
2,2±0,45
(2,5)
3,6±1,4
(2,1)
3,8±2,4
(0,7)
5,4±1,9
(3,4)
4,4±1,6
(3,9)
6,2±2,5
(4,1)
3,4±1,4
(1,3)
6,2±2,2
(6,2)
- свешивания
4,4±1,1
(5,2)
2,2±1,0
(1,7)
7,6±3,3
(6,9)
1,0±0,6
(0,0)
0,8±0,3
(0,8)
0,4±0,3
(0,0)
0,8±0,4
(0,0)
2,6±0,9*
(2,9)
- груминг
13,9±4,5
(13,3)
15,3±3,6
(15,9)
14,6±2,6
(13,2)
7,6±1,9
(8,6)
13,3±2,9
(10,5)
18,5±3,9
(15,2)
16,2±4,6
(14,7)
11,2±2,2
(13,9)
- в открытых рукавах
43,5±13,5
(49,9)
16,3±6,4
(12,7)
38,1±14,8
(34,5)
21,3±16,6
(1,7)
19,4±11,4
(12,3)
6,5±2,9
(2,1)
8,9±3,5
(7,7)
20,6±7,3
(17,1)
- в закрытых рукавах
133,6±14,2
(127,9)
161,9±6,7
(165,8)
140,5±14,8
(144,1)
157,3±16,6
(176,5)
159,2±11,6
(166,4)
172,2±2,9
(176,2)
169,6±3,5
(171,6)
157,7±7,3
(161,3)
Исследовательская
активность (t)
67,5±20,5
(76,3)
25,9±9,9
(16,4)
67,6±25,9
(51,5)
40,1±28,3
(11,6)
30,9±16,5
(20,1)
14,2±5,9
(6,0)
14,3±5,5
(9,4)
34,9±11,8
(28,9)
Уровень
тревожности (t)
261,9±35,5
(224,8)
338,2±18,5
(334,6)
284,0±37,8
(283,5)
318,2±38,9
(352,3)
328,8±30,8
(340,3)
373,7±12,5
(370,5)
361,3±15,5
(357,1)
318,5±18,4*
(331,8)
Число:
- стойки
3,2±0,8
(3,5)
3,9±1,3
(2,5)
4,1±2,2
(1,0)
6,3±2,1
(4,0)
5,5±1,8
(5,0)
5,5±2,2
(3,5)
3,9±1,3
(3,0)
5,9±1,9
(8,0)
- свешивания
4,7±1,4
(5,0)
2,0±1,2
(1,0)
5,6±1,9
(6,0)
1,0±0,6
(0,0)
1,0±0,4
(1,0)
0,4±0,2
(0,0)
1,0±0,5
(0,0)
2,9±1,1*
(2,0)
- груминг
6,2±2,0
(5,0)
2,8±0,5
(2,5)
5,3±1,1
(5,0)
2,7±0,5
(2,0)
6,5±0,9
(6,0)
3,1±0,4
(3,0)
4,0±0,8*
(4,0)
4,1±1,2
(3,0)
- выход в открытые рукава
1,5±0,3
(2,0)
1,3±0,7
(1,0)
1,4±0,5
(1,0)
0,7±0,3
(1,0)
1,5±0,7
(1,0)
0,9±0,4
(0,5)
0,7±0,3
(1,0)
1,6±0,4
(2,0)
- заход в закрытые рукава
2,2±0,4
(2,5)
2,1±0,6
(2,0)
2,1±0,4
(2,0)
1,3±0,3
(1,0)
2,2±0,6
(1,5)
1,6±0,3
(1,5)
1,4±0,2
(1,0)
1,9±0,3
(2,0)
Исследовательская
активность (n)
11,9±2,6
(11,4)
8,4±3,8
(4,3)
13,9±3,8
(14,6)
9,0±2,5
(10,0)
8,9±2,6
(7,4)
7,3±2,8
(4,0)
6,1±2,2
(4,2)
12,0±3,5
(13,1)
Уровень
тревожности (n)
14,1±3,1
(11,7)
9,1±1,5
(8,5)
13,3±2,6
(11,6)
7,6±1,4
(5,9)
16,1±1,9
(15,6)
9,2±1,1
(9,7)
10,5±1,4*
(11,3)
11,1±2,8
(9,5)
Исследовательская
активность (с)
10,9±4,3
(9,1)
1,8±0,7
(1,0)
20,0±15,6
(7,6)
19,3±18,9
(0,1)
7,6±7,3
(0,5)
0,4±0,2
(0,1)
0,8±0,4
(0,3)
2,2±1,1
(1,1)
142,2±61,4
(63,7)
202,9±46,5
(146,8)
136,8±43,3
(105,6)
258,7±52,2
(342,9)
182,9±55,8
(123,2)
247,2±42,7
(259,6)
250,9±39,4
(264,0)
191,8±46,9
(137,9)
Уровень
тревожности (с)
Примечание. * — различия между экспериментальной и контрольной группами достоверны; в скобках — медиана.
