ГОСУДАРСТВЕННОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ «РОССИЙСКИЙ НАЦИОНАЛЬНЫЙ
advertisement
ГОСУДАРСТВЕННОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ «РОССИЙСКИЙ НАЦИОНАЛЬНЫЙ ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМЕНИ Н. И. ПИРОГОВА» МИНИСТЕРСТВА ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ На правах рукописи Тихонов Дмитрий Александрович ДЕЙСТВИЕ ЛИГАНДОВ РЕЦЕПТОРОВ ПРОГЕСТЕРОНА НА КЛЕТКИ МОНОНУКЛЕАРНОЙ ФРАКЦИИ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ ПРИ ГИПЕРПЛАСТИЧЕСКИХ ПРОЦЕССАХ ЭНДОМЕТРИЯ 14.03.06 – фармакология, клиническая фармакология диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор Карева Елена Николаевна Москва 2015 2 ОГЛАВЛЕНИЕ Список сокращений 6 Введение 8 Глава 1. Обзор литературы 13 1.1. Лиганды рецепторов прогестерона 1.2. Лиганды рецепторов прогестерона и иммунная система 13 25 1.3. Гиперпластические процессы эндометрия 31 1.4. Рецепторы половых стероидов в ткани эндометрия 38 1.5. Лечение гиперпластических процессов эндометрия 1.6. Заключение Глава 2. Материалы и методы исследования 2.1. Материалы для исследования 2.1.1. Используемые реактивы 2.1.2.Используемое оборудование 2.1.3. Объекты исследования 2.1.4. Дизайн исследования 2.2. Методы исследования 42 44 46 46 46 47 48 51 53 2.2.1. Выделение мононуклеарной фракции клеток из периферической крови 53 2.2.2. Определение специфического связывания 3Нпрогестерона с прогестерон-связывающими участками МНФК периферической крови 2.2.3. Определение специфического связывания 54 55 3 синтетических стероидов с рецепторами прогестерона 2.2.4. Жидкостная сцинтилляционная радиометрия 56 2.2.5. Инкубация клеток с прегна-D’-пентаранами и прогестероном 56 2.2.6. Оценка метаболической активности клеток (МТТ-тест) 57 2.2.7. Определение уровня ФНО-α с помощью иммуноферментного анализа 2.2.8. Выделение мРНК из клинического материала 58 58 2.2.9. Реакция обратной транскрипции для получения кДНК 8 2.2.10. Полимеразная цепная реакция в реальном времени для определения уровня экспрессии генов 2.2.11. Статистическая обработка результатов Глава 3. Результаты исследований и их обсуждение 58 61 63 3.1. Определение специфического связывания прегна-D’пентаранов с прогестерон-связывающими участками клеток мононуклеарной фракции периферической крови 63 3.2. Анализ влияния прегна-D’-пентаранов на уровень продукции ФНО-α мононуклеарной фракцией периферической крови 66 3.3. Влияние прегна-D’-пентаранов на жизнеспособность неизмененных и опухолевых гормон-чувствительных клеток 68 3.3.1. Влияние прегна-D’-пентаранов на 69 5 4 жизнеспособность мононуклеарной фракции клеток периферической крови 3.3.2. Влияние прегна-D’-пентаранов на жизнеспособность опухолевых клеток Hela и MOLT-4 72 3.4. Влияние прегна-D’-пентаранов на экспрессию генов рецепторов прогестерона и эстрадиола в клетках мононуклеарной фракции периферической крови пациенток с 76 гиперпластическими процессами эндометрия 3.4.1. Экспрессия генов ядерных и мембранных рецепторов стероидных гормонов в МНФК периферической крови пациенток постменопаузального 77 возраста без гинекологической патологии 3.4.2. Экспрессия генов рецепторов эстрадиола и прогестерона МНФК периферической крови пациенток постменопаузального возраста с железисто-фиброзными 85 полипами эндометрия 3.4.3.Экспрессия генов ядерных и мембранных рецепторов эстрадиола и прогестерона МНФК периферической крови пациенток постменопаузального возраста с железистой и железисто-кистозной 91 гиперплазией эндометрия 3.4.4. Экспрессия генов ядерных и мембранных рецепторов стероидных гормонов в МНФК у пациенток постменопаузального возраста с аденокарциномой 95 эндометрия 3.4.5. Влияние прегна-D’-пентаранов на экспрессию 101 5 генов рецепторов прогестерона и эстрадиола в МНФК 3.5. Структурно-функциональный анализ соединений гомологического ряда прегна-D’-пентаранов и выбор наиболее активных соединений 104 Выводы 106 Список литературы 107 6 Список сокращений Ct – пороговый цикл амплификации DBD – ДНК-связывающий домен ERα, ERβ – ядерные рецепторы эстрадиола GAPDH - глицеральдегид 3-фосфат дегидрогеназа Hela – культура эпителиоидного рака шейки матки человека IFN - интерферон IL - интерлейкин LBD – лиганд-связывающий домен mER – мембранный рецептор эстрадиола MOLT-4 – культура Т-клеточного лейкоза человека MTT-тест – реакция на основе превращения 3-(4,5-диметилтиазолил-2)-2,5дифенилтетразолиума бромида в формазан NK-клетки – клетки - естественные киллеры PAQR7, mPR – мембранный рецептор прогестерона PGRmC1 – мембранный рецептор прогестерона компонент 1 PIBF – прогестерон-индуцированный блокирующий фактор PR-A, PR-B – ядерные рецепторы прогестерона Th – лимфоциты группы T-хелперов TLR - Toll-подобные рецепторы Treg – Т-регуляторные клетки аГРГ - агонисты гонадотропин-рилизинг гормон ГПЭ – гиперпластические процессы эндометрия ДК – дендритные клетки 7 ЖФПЭ – железисто-фиброзный полип эндометрия кДНК – комплементарная ДНК, построенная на основе мРНК МНФК (МНФ) – мононуклеарная фракция клеток периферической крови мРНК – матричная РНК ПЦР–РТ (PCR-RT) – полимеразная цепная реакция в реальном времени ФНО (TNF) – фактор некроза опухолей 8 Введение. Актуальность работы. Лечение гиперпластических процессов эндометрия до настоящего времени остается одной из наиболее актуальных задач современной медицинской науки. Это связано с высокой распространенностью данной патологии (в среднем до 9% пациенток) [52, 85], неуклонным ростом заболеваемости, особенно в постменопаузальном периоде [14, 30, 52], частым бессимптомным течением, малигнизацией и низкой эффективностью существующих методов консервативной терапии [17]. Недостаточная эффективность медикаментозного лечения гиперпластических процессов эндометрия может быть следствием отсутствия полной картины этиопатогенеза этого заболевания и ограниченным спектром, разрешенных к применению, лекарственных средств. Патогенетически обоснованной тактикой медикаментозного лечения гиперпластических процессов эндометрия является снижение эстрогенного влияния на ткань. С этой целью используют гестагены, аналоги гонадолиберинов (аГРГ) и комбинированные пероральные контрацептивы, одним из механизмов действия которых, является снижение концентрации гонадотропинов в крови и, в конечном итоге, продукции яичниками эстрогенов. Однако, наличие эстрогенного компонента в комбинированных пероральных контрацептивах и тяжелые побочные эффекты аГРГ ограничивают их применение в клинической практике. Поэтому, гестагены, с их оптимальным профилем безопасности, являются одной из наиболее востребованных групп препаратов для этой цели [32]. Поиск и изучение новых лекарственных средств, в частности, лигандов рецепторов прогестерона (чистых агонистов и селективных модуляторов рецепторов прогестерона) остается одним из важнейших фундаментальных и прикладных направлений в фармакологии [33]. К настоящему времени синтезированы новые синтетические производные прогестерона – прегна-D'пентараны – соединения с дополнительным карбоциклом в 16,17-положениях 9 стероидного скелета, перспективные для изучения структурно-функциональных свойств стероидных лигандов рецепторов прогестерона и поиска новых активных молекул для применения в клинической практике. Современный системный подход в изучении этиопатогенеза, на основании которого формируется тактика медикаментозного лечения, диктует необходимость анализа взаимодействия эндокринной и иммунной систем, влияния стероидных гормонов на функционирование иммунокомпетентных клеток в норме и при патологии [48, 108]. Тесная взаимная регуляция этих двух контролирующих систем организма давно известна. Так, развитию гормонзависимых опухолей тканей репродуктивного тракта женщины сопутствуют нарушения иммунной системы [14, 26, 48], с другой стороны – саногенез любого патологического процесса обеспечивается совокупностью усилий локального и системного звеньев иммунитета [6]. Поэтому для повышения эффективности гормональной терапии при гиперпластических процессах эндометрия необходимо изучить функциональное состояние иммунных клеток, которые можно рассматривать в качестве терапевтической мишени действия препаратов стероидных гормонов. Цель работы: изучение фармакодинамических свойств новых синтетических лигандов рецепторов прогестерона в клетках-мишенях стероидных гормонов. Задачи: 1. Определить уровень специфического связывания прегна-D'-пентаранов с прогестерон-связывающими участками мононуклеарной фракции периферической крови. 2. Изучить влияние прегна-D'-пентаранов на продукцию ФНО-альфа клетками мононуклеарной фракции крови. 10 3. Оценить действие прегна-D'-пентаранов на жизнеспособность неизмененных (МНФК) и опухолевых клеток (Hela, MOLT-4). 4. Исследовать влияние прегна-D'-пентаранов на экспрессию генов рецепторов половых стероидных гормонов в мононуклеарной фракции клеток периферической крови у пациенток постменопаузального возраста без гинекологической патологии, а также у больных с гиперпластическими процессами эндометрия. 5. Выявить соединения в ряду прегна-D’-пентаранов, обладающие наиболее высокой специфической связывающей активностью в отношении прогестеронсвязывающих участков мононуклеаров периферической крови, подавлением жизнеспособности опухолевых клеток при отсутствии токсического действия на неизмененные клетки, перспективные для использования в клинической практике. Научная новизна. Впервые было изучено влияние прегна-D’-пентаранов на мононуклеарную фракцию клеток периферической крови у пациенток с гинекологической патологией, определена экспрессия генов подтипов рецепторов прогестерона и эстрадиола в мононуклеарах периферической крови у женщин постменопаузального возраста без гинекологической патологии и выявлены изменения рецепторного профиля МНФК при развитии гиперпластических процессов эндометрия. Практическая значимость. На основании полученных данных было показано, что для доклинических испытаний наиболее перспективными соединениями класса прегна-D'- пентаранов являются 6(E)-гидрокси-имино-16α,17α-циклогексано-прегн-4-ен3,20-дион) и 16α,17α-циклогексано-4-оксапрегн-5-ен-3,20-дион, которые обладают высокой специфической связывающей активностью с прогестеронсвязывающими участками клеток мононуклеарной фракции периферической 11 крови, снижают выработку мононуклеарами крови ФНО-альфа, угнетают жизнеспособность опухолевых клеток (HeLa и MOLT-4) и не оказывают токсического действия на неизмененные клетки периферической крови. Выявлено, что при развитии гиперпластических процессах у женщин с постменопаузальным периодом до 10 лет в мононуклеарной фракции периферической крови увеличивается уровень экспрессии гена рецептора эстрадиола типа альфа по сравнению с пациентками без гинекологической патологии в 4 раза (р<0,001). Превышение уровня экспрессии данного гена более 0,314 (по формуле 0,5-ΔCt*100 относительно гена GAPDH) может свидетельствовать о развитии гиперпластических процессов слизистой оболочки матки у пациенток старшей возрастной группы. Основные положения диссертации, выносимые на защиту. Исследуемые представители гомологического ряда прегна-D’-пентаранов обладают достаточно высокой специфической связывающей активностью в отношении прогестерон-связывающих участков клеток мононуклеарной фракции периферической крови, по-разному влияют на цитокинопродукцию мононуклеарами периферической крови, способны подавлять жизнеспособность культур опухолевых клеток, при этом не оказывая цитотоксического действия на фракцию мононуклеарных клеток периферической крови, и влияют на стероиднорецепторный транскриптом МНФК у пациенток с гиперпластическими процессами эндометрия по сравнению с женщинами без гинекологической патологии. Апробация работы: состоялась на объединенной научно-практической конференции сотрудников кафедры молекулярной фармакологии и радиобиологии им. академика П.В. Сергеева МБФ, аспирантов и сотрудников научно-исследовательской лаборатории молекулярной фармакологии РНИМУ им. Н.И. Пирогова № 10 от 10 декабря 2013 г. 12 Публикации. Материалы работы доложены и обсуждены на X Всероссийской научной конференции с международным участием «Отечественные противоопухолевые препараты» (Москва, 2011), Международной научной конференции студентов и молодых ученых «Актуальные вопросы современной медицины 2012» (Харьков, 2012), XXV Международном конгрессе с курсом эндоскопии «Новые технологии в диагностике и лечении гинекологических заболеваний» (Москва, 2012), IV съезде фармакологов России «Инновации в современной фармакологии» (Казань, 2012), VIII Международной (XVII Всероссийской) Пироговской научной медицинской конференции (Москва, 2013), VIII Международной (XVIII Всероссийской) Пироговской научной медицинской конференции (Москва, 2013). По материалам диссертации опубликовано 14 печатных работ. Структура и объем диссертации: Диссертационная работа состоит из введения, глав, посвященных обзору литературы, описанию методов исследования, изложению результатов работы и их обсуждению, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 111 источников. Работа изложена на 119 страницах, иллюстрирована 8 рисунками, содержит 22 таблицы, 15 диаграмм и 1 схему. 13 ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. ДЕЙСТВИЕ ЛИГАНДОВ РЕЦЕПТОРОВ ПРОГЕСТЕРОНА НА КЛЕТКИ МОНОНУКЛЕАРНОЙ ФРАКЦИИ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ ПРИ ГИПЕРПЛАСТИЧЕСКИХ ПРОЦЕССАХ ЭНДОМЕТРИЯ 1.1. Лиганды рецепторов прогестерона. Прогестерон (прегнен-4-дион-3, 20) представляет собой стероидный гормон с молекулярной массой 314,5 дальтон. Прогестерон является гормоном сохранения беременности, участвует в созревании яйцеклетки, дифференцировке эндометрия, имплантации эмбриона, росте плаценты, предотвращении сокращения миометрия, дифференцировке тканей молочной железы. Кроме того, он необходим и для нормального функционирования различных систем организма: обладает нейропротекторным и нейрорегенеративным эффектами, играет важную роль в функционировании иммунной системы [53]. Синтезировано большое число производных прогестерона и изучена их способность влиять на ткани-мишени: матку, яичники и молочные железы, а также на другие органы и системы [20]. Гестагены – группа соединений, проявляющих гестагенную активность, проявляющуюся в изменении секреторной трансформации эндометрия у инфантильных кроликов (тест Клауберга-МакФейла) - включают в себя вещества как натурального, так и синтетического происхождения (таблица 1, рисунок 1). Таблица 1. Классификация прогестагенов (по [96]). Классификация Представитель 14 2а. Аналоги прогестерона 2б. Аналоги тестостерона 2. Синтетические 1. натуральные 2а.i ацетилированные прегнаны прогестерон медроксипрогестерона ацетат, мегестрол ацетат, хлормадинона ацетат, ципротерона ацетат 2а.ii неацетилированные прегнаны дигидрогестерон, медрогестон 2а.iii ацетилированные 19норпрегнаны номегестролаацетат, нестерон 2а.iv неацетилированные 19-норпрегнаны демегестон, промегестон, тримегестон 2б.i этинилированные эстраны норэтиндрон, норэтиндрона ацетат, этиндиола диацетат, норэтинодрел, линестренол, тиболон 2б.ii этинилированные 13-этилгонаны левоноргестрел, дазогестрел, норгестимат, гестоден 2б.iii неэтинилированные диеногест, дроспиренон Рисунок 1. Химическая структура прогестерона и тестостерона. 15 Для связывания с рецепторами прогестерона необходимо наличие неароматического кольца А (с кетогруппой в положении 3 и двойной связью между атомами С4 и С5) в инвертированной конформации 1β, 2α, при которой атом С1 находится над, а С2 – под плоскостью, проходящей через атомы С3 – С5 и С10. Другие рецепторы стероидных гормонов также связываются с таким неароматическим кольцом А, но для обеспечения с ними высокого сродства конформация кольца А должна быть иной. Биологическая активность гестагенов зависит от их химической структуры. Это обусловлено тем, что свойства соединений зависят от взаимодействия стероидной молекулы с определёнными участками лиганд-связывающего домена (ligand binding domain, LBD) рецептора прогестерона (рисунок 2) [102]. Рисунок 2. Взаимодействие молекулы прогестерона с аминокислотами лигандсвязывающего домена рецептора прогестерона [102]. Примечание: Gln – глутамин, Arg – аргинин, Phe – фенилаланин, W – Вандер-Ваальсово взаимодействие между молекулами, числовые обозначения – в Ангстремах (10−10 м). 16 Важную роль в прогестерон-связывающем кармане играют следующие молекулы: остаток аргинина 766 необходим для правильной ориентации молекулы прогестерона через водородные связи относительно остатка глутамина 725, при этом фенилаланин фиксирует А-кольцо стероида через Ван-дерВаальсову связь [102]. При этом другие остатки аминокислот также взаимодействуют с молекулой лиганда, что приводит, в конечном итоге, к проявлению агонистической или антагонистической активности [68]. Так, добавление к молекуле прогестерона гидроксильной группы у 17 атома углерода лишает прогестерон гестагенной активности, а ацетилирование по этой гидроксильной группе увеличивает гестагенную активность, а при добавлении метильной группы к 6 атому углерода активность соединения также может увеличиться [96]. Введение в молекулу медроксипрогестерона ацетата двойной связи между атомами углерода 6 и 7, замещение метильной группы у 6 атома углерода, а также добавление метиленовой группы к 1 и 2 атому углерода повышает прогестагенную активность соединения [96]. Кроме того, изменение положения метильной группы у 10 атома углерода прогестерона с бета на альфа-положение, по-видимому, является причиной отсутствия способности соединения вызывать ингибирование овуляции в течение менструального цикла и изменения базальной температуры тела [96]. Введение в молекулу тестостерона этинильной группы в 17 альфаположение приводит к снижению андрогенной активности, а удаление метильной группы в 10 положении углерода повышает прогестагенные свойства и уменьшает андрогенные [96]. Таким образом, существуют литературные данные о влиянии разных заместителей в молекуле прогестерона на прогестагенную, андрогенную 17 активность полученных веществ. При дальнейшем изменении молекул прогестерона могут появиться новые классы соединений, которые будут обладать другими свойствами. Создание таких классов позволяет более глубоко изучить структурно-функциональные связи в ряду производных прогестерона и их свойства. Химическая модификация молекулы прогестерона привела к созданию нового класса синтетических прогестинов - 16α,17α-циклоалканопрогестеронов (прегна-D’-пентаранов), полученных в лаборатории химии стероидов и оксилипинов N 22 ИОХ им. Зелинского (зав. д.х.н. И.В. Заварзин) путем введения дополнительного карбоцикла в молекулу прогестерона, конденсированного со стероидным скелетом в 16α,17α-положениях (рисунок 3)[8]. Рисунок 3. Структурная формула прегна-D’-пентаранов. Примечание: X, Y, R1– положения заместителей. Известно, что стероиды с заместителями в стероидном скелете могут обладать различными видами биологической активности (гормональной и негормональной) в зависимости от особенностей структуры и типа заместителей в стероидном скелете [55]. 18 Прегна-D´n–пентараны - это класс 3,20-дикетопрегнанов с дополнительным 16α, 17α-карбоциклом, содержащим от трех до семи атомов углерода (индекс nуказывает число атомов дополнительного карбоцикла D´), представители которого обладают прогестагенной или антипрогестагенной активностями in vivo. Прогестерон несет две полярные нехиральные (3- и 20-карбонильные) группы, и в силу своей общей изогнутости представляет большие возможности для стереохимических трансформаций [8]. Прегна-D´-пентараны, различающиеся только по размеру дополнительного карбоцикла, делятся в соответствии со своей активностью in vivo на три основные группы: 1) высокоактивные соединения (полные агонисты прогестерона); 2) соединения, активные в тесте трансформации эндометрия, но малоактивные в тесте сохранения беременности; К первой группе полных агонистов прогестерона относится 16α, 17α – циклогексанопрогестерон и его аналоги, несущие в 6α положении заместители и/или дополнительные двойные связи (∆1или ∆6) в стероидном скелете. Соединения с трех-пятичленным дополнительным D´-циклом (вторая группа) характеризуются снижением гестагенной активности, в то время как наличие двойной связи в дополнительном шестичленном карбоцикле (третья группа) несколько увеличивает прогестагенную активность соединения [8]. По результатам исследований, активность прегна-D’-пентаранов по сохранению беременности в эксперименте варьирует от 0 до 100 %, в зависимости от заместителей [8]. Таким образом, среди высокоактивных гормоноподобных веществ ряда пентаранов были обнаружены соединения с высокой гестагенной активностью. 