005586 Предпосылки изобретения Область техники

005586
Предпосылки изобретения
Область техники
Настоящее изобретение относится к ДНК, кодирующей новый гибридный белок, который используется для получения рекомбинантного инсулина. Более конкретно, настоящее изобретение относится к
использованию ДНК для получения инсулина из указанного гибридного белка, который получают путем
экспрессии указанной ДНК, под действием тромбина и карбоксипептидазы В.
Предшествующий уровень техники
Инсулин представляет собой гормон, который секретируется Р-клетками островков Лангерганса в
поджелудочной железе при потреблении животным пищи, и является наиболее важным гормоном для
накопления или использования cахаров, аминокислот и жирных кислот и для поддержания гомеостаза
сахара в крови. Поскольку сахар крови, а именно, глюкоза крови является основным источником энергии
для живого организма, однако, отсутствие гомеостаза сахара в крови может приводить к развитию тяжелых состояний. Повышенное содержание сахара в крови вызывает выведение сахара с мочой, что приводит к потере глюкозы, т.е. к возникновению так называемого сахарного диабета. Если это состояние продолжается в течение длительного промежутка времени, то в тканях живого организма могут развиваться
серьезные осложнения. С другой стороны, пониженное содержание сахара в крови приводит к недостаточному пополнению источников энергии, что представляет определенную угрозу для жизни. Гомеостаз
содержания сахара в крови поддерживается путем обеспечения баланса факторов, повышающих содержание глюкозы в крови (т.е. глюкагона, гормона роста, кортизола, катехоламина) и факторов, снижающих содержание сахара в крови. Инсулин является единственным гормоном, который может снижать
содержание сахара в крови. Следовательно, снижение секреторных функций, происходящее по разным
причинам, и, как следствие этого, недостаточное снабжение инсулином могут вызывать инсулинзависимый сахарный диабет (ИЗСД). Для пациентов, страдающих таким заболеванием, инсулин является незаменимым лекарственным средством.
Человеческий инсулин представляет собой полипептид, содержащий А-цепь из 21 аминокислоты и
В-цепь из 30 аминокислот, и имеющий один внутреннюю дисульфидную связь в А-цепи и две дисульфидных связи, которые связывают А-цепь и В-цепь. Инсулин первоначально биологически синтезируется как "препроинсулин" на рибосомах β-клеток островков Лангерганса поджелудочной железы. Препроинсулин представляет собой линейную молекулу, содержащую сигнальный пептид из 24 аминокислот
(SP), В-цепь (В), С-пептид из 31 аминокислоты (С) и А-цепь (А), присоединенные в порядке, представленном формулой "SP-B-C-A". После транспорта в эндоплазматический ретикулум, сигнальный пептид
отщепляется от препроинсулина с продуцированием "проинсулина (В-С-А)". Проинсулин образует дисульфидные связи в эндоплазматическом ретикулуме, принимая свою трехмерную структуру. Проинсулин расщепляется прогормон-превращающим ферментом РС1/3 в точке соединения В-С, а затем расщепляется превращающим ферментом РС2 в точке соединения С-А. И наконец, два N-концевых основных
аминокислотных остатка С-пептида, которые остаются у С-конца В-цепи при расщеплении ферментом
РС1/3, вырезаются карбоксипептидазой Н. Таким образом образуется инсулин.
Способы получения лекарственного препарата инсулина были первоначально разработаны с использованием экстрактов из поджелудочной железы животных, таких как крупный рогатый скот и свинья. Однако, по составу аминокислот, человеческий инсулин отличается от бычьего инсулина (по двум
положениям А-цепи и по одному положению В-цепи) и свиного инсулина (по одному положению Вцепи). Следовательно, использование бычьего или свиного инсулина для человека неизбежно приводит к
нежелательным эффектам (например, к аллергии). Были разработаны способы полусинтеза человеческого инсулина из свиного инсулина, которые предусматривали проведение реакции транспептидирования с
трипсином. Однако, получение рекомбинантного инсулина генетическими рекомбинантными методиками является, в настоящее время, главным направлением в этой области благодаря низкой стоимости и
высокой эффективности его производства.
Для получения рекомбинантного инсулина был разработан ряд методов. Так, например, известен
метод, разработанный Eli Lilly Corp., который предусматривает экспрессию А-цепи и В-цепи, отдельно, с
использованием Escherichia coli; и объединение А-цепи и В-цепи in vitro с образованием дисульфидных
мостиков, т.е. связывания этих цепей дисульфидными связями (JP-B-63-18960). Однако этот метод является малоэффективным для получения инсулина. Затем, Eli Lilly Corp. разработали более усовершенствованный метод, который предусматривает экспрессию проинсулина; образование дисульфидных мостиков in vitro; a затем отщепление С-пептида от данного продукта трипсином и карбоксипептидазой В с
образованием инсулина (JP-B-1-48278 и патент Японии № 2634176).
Другой метод был разработан Novo Nordisk Corp., и этот метод предусматривает экспрессию минипроинсулина, содержащего В-цепь и А-цепь, связанные между собой двумя основными аминокислотными остатками, в дрожжах; а затем обработку этого минипроинсулина трипсином in vitro с продуцированием инсулина (JP-B-7-121226 и патент Японии № 2553326). Этот метод имеет те преимущества, что
дисульфидные связи образуются в процессе экспрессии и секреции минипроинсулина, и что указанный
минипроинсулин может быть легко выделен и очищен вследствие его секреции в культуральную среду.
-1-
005586
Разработка новых методов получения рекомбинантного инсулина была успешно продолжена.
Hoechst Corporation разработала метод, предусматривающий экспрессию производного инсулина или
препроинсулина нового типа в E.coli; образование дисульфидных связей in vitro; а затем обработку данного продукта лизилэндопептидазой или клострипаином/карбоксипептидазой В, в результате чего продуцировался инсулин (JP-A-2-195896, JP-A-2-225498, JP-A-2-233698, JP-A-3-169895, JP-A-4-258296, JPA-228191 и JP-A-7-265092). Недавно ВIO-TECHNOLOGY GENERAL CORPORATION был разработан
метод, в котором гибридный белок, содержащий супероксиддисмутазу (СОД), связанную с проинсулином, экспрессировали в E.coli в целях увеличения как эффективности экспрессии, так и эффективности
образования дисульфидных связей, после чего проинсулин превращался в инсулин под действием трипсина и карбоксипептидазы В (WO 96/20724). Таким образом, были разработаны различные способы получения рекомбинантного инсулина и, кроме того, была увеличена эффективность экспрессии и эффективность образования дисульфидных связей и превращения в инсулин.
Для получения рекомбинантных белков был использован широкий ряд хозяев, включая микроорганизмы, животные и растения. Из вышеперечисленных хозяев, наиболее часто используются микроорганизмы из-за легкости обращения с ними и высокой промышленной применимости, а наиболее известными являются Escherichia coli и дрожжи. Недавно, стала известна применимость Bacillus brevis в качестве
экспрессирующей системы, для экспрессии рекомбинантных белков (см. патент Японии № 2082727; JPA-62-201583; Yamagata H. et al., J. Bacteriol. 169:1239-1245, 1987; Juzo Udaka, Nihon Nogei Kagakushi 61,
669-676, 1987; Takao M. et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 30:75-80, 1989; Yamagata H. et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 86:3589-3593, 1989).
Целью настоящего изобретения является разработка экспрессирующей системы и способа получения инсулина с высокими выходами и эффективностью продуцирования, равными или превышающими
выходы и эффективность уже существующих систем продуцирования рекомбинантного инсулина. Таким
образом, целью настоящего изобретения является разработка нового способа превращения инсулинового
предшественника в инсулин; среды, в которой могут быть образованы дисульфидные связи, необходимые для обеспечения активности инсулина; и высокопродуктивной экспрессирующей системы.
Сущность изобретения
В одном из своих аспектов, настоящее изобретение относится к ДНК, кодирующей гибридный белок формулы (I)
[Y]-[X1]-[В-цепь]-[Х2]-[линкер]-[Х3]-[А-цепь]
(I)
где
Y представляет лидерную пептидную последовательность для экспрессии и секреции белка, содержащую по крайней мере один аминокислотный остаток;
X1 представляет аминокислотную последовательность, расщепляемую ферментативно или химически;
В-цепь представляет аминокислотную последовательность В-цепи инсулина;
Х2 представляет аминокислотную последовательность, расщепляемую ферментативно;
Линкер представляет линкерную последовательность, содержащую по крайней мере один аминокислотный остаток;
Х3 представляет аминокислотную последовательность, расщепляемую ферментативно; и
А-цепь представляет аминокислотную последовательность А-цепи инсулина, и
где Y, X1, В-цепь, Х2, линкер, Х3 и А-цепь присоединены в порядке, указанном в формуле (I).
