• . : ' /6Ж

МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА СССР
Ульяновский сельскохозяйственный институт
• /6Ж .
: '
На правах
рукописи
Аспирант безотрыва от производства
Г. Б.
Эвранова
ГИСТОХИМИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ОВОГЕНЕЗА
КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА В ВОЗРАСТНОМ АСПЕКТЕ
В НОРМЕ
,
г - . ' . '
И ПРИ НЕКОТОРЫХ ПАТОЛОГИЧЕСКИХ СОСТОЯНИЯХ
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Научный руководитель,
доктор ветеринарных наук,
профессор Н. А. Крылова
УЛЬЯНОВСК —1964
ft
'""l * " \ Л А Д А Л
• \
\\:
О
O^J-JJ^J)
МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА СССР
Ульяновский сельскохозяйственный институт
На правах рукописи
Аспирант без отрыва от производства
Г. Б. Э'вранова
'
-> .
Гй^бхймический" а:н*алйз' овогенеза1
крупного рогатого скота в возрастном
аспекте в норме и при некоторых
патологических^ состояниях
Автореферат
диссертации на' соискание ученой" cf eneiiit
кандидата биологических паук
НаучныЛ руководитель,
доктор ветеринарных паук,
профессор Н. А. Крылова
УЛЬЯНОВСК— 1964
•Диссертационная работа выполнена на кафедре пато­
физиологии Казанского ветеринарного института
Она.содержит 146 страниц машинописи:
Введение — 3 стр.; обзор литературы— 30 стр.; материал
и методы исследования — 9 стр.; собственные исследова­
ния — 61 стр.; анализ полученных результатов — 10 стр.;
выводы—5 стр. Список литературы содержит (311 назва­
нии)—26 стр. Текст иллюстрирован 60 микрофотография­
ми.'" •. ' "' ' - ' ' ' •
' -' '
Официальные оппоненты:
'••--.
-
Доктор биологических наук, профессор И. И. Доманов
Кандидат биологических наук, доцент В. Лх Щеткова
Защита
диссертации
состоится
в Совете
сельскохозяйственного института
Автореферат разослан
Ульяновского
^ ^ i n f k*S
;
1964 Г.
1964 f.
Одной из основных задач семилетнего плана народного
хозяйства СССР является резкое увеличение поголовья
скота и повышение его продуктивности.
Решение этой задачи возможно благодаря проведению
различных мероприятии, направленных к ликвидации бес­
плодия животных. Ритмическое течение процесса размно­
жения у животных обусловливает постоянные морфоло­
гические и функциональные изменения яичников. Причины
бесплодия разнообразны. Анализ их и пути ликвидации
даны в учении А. П. Студениста о бесплодии животных
(1953 г.), которое явилось основанием для проведения
наших исследований. Нередко причины связаны с физио­
логическим состоянием половой системы, прежде всего
с нарушениями функции половых желез. В настоящее
время известно, что одним из основных химических ком­
понентов клетки и ткани в животном организме являются
нуклеиновые кислоты. Они участвуют в образовании ядра,
цитоплазмы и , пепосредствеинио ' связаны с обменом
веществ, поэтому изучение морфологии нуклеиновых кис­
лот в яичнике предствавляет большой интерес в этом
сложном и динамичном органе.
• Другими важными химическими компонентами живот­
ной клетки являются , углеводы, в частности, гликоген.
Изучение содержания его в яичнике крупного рогатого
скота имеет: большое значение, т. к. воспроизведение
яйцеклетки связано со сложной перестройкой половой
железы на различных этапах онтогенеза, начиная с эмбри­
онального развития и кончая периодом функционального
затухания органа.
Не меньший интерес представляет и определение
активности различных ферментных систем в клеточных
элементах яичника с учетом формирования фолликулярно­
го аппарата.
Изучение литературы показало, что нуклеиновые кис­
лоты все чаще привлекают внимание биологов, а в связи
з<-;
с этим увеличивается количество работ, посвященных
изучению хнмическах компонентов, в том числе и нуклеи­
новых кислот в онтогенезе у низжих животных: кишечно­
полостных, червеобразных,
членистоногих, иглокожих,
простейших (Н. А. Богомолова, 1956; А. А. Савич, 1959;
В. Г. Петрова, 1У59 и ряд других). Работ же по изучению
цитохимии яичника у млекопитающих, в частности, у
крупного : рогатого скота, еще сравнительно мало. Эти
работы,нужны потому, что при помощи . современных
методов гистохимических, исследований можно установить
изменения химического состава клеток в период ро'ста,
деления при нормальных и патологических условиях и
разрешить целый ряд теоретических вопросов, тесно свя­
занных с практикой животноводства.
В частности, для выявления точной локализации вну­
триклеточных веществ и их значения при некоторых
формах-бесплодия у крупного рогатого скота, необходимо
знать химию клеточных структур в норме, а это может
быть достигнуто путем изучения жизнедеятельности клет­
ки организма животного'в онтогенезе.
Учитывая все это, мы поставили перед собой задачи:
...1.' Установить динамику нормальных функциональных
изменений яичника в онтогенезенв связи с цикличностью;
2, Выявить патологические отклонения в обменных
цррцессах этого органа, ведущие к бесплодию.
,v"'."v.''
Материал л методы исследования
Объект исследования — яичники от 170 голов крупного
рогатого скота, в том числе плодного периода (от 2 до
9 месяцев) от 51 головы и постнатального (от 10 дней
до 15 лет] от 71 головы по следующим
возрастным груп­
?
пам:"'
:
"2'месяца плодного периода— 5 голов
^
\'\'\''А:''\'
( —-У
•?;.••.
-
:4
Я
»
•>.
»
. -
»
:,":
;
п
и
Всего
*
-
О
1 0
',
А^
П
-
».'"•..,
п
, 5 1 •..•••
> . •
.
Телочки 10 дней постнаталыюго периода 2 головл
Телочки 6 месяцев
„
2 " .
