полнотекстовый ресурс - Электронная библиотека ПГУ им.С

АЛМАГАМБЕТОВ K.X.
БИОТЕХНОЛОГИЯ
Астана - 2011
УДК 663.1
БКК 30.16
А 51
Рецензенты :
Д.б.н., проф. Абиев С.А.
д.б.н., проф. Бисенова Н.М.
Д 5<1 Биотехнология. К.Х. Алмагэмбетов.-Астана, 2011.*270 с.
ISBN 978-601-06-1438-3
В книге изложены материалы по современным биомедицинским
технологиям, применяемым в клинике. Это ДНК-технологии, клеточные
технологии,
рекомбинантные
белки, технологические процессы
и оборудование.
Рекомендуется в качестве дополнительного учебного материала по
медицинской биотехнологии.
удК 663.1
ббк 30.16
■/у 2011
© Алмагамбетов м 4-’ ^
© Республиканская коллекция микроорганизмо
ВВЕДЕНИЕ
Биологические технологии все более глубоко проникают в разные
области человеческой деятельности, связанные с экономическим и
социальным развитием общества. Начиналось биотехнологическое
производство с промышленного микробиологического синтеза (про­
изводство антибиотиков, ферментов, аминокислот, витаминов и др.) и
фарминдустрии лекарственных растений (от настоев и экстрактов до
очищенных субстанций лекарственных растений). В этот период био­
технология как прикладная наука, как бизнес-технология была более
освоена и востребована в агропромышленном комплексе, сельском
хозяйстве, животноводстве и в решении проблем экологического харак­
тера. В настоящее время биотехнология, оснащенная методами моле­
кулярной биологии и генной инженерии широко шагнула в медицину
(гено- и клеточная терапия, применение стволовых клеток, медицински
значимые рекомбинантные белки - гормоны и цитокины, химерные и
мини-антитела).
Медицинская биотехнология - это дисциплина, раскрывающая
роль биологических объектов в разработке и использовании техноло­
гий диагностики, лечения и профилактики заболеваний, а также мони­
торинга и поддержания качества здоровья человека. В историческом
аспекте медицинскую биотехнологию возможно подразделить на
классическую и современную; подобное деление основано на приме­
нении в медицинской практике уже устоявшихся, ставших рутинными
и современных, порой только внедряемых в клиническую практику
биомедицинских технологий. В биомедицинских технологиях, как и в
общей биотехнологии используются три биообъекта —растительные
и животные организмы и клетки, микроорганизмы.
Лекарства растительного происхождения являются основой тра­
диционной медицины. Галеновые препараты, получаемые настаива­
нием и экстрагированием органическими растворителями имеют мно­
говековую историю в лечебной практике. Это классика применения
лекарств растительного происхождения в медицине. Современные
фитопрепараты и индивидуальные биологически активные соедине­
ния растительного происхождения получают, используя специальное
технологическое оборудование для поэтапной тонкой очистки и стаби* лизации целевого продукта.
Столь же длительна история применения в лечебной практике
суспензии тканевых клеток, органопрепаратов с целью замещения и
стимуляции функций клеток и тканей организма. В гематологической
практике широко используются технологии по заготовке и перелива­
нию крови и ее компонентов (эритроцитарной массы, плазмы и др.),
трансплантации костного мозга. Современные биологические техно­
логии с использованием животных клеток и тканей, стволовых клеток
человека лежат в основе тканевой инженерии и клеточной терапии.
Получены трансгенные животные, продуцирующие человеческие тера­
певтические белки.
С середины прошлого столетия, благодаря развитию микробио­
логической промышленности активно стали применяться с целью
лечения и профилактики биопрепараты микробного происхождения.
Это производство вакцин, диагностикумов, пробиотиков, антибиоти­
ков, ферментов, аминокислот, витаминов, основанное на традицион­
ном биотехнологическом процессе, с использованием биореакторов,
сепараторов, колоночной хроматографии и др.
Технологии рекомбинантной ДНК позволили при помощи генети­
чески модифицированных микроорганизмов получать человеческие
гормоны и цитокины (инсулин, интерфероны, интерлейкины и др.), раз­
рабатывать ДНК-вакцины.
В лечение и диагностику онкозаболеваний и моногенной наслед­
ственной патологии внедряются технологии, основанные на исполь­
зовании наночастиц и биочипов.
Достижения в области геномики и протеомики позволяют при
помощи современных биотехнологий проводить мониторинг и поддер­
живать здоровье, качество жизни человека. Это генетическая паспор­
тизация и генодиагностика, позволяющие прогнозировать и предупре­
ждать предрасположенность к наследственной и иной патологии; фар­
макогеномика, позволяющая повысить эффективность, индивидуали­
зировать лекарственную терапию пациента.
Медицинская биотехнология междисциплинарна, базируется она
на фундаментальных и прикладных знаниях в области биологических
наук и на инженерно-технологических разработках.
Если классическая биотехнология (микробиологический син­
тез, фармтехнологии) является предметом обучения на медико­
биологическом и фармфакультетах медицинских вузов, то современ­
ная биотехнология, как образовательная дисциплина востребована
и на общемедицинском факультете. В лечебной практике востребо­
ваны технология получения и применения стволовых клеток, клеточ­
ная терапия и тканевая инженерия, генотерапия и генодиагностика,
биопрепараты на основе рекомбинантных белков и пептидов (гормоны
и цитокины), тест-системы на основе одноцепочечных и гуманизиро­
ванных антител. Именно современные биомедицинские технологии
способствуют более эффективной диагностике, лечению и профилак­
тике особо актуальных заболеваний наследственного, опухолевого и
инфекционного генеза, тяжелой соматической патологии.
4
I.
ЖИВЫЕ ОБЪЕКТЫ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ В
БИОМЕДИЦИНСКИХ ТЕХНОЛОГИЯХ
К биологическим объектам, используемым в биомедицинских тех­
нологиях относятся микроорганизмы, клетки и ткани растительного и
животного происхождения, их структурные компоненты и метаболиты.
Микроорганизмы применяются в биопроизводстве как продуценты
антибиотиков, аминокислот, ферментов, витаминов, рекомбинантных
белков; из них изготавливаются вакцины и пробиотики; они использу­
ются как биокомпоненты при разработке диагностических тест-систем
(биочипы, ПЦР, ИФА).
Клетки и ткани лекарственных растений, наряду с приготовле­
нием настоек и экстрактов, используются как продуценты биологиче­
ски активных веществ лечебно-профилактического действия, терапев­
тических белков и съедобных вакцин.
Клетки и ткани животного происхождения давно известны в меди­
цине в качестве органопрепаратов и биостимуляторов. Стволовые
клетки человека применяются в клеточной терапии и тканевой инже­
нерии. Половые клетки востребованы в технологии экстракорпораль­
ного оплодотворения. Гибридомные клетки хорошо известны как про­
дуценты моноклональных антител, применяемых в диагностики и
терапии.
ДНК человека в современной медицине используется как лечеб­
ная вакцина при онко- и иммунопатологии, в генотерапии наследствен­
ных и иных заболеваний.
Микроорганизмы - продуценты медицинских биопрепаратов,
основа вакцин и пробиотиков
Во второй половине XIX века развитие общей микробиологии
(микробиота почвы, роль микроорганизмов в круговороте веществ в
природе и др.), затем медицинской (необходимость выделения и изу­
чения микроорганизмов, вызывающих инфекционные болезни), при­
вело к созданию методов выделения, культивирования, изучения био­
логических свойств и хранения микроорганизмов in vitro. Благодаря
этим технологиям, а позже методам молекулярной биологии и ген­
ной инженерии началась разработка промышленных микроорганиз­
мов, используемых в производстве биопрепаратов, в том числе меди­
цинского назначения. Широкое использование микроорганизмов в раз­
личных отраслях биотехнологии основано на процессах биосинтеза
(производство биопрепаратов) и брожения (кисло-молочное и спирто5
вое производство), способности к быстрому росту и размножению как
в аэробных, так и в анаэробных условиях, на многообразие метаболи­
ческих путей. Благодаря высокой ферментативной активности они спо­
собны как расщеплять различные органические вещества и ксеноби­
отики, так и синтезировать из неорганических веществ органические
соединения. Они легче адаптируются к технологии культивирования в
биореакторах, гораздо быстрее нарабатывается их биомасса, методи­
чески проще выделение из микробных клеток вторичных метаболитов
в сравнении с растительными и животными клетками.
В биомедицинских технологиях промышленные микроорганизмы
востребованы в качестве вакцин и пробиотиков, являются продуцен­
тами антибиотиков, витаминов, ферментов и аминокислот. Разработаны
и используются в производстве генно-модифицированные штаммы,
продуцирующие рекомбинантные белки человека.
Микроорганизмы - продуценты ферментов
Различные группы микроорганизмов (бактерии, грибы, дрожжи и
актиномицеты) способны синтезировать ферменты, подразделяемые
по химическому строению на 6 классов: оксидоредуктазы, трансферазы, гидролазы, лигазы или синтетазы, лиазы и изомеразы. В лечеб­
ной практике чаще применяются гидролазы, обладающие высокой протеолитической активностью.
Продуценты протеолитических ферментов обнаружены среди
самых различных групп микроорганизмов: бактерии родов - Bacillus,
Micrococcus, Pseudomonas; микромицеты - Aspergillus, Rhizopus,
Penicillium', актиномицеты - Streptomyces и Actinomyces. Так, Asp.
terricola - продуцент тромболитической протеиназы. Подобной актив­
ностью характеризуется стрептокиназа, продуцируемая Streptococcus
hemoliticus. Некоторые микроорганизмы продуцируют несколько протеиназ (карбоксипептидазы и сериновые протеиназы, гидролизующие
казеин, эластин, обладающие трипсиновой и химотрипсиновой актив­
ностями).
Ферменты микробного происхождения, особенно амилазы наи­
более широко применяются в пищевой отрасли. Продуценты амилаз:
мицелиальные грибы родов Aspergillius (Asp.niger, Asp.orizae, Asp.
Awamori), Rhizopus (Rh.niveus, Rh.japonicum), Neurospora и Mucor; дрожжи
и дрожжеподобные грибы родов Saccharomyces, Candida, Endomycopsis
и Endomyces; бактерии рода Bacillus (Bac.subtilis, Bac.diastaticus, Вас.
mesentericus, Bac.polymyxa) и др.
Разработаны
генно-модифицированные
микроорганизмыпродуценты пищеварительных ферментов. Например, рекомбинант­
ные штаммы Escherichia coli, Kluyveromyces lactis и Aspergillus awamori
продуцируют фермент химозин животного происхождения.
6
Микроорганизмы - продуценты антибиотиков
К самой большой группе препаратов, получаемых путем микро­
биологического синтеза (наряду с полусинтетическими и синтетиче­
скими препаратами), относятся антибиотики. По разнообразию и пока­
заниям к применению они занимают ведущее место среди фармпрепа­
ратов. К основным группам микроорганизмов-продуцентов антибио­
тиков относятся:
- грибы - Penicillium chrysogenum и Aeromonium (Cephalosporinum)
chrysogenum - пенициллины и цефалоспорины;
- актиномицеты - Streptomyces spp. и Micromonospora spp. - проду­
центы большинства применяемых антибиотиков (стрептомицин, тетра­
циклин, неомицин и др.). Только один вид Streptomyces griseus проду­
цирует около 50 различных антибиотиков;
- бактерии - Bacillus polymixae, В.brevis, B.subtilis, Streptococcus
lactis и др. (полимиксин В, грамицидин С, субтилин, низин и др.).
Микроорганизмы - продуценты витаминов
Витамины микробного и растительного происхождения широко при­
меняются в медицинской практике. Это витамины: В12 - антианемический, А - антисклерофтальмический, В1 - антиневротический, В2 - вита­
мин роста, В6 - антидерматический, С- иммуностимулирующий, Д - антирахитический, Е - антиоксидантный, К - антигеморрагический.
Витамин А. Основными продуцентами бета-каротина (провита­
мин А) являются промышленные (+) и (-) штаммы Blakeslea trispora.
Синтезировать провитамин могут также актиномицеты, плесневые и
дрожжевые грибы.
Витамин В2 _ рибофлавин, основные продуценты грибы Eremothecium ashbyii, Ashbya gossipii, Asp.niger и бактерии - B.subtilis.
Витамин B12 -цианокобаламин,
этот витамин синтезируют
различные группы микроорганизмов — Pseudomonas denitrificans,
I Micromonospora purpurae, Nocardia rugosa, Eubacterium limosum. К
основным продуцентам относятся бактерии рода Propionibacterium
(Propionibacterium freudenreichii var.shermanii и др.). Селекционирован
штамм Propionibacterium ari, способный активно выделять продуциру­
емый витамин В12 во внеклеточную среду в отличие от других проду­
центов этого рода, накапливающих витамин внутри клетки,
р
Витамин РР - никотиновая кислота, основные продуценты дрожжи
Sacch.cerevisiae и бактерии Brevibacterium ammoniagenes.
Витамин С - аскорбиновая кислота, получают химическим син­
тезом, но завершающий этап высокоселективного дегидрирования
D-сорбита в L-сорбозу (метаболит-предшественник витамина) осущест­
вляют с помощью микроорганизмов (Gluconobacter oxydans, Erwinia
punctata, Corynebacterium spp. и др.).
7
Микроорганизмы - продуценты рекомбинантных белков
Для получения рекомбинантных белков (инсулин, интерферон,
интерлейкин, факторы свертывания крови и др.) используются генномодифицированные бактерии либо дрожжи:
- Escherichia coli -инсулин, соматотропин, интерферон;
- Bacillus licheniformis - интерлейкин;
-Bacillus subtilis
- -интерферон.
- Saccharomyces cerevisiae - интерлейкин;
- Aspergillus nidulans —интерферон;
Наряду с продукцией терапевтических рекомбинантных белков
генно-модифицированные микроорганизмы применяются для получе­
ния микробных антигенов, используемых в качестве диагностикумов.
Например, генно-модифицированная бактерия Francisella tularensis
ssp.halarctica продуцирует антиген - фактор вирулентности возбуди­
теля Pseudomonas pseundomallei С-141. Этот антиген используется как
диагностикум при псевдомонадной инфекции. Рекомбинантный штамм
Е. coli является продуцентом HBs антигена вируса гепатита В (анти­
ген используется как для разработки диагностикума, так и в качестве
вакцины).
Микроорганизмы- продуценты полисахаридов
Основной полисахарид микробного происхождения, используе­
мый в терапевтических целях - декстран. Это капсульный полисаха­
рид, содержит до 200 тыс. мономеров глюкозы; синтезируется из глю­
козы при участии фермента декстрансахаразы:
декстрансахараза
(сахароза —» глюкоза + фруктоза;
глюкоза
—»
декстран).
Используется в качестве плазмозаменителя крови, антикоагу­
лянта и иммуностимулятора. Основные продуценты полисахарида
бактерии рода Leuconostoc, реже Streptococcus, Aerobacter, Klebsiella.
Полисахарид леван применяется как плазмозаменитель, продуцируют
его Zymomonas mobilis и Azotobacter vinelandii.
Хитин, продуцируемый дрожжами и мицелиальными грибами
используется как антикоагулянт.
Микроорганизмы -основа пробиотиков
К симбионтным микроорганизмам, используемым в качестве
пробиотических препаратов относятся бифидобактерии, лактоба­
циллы, стрептококки, другие представители нормальной микрофлоры
организма человека. Это Bifidobacterium bifidum, B.longum, В.breve,
B.adolescentis, Lactobacillus acidophilus, Lb.lactis, Lb.plantarum, Lb. fer8
mentum, Lb. casei, Lb.ramnosus, Streptococcus lactis, Str.cremoris, Bacillus
subtilis и др. Они характеризуются устойчивостью в кислой среде, к
желчным солям, активно колонизируют кишечный и иные биотопы сли­
зистой открытых полостей организма. Наиболее часто в состав проби­
отиков входят бифидобактерии и лактобациллы.
Бифидобактерии это строгие анаэробы, колонизируют поверх­
ность слизистой оболочки толстого кишечника и других биотопов сли­
зистой открытых полостей. Они препятствуют размножению патоген­
ной, гнилостной и газообразующей микрофлоры кишечника, преиму­
щественно за счет образования органических кислот и снижения pH в
кишечнике, участвуют в метаболических процессах.
Лактобациллы также колонизируют слой приэпителиальной зоны,
I среди них есть облигатные и факультативные анаэробы, гомо- и гетероферментативные представители. Лактобациллы синтезируют разно­
образные соединения, угнетающие рост многих патогенных микроорга­
низмов, включая бактерии (кишечная и синегнойная палочка, золоти­
стый стафилококк, сальмонеллы, шигеллы, протей, клебсиеллы, серрации, холерный вибрион и др.), грибы Candida albicans и некоторые
простейшие (лейшмании и др.).
Рис.1 Лактобациллы
(увеличение х 5000)
|)
Рис.2. Бифидобактерии,
(увеличение х 20000, www.
coralclub.mksat.net)
Микроорганизмы, используемые в качестве пробиотиков должны
быть:
не патогенными, не токсичными, не обладать мутагенными
свойствами;
- технологичны, то есть легко культивируются в производственных
условиях, при этом стабильно сохраняют биологическую активность;
- полирезистентны к антибиотикам, резистентность хромосом­
ной локализации.
Пробиотические препараты разрабатывают на основе одного или
9
нескольких штаммов одного вида, консорциума из разных видов, а также
используют композиции, сочетающие микроорганизмы-симбионты с
сорбентом, ферментом, иммуномодулятором и т.д.
В технологии создания пробиотических препаратов в основном
используются молочнокислые бактерии, реже бациллы, эшерихии и
др. Состав некоторых пробиотических препаратов:
«Бактолакт» - Lactobacillus rhamnosum, Lb casei, Lb faecium;
«Нормофлор» - Lb bulgaricus, Lb acidophilus, Bifidobacterium longum,
B. bifidum, Streptococcus thermophilus;
«Линекс» - Lactobacillus, Bifidobacterium, Streptococcus;
«Биоспорин» - Bacillus subtilis, B. cereus;
«Бификол» - В. bifidum, Escherichia coli.
Получены пробиотики на основе генно-модифицированных
микроорганизмов, продуцирующих интерлейкин-10 и регуляторный
протеин - TFF-фактор (Lactococcus lactis), альфа-интерферон чело­
века (B.subtilis) и др.
Микроорганизмы - основа вакцин
Вакцинация является основой иммунопрофилактики инфекцион­
ных заболеваний, а в современной медицине вакцины используются
при терапии онкозаболеваний, иммунодефицитных состояний.
С целью профилактики инфекций в плановом порядке и по эпидпоказаниям применяются вакцины:
- живые, содержащие аттенуированные возбудители (полиомие­
лита* род Poliovirus, кори- род Morbillivirus, эпидемического паротита
- род Paramyxovirus, туберкулеза- Mycobacterium tuberculosis и др.);
- инактивированные (цельноклеточная вакцина против коклюша
- Bordetella pertussis, инактивированная вакцина против бешенства семейство Rabdoviridae и др.);
- химические, создаются из структурных компонентов микроб­
ной клетки. Выделяют, как правило, наиболее иммуногенные анти­
гены микроорганизма. Например, полисахаридные вакцины «Менинго
А+С», содержат полисахаридные антигены серогрупп А и С Neisseria
meningitidis. Вакцины «Пневмо 23» и «Тифим Ви» также содержат поли­
сахаридные антигены соответственно 23 серогрупп пневмококков (Str.
pneumoniae) и брюшно-тифозной палочки и т.д.;
- конъюгированные вакцины («Менинго С» - полисахаридный анти­
ген серогруппы С Neisseria meningitidis конъюгирован с иммуногенным белком, «Н1В» • полисахаридный антиген Haemophilus influenzae
В, конъюгирован с дифтерийным, менингококковым или столбнячным
компонентом, «Prevnar» - содержит семь полисахаридных антигенов
Str. pneumoniae;
- анатоксины (из экзотоксинов Bacillus anthracis - столбнячный,
10
Vibrio сholerae - холерный, Corynebacterium diphtheriae - дифтерийный
и др.);
- ассоциированные (из ассоциации инактивированной бактерии
Bordeteiia pertussis, дифтерийного и столбнячного анатоксинов - АКДС,
АДС-М и др.);
- рекомбинантные (генно-модифицированные Saccharomyces
cerevisiae либо Escherichia coli, продуцирующие HBs антиген вируса
гепатита В);
Актуальна разработка терапевтических вакцин против СПИДа (на
основе инактивированного вируса либо его антигенов др160, др120,
р24, р17), папилломатоза гениталий (включает несколько инактивиро­
ванных штаммов вируса папиломмы человека) и других инфекций.
При разработке вакцин очень важны такие свойства микробных
клеток как антигенность, иммуногенность и безвредность для человека.
Современные направления в технологии разработки вакцин связаны с
получением генно-инженерных, субъединичных и съедобных вакцин.
Растительные клетки и ткани, трансгенные организмы
Основными объектами в получении лекарственных препаратов явля­
ются целые растения, в том числе трансгенные, а также суспензионные
культуры клеток (в том числе генно-модифицированные) растений.
Технологии получения галеновых препаратов на основе настоев и
экстрактов из лекарственных растений имеют многовековую историю.
Промышленное использование суспензионных культур растительных
клеток путем наращивания их в биореакторах насчитывает всего лишь
30-40 лет. Еще позже были разработаны технологии получения транс­
генных растений, продуцирующих терапевтические рекомбинантные
белки и съедобные вакцины. Мягкое и комплексное воздействие био­
логически активных соединений, содержащихся в лекарственных рас­
тениях, особенно при одновременном применении нескольких видов
целебных трав, с учетом не только необходимого сочетания разных
видов, но и точной концентрации индивидуальных компонентов, а
также при сочетании с пробиотическими микроорганизмами, органо­
препаратами и другими полезными веществами обусловливают вос­
требованность и перспективность применения настоек и экстрактов в
| медицинской практике.
Г
Биологически активные вещества могут быть локализованы в
I определенных органах (листьях, корнях и корневищах, цветках, плодах
и т. д.), или же распределены во всем растении. Большое значение в
накоплении действующих веществ в растении имеет фаза вегетации,
или фаза развития растения. Этот фактор всегда необходимо учиты­
вать при заготовке лекарственного растительного сырья.
11
Настойки и экстракты
Известны настои и экстракты нескольких тысяч видов лекар­
ственных растений, широко применяемых в медицинской практике.
Биологически активные соединения находятся или во всех частях
растения, или только в определенных его органах: корнях, стеблях,
листьях или цветниках, а также в плодах и семенах. Химический
состав, количество и качество биологических активных соединений
зависят как от вида растения, так и от условий его местообитания,
времени сбора, способов сушки и условий хранения. Настои и экс­
тракты лекарственных растений содержат алкалоиды, терпеноиды,
гликозиды, полифенолы, полисахариды, эфирные масла, пигменты,
сапонины, дубильные вещества, витамины, фитонциды и др. Эти
биологически активные соединения являются вторичными мета­
болитами растений.
Алкалоиды продуцируются клетками разных органов расте­
ний. В клетке алкалоиды накапливаются в вакуолях в виде солей
яблочной, лимонной и щавелевой кислот. Алкалоиды локализуются
в разных тканях растений. Например, в видах Cincona алкалоиды
находятся главным образом в коре, тогда как у аконитов основная их
масса находится в клубнях. У ракитника алкалоиды сосредоточены
в семенах, в кокаиновом кактусе в листьях и т.д. Различные части
одного и того же растения могут отличаться между собой также и
качественным содержанием алкалоидов, т.е. в различных частях
растений могут находиться разные алкалоиды. Например, в корне
мачка бахромчатого содержатся хелеретрин и сангвинарин, тогда
как в надземных его частях находятся только протопин, коридин и
аллокриптопин. Особенно богаты алкалоидами растения семейства
маковых. Они впервые были выделены из коробочек мака Papaver
somniferum L. Маки и хинное дерево содержат более двух десятков
разных алкалоидов. К растениям - продуцентам алкалоидов также
относится и семейство Осоковые (Сурегасеае), особенно род Сагех,
включающий около 2000 видов, в том числе C.rostrata, C.vesicaria,
C.globularis, C.caespitosa, C.diandra, C.cinerea.vi др. Наряду с мор­
фином, к важнейшим алкалоидам относятся: кофеин (содержится
в натуральном кофе и чае), никотин (в табаке), эфедрин (в эфедре),
сальсолин (в солянке), хинин (в хинном дереве). Растение барвинок
- Catharanthus roseus L. является продуцентом димерных индольных
алкалоидов - винбластина и винкристина, являющихся одними из
наиболее эффективных средств в химиотерапии рака. Из корней
растения раувольфии - Rauvolfia ser pentina L. выделены другие
индольные алкалоиды - резерпин и аймалин, обладающие соот­
ветственно гипотензивным и психотропным эффектами.
12
Гликозиды относятся к изопреноидам, насчитывающим более
двадцати тысяч различных соединений. Гликозиды выделяются раз­
ными тканями растений. Под влиянием ферментов гликозиды расще­
пляются на углеводы и агликоны, последние обладают терапевтическим
действием. В лечебной практике используются следующие группы гликозидов: сердечные гликозиды, антрагликозиды (слабительные), сапо­
нины, горечи, флавоноидные гликозиды и др. Сердечные гликозиды,
или карденолиды построены из стероидной части (агликона) и несколь­
ких сахарных остатков. Наиболее значимыми для медицины растени­
ями - продуцентами карденолидов являются наперстянка и строфант.
Из наперстянки пурпуровой (Digitalis purpurea L.) и наперстянки шер­
стистой (D. lanata L.) выделено более 50 карденолидов - ланатозидов
и пурпуреа гликозидов, в том числе дигитоксин. Также к продуцентам
сердечных гликозидов относится ландыш майский (Convallaria majalis
L). Женьшень (Рапах ginseng С.А. Меу.) содержит комплекс тритерпеновых гликозидов - панаксозидов, а также витамины С, В1, В2, пантотеновую, никотиновую и фолиевую кислоты. Стероидные гликозиды,
являющиеся сырьем для синтеза ряда половых гормональных и проти­
возачаточных препаратов получают путем кислотного гидролиза агликон диосгенина, содержащегося в корневищах различных видов лиан
из рода Dioscorea. К продуцентам гликозидов можно отнести и родиолу розовую (Rhodiola rosea L.).
Сапонины, как и гликозиды относятся к группе изопреноидов. Их
название происходит от способности этих соединений к пенообразованию, вызванному высокой поверхностной активностью сапони­
нов. Сапонины обладают отхаркивающим и мочегонным действием.
Некоторые из них обладают успокаивающим, противоязвенным и противосклеротическим действием. Есть сапонины, обладающие свой­
ством понижать кровяное давление, вызывать рвоту, оказывать пото­
гонное действие и т. д. Сапонины найдены у представителей более,
чем 70 семейств растений, особенно среди гвоздичных и первоцвет­
ных. К сапонинам относится и глицирризин из солодкового корня, он
обладает сильным противовоспалительным действием.
Фенольные соединения. Среди этой группы метаболитов рас­
тений в лечебной практике применяются флавоноиды и катехины.
Флавоноиды накапливаются во многих лекарственных растениях:
( в корнях солодки (Glycyrrhiza glabra L.), траве пустырника (Leonurus
cordiaca L.), цветках бессмертника (Helichryzum arenarium L.). Они обла­
дают желчегонным, бактерицидным, спазмолитическим и кардиотоническим действием. Некоторые флавоновые производные (рутин) обла­
дают действием, подобным действию витамина Р (цитрина). Они уплот­
няют стенки кровеносных капилляров, предотвращают возникновение
кровоподтеков и внутренних кровоизлияний, обладают бактерицид13
ным, желчегонным действием, способствуют удалению радиоактив­
ных веществ из организма. Кф лавоноидам, обладающим спазмолити­
ческим и ранозаживляющим действием относятся рутин, геспередин,
кверцетин и эпикатехин.
Кумарины и фурокумарины, содержатся в растениях семейства
зонтичных, бобовых, рутовых, главным образом в корнях и плодах.
Многие из фурокумаринов обладают сосудорасширяющим, спазмоли­
тическим и противоопухолевым действием.
Эфирные масла — летучие органические вещества самого раз­
нообразного химического состава. В мире известно около 2500 эфи­
ромасличных растений. Особенно богаты маслами многочисленные
виды семейства губоцветных (мята, лаванда, шалфей, базилик, пачули
и др.), зонтичных (анис, фенхель, тмин, кориандр, ажгон и др.), розоц­
ветных (роза эфирномасличная), гераниевых (герань розовая), ама­
риллисовых (тубероза), миртовых (эвкалипт лимонный) и др. Эфирные
масла в свободном состоянии или в виде гликозидов встречаются в
различных частях растений — в цветках, листьях, плодах, а иногда
и в подземных частях. Они представляют собой многокомпонентные
смеси летучих органических соединений (ароматических, эпицикли­
ческих и алифатических карбонильных соединений, спиртов, кислот,
эфиров и т. д.), вырабатываемых в клетках растений и обусловлива­
ющих их запах. Отдельными компонентами являются 1,8-цинеол, кам­
фора, борнеол, борнилацетат, камфен и др. Эфирные масла содер­
жатся в липовом цвете, багульнике, полыни, шалфее, тысячелистнике,
мать-и-мачехе, хвое сосны, мяте, душице, лаванде, розе, можжевель­
нике, тмине, валериане, лимоне и других растениях.
Применение эфирных масел в медицине разнообразно. Есть
масла, обладающие болеутоляющим свойством; успокаивающие и
возбуждающие нервную систему (масло полыни); влияющие на сер­
дечную деятельность (камфара); смягчающие кашель; бактерицид­
ные; антисептические; противоглистные; возбуждающие деятельность
желудка. Эфирные масла используются для улучшения и изменения
вкуса, запаха лекарств, например лавандовое, мятное, кориандровое и
другие масла. Под действием кислорода и влаги воздуха состав эфир­
ных масел изменяется — отдельные компоненты масел окисляются,
происходит осмоление масел и они теряют запах. Свет вызывает изме­
нение окраски масел, также изменяется и состав масел. Поэтому необ­
ходимо строго соблюдать правила сбора, сушки, обработки, хранения
и приготовления лекарственных форм из растений, содержащих эфир­
ные масла.
Дубильные вещества (танины). Содержатся в коре дуба, в кор­
невище лапчатки, земляники, кровохлебки, березы, калины, в траве
зверобоя, шалфея, полыни горькой, кипрея, тысячелистника, череды,
14
щавеля конского, цветках бессмертника, в плодах, листьях и цветках
черемухи, плодах терна, черники, в «шишках» ольхи и во многих дру­
гих растениях. Применяют как вяжущее и убивающее бактерии сред­
ство при желудочно-кишечных заболеваниях, для полоскания горла,
при различных воспалениях и т. д. Вяжущее и противовоспалительное
действие танинов основано на образовании на слизистых оболочках,
состоящих из белковых веществ пленки, препятствующей дальней­
шему воспалению. Танины, нанесенные на обожженные места и раны,
также свертывают белки и используются как местное кровоостанавли­
вающее средство. Кроме того, танины применяются как противоядия
при отравлении тяжелыми металлами.
Сесквитерпеновыелактоны. Род полыней (Artemisia L ,семейство
сложноцветных - астровые, Asteraceae Dumort.) объединяет свыше
400 видов. Это полынь цитварная (Artemisia citvarnia L), австрийская
полынь (Artemisia austrica Jacq.), горькая полынь (Artemisia absinthium),
черная или обыкновенная полынь (Artemisia vulgaris) и др. Лечебно­
профилактическое действие полыни обусловлено содержанием раз­
личных сесквитерпеновых лактонов - абсентин, анабсентин, атермизин, артемолин и др. Они придают горечь, определяют антисептиче­
ское, противовоспалительное, антипаразитарное действия, стимули­
руют пищеварительный процесс и т.д. Кроме сесквитерпеновых лак­
тонов разновидности полыней содержат эфирные масла, аскорбино­
вую кислоту, дубильные вещества и др.(табл.1).