В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к ДНК, кодирующей гибридный белок
формулы (II)
[В-цепь]-[Х2]-[линкер]-[Х3]-[А-цепь]
(II)
где
В-цепь представляет аминокислотную последовательность В-цепи инсулина;
Х2 представляет аминокислотную последовательность, расщепляемую ферментативно;
линкер представляет линкерную последовательность, содержащую по крайней мере один аминокислотный остаток;
Х3 представляет аминокислотную последовательность, расщепляемую ферментативно; и
А-цепь представляет аминокислотную последовательность А-цепи инсулина, и
где В-цепь, Х2, линкер, Х3 и А-цепь присоединены в порядке, указанном в формуле (II).
В одном варианте осуществления настоящего изобретения аминокислотная последовательность X1,
Х2 или Х3, которая используется для ферментативного расщепления гибридного белка, представляет
собой последовательность, расщепляемую тромбином. Так, например, аминокислотная последовательность, расщепляемая тромбином, представляет собой следующую последовательность:
X1=GlySerLeuGlnProArg (SEQ ID NO:1);
Х2=ArgGlyHisArgPro (SEQ ID NO:2); или
X3=ProArg.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения линкерная последовательность имеет
следующую аминокислотную последовательность:
-2-
005586
GluAlaGluAspLeuGlnValGlyGlnValGluLeuGlyGlyGlyProGlyAla
GlySerLeuGlnProLeuAlaLeuGluGlySerLeuGln (SEQ ID NO:3).
Еще в одном варианте осуществления настоящего изобретения, лидерная пептидная последовательность может содержать 9 N-концевых аминокислотных остатков (т.е., аминокислотные положения 19) белка MWP, который является одним из белков клеточной стенки (CWP) бактерии, принадлежащей к
роду Bacillus. В этом случае, ДНК может включать участок, кодирующий сигнальный пептид CWP, присоединенный у 5'-конца этой ДНК.
Примером ДНК по настоящему изобретению является ДНК, содержащая нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO:21. Более
конкретно, указанная ДНК содержит нуклеотидную последовательность, показанную в SEQ ID NO:20.
В другом своем аспекте, настоящее изобретение относится к ДНК, содержащей последовательность
ДНК, которая включает промоторную область, необходимую для экспрессии рекомбинантного белка в
прокариотическом или в эукариотическом организме, где указанная последовательность ДНК присоединена у 5'-конца ДНК, определенной выше.
В другом варианте настоящего изобретения последовательность ДНК, которая содержит промоторную область, выделена из бактерии, принадлежащей к роду Bacillus, а предпочтительно она происходит
от CWP бактерии, принадлежащей к роду Bacillus.
В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к вектору, содержащему ДНК, определенную выше.
Еще в одном своем аспекте настоящее изобретение относится к клетке-хозяину, трансформированной данным вектором. Клеткой-хозяином предпочтительно является бактерия, принадлежащая к роду
Bacillus, такая как Bacillus brevis.
В другом своем аспекте, настоящее изобретение относится к способу получения инсулина, где указанный способ предусматривает
культивирование данной клетки-хозяина или бактерии в культуральной среде для экспрессии гибридного белка, кодируемого интересующей ДНК в указанной клетке-хозяине или в бактерии;
сбор гибридного белка; и
обработку данного гибридного белка путем ферментативного расщепления с выделением инсулина.
В этом аспекте, примером указанной ДНК является ДНК, содержащая нуклеотидную последовательность, приведенную в SEQ ID NO:20, а примером указанного гибридного белка является белок, содержащий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO:21.
В данном способе, экспрессированный гибридный белок может быть выделен и очищен из указанной клетки-хозяина или из указанной бактерии, или из указанной культуральной среды. В соответствии с
одним из вариантов осуществления настоящего изобретения, ферментативное расщепление может быть
осуществлено под действием тромбина и карбоксипептидазы В.
Краткое описание фигур
На фиг. 1 проиллюстрировано превращение гибридного белка MWPmp9-GSLQPR-B-цепь-RGHRPлинкep-PR-A-цeпь в инсулин.
На фиг. 2 представлены аминокислотная последовательность гибридного белка MWPmp9-GSLQPRB-цепь-RGHRP-линкep-PR-A-цепь и нуклеотидная последовательность, кодирующая этот белок.
На фиг. 3 схематически представлена диаграмма, на которой показан способ встраивания гибридной ДНК в экспрессирующий вектор Bacillus brevis (pNU211R2L5).
На фиг. 4 представлена фотография электрофореза среды после культивирования трансформантов:
дорожка 1 - маркерный пептид; дорожка 2 - негативный контроль (т.е. трансформанты, полученные
только с плазмидой pNU211R2L5 и без чужеродного белка); и дорожка 3 - трансформант MWPmp9GSLQPR-B-цепь-RGHRP-линкер-PR-A-цепь.
На фиг. 5 показана хроматограмма гибридного белка MWPmp9-GSLQPR-В-цепь-RGНRР-линкерРR-А-цепь, выделенного и очищенного с помощью хроматографии на XL.
На фиг. 6 показана хроматограмма гибридного белка MWPmp9-GSLQPR-B-цепь-RGHRP-линкepPR-A-цепь, выделенного и очищенного с помощью ВЭЖХ.
На фиг. 7 проиллюстрировано пептидное картирование инсулина ITOHAM (по настоящему изобретению) и Новолина (Novolin 40, который является коммерчески доступным инсулином, поставляемым
Novo Nordisk Pharma).
На фиг. 8 показаны профили элюции инсулина ITOHAM (по настоящему изобретению) и Новолина.
На фиг. 9 показана временная зависимость содержания глюкозы в плазме после введения инсулина
ITOHAM (по настоящему изобретению) и Новолина.
На фиг. 10 показана временная зависимость содержания инсулина в плазме после введения инсулина ITOHAM (по настоящему изобретению) и Новолина.
Подробное описание изобретения
ДНК по настоящему изобретению имеет структуру, представленную вышеуказанной формулой (I)
или (II). ДНК формулы (I) включает лидерную пептидную последовательность для экспрессии и секреции интересующего гибридного белка, содержащую по крайней мере один аминокислотный остаток (Y);
-3-
005586
аминокислотную последовательность, расщепляемую ферментативно или химически (X1); аминокислотную последовательность В-цепи инсулина (В-цепь); аминокислотную последовательность, расщепляемую ферментативно (Х2); линкерную последовательность, содержащую по крайней мере один аминокислотный остаток (линкер); аминокислотную последовательность, расщепляемую ферментативно (Х3);
и аминокислотную последовательность А-цепи инсулина (А-цепь), где Y, X1, В-цепь, Х2, линкер, Х3 и
А-цепь соединены в указанном порядке. ДНК формулы (II) включает аминокислотную последовательность В-цепи инсулина (В-цепь); аминокислотную последовательность, расщепляемую ферментативно
(Х2); линкерную последовательность, содержащую по крайней мере один аминокислотный остаток (линкер); аминокислотную последовательность, расщепляемую ферментативно (Х3); и аминокислотную последовательность А-цепи инсулина (А-цепь), где В-цепь, Х2, линкер, Х3 и А-цепь соединены в указанном порядке. Присутствие лидерной пептидной последовательности позволяет секретировать продукт
экспрессии за пределы клетки-хозяина, а ее отсутствие обеспечивает накопление продукта экспрессии в
данной клетке-хозяине.
В описанных ниже примерах для осуществления превращения гибридного белка в инсулин под
действием тромбина и карбоксипептидазы В был сконструирован новый модифицированный инсулин, в
котором сайты расщепления тромбином расположены между В-цепью инсулина и линкерным пептидом
и между линкерным пептидом и А-цепью инсулина. Затем модифицированный проинсулин соединяют
по N-концу с N-концевыми 9 аминокислотами белка клеточной стенки (CWP) Bacillus brevis, служащими
в качестве линкерного пептида, а третий сайт расщепления тромбином, который позволяет отщеплять
модифицированный проинсулин от лидерного пептида, затем присоединяют непосредственно за лидерным пептидом, что обеспечивает соответствующее окружение для образования дисульфидных связей и
экспрессию модифицированного проинсулина в Bacillus brevis. Таким способом может быть сконструирован линейный искусственный гибридный белок, включающий лидерный пептид, сайт расщепления
тромбином, В-цепь инсулина, сайт расщепления тромбином, линкерный пептид, сайт расщепления тромбином и А-цепь инсулина в указанном порядке. Сначала получают ДНК, кодирующую соответствующий
гибридный белок, а затем встраивают ее в подходящий экспрессирующий вектор. Затем указанный вектор вводят в подходящую клетку-хозяина. Трасформированную клетку-хозяина культивируют для экспрессии ДНК с последующим продуцированном гибридного белка. Затем гибридный белок ферментативно расщепляют тромбином и карбоксипептидазой В. Таким образом, может быть получен инсулин,
имеющий желаемую первичную структуру и биологическую активность, идентичные структуре и активности природного инсулина.
