1 000017 2 Изобретение относится к экстракции ре-

1
Изобретение относится к экстракции рекомбинантных белков, продуцированных прокариотическими микроорганизмами, в частности E.coli.
Все больше разрабатывается технологий с
использованием методов генной инженерии для
получения ценных белков, таких как, например,
инсулин, интерлейкины, гормон роста и т.п.
Обычно микроорганизм трансформируют
вектором экспрессии, содержащим ген, кодирующий интересующий белок, и элементы, необходимые для его экспрессии, такие как сигналы регулирования. Затем микроорганизм культивируют в подходящей культуральной среде
при подходящих параметрах культивирования,
и когда будет получено достаточное количество
клеток микроорганизма, добавляют индуктор
запуска фазы указанной экспрессии, во время
которой продуцируется целевой белок в большом количестве и накапливается. По окончании
культивирования суспензию клеток отделяют от
культуральной среды, например, центрифугированием или микрофильтрацией, потом проводят
процесс экстракции, который часто начинают с
операции разрушения стенок микроорганизмов.
Экспрессия гена, кодирующего интересующий белок в прокариотическом микроорганизме, может быть цитоплазматической, периплазматической или секреторной в зависимости
от природы использованных элементов экспрессии для указанного гена (промотор, терминатор,
сайт связывания рибосом, сигнальный пептид и
т.д.).
Цитоплазматическая экспрессия позволяет
получить значительные количества белков. Однако до экстракции интересующего белка необходимо
провести
стадию
денатурации/ренатурации для белков, содержащих один
или несколько дисульфидных мостиков, что
является особенно трудной и деликатной стадией при производстве в промышленных масштабах. Стадию денатурации/ренатурации проводят
по классическим методикам, хорошо известным
специалистам, используя денатурирующий
агент в присутствии восстановителя, потом условия ренатурации включают, например, контроль окисления-восстановления раствора. Среди денатурирующих используемых агентов
можно привести хлоргидрат гуанидина, который был предложен для способа получения интерпейкина-2 человека. Для этой цели можно
сослаться, например, на европейскую заявку на
патент ЕР-А2-0 145 390.
Системы секреторной экспрессии, в которых интересующий белок находится в культуральной среде, активным образом мало или совсем не используются грамотрицательными
бактериями из-за их низкой продуктивности.
Здесь нужно отметить, что бактериальная культуральная среда с большой плотностью в биореакторе не является идеальной для чувствительных рекомбинантных белков из-за, например,
000017
2
опасностей денатурации на поверхности раздела.
Периплазматическая экспрессия позволяет
получить непосредственно рекомбинантные
белки, в принципе правильно уложенные в защищенном пространстве от окружающей среды,
и это предоставляет разумный выбор для получения белков, а именно негликозилированных
белков. В этом случае, следовательно, нет необходимости подвергать белки стадии денатурации/ренатурации.
Способами разрушения клеток, обычно
полезными в этой области, являются, например,
лизис клеток под действием ультразвука или
механического давления (French Pressure Cell,
шаровая мельница), химический лизис или ферментный лизис, осмотический шок и обработка
хаотропными агентами или детергентами. Эти
методы большей частью разрушают клеточные
мембраны, при которых плазматические мембраны и мембраны эндоплазматического ретикулюма образуют гомогенную суспензию клеточного дебриса. Осадок клеточного дебриса
может быть собран в общем после центрифугирования (ядра, цитоскелет, митохондрии, лизосомы, рибосомы, макромолекулы и т.п.), его
природа зависит, в частности, от длительности и
скорости центрифугирования (10 мин для 1000 q
до 3 ч для 150 000 q).
Трудности, встречающиеся во время операций экстракции, меняются в зависимости от
типа экспрессии и использованных методов экстракции и заключаются, например, в
- потере выхода рекомбинантного белка,
- потере биологической активности рекомбинантного белка,
- протеолитическом разложении рекомбинантного белка,
- токсичности экстрагирующих агентов и
обязательном контроле их удаления,
- трудностях промышленного осуществления,
- смешивания периплазматических белков
с цитоплазматическими белками.
Кроме того, когда продуцированные целевые белки являются гидрофобными или заряженными, они могут ассоциировать с клеточными компонентами, которые сами являются
гидрофобными или заряженными, что приводит
к особенно трудной экстракции.
Промышленное производство целевых рекомбинантных белков с помощью генетической
инженерии представляет значительный интерес,
но необходимо использовать такие методы экстракции, которые устраняют или сводят к минимуму указанные выше недостатки.
Наконец, важно не только получить значительные количества целевого белка, но также
нужно, чтобы эти белки не были загрязнены
экстрагирующими агентами и сохранили всю
свою биологическую активность.
3
Для этой цели уже были предложены различные способы, в частности для экстракциивыделения интерлейкина-2.