19 Таким образом, прегна-D’-пентараны являются высокоактивными соединениями с разделенными биологическими функциями в зависимости от модификаций их молекулы, что делает их перспективными для дальнейшего поиска соединений для применения в клинике в качестве активных гестагенов. Как и у большинства стероидов, действие прогестерона и прегна-D’пентаранов на клетки-мишени опосредуется путем связывания и активации специфических клеточных рецепторов: ядерных («классических», внутриклеточных) и мембранных («неклассических»). Так, лигады рецепторов прогестерона способны как изменять траскрипцию генов-мишеней, так и запускать инициированные через мембранные рецепторы сигнальные каскады [25]. В 1998 г. сформулирована Маннхеймская классификация эффектов половых стероидов с учетом их внегеномного действия [49]. Ее суть отражена в таблице 2: Таблица 2. Действие прогестерона на ткань-мишень ([49] с модификациями). А. Прямые эффекты В. Непрямые эффекты (стероид действует как агонист сам) (стероиду требуется партнер агонист для генерации быстрого ответа) I. Неспецифические (без рецептора, возможен эффект стероида на физические свойства плазматической мембраны) II. Специфические (рецептор и лиганд обязательны) а) классический ядерный стероидный рецептор в) неклассический (мембранный) стероидный рецептор 20 Первой структурой, с которой взаимодействуют стероидные гормоны в процессе реализации биологической активности на клеточном уровне, является цитоплазматическая мембрана клетки-мишени. Еще в 1979 году академиком П.В. Сергеевым были опубликованы основные положения мембранорецепторной теории действия стероидных гормонов. В соответствии с этой теорией: 1) стероид узнается плазматической мембраной клетки-мишени; 2) плазматическая мембрана связывает и осуществляет перенос лиганда в клетку, включает систему вторичных посредников; 3) в распознавании и транслокации гормона принимают участие мембраны субклеточных органелл; 4) в превращении химического гормонального сигнала в биологический ответ клетки-мишени первостепенное значение имеют процессы транскрипции и трансляции [21]. В настоящее время для всех классов стероидных гормонов доказано существование на плазматических мембранах клеток-мишеней специфических рецепторов, которые опосредуют быстрые, негеномные эффекты стероидов, индуцируя изменения проницаемости мембраны для различных ионов, или изменяя активность ферментов, образование вторичных посредников внутри. За последнее время выделены, идентифицированы и описаны свойства нескольких плазмамембранных рецепторов прогестерона, наиболее важными из которых являются два варианта: mPR и PGRmC, которые оказывают независимые от транскрипции эффекты на клетки-мишени, в том числе и ткани матки и клетки иммунной системы [25, 65]. Рецепторы mPR относятся к семейству ассоциированных с G-белком, семь раз пронизывающих мембрану рецепторов прогестерона и адипонектина (PAGR) [105]. Различают три субтипа mPR – α, β и γ, которые отличаются у 21 млекопитающих в зависимости от тканевого распределения, стадии репродуктивного цикла и неогенеза. Эстрадиол 17β стимулирует экспрессию mPRα и β, в то время как прогестерон увеличивает плотность лишь mPR α подтипа мембранных рецепторов. PGRmC1 - второй тип мембраносвязанного рецептора прогестерона представляет собой один раз пересекающий мембрану протеин. О механизме действия данного типа рецепторов известно немного; однако, показано, что он может образовывать комплекс с белком, связывающим ингибитор РНК активатора плазминогена (PAIRBP1), в результате чего активируются цГМФзависимые протеинкиназы и протеинкиназа С [47]. После проникновения внутрь клетки стероидные гормоны связываются с цитозольными (классическими) рецепторами половых стероидов, относящихся к суперсемейству ядерных рецепторов (nuclear receptor, NR). В эту группу входят рецепторы для гидрофобных молекул, таких как эстрогены, глюкокортикоиды, прогестерон, минералкортикоиды, андрогены, витамин Д3, экдизон, желчные кислоты, ретиноидная кислота, гормоны щитовидной железы, жирные кислоты, лейкотриены и простагландины [86]. Они являются внутриклеточными транскрипционными факторами и вызывают положительный или отрицательный эффект на экспрессию генов-мишеней [10, 21]. К классическим рецепторам прогестерона (подсемейство NR3C3) относят PR-А и PR-В. Обе изоформы кодируются единственным геном, но регулируются различными промоторами. Тип В отличается от типа А присутствием в структуре рецептора дополнительного модульного домена, так называемой "функции активации транскрипции". Структура изоформ рецепторов PR-А и PR-В представлена на рисунке 4. Рисунок 4. Структурная организация изоформ рецепторов прогестерона [по 50]. 22 Примечание: ПР-А, ПР-В – рецепторы прогестерона типа А и В, соответственно, AF - транскрипционные активационные функциональные единицы, IF - ингибиторный фактор, DBD – ДНК-связывающий домен, LBD – лиганд-связывающий домен. В качестве основных доменов рецепторной молекулы выступают: DBD (ДНК-связывающий домен)- наиболее консервативный домен из стероидных рецепторов, который отвечает за связывание с рецепторной молекулы с ДНК, а также играет роль в димеризации рецептора, взаимодействие с кофакторами; LBD (лиганд-связывающий домен), который определяет специфичность и аффинность связывания с лигандом, а также играет роль в димеризации, перемещении в ядро и взаимодействии с шаперонами и кофакторами [96]. Активация специфическим лигандом агонистом рецептора прогестерона типа В приводит к ингибированию экспрессии рецептора прогестерона типа А. В большинстве органов-мишеней экспрессия рецепторов прогестерона усиливается под влиянием эстрадиола и ослабляется под влиянием самого прогестерона. Основные механизмы действия рецепторов прогестерона является одинаковым для всех стероидных гормонов и указаны на рисунке 5. Рисунок 5. Схема механизма действия стероидных гормонов [9]. 23 Примечание: ДАГ – диацилглицерол, ПК-С – протеинкиназа С, ПК-А – протеинкиназа А, Ин3Ф – инозитол-3 фосфат, цАМФ – циклоаденозинмонофосфат. При связывании лиганда с рецептором прогестерона эффект может осуществляться через два основных пути. Первый (неклассический) –заключается в связывании на плазматической мембране клетки со специфическими рецепторами и активации каскадных реакций систем вторичных посредников, например, фосфолипазы С, инозитол-3-фосфата, ионизированного Са2+, протеинкиназы С. Таким образом активируются негеномные эффекты. Классический путь передачи сигнала заключается в лиганд-зависимой активации рецепторов и последующем осуществлении своего действия через активацию или ингибирование транскрипции генов-мишеней. Геномный 24 механизм действия лигандов рецепторов прогестерона на клетки-мишени начинается с трансмембранного переноса молекул стероидных гормонов в клетку. В отсутствии лигандов рецепторы прогестерона находятся в комплексе с несколькими вспомогательными белками - шаперонами (hsp 90, hsp 70, hsp 40), иммунофиллином FKBP-52 и р23, которые оставляют открытым на поверхности глобулы лишь лиганд-связывающий домен. Попав внутрь клетки, гормон связывается с цитозольным рецептором прогестерона, после чего образовавшийся комплекс гормон-рецептор димеризуется и отправляется в ядро клетки, где происходит связывание активированного ДНК-связывающего домена рецептора с молекулой ДНК. Это приводит к увеличению (трансактивации) или снижению (трансрепрессии) процессов транскрипции транскрипции зависит от типа генов. Направление регуляции корегуляторов, присоединившихся к мультикомплексу (коактиваторы - NCOA1, NCOA3, CREBBP, SRA1, JDP2 или корепрессор - NCOR2) [19]. Таким образом, рецепторы прогестерона гетерогенны и состоят из различных подтипов ядерных и мембранных рецепторов, которые осуществляют различные эффекты в клетке-мишени. А поскольку именно рецепторы отвечают за эффект лигандов, в данном случае, стероидных гормонов, они могут быть использованы как молекулярные мишени для более эффективной терапии. Если классические рецепторы давно и с успехом используются в качестве скрининг-систем для отбора селективных лигандов рецепторов прогестерона, мембранные рецепторы пока не вовлечены в индустрию создания новых препаратов. Тем не менее, учитывая постоянно пополняющиеся сведения об участии альтернативных рецепторов в патогенезе заболеваний тканей не только репродуктивного тракта, но и иммунной, нервной и сердечно-сосудистой систем, это изучение их роли в развитии гормон-зависимых патологий представляется перспективным направлением в медицине. 25 Лиганды рецепторов прогестерона и иммунная система. 1.2. Доказательствами влияния прогестерона на иммунные клетки являются: увеличение частоты аутоиммунных заболеваний после полового созревания у женщин, изменение функции иммунной системы во время беременности, в лютеиновую фазу овуляторного цикла и после лечения прогестинами, а также исследования in vitro, показавшие непосредственное воздействие прогестерона на иммунокомпетентные клетки крови [53]. Известно, что рецепторы прогестерона находятся и на клетках иммунной системы. Так, они представлены в дендритных клетках, естественных киллерах (NK-клетках), макрофагах, доказательствами влияния Т- и В-лимфоцитах, [25, 53]. прогестерона на иммунные Кроме клетки того, являются: увеличение частоты аутоиммунных заболеваний после полового созревания у женщин, изменение функции иммунной системы во время беременности, в лютеиновую фазу овуляторного цикла и после лечения прогестинами, а также исследования in vitro, показавшие непосредственное воздействие прогестерона на иммунокомпетентные клетки крови [53, 54]. Дендритные клетки. Дендритные клетки (ДК) являются антиген-презентирующими клетками и играют важнейшую роль в создании иммунного ответа. Они захватывают антигены, после чего выделяют большое количество цитокинов, которые, в свою очередь, стимулируют противовоспалительным Т-лимфоциты, реакциям, а также способствуют могут вызывать про- или иммунную толерантность. Дендритные клетки имеют важное значение из-за их способности влиять на тип ответа, вызванного Th клетками в присутствии цитокинов или хемокинов. [39]. . Во время созревания ДК экспрессируют такие молекулы, как CD40, CD80, CD86, которые важны для взаимодействия с В- и Т клеток и последующего развития адаптивного иммунного ответа [61]. Продемонстрировано наличие в дендритных клетках прогестерона и глюкокортикоидных рецепторов [53,61, 110]. рецепторов 26 Было показано, что прогестерон подавляет способность дендритных клеток экспрессировать поверхностные маркеры, такие как CD40, CD80, CD86 и МНС класса II [39, 53, 110]. При этом также снижается продукция цитокинов IL-6 и IL12, IL -1α, IL-1β, IL-12, IFN-γ и TNF-α, и повышается выделение IL-10 [39, 53, 110]. NK-клетки. Естественные киллеры (NK-клетки) являются первой линией защиты организма от опухолевых, инфицированных и других измененных клеток, оказывая цитотоксическое действие и при этом, в отличие от Т-и В-лимфоцитов, не нуждаются в предварительной сенсибилизации. NK-клетки способны продуцировать иммунорегуляторные цитокины, которые способствуют ранней защите от бактерий, нескольких типов вирусов и паразитов [35, 42]. В естественных киллерах были идентифицированы как рецепторы прогестерона, так и глюкокортикоидов [35, 42, 53]. Было показано, что прогестерон может угнетать функциональную активность естественных киллеров, индуцировать их апопотоз и подавлять секрецию ИФН- γ [35, 42, 101]. Нейтрофилы. Нейтрофилы являются основными эффекторными клетками неспецифического иммунитета и представляют первую линию защиты организма против инфекций. Эти клетки узнают и убивают микроорганизмы посредством их фагоцитоза и последующей секреции активных форм кислорода и цитотоксических компонентов гранул. Помимо элиминирования патогенных микроорганизмов, нейтрофилы, аккумулирующиеся в воспаленной ткани, секретируют хемоаттрактанты, привлекающие другие типы клеток иммунной системы в очаг воспаления. Несмотря на то, что в нейтрофилах не было найдено классических рецепторов прогестерона, было показано, что прогестерон может подавлять 27 высвобождение супероксида и апоптоз [53, 74]. При этом прогестерон снижает усиление эстрадиол-индуцированного хемотаксиса [53]. Эозинофилы. Эозинофилы играют важную роль при паразитарных инвазиях, бактериальных и вирусных инфекциях, повреждении тканей, участвуют в противоопухолевом иммунитете, а также патогенезе аллергических заболеваний. В ответ на различные стимулы эозинофильные гранулоциты мигрируют из циркуляции в очаг воспаления. Эозинофилы являются агрессивными эффекторными клетками, обладающими широким арсеналом цитотоксических факторов, важнейшими среди которых являются гранулярные белки (большой основной протеин, эозинофильный катионный протеин, эозинофильный нейротоксин и эозинофильная пероксидаза). Эти компоненты гранул принимают активное участие в реализации воспалительных реакций, потенциируя выделение гистамина из тучных клеток и базофилов; вызывают деструкцию и фрагментацию патогенов различной природы. Немаловажную роль в осуществлении эффекторного потенциала эозинофильных лейкоцитов отводят метаболитам кислорода. Кроме того, эозинофилы обладают и фагоцитарной активностью, но меньшей, чем у макрофагов и нейтрофилов. Несмотря на то, что в эозинофилах, как и в нейтрофилах, не удалось выявить классических рецепторов прогестерона, было показано, что прогестерон подавляет эстроген-стимулированную эозинофилию [34, 90]. Кроме того, было установлено, что прогестерон инициирует дегрануляцию эозинофилов [53]. Моноциты и макрофаги. Моноциты фагоцитирующих и макрофаги являются мононуклеаров. Их основными основными клетками функциями системы являются: фагоцитарная защита организма против микробной инфекции, токсическое действие на паразитов, антиген-презентация, участие в иммунном ответе организма и воспалении; усиление регенерации тканей, противоопухолевая защита, регуляция гемопоэза, фагоцитоз старых и поврежденных клеток крови, секреция различных цитокинов и факторов роста. 28 В моноцитах и макрофагах выявлены как ядерные, так и мембранные рецепторы прогестерона [39, 94]. Выявлено, что прогестерон оказывает подавляющее действие на функции макрофагов, например, угнетая выработку оксида азота, ФНО-альфа, TLR4 и TLR9 - индуцированную выработку IL-6, экспрессию TLR4, рецептора Fcγ и активацию NF-kappaB [53, 94, 98,]. Т-лимфоциты. Т-лимфоциты функциональном представляют отношении собой клеток, сложную систему объединяемых различных в происхождением и присутствием на поверхности общего антигена – тимусного человеческого лимфоцитарного антигена. Они участвуют в реакциях клеточного иммунитета: аллергических реакциях замедленного типа, реакции отторжения трансплантата и других, обеспечивают противоопухолевый иммунитет. Т-лимфоциты разделяют на два основных подкласса (CD4+ и CD8+). CD4+ лимфоциты, к которым относятся: Т-хелперы первого (Th1) и второго (Th2). Т-хелперы первого типа, отвечают за созревание Т-цитотоксических лимфоцитов (Т- киллеров), активируют Т- хелперы 2 типа и цитотоксическую функцию макрофагов, секретируют IL-2, IL-3 и другие цитокины; Т-хелперы 2 типа обеспечивают пролиферацию и дифференцировку В- лимфоцитов в антителпродуцирующие клетки, тормозят функцию Т-хелперов 1 типа и секретируют IL-4, IL-5 и IL-6. К CD8+ лимфоцитам относятся цитотоксические Т-лимфоциты. Их основной функцией является распознавание и лизис клеток-мишеней, несущих чужеродные антигены или измененные аутоантигены. В Т-лимфоцитах идентифицированы как внутриклеточные рецепторы, так и мембранные рецепторы прогестерона [39, 54, 78,]. Исследования показали, что прогестерон способствует подавлению Т-клеточной пролиферации через быстрое 29 негеномное ингибирование Na+/H+-переносчик 1 типа, через блокаду калиевых каналов, а также внутриклеточные рецепторы [41,46, 53]. Было показано, что прогестерон подавляет пролиферацию дифференцировку и функцию Th1/Th17-лимфоцитов, стимулируя при этом диференцировку Th2 и Treg и выработку антител Th2, таким образом, сдвигая равновесие Th1/ Th2 в сторону Th2 [64, 73, 107]. Продемонстрировано, что прогестерон ингибирует экспрессию IFN- γ и IL-17, стимулируя IL-10 и IL-4, и оказывает противовоспалительный эффект [70, 94]. Известно, что прогестерон подавляет цитолитическую активность CD8+ Тлимфоцитов непосредственно, действуя через mPR, или опосредованно, через индукцию белка GdA, ингибитора CD8+ T-клеточной-активности [53]. При этом активированные CD8+ T- лимфоциты вырабатывают под действием прогестерона такие иммунорегуляторные молекулы, как индоламин-2,3-диоксигеназа (IDO) и прогестерон-индуцированный блокирующий фактор (PIBF), которые: способствует индукции Treg и подавлению NK-клеток, соответственно [45,53]. Также PIBFспособен угнетать активацию STAT4-белка и активировать STAT6 в лимфоцитах, тем самым стимулируя выработку противовоспалительных нецитотоксических цитокинов IL-3 , IL-4, IL-10, и снижая продукцию провоспалительных факторов - IL-2, IL- 12, IFN-delta, TNF-alpha[45, 53, 107]. B-лимфоциты. B-лимфоциты способны вырабатывать антитела к разным антигенам и являются основными эффекторами гуморального иммунитета. От других клеток их можно отличить по наличию иммуноглобулинов на клеточной мембране. В В-лимфоцитах также найдены рецепторы прогестерона [39, 53]. Так, показано, что прогестерон стимулирует первичные и вторичные реакции антител, подавляет B-клеточную рекомбинацию и соматическую, способствует важным посттрансляционным модификациям молекул иммуноглобулинов, изменяя их авидность и эффекторные функции [53, 81]. 30 В целом, можно представить действие прогестерона на иммунную систему в виде таблицы 3. Таблица 3. Влияние прогестерона на клетки иммунной системы (по [53]) Клетки Эффект выделение супероксида Гранулоциты нейтрофилы апоптоз хемотаксис эозинофилы Естественные киллеры (NK-клетки) дегрануляция апоптоз цитотоксичность выделение IFN-γ выделение NO Макрофаги продукция TNF-α экспрессия TLR экспрессия CD40,CD80,CD86, МНС класса II Дендритные клетки продукция IL-6, IL-12, IL-1α, IL-1β, IL-12, IFN-γ и TNF-α выделение IL-10 пролиферация дифференцировка Тh2/ Treg CD 4+ дифференцировка Th1/Th17 выработка IFN-γ Т-клетки продукция IL-10 и IL-4 цитолитическая активность CD 8+ выработка IFN-γ продукция PIBF Направление эффекта 31 продукция антител при первичном и вторичном B-клетки иммунном ответе Т-зависимая продукция антител Таким образом, прогестерон является важным иммунорегуляторным стероидным гормоном, который играет важную роль в поддержании нормального функционирования иммунной системы. В последнее время использование мононуклеарной фракции клеток периферической крови нашло широкое применение в качестве удобной и доступной клеточной модели для исследования свойств лигандов и рецепторов прогестерона [109]. Практически все соматические и эндокринные заболевания сопровождаются изменением функционирования иммунной системы с разной степенью выраженности. Как следствие, не удивительно, что терапевтическое действие лекарственных препаратов кроме основного влияния на клетки - мишени могут оказывать терапевтическое действие через модуляцию функции иммунитета. Основными препаратами при лечении гиперпластических процессов эндометрия являются лиганды рецепторов прогестерона, поэтому прегна-D’пентараны могут помочь в создании соединений с высокой активностью и специфичностью. Поскольку именно рецепторы опосредуют действие лигандов, в данном случае стероидных гормонов, они могут быть использованы как молекулярные мишени для создания высокоэффективных соединений. 