013466 Настоящее изобретение относится к иммунотерапевтическим методам и молекулам, а также... кам для применения в иммунотерапевтических методах. В частности, настоящее изобретение...

013466
Настоящее изобретение относится к иммунотерапевтическим методам и молекулам, а также клеткам для применения в иммунотерапевтических методах. В частности, настоящее изобретение относится к
иммунотерапии рака, в частности рака почек. Настоящее изобретение относится в дальнейшем к опухолеассоциированным пептидным эпитопам Т-хелперных клеток, в отдельности или в комбинации с другими опухолеассоциированными пептидами, которые служат как активные фармацевтические ингредиенты для композиций вакцины, которая стимулирует противоопухолевые иммунные ответы. В частности, настоящее изобретение относится к двум новым пептидным последовательностям, полученным из
молекул HLA класса I и II человеческих опухолевых клеточных линий, которые могут быть использованы в вакцинных композициях для вызывания противоопухолевых иммунных ответов.
В соответствии с целями настоящего изобретения все цитаты описания включены в их целостности
путем ссылки.
Уровень техники
Стимуляция иммунных ответов находится под воздействием присутствия антигенов, распознающихся иммунной системой хозяина как чужеродные. Открытие существования опухолеассоциированных
антигенов повысило сейчас возможность использования иммунной системы хозяина для вмешательства
в рост опухоли. Различные механизмы объединения обеих ветвей иммунной системы, как гуморальной,
так и клеточной, исследуются в настоящее время для иммунотерапии рака.
Специфические элементы клеточных иммунных ответов способны к специфическому распознаванию и уничтожению опухолевых клеток. Изоляция цитотоксических Т-клеток (ЦТЛ) из популяций опухоль-инфильтрирующих клеток или из периферической крови предполагает, что такие клетки играют
важную роль в естественной иммунной защите против рака. (Cheever et al., Annals N.Y. Sci. Acad. Sci.
1993 690:101-112). В частности, CD8-положительные Т-клетки (TCD8-положительные), которые распознают молекулы I класса главного комплекса гистосовместимости (МНС) с пептидами, имеющими
обычно 8-10 остатков, образованных из белков, находящихся в ядре или цитозоли, играют важную роль в
этом ответе. Молекулы МНС человека называются также человеческими лейкоцитарными антигенами
(HLA).
Существуют два класса молекул МНС: молекулы МНС I класса, которые могут встречаться на
большинстве клеток, имеющих ядро, которые презентируют пептиды, образующиеся из протеолитического расщепления эндогенных белков и более крупных пептидов. Молекулы МНС II класса могут
встречаться только на профессиональных антигенпрезентирующих клетках (АПК), и презентировать
пептиды экзогенных белков, которые поглощаются АПК в период эндоцитоза и впоследствии процессируются. Комплексы из пептида и МНС класса I распознаются CD8-положительными цитотоксическими
Т-лимфоцитами, комплексы из пептида и МНС класса II распознаются CD4-положительными хелперными Т-клетками.
CD4-положительные хелперные Т-клетки играют важную роль в управлении эффекторными функциями противоопухолевых Т-клеточных ответов, и поэтому идентификация CD4-положительных Тклеточных эпитопов, образованных из опухолеассоциированных антигенов (ТАА), может быть чрезвычайно важна для разработки фармацевтических препаратов для инициации противоопухолевых иммунных ответов (Kobayashi, H., R. Omiya, M. Ruiz, E. Huarte, P. Sarobe, J. J. Lasarte, M. Herraiz, В. Sangro, J.
Prieto, F. Borras-Cuesta, and E. Celis. 2002. Identification of an antigenic epitope for helper T lymphocytes
from carcinoembryonic antigen. Clin. Cancer Res. 8:3219-3225., Gnjatic, S., D. Atanackovic, E. Jager, M. Matsuo, A. Selvakumar, N.K. Altorki, R.G. Maki, B. Dupont, G. Ritter, Y.T. Chen, A. Knuth, and L.J. Old. 2003.
Survey of naturally occurring CD4+ T-cell responses against NY-ESO-1 in cancer patients: Correlation with
antibody responses. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100(15):8862-7).
На моделях млекопитающих животных, например мышах, было показано, что даже при отсутствии
эффекторных клеток цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ) (т.е. CD8-положительных Т-лимфоцитов),
CD4-положительных Т-клеток достаточно для ингибирующего проявления опухолей посредством ингибирования ангиогенеза при секреции интерферон-гамма (IFNγ) (Qin, Z. and Т. Blankenstein. 2000. CD4+
T-cell-mediated tumor rejection involves inhibition of angiogenesis that is dependent on IFN gamma receptor
expression by nonhematopoietic cells. Immunity. 12:677-686). К тому же было показано, что CD4положительные Т-клетки, распознающие пептиды из опухолеассоциированных антигенов, презентированные молекулами HLA класса II, могут препятствовать опухолевой прогрессии посредством индукции
ответов антител (Ab) (Kennedy, R.C., М.Н. Shearer, A.M. Watts, and R.K. Bright. 2003. CD4+ T lymphocytes
play a critical role in antibody production and tumor immunity against simian virus 40 large tumor antigen. Cancer Res. 63:1040-1045). В отличие от опухолеассоциированных пептидов, связывающихся с молекулами
HLA класса I, до сих пор было описано лишь небольшое число опухолеассоциированных лигандов класса II (www.cancerimmunity.org, www.syfpeithi.de). Так как конститутивная экспрессия молекул HLA класса II обычно ограничена клетками иммунной системы (Mach, В., V. Steimle, E. Martinez-Soria, and W.
Reith. 1996. Regulation of MHC class II genes: lessons from a disease. Annu. Rev. Immunol. 14:301-331), то
возможность изоляции пептидов класса II напрямую из первичных опухолей считалась невозможной.
Поэтому было описано множество стратегий по направлению антигенов в каскад реакций по процессированию II класса антигенпрезентирующих клеток (АПК), например, инкубация АПК с интересующим
-1-
013466
антигеном для его поглощения, процессинга и презентации (Chaux, Р., V. Vantomme, V. Stroobant, K.
Thielemans, J. Corthals, R. Luiten, A.M. Eggermont, T. Boon, and B.P. van der Bruggen. 1999. Identification of
MAGE-3 epitopes presented by HLA-DR molecules to CD4(+) T lymphocytes. J. Exp. Med. 189:767-778) или
трансфекция клеток генами или мини-генами, кодирующими интересующий антиген и слитых с инвариантной цепью, которая опосредует транслокацию антигена в лизосомный компартмент МНС класса II
(MIIC) по процессингу и погрузке.
Для того чтобы пептид инициировал (вызывал) клеточный иммунный ответ, он должен связываться
с молекулой МНС. Этот процесс зависит от аллеля молекулы МНС и специфических полиморфизмов
аминокислотной последовательности пептида. Пептиды, связывающиеся с МНС класса I, имеют обычно
8-10 остатков в длину и содержат два консервативных остатка («домены») в их первичной аминокислотной последовательности, которые взаимодействуют с соответствующей связывающей бороздкой молекулы МНС.
При отсутствии воспаления экспрессия молекул МНС II класса преимущественно рестриктирована
по клеткам иммунной системы, в особенности профессиональным антигенпрезентирующим клеткам
(АПК), например, моноцитам, образованным из моноцитов клеткам, макрофагам, дендритным клеткам.
Антигены, которые распознаются опухолевыми специфическими цитотоксическими Т-лимфоцитами, то есть их эпитопами, могут быть молекулами, полученными из любого класса белков, таких как
энзимы, рецепторы, факторы транскрипции и т.д. Кроме того, опухолеассоциированные антигены, например, могут быть представлены также только в опухолевых клетках, например, как продукты распада
мутировавших генов. Другой важный класс опухолеассоциированных антигенов представлен тканеспецифическими структурами, такими как антигены СТ («раковый тестикул»), которые экспрессированы в
различных видах опухолей и здоровой ткани тестикул.
Были выявлены различные опухолеассоциированные антигены. Затем, много усилий было потрачено на исследования по идентификации дополнительных опухолеассоциированных антигенов. Некоторые
группы опухолеассоциированных антигенов, также именуемые в области техники как опухолеспецифические антигены, являются тканеспецифическими. Примеры включают, но не ограничиваются тирозиназой для меланомы, PSA (простата-специфический антиген) и PSMA (простата-специфический мембранный антиген) для рака простаты и хромосомными кроссоверами (транслокации), такими как bcr/abl в
лимфоме. Тем не менее, многие опухолеассоциированные антигены, которые были идентифицированы,
встречаются во множестве видов опухолей, и некоторые, такие как онкогенные белки и/или генысупрессоры опухоли (обзор генов-супрессоров опухоли для почечного рака дается, например, у Linehan
W.M., Walther M.M., Zbar В. The genetic basis of cancer of the kidney. J Urol. 2003 Dec;170(6 Pt 1):2163-72),
которые фактически вызывают трансформационное явление, встречаются практически во всех видах
опухолей. Например, нормальные клеточные белки, контролирующие рост и дифференциацию клетки,
такие как р53 (который является примером гена-супрессора опухоли), ras, c-met, myc, pRB, VHL и HER2/neu, могут аккумулировать мутации, приводящие к повышенной регуляции экспрессии продуктов этих
генов, делая их тем самым онкогенными (McCartey et al. Cancer Research 1998 15:58 2601-5; Disis et al.
Ciba Found. Symp. 1994 187:198-211).
Муцин-1 (MUC1) является высоко гликолизированным трансмембранным гликопротеином I типа,
который с избытком гиперэкспрессирован на клеточной поверхности многих аденокарцином человека,
таких как рак груди и яичников. Аберрантная дегликолизация свойственна злокачественным опухолям и
обнаруживает эпитопы в опухолевых клетках, которые не должны быть представлены на нормальных
клетках. Более того, экспрессия MUC1 была продемонстрирована во множественной миеломе и некоторых В-клеточных лимфомах не-Ходжкина (Gendler S, Taylor-Papadimitriou J, Duhig T, Rothbard J, and
Burchell J. A highly immunogenic region of a human polymorphic epithelial mucin expressed by carcinomas is
made up of tandem repeats. J. Biol. Chem. 263:12820-12823 (1988); Siddiqui 1988; Girling A, Bartkova J,
Burchell J, Gendler S, Gillett C, and Taylor-Papadimitriou J. A core protein epitope of the polymorphic epithelial mucin detected by the monoclonal antibody SM-3 is selectively exposed in a range of primary carcinomas.
Int. J. Cancer 43:1072-1076 (1989); Brossart 1999; Duperray 1989; Mark 1989; Delsol 1988; Apostolopoulos V
and McKenzie IF. Cellular mucins: targets for immunotherapy. Crit Rev. Immunol. 14:293-309 (1994); Finn OJ,
Jerome KR, Henderson RA, Pecher G, Domenech N, Magarian-Blander J, and Barratt-Boyes SM. MUC-1
epithelial tumor mucin-based immunity and cancer vaccines. Immunol. Rev. 145:61-89 (1995)). Некоторые
последние сообщения (Apostolopoulos V and McKenzie IF. Cellular mucins: targets for immunotherapy. Crit
Rev. Immunol. 14:293-309 (1994); Finn OJ, Jerome KR, Henderson RA, Pecher G, Domenech N, MagarianBlander J, and Barratt-Boyes SM. MUC-1 epithelial tumor mucin-based immunity and cancer vaccines. Immunol. Rev. 145:61-89 (1995); Barnd 1989; Takahashi 1994; Noto 1997) показали, что цитотоксические нерестриктированные по МНС Т-клетки из опухолей яичника, груди, поджелудочной железы и множественной
миеломы могут распознавать эпитопы центральной части белка MUC1, находящейся в тандемном повторе. Были идентифицированы два рестриктированных по HLA-A2 Т-клеточных эпитопа, образованных из
белка MUC1 (Brossart 1999, ЕР 1484397). Один пептид образован из участка тандемного повтора белка
MUC1. Второй пептид локализован внутри сигнальной последовательности MUC1. Индукция ответов
цитотоксических Т-лимфоцитов in vivo после вакцинаций пациентов с распространенным раком груди
-2-
013466
или яичника дендритными клетками с введенным импульсным методом пептидом, используя такие пептиды, была успешной (Brossart 2000) (Wierecky 2005). С учетом почечно-клеточной карциномы экспрессия MUC1 свойственна стандартным опухолям, и сообщалось, что она ассоциирована со степенью и стадией опухоли (Fujita 1999; Kraus 2002; Leroy 2002; Bamias 2003; Cao 2000). Для MUC1 белковая гиперэкспрессия не соотносится с гиперэкспрессией мРНК.
Адипофилин является маркером для специализированных дифференцированных клеток, содержащих липидные капельки, и для заболеваний, ассоциированных с жироаккумулирующими клетками (Heid
1998). Адипофилин содержится во многих культивируемых клеточных линиях, включающих фибробласты и эндотелиальные и эпителиальные клетки. Тем не менее, экспрессия адипофилина в тканях рестриктирована по определенным видам клеток, таким как вырабатывающие молоко эпителиальные клетки
молочной железы, клетки коркового вещества надпочечника, клетки Сертоли и Лейдига мужской половой системы, а также по стеатозу или жировому перерождению гепатоцитов при алкогольном циррозе
печени (Heid 1998). Сообщалось, что адипофилин гиперэкспрессирован при колоректальном раке (Saha
2001), гепатоклеточной карциноме (Kurokawa 2004) и при почечно-клеточной карциноме (Young 2001).
c-Met кодирует гетеродимерный трансмембранный рецептор с тирозино-киназной активностью, который состоит из α-цепи, связанной дисульфидной связью с β-субъединицей (Bottaro 1991; Rubin 1993).
Обе субъединицы экспрессированы на поверхности, тяжелая β-субъединица отвечает за связывание лигандов, фактор роста гепатоцитов (HGF), α-субъединица содержит внутриклеточный домен, который
опосредует активацию различных сигнальных путей трансдукции. Сигнальный каскад c-Met задействован в регенерации органов, как было продемонстрировано для печени и почек, эмбриогенеза, кроветворения, развития мышц и при регуляции миграции и адгезии нормально активированных В-клеток и моноцитов (Zarnegar 1995; Naldini 1991; Montesano 1998; Schmidt 1995; Uehara 1995; Bladt 1995; Takayama
1996; Mizuno 1993; van, V 1997; Beilmann 2000). В дальнейшем многочисленные исследования показали,
что гиперэкспрессия c-Met задействована в злокачественной трансформации и инвазивности злокачественных клеток.
c-Met опосредует мультифункциональные и потенциально онкогенные активности фактора роста
гепатоцитов HGF/scatter, включая содействие клеточному росту, подвижности, выживаемости, растворению внеклеточных матриц и ангиогенезу (Bottaro 1991; Rubin 1993; Zarnegar 1995). Связывание HGF с
рецептором вызывает автофосфорилирование c-Met и активирует сигнальные процессы по ходу транскрипции, включая ras, фосфатидилиноситол 3'-киназу, фосфолипазу Сγ и активированные митогеном
белковые каскады реакций, связанные с киназой (Naldini 1991; Montesano 1998; Furge 2000; Ponzetto
1993; Dong 2001; Furge 2001). Ген c-Met экспрессирован преимущественно в эпителиальных клетках и
гиперэкспрессирован в нескольких злокачественных тканях и клеточных линиях (Di Renzo 1995; Ferracini 1995; Tuck 1996; Koochekpour 1997; Li 2001; Fischer 1998; Maulik 2002; Qian 2002; Ramirez 2000).
Возрастающее число сообщений показало, что неэпителиальные клетки, такие как кроветворные, нейтральные клетки и клетки скелета реагируют на HGF, а злокачественные заболевания кроветворной системы, как, например, множественная миелома, болезнь Ходжкина, лейкемия и лимфома экспрессируют
белок c-Met (Gherardi 1991; Teofili 2001; Borset 1999; Jucker 1994; Pons 1998). Ослабленный контроль инвазивного фенотипа роста в онкогенно активированном c-Met, спровоцированном c-Met-активационными мутациями, с-Met амплификацией/гиперэкспрессией и приобретением HGF/c-Met аутокринных
петель, снабжает злокачественные клетки инвазивными и метастатическими свойства. Примечательно,
что конститутивная активация c-Met у трансгенных мышей с HGF-гиперэкспрессией способствует обширному онкогенезу (Wang 2001; Takayama 1997).
Регулятор сигналов G-белка 5 (RGS5) является негативным регулятором сигнальных путей гетеротримерного G-белка, хотя его функция in vivo остается неясной. RGS-белки представляют собой семейство молекул с объединяющей каталитической функцией, но с различным тканевым распределением. Они
стимулируют истинную активность гуанозин-трифосфатазы (GTPase) активированных субъединиц Got и,
таким образом, ускоряет инактивацию G-белка. Таким образом, молекулы RGS ингибируют сигналы по
ходу транскрипции связанных с G-белком рецепторов (De 2000). Недавно было показано, что регулятор
индукции сигнала-5 G-белка в перицитах совпадает с активным ремоделированием сосудов во время
опухолевой неоваскуляризации. В модели панкреатического канцерогенеза островковых клеток мыши, а
также в высоко ангиогенных астроцитомах наблюдалась гиперэкспрессия RGS5 в перицитах во время
ангиогенного переключения, сопровождающего активное ремоделирование сосудов. Гиперэкспрессия
рестриктировалась по сосудистой сети опухоли в сравнении с нормальными островками Лангерганса.
Тем не менее, RGS5 также активирован во время заживления ран и овуляции (Berger 2005).
Экспрессия RGS5 увеличена в RCC (Rae 2000). В другом исследовании ПЦР с обратной транскрипцией показала сильную экспрессию RGS5 во всех исследованных RCC, и экспрессия была очень слаба
или не выявляема в нормальных почках (6.6:1 с ПЦР в реальном времени). Основным местоположением
RGS5 в RCC были эндотелиальные клетки опухоли (Furuya 2004). В дальнейшем сообщалось, что RGS5
является эндотелиальным клеточным маркером синусоидного типа гепатоклеточной карциномы (Chen
2004).
-3-
013466
Аполипопротеин L1 (APOL1) является секретируемым высокоплотным липопротеином, связывающимся с аполипопротеином A-I. Аполипопротеин A-I является относительно широко распространенным
плазменным белком и основным апопротеином HDL (липопротеины высокой плотности). Он задействован в формировании большинства холестериловых эфиров в плазме и также способствует оттоку холестерина из клеток. Аполипопротеин L1 может играть роль в липидном обмене и переносе по организму,
а также в обратном переносе холестерина из периферических клеток в печень. Плазменный белок является полипептидом одинарной цепи с относительной молекулярной массой ок. 40 кДа (Duchateau 1997;
Duchateau 2001). APOL1 цДНК была изолирована из активированных эндотелиальных клеток библиотеки цДНК, и было показано, что она активируется TNF-α, который является сильным провоспалительным
цитокином. (Monajemi 2002).
KIAA0367 был идентифицирован в рамках проекта «Kazusa цДНК», цель которого - обнаружение
неизвестных длинных человеческих транскриптов, кодирующих для предполагаемых белков (Ohara
1997). Хотя функция продукта предполагаемого белка KIAA0367 из 820 аминокислот неизвестна, он содержит CRAL-TRIO связывающий липиды доменный профиль на С-конце, который связывает малые
гидрофобные молекулы и присутствует в нескольких факторах обмена нуклеотидов и в BCL2/аденовирусе Е1В 19-кДа взаимодействующем белке 2 (BNIP-2). BNIP-2 задействован в контроле различных клеточных функций, включая клеточную морфологию, миграцию, эндоцитоз и прогрессию клеточного цикла (Zhou 2005). KIAA0367 расположен на хромосомном участке 9q21. Этот участок описывается как распространенная мишень гомозиготной делеции во многих опухолях (Gursky 2001; Weber 2001) или как
лишенный гетерозиготности (Louhelainen 2000; Tripathi 2003).
Растворимая гуанилат циклаза (sGC), гетеродимерный белок, состоящий из альфа- и бета-субъединиц (1 гемовая группа), катализирует конверсию GTP во вторичный мессенджер cGMP и функционирует
как главный рецептор для оксида азота и азотосодержащих сосудорасширяющих средств (Zabel 1998).
GUCYa3 и b3 гиперэкспрессированы в глиомах человека. Трансфекция антисмысловой GUCY1A3 или
GUCY1B3 снижает васкуляризацию и рост опухоли «голой» мыши. Это может быть связано с тем фактом, что VEGF индуцируется cGMP (Saino 2004). GUCY1A3 способствует миграции опухолевых клеток
опухолевой клеточной линии молочной железы мыши (Jadeski 2003).
Циклин D1 относится к высоко консервативному семейству циклинов, более точно, к подсемейству
циклинов D (Xiong 1991; Lew 1991). Циклины выполняют функцию регуляторов CDK (циклинзависимые
киназы). Различным циклинам свойственна разная экспрессия и способы деградации, которые содействуют временной координации каждого этапа митоза (Deshpande 2005). Циклин D1 формирует комплекс
с - и функционирует как - регуляторная субъединица CDK4 или CDK6, активность которых требуется
для клеточного цикла перехода G1/S. CCND1 формирует с CDK4 и CDK6 голоэнзимный комплекс серин/треонин-киназа, обеспечивающий субстратную специфичность комплекса (Bates 1994). Было показано, что этот белок взаимодействует с белком-супрессором опухоли Rb (Loden 2002), и экспрессия этого
гена положительно регулируется Rb (Halaban 1999). Мутации, амплификация и гиперэкспрессия этого
гена, который изменяет прогрессию клеточного цикла, часто наблюдались в различных опухолях и могут
благоприятствовать онкогенезу (Hedberg 1999; Vasef 1999; Troussard 2000).
Белки семейства матричной металлопротеиназы (ММР) задействованы в разрушении внеклеточной
матрицы при нормальных физиологических процессах, таких как эмбриональное развитие, размножение
и ремоделирование тканей в равной степени, как и во время заболеваний, таких как артрит или метастазы
(Mott 2004). Матричная металлопротеиназа 7 (ММР7) секретируется как неактивный белок-предшественник с массой 29,6 кДа, который активируется при расщеплении внеклеточными протеиназами. Активный
энзим имеет молекулярную массу 19,1 кДа и связывает по два иона цинка и два иона кальция на субъединицу (Miyazaki 1990; Browner 1995). ММР7 расщепляет желатин, фибронектин и казеин (Miyazaki
1990; Quantin 1989) и отличается от большинства членов семейства ММР отсутствием «консервативного» С-терминального белкового домена (Gaire 1994). ММР7 часто гиперэкспрессирован в злокачественной ткани (Lin 2004; Bramhall 1997; Denys 2004), и предполагается, что он способствует инвазии опухолевых клеток in vivo (Wang 2005).
Эти белки могут быть мишенью опухолеспецифического иммунного ответа при многих видах рака.
Пептид корового антигена вируса гепатита В, HBV-001, получен не из эндогенного опухолеассоциированного антигена человека, а из корового антигена вируса гепатита В. Во-первых, это позволяет
количественное сравнение интенсивности Т-клеточных ответов, индуцированных TUMAP, и следовательно, позволяет сделать важные выводы о способности вызывать противоопухолевые ответы. Вовторых, он функционирует как важный положительный контроль в случае недостатка каких-либо Тклеточных ответов у пациента. И в-третьих, он также позволяет сделать заключение о статусе иммунокомпетентности пациента.
Инфицирование вирусом гепатита В (HBV) является одной из самых распространенных причин заболевания печени, поражающим примерно 350 млн. человек по всему миру (Rehermann 2005). В связи с
простотой горизонтального и вертикального переноса и наличием потенциала для хронического заболевания это может привести к циррозу печени и гепатоклеточной карциноме, поэтому HBV наносит сильный удар по системам здравоохранения многих стран мира. Геном HBV (Previsani 2002) включает час-4-
013466
тично двухцепочечную кольцевую ДНК. В вирионах HBV она окружена коровым белком НВс и другими
белками, формируя нуклеокапсид, который защищен внешней оболочкой, содержащей липиды и поверхностные белки семейства HBs (называемые также оболочечными белками). Антигенные детерминанты, ассоциированные с НВс и HBs, обозначаются как HBcAg и HBsAg соответственно. Эти антигены
ассоциированы с серологической реакцией, т.е. ответами антител, обнаруженными в крови пациента, и
находятся среди клинически наиболее применимых систем антиген-антитело для диагноза инфекции
HBV. НВс будет представлять новый чужеродный антиген у всех индивидов без предшествующей истории инфекции HBV. Так как для этого антигена хорошо известны иммуногенные пептиды (Bertoletti
1993; Livingston 1997), то в рамках исследований IMA из HBcAg в качестве антигена для положительного контроля был выбран один пептид из 10 аминокислот. Индукция пептид-специфических ЦТЛ НВс
будет затем использоваться как маркер для иммунокомпетентности пациента и успешной вакцинации.
Иммунотерапия больных раком направлена особенно на активацию клеток иммунной системы, в
особенности, т. н. цитотоксических Т-клеток (ЦТЛ, также известные как «киллерные клетки», известные
также как CD8-положительные Т-клетки) против опухолевых клеток, но не против здоровой ткани. Опухолевые клетки отличаются от здоровых клеток экспрессией опухолеассоциированных белков. Молекулы HLA презентируют наружу на клеточной поверхности клеточное содержимое, таким образом, давая
возможность цитотоксическим Т-клеткам отличать здоровую клетку от опухолевой. Это происходит путем расщепления всех белков внутри клетки на короткие пептиды, которые присоединяются затем к молекулам HLA и презентируются на клеточной поверхности (Rammensee 1993). Пептиды, представленные
на опухолевых клетках, а не на здоровых клетках организма или в намного меньшей степени, называются опухолеассоциированными пептидами (TUMAPs).
Первые клинические испытания с использованием опухолеассоциированных пептидов были начаты
в середине 1990 гг. Буном (Boon) и коллегами, в основном, для показания меланома. Клинические ответы
лучших испытаний достигали от 10 до 30%. О серьезных побочных эффектах или сильной аутоиммунности не сообщалось ни в одном клиническом исследовании с использованием основанной на пептидах
монотерапии вакциной. Сообщалось о слабых формах витилиго у некоторых пациентов, проходивших
лечение меланома-ассоциированными пептидами.
Тем не менее, примирования одного вида ЦТЛ обычно не достаточно для устранения всех опухолевых клеток. Опухоли обладают сильной мутагенностью и, таким образом, способны быстро реагировать
на атаки ЦТЛ изменением своей белковой структуры для избегания узнавания ЦТЛ. Для контратаки по
механизмам уклонения опухоли от ударов для вакцинации использовались различные специфические
пептиды. Таким способом по опухоли могла быть произведена одновременная атака несколькими клонами ЦТЛ, действовавшим синхронно. Так могут быть снижены шансы опухоли на ускользание от иммунного ответа. Эта гипотеза недавно получила подтверждение в клиническом исследовании по лечению
пациентов с меланомой на поздней стадии. С всего лишь несколькими исключениями пациенты, имевшие по меньшей мере 3 различных Т-клеточных ответа, демонстрировали объективные клинические ответы или стабильность заболевания (Banchereau 2001), а также увеличение выживаемости (личные беседы с J. Banchereau), в то время как подавляющему большинству пациентов, имевшему менее 3 Тклеточных ответов, был поставлен диагноз прогрессирования заболевания.
До сих пор было описано множество стратегий по направлению антигенов в каскады реакций по
процессингу II или I класса. Есть возможность инкубировать антигенпрезентирующие клетки (АПК) с
интересующим антигеном для его поглощения и процессинга (Chaux, P., Vantomme, V., Stroobant, V.,
Thielemans, K., Corthals, J., Luiten, R., Eggermont, A. M., Boon, T. & van der, B. P. (1999) J. Exp. Med. 189,
767-778. Dengjel J, Schoor O, Fischer R, Reich M, Kraus M, Muller M, Kreymborg K, Altenberend F, Brandenburg J, Kalbacher H, Brock R, Driessen C, Rammensee HG, Stevanovic S. Autophagy promotes MHC class
II presentation of peptides from intracellular source proteins. Proc Natl Acad Sci USA. 2005 May 31; 102
(22):7922-7). Другие стратегии используют белки слияния, которые содержат лизосомные последовательности-мишени. Экспрессированные в АПК, такие белки слияния направляют антигены в компартмент процессирования II класса (Marks, M. S., Roche, P. A., van Donselaar, E., Woodruff, L., Peters, P. J. &
Bonifacino, J. S. (1995) J. Cell Biol. 131, 351-369, Rodriguez, F., Harkins, S., Redwine, J. M., de Pereda, J. M.