л
От 8 месяцев до 1 года
10
„
Телки от 18 месяцев до 2 лет
40
I
Коровы 3— 5 лет
5
„
Коровы 8 - 1 5 ,
12
„
Всего
71 голова
После забоя коровы и извлечения плода тотчас же
брали яичники и исследовали их. Для определения воз­
раста плода пользовались классификацией А. П. Студенцова (1953), а у взрослых животных — А. Ф. Доброхотова
(1959). Материал в основном собирали в 1959—1962 гг.
в октябре—ноябре на Казанском мясокомбинате. Для
определения половой цикличности у 15 клинически здоро­
вых коров перед забоем проводили ректальное исследо­
вание и наблюдали за ними. У остальных (из 71) макро­
скопически исследовали половой аппарат. От 48 голов
половозрелых животных брали крупные фолликулы. Объ­
ектом исследования служили также яичники бесплодных
коров, выбракованных в различных хозяйствах Татарии.
Для выявления нуклеиновых кислот мелкие кусочки
яичника и отдельные фолликулы только что забитых жи­
вотных в течение 3 часов фиксировались в смеси Карнуа
и в течение 4—10 часов в 12°/° нейтральном формалине
рН 6,8. Кусочки исследуемого материала заливали в : па­
рафин, а при работе с нежной тканью—в желатину с
последующим уплотнением 0 ее в формалине в течение
1 часа при температуре-)-22 С, хранили блоки при—4СС.
Срезы окрашивались пиронипом-метиловым зеленым по
методу Браше. Для детального изучения распределения
исследуемых веществ в этом сложном органе размноже­
ния необходима специальная аппаратура. Примененная
нами ультрафиолетовая микроскопия дала возможность
более глубоко изучить нуклеиновый обмен в яичнике.
Преимущество ультрафиолетового микроскопа заключает­
ся в том, что нуклеиновые кислоты неокрашенной ткани
поглощают ультрафиолетовые лучи длиной волны 260—280
•ммк. В дополнение к этому применялась ультрафиолето­
вая флюоресценция, основанная на самосвечений объекта
исследования
в .профильтрованном ультрафиолетовом
излучении.
5
Кроме визуального наблюдения, препараты фотографи­
ровались по разработанной Брумбергом методике. Абсорб­
ция ультрафиолетовых лучей пуриновыми и пиримидиновыми основаниями отмечалась регистрирующим устрой­
ством — спектрофотометром МФ-4. Для сопоставления
циклических изменений органа по отношению к исходной
йзрме мы использовали
микроскоп сравнения. Часть
препаратов сфотографирована в фазово-контрастном мик­
роскопе. Наиболее характерные изменения сфотографиро­
ваны под микроскопом и представлены в виде простых
и цветных снимков.
В качестве экстрагирующих веществ для рибонуклеи­
новой кислоты (РНК) использовали кристаллическую
рибонуклеазу (Пирс Э., 1956, 1962), рибонуклеазу из под­
желудочной железы, трихлоруксусную,
хлорную и ряд
других кислот; д л я дезоксирибонуьлениовой кислоты
(ДНК) применяли метод окраски без гидролиза в HCL.
Основным фиксатором для выявления фосфомонозстеразы-1 яичника послужил абсолютный ацетон при—4СС
в течение 4-х часов с последующей заливкой в парафин.
Щелочную фосфатазу выявляли методом Гомори с глице­
рофосфатом натрия. Для выявления полисахарида кусочки
ткани фиксировали в жидкости Карнуа, Шабадаши Жандра и заливали в парафиновые блоки. Срезы толщиной в
7 микрон обрабатывали Шифф-йодной кислотой по МакМанусу (ШИК). Для подтверждения специфичности реак­
ции гликогена контрольные срезы перед обработкой под­
вергали действию амилазы по Пирсу Э. (1956).
Результаты исследования
У 2 -3-месячного плода крупного рогатого скота по­
ловая железа (до 2 мм длины) достаточно дифференциро­
вана н можно безошибочно определить, относится ли она
к мужской или женской особи. Яичник в-' этой стадии
развития на гистологическом срезе, окрашенном по мето­
ду Браше, показывает четкое разделение на фолликуляр­
ную (корковую) и сосудистую .зоны.
Пнронинофилия корковой зоны является доказатель­
ством того, что клеточная масса, являющаяся в основном
продуктом размножения зачаткового слоя эпителия, пред­
ставляет исходную эмбриональную ткань, 'образующую
6
11бловь1е. и фолликулярные клетки. Ткань эта отличается
высоким содержанием РНК и рибонуклеопротеидов.
Детальный гистохимический анализ показывает, что
РНК в различных частях коркового вещества содержится
в неодинаковом количестве и распределяется в соответ­
ствии с ходом дифференцировки клеточных элементов.
Наибольшая концентрация РНК в этом периоде развития
обнаруживается в периферических слоях зародышевого
яичника —в покровном эпителии и в близлежащих к нему
клеточных скоплениях.Протоплазма этих морфологически
еще однородных клеток диффузно • окрашивается в яркомалиновый цвет, ДНК в ядрах этих же клеток выявляется
в виде глыбок. Большинство ядер находится в стадии
покоя.
. '. .."
Следующая более глубокая и более широкая часть
фолликулярной зоны представляет собой огромное скоп­
ление уже более крупных овогонни — диаметром до 18
микрон. Клетки, расположенные группами, почти все на­
ходятся в состоянии деления, ядра имеют форму рыхлого
и плотного клубка. Численное нарастание клеток этой
зоны в результате активного размножения отчасти вырав­
нивается гибелью отдельных клеток или группы их в
форме отдельной гнездной генерации. Все перечисленные
факторы — клеточное деление, рост клеток, резорбция —
неизбежно обусловливают различные физиологические
состояния клеточных форм. Так, например, в более наруж­
ных пакетах клеток, расположенных непосредственно под
покровным эпителием, где находится исходный пункт к
массовому их делению, цитоплазма сравнительно богата
РНК. В средних же слоях, после, очевидно, несколько
повторных делений, обнаруживаются лишь следы РНК, а
в смежных с сосудистой зоной группах клеток, где реже
обнаруживаются фигуры мнтотических делений, концент­
рация РНК в овоплазме возрастает. Содержание ДНК в
ядрах овогоний у двухмесячного плода выявляется в
форме хромосом в состоянии митоза или в виде мелких
глыбок хроматина. Сосудистая зона, состоящая из нежной
мезепхимной ткани, характеризуется меньшим-содержа­
нием РНК.