1.3. Гиперпластические процессы эндометрия. Гиперпластические процессы эндометрия представляют собой патологическую диффузную или очаговую пролиферацию железистого или 32 стромального компонентов слизистой оболочки матки с преимущественным поражением железистых структур [16]. Они включают в себя гетерогенную группу патологических процессов, включающих изменения от поликлональной пролиферации клеток эндометрия до моноклональных разрастаний генетически изменённой ткани с высоким риском малигнизации [28]. Известно, что гиперпластические процессы эндометрия часто служат фоном для возникновения рака тела матки. В настоящее время можно выделить несколько основных классификаций гиперпластических процессов эндометрия. Данным заболеваниям присвоены следующие коды МКБ-10: полип – N84.0, железистая гиперплазия – N85.0, аденоматозная гиперплазия – N85.1, рак эндометрия - C54.1, D07.0. В России гиперплазий наиболее эндометрия распространена гистологическая на основе классификации ВОЗ классификация 1975 года и модифицированная Б.И. Железновым в 1980 г. [7, 16]. В соответствии с этой классификацией выделяют: эндометриальные полипы (железистые, железистофиброзные, фиброзные, аденоматозные) и гиперплазии эндометрия (железистая, железисто-кистозная, аденоматозная). Термины «атипическая» и «аденоматозная гиперплазия» используются как синонимы, но первый употребляется применительно к диффузным поражениям эндометрия, а второй – к локальным процессам [14]. Железистая и железисто-кистозная гиперплазия считаются качественно однотипными процессами, отличающимися выраженностью пролиферации желез и стромы. Международным признанием пользуется классификация, предложенная ВОЗ в 1994 г. [91]. Ее основополагающим таксономическим фактором является наличие клеточной атипии. По этому признаку выделяют две группы – гиперплазию эндометрия без атипии и гиперплазию эндометрия с атипией (атипическая гиперплазия), каждая из которых подразделяется в зависимости от степени структурного изменения эндометрия на простую и сложную гиперплазии. 33 Отличием от классификации Б.И. Железнова является то, что полипы эндометрия не входят в эту классификацию и рассматриваются как опухолевидные образования слизистой тела матки, не имеющие признаков патологической пролиферации; исключение составляет лишь аденоматозный полип, который представляет собой форму сложной гиперплазии с наличием или отсутствием атипии. Основным признаком, отличающим атипичную гиперплазию, как простую, так и сложную, от типичной гиперплазии эндометрия, является атипия клеток желез, проявляющаяся в утрате полярности расположения и в необычной форме ядер, которые часто приобретают округлую форму [28]. Существует еще несколько классификаций гиперпластических процессов, например, гистологическая классификация, в соответствии с которой все преинвазивные поражения эндометрия, к которым относятся образцы атипической гиперплазии и высоко дифференцированной аденокарциномы, предлагается объединить понятием “эндометриальная внутриэпителиальная неоплазия” (EIN), а остальные гистологические варианты простой и сложной гиперплазии – понятием “эндометриальная гиперплазия”, или “доброкачественная эндометриальная гиперплазия” [58, 76]. Атипические гиперплазия эндометрии занимают промежуточное положение между обычными формами железистой гиперплазии эндометрия и раком, и относится к предраковым процессам эндометрия. Известно, что при наличии железистой и железисто-кистозной формы гиперплазии риск развития рака матки составляет 1-3%, простой атипической гиперплазии - 8%, сложной атипической гиперплазии - 29%; при этом в постменопаузе этот риск выше, чем в другом возрасте [16]. Согласно гистологической классификации, рак тела матки обычно представлен следующими формами [16]: аденокарциномой, муцинозным раком, папиллярным серозным раком, светлоклеточным раком, плоскоклеточным раком, 34 недифференцированным раком. При этом рак эндометрия в подавляющем большинстве представлен аденокарциномами, составляющими 85-99% [15]. Наряду с гистологической классификацией различают два патогенетических варианта аденокарциномы: гормонзависимый (I тип, эндометриоидные аденокарциномы) и автономный (II тип – неэндометриоидные аденокарциномы), встречающийся в 20-30% случаев [14, 29, 87]. В патогенезе эндометриоидных аденокарцином эндометрия играет роль длительная гиперэстрогения, им предшествуют возникновения гиперпластических процессов; как правило, это высокодифференцированные опухоли с медленной прогрессией и поверхностной миометриальной инвазией, чувствительные к гормональной терапии. Они имеют следующие факторы риска: ожирение, бесплодие, отсутствие родов в анамнезе, позднюю менопаузу, сахарный диабет, артериальную гипертензию, наследственную отягощенность по раку с эндокринно-метаболическим патогенезом, гормонопродуцирующие опухоли яичника, заместительную монотерапию эстрогенами в постменопаузе, применение тамоксифена [16, 87]. Неэндометриоидные аденокарциномы эндометрия возникают на фоне атрофии эндометрия без гиперэстрогении и при отсутствии обменно- эндокринных нарушений и характеризуются низкой дифференцировкой, быстрой прогрессией и глубокой миометриальной инвазией [16, 87]. Считается, что в развитии автономной аденокарциномы играет роль выраженная депрессия Тсистемы иммунитета на фоне нарушений адаптационного гомеостаза и гиперкортицизма; данная форма аденокарцином чаще развивается у женщин без предшествующих гиперпластических процессов эндометрия [16]. Существующие гистологическая и патогенетическая классификации охватывают практически все встречающиеся в клинике формы аденокарцином. Гиперпластические процессы эндометрия часто протекают бессимптомно – лишь у 64% больных они сопровождаются клиническими признаками в 35 постменопаузе, что способствует позднему выявлению патологии [18]. Однако, по приведенным ниже скрининговым исследованиям, можно оценить частоту встречаемости и соотношение разных типов гиперпластических процессов эндометрия. Полипы эндометрия обнаруживаются у 5 - 25% гинекологических больных, причем наиболее часто в пре- и постменопаузе [14]. За 1985–2003 гг. в США было обследовано более 530 тысяч женщин в возрасте 18-90 гиперплазий лет [85]. эндометрия Согласно этому составляет исследованию, приблизительно 133 встречаемость на 100000 обследованных женщин в возрасте 18-90 лет, пик частоты встречаемости гиперпластических процессов эндометрия приходится на возраст 50-54 года и реже всего – у женщин моложе 30 лет. Распределение по распространенности разных типов гиперплазий следующее: простая гиперплазия – 58 на 100000, сложная – 63 на 100000, атипическая – 17 на 100000. При этом простая и сложная гиперплазии эндометрия чаще встречаются в 50-54 года, тогда как атипические гиперплазии – в 60-64 года. Также наблюдается снижение частоты встречаемости гиперпластических процессов после 69 лет, что более характерно для атипической гиперплазии эндометрия. Рак эндометрия является наиболее частым из злокачественных опухолей женских половых органов среди жителей Северной Америки и высокоразвитых стран Европы. Характерным является преобладание заболеваемости среди населения больших городов по сравнению с сельским [24]. Аденокарцинома возникает в основном в постменопаузе, средний возраст пациенток составляет 6062 года [16, 30, 52]. В США рак тела матки занимает первое место среди онкогинекологических заболеваний женской половой сферы: только в 2011 году там было зарегистрировано 46 470 случаев рака тела матки, заболеваемость составляла 24,1 на 100 000 женщин за 2004-2009 года, смертность – 4,2 на 100 000 женщин [52]. 36 Тенденция к росту заболеваемости продолжает расти: предполагается, что в 2013 году будет выявлено 49 560 случаев рака эндометрия, и 8 190 случаев смертельного исхода [52]. В Западной Европе рак эндометрия занимает 7-е место среди причин смертности от злокачественных новообразований и составляет 1-2% от всех смертей вследствие раковых заболеваний. Около 81 500 женщин в Европейском Союзе заболевают раком эндометрия каждый год, и тенденция к росту заболеваемости продолжает увеличиваться [84]. В структуре онкологической заболеваемости женского населения России рак тела матки занимает третье место среди онкологических патологий у женщин (после опухоли молочной железы и новообразований кожи). В 2011 году в России было зарегистрировано 20 469 случаев данной патологии (летальность на первом году составила 10,4%) [31]. В целом заболеваемость составляет 14,83 на 100 000 женского населения [30]. В последние годы отмечен рост заболеваемости гиперпластическими процессами и раком эндометрия [16], что связывают как с увеличением средней продолжительности жизни, с неблагоприятной экологической обстановкой, ростом числа хронических соматических заболеваний, со снижением иммунитета у женщин и «омоложением» патологии. Например, в России за 1997-2007 гг. наибольший прирост заболеваемости гиперпластических процессов тканей тела матки отмечен у лиц до 29 лет — за 10 лет на 50% [16, 30]. Таким процессами образом, увеличение эндометрия консервативной терапии говорит и заболеваемости о гиперпластическими необходимости повышения резерва социально-экономической значимости данных патологий. Хотя даже до настоящего времени этиология гиперпластических заболеваний эндометрия неизвестна, ведущее место в развитии данных патологий эндометрия принадлежит гормональным нарушениям в виде абсолютной или 37 относительной гиперэстрогении, при отсутствии или недостаточном влиянии прогестерона. Причинами гиперэстрогении могут стать: ановуляция при персистенции или атрезии фолликулов; гиперпластические процессы или гормонопродуцирующие опухоли яичников; нарушение гонадотропной функции гипофиза; гиперплазия коры надпочечников; некорректное применение гормональных препаратов (эстрогены, антиэстрогены) и другие. Согласно современным представлениям, эстрогены и/или их производные могут быть как промоторами (митогенами), так и инициаторами (генотоксическими агентами) многоступенчатого процесса канцерогенеза [3]. Несмотря на важную роль гиперэстрогении, гипер- и неопластические процессы эндометрия могут развиваться и при нормальных гормональных соотношениях и даже дефиците эстрогенов [16, 99]. Так, определенное значение отводится нарушениям тканевой рецепции половых стероидов в ткани эндометрия, например, изменение связывающей активности или количества рецепторов половых стероидов на клетках-мишенях. Помимо гормональных нарушений в патогенезе таких патологий, как полипы, гиперплазии и аденокарциномы эндометрия играют значимые роли нарушения эндокринной, нервной и иммунной систем, которые неразрывно связаны друг с другом, поэтому нарушение одной из систем оказывает непосредственное воздействие на другие [16, 26]. Косвенным доказательством этого служат частые сочетанные патологии: у пациенток с гиперпластическими процессами слизистой матки нередко наблюдаются ожирение, гиперлипидемия, сахарный диабет, артериальная гипертензия, снижение иммунитета. Учитывая отсутствие полной картины этиологии ГПЭ, невозможно определить причинноследственные отношения выявленных звеньев этиопатогенеза пролиферативных процессов эндометрия. Выяснение этих связей является задачей будущих исследований. 38 Иммунологическим аспектам гиперпластических заболеваний матки посвящено множество различных исследований, в результате которых было продемонстрировано нарушение надзорных функций иммунной системы [22]. Так, при гипер- и неопластических процессах эндометрия выявлено в крови абсолютное или относительное снижение количества Т- и В-лимфоцитов, появляется большое количество лимфоцитов с блокированными рецепторами. Кроме того, происходит угнетение функциональной активности иммунокомпетентных клеток: например, при раке эндометрия отмечаются существенные нарушения Т-клеточного иммунитета, проявляющиеся снижением функции вилочковой железы, появлением в циркуляции незрелых Т-лимфоцитов, нарушением баланса субпопуляций Т-лимфоцитов, а именно активацией супрессоров и угнетением хелперов, снижением активности естественных киллеров [16]. Таким образом, прогестерон является важным иммунорегуляторным стероидным гормоном, и, вместе с его рецепторами, играет важную роль как в поддержании нормального функционирования иммунной системы, так и в патогенезе таких заболеваний, как аутоиммунные и гиперпластические процессы гормон-чувствительных тканей. 1.4. Рецепторы половых стероидов в ткани эндометрия. Несмотря на неоднозначность сведений об уровнях рецепторов прогестерона и эстрадиола в патологически измененном эндометрии, многие исследователи отмечают зависимость между уровнем рецепторов и формой патологии [14]. Рассмотрим более подробно плотность рецепторов прогестерона и эстрадиола у женщин при гипер- и неопластических процессах эндометрия. При полипах эндометрия. При изучении экспрессии рецепторов прогестерона и эстрадиола в железистой и стромальной тканях полипов и неизмененного эндометрия было 39 показано, что изменения в основном затрагивают железистую ткань, нежели стромальную [12, 14, 67]. Данные исследований по изменениям в ткани полипов у женщин в постменопаузе однозначны и говорят об увеличении уровня рецепторов как эстрадиола, так и прогестерона [44, 51, 56]. При анализе рецепторного профиля ткани полипов эндометрия, можно сказать, что оверэкспрессия как рецепторов эстрадиола, так и прогестерона в слизистой матки это скорее компенсаторная реакция ткани на гиперэстрогению, нежели собственные генетические изменения полипозной ткани. При гиперплазиях эндометрия. При изучении рецепторного профиля гиперплазий эндометрия исследователи разделяют гиперплазии эндометрия на атипичные и типичные, при этом исследования проводятся у женщин независимо от возраста. При простой и сложной гиперплазиях практически все исследователи сходятся во мнении, что при данных патологиях увеличиваются уровни рецепторов эстрадиола, в частности, ERα, по сравнению с неизмененным эндометрием, что более выражено при сложных гиперплазиях эндометрия [13, 82, 83]. Представленность же рецепторов прогестерона по сравнению с контрольной группой по данным разных авторов может быть как сниженной [83], так и повышенной [13, 69, 104]. При атипической гиперплазии все исследователи отмечают снижение уровней рецепторов эстрадиола, в основном ERα [36, 83, 88], и рецепторов прогестерона по сравнению как с неизмененным эндометрием, так и с неатипическими формами гиперплазии эндометрия [82, 83, 88]. Подводя итоги по рецепторному профилю ткани гиперплазий эндометрия, можно сказать, что здесь ситуация неоднозначна - с одной стороны, продолжается гиперэкспрессия рецепторов эстрадиола как компенсаторная реакция, аналогично 40 полипозной ткани, с другой стороны, наблюдаются изменения уровней рецепторов прогестерона от повышения, как при полипах эндометрия, до снижения, что может быть объяснено мутациями и началом ухода от гормонального контроля ткани гиперплазии. При атипической же гиперплазии наблюдается очень значительное снижение уровней рецепторов и эстрадиола, и прогестерона, что уже говорит о снижении гормонального контроля над клеточной популяцией данной патологии. При аденокарциноме эндометрия. В исследованиях рецепторного профиля в ткани аденокарциномы эндометрия обычно не разделяют пациенток по возрастному критерию. При раке эндометрия продемонстрировано снижение уровня относительно неизменной ткани как рецепторов эстрадиола [36, 77, 79], в особенности, ERα [40, 80, 93], так и рецепторов прогестерона [36, 40, 77], однако, относительно уровня PR-B при аденокарциноме эндометрия мнения неоднозначны [36, 93]. Также было показано, что при раке эндометрия в ткани снижается в основном количество рецепторов эстрадиола, а не прогестерона [63, 72, 95]. При аденокарциноме эндометрия исследователями отмечено снижение показателя ERα/ERβ относительно неизменённой ткани эндометрия [59, 77]. Можно отметить, что чем выше концентрация рецепторов прогестерона и эстрадиола в ткани, тем более благоприятный прогноз при раке эндометрия: степень злокачественности (G по FIGO) обратно пропорциональна уровню рецепторов эстрадиола [66, 97, 111], в частности, ERα [43, 62, 77], и рецепторов прогестерона [66, 111] в эндометрии; на поздних стадиях аденокарциномы эндометрия иследователи отмечают значительное снижение уровней рецепторов эстрадиола [97, 100, 111], в частности, ERα [62, 66] и прогестерона [66, 97, 100]; 41 степень миометриальной инвазии аденокарциномы эндометрия обратно пропорциональна уровню рецепторов эстрадиола [60, 97, 111] и прогестерона [60, 95, 97] в клетках эндометрия. выживаемость пациентов с раком эндометрия выше при наличии рецепторов эстрадиола и прогестерона в измененной ткани матки [71, 100, 106]. уровни рецепторов прогестерона и эстрадиола обратно пропорциональны частоте рецидивирования [71, 100] и метастазирования опухолевых клеток в лимфоузлы [57]. Необходимо также отметить, что помимо информации о значении классических ядерных рецепторов половых стероидов в развитии патологий гормон-чувствительных тканей появляются данные о важной роли мембранных рецепторов в этих процессах. Так, гиперэкспрессия мембранного рецептора эстрадиола mER, чаще встречается в опухолях с высоким риском миометриальной инвазии, поздней стадией развития, высокой степенью злокачественности и агрессивности и низкой выживаемостью пациенток [92]. Подводя итоги по экспрессии рецепторов эстрадиола и прогестерона в ткани аденокарциномы эндометрия, можно сказать, что в опухолевой ткани происходит потеря рецепторов к половым стероидам и тем самым опухоль перестает отвечать на регуляторные сигналы и становится более автономной. В целом, направление и выраженность изменений экспрессии рецепторов прогестерона и эстрадиола при разных гиперпластических процессах и аденокарциноме эндометрия относительно неизменённой ткани у пациенток вне зависимости от возраста приведены в таблице 4. Таблица 4. Уровни рецепторов прогестерона и эстрадиола при гиперпластических процессах эндометрия относительно неизмененной ткани. 42 Рецепторы половых стероидов Патология эндометрия гиперплазия полипы аденотипичная атипичная карцинома ER PR Примечание: ER – рецепторы эстрадиола, PR- рецепторы прогестерона. Таким образом, самая противоречивая патология с точки зрения экспрессии рецепторов эстрадиола и прогестерона - гиперплазия эндометрия без атипии. Лечение гиперпластических процессов эндометрия. 