Казахстанский препарат «Арглабин», полученный из эндемичного
растения полыни гладкой (Artemisia glabella Kar.et Kir.) применяется в
комплексном лечении рака легких, печени и молочной железы. Кроме
противоопухолевого действия, препарат характеризуется иммуномо­
дулирующим эффектом.
Таблица 1 Примеры фармакологически исследованных фито­
препаратов, терапевтическая эффективность которых подтверж­
дена контролированными исследованиями и хорошо документи­
рованными врачебными отчетами по клиническим наблюдениям
Биоактивное
Экстракты
вещество
лекарствен­
ных растений
Гинко-билоба Билобалид,
гинкголиды,
флавоновый
эфир
Фармакологическое
действие
Область
применения
Нейропротективное, Симптоматиче­
антиоксидантное, ге- ское лечение ор­
мореологическое
ганических нару­
шений мозговой
деятельности
15
Э кстракты
> Биоактивное I Фармакологическое
лекарственвещество
действие
I ны х растений
I
Зверобой
Область
применения
П редполож и­
Местное противовос­ I Легкие и сред­
тельно гипери-
палительное, вяжу­
ней степени тяже­
цин и гиперф о-
щее, антисептиче­
сти депрессивные
рин
ское, антидепрес-
эпизоды
сивное
Ц в е тки р ом аш
П редполож и­
Противовоспали­
ки
те льно хамацу-
тельное, спазмоли­
заболевания кожи
л ен,бизабол ол
тическое
дыхательных пу­
Ч еснок
I Воспалительные
липоф ильные
тей, желудочно-
ф лавоны
кишечного тракта
А лл иин и алли-
Снижающее уровень I Профилактика
иназа
липидов, ингибирую­ атеросклероза
щее агрегацию тром
боцитов, фибринолитическое, антибак­
териальное, снижаю­
щее давление крови
Р о сто р о п ш а
Силимарин, си-
Антигепатотокси-
I Токсическое и хро­
п я тн и с т а я
либинин
ческое. На клеточ-
ническое воспале-
I ном уровне усилива­ [ ние печени
ет образование ри­
босом и синтез про­
С е м е н а ко н ­
с к о го каш та на
Л и с т ь я се н н ы
Л истья и
ц ветки бояр ы ш н и ка
теина
А есцин (тритер- i Антиэкссудативное; 1Симптомы
хрониче-кой ве­
профилактика отепенсапонин)
нозной недостаков.
гочности
Запор, опорожне- 1
Антиабсорбтивное
1
Сеннозиды
I
hже кишечника пеед диагностичеГ
с кими мероприяГ1редположит е л ь н о гл и ко з илфлавоны,
П|ооантоцианиД>1Н
т иями
Кардиопротективное 1Функциональная
н едостаточность
let«рдечной деяте льности, соотj ве тствующая второ й стадии по
|NV'НА
16
I i
1 :
1
1
Суспензионные культуры клеток лекарственных растений
Более ста видов растений используется в технологии наращивания
в биореакторах суспензионной культуры клеток, продуцирующих выше­
приведенные биологически активные соединения растений, необходи­
мые для разработки фармпрепаратов. Среди них женьшень, раувольфия змеиная, наперстянка шерстистая и пурпурная, диоскорея дельто­
видная, воробейник, беладонна, паслен дольчатый, дурман обыкновен­
ный, ландыш майский, клещевина, агава, мак снотворный и др.
Развитие технологии культивирования суспензии раститель­
ных клеток in vitro, совершенствование методов выделения и очистки
биологически активных соединений из клеток либо из культуральной
жидкости и последующая конвективная термосушка либо лиофилизация с целью стабилизации биологической активности и хранения - это
основа фармацевтического производства.
Современные фармтехнологии позволяют получать в гомогенном
виде индивидуальные биологически активные соединения из суспен­
зионной культуры клеток растений. К наиболее часто употребляемым
лекарственным веществам, получаемым из суспензионной культуры
клеток растений относятся:
- стероиды из Dioscorea deltoidea (противозачаточные средства);
- кодеин из Papaver somniferum (болеутоляющее лекарство);
- атропин из Atropa belladonna L. (антихолинэргическое средство);
- резерпин из Rauwolfia serpentina L. (гипотензивное средство);
- геоциамин из Hyoscyamus nigerL (антихолинэргическое средство);
- дигоксин из Digitalis lanata L. (тонизирует сердечную деятельность);
- скополамин из Datura metel L. (антихолинэргическое средство);
- дигитоксин из Digitalis purpurea L. (сердечно-сосудистое средство);
- пилокарпин из Pilocarpus jabonandi (холинэргическое средство);
- хинидин из Cinchona ledgeriana (антималярийное средство);
Суспензионные культуры клеток чаще используются в тех случаях,
когда растение является редким, не произрастающим в данных клима­
тических условиях, например женьшень или барвинок розовый в усло­
виях северного Казахстана. Однако, несмотря на существенную материало- и энергоемкость наращивания суспензионной культуры расти­
тельных клеток в промышленных условиях, совершенствование дан­
ной технологии перспективно из-за постепенного обеднения природных
запасов лекарственных растений, нередко неблагоприятного экологиче­
ского состояния территорий их произрастания. Разработка новых линий
растительных клеток, продуцирующих биологически активные вещества
особенно важно для получения:
- противоопухолевых средств;
- антивирусных препаратов (ВИЧ, вирусные гепатиты);
- адаптогенных и стимулирующих препаратов как галеновых, так и
индивидуальных биологически активных веществ растительного проис­
хождения - гинзенозидов;
- новых иммуностимуляторов на основе терпеноидных гликозидов.
Трансгенные растения - продуценты рекомбинантных белков
Следующий этап развития биотехнологии лекарственных расте­
ний - это продукция рекомбинантных белков медицинского назначения,
съедобных вакцин в трансгенных растениях.
Как известно, большие площади посевных полей занимают транс­
генные растения сельско-хозяйственных культур, обладающие пище­
вой и белковой ценностью, устойчивые к неблагоприятным факторам
окружающей среды. Вместе с тем интенсивно развиваются технологии
получения трансгенных растений, продуцирующих ценные для меди­
цины биологически активные соединения. Это генетически модифи­
цированные культуры злаковых (рис, пшеница, кукуруза), плодоовощ­
ных (томаты, бананы, картофель) и других (табак, арабидопсис) расте­
ний. Эти трансгенные растения продуцируют антитела, пептиды, цитокины, применяются в качестве съедобных вакцин (табл.2-4). Трансгенные
растения выращивают в полевых условиях, затем в производственных
лабораториях выделяют из их клеток и тканей рекомбинантный белок
либо употребляется само трансгенное растение (съедобные вакцины).
Наряду с выращиванием трансгенных растений в полевых условиях,
используется технология культивирования в биореакторе суспензии
генно-модифицированных клеток растений, продуцирующих тот или
иной рекомбинантный белок.
В клетках высших растений происходят гликозилирование и фолдинг белков, сходные с таковым в клетках млекопитающих. Вместе с
тем, необходимо отметить низкий уровень экспрессии перенесенных
генов, протеолиз чужеродных белков в цитоплазме растительной клетки.
Введение в полипептидную цепь целевого белка сигнальных последова­
тельностей, направляющих его накопление в эндоплазматической сети
или секрецию в апопласт, где частота протеолиза значительно ниже,
позволяет достичь повышения продуктивности трансгенных растений
в 100 раз .Экспрессия целевых белков в запасной ткани семян, где уро­
вень биодеградации ниже, чем в обводнённых тканях (листья, плоды),
способствует повышению продуктивности на 2-3 порядка. Весьма при­
влекательным представляется способ переноса экзогенной ДНК в геном
хпоропластов. В одной растительной клетке в среднем содержится от
5 до 10 тыс. копий хлоропластной ДНК, суммарная экспрессии которых
позволяет получать чужеродные белки в существенных количествах.
Также разработана технология заражения растений вирусами
18
(табачной мозаики-ВТМ, мозаики коровьего гороха - ВМКГ и др.) с после­
дующим культивированием их в изолированных условиях. Вирусы пред­
варительно трансфицируются геном, кодирующим синтез рекомбинант­
ного белка медицинского назначения. При репродукции вируса в клет­
ках растений одновременно синтезируется и рекомбинантный белок.
Таблица 2. А нтитела, синтезируем ы е трансгенны м и
растениями
Применение
Онкология (рак
кишечника,
легких, опухо­
ли эпителиаль­
ного происхо­
ждения)
Антиген
Раковоэмбрио­
нальный ан­
тиген чело­
века
Тип антител
Растение
Уровень
экспрессии
Мышино­
человеческие
химерные ан­
титела lgG1
(CT84.66), scFv
Т84.66, Т84.66/
G68
табак
1-12 мг/кг СВ
пшеница
50-900 нг/г
СВ
рис
1.5-29 мкг/г
СВ
Моноклональ­
ные антитела
mAb S057
табак
3 мкг/г СВ
0.07% РБ
scFvT84.66
Нейтрализация
Белок вируса
вируса бешен­
бешенства
ства
ИФАдиагностика
Антитела
против чело­
веческого IgG
С5-1 IgG
люцерна
0.13-1.0% РБ
Предотвраще­
ние зубного ка­
риеса
Поверхност­
ный антиген
стрептококка
SAI/II
Guy’s 13 IgG
IgA/G
slgA/G
табак
200-500
мкг/г СВ
5-8% РБ
Терапия рака
толстой кишки
Поверхност­
ный антиген
CO-17 A IgG
Nicotiana
benthamiana
Нет данных
Лечение герпе­
са типа 2
Белок виру­
са герпеса
HSV-2
IgG, IgA, DigA
или slgA lgG1
Fab и F(ab’)2
рис, соя
Нет данных
19
Применение
Антиген
Болезни серд­
ца, митохон­
дриальные на­
рушения, миопатии, ревма­
тизм и другие Креатинкинаболезни, свя­
за человека
занные с по­
вышенным или
уменьшенным
уровнем креатинкиназы
Растение
Уровень
экспрессии
арабидолсис
0.02-0.4% РБ
листьев
(10-12% РБ
межклеточ­
ной жидко­
сти)
арабидопсис
1.3% РБ
табак
0.044% РБ
МАКЗЗ scFv
табак
6-55 нг/мг РБ
МАКЗЗ Fabфрэгмент
арабидопсис
6.53% РБ
(0.02% РБ
семян)
60 мкг/мл РБ
межклеточ­
ной жидко­
сти
0.031%0.22% РБ
Тип антител
МАКЗЗ lgG1
Fab-фрэгмент
Лечение
В-клеточной
лимфомы
Поверхност­
ный Ig опу­
холи
38С13 scFv
Nicotians
benthamiana
Иммуноаффинная очистка ре­
комбинантного
HBsAg
Поверхност­
ный анти­
ген вируса
гепатита В
(HBsAg)
scFv
табак
Таблица 3. Субъ единичны е вакцины, синтезируемы е
трансгенны ми растениям и
Белок
Поверхностный антиген
оболочки вируса гепатита В
(HBsAg)
Растение
Уровень экспрессии
табак
0.001-0.05% РБ листьев
картофель
до 10 мкг/г СВ клубней
люпин
150 нг/г СВ каллуса
салат
1-5.5 нг/г СВ листьев
физалис
10 нг/г СВ плодов
бананы
38 нг/г СВ листьев
Эпитоп HVR1 вируса гепатита С,
табак
слитый с CTB
20
Нет данных
Белок
Растение
Уровень экспрессии
Белок HEV-E2 вируса гепатита Е гоматы
50-60 нг/г СВ
В-субъединица
габак
<0.01% РБ
2.5% РБ хлоропластов
из энтеротоксичного штамма
Е.соП
картофель
3.7-15.7 мкг/г СВ клубней
кукуруза
8.7% белка эндосперма
картофель
0.3% РБ
табак
4.1% РБ хлоропластов
томат
0.02-0.04% РБ
табак
0.23% РБ
картофель
<0.37% РБ
В-субъединица холерного
токсина СТ-В
Белок капсида вируса
гастроэнтерита человека
Norwalk (NVCP)
Гликопротеин вируса бешенства томат
1.00% РБ
Антиген DRg24 вируса
бешенства
табак, шпинат Нет данных
Антиген сибиреязвенной
палочки
табак
Нет данных
G-белок вируса RSV
табак
Нет данных
F-белок вируса RSV
томат
до 32.5 мкг/г СВ плодов
Гликопротеин В
цитомегаловируса человека
табак
<0.02 РБ
Гемагглютинин вируса кори (MV- морковь,
табак
Н)
Нет данных
Белки вируса папилломы
человека (L1)
Nicotiana
benthamiana
картофель
0.2-0.5% РБ
Столбнячный токсин TetC
табак
10-25% РБ хлоропластов
S i-белок коронавируса
атипичной пневмонии
табак, томаты Нет данных
Капсидный белок р24 вируса
HIV-1
табак
0.35% РБ
картофель
0.0015% РБ
шпинат
0.03% СВ
Nicotiana
benthamiana
Нет данных
арабидопсис
11-25 мкг/г СВ
Белок Tat вируса HIV-1
Белок оболочки вируса HIV-1
(9P41)
Туберкулезный антиген ESAT-6,
слитый с LTB
21
Т аб л и ц а 4. Б елки м едицинского назначения,
си н те зи р у е м ы е трансгенны м и растениями
Белок
Соматотропин
Энкефалины
Область применена 1
Растение
Гормон роста
Табак, подсолнечник
Передозировка
Arabidopsis thaliana и
наркотических вещеслз Brassica napus
Человеческий
Цирроз печени, ожоги,
сывороточный
Табак, картофель
хирургия
альбумин
Эпидермальный фактор Стимуляция роста
Табак
роста
клеток кожи и роговиць
а-Трихосантин
Терапия СПИДа
Nicotiana bethamiana
Гепатиты В и С,
Рис, турнепс,
а-Интерферон
опоясывающий лишай,
картофель
вирусные бородавки
3-Интерферон
То же
Табак
Хронический
/-Интерферон
Табак
грануломатоз,
лейшманиоз, лепра
1Интерлейкины IL-2, IL-4, Лейшманиоз,
Табак, картофель
1IL-10, IL-12, IL-18
адъюванты
I Эритропоэтин
Анемия
I Табак
J
| Лгрудин
IИнгибитор тромбина
Рапс
_1
I Гл ю коцереброзидаза
Табак
-J
юлезнь Гэше
Габак
—1
I а,8-Гемоглобин
13аменитель крови
113-Казеин
I Пищевая добавка
/*Сартофель
кютин-связывающие
Картофель, томаты,
А
Б
/ Авидин, стрептавидин L .
___
!ЛКИ
К укуруза
| Гранулоцит-макрофаг- 1
/ колониестимулирующий 1Антираковая терапия
Те1бак
/ сЬактор
-—
I Пищевая добавка
JТабак, кукуруза
1а,/3-Лак тальбумин
Ингибитор трипсина
^ суруза
/ Алротинин
/ а 1-Антитрипсин
Лактоферрин
Ингибитор протеаз.
Ip
заболевания печени
|----------------Заживление ран______ I Табак
Бактериальные
(картофель
Активатор белков
IТабак_____
22
----------------
-—
Белок
TNF-a
Трипсин
Рицин В
Лизоцим
Эластин
Область применения
Фактор некроза
опухолей
Расщепление белков
адъювант
Инфекционные
заболевания
Восстановление
повреждённых
сухожилий, стенок
сосудов
Растение
Картофель
Кукуруза
Табак
Рис
Табак, картофель
Примечание. Таблицы 2-4 из статьи Е.Б. Рукавцова, Я.И. Бурьянова, Н.Я.
Шульги, В.А. Быкова //Вопросы биологической, медицинской и фармацевти­
ческой химии,- 2006.- № 2,- С. 3-12.
Животные клетки и ткани, трансгенные организмы
В середине прошлого столетия были разработаны сложные по
составу питательные среды (Игла, среда 199, Дюльбекко и др.), позво­
ляющие культивировать животные клетки ex vivo на поверхности сте­
клянных и пластиковых флаконов. Полученный таким образом моно­
слой тканевых клеток изначально использовался для репродукции
вирусов, для их типирования и изучения свойств, для получения про­
тивовирусных вакцин.
В последующем культуры животных клеток стали применять в раз­
личных биологических и медицинских исследованиях. Технология кле­
точных культур позволяет исследовать in vitro процессы перерождения
нормальных клеток в опухолевые, изучить фундаментальные законо­
мерности функционирования клеток и тканей, разрабатывать новые
подходы в лечении и диагностике болезней, оценивать эффективность
новых лекарственных препаратов, их мутагенность и канцерогенность.
Клеточные культуры служат также удобными объектами для изучения
тканевой несовместимости и других иммунных реакций.
Разработка методов длительного культивирования позволяет
формировать банки клеточных линий, обладающих определёнными
> генетическими и биохимическими свойствами. Методом криоконсер­
вации сохраняются различные линии клеток, в том числе стволовые
клетки пуповинной крови, ткани и органы для трансплантации.
В современных биомедицинских технологиях культивирование
тканевых клеток ex vivo является основой тканевой инженерии, полу­
чения рекомбинантных терапевтических белков и антител, a in vivo
они востребованы в клеточной терапии.
23
В специальных биореакторах путем культивирования суспензии
тканевых клеток (включая генно-модифицированные) налажено про­
изводство рекомбинантных белков, в том числе эритропоэтина, акти­
ватора плазминогена, фактора свертывания крови VIII, инсулина, анти­
трипсина, поверхностного белка вируса гепатита В, интерлейкинов,
различных антител и др.
Клеточные технологии в области медицины основаны на исполь­
зовании клеток соединительной (фибробласты), скелетной (кость,
хрящь), мышечной (поперечнополосатой, гладкой) и эпителиальной
(печень, легкие, молочная железа, кожа, мочевой пузырь, почки) тка­
ней. На данном этапе развития клеточных технологий особо востре­
бованы и перспективны стволовые клетки. Также нашли применение
клетки нервной системы (глиальные клетки и нейроны, хотя последние лишены способности к пролиферации), эндокринные клетки (надпочечники, гипофиз, клетки островков Лангерганса), меланоциты и раз­
личные типы опухолевых клеток. Наиболее перспективны в биомеди­
цинских технологиях стволовые клетки.
Кроме вышеизложенного, клеточные культуры используются в
генной инженерии при получении генетически модифицированных
клеток, в технологии клонирования и других медико-биологических
исследованиях.
Эмбриональные и соматические (гемопоэтические, мезенхи­
мальные) стволовые клетки
Стволовые клетки - это недифференцированные клетки, способ­
ные как к самоподдержанию на протяжении жизни организма, так и к
дифференцировке в зрелые специализированные клетки (рис.З). В
здоровом организме они необходимы для восполнения потребности
различных тканей и органов в новых дифференцированных клетках.
Последние, как правило, утрачивают способность размножаться, про­
лиферировать. Из каждой стволовой клетки при митозе образуются
две дочерние, одна из которых является полной копией материнской
клетки и способна самообновляться, а вторая детерминирована к диф­
ференцировке в определенный тип клеток.
По типу происхождения различают эмбриональные, феталь­
ные и соматические (взрослые) стволовые клетки. Эмбриональные
стволовые клетки могут неограниченно поддерживаться в культуре
и способны к дифференцировке во все клетки взрослого организма.
Фетальные стволовые клетки - это клетки, выделенные из орга­
низма плода, они дифференцируются в различные тканевые клетки.
Исследованы несколько типов фетальных клеток, в том числе ней­
24
j
|
рональные стволовые клетки, гемопоэтические стволовые клетки,
клетки-предшественники островковых клеток поджелудочной железы.
Соматические стволовые клетки обладают ограниченной способно­
стью к дифференцировке и, возможно, ограниченным пролиферативным потенциалом. Эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) человека
получают из эмбрионов, сформировавшихся в процессе искусствен­
ного оплодотворения. Их получение связано с разрушением эмбри­
она. Экспериментальная терапия на модельных животных с повреж­
дением спинного мозга, болезнью Паркинсона и диабетом с исполь­
зованием эмбриональных стволовых клеток дали положительные
результаты. Гемопоэтические (ГСК) и мезенхимальные (МСК) стволо­
вые клетки выделены из костного мозга, пуповинной крови, жировой и
другой ткани. Взрослые стволовые клетки применяются в клинике при
пересадке костного мозга и кожи; реже и с меньшим успехом в регене­
рации других тканей. В перспективе трансплантация эмбриональных и
взрослых стволовых клеток рассматривается как альтернатива транс­
плантации органов и тканей.
Стабильные клеточные линии ЭСК человека впервые получил
американский исследователь Дж. Томсон в 1998 г. Для получения ЭСК
берут невостребованные после искусственного оплодотворения бла­
стоцисты человека. Обычно после такой процедуры количество бла­
стоцист больше, чем необходимо реципиенту. Их можно законсервиро­
вать либо с согласия донора использовать для научных целей. Лучше
всего выделять эмбриональные клетки человека на 4-6-й день после
оплодотворения. Сначала с помощью фермента проназы растворяют
прозрачную оболочку бластоцисты, а затем методом комплементзависимого лизиса удаляют трофобласты. Внутреннюю клеточную массу
помещают в культуральную среду на подложку из инактивированных
мышиных эмбриональных фибробластов, которые служат источником
ростовых факторов для стволовых клеток.
Мезенхимальные стволовые клетки (МСК) выделяют чаще из
костного мозга либо жировой ткани, а также из эпидермиса кожи.
Гемопоэтические стволовые клетки (ГСК) в основном получают из пупо­
винной крови. Кровь из пуповины, несколько десятков миллилитров
которой выливается при рождении ребенка, содержит немало стволо­
вых клеток, в основном ГСК. Общая концентрация ГСК в пуповинной
крови ниже, но число ранних клеток-предшественников значительно
выше, чем в костном мозге (в пуповинной крови содержится в 2 раза
бопьше полипотентных ГСК, чем в таком же объеме трансплантанта
костного мозга).
Выделение МСК и ГСК из тканей связано с проблемой их иденти­
фикации, а значит, с поиском молекулярных маркеров (специфических
белков на клеточной мембране), которые помогают распознать и отде­
лить ее от общей клеточной массы.
Ассиметричное клеточное деление стволовых клеток с последу­
ющей дифференциацией одной из дочерних клеток в тканеспецифиче­
скую, а другой вновь в недифференцированную, позволяет вне орга­
низма наращивать популяции стволовых клеток. Среда культивирова­
ния, регуляторные вещества обеспечивают дифференциацию в опре­
деленный тип одной из дочерних клеток, тогда как другая сохраняет
потенции стволовой клетки. Полного понимания сложного процесса
дифференциации стволовых клеток еще следует достичь.
В настоящее время во многих лабораториях человеческие ЭКС
(чЭСК) выращиваются на специальных подложках из Матригеля
(Matrigei) - это коммерчески доступный продукт, представляющий из
себя желатиновый экстракт из опухолевых клеток мыши, содержащий
большое количество белков внеклеточного матрикса. Пластиковая
культуральная посуда, покрытая Матригелем, является оптимальным
субстратом для адгезии и пролиферации чЭСК, сохраняя при этом их
свойства.
Одна из технологий предотвращения дифференцировки стволо­
вых клеток при культивировании in vitro заключается в использовании
субстрата, содержащего эмбриональные фибробласты мыши и живот­
ную сыворотку. В этой технологии существует потенциальная опас­
ность того, что клетки человека могут быть инфицированы вирусами,
либо компонентами клеток мыши и/или животной сыворотки. Поэтому
существует задача по созданию условий культивирования, исключа­
ющих применение материалов животного происхождения.
Диплоидные культуры клет ок
Наибольшее распространение получили фибробласты (к примеру,
фибробласты легких эмбриона человека - ФЛЭЧ) используемые, в
частности, в диагностике и изучении механизмов развития патологии.
Это обусловлено не только легкостью их культивирования, но и тем,
что соединительная ткань, главным клеточным элементом которой
являются фибробласты, представлена во всех органах. Фибробласты
являются важными участниками морфогенеза и создают условия
микроокружения, необходимого для дифференцировки и функциони­
рования специализированных клеток. Эти клетки содержат рецепторы
к глюкокортикоидным гормонам, инсулину, некоторым нейромедиато­
рам. Не менее важна способность фибробластов в условиях in vitro
из непролиферирующих клеток реверсировать вновь в пул активно
размножающихся клеток при снижении плотности клеток в монослое,
изменении концентрации ингредиентов питательной среды, воздей­
ствии гормонов, взаимодействии с внеклеточным матриксом.
26
Перевиваемые линии клеток
Это стабильные линии клеток китайского (ВНК) и серийского
;СНК) хомячка, опухолей печени (Нер-2), шейки матки (Hela, рис.4) и др.
Клеточная линия HeLa - это одна из основных клеточных линий челоi зека, полученная в 1951 г. из раковой опухоли шейки матки у Генриетты
| Паке (H.L.). Линии опухолевых клеток необходимы при изучении проти! воопухолевых химиотерапевтических средств, а из ВНК и СНК полу­
чают генетически модифицированные клетки - продуценты рекомби­
нантных белков.
Гибридомные клетки
При слиянии типичного В-лимфоцита с миеломной клеткой полу­
чают гибридому, содержащую комбинацию генов нормальной и опухо­
левой клеток. Такие гибридомные клетки обладают способностью к про­
дукции моноклональных антител (свойство В-лимфоцитов) и бесконечно
размножаться (свойство миеломной, опухолевой клетки).
Генно-модифицированные клетки
Получают путем трансфекции целевого гена в клетку-реципиент
с последующей амплификацией ДНК полученной трансгенной клетки
для селекции суперпродуцента рекомбинантного белка. Для культиви­
рования генно-модифицированных клеток чаще используются бессывороточные питательные среды. Разработаны технологии направлен­
ного модифицирования имеющихся клеточных линий с помощью метода
РНК-интерференции, изменяя уровень посттрансляционных модифика­
ций белков.
Рис.З Стволовая клетка
(с сайта)
Рис.4 Опухолевые клетки HeLa
Культура клеток HeLa окрашена по Хойсту.
Измененное ядро опухолевой клетки
27
II.
ДНК-ТЕХНОЛОГИИ
ДНК-технологии в современной медицине востребованы в диагно­
стике и лечении болезней человека. Они востребованы, прежде всего,
при тех патологических состояниях, когда разрешающая способность
классических, уже широко применяемых на практике технологий недо­
статочна. ДНК-технологии, используемые в медицине, по-сути, осно­
ваны на технологии рекомбинантной ДНК
Методы ДНК -диагно стики
ДНК-диагностика основана на комплементарности взаимодей­
ствия нуклеотидных оснований (А-Т, Ц-Г), подобно тому как ИФАанализ основан на специфичности взаимо-действия эпитопов анти­
гене с вариабельным фрэгментом энтител.
Идентификэция ДНК - это анализ полиморфизма длин рестрик­
ционных фрагментов (ПДРФ), мини- и микросаттелитных последова­
тельностей; это выявление мутировавших генов при злокачественных
новообразованиях и наследственной патологии; это обнаружение ДНК
(РНК) возбудителей вирусных и бактериальных инфекций и др.
Методы идентификации Д Н К
1. Определение нуклеотидной последовательности (секвенирование). Непосредственная диагностика патологических мутаций путем
определения нуклеотидной последовательности является наиболее
точным. Она позволяет достоверно выявлять замены оснований, делеции и вставки на всем протяжении изучаемого фрагмента.
2. Выявление нарушения места рестрикции и аллельспецифической гибридизации с синтетическими олигонуклеотидными зондами.
Выявление нарушения места рестрикции осуществляется с помощью
блот-гибридизации по Саузерну. При обработке соответствующей
рестриктазой на поверхности геля можно выявить изменение место­
расположения фрагментов ДНК, в отличие от того, что наблюдается у
здоровых лиц. Примерно 50% нуклеотидных замен приводит к измене­
нию места (или сайта) рестрикции, благодаря чему возможна детекция
мутаций на основе рестрикционного анализа. Аллельспецифическая
гибридизация с олигонуклеотидными зондами также позволяет обна­
руживать мутации.
3. Химическое и ферментативное расщепление ДНК в местах
неправильного сшивания оснований, позволяющее выявлять боль­
шую группу мутаций, ведущих к нестабильности ДНК.
4. Регистрация изменения электрофоретической подвижности
28
мутантных молекул ДНК. Во-первых, могут изменяться температур­
ные показатели плавления двухцепочечных фрагментов, что можно
определить с помощью электрофореза двухцепочечной ДНК в гради­
ентном денатурирующем геле (так называемый денатурирующий гельэлектрофорез). Во-вторых, в результате мутации может изменяться
конформация одноцепочечных фрагментов, что выявляется путем
электрофореза предварительно денатурированных ДНК в неденату­
рирующих условиях. В-третьих, проводится так называемый гетеродуплексный анализ, с помощью которого обнаруживаются нарушения
линейности гетеродуплексов в местах коротких вставок и делеций.
5. Трансляция белкового продукта in vitro на основе полученной
специфической мРНК с добавлением лизата ретикулоцитов (в лизате
содержатся все необходимые ингредиенты для синтеза белка). Продукт
трансляции анализируют с помощью электрофореза. Изменение элек­
трофоретической подвижности белка свидетельствует о наличии мута­
ции (нонсенс-мутация, нарушение сплайсинга РНК, сдвиг рамки счи­
тывания).
6. Полиморфизм длин рестриктных фрагментов. Использование
косвенных подходов генодиагностики оказалось возможным благодаря
существованию в геноме полиморфных локусов ДНК. Нуклеотидные
замены достаточно часто встречаются в некодирующих участках ДНК.
Значительное число нуклеотидных замен приводит к изменению кар­
тины рестрикции. Эти изменения можно выявить с помощью блотгибридизации по Саузерну, поскольку изменяется длина рестриктных
фрагментов. Эта разновидность полиморфизма ДНК получила назва­
ние полиморфизма длин рестриктных фрагментов (ПДРФ). Известно,
что полиморфизм примерно 3 млн. нуклеотидов из 3 млрд., состав­
ляющих человеческий геном, отличает одного человека от другого.
С полиморфизмом связана наследственная предрасположенность
ко многим заболеваниям, в том числе злокачественным, с ним свя­
заны многие генетически заданные фенотипические особенности
человека. Созданы эффективные технологии микрочипного анализа
полиморфизма сразу по многим участкам для каждого индивидуума.
Расположенный вблизи изучаемого гена или внутри него полиморф­
ный сайт может служить маркером аллельных вариантов этого гена, в
I том числе маркером патологических мутаций.
7. Маркеры микросателлитные. Часто используемыми в диагно­
стике типами полиморфизма ДНК являются короткие повторяющиеся
последовательности, или микросателлиты. Это моно-, ди-, три- и тетрануклеотидные тандемно повторяющиеся последовательности ДНК.
Микросателлитные локусы с большой частотой встречаются в геноме
и достаточно равномерно распределены по длине генома. В основе
полиморфизма микросателлитов лежат различия в числе повторяю29
щихся единиц. Использование микросателлитов в качестве маркерных
локусов позволяет в большинстве случаев легко проследить в родос­
ловной передачу мутантного гена. Микросателлитные локусы анализи­
руют с помощью ПЦР-амплификации и разделения ампликонов- фраг­
ментов ДНК на полиакриламидном геле. В последующем были исполь­
зованы праймеры, меченные флуоресцентной краской для ПЦР ана­
лиза динуклеотидных повторов и детекции продуктов реакции с помо­
щью автоматического лазерного детектора фрагментов ДНК. Позже
был разработан автоматизированный метод анализа тандемных повто­
ров с помощью стандартных автоматических секвенаторов ДНК. Это
позволило резко повысить чувствительность и скорость анализа по
сравнению с традиционными методами, основанными на гибридиза­
ции геномных блотов.