В протоплазме этих* клеток РНК окрашива.ется на­
столько слабо, что вокруг ядер едва можно заметить мел­
кую нежнорозозую зернистость. Ядра тканевых клеток
окрашиваются метиловым зеленым в зеленоватый цвет.
7
В яичнике трехмесячного плода (4Х^ мм) почти вся
толща фолликулярной зоны заполнена первичнымифолликулами размером от 20 до 30 микрон. Ядра овоцитов
приобретают пузырчатый вид, размер их увеличивается,
реакции на ДНК значительно' ослабляются. Интенсивную
реакцию на РНК дают ядрышки размером 1,5 микрона,
лежащие по одному или по два в каждом ядре. С ростом
фолликула овоплазма накапливает РНК. Среди разьизающнхся фолликулов встречаются с признаками атрезии.
Под покровным , эпителием начинает формироваться сое­
динительнотканная оболочка, отделяющая зачатковый эпи­
телий от паренхимы яичника. Фолликулярный эпителий
дает более сильную реакцию на оба типа нуклеиновых
кислот, чем яйцеклетка этого фолликула.
1
• Высокий уровень содержания гликогена в гранулярном
виде Свойственен строме, особенно в тех -местах, где
расположены овогопни.
Сосудистая зона содержит значительное количество
гликогена. Группы овогоний, объединенные в пакеты и
занимающие большую ЧЕСТЬ поверхности среза яичника,
гликогена не содержат.
Изучение яичника 4-месячпого плода размером-4X3 мм
показало, что на срезе его отмечается более прогрессив­
ный рост сосудистой зоны за счет разрастания соедини­
тельной ткани, тогда как фолликулярная зона кажется
относительно суженной. Развивающиеся фолликулы дости­
гают размера 28 микрон. Наиболее крупные из них^лежат
преимущественно в глубоких слоях. РНК :в цитоплазме
овоцитов таких фолликулов раеггеделяетен равномерно в
виде мелкой зернистости розово-малинового цвета.-ДНК
в ядерном хроматине окрашивается слабо, но иногда хо­
рошо выявляется вокруг ядрышек.. Фолликулярный эпите­
лий к этому времени принимает форму кубических и ци­
линдрических клеток, в протоплазме которых содержится
большое количество РНК. Ядра их отличаются высоким
содержанием ДНК. Дегенерирующие формы яйцеклеток
теряют РНК, цитоплазма их выглядит светлой, вакуолпзич рованной, сморщенной; реже можно наблюдать 'зернистый
распад протоплазмы, ядра пикнотичпы. Вся строма яични­
ка 4-х месячного плода густо заполнена мелкими зернами
гликогена, являющегося одним из признаков •трофической
функции питающих клеток.
•а
Цитохимические картины показывают, .что питающая
функция клеток появляется задолго до развития фоллику­
ла. Сами овоциты в 4 месяца гликогена не содержат.
Мелкораздробленные полисахариды соответствуют нор­
мальной ассимиляции межуточной ткани корковой зоны.
Сосудистая зона яичника содержит большое количество
гликогена в виде мелкой зернистости.
Яичник 5-месячных плодов (5X3 мм) характеризуется
образованием вторичных фолликулов, яйцеклетки которых
начинают заметно накапливать в цитоплазме РНК. У
5-месячной телочки строма яичника на всем протяжении
содержит меткозернистый гликоген. Постепенно из боль­
шого количества первичных фолликулов в процессе их
роста возникают вторичные фолликулы, основным призна­
ком которых является многорядная оболочка из фоллику­
лярного эпителия.
Фолликулярный эпителии содержит
незначительное
количество полисахарида; концентрация которого в даль­
нейшем медленно возрастает.
В яичнике 6-месячного плода регенеративная актив­
ность в покровном эпителии снижается, но содержание
РНК в плазме его клеток остается высоким. Корковая
зона состоит из первичных и вторичных фолликулов, при­
чем в более крупных из них появляются полости с фол­
ликулярной жидкостью. Фолликулярный эпителий, обеспе­
чивающий обменные процессы овоцитов, независимо от
величины последних, неизменно удерживает концентрацию
РНК на высоком уровне. Появляются закладки внутренней
тэки интерна с меньшим содержанием РНК и ДНК, чем в
элементах гранулезы. Овоциты в отношении содержания
нуклеиновых кислот и гликогена заметных изменений не
обнаруживают. Общее количество фолликулов в корковой
зоне яичника меньше, чем в предшествующие периоды
развития.
Яичник 7-8-9-месячных плодов характеризуется нали­
чием массы первичных фолликулов и превращением части
из них во вторичные фолликулы. Цитоплазма яйцеклетокмаленьких фолликулов умеренно и равномерно окраши­
вается пиронпном в розово-малиновый цвет и имеет чрез­
вычайно мелкую зернистость. В более крупных фолликулах
с момента образования фолликулярной жидкости в цитоп­
лазме появляются крупные базофнльные гранулы. В на­
чальном периоде они сосредоточены на периферии кле9
точного тела, д затем, прогрессивно накапливаясь в массе,
все более широким кольцом охватывают цитоплазму
вокруг ядра. При этом всегда хорошо можно заметить
границу между нарастающей зернистостью п убывающей
частью гомогенной протоплазмы. Зернистость заметна
при слабом увеличении микроскопа и в более крупных
овоцитах. На фоне ее видны крупные гранулы, сильно
окрашивающиеся пиронпном н имеющие близкое сходство
с ядрышками клеточного ядра.
После обработки панкреатической рибонуклеазой гра­
нулы не окрашиваются, следовательно, с гистохимической
точки зрения мы должны рассматривать все эти глыбки
(мелкие н крупные) как продукт постоянного синтеза РНК.
