6566 УДК 574.352.3 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ МОДЕЛИРОВАНИЕ ПРОДОЛЖИТЕЛЬНОСТИ ЖИЗНИ А.И. Божков НИИ биологии Харьковского национального университета им. В.Н. Каразина Украина, 61022, Харьков, Свободы пл., 4 E-mail: bozhkov@univer.kharkov.ua Ю.В. Никитченко НИИ биологии Харьковского национального университета им. В.Н. Каразина Украина, 61022, Харьков, Свободы пл., 4 E-mail: yunikitchenko@mail.ru Е.М. Климова Кафедра молекулярной биологии и биотехнологии Харьковского национального университета им. В.Н. Каразина Украина, 61022, Харьков, Свободы пл., 4 E-mail: klimova_elena@list.ru С.В. Львов НИИ биологии Харьковского национального университета имени В.Н. Каразина Украина, 61022, Харьков, Свободы пл., 4 E-mail: lvovser@rambler.ru Ключевые слова: продолжительность жизни, активность ферментов, температура тела, про- и антиоксидантная система Аннотация: На моделях увеличения и уменьшения средней продолжительности жизни обнаружена взаимосвязь между температурой тела и продолжительностью жизни у крыс. Показано, что экспериментальное моделирование продолжительности жизни в этом случае сопряжено с изменением окислительного фосфорилирования и активностью проантиоксидантной системы в организме. 1. Введение Основная цель биологических исследований направлена на разработку систем управления: продуктивностью (агробиотехнологии), метаболизма (здравоохранение и животноводства) и наконец, продолжительностью жизни (геронтология). Без знаний закономерности и принципов биологической регуляции эти цели не могут быть достигнутыми. В изучении систем биорегуляции особое место занимает процесс моделирования. С одной стороны – моделирование – это проверка экспериментальных данных и подтверждение эмпирических гипотез, а, с другой – это получение новых знаний о принципах функционирования биологических систем. Однако моделирование биологических процессов сопряжено с целым рядом объективных и субъективных ограничений и трудностей. Так, в настоящее время накоплен XII ВСЕРОССИЙСКОЕ СОВЕЩАНИЕ ПО ПРОБЛЕМАМ УПРАВЛЕНИЯ ВСПУ-2014 Москва 16-19 июня 2014 г. 6567 огромный массив экспериментальных и клинических данных, однако эти данные не всегда могут быть объединены и использованы для построения обобщающих моделей. Это связано, прежде всего с тем, что биологи в своих исследованиях практически не используют системный подход. Поэтому мы мало знаем о механизмах взаимосвязи молекулярного уровня с клеточным и особенно организменным уровнем, что необходимо для построения математических моделей. Так, исследуя механизмы продолжительности жизни, мы владеем знаниями о молекулярных возрастзависимых изменениях метаболизма, однако мало знаем, как эти изменения интегрируются в данную систему и формируют механизмы, непосредственно влияющие на продолжительность жизни. В связи с этим, разработка подходов к моделированию биологических процессов является актуальной задачей. В этом направлении уже получены интересные результаты в ряде лабораторий, и сегодня можно говорить о геронтологии in silico [1, 2]. Для дальнейшего развития этого перспективного подхода нам необходимо знать, существуют ли метаболические состояния, которые обеспечивают значительную продолжительность жизни, какова характеристика этих состояний, которые сопряжены с увеличением и, напротив, с уменьшением продолжительности жизни. Решение этих насущных задач, по сути, есть разработка имитационного моделирования, которое использует множество правил, определяющих в какое состояние, перейдет система в будущем из заданного текущего состояния [3]. Решение этих задач может быть основано на экспериментальном моделировании продолжительности жизни. Наиболее изученной и широко используемой моделью увеличения продолжительности жизни является калорийно ограниченная диета (КОД) [4]. Наряду с этим, имеются данные, указывающие на то, что снижение температуры тела у насекомых сопровождается увеличением продолжительности жизни [4]. Однако эта модель работает пока только для насекомых. В 1986 г. Оока показал, что гипертиреоз сопровождался сокращением продолжительности жизни крыс [5]. В связи с этим, целью настоящей работы было исследование взаимосвязи между температурой тела, состоянием эпигенотипа, отражающего проантиоксидантную активность и продолжительностью жизни. Этот подход может позволить определить взаимосвязь текущего состояния эпигенотипа с предстоящей продолжительностью жизни и ответить на вопрос о системоорганизующей роли температуры тела млекопитающих. Для решения этих задач были использованы две экспериментальные модели: калорийно ограниченная диета и модель индуцированного гипертиреоза (ИГ). 