В европейской заявке на патент ЕР-А2-0
145 390 описан способ получения негликозилированного человеческого интерлейкина-2
(ИЛ-2), имеющего удельную активность выше
104 Е/кг, в котором для экстракции ИЛ-2 проводят стадию выделения хроматографией на колонке. Этот способ также требует введения стадии денатурации с помощью хлоргидрата гуанидина.
В европейской заявке на патент ЕР-А1-0
337 243 описан способ очистки человеческого
интерлейкина-2, в котором использована система двух колонок для жидкостной хроматографии с обратимой фазой. Перед стадией хроматографической очистки нерастворимую фракцию бактериального клеточного лизата экстрагируют раствором, содержащим хлоргидрат
гуанидина, чтобы получить бактериальный экстракт, который затем разбавляют буфером, не
содержащим хлоргидрат гуанидина, потом хроматографируют, элюирование проводят с градиентом ацетонитрила.
В европейской заявке на патент ЕР-А2-0
147 819 предложен способ получения гомогенного и чистого рекомбинантного интерлейкина2. Этот способ заключается в культивировании
микроорганизма, трансформированного вектором экспрессии, содержащим ген, кодирующий
интерлейкин-2, проведении лизиса клеток, извлечении клеточного дебриса, экстракции ИЛ-2
путем промывки клеточного дебриса соответствующим промывочным раствором с последующей хроматографической очисткой раствора,
полученного при промывке. Используемые
промывочные растворы могут содержать соль,
такую как хлорид натрия или хлоргидрат гуанидина, или детергент, такой как, например, продукт, известный под торговым названием "Тритон XR - 100".
В соответствии с предпочтительным вариантом предусматривается последовательное
использование трех промывочных растворов, а
именно промывочного раствора, содержащего
хлорид натрия, промывочного раствора, содержащего детергент, и промывочного раствора,
содержащего хлоргидрат гуанидина.
Теперь неожиданно обнаружено, что экстракция целевого белка, продуцируемого прокариотическим микроорганизмом, трансформированным вектором экспрессии, содержащим ген,
кодирующий целевой белок, и элементы для
экспрессии, такие как сигналы регулирования,
необходимые для его периплазматической экспрессии, может быть осуществлена при суспендировании осадка клеток или клеточного дебриса микроорганизмов, полученных при культивировании указанного микроорганизма, в буферном растворе, указанный раствор целесооб-
000017
4
разно содержит аргинин, аргинин может быть в
L или D форме.
Это упрощение способа экстракции дает
преимущество при промышленном получении
периплазматических рекомбинантных белков,
при просеивании для определения биологической активности лабораторного образца, содержащего, например, зрелые белки.
В отличие от гуанидина.НСl, часто используемого в качестве экстрагирующего агента,
аргинин не является агрессивным по отношению к материалам, используемым в промышленности, а именно к стали. С другой стороны,
аргинин не является загрязняющим окружающую среду агентом, что также не требует дорогостоящего процесса обработки выходящих потоков.
Преимущество получения периплазматического белка в присутствии аргинина с концентрациями, по крайней мере, равными 2 г/л, в
частности при концентрациях между 2 и 10 г/л в
культуральной среде, доказывается повышением выхода секретируемого рекомбинантного
белка, полученного in vivo.
В соответствии с первым аспектом, объектом изобретения является применение аргинина
в качестве агента экстракции периплазматических белков.
В соответствии со вторым аспектом, объектом настоящего изобретения является способ
экстракции целевого периплазматического рекомбинантного белка, заключающийся в том,
что:
1) суспендируют клеточный осадок, полученный при культивировании микроорганизма,
трансформированного вектором экспрессии,
содержащим ген, кодирующий указанный белок, и все сигналы регулирования, необходимые
для его периплазматической экспрессии, в буферном растворе, содержащем аргинин, и после
определенного времени контакта адекватных
условиях рН, температуры, концентрации бактерий и т.п., осаждают полученную суспензию и
2) извлекают целевой белок из супернатанта полученной таким образом бактериальной
суспензии.
Вариант указанного способа экстракции
целевого периплазматического рекомбинантного белка заключается в суспендировании осадка
клеточного дебриса, полученного после лизиса
клеток, полученных при культивировании прокариотического микроорганизма, в буферном
растворе, содержащем аргинин. Экстракция периплазматических белков является особенно
эффективной, когда экстрагирующий буфер
состоит из водного раствора, содержащего аргинин в концентрации, по меньшей мере, равной
0,4 М аргинина в пределах растворимости аргинина при комнатной температуре в воде (близкой к 0,8 М в чистой воде и выше в присутствии
солей), при рН, предпочтительно, равном 8.