Туника альбугинеа 7-8-месячных плодов содержит не­
значительное количество гликогена. Уже на ранних сту­
пенях развития имеет место избирательная локализация
гликогена. В разветвлении крупных кровеносных сосудов
можно обнаружить. самые крупные фолликулы, с двумя
пли несколькими слоями зернистых клеток. Гранулы гли­
когена в половых клетках этих фолликулов накаплива­
ются по мере роста яйца н размещаются в возрастающей
степени.
Основное значение изменений, происходящих в зер­
нистых клетках фолликула, состоит в подготовке их к
дальнейшему функционированию в качестве питающих
овоцит элементов. По мере поступления гликогена в
овоплазму, он занимает всю центральную часть, однако
ядро его совершенно лишено этого важного химического
компонента и выглядит в виде пустого пузырька. Фолли­
кулярный эпителий снабжает растущее яйцо питательным
материалом. Вся его внутренняя ^организация является
.приспособлением для выполнения только одной задачи:
образования и передачи энергетического материала. Хи­
мические свойства плазмы фолликулярного эпителия, пи­
тающие яйцевую клетку, основную массу гликогена
содержат во внутренних участках зоны гранулезы. Осо­
бенно это характерно для 8-9-месячних плодов утробного
развития.
' t
••"'.'••.."'
В яичнике плодного периода основным местом отло­
жения углеводов в виде зерен и крупных гранул, служа­
щих резервом для физиологического режима органа, явля­
ется корковая зона под тупика альбугинеа. Рост овоцитов и протекающие в нем синтезы осуществляются фолЮ
ликулярнымй клетками. Плотное насыщение гликогеновыми
зернами наблюдается в гранулезных клетках яйценосного
бугорка растущего фолликула. Исключение, составляют
их ядра. Вдоль хода крупных сосудов, стенок средних
и мелких артерпол и капилляров наблюдается скопление
полисахарида в виде глыбок и зерен. Другим изменением,
наступающим очень рано, является уменьшение концепт-'
рации гликогена в овоците, т. е. задержка поступления
питательного материала. В этих случаях мы наблюдаем
атрезию молодого растущего фолликула и заполнение
полости железистыми клетками.
. ~ •
:
ПОСТМАТАЛЬНЫЙ ПЕРИОД
Зародышевый эпителий, кора и мозговая часть яичника
Зародышевый эпителий в первые дни жизни телочки
отличается значительной протоплазматической базофилией,:
т. е. избирательно окрашивается пиронином в ярко розо
вый цвет. Корковая зона яичника в этом возрасте содер­
жит большое количество первичных фолликулов. Обна­
ружение в цитоплазме овоцитов яркой пиронинофнлыюй
зернистости говорит о богатом содержании РНК в поло­
вых клетках. Что касается ферментов, то выявленная
нами фосфомоноэстераза 1 в яйце отсутствовала,. она
давала реакцию в виде зернистого черного осадка в яд­
рах клеток, окружающих овоцит. Фосфатазная активность
совершенно отсутствовала как в покровном эпителии,
так и в строме.
По мере роста животного деятельность яичника уси­
ливается, достигая наибольшего количества растущих
фолликулов: на одном срезе насчитывается до 7 граафовых
пузырьков различной величины (с 1,5 до 3-4 лет). Для
того, чтобы выявить динамику изменения нуклеиновых
кислот и ферментов в зависимости от физиологического
состояния организма,'мы сравнивали локализацию изуча­
емых веществ в процессе овогенеза яичника одного возраста
(в 1,5 года) в стадию возбуждения при общей реакции
организма, в послеовуляцнонный период, беря за основу
стадию уравновешивания.
РНК увеличивается в строме яичниковой ткани в ста­
дии возбуждения полового цикла и уменьшается в пос­
ледние ее дни, особенно при формировании желтого тела
И '
из кровяного сгустка. Скопление зернистости различной
величины в растущих фолликулах говорит о накоплении
в них РНК, фосфатазиоп активности как в тэка интерна,
так и гранулезе. Ядрышко обладает высокой концентра­
цией РНК. Фолликулярный эпителий также богат нукле­
иновыми кислотами. Такое заключение можно сделать
на основе изучения клеток с помощью микроскопии в
ультрафиолетовых лучах длиной волны 250-280 ммк.
Для подтверждения наличия РНК те же препараты^мы
обрабатывали кристаллической рибонуклеазой, приготов­
ленной на буфере рН-6,8. Ультрафиолетовая микроскопия
более полно определяет содержание нуклеиновых кислот,
т. к. срезы ' не подвергаются никакой гистохимической
обработке. На станин сформированного фолликула эпите­
лий несколько снижает .пиронинофильносгь в тэка ин­
терна и граиулезе.
Щелочная фосфатаза в эпителии молодых граафовых
пузырьков более активна, чем в зрелых, но по мере
роста фолликула эпителий его теряет ферментную актив­
ность в зоне гранулеза и увеличивается в тека интерна.
По мере роста крупных и предовуляционных фоллику­
лов в цитоплазме яйца отмечается снижение содер­
жания РНК.
Сравнительное изучение РНК и ДНК гистохимичес­
кими методами в корковой зоне яичника показало прямую
зависимость между исчезновением нуклеиновых кислот
и возрастом животного. Строма яичника, начиная с 3летнего возраста, постепенно теряет РНК в своих клетках.
Атретические фолликулы
Проводимые исследования показали, что дегенерацияяйцевых клеток сопровождалась резко выраженными гис­
тохимическими изменениями: "снижением интенсивности
реакции РНК в цитоплазме и ядрышке яйца и уменьше­
нием содержания ДНК в ядре.
х
В цитоплазме дегенерирующего яйца отмечается отсут­
ствие гранулярного гликогена. В начале атрезии фолли­
кула происходит исчезновение полисахарида в клетках
фолликулярного эпителия.
12
Исследование яичников бесплодных коров
Нами были исследованы яичники 7-8-летних коров,
имевших различные формы бесплодия в течение 2-3 лет.
