и ус ар ел

ус
и
ар
ел
ем
ия
н
ау
кБ
СЕРЫЯ МЕДЫЦЫНСКІХ НАВУК 2009 № 3
СЕРИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК 2009 № 3
ЗАСНАВАЛЬНIК – НАЦЫЯНАЛЬНАЯ АКАДЭМIЯ НАВУК БЕЛАРУСI
Часопіс выдаецца са студзеня 2004 г.
ак
ад
Выходзіць чатыры разы ў год
ЗМЕСТ
ая
КЛІНІЧНАЯ І ЭКСПЕРЫМЕНТАЛЬНАЯ МЕДЫЦЫНА
На
ци
он
ал
ьн
Квитко О. В., Конева И. И., Анисович М. В., Шейко Я. И., Крупнова Э. В., Чакова Н. Н., Михаленко Е. П., Дромашко С. Е. Использование гене­тического маркера клеточного старения бета-галактозидазы
в цитологической онкодиагностике. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Митюкова Т. А., Леонова Т. А., Дрозд В. М. , Платонова Т. Ю. , Лущик М. Л., Тузова А. А. Динамика
уровня тиреоидных гормонов в сыворотке крови пациентов с карциномой щитовидной железы после приема
L-тироксина . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Нечипуренко Н. И., Анацкая Л. Н., Пашковская И. Д., Грибоедова Т. В., Маслова Г. Т. Роль изменений показателей антиоксидантной системы и содержания магния крови в развитии лакунарного инфаркта
мозга и дисциркуляторной энцефалопатии . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Конопля Е. Ф., Сушко С. Н., Маленченко А. Ф., Савин А. О., Кадукова Е. М., Гончаров С. В. Влияние
экологических факторов зоны отчуждения ЧАЭС на соматические клетки мышей и их потомства. . . . . . . . . . . Виницкая А. Г., Лелевич В. В., Леднева И. О., Дорошенко Е. М. сравнительная характеристика обмена
гамма-аминомасляной кислоты в головном мозге и печени крыс при синдроме отмены этанола. . . . . . . . . . . . . . Лихачев С. А., Сидоренко А. В., Овсянкина Г. И., Чернуха Т. Н., Садовников В. В. Нелинейный анализ электроэнцефалограмм при спастической кривошее. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Свирновский А. И., Сергиенко Т. Ф., Смольникова В. В., Бакун А. В., Тарас И. Б. Экспрессия транспортного белка P-гликопротеина на лейкозных лимфоцитах в связи с ответом на химиопрепараты in vitro. . . . Новикова Л. Н., Арчакова Л. И. Морфофункциональная организация сосудистого сплетения боковых
желудочков головного мозга кролика. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5
10
16
21
27
31
39
43
1
ус
и
ау
АГЛЯДЫ
кБ
ел
ар
Тропникова Г. К. Влияние мелатонина на функциональное состояние серотонинергических структур
мозга после разрушения дорсального ядра шва в эксперименте. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Ходулев В. И., Сидоренко А. В. Состояние проводящей функции малоберцового нерва при алкогольной
полиневропатии. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Судникович Е. Ю., Максимчик Ю. З., Забродская С. В., Макар Е. А., Дремза И. К., Аверин В. А.,
Лапшина Е. А. Влияние мелатонина на активность ферментов антиоксидантной защиты и пентозофосфатный путь при диабете . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Грицук Н. А. Митохондриальное окисление в кардиомиоцитах и электрокардиографические показатели
у крыс при инкорпорации 137Cs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Филонюк В. А., Петрова-Соболь Т. И., Семенов И. П., Пироговская Г. В. Токсикологическая и гигиеническая характеристики новых комплексных удобрений с микроэлементами . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Нижегородова Д. Б., Колобова М. Ю., Багатка С. С., Иванчик Г. И., Мотузова Я. М., Зафранская М. М.
Экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит и функциональная характеристика Т-лимфоцитов . . . . . Титовец Э. П., Смеянович А. Ф., Пархач Л. П., Лукашейко Ю. Н. Выраженность перитуморального
отека головного мозга в зависимости от гистоструктуры опухоли . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Мрочек А. Г., Алексеевская И. Н., Корнелюк И. В., Персидских Ю. А., Севрук Т. В., Устинова И. Б.,
Коваленко Д. В. С-реактивный белок как маркер субклинического воспаления при электрической кардиоверсии персистирующей мерцательной аритмии . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ем
ия
н
Залуцкий И. В. Стратегия борьбы со злокачественными новообразованиями. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Прохорова В. И., Колядко Н. Н. Использование теста генерации тромбина для оценки коагуляционного
потенциала крови. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Жариков О. Г., Литвин А. А. Использование метода искусственных нейронных сетей в диагностике
и прогнозировании заболеваний поджелудочной железы. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49
53
59
63
68
75
82
88
93
105
114
ВУЧОНЫЯ БЕЛАРУСІ
121
ая
ак
ад
Никандров Виталий Николаевич (К 60-летию со дня рождения). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ал
ьн
ИЗ­ВЕСТ­И Я НАЦ­ИО­Н АЛЬ­НОЙ АКА­Д ЕМИИ НАУК БЕ­Л А­РУСИ 2009 № 3
Сер­и я медицинских наук
на русском, бе­ло­русс­ком и английском язы­ках
Рэдактар В. Г. К а л а с о ў с к а я
Тэх­ніч­н ы рэ­дак­тар Ю. А. Д а ш к е в і ч
Камп’ю­тэр­ная вёрст­ка Н. І. К а ш у б а
Зда­дзе­на ў на­бор 15.06.2009 г. Пад­пі­са­на ў друк 06.07.2009 г. Выхад у свет 03.08.2009 г. Фар­мат 60×841/8. Па­пе­ра аф­сет­ная. Ум. друк.
арк. 14,88. Ум. фарб.-адб. 16,04. Ул.-выд. арк. 16,4. Ты­раж 65 экз. За­каз 355.
ци
он
Кошт нумару: індывідуальная падпіска – 17 250 руб., ведамасная падпіска – 42 814 руб.
Рэс­п уб­лі­канс­кае уні­тар­нае прадп­рыемст­ва «Вы­да­вецкі дом «Бе­ла­рус­кая на­ву­ка». ЛИ № 02330/0494405 ад 27.03.2009.
Вул. Ф. Скарыны, 40, 220141, г. Мінск. Пасведчанне аб рэгістрацыі № 393 ад 18.05.2009 г.
На
Надрукавана ў РУП «Выдавецкі дом «Беларуская навука».
© Вы­да­вецкі дом «Бе­ла­рус­кая на­ву­ка»
Вес­ці НАН Бе­ла­ру­сі, се­рыя медыцынскіх на­вук, 2009
ар
ус
и
PROCEEDINGS
OF THE NATIONAL ACADEMY
ел
OF SCIENCES OF BELARUS
MEDICINE SERIES 2009 N 3
кБ
Founder is the National Academy of Sciences of Belarus
The Journal has been published since January 2004
ем
ия
н
ау
Issued four times a year
CONTENTS
CLINICAL AND EXPERIMENTAL MEDICINE
На
ци
он
ал
ьн
ая
ак
ад
Kvitko O. V., Koneva I. I., Anisovich M. V., Sheiko Y. I., Krupnova E. V., Chakova N. N., Mikhalenko E. P.,
Dromashko S. E. Application of beta-galactosidase as a cell ageing genetic marker in cytological cancer diagnostics. Mityukova T. A., Leonova T. A., Drozd V. M., Platonova T. Yu., Lushchyk M. L., Tuzova A. A. Dynamics of
serum thyroid hormone levels after administration of thyroxin in thyroid cancer patients. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Nechipurenko N. I., Anatskaia L. N., Pashkouskaya I. D., Griboedova T. V., Maslova G. T. Role of antioxidant
system and blood magnesium concentration changes in the development of acute lacunar infarcts and chronicle cerebral
ischaemia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Konoplya E. F., Sushko S. N., Malenchenko A. F., Savin A. O., Kadukova E. M., Goncharov S. V. Influence
of ecological factors of the zone of the Chernobyl disaster on the somatic cells of mice and their posterity. . . . . . . . . . . Vinitskaya H., Lelevich V. V., Ledniova I. O., Doroshenko Y. M. comparative study of the gamma-aminobutyric
acid metabolism in the rat brain and liver during alcohol withdrawal. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Lihacev S. A., Sidorenko A. V., Ovsyankina G. I., Chernucha T. N., Sadovnikov V. V. Nonlinear analysis of
the electroencephalograms with spasmotic torticollis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Svirnovski A. I., Serhiyenka T. F., Smolnikova V. V., Bakun A. V., Taras I. B. P-glycoprotein expression on
leucosis lymphocytes in connection with response to chemopreparations in vitro. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Novikova L. N., Archakova L. I. Morphofunctional organization of the vascular plexus of the rabbit cerebral
lateral ventricles. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Tropnikova G. K. Melatonin influence on the functional state of the serotonin structures of the brain after
destruction of the dorsal raphe nucleus in experiment . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Khodulev V. I., Sidorenko A. V. State of the conductive function of the fibular nerve at alcohol polyneuropathy. . Sudnikovich E. Ju., Maksimchik Yu. Z., Zabrodskaya S. V., Makar E. A., Dremza I. K., Averin V. A.,
Lapshina E. A. Melatonin influence on the activity of antioxidant enzymes and a pentose phosphate way under
diabetes. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Gritsuk N. А. Mitochondrial oxidation in cardiomyocytes and rat electrocardiographic parameters at 137Cs
incorporation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Filanyuk V. A., Piatrova-Sobal Т. I., Siamionau I. P., Piragovskaya G. V. Тoxicological and hygienic
characteristics of new complex fertilizers with microelements. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Nizheharodava D. B., Kolobova M. J., Bagatka S. S., Ivanchik G. I., Motuzova J. M., Zafranskaya М. М.
Experimental autoimmune encephalomyelitis and T-lymphocytes functional characteristics. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Titovets E. P., Smeyanovich A. F., Parkhach L. P., Lukasheika Yu. N. Dependence of peritumor edema on the
brain tumor cellular composition. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Mrochek A. G., Alekseevskaya I. N., Korneluik I. V., Persidskikh Yu. A., Sevruk T. V., Ustinova I. B.,
Kovalenko D. V. C-reactive protein as a marker of subclinical inflammation at electrical cardioversion of persistent
cardiac fibrillation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5
10
16
21
27
31
39
43
49
53
59
63
68
75
82
88
3
ус
и
SYRVEYS
ар
Zalutsky I. V. Cancer control strategy . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Prokhorova V. I., Kolyadko N. N. Use of the thrombin generation test for estimation of the blood coagulation
potential . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Zharikov O. G., Litvin A. A. Use of the method of artificial neutral networks in diagnosis and prognosis of
pancreas diseases. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . SCIENTISTS OF BELARUS
На
ци
он
ал
ьн
ая
ак
ад
ем
ия
н
ау
кБ
ел
Nikandrov Vitalii Nikolaevich (To the 60th Anniversary of Birthday) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 93
105
114
121
ар
СЕ­Р­Ы Я МЕДЫЦЫНСКІХ НА­ВУК
ус
и
ВЕСЦI НА­Ц­Ы Я­НАЛЬ­НАЙ АКА­ДЭМII НА­ВУК БЕ­ЛА­РУСI № 3 2009
ел
КЛІНІЧНАЯ І ЭКСПЕРЫМЕНТАЛЬНАЯ МЕДЫЦЫНА
УДК 575.1./.316:616.24-006
кБ
О. В. КВИТКО, И. И. КОНЕВА, М. В. АНИСОВИЧ, Я. И. ШЕЙКО, Э. В. КРУПНОВА,
Н. Н. ЧАКОВА, Е. П. МИХАЛЕНКО, С. Е. ДРОМАШКО
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКОГО МАРКЕРА КЛЕТОЧНОГО СТАРЕНИЯ
БЕТА-ГАЛАКТОЗИДАЗЫ В ЦИТОЛОГИЧЕСКОЙ ОНКОДИАГНОСТИКЕ
ау
Институт генетики и цитологии НАН Беларуси, Минск
(Поступила в редакцию 23.04.2008)
На
ци
он
ал
ьн
ая
ак
ад
ем
ия
н
Введение. Цитологические методы являются неотъемлемым компонентом современной диагностики опухолей и предопухолевых процессов. Цитоморфологический анализ препаратов, изготовленных из мазков-отпечатков, пунктатов, биопсийного и операционного материала, позволяет получить ценную информацию для диагностики онкозаболеваний. Поэтому дальнейшее
совершенствование методов клинической онкоцитологии имеет большое научно-практическое
значение. При этом важно подчеркнуть перспективность исследований, направленных на разработку дополнительных, а не альтернативных цитодиагностических методов, что основано в первую очередь на необходимости максимально объективного, комплексного подхода к такой сложной и ответственной задаче, как точная онкодиагностика. С этой точки зрения представляют
интерес исследования, имеющие целью получение дополнительной диагностической информации с использованием стандартных цитологических препаратов. Такой подход обеспечит экономичность и организационную выполнимость внедрения новых методических подходов в практику клинической онкодиагностики, поскольку в полной мере будут использованы существующая
материальная база и нарабатываемая с годами высокая квалификация работников современных
онкоцитологических лабораторий.
Известно, что в процессе клеточного старения увеличивается нестабильность генетического
аппарата. Нарушения апоптоза (программируемой клеточной гибели) могут иметь двоякое значение. С одной стороны, усиление программируемой клеточной гибели может коррелировать
с нестабильностью хромосомного аппарата, а с другой – ослабление апоптоза может замедлять
отбраковку аномальных клеток и тем самым ускорять появление трансформированных клеточных клонов. Это, в свою очередь, повышает риск развития онкологических заболеваний [1, 2].
Поэтому обнаруженные в последние годы молекулярные и цитогенетические маркеры клеточного старения и апоптоза представляют интерес с точки зрения их возможного использования
в онкодиагностике в дополнение к интенсивно изучаемым в настоящее время в ряде лабораторий генам и белкам, регулирующим процессы деления клеток. Важно также, что для анализа
некоторых маркеров апоптоза и клеточного старения могут быть пригодны стандартные цитологические препараты, используемые в онкодиагностике. Это относится, в частности, к маркеру
активности фермента бета-галактозидазы (β-gal), который используется для детекции постаревших клеток при изучении клеточного старения на моделях in vitro.
Ген β-gal в норме экспрессируется в клетках большинства органов и тканей организма. Первые сообщения о возможности использования β-gal как маркера физиологического состояния
отдельной клетки были опубликованы в работе Dimri et al. [3]. О перспективности использования бета-галактозидазного маркера в диагностике опухолей, представляющих собой гетероген5
ус
и
ци
он
ал
ьн
ая
ак
ад
ем
ия
н
ау
кБ
ел
ар
ную популяцию постаревших и активно пролиферирующих клеток, свидетельствуют данные
работы [4], в которой показано, что в доброкачественных опухолях простаты накапливаются
эпителиальные клетки, активно экспрессирующие β-gal. Имеются также сообщения о присутствии позитивных по бета-галактозидазе клеток в покоящихся культурах некоторых иммортализированных культур, включая раковые клетки человека [5].
Материалы и методы исследования. Образцы гистологически нормальной и опухолевой
ткани легкого были получены от пациентов, находившихся на лечении в Минском городском
клиническом онкологическом диспансере. Диагноз «плоскоклеточный рак легкого» (ПКРЛ)
у всех больных был подтвержден цитологически и гистологически.
Для исследования клеток легкого in vivo использовали послеоперационные мазки-отпечатки
опухолевой и гистологически нормальной тканей больных раком легкого, полученные путем
плотного прикладывания обезжиренных предметных стекол к разрезу нормальной ткани легкого
или к удаленному очагу поражения. Для получения полноценных отпечатков разрез делали сухим скальпелем во избежание разрушения клеток от соприкосновения с водой или новокаином.
Детекцию активности β-gal при pH 6,0 проводили с помощью субстратного красителя X-gal
по модифицированному методу Dimri et al. [3]. Отличие состояло в том, что в целях экономии
дорогостоящего хромогенного красителя X-gal на предметное стекло с мазком-отпечатком после
его фиксации наносили каплю раствора X-gal, которую распределяли по мазку-отпечатку путем
наложения сверху второго предметного стекла. Затем мазок-отпечаток инкубировали в течение
24 ч при 37 оС во влажной камере (для предотвращения упаривания раствора X-gal). После
окраски стекла с мазками-отпечатками промывали в восходящих концентрациях этанола
(24, 48 и 96%) и высушивали на воздухе.
Накопление клеточных имиджей осуществляли с помощью компьютерного видеокомплекса [6–9].
Результаты и их обсуждение. Полученные образцы опухолевой ткани сильно варьировали между собой по структуре мазковотпечатков, отличаясь от образцов нормальной
ткани наличием крупных клеточных агрегатов или густых монослойных участков. Так, по
сравнению с нормальной тканью в опухолевом
образце одного из 4 пациентов было обнаружено значительно большее (в 6 раз) количество
окрашенных по β-gal клеток в разреженных
участках препарата (рис. 1, а), а также большое
количество крупных интенсивно окрашенных
клеточных агрегатов, в то время как в соответствующем образце нормальной ткани их вообще не было (рис. 1, б).
Всего для анализа экспрессии β-gal изготовлено и проанализировано по 27 цитологических препаратов (мазков-отпечатков) гистологически нормальной и опухолевой тканей
больных ПКРЛ (по 1 препарату нормальной
Рис. 1. Экспрессия бета-галактозидазы в мазке-отпечатке и опухолевой тканей от каждого пациента).
опухолевой ткани пациента, больного плоскоклеточным
При учете доли окрашенных одиночных
раком легкого: а – крупная X-gal-позитивная клетка (на
и
малоагрегированных
клеток значительных
препарате видны клетки крови и несколько неокрашенных клеток ткани); б – интенсивно окрашенный клеточ- различий между экспериментальными и конный агрегат
трольными препаратами не выявлено. В сред-
На
6
ус
и
ци
он
ал
ьн
ая
ак
ад
ем
ия
н
ау
кБ
ел
ар
нем доля окрашенных одиночных клеток и клеток в составе некрупных агрегатов (10 клеток и
менее) в опухолевой ткани составил 12,7%, а в нормальной ткани – 8,22%. Доля β-gal-позитивных
клеток среди одиночных клеток и клеток в составе некрупных агрегатов была выше в опухолевой ткани (по сравнению с нормальной) у 14 пациентов, а у 7 больных наблюдалась обратная
картина, т. е. уровень экспрессии β-gal был выше в гистологически нормальных тканях легкого.
В целом при сравнении по одиночным клеткам и некрупным агрегатам не было найдено достоверных различий в экспрессии β-gal между нормальными и опухолевыми участками легочной ткани.
Анализ активности β-gal в одиночных клетках и небольших агрегатах является наиболее методически однозначным, так как при подсчете крупных многослойных агрегатов очень сложно
определить точное количество клеток, а соответственно, и количество окрашенных.
Однако, на наш взгляд, особый смысл имеет именно анализ экспрессии β-gal в крупных клеточных агрегатах. Так, мазки-отпечатки опухолевой ткани, как правило, отличались от препаратов нормальной ткани более высокой степенью агрегированности клеток. Если в мазкахотпечатках гистологически здоровой ткани крупные агрегаты практически отсутствовали на
большинстве препаратов (только на двух препаратах их было достаточно заметное количество –
20–30 агрегатов), то в опухолевой ткани подавляющая часть клеток (примерно четыре пятых
всех учтенных) находилась в составе средних и крупных агрегатов. При этом агрегаты опухолевой ткани иногда достигали размеров в сотни клеток, а также имелись агрегаты, в которых прак-
На
Рис. 2. Доля окрашенных агрегированных клеток в нормальной и опухолевой тканях легкого: ■ – доля β-galпозитивных клеток в опухолевой ткани; □ – доля окрашенных клеток в нормальной ткани легкого
7
ус
и
ци
он
ал
ьн
ая
ак
ад
ем
ия
н
ау
кБ
ел
ар
тически все клетки интенсивно окрашивались по β-gal. Следует отметить, что не было найдено
корреляции между величиной агрегатов и долей β-gal-позитивных клеток в них. Это свидетельствует о корректности количественного сравнения доли окрашенных клеток в агрегатах нормальных и опухолевых участков, несмотря на различия в средних размерах тех и других. Препаратов контрольной ткани с наличием более крупных агрегатов было немного (12 из 27 мазковотпечатков), но только в трех из них были найдены окрашенные клетки (рис. 2). Общее количество
β-gal-позитивных агрегированных клеток в опухолевых тканях составило 15,2% от всех агрегированных клеток в образцах, что примерно в 9 раз больше, чем на препаратах гистологически
здоровых тканей (1,44%). Эти различия статистически высокодостоверны.
Из 27 пациентов у 19 доля всех окрашенных клеток (включая одиночные клетки и агрегаты)
была больше в опухолевой ткани, у 1 больного количество β-gal-позитивных клеток в нормальной и опухолевой тканях было одинаковым, у 7 пациентов окрашенные клетки практически отсутствовали и в опухолевой, и в гистологически нормальной ткани.
Полученные результаты анализа экспрессии бета-галактозидазы в нормальных и опухолевых тканях при плоскоклеточном раке легкого подтверждают данные литературы об отсутствии
исходно предполагавшейся простой зависимости, при которой экспрессия β-gal как маркера клеточного старения должна понижаться или вообще отсутствовать при развитии опухолевого процесса. В реальных ситуациях может наблюдаться и обратное. Можно указать на две возможные
причины этого.
Во-первых, в гетерогенной опухолевой популяции могут встречаться не только активно пролиферирующие, но и постаревшие клетки. При этом в некоторых особенно гетерогенных опухолях доля постаревших клеток может быть даже выше, чем в нормальных тканях. Ведь для прогрессии опухоли может быть важно не столько отсутствие способности активно делиться у части клеток, сколько наличие хотя и небольшой, но активно делящейся иммортализированной
субпопуляции. К тому же давно известен тот факт, что стареющие клетки могут оказывать промотирующее влияние на раковую трансформацию. Так, было установлено, что положительным
эффектом на трансформацию эпителиальных клеток обладают некоторые изменения стромы,
которые коррелируют со старением организма. К специфическим медиаторам возрастных изменений во взаимоотношениях клеток стромы и эпителия относят интерлейкин-1, трансформирующий фактор роста, ростовые факторы кератиноцитов и гепатоцитов [1].
Во-вторых, вследствие изменения спектра экспрессии генома при развитии опухолей могут
изменяться тканеспецифические характеристики и эпигенетический статус клеток. Поэтому
в некоторых случаях дифференцировка в опухолях может приводить к появлению клеток таких
тканевых типов, в которых β-gal в норме более интенсивно экспрессируется по сравнению с исходными нормальными тканями, в которых возникла опухоль.
Таким образом, ген бета-галактозидазы может служить не только маркером старения, но и, по­
добно многим другим генам, маркером дифференцировки [10], что предполагает дифференцированный подход к использованию бета-галактозидазного теста при поиске методов детекции опухолей и вместе с тем расширяет возможности применения этого маркера.
Полученные данные позволяют предположить, что в пределах ПКРЛ имеется значительная
гетерогенность вариантов опухоли, в то время как образцы неопухолевой ткани легкого относительно более однородны. Все это свидетельствует в пользу того, что бета-галактозидазный тест
после проведения ряда дополнительных исследований может быть использован в диагностике
ПКРЛ. При этом одним из основных признаков, по которым можно отличить опухолевую ткань от
нормальной, является не столько количество одиночных позитивных по β-gal клеток, сколько наличие интенсивно окрашенных в синий цвет крупных клеточных агрегатов, которые практически
отсутствуют в образцах нормальной ткани. Вместе с тем использование одного лишь бетагалактозидазного теста, по-видимому, недостаточно для диагностики ПКРЛ, поскольку у некоторых пациентов ни в нормальной, ни в опухолевой ткани легкого не выявлено позитивных по бетагалактозидазе клеток.
Дополнительно к изучению экспрессии β-gal в тканях легкого у больных ПКРЛ были выполнены исследования экспрессии β-gal в легочной ткани пациентов, умерших от причин, не свя-
На
8
ус
и
ем
ия
н
ау
кБ
ел
ар
занных с раком легкого. С этой целью
были проанализированы цитологические препараты легочной ткани 38 пациентов, имевших различные болезни,
причем у большинства их было более
одной.
Обращает на себя внимание высокая степень экспрессии β-gal в легочной ткани больных циррозом печени
(по сравнению с таковой при других
болезнях). Особенно велики различия
активности β-gal в легочной ткани
между группами больных циррозом
Рис. 3. Различия в экспрессии бета-галактозидазы в клетках ткапечени и инфарктом мозга (рис. 3).
ней легкого у больных циррозом печени (пациенты 1–3) и инфарДанные о выраженной положительктом мозга (пациенты 4–11)
ной связи между циррозом печени
и экспрессией β-gal в тканях легкого
требуют дополнительной проверки на расширенных контингентах пациентов, поскольку их подтверждение могло бы послужить основой для проведения исследований, направленных на поиск
корреляций между циррозом печени и экспрессией β-gal в других (помимо легочной) тканях.
Заключение. Установлено, что у больных ПКРЛ опухолевые участки резко отличаются от
нормальной легочной ткани наличием крупных клеточных агрегатов (порядка сотен клеток), которые часто интенсивно окрашиваются по β-gal. Показано также, что в группе умерших лиц,
болевших рядом заболеваний, но не ПКРЛ, наибольшая экспрессия β-gal в легочной ткани наблюдается у больных циррозом печени. Полученные результаты могут быть использованы
в учреждениях Министерства здравоохранения, осуществляющих цитологическую онкодиагностику ПКРЛ.
ак
ад
Литература
ьн
ая
1. А н и с и м о в В. Н. // Успехи геронтологии. 2002. Вып. 10. С. 99–125.
2. R o n i n s o n I. B. // Canc. Res. 2003. Vol. 63. P. 2705–2715.
3. D i m r i G. P., L e e X., B a s i l e G. et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995. Vol. 92. P. 9363–9367.
4. C a s t r o P., G i r i D., L a m b D., I t t m a n n M. // Prostate. 2003. Vol. 55. P. 30–38.
5. Y e g o r o v Y. E., A k i m o v S. S., H a s s R. et al. // Exp. Cell Res. 1998. Vol. 243. P. 207–211.
6. Ш е й к о Я. И., К в и т к о О. В., К о н е в а И. И., Т ю р и к о в А. П. // Докл. НАН Беларуси. 2002. Т. 46, № 1.
С. 90–94.
7. K v i t k o O. V., K o n e v a I. I., S h e i k o Y. I., A n i s o v i c h M. V. // Cell Biol. Int. 2005. Vol. 29. P. 1019–1024.
8. К в и т к о О. В., Ш е й к о Я. И., К о н е в а И. И., А н и с о в и ч М. В. // Весцi НАН Беларусi. Сер. біял. навук.
2006. № 4. С. 53–57.
9. К в и т к о О. В., Ш е й к о Я. И., К о н е в а И. И., Д р о м а ш к о С. Е. // Молекулярная и прикладная генетика. 2008. Т. 7. С. 18–24.
10. U n t e r g a s s e r G., G a n d e r R., R u m p o l d H. et al. // Exp. Gerontol. 2003. Vol. 38. P. 1179–1188.
O. V. KVITKO, I. I. KONEVA, M. V. ANISOVICH, Y. I. SHEIKO, E. V. KRUPNOVA, N. N. CHAKOVA,
E. P. MIKHALENKO, S. E. DROMASHKO
ал
APPLICATION OF BETA-GALACTOSIDASE AS A CELL AGEING GENETIC MARKER
IN CYTOLOGICAL CANCER DIAGNOSTICS
ци
он
Institute of Genetics and Cytology of NAS of Belarus, Minsk
Summary
На
The expression of beta-galactosidase gene in tumoural and normal sites of lung tissues of patients, suffering from
epidermoid cancer of lungs, was studied. The main distinctive feature of tumoural sites is the presence of large cell aggregates
(around hundreds of cells) intensively coloured on beta-galactosidase. A group of deceased persons with other sicknesses
(excluding lung cancer) was also investigated. There was a maximal beta-galactosidase expression in lung tissues of patients
suffered from cirrhosis.
ус
и
ВЕСЦI НА­Ц­Ы Я­НАЛЬ­НАЙ АКА­ДЭМII НА­ВУК БЕ­ЛА­РУСI № 3 2009
ар
СЕ­Р­Ы Я МЕДЫЦЫНСКІХ НА­ВУК
УДК 616.441-006.6-085.357
ел
Т. А. МИТЮКОВА, Т. А. ЛЕОНОВА, В. М. ДРОЗД, Т. Ю. ПЛАТОНОВА,
М. Л. ЛУЩИК, А. А. ТУЗОВА
кБ
Динамика уровня тиреоидных гормонов
в сыворотке крови пациентов с карциномой щитовидной железы
после приема L-тироксина
Белорусская медицинская академия последипломного образования, Минск
ау
(Поступила в редакцию 09.04.2008)
ци
он
ал
ьн
ая
ак
ад
ем
ия
н
Введение. Рост случаев рака щитовидной железы (ЩЖ) среди детей, подростков и взрослых
Республики Беларусь является одним из наиболее значимых последствий аварии на Чернобыльской АЭС. Лечение таких больных подразумевает оперативное удаление ткани ЩЖ, а затем супрессивную терапию тироксином с целью подавления уровня тиреотропного гормона
(ТТГ<0,3 мМЕ/л), что необходимо для предотвращения опухолевого роста [1, 2]. Стандартная
супрессивная доза тироксина для этой категории пациентов составляет около 3 мкг/кг массы
тела [1, 2]. Одной из важнейших задач мониторинга пациентов, прооперированных по поводу
карциномы ЩЖ, является контроль эффективности тироксинотерапии по данным гормональных исследований. Динамический мониторинг 278 пациентов, проводимый в период 2005−
2008 гг. на базе Республиканского центра медицинской реабилитации и бальнеолечения (обследование не менее двух раз в год) показал, что число лиц с достигнутой супрессией ТТГ повысилось от 59% при первом визите до 80% и более при четвертом и последующих визитах [3].
Разъяснительная работа с пациентами, исключение заболеваний желудочно-кишечного тракта (ЖКТ), подбор доз и коммерческих форм тироксина, исключение совместного приема препарата с другими веществами, уменьшающими его биодоступность, позволили свести к минимуму
количество больных со сниженной эффективностью тироксинотерапии [3–5]. Несмотря на все
предпринимаемые усилия, выявляются единичные случаи, когда не удается достичь требуемого
уровня супрессии ТТГ у пациентов. В связи с этим актуальным остается вопрос о поступлении
тироксина в кровь после его орального приема. Установлено, что препарат абсорбируется лучше
всего, если его принимают за 0,5−1 ч до завтрака или за 2 ч до дневного приема пищи (70−80%)
по сравнению с приемом после завтрака (64%). Из литературы известно, что абсорбция тироксина при оральном приеме утром натощак у взрослых составляет в среднем 70±14% от исходной
дозы препарата, а у пожилых субъектов (70–79 лет) его абсорбция снижена до 62,8±13,0% [ 6–8].
Цель работы − изучение динамики уровней тиреоидных гормонов в сыворотке крови у пациентов с карциномой ЩЖ после орального приема стандартной супрессивной дозы L-тироксина
в зависимости от исходного уровня ТТГ.
Материалы и методы исследования. У 20 пациентов с карциномой ЩЖ было проведено
определение уровня тиреоидных гормонов в сыворотке крови натощак, а затем через 1 и 3 ч после орального приема назначенной им дозы L-тироксина («Эутирокс», фирма «Никомед»). Группа состояла из 11 девушек и 9 юношей, средний возраст которых на момент обследования составлял 21,85±0,36 года (от 20 до 26 лет). Средний возраст пациентов на дату операции составлял
13,02±2,85 года (от 9 до 19 лет), а на момент аварии на ЧАЭС − 1,68±1,7 года (10 человек в возрасте до 1 года). После тотального хирургического удаления ЩЖ проводили обязательную абляцию остатков ткани ЩЖ с использованием I131 в дозе 50 МБк/кг массы тела. В дальнейшем при
необходимости проводили радиойодтерапию метастазов в дозе 100 МБк/кг массы тела.
На
10
ус
и
На
ци
он
ал
ьн
ая
ак
ад
ем
ия
н
ау
кБ
ел
ар
Среди обследованных большинство пациентов (18 чел.) прошли не более трех курсов лечения радиойодом. Показанием для повторной радиойодтерапии служило наличие метастазов
в регионарные лимфатические узлы либо отдаленных метастазов в легкие (других отдаленных
метастазов в данной группе больных не было). Распространенность опухолевого роста оценивали по классификации UICC, 2002 г. (цит. по: [1]). При оценке метастазов в легкие нами внесена
дополнительная градация (M0 − отсутствие метастазов, М1 − локальные, М2 − локальнодиффузные и М3 − диффузные), что позволило оценить их количественно (по балльной системе).
Всем пациентам был назначен тироксин в дозе около 3 мкг/кг массы тела. Из общего числа
обследованных больных у 12 человек был необходимый уровень супрессии ТТГ, у 3 больных
уровень ТТГ был в рамках нормы и 5 пациентов находились в состоянии некомпенсированного
послеоперационного гипотиреоза.
Уровень тиреоидных гормонов в сыворотке крови − тироксин общий и свободный (Т4 и св.
Т4), трийодтиронин общий и свободный (Т3 и св. Т3), а также ТТГ определяли ИФА-методом
с использованием наборов фирмы «Диалаб» (Австрия), все определения проводили в дублях.
Дополнительно были проведены референтные определения уровня ТТГ с использованием ИФАнаборов фирмы «Хоффман Ля Рош» (Швейцария) на закрытой автоматической системе «Модуляр 170». Интервал нормы для ТТГ составлял 0,27−4,2 мМЕ/л (интервалы нормы и единицы измерения для всех гормонов даны в подписях к иллюстрациям). Рассчитывали показатель Т3/Т4
(для удобства изображения этот коэффициент был умножен на 100 − Т3/Т4·100).
Статистический анализ полученных данных проводили в таблицах Microsoft Excel с использованием критерия Стьюдента для сравнения двух групп и поправки Бонферрони для нескольких групп,
результаты представлены в виде средних величин с их стандартными отклонениями (X±Sd) [9].
Результаты и их обсуждение. Пациенты были разделены на три группы: 1) супрессия ТТГ
(ТТГ<0,3 мМЕ/л), 2) эутиреоз, т. е. ТТГ в интервале нормы (0,3−4,2 мМЕ/л) и 3) некомпенсированный гипотиреоз (ТТГ > 4,2 мМЕ/л). Проведено определение уровней Т4, св. Т4, Т3 и св. Т3
утром натощак и через 1 и 3 ч после приема назначенной дозы тироксина.
Средняя доза тироксина в общей группе пациентов с карциномой ЩЖ составляла
2,94±0,42 мкг/кг.
У пациентов с супрессией ТТГ средняя доза назначенного им препарата составляла
2,81±0,44 мкг/кг, в группе с ТТГ в интервале нормы (эутиреоз) − 2,95±0,26, а в группе некомпенсированного гипотиреоза − 3,26±0,31 мкг/кг. Средние уровни ТТГ в группах супрессии, эутиреоза и гипотиреоза составляли соответственно 0,15±0,13; 2,37±1,23 и 54,41±34,06 мМЕ/л.
Как показано на рис. 1, исходные средние уровни Т4 в обследованных группах пациентов су­
щественно отличались, минимальное значение среднего уровня Т4 было в группе гипотиреоза
(94,91±39,04), максимальное − в группе супрессии ТТГ (161,6±24,13 нмоль/л, P<0,05). После
орального приема тироксина уже через 1 ч
отмечалось некоторое повышение Т4 в сыворотке крови, неодинаково выраженное в
разных группах. Через 3 ч средний уровень
Т4 в группе супрессии практически не изменялся, в группе эутиреоза имел тенденцию к снижению, а в группе некомпенсированного гипотиреоза продолжал нарастать.
Через 3 ч после приема препарата сохранялись достоверные отличия уровня Т4
в группах эутиреоза и гипотиреоза по сравнению с группой супрессии. Наиболее значимый прирост уровня Т4 был отмечен на
фоне некомпенсированного гипотиреоза: че- Рис. 1. Динамика средних уровней Т4 у пациентов трех групп
эутиреоз и гипотиреоз) после орального приема
рез 1 ч − на 30,9% и через 3 ч − на 44,8% (супрессия,
стандартной дозы тироксина. * – достоверные отличия от груп(P < 0,05) от исходной величины.
пы супрессии, Р< 0,05. Интервал нормы для Т4: 44–116 нмоль/л
11
ус
и
ци
он
ал
ьн
ая
ак
ад
ем
ия
н
ау
кБ
ел
ар
Средние уровни св. Т4, измеренные натощак, в группах гипотиреоза (0,68±0,29 нг/дл)
и эутиреоза (1,08±0,08 нг/дл) были достоверно
ниже, чем при супрессии ТТГ (1,39±0,22 нг/дл).
Через 1 и 3 ч средние уровни св. Т4 в группе
гипотиреоза достоверно повышались – на 30,8
и 33,6% соответственно по сравнению с исход­
ной величиной (рис. 2). В группе эутиреоза
отмечалась тенденция к повышению. В группе
супрессии через 1 ч наблюдалась тенденция
к увеличению среднего значения на 44,8%, но
через 3 ч изменения сглаживались и были неРис. 2. Динамика средних уровней св. Т4 у пациентов достоверными. Через 3 ч сохранялись достотрех групп (супрессия, эутиреоз и гипотиреоз) после
верные отличия между группой супрессии
орального приема стандартной дозы тироксина. * – достоверные отличия от группы супрессии, Р< 0,05. Интер- и группой гипотиреоза.
Как показали исследования M. T. Hays [7,
вал нормы для св. Т4: 0,8–2,0 нг/дл
10], оральное введение меченого Т4 приводит
к его накоплению в желудке уже в первые
10 мин и длится около 30 мин, через 20 мин начинается его перемещение в тонкий кишечник, где
снижение концентрации меченого препарата наблюдается через 40−60 мин. Резкое повышение
концентрации меченого Т4 в плазме крови наблюдается через 1−3 ч после орального приема, затем выходит на плато и длится около 10 ч.
При 6-недельной ежедневной заместительной терапии (150−200 мкг тироксина) пик уровня
общего и св. Т4 у здоровых волонтеров был отмечен в период 3−6 ч, повышение длилось до 10 ч,
а затем уровень гормонов возвращался к базовым значениям [8]. При длительном приеме препарата авторы наблюдали постепенное сглаживание пика общего Т4, тогда как пик св. Т4 оставался
примерно на одном уровне. Базовые значения обоих гормонов несколько повышались уже после
2 недель ежедневного приема препарата [8].
В наших исследованиях значения общего Т4 (но не св. Т4) выходили за верхнюю границу интервала нормы у пациентов с супрессией ТТГ и ТТГ и были в рамках эутиреоза. Наиболее значимое повышение средних уровней Т4 и св. Т4 после приема препарата отмечалось в группе некомпенсированного гипотиреоза. При регулярном длительном приеме тироксина (пациенты из
группы супрессии) пик подъема гормонов был минимальным либо отсутствовал, но базовые
уровни обоих гормонов, измеренные натощак, были существенно выше, чем при некомпенсированном гипотиреозе, что совпадает с данными литературы [8].
Исходные значения средних уровней Т3
были практически идентичны у пациентов из
групп гипотиреоза и эутиреоза (0,62±0,33
и 0,63±0,13 нг/мл), а в группе супрессии составляли 1,26±0,65 нг/мл (рис. 3). Через 1 ч
средний уровень Т3 в группе супрессии имел
слабую тенденцию к снижению, а через 3 ч
возвращался к исходному значению. Средние
уровни Т3 в группах гипотиреоза и эутиреоза
практически не изменялись во времени.
Как видно из рис. 4, средние уровни св. Т3,
измеренные натощак, составляли у пациентов
с эутиреозом 1,88±0,25 пг/мл, а в группе супрессии − 2,50±0,77 пг/мл, причем отличия не
Рис. 3. Динамика средних уровней Т3 у пациентов трех
имели статистической значимости. Средний групп (супрессия, эутиреоз и гипотиреоз) после оральноуровень св. Т3 при некомпенсированном гипо- го приема стандартной дозы тироксина. Интервал нормы
для Т3: 0,49–2,02 нг/мл
тиреозе был не ниже, чем при эутиреозе, что,
На
12
ус
и
На
ци
он
ал
ьн
ая
ак
ад
ем
ия
н
ау
кБ
ел
ар
по-видимому, объясняется повышенной конверсией Т4 в Т3 при недостатке циркулирующего в крови тироксина. Через 1−3 ч после
приема препарата уровень св. Т3 в группе гипотиреоза практически не изменился, в группе
эутиреоза наблюдалась тенденция к его повышению, а в группе супрессии − тенденция
к снижению. Через 3 ч после приема препарата
средние значения св. Т3 во всех трех группах
находились в близких пределах − от 2,17±0,23
до 2,34±0,64 пг/мл.
Как показано на рис. 5, исходное значение Рис. 4. Динамика средних уровней св. Т3 у пациентов
показателя Т3/Т4·100 в группе супрессии со- трех групп (супрессия, эутиреоз и гипотиреоз) после
ставляло 0,76 и почти не изменилось через орального приема стандартной дозы тироксина. Интервал нормы для св. Т4: 1,4–4,2 пг/мл
1−3 ч после приема тироксина. В группе эутиреоза исходное соотношение было более низким (0,48) и тоже практически не изменилось на фоне приема препарата. Интересно, что в группе
гипотиреоза соотношение Т3/Т4·100, измеренное натощак, полностью совпадало со значением
для группы супрессии (0,76), но через 1 и 3 ч оно резко снизилось, примерно на 33%. Это снижение было достоверным по отношению к исходной величине (P<0,05).
Известно, что около 80% циркулирующего в крови Т4 подвергается монодейодированию
с образованием эквивалентных количеств Т3 и реверсивного Т3 (rТ3). Современные кинетические исследования показывают, что циркулирующий в крови Т3 преимущественно образуется
за счет экстратироидальной дейодинации Т4. Многие исследователи находят обратную корреляцию между уровнем сывороточного Т4 и скоростью дейодинации Т4 в Т3 [8], т. е. при недостатке
Т4 происходит его быстрая конверсия в активную форму гормона – Т3. Исследования на эутироидных больных и пациентах с первичным гипотиреозом показывают, что при поступлении Т4
в кровь наблюдается быстрое повышение, а затем снижение до нормального уровня сывороточного Т3 в течение периода изучения, что связано с тонкой регуляцией превращения Т4 в Т3
у здоровых волонтеров и пациентов. Высокое соотношение Т3/Т4 в сыворотке у атироидных пациентов частично снимается при терапии тироксином [8].
Нами обнаружено существенное снижение соотношения Т3/Т4 у пациентов с некомпенсированным послеоперационным гипотиреозом после орального приема тироксина. Изменения уровня общего Т3 после приема тироксина были незначительны, что, по-видимому, связано с регуляцией дейодинации по типу отрицательной обратной связи и направлено на поддержание оптимального стабильного уровня Т3 в крови [8].
Далее нами проведен анализ полученных данных у пациентов из первой группы (супрессия
ТТГ) в зависимости от уровня накопленной суммарной радиоактивности в период лечения I131.
Все пациенты этой группы прошли не более
двух курсов радиойодтерапии (I131), и накопленная ими радиоактивность зависела от распространенности опухолевого роста.
Как видно из таблицы, отличия между первой и второй группами по средним уровням ТТГ
и средним дозам тироксина отсутствовали.
Исходные средние уровни Т4 в обеих группах не давали достоверных отличий, так же
как и уровни гормона после приема препарата.
Обращает на себя внимание тот факт, что повышение концентрации Т4 после приема левоРис. 5. Динамика средних значений показателя Т3/Т4·100
у пациентов трех групп (супрессия, эутиреоз и гипотире- тироксина было незначительным и практичеоз) после орального приема стандартной дозы тироксина ски отсутствовало во второй группе.
13
ус
и
Изменение уровня некоторых показателей тиреоидного статуса после орального приема стандартной дозы
тироксина у пациентов со стабильной супрессией ТТГ (ТТГ <0,3 мМЕ/л) в зависимости
от кумулятивной активности I131
без отдаленных метастазов (I)
(n = 9)
с метастазами в легкие (II)
(n = 3)
4,76±0,74
0,15±0,12
2,84±0,49
9,72±0,45*
0,13±0,17
2,71±0,26
ел
Активность I131, ГБк
ТТГ, мМЕ/л
Доза тироксина, мкг/кг
Т4, нмоль/л:
натощак
через 1 ч
через 3 ч
Св. Т4, нг/дл:
натощак
через 1 ч
через 3 ч
Т3, нг/мл:
натощак
через 1 ч
через 3 ч
Св. Т3, пг/мл:
натощак
через 1 ч
через 3 ч
Т3/Т4·100:
ар
Группа пациентов
Показатель
ем
ия
н
1,06±0,34
0,89±0,26
1,03±0,23
ау
1,39±0,23
1,55±0,19
1,65±0,19
172,20±34,72
178,23±33,83
173,98±28,51
кБ
158,06±21,05
168,73±14,47
169,77±19,25
натощак
через 1 ч
1,87±1,05
1,93±1,15*
1,85±1,35
2,25±0,31
2,12±0,49
2,11±0,36
3,25±1,33*
3,42±1,48*
2,97±0,88*
0,67±0,18
1,04±0,43
0,53±0,17
1,05±0,50*
0,60±0,10
1,01±0,59
ак
ад
через 3 ч
1,40±0,25
3,35±2,33*
1,83±0,45
П р и м е ч а н и е. * – достоверные отличия между группами (Р < 0,05).
ци
он
ал
ьн
ая
Исходный уровень св. Т4 в обеих группах был практически одинаковым. Через 1 ч после приема препарата отмечалось повышение среднего значения св. Т4: в первой группе примерно на
12%, во второй ― на 139%. Несмотря на большой разброс индивидуальных значений во второй
группе, отличия между группами были статистически значимы (P<0,05). Через 3 ч различия
сглаживались.
Средний уровень общего Т3 через 1 ч после приема препарата был достоверно выше во второй группе, чем в первой. Что касается св. Т3, то его уровень был достоверно выше во второй
группе, чем в первой во все сроки исследования. Соотношение Т3/Т4 было достоверно выше во
второй группе, чем в первой, через 1 ч после приема тироксина.
Корреляционный анализ показал наличие тесной достоверной взаимосвязи между распространенностью опухолевого процесса (в баллах) и соотношением Т3/Т4 во все изученные сроки
(r = 0,71; r = 0,82 и r = 0,66 соответственно), уровнями Т3 в первые два срока (r = 0,66; r = 0,76),
уровнями св. Т3 во все сроки (r = 0,84; r = 0,83; r = 0,82) и уровнем св. Т4 через 1 ч после приема
препарата (r = 0,87).
Полученные данные, по-видимому, отражают повышенную конверсию Т4 в Т3 у лиц с более
распространенным опухолевым процессом (метастазы в легкие) на фоне более высокого накопления радиойода (более 9 ГБк). Достоверное повышение содержания свободных фракций гормонов может быть связано с модификацией активности тиреоидтранспортных систем плазмы
крови у этой категории больных. Выявленные особенности характерны только для группы супрессии ТТГ и проявляются при регулярном приеме стандартных доз L-тироксина, т. е. когда
ферментные и транспортные системы тиреоидного статуса испытывают наибольшую нагрузку.
На
14
ус
и
Выводы
Литература
ау
кБ
ел
ар
1. Выявлены некоторые особенности исходного тиреоидного статуса и динамики гормонов
Т4, св. Т4, Т3 и св. Т3 после орального приема супрессивной дозы тироксина в группах лиц, отличающихся по уровню ТТГ.
2. Статистически значимое повышение уровней Т4 и св. Т4 после орального приема тироксина было отмечено у лиц из группы некомпенсированного гипотиреоза, что демонстрирует нормальную абсорбцию препарата.
3. Недостаточная эффективность тироксинотерапии у некоторых лиц (группы эутиреоза
и гипотиреоза), по-видимому, может быть связана не с абсорбцией тироксина, а с нарушениями
рекомендаций по приему препарата.
4. Определение уровней Т4 и св. Т4 в сыворотке крови после орального приема стандартной
дозы тироксина может быть использовано в качестве клинической пробы на исключение нарушений абсорбции препарата.
5. Выявлены отличия конверсии Т4 в Т3, а также активности тиреоидтранспортных систем у
пациентов со стабильной супрессией ТТГ на фоне более высокой кумулятивной активности радиойода (более 9 ГБк).
ак
ад
ем
ия
н
1. Д а н и л о в а Л. И. Болезни щитовидной железы и ассоциированные с ними заболевания. Минск; Нагасаки, 2005.
2. P a g a n o L., K l a i n M., P u l c r a n o M. et al. // Minerva Endocrinol. 2004. Vol. 29, N 4. P. 161−174.
3. Л е о н о в а Т. А., Д р о з д В. М., М и т ю к о в а Т. А. и др. // Диагностика, лечение, профилактика патологии
щитовидной железы и сопутствующих заболеваний в современных экологических условиях Беларуси: материалы
науч.-практ. бел.-нем. конф. / Под ред. проф. В. М. Дрозд и проф. К. Райнерса. 3−4 мая 2007 г. Минск, 2007. С. 74−92.
4. S t o n e E., L e i t e r L. A., L a m b e r t J. R., S i l v e r b e r g D. H. // J. Clin. Endocrinol. Metab. 1984. Vol. 59.
P. 139−141.
5. W a l s h J. P. // Curr. Opin. Pharmacol. 2002. Vol. 2, N 6. P. 717−722.
6. B e n n h o l d H., O t t H. // Handbuch der Allgemeinen Pathologie / F. Biichner, F. Letterer, F. Roulet (eds). Berlin,
1961. P. 166−275.
7. H a y s M. T. // J. Clin. Endocrinol. Metab. 1968. Vol. 28. P. 749−756.
8. K o h r l e J. // The Thyroid and Tissues: Merck/ Eur. Thyroid Symp. Strasbourg, 1994. P. 3−32.
9. С т е н т о н Г. Медико-биологическая статистика / Пер. с англ.; под ред. Н. Е. Бузикашвили и Д. В. Самойлова. М., 1999.
10. H a y s M. T. // Thyroid. 1991. Vol. 1. P. 241−248.
T. A. MITYUKOVA, T. A. LEONOVA, V. M. DROZD, T. Yu. PLATONOVA, M. L. LUSHCHYK, A. A. TUZOVA
DYNAMICS OF SERUM THYROID HORMONE LEVELS AFTER ADMINISTRATION OF THYROXIN
IN THYROID CANCER PATIENTS
ая
Belarusian Medical Academy of Postgraduate Education, Minsk
Summary
На
ци
он
ал
ьн
This article deals with the problem of the lowered sensitivity to levothyroxin treatment in patients with thyroid carcinoma.
There is a question of adequate thyroxin inflow into the bloodstream after its oral intake. The task of the work was the
estimation of serum thyroid hormone levels in thyroid cancer patients after oral intake of a standard dose of thyroxin depending
on initial TSH levels.
In 20 patients we detected serum levels of thyroid hormones (free and total fractions of T4 and T3) and after 1 and 3 hours
following the administration of a standard suppressive dose of thyroxin (about 3 mcg/kg of body weight). Patients were divided into
3 groups according to their initial TSH levels: 1) TSH suppression is less than 0.3 mIU/1; 2) Normal TSH is 0.3 − 4.2 mIU/1; 3)
TSH is more than 4.2 mIU/1.
Some peculiarities were found in the initial thyroid status and thyroid hormone (T4, FT4, T3, FT3) level dynamics after
administration of a suppressive dose of thyroxin among the groups of patients differing in the TSH level.
A statistically significant increase of T4 and FT4 levels after oral administration of thyroxin was detected in patients with
non-compensated hypothyroidism, showing normal absorption of medication.
The insufficient efficiency of thyroxin suppressive therapy in some patients (from eu- and hypothyroid groups) was
probably connected to irregular thyroxin intake than to impaired absorption.
Estimates of serum T4 and FT4 levels after oral administration of a thyroxin standard dose can be used as a clinical test
for exclusion of impaired absorption of medication.
Some peculiarities of T4/T3 conversion were also revealed in patients with stable TSH suppression who had a more
expanded tumor growth and received higher cumulated radioiodine activities (above 9 GBk).
ус
и
ВЕСЦI НА­Ц­Ы Я­НАЛЬ­НАЙ АКА­ДЭМII НА­ВУК БЕ­ЛА­РУСI № 3 2009
ар
СЕ­Р­Ы Я МЕДЫЦЫНСКІХ НА­ВУК
УДК 616.831-005:[612.1:612.014.464:546.46
ел
Н. И. НЕЧИПУРЕНКО1, Л. Н. АНАЦКАЯ1, И. Д. ПАШКОВСКАЯ1,
Т. В. ГРИБОЕДОВА1, Г. Т. МАСЛОВА2
кБ
РОЛЬ ИЗМЕНЕНИЙ ПОКАЗАТЕЛЕЙ АНТИОКСИДАНТНОЙ СИСТЕМЫ
И СОДЕРЖАНИЯ МАГНИЯ КРОВИ В РАЗВИТИИ ЛАКУНАРНОГО ИНФАРКТА МОЗГА
И ДИсциркуляторной ЭНЦЕФАЛОПАТИИ
1
ау
Республиканский научно-практический центр неврологии и нейрохирургии, Минск, Беларусь,
2
Белорусский государственный университет, Минск
(Поступила в редакцию 28.04.2008)
ци
он
ал
ьн
ая
ак
ад
ем
ия
н
Введение. В патофизиологических механизмах развития цереброваскулярной патологии
большое значение имеют нарушения церебральной гемодинамики, изменение уровня магния
в крови и активация реакций перекисного окисления липидов (ПОЛ) при недостаточности антиоксидантной системы (АОС).
По внутриклеточному содержанию магний является вторым после калия катионом, который
задействован в качестве кофактора более чем в 300 ферментативных реакциях. Он не только
принимает непосредственное участие в регуляции сосудистого тонуса и артериального давления, но и потенцирует действие других вазодилататоров – аденозина, ионов калия, простагландинов и пр.; обеспечивает поддержание трансмембранного потенциала покоя; уменьшает повреждающее влияние окисленных липопротеинов на эндотелий сосудов [1–3]. Дефицит магния
приводит к повышению периферического сосудистого сопротивления, уровня артериального
давления, нарушению функции эндотелия, увеличению пролиферации гладкомышечных клеток, активации тромбоцитов [4]. Снижение его внутриклеточного содержания при остром инфаркте мозга играет важную роль в развитии тромбоза сосудов, связанного с возрастанием агрегации тромбоцитов. Показано, что недостаток магния запускает механизмы вазоконстрикции
и обусловливает повреждение эндотелия сосудов, вызывая тем самым возникновение и прогрессирование атеросклероза, чему способствует активация воспалительных и окислительных процессов при повышении концентрации холестерина липопротеинов низкой плотности [1, 5].
При развитии церебральной ишемии снижение поступления в нейрон молекулярного кислорода и повышение уровня восстановленности компонентов дыхательной цепи приводит к восстановлению О2 по одноэлектронному пути с образованием свободных радикалов, а также оксидантов нерадикальной природы (пероксида водорода и аниона гипохлорита), так как кислород
в таком состоянии легко реагирует с промежуточными компонентами дыхательной цепи [2, 6,
7]. Основной фермент АОС – супероксиддисмутаза (СОД) катализирует реакцию дисмутации,
превращая токсичный О2– в менее токсичную перекись водорода и кислород. СОД, являясь ферментом, непосредственно вовлеченным в метаболизм кислорода в клетках, защищает их от прямого и непрямого повреждения свободными радикалами [8]. Каталаза предотвращает накопление перекиси водорода, образующейся при дисмутации супероксидного аниона и при аэробном
окислении флавопротеидов. Глутатион – трипептид, который присутствует во всех клетках животных и человека. Это важный водорастворимый эндогенный антиоксидант, играющий существенную роль в поддержании окислительно-восстановительного равновесия. Кроме того, он
является субстратом целого ряда глутатионзависимых пероксидаз и способен связывать ионы
металлов переменной валентности, контролируя и регулируя тем самым свободнорадикальные
процессы. Снижение концентрации восстановленного глутатиона (ГSН) свидетельствует о дис-
На
16
ус
и
На
ци
он
ал
ьн
ая
ак
ад
ем
ия
н
ау
кБ
ел
ар
балансе в ферментативном звене аминокислотной защиты и, в конечном итоге, о нарушении активности всего антиперекисного комплекса [9].
Церулоплазмин (ЦП) – мультифункциональный белок. Важнейшие его функции: транспорт
Сu2+ из печени в клетки различных тканей; окисление Fe2+ до Fe3+, что способствует встраиванию последнего в трансферрин; окисление биогенных аминов в ЦНС. Способность ЦП предотвращать ПОЛ и деградацию ДНК связана с выполнением им роли внеклеточной СОД, т. е. он катализирует дисмутирование супероксидных анион-радикалов с образованием перекиси водорода. Оценка содержания вторичных продуктов, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой
(ТБК-П), позволяет судить об интенсивности процессов ПОЛ в организме [10–12].
Возникающая при церебральной микроангиопатии и нарушениях системной гемодинамики
гипоперфузия мозга приводит к замедлению мозгового кровотока, уменьшению содержания
кислорода и глюкозы в крови, активации анаэробного гликолиза, лактат-ацидозу, гиперосмолярности, капиллярному стазу и повышению риска тромбообразования. В то же время своевременное
восстановление мозгового кровотока способствует устранению гипоксии, улучшению церебрального метаболизма и в конечном итоге сохранности мозговой ткани [13].
Цель работы – изучение содержания магния, ряда показателей АОС и уровня ТБК-П в крови
пациентов с лаку­нарными инфарктами мозга (ЛИМ), дисциркуляторной энцефалопатией (ДЭ)
при церебральной микроангиопатии и атеротромботическими инфарктами мозга (АИМ) в зависимости от состояния мозговой гемодинамики.
Материалы и методы исследования. Показатели церебральной гемодинамики, активности
ферментов АОС, содержания ТБК-П и магния в цельной крови были изучены у 40 человек, разделенных на три группы. В 1-ю группу вошли 12 пациентов с ДЭ на фоне церебральной микроангиопатии (средний возраст 72,8±2,3 года); во 2-ю – 18 человек с ЛИМ, у которых имелись косвенные признаки церебральной микроангиопатии (средний возраст 66,3±1,9 года), в 3-ю –
10 больных с АИМ (средний возраст 63,2±1,6 года). Контрольную группу составили 22 человека
(практически здоровые мужчины и женщины), у которых изучали биохимические показатели.
Патогенетический вариант развития заболевания определяли в соответствии с критериями
TOAST на основании данных анамнеза, особенностей клинической картины, результатов ультразвуковой допплерографии магистральных артерий головы, данных нейровизуализации (КТ
или МРТ головного мозга), ЭКГ и лабораторных показателей.
У всех пациентов с ЛИМ и ДЭ имелись микроангиопатические факторы риска (артериальная
гипертензия, злоупотребление алкоголем, повышенный уровень креатинина в плазме крови при
хронической почечной недостаточности, хронические обструктивные болезни легких, сахарный
диабет), а также косвенные признаки микроангиопатии в виде ретинальной ангиопатии, очагов
лейкоареоза в белом веществе полушарий головного мозга, подкорковых ганглиях, перивентрикулярно. У пациентов с ЛИМ на КТ или МРТ головного мозга визуализировались острые единичные или множественные ЛИМ диаметром не более 20 мм, локализовавшиеся в глубинных
отделах. Анатомическая локализация ЛИМ коррелировала с его клиническими проявлениями.
Ультразвуковая диагностика брахиоцефальных артерий (БЦА) позволяла установить различные
гемодинамические нарушения.
Содержание Мg в цельной крови определяли методом атомно-эмиссионной спектрометрии
[14]. Активность каталазы в плазме крови исследовали по методу М. А. Королюка [15], СОД – по
реакции супероксидзависимого окисления кверцетина [16], ГSН в цельной крови – спектрофотометрическим методом [17]. Активность процессов ПОЛ в плазме крови измеряли, определяя содержание ТБК-П по методу, модифицированному В. А. Костюком [18], содержание ЦП изучали
методом Ревина [19].
При статистической обработке результатов применяли программу Statistica 6.0. Вычисляли
среднюю арифметическую и ошибку среднего арифметического (M+m). Для анализа статистически значимых зависимостей использовали параметрический t-критерий Стьюдента для независимых групп. При анализе содержания Mg в крови учитывали значение медианы (Ме), 25 и 75
процентилей. Сравнение выборок осуществляли с помощью непараметрического U-критерия
Манна–Уитни. Статистически значимыми являлись результаты при Р < 0,05.