К основным методам диагностики либо типирования ДНК отно­
сятся полимеразная цепная реакция, блот-гибридизация, клонирова­
ние и секвенирование ДНК.
Технология ПЦР
1. Исследуемая геномная ДНК выделяется из клеток крови (лейко­
цитов), тканевых клеток (фибробласты и др.). Внутриклеточные нуклеазы, в частности - ДНКазы инактивируются до того, как они успеют гидро­
лизовать молекулы нуклеиновых кислот. Поэтому ингибиторы нуклеаз
вводятся в буферные растворы до разрушения клеток. В качестве инги­
биторов нуклеаз чаще используются неспецифические денатурирую­
щие реагенты (ионные детергенты, гидроокись ртути, гуанидинхлорид, гуанидинизотиоцианат, фенол, хлороформ и др.). При выделе­
нии ДНК допускается лишь мягкое перемешивание ее раствора в про­
цессе депротеинизации. На первых этапах очистки применяют протеолитические ферменты (протеиназу К из Trirachium album или проназу
из Streptomyces griseus), фенол и хлороформ. Поскольку при освобож­
дении от белков происходит одновременная очистка ДНК и РНК, для
освобождения от примесей РНК применяют высокоочищенные препа­
раты РНКаз без примесей ДНКаз (чаще всего панкреатическую РНКазу).
2. К исследуемой ДНК добавляют пару олигонуклеотидных
праймеров - химически синтезированных фрагментов ДНК длиной
20-30 нуклеотидов. Последовательность нуклеотидов в них подбирают
так, чтобы они были комплементарны участкам ДНК по краям амплифицируемого фрагмента. Своими З'-концами праймеры направлены друг
к другу, то есть внутрь амплифицируемого фрагмента ДНК. Важнейший
компонент реакции - термостабильная ДНК-полимераза, которая ката­
лизирует реакцию синтеза ДНК. Она использует олигонуклеотидные
праймеры как затравки, а исходную молекулу ДНК - в качестве матрицы
для синтеза. В реакционную смесь добавляют также дезоксинуклео30
тиды: А, Т, G, С, необходимые для амплификации ДНК. Далее в усло­
виях повышенной температуры происходит тепловая денатурация
исследуемой двуспиральной ДНК на однонитевые нуклеотиды. Затем
пробирку охлаждают до температуры, оптимальной для наплавления
олигонуклеотидных праймеров на соответствующие им места в однонитевой ДНК. Олигонуклеотидные праймеры соединяются с компле­
ментарными им последовательностями ДНК. После этого начинается
синтез второй комплементарной цепи ДНК. При этом ДНК-полимераза
«ползет» по старой цепи, как по матрице, и синтезирует новую, компле­
ментарную цепь (А соответствует Т, a G - С). Полимераза синтезирует
новую цепь всегда в направлении 5-3', то есть подшивая дезоксинуклеотиды только к одному из концов олигонуклеотидных праймеров
(а именно к З'-концу). Таким образом, процесс амплификации заклю­
чается в осуществлении повторяющихся циклов. Каждый цикл вклю­
чает 3 стадии:
- температурная денатурация ДНК (разделение двухцепочечной
ДНК на одноцепочечные молекулы);
- присоединение праймеров к комплементарным последователь­
ностям одноцепочечных молекул (отжиг);
- синтез полинуклеотидных цепей на одноцепочечных молекулах
в границах присоединенных праймеров с помощью полимеразы.
В течение нескольких часов можно размножить определённую
последовательность ДНК в количестве, превышающем исходное в мил­
лион раз и более. Для прохождения одного цикла достаточно 1-3 минут.
Затем цикл нагревания и охлаждения пробирки многократно повторяют
в термоциклере, и все этапы амплификации (денатурация дуплексов
ДНК - наплавление праймеров на ДНК - удлинение ДНК) повторяется.
3. Сайт-специфическая рестрикция ДНК на фрагменты при помощи
ферментов - рестриктаз. Основное свойство данных ферментов - рас­
щеплять двухцепочечную ДНК в пределах строго определенных для
каждого фрагмента последовательностях нуклеотидов, в сайтах про­
тяженностью 4-6 пар оснований. При обработке геномной ДНК рестриктазой получается закономерный для данной рестриктазы набор фраг­
ментов различной длины.
4. Электрофорез фрагментов ДНК обеспечивает разделение этих
( фрагментов при их распределении на поверхности агарозного или поли­
акриламидного геля. Фрагменты ДНК движутся в геле, помещенном
в постоянное электрическое поле, от отрицательного полюса к поло­
жительному в зависимости от размеров (чем больше относительная
молекулярная масса фрагмента, тем медленнее он движется в элек­
трическом поле). После окончания электрофореза каждый фрагмент
ДНК занимает определенное положение в виде дискретной полосы в
конкретном месте геля. Длину каждого фрагмента можно определить
31
путем сравнения пройденного фрагментом расстояния с расстоянием,
пройденным стандартным образцом ДНК с известными размерами.
5.
Визуализация и идентификация фрагментов ДНК в геле явл
ется либо конечным этапом диагностики, либо необходимым элемен­
том дальнейшего анализа. Визуализация фрагментов ДНК после элек­
трофореза в агарозном геле может осуществляться обработкой этидием бромида, который связывается с ДНК. При ультрафиолетовом
облучении поверхности геля выявляется свечение в красной области
спектра излучения. Однако идентификация конкретных фрагментов в
геле среди геномной ДНК является более сложной задачей. Из-за боль­
ших размеров генома человека после рестрикции образуется настолько
большое число рестриктных фрагментов, что агарозный гель после
электрофореза и окраски этидия бромидом при ультрафиолетовом
облучении выглядит как более или менее равномерно окрашенная
поверхность. Чтобы выявить конкретные фрагменты ДНК применя­
ется блот-гибридизация. Но гибридизация меченого зонда с фрагмен­
тами ДНК, находящимися в геле, происходит не очень эффективно.
Поэтому перед отжигом фрагменты переносят из геля на более подхо­
дящую твердую подложку, обычно на нитроцеллюлозный фильтр (или
нейлон). Перенос ДНК с геля на нитроцеллюлозный или нейлоновый
фильтр производится в буферном растворе. Сначала гель обрабаты­
вают щелочью, чтобы произошла денатурация ДНК. Затем непосред­
ственно на поверхность геля помещают нитроцеллюлозный фильтр и
сверху стопку фильтровальной бумаги. Из-за капиллярного эффекта
буферный раствор, пропитывая фильтровальную бумагу переносит
на твердую подложку с поверхности геля одноцепочечные фрагменты
ДНК. Вымываемая из геля ДНК задерживается фильтром и практически
полностью оказывается на его поверхности. После переноса одноце­
почечные нити фиксируют на твердой подложке. Расположение фраг­
ментов на ней точно соответствует их расположению в геле. Проводят
гибридизацию со специфическим по нуклеотидной последовательно­
сти и меченым радионуклидом или флюоресцентной меткой олигонуклеотидным синтетическим зондом (такой зонд состоит из 16— 30 пар
нуклеотидов) либо клонированным фрагментом ДНК. Нуклеотидная
последовательность зонда должна быть полностью или частично
комплементарна изучаемому участку геномной ДНК. При инкубации
фильтра с раствором, содержащим меченый зонд, происходит гибри­
дизация комплементарных цепей ДНК-зонда и фрагмента на фильтре.
Неспецифически связанные молекулы зонда отмываются, а оставши­
еся полосы гибридных молекул ДНК идентифицируются по радиактивной либо флюоресцентной метке.
Применяя специфические олигонуклеотидные праймеры, ПЦРметодом идентифицируются ДНК возбудителей инфекций, онкогены в
32
атипичных клетках, тип мутаций в геномной ДНК при анализе наслед­
ственных заболеваний. А также этот метод используется в кримина­
листике для идентификации личности, для установления отцовства и
степени родства.
ПЦР в реальном времени (количественный ПЦР)
ПЦР в реальном времени позволяет одновременно выполнять
качественный и количественный анализы. Технология позволяет
определять количество образующихся амплификатов во времени,
проводить автоматическую регистрацию и интерпретацию получен­
ных результатов. Измеряется количество амплифицированной ДНК в
реальном времени после каждого цикла амплификации. Для количе­
ственного определения используют два метода, основанные на реак­
ции флуоресценции:
амплифицированные фрагменты ДНК идентифицируются п
помощи меченного флуоресцентным красителем олигонуклеотидного
зонда. В процессе гибридизации происходит высвобождение флуо­
ресцентной метки в раствор, что дает возможность ее определения на
флуоресцентном детекторе. Данный способ детекции является альтер­
нативой электрофоретическому методу;
флуоресцентная детекция количества амплификатов при
помощи закрытой системы TaqMan, использующей 5’-экзонуклеазную
активностьTaq-полимерэзы. Свободный зонд имеет на 5-конце флуо­
ресцирующий краситель, а на З'-конце вещество гасящее флуоресцен­
цию. Поэтому свободный зонд флуоресцирует слабо, но когда связан­
ный с комплементарным амплификоном зонд создает препятствие для
продвижения Taq-полимерэзы, она его расщепляет начиная с 5-конца,
что приводит к отдалению флуоресцирующего красителя от его гаси­
теля и тем самым к усилению флуоресценции. Флуоресцентный сиг­
нал усиливается в реальном времени пропорционально накоплению
комплементарной зонду, амплифицированной ДНК. Использование
флуоресцентной детекции в закрытой системе TaqMan или подобных
системах полностью исключает попадание амплификонов в окружаю­
щую среду и снимает проблему контаминаций и соответственно сни­
жает требования к организации ПЦР-лабораторий. На такой детекции
I основана ПЦР в реальном времени, уже определившаяся в качестве
более перспективного метода. В исследовательской практике приме­
няются также:
- RT-PCR (Reverse Transcription) - исходный продукт мРНК, с кото­
рой реплицируется кДНК, далее проводится ПЦР;
- PCR-RFLP (PCR-Restriction Fragment Length Polymorphism Assay,
ПЦР-ПДРФ - полиморфизм длин рестрикционных фрагментов) - вна­
чале проводится ПЦР, а затем - рестрикция амплифицированного
33
ДНК соответствующими эндонуклеазами с определением полученных
рестрикционных фрагментов ДНК.
Блот-гибридизация
Гибридизация ДНК - соединение in vitro комплементарных одно­
цепочечных нуклеиновых кислот в одну двухцепочечную гибридную
молекулу.
Блот-гибридизация по Саузерну - метод идентификации электрофоретически разделенных фрагментов исследуемой ДНК по компле­
ментарным ДНК-зондам на нитроцеллюлозных или нейлоновых филь­
трах. Во время электрофореза фрагменты исследуемой ДНК распре­
деляются в соответствии со своей молекулярной массой на поверхно­
сти геля. Эти фрагменты денатурируются, однонитевые олигонукле­
отиды переносятся и фиксируются на нитроцеллюлозном фильтре,
затем вносится меченый радиоактивной либо флуоресцентной мет­
кой ДНК-зонд и смесь инкубируется при повышенной температуре с
последующим охлаждением (денатурация и отжиг). При этом компле­
ментарные однонитевые последовательности исследуемой и зондовой
ДНК, соединяясь водородными связями (сшивка) образуют гибридную
двунитевую молекулу ДНК. Полученные гибриды визуализируются и
идентифицируются по маркировке. Метод гибридизации in situ позво­
ляет выявить нужные последовательности ДНК или РНК (например,
вирусной, бактериальной, грибковой или протозойной в инфицирован­
ной ткани), позволяет выявлять хромосомные аномалии при наслед­
ственной патологии и др.
Блоттинг - перенос молекул ДНК, РНК или белка из геля, в кото­
ром шёл электрофорез, на фильтр; метод назван по имени его изобре­
тателя блоттингом по Саузерну; соответствующие методики для РНК
и белков получили название нозерн-блоттинга и вестерн-блоттинга.
Флуоресцентная гибридизация in situ
В флуоресцентной гибридизации in situ (fluorescent in situ hybridiza­
tion - FISH) используются флуоресцирующие молекулы для прижизнен­
ной окраски генов или хромосом (рис.5). Метод используется для кар­
тирования генов и идентификации хромосомных аберраций. Методика
начинается с приготовления коротких последовательностей ДНК, назы­
ваемых зондами, которые являются комплементарными по отношению
к последовательностям ДНК, представляющим объект изучения. Зонды
гибридизуются (связываются) с комплементарными участками ДНК и
благодаря тому, что они помечены флуоресцентной меткой, позволяют
видеть локализацию интересующих генов в составе ДНК или хромосом.
В отличие от других методов изучения хромосом, требующих активного
деления клетки, FISH можно выполнять на неделящихся клетках, бла­
34
годаря чему достигается гибкость метода. FISH является полезным и
чувствительным методом цитогенетического анализа при выявлении
количественных и качественных хромосомных аберраций, таких как
делеции (в том числе и микроделеции), транслокации, удвоение и анэуплоидия. FISH на интерфазных хромосомах служит быстрым методом
пренатальной диагностики трисомий по 21,18 или 13 хромосомам или
аберраций половых хромосом. В онкологии с помощью FISH можно
выявлять рад транслокаций (bcr/abl, MLL, PML/RARA, TEL/AML1), свя­
занных с гематологическими злокачественными новообразованиями.
Метод также может использоваться для мониторинга динамики опу­
холевого процесса после химиотерапии и пересадки костного мозга,
при выявлении онкогенов (c-myc/n-myc). Кроме того FISH использу­
ется для контроля приживаемости аллотрансплантата костного мозга,
полученного от индивида противоположного пола.
Рис.5. Гибридизация in situ с флуоресцентной меткой (FISH), (с сайта).
Клонирование ДНК
С помощью специализированных ферментов (ДНК-рестриктаз)
нить ДНК расщепляется на короткие фрагменты, на отдельные группы
генов или на единичные гены. Для изучения признаков (в том числе
патологических), кодируемых данными генами, нарабатывается доста­
точное количество копий данного гена. Обычно в клетке мало клони­
руемой ДНК (кДНК), но достаточное количество молекул мРНК дан­
ного гена. Поэтому с помощью обратной транскриптазы на матрице
мРНК синтезируется к ДНК, пригодная для клонирования и анализа.
Далее при помощи сайт-специфической рестрикции клонируемый
фрагмент ДНК трансформируется в вектор на основе плазмид либо
вирусов. При последующей трансфекции и репликации вектора (плаз­
миды либо вируса) в реципиентной клетке накапливается также кло­
35
нируемый фрагмент ДНК.
Клоны кДНК (в отличие от клонов геномной ДНК) не содержат
последовательностей, соответствующих интронам. На основании
полного или частичного определения нуклеотидной последователь­
ности клонированной кДНК определяют аминокислотную последова­
тельность белка и сравнивают с аминокислотными последователь­
ностями известных белков. Уже клонированы сотни генов, например
гены, мутации которых вызывают муковисцидоз, синдром Марфана,
аденоматозный полипоз толстой кишки, нейрофиброматоз, атрофиче­
скую миотонию, синдром ломкой Х-хромосомы, болезнь Гентингтона,
семейный рак молочной железы типа 1, синдром Линча и многие другие.
В любой клонированный фрагмент можно ввести метку (радио­
активный изотоп, биотин и др.) и использовать его как специфический
молекулярный зон д . Радиоактивные зонды выявляют с помощью ради­
оавтографии, а биотинилированные - с помощью меченного авидина.
Клонирование позволило получить зонды для анализа ДНК, для выяв­
ления мутаций, вызывающих заболевания, а также установить после­
довательность нуклеотидов в ДНК, зная которую можно определить
аминокислотную последовательность в белке и приготовить праймеры
для амплификации ДНК с помощью ПЦР.
Секвенирование Д НК
1. Метод Сенгера с дидезоксинуклеозидтрифосфатами (ddNTP)
• ферментативный, дезоксинуклеотидный метод. Метод используется
для определения нуклеотидной последовательности ДНК. При дидезоксисеквенировании происходит гибридизация синтетического олиго­
нуклеотида длиной 17—20 звеньев со специфическим участком одной
из цепей секвенируемого участка. Этот олигонуклеотид является прай­
мером, поставляющим З'-гидроксильную группу для инициации син­
теза цепи, комплементарной матрице. Раствор с праймером распре­
деляют по четырем пробиркам, в каждой из которых находятся четыре
дезоксинуклеотида, dATP, dCTP, dGTP и dTTP (один из них — мечен­
ный радиоактивным изотопом) и один из четырех 2',3-дидезоксинуклеотидов (ddATP, ddTTP, ddGTP или ddCTP). Дидезоксинуклеотид вклю­
чается по всем позициям в смеси растущих цепей, и после его присо­
единения рост цепи сразу останавливается. В результате этого в каж­
дой из четырех пробирок при участии ДНК-полимеразы образуется уни­
кальный набор олигонуклеотидов разной длины, включающих праймерную последовательность.
Таким образом вначале фрагменты ДНК, последовательность
которых предстоит определить, многократно копируются (амплифицируются), затем расщепляются на короткие фрагменты, которые затем
служат матрицей для синтеза полностью комплементарных цепей ДНК.
36
Особенность метода заключается в использовании химически моди­
фицированных разновидностей четырех дезоксирибонуклеотидов,
составляющих цепи ДНК. Каждая разновидность «помечена» флуо­
ресцентной молекулой-маркером. Вместо флуоресцентных веществ в
качестве маркеров для мечения можно использовать радиоактивные
изотопы. Короткий фрагмент ДНК, называемый затравкой, или прайме­
ром, инициирует синтез ДНК в определённой точке цепи ДНК-матрицы.
Синтез комплементарной цепи происходит при участии фермента
ДНК-полимеразы. При этом видоизменённые разновидности нуклео­
тидов, внесенные в реакционную смесь в значительно меньших коли­
чествах, чем обычные нуклеотиды, обрывают синтез, когда один из них
оказывается на конце растущей ДНК-цепи. Видоизмененные нуклео­
тиды не имеют той самой химической группы, к которой должен при­
соединяться следующий нуклеотид для продолжения цепи. В резуль­
тате получается смесь, содержащая полный набор новосинтезированных фрагментов ДНК, каждый из которых начинается в одном и том же
месте, но заканчивается во всех возможных положениях вдоль цепи
ДНК-матрицы.
Далее в пробирки добавляют формамид для расхождения цепей и
проводят электрофорез в полиакриламидном геле на четырех дорож­
ках. Проводят радиоавтографию, которая позволяет «прочесть» нукле­
отидную последовательность секвенируемого сегмента ДНК.
В более современном варианте дидезоксинуклеотиды метят
четырьмя разными флуоресцентными красителями и проводят ПЦР в
одной пробирке. Затем во время электрофореза в полиакриламидном
геле луч лазера в определенном месте геля возбуждает флуоресцен­
цию красителей, и детектор определяет, какой нуклеотид в настоящий
момент мигрирует через гель. Современные приборы используют для
секвенирования ДНК капиллярный электрофорез.
В качестве матрицы в реакции полимеразного копирования
используется одноцепочечный фрагмент ДНК, в качестве праймеров синтетические олигонуклеотиды или природные субфрагменты, полу­
чаемые при гидролизе рестрицирующими эндонуклеазами, а в каче­
стве фермента - фрагмент Кленова ДНК полимеразы I (Poll) из E.coli.
Метод включает два этапа. Сначала в ограниченных условиях про­
водится полимеразная цепная реакция в присутствии всех четырех
типов dNTP (один из них с меткой по альфа-положению фосфата),
получая на выходе набор продуктов неполного копирования матрич­
ного фрагмента. Смесь очищается от несвязавшихся дезоксинуклеозидтрифосфатов и делится на восемь частей. После чего в «плюс»
системе проводятся четыре реакции в присутствии каждого из четырех
типов нуклеотидов, а в «минус» системе - в отсутствие каждого из них.
В результате, в «минус» системе терминация происходила перед dNTP
37
данного типа, а в «плюс» системе - после него. Полученные таким обра­
зом восемь образцов разделяются с помощью электрофореза, «счи­
тывается» сигнал и определяется последовательность исходной ДНК.
2. Метод Максама и Гилберт, основанный на специфической хими­
ческой деградации фрагмента ДНК, радиоактивно меченного с одного
конца. Препарат меченной ДНК разделяется на четыре аликвоты и каж­
дая обрабатывается реагентом, модифицирующим одно или два из
четырех оснований. А. Максам и У. Гилберт предложили модифициро­
вать пуриновые основания диметилсульфатом. При этом происходит
метилирование адениновых остатков по азоту в положении 3, а гуаниновых - по азоту в положении 7. Обработка образца ДНК соляной кис­
лотой при 0°С приводит к выщеплению метиладенина. Последующая
инкубация при температуре 90°С в щелочной среде вызывает раз­
рыв сахарно-фосфатной цепи ДНК в местах выщепления оснований.
Обработка пиперидином приводит к гидролизу образца по остаткам
метилгуанина. Пиримидиновые основания модифицируют гидразином.
Если реакцию вести в бессолевой среде, то модифицируются как цито­
зин, так и тимидин; если обработку вести в присутствии 2М NaCI, то
модифицируется лишь цитозин. Расщепление цепи ДНК на фрагменты
и в этом случае осуществляется пиперидином. Условия реакций авторы
подбирали таким образом, чтобы в итоге получить полный набор суб­
фрагментов разной длины. Последующий электрофорез в полиакри­
ламидном геле позволяет восстановить полную структуру исследуе­
мого фрагмента.
3. Автоматическое секвенирование ДНК. В основе автоматиче­
ского секвенирования лежит уже упоминавшийся выше метод фермен­
тативного секвенирования с использованием терминирующих ddNTP.
Как и классический вариант Сэнгера, автоматическое секвенирова­
ние включает две стадии: проведение терминирующих реакций и раз­
деление продуктов этих реакций с помощью электрофореза. Как пра­
вило, автоматизирована лишь вторая стадия, т.е. разделение мечен­
ных фрагментов ДНК в ПААГ, получение спектра эмиссии флуорофоров и последующий обсчет собранных данных. Флуоресцентную метку
включают либо в праймер, либо в терминатор транскрипции согласно
следующим схемам: меченный праймер (четыре разных красителя)
и немеченные терминаторы; меченный праймер (один краситель) и
немеченные терминаторы; меченные терминаторы (каждый тип тер­
минатора своим красителем) и немеченный праймер. Использование
меченных праймеров предполагает проведение четырех независи­
мых реакций (отдельно с каждым из терминаторов) для каждого секвенируемого образца. Использование меченных терминаторов позво­
ляет совместить все четыре реакции в одной пробирке. Если исполь­
зуется единственный краситель, то разделение продуктов сиквенсовой
38
реакции в геле проводят на четырех разных дорожках. Использование
четырех разных красок позволяет разгонять продукты реакции(й) на
одной дорожке.
Современные автоматизированные секвенаторы
разделяют эти фрагменты, пропуская всю смесь через тончайшие
капилляры, наполненные гелем. Чем короче фрагмент, тем быстрее
он движется в геле по капилляру под действием электрического поля
(фрагменты ДНК — по сути, ионы, движущиеся в электрическом поле
от «минуса» к «плюсу».). Процесс, называемый капиллярным электро­
форезом, настолько эффективен, что фрагмент, только что вышед­
ший из капилляра, оказывается ровно на один нуклеотид длиннее,
чем предшествующий ему. По мере того как фрагмент появляется,
он освещается лазером, что заставляет светиться меченный нукле­
отид на его конце. Компьютер определяет разновидность этих нукле­
отидов и регистрирует последовательность их появления, складывая
«буквы» (нуклеотиды) в «текст» (последовательность ДНК). В случае
расшифровки целого генома так нарабатываются миллиарды коротких
«текстов», которые поступают в специальную программу, запускаемую
на суперкомпьютерах. Программа находит места перекрывания «тек­
стов» и, располагая их в нужном порядке, выстраивает полную после­
довательность генома.
4.
454 -секвенирование (высокопроизводительное пиросекв
нирование ДНК). Весь геном, все молекулы ДНК, случайным обра­
зом рестриктируются на фрагменты по 300-500 пар оснований. Затем
комплементарные цепи фрагмента разделяются, к каждой цепи фраг­
ментов пришивается одинаковый для всех олигонуклеотид- «адап­
тер», который позволяет отдельным цепям налипать на пластико­
вые бусинки (последовательность этого олигонуклеотида позволяет
позднее в процессе секвенирования распознавать ДНК-матрицу).
При этом смесь разъединённых на комплементарные цепи фрагмен­
тов разбавляют таким образом, что каждая бусинка получает лишь
по одной (!) индивидуальной цепи. Каждая бусинка оказывается заклю­
чённой в липидную микрокапельку и содержащую смесь для осу­
ществления ПЦР, которая и проходит отдельно в каждой капельке
эмульсии (так называемая эмульсионная ПЦР, эПЦР). Это приво­
дит к «клональной амплификации» цепей ДНК, т.е. на поверхности
бусинки удерживается уже не одна, а около 10 млн. копий («клонов»)
уникальной ДНК-матрицы. Далее эмульсия разрушается, вновь дву­
цепочечные фрагменты ДНК (образовавшиеся в ходе ПЦР) разделя­
ются, и бусинки, несущие одноцепочечные копии ДНК-матрицы, поме­
щаются в лунки «предметного стекла» — слайда особой конструк­
ции. Каждая лунка такого слайда образует отдельный пиколитровый
«реактор», в котором и будет происходить реакция секвенирования.
Слайд представляет собой срез блока, полученного путём несколь­
39
ких раундов вытягивания и сплавления оптических волокон. В резуль­
тате каждой итерации, диаметр индивидуальных волокон уменьша­
ется по мере того, как волокна формируют пучки шестигранной упа­
ковки увеличивающегося поперечного диаметра. Каждое волокно
имеет сердечник диаметром 44 мкм, окружённый 2 -3 мкм слоем пла­
кировки (оболочки). Затем сердечники вытравливаются, и в результате
получаются лунки «55 мкм глубиной, с расстоянием =50 мкм между
центрами соседних лунок. Объём таких «реакторов» — 75 пиколитров;
плотность размещения на поверхности слайда — 480 лунок на ква­
дратный миллиметр. Каждый слайд несёт около 1,6 миллионов лунок,
в каждую из которых попадает одна (!) бусинка с ДНК-матрицей. Слайд
помещается в проточную камеру таким образом, что над отверстиями
лунок создаётся канал высотой 300 мкм, по которому в лунки посту­
пают необходимые реактивы.
Доставляемые в проточную камеру реактивы текут в слое, пер­
пендикулярном оси лунок. Такая конфигурация позволяет одновре­
менно осуществлять реакции на бусинках, несущих ДНК-матрицы, вну­
три отдельных лунок. Добавление и удаление реагентов и продуктов
реакции происходит за счёт конвекционного и диффузионного пере­
носа. Временные рамки диффузии между потоком и лунками состав­
ляют порядка 10 секунд и зависят от высоты проточной камеры и глу­
бины лунок. Помимо бусинок с ДНК-матрицей, в каждую лунку вносят
ещё бусинки помельче — каждая с иммобилизованными на её поверх­
ности ферментами, необходимыми для пирофосфатного секвенирования. Нуклеотиды (одного вида в цикле) и другие реактивы, необходимые
для реакции секвенирования, подаются последовательно в проточ­
ную камеру, куда помещается слайд. Каждый раз, когда определённый
нуклеотид встраивается в растущую цепь ДНК в какой-нибудь из лунок,
в ней высвобождается молекула пирофосфата, которая, в свою оче­
редь, является необходимым предшественником компонента другой
ферментативной реакции. Её катализирует особый фермент, люцифераза светлячка Photinus pyralis. Но для её осуществления необходим
аденозинтрифосфат (АТФ). Новообразованный пирофосфат превра­
щается в лунке в АТФ под действием ещё одного фермента — АТФсульфурилазы. И тогда люцифераза окисляет люциферин до оксилюциферина, а эта реакция сопровождается хемилюминесценцией. Дно
слайда находится в оптическом контакте с оптико-волоконным светово­
дом, подключённым к прибору с зарядовой связью (CCD-сенсор, charge
coupled device). Это позволяет регистрировать излучаемые фотоны
со дна каждой индивидуальной лунки, в которой произошло встраива­
ние известного нуклеотида. Общая схема пиросеквенирования дана
на рис. 6 (с сайта).
40
Рисунок 6. Схема пиросеквенирования.
А—
днк
фрагментируется,
к фрагментам пришиваются олигонуклеотиды-«адаптеры»; полученные двуцепочеч­
ные молекулы Д НК разделяются на две комплементарные цепи. Б — Одноцепочечные
молекулы ДНК прикрепляются к бусинкам в условиях, стимулирующих попадание лишь
одной молекулы на бусинку. Отдельные бусинки заключаются в капли реакционной смеси,
окруженные маслом. Количество молекул на бусинке увеличивается в миллионы раз в
результате эмульсионной полимеразной цепной реакции (эПЦР). В — Эмульсия разбива­
ется, и цепи ДНК-фрагментов, образовавшиеся в результате эПЦР, разделяются. Бусинки,
несущие на своей поверхности миллионы одноцепочечных копий первоначального фраг­
мента ДНК, помешаются в лунки оптико-волоконного слайда, по одной в каждую лунку.
Г — В каждую лунку добавляются бусинки поменьше, несущие на своей поверхности
ферменты, необходимые для пиросеквенирования. Д — Микрофотография эмульсии,
изображающая «пустые» капли и капли, содержащие бусинки с ДНК-матрицей. Толстая
стрелка указывает на 100-мкм каплю, тонкая— на 28-мкм бусинку. Е — Микрофотография
фрагмента оптико-волоконного слайда, полученная при помощи сканирующего электрон­
ного микроскопа. Видна плакировка оптических волокон и пустые лунки.
Связывая зарегистрированные от каждой лунки вспышки с типом
I нуклеотида, присутствующего в проточной камере в данный момент вре­
мени, компьютер последовательно отслеживает рост цепочек ДНК в сот­
нях тысяч лунок одновременно. Время, необходимое для протекания
ферментативной реакции, производящей детектируемую «вспышку»,
j составляет порядка 0,02-1,5 секунды. Таким образом, скорость реак) ции определяется скоростью массопереноса, что оставляет место для
улучшений за счёт ускорения доставки реактивов. После поступления
в проточную камеру каждого нуклеотида, она промывается раствором,
содержащим фермент апиразу. Таким образом перед тем, как «запу­
стить» в камеру следующий нуклеотид, из всех лунок удаляются любые
нуклеотиды, остававшиеся там от предыдущего раунда. Включение
того или иного нуклеотида детектируется в результате высвобожде­
ния неорганического пирофосфата и последующего излучения света.