Гистохимическая картина
Подэпителиальный слой, соответствующий тунике альбугинеа, склерозирован, клеточный состав резко разрежен.
Основную массу составляют гомогенизированные волокна
соединительной ткани. В паренхиме яичника в неболь­
шом количестве встречаются первичные и вторичные
фолликулы, главным образом по периферии корковой
зоны. Большая часть растущих фолликулов находится
в состоянии атрезии. Отмечается массовая вакуолизация
цитоплазмы яйцевых клеток с минимальным содержанием
РНК и ДНК. Полученные кривые поглощения ультрафи­
олетовых лучей нуклеиновыми кислотами носят довольно
однообразный характер распределения исследуемого ве­
щества, количество которого сведено до минимума.
Абсолютное преобладание в яичнике соединительной
ткани, крайнее истощение половых клеток и нааичпе
дегенеративных форм развивающихся овоцитов, начиная
с прнмордиальных фолликулов, свидетельствуют о пато­
логическом процессе овогенеза и связанного с ним бес­
плодия коров. Что касается распределения гликогена, то
в вакуолнзированной половой клетке он имеется в незна­
чительном количестве. В мелких растущих фолликулах,
незатронутых дегенеративным процессом, яйцевые клетки
содержат РНК в пределах нормы. Особенно сильное
обеднение этими химическими компонентами наблюдается
в кистозном образовании, возникновение которого связано
несомненно с изменением трофики в отдельных структу­
рах фолликула. Вместо крупных фолликулов у исследо­
ванных животных, мы находили кистозные полости без
овоцитов и фолликулярного покрова. Судя по картине
всего фолликулярного состава, можно предположить, что
в этом яичнике развивающиеся фолликулы не достигают
стадии зрелого граафова пузырька и, следовательно, ову­
ляция исключается. •
-ч
13
АНАЛИЗ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ
Изложенный материал позволяет сделать вывод, что
поглощение нуклеиновыми кислотами ультрафиолетовых
лучей и количество адсорбции ими красок зависит от
природы тканей, состояния организма, возраста клеток
и тканей яичника. Детальное гистохимическое изучение
большого количества серийных срезов, начиная от яични­
ков плодов, величиной с просяное зерно, и кончая круп­
ными, достигающими размера 1214 мм, взятыми от поло­
возрелых животных с предовуляционными фолликулами,
дало нам возможность установить некоторые законо­
мерности.
Следует отметить, что гистохимическое выявление
нуклеиновых кислот в яичнике млекопитающих в онтоге­
незе изучено далеко недостаточно, поэтому мы не всегда
имели возможность проводить сравнения наших данных
с имеющимися литературными данными. Особенно это ка­
сается тех результатов, которые были получены нами с
помощью физических методов исследования.
Из наших наблюдений, а также из работ других авто­
ров следует, что половая железа 2,5—3-месячных плодов
крупного рогатого скота уже достаточно дифференциро­
вана, чтобы безошибочно определить: относится ли она
к мужской или женской особи. Яичник в этой стадии раз­
вития на гистологическом срезе показывает четкое разде­
ление на фолликулярную и сосудистую зоны. В гистохи­
мическом отношении, при выявлении нуклеиновых кислот
корковое вещество резко отличается свойством выражен­
ной базофилии, т. е. более интенсивной окраской ткани
пиронином в красный или малиново-розовый цвет. Это
свойство пиронинофилни н является ( как раз доказатель­
ством того, что клеточная масса коркового слоя, явля­
ющаяся в основном продуктом, размножения зачаткового
слоя эпителия и представляющая, следовательно, исход­
ную эмбриональную ткань для образования половых и
фолликулярных клеток,-является высокоактивной в отно­
шении обменных процессов.
Половые клетки в яичнике 2-3-месячных плодов нахо­
дятся в состоянии массового деления, в результате чего
к 4-месячному возрасту плодного развития вся корковая
зона половой железы оказывается переполненной группо­
выми скоплениями этих клеток. Всюду можно видеть фи14
rypu кариоинеза в форме рыхлого и плотного клубка.
Это говорит о том, что максимум продукции половых
клеток относится к этому периоду онтогенеза. В процес­
се деления овогоиип предстапляется наиболее удобный
случаи убедиться в наличии колебаний содержания как
РНК, так и ДНК.
Подробное изложение этого вопроса обобщено в ли­
тературном обзоре Б. В. Ксдропским (1959).
Не менее демонстративные изменения -наблюдаются и
в отношении содержания РНК. После нескольких повтор­
ных делении овогоиип мы обнаружили в них лишь следы
РНК.
Исчезновение РНК в цитоплазме и ядрышке после де­
лений клеток признается закономерным явлением "н отме­
чается в целом ряде работ (Л. Б. Левиисон, Н. Д. Лагова,
1949; Г. И. Роскин, М ; Е. Струве, Г. А. Оглоблнна, И. X.
Хатаб, 1961; Мэзиа — Mazia G. 1961). В соответствии с
литературными данными по этому вопросу Я. Г. Эренпрейс (1963) снижение РНК в делящихся клетках объяс­
няет двумя способами: . 1 ) неспособностью клетки с кон­
денсированными. хромосомами синтезировать РНК, 2)
частичным разрушением имеющейся РНК".
В самых глубоких слоях корковой зоны, где реже об­
наруживаются фигуры мнтотического деления, по.тбвые
клетки начинают восстанавливать утраченную РНК как
в цитоплазме, так и в ядрышках. Ядрышки при этом уве­
личиваются, а некоторые из них достигают размера 1,5
ммк в диаметре. Цитоплазматические изменения в сторо­
ну увеличения РНК являются верным признаком . интен­
сивного роста клеток. Это подтверждается рядом работ:
Б. .В. Кедровский (1959), Ж. Браше (1960—1961), Г. П.
Георгиев (1961), Г. П. Георгиев, О. П. Самарина (1961),
И. Б. Збарскнй(]961), Браше, Шантрен, Вандерхаге (Вгасhet.J, Chantrenne H, Vanderh?ghe F, 1955), Альтман (Altman Н., 1655).