1.5. Тактика лечения пациенток с гиперпластическими процессами слизистой оболочки матки определяется многими факторами: возрастом пациентки, характеристиками патологического процесса, этиопатогенеза заболевания, сопутствующими гинекологическими и экстрагенитальными заболеваниями. Основными целями терапии является остановка кровотечения, восстановление менструальной функции в репродуктивном периоде или достижение стойкой менопаузы в более старшем возрасте и профилактика рецидивов гиперпластического процесса. Консервативные методы лечения гиперплазий эндометрия включают в себя применение прогестинов, антигонадотропные комбинированных препараты, агонисты пероральных контрацептивов, гонадолиберина. Основными направлениями в гормональной терапии являются: 1. местное действие, направленное эндометрия, приводящее к его атрофии; на подавление пролиферации 43 2. центральное действие, направленное на подавление выделения гонадотропных гормонов гипофиза и, как следствие, - торможение стероидогенеза в яичниках [14]. Первым этапом лечения гиперплазии эндометрия является раздельное лечебно-диагностическое выскабливание матки под контролем гистероскопии. Гормональное лечение (второй этап) назначают только после получения результатов гистологического исследования удаленного эндометрия [14, 15]. Используемые при гиперпластических процессах эндометрия гормональные препараты можно разделить на несколько групп [14]: гестагены (прогестерон и его производные: дидрогестерон, медроксипрогестерона ацетат и другие) – подавляют пролиферацию, вызванную эстрогенами, и способствуют дифференцировке; аналоги гонадолиберинов (бусерелин, гозерелин) - подавляют секрецию лютеинизирующего и фолликулостимулирующего гормонов при длительном применении, снижают секрецию эстрогенов в яичниках и способствуют атрофии эндометрия; комбинированные пероральные контрацептивы (например, дезогестрел+этинилэстрадиол), содержащие эстроген-гестагенные препараты. При лечении больных с дисфункциональными маточными климактерическими кровотечениями и гиперплазией эндометрия могут быть также использованы препараты андрогенных гормонов. Кроме того, применяют негормональный консервативный подход к лечению гиперпластических процессов эндометрия, включающий: диеты, коррекцию обменно-эндокринных нарушений (метионин, линетол), вещества, нормализующие водно-электролитный обмен (спиронолактон, аспарагинаты магния или калия), средства для улучшения состояния центральной нервной системы (циннаризин, пирацетам), витамины, иммуномодуляторы, седативные 44 препараты [14].Это подтверждает вовлечение различных органов и тканей в патогенез гиперплазии эндометрия. Кроме того, перед решением вопроса о целесообразности гормонотерапии необходимо убедиться в чувствительности опухоли к прогестагенам, обращая внимание на степень дифференцировки опухоли, содержание рецепторов эстрогена и прогестерона и патогенетический тип заболевания. С другой стороны, повысить эффективность терапии гиперпластических процессов эндометрия можно созданием новых соединений, обладающих, с одной стороны, более высокой активностью по отношению к гиперплазированной ткани эндометрия и, с другой стороны, оптимальным профилем безопасности. Прегна-D’-пентараны являются высокоактивными соединениями с разделенными биологическими функциями в зависимости от модификаций их молекулы, что делает их перспективными для дальнейшего применения в клинике в качестве активных гестагенов. А поскольку основными препаратами при лечении гиперпластических процессов эндометрия являются лиганды рецепторов прогестерона, то прегна-D’-пентараны могут помочь в создании соединений с высокой противоопухолевой активностью. 1.6. Заключение. Подводя итоги, можно сказать, что, несмотря на наличие сведений о роли иммунной системы в этиопатогенезе гиперпластических процессов эндометрия, сведений о рецепторном профиле иммунокомпетентных клеток периферической крови при развитии гормон-зависимых патологий достаточно мало. Поэтому необходимо продолжить изучение рецепторного профиля мононуклеарных клеток периферической крови пациенток при развитии различных патологий тканей матки, что может позволить более глубоко изучить роли рецепторов эстрадиола и прогестерона в этиопатогенезе гиперпластических процессов эндометрия для 45 решения фундаментальных и прикладных проблем. Кроме того, поиск и анализ новых лекарственных соединений является перспективным направлением для повышения эффективности и резерва консервативной терапии гормон-зависимых патологий эндометрия. 46 ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ. 2.1.Материалы для исследования 2.1.1. Используемые реактивы. 1. физиологический раствор, 0,9% раствор натрия хлорида («Биосинтез», Россия); 2. раствор фиколла, ρ=1,077 г/см3 («ПанЭко», Россия); 3. реактивы набора "Рибо-преп" («AmpliSens», Россия); 4. реактивы набора "Реверта-L" («AmpliSens», Россия) ; 5. реактивы "Реакционная смесь 2,5х для проведения ПЦР-РВ в присутствии SYBR Green I" («Синтол», Россия); 6. праймеры для полимеразной цепной реакции («Синтол», Россия); 7. среда DMEM с глутамином и гентамицином («ПанЭко», Россия); 8. сыворотка крови эмбриональная телячья («ПанЭко», Россия); 9. трис-аминометан (TRIS) («Merck», Германия); 10. ЭДТА («Sigma», США); 11. трипановый синий («ПанЭко», Россия) 12. дитиотрейтол (DTT) («Calbiochem», Англия); 13. сцинтилляционная жидкость Ultima Gold AB («PerkinElmer», США); 14. [1,2,6,7]3Н-Р4 («GE Healthcare Ltd», Англия); 15. прогестерон («Merck», Германия); 16. гидрокортизон («Merck», Германия); 17. декстран Т-70 («Pharmacosmos», Дания) 18. глицерин («ПанЭко», Россия); 19. 3-(4,5-диметилтиазолил-2)-2,5-дифенилтетразолиум бромид (МТТ) («Sigma», США); 47 20. ДМСО (диметилсульфоксид) («Serva», Германия); 21. набор реагентов для иммуноферментного определения концентрации фактора некроза опухолей типа альфа в сыворотке крови «альфаФНО-ИФА-БЕСТ» («Вектор-БЕСТ», Россия); 2.1.2. Используемое оборудование. 1. центрифуга РС-6 («ТНК Дастан», Киргизия); 2. центрифужные пробирки из полистирола на 10 мл («F.L. Medical», Италия); 3. камера Горяева; 4. пробирки микроцентрифужные типа Эппендорф стерильные на 1,5 и 0,2 мл; 5. автоматические дозаторы Thermo на 1000, 200 и 10 мкл («Ленпипет», Россия); 6. термостат электрический суховоздушный ТС-80М («МЕДЛАБОРТЕХНИКА», СССР); 7. насадки для микропипеток на 1000, 200 и 10 мкл с/без аэрозольного барьера; 8. вортекс MicrospinFV-2400 («BioSan», Латвия); 9. микроцентрифуга Eppendorf mini spin («Eppendorf», Германия); 10. термостат Гном («ДНК-Технология», Россия); 11. амплификатор iCycler iQ5 real-time PCR («BioRad», Германия); 12. ламинарный бокс («LS», Россия); 13. микроскоп Биолам П2-1(«ЛОМО», Россия); 14. плоскодонные и круглодонные 96-луночные планшеты («Медполимер», Россия); 15. стеклянные фильтры Whatman GF/B (Whatman Grade GF/B Glass Microfiber Filters) («GE Healthcare Ltd», GB); 16. анализатор иммуноферментных реакций "УНИПЛАН" АИФР-01 48 («Пикон», Россия); 17. сцинтилляционные флаконы («PerkinElmer», США); 18. жидкостной сцинтилляционный альфа-бета радиометр «Tri-carb 3110» («PerkinElmer», США). 2.1.3. Объекты исследования. В исследовании использованы образцы периферической крови 110 пациенток репродуктивного и постменопаузального возраста, наблюдавшихся в период в 2008-2014 годов в гинекологической клинике кафедры акушерства и гинекологии педиатрического факультета РНИМУ им. Н.И. Пирогова (зав. академик РАН, профессор Савельева Г.М.) врачами к.м.н. Мартиросян К. А. и Ивановской Т.Н., и проходивших плановое обследование в отделении гинекологической эндокринологии МОНИИАГ (директор – чл.–корр. РАН, профессор Краснопольский В.И.) врачом Горенковой О.С. Перед включением в исследование пациенток у каждой получено информированное согласие на участие. Условиями включения в исследование явились: неиспользование гормональных препаратов в течение 3 последних месяцев, тяжелая соматическая патология и выраженные метаболические нарушения в стадии декомпенсации. Возраст пациенток репродуктивного возраста составил в среднем 39,1 ± 11,9 года. Возраст больных постменопаузального возраста составил в среднем 63,7 ± 9,2 года, длительность менопаузы варьировала от 2 до 40 лет – 13,9 ± 9,8 лет. Пациентки постменопаузального возраста были разделены на две группы: в контрольную (I) были включены 40 больных без гинекологической патологии, тяжелых соматических заболеваний и выраженных метаболических нарушений; в основную (II) вошли 53 пациентки с гиперпластическими процессами: с полипами, гиперплазией и аденокарциномой эндометрия. 49 Распределение пациенток постменопаузального возраста в зависимости от результатов гистологического исследования эндометрия представлено на диаграмме 1. Диаграмма 1. Состав исследуемой группы пациенток постменопаузального возраста по характеру патологии эндометрия (n = 96). аденокарцинома 18% железистаяи железистокистозная гиперплазия 12% без гинекологических патологий 31% железистофиброзные полипы 39% Забор крови у больных репродуктивного возраста производили из локтевой вены в пролиферативную фазу менструального цикла. Забор крови из локтевой вены у пациенток основной группы производили перед оперативным вмешательством, а у контрольной группы – натощак. Культуры клеток HeLa (эпителиоидный рак шейки матки человека), MOLT4 (Т-клеточный лейкоз человека) получены из банка клеток Всероссийского научного центра молекулярной диагностики и лечения (директор – чл.-кор. РАН, профессор Северин Е.С.). 50 Восемь прегна-D’-пентаранов были синтезированы и любезно предоставлены сотрудниками лаборатории химии стероидов и оксилипинов N22 д.х.н., профессором Левиной И.С. и д.х.н., профессором Камерницким А.В. (зав. д.х.н. И.В. Заварзин) Института органической химии им. Н.Д. Зелинского РАН. Структуры полученных лигандов рецептора прогестерона представлены в таблице 5. Таблица 5. Положение и структура заместителей в прегна- D’-пентаранах. №№ Стероид P4 прогестерон D′ Двойная X Y - O C 4,5 -(CH2)4- H,OH C 4,5 (16α,17α) связь 6(E)-гидроксииминоК-1044 16α,17α-циклогексанопрегн-4-ен-3-ол-20-он R1 H2 (E) NOH 51 6(E)-гидрокси-иминоК-1045 16α,17α-циклогексано- O C 4,5 -(CH2)4- H,OH C 4,5 -(CH2)4- O C 4,5 -CH2- O C 4,5 H2 -(CH2)4- O O 5,6 H2 O C 4,5 H2 O C 4,5 H2 прегн-4-ен-3,20-дион 6(E)-метокси-иминоК-1046 16α,17α-циклогексанопрегн-4-ен-3-ол-20-он 6(E)-метокси-имино- К-1047 16α,17α-циклогексанопрегн-4-ен-3,20-дион К-338 К-1036 16α,17α-циклопропанопрегн-4-ен-3,20-дион 16α,17α-циклогексано-4оксапрегн-5-ен-3,20-дион (E) -(CH2)4- NOH (E) NOCH3 (E) NOCH3 3′-Фенил[16α,17α]К-1030 циклопропанопрегн-4-ен- -CH2-С6H5 3,20-дион 3′-п-ФторфенилК-1039 [16α,17α]-цикло- -CH2- пропанопрегн-4-ен-3,20- С6H4F дион 2.1.4. Дизайн исследования. Исследование влияния прегна-D’-пентаранов на мононуклеарную фракцию клеток периферической крови проводили согласно схеме 1. Схема 1. 52 Последовательность экспериментов по оценке влияния лигандов рецепторов прогестерона на мононуклеарную фракцию клеток периферической крови. ПЕРИФЕРИЧЕСКАЯ КРОВЬ СЕДИМЕНТАЦИЯ В ГРАДИЕНТЕ ПЛОТНОСТИ ФИКОЛЛА (45 мин, 2000 об/мин, 40С) МОНОНУКЛЕАРНАЯ ФРАКЦИЯ КЛЕТОК ИНКУБАЦИЯ С ПРЕГНА-DПЕНТАРАНАМИ, ПРОГЕСТЕРОНОМ И 3НПРОГЕСТЕРОНОМ ИНКУБАЦИЯ С ПРЕГНА-DПЕНТАРАНАМИ И ПРОГЕСТЕРОНОМ 0 (60 мин, 37 С, концентрация соединений - 10-8М) ЖИДКОСТНАЯ СЦИНТИЛЛЯЦИОННАЯ РАДИОМЕТРИЯ ОПРЕДЕЛЕНИЕ СПЕЦИФИЧЕСКОГО СВЯЗЫВАНИЯ ПРЕГНА-DПЕНТАРАНОВ С ПРОГЕСТЕРОНСВЯЗЫВАЮЩИМИ УЧАСТКАМИ (72 ч, 370С, концентрация соединений - 10-8М) КЛЕТКИ МТТ-ТЕСТ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЖИЗНЕСПОСОБНОСТИ КЛЕТОК ВЫДЕЛЕНИЕ МРНК МЕТОДОМ ПРЕЦИПИТАЦИИ ПОЛУЧЕНИЕ КДНК РЕАКЦИЕЙ ОБРАТНОЙ ТРАНСКРИПЦИИ СУПЕРНАТАНТ ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ В РЕАЛЬНОМ ВРЕМЕНИ ИММУНОФЕРМЕНТНЫЙ АНАЛИЗ ОПРЕДЕЛЕНИЕ УРОВНЯ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ РЕЦЕПТОРОВ ПРОГЕСТЕРОНА И ЭСТРАДИОЛА ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОНЦЕНТРАЦИИ ФНОα 53 2.2. Методы исследования. 2.2.1. Выделение мононуклеарной фракции клеток из периферической крови. Получение мононуклеаров из периферической крови осуществляли методом центрифугирования в градиенте плотности фиколла («ПанЭко», Россия) по Boyum [38]. Кровь с гепарином (10 и 1 мл, соответственно) разводили физиологическим раствором в объемном соотношении 1 : 1. Разведенную кровь по 5 мл наслаивали на 3 мл раствора фиколла комнатной температуры (ρ=1,077 г/см3) в полистирольной центрифужной пробирке на 10 мл и центрифугировали 45 мин при 2000 об/мин и 40С на приборе РС-6 («ТНК Дастан», Киргизия). Затем автоматическим дозатором отбирали фракцию мононуклеарных клеток, находящуюся на границе плотности (рисунок 6), переносили ее в чистую центрифужную пробирку и доводили объем физиологическим раствором до 10 мл. Рисунок 6. Разделение форменных элементов крови в градиенте плотности фиколла. 54 Примечание: 1 – плазма крови, 2 – слой мононуклеарных клеток, 3 – фиколл, 4 – эритроциты. Далее полученную взвесь центрифугировали 15 мин при 1600 об/мин и 4 0С (РС-6), сливали супернатант и доводили объем физиологическим раствором до 10 мл, снова центрифугировали 15 мин при 1600 об/мин и 40С и сливали надосадочную жидкость. Оставшийся осадок (МНФК) использовали для анализа. Подсчет и анализ жизнеспособности клеток производили в камере Горяева под микроскопом Биолам П2-1(«ЛОМО», Россия) в среде DMEM («ПанЭко», Россия) с помощью красителя трипанового синего («ПанЭко», Россия). 2.2.2. Определение специфического связывания 3 Н-прогестерона с прогестерон-связывающими участками МНФК периферической крови. Изучение специфического связывания прогестерона в мононуклеарной фракции проводили с помощью конкурентного радиолигандного анализа [2].Для определения общего связывания пробы содержали 20 нМ [1,2,6,7]-3Н-Р4 («GE Healthcare Ltd», Англия) и 1мкМ гидрокортизона («Merck», Германия) в инкубационной среде. Для определения неспецифического связывания пробы дополнительно содержали 2 мкМ прогестерона («Merck», Германия). Этанол, используемый для разведения стероидов, после раскапывания в 96-луночный планшет, испаряли. Затем добавляли по 100 мкл мононуклеарной фракции клеток крови (~ 1 млн. клеток/лунка) в среде DMEM («ПанЭко», Россия), инкубировали 60 мин при 370С, после чего клеточную суспензию из каждой лунки с помощью автоматического дозатора помещали на стеклянные фильтры Whatman GF/B («GE Healthcare Ltd», GB) и промывали 100-кратным избытком ледяного ТЭД-буфера (10 мМ TRIS («Merck», Германия), 1,5 мМ ЭДТА («Sigma», США), 0,5 мМ дитиотрейтол («Calbiochem», Англия), 10% глицерина («ПанЭко», Россия), pH=7,4). Стеклянный фильтр из каждой пробы после высушивания помещали во 55 флаконы с 10 мл сцинтилляционной жидкости Ultima Gold AB («PerkinElmer», США). Все исследования проводили в триплетах. Связывание стероидных гормонов в МНФК выражали в фемтомолях гормона на млн. клеток, которое рассчитывали по формуле: N = ( T – NSB ) / ( K * С ) Примечание: N – количество рецепторов прогестерона (фмоль на 1млн. клеток); Т - средняя величина общего (в отсутствии конкурента) связывания меченого гормона в dpm (decompositions per min, распад в минуту); NSB- средняя величина неспецифического (в присутствии конкурента) связывания в аналогичной аликвоте в dpm, регистрируемых β-радиометром; K – коэффициент пересчета количества связанного гормона из dpm в фмоль, зависящий от удельной радиоактивности 3Н-прогестерона; С – концентрация клеток в лунке (100 мкл). 2.2.3. Определение специфического связывания синтетических стероидов с рецепторами прогестерона. Исследование специфического связывания прегна-D’-пентаранов с прогестерон-связывающими участками МНФ проводили аналогично определению специфического связывания прогестерона с рецепторами прогестерона, но вместо избытка немеченого прогестерона в лунки планшета вносили по 2 мкМ образцов прегна-D’пентаранов. Величину специфического связывания лигандов рецепторов прогестерона (% ингибирования специфического связывания Н 3прогестерона веществом) оценивали согласно «Руководству по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ» [27] по формуле: И= (В спец. преп./В спец. горм.)*100%, где 56 И – ингибирование специфического связывания с рецептором прогестерона препаратом, В спец. преп. – специфическое 3 Н- связывание прогестерона в присутствии препарата; В спец. горм. – специфическое связывание прогестерона в отсутствии препарата. 2.2.4. Жидкостная сцинтилляционная радиометрия. В основе метода лежит свойство β-частиц вызывать сцинтилляцию веществ в специальных средах. Это дает возможность с большой эффективностью регистрировать β-излучение, обладающее малой энергией. Для регистрации радиоактивности образцы с меченым тритием прогестероном помещали во флаконы с 10 мл сцинтилляционной жидкости Ultima Gold AB («PerkinElmer», США). Смесь перемешивали и регистрировали радиоактивность образца на жидкостном сцинтилляционном альфа-бета радиометре «Tri-carb 3110» («PerkinElmer», США). Эффективность счета для 3Н составила 64-68%. 2.2.5. Инкубация клеток с прегна-D’-пентаранами и прогестероном. Работу с клетками осуществляли в стерильных условиях – в ламинарном боксе («LS», Россия). Cпиртовые растворы прегна-D’-пентаранов и прогестерона вносили во все лунки стерильного плоскодонного 96-луночного планшета, кроме лунок контроля так, чтобы их конечная концентрация в инкубационной среде составила 10 -8 М. Этанол после раскапывания испаряли. Затем в лунки планшета добавляли по 200 мкл суспензии клеток в полной среде DMEM (среда DMEM (100 мкг/мл Lглутамина и 40 мкг/мл гентамицина сульфата) («ПанЭко», Россия) с 20 % термоинактивированной эмбриональной телячьей сыворотки («ПанЭко», Россия)), количество клеток в лунке составляло 0,1-0,5 млн. клеток. Клетки инкубировали в термостате ТС-80М («МЕДЛАБОРТЕХНИКА», СССР) при 37ºС в 57 условиях 5% СО2, во влажной среде для исключения высыхания, в течение 3-х суток. После инкубации отбирали автоматической пипеткой 100 мкл супернатанта для определения концентрации ФНО-альфа в супернатанте, оставшиеся клетки использовали для постановки МТТ-теста и выделения мРНК. 2.2.6. Оценка метаболической активности клеток (МТТ-тест). Оценку жизнеспособности клеток проводили согласно «Руководству по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ» [27]. Метод основан на способности ферментов дыхательной цепи митохондрий (сукцинатдегидрогеназ) живых клеток восстанавливать бледножелтый водорастворимый 3-(4,5-диметилтиазолил-2)-2,5-дифенилтетразолиум бромид (МТТ) в голубые кристаллы формазана, не растворимые в воде. Количество образовавшегося окислительно-восстановительных формазана процессов характеризует в клетках, интенсивность то есть их жизнеспособность. После завершения инкубации клеток с соединениями к 100 мкл суспензии клеток добавляли по 10 мкл МТТ-раствора (концентрация МТТ («Sigma», США) составляла 10 мг/мл), приготовленного на среде DMEM («ПанЭко», Россия). Затем планшеты с клетками инкубировали в термостате в течение 3 ч при 37 0С, 5% СО2. После инкубации супернатант из лунок аккуратно отбирали шприцом и вносили в каждую лунку планшета по 100 мкл ДМСО (диметилсульфоксида) («Serva», Германия), перемешивали 30 мин для растворения образовавшихся кристаллов формазана. Развитие окраски регистрировали с помощью определения оптической плотности при λ=530 нм на планшетном фотометре «Униплан» АИФР-01 («Пикон», Россия). Оптическую плотность контрольных образцов, в отсутствие исследуемых соединений, принимали за 100% жизнеспособность клеток. Погрешность измерения составила ±0,007%. 58 2.2.7. Определение уровня ФНО-α иммуноферментным анализом. Для анализа концентрации цитокина отбирали по 100 мкл супернатанта из каждой лунки планшета по окончании инкубации c веществами (п. 2.2.5.) Иммуноферментный анализ проводили согласно инструкции, прилагаемой к набору готовых реагентов альфа-ФНО-ИФА-БЕСТ («Вектор-БЕСТ», Россия). Регистрацию результатов проводили с помощью планшетного фотометра «Униплан» АИФР-01 («Пикон», Россия) при длине волны 450 нм. Погрешность измерения составила ±0,008%. 2.2.8. Выделение мРНК из клинического материала. Выделение РНК из клеток МНФК периферической крови проводили методом преципитации с помощью набора готовых реагентов "Рибо-преп" («AmpliSens», Россия) согласно инструкции производителя. 2.2.9. Реакция обратной транскрипции для получения кДНК. Получение кДНК на матрице мРНК осуществляли реакцией обратной транскрипции с использованием комплекта готовых реагентов "Реверта-L" («AmpliSens», Россия) согласно инструкции производителя. 2.2.10. Полимеразная цепная реакция в реальном времени для определения уровня экспрессии генов. Для реакции использовали набор реактивов для ПЦР "Реакционная смесь 2,5х для проведения ПЦР-РВ в присутствии SYBR Green I" («Синтол», Россия) на приборе iCycler iQ 5 real-time PCR («BioRad», Германия). В качестве контрольного гена использовали ген GAPDH. 