& Whitton, J. L. (2001) J. Virol. 75, 10421-10430).
Для того чтобы белки были узнаны цитотоксическими Т-лимфоцитами в качестве опухолеспецифического антигена и для того чтобы они были использованы в терапии, должны выполняться особые
предварительные требования. Антиген должен быть экспрессирован преимущественно опухолевыми
клетками, а не здоровыми тканями или в достаточно малом объеме. В дальнейшем желательно, чтобы
соответствующий антиген не только присутствовал в одном виде опухоли, но и также имел высокую
концентрацию (например, число копий на клетку). Необходимо присутствие эпитопов в аминокислотной
последовательности антигена, поскольку такой пептид («иммуногенный пептид»), который образован из
опухолеассоциированного антигена, должен вести in vitro или in vivo к Т-клеточному ответу.
Приблизительно 30% пациентов страдают от метастатической болезни при показе врачу, и другие
25% пациентов имеют локально распространенную опухоль. У 40% индивидов метастазы развиваются, в
конечном итоге, после хирургического вмешательства. Среди индивидов с метастатической болезнью
-5-
013466
приблизительно у 75% обнаруживаются легочные метастазы, у 36% поражены лимфатические узлы
и/или мягкие ткани, у 20% - кости, и у 18% - печень. Показатели 5-летней выживаемости различны в зависимости от класса по системе Робсона. В целом, RCC является причиной смерти около 80% пациентов
(Senn HJ, Drings P, Glaus A, Jungi WF, Pralle HB, Sauer R, and Schlag PM. Checkliste Onkologie, 5th edition.
Georg Thieme Verlag, Stuttgart/New York (2001), Vokes ЕЕ, and Golomb HM. Oncologic Therapies, 2nd edition. Springer-Verlag, Berlin/Heidelberg (2003)).
Классификация почечно-клеточной карциномы (RCC) была произведена в соответствии с классификацией по TNM (Guinan P. TNM Staging of Renal Cell carcinoma. Presented at 'Diagnosis and prognosis of
Renal Cell Carcinoma: 1997 Workshop', Rochester, Minnesota, March 21-22, Communication of the UICC Union Internationale Contre le Cancer, and AJCC - American Joint Committee on Cancer, published by ASC American Society Cancer (1997), Communication of the UICC), см. табл. А и В, внизу.
Таблица А. Классификация по TNM почечно-клеточной карциномы
Таблица В. Классификация Робсона для почечно-клеточной карциномы и 5-летняя выживаемость
* Американский фонд урологических заболеваний (American Foundation for Urologic Disease).
Стандартный метод лечения RCC - радикальная нефректомия (для всех стадий). Лучевая терапия
может быть применена для сокращения распространения рака, однако почечно-клеточные карциномы
зачастую резистентны к облучению. Гормональная терапия может в некоторых случаях (менее 10%) замедлить рост опухоли. До настоящего времени химиотерапия не проявила никакой значительной действенности при этой болезни. Винбластин, 5-FU (5-фторурацил) и флоксоуридин (FUDR) являются наиболее изученными препаратами для химиотерапии, однако лишь 5-FU и его метаболит FUDR проявили 1012%-ую действенность (Vokes ЕЕ, and Golomb HM. Oncologic Therapies, 2nd edition. Springer-Verlag, Berlin/Heidelberg (2003)). При комбинации гемцитабина и 5-FU показатель результативности составил 17%,
Иммунологическое лечение, например, с применением Интерферона альфа (IFNα) или Интерлейкина-2 (IL-2) для лечения распространенной RCC в последние годы были оценены регулирующими органами США и Европы. Лечение высокодозированным IL-2 на сегодняшний день является единственным иммунологическим режимом, одобренным Управлением по санитарному надзору за пищевыми продуктами и медикаментами США (FDA). Первоначально сообщалось, что монотерапия IFNα имеет пока-6-
013466
затель эффективности в 25-30%, но действительная эффективность при многих дополнительных исследованиях составила лишь около 10% (Vokes ЕЕ, and Golomb HM. Oncologic Therapies, 2nd edition.
Springer-Verlag, Berlin/Heidelberg (2003)). IL-2 имеет, предположительно, похожую общую эффективность в сравнении с IFNα, когда приблизительно 5% пациентов достигают стабильной полной ремиссии
(Rosenberg 1987). Заключение последнего мета-анализа более 6000 пациентов с распространенной RCC
таково, что цитокиновой терапией (например, IFN-альфа, высокодозированные болюсные инъекции IL-2
или ингаляции IL-2) могут быть, в среднем, достигнуты только 12,9% клинической эффективности. Тот
же анализ показал наличие 4,3% ответов на плацебо и 2,5% ответов в контрольных группах без проведения иммунотерапии (Cochrane Database Syst Rev. 2000; (3):CD001425. Immunotherapy for advanced renal
cell cancer. Coppin C, Porzsolt F, Awa A, Kumpf J, Coldman A, Wilt T).
Хотя в последние годы новые терапии проявляли клиническую эффективность по отношению ко
многим видам опухолей и были одобрены, показатель выживаемости при почечно-клеточной карциноме
за последнее десятилетие не сильно изменился. Имеющиеся на данный момент возможности для систематического лечения, как химиотерапия, так и иммунологическое лечение, проявили относительно слабую эффективность и, что особенно важно, при этом существует ограничение из-за значительной общей
токсичности. Следовательно, существует значительная неудовлетворенная потребность медицины в новых методах лечения почечно-клеточной карциномы.
Т-хелперные клетки играют важную роль в управлении эффекторной функцией ЦТЛ в противоопухолевом иммунитете. Эпитопы Т-хелперных клеток, инициирующие ответы Т-хелперных клеток типа
ТН1, поддерживают эффекторные функции CD8-положительных киллерных Т-клеток, которые включают цитотоксические функции, направленные против опухолевых клеток, проявляющих опухолеассоциированные пептиды/МНС-комплексы на их клеточной поверхности. Таким образом, опухолеассоциированные пептидные эпитопы Т-хелперных клеток, одни или в комбинации с другими опухолеассоциированными пептидами, могут служить в качестве активных фармацевтических ингредиентов вакцинных
композиций, которые стимулируют противоопухолевые иммунные ответы.
Основной задачей в разработке вакцины против опухолей является, поэтому, выявление и характеристика новых опухолеассоциированных антигенов и полученных из них иммуногенных Т-хелперных
эпитопов, которые могут быть распознаны CD8-положительными Т-клетками или CD4-положительными
Т-клетками, в особенности CD4-положительными Т-клетками типа TH1. По этой причине целью настоящего изобретения является обеспечение новых аминокислотных последовательностей для таких пептидов, которые обладают способностью связываться с молекулой главного комплекса гистосовместимости
человека (МНС) класса I (HLA класса I) или II (HLA class II). Дальнейшей целью настоящего изобретения является обеспечение эффективной противораковой вакцины, которая, по крайней мере, частично
основана на новых пептидах.
В соответствии с настоящим изобретением первая задача была решена обеспечением опухолеассоциированного пептида, выбранного из группы пептидов, включающих по крайней мере одну последовательность в соответствии с любой из SEQ ID № 1 или SEQ ID № 2 из приложенного списка последовательностей, причем один пептид обладает способностью связываться с молекулой главного комплекса
гистосовместимости человека (МНС) класса II (HLA класса II), а другой способен связываться с молекулой главного комплекса гистосовместимости человека (МНС) класса I (HLA класса I) при условии, что
пептид не является интактным человеческим опухолеассоциированным полипептидом.
В настоящем изобретении изобретатели демонстрируют то, что возможно изолировать и охарактеризовать пептиды, связывающиеся с молекулами HLA класса I или II, напрямую из опухолей млекопитающих, с приоритетом для опухолей человека, предпочтительно почечно-клеточных карцином.
Настоящее изобретение обеспечивает пептиды, которые образованы из антигенов, ассоциированных с генезом опухоли, и имеют способность связываться в достаточной мере с молекулами HLA II
класса для инициации иммунного ответа человеческих лейкоцитов, в особенности лимфоцитов, в особенности Т-лимфоцитов, в особенности CD4-положительных Т-лимфоцитов, в особенности CD4положительных Т-лимфоцитов, опосредующих иммунные ответы типа TH1.
Настоящее изобретение обеспечивает также пептиды, которые образованы из антигенов, ассоциированных с генезом опухоли, и имеют способность связываться в достаточной мере с молекулами HLA I
класса для инициации иммунного ответа человеческих лейкоцитов, в особенности лимфоцитов, в особенности Т-лимфоцитов, в особенности CD8-положительных цитотоксических Т-лимфоцитов.
Пептиды образованы из опухолеассоциированных антигенов, в особенности опухолеассоциированных антигенов с функциями, например, в протеолизе, ангиогенезе, росте клеток, регуляции клеточного
цикла, делении клеток, регуляции транскрипции, регуляции трансляции, инвазии ткани, включая, например, опухолеассоциированные пептиды из матричной металлопротеиназы 7 (ММР7; SEQ ID № 1) и Аполипопротеина L1 (IGFBP3; SEQ ID № 4).
В настоящем изобретении изобретатели обеспечивают неопровержимую очевидность того, что
опухолеассоциированные пептиды, в достаточной мере связывающиеся беспорядочно с молекулами
HLA II класса, в особенности с такими аллелями HLA II класса, которые генетически закодированы локусом HLA DR человеческого генома, способны вызывать иммунные ответы, опосредованные CD4-7-
013466
положительными Т-клетками человека. CD4-положительные Т-клетки были изолированы из периферической крови человека, демонстрируя, что заявленные пептиды пригодны для инициации Т-клеточных
ответов человеческой иммунной системы против выбранных пептидов пептидомы опухолевых клеток.
Как поясняется далее на примере с пептидом из ММР7 (SEQ ID № 1), этот, беспорядочно связывающийся с HLA-DR, опухолеассоциированный пептид, как было обнаружено, распознается CD4положительными Т-клетками.
В одинаковой степени было обнаружено, что опухолеассоциированные пептиды, в достаточной мере связывающиеся с молекулами HLA I класса, способны вызывать иммунные ответы, опосредованные
CD8-положительными цитотоксическими Т-лимфоцитами человека, демонстрируя также, что заявленные пептиды пригодны для инициации ответов человеческой иммунной системы против выбранных пептидов пептидомы опухолевых клеток.
Так как пептиды могут быть синтезированы химическим путем и могут быть использованы в качестве активных фармацевтических ингредиентов в фармацевтических препаратах, то пептиды, обеспечиваемые настоящим изобретением, могут быть использованы для иммунотерапии, предпочтительно для
иммунотерапии рака.
В целях идентификации лигандов HLA I или II класса из опухолеассоциированных антигенов
(ТАА) для разработки основанной на пептидах иммунотерапии изобретатели попытались изолировать
пептиды напрямую из вырезанных солидных опухолей, в особенности почечно-клеточной карциномы
(RCC) (см. ниже, примеры).
Причинами для фокусировки внимания на RCC для демонстрации доказательства правильности
концепции были следующие: диагноз RCC ставится вновь ежегодно примерно 150 тысячам человек в
мире, с данным заболеванием связан высокий уровень смертности, результатом чего являются приблизительно 78 тысяч смертей в год (Pavlovich, C. P. and L.S. Schmidt. 2004. Searching for the hereditary causes of
renal-cell carcinoma. Nat. Rev. Cancer 4:381-393). Если выявлены метастазы, то одногодичный коэффициент выживаемости сокращается примерно до 60% (Jemal, A., R. C. Tiwari, T. Murray, A. Ghafoor, A.
Samuels, E. Ward, E. J. Feuer, and M.J. Thun. 2004. Cancer statistics, 2004. CA Cancer J. Clin. 54:8-29), подчеркивая сильную беспомощность медицины при этом показании. В связи с тем фактом, что RCC является, вероятно, иммуногенной опухолью (Oliver RTD, Mehta A., Barnett M. J. A phase 2 study of surveillance in patients with metastatic renal cell carcinoma and assessment of response of such patients to therapy on
progression. Mol Biother. 1988;1:14-20. Gleave M., Elhilali M., Frodet Y., et al. Interferon gamma-lb compared
with placebo in metastatic renal cell carcinoma. N Engl J Med. 1998; 338:1265), как было указано существованием опухолевых реагирующих и инфильтрирующих ЦТЛ (Finke, J.H., P. Rayman, J. Alexander, M. Edinger, R.R. Tubbs, R. Connelly, E. Pontes, and R. Bukowski. 1990. Characterization of the cytolytic activity of
CD4+ and CD8+ tumor-infiltrating lymphocytes in human renal cell carcinoma. Cancer Res. 50:2363-2370),
были инициированы клинические исследования для разработки основанных на пептидах противоопухолевых вакцинаций (Wierecky J., Mueller M., Brossart P. Dendritic cell-based cancer immunotherapy targeting
MUC-1. Cancer Immunol Immunother. 2005 Apr 28). Однако в связи с недостатком хелперных Тклеточных эпитопов из ТАА молекулярные вакцины обычно включают пептиды, функционирующие
только как лиганды I класса.
Вторая задача настоящего изобретения была решена обеспечением фармацевтического препарата,
предпочтительно в форме вакцины, эффективной против раковых клеток, в особенности клеток солидных опухолей, включающей эффективное количество пептида в соответствии с изобретением, или включающей нуклеиновую кислоту, кодирующую такой пептид. Вакцина в дальнейшем может содержать дополнительные пептиды и/или наполнители для большей эффективности, как это будет пояснено ниже.
Пептид или кодирующая пептид нуклеиновая кислота могут также формировать вакцину против
опухолей или рака. Она может вводиться непосредственно пациенту, в пораженный орган или систематично, или вноситься ex vivo в клетки, полученные от пациента, или в человеческую клеточную линию,
которые затем могут вводиться пациенту или использоваться in vitro для селекции субпопуляции из иммунных клеток, полученных от пациента, которые после этого вновь вводятся пациенту.
Первым аспектом изобретения обеспечивается пептид, включающий аминокислотную последовательность в соответствии с SEQ ID № 1 (SQDDIKGIQKLYGKRS) или SEQ ID № 2 (VMAGDIYSV) или
их вариант, при условии, что пептид не является интактным полипептидом человека, из которого получена аминокислотная последовательность (т. е. одна из последовательностей во всю длину как представленные в списке ID локусов (инвентарные номера указаны в приложенной далее табл. 1).
Как здесь описывается в дальнейшем, все пептиды, формирующие основу настоящего изобретения,
были выявлены как презентируемые несущими клетками МНС I или II класса (RCC). Таким образом, эти
конкретные пептиды так же, как и другие пептиды, содержащие данную последовательность (т.е. дериваты пептидов) будут все вызывать специфический Т-клеточный ответ, хотя уровень, до которого такой
ответ будет простимулирован, может варьироваться между отдельными пептидами. Различия, например,
могут быть вызваны мутациями в указанных пептидах (см. ниже). Специалист данной области полностью осведомлен о способах, которые могут использоваться с целью определения силы, с которой был
индуцирован ответ каждым отдельным пептидом, в частности, благодаря ссылкам на приведенные здесь
-8-
013466
примеры и соответствующую литературу.
Предпочтительно, чтобы пептид в соответствии с настоящим изобретением состоял преимущественно из аминокислотной последовательности в соответствии с SEQ ID № 1 или SEQ ID № 2 или одним
из их вариантов.
«Состоял преимущественно из» подразумевает, что пептид в соответствии с настоящим изобретением, помимо последовательности в соответствии с любой из SEQ ID № 1 по SEQ ID № 11 или одним из
их вариантов, содержит дополнительные находящиеся на N- и/или С-конце фрагменты аминокислот,
которые не являются обязательно формирующими часть пептида, которая функционирует как коровая
последовательность пептида, включая соединяющий элемент, и как иммуногенный Т-хелперный эпитоп.
Тем не менее, эти фрагменты могут быть важны в целях обеспечения эффективного введения пептида в клетки в соответствии с настоящим изобретением. В одном воплощении настоящего изобретения
пептид по изобретению включает 80 N-терминальных аминокислот HLA-DR антиген-ассоциированной
инвариантной цепи (p33, в дальнейшем «Ii»), как взятая из NCBI, инвентарный номер - GenBank Accession-number X00497 (Strubin, M., Mach, В. and Long, E.O. The complete sequence of the mRNA for the HLADR-associated invariant chain reveals a polypeptide with an unusual transmembrane polarity EMBO J. 3 (4),
869-872 (1984)).
«Вариантом» данной аминокислотной последовательности мы обозначаем, что боковые цепи, например, одного или двух аминокислотных остатков изменены (например, при их замещении боковой
цепью другого встречающегося в природе аминокислотного остатка или какой-либо другой боковой цепью), так что пептид по-прежнему способен связываться с молекулой HLA по существу таким же путем,
как и пептид, состоящий из данной аминокислотной последовательности. Например, пептид может быть
модифицирован таким образом, что он, по крайней мере, сохранит, если не улучшит, способность взаимодействовать и связываться с подходящей молекулой МНС, такой как HLA-DRB1 в случае молекул
HLA II класса или HLA-A2 в случае молекул I класса, и так что он, по крайней мере, сохранит, если не
улучшит как способность генерировать активированные ЦТЛ, которые могут распознавать и уничтожать
клетки, которые аберрантно экспрессируют полипептид, который содержит аминокислотную последовательность, как определено в аспектах этого изобретения, так и способность стимулировать хелперные Тклетки, которые могут обеспечить помощь CD8-положительным Т-клеткам или напрямую атаковать
клетки-мишени секрецией цитокинов. Как может быть извлечено из базы данных, как описывается впоследствии, некоторые позиции связывающихся с HLA-DR пептидов являются типичными якорными остатками, образующими коровую последовательность, подходящую к соединительному элементу HLAсвязывающей бороздки. Модификации этих или других остатков, задействованных в связывании HLADR, могут усиливать связывание без изменения распознавания ЦТЛ.
Те аминокислотные остатки, которые не обязательны для взаимодействия с Т-клеточным рецептором, могут быть модифицированы при замещении другой аминокислотой, чье включение, по существу,
не влияет на реактивность Т-клетки и не устраняет связь с соответствующим МНС. Таким образом, помимо данного условия, пептид по изобретению может быть любым пептидом (в обозначение которого
мы включаем олигопептиды или полипептиды), который включает аминокислотные последовательности
или их часть или их вариант, как дано.
В дальнейшем известно, что пептиды, презентированные МНС класса II, образованы «коровой последовательностью», имеющей конкретный HLA-специфический аминокислотный фрагмент и, факультативно, N- и/или С-терминальные удлиняющие сегменты, которые не препятствуют функции коровой
последовательности (т.е. считаются нерелевантными для взаимодействия пептида и Т-клетки). N- и/или
С-терминальные удлиняющие сегменты могут иметь длину от 1 до 10 аминокислот, соответственно. Таким образом, предпочтительный пептид настоящего изобретения обладает общей длиной между 9 и 100,
предпочтительно между 9 и 30 и особенно предпочтительно между 9 и 16 аминокислотами. Эти пептиды
могут быть использованы как непосредственно для погрузки на молекулы МНС класса II, так и последовательность может быть клонирована на векторы в соответствии с описанным ниже. Так как эти пептиды
образуют конечный продукт процессинга более длинных пептидов внутри клетки, то более длинные пептиды могут использоваться в равной степени. Пептиды по изобретению могут быть любого размера, но, в
основном, они могут иметь молекулярный вес меньше чем 100000 Да, предпочтительно меньше, чем
50.000 Да, более предпочтительно меньше, чем 10000 Да, и типично около 5000 Да. В отношении числа
аминокислотных остатков пептиды по изобретению могут иметь менее чем 1000 остатков, предпочтительно менее чем 500 остатков, более предпочтительно менее чем 100 остатков.
В другом аспекте настоящего изобретения, аналогично с ситуацией, поясненной выше для молекул
МНС II класса, пептиды по изобретению могут быть применены для вызывания специфического Тклеточного ответа МНС I класса, так как пептиды могут одновременно обладать коровыми или частичными последовательностями молекул HLA класса I. Предпочтительный специфический пептид МНС I
класса настоящего изобретения обладает общей длиной между 9 и 16, предпочтительно между 9 и 12
аминокислотами. Нужно понимать, что такие пептиды могут быть использованы (например, в вакцине)
как более длинные пептиды, аналогично пептидам МНС II класса. Способы идентификации специфических «Коровых последовательностей» МНС класса I, имеющих конкретный HLA-специфический амино-9-
013466
кислотный фрагмент для молекул HLA класса I известны специалисту данной области и могут быть
спрогнозированы, например, компьютерными программами PAProC (http://www.uni-tuebingen.de/uni/kxi/)
и SYFPEITHI (http://www.syfpeithi.de) (см. ниже).
Пептиды по изобретению особенно полезны для иммунотерапевтических методов для наделения Тклеток способностью распознавать клетки, которые аберрантно экспрессируют полипептиды, формирующие основу для настоящих пептидов по изобретению. Так как эти специфические пептиды, состоящие из данных аминокислотных последовательностей, связываются с молекулами HLA класса I или HLA
класса II, предпочтительно, чтобы пептиды по изобретению были такими, которые связывают молекулы
HLA класса I или HLA класса II, и при такой связи HLA-пептидный комплекс, представленный на поверхности подходящей антигенпрезентирующей клетки, был бы способен вызывать стимуляцию Тклеток, которые распознают клетки, которые аберрантно экспрессирует полипептид, включающий данную аминокислотную последовательность.
Если пептид, который имеет больше чем около 12 аминокислотных остатков, непосредственно используется для связывания с молекулой МНС, предпочтительно, чтобы остатки, которые примыкают к
центральному HLA-связывающему региону, являлись такими, которые, по существу, не влияют на способность пептида специфически связываться со связывающей бороздкой молекулы МНС или презентировать пептид Т-клеткам. Тем не менее, как уже было указано выше, следует понимать, что могут быть
использованы более крупные пептиды, в особенности, если они закодированы полинуклеотидом, потому
что такие крупные пептиды могут быть разделены на фрагменты подходящими антигенпрезентирующими клетками.
Примеры для пептидов из МНС-лигандов, элементов, вариантов, а также отдельные примеры для
N- и/или С-терминальных удлиняющих сегментов могут быть взяты, например, из банка данных
SYFPEITHI (Rammensee H, Bachmann J, Emmerich NP, Bachor OA, Stevanovic S. SYFPEITHI: database for
MHC ligands and peptide motifs. Immunogenetics. 1999 Nov; 50(3-4):213-9. Review.) на сайте http://syfpeithi.
bmi-heidelberg.com/ и ссылок, включенных сюда.
В качестве неограниченных примеров некоторые пептиды для HLA-DR в банке данных представлены KHKVYACEVTHQGLSS, получен из цепи Ig kappa 188-203 (Kovats et al. Eur J Immunol. 1997 Apr; 27
(4): 1014-21); KVQWKVDNALOSGNS, получен из цепи Ig kappa 145-159 (Kovats et al. Eur J Immunol.
1997 Apr; 27 (4): 1014-21), LPRLIAFTSEHSHF, получен из GAD65 270-283 (Endl et al. J Clin Invest. 1997
May 15; 99 (10): 2405-15) или FFRMVISNPAATHQDIDFLI, получен из GAD65556-575 (Endl et al. J Clin
Invest. 1997 May 15; 99 (10):2405-15.). Кроме того, пептиды могут также быть получены из мутировавших последовательностей антигенов, таких как в случае ATGFKQSSKALQRPVAS, полученного из bcrabl 210 kD белка слияния (ten Bosch et al. Blood. 1996 Nov 1; 88 (9): 3522-7), GYKVLVLNPSVAAT, полученного из HCV-1 NS3 28-41 Diepolder et al. J Virol. 1997 Aug; 71 (8): 6011-9), или FRKQNPDIVIQYMDDLYVG, полученного из HIV-1 (HXB2) RT 326-345 (van der Burg et al. J Immunol. 1999 Jan 1;
162(1):152-60.). Все «якорные» аминокислоты (see Friede et al., Biochim Biophys Acta. 1996 Jun 7; 1316
(2):85-101; Sette et al. J Immunol. 1993 Sep 15; 151 (6): 3163-70; Hammer et al. Cell. 1993 Jul 16; 74 (1):197203., and Hammer et al. J Exp Med. 1995 May 1; 181 (5): 1847-55. Как примеры для HLA-DR4) выделены
жирным шрифтом, предполагаемые центральные (коровые) последовательности подчеркнуты.
Все описанные выше пептиды охватываются термином «варианты» данной аминокислотной последовательности.
В понятие «пептид» изобретатели включают не только молекулы, в которых аминокислотные остатки присоединены пептидными связями (-CO-NH-), но и также молекулы, в которых пептидная связь
является обратной. Такие ретро-обратные пептидомиметики могут быть получены методами, известными из уровня техники, например, такими, как описано в работе Meziere et al. (1997) J. Immunol. 159,32303237, включенной сюда путем ссылки. Этот принцип охватывает получение псевдопептидов, содержащих изменения, которые охватывают остов, но не ориентацию боковых цепей. Meziere et al. (1997) показывают, что эти псевдопептиды пригодны, по крайней мере, для клеточных ответов МНС класса II и Тхелперов. Ретро-обратные пептиды, которые содержат связи NH-CO вместо пептидных связей CO-NH,
намного более устойчивы к протеолизу.
Типично, что пептид по изобретению является таким, который может процессироваться, если он
экспрессирован в антигенпрезентирующей клетке, так что получается фрагмент, который способен связываться с адекватной молекулой МНС и может быть презентирован подходящей клеткой и может вызывать адекватный Т-клеточный ответ. Следует понимать, что полученный из пептида сегмент может также
быть пептидом по изобретению. Целесообразно, что пептид по изобретению содержит участок, который
включает данную аминокислотную последовательность или ее сегмент или ее вариант и дальнейший
сегмент, который обладает некоторыми желаемыми свойствами. Например, дальнейший сегмент может
включать дальнейший Т-клеточный эпитоп (независимо от того, получен ли он из одного и того же полипептида в качестве первого сегмента, содержащего Т-клеточный эпитоп, или нет) или он может включать белок-носитель или пептид. Таким образом, в одном воплощении пептид по изобретению является
«усеченным» белком человека или белком слияния белкового фрагмента и другого сегмента полипептида, при условии, что человеческий сегмент включает одну или более аминокислотную последователь- 10 -
013466
ность изобретения.
В особенно предпочтительном воплощении пептиды по изобретению включают аминокислотную
последовательность по изобретению и по крайней мере один дальнейший Т-клеточный эпитоп, причем
дальнейший Т-клеточный эпитоп способен содействовать продуцированию Т-клеточного ответа, направленного на вид опухоли, который аберрантно экспрессирует опухолеассоциированный антиген. Таким
образом, пептиды по изобретению включают так называемые полипептиды «бусины на нити», которые
могут также использоваться в качестве вакцин. Такие пептиды могут быть отделены друг от друга химическими линкерами, которые могут содержать аминокислоты (такие как G-удлиннения), но которые могут, дополнительно или альтернативно, включать химические сшивающие группы (т.е. не иметь другой
функции, кроме как обеспечения особенного пространственного размещения).
В понятие «аберрантно экспрессированный» мы включаем значение, что полипептид гиперэкспрессирован по сравнению с нормальным уровнем экспрессии, или что ген является «молчащим» в ткани, из
которой образовалась опухоль, однако он экспрессирован в опухоли. Под понятием «гиперэкспрессирован» мы подразумеваем, что полипептид представлен на уровне, который по крайней мере в 1,2 раза выше уровня, представленного в нормальной ткани; предпочтительно по крайней мере в 2 раза и более
предпочтительно по крайней мере в 5 или 10 раз выше уровня, представленного в нормальной ткани.