2. Методы исследования Модель КОД разработана в НИИ биологии акад. АН Украины В.Н. Никитиным и описана в работе [4]. Для получения модели крыс с гипертиреозом взрослые крысы получали тироксин с питьевой водой в дозе 0,1 мг/100 г ежедневно на протяжении двух месяцев. У экспериментальных животных определяли массу тела, температуру тела, продолжительность жизни. Для определения эпигенотипа, обеспечивающего проантиоксидантную активность, определяли содержание тироксина и трийодтиронина в сыворотке крови, активность антиоксидантных ферментов (глутатионпероксидазы, глутатионтрансферазы, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы и др.), как описано в работе [6]. 6568 О функциональной активности митохондрий судили по скорости окислительного фосфорилирования [6]. Активность прооксидантной системы оценивали по содержанию ТБК-активных продуктов. Результаты обрабатывали статистически. 3. Результаты исследования 3.1. Связь продолжительности жизни, тиреоидного статуса и термогенеза Перевод одномесячных крыс на калорийно ограниченную диету (КОД), сопровождалось увеличением продолжительности жизни (рис. 1). Необходимо отметить, что ректальная температура в онтогенезе крыс незначительно снижалась (рис.1). Однако у крыс, находящихся на КОД она была достоверно ниже контрольного уровня на всех этапах онтогенеза (рис. 1). 1.0 37.0 B D C E 36.5 survival rate 36.0 0.6 35.5 0.4 35.0 34.5 0.2 body temperature, C 0.8 34.0 0.0 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 age, month Рис. 1. Продолжительность жизни крыс контрольной группы (1) и группы на КОД (2). Температура тела контрольной группы (□) и группы на КОД (■). Снижение температуры тела у животных, находящихся на КОД, происходило на фоне достоверного снижения содержания тироксина на 35-39 % и трийодтиронина на 50 % (рис. 2). Следовательно, между содержанием тиреоидных гормонов, температурой тела и продолжительностью жизни у животных, находящихся на КОД, существует тесная взаимосвязь. Ранее было показано, что, регулярное потребление тироксина с питьевой водой сопровождалось развитием гипертиреоза и сокращением средней продолжительности жизни крыс [5]. В наших экспериментах двухмесячное потребление Т4 с питьевой водой начиная с 17 мес. возраста сопровождалось увеличением тироксина в сыворотке крови почти в 2 раза, при этом у них увеличивалось и содержание трийодтиронина на 48 % (табл. 1). Это свидетельствует об эффективной конверсии Т4 в Т3, в которой принимает участие селензависимая монодейодиназа. Температура тела у крыс с индуцированным гипертиреозом (ИГ) была почти на 2 °С выше средней температуры тела контрольных крыс (таблица 1). 6569 Таблица 1. Среднее значение температуры тела, содержания тироксина и трийодтиронина в сыворотке крови контрольных 19-ти мес. крыс и крыс с 2-х месячным гипертиреозом в возрасте 19 месяцев. Примечание. * – достоверная разница по сравнению с контролем при Р <0,05. Показатель Содержание тироксина, нмоль/л Содержание трийодтиронина, нмоль/л Ректальная температура, °С Контроль 30,98 ± 2,03 0,66 ± 0,04 36,3 ± 0,3 Гипертиреоз 60,18 ± 7,02* 0,98 ± 0,11* 38,2 ± 0,3* Следовательно, между содержанием тироксина в крови, ректальной температурой животных и продолжительностью их жизни существует взаимосвязь не только на модели КОД, но и в случае длительного потребления тироксина. Как известно, изменение температуры тела отражает баланс между теплопродукцией и теплообменом. В случае тироксина мы наблюдали увеличение теплопродукции, а это, в свою очередь, может сопровождаться и изменением