5
Аргинин
является
природной
αаминокислотой, которая была предложена в качестве вспомогательного агента денатурации
(ренатурации) замещения двух цепей АббокиназыR (мочевой активатор плазминогена), в котором нативный пептид частично замещается синтетическим пептидом во время этой операции.
(cм. G.A. Homandberq et T. Wai Biocimica et Biophysica Acta, 1990, 1038, 209-215).
В способе по изобретению или в его варианте не происходит денатурации (ренатурации)
белка и аргинин участвует только на уровне
экстракции белка из осадка клеток или клеточного дебриса микроорганизмов.
Аргинин обеспечивает повышение выхода
и биологической активности белка. Действительно было обнаружено, что, например, извлекают зрелую форму ИЛ-13 с выходом более
95% при полном сохранении его биологической
активности. Следует отметить, что опыты по
экстракции с помощью осмотического шока на
той же самой системе экспрессии не приводят к
сравнимым выходам.
Сравнительные опыты показали, что гуанидин НСl, используемый в тех же самых условиях, также позволяет извлекать белок ИЛ-13 с
выходом более 95%, тогда как биологическая
активность извлеченного таким образом белка,
ухудшается больше, чем в способе с аргинином.
Не ограничиваясь какой-либо теорией, полагают, что аргинин действует как мягкий биологический хаотропный агент в противоположность мощным хаотропным агентам, денатурирующим при высоких концентрациях, равных
или превышающих 5М, необходимым, чтобы
обеспечить экстракцию, таким как хлоргидрат
аргинина.
Способ по изобретению или его вариант
могут быть осуществлены после любого процесса культивирования микроорганизма, трансформированного вектором экспрессии, содержащим ген, кодирующий целевой белок, и элементы для периплазматической экспрессии указанного белка, таких как любые необходимые
сигналы регуляции.
Для специалиста в этой области очевидно,
что способ применим к бактериям, близким к
E.coli, т.е. к бактериям, называемым грамотрицательными, анаэробным, необязательно составляющим группу энтеробактерий. В это семейство энтеробактерий входят, в частности,
виды: Escherichia, Salmonella, Erwinia mais, а
также Shiqella, Klebsiella, Serratia, Froteus и Enterobacter.
Учитывая хаотропный характер аргинина,
аргинин можно успешно применять вместо других хаотропных агентов. Невозможно подтвердить примерами все семейства бактерий из-за
разнообразия рассматриваемых живых систем,
но очевидно, что специалист может применить
и приспособить способ экстракции с аргинином
к своему конкретному случаю.
000017
6
Такие способы культивирования хорошо
известны специалистам. Способы, описывающие культивирование грамотрицательных бактерий в ферментере, описаны, например, в европейских патентах ЕР-360641 и ЕР-356335,
относящихся к получению и использованию
штаммов E.coli, называемых SEBR 1250 и ТР
2339.
Когда при культивировании получают достаточное количество клеток, культуральную
среду подвергают центрифугированию (обычно)
или микрофильтрации и полученный осадок
биомассы контактируют с буферным раствором,
содержащим аргинин, согласно способу изобретения.
Как правило работают при температуре,
лежащей между комнатной температурой примерно 25 и 2°С, предпочтительно 4°С.
Время контакта клеточного осадка с буферным раствором, содержащим аргинин,
должно быть достаточным, чтобы обеспечить
переход целевого белка в буферный раствор.
Обычно при работе при 4°С время контакта преимущественно составляет примерно 1 ч.
Экстракция, т.е. переход периплазматического белка в среду, происходит при контактировании биомассы и экстрагирующего буфера с
аргинином. Время контакта, обеспечивающее
полную экстракцию или не увеличивающуюся,
лежит между 30 мин и 16 ч. Опыты показали,
что могут быть получены удовлетворительные
выходы экстракции в течение нескольких часов
при 4°С. Также было отмечено, что слабое перемешивание биомассы в экстрагирующем буфере для предотвращения седиментации осадка
микроорганизмов дает лучшие результаты, т.е.
более высокую степень экстракции в зависимости от времени.
Способ экстракции согласно изобретению
удобен для экстракции таким образом как гидрофобных белков, таких как, например, интерлейкины, в частности ИЛ-13, описанный в европейской заявке на патент ЕР-А1-0 506 574, так и
гидрофильных белков, таких как, например,
гормон роста (hGH). Способ изобретения упрощает получение hGH, который обычно требует
для своей экстракции применения осмотического шока.
Для осуществления экстракции целевого
белка непосредственно из суспензии клеточного
осадка предпочтительным будет буферный раствор, содержащий аргинин в концентрации между 0,4 и 0,8 М.