Настоящее изобретение более подробно проиллюстрировано ниже.
Лидерный пептид (Y), который содержит по крайней мере один аминокислотный остаток, необходимый для экспрессии интересующего белка, включает известный МBР (Maina C.V. et al., Gene 74:365373, 1988), GST (Smith, D.B., et al.. Gene 67:31-40, 1988), TRX (LaVallie, E.R. et al. Bio/Technology 11:187193, 1993), DsbA (Collins-Racie, L.A., et al., Bio/Technology 13:982-987, 1995) и LamB (Benson S.A. et al.,
Cell 32:1325-1335, 1983) из E.coli; и α-фактор, происходящий от дрожжей (Brake A.J., Yeast Genetic Engineering, p.269-280, 1989). В частности, указанный лидерный пептид часто бывает необходим для E.coli,
если интересующий белок секретируется в периплазму, или, для дрожжей, если указанный белок секретируется в культуральную среду. В соответствии с одним из вариантов осуществления изобретения,
предпочтительный лидерный пептид содержит N-концевые 9 аминокислот CWP бактерии, принадлежащей к роду Bacillus (далее иногда называемой "бактерией Bacillus"). CWP, применимый в соответствии с
настоящим изобретением, включает, не ограничиваясь CWP из штамма 47 Bacillus brevis (FERM P-7224;
JP-A-60-58074 и JP-A-62-201589), и штамма HPD 31 (FERM ВР-1087; JP-A-4-278091). В частности, могут
быть использованы следующие последовательности (где в скобках указаны ссылки).
MWPmp9: AlaGluGluAlaAlaThrThrThrAla
(SEQ ID NO:4; J. Bacteriol., 169:1239-1245, 1989)
OWPmp9: AlaProLysAspGlyIleTyrIleGly
(SEQ ID NO:5; J. Bacteriol., 170:176-186, 1988)
HWPmp9: AlaGluAspThrThrThrAlaProLys
(SEQ ID NO:6; J. Bacteriol., 172:1312-1320, 1990).
Число аминокислотных остатков от N-конца CWP необязательно должно быть равно 9, при условии, что может быть экспрессирован гибридный белок. Так, например, может быть использована последовательность, содержащая N-концевые 1-50 аминокислотных остатков CWP бактерии Bacillus. Лидерный пептид не всегда является необходимым, если часть гибридного белка, находящаяся за В-цепью инсулина гибридного белка, а именно [В-цепь]-[Х2]-[линкер]-[Х3]-[А-цепь], соединена с 3'-концом ДНК,
содержащей промоторную область экспрессирующей системы, что позволяет экспрессировать данную
часть гибридного белка. Если указанный гибридный белок содержит лидерный пептид CWP, то предпочтительно, чтобы указанный лидерный пептид был присоединен к сигнальному пептиду CWP (а в частности, MWP) у его 5'-конца. Информацию, касающуюся последовательностей MWP, можно найти в работах Yamagata H. et al., J. Bacteriol., 169:1239-1245, 1987 или Tsuboi A. et al., J. Bacteriol., 170:935-945,
1988, и в работах, на которые имеются ссылки. Сигнальный пептид обычно направляет экспрессирован-4-
005586
ный и транслированный белок к клеточной мембране и способствует внеклеточной секреции данного
белка. Секретированный белок является предпочтительным, поскольку он может быть более легко выделен и очищен по сравнению с несекретированным белком.
Для гибридного белка ферментативное расщепление X1 предусматривает использование фермента,
который не содержит сайта расщепления в В-цепи инсулина или А-цепи инсулина, такого как фактор Ха,
тромбин и энтерокиназа. При присоединении остатка Gly или Ser к N-концу В-цепи инсулина, если такой
остаток не влияет на активность полученного инсулина, может быть использована протеаза TEV. С другой стороны, химическое расщепление X1 может включать селективное расщепление у С-конца метионина (J. Biol. Chem. , 237:1856-1860, 1962) и селективное расщепление у С-конца триптофана (Methods in
Enzymol., 91:318-324, 1983). В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления настоящего
изобретения, каждый из Х1-Х3 может быть расщеплен одновременно, где используемым ферментом является тромбин, а аминокислотными последовательностями Х1-Х3 являются X1=GlySerLeuGlnProArg
(SEQ ID NO:1); X2=ArgGlyHisArgPro (SEQ ID NO:2); и Х3=ProArg. В этом случае, могут быть также использованы X1, X2 и Х3 с другими аминокислотными последовательностями, при условии, что может
быть осуществлено нужное расщепление тромбином. Так, например, в вышеуказанных аминокислотных
последовательностях, для такого расщепления возможны следующие замены: для X1 и Х3, Ser=Val, Glu,
Phe, Asp, Pro, Ile, Gly, Lys, Arg, Ala, Gln, Asn или Leu; Leu=Arg, Val, Phe, Asp, Gly, Leu, His, Ile, Met, Thr
или Lys; Gln=Glu, Phe, Tyr, Gly, Ile, Asn, Ala, Arg, Thr, Ser, Leu, Val или Cys; Pro=Ala или Val; и Arg=Lys
(Chang, J-Y, Eur. J. Biochem., 151:217-224, 1985; Kawabata S. et al., Eur. J. Biochem., 172:17-25, 1988); а для
Х2, Arg=Lys; Gly=Thr, Ile, His, Ser, Ala, Phe, Val, Asn, Asp, Leu или Pro; His=Pro, Trp, Cys, Gln, Thr, Ser,
Val, Leu, Ala, Phe или Gly; Arg=Val, Pro, Glu, Asn, Asp, Ser, Met, Lys, Ala, Gln, Gly, Trp или Thr; Pro=Val,
Thr, Leu, Ser, Asp, Gly, Tyr, Ile, Asn, Arg, His или Glu (Chang J.-Y. Eur. J. Biochem., 151:217-224, 1985).
Линкер, содержащий по крайней мере один аминокислотный остаток, обычно находится между
функциональными доменами в белке и может присоединять указанные домены, не оказывая какого-либо
влияния на функции этих доменов. В настоящем изобретении, указанный линкер локализован между Вцепью инсулина и А-цепью инсулина, связанный с ними посредством каждой ферментативно расщепляемой последовательности, и служит для образования дисульфидных связей между В-цепью инсулина и
А-цепью инсулина и для облегчения экспрессии данного гибридного белка. Этот линкер может содержать, по крайней мере, один аминокислотный остаток, и, при этом, может быть использована любая
аминокислота(ы), при условии, что она несет ту же самую функцию. В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения, указанный линкер может предпочтительно содержать С-пептид проинсулина. В соответствии с одним из вариантов осуществления настоящего изобретения, указанный линкер имеет следующую последовательность:
GluAlaGluAspLeuGlnValGlyGlnValGluLeuGlyGlyGlyProGlyAlaGly
SerLeuGlnProLeuAlaLeuGluGlySerLeuGln (SEQ ID NO:3).
В настоящем изобретении ДНК, кодирующая гибридный белок, экспрессируется в форме, присоединенной к 3'-концу ДНК, содержащей промоторную область для используемой экспрессирующей системы. Примерами такого промотора являются промотор бактериофага λpL, промотор Т7, промотор trplac E. coli (Maniatis Т. et al., Molecular Cloning 2nd ed., A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory,
1989), промотор PRBI дрожжей (BIO/TECHNOLOGY 9:183-187, 1991), промотор GAPDH
(BIO/TECHNOLOGY 12:381-384, 1994), вирусный промотор LTR, промотор SV40 (Maniatis, Т. et al.,
Molecular Cloning 2nd ed., A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989). В соответствии с
одним из вариантов осуществления настоящего изобретения указанный гибридный белок присоединен к
3'-концу последовательности ДНК, содержащей промоторную область бактерии Bacillus. Доступные
промоторы включают, не ограничиваясь, промотор MWP из штамма 47 Bacillus brevis (JP-A-1-58950 и
JP-A-7-108224) и промотор HWP из штамма HPD31 Bacillus brevis (JP-A-4-278091 и JP-A-6-133782).