17
ус
и
ел
ар
Результаты и их обсуждение. У всех больных ДЭ и у 61% пациентов с ЛИМ клинические
проявления заболевания развились на фоне недостаточности кровообращения головного мозга.
При этом у 22,2% пациентов с ЛИМ отмечалось умеренное снижение линейной скорости кровотока (ЛСК) в бассейне сонных артерий, у 27,7% – в бассейне позвоночных артерий с дефицитом
по основной артерии и у 11,1% ЛСК уменьшалась по всем БЦА. У 50% пациентов с АИМ отмечалось умеренное гомолатеральное стенозирование БЦА. Следует отметить, что у 38,8% пациентов с ЛИМ и у 58,3% больных ДЭ имела место сердечная недостаточность при ишемической
болезни сердца. У большинства пациентов с ДЭ (83,3%) наблюдалось умеренное снижение ЛСК
в бассейне сонных или позвоночных артерий, а у 16,6% обследованных – умеренное снижение
ЛСК по всем БЦА (табл. 1).
Показатель
кБ
Т а б л и ц а 1. Распределение больных (в %) в группах с лакунарным инфарктом мозга
при церебральной микроангиопатии, дисциркуляторной энцефалопатией
и атеротромботическим инфарктом мозга в зависимости от характера гемодинамических нарушений
ДЭ, % (n = 12) ЛИМ, % (n = 18) АИМ, % (n = 10)
ау
Умеренное снижение линейной скорости кровотока (ЛСК) в бассейне сонных артерий
33,3
22,2
10
50
16,6
–
–
27,7
11,1
–
–
–
–
20
30
ем
ия
н
Умеренное снижение ЛСК в бассейне позвоночных артерий с дефицитом
по основной артерии
Умеренное снижение ЛСК по всем БЦА
Умеренное гомолатеральное стенозирование внутренней сонной артерии
Умеренное гомолатеральное стенозирование позвоночной артерии
ая
ак
ад
Медиана содержания Мg у здоровых лиц (n = 17) составила 3,0 (2,4; 3,6) ммоль/л. У больных
с ЛИМ (n = 15) и ДЭ (n = 13) наблюдали значительное (Р<0,01 в сравнении с контролем) повышение уровня Мg – до 22,5 (17,2; 32,3) и 23,5 (3,8; 28,9) ммоль/л соответственно. У пациентов с АИМ
(n = 6) выявлена тенденция к снижению содержания Мg – до 1,1 (0,17; 4,1) ммоль/л.
Для больных всех групп характерно возрастание уровня ТБК-П, свидетельствующее о значительной активации процессов ПОЛ. Уровень ЦП в группах с ЛИМ и АИМ превышал контрольные значения, достоверной разницы между показателями ЦП у больных с ДЭ и ЛИМ по сравнению со здоровыми лицами не выявлено.
У больных с ДЭ установлено достоверное снижение активности СОД и повышение содержания ГSН в цельной крови. У пациентов с ЛИМ показатели АОС не отличались от таковых у здоровых лиц. В этих группах отмечена тенденция к повышению активности каталазы в плазме
крови. В группе больных с АИМ наблюдалось снижение (на 10 %) активности СОД и увеличение
активности каталазы, изменения содержания ГSН по сравнению с данным показателем у доноров не выявлено (табл. 2).
ьн
Т а б л и ц а 2. Содержание продуктов перекисного окисления липидов и ферментов антиокислительной
системы в крови здоровых лиц и у больных с цереброваскулярной патологией, M±m
Показатель
ЦП, мг/л
ал
ТБК-П, мкмоль/л
ци
он
СОД, % ингибирования
Каталаза, усл. ед /мин·мл
ГSН, ммоль/л
Здоровые лица
ДЭ
ЛИМ
АИМ
7,3±0,4
(n = 21)
245±17
(n = 21)
40,2±2,6
(n = 21)
19,5±2,9
(n = 22)
42,2±3,9
9,1±0,4*
(n = 11)
257±20
(n = 10)
31,2±3,6*
(n = 12)
22,4±4,8
(n = 12)
66,8±8,7*
9,2±0,4*
(n = 9)
285±22
(n = 9)
40,5±2,7
(n = 18)
25,2±5,16
(n = 17)
40,1±5,16
9,6±0,5*
(n = 10)
295±10*
(n = 9)
35,4±3,5
(n = 10)
40,8±5,7*
(n = 10)
37,3±3,8
(n = 22)
(n = 12)
(n = 18)
(n = 10)
П р и м е ч а н и е. * – достоверность различий по сравнению с данными здоровых лиц.
На
18
ус
и
ая
ак
ад
ем
ия
н
ау
кБ
ел
ар
Сниженная активность СОД и нарушение соотношения окисленных и восстановленных форм
глутатиона способствуют активации реакций ПОЛ в тканях [20, 21]. Установленное снижение
активности СОД в плазме крови пациентов с ДЭ и АИМ указывает на уменьшение антиокислительного потенциала вследствие избыточной продукции супероксидных радикалов и других
активных форм кислорода. Следует отметить повышение уровня ЦП или тенденцию к его повышению у всех обследованных больных, что может быть связано с напряженностью антиокислительных систем организма в условиях острого и хронического нарушения мозгового крово­
обращения [8]. На фоне уменьшения активности СОД у пациентов с ДЭ и АИМ выявлено повышение активности каталазы у больных с АИМ и изменение соотношения окисленных и вос­становленных форм глутатиона у лиц с ДЭ. Следовательно, наряду с активацией реакций ПОЛ
и тенденцией к возрастанию уровня ЦП у больных всех обследованных групп отмечены изменения показателей АОС с развитием ряда компенсаторно-адаптивных процессов, направленных на
поддержание антиокислительного потенциала организма.
Если рассматривать каждую группу дифференцированно, то прослеживается следующая закономерность: у пациентов с ЛИМ и ДЭ на фоне преобладания снижения ЛСК по БЦА отмечается возрастание содержания Мg в крови, в то время как у больных с АИМ при умеренном гомолатеральном стенозировании сонных и позвоночных артерий наблюдаются уменьшение уровня
Мg и адаптивные реакции в отдельных звеньях АОС.
При ЛИМ и ДЭ повышение уровня Мg в крови можно расценивать как одно из проявлений
сложных саногенетических процессов в организме, способствующих поддержанию церебральной перфузии за счет вазодилатации. Установленное при АИМ падение содержания Мg является
фактором риска тромбообразования у больных с инсультом и служит маркером церебральной
макроангиопатии.
Таким образом, в патофизиологических механизмах развития ЛИМ, ДЭ и АИМ важное значение имеет активация реакций ПОЛ при недостаточности АОС и изменении концентрации магния в крови.
Заключение. Показано, что в формировании ЛИМ при церебральной микроангиопатии
основная роль принадлежит развитию хронической ишемии головного мозга, которая усугубляется сердечно-сосудистой недостаточностью. Установлены активация реакций ПОЛ во всех изученных группах и снижение СОД у пациентов с ДЭ, а также изменение активности каталазы,
содержания ГSН и ЦП, направленные, скорее всего, на поддержание АОС в организме как при
острой, так и при хронической церебральной ишемии. Одним из механизмов компенсации, по
нашему мнению, у больных с ЛИМ и ДЭ является возрастание концентрации магния в крови,
способствующее, вероятно, сохранению необходимой церебральной перфузии за счет вазодилатации при снижении скорости кровотока по БЦА.
Литература
На
ци
он
ал
ьн
1. А м и г и Д ж., С а б е т и С., Ш л а г е р О. и др. // Stroke (рос. изд.) 2004. Вып. 3. С. 28–35.
2. A r s e n i a n M. A. // Prog. Cardiovasc. Dis. 1993. Vol. 35. P. 271–310.
3. D i c k e n s B. F. et al. // FEBS Lett. 1992. Vol. 311. P. 187–191.
4. M a i e r J. A. // Mol. Aspects Med. 2003. Vol. 24. P. 137–146.
5. S h e c h t e r M., K a p l i n s k y E., R a b i n o w i t z B. // Coron. Artery Dis. 1996. Vol. 7. P. 352–358.
6. Б о л д ы р е в А. А. // Биохимия. 1995. Т. 47. Вып. 9. С. 1536–1542.
7. С к в о р ц о в а В. И., Н а р ц и с с о в Я. Р., Б о д ы х о в М. К. и др. // Журн. неврол. и психиатр. 2007. № 1.
С. 30–36.
8. Д у б и н и н а Е. Е. // Вопр. мед. химии. 2001. Т. 47, № 6. С. 561–581.
9. Л у ц к и й М. А., Т о н к и х Р. В., А н и б а л А. П. // Журн. неврол. и психиатр. 2007. Инсульт (прил. к журн.).
С. 233–234.
10. З и н ч у к В. В. // Мед. новости. 2002. № 4. С. 9–14.
11. Л у к ь я н о в а Л. Д. // Вестн. РАМН. 2000. № 9. С. 3–12.
12. Н о в и к о в а Н. П., К р ы ж а н о в с к и й В. Л. // Дисфункция эндотелия: экспериментальные и клинические
исследования: материалы 5-й междунар. конф. Витебск, 2006. С. 188–191.
13. С к в о р ц о в а В. И., С т а х о в с к а я Л. В., Г у д к о в а В. В. и др. // Болезни сердца и сосудов. 2006. Т. 1,
№ 3. С. 1–7.
19
ус
и
ел
ар
14. З а ж о г и н А. П., Ч е р в я к о в с к и й К. И., Б у л о й ч и к Ж. И., М а с л о в а Г. Т. // Вестн. БГУ. Сер. 1.
2001. № 2. С. 3–7.
15. К о р о л ю к М. А., И в а н о в а Л. И., М а й о р о в а И. Г., Т о к а р е в В. Е. // Лаб. дело. 1988. № 1. С. 16–19.
16. К о с т ю к В. А., П о т а п о в и ч А. И. // Вопр. мед. химии. 1987. № 3. С. 115–118.
17. H a b e e b F. F. // Meth. in Enzymol. 1972. Vol. 25. P. 457–464.
18. К о с т ю к В. А., П о т а п о в и ч А. И., К о в а л е в а Ж. В. // Вопр. мед. химии. 1990. Т. 36, № 2. С. 88–91.
19. К а м ы ш н и к о в В. С. // Клин. биохимия. 1991. № 1. С. 28–29.
20. К и м Л. Б., Л и т в и н А. Н., Б е р е з о в с к а я Г. А. и др. // Бюл. СО РАМН. 2003. № 3. С. 24–28.
21. Ч а я л о П. П., С о л о в ь е в А. В., Е н а Я. М. и др. // Врачеб. дело. 1992. № 3. С. 15–17.
N. I. NECHIPURENKO1, L. N. ANATSKAIA1, I. D. PASHKOUSKAYA1, T. V. GRIBOEDOVA1, G. T. MASLOVA2
1
кБ
ROLE OF ANTIOXIDANT SYSTEM AND BLOOD MAGNESIUM CONCENTRATION CHANGES
IN THE DEVELOPMENT OF ACUTE LACUNAR INFARCTS AND CHRONICLE CEREBRAL ISCHAEMIA
Summary
ау
Belаrusian Research and Practical Center of Neurology and Neurosurgery, Minsk,
2
Belаrusian State University, Minsk
На
ци
он
ал
ьн
ая
ак
ад
ем
ия
н
This study was conducted to investigate changes of antioxidant system and blood magnesium concentration in patients
with lacunar infarcts and chronicle cerebral ischaemia (ССI) resulting from small vessel disease and atherothrombotic
infarcts. We assessed the blood Mg concentration, the catalase and superoxidedismutase activity, the reduced glutathione and
ceruloplasmin plasma level and the lipid peroxidation activation in 18 patients with lacunar infarcts, in 10 patients with
atherothrombotic infarcts and in 12 patients with CCI, and in 22 healthy persons. It was revealed that the lipid peroxidation
activation in all groups, a decrease of the superoxidedismutase activity in patients with CCI and changes of the catalase
activity, glutathione and ceruloplasmin plasma level are directed toward the maintenance of the antioxidant system both in
chronicle and in acute cerebral ischaemia. An increase of blood magnesium concentration in patients with lacunar infarcts
and CCI resulting from small vessel disease can probably improve the cerebral perfusion by vasodilatation.
ар
СЕ­Р­Ы Я МЕДЫЦЫНСКІХ НА­ВУК
ус
и
ВЕСЦI НА­Ц­Ы Я­НАЛЬ­НАЙ АКА­ДЭМII НА­ВУК БЕ­ЛА­РУСI № 3 2009
УДК 612.014.482
ел
Е. Ф. Конопля, С. Н. Сушко, А. Ф. МаленченкО, А. О. Савин,
Е. М. Кадукова, С. В. Гончаров
кБ
Влияние экологических факторов зоны отчуждения ЧАЭС
на соматические клетки мышей и их потомства
Институт радиобиологии НАН Беларуси, Гомель
ау
(Поступила в редакцию 14.07.2008)
На
ци
он
ал
ьн
ая
ак
ад
ем
ия
н
Введение. Изменения в генетических структурах соматических клеток и повреждения в механизме их деления составляют основу радиационных эффектов на тканевом и организменном
уровнях. Поражение организма может проявляться сразу после воздействия ионизирующей радиации или в виде отдаленных последствий в результате воздействия комплекса биохимических
и физиологических процессов [1, 2]. Возможность индукции нестабильности генома у потомков,
родители которых подвергались воздействию ионизирующего излучения, остается предметом
серьезных дискуссий, особенно в отношении постчернобыльского периода [3, 4]. Эти вопросы
особенно актуальны при анализе и прогнозировании демографических последствий изменения
среды обитания человека. В широком смысле демографическая проблема не ограничивается
основными составляющими рождаемости и смертности. Не меньшее значение имеет и состояние здоровья потомства. Результаты эпидемиологических исследований связи между состоянием
среды обитания и здоровьем рождающихся детей достаточно противоречивы.
Анализ результатов динамического наблюдения детей первого поколения ликвидаторов, проживавших в г. Обнинске (300 детей от 3 до 14 лет), а также остальных детей этого населенного
пункта и Российской Федерации в целом выявил, что в структуре распространенности заболеваний во все годы наблюдения (1994–2002) у детей ликвидаторов по сравнению с контрольными
группами наиболее часто диагностируются новообразования, врожденные аномалии, болезни
эндокринной системы, обмена веществ, психические расстройства и расстройства поведения,
а в отдельные годы наблюдения – болезни мочеполовой, нервной систем и органов чувств [5].
В работах ученых России, Великобритании, Беларуси отмечено, что у детей, проживающих на загрязненной после аварии на Чернобыльской АЭС территории Могилевской области, частота минисателлитных мутаций в 2 раза выше, чем у потомков необлученных родителей [6].
С другой стороны, данные, собранные в течение последних 40 лет у потомков родителей, пострадавших во время атомных бомбардировок Хиросимы и Нагасаки, при использовании 8 различных индикаторов не выявили статистически достоверных различий между облученными
и необлученными семьями [7]. В работе [8] отмечено, что дети, родившиеся от облученных родителей после бомбардировки Хиросимы и Нагасаки, не отличались от детей из контрольной
группы по таким медико-генетическим параметрам, как генетические уродства, мертворождения и т. д. Наблюдение показало достоверные отличия только по соотношению полов: у облученных матерей рождалось меньше сыновей, а у облученных отцов – меньше дочерей.
Таким образом, противоречивость оценки генетических последствий радиационного воздействия на человека определяет необходимость проведения долговременных наблюдений за жизнедеятельностью организмов и их потомства на загрязненной территории [4], в частности в непосредственной близости от источника радиоактивных выбросов – на территории 30-километровой зоны Чернобыльской АЭС (Полесский государственный радиационно-экологический
заповедник – ПГРЭЗ). К экологическим факторам ПГРЭЗ (зоны отчуждения ЧАЭС) относят не
21
ус
и
ци
он
ал
ьн
ая
ак
ад
ем
ия
н
ау
кБ
ел
ар
только доминирующий по уровню воздействия радиационный фактор с широким спектром радионуклидов, но и нерадиоактивные материалы, использовавшиеся при ликвидации аварии. При
этом следует учитывать, что реализация биологических эффектов происходит на специфической
биогеохимической территории, характеризующейся дефицитом йода. Следует также отметить,
что оценка радиобиологических последствий аварии на ЧАЭС заключается не только в констатации и выявлении существующих цитогенетических, морфологических, иммунологических и гематологических изменений в организме. Наиболее важным и определяющим отдаленные последствия в условиях радиоактивного загрязнения среды является формирование новых или изменение имеющихся свойств организма – чувствительности к действию токсических факторов,
что проявляется реакцией организма на тестирующее стандартизированное действие химического мутагена при разных уровнях хронического лучевого воздействия. Этим обусловлено формирование генетического груза, определяющего устойчивость потомства к действию неблагоприятных факторов окружающей среды.
Материалы и методы исследования. Изучение состояния генома соматических клеток проведено на самцах и самках мышей линии Af, которые в возрасте 11–12 недель были ввезены
в зону отчуждения ЧАЭС (реперная площадка в окрестностях д. Масаны – 12-километровая
зона) – ПГРЭЗ. Мощность экспозиционной дозы в местах размещения животных на поверхности
почвы составляла 3,3±0,1 мкГр/ч. Через 1 мес. экспозиции животные были разделены на три
группы: две группы мышей вывезены из зоны отчуждения в качестве контроля и для введения
10%-ного раствора уретана (1 мг/г массы, внутрибрюшинно), третью группу мышей отсаживали
на 10 дней для спаривания. Беременные самки были транспортированы из реперной площадки
территории ПГРЭЗ в виварий г. Минска. Таким образом, было получено потомство (F1) от родителей, которые в течение 1 мес. находились в зоне отчуждения ЧАЭС. Потомству мышей в возрасте 12 недель также вводили уретан (1 мг/г). В качестве интактного контроля использовали
линейных мышей вивария г. Минска аналогичного возраста.
Для исследований были выбраны цитогенетические (микроядерный тест в полихроматофильных эритроцитах красного костного мозга – МЯ ПХЭ), иммунологические (фагоцитарная
активность альвеолярных макрофагов – АМ), гематологические (содержание гемоглобина (Hb)
и метгемоглобина (MetHb) в крови животных) методы. Дана оценка индуцированному опухолеобразованию в легких.
Микроядерный тест в оценке генетических последствий выполняли по методу [9]. Анализ МЯ
ПХЭ выполняли через 72 ч после введения уретана. Опухолевой процесс в легких у родителей и их
потомства оценивали по среднему числу аденом на мышь через 20 недель после введения уретана
[10]. Оценка фагоцитарной активности АМ дана по величине фагоцитарного индекса (количества
фагоцитов в общем пуле клеток бронхоальвеолярного смыва – БАС, %) и фагоцитарного числа (количество частиц латекса на фагоцит) [11]. Подсчет количества клеток в смывах проводили в камере
Горяева (с применением жидкости Самсона) с пересчетом на весь объем смыва (5 мл) [12]. Определение содержания Hb и MetHb в крови животных выполняли по методу [13].
Статистическая обработка данных проведена с использованием t-критерия Стьюдента, системы Statistica 6.0. Коэффициент взаимодействия определяли отношением полученного сочетанного радиационно-токсического эффекта к вычисленному аддитивному. Работы с экспериментальными животными выполняли с использованием тиопенталового или эфирного наркоза.
Из опыта животных выводили методом цервикальной дислокации.
Результаты и их обсуждение. Данные по частоте МЯ в ПХЭ поколения F1, полученного от
родителей, которые были ввезены в зону отчуждения ЧАЭС на 1 мес., а также при дополнительном введении уретана представлены в табл. 1.
Анализ полученных данных показал, что средняя спонтанная частота МЯ ПХЭ костного
мозга линейных мышей, которые находились в зоне отчуждения ЧАЭС, в 2,6 раза превышает
аналогичный показатель группы интактного контроля. Введение уретана мышам, экспонированным в зоне отчуждения ЧАЭС, привело к увеличению средней частоты ПХЭ с МЯ костного
мозга до 0,78%, что статистически достоверно превысило показатели спонтанного уровня интактного контроля и уровня уретанового контроля (на 11,4%).
На
22
ус
и
Т а б л и ц а 1. Частота МЯ ПХЭ костного мозга мышей, экспонированных в зоне отчуждения ЧАЭС
в течение 1 мес., и их потомства F1
Кол-во
Общее число
животных проанализированных ПХЭ
8
7
8
7
10
7
17 284
16 115
16 415
16 415
23 151
0,12±0,03
0,70±0,15
0,31±0,08
0,78±0,15
0,22±0,10
ар
Интактный контроль
Уретановый контроль
Животные после 1 мес. пребывания в зоне ЧАЭС
Животные после 1 мес. пребывания в зоне ЧАЭС, получавшие уретан
Поколение F1 от родителей, содержавшихся 1 мес. в зоне ЧАЭС
Поколение F1 от родителей, содержавшихся 1 мес. в зоне ЧАЭС, получавшие уретан
X±Sx, %
ел
Группа
15 003
0,76±0,19
На
ци
он
ал
ьн
ая
ак
ад
ем
ия
н
ау
кБ
Вместе с тем частота ПХЭ с МЯ у потомства мышей, родители которых содержались в условиях ПГРЭЗ, более чем на 80% превысила аналогичный показатель у потомства интактных животных, но в силу высоких индивидуальных различий носила статистически недостоверный характер.
Различие в частоте индуцированных МЯ в ПХЭ потомства родителей, ввезенных в зону отчуждения ЧАЭС, сокращается до 8,6% по сравнению с потомством F1 от интактных родителей,
которым вводили канцероген. Следует отметить более высокую реактивность потомства мышей
по сравнению с реактивностью их родителей после экспозиции в зоне отчуждения ЧАЭС. При
введении уретана потомству мышей, экспонированных в зоне отчуждения ЧАЭС, частота ПХЭ с
МЯ увеличилась более чем в 3,4 раза по сравнению с их спонтанным уровнем, у родителей после
нахождения в зоне отчуждения ЧАЭС уретановая интоксикация повысила частоту генетических
нарушений только в 2,5 раза.
При сопоставлении результатов, полученных при анализе индукции МЯ в ПХЭ потомства
интактных и экспонированных в ПГРЭЗ мышей, а также их реакции на дополнительное введение канцерогена отмечается широкая индивидуальная вариабельность (см. рисунок).
У отдельных особей потомства мышей, находившихся в зоне отчуждения ЧАЭС, повышенный уровень МЯ свидетельствовал об активизации мутационного процесса и отражал высокую
чувствительность ядерного аппарата клеток костного мозга к токсическому фактору: из 11 мышей потомства F1 введение уретана индуцировало частоту МЯ в диапазоне 0,8–1,02 в 57% случаев, в контроле – лишь в 14% случаев (см. рисунок).
Анализ выраженности опухолевого процесса у мышей после нахождения в зоне ПГРЭЗ показал, что радиоэкологические факторы зоны отчуждения ЧАЭС после 1 мес. экспозиции животных практически не изменяют уровень опухолеобразования (табл. 2).
Уретановая интоксикация
мышей статистически достоверно повышает количество индуцированных аденом в легких. Введение уретана мышам, содержавшимся
в зоне ЧАЭС, аналогичным
образом статистически достоверно повышает среднее
количество аденом на мышь
по сравнению с уретановым
контролем и показателем зо­
ны отчуждения ЧАЭС. Ко- Частота МЯ ПХЭ костного мозга с введением уретана у потомства F мышей,
1
эффициент взаимодействия экспонированных в течение 1 мес. в зоне ЧАЭС. Условия содержания: в вивасоставил 2,40, что свиде- рии:  – не получавшие уретана;  – получавшие уретан; в зоне ЧАЭС: –
не получавшие уретана;  – получавшие уретан
тельствует о синергическом
23
ус
и
Т а б л и ц а 2. Количество индуцированных аденом на мышь у животных, экспонированных
в зоне отчуждения ЧАЭС в течение 1 мес.
Количество аденом на мышь
Коэффициент взаимодействия
39
26
0,31 ± 0,09
3,36 ± 0,43*
–
–
24
0,37 ± 0,02
24
7,67 ± 2,08**
ар
Контроль (фоновый уровень)
Уретановый контроль
Животные в зоне отчуждения ЧАЭС
(1 мес. экспозиции)
Животные в зоне отчуждения ЧАЭС
(1 мес. экспозиции), получавшие
уретан
Кол-во животных
–
2,40
ел
Группа
кБ
П р и м е ч а н и е. Статистическая достоверность при P ≤ 0,05: * – по сравнению с контролем; ** – по сравнению
с уретановым контролем. То же для табл. 3.
Т а б л и ц а 3. Количество индуцированных аденом на мышь у потомства F1 мышей, экспонированных
в зоне отчуждения ЧАЭС в течение 1 мес.
Потомство мышей F1 в условиях вивария
Потомство мышей F1 в условиях вивария,
получавших уретан
Потомство мышей F1 от родителей из зоны
отчуждения ЧАЭС
Потомство мышей F1 от родителей из зоны
отчуждения ЧАЭС, получавших уретан
23
25
Количество аденом на мышь
ау
Кол-во животных
Коэффициент
взаимодействия
0,33 ± 0,07
–
6,10 ± 0,81*
–
ем
ия
н
Группа
20
1,75 ± 0,61*
–
14
10,28 ± 1,40**
1,38
ал
ьн
ая
ак
ад
характере воздействия экологических факторов зоны отчуждения и экзогенного канцерогена –
уретана.
Индуцируемые экологической средой зоны отчуждения ЧАЭС повреждения генома наследуются потомством (табл. 3).
Оценка отдаленных эффектов показала, что у потомства F1 мышей, содержавшихся в зоне
отчуждения ЧАЭС, спонтанная частота аденом в легких статистически достоверно возрастает
по сравнению с количеством аденом в легких у потомства интактных мышей.
Введение уретана потомству мышей, экспонированных в зоне отчуждения ЧАЭС, статистически
достоверно (более чем в 1,6 раза) повышает количество индуцированных аденом на мышь по сравнению с контрольной группой (потомство интактных мышей с уретановой интоксикацией) и потомством мышей из зоны отчуждения ЧАЭС. Следует отметить высокую реактивность потомства мышей, экспонированных в зоне отчуждения ЧАЭС (коэффициент взаимодействия составил 1,38).
Одним из клеточных эффектов радиационного фактора является активация клеток макрофагального звена [8]. Эти клетки присутствуют практически во всех тканях организма, и повышение их функциональной активности приводит к усилению процессов перекисного окисления
в тканях.
Анализ фагоцитарных показателей альвеолярных макрофагов по значениям фагоцитарного
числа и фагоцитарного индекса по отношению к поглощенным частицам латекса у потомства F1
мышей, находившихся в условиях действия экологических факторов зоны отчуждения ЧАЭС, не
выявил статистически достоверных различий между исследуемыми группами в данные временные сроки (табл. 4).
ци
он
Т а б л и ц а 4. Фагоцитарные показатели альвеолярных макрофагов потомства F1 мышей,
экспонированных в зоне отчуждения ЧАЭС в течение 1 мес.
Группа
Поколение мышей F1 (виварий)
Поколение мышей F1 (зона ЧАЭС)
Поколение мышей F1 в условиях вивария, получавших уретан
Поколение мышей F1 из зоны ЧАЭС, получавших уретан
На
24
Фагоцитарный индекс, X±Sx Фагоцитарное число, X±Sx
54,7 ± 6,2
53,7 ± 3,4
58,6 ± 4,1
50,0 ± 2,5
2,0 ± 0,36
2,3 ± 0,2
2,21 ± 0,34
2,47 ± 0,25
ус
и
ел
ар
Некоторое повышение поглотительной способности фагоцитов, выраженное показателем фагоцитарного числа при введении уретана у потомства, рожденного от родителей после 1-месячного содержания в зоне отчуждения ЧАЭС, по сравнению с остальными группами носит компенсаторный характер и может быть обусловлено снижением процентного содержания фагоцитов в БАС.
В табл. 5 представлены результаты исследований содержания Нb и MetHb у мышей после
1-месячного экспонирования в ПГРЭЗ (с последующим введением уретана), а также у их потомства F1.
Т а б л и ц а 5. Уровень метгемоглобина (MetHb) и гемоглобина (Нb) в крови мышей, экспонированных
в зоне отчуждения ЧАЭС в течение 1 мес., и их потомства F1
Кол-во животных
Интактный контроль
Уретановый контроль
Животные после 1 мес. пребывания в зоне ЧАЭС
Животные после 1 мес. пребывания в зоне ЧАЭС, получавшие уретан
Потомство F1 от родителей, находившихся 1 мес. в зоне ЧАЭС
Потомство F1 от родителей, находившихся 1 мес. в зоне ЧАЭС, получавшие уретан
16
16
8
11
9
MetHb, %
кБ
Группа
ау
1,31 ± 0,27 136,61± 12,77
1,16 ± 0,31
126,06 ± 9,93
2,23 ± 0,38* 136,08 ± 13,24
1,56 ± 0,36 131,79 ± 17,46
1,42 ± 0,22 140,39± 17,71
1,19 ± 0,17
133,18 ± 7,90
ем
ия
н
10
Hb, г/л
* Различие с контролем статистически достоверно при P < 0,05.
ал
ьн
ая
ак
ад
Следует отметить, что статистически достоверное повышение содержания MetHb наблюдалось у мышей, которые находились в зоне отчуждения ЧАЭС. Уровень MetHb и Hb в периферической крови F1 их потомства не отличался от контроля.
Заключение. Результаты экспериментальных исследований свидетельствуют о том, что комплекс экологических факторов зоны отчуждения ЧАЭС индуцирует повреждения в геноме половых клеток родителей и трансгенерационную передачу их потомству. Экологические факторы
не только влияют на фоновый уровень их проявления, но и изменяют реакцию организма на действие химического фактора, что выявляется при стандартизированном действии экзогенного
канцерогена – уретана.
С использованием микроядерного теста на полихроматофильных эритроцитах костного мозга показана более высокая реактивность потомства мышей по сравнению с реактивностью их
родителей после 1 мес. экспозиции в зоне отчуждения ЧАЭС. При введении уретана потомству
мышей, экспонированных в зоне отчуждения ЧАЭС, частота ПХЭ с МЯ увеличилась более чем
в 3,4 раза по сравнению с их спонтанным уровнем, у мышей-родителей после нахождения в зоне отчуждения ЧАЭС уретановая интоксикация повысила частоту генетических нарушений
в 2,5 раза.
Полученные данные свидетельствуют о росте темпов формирования генетических повреждений в организмах, находящихся в условиях повышенного радиационного фона и действия токсических факторов. Экстраполяция установленных закономерностей модифицирующих эффектов экологических факторов зоны отчуждения на население, проживающее на загрязненных
территориях, прилегающих к зоне отчуждения ЧАЭС, не позволяет исключать проявления аналогичных закономерностей среди них, но выраженность их, безусловно, будет меньше.
Литература
На
ци
он
1. С п и р и д о н о в С. И., А л е к с а х и н Р. М., Ф е с е н к о С. В., С а н ж а р о в а Н. И. // Радиац. биология.
Радиоэкология. 2007. Т. 47, № 2. С. 196–203.
2. L o r i m o r e S. A., M c i r a t h J. M., C o a t e s P. J. et al. // Canc. Res. 2005. Vol. 65, N 13. P. 5668–5673.
3. С у с к о в И. И., К у з ь м и н а Н. С., С у с к о в а В. С. // Радиац. биология. Радиоэкология. 2006. Т. 46. Вып. 2.
С. 167–177.
4. Н е ф е д о в И. Ю., Н е ф е д о в а И. Ю., П а л ы г а Г. Ф. // Радиац. биология. Радиоэкология. 1996. Т. 36. Вып. 6.
С. 912–920.
25
ус
и
кБ
ел
ар
5. Ц ы б А. Ф., С у ш к е в и ч Г. Н., Л я с к о Л. И. и др. // Intern. J. of Radiation Medicine. 2004. Vol. 6, N 1/4.
Р. 116–121.
6. D u b r o v a Y. E., N e s t e r o v V. N., K r o u c h i n s k y N. G. // Nature. 1996. Vol. 380, N 25. P. 683–686.
7. N e e l J. V. et al. // Am. J. Hum. Genet. 1990. Vol. 46. P. 1053–1072.
8. Ф о г е л ь Ф., М о т у л ь с к и й А. Генетика человека. М., 1990. С. 245–249.
9. Руководство по краткосрочным тестам для выявления мутагенных и канцерогенных химических веществ.
Женева, 1989.
10. Т у р у с о в В. С., П а р ф е н о в Ю. Д. Методы выявления и регламентирования химических канцерогенов.
М., 1986.
11. В а з и н а И. Р., П ы л а е в а С. И., М а т у с и с З. Е., Г р о м ы х и н а Н. Ю. // Бюл. эксперим. биологии
и медицины. 1984. Т. 97, № 6. С. 756–758.
12. M y r v i k Q. N., L e a k e E. S., F a r i s s B. // J. Immunol. 1961. Vol. 86. P. 128–136.
13. К у ш а к о в с к и й М. С. Клинические формы повреждения гемоглобина. М., 1968.
E. F. Konoplya, S. N. Sushko, A. F. Malenchenko, A. O. Savin, E. M. Kadukova, S. V. Goncharov
Influence of ecological factors of the zone of THE Chernobyl disaster
on THE somatic cells of mice and their posterity
ем
ия
н
Summary
ау
Institute of Radiobiology of NAS of Belarus, Gomel
На
ци
он
ал
ьн
ая
ак
ад
The main purpose of the present research is to study the reaction of cells of the haemopoetic system and carcinogenesis in
the lungs of linear mice which were in the zone of the Chernobyl disaster for 1 month and their posterity (F1). It is established
that the increase in frequency of micronucleated polychromatic erythrocytes in bone marrow for posterity F1 from mouseparents being in the zone of the Chernobyl disaster had no statistical significance in comparison with the control groups. It is
shown that the raising sensitivity of the posterity of linear mice, which were in the zone of the Chernobyl disaster, to the
carcinogenic effect of urethane had more significance in comparison with the sensitivity of their parents. The estimate of the
tumor process has shown that a spontaneous frequency of adenomas in the lungs for posterity F1 statistically increased more
than 5 times in comparison with the similar parameter for the posterity of intact mice.
ар
СЕ­Р­Ы Я МЕДЫЦЫНСКІХ НА­ВУК
ус
и
ВЕСЦI НА­Ц­Ы Я­НАЛЬ­НАЙ АКА­ДЭМII НА­ВУК БЕ­ЛА­РУСI № 3 2009
УДК 615.244.03:616.36-02:547.262]-092.9
ел
А. Г. Виницкая, В. В. Лелевич, И. О. Леднева, Е. М. Дорошенко
кБ
сравнительная характеристика обмена
гамма-аминомасляной кислоты в головном мозге
и печени крыс при синдроме отмены этанола
Гродненский государственный медицинский университет, Беларусь
ау
(Поступила в редакцию 27.06.2008)
На
ци
он
ал
ьн
ая
ак
ад
ем
ия
н
Введение. В патогенезе алкогольной болезни определяющую роль играют изменения, происходящие в печени, головном мозге, сердце и легких [1]. При хронической алкогольной интоксикации в ЦНС наблюдаются изменения в концентрациях γ-аминомасляной кислоты (ГАМК), глутамата, дофамина и других нейромедиаторов, которые связывают с активацией в мозге центра
удовольствия, способствующего формированию постоянной тяги к употреблению этанола [2, 3].
В эксперименте было показано, что лишение животных алкоголя после его длительного поступления в организм приводит к нарушению баланса между содержанием тормозных и возбуждающих нейромедиаторов в ключевых отделах мозга, что проявляется в гиперактивности животных – ведущем симптоме синдрома отмены этанола [4, 5].
В настоящее время доказано участие печени в реализации центральных и периферических
эффектов алкоголя, в том числе на другие органы и ткани [1, 6]. Функциональное состояние печени обусловливает скорость метаболизма этанола и метаболической адаптации при его хроническом употреблении [6]. ГАМК и ферменты ее метаболизма были выявлены не только в головном мозге, но и в печени, горизонтальных клетках сетчатки, спинном мозге, ганглиях автономной нервной системы и некоторых эндокринных железах [7, 8]. Так, в печени были обнаружены
ГАМК А-ергические рецепторы и полный набор ГАМК-метаболизирующих ферментов [9]. На сегодняшний день состояние метаболизма ГАМК в отделах головного мозга подопытных животных при различных видах алкогольной интоксикации изучено достаточно [4, 5]. В то же время
отсутствуют данные об изменениях параметров метаболизма ГАМК в печени при действии этанола.
Цель данного исследования – сравнение эффектов алкоголизации на состояние катаболизма
ГАМК, содержание ГАМК и некоторых аминокислот в отделах головного мозга и печени крыс
при моделировании синдрома отмены этанола.
Объекты и методы исследования. Эксперименты выполнены на белых беспородных
крысах-самцах массой 180–200 г, которые были разделены на четыре группы, по 6–8 особей
в каждой. Синдром отмены этанола вызывали стандартным методом интрагастральных интубаций по Майхровичу в модификации [10]. Животным внутрижелудочно вводили 25%-ный раствор этанола (2 раза в сутки по 5 г/кг массы тела) с интервалом 12 ч на протяжении 5 сут. Контрольные животные (I группа) получали 0,9%-ный раствор NaCl внутрижелудочно, дважды
в сутки, в течение 5 сут. Декапитацию подопытных крыс проводили через 3 ч (II группа), 3 сут
(III группа) и 7 сут (IV группа) после последней инъекции алкоголя, а животных контрольной
группы – через 3 ч, 3 и 7 сут после последней инъекции физиологического раствора. Крыс декапитировали, выделяли печень, а из головного мозга − большие полушария и мозжечок, которые
немедленно замораживали в жидком азоте.
В гомогенатах отделов головного мозга и печени определяли активность ферментов катаболизма ГАМК: ГАМК-трансаминазы (ГАМК-Т) и дегидрогеназы янтарного полуальдегида
27
ус
и
ци
он
ал
ьн
ая
ак
ад
ем
ия
н
ау
кБ
ел
ар
(ЯПА-ДГ) спектрофлуориметрическим методом [11]. Уровень ГАМК, глутамата, β-аланина определяли методом ВЭЖХ по ранее описанной методике [12], содержание белка – по Лоури. Достоверность различий между группами оценивали параметрическим методом с применением
t-критерия Стьюдента.
Результаты и их обсуждение. Показано, что 5-дневная алкогольная интоксикация приводит
к достоверным сдвигам в параметрах ГАМК-ергической системы в коре больших полушарий
и мозжечке головного мозга крыс. По литературным данным, ГАМК-ергические интернейроны
в большом количестве находятся в коре больших полушарий, пластинке четверохолмия и ретикулярной формации ствола мозга, других отделах мозга [13]. В мозжечке ГАМК-ергические синапсы были обнаружены на поверхности клеток Пуркинье, звездчатых и корзинчатых клеток,
где они, по-видимому, координируют церебральные рефлексы и различные ингибиторные механизмы в спинальных α-мотонейронах [13]. По другим данным [1, 6], отмена алкоголя после длительной алкоголизации способствует накоплению ацетальдегида, обладающего мембраноповреждающим действием, что может являться дополнительным фактором, влияющим на активность митохондриальных ферментов, в том числе на катаболизм ГАМК.
Через 3 ч после последнего введения крысам этанола (II группа) в исследуемых отделах мозга не наблюдали статистически значимых изменений в содержании аминокислот и катаболизме
нейромедиатора. Через 3 сут после отмены этанола (III группа) в больших полушариях достоверно снизилась активность ГАМК-Т и ЯПА-ДГ (на 33 и 36% соответственно; P < 0,05). При этом
концентрации ГАМК и ее предшественника глутамата не изменялись. Увеличение срока лишения алкоголя до 7 сут (IV группа) вызвало в больших полушариях значительное (на 158%)
увеличение содержания глутамата (P < 0,001) при неизменном уровне ГАМК и снижении (на
25%) активности ГАМК-Т (P < 0,05) (рис. 1).
В мозжечке крыс III группы наблюдали повышение содержания ГАМК на 67% (P < 0,001) на
фоне угнетения ГАМК-трансаминазной реакции на 43% (P < 0,05). На 7-е сутки после отмены
этанола в мозжечке сохранялось увеличение уровня ГАМК (на 39%; P < 0,05) на фоне снижения
активности ЯПА-ДГ на 17% (P < 0,05). Активность ГАМК-Т и содержание глутамата в этом отделе мозге достоверно не изменились (рис. 2).
В головном мозге концентрация ГАМК, определяемая балансом между ее синтезом и деградацией, включает синтез ГАМК из глутамата и ее катаболизм до сукцината и γ-оксимасляной
кислоты [14, 15]. Известно, что около 17% от всей активности ЦТК в целом мозге приходится на
обходной путь превращения α-кетоглутарата в сукцинат через переаминирование ГАМК и анаплеротический ГАМК-шунт, причем активность обмена ГАМК в мозжечке по сравнению с большими полушариями протекает с большей интенсивностью [15].
Наши результаты показали, что отмена
этанола после интенсивной алкогольной нагрузки приводит к угнетению распада ГАМК
в обоих изученных отделах мозга. Однако
в мозжечке крыс через 3 и 7 сут после отмены
этанола угнетение катаболизма нейромедиатора происходило на фоне повышения содержания ГАМК. В то же время в IV группе угнетение катаболизма ГАМК в больших полушариях сопровождалось увеличением содержания
нейромедиатора возбуждения − глутамата. Повышение уровня глутамата на 7-е сутки отмеРис. 1. Активность ферментов обмена ГАМК, содержание ны может свидетельствовать о сохранении ринекоторых аминокислот в больших полушариях мозга ска возбудимости нервной ткани в отдаленные
крыс (n = 8) в разные сроки отмены этанола (в % к контросроки после отмены этанола, поскольку в корлю). Группы: II – отмена этанола 3 ч; III – отмена этанола
3 сут; IV – отмена этанола 7 сут. * – достоверные измене- ковых структурах обнаружено много глутамат­
ния по отношению к контролю
ергических рецепторов [13, 15].
На
28
ус
и
ем
ия
н
ау
кБ
ел
ар
В печени обнаружены полный набор ГАМКметаболизирующих ферментов и ГАМКА-ерги­
ческие рецепторы. Последние участвуют в регуляции регенерации печени после токсического действия этанола и некоторых гепато­тропных соединений [8].
Через 3 ч (II группа) после 5-дневного введения этанола в печени крыс достоверно повысились концентрации β-аланина и глутамата −
на 136,0% (P < 0,001) и 27,3% (P<0,05) (см. таб­
лицу). В этой группе эффект повышения в печени концентрации β-аланина сопровождался
угнетением активности ГАМК-Т (на 21,1%; Рис. 2. Активность ферментов обмена ГАМК, содержание
P<0,05), поскольку β-аланин является одним некоторых аминокислот в мозжечке мозга крыс (n = 8)
из субстратов неспецифичной ГАМК-Т печени в разные сроки отмены этанола (в % к контролю). Груп[16]. По литературным данным, печеночная пы: II – отмена этанола 3 ч; III – отмена этанола 3 сут;
IV – отмена этанола 7 сут. * – достоверные изменения по
форма ГАМК-Т способна к переаминированию
отношению к контролю
ГАМК, β-аланина и пищевых ω-аминокислот,
а ее функции отличаются от функций фермента, локализованного в нервной ткани, поскольку ГАМК не является в печени нейромедиатором
[9, 16]. Позже было показано, что первично в печени происходит синтез ГАМК-Т, по строению
аналогичной ферменту мозгового типа. Затем этот фермент-предшественник подвергается частичному протеолизу посредством эндопептидазы и превращается в β-аланин-оксоглутаратаминотрансферазу [17]. Следовательно, изменение активности ГАМК-Т при отмене этанола может свидетельствовать не только о состоянии обмена ГАМК, но и о нарушении способности печени к утилизации некоторых нутриентов.
Показатель
Группа
I (контроль)
II (отмена этанола
через 3 ч)
III (отмена этанола
через 3 сут)
IV (отмена этанола
через 7 сут)
15,40 ± 0,72
127,7 ± 4,74
4138,5± 199,7
3,61 ± 0,23
15,96 ± 1,07
13,11 ± 1,18
301,3 ± 28,91*
5269,3 ± 236,2*
2,49 ± 0,15*
16,04 ± 0,89
17,46 ± 1,10
136,3 ± 8,01
4853,1± 440,4
2,16 ± 0,39*
14,27 ± 0,62
12,59 ± 0,59*
99,29±4,49*
4514,6 ± 188,9
3,65 ± 0,19
12,96 ± 0,52*
ая
ГАМК, нмоль/г ткани
β-Аланин, нмоль/г ткани
Глутамат, нмоль/г ткани
ГАМК-Т, нмоль/мг белка /мин
ЯПА-ДГ, нмоль/мг белка /мин
ак
ад
Активность ферментов обмена ГАМК, содержание некоторых аминокислот
в печени крыс (n = 8) в разные сроки отмены этанола
ьн
П р и м е ч а н и е. * – достоверные изменения по отношению к контролю.
На
ци
он
ал
На 3-и сутки после отмены этанола (III группа) в печени наблюдалось снижение (на 40,2%)
активности ГАМК-Т при отсутствии изменений других изучаемых параметров системы ГАМК.
На 7-е сутки после отмены этанола (IV группа) отмечалось снижение уровней ГАМК и β-аланина
на 18,3% (P < 0,05) и 22,3% (P < 0,001) на фоне неизмененной активности ГАМК-Т. В то же время
в печени крыс IV группы активность ЯПА-ДГ была снижена на 18,8% (P < 0,05) (см. таблицу).
Известно, что ЯПА-дегидрогеназа в печени также является неспецифичным ферментом и способна окислять, помимо янтарного, и другие полуальдегиды [18]. Ее активность, как и других
дегидрогеназ, в большей степени определяется соотношением НАД+/ НАДН(Н+), которое изменяется в печени при хронической алкогольной интоксикации [6]. Следовательно, угнетение
активности ЯПА-ДГ на 7-е сутки после отмены этанола может свидетельствовать не только
о процессах окисления субстратов реакции, но и о синтезе восстановленных эквивалентов
в гепатоцитах.
29
ус
и
Литература
ау
кБ
ел
ар
Результаты проведенных исследований показали, что прекращение поступления этанола после интенсивной 5-дневной алкоголизации вызывает достоверные сдвиги в катаболизме ГАМК
в изученных отделах мозга и печени крыс. Причем на 3-и и 7-е сутки после отмены в головном мозге и печени происходит угнетение активности обоих ГАМК-катаболизирующих ферментов на фоне
повышения (в мозжечке) и снижения (в печени) концентраций субстратов ГАМК-трансаминазной
реакции. В головном мозге данный эффект можно объяснить уменьшением компенсаторной роли
ГАМК-шунта как дополнительного источника субстратов для цикла Кребса [14]. Учитывая множественность функций неспецифической ГАМК-Т в ткани печени [8, 15, 19], можно предположить,
что наблюдаемые изменения при отмене алкоголя свидетельствуют об угнетении утилизации не
только ГАМК, но и других ее метаболитов, относящихся к нутриентам.
Заключение. Таким образом, можно предположить, что наблюдаемые метаболические сдвиги являются следствием неспецифической адаптации клеток печени и отделов головного мозга
к интенсивной алкогольной нагрузке и ее последующей отмене. Полученные новые данные о нарушениях метаболизма ГАМК и энергетического обмена при отмене алкоголя могут быть полезны при разработке новых методов лечения алкогольных абстинентных состояний и направленной метаболической коррекции выявленных метаболических сдвигов.
ая
ак
ад
ем
ия
н
1. П а у к о в В. С. // Бюл. эксперим. биол. и мед. 1996. Т. 122, № 12. С. 604–610.
2. L u n g f o r d – H u g h e s A., N u t t D. // Brit. J. Psychiatry. 2003. Vol. 182. P. 97–100.
3. V e t u l a n i J. // Pol. J. Pharmacol. 2001. Vol. 53, N 5. P. 415–434.
4. В и н и ц к а я А. Г., Л е л е в и ч В. В., К а н у н н и к о в а Н. П. // Весцi НАН Беларусi. Сер. бiял. навук. 1999.
№ 4. C. 121–127.
5. S h e r i f F., W a h l s t r o m G. // Alcohol. Clin. Exp. Res. 1993. Vol. 17, N 6. P. 1313–1318.
6. Р о с л ы й И. М., А б р а м о в С. В., А г а р о н о в В. Р. и др. // Вопр. наркологии. 2004. № 2. С. 70–79.
7. T i l l a k a r a t n e N. J., M e d i n a-K a u w e L., G i b s o n K. M. // Comp. Biochem. Physiol. A Physiol. 1995.
Vol. 122, N 2. P. 247–263.
8. E r l i t z k i R., G o n g Y u., Z h a n g M., M i n u k G. // Am. J. Psysiol. Gastrointest. Liver Physiol. 2000. Vol. 279.
P. 733–739.
9. K i r b y N., K i r b y N., F o w l e r L. J. et al. // Biochem. J. 1985. Vol. 230. P. 481–488.
10. А б д р а ш и т о в А. Х., Л и с т в и н а В. П., Н у ж н ы й В. П., У с п е н с к и й А. Е. // Фармакол. и токсикол.
1983. № 6. С. 94–98.
11. D e B o e r T h., B r u i n v e l s J. // J. Neurochem. 1977. Vol. 28. P. 471–478.
12. Л е л е в и ч В. В., А б а з и д Х., В и н и ц к а я А. Г., Д о р о ш е н к о Е. М. // Нейрохимия. 2005. Т. 1, № 1.
С. 38–43.
13. K r u k Z. L., P y c o c k C. J. // Croom Helm. London & Canberra, 1983. P. 147–155.
14. Р о з а н о в В. А. // Успехи совр. биологии. 1989. Т. 103, № 3. C. 375–391.
15. S o n n e w a l d U., M c K e n n a M. // Neurochem. Res. 2002. Vol. 27, N 1–2. P. 43–50.
16. N o r i k u r a T., K o j i m a – Y u a s a A., O p a r e K e n- n e d y D. // Amino Acids. 2007. Vol. 32, N 3. P. 419–423.
17. O h y a m a T., M a t s u d a K., T a c h i b a n a H. et al. // FEBS Lett. 2004. Vol. 572, N 1–3. P. 251–255.
18. N g u y e n E., P i c k l o M. J. // Biochim. Biophys. Acta. 2003. Vol. 1637, N 1. P. 107–112.
19. Lau G., Zhang M., Minuk G. // Alcohol. 1999. Vol. 19, N 3. P. 219–227.
ьн
H. Vinitskaya, V. V. Lelevich, I. O. Ledniova, Y. M. Doroshenko
ал
comparative study oF The GAMMA-aminobutyric acid metabolism
in THE RAT brain and liver during alcohol withdrawal
Grodno State Medical University, Belarus
Summary
На
ци
он
The objective was to compare the changes in the gamma-aminobutyric acid (GABA) metabolism in the regions of the rat
brain (hemispheres, cerebellum) and liver after chronic alcohol intoxication and withdrawal (AW). In aw the rats were
preliminarily treated by chronic intragastrical infusion of a 25% ethanol solution in a dose of 5 g/kg of body weight, twice
daily, within 5 days and were sacrified 3 hours, 3 and 7 days after the last alcohol administration. 3 and 7 days of AW resulted
in the inhibition of the GABA catabolism both in the brain regions and in the liver, followed by increase (in cerebellum) and
decrease (in liver) of the GABA-T substrates. It was proposed that the changes observed can occur due to the non-specific
adaptation of brain regions and hepatocytes to the excessive alcohol consumption and further cessation. The results obtained
on the disturbances of energy and GABA metabolism in the brain and liver resulted from AW might be useful for working
new effective methods of alcoholism treatment.
ар
СЕ­Р­Ы Я МЕДЫЦЫНСКІХ НА­ВУК
ус
и
ВЕСЦI НА­Ц­Ы Я­НАЛЬ­НАЙ АКА­ДЭМII НА­ВУК БЕ­ЛА­РУСI № 3 2009
ел
УДК 577.3:612.65:621.391
С. А. ЛИХАЧЕВ1, А. В. СИДОРЕНКО 2, Г. И. ОВСЯНКИНА1,
Т. Н. ЧЕРНУХА 1, В. В. САДОВНИКОВ2
Республиканский научно-практический центр неврологии и нейрохирургии, Минск, Беларусь,
2
Белорусский государственный университет, Минск
ау
1
кБ
НЕЛИНЕЙНЫЙ АНАЛИЗ ЭЛЕКТРОЭНЦЕФАЛОГРАММ
ПРИ СПАСТИЧЕСКОЙ КРИВОШЕЕ
(Поступила в редакцию 03.12.2008)
На
ци
он
ал
ьн
ая
ак
ад
ем
ия
н
Введение. Современные информационные технологии находят все более широкое применение в практической электрофизиологии, позволяющей на уровне обработки и анализа биоэлектрических сигналов диагностировать различные состояния систем организма. Проведение анализа осложняется при действии на организм антропогенных факторов, а также при обработке
электроэнцефалограмм, искаженных наложением других сигналов, носящих аддитивный или
мультипликативный характер.
Среди нейрогенных заболеваний особую группу составляет спастическая кривошея, как одна
из форм фокальной мышечной дистонии, которая проявляется тоническими, клоническими или
топико-клоническими гиперкинезами мышц шеи, чаще ротационного характера. В результате
этого наблюдается постоянное или периодическое отклонение головы и шеи [1, 2].
Характерным для пациентов при спастической кривошее является наличие в электроэнцефалограмме наряду с ритмами мозга колебаний, обусловленных влиянием мышечных сокращений,
что затрудняет проведение диагностики на высоком уровне и выбор курса лечения [3, 4].
Представляется актуальным установление информативных и ранних нейрофизиологических
критериев диагностики и определения динамики протекания заболевания в процессе проведения лечебных процедур.
В качестве методологии исследований в данной работе был применен один из методов нелинейной динамики – метод задержанной координаты. Указанная методология успешно использована нами при обработке и анализе электроэнцефалографических сигналов у пациентов с нарушением мозгового кровообращения [5], а также электрокортикограмм у животных в условиях
электромагнитных излучений [6].
Цель работы − изучение и анализ методами нелинейной динамики электроэнцефалограмм
пациентов при спастической кривошее для получения качественных и количественных параметров, характеризующих функциональное состояние центральной нервной системы при рассмат­
риваемой патологии.
Методика проведения исследований. Обработку и анализ электроэнцефалограмм, зарегистрированных компьютерным электроэнцефалографом фирмы «МБН», проводили по схеме
«10/20» в разработанном нами информационно-измерительном комплексе, описанном в работе
[7]. В процессе проведения исследований были обработаны электроэнцефалограммы 40 пациентов со спастической кривошеей в следующих восьми отведениях: Fp1–A1, Fp2–A2, C3–A1, C4 –A2,
O1–A1, O2–A2, T3–A1, T4 –A2. Функциональное состояние центральной нервной системы при этом
определяли в момент поступления в клинику (функциональное состояние I) и после проведения
курса лечения препаратом ботулотоксином типа А (диспорт) в дозе 400–750 ЕД (функциональное состояние II).
31
ус
и
ем
ия
н
ау
кБ
ел
ар
Построение фазовых портретов в работе использовали для визуального анализа электроэнцефалограмм. Метод анализа колебаний динамической системы в фазовом пространстве был
разработан в рамках теории колебаний [8]. Фазовые портреты сложных колебательных процессов применяли для определения структуры динамической системы и выбора направления дальнейших исследований.
В процессе обработки электроэнцефалограмм с помощью метода задержанной координаты
и спектрального корреляционного метода рассчитывали корреляционную размерность d, энтропию Колмогорова Е, спектр мощности, спектральную плотность мощности и ее распределение
в частотных диапазонах ритмических составляющих мозга − дельта-, тета-, альфа-, бетаи гамма-диапазонах.
Достоверность определения параметров определяли методом дискриминационной статистики [9]. Достоверными при обработке цифровых данных считали результаты при вероятности
ошибки Р < 0,05.
Метод задержанной координаты. Метод задержанной координаты, в отличие от традиционных методов анализа электроэнцефалограмм, включая спектральный корреляционный, разработан для нестационарных сигналов. Он позволяет учесть нелинейности, свойственные электрофизиологическому сигналу. Анализ временной реализации сигнала, зависящего от одной переменной, позволяет восстановить структуру динамической системы в фазовом пространстве,
которое характеризуется корреляционной размерностью и энтропией Колмогорова. Алгоритм
метода задержанной координаты может быть сведен к следующему [10].
Временную реализацию электрокортикограммы представляли в виде последовательности
чисел
x1, x2, …, xN, (1)
ак
ад
где xn = x(nτ); τ – время выборки; n – целое число.
Эта последовательность порождает m-мерные векторы, лежащие в m-мерном фазовом пространстве:

xiT = ( xi , ..., xi + m −1 ), (2)
где T − знак транспонирования.
Состояние системы в реконструированном m-размерном фазовом пространстве определяли
m–размерными точками для каждой временной реализации x(t):
xim = (m −1/ 2 ) ( xi , xi +1 ,..., xi + m −1 ). (3)
ая
Корреляционный интеграл Сm(l) – это функция, определяемая вероятностью того, что рас
стояние между двумя реконструированными векторами xi меньше l.
Корреляционную размерность d определяли по формуле
d = lim r →0 [lg Cm (r ) / lg r ], ьн
(4)
ал
где Cm(r) − корреляционный интеграл; r – размер ячейки разбиения, или коэффициент подобия.
Корреляционный интеграл записывали как
Cm (r ) = lim N →∞
1
N
2
N


∑ θ( r − | xi − x j |), i , j =1
(5)
ци
он
где θ − функция Хевисайда ( θ = 0 при t ≤ 0, θ = 0,5 при t = 0, θ = 1 при t ≥ 0 ); N – число точек,
используемых для оценки размерности.
Найдено [10], что для малых r поведение функции Cm(r) может быть описано следующим образом:
Сm ( r ) = r d , где d − параметр, близкий к фрактальной размерности аттрактора; r – параметр подобия.
На
32
(6)
ус
и
Для достоверной оценки корреляционной размерности d размерность соответствующих фазовых пространств должна удовлетворять условию Мане
m ≥ 2d + 1 .
(7)
ар
Для сокращения объема вычислений был использован алгоритм И. Арансона, описанный в
работе [11].
Энтропию Колмогорова определяли по формуле
1
K = lim r →0 lim τ→0 lg[Cm (r ) / Cm +1 (r )]. (8)
τ
Для динамических систем, определяемых из экспериментальных временных реализаций, энтропию Колмогорова целесообразно представлять в нормированном на энергию виде [12].
В нашей работе рассчитывали энтропию Колмогорова, нормированную на энергию в физиологически значимом диапазоне электроэнцефалограмм. В качестве нормирующей величины использовали энергию в том частотном диапазоне ритмических составляющих мозга, в котором
находится максимальная частота спектра [6].
Результаты и их обсуждение. В процессе проведения исследований в биоэлектрической активности мозга пациентов до лечения (в состоянии I) и после лечения (состояние II) отмечалось
наличие асимметрии и преобладание бета- и гамма-ритмов (табл. 1–4). Однако уровень спектральной плотности мощности этих ритмов превышал значения, зарегистрированные до лечения. На рис. 1 приведены гистограммы распределения спектральной плотности мощности в частотных диапазонах ритмических составляющих мозга: дельта-, тета-, альфа-, бета- и гаммадиапазонах электроэнцефалограмм пациента Л. (отведения электроэнцефалограмм O1–A1 (a, в)
и O2–A2 (б, г)) в состояниях I и II при спастической кривошее.
ем
ия
н
ау
кБ
ел
T a б л и ц а 1. Параметры электроэнцефалограмм (различные отведения), вычисленные спектральным
корреляционным методом и методом задержанной координаты для пациента Л. (состояние I)
Спектральная плотность мощности Si /S0, отн. ед.