Когда хотят осуществить экстракцию целевого периплазматического белка из осадка
клеточного дебриса согласно варианту способа
изобретения, работают таким же образом, как в
способе согласно изобретению до стадии получения осадка клеток, полученного после центрифугирования или микрофильтрации, потом
проводят разрушение клеток по хорошо известным специалистам методикам. Методы разру-
7
шения клеток описаны, например, в С. T. Choma
and H. Yamazaki, Can. J. Microbiol, 1981, 27, 547550; L.O. Inqram, Journal of Bacteriology, 1981,
146, 1, 331-336 ;N.G. Mossal and L.A. Heppel,
Journal of Biological Chemistry, 1966, 241, 13.,
3065-3072, K. Bennett, D.K. Taylor and A. Hurst,
Biochem. Biophys. Acta 18 (3), 512-521, (1966) и
коллективном труде "Ферментация и ферментная технология". Глава 12, 239-309, J. Willey and
Sons Editeurs. (1979).
Осадок клеточного дебриса, собранный
обычно после центрифугирования, суспендируют, потом контактируют с буферным раствором, содержащим аргинин. Время контакта клеточного дебриса с буферным раствором, содержащим аргинин, должно быть достаточным,
чтобы обеспечить переход целевого белка в буферный раствор. Обычно при температуре 4°С
время контакта, обеспечивающее практически
полную экстракцию, составляет 48 ч. Также было отмечено, что слабое перемешивание биомассы в экстрагирующем буферном растворе,
устраняющее таким образом седиментацию клеточного дебриса, приводит к более высокой степени экстракции в зависимости от времени.
Этот вариант способа экстракции согласно
изобретению удобен для экстракции, в частности, целевых периплазматических белков, которые сильно ассоциированы с клеточными мембранами, таких как, например, интерлейкины.
Специалистам в данной области хорошо
известно, что экстрагирующий буфер, содержащий аргинин, согласно изобретению, также может содержать дополнительный детергент, который будет улучшать выход и/или скорость
экстракции целевого белка. Среди дополнительных детергентов, которые могут быть использованы, специалист будет выбирать те, которые позволят сохранить преимущества использования аргинина как экстрагирующего
агента, в частности сохранение биологической
активности целевого белка. Среди этих мягких
дополнительных детергентов можно привести,
например, алкилгликозиды, например, алкилмальтозиды,
αили
β-нонил-Дглюкопиранозиды,
αили
β-октил-Дглюкопиранозиды
или
αили
βалкилкарбамоилметил-Д-глюкопиранозиды,
например HecameqR, очень низкая токсичность
которых позволяет считать возможным нахождение его в следовых количествах как составного агента в конечном продукте.
Для осуществления экстракции целевого
белка из суспензии осадка клеточного дебриса
предпочтительно использовать буферный раствор, содержащий аргинин в концентрации между 0,4 и 2,5 М, концентрация 2,5 М аргинина
может быть получена, в частности, в присутствии солей.
Кроме того обнаружено, что аргинин оказывает значительное благоприятное действие на
000017
8
выходы рекомбинантного периплазматического
секретированного белка, если его добавляют не
в обычных и очень высоких концентрациях к
белкам, которые встречаются в культуральных
средах, полученных из гидролизатов коммерческих белков, и которые позволяют удовлетворить потребность в аргинине применяемого
штамма.
С другой стороны, было обнаружено, что
аргинин оказывает особенно благоприятное
действие, если концентрации аргинина, добавленного в культуральную среду, лежат между 2
и 10 г/л.
Итак, согласно другому аспекту изобретения его объектом является способ культивирования прокариотических микроорганизмов,
трансформированных с помощью вектора экспрессии, содержащего ген, кодирующий целевой белок, который заключается в культивировании указанного микроорганизма в присутствии аргинина в концентрации, по меньшей мере,
равной 2 г/л и, в частности, при концентрации
между 2 и 10 г/л.
Специалист в этой области может оптимизировать эту концентрацию аргинина в зависимости от конкретного случая.
Этот способ особенно пригоден для получения белков с активностью типа цитокина, в
частности ИЛ-13, такой как описана в европейской заявке на патент ЕР-А1-0 506 574.
Далее изобретение будет описано более
детально с помощью примеров, которые приведены только для иллюстрации.
Пример 1. Экстракция периплазматического ИЛ-13 из E.coli в присутствии аргинина из
осадка клеток.
1) Культивирование в колбе.
В этом примере используют штамм E.coli
RB 791 (Roger Brent, P1AS 78 (1981), стр.42044208), трансформированный плазмидой р922,
полученной по способам, аналогичным способам, описанным в патентах ЕР 360 641 и 356
335, последовательность ДНК которой представляет собой последовательность SEQ ID № 1.
Различные последовательности, которые
составляют эту плазмиду р922, указаны ниже
(см. конец описания )
Последовательность промотора.
Характеристические
гексануклеотиды
TTGCTT и ТАТААТ промоторов у E.coli, обозначены жирным шрифтом (см.конец описания).