41
Определить лунки, содержащие бусинки с ДНК-матрицей, можно, про­
читав «последовательность-ключ» адаптерного олигонуклеотида, при­
шитого к началу каждой ДНК-матрицы. Из регистрируемого сигнала
вычитается уровень фона, затем сигнал нормализуется и корректиру­
ется. Интенсивность нормализованного сигнала для каждой конкретной
лунки во время поступления в проточную камеру определённого нукле­
отида пропорциональна числу встроенных нуклеотидов, если таковые
имеются. Линейность зависимости сохраняется для гомополимеров
длиной как минимум в восемь нуклеотидов. При таком секвенировании синтезом очень небольшое число ДНК-матриц на каждой бусинке
теряет синхронизм, т. е. вырываются вперёд или начинают отставать
от других матриц. Причиной этому прежде всего служат остающиеся
в лунке нуклеотиды или неполное удлинение цепи. Исправление таких
сдвигов необходимо, поскольку потеря синхронизма создаёт кумулятив­
ный эффект, сильно снижающий качество прочтения при увеличении его
длины. Исходя из подробной модели лежащих в основе этого эффекта
физических процессов, разработан особый алгоритм, позволяющий
оценивать и вносить поправки на «перелёт» и неполную достройку цепи,
происходящие в отдельных лунках. Перед тем, как составить и «запи­
сать» окончательную последовательность прочитанной ДНК, из всего
массива данных для дальнейшей работы необходимо отобрать высоко­
качественные прочтения и отбросить некачественные. Отбор основыва­
ется на наблюдении, что в прочтениях низкого качества велика доля сиг­
налов, не позволяющих отличить циклы, в течение которых произошло
включение нуклеотида, от циклов без включения. Такие двусмыслен­
ные сигналы — причина ошибок в записи последовательности отдель­
ных прочтений. Чтобы увеличить число пригодных для использования
прочтений, также разработана особая мера, позволяющая оценивать
ab initio вероятность правильного определения нуклеотида в каждой
конкретной позиции отдельных прочтений. Высокая точность расшиф­
ровки последовательности достигается тем, что система осуществляет
многочисленное прочтение одного и того же фрагмента, что позволяет
построить единую обобщённую (так называемую консенсусную) после­
довательность. Отдельные прочтения одного и того же участка ДНК
выравниваются относительно друг друга исходя из интенсивности сиг­
налов в момент протекания через камеру того или иного нуклеотида,
а не на основе последовательности этих прочтений. Затем соответ­
ствующие сигналы усредняют, и только тогда записывают полученную
последовательность. Такой подход значительно улучшает качество рас­
шифровки последовательности и предоставляет возможность оценки
её качества. Технология 454, сочетающая эПЦР и пиросеквенирование,
обладает неоспоримым преимуществом перед методом Сэнгера (рис.7).
Эмульсионная ПЦР позволяет амплифицировать без всяких предпочте42
ний единичные молекулы ДНК, заключая их в капельку эмульсии и устра­
няя конкуренцию со стороны других ДНК-матриц за ограниченное число
ДНК-полимераз. Пиросеквенирование, в свою очередь, осуществляет
параллельное прочтение этих матриц со световым сигналом на выходе,
который может считываться компьютером.
Новый метод секвенирования имеет практическое примене­
ние в медицине. Например, в генетике раковых заболеваний, специфи­
ческие раковые аллели могут быть отслежены в тканях посредством
высокопроизводительного секвенирования геномной ДНК в тех случаях,
когда метод Сэнгера не пригоден.
Рисунок 7. Схема секвенатора Roche(454) Genome Sequencer FLX.
Прибор состоит изтрехосновныхблоков: А— система микронасосов для подачи реак­
тивов^— Проточнаякамера,содержащаяоптико-волоконныйслайдслунками-реакторами;
В—оптико-волоконнаясистемасССО-сенсорамидля регистрации сигналов. Прибор также
включает в себя встроенный компьютер с необходимым программным обеспечением
для управления всем процессом, с сайта 454 Life Sciences.
ДНК-микрочип (DNA microarray)
Наиболее широкое применение нашли биочипы, изготовленные на
твердой поверхности из стекла, пластика, металла и другого матери­
ала. На такую поверхность в определённом порядке нанесены фраг­
менты одноцепочечной синтетической ДНК с известной последователь­
ностью. В ДНК биочипах организованно размещаются, иммобилизуются
на твердой поверхности короткие однонитевые молекулы ДНК - оли­
гонуклеотиды. Общепринято иммобилизуемые молекулы ДНК назы­
вать зондами, а исследуемые ДНК, которые были выделены из биоматериала и подвергаются анализу, — мишенями. Зонды иммобили­
зуют на твердой поверхности, на матрице биочипа в строго определен­
43
ной последовательности. При последующей гибридизации происходит
специфическое взаимодействие зондов и мишеней по принципу комплементарности. Для того чтобы выявлять стабильные гибридизационные структуры и определить, с каким зондом произошло взаимодей­
ствие, молекулы-мишени предварительно метят флюоресцентным кра­
сителем. Чем больше в образце молекул ДНК с определенной последо­
вательностью, тем большее их количество свяжется с комплементарным
зондом, и тем сильнее будет сигнал в точке микрочипа, куда был «поса­
жен» соответствующий зонд. После гибридизации поверхность микро­
чипа сканируется, и в результате каждой последовательности ДНК ста­
вится в соответствие тот или иной уровень сигнала, пропорциональ­
ный числу молекул ДНК с данной последовательностью, присутствую­
щих в смеси. Технология ДНК-микрочипов находит самые разнообразные
применения в современной биологии и медицине для анализа сложных
смесей ДНК. Таким образом, картина гибридизации представляет собой
картину распределения флюоресцентных сигналов, наиболее ярких в
точках специфического связывания зонда и мишени.
Этапы биочиповой идентификации ДНК:
- выделенные из биоматериала молекулы ДНК амплифицируются с помощью ПЦР После амплификации ДНК расщепляется сайтспецифическими рестриктазами на определенные фрагменты - оли­
гонуклеотиды, последние конъюгируются с флуоресцентной меткой.
Получается набор из огромного числа маркированных олигонуклеоти­
дов - мишеней;
- на поверхность биочипа с иммобилизованными ДНК-зондами
наносятся микрокапли исследуемой (гибридизуемой) ДНК - мишени;
- гибридизация исследуемой ДНК с нанесенными на стекло однонитевыми олигонуклеотидами осуществляется в термостатируемых усло­
виях. Если в исследуемом образце имеется олигонуклеотид, компле­
ментарный иммобилизованному на поверхности биочипа, то они сое­
динятся. При последующем промывании на поверхности биочипа оста­
нутся только связавшиеся с зондами мишени;
- после промывки биочип высушивают и при помощи прибора визу­
ально оценивают наличие и активность флуоресцентного свечения на
твердой поверхности устройства. Затем по результатам компьютерного
анализа, зная олигонуклеотиды, которые были изначально помещены
на подложку, определяется специфичность исследуемой ДНК.
Разрабатываются биочипы-универсалы, имеющие на своей поверх­
ности ДНК-зонды, способные одновременно идентифицировать мути­
ровавшие гены при начальной стадии рака простаты, легкого, молочной
железы, кишечника и некоторых других видов опухолей.
Другой метод оценки результатов анализа с использованием ДНКчипов основан на измерении сил электростатического отталкивания,
44
возникающего между объектами, обладающими зарядами одинакового
знака. С этой целью на поверхность биочипа после проведения гибриди­
зации (исследуемый образец ДНК без флуоресцентной метки) наносится
жидкость, содержащая мельчайшие электрически заряженные кремни­
евые (стеклянные) сферы. Затем анализируют броуновское движение
этих сфер на поверхности микрочипа и измеряют силы электрического
отталкивания между заряженными сферами и молекулами ДНК, прогибридизовавшимися с иммобилизованными на биочипе известными оли­
гонуклеотидами . Такие измерения позволяют анализировать миллионы
последовательностей ДНК одновременно. Эта технология не менее чув­
ствительна, чем флуоресцентное мечение образцов.
Определять прореагировавшие зонды также можно массспектрометрией (по возрастанию молекулярного веса зондового веще­
ства, об этом свидетельствует изменение электропроводности анали­
зируемого материала).
Биочипы применяются при диагностике генетически измененных,
мутировавших штаммов микобактерий туберкулеза, устойчивых к воз­
действию антибиотика, в частности к рифампицину. С этой целью в ячейки
гелевого биочипа наносится в качестве зонда один из наиболее харак­
терных фрагментов одинарной цепи ДНК микобактерий туберкулеза,
устойчивых к рифампицину. Далее из биоматериала выделяется иссле­
дуемая ДНК микроорганизмов и расщепляется сайт-специфическими
рестриктазами на фрагменты, которые амплифицируются до необхо­
димой концентрации. Затем двойные цепи амплифицированной ДНК
расщепляются на одинарные, и получившийся раствор наносится на
поверхность биочипа. При этом однонитевые фрагменты исследуемой
ДНК гибридизуются только с комплементарными им фрагментами оли­
гонуклеотидов, иммобилизованных в геле, на поверхности биочипа.
Положительный результат детектируется при помощи флуоресцентной
метки или другими способами.
В фармакогеномике анализ полиморфизма длин рестрикционных
фрагментов, микросателлитных последовательностей при помощи
биочипов имеет определенное значение в оценке характера и скорости
метаболизма лекарственных средств в организме конкретного паци­
ента. Проблема в том, что у некоторых людей отсутствуют ферменты,
взаимодействующие с данным лекарством либо имеет место избыточ­
ная ингибиция активности лекарства и др. Серийный биочип-анализ ДНК
пациента позволяет оценить потенциальные противопоказания для него
данного лекарственного препарата.
45
ДНК - диагностика заболеваний
а) опухолей
Традиционными цитогенетическими методами можно выявить в
геноме человека лишь некоторые крупные хромосомные перестройки:
протяженные делеции и транслокации генетического материала, потерю
или приобретение целых хромосом. При этом мелкие делеции, трансло­
кации и вставки, а также точечные мутации, остаются не обнаруженными.
Поэтому наряду с цитогенетическими и биохимическими методами в диа­
гностике онкологических заболеваний более востребовано исследование
онкомаркеров и ДНК-диагностика.
Онкомаркеры - это белки, которые продуцируются опухолевой клет­
кой или синтезируются другими клетками, взаимодействующими с опухо­
левыми. Маркеры опухолевого роста подразделяются на:
- иммунологические - опухол ь-ассоциированные антигены или анти­
тела к ним;
- гормоны - ХГЧ, адренокортикотропный гормон и др.;
- ферменты - фосфатазы, лактатдегидрогеназы и др.;
- продукты обмена - креатин, гидроксипролин, полиамины, свобод­
ная ДНК;
- белки плазмы - ферритин, церуллоплазмин, р2-микроглобулин;
- белковые продукты распада опухолей.
Например, при ранней диагностике рака предстательной железы
выявляется ПСА —простатспецифический антиген, при идентификации
наследственного множественного аденоматозного полипа толстой кишки
выявляются маркерные белки, характерные именно для данных опухо­
лей. Важное значение в диагностике опухолевого процесса имеет выяв­
ление мутаций в гене р53, в норме участвующего в регуляции клеточного
цикла, репликации и репарации ДНК, поддержании геномной стабиль­
ности в ответ на генотоксические воздействия. Ген р53 экспрессируется
на высоком уровне при многих типах опухолей разной локализации. Он
обнаружен в ткани опухолей мозга, кишечника, молочной железы, легкого,
печени и яичника, при лейкозах и лимфомах. Повышенный риск разви­
тия рака молочной железы, яичников вызывают дефекты в генах «Ret»,
BRCA1 и BRCA2 (Breast Cancer Associated). Характерна микросателлитная нестабильность при повреждениях генов наследственного неполипозного рака толстой кишки - MSH2, MLH1. При злокачественной транс­
формации клеток толстой кишки, при семейном полипозе на начальной
стадии наблюдаются соматические мутации в гене АРС. Мутации в этом
гене происходят при различных типах рака толстой кишки и наблюдаются
более чем в 80% возникающих опухолей. При атаксии-телеангиоэктазии
мутации в гене ATM, при нейрофиброматозе - в NF1, NF2, при наслед­
ственной меланоме - в р16, при синдроме фон Хиппель-Ландау - в VHL и
46
т.д. Сведения о некоторых онкогенах приведены на табл.5.
Таблица 5. Гены супрессии опухолей человека1
Наименование гена
АРС (аденоматозного
полипоза кишечника)
Хромосома
Rb1 (ретинобластомы)
13q14
WT-1 (опухоли Вильмса)
11р13
р53
5q21
17р12-13
NF-1
(нейрофиброматоза)3
ОСС (делегированный
при раке кишечника)
17q11
18q21
Заболевание
Семейный полипоз
кишечника
Ретинобластома,
остеосарком и др.
Опухоль Вильмса, другие
опухоли
Опухолевый синдром ЛиФромени2
Нейрофиброматоз
(1 тип)
Рак кишечника
1Гэны супрессии опухолей кодируют синтез веществ, регулирующих рост т ка­
ней. Как правило, потеря обоих генов приводит к развитию опухолей, кроме р53
гена, для которого потеря даже одного гена приводит к нарушению и сниже­
нию функции клет ок и неоплазии.
2При этом синдроме наблюдается высокая семейная предрасположенность к
возникновению рака молочной железы, сарком и опухолей мозга как в детстве,
так и у взрослых.
3 Также существует аналогичный ген (N F-2) и для второго типа нейрофиброматоза, который локализуется в 22 хромосоме (simf.h10.ru/patan/cancer.shtml).
При молекулярной диагностике некоторых онкозаболеваний очень
важны тесты на клональность. Смысл тестов на клональность состоит
в том, что клетки опухоли берут начало из единого источника, поэтому
для них характерна практически идентичная генетическая характери­
стика. Например, тест на клональность составляет основу диагностики
лимфом. Так, при помощи ДНК-биочипа можно дифференцировать
геном двух клонов клеток, дающих начало двум подтипам острого лей­
коза (острый миелоидный и острый лимфобластный). При идентифика­
ции билатерального рака молочной железы используется другой метод
- аллелотипирование парных образцов ДНК. При опухолях желудочнокишечного тракта разработана методика, основанная на выявлении ДНК
атипичных клеток, регулярно слущивающихся с поверхности опухоле­
вой ткани (злокачественные новообразования пищевода, поджелудоч­
ной железы, желчных протоков и желчного пузыря, желудка и кишечника)
в содержимом толстой кишки.
47
6) наследственных заболеваний
Клонированы гены, мутации в которых вызывают распространен­
ные болезни - нейрофиброматоз, синдром Марфана, семейную гиперхолестеринемию, несовершенный остеогенез, атрофическую миотонию, ахондроплазию, аденоматозный полипоз толстой кишки, болезнь
Гентингтона, поликистоз почек, муковисцидоз, гемоглобинопатии.
Доказано наличие наследственной предрасположенности к некото­
рым видам рака, сердечно-сосудистым и неврологическим заболева­
ниям и т. п. Так, например, некоторые достаточно широко распростра­
нённые аллели гена альфа-1-антитрипсина ассоциированы с потенци­
ально летальными болезнями печени и легких, а полипопротеина Е - с
нарушениями метаболизма холестерина и развитием атеросклероза и
болезни Альцгеймера и т.д.
При хромосомных, моногенных и полигенных (мультифакториальных) наследственных заболеваниях применение методов дифференци­
ального окрашивания хромосом (цитогенетика) и флюоресцентной гибри­
дизации in situ иногда позволяют идентифицировать дупликации, делеции и другие крупные мутационные изменения в хромосоме. Но нераз­
личимые под микроскопом точечные мутации, полиморфизм нуклео­
тидной последовательности, также приводящие к наследственной пато­
логии можно идентифицировать только молекулярно-генетическими
методами.
Использование методики блот-гибридизации для диагностики
наследственных метаболических нарушений явилось наиболее важ­
ным вариантом применения ДНК технологий в медицине. Этот подход
основывается на выделении ДНК из легко доступных тканей, например
лейкоцитов периферической крови, культивируемых фибробластов или
клеток амниотической жидкости. После расщепления ДНК рестрикцион­
ными эндонуклеазами и определения размеров полученных фрагментов с
помощью гель-электрофореза, проводят реакцию с меченными зондами к
специфическим генам из конкретных локусов, ответственным за конкрет­
ные нарушения. Если молекулярный дефект, лежащий в основе наруше­
ния, точно известен, как, например, при серповидно-клеточной анемии или
Z-варианте а,-антитрипсина, то можно подобрать строго определенные
олигонуклеотидные зонды. В других случаях диагностика осуществляется
легче путем регистрации полиморфизма длины рестрикционных фрагмен­
тов, подразделяемых на семейства и служащих полезными маркерами
болезни. Этот подход использован для диагностики болезни Гентингтона,
фенилкетонурии, цитрулпинемии, синдрома Леша— Найхана, недостаточ­
ности орнитин-транскарбамилазы и др.
В медико-генетической консультации ДНК-диагностику проводят:
при наследственных заболеваниях, в случаях наличия в сем
ребенка или близкого родственника с наследственным заболеванием;
48
диагностика проводится с целью избежать рождение больного ребенка;
- при установлении или исключении отцовства или материнства;
- при диагностике некоторых форм бесплодия и невынашивания
беременности.
Все методы ДНК-диагностики наследственных болезней можно раз­
делить на прямые и косвенные (табл.6). Прямая ДНК-диагностика - это
выявление мутаций в исследуемом гене; косвенная ДНК-диагностика
- выявление полиморфизма генов у больных и здоровых членов семьи,
благодаря наличию непрямых (косвенных) методов молекулярной диа­
гностики. Этот исторически более ранний подход основан на исполь­
зовании сцепленных с геном полиморфных маркеров, с помощью кото­
рых проводится идентификация мутантных хромосом (точнее хромосом,
несущих мутантный ген) в семьях высокого риска, т. е. у родителей боль­
ного и его ближайших родственников. Косвенные методы молекулярной
диагностики принципиально возможны практически для всех моногенных заболеваний с известной локализацией контролирующего гена, для
каждого из которых разработана удобная система вне- и внутригенных
полиморфных индексных маркеров.
Таблица 6. ДНК-диагностика моногенных наследственных заболеваний
Прямая
Косвенная
Определение мутации, являющейся
непосредственной причиной болезни
Определение хромосомы, несущей
поврежденный ген
Прямая ДНК-диагностика
Ген (локализация)
Заболевание
FGFR3 (4р16.3) Доминантная мутация .карликовость
IT-15 (4р16.3).Накопление тринуклеотидных повторов
ЦАГ в гене на хромосоме 4
РАН (12q22-q24.1). Отсутствие фермента,
превращающего фенилаланин в тирозин
CFTR (7q31.2). Мутации в гене CFTR на хромосоме 7,
кодирующем белок, ответственный за перенос, хлора
через мембраны эпителиальных клеток ( наиболее
часто имеет место делеция трех оснований F508)
Дистрофии (Хр21.2). Мутации в гене мышечного белка
дистрофина, находящемся на Х-хромосоме
Ахондроплаэия
Хорея Гентигтона
Фенилкетонурия
Муковисцидоэ
Миодистрофия
Дюшенна-Беккера
Косвенная ДНК-диагностика
Ген (локализация)
Заболевание
Гемофилия А,В
Синрдом Луи-Бар
Синдром Марфана
Рецессивный поликистоз почек
Синдром Миллера-Дикера
Xq27-28. Рецессивная мутация в расположенном на Xхромосоме в гене, кодирующем факторы свертывания
крови VIII и IX
11q23
15q21.1
6р21.1-р12
17р13.3
49
в) инфекций
ПЦР позволяет определять ДНК (либо РНК) возбудителей инфек­
ционных заболеваний. Чувствительность ПЦР-анализа равна 10-1000
клеткам в пробе, в то время как чувствительность иммунологических
и микроскопических методов - 1000-100000 клеток в пробе.
При выявлении трудно культивируемых, некультивируемых и персистирующих форм патогенных микроорганизмов только прямой метод,
выявляющий ДНК возбудителя, дает необходимый диагностический
ответ. Высокая специфичность метода ПЦР обусловлена нуклеотид­
ной последовательностью праймеров и специально отрабатываемыми
технологическими условиями их присоединения к комплементарному
фрагменту ДНК возбудителя. В зависимости от выбранных праймеров
ПЦР может дифференцировать роды и виды, типы и подтипы микро­
организмов.
ПЦР-диагностика актуальна:
- при урогенитальных инфекциях, обусловленных Chlamydia
trachomatis, Ureaplasma urealyticum, Gardnerella vaginalis, Mycoplasma
hominis, Mobiluncus, ВПГ-2;
- при СПИДе, гепатите С, и других актуальных вирусных инфекциях;
- при диагностике инфекции, возбудители которых не культиви­
руются либо требуют длительного времени культивирования на пита­
тельных средах (туберкулез и др);
- при внутриутробных инфекциях (цитомегаловирус, токсоплазмы,
вирус герпеса, вирус краснухи, микоплазмы и хламидии; это так назы­
ваемый TORCH-комплекс, обязательный этап пренатальной диагно­
стики для каждой женщины). Для проведения анализа в качестве мате­
риала используется амниотическая жидкость или ворсинки хориона;
- в гастроэнтерологии при диагностике хеликобактериоза;
- при прочих бактериальных, вирусных, грибковых и вызванных
простейшими инфекциях.
Генотерапия
Генотерапия — коррекция наследственных, инфекционных, онко­
логических и иных заболеваний путем введения в организм реципиента
чужеродной генетической информации с целью направленного изме­
нения генных дефектов или восполнения нарушенных функций. Она
стала применяться в клинических испытаниях, благодаря существую­
щим теоретическим знаниям в области молекулярной биологии и мето­
дам генной инженерии. По-сути, генно-инженерные методы являются
технологической основой генной терапии. Направление очень акту­
ально не только для медицины, но в целом для биологической науки.
Но лечение больных терапевтическими генами пока осуществляется
только в ведущих мировых научных и клинических центрах; геноте50
рапия представлена в основном экспериментальными результатами.
Из истории генотерапии
1980 г. Введение больному при талассемии (наследственная гемо­
литическая анемия, обусловленная мутацией гена, ответственного за
синтез b-цепи глобина - белка, входящего в состав гемоглобина) здо­
рового гена b-глобина. Терапевтического эффекта не было. В после­
дующем было выяснено, что была необходима трансфекция не только
гена b-глобина, но одновременно и трансрегуляторных генов, без кото­
рых не могло быть экспрессии терапевтического гена.
1989 г. Первая попытка генной терапии пациента, умирающего от
рака кожи, от меланомы. Лечение оказалось безуспешным.
1990 г. Генотерапия врожденного наследственного иммунодефи­
цита, обусловленного недостаточностью фермента аденозиндезаминазы (АДА). Лимфоциты больных трансфицировали ретровирусным
вектором, содержащим ген, ответственный за синтез АДА, после чего
их возвращали в кровоток больного. Генотерапия оказалась эффек­
тивной.
1993 г. Ингаляционное введение гена муковисцидоза, ответствен­
ного за синтез муковисцидозного трансмембранного белка - регуля­
тора (МТР) в составе аденовирусного либо липосомального векто­
ров. Муковисцидоз является тяжелым аутосомно-рецессивным забо­
леванием, обусловленным недостаточностью муковисцидозного
белка, регулирующего трансмембранную проводимость цАМФ хлор­
ного канала. Это системная патология, но чаще поражаются легкие и
кишечник.
2006 год. Применение генетически модифицированных Т-киллеров
при лечении метастазирующей меланомы. Пациентам вводили их соб­
ственные лимфоциты, измененные генетическим введением так назы­
ваемых «рецепторов Т-клетки», которые заставляют клетки отыскивать
и уничтожать клетки раковые. Позднее цитотоксические Т-лимфоциты,
специфические к антигенам ВИЧ (HIV-1), пытались использовать для
уничтожения клеток, зараженных ВИЧ. Эти Т-лимфоциты также метили
с помощью ретровирусного вектора, с тем, чтобы проследить их судьбу
после введения в организм пациента. Однако в данном исследова­
нии у большей части пациентов было обнаружено развитие иммунного
ответа на модифицированные лимфоциты.
2007 год. Генотерапии врожденного амавроза Лебера (наслед­
ственное заболевание, из-за дефектного гена RPE65 в сетчатке уми­
рают и не восстанавливаются светочувствительные клетки; ослабле­
ние либо полная потеря зрения) трансфекцией в сетчатку рекомбинант­
ного адено-ассоциированного вируса (adeno associated virus), несущего
полноценный ген RPE65. Лечение привело к положительным результа51
там, при этом не было обнаружено никаких побочных эффектов.
2009 год. Генотерапия успешно применена для улучшения состоя­
ния больных ВИЧ. Ранее была апробирована технология внутримышеч­
ного введения ретровирусного вектора, несущие отдельные гены ВИЧ.
Предполагалось, что синтез белков вируса усилит иммунный ответ на
возбудитель инфекции. Также апробирована в клинике методика вве­
дения стволовых клеток крови, несущих рибозим, расщепляющий РНК
вируса СПИДа. Разработаны однослойные углеродные нанотрубки,
способные транспортировать в Т-лимфоциты специальные молекулы
РНК, болокирующие синтез рецепторов CD4 и тем самым прекращаю­
щие способность вируса заражать Т-клетки.
Технология генотерапии изначально разрабатывалась для лече­
ния наследственных болезней, однако в последующем она стала при­
меняться для лечения ненаследственных, в первую очередь онкологи­
ческих заболеваний и вирусных инфекций. Большая часть утвержден­
ных для клинических испытаний протоколов генотерапии направлена
на лечение онкологических заболеваний. По социальной значимости
лидирует генотерапия злокачественных новообразований, нейродегенеративных, кардиологических заболеваний и наследственных болез­
ней, актуальных инфекций (ВИЧ, вирусные гепатиты).
Если при наследственной патологии чаще необходимо воспол­
нить функции дефектного гена, то при злокачественных новообра­
зованиях и при инфекции задача противоположная - блокировать
онкоген либо гены возбудителя. Вместе с тем при коррекции любой
патологии, важнейшей задачей в генотерапии является разработка
системы адресной доставки корректирующего генетического матери­
ала к клеткам-мишеням и стабильная экспрессия данного терапев­
тического гена в организме больного. Однако, это не только безуко­
ризненное соблюдение и качественное выполнение хорошо извест­
ных этапов генно-инженерной технологии, технологии рекомбинант­
ной ДНК, но и проблемы воздействия иммунной системы и взаимо­
действия генома клетки организма-реципиента с привнесенным чуже­
родным генетическим материалом.
Стандартная технология генной терапии включает следующие
стадии:
- подготовка экзогенного генетического материала (кДНК), необхо­
димого для трансфекции в клетки-мишени больного организма;
- встраивание кДНК в векторную систему, сконструированную на
основе плазмиды, адено-, ретровирусов, путем использования липосом и др.;
- трансфекция ex vivo либо in vivo вектора, несущего целевой ген
в клетки-мишени больного организма в следующей последовательно­
сти: экспериментальные или предклинические испытания генной кон­
52
струкции на лабораторных животных; затем апробирование на добро­
вольцах и, наконец, применение у больных после утверждения прото­
колов клинических испытаний.
Например, стандартная схема генотерапии при наследственной
патологии начинается с создания полноценно работающей (экспрес­
сирующейся) генетической конструкции, содержащей смысловую (коди­
рующую белок) и регуляторную части гена; затем создается вирусный
вектор, обеспечивающий доставку сконструированного гена к клеткаммишеням; и наконец, осуществляется трансфекция (перенос получен­
ной конструкции) в клетки-мишени. Анализируется результат трансфек­
ции в экспериментах in vitro и in vivo. В случае положительного резуль­
тата разрабатывается программа и утверждается протокол клиниче­
ских испытаний.
Так, разработке программы генной терапии наследственной
болезни предшествуют тщательный анализ тканеспецифической экс­
прессии соответствующего гена, идентификация первичного биохи­
мического дефекта в организме пациента, исследование структуры,
функции и внутриклеточного распределения его белкового продукта,
а также биохимический анализ патологического процесса. Все эти
данные учитываются при составлении соответствующего медицин­
ского протокола. Апробацию процедуры генокоррекции наследствен­
ного заболевания проводят на первичных культурах клеток больного,
в которых в норме функционально активен данный ген. На этих клеточ­
ных моделях оценивают эффективность выбранной системы переноса
экзогенной ДНК, определяют экспрессию вводимой генетической кон­
струкции, анализируют ее взаимодействие с геномом клетки, отраба­
тывают способы коррекции на биохимическом уровне. Используя куль­
туры клеток, можно разработать систему адресной доставки рекомби­
нантных ДНК, однако проверка надежности работы этой системы может
быть осуществлена только на уровне целого организма. Поэтому такое
внимание в программах по генной терапии уделяется экспериментам in
vivo на естественных или искусственно полученных моделях соответ­
ствующих наследственных болезней у животных. Успешная коррекция
генетических дефектов у таких животных и отсутствие нежелательных
побочных эффектов генной терапии являются важнейшей предпосыл­
кой для разрешения клинических испытаний.
Вместе с тем, если этапы генно-инженерных работ в техноло­
гии генотерапии (подготовка, встраивание в вектор и трансфекция в
организм терапевтического гена), успешно реализуются как в экспе­
рименте, так и у постели больного, то последующий этап - активное и
длительное функционирование введенного гена в организме больного
пока не всегда успешны.
В целом при генотерапии программы клинических испытаний
53
должны включать:
- обоснование выбора заболевания для проведения такой терапии;
- определение типа клеток, подлежащих генетической модифи­
кации;
- схему конструирования экзогенной ДНК;
- обоснование биологической безопасности вводимой генной кон­
струкции;
- предварительную экспериментальную трансфекцию терапевти­
ческого гена на культурах клеток и на модельных животных;
- разработку его переноса в клетки пациента;
- методы анализа работы введённых генов;
- оценку клинического (терапевтического) эффекта;
- учесть возможные побочные последствия и методы их преду­
преждения.
Методы генной терапии
Методы генной терапии зависят от типа используемых клетокмишеней, от способа введения генов в организм пациента, от типа
применяемых векторных систем, и по механизму воздействия на боль­
ной организм.
По типу клеток-мишеней
Фетальная генотерапия, при которой чужеродную ДНК вводят в
зиготу или эмбрион на ранней стадии развития; при этом ожидается,
что введенный материал попадет во все клетки реципиента (и даже в
половые клетки, обеспечив тем самым передачу генетической инфор­
мации следующему поколению); генетическую конструкцию вводят в
амниотическую полость, осуществляют доставку через эмбриональное
кровообращение путем введения в пупочную вену. Методы фетальной
генотерапии отработаны на лабораторных мышах, в клинике пока не
применяются.
Соматическая генотерапия, при которой генетический материал
вводят только в соматические клетки и он не передается половым клет­
кам. Соматические клетки-мишени используются при лечении опухо­
левых, инфекционных, наследственных и иных заболеваний. Клетки
пораженных тканей и органов извлекаются и вне организма трансфи­
цируются генетической конструкцией, содержащей терапевтический
ген (ex vivo) либо генетическая конструкция, включающая терапевтиче­
ский ген вводится (in vivo) -системно в сосудистое русло или локально
в пораженный орган - аэрозольно в легочную ткань, иньекция в опу­
холевую ткань и пр.
По способу введения генов
54
Генная терапия ex vivo осуществляется путем переноса генети­
ческого материала в клетки-мишени, заранее выделенные из орга­
низма (лимфоциты,стволовые клетки красного костного мозга, гепатоциты, астроциты, фибробласты и др.), с последующей реимплан­
тацией этих клеток. Таким образом генотерапия ex vivo основана на
выделении,культивировании клеток, введение в них чужеродных генов,
отбор трансфицированных клеток и реинфузию их тому же пациенту.
В большинстве допущенных к клиническим испытаниям программ
используется именно этот подход. Преимуществом генной терапии
ex vivo является то, что можно полностью охарактеризовать получен­
ные трансформированные клетки до их трансплантации в организм,
можно получить многочисленные клоны этих клеток и отобрать клоны
с высоким уровнем экспрессии требуемого гена, а также исключить
клоны с опасными трансформациями, которые могли бы нанести вред
организму.
Генная терапия in vivo - это прямая трансфекция вектора с тера­
певтическим геном, а не генно-модифицированных клеток в организм
пациента. Вектора со встроенными кДНК вводятся непосредственно
в ткань путем иньекции (в почки, тимус, поперечно-полосатые мышцы,
опухоли и др; либо в кровеносные сосуды, питающие трансфици­
руемый орган. При муковисцидозе и злокачественном поражении лег­
ких известно аэрозольное введение генетической конструкции, несу­
щей кДНК.