имелась достоверно большая плотность расположения
нейронов во II и V слоях ПТД и СТД. В то же время, толщина коры в них была близкой к таковой у контрольных
животных (табл. 1). Большая численная плотность нейронов у животных из экспериментальной группы может
рассматриваться либо как следствие меньшей степени
развития глии, нейропиля, интенсивно идущего у крыс
после рождения, либо как следствие уменьшения числа
погибающих нейронов. В то же время, связь увеличенной
численной плотности нейронов с их общим числом в коре не является простой, так как зависит и от массы мозга
и полушария, толщины коры.
Тестирование поведения самцов в ПКЛ показало, что в
25-дневном возрасте у них имелись следующие межгрупповые различия медианы: в подопытной группе наблюдалось более чем трехкратное ее уменьшение по времени
стоек, на 31% — нахождения в открытых рукавах, более
чем трехкратное уменьшение медианы числа стоек. Совокупность этих отклонений обусловливала меньшую величину исследовательской активности при расчете времени
«элементарных» компонентов поведения и показателя,
учитывавшего как время, так и их число. Параллельно
с этим отмечалось увеличение медианы тревожности (t)
самцов опытной группы. Тестирование 30-дневных самцов выявило более чем двукратное снижение медианы
исследовательской активности, рассчитанной по исследованным временным показателям, уменьшение ее на
43% по частотным показателям, уменьшение ее на 40%
при учете обоих способов регистрации поведенческих
реакций животных.
У 25-дневных самок, получавших инъекции прогестерона, направленность отклонений от контроля была однотипной с таковой у самцов, однако более выраженной.
В противоположность этому, у 30-дневных подопытных
самок медиана исследовательской активности, рассчитанная по временным показателям, превышала таковую
в контроле более чем в 4 раза, по частотным показателям
— в 3 раза и в 11 раз — по совокупности временных и
частотных характеристик поведения (табл. 2).
Изучение концентрации половых стероидов не выявило достоверных межгрупповых различий концентрации тестостерона у самцов, эстрадиола и прогестерона
— у самок. В то же время, можно отметить, что медиана концентрации тестостерона у подопытных крыс (2,1
98
нмоль/л) была выше, чем в контроле (1,4 нмоль/л), медиана концентрации эстрадиола (80,4 пг/мл) меньшей, чем
в контроле (117,3 пг/мл), медиана концентрации прогестерона (2,2 нмоль/л) также меньшей, чем в контроле (2,4
нмоль/л).
Таким образом, полученные данные свидетельствуют
о том, что введение новорожденным крысятам прогестерона в неонатальном периоде оказывает существенное
влияние на морфологические и функциональные показатели развития головного мозга, по-разному выраженные
у самцов и самок.
Эти данные представляют интерес в связи с тем, что
новорожденные крысята — менее зрелые, чем новорожденные дети, в том числе и по показателям развития мозга
[5]. В связи с этим полученные результаты могут учитываться при определении значимости концентрации прогестерона в поздние периоды беременности в системе мать
— плацента — плод для развития головного мозга плода.
5. Рыжавский Б.Я. Развитие головного мозга: отдаленные последствия влияния некомфортных условий. - Хабаровск: Изд-во Дальнев. гос. мед. ун-та, 2006. - 232 с.
6. Сапожников Ю.А., Фельдшеров Ю.И., Рыжавский
Б.Я. Математический и экспериментальный анализ возможности оптимизации оценки ВНД (поведения) крыс //
Дальнев. мед. журнал. - 2002. - №4. - С. 25-28.
7. Светухина В.М. Цитоархитектоника новой коры
мозга в отряде грызунов (белая крыса) // Архив анатомии,
гистологии и эмбриологии. - 1962. - Т. 42, №2. - С.31-45.
8. Charalampopoulos I., Remboutsika E., Margioris
A.N. et al. Neurosteroids as modulators of neurogenesis and
neuronal survival // Trends Endocrinol Metab. - 2008. - Vol.
19, №8. - P. 300-307.
9. Trotter A., Maier L., Pohlandt F. Management of the
extremely preterm infant: is the replacement of estradiol and
progesterone beneficial? // Paediatr Drugs. - 2001. - Vol. 3,
№9. - P. 629-666.
10. Wagner CK. Progesterone receptors and neural
development: a gap between bench and bedside? // Endocrinology. - 2008 - Vol. 149, №6. - P. 2743-2752.
Л и те ра тура
1. Лойда 3., Госсрау Р., Шиблер Т. Гистохимия ферментов. - М.: Мир, 1982. - 270 с.
2. Межевитинова Е.А. Прогестагены в контрацепции.
// Гинекология. - 2001. - Т 3, №2. - С 36-40.
3. Мицкевич М.С. Гормональные регуляции в онтогенезе животных. - М.: Наука, 1978. - 224 с.
4. Резников А.Г. Прогестагены, беременность и здоровье плода // Гинекология. - 2003. - Т. 5, №6. - С. 260-262.
Координаты для связи с авторами: Колмакова
Юлия Борисовна — аспирант кафедры гистологии; Учакина Раиса Владимировна — доктор биологических наук,
профессор, гл. науч. сотрудник НИИ охраны материнства и детства СО РАМН; Рыжавский Борис Яковлевич
— проректор по НИР ДВГМУ, доктор мед. наук, тел.:
8(4212)-32-63-93.
99