ДНК по настоящему изобретению может быть получена любой комбинацией методов, известных
специалистам. Так, например, составляющие последовательности ДНК могут быть получены отдельно
методами химического синтеза или методами клонирования и последовательно лигированы с помощью
лигазы, а полученная последовательность ДНК целиком может быть подвергнута полимеразной цепной
реакции (ПЦР) с получением желаемой ДНК. Детали конкретного способа получения указанной ДНК
будут очевидны из приведенных ниже примеров. Для получения ДНК могут быть использованы стандартные методы, например, методы, описанные Maniatis Т. et al., Molecular Cloning 2nd ed., A Laboratory
Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989; и Innis, M.A., et al., PCR Protocols, A guide to methods and
applications. Academic Press, 1990.
ДНК, кодирующая человеческий инсулин, содержащий В-цепь, С-пептид и А-цепь, может быть получена с использованием коммерчески доступной мРНК, выделенной из поджелудочной железы человека, с использованием коммерчески доступного набора для синтеза первой цепи кДНК (Pharmacia) и т.п.
Если короткие цепи ДНК (в качестве праймеров) могут быть синтезированы на основе известных последовательностей ДНК с использованием коммерчески доступного ДНК-синтезатора, то ДНК-фрагменты,
кодирующие В-цепь, С-пептид и А-цепь, могут быть амплифицированы стандартным ПЦР-методом. В
этом случае, ПЦР может быть проведена в 20 или более циклов при следующих условиях: денатурация
-5-
005586
ДНК (например, при 94°С, 30 с-1 мин); отжиг с праймером (например, приблизительно при 45-60°С, 30
с-1 мин); и реакция удлинения (например, при 72°С, 30 с или более).
Настоящее изобретение также относится к вектору, содержащему данную ДНК. Необходимо, чтобы
вектор, который может быть использован в настоящем изобретении, обладал, по крайней мере, следующими свойствами: чтобы он имел соответствующий сайт инсерции (т.е. сайт рестрикции), в который может быть встроена ДНК по настоящему изобретению; чтобы он мог экспрессировать данную ДНК в
клетке-хозяине; и чтобы он автономно реплицировался в данной клетке-хозяине. Указанный вектор
обычно содержит промотор, который функционально связан с расположенной ниже интересующей ДНК.
Этот вектор может содержать сайт инициации репликации и терминирующую последовательность, а
также может содержать отбираемый маркер, такой как ген резистентности к лекарственному средству
или ген, придающий ауксотрофию. Предпочтительным вектором по настоящему изобретению является
плазмида, которая реплицируется в бактерии Bacillus. Примеры такой плазмиды включают, не ограничиваясь, pNU200, pHY500 (Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86:3589-3593, 1989), pHY4831 (J. Bacteriol. 169:12391245, 1987), pNU100 (Appl. Microbiol. Biotechnol., 30:75-80, 1989), pNU211 (J. Biochem., 112:488-491,
1992), pNU211R2L5 (выложенная заявка на патент Японии № 7-170984), pHY700 (выложенная заявка на
патент Японии № 4-278091), рНТ210 (выложенная заявка на патент Японии № 6-133782), pHT110R2L5
(Appl. Microbiol. Biotechnol., 42:358-363, 1994). В соответствии с вариантом осуществления настоящего
изобретения, экспрессирующий вектор pNU-mPINS может быть получен путем конструирования, как
проиллюстрировано на фиг. 3.
Настоящее изобретение также относится к клетке-хозяину, трансформированной вектором, определенным выше. Указанной клеткой-хозяином могут быть прокариотические клетки (например, бактерии) или эукариотические клетки (например, грибы, дрожжи, клетки животных, клетки растений), а предпочтительно
бактерия Bacillus. Примеры бактерии Bacillus, используемой в качестве хозяина, включают, не ограничиваясь,
штамм 47 Bacillus brevis (FERM P-77224; JP-A-60-58074 и JP-A-62-201589), штамм 47К (JP-A-2-257876),
штамм 310К (JP-A-6-296485) и штамм HPD31 (FERM BP-1087; JP-А-4-27809). Рекомбинантный штамм 47-5Q
бактерии Bacillus brevis, трансформированный экспрессирующим вектором pNU-mPINS, был депонирован в
соответствии с Будапештским договором 20 апреля 1999 Национальным институтом биологических наук и
биотехнологии человека. Управлением промышленных наук и технологии, Япония (1-3, Higashi 1-chome,
Tsukuba-shi, Ibaragi-ken, Japan) с присвоением номера № FERM BP-6706.
Затем экспрессирующий вектор, полученный как описано выше, вводят в компетентную клеткухозяина, предпочтительно бактериальную клетку Bacillus. Эту бактериальную клетку культивируют в
подходящей культуральной среде в условиях, способствующих экспрессии данной ДНК, для внеклеточного или внутриклеточного продуцирования интересующего рекомбинантного гибридного полипептида,
предпочтительно, для внеклеточного продуцирования. После этого, рекомбинантный гибридный полипептид собирают и очищают. Введение экспрессирующего вектора в клетку-хозяина может быть осуществлено любым стандартным методом, таким как электропорация (Methods in Enzymol., 217:23-33, 1993).
Очистка данного гибридного полипептида может быть осуществлена путем соответствующей комбинации любых стандартных методов, таких как экстракция растворителем, ультрафильтрация, фракционирование сульфатом аммония, ВЭЖХ, гель-фильтрация, ионообменная хроматография, аффинная хроматография, гидрофобная хроматография, электрофорез и изоэлектрическое фокусирование.
Гибридный белок может быть обработан протеазой и/или пептидазой, которая может ферментативно расщеплять данный гибридный белок, такой как тромбин и карбоксипептидаза В, используемые в нижеописанных примерах, в результате чего может быть продуцирован инсулин. Как проиллюстрировано
на фиг. 1, сначала тромбин расщепляет полипептид на участке между лидерным пептидом (Y) и Вцепью, между В-цепью и линкером и между линкером и А-цепью, в подходящих условиях. Для специфичного расщепления тромбином предпочтительными являются следующие условия; рН 7,5-8,5 (предпочтительно с использованием трис-буфера); температура - 3-6°С, предпочтительно 4°С; отношение субстрат:фермент=5:1-125:1 (молярное отношение), а более предпочтительно 25:1; период времени 1-24 ч.
Затем, карбоксипептидаза В удаляет остаток Аrg, присутствующий у С-конца В-цепи, в результате чего
продуцируется инсулин (см. фиг. 1). Эти ферменты могут быть использованы в количествах, достаточных для расщепления гибридного белка.
В соответствии с настоящим изобретением инсулин может быть получен путем культивирования
трансформированной бактерии Bacillus, полученной как описано выше, с накоплением гибридного белка,
содержащего инсулиновую последовательность, за пределами клетки, с последующим расщеплением
собранного гибридного белка.
Полученный таким образом рекомбинантный инсулин имеет такую же аминокислотную последовательность, дисульфидные мостики и биологическую активность, как и природный инсулин, а поэтому он
может быть использован в качестве лекарственного препарата для лечения инсулинзависимого сахарного
диабета.
Примеры
Более подробно настоящее изобретение проиллюстрировано в нижеследующих примерах. Однако
эти примеры не должны рассматриваться как ограничение объема настоящего изобретения.
-6-
005586
При получении ДНК, кодирующей гибридный белок, использовался способ, в котором ДНКфрагменты, амплифицированные с помощью ПЦР, лигировали посредством реакции лигирования с
ДНК-лигазой. В данном описании, термин "MWPsp" означает сигнальный пептид MWP, а термин
'"MWPmp9" означает 9 N-концевых аминокислотных остатков зрелого MWP.
Пример 1. Конструирование вектора (pmPINS), содержащего интергированную в нем гибридную
ДНК MWPsp-MWPmp9-GSLQPR-B-цепь-RGHRP-линкep-PR-A-цепь.
(1) Получение ДНК-фрагмента для MWPsp-MWPmp9.
а. ДНК-матрица.
Геномную ДНК экстрагировали из штамма 47-5Q Bacillus brevis известным методом (Molecular
Cloning 2nd ed., A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989): 800 нг,
b. Праймеры.
Прямой праймер: 5'-GTCGTTAACAGTGTATTGCT-3' (SEQ ID NО:7).
Обратный праймер: 5'-AGCTGTAGTAGTTGCTGC-3' (SEQ ID NO:8).
Эти праймеры были химически синтезированы исходя из нуклеотидной последовательности MWP,
определенной Yamagata, Н. et al. (J.Bacteriol., 169:1239-1245, 1987) и Tsuboi, A. et al. (J.Bacteriol., 170:935945, 1988), и добавляли в конечной концентрации 0,1 мкМ.