С формированием первичных и, вторичных фолликулов
наблюдается дальнейшее усиление синтеза РНК в поло­
вых клетках в форме мелкой и крупной зернистости, за­
полняющей всю цитоплазму от периферии к центру.
...v,.';.. Щелочная фосфатаза и гликоген, как уже указывалось
ранее, .начинают обнаруживаться в цитоплазме овоцитов
в янчпнке 4—5-месячных плодов в период формирования
15
первичных фолликулов, т. е. вместе с образованием обо­
лочки из фолликулярного эпителия. Яйцеклетки, объеди­
ненные в пакеты, этих химических компонентов еще не
содержат.
Несмотря на отсутствие гликогена в половых клетках
2—4-месячных плодов, межуточная ткань коркового слоя
отличается высоким уровнем гранулярного полисахарида.
Когда яйцо требует повышенного обмена веществ,
образование вторичного фолликула зависит от клеточных
элементов.
Гликоген яйцевая клетка получает от основного ре­
зерва — яйценосного бугорка, который представляет собой
клетки, насыщенные полисахаридом.
Исследования гликогена интересны в том отношении,
что они дают возможность получить характеристику об­
мена веществ в фолликулярном эпителии, питающем яй­
цевую клетку.
• •.
В силу того, что клетки тэки интерна продуцируют
секрет в фолликулярную жидкость, а клетки зоны гранулезы при быстром росте фолликула обладают интенсив­
ным делением н ростом, то все они характерны выражен­
ной базофилией, т. е. содержат значительные количества
РНК.
'
Судя по выше, описанному процессу обмена нуклеи­
новых кислот и, особенно гликогена, в результате раз­
вития фолликула, можно сказать, что фолликулярный эпи­
телий играет существенную роль в питании яйца, перено­
ся питательные вещества из кровеносных сосудов к по­
ловой клетке.
Наши выводы относительно тканевого обмена согла­
суются сданными ряда авторов, полученными на экспе­
риментальном материале с помощью меченых атомов S:!5,
а также с результатами гистохимического обнаружения
кислых мукополисахаридов, идущих через зону пеллюцида
в яйцо: Сахарнэ Zacharial F, 1957; Хорстман и Кноп —
Horslmann E, Кпор А. 1951).
Многие исследователи большое внимание уделяли воп­
росу о происхождении половых:клеток: Шпулер (Spuler А,
1900), Н. П. Овчинников (1902), Стрих (Stricht О. 1921),
Гартман (Hartman С. 1926), Ф. Е. Агейченко (1933), Хоффлингер (Hofflinger Н. 1948), В. А. Пузик (1951), Л. Д.
Литвинова (1954).
1G
Наличие двухядерных овоцитов, двух и более яйцевых
фолликулов они объясняют митозом яиц в иостнаталыюм
периоде. Нами же были обнаружены двухяйцевые ири'мордиальные фолликулы в яичниках 4—.5-месячных плодов.
"При изучении яичника телочки первых дней жизни
наблюдалось интенсивное окрашивание ткани покровного
-слоя т! корковой зоны пиронином и сильное поглощение
ультрофиолетовых лучей длиной волны 260—280 ммк.
Этот период, судя по нашим исследованиям, а также по
.морфологическим описаниям яичника (Л. Д. Литвинова,
1954), характерен наличием массы растущих фолликулов
в различной стадии их развития, начиная от примордиальных до крупных полостных. По-видимому, содержащаяся
:в яичнике масса овоцитов требует усиленного обмена
нуклеиновых кислот в молодом органе.
.
Дальнейшие исследования гистохимии яичников 6-ме­
сячных телочек не ,дали.нам какой-либо существенной
разницы по сравнению с яичниками новорожденных те­
лочек.
Мосс, Рейн, Сакс,леследуя гистохимические изменения
яичника
.половозрелых .животных при половой циклично­
сти 1 отмечают, что количество гликогена ,-к концу цикла
снижается, не затрагивая обменные процессы нуклеино­
вых кислот.
. • .«Основное, что можно отметить при исследовании.яич­
ника растущего :половозрелого животного при повышении
его функциональной активности, это -наличие массы ;вторичных и третичных фолликулов различной величины. Для
'выявления /динамики'«изменения нуклеиновых кислот, мы
'Сравнивали локализацию их в яичниках животных 1 — 1,5-летнегошозраста в стадию -возбуждения, торможения и
уравновешивания, взяв: последнюю j a основу.
Покровный :эпителий, как и корковая зона яичника
животных данного 'возраста, удерживает. высокую кон­
центрацию ;РНК.. Поеледняялувеличнвается в строме^кор­
ковой зоны in стадию возбуждения полового цикла и
уменьшается ш.стадию ^торможения, особенно при форми­
ровании желтого тела из кровяного сгустка.
Изучение налнчиялукяепновых кислот в яйцевой клетке
•кроликов (Л. И. Павлова, Л959), -.амфибий, птиц и групп
беспозвоночных :.(BpaiHe—;Brachet J. 1929, -Н -В. Макаров,
1956, 1959; И. И. Кнкнадзе, 1957; Н. А. „Богомолова, 1956;
Л. А. Савнч, 1959; В.^Г.-Пел:р.сша^_11Шд1_др.) показало,
HeCKOSCia.'-i о; 1 '.. .; ,,.;;i'i i j i i i , . ! ^
Л7
что РНК.в яйцеклетке крупных'фолликулов уменьшаете^
Нам удалось получить у половозрелых ; животных в
крупных н предовуляционных фолликулах яйцевые клетки,
концентрация РНК в которых постепенно уменьшалась,
поэтому зрелая яйцевая клетка содержала меньше РНК
и гликогена на единице площади. По-видимому, растущее
яйцо не успело синтезировать РНК в цитоплазме в таком
количестве, которое могло отложиться в этой быстро­
растущей клетке.
Придавая большое значение ферментам в синтезе бел­
ков, мы выявили фосфомоноэстеразы в окружающих овоцит клетках как в фолликулярном эпителии, так и в тэке
интерна, учитывая при этом величину фолликула.