Пептиды (по крайней мере те, что содержат пептидные связи между аминокислотными остатками)
могут быть синтезированы Fmoc-полиамидным способом твердофазного пептидного синтеза, как раскрыто у Lu et al. (1981) J. Org. Chem. 46, 3433-3436, и в прилагающихся ссылках. Временная защита Nаминогруппы предусмотрена группой 9-флуоренилметилоксикарбонил (Fmoc). Повторное расщепление
этой высоко щелоче-лабильной защитной группы осуществляется с использованием 20% пиперидина в
N,N-диметилформамиде. Функциональности боковой цепи могут быть защищены как их бутиловые эфиры (в случае серинтреонина и тирозина), бутиловые сложные эфиры (в случае глютаминовой кислоты и
аспарагиновой кислоты), бутилоксикарбониловое производное (в случае лизина и гистидина), тритиловое производное (в случае цистеина) и производное 4-метокси-2,3,6-триметилбензолсульфонила (в случае аргинина). Где глютамин или аспарагин являются С-терминальными остатками, для защиты боковой
цепи амидо-функциональностей используется 4,4'-диметоксибензгидрильная группа. Твердофазный носитель базируется на полимере полидиметилакриламида, состоящем из трех мономеров: диметилакриламида (остов-мономер), бис-акрилоилэтилендиамина (кросс-линкер) и метилового эфира акрилоилсаркозина (функционализирующий агент). Использованным агентом с расщепляемым соединением пептидсмола является кислотно-лабильное производное 4-гидроксиметилфеноксиуксусной кислоты. Все аминокислотные производные добавляются как их преформированные симметричные ангидридные производные за исключением аспарагина и глютамина, которые добавляются с применением метода обратного
соединения, опосредованного N,N-дициклогексилкарбодиимид/1-гидроксибензотриазолом. Все реакции
сочетания и снятия защитных групп отслеживались с помощью нингидрина, тринитробензолсульфоновой кислоты или технологии контроля изотином. После завершения синтеза пептиды отщепляются от
смолы-носителя сопутствующим удалением защитных групп боковой цепи, при обработке 95% трифторуксусной кислотой, содержащей 50% поглотителя примесей. Обычно используемые поглотители - это
этандитиол, фенол, анизол и вода, точный выбор зависит от составляющих аминокислот пептида при
синтезе.
Трифторуксусная кислота удаляется выпариванием в вакууме с последующим измельчением с диэтиловым эфиром для получения сырого пептида. Любые представленные поглотители удаляются простой технологией экстракции, которая при лиофилизации водной фазы позволяет получить сырой пептид
без поглотителей. Реагенты для синтеза пептидов, как правило, имеются в наличии в CalbiochemNovabiochem (Великобритания) Ltd, Nottingham NG7 2QJ, Великобритания.
Очистка может быть произведена любой техникой или комбинацией таких техник как эксклюзивная хроматография, ионообменная хроматография и (обычно) обратнофазная высокоэффективная жидкостная хроматография.
Анализ пептидов может быть произведен при использовании тонкослойной хроматографии, обратнофазной высокоэффективной жидкостной хроматографии, аминокислотного анализа после кислотного
гидролиза и масс-спектрометрического анализа при быстрой бомбардировке атомами (FAB), a также
масс-спектрометрического анализа MALDI и ESI-Q-TOF.
Дальнейший аспект изобретения обеспечивает нуклеиновую кислоту (например, полинуклеотид),
кодирующую пептид по изобретению. Нуклеиновая кислота в соответствии с настоящим изобретением
может быть ДНК, кДНК, ПНК, ЦНК (циклогексанилнуклеиновая кислота), РНК или их комбинациями и
может или не может содержать нитроны в период времени кодирования для пептида. Конечно, только
пептиды, которые содержат встречающиеся в природе аминокислотные остатки, присоединенные встречающимися в природе пептидными связями, могут кодироваться полинуклеотидом. Еще один дальнейший аспект изобретения обеспечивает вектор экспрессии, способный экспрессировать полипептид в соответствии с изобретением.
Был разработан ряд методов для функционального связывания полинуклеотидов, в особенности
ДНК, с векторами, например, с помощью дополнительных липких концов. К примеру, в сегмент ДНК
- 11 -
013466
могут быть добавлены дополнительные гомополимерные участки для внесения в вектор ДНК. Вектор и
сегмент ДНК в таком случае соединены водородной связью между дополнительными гомополимерными
концевыми участками, образуя рекомбинантные молекулы ДНК.
Синтетические сшивающие агенты, содержащие один или несколько сайтов рестрикции, обеспечивают альтернативный способ соединения сегмента ДНК с векторами. Сегмент ДНК, получаемый в результате расщепления эндонуклеазы рестрикции, как описывалось ранее, подвергается воздействию бактериофага Т4 ДНК полимеразы или E.coli ДНК полимеразы I, ферментов, которые удаляют выдающиеся
3'-одноцепочечные концы с их 3'-5'-экзонуклеолитическими активностями и наполняют имеющие углубления 3'-концы их полимеразными активностями.
Комбинация этих активностей вследствие этого формирует фрагменты ДНК с тупыми концами.
Фрагменты с тупыми концами инкубируются затем с большим молярным избытком молекул-линкеров в
присутствии фермента, способного катализировать лигирование по тупым концам молекул ДНК, такого
как бактериофаг Т4 ДНК лигаза. Таким образом, продуктами реакции являются фрагменты ДНК, несущие последовательности полимерных сшивающих агентов на их концах. Затем эти фрагменты ДНК расщепляются подходящим ферментом рестрикции и связываются с вектором экспрессии, который был
расщеплен ферментом, вырабатывающим концы, совместимые с концами фрагмента ДНК.
Синтетические сшивающие агенты, содержащие ряд сайтов рестрикционной эндонуклеазы, имеются в продаже в различных источниках, включая International Biotechnologies Inc, New Haven, CN, США.
Желаемый путь модификации ДНК, кодирующей полипептид по изобретению, - это использование
цепной реакции полимеразы, как раскрыто у Saiki et al. (1988) Science 239, 487-491. Этот метод может
быть использован для введения ДНК в подходящий вектор, например при инженерии в подходящих сайтах рестрикции, или же он может быть использован для модификации ДНК другими пригодными путями, известными из уровня техники. Согласно этому методу ДНК для ферментативного амплифицирования примыкает к двум специфическим праймерам, которые, в свою очередь, внедряются в амплифицированную ДНК. Приведенные специфические праймеры могут содержать сайты узнавания рестрикционной
эндонуклеазы, которые могут быть использованы для клонирования на векторы экспрессии с применением известных из уровня техники методов.
Затем ДНК (или в случае ретровирусных векторов РНК) экспрессируется в подходящего хозяина
для получения полипептида, включающего соединение по изобретению. Таким образом, ДНК, кодирующая полипептид, представляющий собой соединение по изобретению, может быть использована в
соответствии с известными техниками, модифицированная соответствующим образом с учетом приведенных здесь идей, для создания вектора экспрессии, который затем используется для трансформации
подходящей клетки-хозяина для экспрессии и получения полипептида по изобретению. Такие техники
включают также те, что раскрыты в патентах США №: 4,440,859, выданном 3 апреля 1984 на имя Rutter
et al., 4,530,901, выданном 23 июля 1985 на имя Weissman, 4,582,800, выданном 15 апреля 1986 на имя
Crowl, 4,677,063, выданном 30 июня 1987 на имя Mark et al., 4,678,751, выданном 7 июля 1987 на имя
Goeddel, 4,704,362, выданном 3 ноября 1987 на имя Itakura et al., 4,710,463, выданном 1 декабря 1987 на
имя Murray, 4,757,006, выданном 12 июля 1988 на имя Toole, Jr. et al., 4,766,075, выданном 23 августа
1988 на имя Goeddel et al,. и 4,810,648, выданном 7 марта 1989 на имя Stalker, которые все включены сюда путем ссылки.
ДНК (или в случае ретровирусных векторов РНК), кодирующая полипептид, представляющий собой соединение по изобретению, может быть присоединена к обширному ряду других последовательностей ДНК для введения в адекватного хозяина. ДНК-спутник будет зависеть от природы хозяина, способа введения ДНК хозяину и от того, желательно ли эписомальное поддержание или интеграция.
Как правило, ДНК вводится в вектор экспрессии, такой как плазмида, с правильной ориентацией и
корректной рамкой считывания экспрессии. Если необходимо, то ДНК может быть сцеплена с адекватными транскрипционными и трансляционными регулирующими контрольными нуклеотидными последовательностями, распознающимися желательным хозяином, хотя такой контроль обычно имеется в векторе экспрессии. Вектор вводится затем хозяину стандартными способами. Как правило, не все хозяева
трансформируются вектором. Поэтому будет необходимо выбрать трансформированные клетки-хозяева.
Одна из техник отбора включает введение в вектор экспрессии последовательности ДНК с любыми необходимыми элементами контроля, кодирующей выбранный признак в трансформированной клетке, такой как невосприимчивость к антибиотикам.
Альтернативно ген для такого выбираемого признака может быть на другом векторе, который используется для котрансформации желаемой клетки-хозяина.
Клетки-хозяева, которые были трансформированы рекомбинантной ДНК по изобретению, культивируются затем в течение достаточного времени и при адекватных условиях, известных специалистам
данной области, учитывая раскрытые здесь идеи, что ведет к экспрессии полипептида, который после
этого может быть получен.
Известно множество систем экспрессии, включающих бактерии (например, Е. coli и Bacillus
subtilis), дрожжи (например, Saccharomyces cerevisiae), мицелиальные грибы (например, Aspergillus), растительные клетки, клетки животных и насекомых. Предпочтительной системой может быть RCC (почеч- 12 -
013466
но-клеточная карцинома) или линия клеток Awells.
Промотор является контрольным элементом экспрессии, образованным последовательностью ДНК,
которая позволяет связывание РНК-полимеразы и приводит к транскрипции. Совместимые с отдельными
бактериями-хозяевами последовательности-промоторы типично представлены в плазмидных векторах,
содержащих подходящие сайты рестрикции для вставки фрагмента ДНК настоящего изобретения. Типичными прокариотическими векторными плазмидами являются pUC18, pUC19, pBR322 и pBR329,
имеющиеся в наличии в Biorad Laboratories, Richmond, CA, США, а также pTrc99А и pKK223-3, имеющиеся в наличии в Pharmacia, Piscataway, NJ, США.
Типичная клеточная векторная плазмида млекопитающих pSVL имеется в наличии в Pharmacia, Piscataway, NJ, США. Этот вектор использует поздний промотор SV40 для возбуждения экспрессии клонированных генов, наивысший уровень экспрессии был обнаружен в Т-антиген-вырабатывающих клетках,
таких как клетки COS-1. Примером индуцируемого вектора экспрессии млекопитающих является pMSG,
имеющийся также в наличии в Pharmacia. Этот вектор использует глюкокортикоид-индуцируемый промотор длинного концевого повтора опухолевого вируса молочной железы мыши для возбуждения экспрессии клонированного гена. Пригодными плазмидными векторами дрожжей являются pRS403-406 и
pRS413-416, и они, как правило, имеются в наличии в Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA 92037,
США. Плазмиды pRS403, pRS404, pRS405 и pRS406 являются дрожжевыми интегрирующими плазмидами (YIps) и включают дрожжевые селектируемые маркеры HIS3, TRP1, LEU2 и URA3. Плазмиды
pRS413-416 являются дрожжевыми центромерными плазмидами (Ycps). Другие векторы и системы экспрессии для применения с различными клетками-хозяевами хорошо известны из уровня техники.
Настоящее изобретение относится также к клетке-хозяину, трансформированной с помощью полинуклеотидной векторной модели настоящего изобретения. Клетка-хозяин может быть либо прокариотической, либо эукариотической. Бактериальные клетки могут быть, предпочтительно, прокариотическими
клетками-хозяевами в некоторых случаях и типично являются штаммом Е. coli, таким как, например, Е.
coli штамма DH5, имеющимся в наличии в Bethesda Research Laboratories Inc., Bethesda, MD, США, и
RR1, имеющимся в наличии в Американской коллекции типов культур American Type Culture Collection
(АТСС) of Rockville, MD, США (№ АТСС 31343). Предпочтительные эукариотические клетки-хозяева
включают дрожжи, клетки насекомых и млекопитающих, предпочтительно клетки позвоночных, таких
как мышь, крыса, обезьяна или человеческие фибробластные клетки и почечные клеточные линии.
Дрожжевые клетки-хозяева включают YPH499, YPH500 и YPH501, которые, как правило, имеются в наличии в Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA 92037, США. Предпочтительные клетки-хозяева млекопитающих включают клетки яичника китайского хомяка (СНО), имеющиеся в наличии в АТСС как
CCL61, NIH эмбриональные клетки швейцарской мыши NIH/3T3, имеющиеся в наличии в АТСС как
CRL 1658, почечные клетки обезьяны COS-1, имеющиеся в наличии в АТСС как CRL 1650 и клетки 293,
являющиеся эмбриональными клетками печени человека. Предпочтительными клетками насекомых являются клетки Sf9, которые могут трансфецироваться с помощью бакуловирусных векторов экспрессии.
Трансформация адекватных клеток-хозяев с помощью модели ДНК настоящего изобретения совершается при помощи хорошо известных способов, которые обычно зависят от типа используемого вектора. Относительно трансформации прокариотических клеток-хозяев см., например, Cohen et al. (1972)
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69, 2110 и Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold
Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Нью-Йорк. Трансформация дрожжевых клеток описывается
у Sherman et al. (1986) Methods In Yeast Genetics, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Нью-Йорк.
Также подходит метод Бигса (Beggs) (1978) Nature 275, 104-109. Что касается клеток позвоночных, то
подходящие для трансфекции таких клеток реагенты, например, фосфат кальция и DEAE-декстран или
липосомальные композиции, имеются в наличии в Stratagene Cloning Systems или Life Technologies Inc.,
Gaithersburg, MD 20877, США. Электропорация также подходит для трансформации и/или трансфекции
клеток и хорошо известна из уровня техники для трансформации дрожжевых клеток, бактериальных клеток, клеток насекомых и клеток позвоночных.
Успешно трансформированные клетки, т.е. клетки, которые содержат модель ДНК настоящего изобретения, могут быть идентифицированы хорошо известными способами. Например, клетки, образующиеся в результате введения модели экспрессии настоящего изобретения, могут выращиваться для получения полипептида по изобретению. Клетки могут собираться и лизироваться, а содержимое их ДНК
проверяться на наличие ДНК с помощью такого способа, как описывается у Southern (1975) J. Mol. Biol.
98,503 или у Berent et al. (1985) Biotech. 3, 208. Альтернативно наличие белка в супернатанте может выявляться применением антител, как описывается ниже.
В дополнение к непосредственному анализу на наличие рекомбинантной ДНК успешная трансформация может быть подтверждена хорошо известными иммунологическими способами, когда рекомбинантная ДНК способна управлять экспрессией белка. Например, клетки, успешно трансформированные
вектором экспрессии, вырабатывают белки, проявляющие соответствующую антигенность. Образцы
предположительно трансформированных клеток собирают и анализируют на белок, используя подходящие антитела. Таким образом, в дополнение к самим трансформированным клеткам-хозяевам настоящее
изобретение сосредоточено также на культуре таких клеток, предпочтительно моноклональной (кло- 13 -
013466
нально гомогенной) культуре или культуре, полученной из моноклональной культуры в питательной
среде.
Следует понимать, что некоторые клетки-хозяева по изобретению подходят для получения пептидов по изобретению, например, бактериальные, дрожжевые клетки и клетки насекомых.
Тем не менее, другие клетки-хозяева могут быть пригодны в некоторых терапевтических методах.
Например, антигенпрезентирующие клетки, такие как дендритные клетки, могут с пользой быть использованы для экспрессии пептидов по изобретению так, что их можно будет нагружать на адекватные
молекулы МНС.
Предпочтительными клетками-хозяевами являются рекомбинантные клетки RCC или линии Awells.
Предпочтителен способ получения опухолеассоциированного пептида в соответствии с настоящим изобретением, способ, включающий культивацию клетки-хозяина в соответствии с настоящим изобретением и изоляцию пептида из клетки-хозяина или ее культуральной среды в соответствии со стандартными
методами.
Дальнейший аспект изобретения обеспечивает способ получения пептида для орального, ректального или лингвального приема, внутривенной (i.v.) инъекции, подкожной (s.c.) инъекции, внутрикожной
(i.d.) инъекции, внутрибрюшной (i.p.) инъекции, внутримышечной (i.m.) инъекции. Предпочтительными
способами пептидной инъекции являются s.c, i.d., i.p., i.m. и i.v. Предпочтительными способами инъекции ДНК являются i.d., i.m., s.c., i.p. и i.v. Вводиться могут дозы от 0,1 до 500 мг пептида или ДНК, как
изложено ниже.
Дальнейший аспект изобретения относится к использованию опухолеассоциированного пептида в
соответствии с изобретением, нуклеиновой кислоты в соответствии с изобретением или вектора экспрессии в соответствии с изобретением в медицине.
Объектом настоящего изобретения в его дальнейшем аспекте является фармацевтическая композиция, содержащая по крайней мере один опухолеассоциированный пептид в соответствии с SEQ ID № 1
или SEQ ID № 2 в соответствии с изобретением, нуклеиновую кислоту в соответствии с изобретением
или вектор экспрессии в соответствии с изобретением и фармацевтически приемлемый носитель. Эта
композиция используется для парентерального введения, такого как подкожное, внутрикожное, внутрибрюшинное, внутривенное, внутримышечное или оральное введение. Для этого пептиды растворяются
или суспендируются в фармацевтически приемлемом, предпочтительно водном носителе. Помимо этого,
композиция может содержать наполнители, такие как буферы, связующие агенты, разрушающие агенты,
разбавители, вкусоароматические добавки, смазочные вещества и т.д. Пептиды могут быть также введены вместе с иммуностимулирующими веществами, такими как цитокины. Пространный список наполнителей, которые могут быть использованы в такой композиции, может быть взят, например, из A. Kibbe,
Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3. Ed., 2000, American Pharmaceutical Association and pharmaceutical press. Композиция может использоваться для предупреждения, профилактики и/или лечения аденоматозных или раковых заболеваний.
Фармацевтический препарат, содержащий по крайней мере один из пептидов настоящего изобретения, включающих SEQ ID № 1 и/или SEQ ID № 2, нуклеиновую кислоту в соответствии с изобретением
или вектор экспрессии в соответствии с изобретением, вводится пациенту, страдающему аденоматозным
или раковым заболеванием, ассоциированным с соответствующим пептидом или антигеном. Тем самым
может быть инициирован иммунный ответ, опосредованный Т-клетками. Фармацевтическая композиция
в соответствии с настоящим изобретением предпочтительно включает в дальнейшем по крайней мере
один дополнительный опухолеассоциированный пептид, включающий последовательность в соответствии с любой из SEQ ID № 3 по SEQ ID № 10, соответствующую нуклеиновую кислоту или соответствующий вектор экспрессии.
Вообще, пептиды, присутствующие в фармацевтической композиции в соответствии с изобретением, имеют такие же свойства, как описаны выше для пептидов настоящего изобретения, включающих
последовательность SEQ ID № 1 и/или SEQ ID № 2. Таким образом, они могут иметь общую длину между 9 и 100, предпочтительно между 9 и 30 и особенно предпочтительно между 9 и 16 аминокислотами.
Кроме того, по крайней мере один пептид в соответствии с любой из последовательностей SEQ ID № 1
по SEQ ID № 11 может включать непептидные связи. Кроме того, соответствующие нуклеиновые кислоты могут кодировать для от 9 до 100, предпочтительно от 9 до 30 и особенно предпочтительно от 9 до 16
аминокислот.
Предпочтительна фармацевтическая композиция в соответствии с изобретением, включающая (в
особенности опухолеассоциированные) пептиды, состоящие из аминокислотных последовательностей в
соответствии с SEQ ID № 1 и/или SEQ ID № 2 и SEQ ID № 3 по SEQ ID № 11.
Предпочтительна фармацевтическая композиция в соответствии с изобретением, причем количество (в особенности опухолеассоциированного(ых)) пептида(ов), нуклеиновых(ой) кислот(ы) в соответствии с изобретением или вектора(ов) экспрессии в соответствии с изобретением, как присутствующие в
указанной композиции, являе(ю)тся ткане-, раково- и/или пациент-специфическим.
Пептид может быть также меченым или являться белком слияния или гибридной молекулой.
Пептид может быть, в основном, чистым или комбинированным с иммуностимулирующим адъю- 14 -
013466
вантом или использоваться в комбинации с иммуностимулирующими цитокинами или вводиться с подходящей системой доставки, например, липосомами. Другие подходящие адъюванты включают стимулон Aquila's QS21 (Aquila Biotech, Worcester, MA, США), который получают из сапонина, микобактериальных экстрактов и синтетических имитаций бактериальных клеточных стенок и, собственно, адъювантов, таких как Ribi's Detox. Также может быть использован Quil А, другой, полученный из сапонина адъювант, (Superfos, Дания). Другие адъюванты, такие как адъювант Фрейнда, могут также быть применены. Пептид может быть также конъюгирован с подходящим носителем, таким как гемоцианин лимфы
улитки (KLH) или маннан (см. WO 95/18145 и Longenecker et al. (1993) Ann. NY Acad. Sci. 690,276-291).
Так как адъювант дефинируется как субстанция, усиливающая иммунный ответ на антиген (MedlinePlus® Medical Dictionary, NIH), то могут использоваться и другие субстанции с этой же функцией, включая, но не ограничиваясь, агонистами Toll-подобного рецептора (TLR агонисты), предпочтительно субстанции, агонистически взаимодействующие с TLR 3, 7, 8 и 9, более предпочтительно TLR 9, такие как
протамин-стабилизированная РНК, CpG-олигонуклеотиды, CpR-олигонуклеотиды, бактериальная ДНК,
имидазохинолины и т.д.
Другие вещества, о которых из уровня техники известно, что они способны усиливать иммунный
ответ, включают, но не ограничиваются ингибиторами индуцируемой синтазы оксида азота (iNOS), аргиназы (ARG1), индоламин-2,3-диоксигеназы (IDO), рецептора васкулярного эндотелиального фактора
роста 1 (VEGFR-1), васкулярного эндотелиального фактора роста (VEGF), циклооксигеназы-2 (СОХ-2),
рецептора I TGF-бета (TGF-бета-RI).
Такими ингибиторами могут быть, например, моноклональные антитела к названным молекулам
или малым молекулам. О малых молекулах и моноклональных антителах из уровня техники известно,
что они имеют ингибиторную функцию по отношению к факторам, названным выше, и, таким образом,
усиливают иммунный ответ, ими являются, например, 1-МТ, NCX-4016, рофекоксиб, целебрекс, ВЕС,
ABH, nor-NOHA, SB-505124, SD-208, LY580276, AMD3100, акситиниб, бевацизумаб, JSI-124, СРА-7,
XL-999, ZD2171, пазопаниб, СР-547632 и VEGF Trap.
Также субстанции, снижающие число регуляторных Т-клеток (CD4+, CD25+, FoxP3+), подходят в
качестве адъювантов. Они включают, например, но не ограничиваются циклофосфамидом (Цитоксан),
ONTAK (денилейкин дифтитокс), Сунитиниб, анти-CTLA-4 (MDX-010, СР-675206), анти-CD25, антиCCL22 и анти-GITR.
В другом предпочтительном воплощении вакцина является вакциной из нуклеиновой кислоты. Известно, что инокуляция вакциной из нуклеиновой кислоты, такой как ДНК-вакцина, кодирующей полипептид, приводит к Т-клеточному ответу. Она может вводиться непосредственно пациенту, в пораженный орган или систематично, или вноситься ex vivo в клетки, полученные от пациента, или в человеческую клеточную линию, которые затем могут вводиться пациенту или использоваться in vitro для селекции субпопуляции из иммунных клеток, полученных от пациента, которые после этого вновь вводятся
пациенту. Если нуклеиновая кислота введена в клетки in vitro, то для клеток может быть полезно быть
трансфицированными, чтобы коэкспрессировать иммуностимулирующие цитокины, такие как интерлейкин-2 или ГМ-КСФ (GM-CSF).
Вакцина из нуклеиновой кислоты может также вводиться с адъювантом, таким как БЦЖ или квасцы. Однако предпочтительно, если вакцина из нуклеиновой кислоты вводится без адъюванта.
Полинуклеотид может быть, в основном, чистым или содержаться в подходящем векторе или системе доставки. Подходящие векторы и системы доставки включают вирусные системы, такие как те, что
основаны на аденовирусе, вирусе осповакцины, ретровирусах, вирусе герпеса, аденоассоциированном
вирусе или гибридах, содержащих элементы более чем одного вируса. Невирусные системы доставки
включают катионные липиды и катионные полимеры, хорошо известные из уровня техники в области
доставки ДНК. Также может быть использована физическая доставка, такая как посредством «генпистолета». Пептид или закодированный нуклеиновой кислотой пептид может быть белком слияния,
например, с эпитопом из столбнячного токсина, который стимулирует CD4-положительные Т-клетки.
Соответственно, любая нуклеиновая кислота, вводимая пациенту, является стерильной и свободной
от пирогенов. «Обнаженная» ДНК может вводиться внутримышечно или внутрикожно, или подкожно.
Пептиды могут вводиться внутримышечно, внутрикожно или подкожно.
Обычно вакцина из нуклеиновой кислоты может включать любое подходящее средство доставки
нуклеиновой кислоты. Нуклеиновая кислота, предпочтительно ДНК, может быть «обнаженной» (т.е. по
существу без других компонентов для введения) или она может быть доставлена в липосоме или как
часть системы доставки вирусного вектора.
Полагают, что поглощение нуклеиновой кислоты и экспрессия закодированного полипептида профессиональными антигенпрезентирующими клетками, такими как дендритные клетки, может быть механизмом прайминга иммунного ответа; тем не менее, дендритные клетки могут не быть трансфецированы,
однако они по-прежнему важны, так как они могут поглощать экспрессированный пептид из трансфецированных клеток в ткани («кросс-прайминг», например, Thomas AM, Santarsiero LM, Lutz ER, Armstrong
TD, Chen YC, Huang LQ, Laheru DA, Goggins M, Hruban RH, Jaffee EM. Mesothelin-specific CD8(+) T-cell
responses provide evidence of in vivo cross-priming by antigen-presenting cells in vaccinated pancreatic cancer
- 15 -
013466
patients. J Exp Med. 2004 Aug 2; 200(3):297-306).
Предпочтительно, если вакцина из нуклеиновой кислоты, такая как ДНК-вакцина, вводится в мышцу, тогда как пептидные вакцины предпочтительно вводятся s.c. или i.d. Предпочтительно также, если
вакцина вводится в кожу. Вакцина из нуклеиновой кислоты может вводиться без адъюванта. Вакцина из
нуклеиновой кислоты может также вводиться с адъювантом, таким как БЦЖ или квасцы. Другие подходящие адъюванты включают стимулон Aquila's QS21 (Aquila Biotech, Worcester, MA, США), который
получают из сапонина, микобактериальных экстрактов и синтетических имитаций бактериальных клеточных стенок и, собственно, адъювантов, таких как Ribi's Detox. Также может быть использован Quil А,
другой, полученный из сапонина адъювант, (Superfos, Дания). Предпочтительно, если вакцина из нуклеиновой кислоты вводится без адъюванта. Другие адъюванты, такие как адъювант Фрейнда, могут также быть применены. Полезным также может быть введение пептида, конъюгированного с гемоцианином
лимфы улитки, предпочтительно также с адъювантом.
Полинуклеотид-опосредованная иммунизационная терапия против рака описывается у Conry et al.
(1996) Seminars in Oncology 23, 135-147; Condon et al. (1996) Nature Medicine 2,1122-1127; Gong et al.