По типу векторов
Решающим условием успешной генотерапии является обеспече­
ние эффективной доставки, то есть трансфекции чужеродного гена
в клетки-мишени, обеспечение длительного функционирования его в
этих клетках и создание условий для полноценной работы. Векторы
должны адресно трансфицировать клетки, обеспечивать эффектив­
ный генный перенос в высокий процент этих клеток, интегрировать в
определенные сайты генома клетки-реципиента (либо существовать
как стабильные эписомы), должны регулироваться введением опреде­
ленных реагентов или регуляторными сигналами организма, обеспе­
чивать необходимый терапевтический результат.
Трансфекция терапевтического гена (кДНК) может проводиться:
- с использованием только фрагмента чистой (naked - «голой»)
ДНК;
-ДНК комплексированной, соединенной с белками (трансферрин),
органическими полимерами (DEAE-декстран, полилизин), липосомами
или частицами золота;
- в составе плазмиды или вирусов, лишенных способности репли­
цировать в трансфицированной клетке).
55
В качестве вектора для переноса кДНК в клетку используются:
- вирусы (ретровирусы, аденовирусы, аденоассоциированные и
герпесвирусы);
- невирусные векторы. Предполагается использовать гидро­
фобные производные полиэтилен\пропиленимина, нейтральные и
pH-чувствительные лилосомы, модифицированные хитозаны, гликокатионные липиды, углеводные векторы;
- физические методы (электропорация, баллистическая транс­
фекция).
Вирусные векторы. Это генетические конструкции, основанные на
вирусных нуклеотидных последовательностях, способных к активной
трансдукции, а в некоторых случаях и к длительной экспресссии чуже­
родных генов в клетке-мишени используются чаще других векторов.
Потому что вирусы легко инфицируют и вместе с клонируемым фраг­
ментом ДНК интегрируют в геном клетки-мишени.
Существуют следующие способы генно-инженерной реконструк­
ции тех или иных вирусов в векторные системы:
- оставляются только последовательности, кодирующие синтез
капсида вируса. К примеру, у ретровирусов в качестве вектора исполь­
зуются только гены, кодирующие капсид этого вируса и трансфицируе­
мые терапевтические гены, исключив при этом те гены ретровирусов,
которые могли бы вызвать в трансфицируемом организме патологию,
в частности инсерционный мутагенез или индукцию злокачественного
роста. Вирусная РНК проникает в ядро клетки с последующей экспрес­
сией терапевтического гена;
- удаляются последовательности вирусных нуклеотидов, ответ­
ственные за репродукцию вируса. Имеет место временная экспрессия
терапевтического гена в составе вектора вне ядра клетки. Это аденови­
русные векторы не обладающие онкогенностью, а также непатогенные
аденоассоциированные вирусы; они способны трасфицировать тера­
певтические гены в неделящиеся клетки, в отличие от ретровирусов;
- в качестве вектора используется также вирус простого герпеса.
Как и аденовирусы, вирус герпеса подвергается генно-инженерной
обработке, ведущей к утрате его способности к репродукции в клетке.
Вирусные векторы значительно более эффективно переносят
встроенные в них генетические конструкции в клетки-мишени. Таким
образом, вирусы (кроме адено-ассоциированного вируса, который не
обладает способностью к самостоятельной репликации) когда исполь­
зуются в качестве векторов, генетически модифицируются, так что они
оказываются неспособными к самостоятельной репликации в клеткехозяине, но сохраняют способность инфицировать эти клетки, а также
избегать деградации лизосомами. Вирусные векторы обладают выра­
56
женным в большей или меньшей степени тропизмом к определенной
ткани, что способствует адресной доставке генотерапевтической кон­
струкции. Так, аденовирус тропен к эпителию дыхательных путей, вирус
герпеса - к нейронам ЦНС, вирус гепатита - к клеткам печени и т.д.
Ретровирусный вектор наиболее часто используется в протоколах кли­
нических испытаний генотерапии различных заболеваний человека.
Это обусловлено сравнительно высокой эффективностью трансдукции генов и их стабильной интеграции в составе провируса в геном
соматических клеток больного.
Вектор на основе аденовирусов особенно полезен в тех случаях,
когда необходима лишь временная продукция терапевтического гена.
Основной проблемой, возникающей при разработке аденовирусных
векторов для доставки терапевтического гена, является их невысо­
кая инфицирующая способность.
Вектор на основе аденоассоциированных вирусов не вызывает
токсического эффекта и проявляют высокую трансфицирующую спо­
собность (табл.7). Аденоассоциированные вирусы (ААВ), способные
доставлять кДНК в клетки разных типов, также часто используются в
качестве векторов для рибозимов. Сконструирован вектор, который из
всего генома ААВ содержит только концевые последовательности. С
использованием такого вектора получена экспрессия антисмысловых
РНК, блокировавших размножение вируса иммунодефицита человека.
Таблица 7. Клинические испытания векторов на основе
аденоассоциированного вируса
| Заболевание
Ген
-------------CFTR
Муковисцидоз
CFTR
CFTR
ИХ
Гемофилия В
FIX
Артрит
TNFR:Fc
Наследствен­
ная эмфи­
зема
ААТ
_______
Способ вве­
дения
Легкие, аэро­
золь
Легкие, аэро­
золь
Легкие, аэро­
золь
Внутримышечено
Печеночная
артерия
Внутрисуставно
Внутримышечено
57
Фаза ис­
пытаний
Количество
испы туе­
мых
Статус
1
12
Завершены
II
38
Завершены
II
100
Завершены
1
9
1
6
Закончены
1
1
Продолжа­
ются
1
12
Продолжа­
ются
__ ____
Завершены
________
Заболевание
Ген
Способ вве­
дения
Фаза ис­
пытаний
Количество
испытуе­
мых
Статус
Мышечная
дистрофия
Саркогликан
Внутримышечено
1
10
Продолжа­
ются
Болезнь
Паркинсона
Болезнь
Канавана
Болезнь
Баттена
Синдром
Альцгеймера
GAD65,
GAD67
Внутрь черепа
1
12
Завершены
ААС
Внутрь черепа
1
21
CLN2
Внутрь черепа
1
10
NGF
Внутрь черепа
■
~
6
Продолжа­
ются
Продолжа­
ются
Продолжа­
ются
Источник. Carter, BJ (2005), «Adeno-Associated Virus Vectors in Clinical Trials»,
Human Gene Therapy 16:541-50.
Концепция мультифункциональных частиц (МФЧ) на основе вирус­
ных векторов. Она основана на том, что терапевтические вирусные век­
торы могут осуществлять сразу несколько функций: адресно достав­
лять генетический материал в клетки-мишени, давать возможность их
визуализации в организме и ингибировать рост опухолевых клеток. В
качестве примера МФЧ на основе вирусного вектора можно привести
адено-ассоцированный вирус (ААВ) с модифицированными белковыми
«шипами», находящимися на оболочке вируса (с помощью шипов вирус
взаимодействует с клеткой-мишенью, в частности с опухолевыми клет­
ками). Модификация позволила одновременно «нацеливать» вирусы
на раковые клетки и визуализировать их передвижение и распростра­
нение.
Например, взаимодействие тимидинкиназы вируса простого гер­
песа (ТК ВПГ), находящейся на поверхности модифицированного ААВ,
с известным субстратом для позитронной эмиссионной томографии
ieF-пенцикловиром позволяет проводить мониторинг вирусных частиц
в клинической практике. Кроме этого, фермент ТК ВПГ открывает воз­
можности для так называемой суицидной генотерапии, суть которой
заключается в следующем: фермент ТК преобразует свои субстраты
(такие лекарства, как ганцикловир) в метаболиты, узнаваемые фер­
ментами зараженной клетки. Последовательное воздействие клеточ­
ных белков на эти метаболиты приводит к образованию токсичных сое­
динений, вызывающих гибель опухолевой клетки. Более того эти сое­
динения, образовавшиеся под действием фермента ТК индуцируют
самоуничтожение смежных клеток, в чем проявляется одно из свойств
МФЧ —прогрессирующее онколитическое действие.
Липосомы в качестве векторов. Липосомы - это микроскопические
58
фосфолипидные везикулы, образованные одной или несколькими бис­
лойными мембранами, которые служат транспортным средством для
доставки химиопрепаратов, белков, ДНК, антисмысловых олигонукле­
отидов и т.д. Созданы липосомы с разными свойствами. Например,
катионные липосомы, которые связываются с отрицательно заряжен­
ной молекулой ДНК, образуя ДНК-липидный комплекс - липоплекс.
Достаточно эффективны катионные липиды, удерживающие ДНК за
счет электростатических взаимодействий.
Катионные полимеры, используемые для создания полиплексов
(рис.8). В качестве ДНК-связывающих полимеров могут служить кати­
онные белки, синтетические гомополимеры аминокислот (полилизины,
полиаргинины), полисахарид хитозан, полиэтиленимин, дендримеры
различного состава и другие модифицированные полимеры. Степень
компактизации ДНК определяется суммарным зарядом комплекса,
который, в свою очередь, зависит от отношения количества положи­
тельных групп полимеров к числу отрицательных фосфатных групп
ДНК. Обычно в составе полиплексов поликатион находится в избытке,
в результате чего формируются наноразмерные комплексы (от несколь­
ких десятков до нескольких сотен нм), которые растворимы в воде и
положительно заряжены.
Однослойные углеродные нанотрубки применены для доставки
антисмысловой РНК, блокирующей синтез рецепторов СД4 вируса
ммунодефицита человека, необходимых для адгезии вируса к мем­
бране Т-лимфоцитов. Для использования нанотрубок в качестве век­
тора, на их поверхность были нанесены фосфолипиды, благодаря
которым нанотрубка стала способной проникнуть внутрь клетки. К кон­
цам фосфолипидных молекул были конъюгированы антисмысловые
РНК. При попадании нанотрубок в Т-клетки конъюгирующая сульфид­
ная связь разрывается и антисмысловая РНК блокирует мРНК, отвественную за синтез СД4.
Физические методы введения ДНК-конструкций:
- электропорация (действие на клетки импульсов электрического
поля высокой напряженности, приводящее к обратимому увеличению
проницаемости мембраны, образованию пор диаметром около 0,5 нм.);
- метод баллистической трансфекции с использованием генного
«пистолета» (ДНК-конструкции конъюгируют с частицами тяжелых
металлов - золота или вольфрама диаметром 1-3 мкм; обстрел орга­
нов и тканей, глубина проникновения около 1 мм). Физические методы
доставки генов считаются наименее эффективными, так как трансфи­
цируется небольшой процент клеток-реципиентов, а их лизосомы раз­
рушают проникшую в клетку чужеродную ДНК. В результате, только в
отдельных клетках, подвергнутых обработке, введенные генетические
конструкции оказываются встроенными в геном этих клеток. Тем не
59
менее, было показано что даже при обычной инъекции ДНК в мышцы,
она способна проникать в миоциты и экспрессироваться там в тече­
ние года.
9
Рис. 8. 1-Схема образования полиплексов из катионных полимеров и
плазмид. 2-Изображение полиплексов на подложке, полученное с помо­
щью трансмиссионной электронной микроскопии (деление шкалы
200 нм). [Pack et al„ 2005].
По механизму генотерапии:
1. Восстановление активности дефектных генов (при мутациях,
изменяющих небольшой участок ДНК) методически сложно, пока отра­
батывается в эксперименте, в условиях лабораторий;
2. Коррекция утраченной функции клетки путем доставки в клетку
терапевтического, полноценного гена, который восполняет функции
дефектного гена, последний остается в больном организме. В протоко­
лах клинических испытаний в основном применяется данная техноло­
гия генной терапии. Терапевтический ген позволяет восполнить недо­
стающую в организме функцию - это восполняющая (augmentative) ген­
ная терапия. Предпочтительны генетические конструкции, содержа­
щие наряду с функционально активными генами- аналогами дефект­
ных генов (терапевтические гены), еще и последовательности ДНК,
регулирующие экспрессию дефектного гена.
3. Подавление функции болезнетворного гена при актуаль­
ных вирусных инфекциях и онкогенов при злокачественных новооб­
разованиях:
подавление репликации мРНК «больного» гена осуществляет
антисмысловыми РНК. Антисмысловые РНК - это короткие РНК, ком­
плементарные мРНК, образуют с ними гибриды и блокируют последу­
ющую трансляцию. Поскольку действие таких РНК направлено про­
тив функционирования кодирующих (осмысленных) РНК, они получили
60
название антисмысловых (antisense RNA), или micPHK (mRNA interfering
complementary RNA). Это синтетическая РНК, комплементарная мРНК
«больного» гена, будучи введенной в клетку, она связывается с мРНК
итрансляция этой мРНК специфически ингибируется; такая синтетиче­
ская РНК была названа антисмысловой, в связи с обратным по отноше­
нию к мРНК расположением в ней нуклеотидов. В результате наступает
посттранскрипционный генетический сайленсинг- остановка трансля­
ции, разрушение мРНК гена-мишени и резкое снижение или даже пол­
ное прекращение его экспрессии; особенно интенсивно разрабатыва­
ются препараты для генотерапии на основе антисмысловх РНК, пода­
вляющие экспрессию онкогенов (c-myc, c-fos, N-ras, bcl/abl) и генома
возбудителей вирусных инфекций;
- использование способности двуцепочечных РНК (дцРНК) эффек­
тивно и избирательно подавлять экспрессию генов, содержащих гомо­
логичные нуклеотидные последовательности. Это явление получило
название РНК-интерференции. При попадании дцРНК в клетку проис­
ходит фрагментирование ее на короткие дуплексы длиной 19-21 пар
нуклеотидов с двумя выступающими нуклеотидами на З'-конце (микроРНК), которые в составе комплекса с белками образуют каталитические
структуры, вызывающие направленную деградацию комплементарной
им РНК-мишени. Ингибирование генной активности с помощью микроРНК показано в эксперименте на Caenorhabditis elegans и Drosophila;
- механизм разрушения определенных мРНК в клетках млекопи­
тающих также может быть запущен, если использовать не протяжен­
ные двуцепочечные РНК (дцРНК), а короткие синтетические дуплексы,
имитирующие фрагменты РНК, получающиеся в ходе вышеописанной
фрагментации РНК, так называемые малые интерферирующие РНК
(siPHK);
- применение рибозимов или каталитических РНК, обладающих
способностью ферментативно расщеплять самих себя или других
молекул РНК.
4.
Активация иммунного ответа (особенно при онкопатологии
путем:
- трансфекции генов цитокинов в Т-лимофоциты и тем самым
усиление их цитотоксического действия на опухолевые клетки, возбу­
дители инфекций;
- введения генетической информации в клетки, против которых
нужно усипить ответ (например, модификация, усиление иммуногенности антигенов опухолевых клеток). Это использование аутологич­
ной и аллогенной вакцины на основе опухолевых клеток, иммунотера­
пия с использованием интерлейкина-2 и лимфокин-активированных
Т-киллеров. Клинические испытания показали эффективность этого
вида иммунотерапии при лечении злокачественных серозитов.
61
5. Использование генов, кодирующих синтез фермента, активи­
рующего предшественник лекарственного препарата. В этом случаев
тканях предшественник лекарственного препарата метаболизируется
до активного состояния при помощи трансгенного фермента и вызы­
вает нужный эффект. С другой стороны, для уменьшения токсического
действия лекарств (в частности, при химиотерапии опухолей) предла­
гается вводить в нормальные ткани гены лекарственной устойчивости.
6. Вставка генов, программирующих гибель клеток. При этом
методе генотерапии в ткани доставляются гены, которые инициируют
каскадный комплекс, приводящий к апоптозу атипичных либо инфи­
цированных клеток.
Генотерапия заболеваний
а) опухолей
Несмотря на то, что круг ненаследственных заболеваний, где воз­
можно применение генной терапии очень широк, большинство прото­
колов лечения терапевтическими генами приходится на опухолевые
заболевания. Генная терапия онкозаболеваний направлена на:
- генетическую модификацию клеток иммунной системы для уси­
ления их противоопухолевой активности;
- трансфекцию в опухолевую ткань генов, повышающих чувстви­
тельность злокачественных клеток к химиотерапевтическим препа­
ратам;
- блокирование экспрессии онкогенов, генов пролиферации;
- создание и использование рекомбинантных противоопухолевых
ДНК- вакцин.
Методы генотерапии опухолей
1.
Коррекционное добавление гена. Онкологические заболев
ния возможно подразделять на р53-зависимые и р53-независимые,
поскольку при многих опухолях имеет место мутация в гене р53. Белок,
кодируемый геном р53 представляет собой известный опухолевый
супрессор, основная функция которого заключается в поддержании
стабильности генома. Он принимает участие в регуляции клеточного
цикла, в исправлении возникающих дефектов ДНК и в апоптозе - запро­
граммированной клеточной гибели . Доклинические испытания пока­
зали, что замена мутантного гена р53 в раковых клетках геном дикого
типа (не содержащим мутаций) с помощью методов генотерапии, при­
водит к полному восстановлению функций белка р53 и запускает апоптоз злокачественных клеток. Клинические испытания ретровирусных и
аденовирусных векторов, несущих неповрежденные гены р53, оказали
положительный эффект у пациентов, страдающих немелкоклеточным
раком легкого и бронхоальвеолярной карциномой .
62
2. Суицидная генотерапия. Суть суицидной генотерапии заклю­
чается в доставке в злокачественные клетки гена, кодирующего фер­
мент, который конвертирует пролекарство в лекарство, вызывающее
гибель зараженных раковых клеток. К примеру, фермент тимидинкиназа вируса простого герпеса преобразует нетоксичные аналоги нуклеозидов, такие как ганцикловир или ацикловир, в токсичные вещества,
приводящие к гибели трансфицированных суицидным геном клеток. У
части пациентов отмечен положительный эффект, также имеет место
гибель смежных,здоровых клеток при систематическом введении ганцикловира. Подобная генотерапия разабатывается при глиобластоме
мозга, раке яичника и молочной железы. Разработан метод направ­
ленного подавления опухолевых клеток, заключающийся во введе­
ние генов, специфически экспрессирующихся в опухолевых клетках и
продуцирующих токсин, например дифтерийный или введение генов,
подавляющих гены-супрессоры белка р53 и др.
3. Иммуногенотерапия. Лечение в эксперименте аутологичными
лимфоцитами, выделенными из опухолевой ткани и трансфицирован­
ными геном интерлейкина-2 с помощью вирусных векторов. Усиление
противоопухолевой активности клеток иммунной системы также можно
достичь путем трансфекции в Т-лимфоциты пациента генов, кодиру­
ющих фактор некроза опухолей синтез вариабельных участков моно­
клональных антител, усиливающих рецепцию и действие этих лимфоцитов на опухолевые клетки. Существуют способы специфической
(активный - введение аутологичных антигенпрезентирующих клеток,
прединкубированных in vitro с опухолевыми антигенами; пассивный
- введение пациенту противоопухолевых моноклональных антител) и
неспецифической противоопухолевой иммунотерапии (рекомбинант­
ные ИЛ-2, ИЛ-12, ИЛ-14, TNF-альфа и др.; интерферонотера-пия, иммуномодупяторы - чаще все в качестве адъювантной иммунотерапии,
для профилактики в послеоперацинном периоде метастазирования).
4. Генотерапия, направленная на подавление ангиогенеза.
Антиангиогеннная терапия направлена на ингибирование роста сосу­
дистой сети в опухолевой ткани. Неоангиогенез —это формирование
сети новых капилляров из эндотелиальных клеток, выстилающих мел­
кие венулы - необходимое условие для активной пролиферации кле­
ток и роста опухолевой ткани. К основным факторам роста эндотелия и
фибробластов относятся гены FGFb и VEGF, а также гены опухолевого
фактора роста бета (TGF - бета) и ангиогенина. Эти белки секретируются клетками опухолей, затем контактируют с рецепторами на поверх­
ности клеток эндотелия сосудов и передают им сигнал к росту. Именно
таким образом формируется капиллярная сеть. Цитостатическая гено­
терапия направлена на блокаду генов FGFb и VEGF, кодирующих син­
тез сигнальных рецепторов на поверхности клеток эндотелия; также с
63
этой целью возможно применение рибозимов.
5. Технология «молчащих» генов (сайленсинг генов, от англ.
silence -молчание^. Технология генотерапии опухоли, направленная
на ингибирование генов, отвечающих за рост и деление раковых кле­
ток. Блокируется экспрессия онкогенов при помощью механизма РНКинтерференции, при котором связывание коротких двунитевых моле­
кул РНК с регуляторной последовательностью гена-мишени вызывает
остановку синтеза продукта этого гена. Так, введение в опухолевую
ткань при раке простаты гена RTVP-1 в составе аденовирусного век­
тора приводит к регрессии новообразования. Ген RTVP-1 в норме при­
сутствует в клетках ткани простаты и отсутствует в клетках опухоли. Он
является геном-супрессором опухоли, т.е. ингибирует ее рост и метастазирование. РНК- интерферен-ция уместна при разработке векто­
ров, несущих ген -супрессор активности онкогенов RAS, WNT, Мус,
ERK, TRK и др.
6. Гены лекарственной устойчивости, придающие нормальным
клеткам устойчивость к химиотерапевтическим препаратам, исполь­
зуемым в онкологической практике. Показано, что экспрессия гена
MDR1 в стволовых клетках крови придает им резистентность ко мно­
гим используемым в клинике химиопрепаратам, таким как винкристин
и адриамицин, что позволяет значительно уменьшить риск подавления
гемопоэза у пациента при проведении курса химиотерапии. Так, при
генотерапии меланомы были использованы ретровирусные векторы,
несущие ген пео (ген неомицин-фосфотрансферазы, сообщает клет­
кам устойчивость к антибиотику G-418), Из ткани опухоли, выделяли
Т-лимфоциты и трансдуцировали данным вектором, а затем, после
наращивания клеток in vitro, их возвращали в организм больных, наде­
ясь подавить рост неудаленных у больных злокачественных клеток.
Было показано, что маркерный ген пео сохраняется в течение несколь­
ких месяцев в таких модифицированных лимфоцитах, как циркулирую­
щих в кровотоке, так и находящихся в метастатических узлах. Но лечеб­
ного эффекта не наблюдалось, как впоследствие было выяснено из-за
недостаточной экспрессии гена пео.
7. Гены, восстанавливающие адгезивность клеток. Метастазирование опухолевых клеток, их легкое отделение от основной ткани
обусловлено нарушением кадхерин-катениновой системы. В нор­
мальной ткани комплекс, состоящий из белков Е-кадхерина и а- и
р-катенинов обеспечивает прочность межклеточных контактов. При
многих опухолях нарушен синтез этих белков, поэтому трансфекция
гена белка Е-кадхерина и его экспрессия в опухоли рассматривается
как способ подавления злокачественности, метастазирующей актив­
ности новообразования.
Следует отметить то, что в генотерапии онкозаболеваний чаще
64
применяется терапия in situ, т.е. введение терапевтического гена
локально, непосредственно в опухолевую ткань.
б) наследственных заболеваний
В основе наследственных заболеваний лежат нарушения (мута­
ции) наследственной информации - хромосомные, генные и митохон­
дриальные мутации. Соответственно наследственные заболевания
подразделяются на: моногенные, полигенные и хромосомные абер­
рации. В настоящее время описано более 4000 вариантов моногенных наследственных болезней, подавляющее большинство которых
встречается довольно редко. Широкий круг моногенных болезней обра­
зуют наследственные нарушения обмена веществ, возникновение кото­
рых связано с мутацией генов, контролирующих синтез ферментов и
обусловливающих их дефицит или дефект строения - ферментопатии. Изначально технология генотерапии в медицине была направ­
лена на лечение наследственных моногенных заболеваний, обуслов­
ленных мутацией одного гена - это гемофилия (дефект в генах VIII
или IX фактора свертывания крови, расположенных на Х-хромосоме),
миодистрофия Дюшенна (дефект в гене дистрофина на Х-хромосоме),
муковисцидоз и др.
Генотерапия, направленная на замещение функции дефект­
ного гена. При тяжелом комбинированном иммунодефиците, вызван­
ном недостаточностью фермента аденозиндезаминазы (ADA) исполь­
зован ретровирусный вектор, несущий ген АДА. У больных с таким
заболеванием резко снижено содержание Т- и В- лимфоцитов, что без
лечения приводит к смерти в детстве от разного рода инфекционных
заболеваний. Для восполнения дефицита по ADA у пациентов выде­
ляли лимфоциты, в которые с помощью ретровирусных векторов вво­
дили ген ADA. Генномодифицированные лимфоциты наращивали in
vitro, после чего возвращали в организм пациентов. Процедуру прово­
дили неоднократно с интервалом в 1,5 месяца. В результате у одной
из двух девочек, подвергшихся лечению, уровень ADA в циркулирую­
щих Т-лимфоцитах поддерживался на высоком уровне в течении 2-х
лет без дополнительных курсов генотерапии, и у обеих было отмечено
улучшение иммунного статуса по сравнению с таковым до терапии.
Другой пример использования ретровирусных векторов в ген­
ной терапии моногенных заболеваний - лечение семейной гиперхолестеринемии, вызванной дефектами в белке-рецепторе липопротеинов низкой плотности (LDL). Технология генотерапии в данном случае
заключалась во взятии пунктата печени больного для получения куль­
туры гепатоцитов. Затем культура печеночных клеток трансфицирова­
лась ретровирусным вектором, несущим ген синтеза белка-рецептора
LDL. Трансфицированные аутогепатоциты вводили непосредственно
65
в печень пациента, у которого после этого достоверно снижался уро­
вень холестерина в крови.
При наиболее распространенной форме гемофилии отмечается
недостаток белка, называемого восьмым фактором свертывания крови.
Для проведения генотерапии у больного предварительно выделяют
эндотелиальные клетки. Выделенные клетки культивируют in vitro и
трансфицируют геном восьмого фактора крови в составе вирусного
вектора. Трансфицированную культуру клеток, способную продуциро­
вать восьмой фактор крови обратно вводят пациенту.
У детей, больных адренолейкодистрофией (тяжелое наследствен­
ное заболевание с преимущественным поражением белого вещества
головного мозга и коры надпочечников) выделены стволовые клетки
костного мозга и трансфицированы вирусным вектором (на основе
ВИЧ), несущим недостающий в организме больных терапевтический
ген. Такой модифицированный вирус иммунодефицита человека пока
является единственным известным вектором, способным доставить
терапевтический ген в ядра неделящихся клеток, в частности, в ство­
ловые клетки костного мозга. После этого ткань костного мозга с гемопоэтическими стволовыми клетками, содержащими терапевтический
ген вновь вводится в организм больных детей.
При муковисцидозе (моногенное аутосомно-рецессивное забо­
левание легких), вызванном мутацией гена CFTR, (регулятор транс­
мембранной проводимости клеток легочного эпителия) развивается
тяжелая хроническая инфекция, поражающая чаще дыхательные пути,
легочную ткань. Заместительная генотерапия заключается в ингаля­
ции суспензии, содержащей аденовирусный вектор со встроенным
нормальным геном CFTR. Вектор также включает лиганд к рецепто­
рам эпителия дыхательных путей, облегчающий доставку терапевти­
ческого гена в клетки.
При наследственном дефекте зрения - амаврозе Лебера (почти
полная либо полная потеря зрения), обусловленном мутацией гена RPE65 успешно введен терапевтический ген. Для этого суспензию аденоассоциированного вируса, трансфицированного геном RPE65 иньецировали пациенту в глаз, в область сетчатки. Восполнение функции
дефектного гена позволило частично восстановить полностью утерян­
ное зрение. За два года наблюдений заметных осложнений после гено­
терапии не выявлено (всего наблюдалось 12 пациентов).
в) соматических заболеваний
Одновременно с развитием исследований в области генокоррекции наследственных дефектов успешными также оказались пои­
ски методов терапевтического использования смысловых последо­
вательностей ДНК (структурных генов) для лечения не только
66
злокачественных опухолей и вирусных инфекций, но и иной соматиче­
ской патологии. Существенно, что именно при этих патологиях поиски
путей генокоррекции проводятся особенно интенсивно, а число про­
токолов клинических испытаний во много раз превышает число таковых
для лечения наследственных моногенных болезней.
Генотерапии, направленная на усиление экспрессии генов анги­
огенеза. Для лечения болезней, обусловленных недостаточностью
кровоснабжения органов и тканей перспективен метод генной тера­
пии, направленный на стимуляцию образования новых кровеносных
сосудов. На стадии эмбрионального развития в процессах ангиоге­
неза может участвовать множество факторов роста. Однако у взрос­
лого человека ангиогенные факторы в основном продуцируются при
заживлении ран, а также при некоторых патологических процессах
(росте злокачественных опухолей, при диабетической ретинопатии и
др.). При разработке методов ангиогенной терапии изучают факторы
роста, которые можно использовать для активации ангиогенеза. Одним
из таких факторов ангиогенеза является сосудистый эндотелиальный
фактор. Так у пациентов со специфической ишемией конечностей, в
томчисле тем, кому грозила ампутация, после трансфекции гена стиму­
ляции ангиогенеза получен долговременный, положительный эффект,
выразившийся в стимуляции образования новых кровеносных сосудов
в больной конечности.
Гзнотерапия, направленная на подавление избыточной экспрес­
сии генов пролиферации клеток. При ревматоидных артритах раз­
рабатываются технологии введения в суставную ткань при помощи
ретровирусных векторов генов, кодирующих синтез белка - антагониста
рецептора интерлейкина-1, предотвращающего избыточную пролифе­
рацию синовиальных клеток, покрывающих суставную сумку. Соскоб
ткани с поверхности пораженного артритом сустава, получение суспен­
зии клеток, их трансфекция ретровирусным вектором, несущим ген син­
теза белка, подавляющего избыточную пролиферацию синовиальных
клеток. Затем реимплантация этих клеток в больной сустав.Возрастная
макулярная дегенерация сетчатки (macular degeneration), приводящая
к потере зрения. Болезнь заключается в том, что в центральной части
сетчатки неконтролированно растут новые кровеносные сосуды, что
приводит к разрушению клеток, воспринимающих свет. Был идентифи­
цирован ген, избыточная активность которого в сетчатке приводит к
росту кровеносных сосудов. Это ген рецептора эндотелиального фак­
тора роста сосудов - белка, который «воспринимает» гормональный
сигнал к росту. В результате, человек слепнет из-за активности своего
же «нормального» и «нужного» гена, но в ненужном месте и не «на
67
том» этапе жизни. Потерю зрения можно замедлить, подсаживая под
сетчатку модифицированные пигментные клетки радужной оболочки.
В этих клетках реплицируется специфическая микро-РНК, которая
запускает механизм разрушения информационной РНК, обеспечи­
вающей синтез рецептора эндотелиального фактора роста сосудов.
Задерживается формирование новых сосудов и тем самым задержи­
вается прогресс дегенерации сетчатой оболочки глаза.
г) вирусных инфекций
Использование генетических конструкций для подавления репро­
дукции вируса в пораженных клетках организма особенно активно раз­
рабатывается при таких актуальных вирусных инфекциях, как ВИЧ,
гепатит С и др. Применение антисмысловых генетических конструк­
ций для блокирования экспрессии генов тех или иных белков (напри­
мер, инактивация мРНК вируса иммунодефицита человека и др.).
Лечение ВИЧ-инфекции гемопоэтическими клетками, в ДНК кото­
рых был встроен ген, кодирующий ферментативную РНК (рибозим) OZ1.