Последовательность 5'-нетранслируемой
области и РНК.
Сайт связывания на рибосоме указан жирным шрифтом. Последовательность CAT, расположенная на 3'-конце этой последовательности, является частью гексануклеотида, распознаваемого ферментом рестрикции Ndel.
Последовательность, кодирующая предшественник ИЛ-13.
Последовательность, обозначенная курсивом, соответствует последовательности зрелого
9
ИЛ-13. Последовательность, которая не обозначена жирным шрифтом, является связующей
последовательностью, связывающей конец последовательности, кодирующей ИЛ-13, с гексануклеотидом, распознаваемым ферментом рестрикции BamH1 (плазмида р BR 327 описана в
документе Gene, 9, 287-305,1980).
Этот штамм E.coli RB 791/p922 предварительно культивируют в течение ночи при 30°С
при перемешивании 200 об/мин в среде L(Luria
Broth, описанный в Molecular Cloning, A Laboratory Manual Sambook, Fritsch, Maniatis; Cold
Spring Harbor Laboratory Press, 2-е издание,
1989) со 100 мг/л ампициллина. Исходя из этой
пре-культуры инокулируют новую колбу со
средой L таким образом, чтобы исходная Д. O.
(Д. О. = оптическая плотность при 600 нм,
Д.O.=1 соответствует 400-450 мг биомассы/л)
была равна 0,6. После часа выстаивания культур
индуцируется с помощью 1 мМ 1PTG (βизопропил-Д-1-тиогалактопиранозида) и продолжают его 3 ч. Образцы бактериальной суспензии центрифугируют и собранные таким
образом бактериальные осадки суспендируют в
экстрагирующих буферах, приведенных ниже,
таким образом, чтобы конечная Д.О. была равна
10, что эквивалентно 4,5 г биомассы/л в момент
экстракции.
Экстрагирующие буферы, использованные
в этом примере, являются следующими:
А: Аргинин 0,8 м рН 8,0, скорректированный НСl, в воде Милли-QR (Миллипор).
В: Гуанидин.НСl 5 М в воде Милли-QR без
коррекции рН.
Экстракцию проводят в течение 1 ч при
4°С при легком перемешивании магнитной мешалкой.
Для измерения эффективности экстракции
отбирают образцы, эквивалентные 1 мл суспензии культуры с Д.О. 0,2, и соответствующие
бактериальные осадки, полученные центрифугированием при 5000xq в течение 10 мин, наносят на гель полиакриламида 16,5% после денатурации SDS. Бактериальные суспензии также
центрифугируют и их супернатанты обессоливают ультрафильтрацией (прибор для фильтрации Ультрафри-МС с порогом разрыва 5000 Да
Миллипор) перед нанесением на гель. Сам гель
проявляют Вестерн-блот-анализом, используя
антитело анти-ИЛ-13 СНО, и количественно
оценивают с PhosphorimaqerR (Molecular Dynamics). Антитела анти-ИЛ-13 СНО (яичники
китайского хомячка), использованные в этом
примере, были получены иммунизацией кроликов.
В этом примере было установлено, что
экстракция в присутствии гуанидина.НСl или
же в присутствии аргинина является почти количественной для зрелой формы с выходами
экстракции в обоих случаях выше 99%.
Также было отмечено, что в супернатанте,
экстрагированном в присутствии аргинина,
000017
10
форма предшественника ИЛ-13 не показывает
различий с экстрактом, полученным в присутствии гуанидина.НСl.
2) Культивирование в ферментере. Штамм
E.coli RB 791/р922 наносят на среду L со 100
мг/л ампициллина и инкубируют при 30°С при
перемешивании, чтобы создать прекультуру.
Объем 100 мл этой прекультуры служит инокулятом для ферментера общим объемом 2,5 л
марки MBR. Культивирование проводят в объеме 1,2 л в среде, состав которой приведен ниже,
и в условиях, определенных ниже. Среда для
ферментера - штамм E.coli RB 791/р922. Состав
приведен для 1 л готовой среды, объем инокулята отброшен.
1. Растворите в 700 мл воды Милли-QR:
Компонент
Масса/л
EDTA
1г
FeSO4·7H2O
45 мг
1,5 г
MgSO4·7H2O
K2SO4
0,75 г
CaCl2·H2O
32 мг
NaCl
1,45 г
KCl
5г
HY-SOYR
75 г
L-метионин
1,4 г
Триптофан
1г
Опигоэлементы*
2 мл
Дрожжевой экстракт
10 г
Дополнить до 800 мл водой Милли-QR, автоклавировать 30 мин при 120°С.
2. Фильтровать на 0,2 мкм в воде МиллиQR.
Глицерин
15 г
К2НРO4
7,1 г
Концентрацию глицерина поддерживают
между 10 и 15 г/л во время культивирования.