В результате оказалось, что наиболее высокая актив­
ность фермента обнаруживается в мелких и средних фол­
ликулах. Более крупные фолликулы теряют активность
щелочной фосфатазы в клетках фолликулярного эпителия
и накапливают ее в тэка интерна. Предовуляционное яй­
цо несколько снижает реакцию на энзим.
Сравнение фолликулов одного размера у половозрелых
животных различных возрастов показало, что овоциты при
своем росте удерживают нуклеиновые кислоты и гликоген,
чего нельзя сказать о мезенхиме коры яичника, которая
с возрастом животного прогрессивно теряет РНК и ДНК.
Корковая зона яичника у коров в .стадии уравновешива­
ния—до трех лет—удерживает значительное содержание
РНК, но с возрастом животного она уменьшается:;
,
Для характеристики возрастных изменений у^З-^о-летних коров следует отметить значительное скопление'; ,атретических тел на уровне растущих фолликулов,'.что,яв­
ляется отражением функциональной активности половой
железы в этом возрасте. Процесс атрезии фолликулов в
яичнике представляется большим многообразием .клеточ­
ных форм. Атрезия наступает или со стороны дегенериру­
ющего ядра, вакуолизированнои протоплазмы самой яйце­
вой клетки, или со стороны фолликулярного аппарата. И
хотя она рассматривается как нормальный физиологичес­
кий процесс (В, Е. Строкин, 1939), в яйцевой клетке и
строме яичника происходят сложные биохимические из­
менения, приводящие железистый орган к рубцеобразова11шо и сокращению обмена нуклеиновых кислот и соот­
ветствующих ферментов.
Наблюдаемое нами многообразие атрезии фолликулов
18
почти всегда сопровождалось уменьшением нуклеиновых
кислот в яйцеклетке до минимума. Желтое тело содер­
жит значительное количество РНК, поэтому гистохими­
ческому изучению его отведено большее внимание, чем
изучению фолликулярного аппарата. Так, Бальбони (Balboni G. С, 195G) доказал, что по мере созревания менст­
руального желтого тела человека рпбонуклеопротеиды
увеличиваются, достигая максимума в период оконча­
тельного созревания, с дальнейшим их снижением. Мосс,
Рейн, Сакс (Moss S, Wrenn Т, Sukes L, 1954) показали,
что у коров отмечается увеличение щелочной фосфатазы
в первые 8—14 дней после стадии возбуждения полового
цикла, а к концу его наступает уменьшение.
Подобная картина была прослежена Хейден (Haden R,
1958) на шотландских овцах на выявление энзимной- ак­
тивности в клетках ' гранулезы ,с продолжением реакции
2—3 дня. Кроме того, им было отмечено, что энзим вы­
являлся в клетках теки интерна в фолликулах крупнее
500 ммк.
После функционального расцвета яичника 3—5-летних
коров наступает постоянное снижение активности, выра­
жающееся в замене фолликулярного состава соединитель­
ной тканью. К 10 —15-летнему возрасту эти старческие из­
менения у коров выражаются достаточно сильно,* наблю­
дается падение РНК в корковой зоне яичников. Визуаль­
ное наблюдение в ультрафиолетовом микроскопе дает яс­
ную картину затухания флюоресценции в этой зоне. В
таком возрастном периоде у Животных в яйцеклетках рас­
тущих фолликулов на слабо бззофильной цитоплазме, наб­
людались нежные,- розовые образования, содержащие
РНК.
Причины приобретенного бесплодия коров, согласно
литературным данным, могут быть обусловлены инфек­
цией, нарушением гормонального баланса; работой, недо­
статочностью питания (А.-П. Студеицов, 1953; Хансон —
Hanson М; 1955).: Особенно; большая роль отводится ра­
циону,; т.'ic недостаточное питание, как известно, вызы­
вает- глубокие дегенеративные изменения(В. В. Маховко,
1958). в основных клеточных элементах. /Причем глубина
последних определяется продолжительностью голодания.
Для яичников бесплодных коров характерны следую­
щие патологические изменения: массовая атрезия фолли­
кулов, дегенеративные изменения в сосудах, увеличение19
количества стромы, разрастание клеток тэки интерна и
т. д.
. .
Все эти показатели патологических состояний бесплод­
ных коров были обнаружены и в наших наблюдениях.
Они полностью согласуются и с данными Дьюри, Лано,
Фехер (Dyory G, Laslo L, Feher A, 1957).
Строма корковой зоны, вследствие низкого уровня со­
держания РНК, как правило, отличалась слабой базофи'льностью. Встречающиеся в срезах одиночные ' половые
клетки в разных стадиях развития давали постоянную
картину тего или иного нарушения обмена веществ, как
предвестника наступающих структурных изменений..Пато­
логические изменения, выражаются прежде всего в умень­
шении содержания РНК в овоплазме и'ядрышке, а также
ДНК в ядре. Это подтверждается графическим изображе­
нием оптической плотности на таблицах—в виде кривых.
Резко уменьшается и отложение в яичнике полисахарида
(вплоть до полного исчезновения резервного гликогена),
являющегося необходимым веществом для нормального
роста и развития яйцеклетки и всего фолликула.
Нарушение обмена в отношении указанных ведущих
химических компонентов приводят к гибели яйца. Так,
например, кистозное перерождение фолликулов, сопровож­
дающееся глубокими нарушениями обменных процессов,
ведет к прекращению созревания фолликулов и его лютеинизацин.
Наши гистохимические исследования показывают, что
отклонения в обмене веществ в яичнике приводят к воз­
никновению кистозных перерождений фолликулов, что
следует рассматривать как одну из причин нарушения про­
цесса овуляции, исключения возможности оплодотворения
и наступления бесплодия.
ВЫВОДЫ
1. Покровный эпителий яичника в период активной де­
ятельности половой железы отличается высокой концен­
трацией РНК. Особенно много рибонуклеопротеидов об­
наруживается в покровном эпителии в плодный пери­
од.
;
Относительно высокий уровень концентрации РНК в
строме яичника коров удерживается до 2—3-летнего воз­
раста, а затем отмечается снижение нуклеиновых кислот.