с. ДНК-полимераза Taq.
Добавляли коммерчески доступный продукт (GIBCO BRL) (5 ед.).
d. Другие материалы.
Добавляли Трис-НСl (конечная концентрация: 20 мМ, рН 8), MgCl2 (конечная концентрация: 2,5
мМ), dNTP (dATP, dGTP, dCTP, dTTP; конечная концентрация: 50 мкМ для каждого).
Материалы "a"-"d" смешивали в пробирке емкостью 0,5 мл так, чтобы полный объем реакционного
раствора был равным 100 мкл. Затем осуществляли ПЦР-реакцию стандартным способом (Innis, M.A., et
al., PCR Protocols, A guide to methods and applications. Academic Press, 1990) в следующих условиях: температура денатурации: 94°С - 1 мин; температура отжига: 50°С - 1 мин; температура удлинения ДНКцепи: 72°С - 1 мин; 30 циклов. После завершения ПЦР, реакционный раствор концентрировали фенолом,
а затем наносили на 0,8% агарозный гель для проведения электрофореза в стандартных условиях. Указанный агарозный гель обрабатывали с использованием фильтра Ultrafree C3H (Millipore) для сбора продукта ПЦР (то есть, ДНК-фрагмента для MWPsp-MWPmp9). Собранный продукт ПЦР экстрагировали
фенолом, осаждали этанолом, а затем сушили в вакууме. Осушенный продукт растворяли в соответствующем объеме дистиллированной воды, а затем подвергали реакции затупления концов с использованием набора для затупления ДНК (Takara Shuzo Со, Ltd.) в соответствии с инструкциями производителя.
(2) Получение ДНК-фрагмента для проинсулина.
Затупленный по концам ДНК-фрагмент для проинсулина получали способом, упомянутым в (1), за
следующими исключениями.
В качестве ДНК-матрицы использовали плазмидный вектор, содержащий интегрированную в нем
ДНК препроинсулина человека (10 мг). Этот рекомбинантный плазмидный вектор получали следующим
образом. кДНК поджелудочной железы человека синтезировали из коммерчески доступной мРНК поджелудочной железы человека (CLONTECH) с использованием набора для синтеза 1-ой цепи кДНК
(Pharmacia) в соответствии с инструкциями производителя. ПЦР осуществляли с использованием кДНК в
качестве матрицы и прямого праймера: 5'-ATGGCCCTGTGGATGCGCC-3' (SEQ ID NO:9) и обратного
праймера: 5'-CTAGTTGCAGTAGTTCTCC-3' (SEQ ID NO:10), оба из которых были синтезированы на
основе нуклеотидной последовательности гена препроинсулина человека, определенного Bell G.I. и др.
(Nature, 282:525-527, 1979) в следующих условиях: 94°С - 1 мин; 60°С - 1 мин; 72°С - 1 мин; 35 циклов.
Продукт ПЦР, т.е. ДНК препроинсулина человека, был клонирован в вектор pGEM-T (Promega).
В качестве праймеров использовали прямой праймер: 5'-ТТТGТGААССААСАССТG-3' (SEQ ID
NO:11) и обратный праймер: 5'-CTAGTTGCAGTAGTTCTCC-3' (SEQ ID NO:10).
Были использованы следующие ПЦР-условия: температура денатурации: 94°С - 1 мин; температура
отжига: 47°С - 1 мин; температура удлинения ДНК-цепи: 72°С - 30 с; 25 циклов.
(3) Получение ДНК-фрагмента для GSLQPR-B-цепь-R.
Затупленный по концам ДНК-фрагмент для GSLQPR-B-цепь-R получали способом, упомянутым в
(1), за следующими исключениями: Полученный ДНК-фрагмент подвергали реакции фосфорилирования
с использованием полинуклеотид-киназы Т4 (Nippon Gene Co., Ltd.) в соответствии с инструкциями производителя с получением фосфорилированного ДНК-фрагмента для GSLQPR-B-цепь-R.
В качестве ДНК-матрицы использовали продукт ПЦР проинсулина, полученный в (2) (10 нг).
В качестве праймеров использовали прямой праймер: 5'-GGTTCCTTGCAACCTCGTTTTGT
GAACCAACACCTG-3' (SEQ ID NO:12) и обратный праймер: 5'-GCGGGTCTTGGGTGTGTA-3' (SEQ ID NO:13).
Были использованы следующие ПЦР-условия: температура денатурации: 94°С - 1 мин; температура
отжига: 47°С - 1 мин; температура удлинения ДНК-цепи: 72°С - 30 с; 25 циклов.
(4) Получение ДНК-фрагмента для линкера.
Затупленный по концам ДНК-фрагмент для линкера получали способом, упомянутым в (1), за следующими исключениями.
-7-
005586
В качестве ДНК-матрицы использовали продукт ПЦР проинсулина, полученный в (2) (10 нг).
В качестве праймеров использовали прямой праймер: 5'-GAGGCAGAGGACCTGCAG-3' (SEQ ID
NO:14) и обратный праймер: 5'-GTGCAGGGACCCCTCCAG-3' (SEQ ID NO:15).
Были использованы следующие ПЦР-условия: температура денатурации: 94°С - 1 мин; температура
отжига: 55°С - 1 мин; температура удлинения ДНК-цепи; 72°С - 30 с; 25 циклов.
(5) Получение ДНК-фрагмента для GHPR-линкера.
Затупленный по концам ДНК-фрагмент для GHRP-линкера получали способом, упомянутым в (4),
за следующими исключениями: Полученный ДНК-фрагмент подвергали реакции фосфорилирования с
использованием полинуклеотид-киназы Т4 (Nippon Gene Co., Ltd.) в соответствии с инструкциями производителя с получением фосфорилированного ДНК-фрагмента для GHRP-линкера.
В качестве ДНК-матрицы использовали продукт ПЦР (ДНК-фрагмент для линкера), полученный в
(4) (10 нг).
В качестве прямого праймера использовали праймер: 5'-GGTCACCGTCCAGAGGCAGAGGACCTG
CAGGTGGGG-3' (SEQ ID NO:16).
Были использованы следующие ПЦР-условия: температура денатурации: 94°С - 1 мин; температура
отжига: 55°С - 1 мин; температура удлинения ДНК-цепи: 72°С - 30 с; 25 циклов.
(6) Получение ДНК-фрагмента для А-цепи.
Затупленный по концам ДНК-фрагмент для А-цепи получали способом, упомянутым в (1), за следующими исключениями.
В качестве ДНК-матрицы использовали продукт ПЦР для проинсулина, полученный в (2) (10 нг).
В качестве праймеров использовали прямой праймер: 5'-GGCATTGTGGAACAATGCTGT-3' (SEQ
ID NO:17) и обратный праймер: 5'-CTAGTTGCAGTAGTTCTCCAGCTGGTA-3' (SEQ ID NO:18).
Были использованы следующие ПЦР-условия: температура денатурации: 94°С - 1 мин; температура
отжига: 55°С - 1 мин; температура удлинения ДНК-цепи: 72°С - 30 с; 25 циклов.
(7) Получение ДНК-фрагмента для PR-A-цепи.
Затупленный по концам ДНК-фрагмент для PR-A-цепи получали способом, упомянутым в (6), за
следующими исключениями. Полученный ДНК-фрагмент подвергали реакции фосфорилирования с использованием полинуклеотид-киназы Т4 (Nippon Gene Co., Ltd.) в соответствии с инструкциями производителя с получением фосфорилированного ДНК-фрагмента для PR-A-цепи.
В качестве ДНК-матрицы использовали продукт ПЦР (т.е. ДНК-фрагмент для А-цепи), полученный
в (6) (10 нг).
В качестве прямого праймера использовали праймер: 5'-CCACGTGGCATTGTGGAACAATGCTGT3' (SEQ ID NO:19).
Были использованы следующие ПЦР-условия: температура денатурации: 94°С - 1 мин; температура
отжига: 55°С - 1 мин; температура удлинения ДНК-цепи: 72°С - 30 с; 25 циклов.
(8) Получение гибридной ДНК для MWPsp-MWPmp9-GSLQPR-B-цепь-R.
Затупленный по концам ДНК-фрагмент для MWPsp-MWPmp9-GSLQPR-B-цепь-R получали способом, упомянутым в (1), за следующими исключениями.