морфологических и весовых характеристик таких животных. Масса 19 мес. крыс с экспериментальным 2-х месячным гипертиреозом была меньше контрольных животных на 36 % (табл. 2). Таблица 2. Изменение массы животного, массы печени и митохондриальной фракции 19-ти месячных крыс с 2-х месячным гипертиреозом. Средние значения из 5-9 повторностей при Р< 0,05 по сравнению с контрольным вариантом. Показатель Масса животного, г Масса печени, г Соотношение массы животного к массе печени г/г × 10-2 19-ти месячные крысы Контроль Гипертиреоз 407,5 ± 7,5 264,0 ± 6,0* 9,3 ± 0,36 10,9 ± 0,76 2,3 ± 0,10 4,2 ± 0,2* Уменьшение массы крыс на фоне стабильного повышения температуры тела убедительно свидетельствует об увеличении теплопродукции у этих животных. В таком случае можно ожидать увеличения функциональной нагрузки на печень как одного из органов энергетического обмена организма. Оказалось, что масса печени у крыс с ИГ была несколько увеличенной, а с учетом массы тела, относительная масса этого органа была почти в 2 раза больше контрольных животных (таблица 2). Можно ожидать, что увеличение относительной массы печени будет сопровождаться увеличением количества митохондрий в расчете на единицу массы животного. 3.2. Функциональная активность митохондрий печени гипертиреоидных крыс Скорость нефосфорилирующего окисления сукцината (V2) в изолированных митохондриях печени крыс с ИГ была увеличенной на 57,2 %, а скорость фосфорилирующего окисления (V3) на 16 % по сравнению с контрольными животными (таблица 3). Показатель степени сопряжения (ДК) у опытных крыс был снижен на 24 % (таблица 3), что указывает на проявление эффекта разобщения. 6570 Таблица 3. Скорость потребления кислорода, дыхательный контроль (ДК) в митохондриях печени крыс. Представлены средние значения из 5-9 опытов. Примечание. * – достоверная разница по сравнению с контролем при Р <0,05. Параметр Контроль Опыт Субстрат окисления – сукцинат V2, наноатом О/мин.мг белка 41,82 ± 2,04 65,74 ± 6,48* V3 наноатом О/мин.мг белка ДК 157,6 ± 9,38 3,78 ± 0,20 183,6 ± 15,50 2,86 ± 0,31* Известно, что существуют две формы малатдегидрогеназы, одна локализована в митохондриях, а вторая в цитоплазме и соотношение активности этих форм различно в разных органах. Представляло интерес определить соотношение активности митохондриальной и цитоплазматической малатдегидрогеназы в печени контрольных и крыс с гипертиреоидизмом. Оказалось, что активность малатдегидрогеназы в цитоплазме печени в несколько раз выше по сравнению с митохондриальной, а в цитоплазме клеток печени крыс с гипертиреозом она была выше по сравнению с таковой контроля в 6,8 раз (рис. 3). 400 100 300 2 1 * 200 10 * 100 * нМ/мин на 1 мг белка нМ/мин на 1 мг белка * 0 1 МТ ГП МТ ГП Клеточные фракции Рис. 3. Активность малатдегидрогеназы (1) и изоцитратдегидрогеназы (2) в митохондриях (МТ) и цитозоле печени (ГП) контрольной группы (□) и крыс с 2-х месячным гипертиреозом (■). Примечание. * – достоверная разница по сравнению с контролем при Р <0,05. При этом активность изоцитратдегидрогеназы в цитозоле клеток печени крыс с гипертиреоидизмом была как и в митохондриях в 1,4 раза ниже контроля (рис. 3). Соотношение активности малатдегидрогеназы в митохондриях/цитоплазме клеток печени у контрольных животных составляла 4,7, а у крыс с гипертиреоидизмом 19,6. Следовательно, увеличенное содержание тироксина индуцировало разобщение окислительного фосфорилирования, выражающееся в изменении в соотношении активности ферментов, в частности малат и изоцитратдегидрогеназ, что позволяет предположить формирование отличного от контроля паттерна ферментативной активности. 3.3. Интенсивность свободнорадикальных процессов в митохондриях и микросомах печени крыс с гипертиреозом Свободнорадикальная гипотеза старения по-прежнему остается одной из наиболее активно обсуждаемых [7]. Представляло интерес определить некоторые ее характери- 6571 нмоль кислорода/мин.