тета-ритм
(4–8 Гц)
альфа-ритм
(8–12 Гц)
бета-ритм
(12–25)Гц
гамма-ритм
(25–50 Гц)
0,129±0,004
0,096±0,003
0,085±0,003
0,092±0,003
0,076±0,003
0,241±0,007
0,575±0,018
0,223±0,007
0,029±0,001
0,033±0,001
0,044±0,001
0,048±0,001
0,043±0,001
0,088±0,003
0,081±0,003
0,095±0,003
0,028±0,001
0,033±0,001
0,054±0,002
0,049±0,001
0,063±0,002
0,094±0,003
0,061±0,002
0,097±0,003
0,105±0,003
0,521±0,015
0,474±0,014
0,464±0,014
0,469±0,014
0,431±0,014
0,174±0,005
0,427±0,014
0,708±0,021
0,318±0,011
0,343±0,011
0,345±0,011
0,349±0,011
0,145±0,004
0,108±0,003
0,156±0,005
ак
ад
Fp1–A1
Fp2–A 2
C3–A1
C4 –A 2
O1–A1
O2–A 2
T3–A1
T4 –A 2
дельта-ритм
(0,5–4 Гц)
ая
Отведение
Корреляционная
размерность, d
Энтропия
Колмогорова, Е
1,705±0,017
1,729±0,017
1,729±0,017
1,742±0,017
1,729±0,017
1,647±0,016
1,721±0,017
1,650±0,017
(1,02±0,04)·10 –2
(7,40±0,22)·10 –3
(8,62±0,25)·10 –3
(7,40±0,23)·10 –3
(1,06±0,04)·10 –2
(1,70±0,05)·10 –1
(8,35±0,25)·10 –2
(2,05±0,06)·10 –1
П р и м е ч а н и е. В табл. 1–4 достоверность различий при Р <0,05.
ьн
T a б л и ц а 2. Параметры электроэнцефалограмм (различные отведения), вычисленные спектральным
корреляционным методом и методом задержанной координаты для пациента Л. (состояние II)
дельта-ритм
(0,5–4 Гц)
тета-ритм
(4–8 Гц)
альфа-ритм
(8–12 Гц)
бета-ритм
(12–25)Гц
гамма-ритм
(25–50 Гц)
0,092±0,003
0,087±0,003
0,071±0,002
0,065±0,002
0,053±0,002
0,249±0,007
0,374±0,011
0,185±0,001
0,032±0,001
0,032±0,0010
0,053±0,003
0,047±0,001
0,045±0,001
0,086±0,003
0,099±0,003
0,086±0,001
0,027±0,001
0,027±0,001
0,053±0,002
0,054±0,002
0,051±0,001
0,084±0,003
0,087±0,003
0,082±0,001
0,518±0,015
0,521±0,015
0,472±0,014
0,481±0,014
0,508±0,015
0,458±0,014
0,305±0,010
0,499±0,015
0,330±0,011
0,333±0,011
0,350±0,011
0,352±0,011
0,341±0,015
0,123±0,004
0,134±0,004
0,147±0,004
На
ци
он
Fp1–A1
Fp2–A 2
C3 –A1
C4 –A 2
O1–A1
O2–A 2
T3–A1
T4 –A 2
ал
Спектральная плотность мощности Si /S0, отн. ед.
Отведение
Корреляционная
размерность, d
Энтропия
Колмогорова, Е
1,616±0,016
1,617±0,016
1,623±0,016
1,626±0,016
1,621±0,016
1,526±0,015
1,621±0,016
1,517±0,015
(1,51±0,04)·10 –2
(1,31±0,04)·10 –2
(1,55±0,03)·10 –2
(1,46±0,04)·10 –2
(1,55±0,05)·10 –2
(2,02±0,06)·10 –1
(1,37±0,04)·10 –1
(2,47±0,07)·10 –1
33
ус
и
ар
ел
кБ
ау
ем
ия
н
Рис. 1. Гистограммы распределений спектральной плотности мощности в частотных диапазонах ритмических составляющих мозга: дельта-, тета-, альфа-, бета- и гамма-диапазонах электроэнцефалограмм пациента Л. (отведения
электроэнцефалограмм O1–A1 (a, в) и О2 − А 2 (б, г)) в состояниях I и II при спастической кривошее
ци
он
ал
ьн
ая
ак
ад
Фазовые портреты электроэнцефалограмм (отведения O1–A1 и O2–A2) при различных состояниях центральной нервной системы пациента Л. приведены на рис. 2.
Визуальный анализ фазовых портретов отражает изменения в структуре динамических систем, восстановленных с помощью электроэнцефалограмм в процессе лечения. Это подтверждается также более низкими значениями корреляционной размерности, полученными в восьми отведениях электроэнцефалограмм в состоянии II относительно состояния I (см. табл. 1, 2).
При анализе параметров нелинейной динамики в правом и левом полушариях головного мозга значения корреляционной размерности d электроэнцефалограмм были выше в отведениях
Fp2–A2, C4 –A2, O1–A1, T3–A1. Значения энтропии Колмогорова Е, наоборот, преобладали в отведениях Fp1–A1, C3–A1, O2–A2, T4 –A2. Параметры нелинейной динамики для отведений O1–A1
и O2–A2 также отличались: корреляционная размерность для отведения O2–A2 была ниже, чем
для O1–A1 ( d = 1,647±0,017 и d = 1,729±0,017 соответственно; в процентном отношении – на 4,8%
относительно отведения O1–A1 до лечения). А значения энтропии Колмогорова, наоборот, были
выше (E = (1, 70±0,05)·10 –1 и E = (1,06±0,04)·10 –2). Это значит, что динамическая система, восстановленная из электроэнцефалограммы (отведение O1–A1), обладает большим числом степеней
свободы и характеризуется более высокой расходимостью фазовых траекторий по отношению
к электроэнцефалограмме отведения O2 –A2.
В результате лечения (рис. 1) также преобладали бета-ритмы, но их уровень был значительно
выше. Параметры корреляционной размерности были снижены. Происходило их выравнивание
в отведениях Fp1–A1 и Fp2 – A2, а также в C3–A1 и C4 –A2. Корреляционная размерность в электроэнцефалограммах O2–A2 и T3–A1 отведений практически была одинаковой. Асимметрия в значениях корреляционной размерности для электроэнцефалограмм отведений O2–A2 и O1–A1
сохранялась (d = 1,621±0,016 и d = 1,526±0,015 соответственно; в процентном отношении –
на 5,8%). В состоянии II энтропия Колмогорова возрастала по отношению к этому показателю
в состоянии I. Для пациента Л. в процессе лечения корреляционная размерность снижалась,
а энтропия Колмогорова возрастала. Таким образом, биоэлектрическая активность мышц преобладала в структуре электроэнцефалограммы данного пациента.
На
34
ус
и
ар
ел
кБ
ау
ем
ия
н
ак
ад
Рис. 2. Фазовые портреты электроэнцефалограмм (отведения О1−А1 (a, в) и О2−А 2 (б, г)) в состояниях I и II пациента
Л. при спастической кривошее
ая
Параметры электроэнцефалограмм (различные отведения), вычисленные спектральным корреляционным методом и методом нелинейной динамики для пациента Г., приведены в табл. 3
(состояние I, до лечения) и в табл. 4 (состояние II, после лечения), а также на рис. 3.
ьн
T a б л и ц а 3. Параметры электроэнцефалограмм (различные отведения), вычисленные спектральным
корреляционным методом и методом задержанной координаты для пациента Г. (состояние I)
Спектральная плотность мощности Si /S0, отн. ед.
Отведение
Корреляляционная
размерность, d
Энтропия
Колмогорова, Е
0,374±0,009
1,696±0,016
(2,32±0,07)·10 –2
0,251±0,007
0,394±0,009
0,273±0,007
0,328±0,009
0,124±0,004
0,314±0,011
0,147±0,004
1,697±0,016
1,699±0,016
1,704±0,017
1,698±0,018
1,621±0,017
1,547±0,018
1,609±0,018
(1,58±0,05·10 –2
(2,06±0,06)·10 –2
(1,64±0,05)·10 –2
(1,99±0,06)·10 –2
(8,43±0,25)·10 –2
(2,81±0,08)·10 –1
(1,10±0,03)·10 –1
тета-ритм
(4–8 Гц)
альфа-ритм
(8–12 Гц)
бета-ритм
(12–25)Гц
гамма-ритм
(25–50 Гц)
Fp1–A1
0,174±0,006
0,073±0,002
0,057±0,005
0,321±0,009
Fp2–A 2
C3 –A1
C4 –A 2
O1–A1
O2–A 2
T3–A1
T4 –A 2
0,088±0,003
0,128±0,004
0,046±0,001
0,069±0,002
0,036±0,001
0,149±0,004
0,048±0,001
0,051±0,002
0,090±0,003
0,051±0,001
0,085±0,002
0,021±0,001
0,061±0,002
0,027±0,001
0,038±0,001
0,081±0,00
0,052±0,001
0,043±0,001
0,025±0,001
0,046±0,014
0,033±0,001
0,570±0,015
0,305±0,009
0,576±0,017
0,474±0,014
0,791±0,024
0,430±0,013
0,744±0,022
На
ци
он
ал
дельта-ритм
(0,5–4 Гц)
35
ус
и
T a б л и ц а 4. Параметры электроэнцефалограмм (различные отведения), вычисленные спектральным
корреляционным методом и методом задержанной координаты для пациента Г. (состояние II)
альфа-ритм
(8–12 Гц)
бета-ритм
(12–25)Гц
гамма-ритм
(25–50 Гц)
0,186±0,006
0,316±0,009
0,170±0,005
0,224±0,007
0,305±0,009
0,608±0,018
0,197±0,006
0,492±0,015
0,093±0,003
0,087±0,003
0,106±0,003
0,120±0,004
0,090±0,003
0,096±0,003
0,091±0,003
0,081±0,003
0,065±0,002
0,071±0,002
0,060±0,002
0,067±0,002
0,052±0,002
0,039±0,001
0,065±0,019
0,048±0,001
0,267±0,008
0,247±0,007
0,300±0,009
0,257±0,008
0,276±0,008
0,119±0,004
0,319±0,010
0,199±0,006
0,384±0,012
0,276±0,008
0,361±0,011
0,329±0,010
0,275±0,008
0,136±0,004
0,326±0,011
0,178±0,006
Корреляляционная
размерность, d
Энтропия
Колмогорова, Е
ар
тета-ритм
(4–8 Гц)
1,711±0,017
1,715±0,018
1,717±0,017
1,723±0,017
1,712±0,018
1,664±0,017
1,546±0,016
1,606±0,017
кБ
Fp1–A1
Fp2–A 2
C3 –A1
C4 –A 2
O1–A1
O2–A 2
T3–A1
T4 –A 2
дельта-ритм
(0,5–4 Гц)
(2,80±0,08)·10 –2
(2,90±0,09)· 10 –2
(2,60±0,08)·10 –2
(2,50±0,08)·10 –2
(2,60±0,09)·10 –2
(1,05±0,04)·10 –1
(3,07±0,09)·10 –1
(2,21±0,07)·10 –1
ел
Спектральная плотность мощности Si /S0, отн. ед.
Отведение
ци
он
ал
ьн
ая
ак
ад
ем
ия
н
ау
Фазовые портреты электроэнцефалограмм отведений O1–A1 и O2–A2 для двух анализируемых состояний центральной нервной системы (до и после проведения курса лечения) для пациента Г. cо спастической кривошеей приведены на рис. 4.
Как видно из рис. 4, фазовые портреты отличаются от таковых для пациента Л. Область локализации фазового портрета пациента Г. для электроэнцефалограмм O1–A1 отведения до лечения (cостояние I) имеет форму, смещенную книзу, и занимает меньшую область, чем после лечения (cостояние II) (табл. 3, 4, рис. 2). До проведения курса лечения в Fp1–A1, C3 –A1 отведениях
преобладал гамма-ритм, а в Fp2–A2, C4 –A2, O1–A1, O2–A2, T3–A1, T4 –A2 отведениях, соответственно, бета-ритм (рис. 3). Значения корреляционной размерности асимметричны: в Fp1–A1,
C3–A1, O2–A2, T3–A1 отведениях по отношению к симметричным им отведениям значения d выше.
Это отмечалось для всех восьми отведений. По отношению к состоянию I, например, в процентном отношении значение корреляционной размерности d для отведений O1–A1 и O2–A2 изменилось на 4,6% (до лечения) и на 2,8% после лечения. Значение энтропии Колмогорова E после лечения для электроэнцефалограмм отведения O1–A1 было выше, а для отведения O2–A2 ниже.
Рис. 3. Гистограммы распределений спектральной плотности мощности в частотных диапазонах ритмических составляющих мозга: дельта-, тета-, альфа-, бета- и гамма-диапазонах электроэнцефалограмм (отведения электроэнцефалограмм O1–A1 (a, в) и O2–A 2 (б, г)) в состояниях I и II пациента Г. при спастической кривошее
На
36
ус
и
ар
ел
кБ
ау
ем
ия
н
ак
ад
ая
Рис. 4. Фазовые портреты электроэнцефалограмм (отведения O1–A1 (a, в) и O2–A2 (б, г)) в состояниях I и II пациента Г.
при спастической кривошее
На
ци
он
ал
ьн
В результате проведенного лечения в Fp2–A2, O1–A1, O2–A2 и T4 –A2 отведениях преобладали
дельта-ритмы, а в Fp1–A1, C3–A1, C4 –A2 и T3–A1 отведениях – гамма-ритмы (рис. 3). Значения показателей нелинейной динамики возрастали. Так, в O1–A1 отведении d изменялось со значения
d = 1,698±0,018 до d = 1,712±0,018 (в процентном отношении – на 1,3%), а в O2–A2 отведении, соответственно, со значения d = 1,621±0,017 до d = 1,664±0,017 (в процентном отношении – на
2,6%). Значения энтропии Колмогорова в O1–A1 и O2–A2 отведениях увеличивались – соответственно на 30,6 и 24,6%. Очевидно, для указанного пациента действие препарата диспорта приводит
к тому, что биоэлектрическая активность мышц снижается, вызывая усиление активности мозга.
Проведение курса лечения вызывало в организме пациента Г. реакции, позволяющие определить в динамике показатели электроэнцефалограммы, которые подтверждали, что динамическая
система становится менее стабильной и обладает большим количеством степеней свободы. Об
этом свидетельствовали и количественные показатели: значения корреляционной размерности d
и энтропии Колмогорова Е.
37
ус
и
ем
ия
н
ау
кБ
ел
ар
В результате проведенных исследований было выявлено две группы пациентов: в первой группе после введения препарата диспорта происходило снижение корреляционной размерности, увеличение мышечной активности. Уровень бета-ритмов возрастал. В электроэнцефалограммах отведения T3–A1 пациента Л., например, наблюдалось снижение дельта-ритма, но появлялись дельтаритмы в электроэнцефалограммах отведений O1–A1, О2–А2, T4 –A2. У пациента Г. в результате
лечения в электроэнцефалограммах первых четырех отведений корреляционная размерность d
возрастала, а в электроэнцефалограммах отведений O1–A1, O2–A2, T3–A1, T4 –A2 – падала. Дельтаритмы в электроэнцефалограммах оставались преобладающими, но их уровень падал.
Во второй группе пациентов лечение препаратом диспортом приводило к увеличению параметра корреляционной размерности d, т. е., можно сказать, происходил переход к усилению активности мозга. Это подтверждается также тем, что, например, у пациента Г. преобладали гаммаритмы (до лечения это были бета-ритмы).
Общим для обеих групп пациентов было возрастание энтропии Колмогорова Е, что свидетельствует о том, что в результате лечебных процедур динамическая система, согласно каждой
из исследуемых электроэнцефалограмм, становится менее стабильной.
Заключение. Анализ электроэнцефалограмм разных пациентов показал, что изменения
функционального состояния их центральной нервной системы при спастической кривошее могут быть проанализированы в динамике и охарактеризованы количественно с помощью параметров корреляционной размерности и энтропии Колмогорова, что позволяет оценить эффективность проводимого лечения. Предварительные результаты, полученные методом задержанной
координаты, хорошо согласуются с показателями спектрального корреляционного метода анализа. Однако у данной категории больных они были менее информативны, чем предложенные
нами методы нелинейного анализа. Проведенные исследования позволяют расширить представления о патогенезе изучаемой патологии и будут продолжены.
Литература
ая
ак
ад
1. Ш т о к В. Н. Экстрапирамидные расстройства: Руководство по диагностике и лечению / Под ред. В. Н. Шток,
И. А. Ивановой-Смоленской, О. С. Левина. М., 2002.
2. B r i n M. F., H a l e t t M., J a n k o v i c J. Scientific and therapeutic aspects of botulinium toxic. N. Y., 2002.
3. Л и х а ч е в С. А., Р у ш к е в и ч Ю. Н. // Неврол. журн. 2006. № 1. С. 18–21.
4. A l b a n e s e A. Update on dystonia. Teaching course 1.2 // Proc. of 10th Congr. of the Eur. Federation of Neurol. Societies.
Glasgow, Sept. 2–5. Glasgow, 2006. P. 1–17.
5. S i d o r e n k o A. V., O v s y a n k i n a G. I., S o l o n o v i c h N. A. // Nonlinear Phenomena in Complex Systems.
2006. Vol. 9. P. 97–104.
6. С и д о р е н к о А. В. Методы информационного анализа биоэлектрических сигналов. Минск, 2003.
7. С и д о р е н к о А. В., Ш а д и н ц е в А. А., Ц а р ю к В. В., С т е ц к о И. П. // Биомед. радиоэлектроника. 2001.
№ 2. С. 66–71.
8. А н д р о н о в А. А., В и т т А. А. Теория колебаний. М., 1998.
9. P r i c h a r d D. // Phys. Rev. Lett. 1994. Vol. 73, N 7. P. 951–959.
10. G r a s s b e r g e r P., P r o c a c c i a I. // Phys. Rev. Lett. 1983. Vol. 50, N 5. P. 346 –349.
11. А р а н с о н И. С. // Нелинейные волны. Динамика и эволюция. М., 1989. С. 262–266.
12. А н и щ е н к о В. С., А с т а х о в В. В., В а д и в а с о в а Т. Е. Нелинейные эффекты в хаотических и стохастических системах. М.; Ижевск, 2003.
ьн
S. A. LIHACEV1, A. V. SIDORENKO2, G. I. OVSYANKINA1, T. N. CHERNUCHA1, V. V. SADOVNIKOV2
NONLINEAR ANALYSIS OF THE ELECTROENCEPHALOGRAMS WITH SPASMOTIC TORTICOLLIS
1
ал
Republican Scientific and Practical Center of Neurology and Neurosurgery, Minsk, Belarus,
2
Belarusian State University, Minsk
Summary
На
ци
он
It is proposed to use the methodology of nonlinear dynamics to study and analyze clinical electroencephalograms of patients with
spasmodic torticollis. This allows analyzing the electroencephalograms characterized by the presence of oscillations due to muscle
contractions and estimating their dynamics in the process of treatment of patients after administration of disport. The algorithm of
realization of the delayed coordinate method, on the basis of which the program software is elaborated, is presented.
The performed analysis of the electroencephalograms shows that the changes in the functional states of the central nervous system
of the patients suffering from spasmodic torticollis can be analyzed in dynamics and characterized quantitatively using the correlation
dimension and Kolmogorov entropy parameters. The results obtained by the delayed coordinate method correlate well with those
obtained by the spectral correlation method. However these results are less informative that those of our suggested method of analysis.
These investigations allow extending our concepts of pathogenesis of this pathology and will be continued.
ар
СЕ­Р­Ы Я МЕДЫЦЫНСКІХ НА­ВУК
ус
и
ВЕСЦI НА­Ц­Ы Я­НАЛЬ­НАЙ АКА­ДЭМII НА­ВУК БЕ­ЛА­РУСI № 3 2009
УДК 616.155.392
ел
А. И. СВИРНОВСКИЙ, Т. Ф. СЕРГИЕНКО, В. В. СМОЛЬНИКОВА, А. В. БАКУН, И. Б. ТАРАС
кБ
Экспрессия транспортного белка P-гликопротеина
на лейкозных лимфоцитах в связи
с ответом на химиопрепараты in vitro
Республиканский научно-практический центр гематологии и трансфузиологии, Минск, Беларусь
ау
(Поступила в редакцию 14.07.2008)
На
ци
он
ал
ьн
ая
ак
ад
ем
ия
н
Введение. Один из наиболее важных механизмов выведения чужеродных веществ из клетки –
функционирование транспортных АТФ-зависимых белков. Белки-транспортеры избавляют
клетку от ксенобиотиков и эндогенных метаболитов, что приводит к снижению их внутриклеточного содержания и в конечном счете защищает нормальную клетку от повреждающего воздействия токсикантов. С другой стороны, экспрессия активных транспортных систем способствует формированию нечувствительности опухоли к ятрогенным воздействиям, что может рассматриваться как одно из существенных препятствий на пути излечения опухолей с помощью
лекарственных средств [1–3].
В развитии феномена множественной лекарственной устойчивости (МЛУ) опухолевых клеток основная роль отводится такому белку, как P-гликопротеин (P-gp) [4, 5]. Этот белок обнаружен во всех типах новообразований, и для него характерна широкая субстратная специфичность.
Однако связь химиочувствительности лейкозных клеток и экспрессии Р-gp многопланова и, повидимому, не всегда однозначна.
Цель данной работы – исследование содержания белка P-gp на нормальных и лейкозных лимфоцитах при хроническом лимфоцитарном лейкозе (ХЛЛ) в сопоставлении с их чувствительностью к лекарственным препаратам in vitro.
Материалы и методы исследования. В качестве объекта исследования использовали лимфоциты периферической крови 10 здоровых лиц Республиканского научно-практического центра гематологии и трансфузиологии и 43 пациентов с ХЛЛ из гематологических отделений 9-й
клинической больницы г. Минска.
Нормальные и лейкозные лимфоциты выделяли из периферической крови на градиенте
фиколл-верографина (плотность 1,077) с последующей двукратной отмывкой физиологическим
раствором.
Для определения химиочувствительности выделенные клетки культивировали в концентрации 2·106/мл в среде RPMI-1640 (Sigma, США) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС), 2 мM L-глутамина (Sigma, США), 100 Ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина при 37 ˚С во влажной атмосфере с 5% CO2 в течение 44 ч. Чувствительность лимфоцитов
периферической крови к химическим воздействиям определяли с помощью 3-(4,5-диметилтиазол2-ил)-2,5-дифенилтетразолиум бромид (МТТ) теста [6].
Нормальные и лейкозные клетки in vitro подвергали воздействию цитостатических препаратов, которые применяются в стандартной химиотерапии ХЛЛ. Концентрация препаратов в среде
культивирования соответствовала терапевтической, в частности для циклофосфана она составила 10 мкг/мл, для дексаметазона – 5, для лейкладина – 2, для флударабела – 5, для винкристина –
0,05, для доксорубицина – 1 мкг/мл.
Для прямой иммунодетекции экспрессии белка P-gp на поверхности клеток использовали
FITC-меченые моноклональные антитела (МАТ) к P-gp 170 (клон 17F9) (BD Pharmingen, США).
39
ус
и
ем
ия
н
ау
кБ
ел
ар
Для определения P-gp клетки отмывали, ресуспендировали в фосфатно-солевом буфере (PBS)
с бычьим сывороточным альбумином (Sigma, США) и инкубировали с антителами в концентрациях, указанных производителем, в течение 30 мин в темноте при комнатной температуре с последующей отмывкой от избытка антител путем центрифугирования при 2 000 об/мин в течение
3 мин. Затем в них добавляли PBS и определяли флуоресценцию на проточном цитофлуориметре при длине волны возбуждения 480 нм. Для контроля неспецифического связывания использовали неспецифичные изотипические МАТ к IgG1 (FITC-меченые). С помощью программы
CellQuestPro анализировали не менее 10 000 клеток в каждом образце.
Рассчитывали процентное содержание позитивных клеток и среднюю интенсивность флуоресценции (СИФ), отнесенную к средней интенсивности флуоресценции изотипического контроля.
Статистический анализ проводили с помощью непараметрических методов, учитывая характер распределения данных, в программах Microsoft Excel и Statistica 6.0. Для представления данных использовали значения медианы, разброс данных представлен в виде 25–75 персентилей.
Оценку достоверности различий между независимыми группами проводили с помощью U-теста
Манна–Уитни.
Результаты и их обсуждение. При ХЛЛ Р-gp выявлен на поверхности 0,41% клеток, при этом
разброс данных в 25–75 персентилях составил от 0,26 до 0,81%, что не отличалось от аналогичного показателя у здоровых лиц (P>0,05). Однако медиана средней интенсивности флуоресценции составила 1,59 (1,42–1,88) отн. ед. для лейкозных клеток и 1,13 (1,05–1,21) отн. ед. для нормальных (P<0,05). Очевидно, что при сходных концентрациях P-gp-позитивных клеток в образцах лимфоцитов, выделенных из крови здоровых людей и больных ХЛЛ, плотность распределения
молекул P-gp выше в клетках при ХЛЛ, если не принимать во внимание малую вероятность различий в сродстве молекул белка к антителам.
При анализе влияния предшествующей терапии пациентов с ХЛЛ на экспрессию P-gp (табл.
1) изменения количества P-gp-позитивных клеток, а также плотности распределения этого белка
на поверхности клеток после одного или нескольких курсов полихимиотерапии не установлено.
Показатель
P-gp-положительные клетки, %
ак
ад
Т а б л и ц а 1. Экспрессия P-gp на поверхности лимфоцитов при ХЛЛ в зависимости
от проведенной полихимиотерапии (ПХТ)
ая
Средняя интенсивность флуоресценции, отн. ед.
Показатели экспрессии P-gp у пациентов
без терапии или не получавших ПХТ
в течение не менее 3 мес. перед исследованием
после 1
или нескольких курсов ПХТ
0,41 (0,27–0,70)
(n = 18)
1,51 (1,40–1,95)
(n = 10)
0,34 (0,24–0,81)
(n = 25)
1,67 (1,52–1,86)
(n = 13)
ьн
П р и м е ч а н и е. Значения представлены медианой (25–75 персентилями); n – количество исследованных образцов клеток.
ци
он
ал
Расчет корреляций показателей, характеризующих клинический статус пациентов, с экспрессией изучаемого белка показал, что экспрессия P-gp не зависит от стадии заболевания, возраста пациентов, количества лейкоцитов и CD19 + клеток.
Таким образом, экспрессия P-gp во всех исследованных нами образцах была незначительной,
что согласуется с результатами, приведенными другими авторами [8]. Несмотря на то что P-gp
выявлен нами на поверхностной мембране только небольшого количества клеток, такие клетки
обнаружены нами во всех исследованных образцах лимфоцитов при ХЛЛ, что в количественном
отношении не совсем совпадает с данными, согласно которым белок P-gp детектировался в 73–
86% случаев ХЛЛ [3].
Ответ лимфоцитов здоровых лиц и пациентов с ХЛЛ на лекарственные препараты представлен в табл. 2. Более выраженная резистентность нормальных клеток была статистически подтверждена ко всем исследованным химиопрепаратам (за исключением винкристина). Тот факт,
На
40
ус
и
ар
что при повышенной экспрессии P-gp на лейкозных клетках, если судить по средней интенсивности флуоресценции, они более чувствительны к препаратам, чем нормальные лимфоциты,
ставит под сомнение роль исследуемого транспортного белка в ответе лимфоцитов на химиопрепараты (в том числе и на специфические субстраты P-gp) in vitro.
Т а б л и ц а 2. Выживаемость лимфоцитов при действии лекарственных препаратов
Жизнеспособность клеток, %
Исследованные препараты
85 (82–91)
70 (52–81)
60 (47–72)
80 (66–85)
76 (62–85)
81 (74–88)
72 (61–76)*
38 (29–57)*
39 (31–50)*
40 (33–49)*
63 (44–66)
62 (49–70)*
кБ
Циклофосфан, 10 мкг/мл
Флударабел, 5 мкг/мл
Лейкладин, 2 мкг/мл
Доксорубицин, 1 мкг/мл
Винкристин, 0,05 мкг/мл
Дексаметазон, 5 мкг/мл
лейкозных
ел
нормальных
ау
П р и м е ч а н и е. Значения представлены медианой (25–75 персентилями). * – различия достоверны при
Р<0,05.
ак
ад
ем
ия
н
Корреляционные связи между экспрессией P-gp и химиочувствительностью лейкозных клеток оценивали в нескольких вариантах с целью более детально установить зависимость между
ответом опухолевых лимфоцитов на лекарственные препараты in vitro и содержанием P-gp на
поверхности этих клеток. Статистически значимых корреляций для специфических (винкристин, доксорубицин) и неспецифических (дексаметазон, циклофосфан) субстратов P-gp и количеством P-gp-позитивных клеток не установлено. В качестве пока недостаточно объяснимого исключения можно рассматривать факт слабой обратной зависимости между количеством P-gpпозитивных клеток и их жизнеспособностью при действии лейкладина и флударабела, хотя эта
зависимость подтверждена статистически (коэффициент корреляции составил от –0,30 до –0,39
при P<0,05). Следовательно, некоторое увеличение количества клеток, содержащих P-gp, не исключает более высокой чувствительности к аналогам пуриновых нуклеозидов, выведение которых из клеток не подчиняется закономерностям для субстратов P-gp.
При разделении всех исследованных образцов на группы с высокой и низкой экспрессией
белка-транспортера относительно медианного значения количества P-gp-позитивных клеток зависимости ответа клеток на действие лекарственных препаратов от уровня экспрессии P-gp также не установлено.
ая
Т а б л и ц а 3. Сопоставление лекарственной чувствительности клеток
с содержанием P-gp-позитивных клеток при ХЛЛ
Умеренная
Низкая
ал
Высокая
ьн
Чувствительность к химиопрепаратам
Количество P-gp-позитивных клеток с различной чувствительностью, %
к флударабелу
к дексаметазону
0,64 (0,34–0,80)
(n = 14)
0,41 (0,29–0,84)
(n = 24)
0,23 (0,18–0,26)*
(n = 6)
0,44 (0,34–0,61)
(n = 13)
0,33 (0,22–0,81)
(n = 27)
1,18 (1,14–3,60)*
(n = 3)
ци
он
П р и м е ч а н и е. Значения представлены медианой (25–75 персентилями); n – количество исследованных случаев; * – достоверность различий между химиочувствительными и химиорезистентными клетками (Р<0,05).
На
Еще один вариант определения возможной связи экспрессии P-gp с чувствительностью лейкозных клеток к химиопрепаратам in vitro заключался в разделении образцов лимфоцитов на
группы с высокой (сохранность менее 35% жизнеспособных клеток), умеренной (35–70%) и низкой чувствительностью (жизнеспособность клеток более 70%) к цитотоксическим агентам
41
ус
и
ел
ар
и в оценке в этих группах экспрессии P-gp (табл. 3). Статистически значимые различия между
группами с высокой и низкой чувствительностью к соответствующему препарату были установлены для флударабела, причем сниженная экспрессия P-gp была ассоциирована с более резистентным фенотипом. Устойчивость к дексаметазону, напротив, совпадала с более высокой экспрессией P-gp на поверхности лейкозных клеток.
Заключение. Таким образом, несмотря на уникальную роль одного из основных транспортных белков, обеспечивающих выведение многих химических соединений из клеток, при ХЛЛ
нам не удалось установить значимость экспрессии P-gp в определении профиля лекарственной
чувствительности лейкозных клеток.
кБ
Литеpатуpа
ем
ия
н
ау
1. С в и р н о в с к и й А. И. // Мед. новости. 2003. № 7. С. 28–31.
2. B o r o w s k i E. et al. // Acta Biochim. Pol. 2005. Vol. 52, N 3. P. 609–627.
3. C o n s o l i U. et al. // Br. J. Haematol. 2002. Vol. 116, N 4. P. 774–778.
4. D e e l e y R. G. et al. // Physiol. Rev. 2006. Vol. 86. P. 849–899.
5. S z e n d r e i T. et al. // Orv. Hetil. 2008. Vol. 149, N 4. P. 161–167.
6. K a s p e r s G. J. et al. // Br. J. Cancer. 1991. Vol. 64, N 3. P. 469–474.
7. H o M. M. et al. // [Electronic resourse]. 2008. Mode of access: http:// www. ncbi. nlm. nih. gov/pubmed/18249061?
ordinalpos= 1&itool=EntrezSystem2. PEntrez. Pubmed. Pubmed_ResultsPanel. Pubmed_RVDocSum
8. Q u i n e y C. et al. // Leuk. Lymphoma. 2007. Vol. 48, N 8. P. 1587–1599.
9. S v o b o d a – B e u s a n I. et al. // Haematologica. 2000. Vol. 85, N 12. P. 1261–1267.
A. I. SVIRNOVSKI, T. F. SERHIYENKA, V. V. SMOLNIKOVA, A. V. BAKUN, I. B. TARAS
P-GLYCOPROTEIN EXPRESSION on LEUCOSIS LYMPHOCYTEs in connection
with response to CHEMOPREPARATIONS IN VITRO
Republican Scientific and Practical Center for Hematology and Transfusiology, Minsk, Belarus
Summary
На
ци
он
ал
ьн
ая
ак
ад
The purpose of the work is to study the P-glycoprotein (P-gp) expression in normal and leukemic lymphocytes taking
into account the drug sensitivity in vitro. The P-gp expression is more pronounced in leukemia cells than in normal
lymphocytes. A correlation between the P-gp content on the cell surface, the clinical features of CLL patients and the cell
drug sensitivity in vitro was not observed. Apparently, the level of the P-gp expression in CLL cells could not serve as a
prediction factor for the drug sensitivity profile in these cells.
ар
СЕ­Р­Ы Я МЕДЫЦЫНСКІХ НА­ВУК
ус
и
ВЕСЦI НА­Ц­Ы Я­НАЛЬ­НАЙ АКА­ДЭМII НА­ВУК БЕ­ЛА­РУСI № 3 2009
УДК 611.819.2-611.161-612.086.3
ел
Л. Н. Новикова, Л. И. Арчакова
морфофункциональная организация сосудистого сплетения
боковых желудочков головного мозга кроликА
(Поступила в редакцию 15.10.2008)
кБ
Институт физиологии НАН Беларуси, Минск
На
ци
он
ал
ьн
ая
ак
ад
ем
ия
н
ау
Введение. Сосудистое сплетение головного мозга (или, согласно принятой международной
номенклатуре, хориоидное сплетение) является главным источником цереброспинальной жидкости (ЦСЖ) в мозге. Функциональное состояние сплетения во многом определяет изменения
ликвородинамики, происходящие у человека при различных патологических процессах. Сосудистое сплетение является мишенью многих системных заболеваний и «входными воротами»
в мозг для ряда бактериальных и вирусных инфекций [1–3]. С помощью своих барьеров – гематоэнцефалического (ГЭБ), гематоликворного (ГЛБ), ликвороэнцефалического – сосудистое сплетение регулирует постоянство химического и иммунологического статуса мозга, а также обеспечивает его детоксикационную функцию [4, 5]. Сосудистое сплетение головного мозга – наиболее
важная структурная зона ГЛБ [6, 7]. В формировании ГЛБ в сосудистом сплетении принимают
участие все тканевые составляющие сплетения, однако основным его компонентом является
эпителий.
Согласно современным литературным данным [8, 9], эпителиоциты обеспечивают секрецию
ЦСЖ, синтезируют ряд веществ, которые секретируются в полость желудочков. Главным продуктом секреции является белок транстиретин (преальбумин), который содержится в ЦСЖ
и плазме крови, а также участвует в транспорте витамина А и тироксина. Кроме того, эпителиальные клетки сосудистого сплетения синтезируют и секретируют в ЦСЖ гормоны (вазопрессин, станниокальцин), нейротрофические факторы и факторы роста фибробластов и эндотелия
[10–12]. Недостаток нейротрофических факторов играет важную роль в патогенезе нейродегенеративных заболеваний мозга. Дисфункция ГЭБ осложняет течение ряда неврологических заболеваний, включая инсульты, травмы, нейроинфекции, и ведет к формированию вторичных отеков в зоне повреждения, а в дальнейшем – к отеку мозга. Повышение проницаемости ГЭБ является одним из ключевых моментов в патогенезе таких неврологических заболеваний, как
рассеянный склероз, болезнь Альцгеймера, ВИЧ-индуцированная деменция и др.
Все изложенное выше объясняет неослабевающий интерес морфологов, физиологов и клиницистов к вопросам морфофункционального состояния сосудистого сплетения в норме и при различных патологических процессах. Сосудистое сплетение боковых желудочков головного мозга,
секретируя основной объем ЦСЖ в головном мозге, чаще всего является местом развития патологических процессов и объектом хирургических вмешательств [13, 14].
Имеется ряд научных работ, посвященных структурно-функциональным особенностям организации сосудистого сплетения боковых желудочков головного мозга. Так, анатомия данных
образований изучена довольно подробно. Однако, несмотря на это, многие вопросы ультраструктурной организации сосудистого сплетения, его проницаемости для электролитов крови и ЦСЖ
изучены недостаточно, а имеющиеся данные порой противоречивы.
Цель настоящего исследования – изучение структурно-функциональ­ных особенностей организации сосудистого сплетения боковых желудочков головного мозга кролика: структуры ГЭБ,
микроциркуляторного русла мягкой мозговой оболочки и взаимоотношений его звеньев в сосудистом сплетении с нервными элементами, эпителием и окружающими тканями.
43
ус
и
ци
он
ал
ьн
ая
ак
ад
ем
ия
н
ау
кБ
ел
ар
Материалы и методы исследования. Исследования проведены на 16 кроликах-самцах породы шиншилла массой 2,3 – 2,8 кг, выращенных в виварии при стандартных условиях. Объектом
исследования служило сосудистое сплетение боковых желудочков головного мозга. Под ингаляционным эфирным наркозом производили декапитацию животных [15], вскрывали черепную коробку,
извлекали головной мозг и выделяли из него исследуемый материал. Для электронно-мик­ро­ско­пи­
ческого исследования материал фиксировали в растворе, состоявшем из 4%-ного глютарового альде­
гида и 1%-ного параформа. Исследуемый материал измельчали в том же фиксирующем растворе
на льду, промывали 0,1 М фосфатным буфером и подвергали дополнительной фиксации в 1%-ном
растворе четырехокиси осмия при температуре 4 ºС в течение 2 ч. Материал обезвоживали в спиртах возрастающей крепости и заключали в аралдит по общепринятой методике [16]. Срезы готовили
на микротоме LKB (Швеция) и просматривали в электронном микроскопе JEM–100 СХ (Япония).
Результаты и их обсуждение. Анализ полученных данных показал, что эпителиоциты сосудистого сплетения в большинстве случаев имеют кубическую форму и обладают структурной
полярностью, соединены между собой плотными и щелевидными контактами, интердигитациями и образуют плотный однослойный эпителиальный слой, который является важным компонентом ГЛБ (рис. 1, а–г). Поверхность эпителиальных клеток, обращенная в полость желудочков
и принимающая участие в секреции ЦСЖ, неровная. При больших увеличениях на сканирующем электронном микроскопе видны кратеры и выпуклости неправильной формы [17]. Выявлено, что на апикальной поверхности эпителиальных клеток имеются многочисленные микроворсинки, реснички и округлые тельца на ножке с центральной электронно-прозрачной сердцевиной. Функции их различны: микроворсинки богаты щелочной фосфатазой и являются
резорбирующим аппаратом клетки, реснички своими колебательными движениями способству-
Рис. 1. Ультраструктура эпителиального слоя сосудистого сплетения боковых желудочков мозга кролика: а – эпителиальная клетка (ЭК); б – контакт двух эпителиальных клеток (К); в – надэпендимная клетка (НЭК), расположенная
в полости желудочка (ПЖ) и примыкающая к ворсинкам эпителия (ВР); г – контакт эпителиальных клеток с отростками надэпендимных клеток в полости желудочка. Я – ядро, М – митохондрии, БМ – базальная мембрана эпителия,
С – строма сосудистого сплетения, О – отросток надэпендимной клетки
На
44
ус
и
На
ци
он
ал
ьн
ая
ак
ад
ем
ия
н
ау
кБ
ел
ар
ют циркуляции ликвора, а через округлые тельца происходит экзоцитоз ликвора [18]. Ядра эпителиоцитов обычно овальные и занимают центральную часть клетки (рис. 1, а). В цитоплазме
вокруг ядра сосредоточено множество митохондрий, свободных рибосом. Пиноцитозные пузырьки сосредоточены преимущественно в апикальной части клетки.
На поверхности эпителиальных клеток сосудистого сплетения рассеяны надэпендимные клетки (клетки Колмера) с хорошо развитым лизосомальным аппаратом, которые являются макрофагами, дифференцирующимися из моноцитов крови (рис. 1, в, г). Полагают [19], что данные клетки
мигрируют на поверхность сосудистого сплетения из кровеносных сосудов, проходя через стенку
сосудов, слой соединительной ткани и эпителиальный слой. Процесс миграции и дифференцировки моноцитов в клетки Колмера в обычных условиях длится около 5 сут. При ряде патологических
состояний скорость миграции увеличивается. Клетки Колмера являются важным компонентом
ГЛБ, так как они фагоцитируют посторонние вещества, попавшие в ЦСЖ в результате различных
воздействий либо патологических процессов, и участвуют в транспорте и накоплении железа.
Базальная мембрана отделяет слой эпителиоцитов от подлежащего интерстициального пространства, заполненного рыхлой соединительной тканью стромы, в которой находятся многочисленные фенестрированные капилляры и нервные волокна (рис. 1, а, б). Большая часть клеток стромы сосудистого сплетения имеет морфологические черты фибробластов, но гистогенетически они
существенно отличаются от фибробластов соединительной ткани за пределами нервной системы.
Фибробласты стромы сосудистого сплетения являются менингоцитами, обладающими рядом спе­
цифических свойств. Так, они способны изменять фенотип – от фибробластоподобного до эпители­о­
подобного, что не характерно для типичных фибробластов [6]. Менингоциты сосудистого сплетения способны образовывать слоистые кальцификаты – псаммомные тельца, функциональная роль
которых неизвестна. Их формирование пытаются связать с различными патологическими процессами, но имеющиеся данные [6, 17] не дают универсального объяснения причин их возникновения.
В строме сосудистого сплетения присутствуют и тучные клетки, которые располагаются группами по ходу кровеносных сосудов микроциркуляторного русла, в субэпителиальной зоне и даже между эпителиоцитами. В их цитоплазме имеются многочисленные гранулы, которые создают специфическую зернистость. Дегрануляция тучных клеток происходит в ответ на любое изменение физиологических условий и действие патогенов. Данный процесс сопровождается выбросом гранул,
содержащих биологически активные вещества (гепарин, гистамин, серотонин, гиалуроновая кислота, хондроитинсерные кислоты), которые изменяют местный и общий гомеостаз. Выход гистамина
из тучных клеток может происходить также путем секреции, вызывая расширение кровеносных капилляров и повышая их проницаемость, что проявляется локальными отеками, гипотензией. Литературные данные о функциональной роли тучных клеток в сосудистом сплетении, их участии в регуляции проницаемости гистогематических барьеров сплетения немногочисленны [20].
Преобладание капилляров среди других сосудов микроциркуляторного русла в сосудистом
сплетении объясняется их уникальной ролью в обеспечении обменных процессов между кровью
и тканями мозга. Кровеносные капилляры сосудистого сплетения различаются по диаметру (от 6
до 23 мкм), толщине стенок. Ультраструктурные исследования показали, что стенка капилляра состоит из клеток и специальных неклеточных образований (рис. 2). Клеточные элементы представлены фенестрированным эндотелием и перицитами, а роль неклеточного компонента играет базальная мембрана и субэндотелиальная зона [14, 21, 22]. Полученные данные указывают на преобладание вытянутых форм эндотелиоцитов и преимущественную ориентацию их вдоль оси сосуда.
Каждый эндотелиоцит имеет овальное или округлое ядро с диффузно распределенным в нем хроматином. Основную массу органелл составляют комплекс Гольджи, митохондрии, гранулярный
и агранулярный эндоплазматический ретикулумы, полисомы и свободные рибосомы, различного
вида вакуоли, располагающиеся в хорошо выраженном перинуклеарном пространстве. Митохондрии на продольном срезе чаще имеют овальную форму, а на поперечном – округлую. Ультраструктурно они отличаются от митохондрий других клеток светлым матриксом и малым числом
крист. В цитоплазме эндотелиоцитов имеется множество микровезикул, которые распределены
неравномерно. В большом количестве они встречаются в периферических отделах. В цитоплазме
микровезикулы представлены в основном в виде изолированных элементов, однако иногда они
45
ус
и
ар
ел
кБ
ау
Рис. 2. Ультраструктурная организация микроциркуляторного русла сосудистого сплетения боковых желудочков
мозга кролика: а – капилляр, локализующийся в строме сосудистого сплетения; б – взаимосвязь между эндотелием
капилляра и отростками перицита. ПК – просвет капилляра, Э – эндотелий, Ф – фенестры, Б – базальная мембрана
эндотелия, П – перицит, ОП – отростки перицита, ОЭ – аблюминальные отростки эндотелиоцита. Остальные обозначения те же, что на рис. 1
ци
он
ал
ьн
ая
ак
ад
ем
ия
н
сливаются, образуя более крупные сферические структуры – вакуоли. Возможно слияние микровезикул с первичными лизосомами. Микровезикулярная система эндотелиальных клеток
кровеносных капилляров рассматривается, с одной стороны, как морфологическое проявление
способности эндотелиальных клеток транспортировать жидкость и растворенные в ней вещества и коллоиды, а с другой – как характер динамики мембран в эндотелиальной клетке [21].
ГЭБ в сосудистом сплетении имеет сложную морфологическую структуру, в состав которой
входит эндотелий капилляров мозга, базальная мембрана капилляров, периваскулярная глиальная
мембрана из отростков астроцитов [5, 22]. Эндотелиальная выстилка капилляров является морфологической основой ГЭБ и представлена фенестрированным эндотелием. Электронно-микро­
скопический анализ межэндотелиальных контактов показал, что структура их разнообразна. Боковые поверхности эндотелиальных клеток формируют контакты, которые имеют различную длину
и форму. Среди них преобладают открытые формы соединений в виде щелей различной ширины.
Контакты представлены также в виде интердигитаций, точечных перемычек, нексусов, черепицеобразных наложений краев эндотелиальных клеток друг на друга. В зоне фенестр и на люминальной поверхности эндотелиоцитов концентрируются сульфатированные протеогликаны, которые
придают мембране отрицательный заряд, ограничивающий прохождение через эндотелий анионных молекул [3]. Эндотелиоциты капилляров сосудистого сплетения содержат значительное количество белка Glut 1, ответственного за транспорт глюкозы через гистогематические барьеры [4].
При ряде патологических процессов проницаемость ГЭБ изменяется, что приводит к нарушению
постоянства внутренней среды мозга и запускает компенсаторные реакции [3, 14, 23].
Между слоем эндотелиальных клеток и базальной мембраной расположена субэндотелиальная зона, заполненная коллоидным веществом. (До настоящего времени вопрос о функциональной роли этого слоя представляет большой интерес как с теоретической, так и с практической
точки зрения и является дискуссионным.) Базальная мембрана представлена гомогенным электронноплотным материалом. Ее поверхность, обращенная к перикапиллярной соединительной
ткани, часто неровная. Та же часть, которая обращена к эндотелию, относительно ровная и, как
правило, повторяет наружный рельеф эндотелиальной трубки.
Большинство исследователей к элементам ГЭБ относят клеточные элементы, получившие
название перицитов (рис. 2, б). Они располагаются в основном в стенках микрососудов, которые
либо не содержат гладкомышечных клеток, либо имеют незначительное их количество. На полученных электронограммах перициты, как правило, имеют вытянутую форму и изогнуты в соответствии с внешним контуром эндотелиальной трубки. При ультраструктурном анализе
в каждом периците можно выделить зону перикариона и систему отростков, находящихся в разных взаимоотношениях с эндотелиоцитами. Ядро перицита имеет овальную форму и различную ориентацию по отношению к длинной оси капилляра. Перинуклеарная цитоплазма перици-
На
46
ус
и
ци
он
ал
ьн
ая
ак
ад
ем
ия
н
ау
кБ
ел
ар
та, довольна плотная, узким ободком окружает ядро. В ряде случаев цитоплазма содержит немногочисленные микропиноцитозные пузырьки и митохондрии, небольшой комплекс Гольджи,
а также свободные рибосомы. Часть рибосом связана с поверхностью немногочисленных канальцев цитоплазматической сети либо с наружным листком ядерной мембраны. По данным литературы [14], перициты содержат сократительные белки типа актина, миозина, тропомиозина. Связь
перицитов с эндотелием осуществляется за счет отростков, проникающих сквозь базальный
слой к эндотелию, а также за счет аблюминальных отростков эндотелиальных клеток, таким же
путем достигающих поверхности перицитов. Благодаря достаточной длине и большому количеству отростков перицит может одновременно контактировать с несколькими эндотелиальными
клетками. Контактирующий эндотелий и перициты – единая функционирующая система, регулирующая тонус микроциркуляторного русла. Поскольку перициты первыми реагируют на дисфункцию капиллярной перфузии и подвергаются ультраструктурным изменениям на ранних
стадиях гипоксии, они, как правило, влияют на функционирование ГЭБ [24].
Согласно полученным данным, капилляры сосудистого сплетения имеют самостоятельную
иннервацию. Нервные волокна могут оканчиваться на эндотелиоцитах и других клетках сосудистой стенки, а также вблизи кровеносных сосудов различного калибра, располагаться в соединительной ткани сосудистого сплетения (рис. 3, а–г). Расстояние между нервными окончаниями
и капилляром может колебаться от 100 до 20 нм. Тщательный электронно-микроскопический анализ взаимоотношений между нервными окончаниями и эндотелием выявил наличие нервных
окончаний различной природы: адренергических (наличие в окончаниях медиаторных пузырьков
округлой формы малых размеров с электронноплотными включениями), холинергических (варикозные окончания, содержащие лишь агранулярные сферические пузырьки). Кроме того, нельзя
исключить и наличия нервных окончаний другой природы, например пептидергических.
На
Рис. 3. Ультраструктурная организация нейрокапиллярных взаимоотношений в сосудистом сплетении боковых желудочков мозга кролика (а – г). Поступательный ход нервного пучка (а – в), иннервирующего капилляр сосудистого
сплетения (г). НВ – нервное волокно, НП – нервный пучок. Остальные обозначения те же, что на рис. 1, 2
47
ус
и
Литература
ау
кБ
ел
ар
Заключение. Таким образом, в результате проведенного исследования удалось установить, что
сосудистое сплетение боковых желудочков головного мозга кролика представлено однослойным
кубическим эпителием и стромой, состоящей из рыхлой соединительной ткани с высоким содержанием мелких сосудов и нервных волокон. На поверхности эпителия сплетения располагаются
клетки Колмера (надэпендимные клетки). Особого внимания заслуживает электронно-микро­
скопическое исследование структуры ГЭБ сплетения. В сосудистом сплетении боковых желудочков головного мозга кролика он представлен эндотелием капилляров, базальной мембраной капилляров, периваскулярной глиальной мембраной из отростков астроцитов. Контакты между эндотелиоцитами, как правило, не являются сплошными и непрерывными, а имеют щели и фенестры,
которые обеспечивают достаточную проницаемость для ряда циркулирующих в крови веществ.
При некоторых патологических процессах проницаемость ГЭБ изменяется, что приводит к нарушению постоянства внутренней среды мозга и запускает компенсаторные реакции. Изучение
структурно-функциональной организации ГЭБ, понимание механизмов его функционирования
важно не только для фундаментальной науки, но и для медицины. Полученные результаты позволяют расширить современные представления о структурно-функциональных особенностях организации сосудистого сплетения головного мозга в физиологических условиях.
ьн
ая
ак
ад
ем
ия
н
1. B r i t z G. W., K i m D. K. a n d L o e s e r J. D. // Neurosurg. J. 1996. Vol. 85, N 4. P. 689–691.
2. N e a u J. P. and B o g o u s s l a v s k y J. // Ann. Neurol. 1996. Vol. 39, N 6. P. 779–788.
3. S e g a l M. B. // Cell. Mol. Neurobiol. 2000. Vol. 20, N 2. P. 183–196.
4. S e g a l M. B. // Microsci. Res. Tech. 2001. Vol. 52, N 1. P. 38–48.
5. B r a d b u r y M. The concept of a blood-brain barrier. Chichester; New York; Brisbane; Toronto, 1979.
6. К о р ж е в с к и й Д. Э. Сосудистое сплетение головного мозга человека: гистогенез и тканевая организация:
автореф. дис. … д-ра мед. наук. СПб., 2001.
7. K o r z e v s k i i D. E., O t e l l i n V. A. // Evol. Biokim. Fiziol. J. 2001. Vol. 37, N 2. P. 150–153.
8. L i M. D., K a n e J. K. et al. // Neurosci. J. 2000. Vol. 20, N 4. P. 1318–1323.
9. S c h r e i b e r G., A l d r e d A. R., J a w o r o w s k i A. et al. // Amer. J. Physiol. 1990. Vol. 258, N 2 (Pt. 2). P. 338–345.
10. F r a n z e n A. M., Z h a n g K. Z., W e s t b e r g J. A. et al. // Brain Res. 2000. Vol. 887, N 2. P. 440–443.
11. N i l s s o n C., B l a y P., N i e l s e n F. C. and G a m m e l ­t o f t S. // Neurochem. J. 1992. Vol. 58, N 3. P. 923–930.
12. T i m m u s k T., M u d o G., M e t s i s M. a n d B e l l u a r d o N. // Neuroreport. 1995. Vol. 6, N 15. P. 1997–2000.
13. J o h a n s o n C., D u n c a n J., K l i n g e P. et al. // Cerebrospinal Fluid Res. 2008. Vol. 5. P. 10.
14. L i w n i c z B. N., L e a c h J. L., Y e h H. S., P r i v i t e r a M. // Neurosurg. J. 1990. Vol. 26, N 4. P. 409–420.
15. О н и щ е н к о Л. С., Г а й к о в а О. Н., Я н и ш е в с к и й С. Н. // Морфология. 2006. Т. 130, № 6. С. 40–46.
16. Б о г о л е п о в Н. Н. Методы электронно-микроскопического исследования мозга. М., 1976.
17. М о т а в к и н П. А., С е л и в а н о в А. И., И в а н е н к о М. Г. // Журн. арх. анатомии. 1985. Т. 88, № 2. С. 23–28.
18. К о н с т а н т и н о в с к и й Г. А., С т е ч е н к о Л. А. // Журн. арх. анатомии. 1983. Т. 85, № 7. С. 45–50.
19. L i n g E. A., K a u r C., L u J. // Microsci. Res. Tech. 1998. Vol. 41, N 1. P. 43–56.
20. Б а б и к Т. М. // Бюл. эксперим. биол. и мед. 2005. Т. 140, № 7. С. 584–587.
21. Ш а х л а м о в В. А. Капилляры. М., 1971.
22. S t r a z i e l l e N., G h e r s i – E g e a J. F. // Neuropathol. Exp. Neurol. J. 2000. Vol. 59, N 7. P. 561–574.
23. Б е л я е в а И. А., Г у с е в Е. И., Ч е х о н и н В. П. и др. // Журн. неврол. и психиатр. 1999. № 8. С. 57–62.
24. G o n u l E., D u z B., K a h r a m a n S. et al. // Microvasc. Res. 2002. Vol. 64. P. 116–119.
L. N. NOVIKOVA, L. I. ARCHAKOVA
ци
он
ал
morphofunctional ORGANIZATION OF THE VASCULAR PLEXUS OF THE RABBIT CEREBRAL
LATERAL VENTRICLES
Institute of Physiology of NAS of Belarus, Minsk
Summary
На
Organization of various components of the vascular plexus in the rabbit cerebral lateral ventricles – epithelial and
supraependymal cells, as well as capillaries, making the base of the hemato-encephalic barriers of the plexus, has been studied
by means of electron microscopy. The capillaries of the vascular plexus are shown to be innervated by nerve fibers and
terminals adjacent to the basal membrane of the endothelium. Electron microscopic studies of the vascular plexus microvessels
in the rabbit brain have revealed the diaphragm – covered caveoles and fenestrae in them. The morphological bases of the
functional activity of the structural components of the choroid plexus are established.
ар
СЕ­Р­Ы Я МЕДЫЦЫНСКІХ НА­ВУК
ус
и
ВЕСЦI НА­Ц­Ы Я­НАЛЬ­НАЙ АКА­ДЭМII НА­ВУК БЕ­ЛА­РУСI № 3 2009
ел
УДК 612.8.015
Г. К. ТРОПНИКОВА
кБ
ВЛИЯНИЕ МЕЛАТОНИНА НА ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ СОСТОЯНИЕ
СЕРОТОНИНЕРГИЧЕСКИХ СТРУКТУР МОЗГА
ПОСЛЕ РАЗРУШЕНИЯ ДОРСАЛЬНОГО ЯДРА ШВА В ЭКСПЕРИМЕНТЕ
Институт физиологии НАН Беларуси, Минск
ау
(Поступила в редакцию 14.07.2008)
На
ци
он
ал
ьн
ая
ак
ад
ем
ия
н
Введение. В настоящее время установлено, что окислительный стресс, приводящий к апоптозу нервных клеток, является одним из признаков многих нейродегенеративных заболеваний
(болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера и др.). В то же время широко известны антиоксидантные свойства мелатонина, которые базируются на его способности поглощать кислородные
радикалы и снижать окислительное повреждение нервных клеток [1, 2]. Поэтому мелатонин как
потенциальное средство борьбы с нейродегенеративными процессами представляет интерес для
дальнейшего изучения его роли в восстановлении функций поврежденного мозга.
Мезенцефалическое дорсальное ядро шва (ДЯШ) – филогенетически древняя часть мозга,
40% площади которого занимают серотонинергические нейроны [3]. Благодаря обширным проекциям к различным отделам переднего мозга (кора головного мозга, стриатум, гиппокамп),
среднего мозга, гипоталамуса, таламуса, мозжечка и структурам продолговатого мозга (вестибулярные ядра, ростровентролатеральное ядро, большое ядро шва) [4–6] серотонинергические
нейроны ДЯШ вовлекаются в процессы регуляции, охватывающие широкий круг физиологических функций, включая эмоции, чувство страха и тревожные состояния, оборонительные реакции и агрессию, познавательные функции и память (особенно пространственную), локомоцию,
контроль тонуса сосудов и дыхания, регуляцию цикла сон–бодрствование [7–10], т. е. те функции, которые больше всего нарушаются при нейродегенеративных заболеваниях.
Особый интерес представляют связи ДЯШ с ядрами таламуса. Показано, что высокочастотная стимуляция субталамического ядра, применяемая для лечения двигательных расстройств
при болезни Паркинсона, вызывает у пациентов депрессию. Кроме того, экспериментально установлено, что данная стимуляция ингибирует активность серотонинергических нейронов в ДЯШ
[11]. Поэтому в настоящее время ДЯШ уделяется особое внимание при исследовании механизмов депрессии [12].
Учитывая нейропротекторные свойства мелатонина и роль серотонинергических нейронов
ДЯШ в регуляции многообразных физиологических функций, целью настоящего исследования
было изучение влияния экзогенного мелатонина, применяемого в послеоперационном периоде,
в восстановлении функций серотонинергических структур мозга после разрушения ДЯШ среднего мозга.
Материалы и методы исследования. Опыты проводили на взрослых крысах-самцах массой
250±20 г, разделив их на три группы, по 8 особей в каждой. В 1-ю группу вошли ложнооперированные (ЛО) животные (контроль), которым в отверстие, просверленное в черепе, опускали
электрод, но ток не пропускали. Разрушение ДЯШ животным 2-й и 3-й групп производили анодным током силой 10 мА в течение 5 с. Для этого голову крыс фиксировали в стереотаксическом
аппарате так, чтобы брегма и лямбда были на одном уровне. Стальной электрод изолировали,
кроме кончика (100 мкм), и вводили по срединной линии 7,3–7,4 мм каудальнее брегмы на глуби49
ус
и
ар
ел
кБ
ау
Коронарный срез, показывающий место локализации кончика электрода в дорсальном ядре шва (ДЯШ), расположенного вентральнее центрального серого вещества (ЦСВ) среднего мозга
ци
он
ал
ьн
ая
ак
ад
ем
ия
н
ну 6,3–6,4 мм от поверхности черепа. В дальнейшем верификацию местонахождения кончика
электрода проводили на срезах мозга согласно атласу стереотаксических координат [13]. На рисунке представлено типичное местоположение кончика электрода – вентральнее центрального
серого вещества в области ДЯШ (нативная съемка срезов после фиксации в глутаральдегиде).
Все операции проводили под гексеналовым наркозом. По окончании операции крысы 1-й
и 2-й групп получали 0,9% NaCl с добавлением 1% этанола (раствор, используемый для приготовления мелатонина), а крысы 3-й группы – мелатонин (фирмы Sigma Aldrich Chemicals, США)
в дозе 0,5 мг/кг. Препараты вводили внутрибрюшинно в объеме 0,2 мл ежедневно в 10 ч утра
в течение 7 дней. Животные, которых содержали в помещении вивария при естественном световом режиме и температуре воздуха 21 ºС, имели стандартный рацион питания и свободный доступ к воде. Через сутки после последней инъекции крыс декапитировали (с 10 до 11 ч утра)
и быстро извлекали головной мозг. На ледяной пластинке выделяли теменную кору головного
мозга, стриатум, таламус, мозжечок и вентролатеральную область продолговатого мозга
(ВЛОПМ), в которых определяли содержание серотонина (5-ОТ) и его основного метаболита –
5-оксииндолуксусной кислоты (5-ОИУК) [14]. Данные обработаны статистически с применением t-критерия Стьюдента и программы вариационной статистики ANOVA.