3. В момент индукции добавить:
IPTG
1г
6-Аминокапроновая кислота
0,65 г
HY-SOYR
40 г
L-цистеин
0,3 г
Объем этой добавки не включен в другие
расчеты.
*Растворы олигоэлементов
Его используют в количестве 1 мл/л.
Для 1 л готового раствора в воде Милли-Q
растворяют в 800 мл:
Компонент
Масса/л
Н3ВО3
3 мг
NaMoO4·2H2O
4,8 мг
MnSO4·H2O
59 мг
CoCl2·6H2O
23,8 мг
8,7 мг
CuSO4·5H2O
ZnSO4·7H2O
13 мг
F АlСl3·6Н2O
60 мг
KCr/SO4/2·12H2O
6 мг
Кl (приготовлен перед
введением)
60 мг
NiSO4·6H2O
2,6 мг
Прибавить 100 мл концентрированной
НСl. Дополнить до 1000 мл водой Милли-QR.
11
Д.О. 58 достигнута, экспрессию ИЛ-13 индуцируют добавлением IPTG в количестве 1 г/л
и продолжают в течение 5 ч.
Параметры культивирования в ферментере
были следующие: рН 7,4; Т=30°С; рO2=40 мм
рт.ст., регулируемое перемешиванием; расход
воздуха находится между 1 и 3 л/мин.
Способы экстракции и использованные для
измерения биологической активности являются
такими же, как те, что описаны в параграфе 1
выше.
Установлено, что экстракция бактериального осадка, полученного в ферментере, а не в
колбе в присутствии гуанидина.НСl или же в
присутствии аргинина, является практически
полной для зрелой формы ИЛ-13 при выходах
экстракции в обоих случаях выше 97%.
Пример 2. Биологическая активность экстрагированного таким образом ИЛ-13.
Экстракты, полученные в присутствии
гуанидина.НСl или аргинина в примере 1, обессоливают ультрафильтрацией, как описано выше. Они были взяты после серийного разбавления в присутствии субклона ИЛ-13, зависимого
от клеточной линии В9. Активность разбавленных образцов ИЛ-13 вызывает рост клеток В9 и
определяют концентрацию полупролиферации.
Рост клеток был прекращен после 3 дней контакта
добавлением
МТТ:
[3-(4,5-диметилтиазол-2-ил-2,5-дифенилтетразолий) бромида] и измерен спектрофотометрически по поглощению голубой окраски при 565 нм. Биологическая активность ИЛ-13 выражена в нг/мл по
отношению к стандарту ИЛ-13, который сам
был откалиброван по стандартному международному кандидату, полученному из культуры
ИЛ-13 СНО, полученной при иммунизации кроликов по N.Vita, Archives of Biochemistry and
Biophysics, 1983, 225, 2, 436-445. Полученные
результаты приведены в табл.1.
Приведенные результаты показывают, что
удельная биологическая активность экстракта с
аргинином является, перед любой другой операцией последующей очистки, более высокой,
чем у экстракта с хлоргидратом гуанидина.
Пример 3. Экстракция периплазматического чГР из E.coli в присутствии аргинина из
осадка клеток.
Штамм SEBR 1250 (ЕР-360641 и ЕР356335) вводят в прекультивирование в течение
ночи при 37°С и перемешивании со скоростью
200 об/мин в среде L/Luria broth/co 100 мг/л ампициллина. Из этой прекультуры новая колба со
средой L была инокулирована таким образом,
что начальная Д.О. равна 0,2. После 1 ч выдержки культуру индуцируют 1 мМ IPTG и
продолжают его в течение 3 ч. Центрифугируют
образцы бактериальной суспензии и суспендируют полученные при этом бактериальные
осадки в экстрагирующих буферах таким образом, чтобы конечная Д.О. была равна 10, что
000017
12
эквивалентно 4,5 г биомассы/л в момент экстракции.
Условия экстракции представлены в
табл.2.
Для измерения эффективности экстракции
отбирают образцы, эквивалентные 1 мл суспензии культуры с Д.О. 0,2, и соответствующие
бактериальные осадки, полученные центрифугированием при 5000 q в течение 10 мин, наносят на гель полиакриламида 16,5% после денатурации SDS. Бактериальные суспензии также
центрифугируют и их супернатанты наносят на
гель. Сам гель проявляют Вестерн-блотанализом, используя антитела анти-чГР и количественно оценивают с Phosphorimaqer (Molecular Dynamics). Использованные антитела к
чГР были получены иммунизацией кроликов.
Анализ полос, полученных с PhosphorimaqerR, позволяет сделать вывод, что экстракция человеческого периплазматического чГР,
продуцированного в E.coli, в присутствии аргинина является эффективной. В этом примере
выход экстракции, по крайней мере 60%, может
быть достигнут в присутствии 0,8 М аргинина,
рН 8,0, Т 22°С и 20 ч выдержки, а выход более
80% может быть достигнут при экстракции в
присутствии аргинина 0,8 М рН 8,0, Т 4°С и 20 ч
выдержки.