мг белка стики у гипертиреоидных крыс, которые характеризовались «сокращенной» продолжительностью жизни. Генерация супероксидных радикалов в митохондриях печени ГК была увеличена по сравнению с контрольной группой на 50 % (рис. 4). Как известно, наряду с митохондриями еще одним «индуктором» генерации активных форм кислорода являются NAD (P)H-зависимые редокс-цепи эндоплазматического ретикулума [12]. Оказалось, что скорость образования супероксидных радикалов и во фракции микросом крыс с ИГ увеличена на 55 % по сравнению с 19-ти мес. крысами того же возраста с нормальным тиреоидным статусом (рис. 4). 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 контроль гипертиреоз митохондрии микросомы Фракции печени Рис. 4. Интенсивность генерации супероксидного радикала во фракциях митохондрий и микросом печени контрольных 19-ти мес. крыс и крыс с гипертиреозом. Представлены средние из 5-ти экспериментов. Столь значительное увеличение генерации супероксидных радикалов в митохондриях и микросомах печени крыс с ИГ должно сопровождаться и увеличением содержания продуктов ПОЛ. Было обнаружено, что содержание ТБК-активных продуктов, о котором судили по количеству МДА, у них было увеличено как и в митохондриях (на 48 %), так и в микросомах (на 31 %, рис. 5). нмоль МДА/мг белка 0,4 0,35 0,3 контроль 0,25 гипертиреоз 0,2 0,15 0,1 0,05 0 митохондрии микросомы Фракции печени Рис. 5. Содержание ТБК-активных продуктов (нмоль МДА/мг белка) во фракциях митохондрий и микросом у контрольных и крыс с 2-х месячным гипертиреозом. Средние значения из 5-7-ми опытов. Следовательно, увеличение теплопродукции в митохондриях ГК сопровождалось и увеличением интенсивности свободнорадикальных процессов, как в митохондриях печени крыс с ИГ, так и в микросомах. По этому показателю крысы с ИГ «старше» по сравнению с животными такого же календарного возраста. 6572 Основная идея свободнорадикальной концепции основана на потере функциональной активности окисленных макромолекул. Вместе с тем, негативные эффекты могут быть устранены антиоксидантной системой. 3.4. Активность некоторых ферментов антиоксидантной защиты В инактивации гидроперекисей и других токсических соединений принимают участие ферменты семейства глутатионпероксидаз, которые имеют разную клеточную локализацию и субстратную специфичность. Глутатионпероксидазы специфичные к перекиси водорода и гидроперекиси кумола, локализованные в митохондриях животных с гипертиреозом, не отличались по активности от этих ферментов в митохондриях контрольных животных (таблица 4). Таблица 4. Активность некоторых ферментов системы антиоксидантной защиты в митохондриях печени контрольных животных и животных с 2-х месячным гипертиреозом (ГК). Представлены средние значения из 5-7 опытов. Примечание. * – достоверная разница по сравнению с контролем при Р <0,05. Ферменты Глутатионпероксидаза с гидроперекисью кумола Глутатионредуктаза Глутатион-S-трансфераза Контрольная группа 123,3± 20,4 26,1±1,6 164,4±11,0 Группа с гипертиреозом 102,4±23,2* 29,5±1,9 96,3±4,1* Активность глутатионредуктазы, которая участвует в реакции восстановления глутатиона, также не отличалась от митохондрий контрольных животных (таблица 4). Активность глутатионтрансферазы, которая использует восстановленный глутатион в метаболизме разнообразных гидрофобных ксенобиотиков, включая и альдегиды, напротив, была снижена в 1,7 раза по сравнению с контролем (таблица 4). Как известно, наибольшее количество глутатионпероксидазы локализуется в цитоплазме клеток. Определение активности глутатионпероксидазы в цитоплазме показало, что у крыс с гипертиреозом обе исследуемые формы глутатионперокисдазы были менее активными на 30 % по сравнению с контрольными животными (таблица 5). Таблица 5. Активность некоторых ферментов антиоксидантной защиты клеток печени контрольных животных и животных с 2-х месячным гипертиреозом (ГК). Представлены средние значения из 5-7 опытов. Примечание. * – достоверная разница по сравнению с контролем при Р <0,05. Ферменты Глутатионпероксидаза, индуцированная перекисью водорода Глутатионпероксидаза, индуцированная гидроперекисью кумола Глутатионредуктаза Глутатион-S-трансфераза Глутатион-6-фосфатдегидрогеназа Контрольная группа Группа с гипертиреозом 100,9± 6,4 77,4±6,7* 254,7±11,8 185,8±15,0* 40,6±1,3 745,3±59,0 22,8±2,7 38,0±1,3 354,8±26,2* 66,1±8,1* При этом глутатионредуктаза оставалась неизменной по сравнению с контрольным уровнем, а глутатионтрансфераза была в 2 раза менее активной по сравнению с контрольным уровнем (таблица 5). 