Результаты и их обсуждение. Анализ данных, представленных в таблице, показал, что разрушение ДЯШ не изменяет уровень 5-ОТ в мозжечке, но приводит к достоверному снижению
его в теменной коре и стриатуме (соответственно на 16,4 и 46,47%, P < 0,05) и противоположной
реакции его накопления в таламусе (на 61,52%, P < 0,05) и ВЛОПМ (на 32,76%, P < 0,05). Изменения 5-ОТ в тканях мозга сопровождались, за исключением мозжечка, достоверным увеличением
концентрации 5-ОИУК, наиболее выраженным в теменной коре, ВЛОПМ, таламусе и стриатуме
(соответственно на 92,5; 68,5; 29,68 и 16,0%). При этом показатель 5-ОИУК/5-ОТ (индекс оборота
5-ОТ в мозге) в теменной коре и стриатуме увеличился более чем в 2 раза, что указывало на активацию процессов окислительного дезаминирования 5-ОТ в передних отделах мозга и ослабление процессов его синтеза. В то же время, несмотря на значимое увеличение содержания 5-ОТ
в таламусе у крыс с разрушенными ядрами шва, показатель 5-ОИУК/5-ОТ в этом отделе мозга
уменьшился с 1,298±0,073 (ЛО) до 1,040±0,078 (–20%, P < 0,05).
Следует отметить, что в первые дни после разрушения ДЯШ у крыс отмечались повышенная
локомоторная активность, циркуляторные движения и агрессивность. Подобные циркуляторные
движения после разрушения ДЯШ наблюдали и другие авторы [15–17]. При этом повышенная
локомоторная активность отмечалась после электролитического разрушения ДЯШ, а не нейротоксического (после введения в ядро 5,7-дигидрокситриптамина, специфически разрушающего
На
50
ус
и
Влияние мелатонина (0,5 мг/г) на вызываемые разрушением ДЯШ региональные изменения
содержания 5-ОТ и 5-ОИУК в мозге крыс (мкг/г ткани)
Контроль
ДЯШ разрушено
0,9 % NaCl
0,9 % NaCl
Мелатонин
ар
Исследуемая ткань
0,583 ± 0,028
0,594 ± 0,034
0,421 ± 0,010
0,124 ± 0,006
0,650 ± 0,064
Теменная кора
Стриатум
Таламус
Мозжечок
ВЛОПМ
0,387 ± 0,015
0,520 ± 0,016
0,543 ± 0,026
0,124 ± 0,005
0,317 ± 0,030
0,487 ± 0,044*
0,318 ± 0,023*
0,680 ± 0,039*
0,111 ± 0,013
0,863 ± 0,069*
5-ОИУК
0,464 ± 0,037
0,602 ± 0,048
0,810 ± 0,039*
0,173 ± 0,023*
1,323 ± 0,120*
ау
кБ
0,745 ± 0,044*
0,607 ± 0,022*
0,699 ± 0,042*
0,100 ± 0,009*
0,533 ± 0,089*
0,581 ± 0,054
0,733 ± 0,063
0,559 ± 0,045*
0,157 ± 0,014 *
0,668 ± 0,034
ел
5-ОТ
Теменная кора
Стриатум
Таламус
Мозжечок
ВЛОПМ
П р и м е ч а н и е. ВЛОПМ – вентролатеральная область продолговатого мозга. * –P < 0,05.
На
ци
он
ал
ьн
ая
ак
ад
ем
ия
н
серотонинергические нейроны). Полагают [16], что гиперактивность развивается вследствие разрушения проходящих рядом допаминергических терминалей из черного вещества среднего мозга к стриатуму. При этом в черном веществе таких крыс наблюдалось трехкратное увеличение
мест связывания 5-ОТ и увеличение аффинности к нему [16, 17].
Наблюдаемые в наших экспериментах локомоторные нарушения у крыс, возможно, были
связаны с повреждением проходящих рядом нигростриарных волокон. Другой причиной двигательных расстройств и агрессии могло быть разрушение тех серотонинергических нейронов, которые посылают свои аксоны к вестибулярным ядрам с коллатералями к амигдале [6]. Вместе
с тем, учитывая тормозное влияние 5-ОТ на нейрональную активность стриатума [18], играющего важную роль в регуляции тонких двигательных актов, нельзя игнорировать и наблюдаемое
после разрушения ДЯШ достоверное снижение уровня 5-ОТ в стриатуме.
Ежедневное введение мелатонина в течение 7 дней после операции способствовало нормализации уровня 5-ОТ в теменной коре, стриатуме и ВЛОПМ, приближая его к уровню ЛО крыс (см.
таблицу). Хотя в таламусе крыс, получавших мелатонин, содержание 5-ОТ было выше по сравнению с таковым у ЛО животных, это повышение было на 30% меньше по сравнению с данным
показателем у крыс, получавших после разрушения ДЯШ изотонический раствор хлористого
натрия. В то же время введение мелатонина сопровождалось увеличением на 26,6% (P < 0,05)
концентрации 5-ОТ в мозжечке. Что касается 5-ОИУК, то в теменной коре и стриатуме ее уровень достоверно не отличался от контроля. Вместе с тем в таламусе, мозжечке и особенно
в ВЛОПМ (центр локализации адренергических нейронов, обеспечивающих симпатический контроль тонуса сосудов крыс) животных 3-й группы, получавших мелатонин, наблюдаемое повышение содержания 5-ОИУК по сравнению с таковым у крыс 2-й группы было более выраженным, что указывало на усиление метаболизма 5-ОТ в данных областях мозга. В частности,
в ВЛОПМ показатель 5-ОИУК/5-ОТ под влиянием мелатонина увеличился по сравнению
с контролем в 4 раза.
Вероятно, эти изменения, свидетельствующие об усилении метаболизма 5-ОТ в мозге, были
адаптивными, направленными на поддержание оптимального уровня 5-ОТ в исследованных
областях мозга и нормализацию интегративной функции мозга. Подтверждением этому может
служить тот факт, что после введения мелатонина животные с разрушенными ядрами шва стали
заметно спокойнее, у них снизилась спонтанная двигательная активность и прекратились циркуляторные движения.
Заключение. Таким образом, полученные результаты свидетельствуют, что введение экзогенного мелатонина в течение 7 дней после электролитического разрушения ДЯШ способствует
нормализации метаболизма серотонина в мозге. Одним из возможных механизмов протектор51
ус
и
ел
ар
ных свойств мелатонина является изменение процессов окислительного дезаминирования выделяемого 5-ОТ и компенсаторных механизмов, дающих возможность сохранившимся серотонинергическим терминалям поддерживать базальные уровни 5-ОТ в мозге [19].
Полученные данные о снижении уровня агрессивности и локомоторных расстройств, обусловленных деструкцией ДЯШ, свидетельствуют также об участии серотонина в опосредовании
седативных эффектов мелатонина, что позволяет рекомендовать применение малых доз мелатонина после операций на мозге.
Литература
ак
ад
ем
ия
н
ау
кБ
1. R e i t e r R. J., T a n D. X., M a n c h e s t e r L. C., Q i W. // Cell Biochem. Biophys. 2001. Vol. 34, N 2. P. 237–256.
2. T a n D. X., M a n c h e s t e r L. C., R e i t e r R. et al. // Biol. Sygnals Recept. 2000. Vol. 9, N 4. P. 137–159.
3. K i r b y L. G., P e r n a r L., V a l e n t i n o R. J., B e c k S. G. // Neuroscience. 2003. Vol. 116. P. 669–683.
4. L e a n d e r P., V r a n g N., M o l l e r M. // J. Comp. Neurol. 1998. Vol. 399, N 1. P. 73–93.
5. U n d e r w o o d M. D., A r a n g o V., B a k a l i a n M. J., R u g i e r r o D. A. et al. // Brain Res. 1999. Vol. 824,
N 1. P. 454–455.
6. H a l b e r s t a d t A. L., B a l a b a n C. D. // Neuroscience. 2006. Vol. 140, N 3. P. 1067–1097.
7. L i e b e n C. K., S t e i n b u s c h H. W., B l o c k l a n d A. // Behav. Brain Res. 2006. Vol. 168, N 2. P. 197–207.
8. L o w r y C. A., J o h n s o n P. L., H a y-S c h m i d t A. et al. // Stress. 2005. Vol. 8, N 4. P. 233–246.
9. M o n t i J. M., M o n t i D. // Life Sсi. 2000. Vol. 66. P. 1999–2012.
10. J a c o b s B. L., C o h e n A. // Pharmacology. 1980. Vol. 20, N 6. P. 310–315.
11. T e m e l Y., B o o t m a n L. J., B l o c k l a n d A. et al. // Proc. Nathl. Acad. Sci. USA. 2007. Vol. 104, N 43.
P. 17087–17092.
12. M i c h e l s e n K. A., S c h m i t z C., S t e i n b u s c h H. W. // Brain Res. Rev. 2007. Vol. 55, N 21. P. 329–342.
13. P a x i n o s Y., W a t s o n J. The rat brain in stereotaxic coordinates. Orlando, 1986.
14. C u r z o n G., G r e e n A. R. // Br. J. Pharmacol. 1970. Vol. 39, N 3. P. 653–655.
15. B l a c k b u r n T. P., F o s t e r G. A., H e a p y C. G., K e m p J. D. // Eur. J. Pharmacol. 1980. Vol. 67, N 4.
P. 427–428.
16. B l a c k b u r n T. P., C o x B., L e e T. F. // Psychopharmacology (Berlin). 1982. Vol. 78, N 3. P. 261–262.
17. L o r e n s S. A., G u i l b e r g H. C., H o l e K. et al. // Brain Res. 1976. Vol. 108, N 1. P. 97–113.
18. Y a m a m o t o M., M u r a y a m a S. // Pharmacology. 1980. Vol. 20, N 6. P. 310–315.
19. K i r b y L. G., K r e i s s D. S., S i n g h A., L u c k i I. // Synapse. 1995. Vol. 20, N 2. P. 99–105.
G. K. TROPNIKOVA
MELATONIN INFLUENCE ON THE FUNCTIONAL STATE OF THE SEROTONIN STRUCTURES
OF THE BRAIN AFTER DESTRUCTION OF THE DORSAL RAPHE NUCLEUS IN EXPERIMENT
Institute of Physiology of NAS of Belarus, Minsk
ая
Summary
На
ци
он
ал
ьн
In chronic experiments on adult male rats (250 ± 20 g) it was shown that introperitoneal injection of melatonin (0.5 mg/
kg) in the morning daily for 7 days after electrolytic destruction of dorsal raphe nucleus (DRN) prevented an operation-induced decrease in the serotonin level in the parietal cortex and striatum, diminished an increment growth of its content in the
thalamus, ventrolateral medulla oblongata and increased the serotonin content in the cerebellum.
Thus our results suggest that exogenous melatonin can prevent the changes in the brain serotonin content caused by destruction of DRN. One of the possible mechanisms of the protective action of melatonin is a change in the processes of oxidative desamination of serotonin released.
ар
СЕ­Р­Ы Я МЕДЫЦЫНСКІХ НА­ВУК
ел
УДК 577.3:612.65:615.47
В. И. Ходулев1, А. В. Сидоренко2
ус
и
ВЕСЦI НА­Ц­Ы Я­НАЛЬ­НАЙ АКА­ДЭМII НА­ВУК БЕ­ЛА­РУСI № 3 2009
1
кБ
Состояние проводящей функции малоберцового нерва
при алкогольной полиневропатии
Республиканский научно-практический центр неврологии и нейрохирургии, Минск, Беларусь,
2
Белорусский государственный университет, Минск
ау
(Поступила в редакцию 03.11.2008)
На
ци
он
ал
ьн
ая
ак
ад
ем
ия
н
Введение. В основе аксональных невропатий лежат метаболические нарушения в нейронах,
приводящие к дегенерации аксонов. Большинство аксональных макромолекул синтезируется
в теле нервной клетки, а затем с транспортируется по аксону к месту их приложения. Вследствие
действия экзогенных токсинов транспортировка в аксонах нарушается, что приводит к их дистальному распаду. Кроме того, при аксональных невропатиях вследствие первично измененных
аксонов развивается вторичная демиелинизация. Длительная аксональная дегенерация в конечном итоге приводит к прогрессирующему распаду и поглощению аксона и распространяется по
направлению к телу клетки, захватывая ее. Однако точная последовательность событий в нервных волокнах, кульминацией которых является аксональная дегенерация, остается неясной [1, 2].
Патоморфологические различия между аксонопатиями и миелинопатиями не всегда четко
выражены, а в некоторых случаях отмечается сочетанное повреждение и аксонов, и миелиновых
оболочек. Кроме того, факт вовлечения в патологический процесс аксона или миелиновой оболочки не обязательно свидетельствует о том, что патология ограничивается только областью пораженной структуры [1].
Наиболее частыми полиневропатиями (ПНП) являются аксональные, причем в половине
случаев причина их не может быть установлена. Клиническая картина аксональной дегенерации, которая проявляется дистальной, симметричной, генерализованной, сенсомоторной ПНП,
чаще всего развивается незаметно. У большинства больных выявляются парестезии, чувство
жжения, боли в стопах и голенях стреляющего или сверлящего характера, крампи. Объективные
признаки включают потерю чувствительности в дистальных отделах конечностей, снижение
или отсутствие глубоких сухожильных рефлексов, дистальную атрофию и слабость. Часто страдает вегетативная нервная система [1, 3].
Алкогольная ПНП, которая также является типично аксональной невропатией, относится
к тяжелым интоксикационным заболеваниям нервной системы. Многие вопросы ее патогенеза
и диагностики остаются спорными. Недостаточно изучены патофизиологические механизмы поражения периферической нервной системы при хронической алкогольной интоксикации. Зачастую
алкогольная ПНП имеет слабо выраженную клиническую картину, что затрудняет ее диагностику. Классические формы с наличием парезов или параличей встречаются редко. Наиболее уязвим
при алкогольной ПНП малоберцовый нерв, что обусловлено топографо-анатомическим, нейрогистологическим строением, эволюционно-филогенетическими особенностями формирования и созревания, а также низким уровнем васкуляризации. В связи с этим малоберцовый нерв на разных
стадиях его поражения является удобной моделью для изучения аксональной дегенерации [3–5].
Электрофизиологические исследования играют большую роль в диагностике патологии периферических нервов, в изучении механизмов развития заболевания, а также в процессе проведения лечебных процедур. В качестве объекта исследования используют электромиограммы
и электронейромиограммы. В работе [6] при определении динамики восстановления пораженных
53
ус
и
ци
он
ал
ьн
ая
ак
ад
ем
ия
н
ау
кБ
ел
ар
нервов в процессе проводимого лечения нами были исследованы электромиограммы с помощью
нелинейного анализа, что позволило на основе количественных показателей оценить изменения
биоэлектрической активности мышцы при лечении поражений лучевого нерва нейромидином.
При изучении электронейромиограмм оценка дистальной латентности М-ответа позволяет
судить о состоянии проводимости нерва на самых дистальных его участках, включая терминальные ветви к мышце, нервно-мышечную передачу и мышечное волокно. При исследовании
малоберцового нерва скорость проведения импульса (СПИ) показывает проводимость на сегменте голени. Латентный период F-волны указывает на проводимость на проксимальном уровне
двигательного сегмента, тогда как амплитуда и площадь М-ответа отражают степень аксонального дефицита нерва. Анализ степени (уровня) изменения тех или иных электронейромиографических (ЭНМГ) показателей позволяет оценить состояние аксональной и проводящей функции
нерва (демиелинизации), а также установить их зависимость друг от друга (например, демиелинизации от аксональной дегенерации).
Планируя данное исследование, мы исходили из того, что амплитуда и площадь М-ответа отражают аксональную функцию нерва, т. е. аксональную дегенерацию, а СПИ, латентные периоды М-ответа и F-волны свидетельствуют о демиелинизации. Чтобы выделить этапы аксональной дегенерации, больные с алкогольной ПНП были разделены на три группы в зависимости от
степени изменения амплитуды и площади М-ответа.
Цель исследования – сравнительная оценка ЭНМГ показателей проводимости малоберцового нерва в зависимости от степени изменения его аксональной функции.
Материалы и методы исследования. Обследовано 92 больных с алкогольной ПНП, средний возраст – 46,5±9,0 года. Контрольную группу составили 54 практически здоровых лица без
признаков клинического поражения малоберцового нерва (средний возраст – 43,9±9,0 года). Диагноз установлен на основании клинических данных, лабораторных и инструментальных показателей. В зависимости от степени изменения нормированного отклонения амплитуды М-ответа
пациенты с алкогольной ПНП были разделены на три группы. У первой группы больных показатель амплитуды М-ответа составлял не более двух, у второй – не более трех, а у третьей – три
и более нормированных отклонения.
Запись осуществляли с помощью компьютерной диагностической системы Compass, Viking
Select фирмы Nicolet, Viasys Healthcare Inc. (США). Развертка составляла 50 мс, полоса пропускания частот – 2–10 000 Гц. Для регистрации использовали поверхностные чашечковые электроды
диаметром 10 мм. Электрическую стимуляцию проводили биполярным накожным электродом
прямоугольными одиночными стимулами длительностью 0,1–0,2 мс (величина тока супрамаксимальна), катод располагали дистальнее анода. Заземляющий электрод находился между регистрирующим и стимулирующим электродами.
При исследовании малоберцового нерва активный электрод накладывали над областью двигательной точки мышцы короткого разгибателя пальцев, референтный – дистально над областью сухожилия этой мышцы. Электрическую стимуляцию осуществляли в области голеностопного сустава между сухожилиями длинного разгибателя пальцев и длинного разгибателя
большого пальца (дистальная точка), в области головки малоберцовой кости (проксимальная
точка стимуляции). При исследовании F-волны стимуляцию осуществляли в дистальной точке
нерва, при этом катод располагали проксимальнее анода. Определяли минимальную латентность из 8–16 последовательных F-волн.
Аксональную функцию нерва оценивали по амплитуде – от пика до пика и по площади негативного пика М-ответа. Проводящую функцию анализировали по дистальной латентности
М-ответа, СПИ на уровне голени, минимальному латентному периоду F-волны. Абсолютные
значения вышеуказанных показателей для каждого пациента выражали в нормированном отклонении, которое рассчитывали по формуле [7]
t = (χi – χ ) / σ,
где t – нормированное отклонение; χi – значение исследуемого показателя; χ – средняя арифметическая показателей контрольной группы; σ – стандартное отклонение в контрольной группе.
На
54
ус
и
кБ
ел
ар
В связи с тем что при патологии одни показатели изменяются в большую (знак «плюс»), другие – в меньшую сторону (знак «минус»), мы конвертировали изменения нормированного отклонения в одном направлении – со знаком «плюс». Результаты обрабатывали с помощью программ
Excel, Statistica 6.0. Рассчитывали медиану, межквартильный интервал. Степень достоверности
определяли с помощью критерия Манна–Уитни. За уровень статистической достоверности принимали р < 0,05.
Результаты и их обсуждение. С помощью ЭНМГ исследовано состояние малоберцового нерва у трех групп больных с алкогольной ПНП (см. таблицу). Статистически пациенты представленных групп не имели различий по возрасту. Установлено, что показатели, отражающие аксональную функцию нерва (амплитуда, площадь М-ответа) во всех трех группах отличны между
собой (p < 0,001). На рисунке показана степень аксонального поражения по амплитуде и площади М-ответа у всех обследованных.
ЭНМГ характеристика моторных волокон малоберцового нерва у больных с алкогольной ПНП,
представленная в виде нормированного отклонения
первая (n=39)
вторая (n=33)
третья (n=20)
0,3 (–0,5–0,8)
1,1 (0,3–1,4)2,3
0,7 (0,1–1,3)2,3
0,7 (–0,1–1,9)
1,8 (1,5–2,7)2,3
1,8 (1,2–2,3)2,3
0,1 (–0,3–1,2)
2,5 (2,2–2,7)1,3
2,0 (1,7–2,3)1,3
1,1 (0,3–2,2)
3,1 (2,4–3,7)1
2,8 (2,0–3,5)1
0,2 (–0,7–1,0)
3,2 (3,1–3,4)1,2
3,1 (2,8–3,2)1,2
1,1 (0,4–1,9)
3,7 (2,4–4,0)1
2,9 (0,8–4,3)1
ем
ия
н
Возраст
Амплитуда М-ответа
Площадь М-ответа
Латентный период М-ответа
СПИ
Латентный период F-волны
ау
Исследуемая группа
Показатель
П р и м е ч а н и е. Данные представлены в виде медианы, в скобках указан интервал между 25-й и 75-й процентилями; 1,2,3 – различия статистически значимы (р<0,05) между соответствующими группами (все показатели получены при стимуляции дистальной точки нервов).
ци
он
ал
ьн
ая
ак
ад
В первой группе пациентов установлено изменение аксональной функции примерно на одно
нормированное отклонение в виде снижения амплитуды и площади М-ответа, изменение проводящей функции нерва было более значительным. СПИ на уровне голени и минимальная латентность F-волны снижена на 1,8 отклонения (см. таблицу). Выявлены статистические различия
между СПИ и латентностью F-волны, с одной стороны, и амплитудой и площадью М-ответа –
с другой (p < 0,0001). Статистической достоверности при анализе латентного периода М-ответа
не установлено.
На
Изменение СПИ, латентных периодов (ЛП) М-ответа и F-волны в зависимости от степени изменения амплитуды
и площади М-ответа малоберцового нерва. 1, 2, 3 – группы больных; t – нормированное отклонение
55
ус
и
ци
он
ал
ьн
ая
ак
ад
ем
ия
н
ау
кБ
ел
ар
Во второй группе при уровне снижения площади и амплитуды М-ответа на 2 и 2,5 нормированных отклонения соответственно СПИ снижалась на 3,1, а латентный период F-волны – на 2,8
нормированных отклонения. Как и в первой группе, различие между степенью изменения амплитуды М-ответа и СПИ (р < 0,01) было значимым, но в меньшей степени. Уменьшение СПИ
и латентности F-волны по сравнению с первой группой было статистически значимым (p < 0,01).
Показатель дистальной латентности М-ответа в первой группе не отличался от такового во второй группе.
Наряду с дальнейшим снижением амплитуды и площади М-ответа в третьей группе больных
с алкогольной ПНП по сравнению со второй (p < 0,001) выявлено отсутствие значимого снижения СПИ, и латентного периода F-волны (р < 0,05). Не обнаружено статистической достоверности между показателями, отражающими аксональную функцию и СПИ и латентностью F-волны
(р > 0,05). На самом дистальном сегменте нерва (латентный период М-ответа) статистических
отличий между группами по проводимости не выявлено.
Таким образом, в первой и второй группах показатели, характеризующие проводящие свойства малоберцового нерва (СПИ, латентность F-волны), значимо изменялись по сравнению с показателями, отражающими аксональную функцию (амплитуда, площадь М-ответа), тогда как
в третьей группе подобной зависимости не наблюдалось. Кроме того, выявлена статистическая
достоверность изменения СПИ и латентности F-волны между данными показателями первой
и второй групп и ее отсутствие между показателями второй и третьей групп. При сравнении
всех групп между собой изменения латентного периода М-ответа не установлено.
На основании полученных данных можно предположить, что у больных с алкогольной ПНП
на ранней стадии аксональной дегенерации нерва (первая группа пациентов) преобладают процессы демиелинизации. Однако по сравнению с первично демиелинизирующими заболеваниями,
такими как острая и хроническая воспалительная демиелинизирующая или наследственная
моторно-сенсорная невропатия первого типа, они незначительны. Развитие демиелинизации
в периферических нервах начинается, как правило, с паранодальных областей периферического
нерва. Под термином «демиелинизация» подразумевается спектр поражений – от минимальных
изменений в паранодальной области до полного отсутствия миелина на протяжении целых интернодиев. При компьютерном моделировании миелинизированного волокна путем снижения
сопротивления паранодальных сегментов показано также уменьшение проводимости вдоль
предложенной модели [8]. Процессы демиелинизации развиваются в быстро-, средне- и медленнопроводящих волокнах нерва [9–11], но ЭНМГ данные показывают состояние только быстропроводящих волокон.
На следующей стадии дегенерации периферических нервов (вторая группа больных) процессы
изменения амплитуды и площади М-ответа и снижения проводимости идут параллельно, хотя по
сравнению с первой группой имеет место тенденция к уменьшению степени изменения СПИ и латентности F-волны (см. рисунок). В этот период снижение проводимости по нерву, по нашему мнению, происходит за счет присоединения дегенерации быстропроводящих волокон нерва. J. P. Bal­
lantyne et al. [12] выявили у больных без клинических признаков ПНП только тенденцию к снижению СПИ, получив при этом значительную положительную корреляцию между снижением СПИ
и числом двигательных единиц и отрицательную корреляцию с латентностью М-ответа.
В третьей группе больных, имевших большую степень дегенерации нерва, происходит дальнейшее снижение скорости проводимости по нерву, которое статистически не значимо по сравнению с данным показателем во второй группе, а также со степенью снижения амплитуды
М-ответа в этой группе. На этом этапе незначительное уменьшение СПИ обусловлено гибелью
волокон среднего диаметра нерва. Процесс демиелинизации уже на этом этапе минимален по
сравнению с аксональной дегенерацией. Среднепроводящие волокна малоберцового нерва составляют основную часть нерва. F. G. Bayramoglu et al. [13] показали, что в волокнах малоберцового нерва, иннервирующих короткую мышцу разгибателей пальцев стопы, СПИ составляет
28–52 м/с, а наибольшее количество волокон (70%) проводят импульс со скоростью 40–48 м/с.
Имеющиеся в настоящее время данные патоморфологических и нейрофизиологических исследований позволяют утверждать, что в основе развития алкогольной ПНП лежит аксональная
На
56
ус
и
ал
ьн
ая
ак
ад
ем
ия
н
ау
кБ
ел
ар
дегенерации нервов – так называемая «дегенерация затухающего ретроградного типа» (dying
back), подобная валлеровской дегенерации нерва. При алкогольной невропатии описывают также демиелинизацию, которую характеризуют как вторичную [1, 3]. В эксперименте на крысах
показано влияние этанола или его метаболитов на механизм аксонального транспорта, что ведет
в свою очередь к развитию алкогольной ПНП [2].
Демиелинизацию при алкогольной ПНП впервые описал A. Gombault в конце XIX в. [14].
В 1958 г. D. Denny-Brown [15] обнаружил сегментарное истончение или утрату миелина без деструкции аксона на большинстве периферических отделов длинных периферических нервов.
В 1964 г. R. F. Mayer и D. Denny-Brown [16] выявили снижение скорости проводимости у кошек,
у которых отмечалась паранодальная гибель миелина в нервах. С помощью электронной микроскопии было доказано наличие первично аксонального поражения периферических нервов при
алкогольной ПНП [5, 17]. На основании проведенных исследований H. P. Ludin и W. Tackmann
[10] пришли к выводу, что первичное аксональное поражение и вторичная демиелинизация моторных и сенсорных волокон (особенно малого диаметра) составляют морфологическую основу
алкогольного повреждения невральной ткани.
Нейрофизиологические данные показывают нормальные или несколько сниженные показатели СПИ и латентных периодов М-ответа и F-волны на разных стадиях алкогольной ПНП.
E. B. Casey, P. M. Le Quesne [18] установлена нормальная проводимость у большинства больных,
но с тенденцией к снижению или некоторое снижение амплитуды проксимального М-ответа,
что было расценено как увеличение дисперсии проходящих по нерву импульсов. M. L. D’Amour
et al. [19] выявили снижение СПИ по периферическим нервам у умеренно пьющих людей, а также признаки денервации при игольчатой электромиографии и более выраженные изменения
у больных алкоголизмом. A. Ammendola et al. [3] показано значимое снижение СПИ и амплитуды М-ответа при исследовании нервов верхних и нижних конечностей. Следует отметить, что
уменьшение СПИ в условиях стимуляции срединного нерва наблюдается при нормальной амплитуде М-ответа. C. Mawdsley, R. F. Mayer [20] обнаружили нарушение проводящей функции
нервов на фоне нормальной амплитуды полученных М-ответов у больных, не имевших клинических признаков невропатии. Кроме того, они показали значимое отличие ЭНМГ данных
у групп больных с сенсорными нарушениями как при отсутствии или снижении сухожильнопериостальных рефлексов, так и при их наличии.
При изучении поздних ответов (F-волны, Н-рефлекса) показано значительное изменение их
латентных периодов по сравнению с проводимостью на дистальных участках, что улучшало диагностику ПНП [21]. Это объясняется большим расстоянием прохождения импульса по нерву –
от дистальной точки стимуляции нерва до спинного мозга и обратно, что доказывает роль вторичной демиелинизации в снижении проводимости на ранней стадии заболевания. Длинный
путь имеет преимущества в оценке диффузных процессов и аккумуляции всех сегментарных нарушений, которые в отдельности могут не показать достоверных отличий от нормы.
Заключение. Таким образом, на основании наших и литературных данных показано, что аксональная дегенерация периферических нервов при алкогольной ПНП начинается с процесса демиелинизации волокон. Дальнейшее изменение проводящей функции связано с дегенерацией
быстропроводящих волокон, а затем и с вовлечением наиболее крупного пула волокон среднего
диаметра.
Литература
На
ци
он
1. Э с б е р и А. К., Д ж и л л и а т Р. У. Заболевания периферической нервной системы. М., 1987.
2. M c L a n e J. A. // Alcohol. 1987. Vol. 4. P. 385–389.
3. A m m e n d o l a A., T a t a M. R., A u r i l i o C. et al. // Alcohol and Alcoholism. Vol. 36. P. 271–275.
4. А к и м о в Г. А., М и х а й л е н к о А. А., О с е т р о в Б. А. и др. // Журн. невропат. и психиатр. 1986. № 6.
С. 898–901.
5. K o i k e H., I i j i m a M., S u g i u r a M. et al. // Ann. Neurol. 2003. Vol. 54. P. 19–29.
6. С и д о р е н к о А. В., Х о д у л е в В. И., С е л и ц к и й А. П., П о н о м а р е в В. В. // Мед. панорама. 2006.
№ 6. С. 46–49.
7. Р о к и ц к и й П. Ф. Биологическая статистика. Минск, 1964.
57
ус
и
кБ
ел
ар
8. S t e p h a n o v a D. I., C h o b a n o v a M. // Biol. Cybern. 1997. Vol. 76. P. 311–314.
9. Х о д у л е в В. И., Н е ч и п у р е н к о Н. И., М а р ч е н к о С. В. // Журн. неврол. и психиатр. 1999. № 12.
С. 47–49.
10. L u d i n H. P., T a c k m a n W. Polyneuropathien. Stuttgart; N. Y., 1984. P. 250–255.
11. Z a m b e l i s T., K a r a n d r e a s N., T z a v e l l a s E. et al. // J. Peripheral Nerv. System. 2005. Vol. 10. P. 375–
381.
12. B a l l a n t y n e J. P., H a n s e n S., W e i r A. et al. // J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry. 1980. Vol. 43. P. 427−432.
13. B a y r a m o g l u F. G., D a l k i l i c N., K i z i l t a n E. et al. // Inter. J. Neurosci. 2004. Vol. 114. P. 1147–1159.
14. G o m b a u l t A. // Arch. Neurol. 1880. Vol. 1. P. 11–38.
15. D e n n y–B r o w n D. E. // Fed. Proc. 1958. Vol. 17. Suppl. 2. P. 35–39.
16. M a y e r R. F., D e n n y–B r o w n D. // Neurology. 1964. Vol. 14. P. 714–726.
17. B e h s e F., B u c h t h a l F. // Ann. Neurol. 1977. Vol. 2. P. 95–110.
18. C a s e y E. B., Le Q u e s n e P. M. // J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry. 1972. Vol. 35. P. 624–630.
19. D’ A m o u r M. L. et al. // Addict. Biol. 2000. Vol. 5. P. 71–75.
20. M a w d s l e y C., M a y e r R. F. // Brain. 1965. Vol. 88. P. 335–356.
21. D’A m o u r M. L., S h a h a n i B. T., Y o u n g R. R., B i r d K. T. // Neurology (Minneap). 1979. Vol. 29.
P. 1600–1604.
ау
V. I. KHODULEV1, A. V. Sidorenko2
STATE OF THE CONDUCTIVE FUNCTION
OF THE FIBULAR NERVE AT ALCOHOL POLYNEUROPATHY
ем
ия
н
1
Republican Scientific and Practical Center of Neurology and Neurosurgery, Minsk, Belarus,
2
Belarusian State University, Minsk
Summary
На
ци
он
ал
ьн
ая
ак
ад
Electroneuromyograms of patients with alcohol polyneuropathy are investigated using electroneuromyography. Patients
were divided into three groups depending on a degree of decreasing the M-response amplitude. In the first group of patients
the index of the M-response amplitude was not more than two, in the second – not more than three, whereas in the third –
three and more normalized deviations. On basis of the data obtained it is established that the axonal degeneration of peripheral nerves at alcohol polyneuropathy starts with the process of demyelization of nerve fibers. A further change in the conductive function of the nerve is associated with degenerating fast conducting fibers and then with involving the largest pool of
mean-diameter fibers.
ар
СЕ­Р­Ы Я МЕДЫЦЫНСКІХ НА­ВУК
ус
и
ВЕСЦI НА­Ц­Ы Я­НАЛЬ­НАЙ АКА­ДЭМII НА­ВУК БЕ­ЛА­РУСI № 3 2009
УДК 577.15 + 616.379-008.64 + 615.357
ел
Е. Ю. СУДНИКОВИЧ, Ю. З. МАКСИМЧИК, С. В. ЗАБРОДСКАЯ, Е. А. МАКАР,
И. К. ДРЕМЗА, В. А. АВЕРИН, Е. А. ЛАПШИНА
кБ
ВЛИЯНИЕ МЕЛАТОНИНА НА АКТИВНОСТЬ ФЕРМЕНТОВ АНТИОКСИДАНТНОЙ
ЗАЩИТЫ И ПЕНТОЗОФОСФАТНЫЙ ПУТЬ ПРИ ДИАБЕТЕ
Научно-производственный центр
«Институт фармакологии и биохимии НАН Беларуси», Гродно
ау
(Поступила в редакцию 13.03.2008)
На
ци
он
ал
ьн
ая
ак
ад
ем
ия
н
Введение. Сосудистые осложнения являются основными долговременными нарушениями
у больных сахарным диабетом. Высокие концентрации глюкозы приводят к структурнофункциональным изменениям стенки сосудов, окислительному стрессу, возрастанию метаболизма глюкозы по сорбитоловому пути, неэнзиматическому гликозилированию белков, реакции
гликооксидации, изменению в продукции сосудоактивных веществ, таких как эндотелин, простаноиды и окись азота (NO) [1–5]. Продукция NO при диабете возрастает, но его биодоступность уменьшается. Это происходит, как предполагают, за счет инактивации NO активными
формами кислорода с образованием высокотоксичного пероксинитрита [1]. Вследствие активации экспрессии индуцибельной NO-синтазы уровень NO повышается, в то время как экспрессия
гена эндотелиальной NO-синтазы уменьшается [1]. C целью снижения риска осложнений при
развитии данной патологии предполагается использование различных антиоксидантов.
Показано [6], что мелатонин (N–ацетил-5-метокситриптамин) – гормон, секретируемый эпифизом, – является скэвенджером свободных радикалов и окислителей: гидроксильных, пероксильных и алкоксильных радикалов, перекиси водорода. Кроме того, он обладает выраженной
антиоксидантной активностью (в основном благодаря своим электрон-донорным свойствам) [7–
9] и легко проникает в субклеточные компартменты; эффективно ингибирует индуцибельную
синтазу окиси азота (iNOS), ингибируя тем самым продукцию NO [10], и стимулирует активность таких ферментов антиоксидантной защиты, как супероксиддисмутаза, глутатионпероксидаза (ГSHП) и редуктаза [7].
Несмотря на предпринятые в последние несколько лет многочисленные исследования, механизмы регуляторного, протекторного действия мелатонина требуют дальнейшего выяснения,
так же как и поиск новых возможных областей его применения в качестве фармакологического
препарата широкого спектра действия.
Цель работы – исследование метаболических эффектов мелатонина в крови, ткани печени
и аорты крыс при стрептозотоцин-индуцируемом диабете.
Материалы и методы исследования. В работе использовали N–ацетил-5-метокситриптамин
(мелатонин), 5,5′–дитиобис (2-нитробензойную кислоту) (реактив Эллмана), восстановленный
глутатион (ГSH), 2-тиобарбитуровую кислоту (ТБК), трихлоруксусную кислоту, третбутилгид­
роперекись, НАДН, НАДФ, гидрат динатриевой соли глюкозо-6-фосфата, АДФ (Sigma – Aldrich,
St. Louis, США); 1-хлор-2,4-динитробензол (ХДНБ) и стрептозотоцин (Fluka Chemie AG, Buchs,
Швейцария). Степень чистоты остальных реактивов – ч. д. а. («Реахим», Россия). Все растворы
готовили на бидистиллированной воде.
Исследования выполнены на крысах-самцах линии Wistar массой 150–180 г. Животные, которых содержали на стандартной сбалансированной диете при свободном доступе к воде, были
разделены на три группы. Первая группа была оставлена как контроль (крысам вводили физио59
ус
и
ьн
ая
ак
ад
ем
ия
н
ау
кБ
ел
ар
логический раствор). Животным второй и третьей групп однократно был введен стрептозотоцин
(60 мг/кг, внутрибрюшинно), растворенный непосредственно перед использованием в 0,01 М цит­
ратном буфере, рН 4,5. Крыс, получивших инъекцию стрептозотоцина, считали диабетическими, если уровень глюкозы в крови, взятой натощак, превышал 200 мг/дл. Животным второй
группы ежедневно вводили физиологический раствор (диабет), животным третьей группы – мелатонин (10 мг/кг массы тела) в течение 18 дней с момента начала эксперимента. Мелатонин готовили в фосфатном буфере (0,145 М NaCl, 10 мМ натрий фосфорнокислый, рН 7,4) в виде 0,3%ного раствора, содержавшего 5% этанола.
В постмитохондриальной фракции ткани печени по методу Эллмана [11] определяли содержание ГSH, используя коэффициент молярной экстинкции (ε412 = 13 600 М–1·см–1), и продуктов
перекисного окисления мембранных липидов (ТБК-реактивные соединения, ТБКРС) [12]
(ε532 = 156 000 М–1·см–1). Стабильную форму гликозилированного гемоглобина в крови определяли, используя наборы реактивов (Pliva-Lachema a. s., Brno, Чешская Республика). Содержание
белка измеряли по методу Лоури [13]. Активность цитозольной глутатион-S-трансферазы (ГST)
в ткани печени определяли по методу W. H. Habig et al. [14]. Конъюгацию ХДНБ с глутатионом,
которую наблюдали при 340 нм, используя коэффициент молярной абсорбции 9 600 М–1·см–1,
выражали в микромолях конъюгата в минуту на 1 мг белка [14].
Активность ГSHП в постмитохондриальной фракции ткани печени и эритроцитах определяли по методу J. I. R. Martinez [15] (концентрация белка в реакционной среде составляла 40 мкг/
мл, реакционный объем – 1 мл); активность фермента выражали как количество ГSH, окисленного в глутатионпероксидазной реакции, с помощью реактива Эллмана.
Для определения активности каталазы использовали метод H. Aebi [16]. За разложением H2O2
наблюдали в течение 3 мин при 240 нм и температуре 25 ºС. Активность фермента выражали как
количество H2O2, разложившейся за 1 мин, на 1мг белка образца, используя коэффициент молярной абсорбции 36 М–1·см–1.
Ферментативную активность транскетолазы (ТК) определяли спектрофотометрически по
скорости окисления НАДН в 50 мМ трис-НСl буфере (рН 7,6) при 18±1 ºС, регистрируя снижение
оптической плотности при 340 нм [17]. Реакционная среда (1,7 мл) содержала 0,1 мМ НАДH,
3 мМ MgCl2, 5 мM рибозо-5-фосфата; триозофосфатизомеразу, эпимеразу/изомеразу фосфопентоз и глицеролфосфатдегидрогеназу в избытке, концентрация белка в пробе составила 0,5 мг/мл.
Реакцию инициировали внесением субстрата – рибозо-5-фосфата.
Активность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Г6ФДГ) определяли по уровню наработки
НАДФН при 340 нм и 18±1 ºС [29]. Реакционная среда содержала 100 мМ трис-HCl (рН 7,6), 5 мМ
MgCl2, 0,5 мМ НАДФ, 1 мМ глюкозо-6-фосфата.
Статистический анализ. Результаты представляли в виде средних значений ± стандартное
отклонение 10–12 измерений в каждой группе. Значение Р<0,05 выбирали в качестве показателя
статистической достоверности различий между группами с помощью вариационного анализа
ANOVA.
Результаты и их обсуждение. Стрептозотоцин-индуцированный диабет у крыс (18 дней)
приводил к значительной гипергликемии, повышению уровня гликозилированного гемоглобина
и задержке роста животных (табл. 1). Введение мелатонина (10 мг/кг, 18 дней) не влияло на эти
параметры.
ци
он
ал
Т а б л и ц а 1. Изменение концентрации глюкозы, гликозилированного гемоглобина в крови
и массы тела у контрольных и диабетических крыс
Показатель
Глюкоза крови, мM
Гликозилированный гемоглобин, мкM фруктозы/г Hb
Масса тела (конечная – начальная), г
Контроль
5,5±0,4
1,76±0,48
61,5±4,5
Диабетические животные
не получавшие мелатонин
получавшие мелатонин
29,3±2,9*
4,36±0,55*
–14,5±4,5*
30,2±1,5*
4,3±0,38*
–6,5±6,0*
П р и м е ч а н и е. Статистически достоверно: *– по сравнению с контролем; # – по сравнению с показателями
у диабетических животных. То же для табл. 2, 3 и рисунка.
На
60
ус
и
Т а б л и ц а 2. Эффект введения мелатонина (18 дней) при диабете на активность глутатионпероксидазы,
каталазы, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, уровни восстановленного глутатиона и ТБКРС в эритроцитах
и концентрацию нитритов/нитратов в плазме крови крыс
ГSHП, мкмоль ГSH/мин/мл упак. кл.
Каталаза, ммоль H2O2/мин/мл упак. кл.
Г6ФДГ, мкмоль НАДФН/мин/мл упак. кл.
ГSH, мM
TБКРС, нмоль/мл упак. кл.
Нитриты/нитраты, мкМ
448±31
12,9±0,8
2,69±0,18
1,34±0,16
3,9±2,1
22,1±1,4
Диабетические животные
не получавшие мелатонин
получавшие мелатонин
502±17
11,8±0,6
2,96±0,08
1,21±0,06
4,6±1,3
22,0±3,3#
476±32
13,3±0,7
3,17±0,08*
1,25±0,14
5,0±0,7
32,3±3,5*
ар
Контроль
ел
Показатель
Контроль
36,6±3,3
0,027±0,003
0,59±0,12
3,92±0,7
получавшие мелатонин
31,4±2,9
0,022±0,002*
0,56±0,07
5,19±1,49
26,8±2,8
0,018±0,004*,#
0,46±0,10#
2,75±0,25#
ем
ия
н
ГSH, нмоль/мг белка
TБКРС, нмоль/мг белка
Нитриты/нитраты (печень), нмоль/мг белка
Нитриты/нитраты (аорта), нмоль/мг белка
Диабетические животные
не получавшие мелатонин
ау
Показатель
кБ
Т а б л и ц а 3. Эффект введения мелатонина (18 дней) при диабете на уровни восстановленного глутатиона,
продуктов перекисного окисления липидов в постмитохондриальной фракции ткани печени
и нитритов/нитратов в ткани аорты крыс
ци
он
ал
ьн
ая
ак
ад
Диабет сопровождался повышением (на 50%) уровня NO в плазме крови (табл. 2). В ткани
аорты он возрастал на 30%, а в ткани печени не изменялся (табл. 3). Наличие диабета не влияло
на активность ферментов антиоксидантной защиты, ГSHП и каталазы в эритроцитах крыс
(см. табл. 2). Введение мелатонина диабетическим животным приводило к достоверному уменьшению уровня NO в плазме крови и ткани аорты крыс (табл. 3). При этом уровни ГSH и продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ) в эритроцитах диабетических крыс изменялись незначительно по сравнению с контролем (см. табл. 2).
На
Активность глутатионпероксидазы (а), каталазы (б), глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (в) и транскетолазы (г) в ткани
печени крыс при диабете (1) и при введении мелатонина (2)
61
ус
и
ем
ия
н
ау
кБ
ел
ар
Наблюдалось заметное уменьшение (в 2,2 раза) активности Г6ФДГ, играющей важную роль
в поддержании редокс-баланса клетки, и транскетолазы (в 1,7 раза) в постмитохондриальной
фракции печени диабетических крыс (см. рисунок, в, г). Активность ферментов антиоксидантной защиты – ГSHП и каталазы снижалась в постмитохондриальной фракции печени диабетических крыс в 1,3 и 1,2 раза соответственно (см. рисунок а, б). Активность цитозольной ГST, катализирующей вторую фазу детоксикации ксенобиотиков, в ткани печени не изменялась (результаты не представлены). Как следует из полученных данных, диабет значительно снижал уровень
активности системы антиоксидантной защиты и приводил к нарушению редокс-баланcа ткани.
Введение мелатонина диабетическим крысам в значительной степени восстанавливало активность Г6ФДГ и частично повышало активность каталазы в ткани печени.
Таким образом, введение мелатонина в значительной степени предотвращало нарушения активности ферментов окислительной и неокислительной ветвей пентозофосфатного пути, поставляющего восстановительные эквиваленты в клетку, и системы антиоксидантной защиты. Эти
эффекты могут быть связаны как с прямым радикал-скэвенджерным свойством мелатонина, так
и с его опосредованными эффектами как регулятора системы антиоксидантной защиты.
Заключение. При моделировании экспериментального стрептозотоцин-индуцируемого диабета
(60 мг/кг массы тела, внутрибрюшинно, продолжительность – 18 дней) отмечалась выраженная гипергликемия, которая сопровождалась снижением массы тела животных, увеличением уровня фруктозилированных белков, некоторым уменьшением уровня ГSH в ткани печени (но не в эритроцитах),
ингибированием ферментов антиоксидантной защиты и пентозофосфатного пути, поставляющего
восстановительные эквиваленты в клетку. В то же время нами не выявлено интенсификации процессов ПОЛ в ткани печени и эритроцитах при значительном накоплении NO в плазме крови и эндотелии сосудов. Внутрибрюшинное введение (1 раз в день) мелатонина в дозе 10 мг/кг массы тела животного частично восстанавливало активность ферментов антиоксидантной защиты и пентозофосфатного пути и предотвращало аккумуляцию NO в плазме крови и эндотелии сосудов. Полученные
результаты указывают на то, что регуляция биодоступности монооксида азота является одним из
возможных механизмов защитного действия мелатонина, который, как показано ранее, способен выступать в качестве скэвенджера NO и ингибировать одну из изоформ NO-синтазы.
ак
ад
Литература
ьн
ая
1. N i s h i k a w a T. et al. // Nature. 2000. Vol. 404 P. 787–790.
2. B o j u n g a J. et al. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2004. Vol. 316. P. 771–780.
3. C a l l e s – E s c a n d o n J., C i p o l l a M. // Endocrinol. Rev. 2001. Vol. 22. P. 36–52.
4. W o l f f S. P., J i a n g Z. Y., H u n t J. V. // Free Radic. Biol. Med. 1991. Vol. 10. P. 339–352.
5. A n w a r M. M., M e k i A.-R. M. A. // Comp. Biochem. Physiol. 2003. Vol. 135. Part A. P. 539–547.
6. A l l e g r a M. et al. // J. Pin. Res. 2003. Vol. 34. Р. 1–10.
7. R e i t e r R. J. et al. // J. Pharm. Pharmacol. 2002. Vol. 54. P. 1299–1321.
8. R e i t e r R. J. et al. // Life Sci. 1997. Vol. 60. P. 2255–2271.
9. B l a n c h a r d B., P o m p o n D., D u c r o c q C. // J. Pin. Res. 2000. Vol. 29. P. 184–192.
10. P o z o D. // J. Cell. Biochem. 1997. Vol. 65. P. 430–437.
11. E l l m a n J. // Arch. Biochem. Biophys. 1959. Vol. 82. P. 70–77.
12. S t o c k s J., D o r m a n d y T. L. // Br. J. Haematol. 1971. Vol. 20. P. 95–111.
13. L o w r y O. H. et al. // J. Biol. Chem. 1951. Vol. 193. P. 265–275.
14. H a b i g W. H., P a b s t M. J., J a c o b y W. B. // J. Biol. Chem. 1974. Vol. 249, N 22. P. 7130–7139.
15. M a r t i n e z J. I. R., L a u n a y J. M., D r e u x C. // Anal. Biochem. 1979. Vol. 98, N 1. P. 154–159.
16. A e b i H. // Oxygen radicals in biological systems. Orlando, 1984. P. 121–126.
17. К о ч е т о в Г. А. Практическое руководство по энзимологии. М., 1980.
18. G r e e n L. C. et al. // Anal. Biochem. 1982. Vol. 126. P. 131–138.
ал
E. Ju. SUDNIKOVICH, Yu. Z. MAKSIMCHIK, S. V. ZABRODSKAYA, E. A. MAKAR, I. K. DREMZA, V. A. AVERIN, E. A. LAPSHINA
MELATONIN INFLUENCE ON THE ACTIVITY OF ANTIOXIDANT ENZYMES
AND A PENTOSE PHOSPHATE WAY UNDER DIABETES
ци
он
State Research and Innovation Center «Institute for Pharmacology and Biochemistry of NAS of Belarus», Minsk
Summary
На
We observed the growth retardation, the high glycosylated haemoglobine level, the decreased activities of antioxidative and pentose
phosphate enzymes under streptozotocin-induced diabetes (60 mg/kg, i. p.) in rats. Diabetes was accompanied by an enhancement of blood
plasma (1.5-fold) and diabetic aorta tissue (1.3-fold) nitric oxide levels. The melatonin treatment (10 mg/kg, 18 days) markedly reversed the
activities of G6PDH and transketolase in the liver tissue of diabetic rats and prevented an increase in nitric oxide levels in blood plasma and
aorta tissue under diabetes. We can conclude that melatonin might operate as an NO scavenger and carrier. Melatonin treatment may have
some beneficial effects in controlling diabetic vascular complications.
ар
СЕ­Р­Ы Я МЕДЫЦЫНСКІХ НА­ВУК
ус
и
ВЕСЦI НА­Ц­Ы Я­НАЛЬ­НАЙ АКА­ДЭМII НА­ВУК БЕ­ЛА­РУСI № 3 2009
ел
УДК 546.36:576.353.3]:616.12-008.3-073.96-092.9
Н. А. ГРИЦУК
кБ
МИТОХОНДРИАЛЬНОЕ ОКИСЛЕНИЕ В КАРДИОМИОЦИТАХ
И ЭЛЕКТРОКАРДИОГРАФИЧЕСКИе показатели
У КРЫС ПРИ ИНКОРПОРАЦИИ 137Cs
Белорусский государственный медицинский университет, Беларусь
ау
(Поступила в редакцию 16.01.2009)
На
ци
он
ал
ьн
ая
ак
ад
ем
ия
н
Введение. По официальным данным, за последние годы распространенность заболеваний
сердечно-сосудистой системы существенно возросла не только среди ликвидаторов аварии на
ЧАЭС, но также среди лиц, включая детей и подростков, проживающих на загрязненных территориях [1–6]. Сохраняются негативные тенденции развития ишемической болезни сердца и других форм сердечно-сосудистой патологии [7, 8].
Не уделяя должного внимания радиационному фактору в возникновении этой патологии, некоторые авторы объясняют указанный рост сердечно-сосудистой заболеваемости среди пострадавшего населения психо-эмоциональным стрессом, вызванным радиофобией [9]. Данное предположение основано на представлениях о радиорезистентности миокарда к внешнему облучению в связи с якобы низкой митотической активностью кардиомиоцитов. Однако результаты
экспериментальных данных [10, 11] и клинических наблюдений последних лет [12] не только
противоречат этому предположению, но и позволяют выделить отдельную группу радиационноиндуцированных кардиомиопатий [11].
Ранее на экспериментальной модели была показана высокая чувствительность миокарда
к внутреннему облучению от инкорпорированного 137Cs [13, 14]. Как основной дозообразующий
элемент загрязненных территорий 137Cs является аналогом и антагонистом калия [15], играющего в деятельности миокарда важную функциональную роль. Интенсивный обмен калия в миокарде с его обильным кровоснабжением и оксигенацией обусловливает выраженную опасность
накопления 137Cs в митохондриальном компартменте [16–18], который утилизирует практически
весь кислород, потребляемый миокардом, и занимает значительную часть его клеточного объема. Если в обычных условиях лишь небольшая часть кислорода превращается в его активные
формы (АФК), то при накоплении радионуклида их образование в матриксе митохондрий (Мх)
резко возрастает, что вызывает повреждение не только ультраструктуры и функции Мх [13, 14],
но и всего мембранного комплекса кардиомиоцитов [19]. Последнее является важнейшим элементом патогенеза метаболической кардиомиопатии [20, 21].
Учитывая изложенное выше, а также тесную сопряженность системы митохондриального
дыхания миокарда с его сократительной и электрической функциями [22], есть все основания
полагать, что вызванные инкорпорацией 137Cs нарушения митохондриального окисления и ультраструктуры миокарда [13, 14] могут сопровождаться изменением его электрической активности. Этот вопрос остается практически не исследованным, хотя и представляется весьма актуальным, поскольку имеет большое значение для понимания механизмов развития радиационноиндуцированной метаболической кардиомиопатии и ее роли в патогенезе сердечно-сосудистых
заболеваний, вызванных радиационными воздействиями.
Цель исследования − оценка состояния митохондриального окисления миокарда и электрокардиографических параметров у животных при инкорпорации 137Cs.
63
ус
и
ци
он
ал
ьн
ая
ак
ад
ем
ия
н
ау
кБ
ел
ар
Материалы и методы исследования. Исследования проводили на белых крысах-самцах
массой 200–230 г с соблюдением всех требований нормативных актов, принятых в международной практике лабораторного животноводства.
Всех животных содержали на стандартном рационе вивария. Опытной группе животных
в течение 7 дней скармливали радиоактивный корм (сушеные белые грибы) до достижения уровня удельной активности радионуклида 170 и 600 Бк/кг, что соответствует расчетной дозе 4
и 15 мкГр. Контрольные животные получали аналогичный чистый корм.
В данной работе описаны результаты изучения митохондриального окисления при инкорпорации 137Cs в 170 Бк/кг (результаты подобных исследований при накоплении радионуклида
в 600 Бк/кг, а также процедура проведения исследования описаны в работе [14]).
Скорость дыхания определяли на эндогенных субстратах (Vэнд), при добавлении 5 мМ сукцината (Vяк), 5 мМ глутамата (Vглу) и 100 мкМ 2,4-динитрофенола – разобщителя окислительного
фосфорилирования (Vднф). Кроме того, применяли ингибиторный анализ, используя ингибитор I
комплекса дыхательной цепи – 1 мМ амитала натрия (Vам) и ингибитор сукцинатдегидрогеназы – 10 мМ малоната натрия (Vмал). Скорость поглощения кислорода тканью выражали в нМ
кислорода за 1 мин на 1 мг белка исследуемого тканевого препарата. Количество белка определяли биуретовым методом.
Кроме того, рассчитывали величину стимулирующего действия (СД) янтарной кислоты
(СДяк = Vяк /Vэнд), глутамата (СДглу = Vглу/Vэнд), креатина (СДкре = Vэнд /Vглу) и 2,4-динитрофенола
(СДднф = Vднф/Vглу), а также показатели амиталрезистентного дыхания (АРД =Vам /Vэнд) и малонат­
резистентного дыхания (МРД = Vмал /Vам), характеризующие соответственно интенсивность
окисления флавопротеидзависимых субстратов и вклад жирных кислот (ЖК) в энергетику исследуемой ткани. Как показала практика, перечисленные выше параметры тканевого дыхания
и окислительного фосфорилирования достаточно полно характеризуют состояние энергетического обмена в ткани [13].
До начала и после окончания закорма животным троекратно проводили электрокардиографию
(ЭКГ) (аппарат SCHILLER AT–I, ФРГ) без применения общей анестезии в шести стандартных отведениях: трех двухполюсных стандартных отведениях от конечностей I, II, III и трех однополюсных усиленных от конечностей aVR, aVL, aVF. Для этого животное фиксировали на столе за конечности в положении лежа на животе. Места контакта датчиков с телом животного – тыльные поверхности предплечий и голеней освобождали от волосяного покрова с помощью депиляционного
крема Eveline laboratories (Q-10). Депилированные поверхности тела животного обрабатывали гелем,
накладывали специальные зажимы, на которых фиксировали электроды, и проводили запись ЭКГ.
Статистическую обработку результатов производили с помощью пакета статистических программ Statistica 6.0 и электронных таблиц
Т а б л и ц а 1. Показатели тканевого дыхания
Microsoft Excel 2003. Результаты ЭКГ исследо137
миокарда крыс при инкорпорации Cs (n = 9)
ваний обрабатывали, используя парный t-тест.
Тканевое дыхание, нМ О2/мин/мг белка
Результаты и их обсуждение. Изучение
Показатель
в контроле
при уровне инкорпорации 170 Бк/кг
параметров тканевого дыхания и окислитель2,23±0,19
3,48±0,16***
Vэнд
ного фосфорилирования показало, что в опыт2,40±0,44
4,72±0,58**
Vглу
ной группе животных происходит достоверно
6,40±0,77
7,12±0,71
Vяк
значимая стимуляция дыхательной активно3,13±0,62
4,65±0,36**
Vкре
сти миокарда на эндогенных субстратах – от
2,45±0,28
5,46±0,87**
Vднф
2,23±0,19 в контроле до 3,48 ± 0,16 при уровнях
СД як
2,09±0,29
1,95±0,28
инкорпорации 137Cs 170 Бк/кг (табл. 1).
СД глу
1,46±0,12
1,49±0,07
Достоверная стимуляция дыхательной акСДкре
1,45±0,07
1,30±0,05*
тивности
миокарда животных опытной групСД днф
1,27±0,08
1,320±0,11
пы наблюдалась также в присутствии глутамаАРД
0,60±0,03
0,80±0,07*
та, креатина и разобщителя – 2,4-ДНФ (соотМРД
0,40±0,11
0,33±0,12
П р и м е ч а н и е. Здесь и в табл. 2 достоверность раз­ ветственно до 4,72±0,58, 4,65±0,36 и 5,46±0,87
личий по отношению к контрольной группе: * – P < 0,05; против 2,40±0,44, 3,13±0,62 и 2,45±0,28 в кон** –P < 0,01; *** – P < 0,005.
троле).
На
64
ус
и
На
ци
он
ал
ьн
ая
ак
ад
ем
ия
н
ау
кБ
ел
ар
Вместе с тем другой экзогенный субстрат – сукцинат не оказывал такого влияния на дыхательную активность, что объясняется особенностью его метаболизма в миокарде, связанной
с высокой восстановленностью компонентов дыхательной цепи Мх кардиомиоцитов за счет интенсивного β-окисления ЖК [23]. Относительно стабильные показатели СД глутамата и сукцината при инкорпорации радионуклида указывают на отсутствие заметных изменений эндогенных пулов этих субстратов. Следует отметить, что изменения параметров митохондриального
окисления в миокарде животных с уровнем инкорпорации радионуклида в 600 Бк/кг более выражены, но в целом идентичны описанным ранее [14].
Достоверное снижение СДкре у опытной группы животных до 1,17±0,03 против 1,45 в контроле свидетельствует о нарушении активности креатинфосфокиназы и сопряженных с ней ферментов. Нарушение депонирования макроэргов в форме креатинфосфата может быть вызвано
радиационно-индуцированной модификацией фосфолипидного микроокружения фермента, иммобилизованного на мембранах кардиомиоцитов, набуханием Мх [13], изменением ионного состава различных микрокомпартментов кардиомиоцитов и др.
Интересно отметить, что нарушение депонирования и передачи макроэргов в форме креатинфосфата при данном воздействии происходит на фоне относительно интактной системы сопряжения окислительного фосфорилирования, что отличает описанную метаболическую ситуацию от таковой при накоплении радионуклида в 600 Бк/кг, когда в кардиомиоцитах животных,
при наличии стабильной активности креатинфосфокиназы, наблюдается разобщение окислительного фосфорилирования [14].