20
.':
При , старении животного,, .строма^ преобразуется»,в грубую
фиброзную ;ткань,г.-белрниая:. оболочка постелен НОР утеряет
Р.НК.!.И[.К: 10тт-Л5.-.годам',, наблюдает.ся-^картина,-.; затухания
флюоресценции в корковой>з,оне. г\1'<ат:;Т\;гп'> v ло':.;:-.,1 :>к
. .2. Овогонии перед процессом; размноженияпа^также. рас­
тущие* овоциты. и,; фолликулярные клетки, любой:.формации
всегда обнаруживают,, признаки,>•.высокой:;;концентрации
Р Н К . ^ - . . : •.! =•...-. •..•;.:.-.-: г. :!•.'«;•.;. 1<г:>^,-.-:-л-Л'.:->:.:-.--Д •'.<
3. Динамика изменений концентрации РНК-,:>нагляднее
зсего, прослеживается в период размножения,.юргониГи;: В
процессе, многократных делений этих клеток р количества
РНК прогрессивно уменьшается/ а .в-^брлее.тлубЬких, сло­
ях генераций овогонии пфлюгеррвскнх. ^ешков, '.наблюда­
ются ее следы. ';,.','''/.•','', .,'., ,, .', ','?;•,".-.';.'•.','/ "', ~'-<:^'l'-l~,'-l'\v,
"•; 4? ДНК в ядрахоргопнй;"выявленной,'пр. Б'ра^шё.'.Ф^льгену и с помощью ультрафиолетового," микррскоца .в'сррр,ме хроматина и хромосом, показывает''наибольшую;
''.кон­
центрацию перед'клеточным делениейГ' '- ' "" r S; !К ' '
5. С формированием первнчных'*фолл'икулов накопление
РНК происходит в цитоплазме, а' также'в-ядрышке : яйце :
вой клетки. В яйцеклетках же вторичных или "растущих
фолликулов РНК накапливается . ото.-перифетлшОк-цент р у .
.
.--•
;-,•
а
.••/.*!••.'):'.>•-J'.-I'.
;•:':.а-,"••:.;:>•
- • - б . При росте фолликула высокое::"содержание.к РНК-в
клетках фолликулярного эпителия в стадии'^интепсивного
размножения,-говорит о том, что ,рна.5.связа,на.1С,-;сш1тезом
.белка. ••..-.
...
. ' ..-:-'.-..'.;i>гом'." гс ?ншс!с-/:.;:-,o:v
7. Концентрация РНК снижается-;;,п<-цитоплазме ,.янца;.,в
составе крупных и предовуляционных-фрлликулов. .-1;- jr.-.?
8. РНК увеличивается в покровной зоне в стадию воз­
буждения и снижается в стадию торможения.
, 9 . Отложение гликогена, в яичнике,наб,людается,с,3-месячного возраста утробного развития в форме крупных и
.мелких,гранул в. клетках стромы. Особенно ..большие ко­
личества гликогена обнаруживаю тс^'/в'^м^стах^г'.^фибрлее
плотного скопления половых клеток; в"Т<Ьрк6вЬй"'зонё,
по­
этому их можно- рассматривать' как оснОвнЬй'лрёзёрв по­
лисахарида для развивающихся:фрлликул.рв;-{л;*"гн;.'Д .1,
10. .С началом роста.первичного;фрллику^а-.,глнкрг;рн.по­
является в клетках фолликулярного эпителия,'а с момен­
та образования вторичного фолликула;'е.* многослойным
эпителием он появляется-в цитоплазме.'.зяйцекдетки.'па ме­
ре роста которой увеличивается полисахарид."-.Особенно
21
большая концентрация зерен гликогена отмечается в фол­
ликулярных клетках яйценосного бугорка. В виде офор­
мленных гранул гликоген локализуется только в цитоплаз­
ме клеток и отсутствует в ядрах, .;
11.; Отложения полисахарида в нормально развивающихся,фолликулах можно .'-использовать как один из показа­
телей интенсивности: обмена ; в яичнике.
12 Дегенерирующая яйцевая клетка почти полностью
теряет гликоген.
;,.
.
;
13. По мере роста - фолликулов активность щелочной
фбефатазы в клетках тэка "интерна возрастает, а в клетках
зернистой зоны уменьшается.
14. Высокое содержание РНК и гликогена в клетках зо­
ны гранулезы и изменение концентрации их в зависимо­
сти от роста свидетельствует о значимости фолликуляр­
ного эпителия в'питании клеток.
15 Яйцевые клетки в кистозно-перерожденном яичнике
дают ясную картину уменьшения РНК, и ДНК, показывая
тем самим нарушение синтеза нуклеиновых кислот при
патологических изменениях.
.16. Основная масса яйцевых клеток яичников коров,
имевших бесплодие в течение 2—3 лет, характеризуется
вакуолизацией цитоплазмы яйца и минимальным содержа­
нием гликогена. ,,•;••
;- 17; Нарушения обменных процессов в яичнике, сопро­
вождающиеся уменьшением нуклеиновых кислот и гли­
когена, обусловливают гибель яйцевой' клетки и окружа­
ющего ее фолликулярного эпителия.
Основные положения диссертации отражены в статьях:
f :
- 1 Гистохимические исследования печени при тремато'дбзах "крупнбгб "рогатого скота.
-^
"'"! ^УченыеЗаписки, КГВИ, т. 79, I960 г.
2. Динамика изменения нуклеинового'обмена в тканях
яичника крупного
рогатого скота в утробный период раз­
вития. - <• .' :: . '•••>'?;. .:'
г -Ученые-записки КГВИ т. 83,-1961 г. - • 3. Квопросу : цитохимического анализа овогенеза круп­
ного рЬгатого скота.
22
Ученые записки КГВИ, т. 86, 1961
4. Гистохимические методы исследования яичника круп­
ного рогатого скота.
Материалы научной конференции, посвященной 90-летйю КГВИ. Июнь 1963 г.
ПФ—030S5
Юдааская типография, зак* 1798 тнр. 250