Стволовые клетки, содержащие OZ1 вводились внутривенно. Рибозим
способен блокировать размножение вируса иммунодефицита человека
при его попадании в клетку. При этом у пациентов, получавших генотерапию, отмечалось «умеренное снижение» уровня вируса. Спустя 2
года после генотерапии, показатели иммунной системы была более
стабильны, чем у тех пациентов, которые не получили генотерапию.
Столь же активно в клинических протоколах генотерапии ВИЧ
активно апробируется механизм подавления экспрессии гена, кодиру­
ющего мембранный рецептор - белок CCR5, к которому вирус иммуно­
дефицита человека прикрепляется для проникновения в клетку. Люди
с мутацией гена CCR5 (в Европе их количество не превышает 3% от
общего числа жителей) лучше сопротивляются воздействию вируса.
Т-лимфоциты, выделенные из организма больных, подвергаются in
vitro воздействию препарата, а затем реинфузируются в организм; раз­
множившиеся мутировавшие клетки создают определенную защиту
от вируса. Показан терапевтический эффект при пересадке костного
мозга пациенту, у которого было диагностировано сразу два смертель­
ных заболевания - СПИД и лейкемия. Для того чтобы заменить разру­
шенные клетки костного мозга, был подобран донор с мутацией гена
CCR5.
В генотерапии ВИЧ среди механизмов регуляции экспрессии
генов, наряду с РНК-интерференцией, метилированием ДНК, импринтингом, модификацией гистонов, также апробируется технология хро­
мосомного сайленсинга, основанная на использовании экспрессиру­
ющих siPHK. РНК интерференция - природный механизм, обеспечива­
ющий регуляцию работы генов, а также защиту клеток от экспрессии
68
чужеродной ДНК. Она обеспечивает мощное и специфическое пода­
вление экспрессии генов, транскрипты которых вовлечены в обра­
зование дуплексов РНК. Ключевым элементом в механизмах РНКинтерференции являются так называемые малые интерферирующие
РНК (siPHK). Они обеспечивают узнавание молекул РНК, вовлеченных
в образование дуплексов, а комплекс белков, в который входит siPHK,
нарезает данные РНК до размеров siPHK. В результате быстро и прак­
тически полностью деградирует данный вид РНК и, следовательно,
блокируется экспрессия соответствующего гена.
Разрабатываются технологии генотерапии гепатита С, направлен­
ные на блокирование трансляции вирусного генома, также с использо­
ванием антисмысловых олигонуклеотидов.
ДНК -вакцины
Традиционные вакцины, содержащие в своей основе анти­
гены микроорганизмов востребованы как средство профилактики
инфекций, как технология создания иммунитета против инфекцион­
ных болезней. Они в основном профилактического назначения, лишь
очень незначительная часть подобных вакцин применяется с лечеб­
ной целью для усиления иммунного ответа при хронических и вяло­
текущих инфекциях.
ДНК-вакцинация основана на введении в организм не антигенов
- белков, полисахаридов и их комплексов, а нуклеотидных последо­
вательностей, кодирующих синтез антигенов в вакцинированном орга­
низме (среди микробных ДНК, чаще используются вирусные, а среди
тканевых, чаще опухолевые).
Предпосылкой к разработке вакцин на основе нуклеиновых кис­
лот послужили эксперименты, показавшие что внутримышечное вве­
дение депротеинизированной ДНК ведет к экспрессии закодирован­
ного в ней гена клетками мышечных волокон. Далее было выяснено,
что после подкожного введения ДНК в организме синтезируется коди­
руемый им белок, последний соединяется с антигенами МНС класса I
и вызывает клеточный, опосредуемый CD8+ Т-лимфоцитами иммун­
ный ответ, т.е. выраженный клеточный иммунный ответ.
Методической основой разработки ДНК-вакцинации являются
генно-инженерные технологии, включающие:
- выделение нуклеиновых кислот (кДНК, кодирующие синтез иммуногенных белков вирусных частиц, иммуногенных белков опухолевых
клеток и др.);
- встраивание кДНК в плазмидный или вирусный вектор;
- трансфекция вектора в клетки и ткани реципиента с последующей
экспрессией введенного в клетку кДНК и синтезом белков-антигенов,
стимулирующих специфический иммунный ответ при вирусной инфек69
ции, злокачественном новообразовании и другой патологии.
ДНК-вакцины - это терапевтические вакцины, так как они применя­
ются с целью усиления иммунитета и выздоровления больного. С про­
филактической целью, практически здоровым лицам ДНК-вакцины не
назначаются. Такие вакцины чаще разрабатываются против актуаль­
ных вирусных инфекций (в частности, против гепатитов В и С, вирус­
ного папилломатоза, ВИЧ и др.), злокачественных опухолей (меланома,
опухоль молочной железы, рак прямой кишки и др.), аллергических и
аутоиммунных болезней (рассеянный склероз, диабет I типа, ревма­
тоидный артрит).
ДНК-вакцины характеризуются низкой токсичностью, более
быстрой и менее дорогостоящей технологией изготовления, в отли­
чие от традиционных вакцин. Они стабильны при хранении, устойчивы
к действию температуры и влажности, не обладают инвазивными и
инфекционными свойствами. Перспективным направлением является
разработка многокомпонентных вакцин, содержащих несколько кДНК,
которые кодируют разные антигены, цитокины или другие биологиче­
ски активные молекулы.
Однако иммуный ответ после ДНК-вакцинаций, апробируемых при
актуальных вирусных инфекциях и опухолях пока остается не высо­
ким. Одна из причин этого - деградация чужеродной ДНК и невысокая
экспрессия вакцинных генов в организме реципиента.
ДНК-вакцины, съедобные вакцины и вакцины, основанные на
использовании живых апатогенных генно-модифицированных микро­
организмов, несущих гены, кодирующие вакцинный белок (иммуноген)
разрабатываются на основе технологии рекомбинантной ДНК. При
этом иммунный белок в съедобной вакцине нарабатывается в клетках
растений, при использовании генно-модифицированных микроорганиз­
мов - в микробной клетке. В ДНК-вакцине иммуноген нарабатывается
in vivo, в клетках и тканях вакцинированного организма.
Технологии разработки ДНК- вакцин
Основой разработки ДНК-вакцин является технология рекомби­
нантной ДНК, позволяющая создавать in vitro и трансфицировать в
организм стабильные генетические конструкции, несущие гены, ответ­
ственные за синтез белковых антигенов in vivo, в организме вакцини­
рованного.
Плазмидные векторы используются для доставки ДНК-вакцины
и экспрессии гена, кодирующего синтез белкового антигена. Чаще при­
меняются плазмидные векторы, несущие сильный промотор, вызыва­
ющий экспрессию высокого уровня во многих типах клеток. Под его
контролем, как правило, находится полная нуклеотидная последова­
тельность гена, кодирующего синтез иммуногена. ДНК-вакцины на
70
основе плазмидных векторов активируют как гуморальный, так и кле­
точный иммунный ответ. Синтез закодированного в плазмиде белка in
vivo обеспечивает его дальнейший процессинг для презентации в ком­
плексе с антигенами главного комплекса гистосовместимости (major
histocompatibility complex, МНС) I класса, что способствует формиро­
ванию цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ) I класса. Активация этих
лимфоцитов в ответ на опухолевые антигены имеет значение в эффек­
тивности противоопухолевого клеточного иммунитета. Кроме того, в
геноме прокариот, в частности в плазмидах часто встречается опре­
деленный фрагмент, а именно связка неметилированных динуклеоти­
дов - цитозина (С) и гуанина (G). Для эукариотного организма подоб­
ный нуклеотидный фрагмент сам по себе является природным имму­
ностимулятором, запускающим активацию макрофагов, натуральных
киллеров и NKT-клеток.Введенная плазмидная ДНК не интегрируется
с геномом, а существует в виде эписомы, способной длительное время
реплицироваться под контролем эукариотических промоторов.
Вирусные векторы в силу высокой трансфицирующей активно­
сти, интеграции с геномом клетки-хозяина и длительной персистенции являются перспективными для широкого использования в разра­
ботке ДНК вакцин. Дефектные по репликации аденовирусы, лентивирусы, вирусы коровьей оспы активно используются в эксперименталь­
ных исследованиях по разработке ДНК-вакцин, особенно к таким акту­
альным инфекциям, как ВИЧ, гепатиты В и С и др.
Кроме вирусноых векторов для доставки ДНК-вакцины в клетки и
ткани организма используются:
- баллистический метод, при помощи микрочастиц золота либо
вольфрама;
- метод электропорации;
- катионные или pH-зависимые липосомы.
Применение ДНК-вакцин
При инфекциях для выработки в организме-хозяине иммунного
ответа не нужны цельные вирусные частицы либо микробные клетки,
достаточно наличия одного или нескольких поверхностных белков
микроорганизмов. Это и обеспечивают ДНК- вакцины. Разработаны и
испытываются ДНК-вакцины против инфекций, вызываемых вирусами
гепатитов В и С, гриппа, лимфоцитарного хориоменингита, бешенства,
иммунодефицита человека (ВИЧ), японского энцефалита, а также воз­
будителями сальмонеллеза, туберкулеза и некоторых паразитарных
заболеваний (лейшманиоз, малярия).
На добровольцах и больных апробирована ДНК - вакцина против
малярии на основе аденоассоциированного вируса, трансфицирован­
ного генами малярийного плазмодия, стимулирующими пропиферацию
71
иммунных Т-киллеров, вакцина вводилась внутримышечно. Иммунная
система вакцинированных реагировала положительно, наряду с акти­
вированием клеточного иммунитета, отмечена выработка защитных
антител. ДНК-вакцина, содержащая гены, кодирующие белок тепло­
вого шока микобактерий туберкулеза (HSP65) и интерлейкина-12 в
составе вирусного вектора (японский гемагглютинирующий вирус) при
аэрозольном введении лабораторным мышам и обезьянам (животные
предварительно были заражены резистентными штаммами возбуди­
теля туберкулеза) показала выраженный терапевтический эффект.
При аутоиммунных заболеваниях, к примеру при рассеянном скле­
розе. Рассеянный склероз - хроническое прогрессирующее заболева­
ние с поражением головного и спинного мозга, зрительных нервов, что
приводит к нарушению соответствующих функций организма. Болезнь
характеризуется образованием очагов демиелинизации вследствие
утраты миелина - белого жирового вещества, покрывающего аксоны
(нервные волокна) клеток головного и спинного мозга. В основе забо­
левания лежат аутоиммунные нарушения: иммунная система человека
по неизвестной причине атакует и разрушает его собственный миелин.
Проведены клинические испытания ДНК-вакцины («ВНТ-3009), ингиби­
рующей пролиферацию клона CD4 Т-клеток, разрушающих миелиновые клетки собственного организма. Выявлены положительные изме­
нения по результатам магнитно-резонансной томограммы головного
мозга и антиген-специфическим иммунным сдвигам. При последую­
щих положительных результатах испытания вакцины от рассеянного
склероза, возможна разработка антиген-специфических ДНК-вакцин
для профилактики и лечения сходных по механизму развития заболе­
ваний, таких как сахарный диабет 1 типа, системная красная волчанка,
ревматоидный артрит и миастения.
При злокачественных новообразованих противоопухолевые ДНКвакцины могут содержать: гены, кодирующие опухолевые антигены,
гены цитокинов и иммуномодуляторов, гены активирующие апоптоз
опухолевой клетки. Разработка вакцин, содержащих комплекс разных
генов обусловлена склонностью опухолей к антигенной изменчивости
и их слабой иммуногенностью. Большинство опухолевых антигенов
являются «собственными», что является труднопреодолимым барье­
ром на пути к разработке эффективных методов иммунотерапии рака.
Поэтому усиление антигенности белков опухолевой ткани или актив­
ная стимуляция поглощения их антигенпрезентирующими клетками
являются ключевыми моментами в разработке терапевтических ДНКвакцин при злокачественных новообразованиях. Кроме традиционных
опухолеспецифических антигенов, в качестве мишеней для ДНК-вакцин
72
могут выступать антигены сосудистой сети опухолей.
Кроме ДНК-вакцины при злокачественных новообразованиях
используются:
а) иммунизация синтетическими пептидами, аналогичными опу­
холевым антигенам;
б) источником опухолевых антигенов служат сами инактивиро­
ванные опухолевые клетки, которые генетически модифицируются с
тем, чтобы они могли вызвать продукцию антиопухолевых цитокинов
(интерлейкинов, интерферонов);
в) на основе дендритных клеток (это антигенпрезентирующие
клетки) пациента, нагруженных (ex vivo) опухолевыми антигенами в
виде пептидов или клеточных лизатов. Схема изготовления дендрит­
ной вакцины такова: из крови больного выделяют клетки, которые дают
начало дендритным клеткам, культивируют in vitro с опухолевыми анти­
генами. Активированные таким образом дендритные клетки реинфузируют в организм больного и тем самым усиливают противоопухоле­
вый иммунитет. Дендритные вакцины можно использовать для лече­
ния как спонтанных опухолей, так и новообразований, ассоциирован­
ных с вирусами. Результаты клинического испытания дендритных вак­
цин на пациентах IV стадии заболевания показали их безвредность,
а в ряде случаев зарегистрирован положительный эффект.
ДНК-вакцинотерапия успешно апробирована при лечении опухо­
лей почек и меланом, злокачественных заболеваний яичника, орга­
нов желудочно-кишечного тракта и, особенно, простаты. Так после
радикального хирургического лечения или радиотерапии рака про­
статы, первое свидетельство рецидива типично —это увеличение уров­
ней простат-специфического антигена (PSA). ДНК-вакцина, кодирую­
щая данный антиген, нацелена на усиление специфического CD8 +
Т-клеточного иммунного ответа против PSA.
ДНК-вакцины при клинических испытаниях вводятся внутримы­
шечно, реже внутрикожно и внутривенно.
В целом результаты проведенных клинических испытаний при
различных типах и локализации злокачественного новообразования
показывают незначительную иммуно-стимулирующую активность про­
тивоопухолевых вакцин. В целом, регресс опухоли после вакцинации
наблюдается в 2-3% случаев.
Механизмы повышения эффективности ДНК-вакцин
Почему ДНК-вакцины не достаточно иммуногенны? Наверное
потому, что они применются при тех заболеваниях (хронические, персистирующие инфекции и злокачественные новообразования), когда
иммунный ответ организма недостаточен в силу слабой иммуногенности антигенов возбудителей или опухолевых клеток, в силу осла­
73
бления защитных сил организма. Известна следующая градация убы­
вания иммуногенной активности вакцин на основе микроорганизмов:
живые, убитые, субклеточные или субъединичные. Также имеет зна­
чение то, что при ДНК-вакцинации антигены - белковые компоненты
микроорганизмов либо опухолевых клеток синтезируются не в соот­
ветствующих прокариотах, вирусах или атипичных клетках, а процесс
происходит в организме реципиента, т.е.в совершенно ином «незна­
комом» молекулярно-биологическом микроокружении.
Теоретически повысить иммунный ответ на ДНК-вакцины воз­
можно путем одновременного введения генов, кодирующих различ­
ные цитокины, дополнительно стимулирующие иммунокомпетентные
клетки (Т- и В-лимфоциты, макрофаги и др). Поэтому цитокины, сти­
мулирующие опосредуемый Тх1 иммунный ответ, в том числе гранулоцитарно - макрофагальный колониестимулирующий фактор (ГМ-КСФ),
интерферон-гамма (ИФН-гамма), интерлейкин-2 (ИЛ-2), интерлейкин-12
(ИЛ-12) и интерлейкин-18 (ИЛ-18), были клинически апробированы.
Столь же хорошо известно из классической вацинологии то, что
иммунный ответ более выражен при большей дозе вводимого антигена
и длительности нахождения его в организме. Повышенная экспрессия
белкового антигена в составе ДНК-вакцины также должна способство­
вать более эффективному иммунному ответу. Поэтому для обеспече­
ния эффективной транскрипции кДНК в составе плазмиды необходим
сильный промотор.
Эффективность иммунного ответа также связана с созданием
оптимальных условий взаимодействия белка-иммуногена с антигенпрезентирующими клетками, тканевыми макрофагами. Этого можно
достичь путем комплексирования иммуногена с С040-лигандом, вне­
клеточным доменом лиганда Fms-подобной тирозин киназы-3 (flt-З) или
антигеном-4 цитотоксических Т-лимфоцитов (CTLA4), и тем самым уси­
ливая поглощение иммуногена антигенпрезентирующими клетками.
Повышение стабильности ДНК-вакцины in vivo, в процессе
доставки ее к клеткам-мишеням также способствует более выражен­
ной и продолжительной экспрессии иммуногена. Одним из подобных
вариантов может быть доставка вакцины в составе липосом и микро­
капсул, в определенной степени защищающих ее от действия эндоген­
ных нуклеаз, а также способствующих проникновению внутрь клеток.
Адсорбция ДНК на катионные микрочастицы из поли DL-лактид-когликолида должна обеспечивать адъювантный эффект, а именно мед­
ленное высвобождение ДНК из комплекса. Это должно способство­
вать формированию более активного иммунного ответа, чем исполь­
зование «голой», депротеинизированной ДНК.
Используются физические способы предохранения ДНК-вакцины
от разрушающих факторов организма-реципиента. Это помещение вак­
74
цины в пористую микросферу из карбоната кальция (СаС03). Покрывают
ее полупроницаемой оболочкой из нескольких слоев природных поли­
меров — полисахаридов либо полипептидов. Если микросферы в поли­
мерной оболочке поместить в подкисленный раствор, карбонат кальция
внутри растворится и уйдет через полимерную мембрану. Внутри оста­
нется только ДНК-вакцина, подлежащая доставке в клетки-мишени.
Некоторые пути усиления эффективности ДНК-вакцинаци показаны на
таблице 8.
Таблица 8. Стратегии усиления эффективности полинуклеотидных противоопухолевых терапевтических вакцин
Характеристика вакцины
Вмешательство
Тип доставки нуклеиновой кислоты - липосомы
- микрочастицы ПЛГ
- электропорация
- гидродинамическая доставка
Модификация антигена для
обеспечения его поглощения АПК
Слияние антигена с CD40L, Flt-3L,
CTLA4
Модификация антигена с целью
повышения его иммуногенности
- изменение процессинга антигена
- внедрение иммуногенных эпитопов
- использование антигена другого
вида
- оптимизация кодона
Модификация микроокружения
- одновременное введение
цитокинов, хемокинов
Проблемы генотерапии
Применение генотерапии чаще всего осуществляется при тяже­
лой патологии, когда нет альтернативного пути излечения. Всего 2-3%
положительных результатов при генотерапии опухолей, столь же незна­
чительны успехи при лечении вирусной и иной ненаследственной пато­
логии, однако количество протоколов клинических испытаний стреми­
тельно растет.
Несмотря на многоэтапную предклиническую апробацию техноло­
гии введения терапевтических генов и изучения их действия в клетке и
организме экспериментальных животных, in vitro либо in vivo, в прото­
колах клинических испытаний часто имеют место отсутствие эффекта
и редко - осложнения.
При наследственном заболевании - Х-сцепленном тяжелом имму­
нодефиците продолжительность жизни больного обычно составляет
75
не более одного года. Причиной такого заболевания является дефект
гена, находящегося в Х-хромосоме. Генотерапия позволяет с помощью
вируса доставить исправный ген в клетки человека, где он начинает
работать, делая безнадежно больного человека практически здоро­
вым. Однако через несколько лет после подобной генотерапии у двух
мальчиков появились первые симптомы лейкемии или рака крови.
Оказалось, что терапевтический ген был встроен в ДНК пациентов
недалеко от гена LM02 и активизировал экспрессию последнего. Это,
в свою очередь, привело к неконтролируемому увеличению количества
лейкоцитов в крови мальчиков, по сути - главному проявлению лейке­
мии. Генотерапия все же спасла жизнь мальчиков, так как развивше­
еся осложнение - лейкемия в детстве успешно лечится в 90 процентах
случаев. В данном случае генотерапии не были известны и поэтому
не учтены возможные нежелательные внутриклеточные молекулярно­
регуляторные нарушения, возникшие при взаимодействии чужерод­
ного гена и организма-реципиента.
Несмотря на смерть в сентябре 1999 г. пациента, Джеси Гелзингера,
страдавшего недостаточностью гена орнитинкарбамоил - трансферазы, в результате применения адено-вирусного вектора третьего поко­
ления, исследования по использованию данного вируса в качестве век­
тора активно продолжаются. Аденоассоциированный вирус (AAV) пред­
почтителен в силу широкого носительства среди практически здоро­
вого населения. Кроме того структура вируса очень проста, а геном AAV
представляет из себя линейную, однонитевую молекулу ДНК, содержа­
щую 4681 нуклеотид. Геном AAV включает в себя с обоих концов инвер­
тированные концевые повторы (ITR), имеющие в длину около 145 нукле­
отидов каждая. ITR имеют много функций, включая начало реплика­
ции ДНК и сигналы для упаковки вирусного генома. Далее, AAV явля­
ется хелпер-зависимым вирусом, т.е. для его активной репликации в
организме обязательно присутствие второго вируса (например, адено­
вируса, вируса герпеса и др.). Поэтому геном AAV не реплицируется в
клетке, а интегрирует с клеточным генетическим материалом, репро­
дукции вируса нет.
Существующие проблемы ДНК-вакцинации:
- поскольку ДНК-вакцинация основана на введени генов, кодиру­
ющих белковые молекулы, вырабатывается иммунный ответ только на
белковые компоненты микроорганизмов, тканевых (опухолевых) кле­
ток, но не на липополисахаридные компоненты;
- низкая иммуногенность ДНК-вакцин;
- возможность развития осложнений после ДНК-вакцинации
(нельзя использовать ДНК-иммунизацию, если человек ранее был
иммунизирован данным белковым антигеном любыи другим способом);
76
- необходимо исключить онкогенную опасность. Еще недостаточно
изучено, может ли вводимая в составе плазмидного вектора к ДНК,
кодирующая иммуноген, встраиваться в геном клетки человека и вызы­
вать мутации клетки-реципиента;
- синтез белкового антигена в организме может продолжаться дли­
тельное время (до нескольких месяцев), это может привести к развитию
различных форм иммуносупрессии и других патологических состояний;
- чужеродная ДНК может вызвать образование анти-ДНК-антител,
которые способны индуцировать различные формы аутоагрессии и
иммунопатологии.
Прежде чем ДНК-вакцинация войдет в повседневную медицин­
скую практику вышеизложенные проблемы будут досконально иссле­
дованы. Вместе с тем ряд вакцин (в том числе, от рака простаты, мела­
номы и лимфомы) достигли позитивных результатов в фазе III клиниче­
ских испытаний. В ряде случаев вакцина против фолликулярной лим­
фомы BiovaxlD отсрочила ремиссию после химиотерапии более, чем на
1 год; вакцина от меланомы вызывает уменьшение опухолей в 2 раза,
сравнительно со стандартной терапией и др.
77
III. КЛЕТОЧНЫЕ ТЕХНОЛОГИИ
«Клетка - есть последний морфологический
элемент всех живых тел... Мы не имеем права
искать настоящей жизнедеятельности вне ее».
Р. Вирхов
Здоровье и качество жизни человека обусловлены морфофунк­
циональным состоянием регуляторных систем (нервной, эндокрин­
ной, иммунной и др.), тканей, органов и клеток организма. Целестный
элемент живой системы - клетка, она доступна для изучения и воздей­
ствия как на морфологическом, так и функциональном уровнях. Более
сложно, анализировать, регулировать и воздействовать на межкле­
точное микроокружение. Тканевое обустройство представляется пока
очень сложной технологией для его полноценного морфофункциональ­
ного воспроизведения in vitro и восполнения ее функций in vivo.
Клеточные технологии - это технологии, основанные на исполь­
зовании в качестве объекта живой клетки. Это использование клеток
с терапевтической и диагностической целью непосредственно после
их выделения и размножения либо после предварительной модифи­
кации ex vivo их гено- и фенотипических свойств; слияние ex vivo ати­
пичных и нормальных клеток с целью получения гибридом, продуциру­
ющих диагностические либо терапевтические моноклональные анти­
тела; выделение и слияние мужских и женских половых клеток ex vivo
при экстракорпоральном оплодотворении.
Клеточные технологии в медицине используются с целью:
- терапии болезни, восполнения функции больного органа или
поврежденной ткани;
- получения гибридных клеток - продуцентов моноклональных
антител, используемых в терапии и диагностике;
- оплодотворения ex vivo путем слияния мужских и женских поло­
вых клеток;
- диагностики и исследования вирусных инфекций, наследствен­
ных болезней в культуре клеток;
- производства биопрепаратов (накопление вирусной биомассы
в культуре клеток человека и животных при получении вирусных вак­
цин, синтез антибиотиков и других биологически активных веществ при
культивировании суспензии про- и эукариотных клеток в биореакторе);
- исследования влияния лекарственных препаратов на фено- и
генотип клеток организма.
78
Клеточная терапия
Цель клеточной терапии
1. Замещение функции больного органа или поврежденной ткани.
2. Стимуляция прогениторных клеток и репаративных про­
цессов в больном организме. Прогениторные клетки —это клеткипредшественники, способные дифференцироваться в клетки тканей
различных типов, это стволовые клетки.
Какие стволовые клетки используются с терапевтической
цепью:
1. Гемопоэтические и мезенхимальные стволовые клетки, выде­
ленные из пуповинной крови, костного мозга, жировой ткани и др.
2. Аутологичные (собственные) и аллогенные (донорские); ксеногенные - клетки животного происхождения, используются редко.
Стволовые клетки тканей взрослого организма служат клеточной
основой для поддержания в нем гомеостаза и лежат в основе репара­
тивных процессов в организме. Стволовые клетки присутствуют в кост­
ном мозге и в меньших количествах в периферической крови. В тече­
ние всей жизни организма они делятся, образуя различные типы кле­
ток крови. Небольшие количества стволовых клеток присутствуют в тка­
нях многих органов. При повреждении тканей соответствующего органа
находящиеся в нем стволовые клетки мигрируют к зоне повреждения,
делятся и дифференцируются, образуя в этом месте новую ткань.
Гемопоэтические стволовые клетки (ГСК) - мультипотентные ство­
ловые клетки, дающие начало всем клеткам крови - эритроцитам,
В-лимфоцитам, Т- лимфоцитам, нейтрофилам, базофилам, эозинофилам, моноцитам, макрофагам и тромбоцитам. Кроме костного мозга
ГСК обнаружены в системном кровотоке и тканях. Таким образом, они
способны дифференцироваться во все линии клеток крови и способны
поддерживать гемопоэз пожизненно за счет механизма самообнов­
ления.
Мезенхимальные стволовые клетки - МСК (другое название
ММСК-мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки) - муль­
типотентные недифференцированные клетки, способные к самовос­
произведению, обладают пластичностью и широким спектром дифференцировки в различные типы клеток (остеобласты, хондроциты, эндо­
телиальные клетки и др.). МСК выделяются из различных тканей, в том
числе из костного мозга.
При ассиметричном делении стволовой клетки образуются две
дочерние - одна недифференцированная стволовая, а другая - диф­
ференцируется в определенный тип клеток. Дифференциацию обеспе­
чивает тканевое окружение, включающее растворимые факторы (сиг­
нальные молекулы) и экстрацеллюлярный матрикс (структура окру79
жающей ткани). И эта дифференциация предопределяется большой
сетью регуляторных генов.
Почему используются взрослые, а не эмбриональные стволо­
вые клетки
Механизмы дифференциации эмбриональных стволовых клеток
изучены недостаточно, чтобы можно было бы четко «управлять» про­
цессом их созревания в те или иные тканеспецифические клетки. Легче
в этом плане со взрослыми стволовыми клетками, они уже предетерминированы к дифференциации в определенный тип клеток.
Дифференцировке клеток предшествует детерминация (состоя­
ние предопределенности типа последующей дифференцировки), про­
исходящая тогда, когда нет внешних признаков дифференцировки, нет
даже маркерных белков. На генетическом уровне, возможно, детерми­
нация происходит в интронах, а не в кодирующей части ДНК (это струк­
турно «молчащие» гены и, возможно, определяющие регуляторные,
сигнальные функции; они занимают основную часть геномной ДНК и
позитивно эволюционируют).
При выделении и использовании стволовых клеток, в отличие от
эмбриональных, отсутствуют этические ограничения, поскольку они,
как правило, выделяются из донорского костного мозга или пуповин­
ной крови. При использовании собственных стволовых клеток полно­
стью исключается возможность реакции иммунного отторжения.
Как используются стволовые клетки:
клетки, просто размножаются in vitro и вводятся в орган
(собственно клеточная терапия);
- in vitro усиливается иммунокомпетентность клеток, а уже затем
они вводятся больному (клеточная иммунотерапия);
- клетки генетически модифицируются in vitro и вводятся паци­
енту (генно-клеточная терапия);
- клетки, наращиваются in vitro на матриксе в присутствии фак­
торов роста для создания тканевой конструкции (графт); последний
имплантируется в область дефекта органа или ткани (графтинг).
Выделение стволовых клеток из костного мозга
Костный мозг является комплексной тканью, состоящей из гемо­
поэтических клеток, красных и белых клеток крови и их предшествен­
ников, мезенхимальных стволовых клеток, стромальных клеток и их
предшественников и группы клеток, включающей фибробласты, ретикулоциты, адипоциты и эндотелиальные клетки, которые образуют сое­
динительную ткань, называемую строма.
80
Клетки из стромы морфологически регулируют дифференцировку
гемопоэтических клеток посредством поверхностных клеточных бел­
ков и секрецией факторов роста, участвующих в образовании и под­
держании структуры кости. У взрослого человека красный костный
мозг содержится только в ячейках губчатого вещества плоских костей
(грудина, крылья подвздошных костей), в губчатых костях и эпифизах
трубчатых костей. Доля собственно стволовых клеток в костном мозге
составляет всего 0,2-0,5%. Клетки костного мозга можно получить или
методом эксфузии (непосредственно проколом подвздошной кости),
или методом цитофереза из мобилизованной крови, после предвари­
тельного введения препаратов, которые стимулируют выброс стволо­
вых клеток в периферическое русло.
Выделение стволовых клеток из пуповинной крови
Общая концентрация ГСК в пуповинной крови ниже, но число ран­
них клеток-предшественников значительно выше, чем в костном мозге.
Клетки пуповинной крови - это клетки новорождённого организма—
молодые, не исчерпавшие своего потенциала. А потому у них высо­
кая способность к размножению и дифференцировке (превращению
в клетки других видов).
Процедура получения стволовых клеток пуповинной крови доста­
точно проста и безопасна для матери и ребёнка. Во время родов пупо­
вину пережимают специальными зажимами, и оставшаяся внутри
кровь (её объём составляет примерно 60—80 мл) стекает в шприц, в
стерильный пластиковый контейнер, содержащий изотонический анти­
коагулянт. Строго соблюдаются условия асептики с целью исключе­
ния инфицирования крови в процессе забора. Транспортировка крови
осуществляется при комнатной температуре в изотермическом транс­
портном стерильном контейнере в специализированную лабораторию,
где образец подготавливают к криоконсервации.
В процессе выделения стволовых клеток из пуповинной крови
поэтапно извлекаются плазма, форменные элементов крови - эритро­
циты, тромбоциты, лейкоциты. Параллельно проводят биохимические
исследования, определяют антигены гистосовместимости. Кроме того,
проверяют, не заражена ли кровь бактериями или вирусами. До окон­
чания такого обследования замороженные образцы держат на „карантине“, отдельно от остальных. Для последующего криогенного хранения
концентраты стволовых клеток в аутологичной плазме расфасовыва­
ются в криопробирки и замораживаются в присутствии 10% ДМСО
до минус 90 °С, а затем для хранения помещаются в жидкий азот.