Данные ингибиторного анализа свидетельствуют о том, что у животных опытной группы
наблюдается изменение соотношения окисляющихся субстратов. Так, достоверное увеличение
АРД до 0,80±0,07 против 0,60±0,03 в контроле указывает на увеличение окисления в Мх миокарда флавопротеид-зависимых субстратов (сукцината и ЖК). Эти изменения наиболее выражены
при увеличении уровня инкорпорации радионуклида до 600 Бк/кг, что проявляется в виде увеличения интенсивности β-окисления ЖК, вызывающих разобщение окислительного фосфорилирования и дополнительно инициирующих в кардиомиоцитах пероксидные реакции [14].
Принимая во внимание ранее представленные данные [13, 14], а также описанные выше изменения метаболических параметров миокарда при инкорпорации 137Cs и учитывая высокую
степень зависимости его электрической активности от реакций энергетического обмена, вполне
логичным представляется изучение влияние радионуклида на ЭКГ параметры животных.
Изучение электрической активности миокарда показало, что ЭКГ параметры контрольных
крыс соответствуют таковым, принятым в научной литературе для интактных животных [24],
а их изменения при инкорпорации 137Cs зависят от дозы внутреннего облучения, определяемой
продолжительностью поступления, уровнем накопления и длительностью воздействия радионуклида.
При накоплении удельной активности радионуклида 170 Бк/кг частота сердечных сокращений (ЧСС) возрастала от 406±13 в контроле до 435±15 уд/мин, тогда как при более продолжительном поступлении и инкорпорации 137Cs до 600 Бк/кг этот показатель достоверно увеличивался до 506±27 уд/мин (см. рисунок).
Таким образом, в среднем ЧСС у экспериментальных
животных при удельной активности 137Cs в 170 и 600 Бк/кг
возрастала соответственно на 34 и 100 уд/мин, или на 7
и 25%. Вполне вероятно, что при этом внутреннее облучение от инкорпорированного радионуклида непосредственно воздействует на аденилатциклазный механизм сердечной мышцы, подобно тому, как это происходит при внешнем лучевом воздействии [28]. Вместе с тем нельзя
исключить и центральный «симпатический» эффект, обусловленный влиянием радионуклида на высшие вегетативные центры головного мозга, где он может активно нака- Изменение частоты сердечных сокраще137
пливаться [25]. В пользу этого предположения свидетель- ний крыс при инкорпорации Cs (n = 30)
65
ус
и
ствуют данные экспериментальных
исследований [26], а также результаты обследования школьников,
Изменение амплитуды зубцов, мм
Зубец
Контроль
проживающих в зоне, где прово170 Бк/кг
600 Бк/кг
дится периодический радиацион1,1±0,2
1,2±0,1
1,3±0,1
P
ный контроль [27]. В результате
4,5±0,1
4,7±0,3
5,4±0,2*
R
реализации указанных механизмов
2,6±0,2
2,9±0,2
3,5±0,3*
T
возможно усиление влияния симпатической нервной системы на
миокард.
При более детальном анализе и оценке ЭКГ опытной группы крыс установлено отсутствие
изменений времени проведения возбуждения от предсердия к желудочкам, на что указывает стабильная продолжительность интервала PQ – надежного интегрального параметра электрической
активности миокарда.
Кроме того, остается неизменной и продолжительность фазы реполяризации, поскольку не
изменяется другой, наиболее важный и информативный параметр ЭКГ – продолжительность
интервала QT, интегрально характеризующий длительность электрической систолы и общую
стабильность миокарда.
В этих условиях на ЭКГ экспериментальных животных возрастают амплитуды зубцов R, P,
T, что свидетельствует об усилении сократительной активности миокарда, вызванной, как уже
отмечалось, возможным влиянием на него симпатической нервной системы (табл. 2).
Согласно представленным данным, при инкорпорации 137Cs с удельной активностью 170
и 600 Бк/кг амплитуда зубца R увеличивается соответственно на 4 и 20%, зубца P – на 9 и 18%,
зубца T – на 12 и 35% от исходного.
Необходимо подчеркнуть, что представленные результаты ЭКГ исследований хорошо согласуются с ранее описанными данными ЭхоКГ исследований, свидетельствующими об усилении
сократительной активности миокарда при данных уровнях инкорпорации радионуклида [14].
Заключение. В ходе исследований установлено наличие высокой чувствительности аэробного энергетического метаболизма миокарда, его электрической активности к действию инкорпорированного 137Cs, обладающего выраженной кардиотропностью, что подтверждает и дополняет
полученные ранее данные, согласно которым вызванные действием данного радионуклида метаболические ультраструктурные и функциональные изменения сердечной мышцы соответствуют
первой (нейрофункциональной) стадии метаболической кардиомиопатии – стадии адаптивной
гиперфункции миокарда [20].
Полученные нами результаты соответствуют представлениям о системной биологии миокарда, согласно которым в норме его метаболизм существует в режиме близкого соответствия спроса и предложения энергии, эффективного сопряжения метаболизма и электрической активности.
При экстремальных состояниях, к каковым можно отнести инкорпорацию 137Cs, система выходит на качественно новый динамический режим с нарушением координации между этими процессами и развитием «метаболической фибрилляции», ведущей к гибели кардиомиоцитов и последующему развитию дисфункции и патологии миокарда [28, 29].
Данная работа выполнена в рамках проекта ГПОФИ «Радиация и экосистемы».
ал
ьн
ая
ак
ад
ем
ия
н
ау
кБ
ел
ар
Т а б л и ц а 2. Изменения амплитуды зубцов R, P, T
на ЭКГ крыс (n = 30) после инкорпорации 137Cs
Литература
ци
он
1. Н и к и ф о р о в А. М. Патология отдаленного периода у ликвидаторов последствий аварии на Чернобыльской АЭС.
СПб., 2002.
2. М а н а к Н. А., Р у с е ц к а я В. Г. // Здравоохранение. 2003. № 1. С. 55–59.
3. Национальный доклад «20 лет после Чернобыльской катастрофы: последствия в Республике Беларусь» / Под ред.
В. Е. Шевчука и В. Л. Гурачевского. Минск, 2006.
4. К а п и т о н о в а Э. К., С о с н о в с к а я Е. Я., К о т о в а О. В. // Радиация и Чернобыль. Ближайшие и отдаленные
последствия: сб. науч. ст. Гомель­, 2007. Т. 4. С. 86–93.
5. А л е к с а н и н С. С. // Вестн. Рос. воен-мед. акад. 2008. № 3 (23). Прил. 1. С. 10–13.
6. V o z i a n o v A., B e b e s h k o V., B a z y k a D. (eds.). Health effects of Chornobyl accident. Kyiv, 2003.
На
66
ус
и
ем
ия
н
ау
кБ
ел
ар
7. К о в а л е н к о А. Н. Пострадиационная эндокринология у участников ликвидации последствий аварии на
ЧАЭС. Киев, 1998.
8. Ч и р к и н А. А., Ц ы к у н о в а И. В., Д о ц е н к о Э. А., Ц ы б и н А. К. Атеросклероз и радиация. Гомель,
1999.
9. Я р м о н е н к о С. П., В а й н с о н А. А. // Радиобиология человека и животных. М., 2004.
10. M a u l i k N., T h i r u n a v u k k a r a s u M. // J. Mol. Cell. Cardiol. 2008. Vol. 44, N 2. P. 219–227.
11. S c h n e i d e r M. D. // J. Mol. Cell. Cardiol. 2008. Vol. 44, N 2. P. 436–439.
12.A n v e r s a P., N a d a l-G i n a r d B. // Nature. 2002. Vol. 415, N 6868. P. 240–243.
13. Г р и ц у к А. И., В е р н е р А. И., М а т ю х и н а Т. Г. и др. // Весці НАН Беларусі. Сер. мед.-біял. навук.
2002. № 2. С. 63–70.
14. Г р и ц у к Н. А., Г р и ц у к А. И., К о н о п л я Е. Ф. // Весцi НАН Беларусі. Сер. мед. навук. 2008. № 2.
С. 105–111.
15. Б и к к у л о в а А. Т., И ш м у р а т о в а Г. М. Биоэлементология s-, p-, d-элементов. СПб., 1999.
16. D a v i s D. G., M u r p h y E., L o n d o n R. E. // Biochemistry. 1988. Vol. 27, N 10. P. 3547–3551.
17. S h e h a n B. P., W e l l a r d R. M., C r a i k D. J., A d a m W. R. // J. Magn. Reson. 1995. Vol. 107, N 2. P. 179–185.
18. S c h o r n a c k P. A., S o n g S. K., L i n g C. S. et al. // Am. J. Physiol. 1997. Vol. 272, N 5. Pt 1. P. C1618–C1634.
19. К о н о п л я Е. Ф., Б а г е л ь И. М., Ш а ф р а н о в с к а я Е. В. // Докл. АН Беларуси. 1996. Т. 40, № 3.
С. 86–89.
20.М у т а ф ь я н О. А. Кардиомиопатии у детей и подростков. СПб., 2003.
21. F a t k i n D. // Physiol. Rev. 2002. Vol. 82. P. 945–980.
22. S a k s V., F a v i e r R., G u z u n R. et al. // J. Physiol. 2006. Vol. 577. P. 769–777.
22. S t a n l e y W. C., R e c c h i a F. A., L o p a s c h u k G. D. et al. // Physiol. Rev. 2005. Vol. 85. P. 1093–1129.
23. G i z u r a r s o n S., L o r e n t z o n M., R å m u n d d a l T. et al. // Europace. 2007. Vol. 9. P. 411–416.
24.L i Y., Neil J., A c k e r m a n J. J. // NMR Biomed. 1995. Vol. 8, N 5. P. 183–189.
25. Д е р е в’ я н к о Л. П. Стан гіпоталамо-гіпофізарно-надниркової та симпато-адреналової систем за умов дії
на організм тварин малих доз іонізувального випромінення та коригування виявлених порушень: автореф. дис. ... д-ра
біол. наук: (03.00.04). Київ, 2007.
26.К и е н я А. И., К и р и ч е н к о О. В., З а и к а Э. М. // Физиология человека. 1998. Т. 24, № 5. С. 106–110.
27. Б у л а н о в а К. Я., Л о б а н о к Л. М., К о н о п л я Е. Ф. Радиация и Чернобыль. Кардиомиоциты и регуляция их функции. Минск, 2008.
28.D r a k e T. A., P i n g P. // J. Lipid Res. 2007. Vol. 48. 1. P. 1–8.
N. А. GRITSUK
ак
ад
MITOCHONDRIAL OXIDATION IN CARDIOMYOCYTES AND RAT
ELECTROCARDIOGRAPHIC PARAMETERS AT 137Cs INCORPORATION
Gomel State Medical University, Belarus
Summary
На
ци
он
ал
ьн
ая
The article considers the influence of incorporation of 170 and 600 Bk/kg 137Cs on indices of mitochondrial oxidation and
electric activity of myocardium of rats. When acted upon by radionuclides, the rat oxygen consumption on endogenous
substrates increases in the presence of glutamate, creatine and dinitrophenol, the deposition of creatine phosphate macroergs
is disturbed, the uncoupling of oxidative phosphorilation is marked. Electrocardiogram changes are shown in the form of
increase in cardiac beat frequency and amplitude of R and T waves. Caused by the incorporation of 137Cs the metabolic and
functional changes of a myocardium correspond to the first (neurofunctional) stage of metabolic cardiomyopathy.
ус
и
ВЕСЦI НА­Ц­Ы Я­НАЛЬ­НАЙ АКА­ДЭМII НА­ВУК БЕ­ЛА­РУСI № 3 2009
ар
СЕ­Р­Ы Я МЕДЫЦЫНСКІХ НА­ВУК
УДК 613.632:577.118:631.8
ел
В. А. ФИЛОНЮК1, Т. И. ПЕТРОВА-СОБОЛЬ1, И. П. СЕМЕНОВ1, Г. В. ПИРОГОВСКАЯ2
1
кБ
ТОКСИКОЛОГИЧЕСКАЯ И ГИГИЕНИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКИ НОВЫХ
КОМПЛЕКСНЫХ УДОБРЕНИЙ С МИКРОЭЛЕМЕНТАМИ
Белорусский государственный медицинский университет, Минск,
2
Институт почвоведения и агрохимии, Минск, Беларусь
ау
(Поступила в редакцию 01.09.2008)
ци
он
ал
ьн
ая
ак
ад
ем
ия
н
В рамках Союзной программы «Повышение эффективности производства и переработки
плодоовощной продукции на основе прогрессивных технологий и техники на 2005–2007 годы»
и Государственной научно-технической программы «Агропромкомплекс – возрождение и развитие села» проведены токсиколого-гигиенические исследования (в объеме первичной токсикологической оценки) шести образцов новых комплексных азотно-фосфорно-калийных удобрений
с микроэлементами.
Цель работы:
1. Определить степень опасности и характер токсического действия новых твердых комплексных азотно-фосфорно-калийных удобрений с микроэлементами при их остром или субхроническом внутрижелудочном поступлении.
2. Экспериментально установить способность новых твердых комплексных азотно-фосфорнокалийных удобрений с микроэлементами к резорбции через неповрежденные кожные покровы
при четырехнедельном эпикутанном воздействии.
3. Определить местнораздражающие свойства новых твердых комплексных азотно-фосфорнокалийных удобрений с микроэлементами.
Организация, объекты и методы исследований. Исследования проведены на базе Центральной научно-исследовательской лаборатории Белорусского государственного медицинского
университета.
Объектами исследований служили лабораторные животные, которых подвергали воздействию шести образцов новых твердых комплексных азотно-фосфорно-калийных удобрений
с микроэлементами, предметом исследований – биологические свойства удобрений.
Изучаемые твердые комплексные азотно-фосфорно-калийные удобрения с микроэлементами – сложные сухие композиции, разработанные РУП «Институт почвоведения и агрохимии»
и полученные в промышленных масштабах ООО «Гринтур» (Минск, Беларусь): бесхлорные удобрения для моркови, капусты, бобовых, марок «Осеннее» и «Калийфос-N», а также хлорсодержащее удобрение для зеленых насаждений.
В опытах использовано два вида лабораторных животных обоего пола – белые крысы линии
Вистар с исходной массой 180–220 г и 2–4-килограммовые кролики породы шиншилла. Животные получены из питомника УО «Белорусский государственный медицинский университет»,
перед экспериментом прошли 2–3-недельный карантин и содержались на стандартном рационе
вивария.
При выявлении биологических эффектов у лабораторных животных на воздействие изучаемых новых бесхлорных удобрений с микроэлементами использовали комплекс высокоинформативных и доступных токсиколого-гигиенических, гематологических, биохимических методов
и приемов, принятых в гигиенической практике. Статистическая обработка данных реализована
на IBM-совместимых персональных компьютерах с применением пакетов прикладных программ
На
68
ус
и
На
ци
он
ал
ьн
ая
ак
ад
ем
ия
н
ау
кБ
ел
ар
для медико-биологических исследований Stadia 3.11 и Microsoft Excel. Определяли средние арифметические величины М, средние квадратические ошибки m, доверительные t-коэффициенты
Стьюдента с предшествующей проверкой нормальности распределения рядов данных в изучаемых выборках [2, 4].
Острая токсичность. Задачей данного этапа исследований являлось определение токсичности шести образцов новых удобрений с микроэлементами и потенциальной опасности острого
отравления ими, а также установление величины среднесмертельной дозы (DL50 – доза, вызывающая гибель 50% лабораторных животных при однократном введении вещества и последующем
14-суточном наблюдении), которая выражается отношением объема вещества (в мг), введенного
в желудок экспериментальных животных с помощью иглы-зонда (DL50 per os) или нанесенного на
неповрежденные кожные покровы (DL50cut), к их массе тела (в кг).
Возможные различия в половой резистентности животных к изучаемому веществу определяли путем формирования в процессе экспериментов равновеликих по содержанию самцов и самок
экспериментальных групп (опытных и контрольных). Об увеличении смертности особей одного
пола судили по увеличению их гибели на 20% по отношению к числу особей другого пола.
Внутрижелудочное поступление. Эксперименты по выявлению токсических свойств новых
удобрений с микроэлементами при внутрижелудочном поступлении проводили на группах половозрелых белых крыс обоего пола численностью по 16 особей каждая (по 8 самцов и самок).
С этой целью голодным (последнее кормление за 24 ч до воздействия) животным опытной группы внутрижелудочно вводили 25%-ные взвеси твердых образцов, которые предварительно измельчали механическим способом до получения однородной порошкообразной массы. Ввиду
возможного наличия у изучаемых удобрений раздражающих свойств на слизистую оболочку
желудка, что могло исказить реальную картину отравления, в качестве растворителя (разбавителя) использовали 1%-ный крахмальный клейстер. Животных контрольных групп подвергали
аналогичному воздействию.
Введения осуществляли дробными дозами с интервалом в 30 мин из расчета 7500 мг чистого
вещества на 1 кг массы животного, кормление животных проводили спустя 3 ч после последнего
введения.
За животными наблюдали ежечасно в первые 8 ч после введения последней дозы препарата,
в последующие 14 сут – ежесуточно, при этом обращали внимание на поведение, состояние,
внешний вид, количество потребляемого корма, уровень водопотребления, степень проявления
реакции на внешние раздражители и другие симптомы интоксикации.
Поступление через кожу. Исследования осуществляли на группах половозрелых белых крыс
обоего пола массой 180–220 г численностью по 8 особей каждая, для чего на выстриженный участок спины площадью 20 см2 (4×5 см) наносили и затем втирали в кожу стеклянной палочкой
массирующими движениями 50%-ную водную взвесь предварительно измельченных твердых
удобрений в дозе 2500 мг/кг. Контрольным животным апплицировали дистиллированную воду
в том же объеме.
Для предотвращения слизывания взвеси животных фиксировали в специальных домиках на
4 ч, после чего остатки препаратов удаляли ватным тампоном, смоченным в дистиллированной
воде. Наблюдение за состоянием животных проводили так же, как и при внутрижелудочном поступлении препарата.
Раздражающее действие. Кожно-раздражающее действие. Изучение раздражающих кожные покровы свойств проводили путем однократных 4-часовых аппликаций водных вытяжек из
шести образцов новых удобрений с микроэлементами на выстриженные участки спины белых
крыс площадью 16 см2 (4×4 см). В опыте использовали самцов с чистой здоровой кожей без механических повреждений.
Предварительно измельченные препараты в виде 50%-ных водных взвесей наносили в стандартной дозе 20 мг/см2. Контролем служили симметрично расположенные на другой стороне
спины «кожные окошки», на которые воздействовали дистиллированной водой в той же дозе.
Оценку функционального состояния кожи на опытном и контрольном участках кожи каждого
животного проводили спустя сутки после аппликации по выраженности отека (нарастанию тол-
69
ус
и
ци
он
ал
ьн
ая
ак
ад
ем
ия
н
ау
кБ
ел
ар
щины кожной складки, измеряемой микрометром типа МК-25, по сравнению с фоном) и по степени выраженности эритемы (визуально с помощью линейки С. В. Суворовой и В. В. Чернышовой). Степень индукции отека и эритемы выражали в баллах согласно приложению 5 Инструкции 1.1.11-12-35-2004 [5], суммировали для каждого животного в отдельности и вычисляли
среднегрупповой общесуммарный балл выраженности кожно-раздражающего действия.
Раздражающее слизистые оболочки действие. Сущность метода основана на регистрации
изменений функционального состояния слизистой оболочки и конъюнктивы глаз лабораторных
животных при внесении определенной дозы испытуемого образца, что адекватно характеризует
опасность его воздействия на слизистые оболочки других органов (полости рта, верхних дыхательных путей, пищеварительного тракта). В качестве лабораторных животных выступали кролики массой 2–4 кг (по 3 кролика на каждый испытуемый образец). В нижний конъюнктивальный свод правого глаза каждого животного инсциллировали дозатором водные 50%-ные взвеси
предварительно измельченных препаратов в объеме 0,05 см3. В левый глаз, который служил контрольным, в том же объеме вносили дистиллированную воду.
Визуальное наблюдение за состоянием слизистой оболочки и конъюнктивы глаз подопытных
животных проводили на протяжении суток с регистрацией признаков раздражения через 1 ч
и ежесуточно в течение последующих двух недель после воздействия, оценивая в баллах для
каждого животного степень выраженности гиперемии, отека и выделений в соответствии с приложением 3 Инструкции 1.1.11-12-35-2004 [5]. В последующем находили среднесуммарный балл
выраженности ирритативного действия.
Токсичность при повторном воздействии. Кумулятивные свойства. Целью изучения кумулятивных свойств являлось определение в эксперименте способности ксенобиотика накапливаться в организме теплокровных животных и оказывать неблагоприятное действие на уровне
смертельных эффектов (материальная кумуляция) или на функциональное состояние ряда органов и систем подопытных животных. Это позволило изучить выраженность кумулятивных
свойств и выявить наиболее поражаемые ксенобиотиком функции, органы и системы организма,
а также уточнить механизмы его токсического действия.
Опыты проводили на белых крысах, которым внутрижелудочно вводили исследуемые образцы удобрений в дозе 0,1 от максимально введенной в остром опыте (750 мг/кг) в течение месяца
(5 раз в неделю). В эксперименте использовали 10%-ные водные взвеси предварительно измельченных твердых удобрений, контрольным животным в адекватных объемах вводили дистиллированную воду.
В ходе эксперимента регистрировали клинические симптомы интоксикации, динамику прироста массы тела, температуру. Через сутки после последнего воздействия проводили сбор мочи
в общеобменных клетках с предварительной водной нагрузкой, составлявшей 2% от массы тела.
Выведение животных из эксперимента методом мгновенной декапитации сопровождалось
забором и макроскопией внутренних органов (легких, сердца, печени, почек, селезенки, желудка), крови, других биологических жидкостей, определением (общепринятыми методами) в них
активности ряда ферментов и содержания некоторых субстратов.
Кожно-резорбтивные свойства. В серии экспериментов оценивали способность новых удобрений с микроэлементами проникать через неповрежденные кожные покровы и вызывать отравления при многократном воздействии.
С этой целью 2/3 хвоста белых крыс на 4 ч 5 раз в неделю в течение месяца погружали в пробирки с 50%-ными водными взвесями препаратов. Хвосты контрольных животных погружали
на то же время в дистиллированную воду. Наблюдение за животными, выведение из эксперимента, забор биологического материала аналогичны таковым при определении кумулятивных
свойств.
Результаты и их обсуждение. Токсичность при внутрижелудочном поступлении. Однократное внутрижелудочное введение белым крысам исследуемых удобрений в дозе 7500 мг/кг не
вызывало гибели лабораторных животных. Непосредственно после введения подопытные и контрольные животные были возбуждены, агрессивны, спустя 5–10 мин возбуждение сменялось некоторым торможением, животные сбивались в угол клетки. В течение всего периода наблюдений
На
70
ус
и
ар
(2 недели) животные всех опытных групп не отличались от контрольных (за исключением повышенного – на 10–15% – водопотребления в первые двое суток после воздействия), охотно поедали корм, были активны, имели гладкий блестящий шерстный покров.
Отсутствие гибели лабораторных животных (как самцов, так и самок) не позволило установить среднесмертельную дозу (DL50 per os>7500 мг/кг, все изученные удобрения относятся к малоопасным веществам IV класса опасности согласно ГОСТ 12.1.007-76 [1]). Половой резистентности к удобрениям не выявлено ни в одном из случаев.
Марка удобрения
для моркови
для капусты
для бобовых
«Калийфос-N»
для зеленых
насаждений
=
=
↓**
↓
↑
↓
↓
↓
↓
↓**
=
↑
↑***
↓
↑
↑
=
↓
↑
↓
↓
↑**
↑
↑
↑
=
↓
↑
↑**
=
↓
↓
↓
↓
↓**
↓
↓***
↑
↑**
↓
=
↓
↓
↑
↓
=
↑
↓
↓
↓
↓
↓
↓
↑
↑
↑
↑
=
=
=
↓***
↑
↓
↑
=
↓
↓
↓
↓***
=
↑
↓*
↓
=
↑
↓
↑
↓
↓
↓
↓
↑
↑
↑*
↑*
кБ
Показатель
ел
Т а б л и ц а 1. Изменения морфофункциональных показателей белых крыс после месячного
внутрижелудочного введения комплексных удобрений с микроэлементами (по сравнению с контролем)
«Осеннее»
Относительные коэффициенты масс внутренних органов
Холестерин, ммоль/л
Глюкоза, ммоль/л
Мочевина, ммоль/л
Хлориды, ммоль/л
Липиды, г/л
Общий белок, г/л
АсАТ, МЕ/л
АлАТ, МЕ/л
Коэф-т де Ритиса
↓
=
↑***
↑
↑
=
↓
↓
↑
↓
↓
↓**
↓
↓***
↓
=
↓
↓
↓**
↓
↓
↓
↓
↓**
ау
↓***
↓
↓*
↓
↓
ем
ия
н
Печень, г/100 г
Сердце, г/100 г
Почки, г/100 г
Легкие, г/100 г
Селезенка, г/100 г
Биохимические показатели крови
↓
↑**
↑**
↑
↑
↑
↑
=
=
↓
↑
↑***
↑
=
↑
↓
↓
↑
↓
↑
↑***
↑
=
↑
↓
↓
↑
ак
ад
Показатели мочевыделительной системы
Диурез, мл
Белок, г/л
Уд. вес белка
Хлориды, ммоль/л
Мочевина, ммоль/л
↑**
↓
↓
↓
↓
↑
↓
↑
↓**
↓***
↑
↓
=
↓
↓
Показатели периферической крови
ая
=
↓
=
↑
=
↑
↓
↓
=
=
=
↑
↑
↑
ци
он
ал
ьн
Гемоглобин, г/л
Эритроциты, ×1012 /л
ЦП, усл. ед.
Лейкоциты:
сегменто-яд., %
сегменто-яд., ×109/л
эозинофилы, %
эозинофилы, ×109/л моноциты, %
моноциты, абс.
лимфоциты, %
лимфоциты, абс.
палочко-яд., %
палочко-яд., абс.
↓**
↓
=
↑
↓*
↓*
=
↑
↓
↓
↑
↑
↑*
↑**
↓*
↓
=
↑
↓
↑
=
↑
=
=
↑
↑
↑
↑
На
П р и м е ч а н и е. * – различий опыта и контроля по критерию Стьюдента нет (Р>0,05), имеется тенденция;
** – различия опыта и контроля по критерию Стьюдента при t>2 (Р<0,05); *** – различия опыта и контроля по критерию Стьюдента при t>3 (Р<0,01); = – разность опыта и контроля менее 2 %; ↓ – понижение, ↑ – повышение более
чем на 2 % по сравнению с контролем. То же для табл. 2.
71
ус
и
ци
он
ал
ьн
ая
ак
ад
ем
ия
н
ау
кБ
ел
ар
Двадцатикратное введение 10%-ных водных взвесей удобрений в дистиллированной воде
в течение месяца (5 раз в неделю) в дозе 750 мг/кг, или 1/10 от максимально введенной дозы,
в остром эксперименте не привело к гибели животных опытных групп, что не позволило рассчитать коэффициент кумуляции.
На протяжении всего эксперимента лабораторные животные охотно поедали корм, были активны, имели гладкий блестящий шерстный покров, поведение особей всех опытных групп не
отличалось от такового особей контрольных. В течение 1–4 недель эксперимента не отмечено
статистически достоверных различий в температуре и массе тела экспериментальных животных, хотя обращает на себя внимание некоторое снижение массы тела животных всех групп после 1–2 недель опыта (что можно объяснить стрессовым воздействием манипуляций по введению растворов), после 3–4 недель – ее увеличение до конца наблюдения.
В то же время установлено негативное влияние удобрений на состояние лабораторных животных, о чем свидетельствуют статистически значимые различия некоторых показателей состояния организма опытных и контрольных белых крыс (табл. 1).
Изменения, наблюдаемые нами в организме лабораторных животных опытных групп после
20-кратного внутрижелудочного введения удобрений в дозе 750 мг/кг, носили полиорганный
и полисистемный характер. Гемотоксическое действие удобрений, в основном на красный росток, проявлялось в снижении или в тенденции к снижению в периферической крови гемоглобина, при этом снижение относительного коэффициента массы (ОКМ) селезенки (как органа, участвующего в кроветворении теплокровных животных) и сердца расценено нами как компенсаторное в ответ на кислородное голодание тканей.
О нарушении работы мочевыделительной системы свидетельствуют снижение (в опытах
с удобрениями для капусты и «Калийфос-N» – достоверное) ОКМ почек, полиурия, накопление
азотсодержащих продуктов белкового обмена (мочевины) в крови, а также нарушение концентрационной функции почек, проявляющееся снижением концентрации мочевины и хлоридов
в моче.
Кожно-раздражающее и кожно-резорбтивное действие. Однократные аппликации на выстриженные участки кожи спины белых крыс площадью 20 см2 водных взвесей удобрений в дозе
2500 мг/кг не приводили к возникновению клинических симптомов интоксикации на протяжении всего эксперимента, подопытные животные оставались активными, охотно поедали корм.
Гибели животных не зарегистрировано ни в одном из случаев, что позволило классифицировать
по опасности вызывать острые отравления при эпикутанном воздействии все шесть образцов
удобрений как малоопасные вещества IV класса опасности согласно ГОСТ 12.1.007-76
(DL50 cut >2500 мг/кг) [1].
При однократных аппликациях 50%-ных водных взвесей удобрений на неповрежденные
участки кожи белых крыс площадью 16 см2 в дозе 20 мг/см2 не выявлено признаков раздражения
кожных покровов (эритемы и отека). Среднегрупповой общесуммарный балл выраженности
кожно-раздражающего действия составил 0 баллов в каждом случае, все шесть образцов по выраженности местного раздражающего кожу действия отнесены к 0 классу опасности согласно
приложению 6 к Инструкции 1.1.11-12-35-2004 [5].
Двадцатикратные погружения 2/3 хвоста белых крыс в 50%-ные водные взвеси удобрений
в течение месяца (5 раз в неделю) не вызывали гибели животных опытных групп, что свидетельствует об отсутствии резорбции через неповрежденную кожу массивных доз препаратов, которые могли бы привести к летальным исходам. На 2–3-й неделях опыта отмечены некоторая сухость, шелушение кожи на месте аппликаций, что может указывать на потенциальные кожнораздражающие свойства изученных удобрений при многократных нанесениях.
В ходе проведения исследований экспериментальные животные охотно поедали корм, были
активны, имели гладкий блестящий шерстный покров, поведение особей всех опытных групп не
отличалось от такового особей контрольных. На 1–4-й неделях эксперимента не отмечено статистически достоверных различий в температуре и массе тела лабораторных животных опытных
и контрольных групп, при этом динамика этих показателей в основном повторяла таковую при
субхроническом внутрижелудочном воздействии.
На
72
ус
и
ар
В то же время имело место проникновение некоторого количества удобрений через кожные
покровы и их отрицательное влияние на функционирование внутренних органов и систем организма лабораторных животных, на что указывают достоверные по сравнению с контролем изменения отдельных морфофункциональных показателей (табл. 2). В подавляющем большинстве
случаев такие изменения (хотя и менее выраженные) носили однонаправленный характер, что
подтверждает главенствующую роль продуктов резорбции удобрений в нарушении работы кроветворной и мочевыделительной систем.
ел
Т а б л и ц а 2. Изменения морфофункциональных показателей белых крыс после месячного нанесения
комплексных удобрений с микроэлементами на хвосты лабораторных животных (по сравнению с контролем)
для моркови
для бобовых
«Осеннее»
Относительные коэффициенты масс внутренних органов
=
↓
↓
↓
↓
↓
=
↓
↓**
↓**
↓
↓
=
↓
↓
=
↓
↓***
↓
↓
Биохимические показатели крови
=
=
=
=
↑
↑
↑
↑**
↑
↑
↑**
↑**
↑
↑
=
=
↓
↓
=
=
↑
↓
=
↑
=
=
=
=
↓
↓
↓
↓
↑
=
=
=
Показатели мочевыделительной системы
↑
↑
↑
↑
↓
↓
↓
=
=
↓
=
↓
↑
↓
↓
↓
↓
↓
↓
↓
Показатели периферической крови
=
↓
=
↓
=
↓
↓
↓
=
=
=
=
=
↑
=
=
=
↓
↓
↓
=
=
↓
↓
↑
↑
↑
↑
=
=
↓
=
↓
↑
↑
↑
=
↑
=
↑
=
=
=
=
=
↑
↑
«Калийфос-N»
для зеленых
насаждений
↑
↑
↓
=
↑
↓
↓
↓
↓
↓
=
↑
↑
↓
↑
=
↑*
↑
↑
↓
↑
=
=
↑
↑
=
=
↓
↓
↑
↓
=
↓
↓
↓
=
↓
=
=
=
↓
↓
=
↓
↓
=
↓
ал
ьн
Гемоглобин, г/л
Эритроцты,×1012/л
ЦП, у. е.
Лейкоциты:
сегменто-яд., %
сегменто-яд., ×109/л
эозинофилы, %
эозинофилы, ×109/л
моноциты, %
моноциты, ×109/л
лимфоциты, %
лимфоциты, ×109/л
ак
ад
Диурез, мл
Белок, г/л
Уд. вес белка
Хлориды, ммоль/л
Мочевина, ммоль/л
ая
Холестерин, ммоль/л
Глюкоза, ммоль/л
Мочевина, ммоль/л
Хлориды, ммоль/л
Липиды, г/л
Общий белок, г/л
АсАТ, МЕ/л
АлАТ, МЕ/л
Коэф-т де Ритиса
ем
ия
н
ау
Печень, г/100 г
Сердце, г/100 г
Почки, г/100 г
Легкие, г/100 г
Селезенка, г/100 г
для капусты
кБ
Марка удобрения
Показатель
ци
он
палочко-яд., %
палочко-яд., ×109/л
↑
↑
↑
↑
↑
↑
=
=
=
=
=
=
=
=
↑
↑
↑
=
=
↓
↓
↓
=
=
=
↓
↓
На
Ирритативное действие. Однократные инстилляции 50%-ных водных взвесей удобрений
на следующие сутки после воздействия приводили к возникновению минимального количества
выделений в углу глаза 33% кроликов, взятых в эксперимент. Среднесуммарный балл выражен73
ус
и
Литература
кБ
ел
ар
ности ирритативного действия составил 0,33 балла, что позволило отнести каждое изученное
удобрение к I классу веществ по выраженности указанного действия. Симптомы раздражения
слизистой оболочки глаз исчезли через 48 ч после инстилляций.
Таким образом, твердые бесхлорные комплексные азотно-фосфорно-калийные удобрения
с микроэлементами для моркови, капусты, бобовых, марок «Осеннее», «Калийфос-N» и хлорсодержащее удобрение для зеленых насаждений не представляют опасности в плане вероятности
острого отравления при их внутрижелудочном и чрескожном поступлении (относятся к веществам IV класса опасности согласно ГОСТ 12.1.007–76), обладают кумулятивными и кожнорезорбтивными свойствами на уровне функциональных эффектов в субхроническом эксперименте с преимущественным поражением мочевыделительной и кроветворной систем, при однократном воздействии не раздражают кожные покровы, слабо раздражают слизистые оболочки;
половой резистентности к удобрениям не имеется.
ем
ия
н
ау
1. Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности: ГОСТ 12.1.007-76.
2. М е р к о в А. М., П о л я к о в Л. Е. Санитарная статистика. Л., 1974.
3. Оценка воздействия вредных химических веществ на кожные покровы и обоснование предельно допустимых
уровней загрязнений кожи (инструкция): утв. МЗ РБ 14.11.2005 г.
4. Р о к и ц к и й П. Ф. Биологическая статистика. Минск, 1973.
5. Требования к постановке экспериментальных исследований для первичной токсикологической оценки и гигиенической регламентации веществ (инструкция): утв. МЗ РБ 14.12.2004 г.
V. A. FILANYUK 1, Т. I. PIATROVA-SOBAL 1, I. P. SIAMIONAU 1, G. V. PIRAGOVSKAYA 2
ТOXICOLOGICAL AND HYGIENIC CHARACTERISTICS
OF NEW COMPLEX FERTILIZERS WITH MICROELEMENTS
1
Belarusian State Medical University, Minsk,
Institute of Soil Science and Agrochemistry, Minsk, Belarus
ак
ад
2
Summary
На
ци
он
ал
ьн
ая
Complex solid nitrogen-phosphorus-potassium chlorine-free fertilizers with microelements for carrot, cabbage, leguminous plant, “Osenneye”, “Kaliyfos-N” and chlorine-containing fertilizers for green plantations show no acute poisoning danger if ingested or in case of percutaneous intervention (substances of class IV danger according to GOST 12.1.007–76), do not
possess sex resistance but demonstrate cumulative and dermo-resorptive properties through subchronic experimental functional effects with predominant impairment of urinary and hematopoietic systems, cause slight irritations of mucous membranes and none of skin at single exposure.
ар
СЕ­Р­Ы Я МЕДЫЦЫНСКІХ НА­ВУК
ус
и
ВЕСЦI НА­Ц­Ы Я­НАЛЬ­НАЙ АКА­ДЭМII НА­ВУК БЕ­ЛА­РУСI № 3 2009
УДК 616.832-004.2:612.017
ел
Д. Б. НИЖЕГОРОДОВА1, М. Ю. КОЛОБОВА1, С. С. БАГАТКА1, Г. И. ИВАНЧИК1,
Я. М. МОТУЗОВА 2, М. М. ЗАФРАНСКАЯ1
1
кБ
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЙ АУТОИММУННЫЙ ЭНЦЕФАЛОМИЕЛИТ
И ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА Т-ЛИМФОЦИТОВ
Белорусская медицинская академия последипломного образования, Минск,
2
Белорусский государственный медицинский университет, Минск
ау
(Поступила в редакцию 29.04.2009)
На
ци
он
ал
ьн
ая
ак
ад
ем
ия
н
Введение. Экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит (ЭАЭ) представляет собой
модель заболевания, характеризующую клинические, нейропатологические и иммунологические процессы, развивающиеся при рассеянном склерозе (РС) у человека [1–3]. Впервые ЭАЭ
был разработан Koritschoner и Schweinburg (1925) на кроликах, затем Rivers и соавт. (1933) адаптировали модель для приматов, а впоследствии ее усовершенствовали Morgan и Kabat (1947),
методические подходы которых послужили основой для создания других экспериментальных
моделей органо-специфической патологии [4, 5].
ЭАЭ индуцируется у многих видов животных путем иммунизации гомогенатом центральной нервной системы (ЦНС), а также миелиновыми белками либо выделенными из них пептидами, однако с 1950-х годов предпочтение отдается моделированию на лабораторных мышах
и крысах. Преимуществом создания ЭАЭ на крысах является однократное введение иммуногенной смеси, отсутствие потребности использования дополнительных адъювантных компонентов
(Pertussis toxin) и высокая воспроизводимость заболевания [6].
Патогенез ЭАЭ характеризуется острым паралитическим CD4+Тh1-медиированным воспалительным процессом, иммунный ответ при котором направлен против собственных антигенных компонентов миелина ЦНС: основного белка миелина (ОБМ), протеолипидного протеина
(ПЛП) и миелин-олигодендроцитарного глигопротеина (МОГ) [7]. Существенный прогресс
в воспроизведении патологического процесса и клинической картины при ЭАЭ, наиболее схожей
с РС у человека, был достигнут при изучении МОГ в качестве ключевого миелинового аутоантигена. Уникальность МОГ заключается в том, что это единственный протеин, индуцирующий не
только энцефалитогенный Т-клеточный иммунный ответ, но и ответ демиелинизирующих аутоантител, усиливающих тяжесть заболевания и инициирующих более обширную демиелинизацию при клеточно-опосредованном иммунном процессе в ЦНС [8].
В последние годы большое внимание уделяется изучению роли γδТ-лимфоцитов в иммунопатогенезе РС. Эта популяция лимфоцитов является минорным пулом Т-клеток периферической
крови и доминирует в слизистых оболочках организма [9, 10]. γδТ-лимфоциты, в которых комбинируются свойства клеток врожденного и приобретенного иммунитета, экспрессируют
γδCD3 +CD4-CD8± фенотип в сочетании с различными NK-рецепторами (NKG2D, CD94) и обладают многообразными биологическими функциями, включающими как регуляцию иммунного
ответа и поддержание антигенного гомеостаза, так и эффекторные реакции, опосредуемые механизмами цитотоксичности [11–13].
Изучение функциональных особенностей Т-лимфоцитов у животных с ЭАЭ позволит оценить механизмы клеточной активации, миграции и пролиферации, а также нарушения или изменения функционирования регуляторных клеток, контролирующих энцефалитогенный ответ
Т-лимфоцитов in vivo. Выявление закономерностей функционирования Т-лимфоцитов не только
75
ус
и
ци
он
ал
ьн
ая
ак
ад
ем
ия
н
ау
кБ
ел
ар
в циркуляции, но и в периферических лимфоидных органах впоследствии будет способствовать
определению эффективности разнообразных иммунорегуляторных стратегий лечения развившегося аутоиммунного заболевания ЦНС.
Цель исследования – изучение возможности использования ЭАЭ для оценки функционального состояния Т-лимфоцитов.
Материалы и методы исследования. Материалом для исследования послужили мононуклеары периферической крови (МПК), подмышечных и подколенных лимфатических узлов
(МЛУ), тимуса, селезенки и тонкого кишечника лабораторных крыс линии Wistar с развившимся ЭАЭ и контрольной группы животных.
Моделирование и оценка ЭАЭ. В ходе эксперимента 61 лабораторная крыса линии Wistar женского пола массой 150–180 г была проиммунизированна подкожно с двух сторон основания хвоста 0,3–0,4 мл иммуногенной смеси, которая была приготовлена из 100–133 мг гомогената крысиного спинного мозга, проэмульгированного в полном адъюванте Фрейнда с содержанием Mycobacterium tuberculosis в концентрации 5 мг/мл. Крысам контрольной группы (n = 12)
аналогичного пола и возраста было введено 0,4 мл физраствора.
Лабораторных животных взвешивали и мониторировали ежедневно. Клиническую картину
ЭАЭ оценивали по 6-балльной шкале в соответствии с международными критериями: 0 – отсутствие симптомов; 0,5 – частичная потеря тонуса хвоста; 1 – парез хвоста; 2 – паралич хвоста; 2,5 –
парез задних конечностей; 3 – паралич задних конечностей; 4 – полный паралич задних и парез
передних конечностей; 5 – паралич передних и задних конечностей, состояние агонии; 6 – смерть
[14].
Выделение мононуклеарных клеток из периферической крови и лимфоидных органов. На 12–
14-е сутки после иммунизации животные были умерщвлены путем инъекции 10%-ного раствора тиопентала натрия. Периферическая кровь, тимус, селезенка, тонкий кишечник, подмышечные и подколенные лимфоузлы были выделены и прогомогенезированы, после чего методом
центрифугирования клеточной суспензии на градиенте плотности (Histopaque, Sigma, Германия)
в течение 30 мин были получены мононуклеары из различных органов и тканей.
Культуральный метод. МПК и МЛУ засевали в 96-луночный планшет в концентрации 2·105
клеток на лунку и инкубировали в полной культуральной среде, содержавшей RPMI-1640
c 25 мМ HEPES, 2 мМ L-глютамина, 1% антибиотика, 10% инактивированной эмбриональной
телячьей сыворотки, 1% инактивированной крысиной сыворотки (Sigma, Германия), в течение
3 сут в присутствии 1 мкг/мл конканавалина А (КонA, Sigma, Германия) в увлажненной атмосфере с 5% СО2 при 37 °С.
Для оценки пролиферативного ответа МПК был использован цитофлуорометрический метод
внутриклеточного окрашивания карбоксифлуоресцеином (СFSE, Sigma, Германия). МПК в концентрации 1·107 кл/мл окрашивали CFSE (7 мкМ) в 1 мл культуральной среды RPMI-1640 в течение 5 мин в темноте при комнатной температуре. После остановки реакции путем отмывания
в полной культуральной среде МПК культивировали в 96-луночном планшете в концентрации
2·105 клеток на лунку в течение 3 сут в присутствии 1 мкг/мл КонA и в течение 6 сут в присутствии синтетических пептидов: 10 мкг/мл крысиного миелин-олигодендроцитарного гликопротеина (MOГ35–55, Sigma, Германия) или коктейля миелиновых пептидов (MOГ35–55, основной белок миелина (ОБМ83–99), протеолипидный протеин (ПЛП183–209)) (Sigma, Германия) в конечной
концентрации 10 мкг/мл каждого пептида.
Проточная цитофлуориметрия. После выделения мононуклеарных клеток из периферической крови и лимфоидных органов или после 3- и 6-суточного культивирования МПК и МЛУ
клеточную суспензию окрашивали 5 мкл моноклональных антител к γδТ-клеточному рецептору
(γδТСR[V65]-PE, Abcam, Англия) или негативным контролем антител и инкубировали при комнатной температуре в темноте в течение 15 мин. Регистрацию данных проводили на проточном
цитофлуориметре FC500 (BeckmanCoulter, США).
Статистический анализ. Статистическую обработку данных проводили с помощью пакета
программ Statistica 6.0. Достоверность различий определяли, используя непараметрические критерии Вилкоксона (в случае зависимых переменных) и Манна–Уитни (в случае независимых пе-
На
76
ус
и
ар
ел
кБ
Рис. 1. Клиническая картина ЭАЭ (n = 25): а – паралич задних конечностей (3 балла) у крысы линии Wistar; б – динамика клинических симптомов ЭАЭ
ьн
ая
ак
ад
ем
ия
н
ау
ременных). Корреляционный анализ выполняли путем определения коэффициентов корреляции
по Спирмену. Результаты считали достоверными при уровне значимости P < 0,05; P < 0,01;
P < 0,001 и представляли в виде медианы (25–75-й процентили).
Результаты и их обсуждение. Моделирование ЭАЭ у лабораторных крыс линии Wistar. ЭАЭ
был индуцирован методом активной подкожной иммунизации животных иммуногенной смесью
в пяти независимых экспериментах. В ходе отработки экспериментальной модели был разработан протокол приготовления иммуногенной смеси и подобрана оптимальная доза иммуногена,
которая составила 100–133 мг чистого гомогентата спинного мозга, что эквивалентно 300–
400 мкл иммуногенной смеси, для создания выраженной клинической картины ЭАЭ у лабораторных крыс.
Первые признаки клинической картины ЭАЭ (потеря тонуса или парез хвоста) были отмечены у 60% лабораторных крыс из всех проиммунизированных животных на 9–10-е сутки после
иммунизации. На 13–14-е сутки у крыс развивался полный паралич хвоста (2 балла), парез задних конечностей (2,5 балла), паралич задних конечностей (3 балла) и парез передних конечностей (4 балла). У 3 животных была зарегистрирована тетраплегия и агония (5 баллов). Ухудшение состояния лабораторных крыс с ЭАЭ сопровождалось резкой потерей массы тела (снижение
веса на 30 г в течение 3–4 сут). Средняя степень выраженности клинических признаков составила 3 балла. Динамика развития клинических симптомов представлена на рис. 1. Крыс с бессимп­
томным течением ЭАЭ (40%) из дальнейших исследований исключали. После развития выраженной клинической картины (12–14-е сутки) животных выводили из эксперимента.
Распределение γδТ-лимфоцитов и их функциональная активность в лимфоидных органах
и тканях. Для изучения распределения γδТ-лимфоцитов в лимфоидных органах животных были
выделены мононуклеары из периферической крови, тимуса, селезенки, тонкого кишечника, подмышечных и подколенных лимфатических узлов. Наибольшее процентное содержание γδТлимфоцитов у крыс с ЭАЭ и здоровых животных определялось среди внутриэпителиальных
лимфоцитов тонкого кишечника. В остальных лимфоидных органах γδТ-клетки присутствовали
в незначительном количестве, при этом наименьшее процентное содержание данной популяции
лимфоцитов было отмечено в периферической крови и тимусе лабораторных животных (табл. 1).
ал
Т а б л и ц а 1. Количество γδТ-лимфоцитов в периферической крови и лимфоидных органах у крыс с ЭАЭ
(n = 25) и у здоровых животных (n = 12)
Ткань/орган
ци
он
Периферическая кровь
Лимфатические узлы
Тимус
Селезенка
Тонкий кишечник
Крысы с ЭАЭ, %
Здоровые крысы, %
0,30(0,15–0,42)**
2,04(1,85–2,70)*
0,90(0,67–1,50)
1,70(1,20–2,50)
42,0(33,0–52,0)
0,75(0,68–0,80)
1,50(1,17–1,61)
0,89(0,63–1,25)
1,93(1,40–2,65)
39,5(22,5–54,0)
На
П р и м е ч а н и е. Достоверность (* – P < 0,05; ** – P < 0,01) указана по отношению к данному показателю у здоровых крыс.
77
ус
и
ци
он
ал
ьн
ая
ак
ад
ем
ия
н
ау
кБ
ел
ар
Полученные результаты о количественном распределении γδТ-лимфоцитов среди лимфоидных органов крыс линии Wistar согласуются с литературными данными об онтогенетическом
развитии данной популяции клеток в организме животных [15]. Большинство γδТ-лимфоцитов
развивается экстратимически в слизистых оболочках желудочно-кишечного тракта, и их количество может достигать 65%. После созревания γδТ-клетки выполняют функцию локального иммунологического надзора в слизистых оболочках организма, но могут также мигрировать, заселяя другие периферические лимфоидные органы. Небольшое количество γδТ-лимфоцитов развивается и созревает в тимусе. Предполагают, что именно γδТ-клетки тимического происхождения
впоследствии мигрируют в периферическую кровь, чем объясняется их минимальное содержание среди циркулирующих Т-лимфоцитов и тимоцитов.
У больных и здоровых крыс достоверные изменения в количестве γδТ-лимфоцитов были обнаружены только в периферической крови и лимфатических узлах. У крыс с ЭАЭ отмечалось
достоверное снижение содержания γδТ-лимфоцитов среди МПК по сравнению со здоровыми животными. При этом у заболевших животных наблюдалось достоверное увеличение уровня γδТлимфоцитов среди мононуклерных клеток лимфатических узлов по сравнению с таковым в контрольной группе (табл. 1).
Для характеристики степени компартментализации популяции γδТ-лимфоцитов был рассчитан коэффициент распределения (отношение количества γδТ-клеток среди МЛУ к количеству
γδТ-клеток среди МПК). Показано, что у крыс с ЭАЭ данный коэффициент составил 8,9(5,5–13,3),
что в 4,5 раза превышало аналогичный показатель (1,99(1,58–2,45)) контрольной группы животных (P < 0,001). Кроме того, коэффициент распределения γδТ-лимфоцитов у крыс с ЭАЭ положительно коррелировал с тяжестью индуцированного заболевания (R = 0,51; P < 0,01).
Таким образом, у заболевших животных наблюдалось перераспределение γδТ-лимфоцитов
из циркуляции в лимфатические узлы, где осуществляется инициация и развитие специфического иммунного ответа. Корреляционная взаимосвязь компартментализации γδТ-клеток в организме с тяжестью клинической картины у крыс с индуцированным ЭАЭ свидетельствует о возможном вовлечении данной популяции клеток в иммунопатогенез заболевания, что может являться
важным лабораторным диагностическим критерием развития патологического процесса.
Антиген-специфический и неспецифический пролиферативный ответ МПК у крыс с ЭАЭ.
Для определения функциональной активности МПК и МЛУ, большинство которых являются
Рис. 2. Пролиферация МПК в ответ на МОГ35–55, коктейля пептидов и КонА у крысы с ЭАЭ
и у здорового животного
На
78
ус
и
ак
ад
ем
ия
н
ау
кБ
ел
ар
αβТ-лимфоцитами, у крыс с ЭАЭ и у животных контрольной группы был использован общепринятый подход оценки пролиферативного ответа путем культивирования клеток в присутствии
неспецифического митогена КонА в течение 3 сут и предполагаемых аутоантигенов – MOГ35–55
и пептидного коктейля – в течение 6 сут. Пролиферативная активность МПК была изучена цитофлуориметрическим методом внутриклеточного окрашивания CFSE, основанном на стабильном поглощении лимфоцитами флуоресцентного красителя, который «теряется» клетками пропорционально числу клеточных делений. При количественной оценке пролиферации методом
проточной цитофлуориметрии в соответствии с распределением МПК по своим размерам и гранулярности были установлены границы популяции лимфоцитов, в пределах которой регистрировали CFSEhigh-клетки (неподелившиеся лимфоциты) и CFSElow-клетки (поделившиеся клетки).
На рис. 2 представлен типичный пролиферативный ответ МПК на аутоантигены и митоген КонА
больной и здоровой крысы.
Полученные результаты оценки антиген-специфической и антиген-неспецифической пролиферации лимфоцитов периферической крови заболевших и здоровых животных показали, что у
крыс с ЭАЭ после 3-суточного культивирования наблюдается повышение уровня спонтанной
пролиферации лимфоцитов периферической крови в 2,4 раза (P < 0,05) относительно контрольной группы, который сохраняется и после 6-суточного культивирования, что подтверждается
многочисленными исследованиями об особенностях предактивационного состояния МПК при
аутоиммунных процессах [2, 5].
Оценка миелин-специфического ответа МПК здоровых животных не показала достоверных
изменений в количестве поделившихся лимфоцитов, культивируемых в присутствии как крысиного МОГ35–55, так и коктейля синтетических миелиновых пептидов (табл. 2). Неожиданным
оказалось отсутствие антиген-специфической пролиферации лимфоцитов в ответ на энцефалитогенные миелиновые пептиды в группе крыс с выраженной клинической картиной ЭАЭ (табл. 2).
В то же время при культивировании МПК в присутствии митогена как в опытной, так и в контрольной группе животных установлено достоверное увеличение количества поделившихся
CFSElow-лимфоцитов в ответ на КонА относительно спонтанной пролиферации (59,4%(47,4–
69,4%) и 57,4%(48,2–68,8%) у здоровых и заболевших крыс соответственно, P<0,001), что свидетельствует о высоком пролиферативном потенциале.
Т а б л и ц а 2. Количество поделившихся CFSElow-лимфоцитов среди МПК и МЛУ, культивируемых
в присутствии аутоантигенов у крыс с ЭАЭ и у здоровых животных
Клеточные культуры
МПК
Культуральная среда, %
MOГ35-55, %
Коктейль пептидов, %
Здоровые (n = 12)
ЭАЭ (n = 15)
Здоровые (n = 12)
ЭАЭ (n = 15)
8,58(6,86–10,5)
17,4(15,2–26,7)
2,58(1,56–3,08)
2,88(2,34–3,86)
10,5(8,33–15,2)
19,2(13,1–28,9)
3,25(1,24–5,30)
2,66(2,25–3,12)
9,21(7,52–13,8)
21,4(15,5–28,3)
3,31(2,24–4,44)
3,75(2,80–4,38)
ая
МЛУ
Группы животных
На
ци
он
ал
ьн
Аналогичные результаты были получены при исследовании миелин-специфической пролиферативной активности МЛУ заболевших животных, которая характеризовалась низким количеством поделившихся CFSElow-лимфоцитов в ответ на крысиный МОГ35–55 и коктейль синтетических миелиновых пептидов (табл. 2).
Наряду с этим в группе крыс с развившимся ЭАЭ была установлена достоверная обратная
корреляционная связь между количеством поделившихся МПК в ответ на миелиновые пептиды
и степенью выраженности клинических симптомов ЭАЭ. С увеличением тяжести клинической
картины отмечалось снижение in vitro пролиферативной способности МПК в ответ на синтетический пептид МОГ35–55 (R = –0,6; P < 0,05).
Согласно литературным данным, в сенсибилизированном организме снижение пролиферативного ответа на специфические антигены может происходить вследствие процессов
активационно-индуцированного апоптоза [17]. Для объяснения полученных результатов была
изучена жизнеспособность культивируемых клеток. Так, было установлено, что в присутствии
аутоантигенов пролиферация МПК обратно пропорционально коррелирует с количеством жи79
ус
и
ал
ьн
ая
ак
ад
ем
ия
н
ау
кБ
ел
ар
вых клеток (R = –0,64; P < 0,05). Таким образом, низкий уровень миелин-индуцированной пролиферации мононуклеарных клеток у крыс с более выраженной клинической картиной заболевания ЭАЭ не коррелировал с активационно-индуцированным апоптозом.
В последнее время обсуждается вопрос эффективности использования ЭАЭ для оценки
антиген-специфической пролиферации клеток [5, 6, 18]. Основным недостатком данной экспериментальной модели является невозможность воспроизведения полноценного течения заболевания, которое имело бы максимальное гистопатологическое и клиническое сходство с РС у человека. ЭАЭ представляет собой модель острого воспаления, в то время как РС характеризуется
медленной дегенерацией аксонов и в развитии заболевания большую роль играют процессы невоспалительного характера. Спорным является вопрос взаимосвязи воспаления и нейродегенерации. Это подтверждает и тот факт, что из 4 выявленных форм демиелинизации при РС только
2 формы схожи с ЭАЭ, а 2 коррелируют больше с вирус- или токсин-опосредованным повреждением, чем с клеточно-медиированной цитотоксичностью [18]. Кроме того, причиной может быть
то, что РС представляет собой генетически обусловленное спонтанное заболевание, в то время
как ЭАЭ индуцируется путем активной иммунизации антигенов ЦНС на здоровом организме
животного. Если при развитии РС не установлено, каким образом происходит срыв толерантности к собственным антигенам организма, то при индукции ЭАЭ толерантность целенаправленно
нарушается путем иммунизации аутоантигенами в составе полного адъюванта Фрейнда. Компоненты адъюванта (минеральные масла и инактивированные Mycobacteria tuberculosis) активируют TLRs и повышают экспрессию костимулирующих молекул на антиген-презентирующих
клетках, что способствует развитию напряженного миелин-специфического иммунного ответа,
сила которого несопоставима с таковой в нормальных физиологических условиях, а также при
инфекционных заболеваниях. Тот факт, что большинство крыс выздоравливают на 18–20-е сутки после иммунизации, предполагает лишь временное избежание внутренних механизмов иммунорегуляции, которые впоследствии начинают функционировать и супрессируют развившуюся органо-специфическую аутоагрессию [5, 6].
Заключение. На протяжении многих лет ЭАЭ является основной моделью для изучения иммунопатогенеза и разработки специфической терапии РС. Очевидные ограничения использования ЭАЭ в качестве полноценной модели заболевания сужают спектр возможностей исследователей в одних областях, однако не отрицают ее эффективности в других.
По нашим результатам, использование ЭАЭ не совсем адекватно для полноценной характеристики миелин-специфического ответа Т-лимфоцитов периферической крови, так как пролиферативный ответ мононуклеарных клеток на аутоантигены не коррелирует с клинической картиной и не объясняется апоптотической гибелью лимфоцитов. В то же время получены новые данные, демонстрирующие результативность применения модели ЭАЭ для изучения количественных
и функциональных характеристик γδТ-лимфоцитов у лабораторных крыс. Установленное перераспределение γδТ-клеток у животных с ЭАЭ, характеризующее их активную миграцию во вторичные лимфоидные органы, и сохранение функционального потенциала отражает возможное
вовлечение этих клеток в формирование миелин-специфического аутоиммунного ответа и может служить ценным прогностическим маркером лабораторной диагностики аутоиммунной патологии ЦНС. Детальное изучение количественных и функциональных особенностей γδТлимфоцитов при ЭАЭ в перспективе позволит рассматривать эту популяцию клеток в качестве
новой терапевтической мишени для улучшения подходов к лечению РС у человека.