(1997) Nature Medicine 3, 558-561; Zhai et al. (1996) J. Immunol. 156,700-710; Graham et al (1996) Int J. Cancer 65,664-670; и Burchell et al. (1996) стр. 309-313 In: Breast Cancer, Advances in biology and therapeutics,
Calvo et al. (eds), John Libbey Eurotext, которые все включены в описание путем ссылки.
Можно также с пользой направлять вакцину в специфические популяции клеток, например, в антигенпрезентирующие клетки либо на месте инъекции с использованием нацеленных векторов и систем
доставки, либо при селективной очистке такой клеточной популяции у пациента с введением ex vivo
пептида или нуклеиновой кислоты (например, дендритные клетки могут быть отсортированы, как описывается у Zhou et al. (1995) Blood 86, 3295-3301; Roth et al. (1996) Scand. J. Immunology 43,646-651). Например, нацеленные векторы могут включать ткане- или опухолеспецифический промотор, который направляет экспрессию антигена в подходящее место.
Согласно своему дальнейшему аспекту изобретение относится к фармацевтической композиции,
которая содержит один или более обозначенных пептидов в соответствии с изобретением. Эта композиция используется для парентерального введения, такого как подкожное, внутрикожное, внутримышечное
или оральное введение. Для этого пептиды растворяются или суспендируются в фармацевтически приемлемом, предпочтительно водном носителе. Помимо этого, композиция может содержать наполнители,
такие как буферы, связующие агенты, разрушающие агенты, разбавители, вкусоароматические добавки,
смазочные вещества и т.д. Пептиды могут быть также введены вместе с иммуностимулирующими веществами, такими как цитокины. Пространный список наполнителей, которые могут быть использованы в
такой композиции, может быть взят, например, из A. Kibbe, Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3. Ed.,
2000, American Pharmaceutical Association and pharmaceutical press. Композиция может использоваться
для предупреждения, профилактики и/или лечения аденоматозных или раковых заболеваний.
Фармацевтический препарат, содержащий по крайней мере один из пептидов настоящего изобретения, включающих последовательность SEQ ID № 1 и/или SEQ ID № 2 вводится пациенту, страдающему
аденоматозным или раковым заболеванием, ассоциированным с соответствующим пептидом или антигеном. Тем самым может быть инициирован ЦТЛ-специфический иммунный ответ.
В другом аспекте настоящего изобретения комбинация двух или нескольких пептидов в соответствии с настоящим изобретением может быть использована в качестве вакцины, как в непосредственной
комбинации, так и в рамках той же лечебной схемы. Кроме того, могут быть использованы комбинации с
другими пептидами, например, с пептидами, специфическими для МНС I или II класса. Специалист данной области будет способен выбрать предпочтительные комбинации иммуногенных пептидов при проверке, например, поколения Т-клеток in vitro в равной степени, как их эффективности и общего присутствия, пролиферации, аффинности и размножения конкретных Т-клеток для конкретных пептидов, и
функциональные свойства Т-клеток, например, при анализе выработки IFN-γ (см. также примеры ниже).
Обычно наиболее эффективные пептиды комбинируются затем в качестве вакцины в соответствии с целями, описанными выше.
Подходящая вакцина будет предпочтительно содержать между 1 и 20 пептидами, более предпочтительно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или 11 различных пептидов, в дальнейшем предпочтительно 6, 7, 8, 9, 10
или 11 различных пептидов и наиболее предпочтительно 11 различных пептидов. Длина пептида для
использования в вакцине против рака может быть любым подходящим пептидом. В особенности, он может быть подходящим 9-мерным пептидом или подходящим 7- или 8- или 10- или 11- или 12-мерным
пептидом. Более длинные пептиды могут быть также подходящими, но 9-мерные или 10-мерные пептиды, как описано в приложенной табл. 1, являются предпочтительными для пептидов МНС класса I.
Пептид(ы) формирует(ют) вакцину против опухолей или рака. Она может вводиться непосредственно пациенту, в пораженный орган или систематично, или вноситься ex vivo в клетки, полученные от
пациента, или в человеческую клеточную линию, которые затем могут вводиться пациенту, или использоваться in vitro для селекции субпопуляции из иммунных клеток, полученных от пациента, которые после этого вновь вводятся пациенту. Пептид может быть также конъюгирован с подходящим носителем,
таким как гемоцианин лимфы улитки (KLH) или маннан (см. WO 95/18145 и Longenecker et al. (1993)
- 16 -
013466
Ann. NY Acad. Sci. 690, 276-291).
Пептидная вакцина может вводиться без адъюванта. Пептидная вакцина может также вводиться с
адъювантом, таким как БЦЖ или квасцы. Другие подходящие адъюванты включают стимулон Aquila's
QS21 (Aquila Biotech, Worcester, MA, США), который получают из сапонина, микобактериальных экстрактов и синтетических имитаций бактериальных клеточных стенок и, собственно, адъювантов, таких
как Ribi's Detox. Также может быть использован Quil А, другой, полученный из сапонина адъювант, (Superfos, Дания). Другие адъюванты, такие как адъювант Фрейнда, могут также быть применены. Полезным также может быть введение пептида, конъюгированного с гемоцианином лимфы улитки, предпочтительно также с адъювантом. Могут быть использованы другие адъюванты, как те, что описаны выше.
Пептид может быть также меченым или являться белком слияния или гибридной молекулой. Пептиды,
последовательность которых дана в настоящем изобретении, как ожидается, стимулируют CD8+ ЦТЛ.
Тем не менее, стимуляция более эффективна в присутствии помощи, производимой CD4+ Т-клетками.
Таким образом, партнеры слияния или секции гибридной молекулы адекватно обеспечивают эпитопы,
которые стимулируют CD4+ Т-клетки. Стимулирующие эпитопы CD4+ хорошо известны из уровня техники и включают те, что были выявлены в столбнячном токсине.
В особенно предпочтительном воплощении пептидной вакцины в соответствии с изобретением,
указанная вакцина является комплексной пептидной опухолевой вакциной для лечения почечноклеточного рака. Предпочтительно, чтобы указанная вакцина вмещала комплекс опухолеассоциированных пептидов в соответствии с SEQ ID № 1 по 10, которые расположены и были идентифицированы на
первичных клетках почечного рака.
Этот комплекс включает пептиды HLA класса I и II. Пептидный комплекс может также содержать
по крайней мере один пептид, например, из корового антигена HBV, используемый в качестве пептида
положительного контроля, служащий как антигенный маркер для проверки эффективности внутрикожного введения. В одном предпочтительном воплощении вакцина состоит из 11 отдельных пептидов (в
соответствии с SEQ ID № 1 по 11) с весом каждого пептида от около 1500 мкг до около 75 мкг, предпочтительно от около 1000 мкг до около 750 мкг и более предпочтительно от около 500 мкг до около 600 мкг
и наиболее предпочтительно около 578 мкг, которые все могут быть очищены на ВЭЖХ и ионообменной
хроматографии и получены в виде белого до серовато-белого порошка. Лиофилизат предпочтительно
растворяют в гидрокарбонате натрия и используют для внутрикожной инъекции в течение 30 мин после
восстановления при комнатной температуре. В соответствии с настоящим изобретением предпочтительные количества пептидов могут варьироваться между около 0,1 и 100 мг, предпочтительно между около
0,1 до 1 мг и наиболее предпочтительно между около 300 мкг до 800 мкг на 500 мкл раствора. Термин
«около» подразумевает здесь +/- 10 процентов заданного объема, если не указано другое. Специалист
данной области будет способен установить фактическое количество пептида для использования, исходя
из нескольких факторов, таких как, например, иммунный статус отдельного пациента и/или количество
TUMAP (опухолеассоциированный пептид), присутствующего в конкретном виде рака. Пептиды настоящего изобретения могут обеспечиваться в других подходящих формах (стерильные растворы и т.д.)
вместо лиофилизата.
Некоторые пептиды, последовательность которых дана в настоящем изобретении, как ожидается,
стимулируют CD8-положительные Т-клетки (ЦТЛ). Тем не менее, стимуляция более эффективна в присутствии помощи, производимой CD4-положительными Т-клетками. Таким образом, партнеры слияния
или секции гибридной молекулы адекватно обеспечивают эпитопы, которые стимулируют CD4положительные Т-клетки. Стимулирующие CD4-положительные эпитопы хорошо известны из уровня
техники и включают те, что были выявлены в столбнячном токсине или пептиде из ММР7, обеспечиваемые данным изобретением.
Наконец, вакцина в соответствии с изобретением может зависеть от специфического типа рака, от
которого страдает пациент, которому предназначено лечение, в равной степени, как и от статуса заболевания, ранних схем лечения, иммунного статуса пациента и, естественно, от HLA-гаплотипа пациента. В
дальнейшем вакцина в соответствии с изобретением может содержать индивидуализированные компоненты, соответствующие личным потребностям отдельного пациента. Примерами являются различные
количества пептидов в соответствии с экспрессией связанных с ними ТАА у обозначенного конкретного
пациента, нежелательными побочными эффектами, в связи с аллергиями или другими лечениями и согласованием для вторичного лечения, следующего за первым циклом или схемой лечения.
Другой дальнейший аспект настоящего изобретения относится к применению пептида в соответствии с изобретением или полинуклеотида или вектора экспрессии, кодирующего такой пептид, для изготовления медикамента для уничтожения клеток-мишеней у пациента, клетки-мишени которого аберрантно экспрессируют полипептид, включающий аминокислотную последовательность по изобретению.
Предпочтительно использование в качестве фармацевтической композиции, являющейся противораковой вакциной.
Другой дальнейший аспект настоящего изобретения обеспечивает применение пептида в соответствии с изобретением или полинуклеотида или вектора экспрессии, кодирующего такой пептид, для изготовления медикамента для индуцирования иммунного ответа, в особенности клеточного иммунного от- 17 -
013466
вета, более предпочтительно опосредованного Т-клетками иммунного ответа против клеток солидных
опухолей, клетки которых экспрессируют молекулу I или II класса МНС человека на их поверхности и
презентируют полипептид, включающий аминокислотную последовательность по изобретению.
В контексте настоящего изобретения было неожиданно установлено, что опухолевые клетки солидных опухолей, в отличие от здоровых клеток той же ткани, экспрессируют человеческие молекулы HLA
II класса на их поверхности. Этот факт был описан лишь раз в работе Brasanac et al. (Brasanac D, Markovic-Lipkovski J, Hadzi-Djokic J, Muller GA, Muller CA. Immunohistochemical analysis of HLA class II antigens and tumor infiltrating mononuclear cells in renal cell carcinoma: correlation with clinical and histopathological data. Neoplasma. 1999; 46(3): 173-8), где криостатные срезы 37 почечно-клеточных карцином
(RCC) - 25 светлоклеточный, 10 гранулярный и 2 хромофобный тип - были исследованы непрямым иммунопероксидазным методом, применяющим моноклональные антитела (MoAb) к антигенам HLA-DR,
-DP и -DQ для анализа антигенов HLA класса II, и анти-CD14, -CD3, -CD4 и -CD8 MoAb для опухольинфильтрующих мононуклеарных клеток (TIM). Число положительных клеток оценивалось полуколичественным методом, а результаты иммуногистохимического исследования были соотнесены с клиническими (возраст и пол пациента, размер опухоли и классификация по TNM) и гистопатологическими (цитология, гистология, степень) характеристиками RCC. Все RCC экспрессировали HLA-DR, 92% -DQ и
73% -DP-антигены с уровнем экспрессии в соотношении -DR>-DQ>-DP, однако не было установлено
никакой значимой связи с какими-либо проанализированными гистопатологическими или клиническими
параметрами. Моноциты были более многочисленны, чем Т-лимфоциты, а Т-клетки CD4+, чем CD8+,
причем опухоли с преобладанием Т-лимфоцитов и приблизительно равным числом CD4+ и CD8+ Тклеток имеют наибольший средний диаметр. Неадекватная активация Т-лимфоцитов опухолевыми клетками (несмотря на способность презентации антигена) могла быть причиной для ассоциации параметров,
которая свидетельствует о более агрессивном поведении опухоли с аберрантной экспрессией антигена
HLA II класса на RCC.
Другой дальнейший аспект настоящего изобретения обеспечивает применение пептида в соответствии с изобретением или полинуклеотида или вектора экспрессии, кодирующего такой пептид, для изготовления медикамента для уничтожения клеток-мишеней у пациента, клетки-мишени которого аберрантно экспрессируют полипептид, включающий аминокислотную последовательность как данная в любой из SEQ ID № 1 по 10.
Дальнейший аспект изобретения обеспечивает, таким образом, способы получения активированных
цитотоксических Т-лимфоцитов in vivo или in vitro, причем первый способ включает контактирование Тклеток in vitro с нагруженными антигеном молекулами МНС I или II класса человека, экспрессированными на поверхности подходящей антигенпрезентирующей клетки на период времени, достаточного для
активации антигенспецифическим образом указанной Т-клетки, причем антиген является пептидом в
соответствии с изобретением. Второй способ, который является более предпочтительным, описывается у
Walter et al. (Walter S, Herrgen L, Schoor O, Jung G, Wernet D, Buhring HJ, Rammensee HG, Stevanovic S.
Cutting edge: predetermined avidity of human CD8 T-cells expanded on calibrated MHC/anti-CD28-coated microspheres. J Immunol. 2003 Nov 15; 171(10):4974-8).
Молекулы МНС класса II могут быть экспрессированы на поверхности любой подходящей клетки
и, предпочтительно, если клетка является такой, которая в естественных условиях не экспрессирует молекулы МНС класса II (в этом случае клетка трансфецирована для экспрессии такой молекулы), или, если она экспрессирует, то она является дефектной для каскадов реакций процессинга или презентации
антигена. Тогда для клетки, экспрессирующей молекулы МНС класса II, возможен, по существу, полный
прайминг с выбранным пептидным антигеном до активации ЦТЛ.
Антигенпрезентирующая клетка (или клетка-стимулятор) типично имеет молекулу МНС I или II
класса на своей поверхности и предпочтительно обычно является не способной самостоятельно нагружать на названную молекулу МНС I или II класса выбранный антиген. Как более детально описано ниже,
молекула МНС I или II класса может быть легко нагружена выбранным антигеном in vitro.
Предпочтительно в клетке млекопитающих не хватает или имеется пониженный уровень или пониженная функция пептидного транспортера ТАР. Подходящие клетки, в которых не хватает пептидного
транспортера ТАР, включают Т2, RMA-S и клетки дрозофилы. ТАР - это Транспортер, ассоциированный
с Процессингом Антигена.
Нагружающая пептидом дефектная клеточная линия Т2 человека имеется в наличии в American
Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, США под каталоговым № CRL
1992; клеточная линия дрозофилы линия Schneider 2 имеется в наличии в АТСС под каталоговым № CRL
19863; клеточная линия мыши RMA-S описывается у Karre и Ljunggren (1985) J. Exp. Med. 162, 1745.
Обычно указанная клетка-хозяин до трансфекции, в основном, не экспрессирует молекулы МНС I
класса. Также предпочтительно, если клетка-стимулятор экспрессирует молекулу, важную для Тклеточной костимуляции, такую как любая из В7.1, В7.2, ICAM-1 и LFA 3.
В дальнейшем воплощении также могут быть использованы комбинации молекул HLA.
Использование рекомбинантных полиэпитопных вакцин для доставки комплексов эпитопов CD8положительных ЦТЛ описывается в работе Thomson et al (1996) J. Immunol. 157, 822-826 и в WO
- 18 -
013466
96/03144, которые включены сюда путем ссылки. По отношению к настоящему изобретению, желательно и выгодно включение в отдельную вакцину пептида (или нуклеиновой кислоты, кодирующей пептид),
причем пептид включает в любом порядке аминокислотную последовательность настоящего изобретения
и CD4-положительный Т-клеточный стимулирующий эпитоп (такой как из ММР-7). Такая вакцина была
бы особенно полезна для лечения раковых заболеваний.
Для генерации ЦТЛ in vitro могут быть использованы многие другие способы. Например, в методах,
описанных у Peoples et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92,432-436 и Kawakami et al. (1992) J.
Immunol. 148, 638643 при генерации ЦТЛ используются аутологичные инфильтрующие опухоль лимфоциты. Plebanski et al. (1995) Eur. J. Immunol. 25, 1783-1787 для приготовления ЦТЛ использует аутологичные лимфоциты периферической крови (ЛПК). Jochmus et al. (1997) J. Gen. Virol. 78, 1689-1695 описывает получение аутологичных ЦТЛ методом импульсного введения пептида или полипептида в дендритные клетки или посредством инфицирования рекомбинантным вирусом. Hill et al. (1995) J. Exp. Med.
181, 2221-2228 и Jerome et al (1993) J. Immunol. 151, 1654-1662 для получения аутологичных ЦТЛ использует В-клетки. Кроме того, для получения аутологичных ЦТЛ могут быть использованы макрофаги
с введенным импульсным методом пептидом или полипептидом или инфицированные рекомбинантным
вирусом.
При получении ЦТЛ могут быть также использованы аллогенные клетки, и этот метод детально
описывается в патенте WO 97/26328, включенном сюда путем ссылки. Например, кроме клеток дрозофилы и Т2-клеток, для презентации антигенов могут использоваться другие клетки, такие как клетки яичника китайского хомяка (СНО), бакуловирус-инфицированные клетки насекомых, бактерии, дрожжи,
инфицированные осповакциной клетки-мишени. Кроме того, могут быть использованы растительные
вирусы (см., например, Porta et al (1994) Virology 202, 449-955, где развитие мозаичного вируса китайской вигны описывается как высокопродуктивная система для презентации чужеродных пептидов.
Предпочтительно, чтобы в методе в соответствии с настоящим изобретением антигенпрезентирующая клетка включала вектор экспрессии как данный выше.
Активированные Т-клетки, которые направлены против пептидов изобретения, применимы в терапии. Таким образом, дальнейший аспект изобретения обеспечивает активированные Т-клетки, получаемые вышеупомянутыми методами по изобретению.
Другой дальнейший аспект изобретения обеспечивает активированные Т-клетки, которые селективно распознают клетку, которая аберрантно экспрессирует полипептид, включающий аминокислотную
последовательность по изобретению. Предпочтительно, чтобы Т-клетки распознавали указанную клетку
при взаимодействии с комплексом HLA/пептид (например, соединение). Т-клетки применимы в методе
уничтожения клеток-мишеней у пациента, клетки-мишени которого аберрантно экспрессируют полипептид, включающий аминокислотную последовательность по изобретению, причем пациенту вводится эффективное число активированных Т-клеток. Т-клетки, которые введены пациенту, могут быть получены
от пациента и активироваться, как описывалось выше (т.е. они являются аутологичными Т-клетками).
Альтернативно Т-клетки получают не от пациента, а от другого индивида. Разумеется, предпочтительно,
если индивид является здоровым индивидом. «Здоровым индивидом» изобретатели обозначают, что индивид имеет, в общем, хорошее здоровье, предпочтительно он имеет компетентную иммунную систему и
более предпочтительно не страдает ни одним заболеванием, которые можно легко проконтролировать и
выявить.
Активированные Т-клетки экспрессируют Т-клеточный рецептор (ТКР), который участвует в распознании клеток, которые экспрессируют аберрантный полипептид. Полезно, если кДНК, кодирующая
ТКР, клонирована из активированных Т-клеток и перенесена на дальнейшие Т-клетки для экспрессии.
Клетками-мишенями для CD4-положительных Т-клеток in vivo в соответствии с одним воплощением настоящего изобретения могут быть клетки опухоли (которые иногда экспрессируют МНС класса II)
и/или стромальные клетки, окружающие опухоль (опухолевые клетки) (которые иногда также экспрессируют МНС класса II).
ТКР клонов Т-клеток по изобретению, специфические для пептидов по изобретению, клонируются.
Использование ТКР в клонах Т-клеток определяется использованием (i) ТКР вариабельных регионспецифических моноклональных антител и (ii) ПЦР с обратной транскрипцией с праймерами, специфическими для семейств генов Va и Vp. Библиотека кДНК подготовлена из поли-(А)-мРНК, экстрагированной из клонов Т-клеток. Использовались праймеры, специфические для С-терминального участка ТКР а
и Р-цепей и для N-терминального участка идентифицированных сегментов Va и Р. Вся кДНК для а и Рцепи ТКР амплифицировалась высокоточной ДНК-полимеразой, и амплифицированные продукты клонировались в подходящий вектор для клонирования. Клонированные гены а и Р-цепей могут быть организованы в одну цепь ТКР с помощью метода, описанного у Chung et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA
91-12658. В этой отдельной модели цепи за сегментом VaJ следует сегмент V DJ, затем сегмент Ср, затем
трансмембранный и цитоплазматический сегмент цепи CD3. Эта отдельная цепь ТКР вводится затем в
ретровирусный вектор экспрессии, панель векторов может быть использована на основе их способности
инфицировать взрослые человеческие CD8-положительные Т-лимфоциты и способствовать экспрессии
генов: ретровирусная векторная система Kat является одной предпочтительной возможностью (см. Finer
- 19 -
013466
et al. (1994) Blood 83, 43). Насыщенный амфотропный ретровирус используется, чтобы инфицировать
очищенные CD8-положительные или CD4-положительные Т-лимфоциты, изолированные из периферической крови пациентов с опухолями (следуя протоколу, опубликованному у Roberts et al. (1994) Blood
84, 2878-2889, включенному сюда путем ссылки). Антитела анти-GD3 используются, чтобы инициировать пролиферацию очищенных CD8-положительных Т-клеток, которая содействует ретровирусной интеграции и стабильной экспрессии отдельной цепи ТКР. Эффективность ретровирусной трансдукции
определяется окрашиванием инфицированных CD8-положительных Т-клеток антителами, специфическими для отдельной цепи ТКР. Анализ in vitro трансдуцированных CD8-положительных Т-клеток устанавливает, что они проявляют такое же опухолеспецифическое уничтожение, как в случае с рестриктированным по аллотипу клоном Т-клеток, из которого были первоначально клонированы цепи ТКР. Популяции трансдуцированных CD8-положительных Т-клеток с ожидаемой специфичностью могут быть
использованы для адоптивной иммунотерапии пациентов с опухолевыми заболеваниями. Для лечения
пациентов можно использовать от 108 до 1011 аутологичных, трансдуцированных Т-клеток. Аналогично
CD8-положительным могут быть генерированы трансдуцированные CD4-положительные Т-хелперные
клетки, несущие соотносимые модели.
Другие подходящие системы для введения генов в Т-клетки описываются в работе Moritz et al.
(1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91-4322, включенной сюда путем ссылки. Eshhar et al. (1993) Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 90,720-724 и Hwu et al. (1993) J. Exp. Med. 178, 361-366 описывают также трансфекцию Тклеток. Таким образом, дальнейший аспект изобретения обеспечивает ТКР, который распознает клетку,
которая аберрантно экспрессирует полипептид, включающий аминокислотную последовательность по
изобретению; ТКР, полученный из активированных Т-клеток.
Равно как и ТКР, в изобретение включены молекулы, функционально эквивалентные ТКР. Они
включают любую молекулу, которая функционально эквивалентна ТКР, которая может выполнять такую
же функцию, как и ТКР. В частности, такие молекулы включают полученные генной инженерией трехдоменные одноцепные ТКР, как те, что получены методом, описанным в работе Chung et al. (1994) Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 91, 12654-12658, включенной сюда путем ссылки и относящейся к сказанному выше.
Изобретение включает также полинуклеотид, кодирующий ТКР или функционально эквивалентную молекулу, и вектор экспрессии, кодирующий ТКР или его функционально эквивалентную молекулу. Векторы экспрессии, которые подходят для экспрессирования ТКР по изобретению, включают те, что описаны
выше в связи с экспрессией пептидов по изобретению.
Тем не менее, предпочтительно, чтобы векторы экспрессии являлись такими, которые способны
экспрессировать ТКР в следующей за Т-клетками трансфекции.
Дальнейший аспект изобретения обеспечивает способ уничтожения клеток-мишеней у пациента,
чьи клетки-мишени аберрантно экспрессируют полипептид, включающий аминокислотную последовательность по изобретению, способ, включающий введение пациенту эффективного объема пептида в
соответствии с изобретением или эффективного объема полинуклеотида или вектора экспрессии, кодирующего указанный пептид, или эффективного числа Т-лимфоцитов, как определено выше, причем объем указанного пептида или объем указанного полинуклеотида или вектора экспрессии или Т-клеток является эффективным для возбуждения иммунного ответа против клетки-мишени у указанного пациента.
Клетка-мишень типично является опухолевой или раковой клеткой, в особенности клеткой солидных
опухолей, которые экспрессируют молекулу I или II класса МНС человека на их поверхности и презентируют полипептид, включающий аминокислотную последовательность, как данная выше.
Другой дальнейший аспект изобретения обеспечивает метод уничтожения клеток-мишеней у пациента, чьи клетки-мишени аберрантно экспрессируют полипептид, включающий аминокислотную последовательность по изобретению, метод, включающий стадии (1) получение Т-клеток от пациента; (2) введение в указанные клетки полинуклеотида, кодирующего ТКР или функционально эквивалентную молекулу, как определено выше; и (3) введение клеток, полученных на стадии (2), пациенту.
Другой дальнейший аспект изобретения обеспечивает метод уничтожения клеток-мишеней у пациента, чьи клетки-мишени аберрантно экспрессируют полипептид, включающий аминокислотную последовательность, которая определена выше, метод, включающий стадии (1) извлечение антигенпрезентирующих клеток, таких как дендритные клетки, у указанного пациента; (2) контактирование указанных
антигенпрезентирующих клеток с пептидом, как определено в первом или втором или третьем аспектах
изобретения, или с полинуклеотидом, кодирующим таковой пептид, ex vivo; и (3) введение обработанных таким образом антигенпрезентирующих клеток снова пациенту.
Предпочтительно, чтобы антигенпрезентирующие клетки являлись дендритными клетками. Соответственно, дендритные клетки являются аутологичными дендритными клетками, в которые импульсным методом введен антигенный пептид. Антигенный пептид может быть любым подходящим антигенным пептидом, который вызывает адекватный Т-клеточный ответ. Т-клеточная терапия с использованием аутологичных дендритных клеток с введенными импульсным методом пептидами из опухолеассоциированного антигена раскрывается у Murphy et al (1996) The Prostate 29, 371-380 and Tjua et al. (1997)
The Prostate 32, 272-278.
В дальнейшем воплощении антигенпрезентирующие клетки, такие как дендритные клетки, контак- 20 -
013466
тируют с полинуклеотидом, который кодирует пептид по изобретению. Полинуклеотид может быть любым подходящим полинуклеотидом, и, предпочтительно, чтобы он был способен к трансдукции дендритной клетки, таким образом, приводя к презентации пептида и индукции иммунитета.
Как правило, полинуклеотид может быть включен в вирусный полинуклеотид или вирус. Например,
аденовирус-трансдуцированные дендритные клетки проявляли способность индуцировать антигенспецифический противоопухолевый иммунитет по отношению к MUC1 (см. Gong et al. (1997) Gene Ther. 4,
1023-1028). Подобным образом могут быть использованы системы, основанные на аденовирусе (см., например, Wan et al. (1997) Hum. Gene Ther. 8, 1355-1363); могут быть использованы ретровирусные системы (Specht et al. (1997) J. Exp. Med. 186, 1213-1221 и Szabolcs et al. (1997), также может быть использован
опосредованный частицами крови перенос в дендритные клетки (Tuting et al. (1997) Eur. J. Immunol. 27,
2702-2707); а также может быть использована РНК (Ashley et al. (1997) J. Exp. Med. 186, 1177-1182).
Следует понимать, что с учетом методов уничтожения клеток-мишеней у пациента особенно предпочтительно, чтобы клетками-мишенями были раковые клетки, более предпочтительно раковыми клетками почек или толстой кишки.
В предпочтительном воплощении HLA-гаплотип пациента определяется до начала лечения. Гаплотипирование HLA может быть произведено при использовании любого подходящего метода; такие методы хорошо известны из уровня техники.