В качестве ДНК-матрицы использовали продукт ПЦР, полученный путем смешивания соответствующего количества ДНК-фрагмента для MWPsp-MWPmp9, полученного в (1), и ДНК-фрагмента для
GSLQPR-B-цепь-R, полученного в (3), и эту смесь подвергали реакции с использованием набора для лигирования ДНК (Takara Shuzo Co., Ltd.) при 16°С в течение 30 мин.
В качестве обратного праймера использовали праймер: 5'-GCGGGTCTTGGGTGTGTA-3' (SEQ ID
NO:13).
Были использованы следующие ПЦР-условия: температура денатурации: 94°С - 1 мин; температура
отжига: 47°С - 1 мин; температура удлинения ДНК-цепи: 72°С - 30 с; 25 циклов.
Данный продукт ПЦР фосфорилировали с использованием полинуклеотид-киназы Т4 (Nippon Gene
Co., Ltd.) в соответствии с инструкциями производителя. Этот фосфорилированный продукт ПЦР гидролизовали ферментом Hinc II с использованием набора для лигирования ДНК (Takara Shuzo Co., Ltd.) и
интегрировали в вектор (STRATAGENE, Blue Script SK-). Штамм DH5α E.coli трансформировали данным вектором известным методом (Molecular Cloning 2nd. ed., A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor
Laboratory, 1989), а затем из указанного трансформанта выделяли вектор (т.е. плазмидную ДНК). Данную
плазмидную ДНК секвенировали с использованием прямого праймера (прямой праймер М13) или обратного праймера (обратный праймер М13) для подтверждения присутствия гибридной ДНК для MWPspMWPmp9-GSLQPR-B-цепь-R. Второй цикл ПЦР проводили вышеупомянутым способом с использованием вектора, имеющего гибридную ДНК для MWPsp-MWPmp9-GSLQPR-B-цепь-R, интегрированную в
нем в качестве ДНК-матрицы, прямого праймера: 5'-GTCGTTAACAGTGTATTGCT-3' (SEQ ID NO:7) и
обратного праймера: 5'-GCGGGTCTTGGGTGTGTA-3' (SEQ ID NO:13), в результате чего получали затупленную по концам гибридную ДНК для MWPsp-MWPmp9-GSLQPR-B-цепь-R.
(9) Получение гибридной ДНК для белка "MWPsp-MWPmp9-GSLQPR-B-цепь-RСНРR-линкер".
-8-
005586
Затупленную по концам гибридную ДНК для белка ″MWPsp-MWPmp9-GSLQPR-B-цепь-RGHRPлинкep" получали способом, упомянутым в (8), за следующими исключениями.
В качестве ДНК-матрицы для первого цикла ПЦР использовали продукт, полученный путем смешивания соответствующего количества гибридной ДНК для MWPsp-MWPmp9-GSLQPR-B-цепь-R, полученной в (8), и ДНК-фрагмента для гибрида "GHRP-линкер", полученного в (5), а затем полученную
смесь подвергали реакции с использованием набора для лигирования ДНК (Takara Shuzo Co., Ltd.) при
16°С в течение 30 мин.
В качестве обратного праймера использовали праймер: 5'-CTGCAGGGACCCCTCCAG-3' (SEQ ID
NO:15).
(10) Получение вектора, содержащего гибридную ДНК для гибрида ″MWPsp-MWPmp9-GSLQPR-Bцепь-RGHRP-линкep-PR-A-цепь", интегрированную в этом векторе.
Вектор, содержащий гибридную ДНК для белка "MWPsp-MWPmp9-GSLQPR-B-цепь-RGHRPлинкep-PR-A-цепь", интегрированную в этом векторе (pmPINS), получали способом, упомянутым в (8),
за следующими исключениями.
В качестве ДНК-матрицы для первого цикла ПЦР использовали продукт, полученный путем смешивания соответствующего количества гибридной ДНК для белка ″MWPsp-MWPmp9-GSLQPR-B-цепьRGHRP-линкep", полученного в (9), и ДНК-фрагмента для гибрида "РR-А-цепь", полученного в (7), а
затем полученную смесь подвергали реакции с использованием набора для лигирования ДНК (Takara
Shuzo Co., Ltd.) при 16°С в течение 30 мин.
В качестве обратного праймера для первого цикла ПЦР использовали праймер: 5'CTAGTTGCAGTAGTTCTCCAGCTGGTA-3' (SEQ ID NO:18).
Были использованы следующие ПЦР-условия: температура денатурации: 94°С - 1 мин; температура
отжига: 50°С - 1 мин; температура удлинения цепи ДНК: 72°С - 1 мин; 25 циклов.
Пример 2. Экспрессия и секреция гибридной ДНК.
(1) Нуклеотидная последовательность гибридной ДНК и аминокислотная последовательность гибридного белка, кодируемая данной гибридной ДНК.
Нуклеотидная последовательность гибридной ДНК, полученной в примере 1, и аминокислотная последовательность гибридного белка, кодируемая этой гибридной ДНК, показаны на фиг. 2.
(2) Экспрессия и секреция гибридной ДНК.
Осуществляли экспрессию гибридного белка, кодируемого данной гибридной ДНК, полученной в
примере 1. Указанную гибридную ДНК интегрировали в экспрессирующий вектор, как показано на фиг.
3.
Более конкретно, вектор pmPINS, в котором была интегрирована гибридная ДНК, гидролизовали
ферментами ApaL I и Hind III. Полученный гидролизованный продукт подвергали электрофорезу на 0,8%
агарозном геле и часть геля, содержащую данную гибридную ДНК, вырезали. Соответствующее количество вырезанной гибридной ДНК и экспрессирующего вектора для Bacillus brevis (pNU211R2L5; JP-A-7170984), который были гидролизованы ферментами ApaL I и Hind III, смешивали, и полученную смесь
подвергали реакции с использованием набора для лигирования ДНК (Takara Shuzo Co., Ltd.) при 16°С в
течение 30 мин, в результате чего эта гибридная ДНК была интегрирована в экспрессирующий вектор.
Таким образом, был получен экспрессирующий вектор pNU-mPINS, содержащий интегрированную в
нем гибридную ДНК. Штамм 47-5 Bacillus brevis (FERM BP-1664) трансформировали данным экспрессирующим вектором известным методом (Methods in Enzymol., 217:23-33, 1993), а затем высевали на культуральную среду с агаром Т2 [полипептон (1%), мясной экстракт (0,5%), дрожжевой экстракт (0,2%),
урацил (0,1 мг/мл), глюкоза (1%), эритромицин (10 мкг/мл), агар (1,5%); рН 7], и трансформанты собирали.
Трансформанты культивировали в культуральной среде Т2 (в среде, имеющей тот же самый состав,
что и культуральная среда с агаром Т2 за исключением того, что агар был удален) при 37°С в течение 1
дня, и выделяли плазмидную ДНК известным методом (Molecular Cloning 2nd.ed, A Laboratory Manual,
Cold Spring Harbor Laboratory, 1989). Плазмидную ДНК обрабатывали ферментами ApaLI и HindIII для
подтверждения присутствия интегрирований в ней гибридной ДНК. Что касается трансформанта, который, как было подтверждено, содержал интергированную в нем гибридную ДНК, то в нем осуществляли
экспрессию и секрецию гибридного белка, кодированного указанной интергрированной гибридной ДНК.
Клеточную суспензию, которая была культивирована в культуральной среде Т2 в течение 1 дня при
37°С, добавляли к среде для культивирования [полипептон (3%), дрожжевой экстракт (0,4%), глюкоза
(3%), MgSO4⋅7H2O (0,01%), MnSO4⋅4Н2О (0,001%), эритромицин (10 мкг/мл); рН 8] в отношении 1/1000
(по объему), а затем культивировали при встряхивании в течение 4 дней при 30°С.
После культивирования культуральную среду центрифугировали при 15000 об./мин в течение 2 мин
с получением супернатанта культуры. Это супернатант культуры подвергали электрофоретическому
анализу на белок известным методом (Laemmli, U.R., Nature, 227:680-685, 1970). То есть к указанному
супернатанту культуры (18 мкл) добавляли буфер 1 [125 MM Трис-HCl (рН 6,8), 20% глицерин, 4% ДСН,
10% 2-меркаптоэтанол] (2 мкл), и смешанный раствор кипятили в течение 5 мин. К полученному сме-9-
005586
шанному раствору добавляли буфер 2 [250 мМ Трис-HCl (рН 6,5), 50% глицерин, 0,5% ВРВ] (4 мкл). Полученный смешанный раствор подвергали электрофорезу в 15/25% полиакриламидном геле с ДСН (DAIICHI PURE CHEMICAL, Co Ltd.) (буфер для электрофореза: 100 мМ Трис, 100 мМ трицина, 0,1% ДСН).