Литература
ци
он
1. L u d w i n S. // J. Neuropathol. Exp. Neurol. 2006. N 65. P. 305–318.
2. S t e i n m a n L., Z a m v i l S. // Ann. Neurol. 2006. N 60. P. 12–21.
3. C o m p s t o n A. // Acta Neurol. Scand. 2006. N 183. P. 41–47.
4. G o l d R., L i n i n g t o n C., L a s s m a n n H. // Brain. 2006. P. 1–19.
5. H o h l f e l d R., W e k e r l e H. // Curr. Opin. Neurol. 2001. N 14. P. 299–304.
6. H o l m o y Т. // Acta Neurol. Scand. 2007. N 115. P. 39–45.
7. K u c h r o o V. et al. // Annu. Rev. Immunol. 2002. N 20. P. 101–123.
8. H a f l e r D. // J. of Clin. Invest. 2004. N 6. P. 788–794.
На
80
ус
и
ар
ел
9. D y u g o v s k a y a L. // Immunology. 2003. N 108. P. 129–136.
10. K a b e l i t z D. et al. // Int. Arch. Aller. Immunol. 2005. N 137. P. 73–81.
11. K r o n e n b e r g M., H a v r a n W. // Immunol. Rev. 2007. N 215. P. 5–7.
12. M o s e r B., E b e r l M. // Immunol. Rev. 2007. N 215. P. 89–102.
13. N a n n o et al. // Immunol. Rev. 2007. N 215. P. 103–113.
14. Z a f r a n s k a y a M. еt al. // Immunology. 2007. Vol. 121, N 1. P. 29–39.
15. K u n h l e i n P. et al. // Development. Immunol. 1995. N 4. P. 181–188.
16. R a m a n a t h a n S. et al. // J. of Immunol. 2002. N 168. P. 2182–2187.
17. S o s p e d r a M., M a r t i n R. // Annu. Rev. Immunol. 2005. N 23. P. 683–747.
18. S r i r a m S., S t e i n e r I. // Ann. Neurol. 2005. N 58. P. 939–945.
кБ
D. B. NIZHEHARODAVA1, M. J. KOLOBOVA1, S. S. BAGATKA1, G. I. IVANCHIK1, J. M. MOTUZOVA 2,
М. М. ZAFRANSKAYA1
EXPERIMENTAL AUTOIMMUNE ENCEPHALOMYELITIS AND T-LYMPHOCYTES FUNCTIONAL
CHARACTERISTICS
1
Summary
ау
Belarusian Medical Academy of Postgraduate Education, Minsk,
2
Belarusian State Medical University, Minsk
На
ци
он
ал
ьн
ая
ак
ад
ем
ия
н
Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is an animal model of organ-specific autoimmune pathology of the
central nervous system used for investigation of multiple sclerosis immunopathogenetic mechanisms and treatment. Recently,
γδT-lymphocytes with a wide range of biological functions have been actively studied.
The γδT-lymphocytes distribution to secondary lymphoid organs by EAE is shown. It defines the γδT-cells involvement
into pathogenesis and can be used as a prognostic marker of disease laboratory diagnosis. There is no correlation of T-cells
proliferative response to potential autoantigen with the clinical picture of EAE. So, the question on the effectiveness of animal
model usage for myelin-specific response estimation is open to discussion.
ус
и
ВЕСЦI НА­Ц­Ы Я­НАЛЬ­НАЙ АКА­ДЭМII НА­ВУК БЕ­ЛА­РУСI № 3 2009
ар
СЕ­Р­Ы Я МЕДЫЦЫНСКІХ НА­ВУК
ел
УДК 616.831-001.8-005.98
Э. П. ТИТОВЕЦ, А. Ф. СМЕЯНОВИЧ, Л. П. ПАРХАЧ, Ю. Н. ЛУКАШЕЙКО
кБ
ВЫРАЖЕННОСТЬ ПЕРИТУМОРАЛЬНОГО ОТЕКА ГОЛОВНОГО МОЗГА
В ЗАВИСИМОСТИ ОТ ГИСТОСТРУКТУРЫ ОПУХОЛИ
Республиканский научно-практический центр неврологии и нейрохирургии, Минск, Беларусь
ау
(Поступила в редакцию 24.03.2008)
ци
он
ал
ьн
ая
ак
ад
ем
ия
н
Введение. Для головного мозга характерна высокая подвижность воды – как интерстициальной и цереброспинальной жидкости, так и ее части, вовлекаемой в интенсивный локальный обмен системы микроциркуляции [1–3]. В настоящее время известно, что эти процессы контролируются аквапоринами – энергонезависимыми каналобразующими белками, обеспечивающими
быстрый трансмембранный перенос воды в условиях небольших изменений осмотического, гидростатического и онкотического давления [4–8].
Аквапорины вовлекаются в механизм развития отека при патологии головного мозга. Как
первичная церебральная патология отек головного мозга развивается при инсультах, черепномозговых травмах, опухолях и абсцессах. По мере нарастания отека повышается внутричерепное
и перфузионное давление, что приводит к церебральной ишемии, сдавлению ствола мозга и,
в конечном счете, к летальному исходу [7, 8].
Церебральный отек сопровождается накоплением воды в паренхиме головного мозга. Череп
взрослого человека представляет собой механически жесткую оболочку, и увеличение объема
паренхимы приводит к повышению внутричерепного давления. Способность частично компенсировать возрастание внутричерепного давления по мере увеличения объема паренхимы связана с возможностью перетекания цереброспинальной жидкости и уменьшения объема венозного
компартмента головного мозга. Различают вазогенный и клеточный (цитотоксический) отек головного мозга [9]. При вазогенном отеке повышается проницаемость гематоэнцефалического
барьера. Вода накапливается в интерстициальном пространстве, причем преимущественно в белом веществе головного мозга, где сопротивление массопереносу воды ниже, чем в сером [10, 11].
При цитотоксическом отеке вода накапливается главным образом интрацеллюлярно, как это
имеет место, например, при гипоксии. При ишемии головного мозга отек наиболее выражен
в популяции астроцитов, и их набухание относится к одному из ранних патогенетически значимых нарушений. Следует отметить, что астроциты незамедлительно реагируют на изменения
осмотического давления, так как в мембранах их отростков содержится большое количество аквапорина AQP4 [12].
В механизме развития отека головного мозга участвуют практически все аквапорины, однако в зависимости от конкретной патологии степень вовлеченности каждого из них различна.
При отеках, вызванных онкологическими заболеваниями головного мозга, преимущественно
вовлекаются AQP1 и AQP4. С аквапоринами связывают метастазирование некоторых опухолей.
Экспрессия AQP1 возрастает в эндотелиальных клетках капилляров агрессивных опухолей головного мозга, при имплантации саркомы глиобластомы, при злокачественных глиомах [13, 14].
В эндотелиальных клетках опухолей экспрессия AQP1 может быть индуцирована вазогенными
факторами, такими как сосудистый эндотелиальный и гепатоцитарный факторы роста, которые
высвобождаются из клеток опухолей. Этот аквапорин обнаружен также в эпителии микрососудов астроцитомы и метастатических карциномах [15]. Уровень экспрессии AQP1 более выражен
На
82
ус
и
ем
ия
н
ау
кБ
ел
ар
на периферии опухоли, что коррелирует с характером транспорта воды в опухоли [13]. Выключение синтеза AQP1 у генно-модифицированной линии мышей сопровождалось понижением внутричерепного давления и уменьшением продуцирования цереброспинальной жидкости [16]. Показано, что уровень экспрессии AQP1 в папилломах хориоидального сплетения и размер опухоли определяют последующее развитие ликворных кист и сообщающейся гидроцефалии [17].
При таких опухолях, как злокачественная астроцитома, метастатическая аденокарцинома
и некоторых других новообразованиях, у человека увеличивается экспрессия AQP4 [18]. Это способствует быстрому дренированию отечной жидкости и восстановлению осмотического гомеостаза головного мозга [19].
Следует отметить, что именно периваскулярные мембраны ножек астроцитов, содержащие
много AQP4, а не клетки эндотелия сосудов (AQP1) определяют проницаемость гематоэнцефалического барьера для воды [19].
Цель работы – количественное исследование выраженности перитуморального отека при различной степени злокачественности новообразований головного мозга на основе нового фундаментального знания о роли аквапоринов при данной патологии.
Материалы и методы исследования. Анализ выраженности перитуморального отека проведен у больных (возраст до 70 лет) с супратенториальными новообразованиями головного мозга. В протокол исследования были включены больные с верифицированным, по данным магниторезонансной томографии (МРТ), перитуморальным отеком и цитоморфологической верификацией гистоструктуры опухоли.
МРТ проводили на аппарате фирмы PICKER с индукцией магнитного поля 1,5 Тл после внутривенного введения магневиста в дозе 0,2 мл/кг массы тела. Площади перитуморального отека
и опухоли, по данным МРТ, определяли при помощи компьютерных программ eFilm Medical
и UTHSCSA Image Tool в формате DICOM. Выраженность отека оценивали с помощью коэффициента, который определяли по формуле
k=
S1 − S 2
,
S2
На
ци
он
ал
ьн
ая
ак
ад
где k – коэффициент выраженности перитуморального отека; S1 – площадь перитуморального
отека; S2 – площадь опухоли.
Результаты и их обсуждение. Проведен анализ выраженности перитуморального отека
и рассчитаны его коэффициенты у 118 пациентов с опухолями головного мозга. Больные были
разделены на пять групп в зависимости от гистоструктуры опухоли. У 16 (14%) пациентов диагностированы астроцитомы, у 11 (2%) – олигодендроглиомы, у 34 (29%) – глиобластомы, у 27
(23%) – менингиомы, у 31 (25%) – метастазы рака в головной мозг.
При МРТ обследовании астроцитомы имели различную степень контрастного усиления – от
слабой до выраженной, наблюдалась пятнистость за счет участков отсутствия усиления, нечеткость контуров и плохая дифференциация от окружающей непораженной ткани головного мозга.
При этом наиболее выраженное усиление по периферии, имевшее неровные контуры, могло сочетаться с отсутствием усиления (за счет некроза) в центральной зоне. Доброкачественные астроцитомы I степени злокачественности являлись исключением, они не накапливали контрастный
препарат и, соответственно, не усиливались.
Астроцитомы I степени злокачественности четко визуализировались при проведении МРТ
обследования на всех трех типах взвешенности изображения (Т1-, Т2-, рВИ). На Т1ВИ они имели
вид гипоинтенсивного очага с четкими границами, на Т2ВИ и рВИ – давали гомогенный гипер­
интенсивный МРТ сигнал, который в совокупности с отеком образовывал зону с нечеткими контурами.
Диффузные астроцитомы (II степень злокачественности) нечетко отграничивались от окружающей ткани головного мозга. В трети случаев они имели кистозный компонент. Более четкую
визуализацию этих опухолей получали на Т2- и рВИ изображениях. При этом регистрировали
выраженный гиперинтенсивный сигнал как от опухоли и ее кистозного компонента, так и от оте­
83
ус
и
ци
он
ал
ьн
ая
ак
ад
ем
ия
н
ау
кБ
ел
ар
ка. Первые две составляющие образовывали ядро с более интенсивным сигналом. Граница отека
и непораженной мозговой ткани дифференцировалась лучше, чем при астроцитомах I степени
злокачественности.
МРТ картина анапластических астроцитом (III степень злокачественности) была еще более
неоднородна, чем при диффузных, так как большинство из них из-за регрессивных изменений
имели выраженную неоднородную морфологическую структуру. На Т1ВИ эти астроцитомы давали неоднородный изо- или гипоинтенсивный сигнал из-за некроза, различных сроков давности кровоизлияний и кистозных включений. Граница опухоли и непораженной ткани головного
мозга плохо прослеживалась. На Т2- и рВИ изображениях анапластические астроцитомы давали
гиперинтенсивный сигнал различной степени выраженности из-за наличия кист, некроза, кровоизлияний, уплотнений опухолевой ткани в виде перегородок. При этом основная опухолевая
ткань имела гипоинтенсивный сигнал, а сильно выраженный перифокальный отек – гиперинтенсивный.
На Т1ВИ олигодендроглиомы и олигоастроцитомы давали однородный гипоинтенсивный сигнал, но чаще они были изоинтенсивны мозговой ткани. Какая-либо внутренняя структурная архитектоника отсутствовала. Анапластические олигодендроглиомы и олигоастроцитомы характеризовались наличием некроза и кистозных компонентов различной величины и являлись гетерогенными образованиями. Т2ВИ были более информативны как в плане визуализации самой опухоли,
так и в плане оценки злокачественности внутренней ее структуры. У очень плотных опухолей этой
гистоструктуры перифокальный отек был незначителен. Контрастное усиление приводило к четкому отграничению опухоли и отека. Кальциноз на фоне гиперинтенсивного сигнала опухоли четко прослеживался при его значительных размерах, малые объемы не определялись из-за нивелирования сигнала. Применение контрастного усиления было малоэффективно.
Среднее значение коэффициента выраженности перитуморального отека для олигодендроглиом составило 1,27, для астроцитом – 1,21. На рис. 1 приведены данные МРТ диагностики
и рассчитаны площади опухоли и перитуморального отека в двух проекциях соответственно.
Визуальная картина глиобластом на Т1ВИ была мало отличима от таковой при астроцитомах
III степени злокачественности. Сигнальная характеристика опухоли была пестрой из-за неоднородного изо- и гипоинтенсивного сигнала некроза, различных сроков давности кровоизлияний
и кистозных включений. Граница перифокального отека и опухоли была неразличима. На Т2ВИ
структура опухоли хорошо прослеживалась. Для дифференциации перифокального отека от
опухоли и здоровой ткани требовалось введение контрастных препаратов. После введения пара-
S1 = 58,8 см2; S2 = 25,9 см2
S1 = 39,5 см2; S2 = 10,4 см2
Рис. 1. МРТ исследование больного с олигодендроглиомой головного мозга (с контрастным усилением и без)
На
84
ус
и
ар
ел
кБ
ау
S1 = 47,0 см2; S2 = 14,7 см2
S1 = 40,7 см2; S2 = 7,1 см2
ем
ия
н
Рис. 2. МРТ исследование больного с глиобластомой головного мозга
ци
он
ал
ьн
ая
ак
ад
магнетика наблюдалась типичная картина кольцеобразного накопления препарата с гиперинтенсивным сигналом по периферии опухоли.
Для исследованных глиобластом среднее значение коэффициента выраженности перитуморального отека составило 2,30. Типичный вид МРТ сигналов при обследовании глиобластом
и зон опухоли S2 и отека S1 приведен на рис. 2.
К наиболее распространенным злокачественным опухолям, которые метастазируют в головной мозг, относят рак легкого, молочной железы, почки, толстой кишки, меланому, реже – саркому, рак яичников, простаты, мочевого пузыря [20, 21]. Относительная частота единичного или
множественного метастазирования обычно зависит от гистологической формы первичного очага. Так, меланома, рак легкого, рак молочной железы образуют в основном множественные очаги, рак толстой кишки и рак почки – единичные [22, 23]. У молодых пациентов метастазы в головной мозг развиваются чаще, чем у пожилых [24]. Метастатические очаги обычно окружены
S1 = 99,7 см2; S2 = 14,8 см2
S1 = 76,0 см2; S2 = 12,7 см2
На
Рис. 3. МРТ исследование больного с метастазами злокачественных опухолей
85
ус
и
ци
он
ал
ьн
ая
ак
ад
ем
ия
н
ау
кБ
ел
ар
зоной обширного перифокального отека, но
бывают небольших размеров, что затрудняет
их обнаружение [21, 25].
Для большинства изученных нами метастазов злокачественных опухолей в головной
мозг был характерен выраженный перифокальный отек. В центральной части метастазов располагалась большая зона некроза, а по
периферии – его тканевая составляющая, которая давала картину кольцеобразной опухоли. Солидная часть метастаза на Т2-, рВИ имела гипоинтенсивный сигнал, перифокальный
отек – гиперинтенсивный. Т1ВИ были малоэффективны для диагностики солидной части
метастазов, на них невозможно было разграничить непораженную ткань от патологичеРис. 4. МРТ исследование больного с менингиомой
ской. Введение парамагнетиков приводило
к существенному увеличению чувствительности в связи с выраженным накоплением препарата и соответствующим усилением.
Выявлено, что перифокальный отек, сопровождающий метастазы, распространяется на белое вещество и смежные доли (рис. 3). Среднее значение коэффициента выраженности перитуморального отека составило 2,37.
Большинство менингиом визуализировались в виде гомогенного образования с повышенной
интенсивностью МРТ сигнала. Границы опухоли очерчивал перитуморальный отек.
На Т1 и Т2ВИ интенсивность МРТ сигналов менингиом и серого вещества головного мозга
были близки, а их структура – однородна. В 50% случаев выявлен перифокальный отек, который
на Т2ВИ визуализировался как зона с гиперинтенсивным сигналом между менингиомой и серым
веществом. Применение парамагнетиков при менингиомах давало значительное усиление. Перитуморальный отек был слабо выражен (рис. 4). Среднее значение коэффициента выраженности
перитуморального отека составило 1,27.
Распределение выраженности перитуморального отека в зависимости от гистоструктуры
опухоли представлено на рис. 5.
Показано, что содержание AQP1 увеличивается в клетках астроцитомы, глиобластомы, метастатической карциномы, эндотелии опухолевых сосудов, а уровень экспрессии AQP1 более выражен на периферии опухолей [13–17]. AQP1 является аквапорином «выхода», т. е. контролирует
вынос внутрисосудистой воды в интерстициум, цереброспинальную жидкость и т. д. [8]. Активная экспрессия AQP1 на периферии опухолей с высокой степенью злокачественности приводит
к развитию обширной зоны перитуморального отека вокруг нее, увеличению внутричерепного
давления и продуцированию цереброспинальной жидкости. Показано, что наиболее выражен перитуморальный
отек головного мозга у больных с глиобластомами (высокая степень злокачественности) и метастазами рака в головной мозг (рис. 5).
Перитуморальный отек у больных с астроцитомами
был менее выражен по сравнению с отеком у пациентов,
имевших глиобластомы. Основу клеточного состава этих
опухолей составляли неопластические астроциты.
Именно в астроциты включена значительная часть AQP4
Рис. 5. Выраженность перитуморального
головного мозга. При злокачественной астроцитоме, в ре- отека в зависимости от гистоструктуры
активных астроцитах при метастатической аденокарцино- опухоли. 1 – астроцитомы; 2 – олигоденме увеличивается экспрессия AQP4 [18]. Этот аквапорин дроглиомы; 3 – глиобластомы; 4 – менинимеет наиболее высокую скорость трансмембранного пе- гиомы; 5 – метастазы рака в головной мозг
На
86
ус
и
Литература
ау
кБ
ел
ар
реноса воды и определяет проницаемость гематоэнцефалического барьера к воде. Одновременно
AQP4 можно назвать аквапорином «выхода». Этот аквапорин в большинстве случаев ответственен за разрешение отека головного мозга. Менингиомы, доброкачественные новообразования головного мозга, не приводили к активной экспрессии аквапоринов в гистоструктуры опухоли,
вследствие чего отек был менее выражен.
Таким образом, коэффициент выраженности перитуморального отека был наибольшим при
первичных нейроэктодермальных опухолях высокой степени злокачественности (анапластические астроцитомы, глиобластомы), а также при метастатическом поражении головного мозга.
Меньшее значение коэффициента выраженности перитуморального отека наблюдалось при глио­
мах с низкой степенью злокачественности, а также при менингиомах головного мозга.
Заключение. Установлено, что выраженность перитуморального отека зависит от гистоструктуры опухоли. Опухоли высокой степени злокачественности (анапластические астроцитомы, глиобластомы), а также метастазы рака в головной мозг сопровождались наиболее выраженным перитуморальном отеком, новообразования с низкой степенью злокачественности и менингиомы – наименее выраженным.
ьн
ая
ак
ад
ем
ия
н
1. M a a s A. I. R., F l e c k e n s s t e n s W., d e J o n d D. A., v a n S a n t r i n k H. // Aсta Neurosurg. 1993.
Vol. 59. P. 50–57.
2. M a y h e w J., J o h n s t o n D., M a r t i n d a l e J. et al. // Neuroimage. 2001.
3. L a s k M., P r e s s l e y I. // Semin. Nephrol. 1999. Vol. 19. P. 533–580.
4. A g r e P., P r e s t o n G., S m i t h B. et al. // Am. J. Physiol. 1993. Vol. 265. Р. 463–467.
5. C h r i s p e e l s M., A g r e P. // Trends Biochem. Sci. 1994. Vol. 19. P. 421–425.
6. V e r k m a n A. // J. Am. Soc. Nephrol. 1999. Vol. 10. P. 1126–1135.
7. Т и т о в е ц Э. П. Аквапорины человека и животных: фундаментальные и прикладные аспекты. Минск, 2007.
8. Т и т о в е ц Э. П. // Здравоохранение. 2002. № 1. С. 30–33.
9. K l a t z o I. // J. Neuropathol. Exp. Neurol. 1967. N 26. Р. 1–14.
10. P a p a d o p o u l o s M. C., S a a d o u n S., D a v i e s D. C. et al. // Br. J. Neurosurg. 2001. N 15. Р. 101–108.
11. K i m e l b e r g H. K. // Neuroscience. 2004. N 129 (4). Р. 851–860.
12. K i m e l b e r g H. K. // J. Neurosci. 1992. N 9. Р. S71 –S81.
13. E n d o M., J a i n R. K., W i t w e r B., B r o w n D. // Microvasс. Res. 1999. N 58. Р. 89–98.
14. M a r k e r t J. M., F u l l e r C. M., G i l l e s p i e G. Y. et al. // Physiol. Genomics. 2001. N 5. Р. 21–33.
15. S a a d o u n S., P a p a d o p o u l o s M. C., D a v i e s D. C. et al. // Br. J. Cancer. 2002. N 87. Р. 621–623.
16. O s h i o K., S o n g Y., V e r k m a n A. S., M a n l e y G. T. // Acta Neurosurg. Suppl. 2003. N 86. Р. 525–528.
17. L o n g a t t i P., B a s a l d e l l a L., O r v i e t o E. et al. // Pediatr. Neurosurg. 2006. N 42 (4). Р. 228–233.
18. S a a d o u n S., P a p a d o p o u l o s M. C., D a v i e s D. C. et al. // J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry. 2002. N 72.
Р. 262–265.
19. M a n l e y G. T., F u j i m u r a M., M a T. et al. // Natur. Med. 2000. N 6. Р. 159–163.
20. N u t t S., P a t c h e l l R. A. // Neurosurg. Clin. N. Am. 1992. N 5. P. 591–599.
21. D i M e c o F., L i K. V., M e n d o l a C. et al. // Acta Neurosurg. 2004. N 146. Р. 995–1001.
22. В о й н а р е в и ч А. О., М и х и н а З. П., И з в е к о в а О. В. // Материалы 3-го съезда онкологов и радиологов СНГ. Минск, 2004. С. 256.
23. G a l i c i c h J. H., A r b i t E. // Neurolog. Surg. 1990. Vol. 70, N 3. P. 320–322.
24. P a t c h e l l R. A., T i b b s P. A., W a l s h J. W. // N. Engl. J. Med. 1990. Vol. 90, N 5. P. 494–500.
25. G o f f a r t Y., J o r i s s e n M., D a e l e J. et al. // Acta Otorhinnolaryngol. Belg. 2000. Vol. 54, N 2. P. 221–232.
ал
E. P. TITOVETS, A. F. SMEYANOVICH, L. P. PARKHACH, Yu. N. LUKASHEIKA
DEPENDENCE OF PERITUMOR EDEMA ON THE BRAIN TUMOR CELLULAR COMPOSITION
ци
он
National Practical Research Center for Neurology and Neurosurgery, Minsk, Belarus
Summary
На
It has been demonstrated that the highly malignant tumors (anaplastic astracytoma, glioblastoma) and brain metastatic
cancer are characterized by high extension of the perifocal edema. With the low malignancy tumors and meningiomas, the
extent of the edema is not like this high as in the previous cases. The results are discussed from the viewpoint of aquaporins
participation in the development of the peritumor edemas in the brain.
ус
и
ВЕСЦI НА­Ц­Ы Я­НАЛЬ­НАЙ АКА­ДЭМII НА­ВУК БЕ­ЛА­РУСI № 3 2009
ар
СЕ­Р­Ы Я МЕДЫЦЫНСКІХ НА­ВУК
УДК 616.12-073.97:616-002-07
ел
А. Г. МРОЧЕК1, И. Н. АЛЕКСЕЕВСКАЯ1, И. В. КОРНЕЛЮК2, Ю. А. ПЕРСИДСКИХ 1,
Т. В. СЕВРУК1, И. Б. УСТИНОВА1, Д. В. КОВАЛЕНКО1
1
кБ
С-РЕАКТИВНЫЙ БЕЛОК КАК МАРКЕР СУБКЛИНИЧЕСКОГО ВОСПАЛЕНИЯ
ПРИ ЭЛЕКТРИЧЕСКОЙ КАРДИОВЕРСИИ ПЕРСИСТИРУЮЩЕЙ
МЕРЦАТЕЛЬНОЙ АРИТМИИ
Республиканский научно-практический центр «Кардиология», Минск, Беларусь,
2
Белгородский государственный университет, Россия
ау
(Поступила в редакцию 29.04.2009)
ци
он
ал
ьн
ая
ак
ад
ем
ия
н
Введение. Проведение трансторакальной электрической кардиоверсии (ЭКВ) мерцательной
аритмии (МА) приводит к восстановлению синусового ритма (СР) приблизительно в 80% случаев. Однако рецидив случаев МА в течение первого месяца после проведения эффективной кардиоверсии составляет примерно 50% [4], а возврат аритмии, наблюдаемый преимущественно
в течение первой недели, достигает 70% [5].
Истинные механизмы, лежащие в основе неэффективности ЭКВ и столь частого возврата
МА, окончательно не установлены. Структурные и электрофизиологические изменения миокарда предсердий, носящие устойчивый и выраженный характер, прогрессируют по мере увеличения продолжительности МА и ослабевают после восстановления СР, что определяет ход течения
МА и переход ее из пароксизмальной в персистирующую или хроническую форму. Ведущим
механизмом аритмогенеза при МА в настоящее время признается ри-энтри, или повторный вход,
волны возбуждения. Электрофизиологические механизмы, лежащие в основе электрического ремоделирования, включают в себя укорочение эффективного рефрактерного периода предсердий
и дисперсию рефрактерности предсердного миокарда с замедлением проведения, которые приводят к укорочению длины волны возбуждения и создают условия для циркуляции множества
волн ри-энтри. Процессы электрического ремоделирования предсердного миокарда ответственны за персистенцию МА или ее рецидив в течение нескольких часов или дней после электроимпульсной терапии (ЭИТ) [6]. Противорецидивное действие антиаритмических препаратов (ААП),
назначаемых перед проведением планируемой кардиоверсии, направлено на замедление этого
типа ремоделирования, но зачастую его оказывается недостаточно. В последнее время
в мировой литературе рецидив МА и неэффективность кардиоверсии связывают с изменениями
воспалительного характера в предсердном миокарде, развивающимися в процессе структурного
ремоделирования. Структурные изменения миокарда включают также дилятацию и увеличение
массы предсердий, мозаичную дегенерацию и очаговый фиброз, апоптоз, анизотропию, гибель
симпатических и парасимпатических нервных волокон, нарушение геометрии и синхронизации
механического растяжения мембраны кардиомиоцита. Особая роль отводится изменениям воспалительного характера в миокарде, которые сопровождаются развитием фиброза в межклеточном веществе предсердий и утратой контрактильных элементов. Такие изменения были выявлены, в частности, в биоптатах у пациентов с идиопатической формой МА [7]. Последующие исследования также подтвердили роль системного воспаления и его маркера – С-реактивного белка
(СРБ) в механизме развития и поддержания предсердных аритмий.
СРБ получил свое название из-за способности вступать в реакцию преципитации с С-по­
лисахаридом пневмококков. Данный белок стимулирует иммунные реакции, в том числе фагоцитоз,
участвует во взаимодействии Т- и В-лимфоцитов, активирует классическую систему комплемента.
Кроме того, как медиатор синдрома системного воспалительного ответа он активирует функцию
На
88
ус
и
На
ци
он
ал
ьн
ая
ак
ад
ем
ия
н
ау
кБ
ел
ар
всех клеток рыхлой соединительной ткани и снабжает энергетическим субстратом клетки врожденного иммунитета. СРБ синтезируется преимущественно в гепатоцитах, его синтез инициируется антигенами, иммунными комплексами, бактериями, грибами и регулируется провоспалительными цитокинами. Синтез СРБ, как и само воспаление, может быть сосредоточен местно (в «воротах инфекции»), на уровне отдельных органов или локальных пулов межклеточной среды. Когда же
возможностей паракринной и органной регуляции системного воспаления недостаточно, происходит
централизация патологического процесса и СРБ начинают синтезировать гепатоциты [3].
За последнее десятилетие были разработаны высокочувствительные методы определения
СРБ в так называемом субклиническом интервале (менее 0,3–0,5 мг/л). В диапазоне концентраций от 10 мг/л и выше (при воспалительных процессах) СРБ следует измерять для определения
тяжести бактериальных и вирусных инфекций, коллагенозов, для мониторинга состояния больного после хирургического вмешательства, инфаркта миокарда и ишемического инсульта. Высокочувствительное измерение СРБ (менее 10 мг/л) применяют для стратификации рисков прогрессирования атеросклероза, развития инфарктов миокарда и ишемических инсультов, тромбоэмболий, осложнений диабета и гемодиализа, реакции отторжения трансплантата [10, 17].
Влияние уровней СРБ на развитие и рецидив МА, а также на эффективность кардиоверсии
изучалось во многих исследованиях. Так, изменения воспалительного характера в миокарде сопровождались повышенной плазменной концентрацией СРБ, которая как возможная причина
послеоперационной фибрилляции предсердий была описана Bruins et al. [8]. Несколько позже
Chung et al. [9] выявили, что уровень СРБ выше у пациентов с МА при сравнении со здоровыми
лицами. Кроме того, они обнаружили, что уровень СРБ выше у пациентов с персистирующей,
чем с пароксизмальной формой МА, на основании чего была выдвинута гипотеза о том, что изменения воспалительного характера в миокарде способствуют персистенции аритмии. Аналогичные данные получены Boos [10], Engelmann et al. [11].
Тем не менее не существует однозначного ответа на вопрос, являются ли изменения воспалительного характера этапом патогенеза МА, способствующим развитию и поддержанию аритмии
[12, 13]. Подтверждением такой точки зрения является тот факт, что плазменная концентрация
СРБ снижается при сохранении СР и достигает нормальных значений в течение одного месяца
после его восстановления [13].
Существует и другая точка зрения, согласно которой повышенный уровень СРБ является
следствием предсердного ремоделирования миокарда в ходе персистенции МА [14]. Тогда, возможно, воспалительный статус связан, скорее, с основным клиническим заболеванием пациента,
осложненным развитием МА [15]. Это предположение подтверждается тем, что повышенный
уровень СРБ ассоциирован не только с развитием и персистенцией МА, но и с увеличением размеров левого предсердия и протромботическим статусом [10, 17], артериальной гипертезией, дестабилизацией ишемической болезни сердца и др.
Метаанализ шести проспективных когортных исследований, выполненный Liu et al. в 2008 г.,
показал, что повышенная концентрация СРБ, измеренная накануне ЭИТ, является независимым
прогностическим фактором неэффективности ЭКВ [16]. В отношении рецидивов МА авторы
воздержались от определенных выводов. Согласно метаанализу Liu et al., опубликованному
в 2007 г. [17], было предложено использовать прекардиоверсионный уровень СРБ для прогноза
рецидивирования МА только в ранние сроки (до одного месяца).
Учитывая роль воспалительных процессов в развитии и персистенции МА, были проведены
клинические исследования, которые показали, что препараты с противовоспалительными свойствами могут быть использованы для предупреждения пароксизмов МА и повышения эффективности ЭКВ. Так, Cheruku et al. [18] добился снижения частоты пароксизмов МА в послеоперационном периоде аорто-коронарного шунтирования назначением кеторолака. Применение статинов, противовоспалительное действие которых также было доказано, способствовало
уменьшению частоты пароксизмов МА [19]. В исследовании ARMYDA-3 частота послеоперационной МА снизилась при назначении аторвастатина до и после вмешательств на сердце, несмотря на то, что уровни СРБ в группах статина и плацебо достоверно не различались [20]. Аналогичные данные получены при использовании ингибиторов ангиотензинпревращающего фермен-
89
ус
и
ци
он
ал
ьн
ая
ак
ад
ем
ия
н
ау
кБ
ел
ар
та и блокаторов рецепторов к ангиотензину II [21], что объясняется предупреждающим действием
последних не только на апоптоз и фиброз, но и на электрическое ремоделирование.
Таким образом, учитывая противоречивость данных мировой литературы, нами было инициировано собственное исследование.
Цель настоящей работы – оценка уровней СРБ в группах пациентов с персистирующей МА.
Обязательным условием исследования явился прием всеми пациентами ААП до и после ЭКВ.
Материалы и методы исследования. Обследовано 70 пациентов (53 мужчины, 17 женщин)
среднего возраста (51,0±1,5 года), прошедших ЭКВ МА, персистировавшей в среднем в течение
122,0±12,1 сут.
В зависимости от исхода ЭИТ сформированы две группы наблюдения: группа 1 (Г1) – пациенты с восстановленным СР; группа 2 (Г2) – пациенты с неэффективной ЭИТ. В дальнейшем
в первой группе выделены две подгруппы: Г1а – пациенты, у которых СР сохранялся в течение
всего периода наблюдения; Г1б – пациенты с рецидивом МА в течение 1 мес. после ЭКВ.
Все больные были сопоставимы по возрасту, продолжительности персистенции МА, клинической характеристике. Основным заболеванием у 68 (97%) пациентов являлась ишемическая
болезнь сердца со стенокардией напряжения I–II функционального класса, у 2 (3%) больных
причиной аритмии признан постмиокардитический кардиосклероз. Пациентов с инфекциями,
очаговым поражением миокарда, ишемическим инсультом, оперативными вмешательствами на
сердце, системными заболеваниями, а также с хроническими в стадии обострения в исследование не включали. Антикоагулянтную подготовку проводили по стандартной схеме с использованием варфарина, дозировку которого корректировали в соответствии с показателем международного нормализованного отношения коагулограммы. Больные всех групп получали антиаритмическое лечение амиодароном (200–600 мг/сут), метопрололом (100–200 мг/сут) или пропа­феноном (450–600 мг/сут) в течение 2–4 недель до и спустя 1 мес. после электроимпульсной
терапии. С целью коррекции хронической сердечной недостаточности использовали ингибиторы ангиотензин-превращающего фермента. Всем пациентам назначали аторвастатин в связи
с выявлением гиперхолестеринемии (средний уровень общего холестерина 6,0±1,2 ммоль/л).
Трансторакальную ЭКВ проводили под внутривенной анестезией тиопенталом натрия последовательными разрядами, энергия излучения которых составляла 200, 300 и 360 Дж.
Перед планируемой ЭИТ выполняли общеклинические исследования, электрокардиографию
(ЭКГ), трансторакальную эхокардиографию, чреспищеводную эхокардиографию (для исключения тромбов в ушке левого предсердия), суточное мониторирование ЭКГ. Концентрацию С-реак­
тивного белка в плазме определяли за сутки до проведения ЭИТ с помощью иммунотурбидиметрического теста, используя набор DiaSys. Наблюдение пациентов осуществляли в течение 1 мес.
после проведения ЭКВ.
Полученные данные анализировали с помощью пакета программ Statistica 6.0. При оценке
материала рассчитывали средние величины (М), их стандартные ошибки (m). Достоверность
различий оценивали по непараметрическому критерию Манна–Уитни для независимых выборок. Различия считали достоверными при уровне значимости Р < 0,05.
Для сравнения несвязанных групп по бинарному признаку с определением отношения шансов
(ОШ) использовали таблицы сопряженности и формулы, предложенные О. Ю. Ребровой [1]. Диагностическую ценность теста с вычислением чувствительности, специфичности и прогностичности
определяли путем построения таблиц типа 2×2 в соответствии с рекомендациями Дж. Стентона [2].
Поиск оптимальной точки разделения уровня СРБ производили на основании построения кривой
операционной характеристики в осях координат «чувствительность» и «1 – специфичность» [2].
Результаты и их обсуждение. Восстановление СР в результате ЭИТ установлено у 59 из 70
больных. Таким образом, эффективность ЭКВ составила 84%. К концу периода наблюдения, т. е.
спустя 1 мес. после проведения кардиоверсии, у 42 (71%) пациентов сохранялся СР. Наибольшее
количество рецидивов – 11 (65%) отмечалось в течение первых 7 дней после ЭИТ.
По продолжительности персистенции МА и по размерам левого предсердия (ЛП) не было
выявлено достоверных различий между Г1 и Г2, а также между Г1а и Г1б (табл. 1, 2), что находится в противоречии с предположением S. Psychari [14] о связи СРБ с размером ЛП и длитель-
На
90
ус
и
ар
ностью МА. Средние значения фракции выброса (ФВ) не различались значимо как в Г1 и Г2, так
и в Г1а и Г1б (табл. 1, 2). Таким образом, нам не удалось подтвердить гипотезу J. Pedersen et al.
[21] об ассоциации СРБ с наличием систолической сердечной недостаточности. На результат
ЭИТ и рецидив МА не оказывали влияние ААП, так как показатели пациентов основных групп
Г1 и Г2 и выделенных подгрупп Г1а и Г1б оказались сопоставимы по этому фактору (табл. 1, 2).
Т а б л и ц а 1. Клиническая характеристика групп пациентов, сформированных
в зависимости от исхода ЭИТ
Г1 (восстановлен СР)
* Р < 0,05.
Г2 (неэффективная ЭИТ)
11
7,5±2,3*
113,0±18,5
42,2±1,2
53,9±2,6
кБ
59
4,7±1,1*
130,7±24,7
43,1±1,1
54,6±2,7
ау
22 (37%)
24 (41%)
13 (22%)
ем
ия
н
Количество пациентов
Уровень СРБ, мг/л
Продолжительность персистенции МА, сут
ЛП, мм
ФВ, %
Количество (доля) пациентов, принимавших разные ААП:
метопролол
амиодарон
пропафенон
ел
Группы пациентов по результатам ЭИТ
Показатель
4 (36%)
3 (38%)
4 (36%)
При сравнении у пациентов с восстановленным СР (Г1) и неэффективной ЭИТ (Г2) уровень
СРБ оказался значимо выше (Р = 0,026) в Г2 (табл. 1). Полученные результаты согласуются с данными литературы, согласно которым повышенная плазменная концентрация СРБ используется
в качестве предиктора безуспешности кардиоверсии [10, 11, 16].
ак
ад
Т а б л и ц а 2. Клиническая характеристика пациентов с восстановленным СР, распределенных
в подгруппы в зависимости от наличия рецидива МА
Показатель
* Р<0,05.
Г1а (СР к концу периода
наблюдения)
Г1б (рецидив МА
в течение 1 мес.)
42
3,4±1,2*
119,7±16,5
42,6±1,1
53,9±3,1
17
6,8±2,2*
136,8±34,2
44,8±1,2
55,6±2,9
16 (38%)
18 (43%)
8 (19%)
6 (35%)
6 (35%)
5 (30%)
ьн
ая
Количество пациентов
Уровень СРБ, мг/л
Продолжительность персистенции МА, сут
ЛП, мм
ФВ, %
Количество (доля) пациентов, принимавших разные ААП:
метопролол
амиодарон
пропафенон
Подгруппы Г1
На
ци
он
ал
Полученные нами результаты (табл. 2) об увеличении уровня СРБ у пациентов с рецидивами
МА по сравнению с данным показателем у больных с СР (Р = 0,016), подтверждают данные, представленные другими исследователями о связи повышенного уровня СРБ с рецидивом МА [12, 13,
17]. Так, Wazni et al. [13] предлагают использовать этот лабораторный показатель как независимый
прогностический фактор риска рецидива МА у пациентов, принимающих ААП до и после ЭКВ.
Следует отметить, что, несмотря на достаточно большое количество исследований, посвященных этому вопросу, авторы воздерживаются от определения пороговых концентраций СРБ,
превышение которых ассоциировано с неэффективной ЭИТ или с развитием рецидивов МА.
Средние значения СРБ, полученные в ходе различных рандомизированных исследований, находятся в широком диапазоне – от 0,11–4,1 мг/л для пациентов с эффективной ЭИТ до 0,23–5,60
91
ус
и
ау
кБ
ел
ар
при неудачной ЭКВ [17]. В ранее упоминавшейся работе Wazni et al. [13] средние уровни этого
лабораторного показателя составили 3,95 мг/л у пациентов с рецидивом МА против
1,81 мг/л у лиц с сохраненным СР.
В нашей работе мы попытались определить пороговые значения СРБ для изучаемых клинических исходов. Проведенный анализ диагностической ценности теста выявил, что уровень СРБ
5,0 мг/л и менее с вероятностью отрицательного прогноза 80% определяет эффективность ЭИТ
(чувствительность 25%, специфичность 32,4%), а также сохранение СР в подостром периоде
с вероятностью отрицательного прогноза 72% (чувствительность 87%, специфичность 42,8%).
Превышение СРБ порового значения 5,0 мг/л увеличивает риск неэффективной ЭИТ в 9,3
раза (отношение шансов 9,3; 95%-ный доверительный интервал 1,1–87,3), а также развитие рецидива МА в 6,85 раза (отношение шансов 6,85; 95%-ный доверительный интервал 1,4–26,7).
Таким образом, несмотря на, казалось бы, доступный метод прогноза эффективности ЭКВ
и развития рецидивов МА, применение его в клинической практике ограничено низкой специфичностью. Возможно, это связано с тем, что МА осложняет такие распространенные заболевания, как, например, артериальная гипертензия или ишемическая болезнь сердца, которые также
ассоциированы с повышенным уровнем СРБ. В связи с этим не представляется возможным определить истинную причину его превышения.
ем
ия
н
Выводы
1. Повышенный уровень СРБ ассоциирован с показателем неэффективности ЭИТ и развитием рецидива МА в течение 1 мес. после проведения кардиоверсии.
2. Для пациентов с уровнем СРБ более 5,0 мг/л, измеренным за сутки до проведения ЭИТ,
характерно практически 9-кратное увеличение показателя безуспешности электрической кардио­
версии, а также 7-кратный риск рецидива МА в течение 1 мес. после ЭИТ.
3. Специфичность СРБ как предиктора эффективности электрической кардиоверсии или развития рецидивов МА находится в пределах 33–43%, что ограничивает его широкое применение.
Литература
ьн
ая
ак
ад
1. Р е б р о в а О. Ю. Статистический анализ медицинских данных. Применение пакета прикладных программ STATISTICA.
М., 2002.
2. С т е н т о н Д ж. // Междунар. журн. мед. практики. 2000. № 4. С. 93–95.
3. Т и т о в В. Н. // Системные гипертензии. 2007. № 2. С. 44–47.
4. F u r s t e r V. // Eur. Heart J. 2006. Vol. 27. P. 1979–2030.
5. C l i m e n t V., M a r i n F., M o n m e n e u J. et al. // Int. J. Cardiol. 2006. Vol. 110. P. 427–428.
6. K o r a n t z o p o u l o s P., K o l l e t i s T., S i o g a s K., G o u d e v e n o s J. // Med. Sci. Monit. 2003. Vol. 9. P. 225–229.
7. F r u s t a c i A., C l i m e n t i C., B e l l o c i F. et al. // Circulation. 1997. Vol. 96. P. 1180–1184.
8. B r u i n s P., V e l t h u i s H., Y a z d a n b a k h s h A. et al. // Circulation. 1997. Vol. 96. Р. 3542–3548.
9. C h u n g M., M a r t i n D., S p r e c h e r D. et al. // Circulation. 2001. Vol. 104. Р. 2886–2891.
10. B o o s C. J., A n d e r s o n R. A., L i p G. Y. H. // Eur. Heart J. 2006. Vol. 27. Р. 136–149.
11. E n g e l m a n n M. D. M., S v e n d s e n J. H. // Eur. Heart J. 2005. Vol. 26. Р. 2083–2092.
12. M a l o u f J. F., K a n a g a l a R., A l A t a w i F. O. et al. // J. Am. Coll. Cardiol. 2005. Vol. 46. Р. 1284–1287.
13. W a z n i O., M a r t i n D. O., M a r r o u c h e N. F. et al. // Heart. 2005. Vol. 91. Р. 1303–1305.
14. P s y c h a r i S. N., A p o s t o l o u T. S., S i n o s L. et al. // Am. J. Cardiol. 2005. Vol. 95. Р. 764–767.
15. C o n w a y D., B r u g g i n s P., H u g h e s E., L i p G. Y. H. // Circulation. 2001. Vol. 104. Р. 2886–2891.
16. L i u T., L i G., L i L., K o r a n t z o p o u l o s P. // J. Am. Coll. Cardiol. 2007. Vol. 49. Р. 1642–1648.
17. L i u T., L i L., K o r a n t z o p o u l o s P., G o u d e v e n o s J., G u a n g p i n g L. // Am. J. Cardiol. 2008. Vol. 101. Р. 1749–1752.
18. C h e r u k u K., G h a n i A., A h m a d F. et al. // Prev. Cardiol. 2004. Vol. 175. Р. 187.
19. Y o u n g –X u Y., J a b b o u r S., G o l d b e r g R. et al. // Am. J. Cardiol. 2003. Vol. 92. Р. 1343–1345.
20. P a t t i G., C h e l l o M., C a n d u r a D. et al. // Circulation. 2006. Vol. 114. Р. 1455–1461.
21. P e d e r s e n O., B a g g e r H., K o b e r L. et al. // Circulation. 1999. Vol. 100. Р. 376–380.
ал
A. G. MROCHEK1, I. N. ALEKSEEVSKAYA1, I. V. KORNELUIK2, Yu. A. PERSIDSKIKH1, T. V. SEVRUK1, I. B. USTINOVA1, D. V. KOVALENKO1
ци
он
C-REACTIVE PROTEIN AS A MARKER OF SUBCLINICAL INFLAMMATION AT ELECTRICAL CARDIOVERSION
OF PERSISTENT CARDIAC FIBRILLATION
1
The Centre of Cardiology, Minsk, Belarus,
2
The State University of Belgorod, Russia
Summary
На
The authors established the levels of C-reactive protein as a marker of subclinical inflammation in patients with persistent cardiac fibrillation. An increased concentration of C-reactive protein more than 5.0 mg/l is associated with the failure of electrical cardioversion and
the early recurrence of cardiac fibrillation.
ар
СЕ­Р­Ы Я МЕДЫЦЫНСКІХ НА­ВУК
ус
и
ВЕСЦI НА­Ц­Ы Я­НАЛЬ­НАЙ АКА­ДЭМII НА­ВУК БЕ­ЛА­РУСI № 3 2009
АГЛЯДЫ
ел
УДК 616-006.6-084(476)
И. В. Залуцкий
кБ
СТРАТЕГИЯ БОРЬБЫ СО ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫМИ НОВООБРАЗОВАНИЯМИ
Республиканский научно-практический центр онкологии и медицинской радиологии
им. Н. Н. Александрова, Минск, Беларусь
ау
(Поступила в редакцию 09.12.2008)
На
ци
он
ал
ьн
ая
ак
ад
ем
ия
н
Введение. Злокачественные опухоли, сопровождая человечество на протяжении всей его
истории, являются одной из основных причин смертности населения, что приводит к значительной утрате трудового и жизненного потенциала общества. Они находятся в центре сложного
комплекса социальных, экономических, психологических, нравственных, деонтологических вопросов, что выводит эту патологию за рамки сугубо медицинской проблемы.
Экономические потери общества, связанные со злокачественными ново­образованиями, обусловлены как высокой стоимостью лечения онкологических больных, профилактических и реабилитационных мероприятий, так и длительной, а зачастую и полной утратой трудоспособности
и связанными с этим значительными затратами на социальное обеспечение по инвалидности
[1–3].
О глобальности современной проблемы злокачественных новообразований свидетельствуют
экспертные оценки, обобщения и прогнозы Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ)
и Международного агентства по исследованию рака (МАИР) [4, 5].
В материалах ВОЗ [1, 4, 6] констатируется, что в настоящее время рак является одной из самых распространенных причин заболеваемости и смертности. Так, в 2007 г. в мире было зарегистрировано 12 млн заболевших злокачественными новообразованиями и 7,6 млн умерших от
них. Рак является причиной примерно 20% всех случаев смерти в промышленно развитых странах. Только за последнее десятилетие прошлого века заболеваемость злокачественными новообразованиями и смертность от них выросли в мире более чем на 23%. Согласно прогнозам, к 2020 г.
число новых случаев заболевания раком достигнет 16 млн в год, а случаев смерти – 10 млн. Значительная часть этого увеличения в абсолютном выражении обусловлена старением населения –
явлением, получившим название «демографический переход» [7].
«Чтобы организовать борьбу, надо знать врага и его диспозицию, надо ознакомиться с частотой болезни и ее распространением». Эти слова, сказанные в самом начале ХХ в. одним из основателей Всероссийского общества борьбы с раковыми заболеваниями И. Э. Гаген-Торном, актуальны и сейчас, столетие спустя [8].
Осуществляемая онкологической службой Республики Беларусь более 50 лет система обязательного учета всех новых случаев заболеваний злокачественными новообразованиями постоянно совершенствуется, что позволило накопить в РНПЦ ОМР им. Н. Н. Александрова огромный статистический материал о структуре и динамике онкологической заболеваемости населения начиная с 1970 г., т. е. за 38-летний период.
Материалы и методы исследования. Для оценки частоты и динамики заболеваемости раком в Республике Беларусь были использованы данные обязательной государственной регистрации злокачественных новообразований за период с 1970 по 2007 г. и демографические данные,
отражающие половозрастную структуру населения в указанные годы.
93
ус
и
ем
ия
н
ау
кБ
ел
ар
Выявление особенностей распространения злокачественных новообразований осуществлено
путем расчета экстенсивных и интенсивных показателей заболеваемости (повозрастных, грубых
и стандартизованных) в целом и по отдельным локализациям с разделением по полу и месту жительства (городское и сельское население).
Следует отметить, что объективная оценка динамики заболеваемости злокачественными новообразованиями населения Беларуси как в целом по республике, так и по отдельным ее областям за период с 1970 по 2007 г. в связи со значительным изменением численности и возрастной
структуры населения, произошедшим за это время, требует использования общепринятых в мировой статистике злокачественных опухолей стандартизованных показателей заболеваемости
(WORLD стандарт). Это позволяет нивелировать влияние на картину заболеваемости происходящих изменений половозрастной структуры населения, а также дает возможность корректного
сопоставления частоты заболеваемости раком в Беларуси и других странах мира. Для исключения влияния случайных колебаний при оценке динамики заболеваемости использован общепринятый в медицинской статистике метод выравнивания показателей путем скользящей средней
(с временным интервалом 3 года).
Результаты и их обсуждение. За последние 38 лет (1970–2007 гг.) в Беларуси выявлено
969 714 случаев злокачественных новообразований, из них 485 797 (50,1%) у мужчин и 483 917
(49,9%) у женщин. Для сравнения: число жителей в городе Бресте – 289 000, в Гродно – 304 000,
в Витебске – 348 000, в Могилеве – 358 000.
Если в 1970 г. диагноз злокачественного новообразования был установлен в 13 983 случаях
(38 заболевших в день), то в 2007 г. – в 39 946 (109 заболевших в день). Таким образом, за прошедшие 38 лет число ежегодно выявляемых случаев заболеваний злокачественными новообразованиями выросло в 2,9 раза (см. таблицу).
Т а б л и ц а 1. Число вновь выявленных случаев рака всех локализаций в Республике Беларусь
Годы
Мужчины
Женщины
Оба пола
1970
1975
1980
6 383
7 600
13 983
8 095
8 657
16 752
8 666
9 425
18 091
1985
1990
1995
2000
2007
10 798
10 763
21 561
13 748
12 957
26 705
16 082
14 576
30 658
16 965
16 075
33 040
19 642
20 304
39 946
ак
ад
Пол
ци
он
ал
ьн
ая
В начале 1970-х годов в структуре онкологической заболеваемости у мужчин превалировал
рак желудка (33,1%), легкого (16,4%), кожи (8,1%). Меньший удельный вес составлял рак мочевого пузыря (3,5%), предстательной железы (3,2%), прямой кишки (2,6%). У женщин в это же время
первые места занимал рак желудка (26,6%), шейки матки (11,2%), кожи (11,1%), молочной железы
(10,2%).
Значительные различия в динамике частоты злокачественных новообра­зований отдельных
локализаций (в направленности и темпах изменений) на протяжении последующих лет (их краткая характеристика приводится ниже) обусловили современную онкологическую ситуацию в рес­
публике.
В нынешней (2007 г.) структуре заболеваемости злокачественными новообразованиями
у мужчин преобладают опухоли легких (18,9%), затем следуют новообразования кожи (13,2%),
предстательной железы (10,2%), желудка (10,1%), толстой кишки (9,6%), почки (4,9%) и мочевого
пузыря (4,3%). К числу наиболее часто регистрируемых опухолей у женщин относятся злокачественные новообразования кожи (19,6%), молочной железы (17,7%), толстой кишки (10,4%), тела
матки (7,4%), желудка (6,8%), шейки матки (4,6%), яичников (4,5%), щитовидной железы (4,2%).
Следует, однако, заметить, что, учитывая длительный, занимающий годы процесс развития
злокачественной опухоли (от одной раковой клетки до клинического проявления заболевания),
в Беларуси кроме 40 тыс. выявленных в 2007 г. больных раком и 19 тыс. взятых на учет за первую половину 2008 г. по крайней мере еще у 200–250 тыс. людей опухоль уже развивается, пока
никак не давая о себе знать.
На
94
ус
и
На
ци
он
ал
ьн
ая
ак
ад
ем
ия
н
ау
кБ
ел
ар
Как свидетельствуют данные официальной медицинской статистики, в настоящее время злокачественные новообразования в Республике Беларусь составляют 0,5% всей первичной заболеваемости населения, занимая 13-е ранговое место. Злокачественные новообразования уступают
по числу заболевших неонкологическим болезням: органов дыхания, кровообращения и многим
другим.
Однако структура смертности населения Республики Беларусь представ­ляет собой совершенно иную картину. Злокачественные новообразования, составляющие 0,5% в общей структуре первичной заболеваемости населения, являются причиной смерти в 13,7% случаев от общей
смертности населения и стоят на втором месте, уступая лишь болезням системы кровообращения. Аналогичная по структуре картина смертности наблюдается в США и многих других странах, где злокачественные новообразования также являются второй по распространенности причиной смертности.
Кроме того, злокачественные новообразования занимают второе место в структуре первичной инвалидности населения Беларуси, составляя 20,4% и уступая лишь инвалидности от болезней системы кровообращения. Динамика первичной инвалидности населения трудоспособного
возраста вследствие злокачественных новообразований имеет четкую тенденцию к росту.
Таким образом, несмотря на очень малый удельный вес злокачественных новообразований
в структуре общей заболеваемости, смертность и первичная инвалидность от этой группы болезней устойчиво занимают вторые ранговые места, что, естественно, позволяет отнести проблему злокачественных новообразований к разряду ведущих медико-социальных проблем.
Следует отметить ряд фактов, уточняющих общую картину онкоэпидемиологической ситуации в Беларуси. Регистрируемый рост числа заболевших обусловлен как старением населения
(увеличением числа лиц среднего и старшего возраста), так и реальным изменением заболеваемости раком. Мы говорим «изменением», так как за прошедшие 38 лет динамика заболеваемости
злокачественными новообразованиями отдельных локализаций и сама структура онкологической заболеваемости мужчин и женщин имеют значительные различия.
Исследования, основанные на анализе 970 тыс. случаев злокачественных новообразований,
зарегистрированных в Беларуси в 1970–2007 гг., позволили объективно оценить онкоэпидемиологическую ситуацию в республике.
Подтверждены значительные различия в частоте злокачественных новообразований отдельных локализаций и уточнена их количественная характеристика. Практически во всех случаях
описываемых локализаций стандартизованные показатели заболеваемости раком у мужчин превышали таковые у женщин (за исключением опухолей щитовидной железы), причем на начальном и заключительном этапах наблюдения эти соотношения также в большинстве случаев имели существенные различия. Так, соотношения заболеваемости мужчины/женщины при раке
кожи в эти периоды составили 1,0/1,0 и 1,1/1,0, ободочной кишки – 1,0/1,0 и 1,4/1,0, прямой кишки –
1,0/1,0 и 1,7/1,0, почки – 1,6/1,0 и 1,9/1,0, желудка – 2,0/1,0 и 2,3/1,0, мочевого пузыря – 8,1/1,0
и 8,1/1,0, легкого – 6,7/1,0 и 13,6/1,0, пищевода – 4,6/1,0 и 14,0/1,0, гортани – 25,5/1,0 и 49,0/1,0 соответственно.
По сравнению с 1970 г. в 2007 г. у мужчин произошло значительное (в 1,8 раза) снижение заболеваемости раком желудка и в 2,6 раза – раком губы. В то же время заболеваемость раком пищевода и гортани возросла в 1,9 раза, легкого и мочевого пузыря – в 2,2, кожи – в 2,7, прямой
кишки – в 3,1, ободочной кишки – в 4,6, предстательной железы – в 5,9, почки – в 7,1. Общая
онкологическая заболеваемость у мужчин возросла в 1,8 раза.
У женщин частота рака желудка снизилась в 2,1 раза, шейки матки – в 1,2. В то же время показатель заболеваемости раком легкого увеличился в 1,1 раза, яичников – в 1,5, прямой кишки –
в 1,8, кожи – в 2,5, мочевого пузыря – в 2,3, ободочной кишки – в 3,4, молочной железы – в 3,1,
тела матки – в 3,5, почки – в 6,0, щитовидной железы – в 16,8. Общая онкологическая заболеваемость у женщин возросла в 1,8 раза [9–11].
Результаты этой многолетней работы позволяют сделать некоторые обобщающие выводы,
в частности установить элементы общности и различий временных трендов заболеваемости злокачественными опухолями отдельных локализаций, характерные для жителей Беларуси.
95
ус
и
ар
ел
кБ
ау
Рис. 1. Показатели заболеваемости злокачественными новообразованиями с отрицательной динамикой
ци
он
ал
ьн
ая
ак
ад
ем
ия
н
Установлено [12] 5 основных типов, характеризующих закономерности динамики заболеваемости солидными опухолями отдельных локализаций.
Злокачественные новообразования, частота которых снижалась на протяжении всего периода наблюдения. К ним относятся рак желудка у мужчин (снижение с 58,7 в 1974 г. до 33,2
в 2007 г.), рак желудка у женщин (снижение с 31,5 в 1970 г. до 13,0 в 2007 г.), рак губы у мужчин
(снижение с 7,9 в 1973 г. до 2,4 в 2007 г.) (рис. 1).
Злокачественные новообразования, показатели заболеваемости которыми не изменились
или изменились незначительно. Такой тип динамики характерен в основном для женщин с локализацией опухолей с низкими показателями их частоты. Это рак легкого (4,1–5,7), поджелудочной железы (2,4–3,7), мочевого пузыря (0,7–1,9), печени (1,2–2,0), губы (0,5–1,0), пищевода (0,3–
0,9), гортани (0,16–0,31) (рис. 2).
Злокачественные новообразования, показатели заболеваемости которыми возрастали относительно равномерно. Это опухоли ободочной кишки у мужского (увеличение от 3,3 в 1970 г.
Рис. 2. Показатели заболеваемости злокачественными новообразованиями с незначительными изменениями
их величины
На
96
ус
и
ар
ел
кБ
ау
ем
ия
н
Рис. 3. Показатели заболеваемости злокачественными новообразованиями, динамика которых возрастала относительно равномерно
ци
он
ал
ьн
ая
ак
ад
до 15,5 в 2007 г.) и женского (увеличение от 3,3 в 1971 г. до 11,6 в 2007 г.) населения, молочной
железы (от 13,0 в 1970 г. до 43,7 в 2007 г.), тела матки (от 4,3 в 1970 г. до 18,3 в 2007 г.), почки (от
1,2 в 1970 г. до 8,4 в 2007 г.) у женщин, меланомы кожи у мужчин (от 0,8 в 1973 г. до 3,6 в 2007 г.)
и женщин (от 1,2 в 1970 г. до 4,7 в 2007 г.) (рис. 3).
Злокачественные новообразования, показатели заболеваемости которыми вначале возрастали, а затем в разные периоды времени стабилизировались или проявили тенденцию к снижению. Этот тип динамики оказался характерен для рака легкого у мужчин (рост заболеваемости
от 28,7 в 1970 г. до 71,4 в 1995 г. с последующим снижением до 62,5 в 2007 г.), прямой кишки
у мужчин (от 4,3 в 1970 г. до 15,0 в 2001 г.) и женщин (от 4,2 в 1970 г. до 9,2 в 2000 г.), поджелудочной железы у мужчин (от 4,0 в 1970 г. до 8,4 в 1998 г.), гортани у мужчин (от 4,3 в 1970 г. до 11,3
в 1997 г.), мочевого пузыря у мужчин (от 5,8 в 1970 г. до 14,6 в 2001 г.), щитовидной железы
у мужчин (от 0,4 в 1970 г. до 3,4 в 1999 г.), яичников (от 7,8 в 1970 г. до 11,2 в 1997 г.) (рис. 4).