чГР является гидрофильным белком, можно сделать вывод, что рекомбинантные белки
очень различной природы, аккумулированные в
периплазме E.coli, могут быть просто экстрагированы в присутствии аргинина.
Пример 4. Экстракция периплазматического ИЛ-13 E.coli из клеточного дебриса в присутствии аргинина.
1) Культивирование в ферментере.
В этом примере используют штамм E.coli
ТР2339 (ЕР 360641 и ЕР 356335), трансформированный плазмидой р922, полученной по способам, аналогичным описанным в примере 1.
Штамм E.coli TP2339/p922 наносят на среду L со 100 мг/л ампициллина и инкубируют
при 30°С и при перемешивании, чтобы создать
прекультуру. Объем 100 мл этой прекультуры
служит инокулюмумом для ферментера общим
объемом 2,5 л марки MBR. Культивирование
проводят в объеме 1,2 л в указанной ниже среде
и в приведенных ниже условиях.
Среда для ферментера - штамм E.coli
TP2339/p922.
Считая на конечный объем 1,2 л, культуральная среда составлена при добавлении 1 л
автоклавированной фазы и 0,1 л фильтрованной
фазы, составы которых приведены ниже, и 0,1 л
прекультуры, определенной выше.
1) Автоклавированная фаза (1000 мл):
Растворить в 900 мл воды Милли-QR
Компонент
Масса/л
Трицин
360мг
FeSO4·7H2O
280 мг
CaCl2·2H2O
6,7 мг
13
MoCl2·6HO2
1,27 г
8,72 г
K2SO4
NaCl
500 мг
KCl
5г
Hy-Case (SF)R
25 г
Дрожжевой экстракт
18 г
Олигоэлементы*
1 мл
L-аргинин
1,5 мг
Установить рН 7,4 раствором КОН, потом
довести до 1000 мл водой Милли-QR. Автоклавировать 30 мин при 120°С.
2) Фильтрованная фаза (100 мл).
Провести стерильно фильтрацию на мембране 0,2 мкм:
Глюкоза
20 г
Глицерин
50 г
К2НРO4
5г
Концентрацию глюкозы поддерживают во
время культивирования на уровне между 5 и 15
г/л.
Когда Д.О. будет достигнуто (примерно 16
г сухого материала/л) экспрессию ИЛ-13 запускают добавлением IPTG 1 г/л и продолжают в
течение 5 ч. Параметры культивирования являются следующими: рН=7,4, регулируется КОН и
3Н НСl Т=37°С, рO2=50 мбар, регулируется перемешиванием при расходе воздуха между 1 и 3
л/мин.
3) Извлечение и измельчение бактериальных клеток.
Центрифугируют 1 л культуральной суспензии в течение 20 мин при ≈6400g. Осадок
обрабатывают таким же объемом буфера Трис
10 мМ, ЕДТА 1 мМ, пепстатин 1 мг/л, рН 8 при
механическом перемешивании винтовой мешалкой.
Измельчение осуществляют в прессе Мантон-Голэн при давлении 700 бар во время двух
проходов. Гомогенат такой, что может быть сохранен при -80°С в этом примере.
4) Экстракция.
После размораживания отбирают 5 мл гомогената с Д.О.,равной 75 (30 г сухого материала/л), потом центрифугируют 50 мин, при 23300
q.
Полученный таким образом осадок обрабатывают одной третью первоначального объема буфера Трис 0,1 мМ рН 7,0 потом доводят до
первоначального объема раствором, содержащим аргинин, таким образом, что конечная концентрация аргинина равна 2,5 М и рН 8,0.
Для этого примера вспомогательный детергент (HecameqR с конечной концентрацией
20 г/л) ассоциирован с аргинином.
Приготовленную таким образом суспензию клеточного дебриса помещают при 4°С в
роторную мешалку при 300 об/мин на 2 дня.
Затем суспензию центрифугируют последний раз 50 мин при 23300 q, супернатант представляет собой целевой экстракт.
5) Биохимический анализ и биологическая
активность.
000017
14
а) определение суммарных белков проводят по методике "Анализ белка" Биорад".
б) Способ определения рекомбинантного
ИЛ-13 является таким же, что использован в
примере 1.
Также рассчитывают выход ИЛ-13.
Полученные результаты приведены в
табл.3.
В этом примере установлено, что экстракция, проведенная с клеточным дебрисом в присутствии 2,5 М аргинина и вспомогательного
детергента позволяет получить выход экстракции около 70%.
Пример 5. Экспрессия ИЛ-13 в присутствии аргинина в культуральной среде.