6573 При этом активность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, которая обеспечивает образование НАДФ-Н и поддержание уровня восстановленного глутатиона, у животных с гипертиреоидизмом была увеличена в 2,8 раза по сравнению с контролем (таблица 5). 4. Обсуждение На моделях КОД и ИГ выявлена взаимосвязь между содержанием тироксина в сыворотке крови, температурой тела и средней продолжительностью жизни. Так если при КОД температура тела была снижена на 1,5-2°С по сравнению с контролем и увеличена продолжительность жизни, то при ИГ напротив, была повышена температура тела на 2 °С и сокращена продолжительность жизни. Эти результаты позволяют заключить, что температура тела, в регуляции которой принимает участие тироксин, выполняя функцию разобщителя дыхания и фосфорилирования, является системообразующим фактором в изменении метаболизма. Результаты работы показали, что на модели ИГ имеют место системные изменения показателей про- и антиоксидантной системы. При этом формируются иные, отличные от контроля соотношения между исследуемыми показателями в митохондриях и цитозоле, т. е. формируются специфические паттерны метаболических показателей, или эпигенотипы [8]. Необходимо отметить, что тироксин в организме выполняет многообразные функции, т.е. полифункционален. Разнообразные функции выполняют и продукты свободнорадикальных реакций. Такая полифункциональность и многовариантность ответа на воздействия обеспечивает высокую адаптивность и метаболическую память, которая имеет прямое отношение к продолжительности жизни биологических систем. Вместе с тем, существующая общебиологическая парадигма исследований основана на редукционизме и логическом рационализме, которая не дает возможности выявить интегративные механизмы функционирования биологических систем. Эффективным методом преодоления существующих ограничений в биологических исследованиях может стать метод моделирования. В настоящее время ведется активная работа по разработке математических подходов моделирования динамичных, нелинейных систем [9]. Мы считаем, что подобные подходы должны состоять из двух элементов. Эмпирического – экспериментального моделирования биологических процессов и в частности продолжительности жизни и имитационного (математическикомпьютерного) моделирования. Такой единый, интегральный подход позволит перейти от эмпирического экспериментального моделирования к прогностическому экспериментальному моделированию. Список литературы 1. 2. 3. 4. 5. Новосельцев В.Н., Михальский А.И. Математическое моделирование и старение: программа научных исследований // Успехи геронтологии. 2009. Т. 22, № 1. С. 117-128. Геронтология in silico: становление новой дисциплины / Ред. Г.И. Марчук, В.Н. Анисимов; А.А. Романюха, А.И. Яшин: М.: Бином, 2007. С. 80-113. Павловский Ю.Н., Белотелов Н.В., Бродский Ю.И. Имитационное моделирование. М.: Академия, 2008. 236 с. Божков А.И. Низкокалорийная диета как модель увеличения продолжительности жизни и исследования механизмов старения // Успехи геронтологии. 2001. Вып. 8. С. 89-99. Ooka H., Shinkai T. Effect of chronic hypertheroidism in the lifespan of the rat // Mechanisms of Ageing and Development. 1986. Vol. 33. P. 275-282. 6574 6. 7. 8. 9. Bozhkov A. I., Nikitchenko Yu. V. Caloric Restriction Diet Induces Specific Epigenotypes Associated with Life Span Extension // Journal of Nutritional Therapeutics. 2013. Vol. 2, No 1. P. 30-39. Анисимов В.Н. Молекулярные и физиологические механизмы старения. СПб: Наука, 2008. Т. 1. С. 161-191. Божков А.И. Эпигенотип, принципы временной организации метаболизма и старение // Проблемы старения и долголетия. 2010. Т. 19, № 3. С. 223-224. Терехин А.Т., Будалова Е.В. Сетевые механизмы физиологической регуляции // Математика и реальность: конфронтация строгости и сложности. М.: Солитон, 2012. С. 224-257.