На
Рис. 4. Показатели заболеваемости злокачественными новообразованиями, положительная динамика которых
с 1990-х годов сменилась стабилизацией
97
ус
и
ар
ел
кБ
ау
ем
ия
н
Рис. 5. Показатели заболеваемости злокачественными новообразованиями с резко выраженной положительной
динамикой в последние 10–15 лет
ци
он
ал
ьн
ая
ак
ад
Злокачественные новообразования, относительно равномерное увеличение показателей заболеваемости которыми сменилось резким ростом в основном с середины 1990-х годов. Это рак
(не меланома) кожи у мужчин и женщин (от 13,8 у мужчин и 13,0 у женщин в 1970 г. до 22,0 и 17,1
соответственно в 1987 г. с последующим снижением заболеваемости до 17,6 у мужчин и 15,4
у женщин в 1991–1993 гг. и избыточным ростом заболеваемости с 1995 г. до 42,2 у мужчин и 36,6
у женщин в 2007 г.), предстательной железы (от 5,0 в 1970 г. до 11,5 в 1991 г. и затем до 32,0
в 2007 г.), почки (от 1,6 в 1970 г. до 4,3 в 1985 г. и до 16,4 в 2007 г.) среди мужского населения и рак
щитовидной железы у женщин (от 0,8 в 1970 г. до 3,7 в 1990 г. и затем до 14,0 в 2002 г. с последующей стабилизацией) (рис. 5).
Изменение с течением времени значений повозрастных и стандартизованных по возрасту показателей заболеваемости является несомненным свидетельством истинности происходящих изменений уровня заболеваемости злокачественными новообразованиями, не связанных со старением населения Беларуси.
Вышеуказанные значительные различия в динамике частоты злокачественных новообразований отдельных локализаций (в направленности и темпах изменений) и обусловили современную онкологическую ситуацию в республике.
Так, по данным Белорусского канцер-регистра [13], в 2007 г. было выявлено 39 946 новых
случаев злокачественных новообразований, из них: рака кожи – 6 457 (16,6%), легкого – 4 187
(10,7%), толстого кишечника – 3 863 (9,9%), молочной железы – 3 554 (9,1%), органов женской репродуктивной системы (шейки и тела матки и яичников) – 3 289 (8,4%), желудка – 3 277 (8,4%),
предстательной железы – 1 961 (5,0%), почки – 1 624 (4,2%), лейкозов – 1 157 (3,0%), рака мочевого пузыря – 1 034 (2,7%), щитовидной железы – 1 013 (2,6%), лимфом – 826 (2,1%), рака гортани –
586 (1,5%), пищевода – 424 (1,1%).
Упомянутый ранее демографический переход в полной мере затрагивает и нашу республику.
В Беларуси начиная с 2009 г. прогнозируется постоянное увеличение численности населения
в возрасте 55–75 лет. Число жителей этого возраста к 2024 г. может возрасти от 1 835 808 до
2 312 297, т. е. увеличиться на 500 000 [10]. А так как возраст человека является одним из решающих факторов, который определяет вероятность заболевания раком, то даже при сохранении повозрастных показателей заболеваемости на нынешнем уровне в последующие годы следует ожидать значительного увеличения числа случаев заболеваний и заболевших злокачественными новообразованиями. Однако, принимая во внимание ожидаемое (на основании приведенных выше
На
98
ус
и
ар
ел
кБ
ау
Рис. 6. Динамика заболеваемости злокачественными новообразованиями и смертности от них
в Республике Беларусь (на 100 000 населения)
На
ци
он
ал
ьн
ая
ак
ад
ем
ия
н
тенденций) дополнительное увеличение частоты заболеваемости мужчин раком ободочной кишки, почки, предстательной железы, кожи (в т. ч. и меланомой), а женщин – раком молочной железы, тела матки, ободочной кишки, кожи (в т. ч. и меланомой), реальное повышение может, вполне
вероятно, оказаться значительно большим.
Оба этих фактора диктуют настоятельную необходимость принятия мер по увеличению
объемов и повышению качества онкологической помощи населению.
Начиная с 1970 г. наряду с повышением заболеваемости злокачественными новообразованиями возрастала, хотя и меньшими темпами, и смертность от них, которая достигла максимума
в 1999 г., когда число умерших достигло 19 812, а показатель смертности – 194,3 на 100 000 населения. В последующие годы, несмотря на продолжающийся рост заболеваемости раком (от
329,1 до 411,2, т. е. на 25%), смертность от злокачественных новообразований в 2007 г. снизилась
до 184,9 на 100 000 населения, т. е. на 5,1% (рис. 6), составив, по данным Министерства здравоохранения Республики Беларусь, в 2007 г. 17 941 случай [14]. Темпы снижения смертности от злокачественных новообразований, достигнутые в Республике Беларусь за последние годы, соответствуют достижениям в этой области в странах Евросоюза и США [15].
Достигнутые результаты (снижение смертности при росте заболеваемости) связаны главным
образом с сохранением в Беларуси активной деятельности онкологической службы, переоснащением материально-технической базы онкологических учреждений республики, в которых проходят лечение более 90% онкологических больных, бесплатным и общедоступным лечением,
преемственностью оказания специального лечения таким пациентам, внедрением в практику работы всех онкологических учреждений национальных протоколов (стандартов) диагностики
и лечения, ограничением выполнения плановых хирургических вмешательств онкологическим
больным в лечебных учреждениях неонкологического профиля.
Вместе с тем в области противораковой борьбы еще остается целый ряд нерешенных проблем. Основными из них являются:
1. Высокий процент выявления больных с III–IV стадиями заболевания, когда ставится под
сомнение сама возможность излечения.
2. Низкая настороженность в отношении злокачественных опухолей у населения и недостаточная грамотность со стороны врачей и среднего медперсонала общей лечебной сети.
3. Крайне недостаточное число учебных часов по онкологии в высших учебных медицинских
заведениях, а также практически их полное отсутствие в медицинских училищах и колледжах.
4. Практически отсутствие рекомендуемых ВОЗ скрининговых программ с доказанной их
эффективностью, позволяющих выявить злокачественную опухоль еще до появления симптомов болезни при раке молочной железы, шейки матки, толстой кишки, предстательной железы.
99
ус
и
ак
ад
ем
ия
н
ау
кБ
ел
ар
Высокая смертность, все еще низкая 5-летняя выживаемость онкобольных и стоящие перед
онкослужбой задачи требуют в современных условиях поиска новых путей в решении вышеуказанных проблем.
По нашему мнению, наиболее эффективным и реальным рычагом в изменении онкологической ситуации в стране может стать разработка Государственной программы противораковой
борьбы. Придание программе статуса государственной вызвано необходимостью привлечения
к ее разработке и исполнению ряда министерств, ведомств и подведомственных им организаций.
Именно таким путем осуществляется борьба со злокачественными опухолями (противораковая борьба) во всех развитых странах мира. В основу таких национальных программ США, стран
Евросоюза положены разработки и рекомендации ВОЗ [1, 16, 17].
Какими же должны быть основные цели и задачи Национальной программы в области онкологии?
Основной целью Программы должно стать снижение смертности от злокачественных новообразований на основе скоординированного межотраслевого комплекса мероприятий, предусматривающих профилактику, раннюю диагностику, а также лечение и диспансеризацию онкологических больных.
Для достижения этой глобальной цели необходимо решить следующие задачи:
формирование здорового образа жизни, повышение устойчивости организма к вредным факторам, предупреждение воздействия канцерогенов (первичная профилактика рака);
раннее активное выявление (скрининг) предраковых заболеваний и бессимптомного рака
и их лечение (вторичная профилактика рака);
предупреждение рецидивов (возврата) болезни и новых случаев опухолевых заболеваний
у излеченных онкологических больных (третичная профилактика рака);
диспансеризация лиц в контингентах с повышенным онкологическим риском и онкологических больных;
создание национального канцер-регистра наследственных онкологичес­ких заболеваний;
укрепление материально-технической базы онкологической службы;
повышение качества и эффективности лечения больных злокачественными новообразованиями при оптимизации затрат;
укрепление нормативной, правовой, организационно-методической, информационной базы
организаций здравоохранения, оказывающих онкологическую помощь населению.
Программа должна включать такие основные разделы, как организационно-методическое
и правовое обеспечение, первичная, вторичная и третичная профилактика злокачественных опухолей, паллиативная помощь; иметь научную поддержку.
ая
Организационно-методическое и правовое обеспечение
ци
он
ал
ьн
разработку нормативных правовых актов, регламентирующих порядок организации противораковой борьбы и оказания медицинской помощи больным злокачественными новообразованиями;
совершенствование государственной учетно-отчетной документации по онкологическим заболеваниям;
совершенствование программ профессиональной подготовки и переподготовки по онкологии и медицинской радиологии врачей, среднего медицинского персонала и студентов; разработку новых квалификационных требований по онкологии и медицинской радиологии для аттестации врачей и среднего медперсонала;
проведение ежегодных межведомственных республиканских совеща­ний и областных семинаров по вопросам организации противораковой борьбы;
развитие международного сотрудничества по вопросам противораковой борьбы;
совершенствование госпитального и республиканского канцер-регистров, создание национального регистра наследственных онкологических заболеваний;
разработку мероприятий по социальным и психологическим аспектам противораковой борьбы.
На
100
ус
и
ал
ьн
ая
ак
ад
ем
ия
н
ау
кБ
ел
ар
Первичная профилактика рака
Существует ряд неопровержимых доказательств того, что рак можно предотвратить. Под
первичной профилактикой этого заболевания понимают систему мероприятий, направленных
на предупреждение возникновения злокачественных опухолей и предшествующих им предопухолевых состояний путем устранения, ослабления или нейтрализации воздействия неблагоприятных факторов окружающей среды и образа жизни, а также повышения неспецифической резистентности организма [18, 19]. Стратегической целью первичной профилактики рака является
снижение онкологической заболеваемости населения.
Общепризнано [1, 6, 20], что в 80–90% случаев наличие онкологического заболевания у человека обусловлено действием канцерогенных факторов окружающей среды и особенностями образа жизни. Этот факт служит отправной точкой при формировании всех профилактических
противораковых программ, принятых в экономически развитых странах. Определены основные
направления, позволяющие в рамках первичной профилактики рака добиться реального снижения онкологической заболеваемости населения:
борьба с табакокурением;
рационализация питания;
повышение физической активности и борьба с избыточной массой тела;
уменьшение воздействия канцерогенных химических и физических факторов (производство,
природная среда, жилище);
профилактика воздействия инфекционных канцерогенных факторов.
Выполнение данного раздела Программы, которое возможно только на общегосударственном уровне с привлечением к работе различных министерств и ведомств, предусматривает проведение следующих основных мероприятий:
1. Разработку нормативных актов, направленных на снижение потребления табака и алкогольных напитков.
2. Определение, учет и государственную регистрацию канцерогеноопасных производств,
определение перечня канцерогенов и канцерогеноопасных веществ, находящихся в Беларуси.
3. Разработку проекта закона Республики Беларусь «О надзоре и контроле за канцерогенными веществами, процессами и производствами».
4. Разработку государственного регистра лиц, имеющих и имевших профессиональный контакт с химическими, физическими, биологическими, радиационными и другими канцерогенными факторами.
5. Разработку программы вакцинации против вирусного гепатита В.
6. Противораковую просветительную работу среди населения:
регулярное проведение на радио и телевидении прямых эфиров с учеными и врачамионкологами по вопросам профилактики, ранней диагностики злокачественных новообразований, лечения и реабилитации онкологических больных;
подготовка материалов по вопросам профи­лактики и ранней диагностики злокачественных
новообразований и их регулярная публикация в периодической печати;
создание и демонстрация документальных фильмов, интервью с людьми, излеченными от
злокачественных новообразований;
издание брошюр и памяток населению по вопросам первичной профилактики и ранней диагностики злокачественных новообразований.
7. Активное выявление семей с наследственной онкопатологией, их консультирование и постоянное наблюдение (организация онкогенетического регистра).
На
ци
он
Вторичная профилактика рака (скрининг и ранняя диагностика)
Мировой опыт борьбы со злокачественными новообразованиями убедительно демонстрирует, что только активное, наступательное внедрение методов выявления и лечения предопухолевых заболеваний и рака у людей, еще не имеющих признаков заболевания (скрининг, т. е. массовое обследование населения для выявления заболевания), является одной из самых эффективных
мер по снижению смертности от этой болезни [21, 22].
101
ус
и
ьн
ая
ак
ад
ем
ия
н
ау
кБ
ел
ар
В рекомендациях ВОЗ [6, 22, 23] по борьбе со злокачественными новообразованиями указывается, что при планировании мероприятий по скринингу должны учитываться следующие важные моменты:
убеждение населения в необходимости участия в программах скрининга, что является одной
из наиболее важных мер по достижению высокого процента участия, особенно при эффективном распространении знаний через средства массовой информации;
доступное обслуживание;
качественное обеспечение всех этапов процесса.
Скрининговые программы в странах Западной Европы и США [17, 20–23] доказали, что регулярная маммография позволяет снизить смертность при раке молочной железы (на 30%), цитологическое исследование мазков – при раке шейки матки (на 80%), использование теста на скрытую кровь – при раке ободочной и прямой кишок (на 15%).
К разряду эффективных скрининговых программ относятся и программы с использованием
теста простатспецифического антигена при раке предстательной железы. Доказано также, что
низкодозное спирально-компьютерное сканирование может выявить рак легкого на ранней стадии, операбельность при которой составляет более 80% [24].
В Республике Беларусь вышеуказанные локализации рака в общей онкологической заболеваемости суммарно составляют 40%.
Среди мероприятий по выполнению данного раздела Программы основными являются:
1. Разработка регламентирующих документов по проведению скрининга рака шейки матки
(определение возрастных групп обследуемых, периодичности обследования, материального обеспечения и т. д.).
2. Разработка регламентирующих документов по проведению скрининга рака молочной железы (определение возрастных групп, периодичности обследования, материального обеспечения
и т. д.).
3. Организация в г. Минске, областных и крупных районных центрах при поликлиниках кабинетов маммологического скрининга, оснащенных современными маммографами и укомплектованных обученными штатами врачей и лаборантов.
4. Разработка регламентирующих документов по проведению скрининга колоректального
рака (определение возрастных групп, периодичности обследования, материального обеспечения
и т. д.).
5. Разработка регламентирующих документов по проведению скрининга рака предстательной железы (определение возрастных групп, периодичности обследования, материального обеспечения и т. д.).
6. Разработка регламентирующих документов по созданию совместной программы «Генетика в онкологии» для генетической консультации лиц, родственники которых страдают генетически детерминированными онкозаболеваниями (перечень заболеваний, материально-техническое,
кадровое обеспечение и др.).
7. Разработка системы пропаганды участия населения в скрининговых программах.
8. Разработка региональных про­г рам­м по раннему выявлению рака.
9. Привлечение к работе по раннему выявлению рака медицинских учреждений негосударственной формы собственности.
ци
он
ал
Третичная профилактика рака
Одним из важных способов снижения и предотвращения смертности от рака является лечение уже существующего заболевания, предупреждение его рецидивов, а также развития других
форм рака (третичная профилактика рака) [17, 18, 22, 23]. Внедрение современных лечебных технологий позволило уже сегодня добиться заметных успехов в лечении некоторых видов опухолей. Однако при основных видах рака (легких, желудка, толстой кишки, молочной железы, урогенитальный рак) достижения оказались не такими успешными, как ожидалось. Большое значение имеет и качество жизни больных после проведенного лечения.
Среди мероприятий по выполнению данного раздела Программы основными являются:
На
102
ус
и
ар
1. Регулярное переиздание протоколов (алгоритмов) диагностики и лечения злокачественных
опухолей с учетом научных достижений в отечественной и мировой онкологии в области новых
технологий.
2. Проведение оперативной реструктуризации онкологических диспансеров в соответствии с
протоколами (алгоритмами) диагностики и лечения злокачественных опухолей.
3. Организация подготовки медицинских физиков (инженерно-технического персонала).
ел
Паллиативная помощь
ау
кБ
Организация комплексной паллиативной помощи, направленной на ослабление боли, купирование других симптомов, психологическую и духовную поддержку на основе разработанных
минимальных национальных стандартов лечения хронического болевого синдрома [1], должна
включать:
а) просветительную работу и обучение лиц, оказывающих паллиативную помощь, а также
широкой общественности;
б) обеспечение в национальном масштабе максимального охвата больных всевозможными
службами, включая и помощь на дому.
На
ци
он
ал
ьн
ая
ак
ад
ем
ия
н
Научное обеспечение Программы
Базовой основой обеспечения научного сопровождения Программы является разработка научных подходов к организации исследований в области противораковой борьбы, эпидемиологии
злокачественных новообразований, современных методов диагностики, лечения и профилактики рака.
Реализация мероприятий Программы позволит:
обеспечить снижение заболеваемости и смертности населения Республики Беларусь;
стабилизировать инвалидизацию больных с онкологическими заболеваниями, снизить процент тяжелой инвалидизации (I группа);
увеличить выявление больных злокачественными новообразованиями на I–II стадиях;
разработать новые направления в скрининге, диагностике и лечении злокачественных новообразований;
оптимизировать использование ресурсов, материально-технической базы и кадрового потенциала онкологической службы.
Социальная эффективность Программы:
формирование здорового образа жизни населения Республики Беларусь на основе заинтересованности и личной ответственности граждан за состояние собственного здоровья и здоровья
своих детей;
улучшение качества диагностики онкологических заболеваний при профилактических осмотрах за счет внедрения скрининговых программ, снижение уровня смертности на первом году
установления диагноза;
повышение эффективности оказания медицинской помощи онкологическим больным;
повышение квалификации кадрового состава здравоохранения.
Экономическая эффективность Программы:
снижение онкологической заболеваемости;
оптимизация расходов государства на профилактику, диагностику, лечение (в том числе дорогостоящее стационарное) онкологических заболеваний и реабилитацию больных, а также на
выплату единовременных пособий по временной нетрудоспособности, пенсий по инвалидности,
компенсаций по социальным льготам (в том числе по оплате лекарственных средств);
снижение затрат на лечение за счет внедрения стационарзамещающих технологий;
внедрение современных цифровых технологий для получения, хранения и передачи медицинской информации;
стандартизация диагностики и лечения в соответствии с действующими протоколами.
Заключение. На современном этапе развития общества проблема борьбы со злокачественными новообразованиями требует комплексного подхода к ее решению, который возможен толь103
ус
и
ар
ко на государственном уровне путем целенаправленных скоординированных действий органов
законодательной и исполнительной власти всех уровней, всех служб государственной системы
здравоохранения, научных и общественных организаций.
Разработка Национальной программы противораковой борьбы и ее реализация послужат
основой для обеспечения планирования и эффективного, действенного и рационального использования ресурсов, выделяемых на борьбу со злокачественными новообразованиями.
ел
Литература
ак
ад
ем
ия
н
ау
кБ
1. G a r c i a M., J e m a l A., W a r d E. M. et al. Global Cancer Facts & Figures. Atlanta, 2007.
2. С а ф р о н н и к о в а Н. Р. Превентивная онкогинекология. СПб., 2008.
3. К а з и е в А. Ю. // Материалы III съезда онкологов и радиологов СНГ. Ч. I. Минск, 2004. С. 225.
4. WHO National Cancer Control Programmes: Policies and Managerial Guidtlines. Geneva, 2002.
5. GLOBOCAN 2002: Cancer Incidence, Mortality and Prevalence Worldwide. IARC CancerBase No 5, version 2.0.
IARC Press, 2004.
6. S t e w a r t B. W., K l e i h u e s P. WHO World Cancer Report. Lyon, 2003.
7. Н а п а л к о в Н. П. // Вопр. oнкол. 2004. Т. 50, № 2. C. 127–144.
8. Г а г е н-Т о р н И. Э. // Русский врач. 1908. Т. 7, № 50. С. 1680–1685.
9. Z a l u t s k y I. V. et al. // UICC World Cancer Congress Free Papers. Washington, 2006. P. 173–178.
10. З а л у ц к и й И. В. и др. // Вопр. онкол. 2007. Т. 53, № 3. С. 274–281.
11. З а л у ц к и й И. В. и др. // Онкол. журн. 2007. T. 2, № 2. С. 4–14.
12. З а л у ц к и й И. В. и др. Эпидемиология злокачественных новообразований в Беларуси. Минск, 2006.
13. П о л я к о в С. М., Л е в и н Л. Ф., Ш е б е к о Н. Г. Злокачественные новообразования в Беларуси 1998–2007 /
Под ред. А. А. Граковича, И. В. Залуцкого. Минск, 2008.
14. Здравоохранение в Республике Беларусь: офиц. стат. сб. за 2007 г. Минск, 2008.
15. A h m e d i n J., R e b e c c a S., E l i z a b e t h W. et al. // CA Cancer J. Clin. 2007. Vol. 57. P. 43–66.
16. National Cancer Control Programmers: Executive Summary. Health & Development Networks (HDN). http:// www.
Bdnet. org.
17. S c h r i j v e r s D., S e n n H. J., M e l l s t e d H. et al. ESMO handbook of cancer prevention. Informa Healthcare,
2008.
18. Профилактика и лечение злокачественных новообразований в современных условиях: материалы Всерос.
науч.-практ. конф. с междунар. участием / Под ред. А. Ф. Лазарева. Барнаул, 2007. C. 20.
19. M a r t i n-M o r e n a J. M. et al. // Eur. J. Cancer. 2008. doi: 10.1016/j. ejca.2008.02.002. P. 1–14.
20. C o g l i a n o V. J. // Профилактика и лечение злокачественных опухолей, связанных с курением: тез. докл.
Рос.-амер. конф. M., 2006. С. 9–10.
21. H a k a m a M. et al. // Eur. J. Cancer. 2008. doi: 10.1016/j. ejca.2008.02.013. P. 2–10.
22. P e r r y N., B r o e d e r s M., d e W o l f C. et al. // Ann. Oncol. 2008. Vol. 19. P. 614 –622,
23. B o y l e P., A u t i e r P., B a r t e l i n k H. et. al. // Ann. Oncol. 2003. Vol. 14. P. 973–1005.
24. S u l l i v a n D. C. // Профилактика и лечение злокачественных опухолей, связанных с курением: Тез. докл.
Рос.-амер. конф. M., 2006. С. 32–35.
ая
I. V. Zalutsky
Cancer control strategy
ьн
N. N. Alexandrov National Cancer Center of Belarus, Minsk
Summary
На
ци
он
ал
The article considers the problems on cancer incidence in Belarus. The distribution of cancer incidence in the country is
characterized over the period of more than 30 years; the changes, which occurred over the above period, are described. The
ways of improving the demographic safety with regard for the cancer factor are proposed.
ар
СЕ­Р­Ы Я МЕДЫЦЫНСКІХ НА­ВУК
ел
УДК 616.15-005.1-08-071 (476)
В. И. ПРОХОРОВА, Н. Н. КОЛЯДКО
ус
и
ВЕСЦI НА­Ц­Ы Я­НАЛЬ­НАЙ АКА­ДЭМII НА­ВУК БЕ­ЛА­РУСI № 3 2009
кБ
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ТЕСТА ГЕНЕРАЦИИ ТРОМБИНА
ДЛЯ ОЦЕНКИ КОАГУЛЯЦИОННОГО ПОТЕНЦИАЛА КРОВИ
Республиканский научно-практический центр онкологии и медицинской радиологии
им. Н. Н. Александрова, Минск, Беларусь
ау
(Поступила в редакцию 05.11.2008)
На
ци
он
ал
ьн
ая
ак
ад
ем
ия
н
Давно известно, что развитие тромбоза определяется силой локального триггера, местными
условиями тока крови и ее коагуляционным потенциалом. Длительное время эту характеристику крови оценивали с помощью времени ее свертывания, что не отражало действительной функции и количества основного фермента системы свертывания – тромбина, так как более 95% от
его общего количества формируется уже после того, как началось свертывание крови. Поэтому
такие показатели, как время свертывания крови и количество образующегося тромбина, заслуживают того, чтобы быть оцененными [1].
Тромбин – ключевой действующий фактор гемостаза, в генерации и последующей инактивации которого принимают участие все составляющие системы свертывания. Свои многочисленные функции он проявляет как в отношении компонентов крови, так и в отношении сосудистой
стенки [2].
Однако даже в системе гемостаза все его функции и свойства до сих пор не изучены. Основными являются протеолиз фибриногена до фибрин-мономеров, активация факторов V, VII, VIII,
XI, XIII, активация тромбоцитов, протеина С в комплексе с тромбомодулином и др. [3]. Влияние
его не ограничивается только прокоагулянтными и антикоагулянтными свойствами, а распространяется и на другие системы организма. Кроме того, как потенциальный митоген он влияет
на гладкомышечные клетки, макрофаги и эндотелиальные клетки. Это действие его как фактора
роста является следствием не только прямой активации митогенных путей, но и альфа-тромбинзависимой секреции собственно факторов роста. Тромбин ответственен также за выделение цитокинов, вазоактивных веществ и хемоаттрактантов. Энзим усиливает проницаемость сосудистого эндотелия, способствует адгезии на эндотелиальных клетках, индуцирует сокращение
гладкомышечных клеток, играет ключевую роль в развитии мышечной ткани [4]. Тромбин является одним из инициаторов ангиогенеза (как нормального, так и патологического), обладает способностью напрямую активировать пролиферацию эндотелиальных клеток, участвует в росте
и метастазировании опухолей [4, 5].
Во всех этих процессах действия тромбина строго регулируются путем влияния на его генерацию и деструкцию. Его нерегулируемая продукция в «неправильных» местах приводит
к тромбообразованию [6].
Ключевая роль IIa фактора отражена в дополненной в последние годы теории свертывания
крови, согласно которой основной составляющей гемостаза является генерация тромбина. В так
называемой каскадно-клеточной модели свертывания выделяют три перекрывающие друг друга
фазы.
Первая фаза – инициация (initiation) – развивается в месте повреждения сосудистой стенки
на поверхности продуцирующих тканевой фактор (ТФ) субэндотелиальных клеток, таких как
фибробласты и моноциты. ТФ соединяется с небольшим количеством ФVIIa, всегда присутствующего в крови, и одновременно активирует ФX, ФIX, а ФXa – ФV. Формирование комплекса Xa/
105
ус
и
ци
он
ал
ьн
ая
ак
ад
ем
ия
н
ау
кБ
ел
ар
Va приводит к образованию незначительного (стартового) количества тромбина, который играет
важнейшую роль в процессе активации тромбоцитов.
Вторая фаза – усиление (amplification) и распространение (propagation) – протекает на поверхности активированных тромбоцитов в месте повреждения. Комплекс фактор Виллебранда/ФVIII
связывается с тромбоцитами, где ФVIII освобождается и активируется тромбином. В процессе
активации тромбоцитов из альфа-гранул высвобождается ФV, который под действием ФXa или
тромбина переходит в ФVa. На фосфолипидной поверхности тромбоцитов формируются прокоагулянтные комплексы – теназный и протромбиназный.
Третья фаза – генерация значительного количества тромбина – приводит к формированию
фибринового сгустка [7].
При различных патологических состояниях, врожденных или приобретенных, происходят
нарушения в звеньях системы гемостаза, в результате чего возможны тромбоз либо кровотечение. Для изучения механизмов этих процессов и ведения таких больных необходим постоянный
лабораторный контроль системы гемостаза. Это важно как для диагностики нарушений, так
и для контроля проводимой терапии.
Первыми тестами для оценки риска тромбоза и кровотечения были определение показателя
протромбинового времени (ПТВ), введенного Quick в 1935 г., и показателя активированного частичного тромбопластинового времени (АЧТВ), предложенного Langdell et al. в 1953 г. [4]. Эти
стандартные клоттинговые тесты оценивают момент, когда образовалось всего лишь 4% тромбина от его общего количества. Таким образом, данные тесты информативны для идентификации грубых нарушений системы гемостаза, однако они не могут отразить реакцию системы гемостаза и, в частности, тромбина. Имеющийся ограниченный набор функциональных и генетических методов лабораторных исследований, пригодных для оценки риска нарушений гемостаза,
не позволяет оценить потенциальную реакцию «стимул – ответ» системы свертывания [8]. Поэтому основной задачей проводимых исследований является создание такого теста, который отражал бы состояние гемостаза, как, например, ЭКГ отражает работу миокарда.
Одной из попыток создания такого метода стали исследования биохимической научной группы Института кардиологии в Маастрикте, Голландия, где с 60-х годов XX в. ведутся работы по
изучению физиологии и патофизиологии системы свертывания крови, в частности действия фермента тромбина, и по созданию лабораторного метода исследования его генерации в процессе
активации системы гемостаза в норме и при различных патологических процессах. В результате
их многолетней работы был разработан новый тест для регистрации процесса генерации тромбина в реальном времени, на который был получен патент.
Оригинальная концепция теста генерации тромбина (ТГТ) практически одновременно была
описана двумя научными группами: в Radcliffe Infirmary, Oxford (Macfarlane & Biggs, 1953),
и в Hammersmith Hospital, London (Pitney & Dacie, 1953). Это было двухфазное исследование,
сложное в исполнении и интерпретации [9].
Начиная с 1986 г. Hemker et al. модифицировали ТГТ несколько раз. Согласно первой модификации, генерацию тромбина измеряли в плазме крови пациентов после добавления триггера, для чего в раствор, содержавший тромбин-специфичный хромогенный субстрат, в фиксированные интервалы времени вносили небольшое количество реакционной смеси. Значения
количества образовавшегося тромбина во времени наносили на график и получали кривую генерации тромбина, или тромбограмму. Авторы также создали компьютерную программу, способную рассчитать параметры, характеризующие тромбограмму, – лаг-фазу, высоту пика, или
максимальное количество тромбина, время до достижения пика и эндогенный потенциал
тромбина. Последний показатель, рассчитанный по площади под кривой генерации тромбина,
характеризовал общее количество тромбина, образовавшегося за определенное время, после
исключения из общей амидолитической активности вклада комплекса альфа2– макроглобулин–
тромбин, который не способен превратить фибриноген в фибрин, но проявляет амидолитическую активность, связываясь со специфическим субстратом. Предполагалось, что ТГТ более
чувствителен, чем традиционные клоттинговые тесты для диагностики состояний гипо- и гиперкоагуляции [10].
На
106
ус
и
ци
он
ал
ьн
ая
ак
ад
ем
ия
н
ау
кБ
ел
ар
В 1993 г. ТГТ был модифицирован еще раз путем замены субстрата на медленно реагирующий тромбин-специфичный хромогенный субстрат, что позволило использовать длительное
фотометрическое измерение расщепления тромбином паранитроанилина без длительной процедуры распределения плазмы по пробиркам и сделало возможным измерение необходимых показателей на обычном автоматическом биохимическом анализаторе. Однако, несмотря на усовершенствование, в данной методике имелся и недостаток: перед исследованием плазму необходимо
было дефибринировать [11]. При использовании хромогенного субстрата генерация тромбина
в плазме, содержавшей фибриноген/фибрин, была на 50% ниже, чем в дефибринированной плазме [9].
В 2002 г. хромогенный субстрат был заменен на «медленный» флуорогенный. Основным
преимуществом этой модификации являлось то, что мутность, появлявшаяся из-за наличия фибрина, не нарушала флуоресцентный сигнал. Следовательно, как бедная, так и богатая тромбоцитами плазма могли быть исследованы без предварительного дефибринирования [10]. (Для
сравнения: в отличие от хромогенного субстрата в экспериментах с флуоресценцией было показано, что активность тромбина значительно выше при наличии фибрина, чем при его отсутствии
[12]. Скорее всего, это происходит из-за того, что тромбин, находящийся в связанном состоянии
с фибрином, измеряется так же, как и свободный тромбин [9]).
Следующей проблемой, вставшей на пути исследователей, явилось отсутствие прямой линейной зависимости между активностью тромбина и флуоресцентным сигналом. Это объяснялось поглощением субстрата и нелинейной интенсивностью флуоресцентного сигнала при возрастании концентрации флуоресцирующих молекул. Проблема была разрешена после создания
Calibrated Automated Thrombogram (CAT), где генерация тромбина в образце сравнивалась с генерацией тромбина в параллельной пробе с известной постоянной активностью тромбина [13].
Действие CAT основано на использовании как «медленного» флуорогенного субстрата, так
и калибратора тромбина. Последний представляет собой модифицированный тромбин с известной активностью, который не взаимодействует с каким-либо плазматическим субстратом или
ингибитором.
Процесс исследования и регистрации результатов происходит следующим образом. Исследуемую плазму делят на две части, в одну из которых добавляют реагент-триггер, содержащий
определенную концентрацию тканевого тромбопластина и фосфолипидов, а в другую – кали-
На
Тромбограмма – графическое изображение процесса генерации тромбина
107
ус
и
ци
он
ал
ьн
ая
ак
ад
ем
ия
н
ау
кБ
ел
ар
братор тромбина. Затем в обе части добавляют смесь флуорогенного субстрата с буферным раствором. Регистрацию флуоресцентного сигнала начинают с момента добавления последнего реагента и продолжают в течение установленного времени в заранее установленные равные промежутки (каждые 10, 20, 30 с). В результате через 30–60 мин можно получить до 24 тромбограмм
(см. рисунок), дающих изображение процесса генерации тромбина в динамике (в реальном времени).
По тромбограмме можно оценить несколько показателей:
1) лаг-фазу (lag-time) – период, в который собственно начинается генерация тромбина (соответствует времени свертывания), мин;
2) эндогенный потенциал тромбина, или ЭПТ (endogenous thrombin potential, ETP), – площадь
под кривой тромбограммы, нМоль·мин;
3) высоту пика (peak height, Cmax) – пиковое количество тромбина, или пик тромбиновой активности, нМоль;
4) TTP (time to peak, Тmax) – время достижения пикового количества тромбина, мин.
Наибольший интерес представляет такой показатель тромбограммы, как площадь под кривой, или ЭПТ. Определяемый как количество тромбина, которое может быть генерировано после
in vitro активации свертывания крови тканевым тромбопластином и фосфолипидами
(в качестве заместителей тромбоцитов), ЭПТ был предложен создателями как лабораторный показатель для исследования гипер- и гипокоагуляционных свойств крови [2]. Он характеризует
тот объем ферментативной «работы», которую потенциально может выполнить тромбин в течение своей активной жизни [14, 15].
Метод САТ достаточно новый. Первые публикации с результатами исследований, где отражены варианты и возможности использования метода, появились лишь несколько лет назад. Более 200 лабораторий по всему миру используют его для научных исследований. Рассмотрим некоторые из них, проведенные с помощью ТГТ в его последней модификации. Здесь можно выделить несколько основных направлений.
1. Изучение системы гемостаза.
2. Оценка коагуляционного статуса как у здоровых лиц, так и у пациентов стационаров различного профиля.
3. Оценка препаратов антикоагулянтной и прокоагулянтной терапии.
4. Оценка коагуляционного статуса при переливании различных компонентов крови.
С этой точки зрения изучение системы гемостаза, т. е. отражение состояния системы свертывания через генерацию и «работу» его основного компонента – тромбина, было начато авторами
метода. В качестве примера можно привести исследование 2002 г. C. Hemker et al. [16], которые
изучили связь между концентрацией факторов свертывания, параметрами тромбограммы и тяжестью клинически наблюдаемых кровотечений у пациентов с врожденным дефицитом протромбина, факторов V, VII, X, XI и XII. Было выявлено, что патологически низкая тромбограмма
у пациентов с кровотечением предполагает наличие дефекта в плазменной части системы свертывания. Для изучения процесса генерации тромбина при патологии необходимо сначала оценить этот процесс в норме и выявить зависимость его от различных факторов. Одним из таких
факторов, как выяснилось, является возраст. В 2006 г. группой австрийских ученых Harald Haidl,
Christina Cimenti et al. [17] методом САТ была исследована генерация тромбина у 121 ребенка
и 86 взрослых разного возраста. Зависимость генерации тромбина от возраста была выявлена
даже после ювенального периода. Результаты данного исследования соответствовали более раннему наблюдению, показавшему, что с возрастом риск тромбоэмболии возрастает.
Кроме того большое значение имеет оценка коагуляционного статуса (прокоагулянтного или
антикоагулянтного) у пациентов с различной нозологией. Изучению этого вопроса посвящено
много публикаций. ТГТ для этих целей использовали и до его последней модификации.
Так, в 2001 г. G. Freyburger et al. [18], Франция, используя хромогенный субстрат, показали
возможность применения ТГТ для оценки состояния системы гемостаза гинекологических больных при лапароскопических операциях. Была показана активация системы гемостаза после операции у больных с предоперационно повышенным эндогенным потенциалом тромбина. И нао-
На
108
ус
и
На
ци
он
ал
ьн
ая
ак
ад
ем
ия
н
ау
кБ
ел
ар
борот, стресс, связанный с хирургическим вмешательством, не вызывал увеличения генерации
тромбина у пациентов, у которых до операции эндогенный потенциал был снижен.
ТГТ применяли и для оценки влияния некоторых препаратов на коагуляционный статус.
В 2002 г. B. C. Kuenen et al. [19] с целью исследования действия препарата – ингибитора ангиогенеза на коагуляционный каскад у онкологических больных использовали ТГТ параллельно
с другими тестами, отражающими деятельность системы гемостаза (тромбин-антитромбиновый
комплекс, фрагменты протромбина 1 + 2 и др.), а также с учетом показателей активности эндотелиальных клеток (VEGF, E-selectin, sTF и др.). Выявлено, что у больных с тромбоэмболией уровень ЭПТ значительно выше, чем у пациентов без нее. Остальные показатели действия тромбина
(тромбин-антитромбиновый комплекс, фрагменты протромбина 1 + 2) у пациентов этих групп не
имели отличий.
На систему гемостаза могут влиять и другие препараты. Так, известно прокоагулянтное действие оральных контрацептивов, некоторых лекарственных средств, применяющихся при лечении онкологических заболеваний. Ряд работ, где был использован САТ, посвящены как раз этому
вопросу. Так, D. Candelaria [20] и A. D. Petropoulou [21] изучили кинетику генерации тромбина
у пациентов с множественной миеломой, получавших в ходе лечения талидомид – препарат, известный своим прокоагулянтным действием. Было выявлено, что терапия талидомидом, особенно в сочетании с дексаметазоном, усиливает генерацию тромбина и при наличии повреждения
эндотелия у пациентов с множественной миеломой может служить фактором риска тромбозов.
Некоторые химиопрепараты, такие как цисплатин, также являются провокаторами тромбозов у пациентов онкологического профиля. В 2006 г. были опубликованы результаты исследования, проведенного в Австрии. Они подтвердили гипотезу о том, что эффект апоптоза цис­
платина, оказываемый им на эндотелиальные клетки, приводит к высвобождению мембранных везикул, так называемых микрочастиц (microparticles), которые, как известно, являются
активаторами гемостаза. Процесс изучали на двух линиях эндотелиальных клеток – HUVEC
и HMVEC-L. Прокоагулянтную активность микрочастиц регистрировали при помощи САТ,
жизнеспособность эндотелиальных клеток оценивали методом проточной цитометрии. Показано, что жизнеспособность эндотелиальных клеток снижается с увеличением дозы и времени
воздействия препарата и сопровождается ростом количества высвобожденных микрочастиц.
Параллельно усиливалась их прокоагулянтная активность – в среднем на 150% (HUVEC)
и 493% (HMVEC-L) [22].
Представляет интерес еще одно исследование, имеющее прямое отношение к онкологии.
В 2007 г. Grigoris T. Gerotziafas [23] был изучен с помощью метода САТ прокоагулянтный потенциал некоторых линий раковых клеток (рак поджелудочной железы BXPC3 и рак молочной железы MCF7). Выявлено, что клетки указанных линий усиливают генерацию тромбина в плазме
крови человека в зависимости от экспрессии ими ТФ. Клетки линии BXPC3 обладали большим
прокоагулянтным потенциалом по сравнению с MCF7.
Как было показано выше, оральные контрацептивы повышают риск тромбоза у принимающих их женщин. Поэтому представляет интерес ряд работ, посвященных их влиянию на генерацию тромбина. Например, в 2007 г. в Голландии с помощью САТ исследовали эффект оральных
контрацептивов разных поколений. Был подтвержден их прокоагулянтный эффект, а при добавлении к образцам активированного протеина С была определена степень риска развития тромбоза в зависимости от вида препарата [24]. Наличие протромботического фенотипа у женщин, принимающих оральные контрацептивы, было показано с помощью того же метода САТ Y. Dargaud
et al. [25]. Кроме того, в этом исследовании был изучен коагуляционный статус еще двух групп:
пациентов с венозной тромбоэмболией в анамнезе с наличием факторов риска венозной тромбоэмболии и пациентов с венозной тромбоэмболией в анамнезе без факторов риска. Сравнивая
основные показатели тромбограммы пациентов этих групп с показателями здоровых лиц, было
выявлено, что ЭПТ у больных с венозной тромбоэмболией был значительно выше, чем у здоровых лиц. А при добавлении к образцам тромбомодулина различия становились гораздо отчетливее: больные с факторами риска имели более высокий показатель ЭПТ, чем пациенты, не имевшие их. Чувствительность метода составила 93%.
109
ус
и
ци
он
ал
ьн
ая
ак
ад
ем
ия
н
ау
кБ
ел
ар
Прогнозирование тромботических осложнений является очень важным аспектом при ведении больных стационаров различных профилей. По данным нескольких исследований, опубликованным в 2008 г., ТГТ методом САТ может стать хорошей альтернативой стандартным коагулологическим тестам при определении риска развития тромбоза. Так, Arina J. ten Cate-Hoek et al.
[26] исследовали кровь более 100 пациентов после эпизода тромбоза глубоких вен на способность к генерации тромбина. Кровь исследовали 3 раза в течение 24 мес. Полученные данные
сравнивали с показателями 137 здоровых лиц. Было показано, что эндогенный потенциал тромбина и пик его количества у пациентов с тромбозами значительно превышают таковые у доноров. Была выявлена сильная отрицательная корреляция между активностью протеинов С и S
и эндогенным потенциалом тромбина. Исследователи утверждали, что определение генерации
тромбина методом САТ отражает изменения коагуляционного статуса у пациентов после недавнего тромбоза глубоких вен. В ходе проведения дальнейших исследований A. Tripodi [27, 28] изу­
чена связь между показателями генерации тромбина и рецидивом венозной тромбоэмболии. Авторы пришли к выводу, что измерение генерации тромбина методом САТ помогает идентифицировать пациентов с высоким риском развития рецидива венозной тромбоэмболии, т. е. эти
показатели могут быть использованы как прогностический маркер.
В 2008 г. F. Couturaud и соавт. [29] представили результаты исследования (при помощи САТ)
протромботических состояний у близких родственников пациентов с венозной тромбоэмболией
и мутацией Лейдена. Все они были обследованы на наличие лейденской мутации, мутации
в гене протромбина G20210А и на генерацию тромбина. Авторами показано, что тест генерации
тромбина позволяет с высокой точностью определять различные протромботические состояния
у данной группы лиц.
В том же году A. Rozenkranz et al. [30] опубликовали данные исследования генерации тромбина при нормальной (неосложненной) беременности. С использованием метода САТ было выявлено, что с увеличением срока нормальной беременности ЭПТ и высота пика тромбина возрастают. Ими было установлено значительное увеличение таких показателей коагулограммы,
как ингибитор активатора плазминогена-1, ингибитор пути ТФ, фрагменты протромбина 1 + 2
и тромбин-антитромбиновый комплекс. В то же время показатели свободного протеина S, антигена протеина S и активности протеина S были заметно снижены.
В 2007 и 2008 гг. были проведены исследования на пациентах кардиологического и кардиохирургического стационаров. E. Stepien [31] опубликовал данные анализа традиционных (возраст, пол, наличие артериальной гипертензии, наличие диабета) и относительно новых факторов
риска (повышенные уровни фибриногена и С-реактивного белка) по отношению к системе гемостаза у пациентов со стабильной стенокардией. Было выявлено, что возраст, пол (мужской), повышенные уровни фибриногена, С-реактивного белка, наличие диабета влияют на генерацию
тромбина, способствуя ее повышению. В кардиохирургическом же стационаре проводилось изучение генерации тромбина у детей с врожденными пороками сердца, перенесших кардиохирургическое вмешательство. При этом изучены все 4 показателя тромбограммы. Данные, полученные с помощью САТ, сравнивали с результатами стандартных коагуляционных тестов, таких
как уровни протромбина, антитромбина, ингибитора пути ТФ и фрагментов протромбина 1 + 2,
тромбин-антитромбиновый комплекс, АЧТВ, ПТВ. В результате была выявлена значительная
положительная корреляция между ЭПТ и уровнем протромбина, а также между высотой пика
тромбина и уровнем протромбина. Также была показана значительная отрицательная корреляция между ЭПТ и уровнем ингибитора пути ТФ, в то время как корреляции между высотой пика
тромбина и уровнем ингибитора пути тканевого фактора не выявлено. Кроме того, установлена
сильная отрицательная корреляция между уровнем фрагментов протромбина 1 + 2 и ЭПТ, а также между уровнем фрагментов протромбина 1 + 2 и высотой пика тромбина. Корреляции между
уровнем антитромбина и ЭПТ и высотой пика тромбина не установлено [32].
Получены данные, демонстрирующие хорошую корреляцию между стандартными показателями коагулограммы и параметрами ТГТ. Так, например, при исследовании плазмы пациентов,
принимавших оральные антикоагулянты, была выявлена корреляция между ЭПТ и ПВ, а у пациентов с гемофилией А – между ЭПТ и уровнем фактора VIII [10].
На
110
ус
и
На
ци
он
ал
ьн
ая
ак
ад
ем
ия
н
ау
кБ
ел
ар
Группа ученых из Голландии (при участии и одного из авторов методики) в 2004 г. изучила
возможность использования ТГТ, и в частности показателя ЭПТ, для мониторинга действия различных видов гепарина. Показатели САТ сравнивали с ранее известными тестами – АЧТВ, антиХа- и антиIIа-активностью. Действие гепарина на систему свертывания вызывало удлинение
АЧТВ в 34% случаев, в то время как ЭПТ показывал ингибирование гемостаза в 80% случаев.
При сравнении с индивидуальным уровнем до введения АЧТВ показало действие гепарина
в 55% случаев, а ЭПТ – в 98% случаев. Авторы ставили перед собой цель показать возможности
САТ при использовании его в мониторинге антикоагулянтной терапии [33].
В 2005 г. было проведено два исследования по изучению действия различных антикоагулянтов на генерацию тромбина, их потенциала к ее ингибированию. В задачу первого входило сравнение in vitro действия нефракционированного гепарина (НФГ) и низкомолекулярных гепаринов
(НМГ). Исследование подтвердило концепцию о гетерогенности низкомолекулярных гепаринов,
показав, что их можно характеризовать не только по соотношению антиХа/антиIIа-активности,
но и по способности их ингибировать генерацию тромбина [34].
В том же году исследователи из Франции опубликовали данные по оценке ингибиторного
действия антикоагулянта Orgaran (danaparoid) – НМГ на генерацию тромбина. Было выявлено,
что препарат значительно удлиняет лаг-фазу и Тmax при концентрациях свыше 0,4 МЕ антиХа/мл.
При более низких концентрациях (0,2 МЕ антиХа/мл) лаг-фаза и Тmax были увеличены только на
12%, в то время как максимальное их удлинение (около 50%) наблюдалось при концентрации
1 МЕ антиХа/мл. Более того, ингибирующий эффект препарата на эндогенный потенциал тромбина и Сmax линейно зависел от его дозы. Значительное снижение этих показателей наблюдалось
при концентрациях свыше 0,2 МЕ антиХа/мл. При самой высокой изучаемой концентрации препарат подавлял генерацию тромбина на 80% [35].
Для оптимизации дозы низкомолекулярных гепаринов авторы методики в 2006 г. предложили учитывать не только его концентрацию в крови, что можно выявить с помощью определения
антиХа- и антиIIа-активности, но и вызываемый ими эффект, т. е. ответ организма на введенную
дозу гепарина. Это, как утверждают исследователи, можно наблюдать по эндогенному потенциалу тромбина, если производить измерение ЭПТ через 2–5 ч после введения антикоагулянта
[36].
Для оценки действия различных видов антикоагулянтов на генерацию тромбина Meyer M.
Samama et al. [37] в 2006 г. сравнили несколько препаратов – Hirudin, Argatroban, Melagatran
и Danaparoid. Действие первого на генерацию тромбина сильно отличалось от действия остальных. Показано, что антикоагулянтная активность различных препаратов связана с разными изменениями параметров генерации тромбина. Результаты этой работы могут быть полезны для
определения дозы, необходимой для адекватной антикоагулянтной терапии или для мониторинга лечения этими препаратами.
В 2007 г. проводились работы по разработке нового перорального антикоагулянта Rivaroxaban. Данные о его влиянии на генерацию тромбина опубликованы Jochen Graff et al. [38]. С помощью метода САТ было определено, что при приеме данного препарата генерация тромбина
остается сниженной в течение 24 ч. Кроме того, показана сильная корреляция между концентрацией препарата в плазме и снижением эндогенного потенциала тромбина.
Интересным представляется исследование с помощью метода САТ эффекта рекомбинантного человеческого активированного протеина С на генерацию тромбина как самостоятельного
препарата, так и в комбинации его с антикоагулянтом Melagatran (прямым ингибитором тромбина), НФГ или НМГ в различных концентрациях. Объектом исследования была плазма крови пациентов с сепсисом. Выявлено, что добавление препарата Melagatran, а также НМГ и НФГ повышает способность рекомбинантного человеческого активированного протеина С снижать генерацию тромбина в плазме крови таких больных [39].
Оценен эффект на генерацию тромбина с помощью метода САТ и других препаратов – НФГ,
Tinzaparin, Enoxaparin, Danaparoid, Fondaparinux, а также лекарственных средств, блокирующих
их действие, – протамина сульфат, NovoSeven, FEIBA [40], НМГ – Reviparin [41], Argatroban[42].
В 2006 г. Sandra Cauwenberghs et al. [43] опубликовали данные исследования с использованием
111
ус
и
ак
ад
ем
ия
н
ау
кБ
ел
ар
САТ, посвященные изучению ответа (реакции) системы гемостаза при переливании тромбоцитарной массы пациентам с развившейся после химиотерапии тромбоцитопенией. Кроме того,
ими оценена возможность идентифицировать пациентов с неадекватной реакцией системы свертывания. Показано, что генерация тромбина линейно возрастает с увеличением концентрации
тромбоцитов, что демонстрирует их активационную способность.
Одна из работ, появившихся уже в 2008 г., также посвящена изучению свойств тромбоцитов,
использующихся в трансфузиологии. С использованием метода САТ и тромбоэластографии было
выявлено, что тромбоциты становятся более прокоагулянтными в процессе хранения, что подтвердилось обоими методами [44].
В работе [45] изучалось применение САТ для оценки результата переливания свежезамороженной плазмы пациентам с коагулопатией разведения. Генерацию тромбина измеряли в пре- и
посттрансфузионный периоды. У всех пациентов переливание привело к повышению уровней
факторов свертывания и сокращению АЧТВ, а также к значительному увеличению генерации
тромбина (высота пика и эндогенный потенциал тромбина). Интересно, что параметры генерации тромбина и уровень фибриногена были выше после трансфузии в пробах плазмы пациентов,
у которых кровотечение остановилось, чем у пациентов с продолжавшимся кровотечением. Исследователи пришли к выводу, что тест генерации тромбина детерминирует улучшенную гемостатическую активность после переливания плазмы. Более того, полученные данные позволяют
предположить, что генерация тромбина и уровень фибриногена являются независимыми показателями риска кровотечения во время операции у пациентов этой группы. В то же время австрийскими учеными было проведено исследование на здоровых лицах, где оценивались показатели
генерации тромбина до, сразу после и через 48 ч после проведения афереза (компоненты крови
собраны с помощью двух различных систем для афереза). Отсутствие каких-либо изменений
в генерации тромбина позволило предположить, что такой вид получения компонентов крови не
приводит к острым нарушениям гемостаза у здоровых лиц [46].
Несмотря на большое количество исследований, в отношении теста генерации тромбина
остается еще много нерешенных задач. Так, еще не установлены значения, при которых высока
вероятность тромбоза или кровотечения. Нет общепринятых норм, на которые могут ориентироваться лаборатории разных стран. Но в любом случае метод САТ является еще одним шагом на
пути к новым возможностям комплексной оценки как самой системы гемостаза, так и многих
факторов, влияющих на нее.
Литература
ци
он
ал
ьн
ая
1. H e m k e r H. C., D i e r i R. A., D e S m e d t E. et al. // J. Thromb. Haemost. 2006. Vol. 96. P. 553–561.
2. H e m k e r H. C., B e g u i n S. // J. Thromb. Haemost. 2000. Vol. 84. P. 747–751.
3. Д о л г о в В. В., С в и р и н П. В. Лабораторная диагностика нарушений гемостаза. М., 2005.
4. M a n n K. G. // Chest. 2003. Vol. 124. P. 1–3.
5. Z a n i a P., P a p a c o n s t a n t i n o u M., F l o r d e l l i s C. S. et al. // Am. J. Physiol. 2008. Vol. 294. P. 1215–
1226.
6. M a n n K. G. // Chest. 2003. Vol. 124. P. 4–10.
7. В а в и л о в а Т. В. Гемостазиология в клинической практике. СПб., 2005.
8. B r u m m e l - Z i e d i n s K. E., M a n n K. G. // J. Thromb. Haemost. 2004. Vol. 2. P. 281–288.
9. B a g l i n T. // Br. J. of Haematol. 2005. Vol. 130. P. 653–661.
10. C h a n t a r a n g k u l V., C l e r i c i M., B r e s s i C. et al. // Haematologica. 2003. Vol. 88. P. 547–554.
11. H e m k e r H. C., W i e l d e r s S. J., K e s s e l s H., B e g u i n S. et al. // J. Thromb. Haemost. 1993. Vol. 70.
P. 617–624.
12. H e m k e r H. C., G i e s e n P. L. A., A l D i e r i R., R e g n a u l t V. et al. // Pathophysiol. Haemost. Thromb.
2003. Vol. 33. P. 4–15.
13. H e m k e r H. C., G i e s e n P. L. A., A l D i e r i R., R e g n a u l t V. et al. // Pathophysiol. Haemost. Thromb.
2002. Vol. 32. P. 249–253.
14. C h a n t a r a n g k u l V. // Br. J. of Haematol. 2004. Vol. 124. P. 355–357.
15. H e m k e r H. C., A l D i e r i R., B e g u i n S. et al. // Curr. Opin. Hematol. 2004. Vol. 11. P. 170–175.
16. A l D i e r i R., P e y v a n d i F., S a n t a g o s t i n o E., G i a n s i l y M. // J. Thromb. Haemost. 2002. Vol. 88.
P. 576–582.
17. H a i d l H., C i m e n t i C., L e s c h n i k B. et al. // J. Thromb. Haemost. 2006. Vol. 95. P. 772–775.
На
112
ус
и
ак
ад
ем
ия
н
ау
кБ
ел
ар
18. F r e y b u r g e r G., D u b r e u i l M., A u d e b e r t A. et al. // Haemostasis. 2001. Vol. 31. P. 32–41.
19. K u e n e n B. C., L e v i M., M e i j e r s J. C. M. et al. // Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 2002. Vol. 22. P. 1500–
1505.
20. C a n d e l a r i a D., A r m i j o B., M o n t g o m e r y R. et al. // J. of Clin. Oncology. 2006. Vol. 24. P. 7602.
21. P e t r o p o u l o u A. D., G e r o t z i a f a s G., Z e r v a s K. et al. // Blood. 2007. Vol. 110. P. 3535.
22. L e c h n e r D., K o l l a r s M., E i c h i n g e r S. et al. // Blood. 2006. Vol. 108. P. 1457.
23. G e r o t z i a f a s G. T., E l a l a m y I., R o m a n M. et al. // Blood. 2007. Vol. 110. P. 3992.
24. T c h a i k o v s k i S. N., v a n V l i e t H. A., T h o m a s s e n M. C. et al. // J. Thromb. Haemost. 2007. Vol. 98 (6).
P. 1350–1356.
25. D a r g a u d Y., T r z e c i a k M. C., B o r d e t J. C. et al. // J. Thromb. Haemost. 2006. Vol. 96 (5). P. 562–567.
26. C a t e – H o e k A. J., D i e l i s A. W., S p r o n k H. M. H. et al. // J. Thromb. Haemost. 2008. Vol. 100. P. 1–6.
27. T r i p o d i A., L e g n a n y C., C h a n t a r a n g k u l V. et al. // J. Thromb. Haemost. 2008. Vol. 6 (8). P. 1327–
1333.
28. T r i p o d i A., M a r t i n n e l l y I., C h a n t a r a n g k u l V. et al. // J. Thromb. Res. 2007. Vol. 121 (3). P. 353–
359.
29. C o u t u r a u d F., D u c h e m y J., L e r o y e r C. et al. // J. Thromb. Haemost. 2008. Vol. 99 (1). P. 223–228.
30. R o s e n k r a n z A., H i d e n M., L e s c h n i c B. et al. // J. Thromb. Haemost. 2008. Vol. 99 (2). P. 331– 337.
31. S t e p i e n E., P l i c n e r D., B r a n i c a A. et al. // Pol. Arch. Med. Wewn. 2007. Vol. 117 (7). P. 297–305.
32. K o e s t e n b e r g e r M., C v i r n G., N a g e l B. et al. // Thromb. Res. 2008. Vol. 122 (1). P. 13–19.
33. A l D i e r i R., A l b a n S., H e m k e r H. C., B e g u i n S. et al. // J. Thromb. Haemost. 2004. Vol. 2. P. 1395–
1401.
34. G e r o t z i a f a s G. T., P e t r o p o u l o u A. D., E l a l a m y I. et al. // Blood. 2005. Vol. 106. P. 912.
35. E l a l a m y I., P e t r o p o u l o u A. D., G e r o t z i a f a s G. T. et al. // Blood. 2005. Vol. 106. P. 4151.
36. A l D i e r i R., A l b a n S., B e g u i n S., H e m k e r H. C. et al. // J. Thromb. Haemost. 2006. Vol. 4. P. 83 – 89.
37. S a m a m a M. M., L e F l e m L., P i e r r e – E u g e n e D. et al. // Blood. 2006. Vol. 108. P. 4111.
38. G r a f f J., v o n H e n t i g N., M i s s e l w i t z F. et al. // J. Clin. Pharmacol. 2007. Vol. 47. P. 1398–1407.
39. C i m e n t i C., K o e s t e n b e r g e r M., L e s c h n i k B. et al. // Thromb. Res. 2007. Vol. 119 (3). P. 361–367.
40. G a f f A., v a n V e e n J. J., W o o l e y A. M. et al. // J. Thromb. Haemost. 2008. Vol. 100 (2). P. 350–355.
41. V r i j A. A., D i j k s t r a G., W a g e n v o o r d R. et al. // J. Thromb. Thrombolysis. 2007. Vol. 24 (2). P. 175–
182.
42. G e r o t z i a f a s G. T., R o m a n M., V e r d y E. et al. // Blood. 2007. Vol. 110. P. 929.
43. C a u w e n b e r g h s S., F e i j e M. A. H., H e e m s k e r k J. W. H. et al. // Blood. 2006. Vol. 108. P. 949.
44. J o h a n s s o n P. I., S v e d e n s e n M. S., S a l a d o J. et al. // Vox. Sang. 2008. Vol. 94 (2). P. 113–118.
45. S c h o l s S. E., v a n d e r M e i j d e n P. E., v a n O e r l e R. et al. // J. Thromb. Haemost. 2008. Vol. 99 (1).
P. 64–70.
46. C i m e n t i C., S i p u r z y n s k i S., G a l l i s t l S. et al. // Transfusion. 2008. Vol. 48 (8). P. 1584–1590.
V. I. PROKHOROVA, N. N. KOLYADKO
USE OF THE THROMBIN GENERATION TEST FOR ESTIMATION
OF THE BLOOD COAGULATION POTENTIAL
ая
N. N. Alexandrov National Cancer Center of Belarus, Minsk
Summary
На
ци
он
ал
ьн
Diagnostics and treatment of haemostatic disorders are still one of the most important problems for specialists of every
description. Many of the mechanisms of these disorders are still to be revealed. One of the last modifications of thrombin generation test (Calibrated Automated Thrombogram) and stages of its improvement are described in this review on the basis of
literature data. Also, some variants of its application in different fields of medical work are represented in the review on the
example of investigations made by different European laboratories.
ус
и
ВЕСЦI НА­Ц­Ы Я­НАЛЬ­НАЙ АКА­ДЭМII НА­ВУК БЕ­ЛА­РУСI № 3 2009
ар
СЕ­Р­Ы Я МЕДЫЦЫНСКІХ НА­ВУК
О. Г. ЖАРИКОВ, А. А. ЛИТВИН
ел
УДК 616.37-07
кБ
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МЕТОДА ИСКУССТВЕННЫХ НЕЙРОННЫХ СЕТЕЙ
В ДИАГНОСТИКЕ И ПРОГНОЗИРОВАНИИ ЗАБОЛЕВАНИЙ
ПОДЖЕЛУДОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ
Гомельская областная клиническая больница, Беларусь
ау
(Поступила в редакцию 03.09.2008)
ци
он
ал
ьн
ая
ак
ад
ем
ия
н
Введение. Заболеваемость острым панкреатитом (ОП) из года в год неуклонно растет. Больные ОП составляют 5–10% от общего числа пациентов хирургического профиля. В 15–20% заболевание носит некротический характер. С развитием панкреонекроза у 40–70% больных происходит инфицирование очагов некротической деструкции. Доля инфекционных осложнений
среди причин летальности составляет не менее 80% [1].