Штамм E.coli RB 791/р922 культивируют в
среде L со 100 мг/л ампициллина в присутствии
различных концентраций аргинина. Индукция
была вызвана через 1 ч после инокуляции добавлением IPTG в количестве 1 мМ и после этого проводят культивирование в течение 3 ч.
Образцы бактериальных осадков эквиваленты 1 мл культуральной суспензии с Д.О. 0,2,
и соответствующие образцы супернатанта наносят на гель, проявляют и количественно оценивают, как описано выше.
Результаты приведены в табл.4.
Оказалось, что в условиях эксперимента и
рассматриваемой системы экспрессии:
- аргинин повышает экспрессию периплазматического ИЛ-13 от 2 г/л и значительно с 4
г/л,
- рост бактерий замедляется при концентрации 8 г/л,
- при этих концентрациях аргинин не вызывает переход ИЛ-13 в супернатант.
Интерес к способу экстракции с аргинином
согласно изобретению обусловлен возможностью использовать такие экстракты белков, как
таковые или при минимальной обработке в тестах на биологическую активность.
Перечень последовательностей (1) Общая
информация
(i) Заявитель
(A) Название: САНОФИ
(B) Улица: 32-34 рю Марбеф
(C) Город: Париж
(Е) Страна: Франция
(F) Почтовый код: 75008
(G) Телефон: 53.77.41.31
(Н) Факс: 53.77.42.16
(h) Название изобретения: Способ экстракции периплазматических белков из прокариотических микроорганизмов в присутствии
аргинина
(iii) Количество последовательностей: 1
(2) Информация о последовательности
SEQ N 1:
(i) Характеристики последовательности:
(A) Длина: 4410 пар оснований
(B) тип: нуклеиновая кислота
(C) Количество разветвлений: простая
15
(D) Конфигурация: линейная
(ii) Тип молекулы: ДНК (геномная))
(xi) Описание последовательности: 5EQ ID
N 1:
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Применение аргинина в качестве агента
экстракции периплазматического рекомбинантного белка.
2. Способ получения периплазматического
рекомбинантного белка путем суспендирования осадка клеток, полученных при культивировании прокариотического микроорганизма,
трансформированного вектором экспрессии,
содержащим ген, кодирующий указанный белок, и элементы для его экспрессии в периплазме микроорганизма, в буферном растворе, содержащем агент экстракции белка, с последующим осаждением полученной бактериальной
суспензии и извлечением белка из надосадочной
жидкости, отличающийся тем, что в качестве
агента экстракции используют аргинин.
3. Способ получения периплазматического рекомбинантного белка путем суспенди-
000017
16
рования осадка дебриса клеток, полученных при
культивировании прокариотического микроорганизма, трансформированного вектором экспрессии, содержащим ген, кодирующий указанный белок, и элементы для его экспрессии в
периплазме микроорганизма, в буферном растворе, содержащем агент экстракции белка, с
последующим осаждением полученной бактериальной суспензии и извлечением белка из
надосадочной жидкости, отличающийся тем,
что в качестве агента экстракции белка используют аргинин.
4. Способ по п.2 или 3, отличающийся тем,
что в качестве буферного раствора используют
водно-щелочной раствор, при этом концентрация аргинина составляет по меньшей мере 0,4
М.
5. Способ культивирования прокариотического микроорганизма, трансформированного
вектором экспрессии, содержащим ген, кодирующий целевой белок, отличающийся тем, что
культивирование проводят в присутствии аргинина при концентрации его, равной, по меньшей
мере, 2 г/л.
17
000017
18
19
000017
20
21
000017
22
23
000017
24
25
000017
Таблица 1
Опыт на ИЛ-13 Биолоклеточной нг/мл; гическая
активлинии В9
ность в
нг/мл
Контроль 500
500
Аргинин 3200
1376
Гуанидин 4300
1098
100
43
25
Таблица 2
Хаотропный агент рН
Аргинин 0,8 М
8,0
Аргинин 0,8 М
8,0
Т длительность
22°С 20 часов
4°С 20 часов
26
Таблица 3
Удельная биологическая активность в нг/мл
Суммарные
белки
Рекомбинантный ИЛ-13
В суспензии
клеточного:
дебриса перед
экстракцией
324 мкг/мп
В супернатанте после
экстракции
3 575 нг/мл
390 нг/мл
Таблица 4
Образец
Контроль
Аргинин 2 г/л
Аргинин 4 г/л
Аргинин 8 г/л
Евразийская патентная организация, ЕАПВ
Россия, Москва, ГСП 103621, М. Черкасский пер., 2/6
Д.О. готовой
культуры
1,17
1,24
1,24
1
100 мкг/мл
ИЛ-13 в нг/л
Д.О.1
388
455
600
720