59 Для постановки 12 реакций с праймерами для одного гена в 1,5 мл микроцентрифужные пробирки добавляли 117 мкл H2Oдд, 117 мкл MIX-смеси, 13 мкл MgCl2, перемешивали и отбирали 19 мкл полученной смеси в 200 мкл микропробирки для первого контроля. Затем в полученную смесь вносили по 24 мкл прямого и обратного праймеров (up и low), перемешивали и отбирали 23 мкл полученной смеси в 200 мкл микропробирки для второго контроля. Последовательности нуклеотидов в используемых праймерах представлены в таблице 6 («Синтол», Россия). Таблица 6. Последовательности нуклеотидов в праймерах для определения экспрессии генов мембранных и ядерных рецепторов прогестерона и эстрадиола. Прямой Обратный gaa-ggt-gaa-ggt-cgg-agt gaa-gat-ggt-gat-ggg-att-tcc mER agg-gac-aag-ctg-agg-ctg-ta gtc-tac-acg-gca-ctg-ctg-aa ERα tgc-caa-gga-gac-tcg-cta-ct ctg-gcg-ctt-gtg-ttt-caa-c ERβ tca-gct-tgt-gac-ctc-tgt-gg tgt-atg-acc-tgc-tgc-tgg-ac PR-A aaa-tca-ttg-cca-ggt-ttt-cg tac-agc-atc-tgc-cca-ctg-ac PR-B gac-tga-gct-gaa-ggc-aaa-gg cga-aac-tcc-agg-caa-ggt-gt mPR tgc-cct-gct-gtg-tga-tct-ta gat-agc-tga-ggc-tcc-tgg-at PGRmC1 tgc-cct-gct-gtg-tga-tct-ta gat-agc-tga-ggc-tcc-tgg-at GAPDH Примечание: ген сравнения – GAPDH (глицеральдегид- фосфатдегидрогеназа); mER – мембранные рецепторы эстрадиола, ERαи ERβ– ядерные рецепторы эстрадиола, mPR и PGRmC1 – мембранные рецепторы прогестерона, PR-Аи PR-В – ядерные рецепторы прогестерона. 60 После приготовления готовой реакционной смеси ее разливали по 23 мкл в 200 мкл микропробирки, добавляли по 2 мкл кДНК, тщательно перемешивали и ставили в прибор iCycler iQ5 real-time PCR («BioRad», Германия). Затем запускали программу амплификации и плавления. 1. Программа амплификации: а) 1 цикл: 10:00 мин – 950С; б) 2-40 циклы: 00:15 мин - 950С, 01:00 мин 600С. В результате эксперимента получали кривые амплификации и плавления (рисунки 7, 8), которые позволяли определить численные значения уровней экспрессии изучаемых генов. Рисунок 7. Кривые амплификации кДНК на примере генов GAPDH, mER, PR-A. 2. Программа плавления: 61 a) 1 цикл: 01:00 мин – 950C; б) 2 цикл: 01:00 мин – 550С; в) 3-84 цикл: 00:10 мин – 550С Рисунок 8. Кривые плавления продуктов амплификации на примере генов Gapdh, mER, PR-A. Для оценки числа копий мРНК применяли ΔСt-метод по формуле 1/2-∆Ct (для выявления различий) и 2-∆∆Ct (для определения кратности разницы), где Ct – пороговый цикл (threshold cycle), соответствующий числу циклов амплификации, необходимых для достижения порогового значения флуоресценции, ∆Сt – разница между пороговым циклом исследуемого гена и геном сравнения (GAPDH), ∆∆Сt – сравнение значений ΔCt контрольного и опытного образцов [89]. 2.2.11. Статистическая обработка результатов. Все данные исследования обрабатывали с использованием программ Microsoft Office Excel 2007 и GraphPad Prism 5.0. Результаты представили в виде среднего значения (М) и стандартной ошибки (SE). 62 Для проверки гипотезы о принадлежности наблюдаемой выборки нормальному закону распределения использовали критерий КолмогороваСмирнова. При нормальном распределении изучаемых параметров для сравнения средних значений применяли критерий Стьюдента, при отличии распределения от нормального – критерий Манна-Уитни. Для оценки корреляционной связи между признаками использовали метод ранговой корреляции Спирмена. Для выявления характеристик потенциального маркера использовали ROC-анализ. Критический уровень значимости при проверке статистических гипотез в исследовании принимали р=0,05. 63 ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ. Изучение фармакологических свойств новых синтетических лигандов рецепторов прогестерона. Лиганды рецепторов прогестерона широко применяют при лечении гипер- и неопластических процессов гормон-чувствительных тканей, что делает поиск новых гестагенов/антигестагенов перспективным направлением повышения эффективности консервативной терапии. Одними из таких синтетических лигандов рецепторов Изучение кинетики прогестерона прямого и являются прегна-D´-пентараны конкурентного взаимодействия (D´6). меченых прогестерона и пентаранов с рецепторами показало, что рецепторы прогестерона является единственным общим для них центром специфического связывания [8], поэтому препаратом сравнения был выбран прогестерон. Ранее было показано, что концентрация прогестерона в ткани мишени при применении в терапевтических дозах обычно составляет 18 нг/мл в ткани эндометрия [75], поэтому в качестве достаточной дозы для соединений была принята концентрация 10-8 M. Поскольку известно, что развитие гиперпластических процессов тесно связано с изменениями функции иммунной системы, необходимо анализировать влияние аналогов прогестерона на опухолевые и иммунокомпетентные клетки. 3.1. Определение специфического связывания прегна-D’-пентаранов с прогестерон-связывающими участками клеток мононуклеарной фракции периферической крови. Удобным и доступным объектом для анализа связывания исследуемых соединений с рецепторами прогестерона является мононуклеарная фракция периферической крови, которая содержит рецепторы прогестерона и является подробно изученной и воспроизводимой моделью. Известно, что у женщин 64 репродуктивного периода уровень прогестерона в крови выше по сравнению с пре- и постменопаузальным возрастом, поэтому оценка общего и специфического связывания лигандов рецепторов прогестерона проводилась на МНФК периферической крови пациенток репродуктивного возраста. Для определения количества прогестерон-связывающих участков в МНФК было проведено 9 последовательных экспериментов, в результате которых их число составило 347 ± 171 фемтомоль/млн. клеток. Полученные нами данные отражают суммарное специфическое связывание 3 Н-прогестерона с МНФК. Специфически связывать прогестерон в клетках могут классические внутриклеточные рецепторы, относящиеся к суперсемейству NR3C3, а также плазмамембранные рецепторы mPR, PGRmC1 и сигма-рецепторы. Специфическое связывание 8 прегна-D’-пентаранов оценивали по конкурентному вытеснению эндогенного лиганда из связи с рецепторами прогестерона, т.е. анализировали способность 200-кратного избытка прегна-D’пентаранов вытеснять меченый тритием прогестерон из его связи с рецепторами (вытеснение 3Н-прогестерона 200-кратным избытком немеченого прогестерона принимали за 100%). Полученные нами результаты специфической связывающей активности изучаемых соединений с клетками МНФ периферической крови представлены в таблице 7. Таблица 7. Уровни специфического связывания прегна-D’-пентаранов с прогестерон-связывающими участками в мононуклеарах периферической крови женщин репродуктивного возраста (М ± SE, в процентах от связывания 3 Н-прогестерона, значение которого принимаем за 100%). стероид специфическое связывание, % р 65 К-338 106,9 ± 30,8 0,941 К-1030 26,9 ± 21,4 0,049 К-1039 104,2 ± 35,7 0,941 K-1036 80,6 ± 42,6 0,162 К-1045 57,0 ± 37,3 0,162 К-1047 75,2 ± 42,7 0,162 К-1044 95,1 ± 35,9 0,941 К-1046 95,6 ± 33,3 0,941 Примечание: р – достоверность отличия значения от контрольных показателей. Согласно нашему исследованию, практически все исследуемые соединения обладают достаточно высоким сродством к рецепторам прогестерона, за исключением прегна-D’-пентарана К-1030 (p=0,049). Согласно исследованию, специфические связывающие активности соединений, используемых для терапии гиперпластических процессов, с рецепторами прогестерона составляют: для прогестерона – 50%, медроксипрогестерона ацетата- 115%, левоноргестрел – 150%, норэтистерон (норэтиндрон) – 75% [96]. Таким образом, сравнивая специфическое связывание с рецепторами прогестерона прегна- D’-пентаранов по сравнению с использующимися в клинической практике препаратами, можно предположить, что исследуемые соединения являются перспективными соединениями для дальнейшей терапии гиперпластических процессов слизистой оболочки матки. Однако, связывание стероидов с рецепторами не может служить единственной тест-системой в отборе активных препаратов, так как соединения 66 могут проявлять различную эффективность при условии высокого аффинитета к рецепторам прогестерона. Поэтому рецепторный анализ всегда сочетают с изучением влияния препаратов на функционирование клеток-мишеней, в частности, на жизнеспособность и специфическую функцию клеток (например, цитокинопродукцию). 3.2. Анализ влияния прегна-D’-пентаранов на уровень продукции ФНО-α мононуклеарной фракцией периферической крови. Для оценки влияния лигандов рецепторов прогестерона на функциональную активность мононуклеаров периферической крови нами было проведено исследование влияния прегна-D’-пентаранов на уровень продукции провоспалительного цитокина ФНО-α. ФНО-α - это регулятор иммунной и воспалительной реакций, который проявляет избирательную цитотоксичность в отношении опухолевых клеток. Согласно классической фармакологической схеме, определение действия соединения осуществляется путем сравнения эффектов исследуемых веществ с эффектом известного агониста, поэтому в качестве вещества сравнения нами был выбран прогестерон. Было проведено 6 последовательных экспериментов, при инкубации МНФК использовались 8 пентаранов и прогестерон. За 100% принимали цитокинопродукцию клеток, инкубированных без соединений (контроль). Результаты экспериментов представлены на диаграмме 2. Диаграмма 2. 67 Концентрация ФНО-α в МНФК при инкубации с прегна-D'- пентаранами (М ± SE, в % от значений контрольных групп, концентрация соединений - 10-8М, длительность инкубации – 72 ч.). Примечание: контроля (р<0,05). - значение статистически достоверно отличается от Из приведенных на диаграмме 6 данных видно, что прегна-D’-пентараны К338, К-1036 и К-1045 снижают выработку мононуклеарами ФНО-α на 11%, 10% и 20% (p=0,023, p=0,014, p=0,023), соответственно, тогда как соединение К-1044 – увеличивает ее на 11% (p=0,014) по сравнению с контролем. При этом все остальные соединения не показали значимого влияния на цитокинопродукцию МНФК. Фактор некроза опухоли альфа (TNF-α) -провоспалительный цитокин, который в периферической крови выделяется преимущественно моноцитами и лимфоцитами. TNF-α увеличивает в других клетках продукцию интерлейкинов IL-1 и IL-6, стимулирует адгезию и индукцию апоптоза измененных клеток, 68 продукцию колониеобразующих факторов эндотелиальными клетками и фибробластами, которые участвуют в процессе ангиогенеза. Кроме того, он активирует антителопродукцию В‑клетками, осуществляет костимуляцию активации Т-лимфоцитов и NK-клеток, повышает продукцию IFN-γ Т-клетками и IL-8 нейтрофилами, а также обладает общим цитотоксическим действием по отношению к опухолевым клеткам [23]. Таким образом, этот цитокин, благодаря своему действию на иммунную систему, играет важную роль в патогенезе хронических воспалительных заболеваний и в регуляции неопластической трансформации. Известно, что полипы эндометрия часто сочетаются с воспалительными процессами слизистой матки, и для их терапии актуальны препараты, обладающие помимо антипролиферативного еще и противовоспалительным эффектом [14]. Поэтому можно предположить, что соединения К-338, К-1036 и К1045имеют дополнительное преимущество при лечении полипов эндометрия, а соединение К-1044 перспективно при терапии опухолей, поскольку стимулирует продукцию противоопухолевого цитокина. 3.3. Влияние прегна-D’-пентаранов на жизнеспособность неизмененных и опухолевых гормон-чувствительных клеток. Использование гестагенов в клинической практике, в частности, в онкогинекологии, часто преследует цель – подавление жизнеспособности гормонозависимых патологически измененных клеток, поэтому исследуемые соединения должны обладать потенциальным токсическим эффектом по отношению к патологическим клеткам. Однако, поскольку препараты оказывают системный эффект, сначала необходимо оценить цитотоксичность лигандов рецепторов прогестерона по отношению к неизмененным клеткам крови – МНФК. Для выяснения способности новых стероидных соединений влиять на жизнеспособность клеток нами использовался МТТ-тест, который в настоящее 69 время широко применяется в лабораторных и экспериментальных исследованиях для определения жизнеспособности клеток [5]. 3.3.1. Влияние прегна-D’-пентаранов на жизнеспособность мононуклеарной фракции клеток периферической крови. В качестве объектов для исследования цитотоксического действия прегнаD’-пентаранов были выбраны клетки МНФ пациенток репродуктивного и постменопаузального возрастов. Было проведено 8 последовательных экспериментов, результаты которых представлены в таблице 8 (за 100% принимали жизнеспособность клеток, инкубированных без соединений (контроль)). Таблица 8. Уровни жизнеспособности клеток мононуклеарной фракции периферической крови после инкубации с прегна–D’-пентаранами и прогестероном по сравнению с контролем (M+SE, % от контроля, концентрация соединений - 10-8М, длительность инкубации – 72 ч). МФНК пациенток клетки репродуктивного возраста соединения без патологий эндометрия постменопаузального возраста без патологий эндометрия с полипами эндометрия прогестерон 92,9 ± 4,9 117,0 ± 6,8 102,4± 0,5 К-338 95,5 ± 4,4 113,5± 3,6 106,4± 1,7 К-1030 97,0 ± 3,8 121,5± 2,6 87,8± 1,0 70 К-1039 95,4 ± 2,1 117,9± 1,3 99,3 ± 1,7 К-1036 94,4 ± 3,5 114,1± 2,4 104,8± 1.3 К-1045 92,4 ± 3,2 110,8± 2,1 106,2± 1,6 К-1047 101,1 ± 4,2 110,3± 1,8 105,1± 1,0 К-1044 102,4 ± 3,7 101,8± 1,5 99,9 ± 0,8 К-1046 97,0 ± 5,2 95, 0 ± 0,5 98,2± 0,5 Таким образом, исследуемые соединения, включая прогестерон, не оказывают значимого эффекта на жизнеспособность мононуклеарных клеток периферической крови больных как с неизмененным эндометрием, так и с полипами эндометрия по сравнению с контролем, т.е. изучаемые прегна-D’пентараны не оказывают значимого отрицательного влияния на жизнеспособность иммунокомпетентных клеток крови. При этом необходимо отметить, что жизнеспособность клеток мононуклеарной фракции под действием исследуемых лигандов рецепторов прогестерона зависела от возраста пациенток (диаграмма 3). Диаграмма 3. Уровни жизнеспособности клеток мононуклеарной фракции периферической крови пациенток репродуктивного и постменопаузального возраста после инкубации с прегна–D’-пентаранами и прогестероном по сравнению с контролем (M+SE, % от контроля, концентрация соединений - 108 М, длительность инкубации – 72 ч). 71 пациентки репродуктивного возраста пациентки постменопаузального возраста 140 120 % от контроля 100 80 60 40 20 0 Примечание: - значение статистически достоверно отличается от аналогичного параметра у пациенток постменопаузального возраста (р<0,05). Как видно из диаграммы 3, у пациенток постменопаузального возраста без гинекологических патологий жизнеспособность МНФК под действием прогестерона, К-1030, К-1039, К-1036, К-1045 (p=0,048, р=0,024, р=0,012, р=0,012, р=0,012, соответственно) была выше, чем у больных репродуктивного возраста. Это может быть связано, с одной стороны, с уменьшением прогестеронзависимого подавления пролиферативной и функциональной активностью лимфоцитов в постменопаузальном возрасте за счет прекращения работы яичников после наступления менопаузы [1, 25]. С другой стороны, данный эффект может быть обусловлен снижением уровня рецепторов эстрадиола в моноцитах после наступления менопаузы, что, в свою очередь, приводит к снижению экспрессии рецепторов прогестерона [37]. 72 Таким образом, вероятность проявления побочных эффектов, в частности иммуносупрессии, при использовании гиперпластических процессов, мала. данных Однако для веществ в лечении подтверждения этого предположения требуются дополнительные исследования в условиях in vivo. 3.3.2. Влияние прегна-D’-пентаранов на жизнеспособность опухолевых клеток Hela и MOLT-4. В качестве объектов для исследования действия прегна-D’-пентаранов на опухолевую ткань были выбраны клетки Hela и MOLT-4. Будучи полученными из Т-клеточной опухоли, клетки линии MOLT-4 обладают многими характеристиками, сходными с лимфоцитами периферической крови, что делает возможным их сравнение с иммунокомпетентными клетками периферической крови [4]. Клеточная культура HeLa представляет собой клетки аденокарциномы шейки матки и является одной из классических моделей при исследовании прогестинов и антипрогестинов [103]. После определения специфического связывания прегна-D’-пентаранов необходимо изучить влияние различных доз исследуемых изучаемых прегна-D’пентаранов на жизнеспособность клеток для определения дозовой зависимости и механизма действия соединений. В качестве объекта исследования использовалась клеточная линия Hela, в качестве метода исследования - МТТтест. Было проведено 5 последовательных экспериментов, результаты которых представлены в таблице 9. Таблица 9. Дозовая зависимость жизнеспособности клеток Hela от концентрации вносимых прегна-D’-пентаранов. (M+SE, % от контроля, длительность инкубации – 72 ч). 73 Концентрация/ 10-5 М 10-6 М 10-7 М 10-8 М К-338 78,4 ± 11,2 * 75,8 ± 4,8 * 91,8 ± 9,1 90,4 ± 10,6 К-1030 96,7 ± 12,4 82,8 ± 4,0 * 99,9 ± 7,5 96,4 ± 8,2 К-1039 78,7 ± 10,6 * 76,5 ± 5,2 * 86,5 ± 5,1 * 85,4 ± 5,6 * К-1036 92,9 ± 15,0 74,0 ± 3,7 * 84,9 ± 5,6 * 91,7 ± 3,2 * К-1045 79,4 ± 10,6 * 99,6 ± 6,9 69,9 ± 9,7 * 82,6 ± 5,9 * К-1047 62,0 ± 12,6 * 83,6 ± 6,4 * 86,7 ± 10,8 97,1 ± 4,7 К-1044 82,1 ± 7,9 * 99,6 ± 5,5 85,0 ± 5,0 * 84,6 ± 4,1* К-1046 81,6 ± 8,4* 83,2 ± 6,09 * 102,9 ± 7,2 104,6 ± 7,5 соединение Примечание: * - значение статистически достоверно отличается от контроля (р<0,05). Как следует из таблицы 9, для прегна-D'-пентаранов K-338, K-1039, K-1047 и K-1046 наблюдалась тенденция к линейной дозовой зависимости. Кроме того, соединения К-1039, К-1036, К-1045, К-1044 подавляют жизнеспособности клеток при концентрации 10-8 М, что позволяет использовать в дальнейшем дозу, при которой механизм действия лигандов рецепторов прогестерона преимущественно рецепторный. Также было проведено 7 последовательных экспериментов, при инкубации клеток нами использовались 8 пентаранов и прогестерон (концентрации 10-8М). За 100% принималась жизнеспособность клеток, инкубированных без препаратов (контроль). Результаты влияния прогестерона и прегна-D’-пентаранов на жизнеспособность опухолевых клеток представлены в таблицах 10 и 11. 74 Таблица 10. Уровни жизнеспособности клеток Hela после инкубации с пентаранами и прогестероном по сравнению с контролем (M+SE, % от контроля, концентрация соединений - 10-7М, длительность инкубации – 72 ч.). клетки Hela P P4 88,9±4,5 * 0,048 К-338 91,8±9,1 0,340 К-1030 99,9±7,5 0,630 К-1039 86,5±5,1 * 0,024 K-1036 84,9±5,6 * 0,012 К-1045 69,9±9,7 * 0,012 К-1047 86,7±7,2 * 0,029 К-1044 85,0±5,0 * 0,012 К-1046 102,9±7,2 0,886 соединения Примечание: * - значение статистически достоверно отличается от контроля (р<0,05). Как следует из таблицы 10, жизнеспособность клеток Hela подавляется прогестероном, К-1039, К-1036, К-1045, К-1047, К-1044 (р=0,029). При этом выявлено, что соединение K-1045 подавляет жизнеспособность клеток Hela сильнее, чем прогестерон (p=0,013). 75 Таблица 11. Уровни жизнеспособности клеток MOLT-4 после инкубации с пентаранами и прогестероном по сравнению с контролем (M+SE, % от контроля, концентрация соединений - 10-8М, длительность инкубации – 72 ч.). клетки MOLT-4 P P4 90,9 ±7,5 * 0,048 К-338 88,0 ±4,1 0,085 К-1030 101,2 ±6,6 0,630 К-1039 101,0 ±4,5 0,941 K-1036 86,0 ±8,8 * 0,029 К-1045 84,2 ±6,2 * 0,024 К-1047 86,7 ±3,7 * 0,029 К-1044 98,0 ±9,6 0,343 К-1046 95,4 ±6,7 0,162 соединения Примечание: * - значение статистически достоверно отличается от контроля (р<0,05). Как следует из таблицы 11, жизнеспособность клеток MOLT-4 подавляется прогестероном, К-1036, К-1045, К-1047 (р=0,049, р=0,022, p=0,019, p=0,020, соответственно). Таким образом, максимальное подавление жизнеспособности опухолевых клеток – Hela и MOLT-4 – оказывают прогестерон и пентараны K-1045, K-1036, K-1047. 76 Противоопухолевая активность лигандов рецепторов прогестерона осуществляется через подавление действия эстрогенов, которые способствуют пролиферации клеток-мишеней. Таким образом, прегна-D’-пентараны связываются с ядерными рецепторами прогестерона и через подавление экспрессии рецепторов эстрадиола снижают эстрогенное влияние на ткань. Таким образом, нами показано снижение жизнеспособности в отношении опухолевых клеток при применении прегна-D’-пентаранов, что делает их перспективными при лечении гормон-зависимых опухолей, в том числе гиперпластических процессов эндометрия. 