Другое не менее тяжелое заболевание – рак поджелудочной железы (РПЖ). В странах Западной Европы аденокарцинома поджелудочной железы занимает четвертое место среди причин
смерти от рака, и пациенты с таким диагнозом имеют самую низкую пятилетнюю выживаемость – менее 1% [9]. Поскольку заболевание характеризуется быстрым местным либо метастатическим распространением опухолевого процесса, для повышения выживаемости должны быть
найдены более эффективные диагностические и прогностические методы.
Общеизвестно, что диагностика и прогнозирование ОП и РПЖ – двух потенциально опасных
для жизни заболеваний вызывают определенные трудности. Существующие в настоящее время
шкалы-системы оценки тяжести состояния, а также системы прогнозирования осложнений и исходов не могут удовлетворить все возрастающей потребности в полноценной и своевременной
диагностике и прогнозе. Раннее распознавание стадии течения заболевания и прогнозирование
возможных осложнений является актуальной проблемой в хирургии поджелудочной железы.
Искусственные нейронные сети. В медицине, по данным ряда исследователей [2–4], наибольшую практическую значимость среди методов прогнозирования и интерпретации диагностических исследований имеют искусственные нейронные сети (ИНС), способные решать слабоструктурированные и плохо формализованные задачи.
ИНС (англ. artificial neural networks) – это область искусственного интеллекта, в которой для
обработки сигналов используются явления, аналогичные происходящим в нейронах живых существ [10]. Важнейшее свойство нейронных сетей, свидетельствующее об их огромном потенциале и широких прикладных возможностях, заключается в их способности к обучению и обобщению полученных знаний. Сеть обладает чертами так называемого искусственного интеллекта.
Натренированная на ограниченном множестве обучающих выборок, она обобщает накопленную
информацию и просчитывает ожидаемую реакцию применительно к данным, не обрабатывавшимся в процессе обучения. Для ИНС характерен принцип параллельной обработки сигналов,
что достигается путем объединения большого числа нейронов в так называемые слои и соединения, определенным образом связывающие нейроны различных слоев (рис. 1). Теоретически число слоев и число нейронов в каждом слое может быть произвольным, однако фактически оно
ограничено ресурсами компьютера, и чем сложнее ИНС, тем масштабнее задачи она в состоянии
решать. Прочность синаптических связей модифицируется в процессе извлечения знаний из обучающего набора данных (режим обучения), а затем используется при получении результата на
новых данных (режим исполнения) [4, 5].
На
114
ус
и
ци
он
ал
ьн
ая
ак
ад
ем
ия
н
ау
кБ
ел
ар
Основным отличием метода ИНС от всех остальных методов
прогнозирования является возможность конструирования экспертных систем самим врачом-специалистом, который может
передать нейронной сети свой индивидуальный опыт, опыт своих коллег или обучать сеть на реальных данных, полученных
путем наблюдений. Нейронные сети оказываются способными
принимать решения, основываясь на выявляемых ими скрытых
закономерностях в многомерных данных. При этом ИНС не программируются, т. е. не используют никаких правил вывода для
постановки диагноза, а обучаются делать это на примерах.
В приложении к медицинской диагностике ИНС дают возможность значительно повысить специфичность метода, не снижая
его чувствительности [11].
Для классификации и распознавания образов сеть обучается
важнейшим их признакам, таким как геометрическое отображение точечной структуры изображения, относительное расположение важнейших элементов образа, компоненты преобразоваРис. 1. Схематичное строение исния Фурье и другие подобные факторы. В процессе обучения
кусственной нейронной сети
выделяются признаки, отличающие образы друг от друга, которые и составляют базу для принятия решений об отнесении образов к соответствующим классам [2]. Данный метод представляет собой нелинейную систему,
позволяющую гораздо лучше классифицировать данные, чем обычно используемые линейные
методы. На рис. 2, 3 продемонстрированы основные принципы линейной и нелинейной классификации [10].
Классификация и прогноз острого панкреатита. Стратификация степени тяжести ОП по
одним клиническим данным затруднительна. Быстрое распознавание тяжелой формы ОП необходимо для своевременного начала лечения. Создано несколько прогностических систем, основанных на подсчете баллов: Ranson [12], Glazgow [13], Balthazar [14], APACHE II [15] и система,
принятая на симпозиуме в Атланте в 1992 г. [16]. Недавнее отнесение фактора тучности к системе APACHE II (APACHE-O) подчеркивает тот факт, что тучность (весо-массовый индекс более
30 кг/м2) является независимым фактором риска при ОП. Пожилой возраст и гипотонию при госпитализации также относят к общим факторам, связанным с более неблагоприятным прогнозом [17].
Широкому применению вышеуказанных систем препятствует то, что некоторые из клинических данных могут быть собраны только по истечении 48 ч после госпитализации. В идеале прогностический тест для оценки тяжести ОП должен представлять собой одно недорогое исследо-
На
Рис. 2. Линейная классификация данных: а – правильная; б – неправильная
115
ус
и
ар
ел
кБ
ау
Рис 3. Нелинейная классификация данных: а – практически полная; б – полная
ци
он
ал
ьн
ая
ак
ад
ем
ия
н
вание, выполнение которого возможно уже на стадии поступления пациента в стационар. Из выявленных нескольких отдельных биомаркеров ОП чаще всего используется С-реактивный белок
(СРБ). Он имеет независимую прогностическую ценность [18], но как маркер неэффективен
в течение первых 48–72 ч заболевания [19]. Концентрация панкреатической липазы в сыворотке
крови достигает максимума в течение 24 ч и имеет большую диагностическую значимость по
сравнению с амилазой крови [20]. Увеличение гематокрита создает угрозу для микроциркуляции в поджелудочной железе и поэтому является надежным маркером тяжелого ОП [21]. Определение трипсиноген-активированного пептида в моче может с высокой степенью точности предсказать тяжелое течение ОП уже через 24 ч после начала болезни [22], так как превращение трипсиногена в трипсин является одним из первых сигналов о развитии системного воспалительного
ответа.
Следует, однако, отметить, что большинство из вышеперечисленных систем и диагностических тестов обладает недостатками, препятствующими их широкому клиническому применению: чувствительность, специфичность и прогностическая точность балльных систем подсчета
невысоки [23, 24], системы громоздки и трудоемки [25]. Кроме того, в случаях принятия решений о срочном хирургическом вмешательстве получение показателей, входящих в интегральные
шкалы, не всегда доступно, что связано с возможностями лабораторных служб конкретного лечебного учреждения, а также с длительностью проведения ряда исследований [6, 7]. Основной
недостаток определения лабораторных маркеров тяжелого ОП – их дороговизна и малодоступность [24].
ИНС при остром панкреатите. Нелинейный принцип работы ИНС позволяет лучше отразить взаимоотношения между факторами риска и результатом, а обработка ею доступных данных без задержки во времени создает альтернативу традиционным системам подсчета. Учитывая высокую летальность от тяжелого ОП, система, которая может точно предсказывать риск
неблагоприятного исхода, чрезвычайно необходима.
Первую попытку диагностики тяжелого ОП на основе ИНС предприняли S. C. Kazmierczak et
al. (1993) путем анализа активности панкреатических ферментов сыворотки крови [26]. Панкреатическая липаза оказалась лучшим прогностическим фактором тяжелого ОП, ее диагностическая точность составила 85%. Точность амилазы сыворотки крови очень низка, комбинация же
липазы и амилазы не позволила увеличить диагностическую точность созданной ИНС.
Целью исследования W. E. Pofahl et al. (1998) было нейросетевое прогнозирование длительности пребывания больного в стационаре [27], которая расценивалась как маркер степени тяжести ОП. Многослойный персептрон был обучен на данных 156 отобранных путем рандомизации
пациентов с ОП и протестирован на 39 больных. Чувствительность нейронной сети, которая правильно предсказала пребывание пациента в больнице (более 7 дней), составила 75%. Прогноз
На
116
ус
и
На
ци
он
ал
ьн
ая
ак
ад
ем
ия
н
ау
кБ
ел
ар
ИНС был сравнен с показателями систем Ranson и APACHE II, подсчитанными при госпитализации и через 48 ч после нее. Прогностическая значимость ИНС оказалась более высокой.
В исследовании M. T. Keogan et al. (2002) нейросетевая модель была использована для предсказания длительности лечения дольше средней – 8,4 дня [28]. Поскольку большое количество
входных переменных относительно сравнительно небольшого числа пациентов (n = 92) создавало риск сверхсоответствия обучающему набору данных, число переменных было сокращено с 23
до 5 (дефицит жидкости, уровень креатинина сыворотки, наличие тяжелого сопутствующего заболевания, артериальное давление и уровень кальция сыворотки крови). Выявленные при компьютерной томографии (КТ) 12 признаков были объединены в 1, характеризующий степень воспаления. Вышеперечисленные данные были подвергнуты нейросетевому и линейному дискриминантному анализу (ЛДА). И ИНС, и ЛДА показали значительно более точный результат, чем
шкалы Ranson и Balthazar. Авторы полагают, что объединение этих шкал позволит повысить
прогностическую точность. Недостатком данной модели ИНС являлось то, что она была обучена
и протестирована на одном и том же наборе данных, поэтому результаты этого исследования
должны быть проверены на других данных [28].
K. I. Halonen et al. (2003) разработали две модели для прогнозирования летального исхода
при тяжелом ОП [29]. В первой модели («LR4») фатальный исход прогнозировался методом логистической регрессии на основании анализа четырех показателей – возраста, наличия сердечнососудистой патологии, дыхательной недостаточности и наивысшего уровня креатинина крови
в течение 72 ч. Во вторую модель («ANN8») помимо вышеупомянутых переменных включено
еще четыре: необходимость вазопрессорной поддержки, пол, ВМИ и самый низкий уровень гемоглобина в течение первых 72 ч. Прогностическая точность различных моделей была сравнена
при помощи ROC-анализа. «LR4» и «ANN8» показали большую прогностическую точность, чем
шкалы Ranson, Glazgow и APACHE II, причем простая модель «LR4» имела самую высокую точность.
В 2007 г. R. Mofidi et al. [30] разработали нейросетевую модель для классификации тяжести
ОП и предсказания летального исхода, которая базировалась на 10 клинических параметрах (возраст, гипотония, SIRS, РаО2, ЛДГ, глюкоза, мочевина, кальций, гематокрит и число лейкоцитов),
определенных при госпитализации и через 48 ч после нее. Эта модель показала существенно
лучшие результаты, чем системы APACHE II и Glazgow. Данная работа отличается от рассмотренных выше тем, что в ней проведен анализ чувствительности для отбора входных парамет­
ров сети с большей прогнозирующей ценностью. Кроме того, исследование выгодно отличается
включением большого количества пациентов (n = 664), а также тем, что обучение и верификация
были выполнены на различных наборах данных. Не менее важным преимуществом является то,
что все 10 входных переменных доступны для лечащего врача в течение первых 6 ч после госпитализации, что предпочтительнее для клинического использования.
Разработанная нами нейросетевая модель основана на исследовании общедоступных
клинико-лабораторных данных 1610 пациентов с ОП [8]. ИНС включает два функциональных
блока. Первый предназначен для прогнозирования инфицированного панкреонекроза в течение
первых 24 ч после госпитализации. При помощи генетического алгоритма отбора входных данных (Genetic Algorithm Input Selection) было выделено 12 наиболее значимых входных параметров: время от начала заболевания, «ранние» операции в анамнезе (в случае перевода из других
больниц после выполненной лапаротомии в ранние сроки), выраженный болевой синдром, индекс массы тела, частота пульса и дыхания, острые жидкостные скопления в брюшной полости
(по данным УЗИ или КТ) или пальпируемый инфильтрат, вздутие живота, число палочкоядерных форм нейтрофилов, уровень глюкозы и мочевины сыворотки крови, эффективность комплексного лечения в течение 24 ч после госпитализации. Проведенный ROC-анализ продемонстрировал отличные прогностические возможности созданной сети: чувствительность – 94,7%,
специфичность – 96,8, точность – 94,7%, площадь под ROC-кривой – 0,97.
Второй функциональный блок ИНС предназначен для непосредственной диагностики развившихся гнойных осложнений и выявления показаний для оперативного вмешательства. Он
основан на анализе 14 входных параметров: время от начала заболевания (сут), стационарное ле-
117
ус
и
ци
он
ал
ьн
ая
ак
ад
ем
ия
н
ау
кБ
ел
ар
чение ОП в анамнезе, «ранние» операции в анамнезе, индекс массы тела, температура тела, частота дыхания, пульс, вздутие живота, наличие инфильтрата (жидкостных скоплений), СОЭ,
лейкоциты крови, число палочкоядерных форм лейкоцитов, глюкоза, мочевина. Диагностический потенциал сети высок: чувствительность, специфичность и точность составили 94,5%, площадь под ROC-кривой – 0,99.
Ранняя диагностика и прогнозирование РПЖ. Хирургическое удаление опухоли до настоящего времени остается единственным действенным средством в лечении РПЖ. По литературным данным, группу риска по РПЖ составляют лица, больные хроническим алкоголизмом,
идиопатическим и другими ненаследственными хроническими панкреатитами [31–33], пациенты с различными генетическими аномалиями [34–36], а также родственники больных с наследственным панкреатитом [37, 38]. РПЖ – возрастное заболевание: более 80% пациентов составляют лица в возрасте 60–80 лет. Курение удваивает риск заболевания РПЖ [35]. Диета, богатая
мясными, рыбными и жирными продуктами в сочетании с низким потреблением фруктов и овощей, рассматривается как экологический фактор риска заболевания [39, 40]. В литературе также
отмечена связь между индексом массы тела и риском развития РПЖ [35].
Таким образом, наличие факторов риска РПЖ диктует необходимость создания надежного
прогностического протокола [41, 42]. В настоящее время считается, что стадия опухоли и радикальность операции – самые важные прогностические факторы РПЖ. Сывороточные маркеры
опухолевого процесса, такие как кальций и СРБ, имеют прогностическую ценность для контроля лечения [43, 44].
Иммуногистохимический анализ опухолей выявил несколько интересных маркеров, которые
могут быть использованы для прогноза. Например, высокая экспрессия сосудистого эндотелиального фактора роста предсказывает ранний рецидив рака и плохой прогноз после операции
[45]. Экспрессия циклооксигеназы 2 также коррелирует с плохим прогнозом при РПЖ, особенно
для прооперированных пациентов [46].
Поскольку ранняя диагностика РПЖ очень важна для улучшения результатов лечения пациентов с РПЖ, необходим поиск новых диагностических методов и тестов. Ранние признаки РПЖ разрозненны и несколько размыты. Визуализация опухоли при помощи КТ или ультрасонографии не
является идеальной, так как позволяет увидеть уже образовавшуюся опухоль, причем определенных размеров. Поэтому должны быть созданы новые диагностические модели, основанные на анализе маркеров сыворотки крови, других диагностических тестов с помощью ИНС [47].
ИНС при раке поджелудочной железы. Диагностика псевдотуморозного панкреатита
и панкреатической аденокарциномы при помощи КТ или эндоскопической ультрасонографии
часто вызывает затруднения, что иногда приводит к неоправданной гастропанкреатодуоденальной резекции. Поэтому возможности искусственного интеллекта для дифференциальной диагностики этих заболеваний могут быть полезными для клиницистов. В 2001 г. I. D. Norton et al.
[48] разработали ИНС, позволяющую проводить дифференциальную диагностику хронического
панкреатита (ХП) и аденокарциномы поджелудочной железы на основе автоматизированного
анализа эндоскопических ультрасонограмм. Достигнута чувствительность выявления малигнизации в 100% случаев, суммарная диагностическая точность составила 80%.
Дифференциальный диагноз ХП и РПЖ также был целью исследований M. Ikeda et al.
и T. Mattfeldt et al. Работа M. Ikeda et al. (1997) базировалась на нейросетевом анализе компьютерных томограмм ПЖ, ИНС обучена на КТ-данных 32 пациентов с псевдотуморозным панкреатитом и 76 больных с аденокарциномой поджелудочной железы [49]. T. Mattfeldt et al. (2000) обучили нейронную сеть анализу гистологических срезов поджелудочной железы пациентов с ХП
и РПЖ [50].
K. Okon et al. (2001) разработали нейросетевую модель для классификации внутрипротоковых пролиферативных повреждений поджелудочной железы на основе анализа структуры хроматина [51]. ИНС смогла правильно классифицировать 73% указанных изменений.
В 2005 г. К. Honda et al. провели спектральный анализ экспрессии генов на основе ИНС у здоровых людей и у пациентов с аденокарциномой поджелудочной железы [52]. Диагностическая
способность модели оказалась достаточно высокой: достигнуты чувствительность и специфич-
На
118
ус
и
ау
Литература
кБ
ел
ар
ность в 91% случаев. При включении авторами в созданную ИНС анализа сывороточного кальция нейросеть правильно проклассифицировала все 29 примеров.
Заключение. Совершенствование методов диагностики и прогнозирования заболеваний поджелудочной железы имеет чрезвычайно большое значение ввиду частоты, тяжести течения и высокой летальности при данной патологии. Существующие в настоящее время диагностические
шкалы, системы прогнозирования осложнений и исходов заболеваний поджелудочной железы
не удовлетворяют все возрастающей потребности в полноценной своевременной диагностике
и прогнозе. Раннее распознавание стадии течения заболевания и прогнозирование возможных
осложнений является актуальной проблемой в хирургии поджелудочной железы.
Анализ публикаций о применении ИНС при остром панкреатите и РПЖ показывает, что нейросетевые технологии завоевывают все большее внимание исследователей. Экспертные компьютерные медицинские системы на основе ИНС позволяют врачу не только проверить собственные
предположения, но и использовать возможности искусственного интеллекта в сложных диагностических случаях.
На
ци
он
ал
ьн
ая
ак
ад
ем
ия
н
1. С а в е л ь е в В. С. // Анналы хирург. гепатол. 2001. Т. 6, № 2. С. 115–122.
2. А н д р е й ч и к о в А. В. Интеллектуальные информационные системы. М., 2006.
3. Г е л ь м а н В. Я. Медицинская информатика: Практикум. СПб., 2002.
4. О с о в с к и й С. Нейронные сети для обработки информации. М., 2004.
5. Б о р о в и к о в В. П. Прогнозирование в системе Statistica в среде Windows. М., 2006.
6. С в е т у х и н А. М. // Хирургия. 2002. № 9. С. 51–57.
7. С в е т у х и н А. М. // Хирургия. 2002. № 10. С. 60–69.
8. Л и т в и н А. А. // Проблемы здоровья и экологии. 2007. Т. 2, № 12. С. 7–14.
9. G u d j o n s s o n B. // J. Clin. Gastroenterol. 1996. Vol. 23, N 1. P. 2–6.
10. H a y k i n S. New directions in statistical signal processing. L., 2007.
11. R a n s o n J. H. // World J. Surg. 1999. Vol. 21, N 2. P. 136–142.
12. R a n s o n J. H. // Surg. Gynecol. Obstet. 1974. Vol. 139, N 1. P. 69–81.
13. I m r i e C. W. // Br. J. Surg. 1978. Vol. 65, N 1. P. 337–341.
14. B a l t h a z a r E. J. // Radiology. 1990. Vol. 174, N 1. P. 331–336.
15. K n a u s W. A. // Crit. Care Med. 1985. Vol. 13, N 1. P. 818–829.
16. B r a d l e y E. L. // Arch. Surg. 1993. Vol. 128, N 1. P. 586–590.
17. A n d e r s s o n B. // Pancreatology. 2006. Vol. 6. P. 536–541.
18. British Society of Gastroenterology // Gut. 1998. Vol. 42. (Suppl. 2). P. S1–S13.
19. S a n d b e r g A. // JOP. 2002. Vol. 3. P. 116–125.
20. S m i t h R. // ANZ J. Surg. 2005. Vol. 75. P. 399–404.
21. B r o w n A. // Pancreas. 2000. Vol. 20. P. 367–372.
22. N e o p t o l e m o s J. P. // Lancet. 2000. Vol. 355. P. 1955–1960.
23. B u c h l e r M. Acute Pancreatitis. Berlin, 1999.
24. F o r s m a r k C. E. Pancreatitis and its complications. New Jersey, 2005.
25. T r i e s t e r S. L. // J. Clin. Gastroenterol. 2002. Vol. 34. P. 167–176.
26. K a z m i e r c z a k S. C. // Clin. Chem. 1993. Vol. 39. P. 1960–1965.
27. P o f a h l W. E. // Am. Surg. 1998. Vol. 64. P. 868–872.
28. K e o g a n M. T. // Acad. Radiol. 2002. Vol. 9. P. 410–419.
29. H a l o n e n K. I. // Pancreatology. 2003. Vol. 3. P. 309–315.
30. M o f i d i R. // Surgery. 2007. Vol. 141. P. 59–66.
31. C h e n R. // Carcinogenesis. 2005. Vol. 26. P. 1513–1519.
32. H a l l P. // Pathology. 2002. Vol. 34. P. 504–517.
33. T a l a m i n i G. // Am. J. Gastroenterol. 1999. Vol. 94. P. 1253–1260.
34. K l e i n A. P. // Cancer Res. 2004. Vol. 64. P. 2634–2638.
35. L o w e n f e l s A. B. // J. Cell Biochem. 2005. Vol. 95. P. 649–656.
36. V i t o n e L. J. // Best Pract. Res. Clin. Gastroenterol. 2006. Vol. 20. P. 253–283.
37. L o w e n f e l s A. B. // N. Engl. J. Med. 1993. Vol. 328. P. 1433–1437.
38. W h i t c o m b D. C. // Nat. Genet. 1996. Vol. 14. P. 141–145.
39. M i l l s P. K. // Cancer. 1988. Vol. 61. P. 2578–2585.
40. N o r e l l S. E. // Am. J. Epidemiol. 1986. Vol. 124. P. 894–902.
41. I k e d a M. // Cancer. 2001. Vol. 91. P. 490–495.
42. S e z g i n C. // Scand. J. Gastroenterol. 2005. Vol. 40. P. 1486–1492.
43. E n g e l k e n F. J. // EJSO. 2003. Vol. 29. P. 368–373.
119
ус
и
ел
ар
44. Z i s k e C. // Br. J. Cancer. 2003. Vol. 89. P. 1413–1417.
45. N i e d e r g e t h m a n n M. // Pancreas. 2002. Vol. 25. P. 122–129.
46. J u u t i A. // J. Clin. Pathol. 2006. Vol. 59. P. 382–386.
47. B a r t o s c h – H a r l i d А. // Br. J. of Surg. 2008. Vol. 95. P. 817–826.
48. N o r t o n I. D. // Gastrointest. Endosc. 2001. Vol. 54. P. 625–629.
49. I k e d a M. // Comput. Med. Imaging Graph. 1997. Vol. 21. P. 175–183.
50. M a t t f e l d t Т. // J. Microscopy. 2000. Vol. 198. P. 143–158.
51. O k o n K. // Anal. Cell. Pathol. 2001. Vol. 23. P. 129–136.
52. H o n d a K. // Cancer Res. 2005. Vol. 65. P. 10613–10622.
O. G. ZHARIKOV, A. A. LITVIN
кБ
USE OF THE METHOD OF ARTIFICIAL NEUTRAL NETWORKS IN DIAGNOSIS
AND PROGNOSIS OF PANCREAS DISEASES
Gomel Regional Clinical Hospital, Belarus
ау
Summary
На
ци
он
ал
ьн
ая
ак
ад
ем
ия
н
Acute pancreatitis and pancreas cancer are the most serious pancreas diseases with high parameters of morbidity and
mortality. It demands the methods of their diagnostics, treatment and predicting to be improved. Diagnostic scales and prognostic systems do not serve the needs of clinical medicine. Modern technical opportunities allow achieving a qualitatively
new level of representation of clinical course, namely, simulating the development of a pathological process on the basis of
artificial neural network technologies.
In the article the review of the examples of use of artificial neutral networks for pancreas diseases is made, advantages
and disadvantages of medical application of artificial intelligence are stated.
ар
СЕ­Р­Ы Я МЕДЫЦЫНСКІХ НА­ВУК
ус
и
ВЕСЦI НА­Ц­Ы Я­НАЛЬ­НАЙ АКА­ДЭМII НА­ВУК БЕ­ЛА­РУСI № 3 2009
ВИТАЛИЙ НИКОЛАЕВИЧ НИКАНДРОВ
(К 60-летию со дня рождения)
ел
ВУЧОНЫЯ БЕЛАРУСІ
На
ци
он
ал
ьн
ая
ак
ад
ем
ия
н
ау
кБ
4 августа 2009 г. видному белорусскому исследователю
в области общей биохимии и биотехнологии Виталию Николае­
вичу Никандрову исполнилось 60 лет.
Виталий Николаевич родился в г. Лиде Гродненской области в семье военнослужащих.
Окончив с медалью в 1966 г. школу, В. Н. Никандров поступил в Витебский ветеринарный институт. Его научная деятельность началась на 2-м курсе на кафедре биологической химии,
руководимой в то время крупным ученым в области биологического действия микроэлементов проф. Ф. Я. Беренштейном.
Выполненные им работы о воздействии солей селена, ванадия
и титана на биохимические процессы в организме кроликов, об
изменениях энзиматической активности головного мозга и миокарда животных при экспериментальной токсической дистрофии печени были удостоены II премии на Всесоюзной научной
конференции студентов сельскохозяйственных вузов СССР
(Киев, 1970) и дважды (в 1970 и 1971 гг.) – медали Минвуза СССР
«За лучшую студенческую научную работу». Первые научные труды опубликованы в 1970 г.
В 1971 г. В. Н. Никандров успешно окончил институт и после непродолжительной работы
в бактериологическом отделе Городокской районной ветеринарной лаборатории (Витебская область) был принят в аспирантуру по специальности «биохимия» при НИИ экспериментальной
ветеринарии.
Кандидатская диссертация, выполненная им под руководством проф. А. Т. Пикулева и проф.
С. Ю. Бусловича и посвященная перестройкам реакций углеводно-энергетического метаболизма
в органах животных при введении ядохимикатов группы 2,4-Д, защищена в 1975 г. Один из итогов диссертационной работы – обоснование нормативов предельно допустимых концентраций
этих ядов в кормах для сельскохозяйственных животных (утв. Минсельхозом СССР в 1975 г.)
С января 1975 по декабрь 2008 г. В. Н. Никандров работал в НИИ эпидемиологии и микробиологии Минздрава Республики Беларусь в должности младшего, а затем старшего научного
сотрудника. С июля 1978 г. возглавил лабораторию прикладной энзимологии и одновременно –
отдел биохимии и технологии микробных ферментов (научно-производственную структуру численностью 60 сотрудников), где в 1975–1983 гг. по предложению министра здравоохранения
СССР акад. Б. В. Петровского под руководством акад. В. И. Вотякова и акад. Н. Е. Савченко был
создан отечественный препарат тромболитического действия – стрептокиназа (для внутрисосудистого введения – «Целиаза»). В 1984 г. Минздрав СССР утвердил фармакопейную статью
и лабораторный регламент на производство препарата, и был начат его серийный выпуск.
В. Н. Никандровым разработан первый вариант энзиматического контроля чистоты стадий
очистки и готового продукта, предложены составы для стабилизации стрептокиназы, изучен
метаболизм продуцента, биосинтез им стрептокиназы. Под руководством В. Н. Никандрова синтезированы иммобилизованные формы «Целиазы» на модифицированных и нативных матрицах, охарактеризованы структурные и функциональные свойства иммобилизованных форм бел121
ус
и
ци
он
ал
ьн
ая
ак
ад
ем
ия
н
ау
кБ
ел
ар
ка. Совместно с В. И. Вотяковым и Н. Е. Савченко В. Н. Никандровым изложена концепция создания тромболитических препаратов и предложена оригинальная биохимическая классификация
тромбофилических состояний и тромболитических препаратов.
Еще в 1982 г. В. Н. Никандров предсказал существование гистидин-карбоксильных (гистидинаспартильных) протеиназ. Через 20 лет такие протеиназы были обнаружены американскими исследователями у малярийного плазмодия.
Основным направлением работ В. Н. Никандрова явились исследования структурно-функ­
циональных свойств молекул стрептокиназы и плазминогена. В итоге обоснован принципиально
новый механизм активаторной функции стрептокиназы (опосредованный супероксидным радикалом), выдвинута концепция кислородзависимого пути активации плазминогена, впервые найдены
специфические ингибиторы стрептокиназы природного происхождения. Данные о струк­турной подвижности молекулы стрептокиназы на 5–7 лет опережали работы исследователей США, Германии,
Великобритании и легли в основу авторской модели структурной организации этого белка. В работах В. Н. Никандрова впервые выдвинута гипотеза кислородзависимых реакций протеолиза. Описан (совместно с Н. С. Пыжовой) феномен подавления протеолитических реакций АТФ.
В 1989 г. им успешно защищена докторская диссертация «Стрептокиназа: структурные
и функциональные свойства», в числе оппонентов которой был один из крупнейших биохимиков
СССР акад. И. Б. Збарский.
Полученные под руководством В. Н. Никандрова уникальные фактические материалы
о роли ряда аминокислотных остатков в структурно-функциональной специфике стрептокиназы
были опубликованы в книге «Chemical Modification of Enzymes» (New York, 1996).
В работах В. Н. Никандрова выявлены принципиально новые значимые для реализации токсического действия свойства молекул стрептолизина О и дифтерийного токсина. Совместно
с Н. С. Пыжовой им обнаружены и описаны «фосфатный эффект» в протеолизе, защитное действие АТФ при УФ-инактивации плазминогена, новые функциональные свойства молекулы фактора роста нервов и его субъединиц, парадоксальное действие фенилметилсульфонилфторида на
протеолитические реакции.
Под его руководством изучено и описано явление формирования устойчивых эквимолярных
комплексов плазминогена или стрептокиназы с клеточными энзимами углеводно-энергетического
метаболизма, исследованы конформационные и функциональные свойства комплексов, что позволило обосновать положение о значении этого феномена для рецепции на мембранах клеток
плазминогена и его активаторов.
С сентября 1998 г. В. Н. Никандров по приглашению акад. В. Н. Гурина перешел на работу
в Национальную академию наук Беларуси, возглавив лабораторию регуляторных белков и пептидов Института физиологии, не оставляя при этом работу в лаборатории в НИИ эпидемиологии
и микробиологии. В этот период под его руководством были развернуты комплексные исследования роли плазминогена и стрептокиназы в жизнедеятельности клеток нервной ткани. Впервые
описан нейротрофический эффект стрептокиназы и плазминогена. Дано теоретическое обоснование нетрадиционного использования стрептокиназы в лечебных целях. Впервые изучено действие пируваткиназы и ее устойчивых комплексов с плазминогеном или стрептокиназой, а также эритроцитарной супероксиддисмутазы на структурно-функциональные характеристики клеток нервной ткани.
Совместно с В. А. Кульчицким и В. Ф. Пятиным им впервые продемонстрированы изменения
электрической активности нейронов ствола головного мозга крысы под действием плазминогена
и стрептокиназы, причем 10-минутное воздействие плазминогена вело к необратимой блокаде
активности нейронов дыхательного центра.
Совместно с М. Е. Хмарой В. Н. Никандровым изложено представление о новом пути регуляции
пролиферации клеток путем образования в них под воздействием повреждающих факторов термостабильных энзиматически активных белковых комплексов, стимулирующих пролиферацию.
Были получены культуры ткани миокарда, эндотелия сосудов, паращитовидной железы.
Под его руководством описаны ранее не известная собственная энзиматическая активность
питательных сред на основе гидролизатов и экстрактов биологических тканей, особенности рас-
На
122
ус
и
На
ци
он
ал
ьн
ая
ак
ад
ем
ия
н
ау
кБ
ел
ар
щепления белков протеиназами высокотоксигенного штамма коринебактерий дифтерии PW-8
и характер перестроек протеиназного аппарата в условиях, оптимальных для токсиногенеза, выделены эффекторы протеолиза этого штамма, установлены гемолитическая и инициирующая
протеолиз способность пиовердина и пиоцианина Ps. aеruginosa.
Осуществлены разработка отечественных питательных сред для микробиологической диаг­
ностики туберкулеза и дифтерии и организация серийного выпуска сред по заказу Минздрава
Республики Беларусь, сыворотки крови лошадиной для микробиологической диагностики дифтерии. Все препараты прошли государственные испытания, сертификацию и регистрацию.
В. Н. Никандровым опубликовано 420 научных работ. В их числе 30 изобретений. Им подготовлено 7 кандидатов наук. В 1999–2001 г. организован и прочитан спецкурс «Функциональная
нейрохимия» на кафедре физиологии человека и животных биологического факультета Белгосуниверситета, в 2002–2008 гг. – курс лекций по биохимии животных в Витебской государственной академии ветеринарной медицины.
В. Н. Никандров являлся одним из организаторов и редактором трудов трех симпозиумов по
проблеме стрептокиназы и фибринолиза (1980–1985 гг.), в которых приняли участие ведущие
ученые России, Украины, Прибалтики, Беларуси.
По предложению Международной ассоциации клеточной и молекулярной биологии в 2005 г.
он был организатором-председателем симпозиума по протеолизу, прошедшего в рамках 4-го
Международного конгресса по клеточной и молекулярной биологии (Пуатье, Франция). Вицепредседателем этого симпозиума дал согласие быть проф. Авраам Гершко – Нобелевский лауреат
2004 г. В 2007 г. В. Н. Никандровым организована международная конференция по протеолизу
(г. Минск), в которой приняли участие ведущие специалисты из России, Украины, Швеции, Словении.
С 2000 г. он входит в состав редколлегии журнала «Известия НАН Беларуси. Сер. медикобиологических наук» (ныне – «Новости медико-биологических наук»), с 2006 г. – член редколлегии журнала «Весцi НАН Беларусi. Сер. мед. навук».
В течение ряда лет В. Н. Никандров был членом Совета по проблемам биотехнологии при
НАН Беларуси, правления Белорусского биохимического общества, Ученого Совета Минздрава
Республики Беларусь, совета Д 01.21.01 по защите диссертаций при Институте биоорганической
химии НАН, экспертом ИНТАС, членом экспертного совета БРФФИ, возглавлял как председатель совета Д 03.02.01 аттестацию специалистов высшей квалификации по вирусологии и эпидемиологии.
В. Н. Никандров является членом Общего собрания НАН Беларуси, совета Д 01.36.01 при
Институте физиологии НАН (с 2006 г. – зам. председателя этого совета), членом Республиканского
экспертного совета по школьным программам обучения при НАН Беларуси и членом экспертного совета ВАК Республики Беларусь.
В. Н. Никандров – член European Peptide Society, избран членом Нью-Йоркской академии
наук, член правления Белорусского общества физиологов. Удостоен знака «Изобретатель СССР»
(1986), диплома I степени ВДНХ БССР (1988), неоднократно награждался почетными грамотами
Минздрава Республики Беларусь и ряда общественных организаций. В 2003 г. совместно
с Н. С. Пыжовой ему присуждена премия Национальной академии наук Беларуси за цикл научных работ по новым механизмам регуляции протеолиза на молекулярном и клеточном уровне.
Желаем Виталию Николаевичу крепкого здоровья и творческого долголетия.
Редакционная коллегия
ар
СЕ­Р­Ы Я МЕДЫЦЫНСКІХ НА­ВУК
ус
и
ВЕСЦI НА­Ц­Ы Я­НАЛЬ­НАЙ АКА­ДЭМII НА­ВУК БЕ­ЛА­РУСI № 3 2009
РЕФЕРАТЫ
УДК 575.1./.316:616.24-006
ел
К в и т к о О. В., К о н е в а И. И., А н и с о в и ч М. В., Ш е й к о Я. И., К р у п н о в а Э. В., Ч а к о в а Н. Н.,
М и х а л е н к о Е. П., Д р о м а ш к о С. Е. Использование генетического маркера клеточного старения
бета-галактозидазы в цитологической онкодиагностике // Весці НАН Беларусі. Сер. мед. навук. 2009. № 3.
С. 5–9.
ау
кБ
Изучена экспрессия гена бета-галактозидазы в опухолевых и нормальных участках легочной ткани больных
плоскоклеточным раком легкого. Отличительной особенностью опухолевых участков является наличие крупных
(порядка сотен клеток) клеточных агрегатов, интенсивно окрашиваемых по бета-галактозидазе. В группе
умерших лиц, болевших рядом заболеваний, но не плоскоклеточным раком легкого, наибольшая экспрессия бетагалактозидазы в тканях легкого выявлена у больных циррозом печени.
Ил. 3. Библиогр.– 10 назв.
УДК 616.441-006.6-085.357
ем
ия
н
М и т ю к о в а Т. А., Л е о н о в а Т. А., Д р о з д В. М., П л а т о н о в а Т. Ю., Л у щ и к М. Л., Т у з о в а А. А. Динамика уровня тиреоидных гормонов в сыворотке крови пациентов с карциномой щитовидной железы после приема L-тироксина // Весцi НАН Беларусi. Сер. мед. навук. 2009. № 3. С. 10–15.
ак
ад
Изучены изменения уровней тиреоидных гормонов в сыворотке крови у пациентов с карциномой щитовидной
железы (ЩЖ) после орального приема стандартной супрессивной дозы тироксина в зависимости от исходного
уровня тиреотропного гормона (ТТГ).
У 20 пациентов проведено определение уровня тиреоидных гормонов – общий и свободный тироксин (Т4 и
св. Т4), общий и свободный трийодтиронин (Т3 и св. Т3) в сыворотке крови натощак, через 1 и 3 ч после орального
приема стандартной супрессивной дозы L-тироксина (около 3 мкг/кг). Пациенты были разделены на три группы:
1) супрессия ТТГ (<0,3 мМЕ/л), 2) ТТГ в интервале нормы (0,3−4,2 мМЕ/л) и 3) ТТГ более 4,2 мМЕ/л.
Выявлены некоторые особенности в исходном тиреоидном статусе и в динамике гормонов Т4, св. Т4, Т3 и св.
Т3 после орального приема супрессивной дозы тироксина в группах пациентов, имеющих отличия по уровню ТТГ.
Статистически значимое повышение уровней Т4 и св. Т4 после орального приема тироксина было отмечено
у лиц из группы некомпенсированного гипотиреоза, что демонстрирует нормальную абсорбцию препарата.
Недостаточная эффективность тироксинотерапии у некоторых лиц (группы эутиреоза и гипотиреоза), повидимому, может быть связана не с абсорбцией тироксина, а с нарушениями рекомендаций по приему препарата.
Определение уровней Т4 и св. Т4 в сыворотке крови после орального приема стандартной дозы тироксина
может использоваться как клиническая проба на исключение нарушений абсорбции препарата.
Выявлены отличия конверсии Т4 в Т3, а также активности тиреоидтранспортных систем у пациентов со
стабильной супрессией ТТГ на фоне более высокой кумулятивной активности радиойода (более 9 ГБк).
Табл. 1. Ил. 5. Библиогр. – 10 назв.
ая
УДК 616.831-005:[612.1:612.014.464:546.46
ьн
Н е ч и п у р е н к о Н. И., А н а ц к а я Л. Н., П а ш к о в с к а я И. Д., Г р и б о е д о в а Т. В., М а с л о в а Г. Т.
Роль изменений показателей антиоксидантной системы и содержания магния крови в развитии лакунарного инфаркта мозга и дисциркуляторной энцефалопатии // Весцi НАН Беларусi. Сер. мед. навук. 2009.
№ 3. С. 16–20.
ци
он
ал
Представлены результаты комплексного обследования 40 больных с энцефалопатией, лакунарным и атеро­­
тромботическим инфарктами мозга. Изучали уровень магния, восстановленного глутатиона (ГSH) и церулоплазмина (ЦП), активность супероксиддисмутазы (СОД) и каталазы, а также содержание вторичных продуктов
перекисного окисления липидов (ПОЛ), реагирующих с тиобарбитуровой кислотой, в крови пациентов.
Показано, что в формировании лакунарного инфаркта мозга при церебральной микроангиопатии основная
роль принадлежит хронической цереброваскулярной недостаточности, которая усугубляется сердечно-сосудистой
патологией. Установлены активация реакций ПОЛ во всех изученных группах и снижение активности СОД
у пациентов с дисциркуляторной энцефалопатией, а также изменение активности каталазы, содержания ГSH
и ЦП, направленные, скорее всего, на поддержание антиокислительной системы в организме как при острой, так
и при хронической церебральной ишемии. Одним из механизмов компенсации, по нашему мнению, у больных
с лакунарным инфарктом мозга и дисциркуляторной энцефалопатией является возрастание концентрации магния
в крови, способствующее, вероятно, сохранению необходимой церебральной перфузии за счет вазодилатации при
снижении скорости кровотока по брахиоцефальным артериям.
Табл. 2. Библиогр.– 21 назв.
На
124
ус
и
УДК 612.014.482
К о н о п л я Е. Ф., С у ш к о С. Н., М а л е н ч е н к о А. Ф., С а в и н А. О., К а д у к о в а Е. М., Г о н ч а р о в С. В. Влияние экологических факторов зоны отчуждения ЧАЭС на соматические клетки мышей
и их потомства // Весцi НАН Беларусi. Сер. мед. навук. 2009. № 3. С. 21–26.
ау
кБ
ел
ар
Изучено влияние экологических факторов зоны отчуждения ЧАЭС на соматические клетки мышей линии Af,
находившихся в зоне отчуждения ЧАЭС 1 мес., и их потомства к действию канцерогена (уретана).
Показано повышение частоты микроядер в полихроматофильных эритроцитах (МЯ ПХЭ) костного моз­
га, количества аденом в легких и статистически достоверное увеличение содержания метгемоглобина в пери­
ферической крови мышей, находившихся в зоне отчуждения ЧАЭС.
У потомства F1 мышей, экспонированных в зоне отчуждения, частота ПХЭ с МЯ костного мозга увеличена
по сравнению с контролем на 80%. Введение уретана потомству F1 экспонированных в зоне отчуждения мышей
привело к более существенному росту частоты ПХЭ с МЯ по сравнению с введением уретана мышам-родителям,
что свидетельствует о более высокой реактивности. Спонтанная частота аденом в легких у потомства мышей,
экспонированных в зоне отчуждения ЧАЭС, а также опухолеобразование после введения уретана статистически
достоверно увеличились по сравнению с показателями у потомства интактных мышей с уретановой инто­
ксикацией. Количество активных фагоцитов в бронхоальвеолярном смыве при введении уретана у потомства
мышей, экспонированных в зоне отчуждения, было снижено по сравнению с количеством фагоцитов у потомства
интактных животных. Наблюдается широкая индивидуальная вариабельность полученных данных.
Табл. 5. Ил. 1. Библиогр. – 13 назв.
УДК 615.244.03:616.36-02:547.262]-092.9
ем
ия
н
В и н и ц к а я А. Г., Л е л е в и ч В. В., Л е д н е в а И. О., Д о р о ш е н к о Е. М. Сравнительная характеристика обмена гамма-аминомасляной кислоты в головном мозге и печени крыс при синдроме отмены
этанола // Весцi НАН Беларусi. Сер. мед. навук. 2009. № 3. С. 27–30.
УДК 577.3:612.65:621.391
ак
ад
Проведено сравнительное исследование изменений обмена ГАМК в отделах головного мозга (большие
полуша­рия, мозжечок) и печени крыс в разные сроки отмены этанола после 5-дневной хронической алкоголизации
На 3-и и 7-е сутки отмены этанола в головном мозге и печени отмечено угнетение активности обоих ГАМКкатаболизирующих ферментов на фоне повышения (в мозжечке) и снижения (в печени) концентраций субстратов
ГАМК-трансаминазы. Сделано предположение, что наблюдаемые метаболические сдвиги являются следствием
неспецифической адаптации регионов головного мозга и гепатоцитов к интенсивной алкогольной нагрузке
и отмене этанола.
Полученные данные о нарушениях метаболизма ГАМК и энергетического обмена при отмене алкоголя могут
быть полезны при разработке новых методов лечения алкогольных абстинентных состояний и направленной
метаболической коррекции выявленных метаболических сдвигов.
Табл. 1. Ил. 2. Библиогр.– 19 назв.
Л и х а ч е в С. А., С и д о р е н к о А. В., О в с я н к и н а Г. И., Ч е р н у х а Т. Н., С а д о в н и к о в В. В. Нелинейный анализ электроэнцефалограмм при спастической кривошее // Весцi НАН Беларусi. Сер. мед.
навук. 2009. № 3. С. 31–38.
ал
ьн
ая
Предлагается для обработки и анализа электроэнцефалограмм при спастической кривошее использовать
методологию нелинейной динамики. Это позволяет проводить анализ электроэнцефалограмм, характерным для
которых является наличие наряду с ритмами мозга колебаний, обусловленных влиянием мышечных сокращений,
и оценить их динамику в процессе проведения лечения пациентов препаратом диспорт. Приведен алгоритм
реализации метода задержанной координаты, на основании которого разработано программное обеспечение.
Установлено, что электроэнцефалографические сигналы характеризуются параметрами нелинейной дина­
мики – корреляционной размерностью d, энтропией Колмогорова E, которые изменяются в процессе лечения. Это
согласуется с результатами традиционного спектрального анализа таких сигналов. Однако у данной кате­гории
больных они были менее информативны, чем при использовании предложенного нами метода анализа. Проведенные
исследования позволяют расширить представления о патогенезе изучаемой патологии и будут продолжены.
Табл. 4. Ил. 4. Библиогр.– 12 назв.
УДК 616.155.392
ци
он
С в и р н о в с к и й А. И., С е р г и е н к о Т. Ф., С м о л ь н и к о в а В. В., Б а к у н А. В., Т а р а с И. Б.
Экспрессия транспортного белка Р-гликопротеина на лейкозных лимфоцитах в связи с ответом на химиопрепараты in vitro // Весці НАН Беларусі. Сер. мед. навук. 2009. № 3. С. 39–42.
На
Исследована экспрессия белка P-гликопротеина (Р-gp) на нормальных и опухолевых лимфоцитах при
хроническом лимфоцитарном лейкозе (ХЛЛ) с учетом лекарственной чувствительности клеток in vitro. Уста­
новлено, что лейкозные клетки характеризуются более плотным распределением этого белка на поверхности, чем
нормальные лимфоциты. Четкой взаимосвязи между количеством P-gp на поверхности клеток и клиническими
параметрами пациентов с ХЛЛ и чувствительностью к лекарственным препаратам in vitro не выявлено. Таким
125
ус
и
образом, экспрессия P-gp не является надежным критерием для прогнозирования профиля лекарственной
чувствительности лейкозных лимфоцитов in vitro.
Табл. 3. Библиогр. – 9 назв.
УДК 611.819.2-611.161-612.086.3
ар
Н о в и к о в а Л. Н., А р ч а к о в а Л. И. Морфофункциональная организация сосудистого сплетения боковых желудочков головного мозга кролика // Весцi НАН Беларусi. Сер. мед. навук. 2009. № 3. С. 43–48.
кБ
ел
Методом трансмиссионной электронной микроскопии изучена структурно-функциональная организация
сосудистого сплетения боковых желудочков головного мозга кролика в физиологических условиях. Описана
ультраструктура и взаимоотношения эпителиальных клеток сосудистого сплетения между собой и с другими
компонентами сосудистого сплетения: базальной мембраной, капиллярами, надэпендимными клетками и
нервными волокнами. Изучена морфологическая структура иннервации капилляров и стромы сосудистого
сплетения. Определены структурные основы его гематоэнцефалического барьера. Установлены морфологические
основы функциональной активности структурных элементов сосудистого сплетения.
Ил. 3. Библиогр. – 24 назв.
УДК 612.8.015
ау
Т р о п н и к о в а Г. К. Влияние мелатонина на функциональное состояние серотонинергических структур
мозга после разрушения дорсального ядра шва в эксперименте // Весцi НАН Беларусi. Сер. мед. навук.
2009. № 3. C. 49–52.
ем
ия
н
В хронических экспериментах на взрослых самцах крыс массой 250 ± 20 г было показано, что внутрибрюшинное введение мелатонина в дозе 0,5 мг/кг ежедневно утром в течение 7 дней после электролитического разрушения
дорсального ядра шва (ДЯШ) предотвращает индуцированное операцией снижение уровня серотонина в теменной
коре и стриатуме, тормозит повышение его уровня в таламусе и вентролатеральных областях продолговатого
мозга, увеличивает его содержание в мозжечке и способствует снижению агрессивности и нормализации
локомоторной активности животных.
Полученные результаты свидетельствуют, что экзогенный мелатонин может предупреждать изменения
содержания серотонина в мозге, вызываемые деструкцией ДЯШ. Одним из возможных механизмов протекторных
эффектов мелатонина могут быть изменения в процессах окислительного дезаминирования выделяемого се­
ротонина.
Табл. 1. Ил. 1. Библиогр.– 19 назв.
УДК 577.3:612.65:615.47
ак
ад
Х о д у л е в В. И., С и д о р е н к о А. В. Состояние проводящей функции малоберцового нерва при алкогольной полиневропатии // Весцi НАН Беларусi. Сер. мед. навук. 2009. № 3. С. 52–58.
ьн
ая
C помощью электронейромиографии исследовано функциональное состояние малоберцового нерва у
больных с алкогольной полиневропатией. В зависимости от степени изменения нормированного отклонения
амплитуды и площади М-ответа пациенты с алкогольной невропатией были разделены на три группы. У первой группы больных показатель амплитуды М-ответа составлял не более двух, у второй – не более трех, а у
третьей – три и более нормированных отклонения. Проведена сравнительная оценка показателей, отражающих проводящую функцию малоберцового нерва в зависимости от степени его аксонального поражения.
Установлено, что показатели, характеризующие проводящие свойства малоберцового нерва (скорость
проведения, латентность F-волны), значимо изменялись по сравнению с показателями, отражающими аксональную функцию (амплитуда, площадь М-ответа) в первой и второй группах, тогда как в третьей группе подобной зависимости не наблюдалось. Кроме того, выявлена статистическая достоверность изменения скорости проведения импульса и латентности F-волны между данными показателями первой и второй групп и ее
отсутствие между показателями второй и третьей групп. При сравнении групп между собой изменения латентного периода М-ответа не наблюдалось.
Табл. 1. Ил. 1. Библиогр. – 21 назв.
ал
УДК 577.15 + 616.379-008.64 + 615.357
ци
он
С у д н и к о в и ч Е. Ю., М а к с и м ч и к Ю. З., З а б р о д с к а я С. В., М а к а р Е. А., Д р е м з а И. К.,
А в е р и н В. А., Л а п ш и н а Е. А. Влияние мелатонина на активность ферментов антиоксидантной защиты и пентозофосфатный путь при диабете // Весцi НАН Беларусi. Сер. мед. навук. 2009. № 3. С. 59–62.
Стрептозотоцин-индуцируемый диабет (60 мг/кг массы тела, внутрибрюшинно, продолжительность – 18
дней) сопровождался выраженным уменьшением массы тела животных, увеличением уровня фруктозилированных
белков, ингибированием ферментов антиоксидантной защиты и ферментов пентозофосфатного пути, по­став­
ляющего восстановительные эквиваленты в клетку. В то же время нами не обнаружено интенсификации
процессов перекисного окисления липидов в ткани печени и эритроцитах при значительном накоплении окиси
азота (NO) в плазме крови и эндотелии сосудов. Введение мелатонина (внутрибрюшинно, 1 раз в день) в дозе
На
126
ус
и
ар
10 мг/кг массы тела животного частично восстанавливало активность ферментов антиоксидантной защиты
и пентозофосфатного пути и предотвращало аккумуляцию NO в плазме крови и эндотелии сосудов. Полученные
результаты указывают на то, что регуляция биодоступности монооксида азота является одним из возможных
механизмов защитного действия мелатонина.
Табл. 3. Ил. 1. Библиогр. – 18 назв.
УДК 546.36:576.353.3]:616.12-008.3-073.96-092.9
Г р и ц у к Н. А. Митохондриальное окисление в кардиомиоцитах и электрокардиографические показатели у крыс при инкорпорации 137Cs // Весці НАН Беларусі. Сер. мед. навук. 2009. № 3. С. 63–67.
кБ
ел
Изучено влияние инкорпорации 137Cs до уровня удельной активности 170 и 600 Бк/кг на показатели мито­
хондриального окисления кусочков миокарда крыс и его электрической активности. При воздействии радионукли­
дов у животных возрастает скорость потребления кислорода на эндогенных субстратах, в присутствии глутама­
та, креатина и динитрофенола, нарушается депонирование макроэргов в форме креатинфосфата, отме­чается
разобщение окислительного фосфорилирования. ЭКГ изменения проявляются в виде увеличения час­тоты сер­дечных
сокращений и амплитуды зубцов R и T. Вызванные инкорпорацией 137Cs метаболические и функциональные изменения
миокарда соответствуют первой (нейрофункциональной) стадии метаболической кардиомиопатии.
Табл. 2. Ил. 1. Библиогр.– 29 назв.
ау
УДК 613.632:577.118:631.8
Ф и л о н ю к В. А., П е т р ов а – С о б о л ь Т. И., С е м е н о в И. П., П и р о г о в с к а я Г. В. Токсикологическая и гигиеническая характеристики новых комплексных удобрений с микроэлементами // Весці
НАН Беларусі. Сер. мед. навук. 2009. № 3. С. 68–74.
ем
ия
н
Установлено, что комплекс твердых бесхлорных азотно-фосфорно-калийных удобрений с мик­роэлементами
для моркови, капусты, бобовых, марок «Осеннее», «Калийфос-N» и хлорсодержащее удобрение для зеленых
насаждений не представляют опасности в плане вероятности острого отравления при их внутрижелудочном и
чрескожном поступлении (относятся к веществам IV класса опасности согласно ГОСТ 12.1.007–76), обладают
кумулятивными и кожно-резорбтивными свойствами на уровне функциональных эффектов в субхроническом
эксперименте с преимущественным поражением мочевыделительной и кроветворной систем, при однократном
воздействии не раздражают кожные покровы, слабо раздражают слизистые оболочки; половой резистентности к
удобрениям не имеется.
Табл. 2. Библиогр. – 5 назв.
УДК 616.832-004.2:612.017
ак
ад
Н и ж е г о р о д о в а Д. Б., К о л о б о в а М. Ю., Б а г а т к а С. С., И в а н ч и к Г. И., М о т у з о в а Я. М.,
З а ф р а н с к а я М. М. Экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит и функциональная характеристика Т-лимфоцитов // Весцi НАН Беларусi. Сер. мед. навук. 2009. № 3. С. 75–81.
ьн
ая
Экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит (ЭАЭ) представляет собой модель органоспецифической аутоиммунной патологии центральной нервной системы. ЭАЭ используется для изучения имму­но­па­
тогенетических механизмов и разработки терапевтических стратегий лечения рассеянного склероза. В последние годы
большое внимание уделяется изучению γδT-лимфоцитов, обладающих широким спектром биологических функций.
Изучены возможности использования ЭАЭ для оценки функционального состояния Т-лимфоцитов.
Полученные результаты свидетельствуют о неадекватности использования ЭАЭ для полноценной характеристики
миелин-специфического ответа Т-лимфоцитов периферической крови и лимфатических узлов. В то же время
представленные новые данные о результативности применения модели ЭАЭ для изучения количественных
и функциональных характеристик γδТ-лимфоцитов у лабораторных крыс могут служить ценным лабораторным
диагностическим маркером течения заболевания.
Табл. 2. Ил. 2. Библиогр.– 18 назв.
УДК 616.831-001.8-005.98
ал
Т и т о в е ц Э. П., С м е я н о в и ч А. Ф., П а р х а ч Л. П., Л у к а ш е й к о Ю. Н. Выраженность перитуморального отека головного мозга в зависимости от гистоструктуры опухоли // Весцi НАН Беларусi. Cер. мед.
навук. 2009. № 3. С. 82–87.
На
ци
он
Изучены количественные аспекты развития перитуморального отека головного мозга с позиций но­во­
го фундаментального знания о роли аквапоринов в водном метаболизме. Обследовано 118 пациентов с но­
вообразованиями головного мозга, цитоморфологической верификацией гистоструктуры опухоли и ве­
рифицированным, по данным МРТ, перитуморальным отеком.
Показано, что выраженность перитуморального отека зависит от гистоструктуры опухоли. Наиболее
выраженным перитуморальный отек был при первичных нейроэктодермальных опухолях высокой степени
злокачественности (анапластические астроцитомы, глиобластомы), а также при метастатическом поражении
головного мозга, наименее выраженным – при глиомах с низкой степенью злокачественности, а также при
менингиомах головного мозга.
Ил. 5. Библиогр. – 25 назв.
127
ус
и
УДК 616.12-073.97:616-002-07
ар
М р о ч е к А. Г., А л е к с е е в с к а я И. Н., К о р н е л ю к И. В., П е р с и д с к и х Ю. А., С е в р у к Т. В.,
У с т и н о в а И. Б., К о в а л е н к о Д. В. С-реактивный белок как маркер субклинического воспаления
при электрической кардиоверсии персистирующей мерцательной аритмии // Весці НАН Беларусі. Сер.
мед. навук. 2009. № 3. С. 88–92.
ел
Исследованы уровни С-реактивного белка как маркера субклинического воспаления у больных, прошедших
электрическую кардиоверсию персистирующей мерцательной аритмии. Установлено, что уровень С-реактивного
белка 5,0 мг/л и более ассоциирован с показателем неэффективности электроимпульсной терапии, а также
с развитием подострого рецидива мерцательной аритмии.
Табл. 2. Библиогр.– 21 назв.
кБ
УДК 616-006.6-084(476)
З а л у ц к и й И. В. Стратегия борьбы со злокачественными новообразованиями // Весцi НАН Беларусi.
Сер. мед. навук. 2009. № 3. С. 93–104.
ем
ия
н
ау
В статье отражены результаты многолетних исследований в области описательной эпидемиологии злокачественных новообразований, проведенных в РНПЦ ОМР им. Н. Н. Александрова. Представлена информация о заболеваемости злокачественными опухолями и структуре смертности от них в Республике Беларусь за
38-летний период. Установлено 5 основных типов, характеризующих закономерности динамики заболеваемости
солидными опухолями отдельных локализаций. Дана характеристика достигнутых результатов в работе
онкологической службы Республики Беларусь (снижение смертности при росте заболеваемости злокачественными опухолями) и определены нерешенные проблемы в области противораковой борьбы. Выдвинуто предложение о необходимости разработки и создания Национальной программы в области онкологии. Сформулированы цель и задачи программы и намечены пути ее выполнения.
Табл. 1. Ил. 6. Библиогр.– 24 назв.
УДК 616.15-005.1-08-071 (476)
П р о х о р о в а В. И., К о л я д к о Н. Н. Использование теста генерации тромбина для оценки коагуляционного потенциала крови // Весцi НАН Беларусi. Сер. мед. навук. 2009. № 3. С. 105–113.
ак
ад
Диагностика и коррекция нарушений системы гемостаза остается одной из важнейших проблем для врачей
стационаров различных профилей. До сих пор не выявлены все механизмы развития этих нарушений. На основе
анализа литературных данных описаны последняя модификация методики определения генерации тромбина
(Calibrated Automated Thrombogram), этапы его совершенствования, а также рассмотрены варианты использования
этой модификации в различных областях медицинской деятельности на примере исследований, проведенных
в клинических и научных лабораториях Европы.
Ил. 1. Библиогр.– 46 назв.
УДК 616.37-07
ая
Ж а р и к о в О. Г., Л и т в и н А. А. Использование метода искусственных нейронных сетей в диагностике
и прогнозировании заболеваний поджелудочной железы // Весцi НАН Беларусi. Сер. мед. навук. 2009. № 3.
С. 114–120.
На
ци
он
ал
ьн
Острый панкреатит и рак поджелудочной железы – одни из наиболее тяжелых заболеваний поджелудочной
железы с высокими показателями частоты заболеваемости и летальности. Это требует совершенствования
методов их диагностики, лечения и прогнозирования. Существующие в настоящее время диагностические шкалы
и прогностические системы не удовлетворяют потребности клинической медицины.
Современные технические возможности позволяют выйти на качественно новый уровень представлений
о течении заболевания, а именно смоделировать развитие патологического процесса на основе нейросетевых
технологий.
Приведен литературный обзор известных примеров использования искусственных нейронных сетей при
заболеваниях поджелудочной железы, изложены достоинства и недостатки медицинского применения ис­
кусственного интеллекта.
Ил. 3. Библиогр.– 52 назв.