После электрофореза, гель подвергали окрашиванию кумасси для определения экспрессии и секреции
гибридного белка. Как показано на фиг. 4, для культуральной среды клеток, трансформированных вектором pNU-mPINS, содержащим гибридную ДНК, была детектирована полоса (отмечена стрелкой), соответствующая данному гибридному белку (дорожка 3); тогда как для культуральной среды клеток, содержащих вектор без указанной гибридной ДНК, такая полоса не была детектирована (дорожка 2).
Пример 3. Превращение в инсулин.
(1) Выделение и очистка гибридного белка, MWPsp-MWPmp9-GSLQPR-В-цепь-RGНRР-линкер-РRА-цепь.
Клетки, трансформированные pNU-mPINS, культивировали при 37°С в течение 1 дня. Аликвоту (50
мкл) клеточной суспензии добавляли к культуральной среде [полипептон (3%), дрожжевой экстракт
(0,4%), глюкоза (3%), MgSO4⋅7H2O (0,01%), MnSO4⋅4H2O (0,001%), эритромицин (10 мкг/мл); рН 8] (50
мл). Смешанную культуральную среду отдельно загружали в шесть конических колб, емкостью 500 мл, а
затем культивировали при встряхивании в течение 4 дней при 30°С. Культуральную среду центрифугировали при 9000 об/мин в течение 20 мин. Супернатант диализовали против буфера [20 мМ NaPO4, 150
мМ, рН 8] при 4°С, а затем центрифугировали при 10000 об/мин в течение 20 мин. Этот супернатант наносили на Ni-хелатную колонку (Pharmacia; 5х10 см) для элюирования нужного гибридного белка буфером, в который был добавлен 60 мМ имидазол. К фракции элюции добавляли ЭДТА и бензамидин (1 мМ
каждого) и выдерживали при 4°С. После этого, к данной фракции элюции дополнительно добавляли мочевину (в конечной концентрации: 1 М) и цистеин (в конечной концентрации: 1 мг/мл). Полученный
смешанный раствор доводили до рН 10,8 с использованием 1 N NaOH и перемешивали при той же температуре в течение 1 ч. Раствор диализовали против буфера [20 мМ Трис, 1 мМ ЭДТА; рН 8,0]. К диализату добавляли мочевину (в конечной концентрации: 1 М) и 2-пропанол (в конечной концентрации:
20%), а затем наносили на колонку с Q-сефарозой XL (Pharmacia; 1,6х10 см). Колонку в достаточной степени уравновешивали буфером [20 мМ трис, 1 мМ ЭДТА, 1 М мочевина, 20% 2-пропанол; рН 8], а затем
элюировали буфером, в который добавляли градиент 1М NaCl. На фиг. 5 показан профиль элюции.
Фракции элюции, элюированные 160-200 мМ NaCl (показано стрелкой), объединяли и доводили до рН 3
путем добавления 1N HCl. Раствор концентрировали с использованием ультрафильтра (фракционированная молекулярная масса: 3000), а затем наносили на Vydac 214TP54 (CYPRESS; колонка С4, 4,6х250
мм) для очистки с помощью ВЭЖХ. Колонку уравновешивали 25% ацетонитрилом и 0,1% раствором
TFE, а затем элюировали в градиенте 33% ацетонитрила и 0,1% раствора TFE. На фиг. 6 показан профиль
элюции. Фракции, проэлюированные 30-31% ацетонитрилом (показаны стрелкой), центрифугировали и
концентрировали досуха. Полученный продукт использовали в следующем эксперименте по расщеплению.
(2) Превращение в инсулин и его очистка.
Полученный в (1) гибридный белок, MWPsp-MWPmp9-GSLQPR-B-цепь-RGНRР-линкер-РR-Ацепь, в виде сухого продукта, растворяли в соответствующем количестве 0,1% TFA, а затем добавляли
0,1М трис-буфер (рН 8) до конечной концентрации 20 нмоль/мл.
Полученный раствор охлаждали до 4°С, а затем добавляли раствор тромбина (250 мкмоль/мл) в отношении субстрат:фермент 25:1 (молярное отношение). Через 9 ч к реакционному раствору добавляли
соответствующее количество 10% TFA для доведения до рН 2, а затем реакцию прекращали. Используемым тромбином был тромбин сорта JP (ITOHAM FOODS INC.), который был повторно очищен с использованием набора Macro Prep CM (BioRad) и лизина-сефарозы 4В (Pharmacia).
Для выделения, с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ, инсулина-Аrg, который имел остаток Аrg в
С-конце В-цепи, расщепленной тромбином, раствор, в котором была прекращена реакция, наносили, после обработки тромбином, на колонку Mightysil RP4 (Cica-MERCK; 20х250 мм), колонку уравновешивали 25% ацетонитрилом и 0,1% раствором TFA, а затем элюировали в градиенте 35% ацетонитрила и 0,1%
раствора TFA. Фракции, проэлюированные 30-31% ацетонитрилом, центрифугировали и концентрировали досуха. Полученный продукт использовали в следующем эксперименте по расщеплению.
Сухой продукт "инсулин-Аrg" растворяли в соответствующем количестве 0,1% TFA, а затем добавляли 0,1М трис-буфер (рН 8) до конечной концентрации 1 мг/мл. В полученный раствор добавляли раствор карбоксипептидазы В (Sigma; 47 мг/мл) в отношении субстрат:фермент 500:1 (молярное отношение)
и реакционный раствор оставляли для реакции на 12 ч при 25°С. Затем к реакционному раствору добавляли соответствующее количество 10% TFA для доведения рН до 2, после чего реакцию завершали. Для
выделения инсулина из раствора, в котором была прекращена реакция, проводили обращенно-фазовую
ВЭЖХ способом, упомянутым выше в связи с выделением инсулина-Arg.
(3) Аминокислотный анализ инсулина.
Сначала анализировали весь аминокислотный состав инсулина. К инсулину, полученному в (2)
(около 2 нмоль), добавляли 6N НСl (200 мкл) и 5% фенол (20 мкл). Полученный реакционный раствор
подвергали деаэрации и пробирку, содержащую указанный реакционный раствор, герметично закрывали.
-10-
005586
Реакционный раствор оставляли на 24 ч при 110°С для реакции гидролиза, а затем сушили. Полученный
сухой продукт растворяли в 0,01N НСl (100 мкл) и фильтровали на 0,2 мкм-фильтре. Аликвоту (50 мкл)
указанного фильтрата анализировали с использованием анализатора аминокислот Hitachi Model L-8500
(HITACHI, Ltd.).
Затем проводили анализ на присутствие цистеиновой кислоты в инсулине. Инсулин, полученный в
(2) (около 2 нмoль), растворяли в смешанном растворе муравьиной кислоты/метанола (5:1) (40 мкл), а
затем охлаждали до -20°С. К охлажденному раствору добавляли смешанный раствор 99% муравьиной
кислоты/30% водного пероксида водорода (19:1) (400 мкл), охлажденный до -20°С, а затем оставляли для
реакции на 4 ч при -20°С. После завершения реакции, к реакционному раствору добавляли дистиллированную воду (3 мл) и лиофилизовали. Полученный сухой продукт гидролизовали способом, упомянутым
выше, а затем анализировали.
Проводили сравнение аналитических значений для Val, определенных в анализе всего состава аминокислот и в анализе на цистеиновую кислоту, и аналитическое значение для цистеиновой кислоты преобразовывали в аналитическое значение для цистеина в анализе для всего состава аминокислот. Как показано в таблице, аминокислотное соотношение инсулина настоящего изобретения почти совпадает с
аминокислотным соотношением природного инсулина.
Анализ INS
Вычисленнoе значение для INS
Амино-кисАналитическое
Число
Остаток
Число
лота
моль %
моль %
значение нмоль
остатков
нмоль
остатков
Cys-S03Н
5,697
12,63%
6,41
0,950
Asp
2,726
6,12%
3,11
0,921
3
5,88%
Thr
2,696
5,97%
3,03
0,899
3
5,88%
Ser
2,437
5,40%
2,74
0,812
3
5,88%
Glu
6,271
13,90%
7,05
0,895
7
13,73%
Pro
0,985
2,18%
1,11
0,985
1
1,96%
Gly
3,392
7,52%
3,81
0,848
4
7,84%
Ala
1,000
2,22%
1,12
1,000
1
1,96%
Cysl/2
6
11,76%
Val*
3,205
7,10%
3,60
0,801
4
7,84%
Met
He
1,409
3,12%
1,58
0,705
2
3,92%
Leu
5,462
12,10%
6,14
0,910
6
11,76%
Tyr
3,507
7,77%
3,94
0,877
4
7,84%
Phe
2,640
5,85%
2,97
0,880
3
5,88%
Lys
0,913
2,02%
1,03
0,913
1
1,96%
His
1,822
4,04%
2,05
0,911
2
3,92%
Trp
Arg
0,924
2,05%
1,04
0,924
1
1,96%
45,122
100,00%
50,73
0,889
51
100,00%
(4) Пептидное картирование инсулина.