3.4. Влияние прегна-D’-пентаранов на экспрессию генов рецепторов прогестерона и эстрадиола в клетках мононуклеарной фракции периферической крови пациенток с гиперпластическими процессами эндометрия. Как известно, половые гормоны обладают системным действием, поэтому при развитии гиперпластических процессов эндометрия происходит нарушение нормального функционирования различных систем организма, в том числе и иммунной системы. Аналоги прогестерона, обладая непрямым антиэстрогенным эффектом, помимо действия на измененную ткань эндометрия могут снижать негативное влияние эстрогенов и на иммунокомпетентные клетки, нормализуя их функции. Уровни ядерных и мембранных рецепторов половых стероидов отражают способность иммунокомпетентных клеток и ткани эндометрия и реагировать на гормональное воздействие. При этом, прежде чем говорить о влиянии прегна-D’пентаранов на мононуклеары периферической крови пациенток с гиперпластическими процессами эндометрия, необходимо сначала узнать уровни экспрессии генов рецепторов прогестерона и эстрадиола у пациенток без гинекологических патологий. 77 Для исследования же рецепторного профиля изучаемой ткани в настоящее время наиболее актуален метод полимеразной цепной реакции, позволяющий, в отличие от иммуногистохимического исследования, оценить соотношения между экспрессией генов различных подтипов рецепторов эстрадиола и прогестерона. 3.4.1. Экспрессии генов ядерных и мембранных рецепторов стероидных гормонов в МНФК периферической крови пациенток постменопаузального возраста без гинекологической патологии. В результате проведенного анализа уровней мРНК в МНФК у пациенток контрольной группы были получены данные по экспрессии генов рецепторов прогестерона и эстрадиола. В таблицах 12 и 13 представлены уровни экспрессии генов мембранных и ядерных стероидных рецепторов в МНФК без учета длительности менопаузы. Таблица 12. Описательная статистика экспрессии генов рецепторов эстрадиола в МНФК у пациенток без гинекологической патологии (количество пациенток – 24; в качестве контрольного гена использовали ген GAPDH). Рецепторы эстрадиола Параметры описательной статистики (0,5^∆Ct*103) ядерные мембранные ERα ERβ mER Минимум 0,01 0,04 4,46 25% перцентиль 0,05 0,22 10,90 Медиана 0,10 0,64 18,96 78 75% перцентиль 0,33 1,14 33,26 Максимум 1,25 1,78 297,30 Среднее значение 0,26 0,73 40,43 Стандартное отклонение 0,34 0,54 67,60 0,08 0,12 14,41 Стандартная ошибка Примечание: mER –мембранные рецепторы эстрадиола, ERα и ERβ ядерные рецепторы эстрадиола. Таблица 13. Описательная статистика экспрессии генов рецепторов прогестерона в МНФК у пациенток без гинекологической патологии (количество пациенток – 24, в качестве контрольного гена использовали ген GAPDH). Рецепторы прогестерона Параметры описательной статистики (0,5^∆Ct*103) ядерные мембранные PR-A PR-B PGRmC1 mPR Минимум 0,01 0,02 0,03 0,22 25% перцентиль 0,44 1,08 0,22 0,50 Медиана 0,98 2,02 0,37 0,78 75% перцентиль 1,39 2,69 0,62 1,25 Максимум 2,88 8,03 4,04 3,70 Среднее значение 1,01 2,13 0,70 1,11 Стандартное 0,75 1,79 1,01 0,92 79 отклонение Стандартная ошибка 0,17 0,41 0,21 0,20 Примечание: PR-А и PR-В - ядерные рецепторы прогестерона, mPR и PGRmC1 – мембранные. Как следует из таблиц 12 и 13, в мононуклеарных клетках периферической крови представлены все подтипы рецепторов прогестерона и эстрадиола. Для оценки распределения отдельных подтипов стероидных рецепторов в МНФК периферической крови у пациенток контрольной группы полученные экспериментальные данные представлены в виде части от суммарной экспрессии генов рецепторов (диаграмма 4). Диаграмма 4. Соотношение уровней экспрессии генов рецепторов эстрадиола и прогестерона в МНФК периферической крови пациенток постменопаузального периода без гинекологической патологии. nER mER mPR mPR nPR Примечание: уровень мРНК (1/2-∆Ct*1000), ген сравнения - GAPDH; mPR – мембранные рецепторы прогестерона, nPR – ядерные рецепторы прогестерона, mER – мембранный рецептор эстрадиола, nER – ядерные рецепторы эстрадиола. 80 Как видно из диаграммы 4, максимальная экспрессия генов в мононуклеарной фракции периферической крови пациенток контрольной группы приходится на мембранные рецепторы эстрадиола, при этом уровень мРНК ядерных рецепторов прогестерона выше, чем мембранных рецепторов прогестерона. Таким образом, уровни мРНК рецепторов прогестерона и эстрадиола в клетках мононуклеарной фракции периферической крови у пациенток постменопаузального возраста без гинекологической патологии уменьшается в ряду: mER >> PR-B (в 14,5 раз, p<0,0001) > PGRmC1, ERβ, PR-A (в 3,3-2,6 раза, p≤0,024) ≥ mPR (в 1,2 раза, p=0,004) > ERα (в 1,7 раз, p=0,002). Соотношение подтипов ядерных рецепторов эстрадиола и прогестерона в МНФК периферической крови у пациенток без гинекологических заболеваний составило: ERα/ERβ = 0,36, PR-A/PR-B = 0,47. Это говорит о преимущественной экспрессии генов ядерных рецепторов эстрадиола и прогестерона, ингибирующих функции основных изоформ. Однако, данные по уровням мРНК рецепторов продемонстрировали широкий разброс значений уровней экспрессии, которые могут зависеть от многих параметров, в частности от возраста пациенток и/или длительности постменопаузы. Поэтому мы разделили исследуемых пациенток без гинекологической патологии на 3 подгруппы (I.I. - I.III) с учетом длительности менопаузы. В подгруппу I.I. (длительность менопаузы менее 10 лет) вошли 15 человек, в подгруппу I.II (длительность менопаузы от 10 до 20 лет) – 12, в подгруппу I.III (длительность менопаузы от 20 лет) – 13 (таблицы 14 и 15). Таблица 14. 81 Уровни экспрессии рецепторов эстрадиола в МНФК у пациенток без гинекологической патологии в зависимости от длительности постменопаузы (M±SE, в качестве контрольного гена использовали ген GAPDH). Рецепторы эстрадиола Длительность (M±SE; 0,5^∆Ct*103) менопаузы ядерные n=40 до 10 лет n=15 от 10 до 20 лет n=12 более 20 лет n=13 мембранные ERα ERβ mER 0,13±0,08 0,67±0,18 70,80±37,94 0,12±0,06 0,55±0,11 15,08±2,90 0,43±0,16 0,91±0,24 29,08±7,11 Примечание: n – количество пациенток, mER – мембранные рецепторы эстрадиола, ERα и ERβ - ядерные рецепторы эстрадиола. Таблица 15. Уровни экспрессии рецепторов прогестерона в МНФК у пациенток без гинекологической патологии в зависимости от длительности постменопаузы (M±SE, в качестве контрольного гена использовали ген GAPDH). Рецепторы прогестерона Длительность (M±SE; 0,5^∆Ct*103) менопаузы ядерные n=40 до 10 лет n=15 мембранные PR-A PR-B PGRmC1 mPR 0,32±0,10 1,44±0,30 0,70±0,10 1,05±0,52 82 от 10 до 20 лет n=12 более 20 лет n=13 1,51±0,33 2,07±0,79 0,68±0,17 0,41±0,06 1,37±0,25 2,76±0,83 1,78±0,44 0,52±0,10 Примечание: n – количество пациенток, PR-А и PR-В - ядерные рецепторы прогестерона, mPR и PGRmC1 – мембранные. Как следует из таблиц 14 и 15, разделение пациенток на 3 возрастные подгруппы позволило не только уменьшить вариативность данных, но и выявить изменение уровней экспрессии генов рецепторов стероидных прогестерона и эстрадиола в МНФК периферической крови в зависимости от периода менопаузы. Индивидуальный анализ экспрессии генов отдельных типов рецепторов в МНФК периферической крови пациенток без гинекологической патологии в динамике позволил выявить некоторые закономерности экспрессии генов рецепторов эстрадиола. При общем доминировании экспрессии гена mER наблюдается следующая тенденция: его максимальное среднее значение приходится на первый возрастной период (постменопаузальный возраст менее 10 лет) - 70,80±37,94; 15,08±2,90; 29,08±7,11 в подгруппах I.I, I.II., I.III, соответственно. При этом, экспрессия гена ERα в мононуклеарах периферической крови, наоборот, увеличивается с возрастом (диаграмма 5). Диаграмма 5. Уровни экспрессии гена рецептора эстрадиола типа альфа в МНФК в зависимости от длительности менопаузы (M±SE, в качестве контрольного гена использовали ген GAPDH). 83 Так, относительное количество мРНК ERα в подгруппе I.III по отношению к мРНК ERα подгрупп I.I и I.II составляет 3,31 и 3,58 (p=0,015 и p=0,048), соответственно. Индивидуальный анализ экспрессии отдельных типов рецепторов в МНФК в динамике также позволил выявить некоторые закономерности экспрессии генов рецепторов прогестерона. Если экспрессия генов рецепторов эстрадиола вполне объяснимо снижается в течение первых 10 лет менопаузы, то экспрессия практически всех рецепторов прогестерона (за исключением mPR) увеличивается и выходит на плато 10-20 лет менопаузы, в частности, PR-A (диаграмма 6). Диаграмма 6. Уровни экспрессии гена рецептора прогестерона типа А в МНФК в зависимости от длительности менопаузы (M±SE, в качестве контрольного гена использовали ген GAPDH). 84 Так, относительное количество мРНК PR-A в подгруппах I.II и I.III по отношению к мРНК PR-A подгруппы I.I составляет 4,76 и 4,29 (p=0,0057 и p=0,0016), соответственно. Также выявлена тенденция к увеличению уровней экспрессии генов PR-B и PGRmC1. Для PR-B максимальное среднее значение уровня мРНК приходится на третий возрастной период (после 20 лет менопаузы) - 1,44± 0,30; 2,07 ± 0,79; 2,76 ± 0,83 в подгруппах I.I, I.II., I.III, соответственно. Для PGRmC1максимальное среднее значение уровня мРНК также приходится на третий возрастной период (после 20 лет менопаузы) - 0,70 ± 0,10; 0,68 ± 0,17; 1,78 ± 0,44 в подгруппах I.I, I.II., I.III, соответственно. Подобное парадоксальное увеличение уровня экспрессии генов рецепторов прогестерона может являться, с одной стороны, следствием адаптивной перестройки рецепторного аппарата клеток-мишеней при длительной недостаточности стероидного фона, или, с другой стороны, может быть связано с компенсаторным увеличением уровня лютеинизирующего и фолликулостимулирующего гормонов, чей уровень максимален в первые 2-3 года после наступления менопаузы, а затем постепенно снижается [1]. 85 Продемонстрированные изменения уровней экспрессии генов стероидных гормонов явились обоснованием для дальнейшего разбиения основной группы на две подгрупп – с периодом менопаузы до 10 лет и после 10 лет. Изучая соотношение подтипов ядерных рецепторов эстрадиола и прогестерона в МНФК периферической крови у пациенток без гинекологических заболеваний в зависимости от длительности менопаузы, были выявлены следующие соотношения между подтипами рецепторов: при периоде менопаузы до 10 лет коэффициент ERα/ERβ = 0,20; PR-A/PR-B= 0,22; при периоде менопаузы более 10 лет - ERα/ERβ = 0,40, PR-A/PR-B = 0,64. Таким образом, при анализе уровня экспрессии ядерных рецепторов в МНФК у женщин без гинекологических заболеваний можно отметить следующую закономерность: соотношение уровней экспрессии классических стероидных рецепторов (PR-B>PR-A, ERβ>ERα) в МНФК в периферической крови сохраняется во всех возрастных группах в пределах менопаузы. Определив значения уровней мРНК генов рецепторов эстрадиола и прогестерона в МНФК периферической крови у пациенток контрольной группы, мы решили изучить экспрессию генов изучаемых рецепторов в МНФ у пациенток с гиперпластическими процессами эндометрия. 3.4.2. Экспрессия генов рецепторов эстрадиола и прогестерона МНФК периферической крови пациенток постменопаузального возраста с железисто-фиброзными полипами эндометрия. По результатам изучения уровней мРНК рецепторов половых стероидов в МНФК у пациенток контрольной группы больные с железисто-фиброзными полипами (ЖФП) были разделены в зависимости от длительности менопаузы на 2 подгруппы: в подгруппу II.I вошли 8 пациенток с длительностью менопаузы менее 10 лет, в подгруппуII.II – 22 с длительностью более 10 лет. Результаты 86 определения уровней мРНК рецепторов прогестерона и эстрадиола в МНФК у пациенток с ЖФП эндометрия по сравнению с контрольной группой сопоставимого менопаузального периода представлены в таблицах 16 и 17. Таблица 16. Уровни экспрессии генов рецепторов эстрадиола в МНФК у пациенток с железисто-фиброзными полипами эндометрия по сравнению с контрольной группой (M±SE, в качестве контрольного гена использовали ген GAPDH). Рецепторы эстрадиола Длительность (M±SE; 0,5^∆Ct*103) менопаузы ядерные n=30 контроль до 10 лет n=10 ЖФПЭ n=8 контроль более 10 n=14 лет ЖФПЭ n=22 мембранные ERα ERβ mER 0,13±0,08 0,67±0,18 70,80 ± 37,94 7,07±4,35 9,32±7,31 22,03±5,21 0,12±0,06 0,77±0,15 29,08±7,11 9,41±2,28 9,22±2,42 22,86±4,57 Примечание: n – количество пациенток, mER – мембранные рецепторы эстрадиола, ERα и ERβ - ядерные рецепторы эстрадиола. Таблица 17. Уровни экспрессии генов рецепторов прогестерона в МНФК у пациенток с железисто-фиброзными полипами эндометрия по сравнению с 87 контрольной группой (M±SE, в качестве контрольного гена использовался ген GAPDH). Рецепторы прогестерона Длительность (M±SE; 0,5^∆Ct*103) менопаузы ядерные n=30 контроль до 10 лет n=10 ЖФПЭ n=8 контроль более 10 n=14 лет ЖФПЭ n=22 мембранные PR-A PR-B PGRmC1 mPR 0,32±0,10 1,44±0,31 0,70±0,11 1,05±0,52 3,49±1,75 4,23±1,76 1,14±0,29 1,39±0,91 1,41±0,19 2,20±0,37 1,31±0,29 0,47±0,06 2,21±0,94 2,31±0,58 3,37±1,56 1,17±0,50 Примечание: n – количество пациенток, PR-А и PR-В - ядерные рецепторы прогестерона, mPR и PGRmC1 – мембранные рецепторы прогестерона. Сравнительный анализ экспрессии генов отдельных типов рецепторов эстрадиола и прогестерона в МНФК периферической крови пациенток с гиперплазией эндометрия по сравнению с контрольной группой позволил выявить некоторые закономерности. Так, у пациенток II.I группы в МНФК периферической крови наблюдается увеличение уровня экспрессии генов ERα и PR-A в 54,4 и 10,9 раз (p=0,005 и p=0,031), соответственно, по сравнению с аналогичными показателями контрольной группы той же возрастной группы (диаграммы 7 и 8). Диаграмма 7. 88 Уровень экспрессии гена рецептора эстрадиола типа альфа в МНФК пациенток с полипами эндометрия по сравнению с контрольной группой, длительность менопаузы менее 10 лет (M±SE, в качестве контрольного гена использовали ген GAPDH). Диаграмма 8. Уровень экспрессии гена рецептора прогестерона типа А в МНФК пациенток с полипами эндометрия по сравнению с контрольной группой, длительность менопаузы менее 10 лет (M±SE, в качестве контрольного гена использовали ген GAPDH). 89 При длительности менопаузы более 10 лет у пациенток с полипами эндометрия нами выявлено увеличение уровня мРНК ERα и ERβ в 30,4 и 12,0 раз (p<0,001 и p=0,028), соответственно, по сравнению с аналогичными показателями контрольной группы той же возрастной группы (диаграммы 9 и 10). Диаграмма 9. Уровень экспрессии гена рецептора эстрадиола типа альфа в МНФК пациенток с полипами эндометрия по сравнению с контрольной группой, длительность менопаузы более 10 лет (M±SE, в качестве контрольного гена использовали ген GAPDH). Диаграмма 10. Уровень экспрессии гена рецептора эстрадиола типа бета в МНФК пациенток с полипами эндометрия по сравнению с контрольной группой, длительность менопаузы более 10 лет (M±SE, в качестве контрольного гена использовали ген GAPDH). 90 При этом разницы в экспрессии генов рецепторов эстрадиола и прогестерона в МНФК у пациенток с ЖФП в зависимости от периода постменопаузы выявлено не было. Таким образом, увеличения экспрессии гена PR-A, уменьшающего уровень рецепторов эстрадиола, и гена ERβ, тормозящего эффект ERα, может быть компенсаторной реакцией клеток МНФ на гиперэстрогению. Эти результаты совпадают с литературными данными об уровнях рецепторов эстрадиола и прогестерона в ткани ЖФП, что позволяет говорить об однонаправленных изменениях рецепторного профиля при данной патологии как в ткани эндометрия, так и на иммунокомпетентных клетках периферической крови [44]. При анализе соотношения между подтипами ядерных рецепторов эстрадиола и прогестерона было выявлено, что при периоде менопаузы до 10 лет коэффициент ERα/ERβ = 0,76, PR-A/PR-B = 0,83; при периоде менопаузы более 10 лет - ERα/ERβ = 1,02, PR-A/PR-B = 0,96.При сравнении этих показателей с коэффициентами у контрольной группы было обнаружено, что при развитии полипов эндометрия баланс смещается в сторону увеличения доли как рецепторов эстрадиола типа альфа, так и рецепторов прогестерона типа А. Это также может быть следствием компенсаторной реакции иммунокомпетентных клеток на 91 гиперэстрогению, как со стороны рецепторов эстрадиола, так и рецепторов прогестерона. Таким образом, развитие ЖФПЭ у пациенток старшей возрастной подгруппы сопровождается изменением преимущественно ядерных рецепторов с геномным механизмом действия и затрагивает в основном рецепторы эстрадиола. Является ли такое изменение рецепции в клетках иммунной системы прямой, либо косвенной причиной развития патологического процесса эндометрия, предстоит выяснить. 3.4.3.Экспрессия генов ядерных и мембранных рецепторов эстрадиола и прогестерона МНФК периферической крови пациенток постменопаузального возраста с железистой и железисто-кистозной гиперплазией эндометрия. Аналогично группе с полипами эндометрия пациентки с железистой и железисто-кистозной гиперплазией эндометрия были разделены в зависимости от длительности менопаузы на 2 подгруппы: в III.I подгруппу вошли 5 пациенток с менопаузой менее 10 лет, в подгруппу III.II– 4 с менопаузой более 10 лет. Результаты определения уровней мРНК рецепторов прогестерона и эстрадиола в МНФК у пациенток III группы эндометрия по сравнению с контрольной группой сопоставимого менопаузального периода представлены в таблицах 18 и 19. Таблица 18. Уровни экспрессии генов рецепторов эстрадиола в МНФК у пациенток с гиперплазией эндометрия по сравнению с контрольной группой (M±SE, в качестве контрольного гена использовали ген GAPDH). 92 Рецепторы эстрадиола (M±SE; 0,5^∆Ct*103) Длительность менопаузы ядерные мембранные ERα контроль до 10 лет n=15 гиперплазия n=5 ERβ mER 0,13±0,08 0,67±0,18 70,80 ± 37,94 0,41±0,12 0,02±0,01 24,55±7,91 0,12±0,06 0,77±0,15 29,08±7,11 0,33±0,19 1,56±1,25 9,61±2,29 контроль более n=13 10 лет гиперплазия n=4 Примечание: n – количество пациенток, mER – мембранные рецепторы эстрадиола, ERα и ERβ - ядерные рецепторы эстрадиола. Таблица 19 Уровни экспрессии генов рецепторов прогестерона в МНФК у пациенток с гиперплазией эндометрия по сравнению с контрольной группой (M±SE, в качестве контрольного гена использовали ген GAPDH). Рецепторы прогестерона Длительность менопаузы (M±SE; 0,5^∆Ct*103) ядерные PR-A PR-B мембранные PGRmc1 mPR 93 контроль до 10 лет n=15 0,32±0,10 1,44±0,30 0,70±0,10 1,05±0,52 0,48±0,22 0,91±0,52 0,55±0,13 0,20± 0,09 1,37±0,25 2,76±0,83 1,78±0,44 0,52±0,10 1,62±0,39 4,56±0,47 2,57±0,97 0,95±0,45 гиперплазия n=5 контроль более n=13 10 лет гиперплазия n=4 Примечание: n – количество пациенток, PR-А и PR-В - ядерные рецепторы прогестерона, mPR и PGRmC1 – мембранные рецепторы прогестерона. При анализе уровней мРНК рецепторов прогестерона и эстрадиола в МНФК у пациенток с гиперплазией эндометрия по сравнению с контрольной группой сопоставимого менопаузального периода были выявлены изменения рецепторного профиля (диаграммы 11). Диаграммы 11. Изменения рецепторного профиля МНФК у пациенток с гиперплазией эндометрия относительно контрольной группы (в качестве контрольного гена использовали ген GAPDH). 94 Как видно из диаграмм 11, у пациенток с гиперплазией эндометрия с периодом менопаузы до 10 лет в МНФК периферической крови наблюдается увеличение уровня экспрессии гена ERα и снижение - ERβ, в 4 и 37 раз соответственно по сравнению с аналогичными показателями контрольной группы; при периоде менопаузы более 10 лет – увеличивается уровень мРНКPR-B в 2 раза (по формуле 2-∆∆Ct). Кроме того, при гиперплазии по сравнению с полипами эндометрия отмечено снижение экспрессии генов рецепторов эстрадиола: ERα (при менопаузальном периоде от 10 лет) и ERβ (при менопаузальном периоде до 10 лет) в 29 и 477 раз (p=0,032 и p=0,006) соответственно (по формуле 2-∆∆Ct). 