Изобретение включает, в особенности, использование пептидов по изобретению (или кодирующих
их полинуклеотидов) для активной вакцинации in vivo; для манипуляции аутологичными дендритными
клетками in vitro при последующем введении манипулированных таким образом дендритных клеток in
vivo для активации ответов Т-клеток; для активации аутологичных Т-клеток in vitro с последующей
адоптивной терапией (т.е. манипулированные таким образом Т-клетки вводятся пациенту); и для активации Т-клеток здоровых доноров (МНС-совместимых или несовместимых) in vitro с последующей адоптивной терапией.
В предпочтительном воплощении вакцины настоящего изобретения вводятся хозяину как отдельно,
так и в комбинации с другой противораковой терапией для ингибирования или супрессии образования
опухолей.
Пептидная вакцина может вводиться без адъюванта. Пептидная вакцина может также вводиться с
адъювантом, таким как БЦЖ или квасцы. Другие подходящие адъюванты описываются также выше.
Пептиды в соответствии с изобретением могут также быть использованы в качестве диагностических реагентов. Используя пептиды, может быть проведен анализ, присутствуют ли в популяции Тклеток такие Т-клетки, которые специфически направлены против пептида или были индуцированы при
терапии. Кроме того, увеличение числа предшественников Т-клеток может быть проверено теми пептидами, которые проявляют реактивность против означенного пептида. Кроме того, пептид может быть
использован в качестве маркера для контроля прогрессирования опухолевого заболевания, экспрессирующего обозначенный антиген, из которого получен пептид.
В приложенной табл. 1 приведены пептиды, которые были идентифицированы. Помимо того, в таблице приводятся названия белков, из которых получен пептид, и соответствующая позиция пептида в
соответствующем белке. Кроме того, даются соответствующие Инвентарные номера, которые относятся
к генному банку «Национального Центра Биотехнологической Информации» (National Centre for Biotechnology Information) Национального Института Здоровья (National Institute of Health) (см. http:
www.ncbi.nlm.nih.gov).
В другом предпочтительном воплощении пептиды используются для окрашивания лейкоцитов, в
особенности Т-лимфоцитов. Такое использование имеет особенное преимущество, если необходимо
проверить, присутствуют ли в популяции ЦТЛ такие специфические ЦТЛ, которые направлены против
пептида. Кроме того, пептид может быть использован в качестве маркера для определения прогрессирования терапии при аденоматозном или раковом заболевании или нарушении.
В другом предпочтительном воплощении пептиды используются для получения антитела. Поликлональные антитела могут быть получены по стандартному способу иммунизации животных путем
инъекции пептида и последующей очистки иммуноглобулина. Моноклинальные антитела могут быть
получены в соответствии со стандартными протоколами, такими как описываются, например, в Methods
Enzymol. (1986), 121, Hybridoma technology and monoclonal antibodies.
Идентификация эпитопов Т-хелперных клеток опухолеассоциированных антигенов остается важной задачей в противоопухолевой иммунотерапии. До сих пор были разработаны различные стратегии
для идентификации пептидов I или II класса из опухолеассоциированного антигена, начиная с инкубации
АПК с интересующим антигеном для его поглощения и процессинга (Chaux, P., V. Vantomme, V. Stroobant, K. Thielemans, J. Corthals, R. Luiten, A.M. Eggermont, T. Boon and B.P. van der Bruggen. 1999. Identification of MAGE-3 epitopes presented by HLA-DR molecules to CD4(+) T. lymphocytes. J. Exp. Med. 189:767778), до всевозможных стратегий трансфекции с белками слияния (Dengjel, J., P. Decker, О. Schoor, F.
Altenberend, T. Weinschenk, H.G. Rammensee, and S. Stevanovic. 2004. Identification of a naturally processed
cyclin D1 T-helper epitope by a novel combination of HLA class II targeting and differential mass spectrometry.
Eur. J. Immunol. 34:3644-3651). Для всех этих методов требуется большая затрата времени и зачастую
- 21 -
013466
остается неизвестным, действительно ли происходит презентация идентифицированных лигандов HLA in
vivo человеческими тканями.
Изобретатели идентифицировали лиганд, имеющий одну «коровую» последовательность из ММР7.
Изобретатели обнаружили этот белок в гиперэкспрессированном состоянии в почечно-клеточных карциномах, к тому же, он был описан как опухолеассоциированный (Miyamoto, S., K. Yano, S. Sugimoto, G.
Ishii, T. Hasebe, Y. Endoh, K. Kodama, M. Goya, T. Chiba, and A. Ochiai. 2004. Matrix metalloproteinase-7
facilitates insulin-like growth factor bioavailability through its proteinase activity on insulin-like growth factor
binding protein 3. Cancer Res. 64:665-671; Sumi, Т., Т. Nakatani, H. Yoshida, Y. Hyun, T. Yasui, Y. Matsumoto, E. Nakagawa, K. Sugimura, H. Kawashima, and O. Ishiko. 2003. Expression of matrix metalloproteinases
7 and 2 in human renal cell carcinoma. Oncol. Rep. 10:567-570). Этот пептид беспорядочно связывался с
молекулами HLA II класса и был способен активировать CD4-положительные Т-клетки различных здоровых доноров. Таким образом, подход изобретателей будет полезен при идентификации новых пептидов-кандидатов II класса из ТАА для использования в клинических протоколах по вакцинации.
Должно быть понятно, что отличительные черты изобретения, раскрываемые и описываемые здесь,
могут быть использованы не только в соответственной комбинации, как было показано, но и также по
отдельности без выхода из рамок, обозначенных настоящим изобретением.
Теперь изобретение будет описано более детально посредством ссылок на последующие фигуры,
список последовательностей и примеры. Следующие примеры приведены исключительно для иллюстрационных целей и не направлены на ограничение изобретения.
Последовательности SEQ ID № 1 по SEQ ID № 2 демонстрируют пептидные последовательности Тклеточного эпитопа, содержащего пептиды, которые презентируются МНС I или II класса в соответствии
с настоящим изобретением.
SEQ ID № 3 по SEQ ID № 11 демонстрируют пептидные последовательности пептидов, использованные в вакцине настоящего изобретения, которая впоследствии обозначается «IMA».
На фиг. 1 показана презентация пептида IA-MET-001, полученного из протоонкогена c-Met, на первичной опухолевой пробе RCC013. Нанокапиллярная высокоэффективная жидкостная хроматография
ESI MS была сделана на пептидах, элюированных из RCC013. Масс-хроматограмма для 1006,54 ±0,5 Да
показывает пик со временем удерживания 47,8 мин. Индуцированный столкновением масс-спектр затухания от м/з 1006,54, записанный во время второй LC-MS при заданном времени удерживания, показанном на вставке, подтвердил присутствие IMA-MET-001 (Weinschenk 2002).
На фиг. 2 показана тканевая экспрессия протоонкогена c-Met (MET). Экспрессия была проанализирована олигонуклеотидными микрочипами. Число копий соотносится с почкой, значение задано 1,0. «Р»
означает, что ген присутствует, «А» - отсутствует, а «М» - предельный случай на основе статистических
алгоритмов абсолютного сигнала. «I» означает, что экспрессия гена значительно увеличена в соотношении с почкой, «D» указывает на пониженную экспрессию, a «NC» означает, что в экспрессии не было
изменений. Значение экспрессии по отношению к почке подсчитывалось по коэффициенту сигнальной
диаграммы и указано наверху столбцов. Пунктирная горизонтальная линия показывает наивысшую экспрессию в нормальных тканях (в данном случае легкого).
На фиг. 3 показано уничтожение нагруженных пептидом клеток-мишеней ЦТЛ, примированных
IMA-MET-001.
На фиг. 4 показано уничтожение злокачественных клеток ЦТЛ, примированных IMA-MET-001.
На фиг. 5 показан анализ ингибирования немечеными клетками-мишенями.
На фиг. 6 показан тетрамерный анализ экспансии, вызванной микросферой.
На фиг. 7 показана иммуногенность in vitro IMA-MMP-001 - репрезентативный внутриклеточный
IFN-гамма в сравнении с окрашиванием CD4 четырех здоровых доноров. СD4-положительные Т-клетки
доноров 1, 2 и 3 проявляли реактивность к IMA-MMP-001 после третьей и четвертой стимуляции. Донор
4 оставался всегда отрицательным.
На фиг. 8 показана дифференциальная презентация пептидов на опухолевой и здоровой тканях - (А)
масс-спектр двух видов пептидов м/з 739,96 и 741,95, полученных из нормальной почки и ткани почечноклеточной карциномы пациента RCC100, соответственно. Масс-спектр демонстрирует гиперпрезентацию
пептида Адипофилин на ткани почечно-клеточной карциномы, которая приблизительно в 4 раза выше,
чем на соответствующей аутологичной нормальной ткани (В). Анализ индуцированного столкновением
масс-спектра затухания с м/з 741,95 (опухоль) обнаруживает пептидную последовательность IMA-ADF003, полученную из Адипофилина.
На фиг. 9 показана иммунность in vivo к IMA-ADF-001 - Т-клеточная иммунность у 2 пациентов с
RCC к нескольким не использованным в вакцинации пептидам у пациентов, вакцинированных аутологичными дендритными клетками с введенными импульсным методом двумя пептидами TUMAP, полученными из MUC. Т-клетки, специфические для IMA-ADF-001 («Адипофилин»), до вакцинации не были
представлены и были выявлены потом у пациента #3 (верхнее изображение) после 6 вакцинаций и у пациента #8 (нижнее изображении) после 8 вакцинаций.
На фиг. 10 представлены репрезентативные примеры IMA-индуцированного Т-клеточного ответа,
выявленного амплифицированным анализом ELISPOT для того же пациента и антигена. Верхняя и ниж- 22 -
013466
няя колонка представляют отрицательный контрольный антиген HIV-001 и отдельный TUMAP IMACCN-001, использованные для считывания, соответственно. В левой колонке представлены анализы
ELISPOT совокупных проб до вакцинации в день обследования 2 (S2) и непосредственно перед первой
инъекцией (V1). В правой колонке представлены анализы ELISPOT совокупных проб, сделанных во время проведения вакцинации на 22ой день (V6) и 36ой день (V7). Дается число положительных клеток для
каждого эксперимента.
Фиг. 11 - репрезентативные примеры IMA-индуцированных Т-клеточных ответов, выявленных амплифицированным тетрамерным анализом на основе изменения окраски. На верхней и средней панелях
представлены двухмерные точечные графики с гейтом для CD3+ лимфоцитов, нижняя панель -с гейтом
для CD3+ CD8+ лимфоцитов. Пациенты, точки времени и окрашивание, как указано для каждой колонки. S1+V1: пробы, взятые до вакцинации; V4+V5: пробы, взятые на 8ой и 15ый день; V6+V7: пробы, взятые на 22ой и 36ой день; V6+V7: пробы, взятые на 64ый день (последняя вакцинация) и с 85ого по 92ой день
(конец исследования).
А. Данные для пациента 03-004, подтверждающие иммунологический ответ на IMA-CCN-001, представлены на фиг. 10. Клеточная популяция, положительная для CD3+ и тетрамера IMA-CCN-001, может
быть выявлена после четвертой и пятой инъекции IMA (V6+V7; средняя панель), насчитывающая 0,78%
лимфоцитов (V6+V7; нижняя панель). Для тетрамера K67-001 не было обнаружено положительной популяции (верхняя панель).
В. Данные для пациента 03-003, не проявляющего иммунологического ответа на пептид IMA-RGS001 (верхняя панель), но вырабатывающего IMA-CCN-001 тетрамерный положительный ответ во время
схемы вакцинации (средняя панель, колонка 3 и 4), насчитывающего до 0,8% лимфоцитов (нижняя панель; колонка 3).
Фиг. 12. Наблюдаемая сила кинетики Т-клетки при амплифицированном тетрамерном анализе в отдельный момент времени. Результаты представлены для считывания в отдельный момент времени для
пациента 05-001, для которого индуцированный вакциной Т-клеточный ответ был выявлен стандартным
амплифицированным тетрамерным анализом с совокупными пробами. Результаты представлены для
всех опухолеассоциированных антигенов, присутствующих в IMA (пул TUMAP), и в особенности для
пептида IMA-CCN-001. Кроме того, представлены контроли HIV-001 и IMA-HBV-001 в рамках того же
анализа в отдельный момент времени.
Примеры
Глоссарий
I. Характеристика пептидов настоящего изобретения.
Данные по экспрессии генных продуктов, из которых получены пептиды IMA
Пептиды, идентифицированные из первичной ткани RCC, были выбраны для включения в вакцину
IMA (см. ниже) в соответствии со внутренней системой приоритетности, основанной, в основном, на
анализе генной экспрессии, литературе и поисках в базах данных известных свойств антигена, из которого был идентифицирован полученный пептид. Все естественно презентируемые пептиды сильно гиперэкспрессированы в ткани почечно-клеточной карциномы по сравнению с нормальной почечной тканью,
также как и с рядом других жизненно важных органов и тканей. Такой отбор необходим (1) для выбора
- 23 -
013466
пептидов, способных индуцировать Т-клетки с высокой специфичностью для распознавания опухоли, но
не другой ткани, для доведения до минимума возможности аутоиммунности, индуцированной вакцинацией IMA и (2) для гарантии того, что большинство опухолей в популяции пациента будет распознано
индуцированной Т-клеткой.
Среднее распространение антигенов, из которых получены пептиды, содержащиеся в IMA, составляет 68% (гиперэкспрессия в RCC по сравнению с жизненно важными органами и тканями в пробах
RCC, n=24), колеблясь от 54 до 96% для отдельных антигенов. Что значительно выше, чем в случае стандартных опухолевых антигенов, таких как Her-2/neu (распространение: 25-30%).
Профилирование по глобальной генной экспрессии производилось с помощью имеющейся в продаже системы микрочипов высокой плотности (Affymetrix). РНК была изолирована из тканей, процессирована и гибридизирована до высокоплотных олигонуклеотидных микрочипов. После окрашивания и
промывания микрочипы были просканированы, и интенсивность флуоресценции каждой точки в анализе
представляла собой своего рода уровень экспрессии гена, совместимого с последовательностью ДНК
олигонуклеотида. Некоторые олигонуклеотиды на микрочипах покрывают последовательность каждого
гена. После статистического анализа компьютерной программой могут быть получены попарные показатели относительной экспрессии двух проб для каждого гена. Упорядочение всех данных различных проб
с использованием одной константной пробы в качестве точки отсчета позволяет произвести относительный количественный подсчет уровней экспрессии среди всех проб.
Источники РНК - все РНК из человеческих тканей были куплены (Ambion, Huntingdon, Великобритания; Clontech, Heidelberg, Германия; Stratagene, Amsterdam, Нидерланды, BioChain, Heidelberg, Германия). Суммарная РНК нескольких индивидов была смешана таким образом, что РНК каждого индивида
имела равный вес. Качество и количество было подтверждено на биоанализаторе Agilent 2100 (Agilent,
Waldbronn, Германия) с использованием лабораторного оборудования RNA 6000 Nano LabChip Kit
(Agilent).
Анализ с высокоплотным олигонуклеотидным микрочипом.
Двухцепочная РНК была синтезирована из 5-8 мкг суммарной РНК, используя Superscript RTII (Life
Technologies, Inc., Karlsruhe, Германия) и праймер (Eurogentec, Seraing, Бельгия), какой приводится в руководстве Affymetrix.
Транскрипция in vitro с использованием оборудования BioArray™ High Yield™ RNA Transcript Labelling Kit (ENZO Diagnostics, Inc., Farmingdale, Нью-Йорк), фрагментация, гибридизация на Affymetrix
U133A или U133 Plus 2.0 GeneChips (Affymetrix, Santa Clara, Канада) и окрашивание стрептавидиномфикоэритрином и биотинилированным антистрептавидиновым антителом (Molecular Probes, Leiden, Нидерланды), следуя указаниям изготовителя (Affymetrix). Использовался сканер Affymetrix GeneArray
Scanner, а данные анализировались программой Microarray Analysis Suite 5.0 или the GeneChip® Operating Software (GCOS). Для упорядочивания использовались 100 генов «домашнего хозяйства», предоставленных Affymetrix. Попарное сравнение просчитывалось с использованием значений экспрессии в почке
в качестве исходных данных. Следовательно, все значения экспрессии, подсчитанные с показаний сигнальной программы, соотносятся с почкой, которая задана значением 1. Значимость дифференцированной экспрессии оценивалась «переменными» показаниями, выводимыми статистическими алгоритмами,
заложенными в компьютерную программу. Для абсолютного определения экспрессии данные были проанализированы снова с использованием статистических алгоритмов. Присутствие или отсутствие генной
экспрессии определялось алгоритмами абсолютного вызова.
Перечень отдельной тканевой экспрессии для генной экспрессии протоонкогена c-Met (MET) представлен на фиг. 2. МЕТ был гиперэкспрессирован в 96% проанализированных почечно-клеточных карцином (n=24, справа), но не гиперэкспрессирован или в намного меньшей степени в нескольких выбранных жизненно важных здоровых тканях и органах, а также иммунологически важных тканях и клетках
(слева на фиг. 2).
В табл. 1 представлен обзор пептидов, содержащихся в вакцине по изобретению IMA, включая
также пептиды в соответствии с изобретением.
- 24 -
013466
Таблица 1. Пептиды в соответствии с настоящим изобретением
В табл. 2 представлен обзор результатов экспрессии для всех антигенов, кодирующих пептиды, содержащихся в вакцине по изобретению IMA, а также для пептидов в соответствии с изобретением.
Таблица 2. Частотность гиперэкспрессии антигенов в RCC (n=24)
1. В соответствии с «переменными» значениями статистических алгоритмов, имеющихся в компьютерной программе (количество «I»).
2. Число RCC с более высокой экспрессией по сравнению с нормальной тканью с наивысшей экспрессией среди всех нормальных тканей.
3. Мозг является иммунопривелегированным органом и не был учтен по этой причине.
Минимальная гиперэкспрессия в RCC в сравнении со всеми нормальными тканями составляет 54%,
максимально 96%. Это значительно выше, чем в случае стандартных опухолевых антигенов, таких как
Her-2/neu (распространение: 25-30%).
Исключением является MUC, где не могла быть выявлена гиперэкспрессия для MUC мРНК. Тем не
менее, необходимо принимать во внимание следующие публикации:
1. Аберрантная дегликолизация свойственна злокачественным опухолям и обнаруживает эпитопы в
опухолевых клетках, которые не должны быть представлены на нормальных клетках. Скорее всего, такой механизм проявляется также и в RCC. Это могло бы объяснить специфическое уничтожение опухолевых клеточных линий, экспрессирующих MUC (Brossart 1999). См. также главу 4.1.5 о свойствах MUC.
2. IMA-MUC-001 вводился в соединении с аутологичными дендритными клетками в рамках ини- 25 -
013466
циированного исследователями испытания в университете Тюбингена (Германия). В этом исследовании,
представленном недавно в ASCO 2003 (Mueller 2003), и последующих данных в ASCO 2005 (Wierecky
2005), не было заявлено ни о каких аутоиммунных эффектах.
3. Другие сообщения о клинических исследованиях показывают, что цитотоксические Т-клетки,
специфические для IMA-MUC-001, встречаются в естественных условиях (без иммунизации) у пациентов с карциномой груди (Rentzsch 2003) и колоректальной карциномой (Dittmann 2004). Для этих пациентов не было заявлено об аутоиммунных эффектах. Эти данные подчеркивают естественную роль IMAMUC-001-специфических Т-клеток.
Основываясь на этих дополнительных данных, введение IMA-MUC-001 может рассматриваться как
безопасное, хотя не может быть установлено гиперэкспрессии для антигена MUC отдельно на уровне
мРНК.
Беспорядочное связывание IMA-MMP-001 с несколькими аллелями HLA-DR
IMA-MMP-001 является пептидом, связывающимся с HLA-DR, молекулой HLA класса II. Пептиды
TUMAP II класса активируют Т-хелперные клетки, которые играют решающую роль в содействии функции цитотоксических Т-клеток, активированных пептидами TUMAP II класса. Беспорядочное связывание пептида HLA-DR важно для гарантии того, что большинство (>50%) HLA-А*02-положительных пациентов, проходящих лечение IMA, способны также проявлять Т-клеточный ответ на IMA-MMP-001.
Анализ связывания IMA-MMP-001 in silico указывает на то, что IMA-MMP-001 беспорядочно связывается с несколькими аллелями HLA-DR (DRB1*0101, *0301, *0401, *1101 и *1501), покрывая в целом по
крайней мере 69,6% HLA-A2-положительной европеоидной популяции. Беспорядочное связывание IMAMMP-001 подтверждено экспериментально in vitro данными по иммуногенности.
Принципы теста
Используя алгоритм SYFPEITHI, разработанный в Университете Тюбингена (Rammensee 1997;
Rammensee 1999), был составлен рейтинг для связывания IMA-MMP-001 с несколькими распространенными аллелями HLA-DR (см. таблицу ниже). Алгоритм успешно применялся для идентификации эпитопов I и II класса из обширного ряда антигенов, например, из человеческого ТАА TRP2 (класса I) (Sun
2000) и SSX2 (класса II) (Neumann 2004). Проанализированные аллели HLA-DR покрывают по крайней
мере 69,6% HLA-А2-положительного населения европеоидной расы (Mori 1997). Пороговое значение для
связывания было задано числом 18, основываясь на анализе опубликованных показателей связывания
для известных беспорядочно связывающихся лигандов HLA-DR. Беспорядочное связывание определяется как связывание пептида HLA-DR с несколькими аллелями HLA-DR, экспрессированными по крайней
мере у 50% европеоидного населения.
Локусы HLA-A и HLA-DR имеют неравномерное распределение связей (linkage disequilibrium), что
ведет к комбинациям HLA-A2 и специфических HLA-DR, которым отдается предпочтение по сравнению
с другими (табл. 3)
Таблица 3
Табл. 3. Частотность гаплотипа Северо-Американской европеоидной расы - приведены серологические гаплотипы. N.a. означает «не определено» (Mori 1997).
Лиганды конкретных молекул МНС содержат химически родственные аминокислоты на конкретных позициях их первичной последовательности, которая позволяет определение пептидного участка для
каждого аллеля МНС (Falk 1991). SYFPEITHI использует матрицы фрагментов, полученные из очищенных фрагментов, основываясь исключительно на анализе естественных лигандов с помощью метода деградации Эдмана и тандемной масс-спектрометрии (Schirle 2001). Эти матрицы позволяют точное прогнозирование пептидов из заданной белковой последовательности, презентированной на молекулах МНС
I или II класса (Rotzschke 1991).
- 26 -
013466
Таблица 4
Табл. 4. Показатели связывания IMA-MMP-001 с распространенными аллелями HLA-DR.
Приводятся показатели связывания по SYFPEITHI для IMA-MMP-001 для наиболее распространенных аллелей HLA-DRB1 среди европеоидного населения. Частота встречаемости соответствующих серологических гаплотипов HLA-А2-положительных европеоидов дана в скобках. Пептид рассматривался
как связывающийся с молекулой HLA, если показатель был равен или выше 18.
Основываясь на алгоритме прогнозирования SYFPEITHI, IMA-MMP-001, скорее всего, связывается
с несколькими аллелями HLA-DR (DRB1*0101, *0301, *0401, *1101 и *1501), покрывая по крайней мере
69,6% HLA-A2-положительной европеоидной популяции. Так как данные по частотности HLA-DR15 не
доступны, этот аллель не был включен в расчеты. Таким образом, велика вероятность того, что покрытие
населения даже выше, чем 69,6%. Экспериментальное подтверждение беспорядочного связывания IMAMMP-001 получено с помощью данных по иммуногенности in vitro (см. ниже).
Сравнение экспрессии антигена и презентация полученного пептида на опухолевой и
аутологичной нормальной ткани
Полагается, что гиперэкспрессированные антигены гиперэкспрессированы на молекулах HLA на их
клеточной поверхности. В отдельности было показано, что пептид HLA-A*03, полученный из Адипофилина, гиперэкспрессированного антигена, из которого получены HLA-A*02 пептиды IMA-ADF-001 и
IMA-ADF-002, содержащиеся оба в IMA, высоко гиперэкспрессирован на ткани почечно-клеточной карциномы по сравнению с аутологичной нормальной тканью пациента RCG100, применяя стратегию
QUALITEA. Это демонстрирует в этом отдельном случае, что гиперэкспрессия антигена (в данном случае Адипофилина) соотносима с гиперэкспрессией полученных из того же антигена пептидов.
Детально этот метод описывается у Lemmel 2004. QUALITEA представляет собой стратегию для
дифференциальной количественной оценки HLA-элюированных пептидов из опухолевой и нормальной
ткани. HLA лиганды, полученные из двух различных источников, дериватизированы по N-терминальной
области 1Hx - или 2Dx -реагентом и скомбинированы. После снижения сложности пептидов при высокоэффективной жидкостной хроматографии пептиды получили количественную характеристику анализом
ESI-MS в соответствии с их пиковыми областями. Пара дериватизированных пептидов (1Hxдериватизация и 2Dx-дериватизация) является физико-химически идентичной и легко обнаруживаемой,
так как она обязательно коэлюируется в хроматографических системах. В дальнейшем существует константная разница в массе, зарегистрированная масс-спектрометрическим сканированием. Эта разница
зависит от числа стабильных изотопов в производном. Идентификация последовательностей лиганда
показывается анализом ESI-MSMS и компьютерным поиском записанного спектра в банке данных. Таким образом, этот анализ обеспечивает информацией о качественных и количественных аспектах презентации пептидов на опухолевой и нормальной ткани.
Пример дифференциальной презентации пептида HLA на опухолевой и нормальной ткани гиперэкспрессированного антигена представлен на фиг. 8. Пептид IMA-ADF-003, гиперпрезентация которого
на опухолевой ткани была в 4 выше, чем на здоровой ткани почки пациента RCC100, был идентифицирован анализом индуцированного столкновением масс-спектра затухания среди множества равно презентированных пептидов. Этот гиперпрезентированный на опухолевой ткани пептид был получен из Адипофилина. Анализ генной экспрессии того же пациента RCC100 показывает также в 2,64 раза большую
гиперэкспрессию Адипофилина в этой опухолевой ткани по сравнению со здоровой почкой (данные не
приводятся). Эти данные подтверждают в этом конкретном случае, что гиперэкспрессия в опухолевой
ткани на генном уровне ведет к пептидной гиперпрезентации на поверхности опухолевой клетки.
Иммуногенность in vivo к IMA-ADF-001
В аутологичные дендритные клетки (DCs), полученные от пациентов с RCC, импульсным способом
были введены два пептида TUMAP, полученных из MUC, среди них был IMA-MUC-001. IMA-ADF-001 в
вакцинации не применялся. Вакцинации производились s.c. по четыре раза каждые две недели и повторялись ежемесячно до прогрессирования опухоли. После пятой инъекции DC пациенты получали дополнительно 3 инъекции в неделю низкой дозы ИЛ-2 (1 млн IE/m2) s.c. За активацией предшественника Тклетки наблюдалось с помощью оборудования IFN-гамма ELISPOT. Кроме индукции Т-клеток против
двух пептидов вакцинации была установлена активность также против нескольких других известных
TUMAP-пептидов, среди них - IMA-ADF-001.
Результаты были представлены в презентации Д-ра наук Петера Броссарта (Peter Brossart) (из Университета Тюбингена) на ежегодной встрече Американского общества клинической онкологии (ASCO)
2005, полная презентация опубликована на веб-сайте ASCO. У двух пациентов (pt #8 и pt #13) после вак- 27 -
013466
цинации двумя пептидами MUC, введенными импульсным способом в аутологичные DCs, был обнаружен Т-клеточный иммунитет к другим пептидам, отличающимся от вакцинированных (фиг. 9). Так как
этого иммунитета не было в наличии до вакцинации, то, скорее всего, что такие Т-клетки были индуцированы распространением эпитопов. Распространение эпитопов может происходить, если опухолевые
клетки разрываются (например, при некрозе, лизисе, вызванном индуцированными вакциной Т-клетками
итд.) и высвобождают антигены, которые затем поглощаются антигенпрезентирующими клетками (АПК,
например, дендритные клетки). Эти АПК могут затем процессировать антиген внутриклеточно и презентировать Т-клеточный эпитоп (т.е. TUMAP-пептид) для примирования Т-клеточных ответов. Эти данные
подчеркивают потенциально важную роль IMA-ADF-001 как встречающегося в естественных условиях
Т-клеточного антигена.