Инсулин, полученный в (2) (называемый далее инсулином ""IТОНАМ") и коммерчески доступный
инсулин, Novolin 40 (Novo Nordisk Pharma) (называемый далее 'Новолином") (5 нмоль каждого) отдельно
растворяли в 0,1М бикарбонате аммония (50 мкл) и в 2 мМ растворе ЭДТА (рН 7,8; 50 мкл). К полученному раствору добавляли водный раствор протеазы V8 (Wako Pure Chemical Industies, Ltd.; 2 мкг/мл)
(1,35 мкл). Реакционный раствор оставляли на 24 ч при 25°С для прохождения реакции, а затем добавляли 1% раствор TFA для доведения до рН 2, после чего реакцию завершали. Раствор, в котором была завершена реакция, наносили на колонку с Vydac 214TP54 (колонка С18, 4,6х250 мм), уравновешенную 5%
ацетонитрилом и 0,1% раствором TFA, а затем элюировали в градиенте 33% ацетонитрила и 0,1% раствора TFE. На фиг. 7 показан профиль элюции. Инсулин ITOHAM и Новолин обнаруживали аналогичные профили элюции. Следовательно, можно сделать вывод, что оба вида инсулина имеют аналогичные
формы образования дисульфидных мостиков.
Пример 4. Биологическая активность инсулина.
Новолин (1,2 мл) обрабатывали способом, описанным в примере 3 (2) с использованием препарата
Wacocil-II 5C18 AR Prep (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.; 20x250 мм) и получали инсулиновые фракции. Фракции инсулина ITOHAM, полученного как описано в примере 3(2), и фракции инсулина Новолин анализировали с использованием силикагеля (Vydac 214TP54; колонка С18, 4,6х250 мм). Для каждого образца инсулина из каждой фракции брали аликвоту, такую, чтобы содержание инсулина обоих видов, вычисленное по площади главного пика, было одинаковым, а затем сушили. Как показано на фиг. 8,
профиль элюции Новолина имел субпики, которые предположительно указывали на присутствие поли-11-
005586
мерных материалов. Уровень субпиков (то есть, полная площадь субпика) Новолина в 1,23 раза превышал уровень субпиков инсулина ITOHAM.
Полученные таким образом инсулин ITOHAM и инсулин Новолин отдельно растворяли в растворе,
содержащем 0,1% BSA, 0,9% NaCl и 0,1% раствора фенола при конечной концентрации 1 ед./мл (вычисленной, исходя из предположения, что содержание каждого инсулина составляло 26 ед./мг). Полученный
раствор (0,5 мл) подкожно инъецировали в спину кроликам Japanese Wister (Kbs:JW, 2,0-2,5 кг). После
инъекции из передней ушной вены кроликов брали кровь через определенные промежутки времени. К
каждой пробе крови (0,45 мл) добавляли смесь ингибирующих гликолиз агентов (NaF: 12,5 мг/мл,
гепарин-Na: 125 ед./мл, EDTA-2Na: 48 мг/мл) (0,05 мл) и полностью смешивали. Смешанный раствор
центрифугировали при 3000 об./мин в течение 15 мин при 5°С и супернатант использовали в качестве
пробы плазмы. Для каждой пробы плазмы, содержание глюкозы в плазме определяли с использованием
биохимического автоматического анализатора (CIBA-CORNING; Express PLUS), а содержание инсулина
в плазме определяли с использованием набора EIA (Wako Pure Chemical Industies, Ltd.). Зависимость содержания глюкозы в плазме от времени и зависимость содержания инсулина в плазме от времени показаны на фиг. 9 и 10, соответственно. После инъекции как инсулина ITOHAM, так и инсулина Новолин
наблюдалось снижение содержания глюкозы в плазме, что свидетельствовало о том, что оба вида инсулина способствуют снижению содержания сахара в крови. Что касается содержания инсулина в плазме,
то оба вида инсулина показывали аналогичные временные зависимости. При введении инсулина Новолина наблюдался слегка более низкое содержание глюкозы в плазме и слегка более высокое содержание
инсулина в плазме, чем при введении инсулина ITOHAM, что, вероятно, было обусловлено увеличением
субпиков Новолина, что подтверждено вышеуказанным ВЭЖХ-анализом.
Как было упомянуто выше, в соответствии с настоящим изобретением, новый гибридный белок,
превращаемый в инсулин, может быть экспрессирован и секретирован в большом количестве в экспрессирующей системе Bacillus. Путем обработки гибридного белка настоящего изобретения тромбином и
карбоксипептидазой В может быть получен инсулин, имеющий тот же аминокислотный состав и ту же
биологическую активность, что и природный инсулин.
Список последовательностей
-12-
005586
-13-
005586
-14-
005586
-15-
005586
-16-
005586
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Гибридный белок проинсулина формулы (I)
[Y]-[X1]-[В-цепь]-[Х2]-[линкер]-[Х3]-[А-цепь]
(I)
где Y представляет собой лидерную пептидную последовательность для экспрессии и секреции белка,
содержащую 9 N-концевых аминокислотных остатков белка MWP, который представляет собой один из
белков клеточной стенки (CWP) бактерии, принадлежащей к роду Bacillus;
X1 представляет собой аминокислотную последовательность, расщепляемую тромбином;
В-цепь представляет собой аминокислотную последовательность В-цепи инсулина;
Х2 представляет собой аминокислотную последовательность, расщепляемую тромбином;
линкер представляет собой линкерную последовательность, содержащую по меньшей мере один
аминокислотный остаток;
Х3 представляет собой аминокислотную последовательность, расщепляемую тромбином;
А-цепь представляет собой аминокислотную последовательность А-цепи инсулина, и
где Y, X1, В-цепь, Х2, линкер, Х3 и А-цепь соединены в порядке, указанном в формуле (I), и где
ДНК сигнального пептида CWP присоединена к 5'-концу указанной ДНК.
2. Белок по п.1, где аминокислотная последовательность X1 представляет собой GlySerLeuGlnProArg (SEQ ID NO:1), аминокислотная последовательность Х2 представляет собой ArgGlyHisArgPro (SEQ ID NO:2), а аминокислотная последовательность Х3 представляет собой ProArg.
3. Белок по п.1 или 2, где указанная линкерная последовательность имеет следующую аминокислотную последовательность:
GluAlaGluAspLeuGlnValGlyGlnValGluLeuGlyGlyGlyProGlyAlaGlySerLeuGlnProLeuAlaLeuGluGlySerLeuGln (SEQ ID NO:3).
4. Белок по любому из пп.1-3, имеющий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ
ID NO:21.
-17-
005586
5. ДНК, кодирующая белок по любому из пп.1-4.
6. ДНК по п.5, содержащая на 5'-конце промоторную область, необходимую для экспрессии рекомбинантного белка.
7. ДНК по п.6, где промоторная область происходит из бактерии, принадлежащей к роду Bacillus.
8. ДНК по п.7, где промоторная область происходит от гена CWP.
9. Вектор, содержащий ДНК по любому из пп.5-8.
10. Клетка-хозяин, трансформированная вектором по п.9.
11. Клетка-хозяин по п.10, представляющая собой бактерию, принадлежащую к роду Bacillus.
12. Клетка-хозяин по п.11, где указанная бактерия представляет собой Bacillus brevis.
13. Способ продуцирования инсулина, где указанный способ предусматривает
культивирование указанной клетки-хозяина по любому из пп.10-12 в культуральной среде для экспрессии белка по любому из пп.1-4 в указанной клетке-хозяине;
сбор указанного белка и
обработку указанного белка путем ферментативного расщепления с выделением инсулина.
14. Способ по п.13, где указанный экспрессированный гибридный белок выделяют и очищают из
указанной клетки-хозяина или из указанной культуральной среды.
15. Способ по п.13 или 14, где указанное ферментативное расщепление осуществляют тромбином и
карбоксипептидазой В.
Фиг. 1
Фиг. 2
-18-
005586
Фиг. 3
Фиг. 4
Фиг. 5
-19-
005586
Фиг. 6
Фиг. 7
-20-
005586
Фиг. 8
Фиг. 9
Фиг. 10
Евразийская патентная организация, ЕАПВ
Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2/6
-21-