95 Была обнаружена разница в уровне мРНК ядерного рецептора эстрадиола между подгруппами пациенток с гиперплазией эндометрия. Так, экспрессия рецептора ERβ выше при периоде менопаузы от 10 лет (p=0,029). Кроме того, выявлено следующее соотношения между подтипами рецепторов: при периоде менопаузы до 10 лет коэффициент ERα/ERβ= 22,33, PRA/PR-B= 0,52; при периоде менопаузы более 10 лет - ERα/ERβ = 0,21, PR-A/PR-B = 0,35. Таким образом, у пациенток с менопаузой до 10 лет при гиперплазиях эндометрия в МНФК наблюдается снижение уровня экспрессии антипролиферативного гена ERβ на фоне увеличенного уровня митогенного гена ERα. При периоде менопаузы более 10 лет – отмечено увеличение уровня мРНКPR-B, который тормозит PR-A. Эти изменения в МНФК могут говорить о более активно протекающих гормональных изменениях у пациенток до 10 лет по сравнению с более поздним менопаузальным периодом, а также об усугублении патологического процесса за счет нарушений тормозных механизмов контроля пролиферации клеток. Вариации иммуно-эндокринного фона гиперплазии и ЖФПЭ в постменопаузе позволяют предположить существование независимых механизмов патогенеза данных нозологий. 3.4.4. Экспрессия генов ядерных и мембранных рецепторов стероидных гормонов в МНФК у пациенток постменопаузального возраста с аденокарциномой эндометрия. Аналогично ситуации с полипами и гиперплазией эндометрия, мы разделили пациенток с гиперплазией эндометрия на 2 подгруппы: в 1 подгруппу вошли 8 пациенток с длительностью менопаузы менее 10 лет, во 2 подгруппу – 6 пациенток с менопаузой более 10 лет. 96 Результаты определения уровней мРНК рецепторов прогестерона и эстрадиола в МНФК у пациенток с аденокарциномой эндометрия по сравнению с контрольной группой сопоставимого менопаузального периода представлены в таблицах 20 и 21. Таблица 20. Уровни экспрессии генов рецепторов эстрадиола в МНФК у пациенток с аденокарциномой эндометрия по сравнению с контрольной группой (M±SE, в качестве контрольного гена использовали ген GAPDH). Рецепторы эстрадиола (M±SE; 0,5^∆Ct*103) Длительность менопаузы ядерные ERα контроль до 10 лет n=15 аденокарцинома n=8 мембранные ERβ mER 0,13±0,08 0,67±0,18 70,80 ± 37,94 1,07 ± 0,82 0,53 ± 0,22 17,07 ± 7,41 0,12±0,06 0,77±0,15 29,08±7,11 6,79 ± 6,39 0,98 ± 0,72 22,71 ± 8,88 контроль более n=13 10 лет аденокарцинома n=6 Примечание: n – количество пациенток, mER – мембранные рецепторы эстрадиола, ERα и ERβ - ядерные рецепторы эстрадиола. Таблица 21 97 Уровни экспрессии генов рецепторов прогестерона в МНФК у пациенток с аденокарциномой эндометрия по сравнению с контрольной группой (M±SE, в качестве контрольного гена использовали ген GAPDH). Рецепторы прогестерона Длительность менопаузы (M±SE; 0,5^∆Ct*103) ядерные мембранные PR-A PR-B PGRmc1 mPR 0,32±0,10 1,44±0,30 0,70±0,10 1,05±0,52 1,43 ± 0,41 1,72 ± 0,50 0,22 ± 0,34 0,45 ± 0,15 1,37±0,25 2,76±0,83 1,78±0,44 0,52±0,10 1,00 0,28 2,71 ± 0,86 0,67 ± 0,13 0,33 ± 0,11 контроль до 10 лет n=15 аденокарцинома n=8 контроль более n=13 10 лет аденокарцинома n=6 Примечание: n – количество пациенток, PR-А и PR-В - ядерные рецепторы прогестерона, mPR и PGRmC1 – мембранные рецепторы прогестерона. Анализ результатов исследования уровней экспрессии рецепторов прогестерона и эстрадиола у пациенток с аденокарциномами эндометрия в зависимости от продолжительности менопаузы представлены на диаграммах12. 98 Диаграммы 12. Изменения рецепторного профиля МНФК у пациенток с аденокарциномой полипами относительно контрольной группы (в качестве контрольного гена использовался ген GAPDH). Как видно из диаграмм 12, у пациенток с аденокарциномой эндометрия с периодом менопаузы до 10 лет в МНФК периферической крови наблюдаются увеличения уровней экспрессии генов ERα и PR-A в 8 и 4 раза соответственно по сравнению с аналогичными показателями контрольной группы (по формуле 2∆∆Ct ). При этом разницы в уровне мРНК рецепторов эстрадиола и прогестерона между подгруппами пациенток с аденокарциномой эндометрия обнаружено не было. Кроме того, при аденокарциноме по сравнению с полипами эндометрия отмечено снижение экспрессии гена ERα (при менопаузальном периоде от 10 лет) в 1,4 раза (p=0,048) (по формуле 2-∆∆Ct). Также выявлены следующие соотношения между подтипами рецепторов: при периоде менопаузы до 10 лет коэффициент ERα/ERβ составил 0,59, PR-A/PR-B – 0,83; при периоде менопаузы более 10 лет - ERα/ERβ = 5,95, PR-A/PR-B = 0,37. 99 Таким образом, наблюдается ситуация, сходная при развитии полипов эндометрия, что может говорить, с одной стороны, о возможных генетических мутациях рецепторного аппарата клетки с потерей гормонального контроля над измененным эндометрием, а, с другой стороны, о реакции иммунной системы на агрессивно развивающуюся опухоль эндометрия. Полученные результаты по изменению рецепторного профиля МНФК периферической крови при развитии гиперпластических процессов эндометрия представлены в таблице 22. Таблица 22. Изменение уровней экспрессии генов рецепторов прогестерона и эстрадиола в МНФК пациенток с полипами, гиперплазиями и аденокарциномой эндометрия постменопаузального возраста по сравнению с аналогичными показателями контрольной группы. Менопауза/патология До 10 лет После 10 лет Полип Гиперплазия Аденокарцинома ERα ↑ ERα ↑ ERα ↑ PR-A ↑ ERβ ↓ PR-A ↑ ERα ↑ ERβ ↑ PR-B ↑ Как следует из таблицы 22, у пациенток с менопаузальным периодом более 10 лет выраженные изменения рецепторного аппарата МНФК наблюдаются только в случае развития полипов эндометрия. Это может являться следствием значимого снижения секреции эстрадиола и прогестерона на фоне прекращения работы яичников и гормональной перестройки. Если рассматривать уровни экспрессии генов рецепторов эстрадиола и прогестерона в МНФК у пациенток с периодом менопаузы менее 10 лет, то можно отметить повышенный уровень 100 мРНК рецепторов эстрадиола типа альфа при всех изучаемых патологиях – полипах, гиперплазии и аденокарциноме эндометрия. При анализе потенциального маркера развития гиперпластических процессов эндометрия у пациенток постменопаузального возраста – ERα – нами была получена ROC-кривая (диаграмма 13). Диаграмма 13. ROC-кривая экспрессии гена ERα у пациенток постменопаузального возраста с гиперпластическими процессами эндометрия. В результате ROC-анализа было выявлено, что увеличение уровня экспрессии гена ERα в мононуклеарной фракции клеток периферической крови более 0,314 (0,5-ΔCt*100, относительно гена GAPDH) может быть надежным маркером наличия гиперпластических процессов у пациенток постменопаузального возраста. Чувствительность данного маркера составляет 82%, а специфичность - 75%. Таким образом, при развитии гиперпластических процессов эндометрия наблюдается изменение рецепторного профиля иммунокомпетентных клеток 101 периферической крови преимущественно за счет гиперэкспрессии гена ERα. Кроме того, можно предположить, что увеличенный уровень экспрессии гена ERα может стать молекулярным скрининговым маркером в периферической крови для выявления гиперпластических процессов у пациенток постменопаузального возраста, что, однако, требует дополнительных исследований. 3.4.5.Влияние прегна-D’-пентаранов на экспрессию генов рецепторов прогестерона и эстрадиола в МНФК. По результатам изучения рецепторного профиля МНФК у больных постменопаузального возраста с полипами эндометрия и без гинекологических патологий мы исследовали действие прегна-D’-пентаранов на уровень экспрессии гена ERα в мононуклеарах периферической крови этих же пациенток. В 3 последовательных экспериментах использована периферическая кровь 4 женщин контрольной группы и 4 - с полипами эндометрия. Инкубация МНФК проводилась с 8 пентаранами и прогестероном. Результаты исследования влияния новых лигандов рецепторов прогестерона на МНФК пациенток без гинекологических патологий представлены на диаграмме 14. Диаграмма 14. Уровни экспрессии генов рецептора эстрадиола типа альфа в МНФК периферической крови пациенток постменопаузального возраста гинекологических патологий при инкубации с прегна-D’-пентаранами. без 102 Примечание: контроля (р=0,029). - значение статистически достоверно отличается от Как видно из диаграммы 14, прогестерон и прегна-D’-пентараны не оказывают значимого влияния на экспрессию гена рецептора эстрадиола альфа в МНФК периферической крови пациенток контрольной группы, за исключением соединений К-338, К-1036, которые снижают уровень мРНК гена ERα в 12 и 21 раз по сравнению с контролем. Результаты исследования влияния новых лигандов рецепторов прогестерона на МНФК больных с гиперпластическими процессами эндометрия представлены на диаграмме 15. Диаграмма 15. 103 Уровни экспрессии генов рецептора эстрадиола типа альфа в МНФК периферической крови пациенток постменопаузального возраста с полипами эндометрия при инкубации с прегна-D’-пентаранами. Примечание: контроля (р=0,0286). - значение статистически достоверно отличается от Как видно из диаграммы 15, все исследуемые соединения снижают уровень экспрессии гена ERα: К-338 – в 4,3 раза, К-1030 – в 19,0 раз, К-1039 – в 52,0 раза, К-1036 – в 21,9 раз, К-1045 – в 5,4 раза, К-1047 – в 4,9 раза, К-1044 – в 7,8 раз, К1046 – в 36,3 раза (p<0,05), тогда как изменения экспрессии гена под действием прогестерона не наблюдается. Таким образом, изучаемые прегна-D’-пентараны снижают экспрессию генов рецепторов эстрадиола типа альфа, повышенную при развитии гиперпластических процессов эндометрия, что может привести к нормализации функционирования иммунокомпетентных клеток периферической крови при данной патологии. 104 3.5. Структурно-функциональный анализ соединений гомологического ряда прегна-D’-пентаранов и выбор наиболее активных соединений. В результате скрининга 8 представителей гомологического ряда прегна-D’пентаранов на основании: 1) изучения их специфического связывания c прогестерон-связывающими участками мононуклеарной фракции клеток периферической крови; 2) влияния на жизнеспособность клеток HeLa, MOLT-4 и МНФК; 3) действия на продукцию ФНО-α в МНФ клеток периферической крови, были выявлены следующие наиболее активные в отношении опухолевых клеток соединения, обладающие минимальными токсическими свойствами по отношению к неизменённым клеткам крови : К- 1045 (6(E)-гидрокси-имино16α,17α-циклогексано-прегн-4-ен-3,20-дион) и К-1036 (16α,17α-циклогексано-4оксапрегн-5-ен-3,20-дион). Эти соединения перспективны для дальнейших доклинических исследований и последующего внедрения в практику в качестве препаратов для медикаментозного лечения гормон-зависимых процессов эндометрия. Анализируя связь между химическим строением гомологического ряда прегна-D'-пентаранов и их свойствами в неизмененных и опухолевых клетках клеток, мы выявили определенные закономерности. Известно, что в мононуклеарной фракции клеток периферической крови подавляющее большинство клеток представлено моноцитами и лимфоцитами, которые экспрессируют ядерные рецепторы прогестерона [94, 39]. А, поскольку в научной литературе пока отсутствуют сведения о структуре лиганд- связывающего домена мембранных рецепторов прогестерона, мы примем за гипотезу предположение, что лиганд-связывающие домены всех рецепторов прогестерона схожи по структуре с таковыми у классических рецепторов. При исследовании влияния заместителей в ряду прегна-D’-пентаранов на специфическую связывающую активность соединений с прогестерон- связывающими участками МНФК было установлено, что введение фенильной 105 группы в D’-кольцо стероидной молекулы снижает специфическую связывающую активность с прогестерон-связывающими участками клеток. Это может быть следствием гидрофобного взаимодействия введенной в стероид фенильной группы с фенильной группой фенилаланина в 778 положении молекулы рецептора прогестерона. В результате, ослабляется взаимодействие гидрофобное взаимодействие фенилаланина рецептора с А-кольцом стероидной молекулы, что, в свою очередь, снижает взаимодействие соединения с рецептором прогестерона. При анализе влияния заместителей в ряду прегна-D’-пентаранов на способность подавлять жизнеспособность опухолевых клеток было установлено, что присоединение имино-группы к 6 атому углерода стероидной молекулы (R1) достоверно угнетает жизнеспособность опухолевых клеток. Таким же эффектом обладает соединение, содержащее атом кислорода вместо 4 атома углерода (Y) стероида, что, однако, требует дальнейшей проверки. Выявленные структурно-функциональные связи в ряду прегна-D’- пентаранов могут помочь в дальнейшем поиске и синтезе новых высокоактивных лигандов рецепторов прогестерона. 106 Выводы 1. Прегна-D'-пентараны К-338, К-1039, K-1046, K-1044, К-1036, К-1047, и К1045 обладают высоким уровнем специфического связывания с прогестеронсвязывающими участками в мононуклеарах периферической крови (57,0 -106,9%). 2. Прегна-D’-пентараны К-338, К-1036 и К-1045 в концентрации 10-8 М при инкубации в течение 72 ч снижают выработку мононуклеарами ФНО-α на 11%, 10% и 20%, соответственно, тогда как соединение К-1044 – увеличивает ее на 11% (р<0,05). 3. Все исследуемые прегна-D'-пентараны в концентрации 10-8 М при инкубации в течение 72 ч не оказывают цитотоксического действия на мононуклеарные клетки крови, при этом соединения K-1045, K-1036, K-1047 подавляют жизнеспособность опухолевых клеток: MOLT-4 – на 30%, 15% и 13%; Hela - на 16%, 14% и 13%, соответственно (р<0,05). 4. В иммунокомпетентных клетках периферической крови пациенток с гиперпластическими процессами слизистой матки (полипами, гиперплазиями и аденокарциномой эндометрия) и постменопаузальным периодом до 10 лет увеличена экспрессия гена рецептора эстрадиола типа альфа в 4 раза (р<0,05) по сравнению с женщинами без гинекологической патологии. 6. Все изучаемые прегна-D’-пентараны подавляют экспрессию гена рецептора эстрадиола типа альфа более чем в 4 раза (p<0,05) у пациенток постменопаузального возраста с гиперпластическими процессами эндометрия. 7. В результате исследования из 8 представителей гомологического ряда прегна-D'-пентаранов выявлены вещества с оптимальным набором свойств, полезных для дальнейшего изучения возможности их использования в клинической практике – 6(E)-гидрокси-имино-16α,17α-циклогексано-прегн-4-ен3,20-дион и 16α,17α-циклогексано-4-оксапрегн-5-ен-3,20-дион. 107 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Ашрафян, Л. А. Опухоли репродуктивных органов (этиология и патогенез) / Л.А. Аршафян, В.И. Киселев. - М.: Димитрейд График Групп, 2007. – 216 с. 2. Бассалык, Л.С. Рецепторы стероидных гормонов в опухолях человека / под ред. Л.С. Бассалык. - М.: Медицина, 1987. – 224 с. 3. Берштейн, Л.М. Эндокринно-генотоксические переключения как промотор основных неинфекционных заболеваний / Л.М. Берштейн, Е.В. Цырлина, А.Ю. Ковалевский // Вестник Российской АМН. - 2008. - № 1. - С.12-17. 4. Васильев, С.А. Различия эффектов импульсно-периодического рентгеновского излучения в опухолевых клетках линии MOLT-4 и лимфоцитах периферической крови человека / С.А. Васильев, А.А. Беленко, О.П. Кутенков, М.А. Большаков, И.Н. Лебедев, В.В. Ростов // Сибирский онкологический журнал. - 2013. - № 2. - С. 45-49. 5. Данлыбаева, Г.А. Цитотоксичность карборанилсодержащих соединений / Г. А. Данлыбаева, А. А. Жылкибаев, В. А. Рыков, В. С. Тритек, Д. В. Силаев, А. Е. Гуляев // Биотехнология. Теория и практика. - 2012. - № 3. - С. 49-54. 6. Добротина, Н.А. Теоретическое и практическое значение системности в изучении гомеостаза человека / Н.А. Добротина, Т.В. Копытова // Вестник нижегородского университета им. Н.И. Лобачевского. - 2012. - № 2. - C.127-134. 7. Железнов, Б.И. О некоторых гиперпластических процессах эндометрия (вопросы терминологии и тактики врача) / Б.И. Железнов // Акушерство и гинекология. – 1973. - № 5. – C. 1-7. 8. Камерницкий, А.В. Прегна - D´-пентараны – прогестины и антипрогестины I. Разделение биологических функций стероидных гормонов / А.В. Камерницкий, И.С. Левина // Биоорганическая химия. – 2005. - № 2. - С. 115129. 9. Карева, Е.Н. Эстрогены и головной мозг / Е.Н. Карева, О.М. Олейникова, В.О. Панов // Вестник РАМН. – 2012. - № 2. - С. 48-59. 108 10. Карева, Е.Н. Мифепристон и миома матки/ Е.Н. Карева // Фарматека – 2010. - № 14. - C. 18-30. 11. Карева, Е.Н. Половые стероиды и иммунитет / Е.Н. Карева, Л.В. Ганковская, Н.Л. Шимановский // Российский иммунологический журнал. - 2012. - № 1. – С. 3-14. 12. Коган, Е.А. Рецепторный статус полипов эндометрия у женщин в постменопаузе / Е.А. Коган, Ш.Н. Саттаров, С.Э. Саркисов, М.А. Бойко, И.О. Мамиконян // Акушерство и гинекология. – 2014. - № 2. – C. 60—66. 13. Кузьмина, И.Ю. Дифференцированные подходы к выбору лечебной тактики у больных с гиперпластическими процессами эндометрия / И.Ю. Кузьмина, Н.М. Пасиешвили, О.Н. Пащенко // Международный медицинский журнал. – 2011. - № 4 - С. 61-64. 14. Кулаков, В.И. Гинекология. Национальное руководство / В.И. Кулаков, Г.М. Савельева, И.Б. Манухина. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2009. – 1150 с. 15. Радзинский, В.Е. Руководство к практическим занятиям по гинекологии / В.Е. Радзинский. - М. : МИА, 2005. – 520 с. 16. Савельева, Г.М. Гинекология / Г.М. Савельева, В.Г. Бреусенко. – 3-е изд., перераб. и доп. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2007. – 432 с. 17. Савельева, Г.М. Гинекология / Г.М. Савельева, В.Г. Бреусенко. - 4-е изд., перераб. и доп. — М.: ГЭОТАР-Медиа, 2012. — C. 432. 18. Савельева, Г.М. Современные методы диагностики и лечения гиперпластических процессов эндометрия в постменопаузе / Г.М. Савельева, В.Г. Бреусенко, Ю.А. Голова // Международный медицинский журнал. – 2005. - № 2. С. 73-77. 19. Сергеев, П.В. Биохимическая фармакология / П.В. Сергеев, Н.Л. Шимановский. – М. : Медицинское информационное агентство, 2010 г. - 624 с. 20. Сергеев, П.В. Очерки биохимической фармакологии / П.В. Сергеев, П.А. Галенко-Ярошевский, Н.Л. Шимановский. – М. : "Фармединфо", 1996. – 384 с. 109 21. Сергеев, П.В. Рецепторы физиологически активных веществ / П.В. Сергеев, Н.Л. Шимановский, В.И. Петров. - 2-е изд., перераб. и доп. – М.Волгоград : Изд-во Семь ветров, 1999. – 640 с. 22. Сидорова, И.С. Современный взгляд на проблему гиперпластических процессов в эндометрии / И.С. Сидорова, Н.А. Шешукова, А.С. Федотова // Российский вестник акушера-гинеколога. – 2008. - № 5. – С. 1922. 23. Соснина, А.В. Роль цитокинов в патогенезе злокачественных новообразований / А.В. Соснина, Н.В. Великая, А.И. Аутеншлюс. – Новосибирск : Вектор-Бест, 2013. - 80 с. 24. Табакман, Ю.Ю. Рак эндометрия / Ю.Ю. Табакман. – М. : Практическая медицина, 2009. – 176 с. 25. Токмаков, А. А. Внегеномные механизмы действия прогестерона / А.А. Токмаков, Я. Фуками // Цитология. – 2009. - № 5. – С. 403 – 416. 26. Учакин, П.Н. Нейроэндокринная регуляция иммунитета / П.Н. Учакин, О.Н. Учакина, Б.В. Тобин, Ф.И. Ершов // Вестник Российской АМН. – 2007. - № 9. – С. 26-31. 27. Фисенко, В.П. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ / под общ. ред. В.П. Фисенко. – М. : Ремедиум, 2000. – 398 с. 28. Чепик, О.Ф. Морфогенез гиперпластических процессов эндометрия / О.Ф. Чепик // Практическая онкология. – 2004. - № 1. – С. 9–15. 29. Чернобровкина, А.Е. Важнейшие события в онкогинекологии: результаты к 2010 году и перспективы / А.Е. Чернобровкина // Практическая онкология. – 2011. - №1. – С. 43-44. 30. Чиссов, В.И. Злокачественные новообразования в России в 2007 году (заболеваемость и смертность) [Электронный ресурс] / В.И. Чиссов, В.В. Старинский, Г.В. Петрова. - М. : ФГУ «МНИОИ им. П.А. Герцена Росмедтехнологий», 2009. http://www.oncology.ru/service/statistics/. – Режим доступа: 110 31. Чиссов, В.И. Состояние онкологической помощи населению России в 2011 году [Электронный ресурс] / В.И. Чиссов, В.В. Старинский, Г.В. Петрова. – М.: ФГУ «МНИОИ им. П.А. Герцена Росмедтехнологий», 2012. – Режим доступа: http://www.oncology.ru/service/statistics/. 32. Шимановский, Н.Л. Молекулярная и нанофармакология / Н.Л. Шимановский, М.А. Епинетов, М.Я. Мельников. - М.: ФИЗМАТЛИТ, 2010. - C. 338-389. 33. Яворский, А.Н. Новые знания о лекарственных средствах и информационное обеспечение регуляторного процесса / А.Н. Яворский // Клиническая фармакология и терапия. – 2010. - № 6. - C. 59-60. 