II. Приготовление и применение вакцины «IMA» в соответствии с изобретением.
IMA является вакциной, содержащей комплекс опухолеассоциированных пептидов, которые расположены и были идентифицированы на первичных клетках почечного рака. Этот комплекс включает пептиды HLA класса I и II. Пептидный комплекс содержит также один пептид из корового антигена HBV,
используемый в качестве пептида для положительного контроля, служащий как антигенный маркер для
проверки эффективности внутрикожного введения. При вакцинации пептидом, в общем, необходим
адъювант, так, ГМ-КСФ будет использован в качестве адъюванта в этой схеме вакцинации (человеческий
ГМ-КСФ имеется в продаже под названием Sargramostim, Leukine®, Berlex).
8 из 10 опухолеассоциированных пептидов, содержащихся в IMA, были идентифицированы с помощью технологии XPRESIDENT, описанной ниже. Поэтому для этих пептидов естественная презентация в контексте молекул HLA, экспрессированных опухолью, имеет прямое доказательство. Пептиды
IMA-MUC-001 и IMA-CCN-001 были идентифицированы с применением других технологий. Для двух
последних пептидов: естественная презентация этих пептидов опухолевыми клеточными линиями демонстрируется, основываясь на косвенных доказательствах из анализа иммуногенности in vitro (см. ниже).
Принципы теста
Молекулы HLA из подвергнутой шоковой заморозке процессированной первичной ткани почечноклеточной карциномы были очищены, и были изолированы HLA-ассоциированные пептиды. Эти пептиды либо разделяются в оффлайновом режиме методом ВЭЖХ, а фракции анализируются, или же анализ
последовательности производится масс-спектрометрией в интерактивном режиме методами ВЭЖХтандемная масс-спектрометрия. Полученные последовательности проверяются синтезом идентифицированных пептидов и сравнением фрагментационных спектров идентифицированных и синтезированных
пептидов. Так как идентифицированные пептиды непосредственно получены из молекул HLA первичных опухолей, то эти результаты дают прямое доказательство естественного процессирования и презентации идентифицированных пептидов на первичной ткани почечно-клеточной карциномы.
Метод
Детально этот метод описывается в работе (Weinschenk 2002). Вкратце, подвергнутые шоковой заморозке пробы пациентов, полученные из Департамента Урологии Университета Тюбингена (одобрено
местным этическим комитетом), были лизированы, молекулы HLA были очищены афинной хроматографией с использованием HLA класса I-специфического антитела W6/32 или HLA-А*02-специфического
антитела ВВ7.2 или (в случае IMA-ММР-001) HLA-DR-специфического антитела L243. HLAассоциированные пептиды были элюированы обработкой кислотой и изолированы из белка МНС с альфа-цепью ультрафильтрацией. Изолированные пептиды были либо разделены в оффлайновом режиме
обратнофазной высокоэффективной жидкостной хроматографией, а фракции проанализированы наноэлектроспрей масс-спектрометрией на гибридном квадрупольном время-пролётном тандемном массспектрометре с ортогональным ускорением ионов (Q-TOF I или Q-TOF Ultima, Waters), или же был произведен анализ в интерактивном режиме ЖХ-МС/МС с использованием той же техники. Холостой ход
использовался всегда для гарантии того, что система чиста от пептидов. Калибровка приборов производилась по крайней мере раз в день, также с надлежащей периодичностью проводились анализы стандартных соединений для гарантии оптимальной работы систем. Интерпретация фрагментационных спектров производилась вручную. Проверка анализа производилась поиском в банке данных и твердофазным
синтезом предполагаемой пептидной последовательности и сравнением фрагментационных спектров
идентифицированного и синтезированного пептидов. Все пептиды, содержащиеся в IMA (данные не приводятся), исключая IMA-MUC-001 и IMA-CCN-001, были идентифицированы в идентичной форме, подтверждая естественную презентацию этих пептидов на первичной ткани почечно-клеточной карциномы.
Ингредиенты IMA
Пептиды для этой клинической разработки синтезируются стандартным и общепринятым способом
Fmoc. Очищение производится препаративной ВЭЖХ и ионным обменом. Особенно важно, что принадлежность и чистота пептидов могут быть легко определены, причем с высокой точностью, с помощью
масс-спектрометрии и ВЭЖХ. Композиция IMA состоит из 11 отдельных лекарственных веществ, которые более детально описываются ниже.
- 28 -
013466
Таблица 5. Антигены в IMA
Все пептиды синтезированы по твердофазной методологии Fmoc и очищены ВЭЖХ и хроматографией ионного обмена до чистоты в >95%. Правильность структуры определялась аминокислотным анализом и масс-спектрометрией.
Таблица 6. Физико-химические характеристики пептидов в IMA
Лекарственный препарат IMA, представленный в качестве лиофилизата для внутрикожного введения, содержит 11 пептидов - 578 мкг каждого пептида - в форме их солей (ацетаты). Для введения фор- 29 -
013466
мулы клинического испытания пациентам порошок для инъекции, содержащий 578 мкг каждого пептида,
растворяется в 700 мкл гидрокарбоната натрия (4,2%). После восстановления раствора 500 мкл (равняется разовой дозе в 413 мкг каждого пептида на инъекцию и общей разовой дозе в 4,5 мг IMA на инъекцию) вводятся внутрикожно.
Таблица 7. Другие ингредиенты в IMA
* удаляются во время производства
Качество IMA гарантируется как при использовании активных веществ, так и инертных носителей,
которые соответствуют требованиям ЕФ.
Иммуногенность in vitro пептидов, содержащихся в IMA
В IMA содержатся 9 опухолеассоциированных пептидов HLA I класса, 1 опухолеассоциированный
пептид HLA II класса и 1 виральный контрольный пептид HLA I класса. Иммуногенность in vitro могла
быть продемонстрирована для подавляющего большинства пептидов, содержащихся в IMA.
Иммуногенность in vitro была продемонстрирована для 8 из 10 последовательностей HLA I класса,
содержащихся в IMA, используя, в основном, два Т-клеточных анализа: А) цитотоксическое уничтожение клеток-мишеней в анализе с высвобождением хрома и/или В) обнаружение Т-клеток тетрамерами
HLA. Эти анализы демонстрируют доказательство присутствия специфических клеток-предшественников в крови HLA-А*02-положительных доноров в равной степени, как и способность таких специфических Т-клеток уничтожать клетки-мишени. Как и в последующем случае распознаются несколько
опухолевых клеточных линий, эндогенно экспрессирующих антиген. Это служит дополнительным (непрямым) индикатором естественной презентации использованных пептидов на опухолевых клетках и
показывает, что цитотоксические Т-клетки, полученные при использовании этих пептидов имеют сильную авидность к распознаванию опухолевых клеток. Иммуногенность in vitro была продемонстрирована
для пептида HLA II класса IMA-ММР-001, содержащегося в IMA, с использованием внутриклеточного
окрашивания цитокинов в проточной цитометрии (см. ниже).
Таблица 8. Обобщение данных об иммуногенности in vitro пептидов, содержащихся в IMA
Анализ на киллерные клетки цитотоксическое уничтожение мишеней, измеренное анализом с высвобождением хрома; Высвобождение цитокинов: высвобождение цитокинов Т-клеток измерялось методом ELISA; Окрашивание цитокинов: синтез цитокинов Т-клетками измерялся внутриклеточной проточной цитометрией; Тетрамерная детекция: детекция пептид-специфических Т-клеток тетрамерами HLA.
Иммуногенность in vitro пептидов HLA I класса, содержащихся в IMA
IMA содержит 10 пептидов, связывающихся с HLA I класса. Чтобы проверить пептиды на их иммуногенность in vitro, были получены CD8-положительные цитотоксические Т-клетки из аутологичных
моноцитов периферической крови (МПК) от здоровых доноров с использованием отдельных пептидов,
содержащихся в IMA, а активность этих цитотоксических Т-клеток контролировалась анализом с высвобождением хрома и детекцией Т-клеток тетрамерами HLA в поточной цитометрии. Подробные данные
представлены для одного отдельного пептида (IMA-MET-001) для обоих методов, данные для других
- 30 -
013466
пептидов обобщаются в табл. 8, выше.
На первой стадии генерируются (примируются) in vitro цитотоксические Т-клетки при повторной
стимуляции моноцитов периферической крови (МПК) здоровых HLA-А*02-положительных доноров
специфическим пептидом, являющимся объектом теста. Примирование может быть произведено также с
использованием аутологичных дендритных клеток, полученных из моноцитов крови донора, или нагруженных тетрамером гранул HLA.
A. Цитотоксическое уничтожение мишени.
На второй стадии цитотоксичность таких примированных цитотоксических Т-клеток (ЦТЛ) проверяется маркировкой клеток-мишеней радиоактивным хромом и инкубацией клеток-мишеней с полученными ЦТЛ. Количество радиоактивного хрома, высвободившегося в супернатант, может быть соотнесено напрямую с пропорцией уничтоженных клеток-мишеней.
B. Детекция Т-клеток тетрамерами HLA.
Альтернативно на второй стадии примированные ЦТЛ со специфичностью для заданного пептида
детектируются с использованием тетрамеров HLA. Тетрамеры состоят из четырех нагруженных пептидом молекул HLA-A*02, соединенных друг с другом. Эти конструкции позволяют произвести специфическую маркировку родственного Т-клеточного рецептора, распознающего HLA-пептидный комплекс в
тетрамере и при маркировке тетрамера флуорохромом с последующим анализом проточной цитометрией
(FACS).
Примирование цитотоксических Т-клеток дендритными клетками
Для возбуждения ЦТЛ в 5×105 DC было введено импульсным способом 50 мкг/мл синтетического
пептида IMA-MET-001 на 2 ч, потом их промыли и инкубировали с 2,5×106 аутологичных МПК в среде
RP10. После 7 дней культивации клетки были рестимулированы аутологичными МПК с введенным импульсным способом пептидом, и 1 нг/мл человеческого рекомбинантного ИЛ-2 (R&D Systems) добавлялся в 1, 3 и 5 день. Цитотоксическая активность индуцированных ЦТЛ анализировалась на 5 день после
последней рестимуляции стандартным способом с хромом-51(Brossart 1999) (см. ниже).
Примирование in vitro цитотоксических Т-клеток нагруженными тетрамером гранулами
Примирование in vitro производилось, как было указано ранее (Walter 2003) или с минимальными
модификациями. Вкратце, биотинилированные рекомбинантные молекулы HLA-A*0201, в которых не
хватает трансмембранного домена и которые были биотинилированы на карбоксильном конце тяжелой
цепи, были получены, как описывалось ранее (Altman 1996). Очищенный костимулированный мышиный
IgG2a к антителам человека CD28 Ab 9.3 (Jung 1987) был химически биотинилирован с использованием
сульфо-N-гидроксисукцинимидобиотина в условиях, рекомендуемых изготовителем (Perbio Science,
Bonn, Германия). Использованные микросферы были покрытыми стрептавидином полистироловыми
частицами с диаметром 5,60 мкм со связывающей силой в прибл. 0,06 мкг биотин-FITC/мг микросфер
(Bangs Laboratories, Fishers, Illinois/США). Для работы с микросферой использовался стерильный буфер
PBS/BSA/EDTA. Для соединения с биотинилированными молекулами микросферы промывались и ресуспендировались в 2×106 частиц/мл в буфере, содержащем биотинилированный МНС и/или антитела в
различных концентрациях. Связывание было возможно при комнатной температуре в течение 30 мин
при постоянном перемешивании. Покрытые гранулы промывались три раза, ресуспендировались в указанном выше буфере и хранились до 4 недель при 4°С до использования.
МПК изолировались из свежей лейкоцитарной пленки с использованием стандартной среды для
градиентного разделения (Linaris, Wertheim-Bettingen, Germany or PAA Laboratories, Linz, Австрия). При
необходимости незатронутые CD8 Т-клетки были магнетически обогащены негативной элиминацией с
использованием оборудования по изоляции CD8 Т-клеток (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Германия)
в соответствии с предписаниями производителя, результатом чего была чистота CD8-положительных
ТКР-положительных клеток в более чем 80%. Стимуляции in vitro были инициированы в 24-луночных
планшетах с 5×106 реактивных клеток плюс 1×106 АПК или микросфер на лунку в 1,5 мл Т-клеточной
среды. Если не указано иного, 5 нг/мл человеческого ИЛ-12 р70 (R&D) добавлялось вместе с АПК или
микросферами. После 3-4 дней коинкубации при 37°С добавлялась свежая среда и 20 U/мл человеческого
ИЛ-2 (R&D), а клетки затем инкубировались далее при 37°С в течение 3-4 дней. Этот цикл стимуляций
повторялся дважды.
Уничтожение клеток-мишеней ЦТЛ при использовании теста с высвобождением хрома
Проводился стандартный анализ с хромом-51 в соответствии с описанием (Brossart 2001). В клеткимишени вводилось импульсным способом 50 мкг/мл пептида на 2 ч, и они помечались хроматом натрия
51
Cr в среде RP10 на 1 ч при 37°С. 104 клеток были перенесены в лунку круглодонного 96-луночного
планшета. Различное число ЦТЛ добавлялось для получения окончательного объема в 200 мкл, и проводилась инкубация в течение 4 ч при 37°С. В конце анализа супернатанты (50 мкл/лунка) были собраны и
посчитаны на планшетном бета-счетчике. Процентно-специфический лизис подсчитывался как:
100×(экспериментальное высвобождение - спонтанное высвобождение/максимальное высвобождениеспонтанное высвобождение). Спонтанное и максимальное высвобождение были определены в присутствии либо среды, либо 2% Triton Х-100, соответственно. Антигенная специфичность лизиса опухолевых
- 31 -
013466
клеток определялась далее анализом ингибирования немечеными клетками-мишенями при анализе способности немеченых клеток Т2 с введенным импульсным способом пептидом блокировать лизис опухолевых клеток при соотношении 20:1 (ингибитор:мишень).
В. Детекция цитотоксических Т-клеток тетрамерами HLA.
Окрашивание тетрамеров in vitro производилось, как было указано ранее (Walter 2003) или с минимальными модификациями. Вкратце, биотинилированные рекомбинантные молекулы HLA-A*0201, в
которых не хватает трансмембранного домена и которые были биотинилированы на карбоксильном конце тяжелой цепи, были получены, как описывалось ранее (Alman 1996). Флуоресцирующие тетрамеры
были получены при ко-инкубации биотинилированного HLA-A*0201 со стрептавидином-РЕ (белковый
эквивалент) или стрептавидином-АРС (Molecular Probes, Leiden, Нидерланды) при соотношении 4:1, молярное соотношение. Для тетрамерного анализа клетки промывались в PBS/BSA/EDTA, содержащем 10
мг/мл азида натрия (Merck, Darmstadt, Германия), и окрашивались при 4°С в течение 20 мин в том же
буфере, содержащем антитела CD4-FITC и CD8-PerCP клона SK1 (оба из Becton Dickinson). После экспериментов по стимуляции микросферой добавлялось 100 мкг/мл немеченого стрептавидина (Sigma).
Клетки промывались в забуференном фосфатом физиологическом растворе (PBS), содержащем 2% инактивированной нагреванием фетальной телячьей сыворотки (FCS) (PAN Biotech, Aidenbach, Германия), 2
мМ натриевой ЭДТУ (EDTA) и 10 мг/мл азида натрия, и тетрамер окрашивался при 4°С в течение 30 мин
в растворе PBS/FCS/EDTA/азид, но включающем 50% FCS. Тетрамерные реагенты использовались всегда при концентрациях МНС в 5 мкг/мл. Окрашенные клетки тщательно промывались в PBS/FCS/
EDTA/азид и обрабатывались 1% формальдегидом (Merck). Клетки анализировались на четырехцветном
сортере с активацией флуоресценции FACSCalibur (Becton Dickinson). Отдельные результаты рассматриваются детально для IMA-MET-001 по методу А, а также и по методу В. Результаты для других пептидов
HLA I класса обобщаются в табл. 8.
А. Цитотоксическое уничтожение мишени.
Результаты были опубликованы у Schag 2004. Релевантная информация обобщена ниже.
На первой стадии цитотоксичность индуцированных ЦТЛ была проанализирована стандартным методом с высвобождением хрома-51 с использованием нагруженных пептидом клеток Т2 и аутологичных
DC в качестве мишеней. Как показано на фиг. 3, линия ЦТЛ, полученная после двухнедельных рестимуляций демонстрировала антигенспецифическое уничтожение. Т-клетки распознавали только клетки Т2
или DC, покрытые родственным пептидом, в то время как они не лизировали клетки-мишени с введенными импульсным способом нерелевантными HLA-А2-связывающими пептидами, полученными из белка сурвивина или обратной транскриптазы HIV-1, подтверждая специфичность цитолитической активности.
На второй стадии анализировалась способность индуцированных in vitro ЦТЛ лизировать опухолевые клетки, экспрессирующие белок c-Met эндогенно, с использованием HLA-А*02-положительных клеточных линий НСТ 116 (рак толстой кишки), А498, MZ 1257 (почечно-клеточная карцинома, RCC),
MCF-7 (рак груди), Mel 1479 (злокачественная меланома) и U266 (множественная меланома), экспрессирующая c-Met как мишени при стандартном анализе с хромом-51. Трансформированная EBV Вклеточная линия Croft (HLA-2+/c-Met-) и клеточная линия рака яичников SK-OV-3 (HLA-A3+/c-Met+)
инкубировались для определения специфичности и HLA-рестрикции для ЦТЛ. Как показано на фиг. 4,
ЦТЛ, специфические для пептида c-Met, были способны эффективно лизировать злокачественные клетки, экспрессирующие как HLA-A2, так и c-Met. Не были распознаны раковые клетки яичника SK-OV-3
или клетки Croft, демонстрируя, что презентация пептида c-Met в контексте молекул HLA-A2 на опухолевых клетках необходима для эффективного лизиса клеток-мишеней, и подтверждая антигенспецифичность и МНС-рестрикцию ЦТЛ. Индуцированные in vitro Т-клетки не распознавали клетки K 562, указывая на то, что цитотоксическая активность не была опосредована NK-клетками.
Для дальнейшей верификации антигенной специфичности и МНС-рестрикции индуцированных in
vitro линий ЦТЛ мы провели анализы ингибирования немечеными клетками-мишенями. Лизис клетокмишеней (U 266 и А 498) мог быть блокирован при анализе ингибирования немечеными мишенями. Добавление «холодных» (немеченых хромом-51) клеток Т2 с введенным импульсным способом родственным пептидом снижал лизис опухолевых клеток, причем клетки Т2 с введенным импульсным способом
нерелевантным пептидом не проявляли никакого эффекта (фиг. 5).
В. Детекция Т-клеток тетрамерами HLA.
Обогащенные CD8 Т-клетки одного здорового донора А*02+ были простимулированы 3 раза гранулами, покрытыми в присутствии 10 нМ CD28 Ab плюс либо 10 нМ нерелевантного комплекса А*02
(левая секция), либо А*02, покрытым указанным антигеном (средняя и правая секция). Указанными антигенами были пептиды NLVPMVATV из CMV pp65 (Wills 1996), модифицированный пептид ELAGIGILTV из Melan-A/MART-1 (Kawakami 1994) и пептид IMA-MET-001. У всех Т-клеточных линий поверхность была окрашена антителом CD8-PerCP Ab, родственным тетрамером-РЕ (белковый эквивалент)
(фиг. 6; левая и средняя секция) и нерелевантным A*02/ILKEPVHGV тетрамером-АРС (правая секция).
Процентное отношение клеток тетрамера+ среди CD8-положительных лимфоцитов определено в каждой
точке.
- 32 -
013466
Иммуногенность in vitro пептида IMA-MMP-001 HLA II класса, содержащегося в IMA
IMA содержит один пептид HLA II класса из матричной металлопротеиназы 7, IMA-MMP-001. Для
проверки пептида на его иммуногенность in vitro и на его свойства по беспорядочному связыванию были
генерированы CD4-положительные Т-клетки из аутологичных моноцитов периферической крови (МПК)
здоровых доноров с различными генотипами HLA с использованием пептида IMA-MMP-001, и активность этих хелперных Т-клеток измерялась методом проточной цитометрии с внутриклеточным окрашиванием цитокинов.
Сначала in vitro генерируются (примируются) цитотоксические Т-клетки при повторной стимуляции моноцитов периферической крови (МПК) здоровых доноров специфическим тестируемым пептидом
в присутствии ИЛ-12.
Примирование производилось с использованием аутологичных дендритных клеток, полученных из
моноцитов крови доноров. На второй стадии проверялась активность примированных CD4положительных Т-клеток, специфических для данного пептида, с помощью измерения выделения IFNγ
при внутриклеточном окрашивании IFNγ с использованием флюоресцентно меченого антитела. Анализ
проводился методом проточной цитометрии (FACS).
Получение дендритных клеток (DCs)
Человеческие DCs были приготовлены из МПК свежевзятой крови здоровых доноров. МПК были
изолированы с помощью градиента плотности (Фиколл) (Lymphocyte Separation Medium, PAA Laboratories GmbH, Pasching, Австрия). Полученные клетки были промыты, ресуспендированы в среде Х-Vivo 15
с добавлением 50 U/мл пенициллина, 50 мкг/мл стрептомицина и 2мМ L-Глютамина (BioWhittaker,
Venders, Бельгия) и высеяны с плотностью в 7×106 клеток/мл. После 2 ч при 37°С адгезивные моноциты
культивировались в течение 6 дней в среде X-Vivo с 100 нг/мл GM-CSF (гранулоцитарномакрофагальный колониестимулирующий фактор) и 40 нг/мл ИЛ-4 (AL-ImmunoTools, Friesoythe, Германия). На 7ой день незрелые DCs были активированы 10 нг/мл TNF-α (R&D Systems, Wiesbaden, Германия)
и 20 мкг/мл poly(IC) (Sigma Aldrich, Steinheim, Германия) на 3 дня. Состояние дифференциации DCs исследовалось проточной цитометрией, зрелыми DCs были, преимущественно, CD14-, CD40положительные, CD80-положительные, CD83-положительные, CD86-положительные и HLA-DR+ (данные не приводятся).
Получение антигенспецифических CD4-положительных Т-клеток
Для получения CD4-положительных Т-клеток 106 МПК были простимулированы 2×105 аутологичными DCs. После примирования каждые 6-8 дней производились рестимуляции замороженными аутологичными МПК. Для стимуляции в клетки вводилось импульсным способом 5 мкг/мл пептида на 90 мин.
при 37°С, и клетки облучались (60 Gy; Gammacell 1000 Elite, Nordion International Inc, Ontario, Канада).
Клетки культивировались в 96-луночных планшетах (7 лунок на донора и пептид) в Т-клеточной среде:
RPMI 1640, содержащей HEPES и L-глютамин (Gibco, Paisley, Великобритания) с добавлением 10%
инактивированной нагреванием человеческой сыворотки (РАА, Cölbe, Германия), 50 U/мл пенициллина,
50 мкг/мл стрептомицина и 20 мкг/мл гентамицина (BioWhittaker) в присутствии 10 нг/мл ИЛ-12 (Promocell, Heidelberg, Германия). После 3-4 дней ко-инкубации при 37°С добавлялась свежая среда с 80 U/мл
ИЛ-2 (Proleukin, Chiron Corporation, Emeryville, CA, США) и 5 нг/мл ИЛ-7 (Promocell). Анализы проводились после третьей и четвертой стимуляции внутриклеточным окрашиванием IFNγ.
Внутриклеточное окрашивание IFNγ
Замороженные МПК размораживались, промывались дважды в среде Х-Vivo 15, ресуспендировались при 107 клеток/мл в Т-клеточной среде и культивировались в течение ночи для снижения неспецифической выработки IFNγ (Provenzano 2002). На следующий день в МПК вводилось импульсным способом 5 мкг/мл пептида в течение 2 ч, они промывались трижды средой X-Vivo 15 и инкубировались с эффекторными клетками в соотношении 1:1 в течение 6 ч. Golgi-Stop (Becton Dickinson, Heidelberg, Германия) добавлялся для заключительных 4 ч инкубации. Клетки анализировались с использованием комплекта Cytofix/Cytoperm Plus (Becton Dickinson) и CD4-FITC- (Immunotools), IFNγ-PE- и антител CD8PerCP клон SK1 (Becton Dickinson). После окрашивания клетки анализировались на трехцветном сортере
с активацией флуоресценции FACSCalibur (Becton Dickinson).
Для генерации антигенспецифических CD4-положительных Т-клеток и для проверки пептидов на
беспорядочное связывание МПК 4 здоровых доноров с разными аллелями HLA-DR (фиг. 7), были простимулированы с использованием аутологичных дендритных клеток с введенным импульсным методом
пептидом. Для системы обработки данных для генерирования антигенспецифических CD4положительных Т-клеток выработка IFNγ была измерена проточной цитометрией. Т-клетки были проанализированы после третьей и четвертой стимуляции внутриклеточным окрашиванием IFNγ плюс окрашивание CD4-FITC и CD8-PerCP для определения процентного выражения IFNγ-вырабатывающих
клеток в специфических Т-клеточных субпопуляциях. Во всех экспериментах стимуляции с нерелевантным пептидом и без пептида производились в качестве отрицательного контроля. IFNγ-ответ рассматривался как положительный, если детекция IFNγ-вырабатывающих CD4-положительных Т-клеток была
более чем в два раза выше в сравнении с отрицательным контролем. (Horton 2004). Нам удалось генери- 33 -
013466
ровать в трех из четырех доноров CD4-положительные Т-клетки, специфически реагирующие на интересующий пептид (фиг. 7). Т-клеточные ответы не могли быть установлены у донора 4, ни после третьей,
ни после четвертой стимуляции. Наиболее высокие частотности IFNγ-продуцирующих CD4положительных Т-клеток, специфических для пептида IMA-MMP-001, были обнаружены у доноров 1 и
2, соответственно.
Таким образом, IMA-MMP-001 является беспорядочно связывающимся пептидом, который был в
состоянии вызвать CD4-положительные Т-клеточные ответы у трех из четырех здоровых доноров,
имеющих различные аллели HLA. В соответствии с прогнозами по связыванию и полученными результатами, скорее всего, пептид презентируется HLA-DRB1*0101, HLA-DRBl*0401/*0408 и HLADRB1*1101. Все четыре аллеля имеют глициновый остаток в положении 86 и остаток аспарагиновой кислоты в положении 57 их β-цепей (данные не приводятся). Поэтому они имеют очень похожие участки
для связывания с похожими характеристиками для их связывающих карманов Р1 и Р4 (Rammensee 1997;
Hammer 1993; Marshall 1994). Донор 4 имеет аллели HLA-DRB1*0318 и DRB1*1401 с сильно отличающимися участками связывания. Это может объяснить, почему было невозможно вызвать Т-клеточные
ответы в клетках этого донора, используя упомянутые выше пептиды.
Влияние на человека
Короткие пептиды, сходные с описанными здесь по длине и распределению аминокислот, были
введены тысячам пациентов во время различных фаз, с 1 по 3, клинических испытаний с 1996. Ни в одном из этих исследований не сообщается о серьезных побочных явлениях. К тому же пептид IMA-MUC001, содержащийся в IMA, был уже применен для вакцинации путем нагружения на дендритные клетки в
рамках начатых исследователями испытаний в Университете Тюбингена в Германии и переносился пациентами очень хорошо (Wierecky 2005).
Пептиды с последовательностями SEQ-ID-№ 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 были протестированы на 30
пациентах, 26 из которых прошли полный курс вакцинации в течение десяти недель. Большая часть пациентов, 74%, проявила специфический иммунный ответ против пептидных последовательностей, включенных в вакцину. Уже у этой небольшой когорты на фазе I могли быть подтверждены биологические
функции in vivo 8 из 9 пептидов (SEQ-ID-№ 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9), связывающихся с МНС класса I (аллель
HLA-A*02), в соответствии с результатами амиплифицированных анализов ELISPOT и/или тетрамерного
окрашивания, проведенными, как описывается ниже. Пептид с последовательностью SEQ-ID-№ 1 (IMAMMP-001), для которого необходимы другие рамки считывания, не мог быть проконтролирован из-за
недостатка МПК из крови пациента.