Жизнеспособность клеток после пробного размораживания составляет
не менее 80%. Такой способ получения концентрата гемопоэтических
стволовых клеток является дорогим, но наиболее эффективным (рис.9).
81
Рис 9. Выделение стволовых клеток (а- получение пуповинной крови,
6- цитаферез клеток крови, в-подготовка к криоконсервации)
Сразу после рождения ребенка и отсечения пуповины кровь соби­
рается в стерильный контейнер, содержащий раствор антикоагулянта.
Забор пуповинной крови может быть осуществлен, как в ходе нормаль­
ных родов, так и в случае кесарева сечения. Риск бактериального
загрязнения минимален. Пуповинная кровь в изотермическом контей­
нере незамедлительно доставляется в банк стволовых клеток, где из
нее выделяются стволовые клетки. Кровь подвергается цитаферезу в
“чистом” помещении, соответствующем международным стандартам, с
применением одноразовых расходных материалов. Перед помещением
в хранилище пуповинная кровь должна быть обработана. Для этого
кровь взвешивают, подсчитывают жизнеспособность клеток. Затем
стволовые клетки помещают в пластиковые контейнеры, разработан­
ные специально для долгосрочного хранения при низких температурах
и погружают в криопротектор - раствор, который предохраняет клетки
от разрушения при автоматическом программированном охлаждении.
После чего погружают в криохранилище —резервуар с жидком азотом,
состоящий из определенного количества криобоксов,в котором они и
хранятся. В каждой ячейке криобокса находится только один контейнер
со стволовыми клетками одного новорожденного. Температура в дюаре
- 196°С. Считается, что клетки могут сохраняться в жидком азоте без
потери активности до 20 лет.
Выделение стволовых клеток из жировой ткани
Жировая ткань выделяется чаще из передней брюшной стенки
путем липоаспирации. Жироваяе ткань измельчается и обрабатывается
слабой концентрацией коллагеназы в течение 30 минут. Полученная
суспензия клеток осаждается цетрифугированием, ресуспендируется
в буфере, лизирующем эритроциты. Очищенная суспензия клеток
инкубируется в среде Игла в модификации Дюльбекко (среда ДМЕМ),
содержащей антибиотик с целью предупреждения инфицирования.
Суспензия фильтруется для удаления клеточного дебриса и протеолитически нерасщепленных фрагментов ткани. Процедура повторяется
для более полной очистки клеток от сопровождающего детрита.
Культивирование стволовых клеток
Технология выделения и культивирования стволовых клеток
включает следующие стадии:
- обработка фрагментированной ткани (костный мозг, жировая
ткань) коллагеназой в течение 6-8 минут;
- отделение клеточной фракции путем цетрифугирования (5 мин
при ЮООд);
- культивирование клеток во флаконах на DMEM и подобных пита­
тельных средах, с добавлением антибиотика;
- идентификация и выделение стволовых клеток среди других
клеточных популяций;
- обогащение популяции стволовых клеток путем многократного
переноса на свежую среду - внесение в среду культивирования фак­
торов роста (базовый фактор роста фибробластов -bFGF и др.), кото­
рые индуцируют интенсивную пролиферацию стволовых клеток.
Для культивирования стволовых клеток используются питатель­
ные среды, содержащие все соединения, необходимые для роста и
деления. Основа сред - минеральные компоненты, подобранные по
составу и концентрации для сохранения кислотно-щелочного баланса
и осмотического градиента. Необходимо наличие аминокислот, вита­
минов, гормональных и иных биологически активных соединений.
При этом требуется соблюдение в процессе культивирования клеток
строго определенной температуры, необходимого соотношения угле­
кислого газа/кислорода, абсолютной стерильности, строго периодиче­
ской смены питательной среды на свежую. К обязательным компонен­
там питательных сред относятся дорогостоящие ростовые факторы и
фетальная сыворотка. При несоблюдении своевременности пересе­
вов, стволовые клетки во флаконах начинают необратимо дифферен­
цироваться в различные тканеспецифические типы клеток (сердечной
мышцы, костной ткани, жировые клетки, хрящевой ткани и т.д.).
Биологический материал, из которого выделяются стволовые
клетки (костный мозг, пуповинная кровь и др.) обязательно тестиру­
ется на наличие инфекции методами ИФА и ПЦР.
Присутствующая в составе питательной среды фетальная сыво­
ротка крови животных (телячья, лошадиная и др.) может оказаться
источником инфицирования пациента агентами прионной природы или
зоонозными инфекциями. Другая опасность заключается в возможно­
сти аллергизации пациента белками чужеродной сыворотки, особенно
83
при повторном введении клеточного материала.
Мезенхимальные стволовые клетки, выделенные из жировой
ткани (Adipose-Derived Stem Cells - ADSCs-клетки) можно культивиро­
вать на средах, не содержащих сыворотки животных, это их преиму­
щество. По фенотипическим характеристикам ADSCs на 90% подобны
мезенхимальным стволовым клеткам из костного мозга и также спо­
собны in vitro дифференцироваться в зрелые адипоциты, хондроциты,
остеобласты и другие типы клеток.
Идентификация стволовых клеток (МСК и ГСК)
Морфологический анализ (обычно фазово-контрастная микроско­
пия) позволяет выделить три типа клеток:
- первый тип клеток представляет собой субпопуляцию малых
веретеновидных клеток, диаметром 10 -1 5 мкм, с четко выделенным
ядром и гомогенной цитоплазмой;
- второй тип представлен клетками округлой формы с вытянутым
с одной стороны плоским выростом цитоплазмы и размером до 40 мкм
с гетерогенной цитоплазмой;
- третий тип клеток характеризуется крупными размерами (до 80
мкм) с большим количеством вакуолей и гранул.
Более специфична иммунологическая идентификация СК. Для
этого популяции выделенных клеток анализируются на наличие
специфичных для СК поверхностных антигенов или маркерных бел­
ков при помощи меченных флуоресцентным красителем антител.
Результаты реакции регистрируются специальным прибором - проточ­
ным цитофлуориметром-сортером, который автоматически отделяет
СК от остальных популяций клеток.
Применение стволовых клеток
Терапия суспензией тканеспецифических клеток относится к
известной технологии в медицинской практике. Полезность такой тера­
пии объясняется присутствием в живых клетках большого числа биоло­
гически активных веществ, стимулирующих регенеративные процессы,
обладающих иммуностимулирующим эффектом и т.д.
Терапия стволовыми клетками, наряду с регенеративной функ­
цией, целенаправлена на восполнение в больном органе и повреж­
денной ткани недостающего числа здоровых дифференцированных,
органо- и тканеспецифичных клеток.
К настоящему времени терапия стволовыми клетками - это еди­
ничные успешные клинические испытания, проводимые во многих
ведущих медицинских учреждениях во всем мире. Эта терапия пока
не является повседневной медицинской практикой, за исключением
пересадки костного мозга, содержащего гемопоэтические стволовые
84
клетки.
1. Пересадка костного мозга, содержащего гемопоэтические ство­
ловые клетки уже на протяжении десятилетий используется для вос­
становления кроветворения у больных с онкологическими и гематоло­
гическими заболеваниями. При аутологичной трансплантации у боль­
ного проводится забор костного мозга, в котором содержится опре­
деленное количество ГСК, а после проведенной лучевой либо хими­
отерапии (часто при онкогематологических заболеваниях - лейко­
зах, лимфомах) проводится реинфузия. При аллогенной трансплан­
тации используется донорский костный мозг. Современные техноло­
гии позволяют выделять при помощи цитофореза из костного мозга
донора (а иногда - и самого пациента в период ремиссии) фракцию
гемопоэтических стволовых клеток.Трансплантация гемопоэтических
стволовых клеток повышает эффективность лечения острого лейкоза
по средне-статистическим данным с 6-7% до 60-70%. В мире ежегодно
выполняется более 10 ООО трансплантаций костного мозга, содержа­
щего гемопоэтические стволовые клетки. Вместе с тем нарастают
технологии использования вместо костного мозга пуповинной крови,
как источника гемопоэтических клеток. Так согласно данным WMDA
(Всемирная организация доноров костного мозга) около 22% от всех
источников гемопоэтических стволовых клеток для аллогенных тран­
сплантаций составляют трансплантаты пуповинной крови.
2. Разрабатываются технологии применения МСК при лечении
инфаркта миокарда и хронической сердечной недостаточности. У
пациента производится забор небольшого количества костного мозга.
Последующее выделение, специальная обработка и наращивание
необходимого количества аутологичных стволовых клеток занимают
1,5-2,0 месяца. Внутрикоронарной инфузией либо иньекцией в пора­
женную зону миокарда вводится концентрат стволовых клеток кост­
ного мозга. Наиболее перспективными являются трансплантации ауто­
логичных клеток и аллогенных клеток пуповинной крови, слабо экс­
прессирующих антигены главного комплекса гистосовместимости.
Предварительно через бедренную артерию в полость сердца вводится
специальный датчик, позволяющий при помощи компьютерной техники
определить пораженные участки миокарда с нарушенным питанием
(инфаркт, хроническая сердечная недостаточность). Иньекции ство­
ловых клеток в зону уже сформировавшегося постинфарктного рубца
малоперспективны, более эффективно их введение в ранние сроки
постинфарктного периода, в околоинфарктную зону или внутрикоронарно. Имплантация стволовых клеток стимулирует рост новых сосу­
дов и регенеративные процессы в зоне инфаркта, улучшает морфо­
функциональное состояние миокарда в целом.
3. При патологии печени клеточная терапия in vivo (введение ство­
85
ловых клеток в портальную вену) и ex vivo (экстракорпоральное под­
ключение изолированных гепатоцитов) применяется для временного
восполнения функции печени:
- гемопоэтические и мезенхимальные стволовые клетки при инфузии их через катетер в портальную вену животных при эксперимен­
тальной печеночной недостаточности существенно улучшают морфо­
функциональное состояние паренхимы органа перед последующей
трансплантацией донорской печени;
- биоискусственная печень для экстракорпорального подключе­
ния аллогенных или ксеногенных зрелых гепатоцитов либо различ­
ных линий ксеногенных мезенхимальных стволовых клеток, способных
дифференцироваться в культуре в гепатоциты (т.е. клетки способные
к биотрансформации метаболитов с участием цитохрома Р450, синте­
зировать белок и мочевину, снижать клиренс аммиака, активно проду­
цировать фермент гамма-глутамилтранспептидазу -GGT) и в клетки
желчных канальцев - холангиоциты (формируют сливающиеся моно­
слои клеток в культуре и обеспечивают трансмембранный транспорт
жидкости, также имеют высокую активность GGT при очень низком
уровне синтеза белка). Сам аппарат биоискусственной печени состоит
из трех частей:
- плазменный фильтр, разделяющий кровь пациента на плазму и
клетки крови;
- биореактор, заполненный суспензией гепатоцитов или стволо­
вых клеток для временного поддержания функции больной печени;
- перфузионная система для транспорта плазмы пациента через
биореактор с контролем газового состава и температуры для лучшего
функционирования клеток.
В настоящее время технология биоискусственной печени нахо­
дит применение для временного поддержания функции поврежденной
печени перед операцией трансплантации здорового донорского органа,
а также с целью вывода больного из печёночной комы.
4.
При аутоиммунных заболеваниях (склеродермия, ревматои
ный артрит, рассеянный склероз, системная красная волчанка и др.)
клеточная терапия направлена на «оздоровление» иммунной системы.
Предварительно элиминируются популяции иммунокомпетентных кле­
ток, разрушающих собственные ткани. А затем проводится инфузия
гемопоэтических или мезенхимальных стволовых клеток, дифферен­
цирующихся в нормальные иммунокомпетентные клетки, не повреж­
дающие собственные ткани организма и восполняющие нормальное
кроветворение.
Так, при рассеянном склерозе популяции иммунокомпетентных
клеток, поражающих собственные ткани уничтожаются путем иммуносупрессивной терапии, а затем в организм вводятся аллогенные гемо86
поэтические стволовые клетки. Последние дифференцируются в иммунокомпетентные клетки, не обладающие аутоагрессией, не повреж­
дающие собственные ткани, тем самым имеет место восстановление
нормальной функции иммунной системы организма без аутоагрессии.
Процесс восстановления кроветворной и иммунной системы после
трансплантации стволовых клеток происходит в течение двух недель.
Втечение этого времени пациент находится в стерильном боксе, обору­
дованном специальной системой очистки воздуха и воды. При необхо­
димости назначается профилактическое введение антибиотиков, про­
тивогрибковых и противовирусных препаратов.
5.
При сахарном диабете 1 типа, обусловленном клеточно
опосредованным аутоиммунным разрушением панкреатических betaклеток, клеточная терапия направлена на восполнение пула островковых клеток поджелудочной железы. Клеточная терапия при данной
патологии подразделяется на:
- ксенотрансплантацию - это использование клеток поджелудоч­
ной железы новорожденных поросят или кроликов, а также плодов
крупного рогатого скота. Железа тщательно очищается от сосудов и
соединительнотканных элементов, измельчается, многократно промы­
вается раствором Хенкса, и затем островковые клетки культивируются
во флаконах либо матрацах на среде 199 (Игла и др.) с 10% сыворот­
кой плодов крупного рогатого скота и раствора антибиотика. Смену
среды в культуре производят каждые 2-3 дня или по мере измене­
ния ее pH. На 6-8-е сутки культивирования клетки наиболее активно
вырабатывают инсулин. Собранную культуру объемом 5-15 мл поме­
щают в стерильный флакон с раствором Хенкса. Клетки вводятся в пор­
тальную венозную систему либо в пульпу селезенки или в брюшную
полость. Необходимо помнить, что при ксенотрансплантации суще­
ствует потенциальная угроза активизации механизмов иммунного
отторжения чужеродных клеток;
- использование аутологичных мезенхимальных стволовых клеток,
дифференцирующихся в инсулин-продуцирующие клетки. Генерация
инсулин-продуцирующих клеток из мезенхимальных стволовых кле­
ток костного мозга, жировой ткани и пуповинной крови осуществля­
ется путем соответствующей генетической модификации клеток и/или
путем соблюдения определенных условий культивирования.
6.
При хронической ишемии нижних конечностей из-за облитер
ции периферических сосудов у пациентов, не являющихся кандида­
тами для оперативной реваскуляризации («болезнь курильщиков») кле­
точная терапия дает положительные результаты. В ишемизированные
мышцы конечностей, в икроножную мышцу инъецируется аутологич­
ная популяция стволовых клеток или аутологичные мононуклеарные
клетки костного мозга (экспрессирующие высокий уровень альдегидде87
гидрогеназы и способствующие реваскулиризации ишемизированных
тканей). Увеличенный кровоток в пораженной конечности, снижение
болевого синдрома сохраняются не менее 3 месяцев после лечения.
Стволовые клетки успешно апробируются в клинике и при других I
заболеваниях, кроме вышеприведенных.
Следует отметить, что при терапии стволовыми клетками ста­
бильно проявляется их прорегенераторная функция (неоангиогенез,
активная пролиферация соединительно-тканных элементов), однако
дифференциация введенных в организм пациента стволовых клеток
в клетки тех или иных органов и тканей пока не всегда однозначна.
Почему всегда активен процесс неоангиогенеза? Потому навер­
ное, что сосудистая ткань наиболее мобильна, она реагирует одной
из первых на повреждение ткани. Да и дифференциация стволовых
клеток в сосудистые эндотелиоциты, наверное, менее сложна, нежели
в паренхиматозные клетки. Именно неоангиогенез лежит в основе
успеха клеточной терапии во многих протоколах клинических испыта­
ний (инфаркт миокарда и др.).
7.
В косметологии с целью временной стимуляции процессов ж
недеятельности клеток кожи, заполнения дефектов, разглаживания
морщин применяются суспензии стволовых клеток, фибробласты. В
пластической хирургии внедряются технологии этих клеток с целью
стимуляции роста собственной коллагеновой ткани, увеличения коли­
чества активных соединительно-тканных клеток в области стареющей,
дряблой, иссушонной кожи и др.
При трансплантации стволовых клеток проводится HLAтипирование донора и реципиента (серологические и молекулярно­
генетические методы) для определения гистосовместимости. Так, при
молекулярно-генетическом типировании используются SSO (sequence
specific oligonucleotides) и SSP (sequence specific primers) технологии.
Технология SSO включает этапы ПЦР с последующей детекцией путем
гибридизации ампликонов с олигонуклеотидными зондами. Технология
SSP базируется на ПЦР с использованием аллель-специфических
праймеров с последующей детекцией методом гель-электрофореза.
Технология терапии стволовыми клетками может быть
успешной:
- при биосовместимости вводимых клеток с тканью реципиента;
- при создании условий для их дифференциации (к примеру, из
МСК костного мозга или жировой ткани, при обработке их 5-азацитидином, можно получить кардиомиоциты, которые определяют успех про­
водимой клеточной терапии при инфаркте миокарда. Если эти клетки
обработать гидрокортизоном (дексаметазоном), витамином С, глице­
рофосфатом, то будет индуцироваться образование костной и хряше88
вой ткани и т.д.;
- при предварительной адаптации стволовых клеток к введению
в ткани, органы реципиента (в очаге имплантации наблюдается гипок­
сия, повышение температуры и иные факторы воспалительной реак­
ции организма) путем культивирования при пониженной концентрации
растворенного кислорода, при температуре 39-40°С и т.д.;
- при достаточности количества клеток и их адресной доставке в
поврежденную ткань (избыток клеток, как и их недостаток нежелате­
лен); предпочтительно локальное, а не системное введение клеток.
Распространен малоинвазивный способ доставки МСК с помощью сосу­
дистого катетера в сердце, печень, поджелудочную железу, почки, лег­
кие, головной мозг. Катетер вводится в бедренную, плечевую или сон­
ную артерии, а также в венозные, лимфатические пути, перитонеаль­
ную, плевральную полости, спинномозговой канал, желудочки голов­
ного мозга. Также осуществляется прямая инъекция клеток в повреж­
денную ткань и органы с помощью микрохирургической техники;
- при последовательном и повторном введении стволовых кле­
ток в поврежденную ткань. Например, при лечении инфаркта мио­
карда в сердечную мышцу вводят мононуклеары костного мозга на
3-7 сутки. Эти клетки способствуют ангиогенезу и улучшают морфо­
функциональные свойства миокарда. После формирования сосуди­
стого звена, на12-14 сутки, в период активизированного к регенерации
микроокружения миокарда приступают ко второму этапу - реконструк­
ции мышечной ткани путем трансплантации преадаптированных к кардиомиогенезу стволовых клеток.
Хранение стволовых клеток
Современные криогенные технологии позволяют сохранять ство­
ловые клетки при низкой температуре практически неограниченное
время. Более 95% клеток остаются жизнеспособными после 15-17 лет
хранения в жидком азоте при температуре -196°С. Наиболее прак­
тична и быстро развивается технология взятия и хранения пуповинной
крови, остающейся после родов. Пуповинная кровь содержит стволо­
вые клетки и может быть использована в последующем с целью ауто­
логичной либо аллогенной клеточной терапии.
Банки для хранения пуповинной крови подразделяются на:
- именные, принимающие на хранение пуповинную кровь конкрет­
ного ребёнка на случай, если самому ребёнку либо его ближайшим
родственникам понадобятся стволовые клетки для пересадки;
- банки-регистры клеток пуповинной крови, которые пополняются
за счёт безвозмездного донорства. Национальные банки-регистры
необходимы, прежде всего, для того, чтобы найти замену донорам кост­
ного мозга. При наличии примерно полумиллиона безымянных образ89
цов, полностью обследованных, проверенных, оттипированных, можно
будет помогать практически любому пациенту, уже не забирая костный
мозг у доноров, а извлекая соответствующий образец из хранилища.
Генно-клеточная терапия или терапия генетически модифици­
рованными клетками основывается на выделение из организма необ­
ходимого типа клеток и трансфекции их ex vivo генами, усиливающими
цитотоксичность, иммуногенность и иные фенотипические свойства.
Трансфекцию культуры клеток осуществляют с помощью вектора, несу­
щего необходимый функциональный ген и на заключительном этапе
производят трансплантацию модифицированных клеток в организм
пациента. Клинические испытания технологии генно-клеточной тера­
пии также проводятся в онкологической практике. При этом использу­
ются исключительно аутологичные, то есть взятые у самого пациента
клетки. Путем комбинирования технологий клеточной и генной терапии
получены опухоль-специфичные цитотоксические лимфоциты, активно
подавляющие рост и размножение атипичных клеток.
Клеточная иммунотерапия
Клеточная иммунотерапия рассматривается как одна из техноло­
гий клеточной терапии, направленная на усиление иммунокомпетент­
ности клеток больного организма. Технологии клеточной иммуноте­
рапии - клеточная вакцинация и адоптивная клеточная иммунотера­
пия чаще используются после лучевой или химиотерапии у онкологи­
ческих больных.
Клеточная вакцинация основана на выделении из организма паци­
ента антигенпрезентирующих (дендритных, ДК) клеток, нагружение их
in vitro антигенами, против которых необходимо усилить иммунный
ответ, а затем реинфузия их этому же больному. Активизация презен­
тации антигена соответственно усиливает клеточный иммунный ответ
на него. Именно таким образом при онкологических заболеваниях акти­
визируется противоопухолевый клеточный иммунитет, цитотоксичность
Т-лимфоцитов в отношении оставшихся опухолевых клеток после луче­
вой либо химиотерапии.
Дендритные клетки - это гетерогенная популяция антиген­
презентирующих клеток костно-мозгового происхождения. В основ­
ном используются мононуклеарные клетки, способные процессировать
чужеродные антигены и экспрессировать их совместно с HLA антиге­
нами. Суть технологии в следующем: проводится забор крови или аспи­
рата костного мозга у пациента, а также послеоперационного опухоле­
вого материала. В лабораторных условиях из стволовых и моноцитарных клеток дифференцируются ДК-клетки, они культивируются с опухо­
левым антигеном. Полученные из моноцитов незрелые ДК приобретают
способность фагоцитировать антигены. Процессированные антигены
90
направляются в эндосомальный компартмент и презентируются моле­
кулами главного комплекса гистосовместимости (ГКГ) класса II, или в
цитозоль и презентируются молекулами ГКГ класса I. После созре­
вания и активации ДК мигрируют во вторичные лимфоидные органы.
Созревание ДК сопровождается экспрессией на их поверхности рецеп­
торов и молекул, которые способствуют миграции ДК в лимфатиче­
ские узлы и презентации процессированных антигенов Т-лимфоцитам,
ответственным за клеточный иммунитет. В качестве антигена использу­
ются белки, выделенные из опухолевых клеток, например, тотальные
клеточные лизаты или белки теплового шока. Как альтернатива могут
быть использованы рекомбинантные белки или синтетические пеп­
тиды, моделирующие антигенные эпитопы опухолевых клеток. Таким
образом усипивается цитотоксичность Т-пимфоцитов, индуцируется
активный противоопухопевый клеточный иммунитет. Клеточные вак­
цины предполагают использование только аутологичных клеток крови
или костного мозга пациента. Активно разрабатываются и проходят
клинические испытания клеточные вакцины не только с целью тера­
пии онкологических заболеваний, но и туберкулеза, ВИЧ, вируса папил­
ломы человека, вируса простого герпеса и др.
Адоптивная (от англ. adopt-принимать) клеточная иммунотерапия
основана на использовании иммунных лимфоцитов. Предварительно
проводится идентификация ex vivo аутологичных или аллогенных
лимфоцитов с противоопухолевой активностью, их экспансия, раз­
множение и последующее введение пациентам совместно с факто­
рами роста, стимулирующими выживание и пролиферацию этих кле­
ток in vivo. Примером адоптивной иммунотерапии может являться
терапия цитотоксическими лимфоцитами, выделенными из опухоле­
вого инфильтрата и размноженными в культуре in vitro для после­
дующей реинфузии (TIL-терапия, tumour-infiltrating lymphocytes). Такие
клоны Т-лимфоцитов более активно инактивируют опухолевые клетки.
Успешную клиническую апробацию подобная адоптивная иммуноте­
рапия прошла в онкогематологии (больные с острыми и хроническими
лейкозами, лимфомами, множественной миеломой). В другом вари­
анте адоптивной клеточной иммунотерапии используются лимфо­
циты, активированные интерлейкином 2 (1L-2) ex vivo (LAK-терапия).
Одновременно ex vivo выполняется Т-клеточная деплеция, т.е. целе­
направленное ингибирование клонов Т-лимфоцитов, ответственных
за развитие реакции трансплантат против хозяина (РТПХ). Кратность
введения пациенту суспензии клеток составляет в среднем 4-5, поэ­
тому при адоптивной иммунотерапии существует опасность развития
РТПХ (рис.10).
91
Рис.10. Схема адоптивной иммунотерапии при трансплантации печени.
Предварительно из донорской печени извлекаются лимфоциты и ex vivo
индуцируются ИЛ-2 с деплецией регуляторных Т-лимфоцитов.
Тканевая инженерия
Технология тканевой инженерией направлена на восстановление
структуры и функции больного органа или поврежденной ткани in vitro.
Она основана на использовании методов молекулярной биологии, ген­
ной инженерии и культивирования тканевых клеток in vitro, применении
каркаса (матрицы) из искусственного или естественного материала,
повторяющего структуру конструируемого органа или ткани, позволяет
наращивать в лабораторных условиях тканевой конструкт или графт.
Это самостоятельное направление биомедицинской технологии,
позволяющее на основе применения принципов и методов биоинжене­
рии, создавать конструкты с целью замещения, восстановления функ­
ции поврежденных тканей и органов. Для этого in vitro, в биореакторе
со специальной питательной средой на матриксе наращиваются ство­
ловые клетки. Последние в условиях применения факторов роста - сиг­
нальных молекул пролиферируют и целенаправленно дифференциру­
ются в тканеспецифические клетки. Так создается биологический экви­
валент ткани (графт), с последующей имплантацией и приживлением
92
его в области тканевого дефекта у пациента (графтинг). Трехмерность
тканевой структуры и участие в ее регенерации совершенно различ­
ных клеток, включая тканеспецифические, клетки сосудистой сети и
сигнальные молекулы - этот комплекс факторов в целом определяет
задачи и сложности технологии тканевой инженерии.
Технология тканевой инженерии основана на использовании трех
компонентов:
а) стволовые клетки - источники тканеспецифических клеток,
в) факторы роста, б) матрикс.
Источники тканевых клеток- аутологичные и аллогенные гемопо­
этические и мезенхимальные стволовые клетки. Использование соб­
ственных клеток пациента для изготовления графта - основополагаю­
щий принцип тканевой инженерии, позволяющий избежать иммуноло­
гических проблем — отторжения пересаженного материала. Факторы
роста, наряду с непосредственной стимуляцией процессов пролифера­
ции и дифференциации, выполняют функции межклеточного взаимо­
действия, влияющие на формирование ткани. Они оказывают регули­
рующее влияние на организацию трехмерной пространственной струк­
туры конструируемой ткани in vitro, участвуют в передаче сигналов
клеткам, в процессе их роста, в реакциях иммунного распознавания и
развития воспалительных процессов. Это фактор роста тромбоцитов
(ТФР или PDGF); эпидермальный фактор роста (ЭФР или EGF); фибробластный фактор роста (ФФР или FGF); трансформирующий фактор
роста бета (ТФР-бета или TGFbs); фактор некроза опухолей альфа
(ФНО-альфа или TNFa), инсулиноподобный фактор роста IGF, фактор
роста эндотелия сосудов VEGF и др. Поэтому в технологии тканевой
инженерии при наращивании стволовых клеток обязательно приме­
няется индукция конкретными факторами роста, которые вносятся в
питательную среду, либо включены в состав матрикса. Питательная
среда для наращивания ткани in vitro содержит все необходимые орга­
ногены, минеральные вещества, обеспечивающие деление и поддер­
жание повышенной физиологической активности клеток.
Матриксы (каркасы, подложки) - это пористые, рассасывае­
мые структуры, изготовленные из естественных (напр., коллагена и
фибрина) или синтетических (напр., полигликолид, полилактид) поли­
меров. В случае инженерии костной ткани могут использоваться ауто­
логичные и аллогенные человеческие, а также животного происхожде­
ния деменирализованые кости. Они могут быть губчатыми пласти­
нами, гелями или очень сложными структурами с множественной систе­
мой пор и каналов, изготовленные с использованием новых технологий
обработки материалов. При этом матриксы должны иметь уникальную,
характерную для каждого типа ткани архитектонику. Используемые в
тканевой инженерии материалы должны быть биораспадающимися,
93
чтобы после имплантации медленно деградировать, и в конечном счете
быть замененными новой тканью. Матриксы должны быть не токсич­
ными, иметь хорошую биосовместимость.
Выбор матрикса для наращивания ткани in vitro значим по сле­
дующим позициям:
- архитектоника, структура материала, из которого изготовлен
матрикс влияют на дифференциацию наращиваемых на ее поверх­
ности клеток;
- матрикс необходим для получения трехмерной структуры нара­
щиваемой ткани.
Инженерия костной ткани
Наибольших успехов регенеративная медицина in vitro достигла
по наращиванию костной ткани и кожи. И, прежде всего, потому, что
они менее других требовательны к активному ангиогенезу в формиру­
ющейся ткани. При наращивании костной ткани in vitro в питательную
среду на поверхность матрикса наносится суспензия мезенхимальных
стволовых клеток и/или активированных эндогенных остеобластопо­
добных клеток, которые непосредственно участвуют в процессе нара­
щивания данной ткани. Клетки могут быть аутологичными или аллогенными. Вносятся факторы дифференцировки и роста клеток. Для каж­
дого пациента такие факторы подбираются индивидуально, с учетом
возраста и пола. Это трансформирующий фактор роста TGF-р, инсули­
ноподобный фактор роста IGF, фактор роста эндотелия сосудов VEGF
и др. Факторы роста вносятся в питательную среду, где наращивается
ткань либо они могут быть заранее включены в поры, нанесены на
поверхность матрикса. Кроме данных веществ в состав композицион­
ных материалов могут входить микро- и макроэлементы, а также дру­
гие молекулы (сахара, пептиды, липиды и т.д.), способные обеспечи­
вать стимуляцию и поддержание повышенной физиологической актив­
ности клеток в регенерирующей костной ткани. Культивирование клеток
в матриксах, в остеогенной среде приводит к формированию трехмер­
ных фрагментов костной ткани in vitro в течение 4-5 недель. Клетки, кос­
нувшиеся подложки с сорбированными молекулами белков матрикса
или волокон матрикса, начинают тут же реагировать на этот контакт,
меняя форму и перестраивая цитоскелет.
В качестве матрикса могут быть использованы губчатые и корти­
кальные кости различных животных, а также человека, не содержащие
жизнеспособные клетки; коллаген и костные сульфатированные гликозаминогликаны. Матрикс характеризуется необходимым в каждом
конкретном случае соотношением поверхности к объему, наличием
системы пор, и, что наиболее важно, требуемыми функциональными
и механическими свойствами. Изготавливаемый матрикс, по форме
94
строго соответствует форме будущей кости.
Остеопластические материалы (скаффолды), используемые в
качестве матрикса обладают следующими свойствами:
- биосовместимостью - хорошей переносимостью тканями;
- не вызывают в организме реакции отторжения и воспаления;
- биодеградирующей способностью - в течение определенного
срока они полностью резорбируются и их замещает вновь образован­
ная ткань;
- остеоиндуктивностью - способностью возбуждать остеогенез
в месте имплантации материала;
- пористостью, обеспечивающей проникновение в них наращи­
ваемых клеток и факторов роста, прорастание их образуемой кост­
ной тканью.