34. Aerts, J.L. Evaluation of progesterone receptor expression in eosinophils using real-time quantitative PCR / J.L. Aerts, M.R. Christiaens, P. Vandekerckhove // Biochim Biophys Acta. – 2002. - Vol. 1571. - № 3. – P. 167-72. 35. Arruvito, L. NK cells expressing a progesterone receptor are susceptible to progesterone-induced apoptosis / L. Arruvito, S. Giulianelli, A.C. Flores, N. Paladino, M. Barboza, C. Lanari, L. Fainboim // J Immunol. – 2008. – Vol. 180. - № 8. – P. 5746-53. 36. Balmer, N.N. Steroid receptor coactivator AIB1 in endometrial carcinoma, hyperplasia and normal endometrium: Correlation with clinicopathologic parameters and biomarkers / N.N. Balmer, J.K. Richer, N.S. Spoelstra, K.C. Torkko, P.L. Lyle, M. Singh // Mod Pathol. – 2006. – Vol. 19. - № 12. – P. 1593-605. 37. Ben-Hur, H. Menopause is associated with a significant increase in blood monocyte number and a relative decrease in the expression of estrogen receptors in human peripheral monocytes / H. Ben-Hur, G. Mor, V. Insler, I. Blickstein, Y. AmirZaltsman, A. Sharp, A. Globerson, F. Kohen // Am J Reprod Immunol. – 1995. – Vol. 34. - № 6. - P. 363-9. 38. Boyum, A. Separation of leukocytes from blood and bone marrow / A. Boyum // Scand. J. Lab. Investig. – 1968 – Vol. 21 – № 97. - P. 1-9. 39. Butts, C.L. Progesterone inhibits mature rat dendritic cells in a receptor- mediated fashion / C.L. Butts, S.A. Shukair, K.M. Duncan, E. Bowers, C. Horn, E. 111 Belyavskaya, L. Tonelli, E.M. Sternberg // Int Immunol. – 2007. – Vol. 19. - № 3. – P. 287-96. 40. Chakravarty, D. Estrogen receptor beta (ERbeta) in endometrial simple hyperplasia and endometrioid carcinoma / D. Chakravarty, R. Srinivasan, S. Ghosh, A. Rajwanshi, S. Gopalan // Appl Immunohistochem Mol Morphol. – 2008. – Vol. 16. - № 6. – P. 535-42. 41. Chang, C.P. Non-genomic rapid inhibition of Na+/H+-exchange 1 and apoptotic immunosuppression in human T cells by glucocorticoids / C.P. Chang, S.W. Wang, Z.L. Huang, O.Y. Wang, M.I. Huang, L.M. Lu, D.C. Tarng, C.H. Chien, E.J. Chien // J Cell Physiol. – 2010. – Vol. 223. - № 3. – P. 679-86. 42. Chen, Y. Mifepristone increases the cytotoxicity of uterine natural killer cells by acting as a glucocorticoid antagonist via ERK activation / Y. Chen, Y. Wang, Y. Zhuang, F. Zhou, L. Huang // PLoS One. – 2012. – Vol. 7. - № 5. – P. 36413. 43. Collins, F. Expression of oestrogen receptors, ERalpha, ERbeta, and ERbeta variants, in endometrial cancers and evidence that prostaglandin F may play a role in regulating expression of ERalpha / F. Collins, S. MacPherson, P. Brown, V. Bombail, A.R. Williams, R.A. Anderson, H.N. Jabbour, P.T. Saunders // BMC Cancer. – 2009. – Vol. 9. – P. 330. 44. De Carvalho, S. Differential expression of estrogen and progesterone receptors in endometrial polyps and adjacent endometrium in postmenopausal women / S. de Carvalho, A.B. Campaner, S.M. Lima, M.A. Silva, P.A. Ribeiro // Anal Quant Cytol Histol. – 2011. – Vol. 33. - № 2. – P. 61-7. 45. Druckmann, R. Progesterone and the immunology of pregnancy / R. Druckmann, M.A. Druckmann // J Steroid Biochem Mol Biol. – 2005. – Vol. 97. -№ 5. – P. 389-96. 46. Ehring, G.R. A nongenomic mechanism for progesterone-mediated immunosuppression: inhibition of K+ channels, Ca2+ signaling, and gene expression in T lymphocytes / G.R. Ehring, H.H. Kerschbaum, C. Eder, A.L. Neben, C.M. Fanger, R.M. Khoury, P.A. Negulescu, M.D. Cahalan // J Exp Med. – 1998. – Vol. 188. - № 9. – P. 1593-602. 112 47. Engmann, L. Progesterone regulation of human granulosa/luteal cell viability by an RU486-independent mechanism / L. Engmann, R. Losel, M. Wehling, J.J. Peluso // J Clin Endocrinol Metab. – 2006. – Vol. 91. - № 12. – P. 4962-8. 48. Enninga, E.A. Immunomodulatory effects of sex hormones: requirements for pregnancy and relevance in melanoma / E.A. Enninga, S.G. Holtan, D.J. Creedon, R.S. Dronca, W.K. Nevala, S. Ognjanovic, S.N. Markovic // Mayo Clin Proc. – 2014. – Vol. 89. - № 4. – P. 520-35. 49. Falkenstein, E. Multiple actions of steroid hormones-a focus on rapid, nongenomic effects / E. Falkenstein, H.C. Tillmann, M. Christ, M. Feuring, M Wehling // Pharmacol Rev. - 2000. – Vol. 52. - № 4. – P. 513-56. 50. Giangrande, P.H. The opposing transcriptional activities of the two isoforms of the human progesterone receptor are due to differential cofactor binding / P.H. Giangrande, E.A. Kimbrel, D.P. Edwards, D.P. McDonnell // Mol Cell Biol. – 2000. – Vol. 20. - № 9. – P. 3102-15. 51. Gul, A. Immunohistochemical expression of estrogen and progesterone receptors in endometrial polyps and its relationship to clinical parameters / A. Gul, M. Ugur, C. Iskender, E. Zulfikaroglu, G. Ozaksit // Arch Gynecol Obstet. -2010. – Vol. 281. - № 3. – P. 479-83. 52. Howlader, N. SEER Cancer Statistics Review, 1975-2009 (Vintage 2009 Populations) [Электронный ресурс] / N. Howlader, A.M. Noone, M. Krapcho, N. Neyman, R. Aminou, W. Waldron, S.F. Altekruse, C.L. Kosary, J. Ruhl, Z. Tatalovich, H. Cho, A. Mariotto, M.P. Eisner, D.R. Lewis, H.S. Chen, E.J. Feuer, K.A. Cronin // National Cancer Institute. Bethesda, MD. – 2012. – Режим доступа: http://seer.cancer.gov/csr/1975_2009_pops09/. 53. Hughes, G.C. Progesterone and Autoimmune Disease / G.C. Hughes // Autoimmun Rev. – 2012. - Vol. 11. - № 6-7. – P. 502–514. 54. Hughes, G.C. The intracellular progesterone receptor regulates CD4+ T cells and T cell-dependent antibody responses / G.C. Hughes, E.A. Clark, A.H. Wong // J Leukoc Biol. – 2013. – Vol. 93. - № 3. – P. 369-75. 113 55. Ibrahim-Quali M. Recent advances in oxasteroid chemistry / M. Ibrahim- Quali // Steroids. – 2007. Vol. 72. - № 6-7. – P. 475-508. 56. Inceboz, U.S. Hormone receptor expressions and proliferation markers in postmenopausal endometrial polyps / U.S. Inceboz, N. Nese, Y. Uyar, H.T. Ozcakir, O. Kurtul, Y.B. Baytur, A.R. Kandiloglu, H. Caglar, I.S. Fraser // Gynecol Obstet Invest. – 2006. – Vol. 61. - № 1. – P. 24-8. 57. Iwai, K. Prognostic significance of progesterone receptor immunohistochemistry for lymph node metastases in endometrial carcinoma / K. Iwai, K. Fukuda, T. Hachisuga, M. Mori, M. Uchiyama, T. Iwasaka, H. Sugimori // Gynecol Oncol. – 1999. – Vol. 72. - № 3. – P. 351-9. 58. Jarboe, E.A. Endometrial intraepithelial neoplasia / E.A. Jarboe, G.L. Mutter // Semin Diagn Pathol. – 2010. – Vol. 27. - № 4. – P. 215-25. 59. Jazaeri, A.A. Well-differentiated endometrial adenocarcinomas and poorly differentiated mixed mullerian tumors have altered ER and PR isoform expression / A.A. Jazaeri, K.J. Nunes, M.S. Dalton, M. Xu, M.A. Shupnik, L.W. Rice // Oncogene. – 2001. – Vol. 20. - № 47. – P. 6965-9. 60. Jeon, Y.T. Steroid receptor expressions in endometrial cancer: clinical significance and epidemiological implication / Y.T. Jeon, I.A. Park, Y.B. Kim, J.W. Kim, N.H. Park, S.B. Kang, H.P. Lee, Y.S. Song // Cancer Lett. – 2006. – Vol. 239. - № 2. - P. 198-204. 61. Jones, L.A. Differential modulation of TLR3- and TLR4-mediated dendritic cell maturation and function by progesterone / L.A. Jones, S. Kreem, M. Shweash, A. Paul, J. Alexander, C.W. Roberts // J Immunol. – 2010. - Vol. 185. - № 8. – P. 4525-34. 62. Jongen, V. Expression of estrogen receptor-alpha and -beta and progesterone receptor-A and -B in a large cohort of patients with endometrioid endometrial cancer / V. Jongen, J. Briët, R. de Jong, K. ten Hoor, M. Boezen, A. van der Zee, H. Nijman, H. Hollema // Gynecol Oncol. – 2009. – Vol. 112. - № 3. – P. 537-42. 63. Kamat, A.A. EphA2 overexpression is associated with lack of hormone receptor expression and poor outcome in endometrial cancer / A.A. Kamat, D. Coffey, 114 W.M. Merritt, E. Nugent, D. Urbauer, Y.G. Lin, C. Edwards, R. Broaddus, R.L. Coleman, A.K. Sood // Cancer. – 2009. –Vol. 115. - № 12. – P. 2684-92. 64. Kidd, P. Th1/Th2 balance: the hypothesis, its limitations, and implications for health and disease / P. Kidd // Altern Med Rev. – 2003. – Vol. 8. - № 3. – P. 223-46. 65. Kowalik, M.K. The putative roles of nuclear and membrane-bound progesterone receptors in the female reproductive tract / M.K. Kowalik, R. Rekawiecki, J. Kotwica // Reprod Biol. – 2013. – Vol. 13. - № 4. – P. 279-89. 66. Kudela, M. Prognostic importance of selected molecular immunohistochemical markers and DNA ploidy in endometrial cancer / M. Kudela, R. Pilka, M. Lubusky, P. Hejtmanek, P. Dzubak, S. Brychtova // Eur J Gynaecol Oncol. – 2012. – Vol. 33. - № 2. – P. 159-63. 67. Lopes, R.G. Analysis of estrogen- and progesterone-receptor expression in endometrial polyps / R.G. Lopes, E.C. Baracat, L.C. de Albuquerque Neto, J.F. Ramos, S. Yatabe, D.B. Depesr, U.G.Lippi // J. Minim Invasive Gynecol. – 2007. – Vol. 14. - № 3. – P. 300-3. 68. Lusher, S.J. X-ray structures of progesterone receptor ligand binding domain in its agonist state reveal differing mechanisms for mixed profiles of 11βsubstituted steroids / S.J. Lusher, H.C. Raaijmakers, D. Vu-Pham, B. Kazemier, R. Bosch, R. McGuire, R. Azevedo, H. Hamersma, K. Dechering, A. Oubrie, M. van Duin, J. de Vlieg // J Biol Chem. – 2012. – Vol. 287. - № 24. – P. 20333-43. 69. Lysenko, O.N. Immunohistochemical study of the expression of receptors to steroid hormones in endometrial hyperplastic processes / O.N. Lysenko, M. Kh. Ashkhab, N.V. Strizhova, I.I. Babichenko // Arkh Patol. – 2004. – Vol. 66. - № 2. – P. 7-10. 70. Maeda, Y. Effect of progesterone on Th1/Th2/Th17 and regulatory T cell-related genes in peripheral blood mononuclear cells during pregnancy in cows / Y. Maeda, H. Ohtsuka, M. Tomioka, M. Oikawa // Vet Res Commun. – 2013. – Vol. 37. № 1. – P.43-9. 115 71. Mariani, A. HER-2/neu overexpression and hormone dependency in endometrial cancer: analysis of cohort and review of literature / A. Mariani, T.J. Sebo, J.A. Katzmann, D.L. Riehle, S.C. Dowdy, G.L. Keeney, T.G. Lesnick, K.C. Podratz // Anticancer Res. – 2005. – Vol. 25. - № 4. – P. 2921-7. 72. Markova, I. Selected immunohistochemical prognostic factors in endometrial cancer / I. Markova, M. Duskova, M. Lubusky, M. Kudela, J. Zapletalová, M. Procházka, R. Pilka // Int J Gynecol Cancer. – 2010. – Vol. 20. - № 4. – P. 576-82. 73. Matsuzaki, J. Immunosteroid as a regulator for Th1/Th2 balance: its possible role in autoimmune diseases / J. Matsuzaki, T. Tsuji, I. Imazeki, H. Ikeda, T. Nishimura // Autoimmunity. – 2005. – Vol. 38. - № 5. - P. 369-75. 74. Molloy, E.J. Sex-specific alterations in neutrophil apoptosis: the role of estradiol and progesterone / E.J. Molloy, A.J. O'Neill, J.J. Grantham, M. SheridanPereira, J.M. Fitzpatrick, D.W. Webb, R.W. Watson // Blood. – 2003. – Vol. 102. - № 7. – P. 2653-9. 75. Morville, R. The bioavailability of natural progesterone given by mouth. Measurement of steroid concentrations in plasma, endometrium and breast tissue / R. Morville, F. Dray, J. Reynier, J. Barrat // J Gynecol Obstet Biol Reprod. – 1982. – Vol. 11. - № 3. – P. 355-63. 76. Mutter, G.L. Benign endometrial hyperplasia sequence and endometrial intraepithelial neoplasia / G.L. Mutter, R.J. Zaino, J.P. Baak, R.C. Bentley, S.J. Robboy // Int. J. Gynecol. Pathol. - 2007. – Vol. 26. - № 2. - P. 103-114. 77. Mylonas, I. Normal and malignant human endometrium express immunohistochemically estrogen receptor alpha (ER-alpha), estrogen receptor beta (ER-beta) and progesterone receptor (PR) / I. Mylonas, U. Jeschke, N. Shabani, C. Kuhn, S. Kriegel, M.S. Kupka, K. Friese // Anticancer Res. – 2005. – Vol. 25. - № 3A. – P. 1679-86. 78. Ndiaye, K. Progesterone effects on lymphocytes may be mediated by membrane progesterone receptors / K. Ndiaye, D.H. Poole, S. Walusimbi, M.J. Cannon, K. Toyokawa, S.W. Maalouf, J. Dong, P. Thomas, J.L. Pate // J Reprod Immunol. – 2012. – Vol. 95. - № 1-2. – P. 15-26. 116 79. Orejuela, F.J. Estrogen and progesterone receptors and cyclooxygenase- 2 expression in endometrial cancer, endometrial hyperplasia, and normal endometrium / F.J. Orejuela, L.M. Ramondetta, J. Smith, J. Brown, L.B. Lemos, Y. Li, L.M. Hollier // Gynecol Oncol. – 2005. – Vol. 97. - № 2. - P. 483-8. 80. O'Toole, S.A. Oestrogen regulated gene expression in normal and malignant endometrial tissue / S.A. O'Toole, E. Dunn, B.L. Sheppard, O. Sheils, J.J. O'Leary, W. Wuttke, D. Seidlova-Wuttke // Maturitas. – 2005. – Vol. 51. - № 2. – P. 187-98. 81. Pauklin, S.Progesterone inhibits activation-induced deaminase by binding to the promoter / S. Pauklin, S.K. Petersen-Mahrt // J Immunol. – 2009. – Vol. 183. - № 2. – P. 1238-44. 82. ……Petrlová, B. Comparison of steroid metabolism markers in endometrium of women with endometriosis, endometrial hyperplasia and without pathological changes of endometrium / B. Petrlová, V. Hejda, Z. Ulcová-Gallová, P. Mukensnábl, Z. Rokyta // Ceska Gynekol. – 2004. – Vol. 69. - № 3. – P. 218-24. 83. Pieczyсska, B. Analysis of PTEN, estrogen receptor and progesterone receptor expression in endometrial hyperplasia using tissue microarray / B. Pieczyńska, S. Wojtylak, A. Zawrocki, W. Biernat // Pol J Pathol. – 2011. – Vol. 62. - № 3. – P. 133-8. 84. Plataniotis, G., Castiglione M. Endometrial cancer: ESMO Clinical Practice Guidelines for diagnosis, treatment and follow-up / G. Plataniotis, M. Castiglione // Ann Oncol. – 2010. – Vol. 21. - № 5. - P. 67-76. 85. Reed, S.D. Incidence of endometrial hyperplasia / S.D. Reed, K.M. Newton, W.L. Clinton, M. Epplein, R. Garcia, K. Allison, L.F. Voigt, N.S. Weiss // Am J Obstet Gynecol. – 2009. Vol. 200. - № 6. – P. 678. 86. Robinson-Rechavi, M. The nuclear receptor superfamily / M. Robinson- Rechavi, G. H. Escriva, V. Laudet // J Cell Sci. – 2003. – Vol. 116. – Pt. 4. – P. 585-6. 87. Samarnthai, N. Molecular Profiling of Endometrial Malignancies [Электронный ресурс] / N. Samarnthai, K. Hall, I.T. Yeh // Obstet Gynecol Int. - 2010. – Режим доступа: http://www.hindawi.com/journals/ogi/2010/162363/ 117 88. Sánchez Anguiano, L.F. Estrogenic receptors in hyperplasia and endometrial adenocarcinoma: immunohystochemical study with image analysis / L.F. Sánchez Anguiano, L. Puente Ledesma, E.F. Lares Bayona, R.H. Milla Villeda // Ginecol Obstet Mex. – 2007. – Vol. 75. - № 9. – P. 501-8. 89. Schmittgen, T. D. Analyzing real-time PCR data by the comparative CT method / T. D. Schmittgen, K. J. Livak // Nat Protoc. – 2008. – Vol. 3. - № 6. - P. 11018. 90. Schubert, A.K. Effects of progesterone antagonists on the eosinophilic granulocytes in the rat uterus / A.K. Schubert // Ann Anat. – 1998. – Vol. 180. - № 5. P. 401-8. 91. Silverberg, S.G. Endometrial Tumours and related Lesions. WHO Classifications of Tumours, Pathology & Genetics. Tumours of the Breast and Female Genital Organs / S.G. Silverberg, G.L. Mutter, P.A. Kubik-Huch, F.A. Tavassoli Lyon, France: IARC Press, 1994. – P. 221–232. 92. Smith, H.O. GPR30: a novel indicator of poor survival for endometrial carcinoma / H.O. Smith, K.K. Leslie, M. Singh, C.R. Qualls, C.M. Revankar, N.E. Joste, E.R. Prossnitz // Am J Obstet Gynecol. – 2007. – Vol. 196. - № 4. – P. 386.e1-9. 93. Smuc, T. Aberrant pre-receptor regulation of estrogen and progesterone action in endometrial cancer / T. Smuc, T.L. Rizner // Mol Cell Endocrinol. – 2009. Vol. 301. - № 1-2. – P. 74-82. 94. Snider, H. Sex hormones and modulation of immunity against leishmaniasis / H. Snider, C. Lezama-Davila, J. Alexander, A.R. Satoskar // Uroimmunomodulation. – 2009. – Vol. 16. - № 2. – P. 106-13. 95. Srijaipracharoen, S. Expression of ER, PR, and Her-2/neu in endometrial cancer: a clinicopathological study / S. Srijaipracharoen, S. Tangjitgamol, S. Tanvanich, S. Manusirivithaya, J. Khunnarong, T. Thavaramara, S. Leelahakorn, K. Pataradool // Asian Pac J Cancer Prev. – 2010. – Vol. 11. - № 1. – P. 215-20. 96. Stanczyk, F.Z. Progestogens used in postmenopausal hormone therapy: differences in their pharmacological properties, intracellular actions, and clinical effects 118 / F.Z. Stanczyk, J.P. Hapgood, S. Winer, D.R. Jr. Mishell //Endocr Rev. – 2013. – Vol. 34. - № 2. – P. 171-208. 97. Stoian, S.C. Endometrial carcinomas: correlation between ER, PR, Ki67 status and histopathological prognostic parameters / S.C. Stoian, C. Simionescu, C. Mărgăritescu, A. Stepan, M. Nurciu // Rom J Morphol Embryol. – 2011. – Vol. 52. - № 2. – P. 631-6 98. Su, L. Progesterone inhibits Toll-like receptor 4-mediated innate immune response in macrophages by suppressing NF-kappaB activation and enhancing SOCS1 expression / L. Su, Y. Sun, F. Ma, P. Lü, H. Huang, J. Zhou // Immunol Lett. – 2009. - Vol. 125. - № 2. – P. 151-5. 99. Suba, Z. Carcinogenesis theory based on estrogen deficiency / Z. Suba // Orv Hetil. – 2009. – Vol. 150. - № 25. – P. 1155-66. 100. Suthipintawong, C. Prognostic significance of ER, PR, Ki67, c-erbB-2, and p53 in endometrial carcinoma / C. Suthipintawong, C. Wejaranayang, C. Vipupinyo // J Med Assoc Thai. – 2008. – Vol. 91. - № 12. – P. 1779-84. 101. Tait, A.S. The role of glucocorticoids and progestins in inflammatory, autoimmune, and infectious disease / A.S. Tait, C.L. Butts, E.M. Sternberg // J Leukoc Biol. – 2008. – Vol. 84. - № 4. – P. 924-31. 102. Tanenbaum, D.M. Crystallographic comparison of the estrogen and progesterone receptor's ligand binding domains / D.M. Tanenbaum, Y. Wang, S.P. Williams, P.B. Sigler // Proc Natl Acad Sci U S A. – 1998. – Vol. 95. - № 11. – P. 5998-6003. 103. Taylor, R.N. Promegestone (R5020) and mifepristone (RU486) both function as progestational agonists of human glycodelin gene expression in isolated human epithelial cells / R.N. Taylor, J.F. Savouret, C. Vaisse, J.L. Vigne, I. Ryan, D. Hornung, M. Seppälä, E. Milgrom // J Clin Endocrinol Metab. - 1998. – Vol. 83. - № 11. – P. 4006-12. 104. Teleman, S. An immunohistochemical study of the steroid hormone receptors in endometrial hyperplasia / S. Teleman, M. Hilgarth, N. Freudenberg, H. 119 Bettendorf, M.S. Mihailovici // Rev Med Chir Soc Med Nat Iasi. – 1999. – Vol. 103. № 1-2. – P. 138-41. 105. Thomas, P. Steroid and G protein binding characteristics of the seatrout and human progestin membrane receptor alpha subtypes and their evolutionary origins / P. Thomas, Y. Pang, J. Dong, P. Groenen, J. Kelder, J. de Vlieg, Y. Zhu, C. Tubbs // Endocrinology. – 2007. – Vol. 148. - № 2. - P.705-18. 106. Vandenput, I. Evolution in endometrial cancer: evidence from an immunohistochemical study / I. Vandenput, J. Trovik, K. Leunen, E. Wik, I. Stefansson, L. Akslen, P. Moerman, I. Vergote, H. Salvesen, F. Amant // Int J Gynecol Cancer. – 2011. – Vol. 21. - № 2. – P. 316-22. 107. Vrachnis, N. Immune aspects and myometrial actions of progesterone and CRH in labor [электронный ресурс] / N. Vrachnis, F.M. Malamas, S. Sifakis, P. Tsikouras, Z. Iliodromiti // Clin Dev Immunol. - 2012. – Vol. 2012. – Режим доступа: http://dx.doi.org/10.1155/2012/937618 108. Witkiewicz, A.K. Increased natural killer cells and decreased regulatory T cells are seen in complex atypical endometrial hyperplasia and well-differentiated carcinoma treated with progestins / A.K. Witkiewicz, T. McConnell, M. Potoczek, R.V. Emmons, R.J. Kurman // Hum Pathol. – 2010. – Vol. 41. - № 1. – P. 26-32. 109. Wolfson, M.L. Progesterone reverts LPS-reduced FAAH activity in murine peripheral blood mononuclear cells by a receptor-mediated fashion / M.L. Wolfson, J. Aisemberg, A.I. Salazar, A.P. Domínguez Rubio, C.A. Vercelli, A.M. Franchi // Mol Cell Endocrinol. – 2013. - Vol. 381. - № 1-2. – P. 97-105. 110. Xu, Y. Immunosuppressive effect of progesterone on dendritic cells in mice / Y. Xu, H. He, C. Li, Y. Shi, Q. Wang, W. Li, W. Song // J Reprod Immunol. – 2011. – Vol. 91. - № 1-2. – P.17-23. 111. Yao, Y.Y. Relationships between the molecular biomarkers and the clinicopathologic features and prognosis in endometrial carcinoma / Y.Y. Yao, W.Z. Xu, Y. Wang, D.H. Shen, J.L. Wang, L.H.Wei // Beijing Da Xue Xue Bao. – 2011. – Vol. 43. - № 5. – P. 743-8.