Специфические иммунологические параметры (иммуномониторинг)
До сих пор иммуномониторинг был распространенной практикой для тысяч пациентов в рамках
различных исследований по терапевтической вакцинации (Romero 2004). До сих пор сообщалось о многих различных методах иммуномониторинга, включая функциональные и специфические подходы. Иммуногенными компонентами терапевтической вакцины IMA являются HLA-связывающие пептиды.
Предполагается, что они индуцируют специфические Т-лимфоциты in vivo. Эта активация приведет к их
пролиферации и приобретению эффекторных функций, что включает их способность к секреции цитокинов при контактировании с антигеном.
В качестве заменителя маркера для Т-клеточной активации может быть протестирована частотность
специфических мононуклеарных клеток в крови, секретирующих цитокины, с использованием анализа
ELISPOT. Такие анализы особенно подходят для этой цели, так как только они основаны на клетках и
дают результаты в параметрах (т.е. число клеток, образующих ореол, среди мононуклеарных клеток),
что, как ожидается, должно напрямую соотноситься с действительной частотностью секретирующих цитокины антигенспецифических Т-лимфоцитов в пробах крови. В этой связи анализы также позволяют
процессинг относительно большого числа проб и пептидов параллельно. Они уже широко применялись
для исследований по иммуномониторингу в большом количестве клинических исследований (Schmittel
2000).
Иммунный ответ
Иммунологическая активность/эффективность может быть описана анализом Т-клеточного ответа.
Опыт и результаты из различных клинических исследований в отношении иммунного ответа для различных показаний представлены в литературе. Т-клеточные ответы до 100% у пациентов с раком яичника и
груди описываются в работе Disis et al., 1999. О распространении эпитопов у 84% пациентов (n = 64) в
параллельном исследовании с 3-мя группами с антигеном Her2/neu плюс ГМ-КСФ сообщается у Disis et
al. в 2002, пациенты с раком яичников, молочной железы и немелкоклеточным раком легкого. Другие
авторы опубликовали результаты по Т-клеточным ответам, находящиеся в пределах 33% и 83% для пациентов с меланомой (Keilholz/Schadendorf, 2003; Slingluff et al., 2004). Авторы Gaudernack/Gjertsen, 2003
сообщают об иммунном ответе нескольких CD4-положительных и CD8-положительных Т-клеточных
клонов, специфических для антигена, использованного в этом исследовании.
Также результаты были представлены в работе Wierecky et al., ASCO 2005: в аутологичные зрелые
дендритные клетки из моноцитов (DC) были введены импульсным способом два связывающихся с HLA- 34 -
013466
A2 пептида, выведенные из пептида MUC1. Для рекрутинга и активации CD4-положительных Т-клеток
DC инкубировались в дальнейшем со связывающими PAN-DR пептидами PADRE. Вакцинации производились s.c. по четыре раза каждые две недели и повторялись ежемесячно до прогрессирования опухоли в
этом терапевтическом подходе. После пятой инъекции DC пациенты получали дополнительно 3 инъекции в неделю низкой дозы ИЛ-2 (1 млн. IE/m2). За активацией предшественника Т-клетки наблюдалось с
помощью оборудования IFN-γ ELISPOT и анализов с радиоактивным хромом. Кроме того, способность
МПК вырабатывать цитокины в ответ на вызов связанных с вакциной эпитопов контролировалась количественным ПЦР-анализом в реальном времени.
В исследовании Wierecky et al. специфические Т-клеточные ответы на пептид MUC1 in vivo были
обнаружены в МПК всех пациентов с объективными ответами. Эти индуцированные in vivo Т-клетки
были способны распознавать клетки-мишени с введенным импульсным способом родственным пептидом или совместимыми аллогенными опухолевыми клетками (А498), конститутивно экспрессирующими
MUC1 антиген- и HLA-рестриктивным способом после рестимуляции in vivo. У пациентов с реакцией на
лечение могли быть установлены Т-клеточные ответы на антигены, не использованные для вакцинации,
такие как адипофилин, теломераза или OFA, указывая на то, что может наблюдаться распространение
эпитопа. Пролиферативный ответ на пептид PADRE был отмечен у 11 из 16 пациентов, у некоторых пациентов уже после 2ой вакцинации. Заключение: анализ распространения эпитопов у вакцинированных
пациентов может быть практическим параметром для соотношения клинических и иммунологических
ответов.
Иммунные ответы in vivo
Композиция для клинических испытаний
Композиция для клинических испытаний IMA состоит из
лиофилизата, включающего 11 пептидов в ампулах по 3 мл;
разбавителя (гидрокарбонат натрия 4,2%).
Формы дозировки IMA
Порошок для инъекций в стеклянных ампулах по 3 мл. Информация об упаковке: по 4 ампулы упакованы в коробочки. Разбавитель состоит из 700 мкл гидрокарбоната натрия, упакованного в бутылки по
250 мл. 1 ампула IMA перерастворяется при добавлении 700 мкл раствора 4,2% гидрокарбоната натрия
(разбавитель). Для растворения IMA ампула и разбавитель тщательно встряхиваются в течение 3 мин и
обрабатываются ультразвуком 1 мин. Затем ампула снова встряхивается в течение 1 мин. 500 мкл этого
раствора вводятся в течение 30 мин после восстановления.
Вакцинация
В рамках данного исследования пациенты с распространенной почечно-клеточной карциномой
проходили вакцинацию восемь раз в течение десяти недель. В общем было задействовано 24 пациента с
HLA-А*02-положительным HLA-типом. Внутрикожная вакцинация (ГМ-КСФ плюс IMA) проводилась в
1, 2, 3, 8, 15, 22, 36 и 64 день. Пробы крови брались в различные моменты времени во время исследования, и Т-клетки, содержащиеся в мононуклеарах периферической крови пациента (МПК), были изолированы из гепариновой крови градиентным центрифугированием с высокой плотностью, посчитаны с помощью гемоцитомеров и законсервированы для хранения при криогенной температуре до проведения
анализов. С кандидатом были проведены два стандартных анализа по методике ELISPOT и один стандартный тетрамерный анализ.
Амплифицированный анализ ELISPOT
Для анализа по методике «ex vivo ELISPOT» клетки с различными датами получения размораживались, подсчитывалось число живых клеток, и пробы подвергались анализу однодневной инкубацией с
различными пептидами или контролями в трипликатных лунках. Анализ ex vivo по методике ELISPOT
предоставляет количественные данные намного быстрее, чем приведенные ниже анализы. Кроме того,
это единственный метод, позволяющий измерение одного пептида HLA II класса (IMA-MMP-001), содержащегося в IMA. Однако этот анализ имеет ограниченную чувствительность, и положительные данные ожидались только в случае очень сильных Т-клеточных ответов в сравнении с иммунными ответами
на вирусы из памяти (вторичными).
В «амплифицированном анализе ELISPOT» клетки с различными датами получения объединяются,
пересчитываются и предварительно стимулируются антигенами в течение приблизительно двух недель
для обеспечения деления специфических клеток. Затем клетки извлекаются из культуры, снова пересчитываются и анализируются, как описано выше на точечную выработку IFN-γ при однодневной рестимуляции антигеном. Клетки, активированные в таких условиях, секретируют IFN-γ, который был обнаружен иммуноферментным сэндвич-методом для антител. Точки были визуализированы при реакции окрашивания и посчитаны с помощью автоматического цифрового фотоаппарата с высоким разрешением
(называющегося здесь «ELISPOT-ридер»). Число точек, соотносимое с действительной частотностью
активированных антигенспецифических Т-лимфоцитов в пробе, определяется по алгоритму компьютерной программы с изображений, полученных ELISPOT-ридером. Этот анализ часто использовался для
выявления Т-клеточных ответов на введенные с вакциной опухолевые антигены в рамках проводимых
- 35 -
013466
третьими лицами различных клинических испытаний. Возможность ложных положительных данных в
связи с Т-клеточным «примированием in vitro» исключена при использовании в этом анализе различных
контролей. В сравнении с тетрамерным анализом, описанным ниже, этот анализ дает дополнительную
целесообразную информацию, т.е. высвобождение цитокинов IFN-γ.
Амплифицированный анализ ELISPOT был применен для 28 пациентов во время исследования, и
все антигены присутствуют в IMA до и во время курса вакцинации в различные моменты времени. На
фиг. 10 представлены репрезентативные примеры IMA-индуцированного Т-клеточного ответа, выявленного амплифицированным анализом ELISPOT для одного и того же пациента и антигена. Верхняя и
нижняя колонка представляют отрицательный контрольный антиген HIV-001 и отдельный TUMAP IMACCN-001, использованный для считывания, соответственно. Дается число положительных клеток для
каждого эксперимента. В левой колонке представлены анализы ELISPOT объединенных проб до вакцинации, в то время как в правой колонке показаны анализы ELISPOT объединенных проб во время курса
вакцинации. В то время как контрольный антиген не вел к увеличению числа точек после индукции иммунного ответа, инъекция IMA вела к увеличению числа точек для IMA-CCN-001. Число положительных, т.е. IFN-γ секретирующих клеток, выросло от 27-34 до вакцинации до 100-141 после четвертой и
пятой инъекции. Лечение IMA привело к росту частотности активированных Т-лимфоцитов, специфических для антигена IMA-CCN-001 у этого пациента.
Амплифицированный тетрамерный анализ
В «амплифицированном тетрамерном анализе» клетки с различными датами получения размораживаются, пересчитываются и предварительно стимулируются антигенами в течение приблизительно двух
недель для обеспечения деления антигенспецифических Т-клеток. Затем клетки извлекаются из культуры, снова пересчитываются и окрашиваются меченными РЕ- и АРС-флуорохромом МНС-мультимерами
плюс антитела для определения CD8+ Т-клеток (одна лунка на окрашивание & момент времени). Мультимеры МНС являются рекомбинантными комплексами пептид-МНС, которые мультимеризованы и
конъюгированы с флуоресцентным красителем. Использовались лишь тетрамерные мультимеры HLAА*0201, которые полностью эквивалентны с первоначально представленными в этой области (Altmann
1996), называемые здесь кратко «Тетрамерами». Окрашенные и обработанные пробы анализировались
проточной цитометрией с использованием стандартной методики, хорошо известной из уровня техники,
результатом был свод данных для каждой пробы, основанный на отдельных клетках. Этот «амплифицированный тетрамерный анализ» имеет очень высокую чувствительность, но является менее количественным в сравнении с анализами ex vivo.
Для первичного анализа тетрамерных данных электронным способом, используя статистические
файлы цитометрии, с помощью имеющейся в продаже компьютерной программы подсчитывалось число
всех оцененных CD8+ Т-клеток, одно-тетрамерные положительные и двух-тетрамерные положительные
клетки на пробу. CD8+ Т-клетки были идентифицированы прямым и боковым светорассеиванием с установлением гейта для живых лимфоцитов и дополнительного гейта для явлений CD8+ CD3+, основанных
на флуоресценции антитела. Определение гейта лимфоцитов и CD3/CD8 было идентичным для всех окрашиваний у одного пациента в рамках одного анализа. Тетрамер-положительные популяции были идентифицированы из CD8+ Т-клеток анализом двойных тетрамерных дот-плотов (точечный график) с квадрантами или гейтами. Определение тетрамер+ клетки было идентичным для каждого условия окрашивания для данного пациента в рамках одного анализа и базировалось на распознаваемых клеточных популяциях. Амплифицированный тетрамерный анализ был применен для 28 пациентов во время исследования, и все антигены присутствуют в IMA до и во время курса вакцинации в различные моменты времени.
На фиг. 11 представлены репрезентативные примеры IMA-индуцированных Т-клеточных ответов,
выявленных амплифицированным тетрамерным анализом на основе изменения окраски. Верхние и средние изображения представляют двухмерные точечные графики с гейтом для CD3+ лимфоцитов, нижние
изображения имеют гейты для CD3+ CD8+ лимфоцитов. Пациенты, точки времени и окрашивание были
такими, как указано для каждой колонки. На фиг. 11А иммунологический ответ на IMA-CCN-001 у пациента 03-004, уже показанный анализом ELISPOT (фиг. 10), был подтвержден тетрамерным анализом.
Клеточная популяция, положительная для CD3+ и тетрамера IMA-CCN-001, была выявлена после четвертой и пятой инъекции IMA (V6+V7; среднее изображение), в то время как для тетрамера K67-001 положительных популяций обнаружено не было (верхнее изображение). IMA-CCN-001-положительные
клетки увеличились с 0,03% до вакцинации до 0,78% лимфоцитов (V6+V7; нижнее изображение) после
первых трех инъекций.
Пациент 03-003 не проявлял иммунологического ответа к пептиду RGS-001 (фиг. 11В; верхнее изображение), но вырабатывал IMA-CCN-001-тетрамерный положительный ответ во время схемы вакцинации (S1+V1: пробы взяты до вакцинации; V4+V5: пробы взяты на 8 и 15 день; V6+V7: пробы взяты на 22
и 36 день; V8+FU: пробы взяты на 64 день (последняя вакцинация) и после 85 до 92 дней; конец исследования). На среднем изображении, в колонке 3 и 4 показаны различные клеточные популяции, положительные для CNN-001 и CD3+. Во время курса вакцинации количество этих клеток возросло с 0,02% до
вакцинации до 0,8% лимфоцитов (нижнее изображение; колонка 3) после первых трех инъекций и сокра- 36 -
013466
тилось до 0,31% после 64 дня (нижнее изображение; колонка 4; V8+FU).
Для выбранных пациентов амплифицированный тетрамерный анализ проводился для отдельных
моментов времени, т.е. пробы крови не были объединены, позволяя более точную оценку Т-клеточной
кинетики, пример которой приводится на фиг. 12. Наблюдаемая сила кинетики Т-клетки при амплифицированном тетрамерном анализе в отдельный момент времени приводится для пациента 05-001. Опухолеассоциированные антигены, представленные в IMA (пул TUMAP), были наиболее высокими на 22, 36
и 64 день (V6, V7 и V8), в то время как пик ответа на пептид IMA-CCN-001 был зарегистрирован ранее,
на 22 день (V6). Положительный контроль HBV-001 привел к еще более быстрому ответу, достигшему
свой максимум на 15 день (V5).
Два пациента с очень высокой отвечаемостью на IMA-CCN-001 были выбраны для подтверждения
результатов амплифицированного тетрамерного анализа в неамплифицированном эксперименте. Эти
тетрамерные анализы ех vivo были проведены без культивации клеток в течение двух недель.
Результаты обобщаются в табл. 9 внизу. Представлены все подлежащие оценке результаты из ex
vivo тетрамер и пациент/антиген-совместимых амплифицированных тетрамерных анализов, где вакциноиндуцированный ответ был обнаружен при амиплифицированном анализе. Для метода «ex vivo» указан
% тетрамера+ среди общего числа CD8+ Т-клеток. Что касается «амплифицированного стандартного»
метода оценки, то могут быть проанализированы субпопуляции CD8+ Т-лимфоцитов, вторая переоценка
стандартных данных показана («амплифицированный, количественный») с расчетами, основанными на
общем количестве CD8+ Т-лимфоцитов. «Фактор амплификации» был рассчитан, если дискретная популяция тетрамер+ была увидена ex vivo и при амплифицированном тетрамерном анализе.
Результаты отчетливо демонстрируют, что иммунологические ответы, измеренные амплифицированным тетрамерным анализом, не являются следствием клеточной экспансии во время двухнедельной
инкубации, а основаны на предшествующих, «ex vivo» лимфоцитах, присутствующих в крови пациента.
Таблица 9. Сравнение силы Т-клеточного ответа, посчитанного исходя из анализов ex vivo и амплифицированного тетрамерного анализа
- 37 -
013466
* - дискретный тетрамер+ популяция обнаружена;
# - отдельный анализ стал отчетливым свидетельством, что ответы пула TUMAP могли быть исключительно отнесены к rCCN-001.
Общая иммунологическая реактивность пациентов
Т-клеточные ответы, измеренные при анализах и описанные выше, оценивались для всех пептидов,
содержащихся в IMA, для 28 пациентов в различные моменты времени исследования. Пациент обозначался как «отвечающий», т.е. показывало индуцированный вакциной иммунный ответ, если одна из проб
крови, взятая в момент времени после вакцинации, содержала тетрамер-положительные лимфоциты или
секретированный IFN-γ при стимуляции одним из пептидов.
Как и ожидалось, пациенты реагировали индивидуально на различные пептиды, содержащиеся в
IMA. Учитывая небольшое число пациентов, результатом стала неожиданно хорошая реактивность, так
как большинство пациентов (23 из 27 подлежащих оценке пациентов) реагировали иммунным ответом по
крайней мере на один из пептидов. 8 из 27 подлежащих оценке пациентов (30%) имели даже Тклеточный ответ на несколько пептидов TUMAP.
Литература
Altman JD, Moss PA, Goulder PJ, Barouch DH, McHeyzer-Williams MG, Bell JI, McMichael AJ, and
Davis MM. Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes. Science 274:94-96 (1996).
Apostolopoulos V and McKenzie IF. Cellular mucins: targets for immunotherapy. Crit Rev. Immunol.
14:293-309 (1994).
Bamias A, Chorti M, Deliveliotis C, Trakas N, Skolarikos A, Protogerou B, Legaki S, Tsakalou G, Tamvakis N, and Dimopoulos MA. Prognostic significance of CA 125, CD44, and epithelial membrane antigen in renal
cell carcinoma. Urology 62:368-373 (2003).
Barnd DL, Lan MS, Metzgar RS, and Finn OJ. Specific, Major Histocompatibility Complex-Unrestricted
Recognition of Tumor-Associated Mucins by Human Cytotoxic T-cells. PNAS 86:7159-7163 (1989).
Bates S, Bonetta L, MacAllan D, Parry D, Holder A, Dickson C, and Peters G. CDK6 (PLSTIRE) and
CDK4 (PSK-J3) are a distinct subset of the cyclin-dependent kinases that associate with cyclin Dl. Oncogene
9:71-79 (1994).
Beilmann M, Vande Woude GF, Dienes HP, and Schirmacher P. Hepatocyte growth factor-stimulated invasiveness of monocytes. Blood 95:3964-3969 (2000).
Berger M, Bergers G, Arnold B, Hammerling GJ, and Ganss R. Regulator of G-protein signaling-5 induction in pericytes coincides with active vessel remodeling during neovascularization. Blood 105:1094-1101
(2005).
Bertoletti A, Chisari FV, Penna A, Guilhot S, Galati L, Missale G, Fowler P, Schlicht HJ, Vitiello A,
Chesnut RC. Definition of a minimal optimal cytotoxic T-cell epitope within the hepatitis В virus nucleocapsid
protein. J Virol. 67:2376-2380 (1993).
Bladt F, Riethmacher D, Isenmann S, Aguzzi A, and Birchmeier С. Essential role for the c-met receptor in
the migration of myogenic precursor cells into the limb bud. Nature 376:768-771 (1995).
Borset M, Seidel C, Hjorth-Hansen H, Waage A, and Sundan A. The role of hepatocyte growth factor and
its receptor c-Met in multiple myeloma and other blood malignancies. Leuk. Lymphoma 32:249-256 (1999).
- 38 -
013466
Bottaro DP, Rubin JS, Faletto DL, Chan AM, Kmiecik ТЕ, Vande Woude GF, and Aaronson SA. Identification of the hepatocyte growth factor receptor as the c-met proto-oncogene product. Science 251:802-804
(1991).
Bramhall SR, Neoptolemos JP, Stamp GW, and Lemoine NR. Imbalance of expression of matrix metalloproteinases (MMPs) and tissue inhibitors of the matrix metalloproteinases (TIMPs) in human pancreatic carcinoma. J Pathol. 182:347-355 (1997).
Brossart P, Heinrich KS, Stuhler G, Behnke L, Reichardt VL, Stevanovic S, Muhm A, Rammensee HG,
Kanz L, and Brugger W. Identification of HLA-A2-restricted T-cell epitopes derived from the MUC1 tumor
antigen for broadly applicable vaccine therapies. Blood 93:4309-4317 (1999).
Brossart P, Schneider A, Dill P, Schammann T, Grunebach F, Wirths S, Kanz L, Buhring HJ, and Brugger
W. The epithelial tumor antigen MUC1 is expressed in hematological malignancies and is recognized by MUC1specific cytotoxic T-lymphocytes. Cancer Res. 61:6846-6850 (2001).
Brossart P, Wirths S, Stuhler G, Reichardt VL, Kanz L, and Brugger W. Induction of cytotoxic Tlymphocyte responses in vivo after vaccinations with peptide-pulsed dendritic cells. Blood 96:3102-3108 (2000).
Browner MF, Smith WW, and Castelhano AL. Matrilysin-inhibitor complexes: common themes among
metalloproteases. Biochemistry 34:6602-6610 (1995).
Cao Y, Karsten U, Zerban H, and Bannasch P. Expression of MUC1, Thomsen-Friedenreich-related antigens, and cytokeratin 19 in human renal cell carcinomas and tubular clear cell lesions. Virchows Arch. 436:119126 (2000).
Chen X, Higgins J, Cheung ST, Li R, Mason V, Montgomery K, Fan ST, van de RM, and So S. Novel endothelial cell markers in hepatocellular carcinoma. Mod. Pathol. 17:1198-1210 (2004).
De VL, Zheng B, Fischer T, Elenko E, and Farquhar MG. The regulator of G protein signaling family.
Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 40:235-271 (2000).
Delsol G, Al ST, Gatter KC, Gerdes J, Schwarting R, Caveriviere P, Rigal-Huguet F, Robert A, Stein H,
and Mason DY. Coexpression of epithelial membrane antigen (EMA), Ki-1, and interleukin-2 receptor by
anaplastic large cell lymphomas. Diagnostic value in so-called malignant histiocytosis. Am. J. Pathol. 130:59-70
(1988).
Denys H, De Wever O, Nusgens B, Kong Y, Sciot R, Le AT, Van Dam K, Jadidizadeh A, Tejpar S, Mareel
M, Alman B, and Cassiman JJ. Invasion and MMP expression profile in desmoid tumours. Br. J Cancer 90:14431449 (2004).
Deshpande A, Sicinski P, and Hinds PW. Cyclins and cdks in development and cancer: a perspective. Oncogene 24:2909-2915 (2005).
Di Renzo MF, Olivero M, Giacomini A, Porte H, Chastre E, Mirossay L, Nordlinger
B, Bretti S, Bottardi S, Giordano S. Overexpression and amplification of the met/HGF receptor gene during
the progression of colorectal cancer. Clin. Cancer Res. 1:147-154 (1995).
Dittmann J, Keller-Matschke K, Weinschenk T, Kratt T, Heck T, Becker HD, Stevanovic S, Rammensee
HG, and Gouttefangeas C. CD8(+) T-cell response against MUC1-derived peptides in gastrointestinal cancer
survivors. Cancer Immunol Immunother. (2004).
Dong G, Chen Z, Li ZY, Yeh NT, Bancroft CC, and Van WC. Hepatocyte growth factor/scatter factorinduced activation of MEK and PI3K signal pathways contributes to expression of proangiogenic cytokines interleukin-8 and vascular endothelial growth factor in head and neck squamous cell carcinoma. Cancer Res.
61:5911-5918 (2001).
Duchateau PN, Pullinger CR, Cho MH, Eng C, and Kane JP. Apolipoprotein L gene family: tissue-specific
expression, splicing, promoter regions; discovery of a new gene. J. Lipid Res. 42:620-630 (2001).
Duchateau PN, Pullinger CR, Orellana RE, Kunitake ST, Naya-Vigne J, O'Connor PM, Malloy MJ, and
Kane JP. Apolipoprotein L, a new human high density lipoprotein apolipoprotein expressed by the pancreas.
Identification, cloning, characterization, and plasma distribution of apolipoprotein L. J. Biol. Chem. 272:2557625582 (1997).
Duperray C, Klein B, Durie BG, Zhang X, Jourdan M, Poncelet P, Favier F, Vincent C, Brochier J, Lenoir
G. Phenotypic analysis of human myeloma cell lines. Blood 73:566-572 (1989).
Falk K, Rotzschke O, Stevanovic S, Jung G, and Rammensee HG. Allele-specific motifs revealed by sequencing of self-peptides eluted from MHC molecules. Nature 351:290-296 (1991).
Ferracini R, Di Renzo MF, Scotlandi K, Baldini N, Olivero M, Lollini P, Cremona O, Campanacci M, and
Comoglio PM. The Met/HGF receptor is over-expressed in human osteosarcomas and is activated by either a
paracrine or an autocrine circuit. Oncogene 10:739-749 (1995).
Finn OJ, Jerome KR, Henderson RA, Pecher G, Domenech N, Magarian-Blander J, and Barratt-Boyes SM.
MUC-1 epithelial tumor mucin-based immunity and cancer vaccines. Immunol. Rev. 145:61-89 (1995).
Fischer J, Palmedo G, von KR, Bugert P, Prayer-Galetti T, Pagano F, and Kovacs G. Duplication and overexpression of the mutant allele of the MET proto-oncogene in multiple hereditary papillary renal cell tumours.
Oncogene 17:733-739 (1998).
Fujita K, Denda K, Yamamoto M, Matsumoto T, Fujime M, and Irimura T. Expression of MUC1 mucins
inversely correlated with post-surgical survival of renal cell carcinoma patients. Br. J. Cancer 80:301-308
- 39 -
013466
(1999).
Furge KA, Zhang YW, and Vande Woude GF. Met receptor tyrosine kinase: enhanced signaling through
adapter proteins. Oncogene 19:5582-5589 (2000).
Furge KA, Kiewlich D, Le P, Vo MN, Faure M, Howlett AR, Lipson KE, Woude GFV, and Webb CP.
Suppression of Ras-mediated tumorigenicity and metastasis through inhibition of the Met receptor tyrosine
kinase. PNAS 98:10722-10727 (2001).
Furuya M, Nishiyama M, Kimura S, Suyama T, Naya Y, Ito H, Nikaido T, and Ishikura H. Expression of
regulator of G protein signalling protein 5 (RGS5) in the tumour vasculature of human renal cell carcinoma. J.
Pathol. 203:551-558 (2004).
Gaire M, Magbanua Z, McDonnell S, McNeil L, Lovett DH, and Matrisian LM. Structure and expression
of the human gene for the matrix metalloproteinase matrilysin. J. Biol. Chem. 269:2032-2040 (1994).
Gendler S, Taylor-Papadimitriou J, Duhig T, Rothbard J, and Burchell J. A highly immunogenic region of
a human polymorphic epithelial mucin expressed by carcinomas is made up of tandem repeats. J. Biol. Chem.
263:12820-12823 (1988).
Gherardi E and Stoker M. Hepatocyte growth factor--scatter factor: mitogen, motogen, and met. Cancer
Cells 3:227-232 (1991).
Girling A, Bartkova J, Burchell J, Gendler S, Gillett C, and Taylor-Papadimitriou J. A core protein epitope
of the polymorphic epithelial mucin detected by the monoclonal antibody SM-3 is selectively exposed in a range
of primary carcinomas. Int. J. Cancer 43:1072-1076 (1989).
Gursky S, Olopade OI, and Rowley JD. Identification of a 1.2 Kb cDNA fragment from a region on 9p21
commonly deleted in multiple tumor types. Cancer Genet. Cytogenet. 129:93-101 (2001).
Halaban R. Melanoma cell autonomous growth: the Rb/E2F pathway. Cancer Metastasis Rev. 18:333-343
(1999).
Hammer J, Valsasnini P, Tolba K, Bolin D, Higelin J, Takacs B, and Sinigaglia F. Promiscuous and allelespecific anchors in HLA-DR-binding peptides. Cell 74:197-203 (1993).
Hedberg Y, Davoodi E, Roos G, Ljungberg B, and Landberg G. Cyclin-D1 expression in human renal-cell
carcinoma. Int. J. Cancer 84:268-272 (1999).
Heid HW, Moll R, Schwetlick I, Rackwitz HR, and Keenan TW. Adipophilin is a specific marker of lipid
accumulation in diverse cell types and diseases. Cell Tissue Res. 294:309-321 (1998).
Horton H, Russell N, Moore E, Frank I, Baydo R, Havenar-Daughton C, Lee D, Deers M, Hudgens M,
Weinhold K, and McElrath MJ. Correlation between interferon-gamma secretion and cytotoxicity, in virusspecific memory T-cells. J. Infect. Dis. 190:1692-1696(2004).
Jadeski LC, Chakraborty C, and Lala PK. Nitric oxide-mediated promotion of mammary tumour cell migration requires sequential activation of nitric oxide synthase, guanylate cyclase and mitogen-activated protein
kinase. Int. J. Cancer 106:496-504 (2003).
Jager, E., Y. Nagata, S. Gnjatic, H. Wada, E. Stockert, J. Karbach, P. R. Dunbar, S. Y. Lee, A. Jungbluth,
D. Jager, M. Arand, G. Ritter, V. Cerundolo, B. Dupont, Y. T. Chen, L. J. Old, and A. Knuth. Monitoring CD8
T-cell responses to NY-ESO-1: correlation of humoral and cellular immune responses. Proc. Natl. Acad. Sci. U.
S. A. 97:4760 (2000).
Jucker M, Gunther A, Gradl G, Fonatsch C, Krueger G, Diehl V, and Tesch H. The Met/hepatocyte growth
factor receptor (HGFR) gene is overexpressed in some cases of human leukemia and lymphoma. Leuk. Res.
18:7-16 (1994).
Jung G, Ledbetter JA, and Muller-Eberhard HJ. Induction of cytotoxicity in resting human T lymphocytes
bound to tumor cells by antibody heteroconjugates. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 84:4611-4615 (1987).
Kawakami Y, Eliyahu S, Sakaguchi K, Robbins PF, Rivoltini L, Yannelli JR, Appella E, and Rosenberg
SA. Identification of the immunodominant peptides of the MART-1 human melanoma antigen recognized by the
majority of HLA-A2-restricted tumor infiltrating lymphocytes. J Exp. Med. 180:347-352 (1994).
Koochekpour S, Jeffers M, Rulong S, Taylor G, Klineberg E, Hudson EA, Resau JH, and Vande Woude
GF, Met and hepatocyte growth factor/scatter factor expression in human gliomas. Cancer Res. 57:5391-5398
(1997).
Kraus S, Abel PD, Nachtmann C, Linsenmann HJ, Weidner W, Stamp GW, Chaudhary KS, Mitchell SE,
Franke FE, and Lalani e. MUC1 mucin and trefoil factor 1 protein expression in renal cell carcinoma: correlation
with prognosis. Hum. Pathol. 33:60-67 (2002).
Kurokawa Y, Matoba R, Nakamori S, Takemasa I, Nagano H, Dono K, Umeshita K, Sakon M, Monden M,
and Kato K. PCR-array gene expression profiling of hepatocellular carcinoma. J. Exp. Clin. Cancer Res. 23:135141 (2004).
Lemmel C, Weik S, Eberle U, Dengjel J, Kratt T, Becker HD, Rammensee HG, and Stevanovic S. Differential quantitative analysis of MHC ligands by mass spectrometry using stable isotope labeling. Nat. Biotechnol.
22:450-454 (2004).
Leroy X, Copin MC, Devisme L, Buisine MP, Aubert JP, Gosselin B, and Porchet N. Expression of human
mucin genes in normal kidney and renal cell carcinoma. Histopathology 40:450-457 (2002).
Lew DJ, Dulic V, and Reed SI. Isolation of three novel human cyclins by rescue of G1 cyclin (Cln) func- 40 -
013466
tion in yeast. Cell 66:1197-1206 (1991).
Li G, Schaider H, Satyamoorthy K, Hanakawa Y, Hashimoto K, and Herlyn M. Downregulation of Ecadherin and Desmoglein 1 by autocrine hepatocyte growth factor during melanoma development. Oncogene
20:8125-8135 (2001).
Lin TS, Chiou SH, Wang LS, Huang HH, Chiang SF, Shih AY, Chen YL, Chen CY, Hsu CP, Hsu NY,
Chou MC, Kuo SJ, and Chow KC. Expression spectra of matrix metalloproteinases in metastatic non-small cell
lung cancer. Oncol Rep. 12:717-723 (2004).
Livingston BD, Crimi C, Grey H, Ishioka G, Chisari FV, Fikes J, Grey H, Chesnut RW, and Sette A. The
hepatitis В virus-specific CTL responses induced in humans by lipopeptide vaccination are comparable to those
elicited by acute viral infection. J Immunol. 159:1383-1392 (1997).
Loden M, Stighall M, Nielsen NH, Roos G, Emdin SO, Ostlund H, and Landberg G. The cyclin D1 high
and cyclin E high subgroups of breast cancer: separate pathways in tumorogenesis based on pattern of genetic
aberrations and inactivation of the pRb node. Oncogene 21:4680-4690 (2002).
Louhelainen J, Wijkstrom H, and Hemminki K. Initiation-development modelling of allelic losses on
chromosome 9 in multifocal bladder cancer. Eur. J. Cancer 36:1441-1451 (2000).
Mark AS and Mangkornkanok M. B-cell lymphoma marking only with anti-epithelial membrane antigen.
Cancer 63:2152-2155 (1989).
Marshall KW, Liu AF, Canales J, Perahia B, Jorgensen B, Gantzos RD, Aguilar B, Devaux B, and
Rothbard JB. Role of the polymorphic residues in HLA-DR molecules in allele-specific binding of peptide
ligands. J. Immunol. 152:4946-4957 (1994).
Maulik G, Kijima T, Ma PC, Ghosh SK, Lin J, Shapiro GI, Schaefer E, Tibaldi E, Johnson BE, and Salgia
R. Modulation of the c-Met/hepatocyte growth factor pathway in small cell lung cancer. Clin. Cancer Res.
8:620-627 (2002).
Miyazaki K, Hattori Y, Umenishi F, Yasumitsu H, and Umeda M. Purification and characterization of extracellular matrix-degrading metalloproteinase, matrin (pump-1), secreted from human rectal carcinoma cell line.
Cancer Res. 50:7758-7764 (1990).
Mizuno K, Higuchi O, Ihle JN, and Nakamura T. Hepatocyte growth factor stimulates growth of hematopoietic progenitor cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 194:178-186(1993).
Monajemi H, Fontijn RD, Pannekoek H, and Horrevoets AJ. The apolipoprotein L gene cluster has
emerged recently in evolution and is expressed in human vascular tissue. Genomics 79:539-546 (2002).
Montesano R, Soriano JV, Malinda KM, Ponce ML, Bafico A, Kleinman HK, Bottaro DP, and Aaronson
SA. Differential effects of hepatocyte growth factor isoforms on epithelial and endothelial tubulogenesis. Cell
Growth Differ. 9:355-365 (1998).
Mori M, Beatty PG, Graves M, Boucher KM, and Milford EL. HLA gene and haplotype frequencies in the
North American population: the National Marrow Donor Program Donor Registry. Transplantation 64:10171027 (1997).
Mott JD and Werb Z. Regulation of matrix biology by matrix metalloproteinases. Curr. Opin. Cell Biol.
16:558-564 (2004).
Mueller MRWJ, Brugger W, Gouttefangeas.C, Kanz L, and Brossart P. Vaccinations with peptide pulsed
dendritic cells induces clinical and immunological responses in patients with metastatic renal cell carcinoma.
Proc Am Soc Clin Oncol 22, 168. 1-6-2003.
Ref Type: Abstract
Naldini L, Vigna E, Narsimhan RP, Gaudino G, Zarnegar R, Michalopoulos GK, and Comoglio PM. Hepatocyte growth factor (HGF) stimulates the tyrosine kinase activity of the receptor encoded by the proto-oncogene
c-MET. Oncogene 6:501-504 (1991).
Neumann F, Wagner C, Stevanovic S, Kubuschok B, Schormann C, Mischo A, Ertan K, Schmidt W, and
Pfreundschuh M. Identification of an HLA-DR-restricted peptide epitope with a promiscuous binding pattern
derived from the cancer testis antigen HOM-MEL-40/SSX2. Int. J. Cancer 112:661-668 (2004).
Noto H, Takahashi T, Makiguchi Y, Hayashi T, Hinoda Y, and Imai K. Cytotoxic T lymphocytes derived
from bone marrow mononuclear cells of multiple myeloma patients recognize an underglycosylated form of
MUC1 mucin. Int. Immunol. 9:791-798 (1997).
Ohara O, Nagase T, Ishikawa K, Nakajima D, Ohira M, Seki N, and Nomura N. Construction and characterization of human brain cDNA libraries suitable for analysis of cDNA clones encoding relatively large proteins. DNA Res. 4:53-59 (1997).
Pachter JS, de Vries HE, and Fabry Z. The blood-brain barrier and its role in immune privilege in the central nervous system. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 62:593-604 (2003).
Pass, H. A., S. L. Schwarz, J. R. Wunderlich, and S. A. Rosenberg. Immunization of patients with melanoma peptide vaccines: immunologic assessment using the ELISPOT assay. Cancer J. Sci. Am. 4:316 (1998).
Pons E, Uphoff CC, and Drexler HG. Expression of hepatocyte growth factor and its receptor c-met in human leukemia-lymphoma cell lines. Leuk. Res. 22:797-804 (1998).
Ponzetto C, Bardelli A, Maina F, Longati P, Panayotou G, Dhand R, Waterfield MD, and Comoglio PM. A
novel recognition motif for phosphatidylinositol 3-kinase binding mediates its association with the hepatocyte
- 41 -
013466
growth factor/scatter factor receptor. Mol. Cell Biol. 13:4600-4608 (1993).
Previsani N and Lavanchy D. Hepatitis B. World Health Organization Department of Communicable Diseases Surveillance and Response. 2002 WHO/CD8/CSR/LYO/2002. 2:Hepatitis B. (2002).
Qian CN, Guo X, Cao B, Kort EJ, Lee CC, Chen J, Wang LM, Mai WY, Min HQ, Hong MH, Vande
Woude GF, Resau JH, and Teh ВТ. Met protein expression level correlates with survival in patients with latestage nasopharyngeal carcinoma. Cancer Res. 62:589-596 (2002).
Quantin B, Murphy G, and Breathnach R. Pump-1 cDNA codes for a protein with characteristics similar to
those of classical collagenase family members. Biochemistry 28:5327-5334 (1989).
Rae FK, Stephenson SA, Nicol DL, and Clements JA. Novel association of a diverse range of genes with
renal cell carcinoma as identified by differential display. Int. J. Cancer 88:726-732 (2000).
Ramirez R, Hsu D, Patel A, Fenton C, Dinauer C, Tuttle RM, and Francis GL. Over-expression of hepatocyte growth factor/scatter factor (HGF/SF) and the HGF/SF receptor (cMET) are associated with a high risk of
metastasis and recurrence for children and young adults with papillary thyroid carcinoma. Clin Endocrinol. (Oxf)
53:635-644 (2000).
Rammensee H, Bachmann J, Emmerich NP, Bachor OA, and Stevanovic S. SYFPEITHI: database for
MHC ligands and peptide motifs. Immunogenetics 50:213-219 (1999).
Rammensee, H.G., Bachmann, J., and Stevanovic, S. (1997). MHC Ligands and Peptide Motifs. SpringerVerlag, Heidelberg, Germany.
Rehermann В and Nascimbeni M. Immunology of hepatitis В virus and hepatitis С virus infection. Nat.
Rev. Immunol. 5:215-229 (2005).
Rentzsch C, Kayser S, Stumm S, Watermann I, Walter S, Stevanovic S, Wallwiener D, and Guckel B.
Evaluation of pre-existent immunity in patients with primary breast cancer: molecular and cellular assays to
quantify antigen-specific T lymphocytes in peripheral blood mononuclear cells. Clin Cancer Res. 9:4376-4386
(2003).
Rotzschke O, Falk K, Stevanovic S, Jung G, Walden P, and Rammensee HG. Exact prediction of a natural
T-cell epitope. Eur. J. Immunol. 21:2891-2894 (1991).
Rubin JS, Bottaro DP, and Aaronson SA. Hepatocyte growth factor/scatter factor and its receptor, the cmet proto-oncogene product. Biochim. Biophys. Acta 1155:357-371 (1993).
Saha S, Bardelli A, Buckhaults P, Velculescu VE, Rago C, St CB, Romans KE, Choti MA, Lengauer C,
Kinzler KW, and Vogelstein B. A phosphatase associated with metastasis of colorectal cancer. Science
294:1343-1346 (2001).
Saino M, Maruyama T, Sekiya T, Kayama T, and Murakami Y. Inhibition of angiogenesis in human
glioma cell lines by antisense RNA from the soluble guanylate cyclase genes, GUCY1A3 and GUCY1B3. Oncol. Rep. 12:47-52 (2004).
Schag К, Schmidt SM, Muller MR, Weinschenk T, Appel S, Week MM, Grunebach F, Stevanovic S, Rammensee HG, and Brossart P. Identification of C-met oncogene as a broadly expressed tumor-associated antigen
recognized by cytotoxic T-lymphocytes. Clin Cancer Res. 10:3658-3666 (2004).
Scheibenbogen, C, A. Schmittel, U. Keilholz, T. Allgauer, U. Hofmann, R. Max, E. Thiel, and D. Schadendorf. Phase 2 trial of vaccination with tyrosinase peptides and granulocyte-macrophage colony-stimulating
factor in patients with metastatic melanoma. J. Immunother. 23:275 (2000) .
Schirle M, Weinschenk T, and Stevanovic S. Combining computer algorithms with experimental approaches permits the rapid and accurate identification of T-cell epitopes from defined antigens. J. Immunol.
Methods 257:1-16 (2001).
Schmidt C, Bladt F, Goedecke S, Brinkmann V, Zschiesche W, Sharpe M, Gherardi E, and Birchmeier C.
Scatter factor/hepatocyte growth factor is essential for liver development. Nature 373:699-702 (1995).
Siddiqui J, Abe M, Hayes D, Shani E, Yunis E, and Kufe D. Isolation and Sequencing of a cDNA Coding
for the Human DF3 Breast Carcinoma-Associated Antigen. PNAS 85:2320-2323 (1988).
Slingluff, С.L., Jr., G. R. Petroni, G. V. Yamshchikov, D. L. Barnd, S. Eastham, H. Galavotti, J. W. Patterson, D. H. Deacon, S. Hibbitts, D. Teates, P. Y. Neese, W. W. Grosh, K. A. Chianese-Bullock, E. M. Woodson,
C. J. Wiernasz, P. Merrill, J. Gibson, M. Ross, and V. H. Engelhard. Clinical and immunologic results of a randomized phase II trial of vaccination using four melanoma peptides either administered in granulocytemacrophage colony-stimulating factor in adjuvant or pulsed on dendritic cells. J. Clin. Oncol. 21:4016 (2003) .
Sun Y, Song M, Stevanovic S, Jankowiak C, Paschen A, Rammensee HG, and Schadendorf D. Identification of a new HLA-A(*)0201-restricted T-cell epitope from the tyrosinase-related protein 2 (TRP2) melanoma
antigen. Int. J. Cancer 87:399-404 (2000).
Takahashi T, Makiguchi Y, Hinoda Y, Kakiuchi H, Nakagawa N, Imai K, and Yachi A. Expression of
MUC1 on myeloma cells and induction of HLA-unrestricted CTL against MUC1 from a multiple myeloma patient. J. Immunol. 153:2102-2109 (1994).
Takayama H, Larochelle WJ, Sharp R, Otsuka T, Kriebel P, Anver M, Aaronson SA, and Merlino G. Diverse tumorigenesis associated with aberrant development in mice overexpressing hepatocyte growth factor/scatter factor. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 94:701-706 (1997).
Takayama H, LaRochelle WJ, Anver M, Bockman DE, and Merlino G. Scatter factor/hepatocyte growth
- 42 -
013466
factor as a regulator of skeletal muscle and neural crest development. PNAS 93:5866-5871 (1996).
Teofili L, Di Febo AL, Pierconti F, Maggiano N, Bendandi M, Rutella S, Cingolani A, Di RN, Musto P,
Piled S, Leone G, and Larocca LM. Expression of the c-met proto-oncogene and its ligand, hepatocyte growth
factor, in Hodgkin disease. Blood 97:1063-1069(2001).
Tripathi A, Dasgupta S, Roy A, Sengupta A, Roy B, Roychowdhury S, and Panda CK. Sequential deletions
in both arms of chromosome 9 are associated with the development of head and neck squamous cell carcinoma
in Indian patients. J. Exp. Clin. Cancer Res. 22:289-297 (2003).
Troussard X, vet-Loiseau H, Macro M, Mellerin MP, Malet M, Roussel M, and Sola B. Cyclin D1 expression in patients with multiple myeloma. Hematol. J. 1:181-185 (2000).
Tuck AB, Park M, Sterns ЕЕ, Boag A, and Elliott BE. Coexpression of hepatocyte growth factor and receptor (Met) in human breast carcinoma. Am. J. Pathol. 148:225-232 (1996).
Uehara Y, Minowa O, Mori C, Shiota K, Kuno J, Noda T, and Kitamura N. Placental defect and embryonic
lethality in mice lacking hepatocyte growth factor/scatter factor. Nature 373:702-705 (1995).
Van D, V, Taher ТЕ, Keehnen RM, Smit L, Groenink M, and Pals ST. Paracrine regulation of germinal
center В cell adhesion through the c-met-hepatocyte growth factor/scatter factor pathway. J. Exp. Med.
185:2121-2131 (1997).
Vasef MA, Brynes RK, Sturm M, Bromley C, and Robinson RA. Expression of cyclin D1 in parathyroid
carcinomas, adenomas, and hyperplasias: a paraffin immunohistochemical study. Mod. Pathol. 12:412-416
(1999).
Walter S, Herrgen L, Schoor O, Jung G, Wernet D, Buhring HJ, Rammensee HG, and Stevanovic S. Cutting Edge: Predetermined Avidity of Human CD8 T-cells Expanded on Calibrated MHC/Anti-CD28-Coated
Microspheres. J Immunol 171:4974-4978 (2003).
Wang FQ, So J, Reierstad S, and Fishman DA. Matrilysin (MMP-7) promotes invasion of ovarian cancer
cells by activation of progelatinase. Int. J Cancer 114:19-31 (2005).
Wang R, Ferrell LD, Faouzi S, Maher JJ, and Bishop JM. Activation of the Met receptor by cell attachment
induces and sustains hepatocellular carcinomas in transgenic mice. J. Cell Biol. 153:1023-1034 (2001).
Weber RG, Rieger J, Naumann U, Lichter P, and Weller M. Chromosomal imbalances associated with response to chemotherapy and cytotoxic cytokines in human malignant glioma cell lines. Int. J. Cancer 91:213-218
(2001).
Weinschenk T, Gouttefangeas C, Schirle M, Obermayr F, Walter S, Schoor O, Kurek R, Loeser W, Bichler
KH, Wernet D, Stevanovic S, and Rammensee HG. Integrated functional genomics approach for the design of
patient-individual antitumor vaccines. Cancer Res. 62:5818-5827 (2002).
Wierecky J, Muller MR, Horger MS, Brugger W, Kanz L, and Brossart P. Induction of clinical and immunological responses in patients with metastatic renal cell carcinoma after vaccinations with peptide pulsed dendritic cells. J Clin Oncol (Meeting Abstracts) 23:2507 (2005).
Wills MR, Carmichael AJ, Mynard K, Jin X, Weekes MP, Plachter B, and Sissons JG. The human cytotoxic T-lymphocyte (CTL) response to cytomegalovirus is dominated by structural protein pp65: frequency,
specificity, and T-cell receptor usage of pp65-specific CTL. J Virol. 70:7569-7579 (1996).
Xiong Y, Connolly T, Futcher B, and Beach D. Human D-type cyclin. Cell 65:691-699 (1991).
Yewdell JW, Reits E, and Neefjes J. Making sense of mass destruction: quantitating MHC class I antigen
presentation. Nat. Rev. Immunol. 3:952-961 (2003).
Young AN, Amin MB, Moreno CS, Lim SD, Cohen C, Petros JA, Marshall FF, and Neish AS. Expression
profiling of renal epithelial neoplasms: a method for tumor classification and discovery of diagnostic molecular
markers. Am. J. Pathol. 158:1639-1651 (2001).
Zarnegar R and Michalopoulos GK. The many faces of hepatocyte growth factor: from hepatopoiesis to
hematopoiesis. J. Cell Biol. 129:1177-1180 (1995).
Zhou YT, Guy GR, and Low ВС. BNIP-2 induces cell elongation and membrane protrusions by interacting
with Cdc42 via a unique Cdc42-binding motif within its BNIP-2 and Cdc42GAP homology domain. Exp. Cell
Res. 303:263-274 (2005).
Romero P, Cerottini JC, Speiser DE. Monitoring tumor antigen specific T-cell responses in cancer patients
and phase I clinical trials of peptide-based vaccination. Cancer Immunol Immunother. 2004 Mar;53(3):249-55.
Schmittel A, Keilholz U, Thiel E, Scheibenbogen С. Quantification of tumor-specific T lymphocytes with
the ELISPOT assay. J Immunother. 2000 May-Jun;23(3):289-95.
Wierecky J, Müller M, Horger M, Brugger W, Kanz L, Brossart P. Induction of clinical and immunological
responses in patients with metastatic renal cell carcinoma after vaccinations with peptide pulsed dendritic cells.
Abstract No. 2507 presented at the Annual Meeting of the American Society of Clinical Oncology ASCO
(2005).
- 43 -
013466
Перечень последовательностей
- 44 -
013466
- 45 -
013466
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Опухолеассоциированный пептид, который выбран из группы пептидов, включающих по меньшей мере одну последовательность в соответствии с SEQ ID № 1 или SEQ ID № 2 или их вариант, при
условии, что пептид не является интактным человеческим опухолеассоциированным полипептидом,
причем указанный пептид обладает общей длиной между 9 и 30 аминокислотами.
2. Опухолеассоциированный пептид по п.1, причем пептид состоит или преимущественно состоит
из аминокислотной последовательности в соответствии с SEQ ID № 1 или SEQ ID № 2 или их варианта.
3. Опухолеассоциированный пептид по п.1 или 2, имеющий способность связываться с молекулой
главного комплекса гистосовместимости человека (МНС) I или II класса.
4. Опухолеассоциированный пептид по п.3, имеющий способность связываться по меньшей мере с
одной дополнительной молекулой главного комплекса гистосовместимости человека (МНС) II класса.
5. Опухолеассоциированный пептид по любому из пп.1-4, причем пептид включает непептидные
связи.
6. Опухолеассоциированный пептид по любому из пп.1-5, причем пептид является белком слияния,
в особенности включающим N-терминальные аминокислоты антигенассоциированной инвариантной
цепи (Ii) HLA-DR.
7. Нуклеиновая кислота, кодирующая пептид по любому из пп.1-6.
8. Нуклеиновая кислота по п.7, которая является ДНК, кДНК, ПНК, ЦНК, РНК или их комбинациями.
9. Вектор экспрессии, способный экспрессировать нуклеиновую кислоту по п.7 или 8.
10. Опухолеассоциированный пептид по любому из пп.1-6 для применения в медицине.
11. Клетка-хозяин, включающая нуклеиновую кислоту по п.7 или 8 или вектор экспрессии по п.9.
12. Клетка-хозяин по п.11, являющаяся рекомбинантной клеткой RCC или линии Awells.
13. Фармацевтическая композиция, содержащая по меньшей мере один опухолеассоциированный
пептид по любому из пп.1-6.
14. Фармацевтическая композиция по п.13, дополнительно включающая по меньшей мере один дополнительный пептид, содержащий последовательность в соответствии с любой из SEQ ID № 3 по SEQ
ID № 11.
15. Фармацевтическая композиция по п.13 или 14, причем пептид включает непептидные связи.
16. Фармацевтическая композиция по любому из пп.13-15, включающая пептиды, состоящие из
аминокислотных последовательностей в соответствии с SEQ ID № 1 и/или SEQ ID № 2 и SEQ ID № 3 по
SEQ ID № 11.
17. Фармацевтическая композиция по любому из пп.13-16, причем количество опухолеассоциированного(ых) пептида(ов), присутствующего(их) в указанной композиции, является ткане-, раково- и/или
пациентспецифическим(и).
18. Фармацевтическая композиция по любому из пп.13-17, дополнительно включающая по меньшей
мере один приемлемый адъювант.
19. Фармацевтическая композиция по п.18, причем указанный адъювант выбран из группы колониестимулирующих факторов, таких как гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (ГМ-КСФ).
20. Применение фармацевтической композиции по любому из пп.13-19 в качестве противораковой
вакцины.
21. Способ получения опухолеассоциированного пептида по любому из пп.1-6, включающий культивирование клетки-хозяина по п.11 и выделение пептида из клетки-хозяина или ее культуральной среды.
22. Способ уничтожения клеток-мишеней у пациента, чьи клетки-мишени аберрантно экспрессируют полипептид, включающий аминокислотную последовательность согласно любому из пп.1-6, включающий введение пациенту эффективного объема пептида по любому из пп.1-6, причем объем указанного пептида, или объем указанной нуклеиновой кислоты, или объем указанного вектора экспрессии является эффективным для возбуждения иммунного ответа против клетки-мишени у указанного пациента.
23. Применение опухолеассоциированного пептида по любому из пп.1-6 для получения лекарственного средства для уничтожения клеток-мишеней у пациента, клетки-мишени которого аберрантно экспрессируют полипептид, включающий аминокислотную последовательность согласно любому из пп.1-6.
24. Способ получения активированных цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ) in vitro, включающий контактирование ЦТЛ in vitro с нагруженными антигеном молекулами человека МНС I или II класса, экспрессированными на поверхности подходящей антигенпрезентирующей клетки в течение периода
времени, достаточного для активации антигенспецифическим образом указанных ЦТЛ, причем указанный антиген является пептидом по любому из пп.1-6.
25. Способ по п.24, причем антиген нагружен на молекулы МНС I или II класса, экспрессированные
на поверхности подходящей антигенпрезентирующей клетки при контактировании достаточного количества антигена с антигенпрезентирующей клеткой.
- 46 -
013466
26. Способ по п.25, причем антигенпрезентирующая клетка включает вектор экспрессии по п.9.
27. Активированные цитотоксические Т-лимфоциты (ЦТЛ), полученные с помощью способа по
любому из пп.24-26, которые селективно распознают клетку, которая аберрантно экспрессирует полипептид, включающий аминокислотную последовательность согласно любому из пп.1-6.
28. Способ уничтожения клеток-мишеней у пациента, чьи клетки-мишени аберрантно экспрессируют полипептид, включающий аминокислотную последовательность согласно любому из пп.1-6, включающий введение пациенту эффективного числа цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ) по п.27.
29. Способ уничтожения клеток-мишеней у пациента, чьи клетки-мишени аберрантно экспрессируют полипептид, включающий аминокислотную последовательность согласно любому из пп.1-6, включающий стадии:
(1) получение цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ) от пациента;
(2) введение в указанные клетки нуклеиновой кислоты, кодирующей Т-клеточный рецептор (ТКР)
или функционально эквивалентную молекулу, и
(3) введение клеток, полученных на стадии (2), пациенту.
30. Применение опухолеассоциированного пептида по любому из пп.1-6 для получения лекарственного средства для уничтожения раковых клеток у пациента.
31. Применение по п.30, причем указанные раковые клетки являются клетками рака почки.
Фиг. 1
Фиг. 2
- 47 -
013466
Фиг. 3
Фиг. 4
Фиг. 5
- 48 -
013466
Фиг. 6
Фиг. 7
Фиг. 8А
- 49 -
013466
Фиг. 8B
Фиг. 9
- 50 -
013466
Фиг. 10
Фиг. 11A
- 51 -
013466
Фиг. 11В
Фиг. 12
Евразийская патентная организация, ЕАПВ
Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2
- 52 -