В ортопедии наряду с рассасывающимися каркасами (полиэфиры
полимолочной кислоты, полигликолевой кислоты и их сочетание),
используются биоинертные материалы (нержавеющие стали, окись
циркония, высокоплотный полиэтилен и др.) и биоактивные материалы,
стимулирующие рост ткани на их поверхности (к примеру, рост кости по
поверхности биоактивного материала) - это биоактивные виды стекла,
синтетическая гидроксиапатитная керамика и др.). Биораспадающиеся
полимеры больше применяются при восстановлении мягких тканей,
связок, так как механические свойства таких каркасов значительно
ниже, чем у кости.
Материалы использующиеся в ортопедии отличаются от биокомпо­
зитов, применяемых в технологии тканевой инженерии. Ортопедические
имплантанты в отличие от живой ткани не способны к самовосстановле­
нию, поддержанию кровоснабжения, к изменению строения и свойств
в ответ на воздействие среды тканевого микроокружения.
Инженерия кожи
В качестве матрикса используется коллагеновый гель, на поверх­
ности которого наращивается культура кератиноцитов (это клетки
поверхностного слоя кожи- эпидермиса), в глубине геля находятся
фибробласты (эти клетки формируют внутренний, дермальный слой
кожи). Фибробласты секретируют внеклеточные матричные белки, фак­
торы роста. Для усиления прочности в гель помещают биодеградируемую полимерную сеточку. Технология разработки искусственной кожи
состоит из следующих этапов:
- биоптат кожи донора проверяется на стерильность;
- в специальном устройстве кожа измельчается и подвергается
ферментативной обработке;
- из клеточной суспензии выделяются кератиноциты и фибро­
бласты;
95
- клетки культивируются в питательной среде, содержащей все
необходимые ростовые факторы;
- размноженные ex vivo культуры клеток помещаются в трехмер­
ную гелевую основу из коллагена (на поверхности кератиноциты, в глу­
бине геля -фибробласты);
- на последней стадии обработки трансплантат упаковывается в
стерильный пакет, готовый к использованию,транспортировке, крио­
консервации.
Предпочтительно использование аутологичного или аллогенного
коллагена, кератиноцитов и фибробластов; менее желателен ксеногенный материал.
Инженерия других тканей:
е- хрящевая ткань не имеет кровоснабжения, поэтому у такой ткани
почти нет способности к самовосстановлению. Технология восстанов­
ления хрящевой ткани заключается в следующем: забор у пациента
хондроцитов, их культивирование in vitro и имплантация на поражен­
ную составную поверхность. Но существуют трудности поддержания в
культуре дифференцированного фенотипа хондроцитов, стабильность
приживления их к поверхности хряща организма-хозяина;
- поджелудочная железа, клетки Лангерганса культивируются in
vitro на полимерных каркасах,с последующей аутотрансплантацией
созданного конструкта. Также технологически сложно поддержание
биологической активности панкреатических клеток в течение продол­
жительного периода времени ex vivo\
- печень, в биоинженерии ткани этого органа исследуются две
технологии: а) трансплантация гепатоцитов путем прямой иньекции,
т.е. клеточная терапия in vivo, б) выращивание гепатоцитов ex vivo,
на рассасывающихся полимерных каркасах, для создания конструкта,
который может быть либо имплантирован, либо использован для уда­
ления продуктов обмена веществ из крови in vitro, пропуская послед­
нюю через этот конструкт;
- почки, имеют место экспериментальные исследования по полу­
чению матрикса из полых микротрубочек, который имплантируется
стволовыми клетками; последние в присутствии факторов роста и диф­
ференциации пролиферируют до тех пор, пока полностью не покроют
внутреннюю поверхность трубочек. Впоследствии эти клетки диффе­
ренцируются в клетки почек, способные синтезировать некоторые
гормоны и участвовать в фильтрации крови;
- сердечно-сосудистая система, также выполнены эксперимен­
тальные исследования по выращиванию клапанов сердца и капилля­
ров in vitro, на матриксе с использованием стволовых клеток;
96
- мочевой пузырь, осуществлено успешное наращивание этого
полого органа в небольшом размере при помощи аутологичных ство­
ловых клеток;
- роговица глаза, для наращивания данной ткани использованы
аутологичные стволовые клетки, взятые из края роговицы. Выделенные
клетки культивированы на специальной питательной среде, спустя
неделю развилась группа клеток, а через 4 недели сформировалась
роговица диаметром 2 см. Таким же образом была наращена ткань
конъюнктивы, покрывающей роговицу снаружи.
Матрикс - это обычно биодеградируемый, индифферентный для
иммунной системы реципиента материал. Но иногда при воссоздани
полых трубчатых органов в качестве матрикса используют лишен­
ные жизнеспособных клеток участки аналогичных органов (кишеч­
ника, трахеи, мочеточников и мочевого пузыря), полученных от круп­
ных животных.
Проблемы тканевой инженерии обусловлены:
1. Недостаточной полнотой фундаментальных исследовний в дан­
ной области знаний. Это неполные знания о межклеточном взаимо­
действии, о функциональных связях клетки с тканевым микроокруже­
нием, осуществляемые сигнальными пептидами. А именно, их сопря­
женные, антагонистические или индифферентные взаимоотноше­
ния в процессе дифференциации и пролиферации тканевых клеток,
при формировании тканевого микрооркружения ex vivo и in vivo опре­
деляют успех тканевой инженерии. Неполностью исследованы меха­
низмы детерминации и последующей дифференциации стволовых кле­
ток в те или иные тканеспецифические клетки.
2. Несовершенством на данный период самой техники клеточной
терапии, техники создания тканевого конструкта.
В естественных условиях ткани организма характеризуются:
- определенной прочностью, создаваемой коллагеновыми волок­
нами, основным веществом (гликозаминогликаны, пептиды, молекулы
адгезии, другие низкомолекулярные соединения), фибробластами и
другими межклеточными веществами;
- капиллярным кровоснабжением, обеспечивающим доставку
питательных веществ и удаление метаболитов;
- присутствием аксонов нервных клеток, покрытых оболочкой из
шванновских клеток; наличием рецепторов вегетативной нервной
системы (адренергические и холинергические);
- наличием макрофагов, лимфоцитов, лейкоцитов и других клеток,
т.е. различными типами клеток, выполняющими специализированные
функции во всем организме, а не только в данной ткани. Получение объ­
емных васкуляризованных тканевых структур ex vivo остается непро97
стой задачей. Новые кровеносные сосуды прорастают в имплантат
медленно, в результате чего клетки испытывают кислородное голода­
ние и погибают. У большинства органов сосудистая сеть хорошо раз­
вита, и трудности с кровоснабжением ex vivo ограничивают возмож­
ности конструирования тканей. Наверное поэтому, по причине очень
малой потребности в васкуляризации более продвинуты в клинику тех­
нологии тканевой инженерии кожи, костей и хряща.
Проблема васкуляризации трехмерных тканеинженерных кон­
струкций, в настоящее время, решается применением следующих
методов:
- метод префабрификации — временное помещение созданной
в лаборатории тканеинженерной конструкции (графта) под кожу или
в мышцы пациента. Через некоторое время, когда сосуды прорастут
весь объем графта, его выделяют с сохранением сосудов и переносят
в область повреждения. Однако такой подход связан с нанесением
пациенту дополнительной операционной травмы;
- разработка биоискусственных сосудов на основе полимерных
микротрубочек, выстланных изнутри эндотелием. Такие микротрубочки
пронизывают всю толщу графта. Постепенно полимер рассасывается,
оставшийся эндотелий формирует новообразованные микрососуды в
графте;
- использование собственных сосудистых сетей децелюллированной ткани. В основе данной технологии лежит принцип сохранения име­
ющихся сосудов в бесклеточном матриксе, с последующим нанесе­
нием культуры эндотелиальных клеток, как на матрицу-носитель, так
и в сохраненное сосудистое русло;
- внесение в графт клеток, способных индуцировать формирова­
ние собственной капиллярной сети. Это клетки стенки сосуда - эндотелиоциты, перициты и сосудистые гладкие миоциты, а также так назы­
ваемые ангиобласты и эндотелиальные прогениторные клетки кост­
ного мозга и подкожного жира. Использование фибробластов в каче­
стве предшественников периваскулярных клеток (перицитов) повы­
шает плотность вновь образованной капиллярной сети в графте, воз­
можно благодаря повышенной экспрессии VEGF. Необходимо отме­
тить, что в отличие от данной клеточной технологии при генотерапев­
тическом ангиогенезе необходимо введение in vivo генов ангиогенеза
VEGF, PDGF-BB и др., способных индуцировать формирование в орга­
низме собственной капиллярной сети.
Также необходимо учесть то, что процессы регенерации в чело­
веческом организме даже в условиях «естественной репарации» огра­
ничены в своих возможностях. Так, при заживлении небольшой раны,
вновь образующийся кожный покров уже не содержит сальных и пото­
вых желез, нет волосяных фолликул. Кроме этих вспомогательных кле98
ток и при «естественной репарации» есть более существенная про­
блема восстановления иннервации регенерированной ткани.
3.
Осложнения, обусловленные реакцией организма против тран
плантата:
а) в клинике - это иммунологические реакции (отторжение), ана­
филаксия (сильная аллергия), эмболии (закупорки) и микроинфаркты
органов, токсические реакции организма на криопротектор;
б) в эксперименте - это образование опухолей, эктопический осте­
огенез, фиброзирование и образование рубцов, побочное действие
иммуносупрессоров.
Таким образом сущность тканевой инженерии состоит в том, чтобы
клетки, способные к активной регенерации и дифференциации посред­
ством факторов роста могли сформировать in vitro новую функциональ­
ную ткань необходимого типа. Это достигается с помощью матрикса,
созданного подобно структуре соответствующей ткани или органа. Для
того чтобы позволить ткани расти в трех измерениях, матрикс должен
иметь сеть микропор (особенно для формирования костного графта).
Порыдолжны быть соединены друг с другом, а отверстия между порами
должны быть диаметром не менее 100 мкм. Это необходимо для того,
чтобы клетки могли мигрировать по каркасу и способствовать росту
ткани на протяжении всего каркаса; это необходимо для ангиогенеза
внутри сети пор.
Экстракорпоральное оплодотворение
Если тканевая инженерия - это биомедицинские технологии в
регенеративной медицине, то экстракорпоральное оплодотворение врепродуктивной медицине; если объект тканевой инженерии-сома­
тические клетки, то при экстракорпоральном оплодотворении- поло­
вые клетки. При слиянии мужской и женской половых клеток получают
ex vivo гибридную клетку, с последующим ее размножением в эмбрион.
Суть метода состоит в следующем: яйцеклетку извлекают из орга­
низма женщины и оплодотворяют in vitro сперматозоидами; получен­
ный эмбрион содержится в условиях инкубатора, где он развивается в
течение 3-5 дней; после чего эмбрион переносят в полость матки, где
уже продолжается естественный процесс развития плода.
Яйцеклетки извлекают из фолликулярной жидкости трансвагиналь­
ной пункцией фолликулов яичника под контролем УЗИ. Обнаруженные
яйцеклетки отмывают от фолликулярной жидкости и переносят в чашки
Петри, либо планшеты с культуральной средой. Лабораторную посуду
с яйцеклетками помещают в инкубаторы, где они содержатся до опло­
дотворения. При невозможности получить яйцеклетки у пациентки
(отсутствие яичников, менопауза и пр.) могут испопьзоваться донор­
ские яйцеклетки.
99
Сперму извлекают путем эякуляции, аспирации содержимого эпидидимиса. Используют сразу же или криоконсервированные сперма­
тозоиды. Перед оплодотворением яйцеклетки сперматозоиды отде­
ляют от семенной жидкости. Для этого проводят многократное цен­
трифугирование спермы в культуральной среде. Возможно использо­
вание спермы донора.
Собственно оплодотворение проводят одним из двух способов:
инсеминацией in vitro или интрацитоплазматической инъекцией (ИКСИ)
сперматозоидов. При первом, более простом способе к яйцеклеткам,
которые находятся в питательной среде, добавляют суспензию сперма­
тозоидов. Сперматозоиды добавляют из расчета 100—200 тыс. на одну
яйцеклетку. В течение 2-3 часов один из сперматозоидов проникает в
яйцеклетку и тем самым оплодотворяет ее. При втором способе спер­
матозоид вводят в яйцеклетку «вручную» с помощью микрохирургиче­
ских инструментов. Нормально оплодотворившаяся яйцеклетка (зигота)
представляет собой в этот момент одну клетку с двумя пронуклеу­
сами. Оплодотворенная яйцеклетка инкубируется в С 02-инкубаторе
при температуре 37 °С и содержании 5-6 % С 02. В среду культивиро­
вания эмбрионов входят основные физиологические ионы (Na+, К+,
Са++, Mg++, CI-, СОа- и т. д.), энергетические субстраты (глюкоза, пируват, лактат), аминокислоты, часто витамины и белки сыворотки крови.
Через 4-5 суток формируется бластоциста, содержащая около 100 кле­
ток, далее развивающаяся в эмбрион. Перенос эмбриона в матку осу­
ществляют через 3-5 дней после оплодотворения яйцеклетки. Эмбрион
переносят в матку, проводя через шейку матки специальный эластич­
ный катетер. В течение культивирования эмбрионов возможно осущест­
вление дополнительных лабораторных мероприятий.
Криоконсервация эмбрионов - жизнеспособные эмбрионы замо­
раживают и хранят при температуре жидкого азота. В дальнейшем
эмбрионы могут быть разморожены и осуществлен повторный пере­
нос в матку для достижения беременности.
Осуществляется преимплантационная генетическая диагностика
с целью исключения наследственной патологии у эмбриона, до поме­
щения его в полость матки.
Технологии клеточных культур
Монослойные тканевые культуры, когда клетки адгезируются и
размножаются на поверхности матрацов либо флаконов, изготовлен­
ных из стекла (алюмоборосиликатное либо натрийсиликатное стекло) и
пластика (полистирол, поликарбонат, поливинилхлорид, тефлон). Реже
используются емкости с поверхностью из нержавеющей стали, титана.
Эти материалы химически инертны и обладают высоким отрицатель­
ным поверхностным зарядом;
100
Выращивание монослоя клеток на специальных носителях, сво­
бодно погруженных в жидкую питательную среду. В качестве носите­
лей, на которые адгезируется монослой клеток используют стеклянные
трубки, шарики, гранулы сефадекса, пластиковые зерна и др. В про­
изводственных условиях выращивание монослоя клеток часто про­
изводят на омываемых питательной средой стенках цилиндрических
вращающихся сосудов, помещенных в термостатируемые камеры - это
роллерное культивирование;
1. Чашка Колле, плоский флакон
с клетками на дне
2. Вращающаяся бутыль (круглый, сосуд)
с клетками на дне и стенках
3. Колонка с клетками на микроносителях
pH, давление, С 0 2, температура
система контроля и регенерации среды
компоненты питательной среды
стеклянные бусы
перистальтшеский насос
1. Культивирование в плоских флаконах (матрацах).
2. Культивирование во вращающихся бутылях, когда в каждый момент
времени 1520% поверхности бутыли покрыто питательной средой, а
клетки находятся попеременно то в среде, то в воздухе.
3. Культивирование в колонках на микроносителях, в качестве кото­
рых выступают плотно упакованные, не смещающиеся стеклянные
бусы диаметром 35 мм, стопка пластин и др., а питательная среда
омывает их, протекая сверху вниз.
Суспензионные культуры, когда клетки растут и размножаются
свободно в суспензии (в лабораторных и промышленных биореакто­
рах, во флаконах и колбах). Клетки в этих условиях размножаются, не
прикрепляясь к стенкам сосуда, находясь во взвешенном состоянии,
благодаря постоянному перемешиванию среды.
Для культивирования клеток человека и животных используются
питательные среды, содержащие в своей основе:
естественные компоненты - коагулянты (сгусток плазмы), би
логические жидкости (сыворотка, амниотическая и асцитическая жид­
101
кость и др.), тканевые экстракты (например, эмбриональный экстракт);
- синтетические компоненты - среда 199, среда Игла, ВМЕ, среда
Маккоя, среда RPM1,среда Финкера и др. Синтетические среды содер­
жат низкомолекулярные вещества, в их числе глюкоза, аминокис­
лоты, витамины и другие, необходимые для роста и размножения кле­
ток ингредиенты.
- комбинированные среды, когда к синтетическим компонентам
добавляют сыворотку, тканевые экстракты и др. Последние обеспе­
чивают растущие клетки гормонами (кортикоиды, инсулин, половые
гормоны, простогландины и др.), ростовыми факторами (эпидермаль­
ным, фибробластным, Т-клеточным, тромбоцитарным, опухоленекро­
тическим и др.) факторами адгезии (коллаген, фибронектин и др.) бел­
ками (альбумин, трансферрин и др.), микроэлементами, липидами и
другими БАВ (табл.9).
Таблица 9. Характеристика некоторых питательных сред для
культивирования
Название
Характеристика
Среды Игла:
Минеральные вещества,
аминокислоты (13 незаменимых), 6
водорастворимых витаминов, холин
MEM (minimal essential medium)
и инозит.
ВМЕ ( basal medium. Eagle)
Используется только с сывороткой,
так как в ней отсутствуют биотин,
витамин В12, ионы железа и
микроэлементы. Основа раствор
Эрла
Среда Дульбекко - ДМЕ
Содержит двойную концентрацию
аминокислот, глицин,
(двойная модификация среды Игла) серин, пируват, железо. При
использовании этой среды
необходим инкубатор с 10%
концентрацией С02
Среда Пскова - IMDM
Добавлены незаменимые
аминокислоты, биотин, витамин В12,
селенит натрия. В среду введен
(модификация среды Дульбекко)
HEPES и уменьшены концентрации
NaCI и NaHCO,.
Среда бессывороточная
Среда 199
Содержит широкий спектр
питательных веществ в невысокой
концентрации. Добавляют 5-20%
фетальной сыворотки.
102
Минеральные компоненты в этих средах подобраны так, что
раствор выполняет буферные функции, поддерживая постоянный
кислотно-щелочный баланс в процессе культивирования. Другим
важным условием культивирования является осмотическое давле­
ние. Оно определяется числом молей осмотически активных частиц
(ионов и неионизированных молекул), растворенных веществ на 1 кг
растворителя (осмоляльность) или на 1 литр раствора (осмолярность).
Диапазоны pH и осмоляльности, при которых происходит размножение
клеток, узки и варьируют в зависимости от типа клеток. Например, для
клонального роста диплоидных фибробластов человека WI38 опти­
мальны рН=7.30 + 0.15 и осмоляльность 285 + 40 мосмоль/кг, а для
фибробластов из эмбриона цыпленка 7.12 + 0.18 и 300 + 20 соответ­
ственно. Для поддержания pH в большинстве сред используется бикарбонатный буфер: НС03= COz + ОН, если выделяется углекислый газ,
увеличивается концентрация ОН. Если культивирование клеток осу­
ществляется не в С02инкубаторе, тогда pH поддерживать труднее и
необходимы альтернативные буферные системы.
Важнейшим компонентом сред для культур тканевых клеток явля­
ется сыворотка, благодаря содержанию в ее составе:
гормональных факторов, стимулирующих рост клеток и их фун
ционирование. Большинство ростовых факторов специфичны для кле­
ток на определенной стадии дифференцировки, действие других не
ограничено каким-либо одним типом клеток. Один и тот же тип кле­
ток может быть стимулирован различными ростовыми факторами.
Например, фибробласты размножаются в ответ на гормональный фак­
тор роста фибробластов, фактор роста эпидермиса, фактор роста, син­
тезируемый тромбоцитами . Все эти вещества являются митогенами
(стимулируют митоз). Другим важным фактором роста практически для
всех типов клеток является гормон инсулин. Из других гормонов наибо­
лее часто применяются глюкокортикоиды (гидрокортизон, дексаметазон), стероиды (эстрадиол, тестостерон, прогестерон) и гормоны щито­
видной железы (трииодтиронин). Гормоны стимулируют или подавляют
рост в зависимости от типа клеток и их плотности. Глюкокортикоиды,
например, влияют на пролиферацию клеток, изменяя их чувствитель­
ность к факторам роста;
- факторов прикрепления и распластывания клеток; к ним отно­
сятся коллаген и фибронектин, более специализированы хондронектин (адгезия хондроцитов) и ламинин (адгезия эпителиальных клеток);
- транспортных белков, переносящих гормоны, минеральные
вещества, витамины, аминокислоты, липиды (альбумин), ионы железа
(трансферрин). Поверхность большинства культивируемых клеток
содержит рецепторы, специфичные к альбумину, трансферрину и дру­
гим транспортным белкам.
103
Учитывая определенный риск вирусной контаминации животными
сыворотками входящими в состав питательных сред, интенсивно разви­
ваются технологии применения для культивирования клеток человека
бессывороточных сред (CellGroR Serum-free Media и др., рис.11). Вместо
животной сыворотки в их составе человеческий альбумин, рекомбинант­
ный человеческий инсулин и человеческий трансферрин, но нет факто­
ров роста и антибиотиков. Среды хранятся в условиях бытового холо­
дильника и предназначены для культивирования гематопоэтических
клеток, прогениторных клеток, Т-клеток, NK-клеток, клеток пуповинной
крови и др. В целом контроль качества питательных сред включает сте­
рильность, тест на эндотоксин, пирогенный тест и биологический анализ.
Рис. 11. Бессывороточные средыСе1Юго1% Serum-free Media (с сайта)
Технология получения клеточных линий
В питательную среду высевают клетки, добавляют факторы роста
и помещают в термостат, где при создании оптимальных условий про­
исходит адаптация клеток, их размножение с образованием суспен­
зионной или монослойной культуры клеток. В дальнейшем осущест­
вляется промывка с удалением нежизнеспособных клеток и пересев
жизнеспособных клеток в новые емкости со стерильной питательной
средой. Возможно применение в зависимости от задач самых различ­
ных платиковых емкостей (рис.12). В результате многократных пасса­
жей получают клетки, адаптированные к росту в культуре, обладаю­
щие уникальными свойствами. Они требуют соблюдения определен­
ных условий при культивировании и пересевах, а также особого тем­
пературного режима и газовой фазы (смеси кислорода и углекислого
газа). Для сохранения их подвергают криоконсервации в специальных
жидких средах, охлаждая по определенной программе, после чего хра­
нят в дьюарах с жидким азотом. Периодически культуры клеток раз­
мораживают, «разгоняют» (пересеивают, 3-4 пассажа в благоприят104
ных условиях) либо используют для исследований, затем их можно
повторно замораживать. Трудности получения культур клеток обуслов­
лены неспособностью многих клеток к росту вне организма, сложно­
стью подбора оптимальных питательных сред и ростовых факторов,
гормонов и другими причинами.
Кривая роста. После посева клеток во флакон они проходят ста­
дию адаптации, продолжительностью 2—24 ч (1ад-фаза), сменяющуюся
периодом экспоненциального роста (логарифмическая фаза). В конце
периода активного размножения клетки образуют плотную суспензию
либо монослой и входят в стационарную фазу, когда численность жиз­
неспособных клеток мало изменяется. Эти фазы характерны для всех
клеточных линий и позволяют получить воспроизводимые характери­
стики клеточных линии по продолжительности лаг-фазы, времени удво­
ения популяции в середине логарифмической фазы и насыщающую
плотность клеток в стационарной фазе. Воспроизводимость этих харак­
теристик возможна только при постоянстве условий культивирования.
Поведение и биохимические свойства клеток заметно различаются в
разные фазы роста культуры, так что важно контролировать и оптими­
зировать фазу логарифмического роста и стационарную фазу путем
внесения в культуральную среду специальных реагентов (ростовые
факторы, регуляторные белки). Форма кривой роста позволяет также
получить информацию о репродуктивном потенциале культуры.
Заражение культуры клеток. Существует опасность микробного
заражения культур, несмотря на применение антибиотиков и ламинар­
ных боксов. Как правило, инфицирование клеток сопровождается сни­
жением pH, хотя некоторые мицелиальные грибы могут индуцировать
увеличение pH. Заражение может привести также к помутнению среды,
появлению межклеточного грануляционного материала, обнаруживае­
мого при микроскопическом исследовании. Во всех этих случаях куль­
туральные сосуды изолируют, не вынимая пробки, и автоклавируют.
Заражение микоплазмами не выявляется визуально, и, поскольку оно
не приводит к изменению роста культуры, часто остаётся незамечен­
ным. Поэтому регулярно (один раз в 1 — 3 мес.) проверяют культуры
на наличие в них микоплазм, поскольку такое заражение значительно
изменяет биохимию клеток, их антигенные свойства и параметры роста
культуры. Предложено несколько методов выявления микоплазм, но
наибольшее распространение получил метод флюоресцентного окра­
шивания ДНК этих микроорганизмов в зараженных культурах тканевых
клеток.
105
а)
б)
в)
г)
Д)
Рис.12. Емкости для клеточных и тканевых культур (Sarstedt, Германия)
Матрацы (а), крышки с вентиляцией (б) и бутылки (в) для клеточных культур. Плашки
для клеточных культур на 96, 24 лунки с плоским или круглым дном (г). Чашки для
адгезивных и гидрофобных клеток, с сеткой для подсчета клеток (д).
Клеточные культуры в диагностике, получении вирусных вакцин
Прогресс в области вирусологии в значительной степени обуслов­
лен возможностью выращивать вирусы в культурах клеток. В резуль­
тате применения этих методов выяснилось, что вирусы способны не
только репродуцироваться в клетке, но могут также интегрировать с
клеточным геномом и приводить к изменению ее свойств.
Выращивание вирусов в культуре клеток имеет важное значе­
ние как для идентификации вирусов, так и для их использования в
получении противовирусных вакцин. Используют первичные, вторич­
ные, стабильные, перевиваемые и диплоидные клеточные культуры.
Первичные культуры получают при диспергировании ткани протеолитическими ферментами (трипсином, коллагеназой). Источником клеток
могут быть ткани и органы (чаще почки) эмбрионов человека и живот­
ных. Суспензию клеток в питательной среде помещают в так назы­
ваемые матрацы, бутыли или чашки Петри, где после прикрепления
к поверхности сосуда клетки начинают размножаться. Для зараже­
ния вирусами используют обычно клеточный монослой. Питательную
жидкость сливают, вносят вирусную суспензию в определенных разве­
дениях и после контакта с клетками добавляют свежую питательную
среду, обычно без сыворотки. Клетки большинства первичных куль­
тур могут быть пересеяны, такая культура называется вторичной. При
дальнейшем пассировании клеток формируется популяция фибробластоподобных клеток, способных к быстрому размножению, большая
часть которых сохраняет исходный набор хромосом. Это так называе­
мые диплоидные клетки. При серийном культивировании клеток полу­
чают стабильные перевиваемые клеточные культуры. При пассажах
появляются быстро делящиеся однородные клетки с гетероплоидным
набором хромосом. Стабильные линии клеток могут быть однослой­
106
ными и суспензионными. Однослойные культуры растут в виде сплош­
ного слоя на поверхности стекла, суспензионные — в виде суспензий
в различных сосудах с использованием перемешивающих устройств.
Существует более 400 линий клеток, полученных от 40 различных
видов животных (в т.ч. от приматов, птиц, рептилий, амфибий, рыб,
насекомых) и человека.
В зараженных клеточных культурах вирусы можно обнаружить: по
изменению морфологии клеток; цитопатическому действию, которое
может иметь специфический характер; появлению включений; путем
определения вирусных антигенов в клетке и в культуральной жидко­
сти; путем выявления вирусных нуклеиновых кислот в клетках мето­
дом молекулярной гибридизации или цитохимическим методом с помо­
щью люминесцентной микроскопии и другими способами. Клеточные
культуры позволяют наращивать биомассу вирусов при получении вак­
цин, при выделении и использовании их антигенов для разработки диа­
гностических тест-систем. Кроме того культуры клеток применяют для
диагностики и лечения наследственных заболеваний, т.е. эти клетки
предварительно наращиваются in vitro, а затем уже проводится диагно­
стика наследственного генетического дефекта. Культура клеток также
является неотъемлемым компонентом генно-инженерных технологий.
Клеточные культуры в тестировании новых лекарств
Наряду с фармакогеномикой и биоинформатикой клеточные куль­
туры применяются в тестирование и изучение механизма действия,
цитотоксичности различных веществ, которые могут быть использо­
ваны в качестве лекарственных препаратов. В настоящее время гепатоциты человека (PHHs) являются «золотым стандартом» клеточных
линий в тестировании ex vivo токсичности лекарственных средств. Эти
клетки получают из тканей трупов или доноров, при этом их жизнеспо­
собность сохраняется до 3-5 дней и количество их не может быть уве­
личено. Именно поэтому РНН-клетки являются достаточно дорогим и
ликвидным ресурсом. Разработка лекарственных препаратов - дли­
тельный и дорогостоящий бизнес. На получение одного лекарствен­
ного препарата требуется затратить несколько лет и около 1,3 милли­
арда долларов. Именно поэтому важным является раннее тестирова­
ние химического соединения, являющегося кандидатом в лекарствен­
ное соединение на цитотоксичность.
Разрабатывается технология получения и наращивания ex vivo
из стволовых клеток функционально активных гепатоцитов, и исполь­
зования их для скрининга лекарственных средств и моделирования
заболеваний печени.
Многие фирмы давно внедрили культуру клеток человека для экс­
пресс- скрининга лекарств, поскольку такие испытания более эконо107
мичны, оперативны и информативны. Кроме того, в последнее время на
культуре клеток изучают индивидуальные колебания чувствительности
индивидуумов к лекарствам (определение гипо- и гиперчувствитель­
ности). Широко применяется культура клеток при изучении хрониче­
ских повреждающих агентов, малых доз радиации, синергизма и анта­
гонизма лекарств.
108
IV. ТЕХНОЛОГИИ ПОЛУЧЕНИЯ БИОПРЕПАРАТОВ
В медицинской практике биопрепараты, полученные на основе
микроорганизмов, клеток и тканей растительного и животного проис­
хождения подразделяют на иммунобиологические препараты (вакцины,
аллергены, сыворотки, диагностикумы, бактериофаги), фитопрепа­
раты (настойки, экстракты,максимально очищенные и индивидуаль­
ные вещества), препараты крови (плазма, альбумин, тромбоцитарная
масса и др.), органопрепараты (высушенные, экстракты и максимально
очищенные органопрепараты, чаще из эндокринных желез животных)
и биогенные стимуляторы из растительной и животной ткани (листья
алоэ и агавы, ткань плаценты, печени и др.). Отдельная обширная
группа медицинских биопрепаратов - это антибиотики, ферменты и
аминокислоты, полученные микробиологическим синтезом.
Благодаря технологии рекомбинантных ДНК в лечебной практике
применяются терапевтические рекомбинантные белки, продуцируемые
генетически модифицированными микроорганизмами, трансгенными
растениями и животными. Это гормоны, цитокины, факторы сверты­
вания крови, колониестимулирующие факторы, генно-инженерные
вакцины и др.
Микробиологический синтез антибиотиков
К основной группе биопрепаратов по объему промышленного про­
изводства и применению относятся антибиотики. Антибиотики полу­
чают микробиологическим синтезом (макролиды, бета-лактамы, тетрациклины и др.), сочетанием микробиологического и химического син­
теза (обширная группа полусинтетических пенициллинов и цефалоспоринов), а также чисто химическим синтезом (фторхинолоны).
Для осуществления микробиологического синтеза антибиотиков
необходимы:
штамм- продуцент, соответствующий критериям, характериз
ющим промышленный микроорганизм. Это апатогенность, отсутствие
мутагенности и генотоксичности, способность быстро расти и размно­
жаться на питательной среде, не требовательность к субстратам куль­
тивирования, технологичность или хорошая адаптация к лаборатор­
ному и производственному технологическому процессу. Процесс полу­
чения микроорганизма - продуцента антибиотика начинается с селек­
ции из природных источников (почва, растения и другие объекты) анти­
биотикопродуцирующих микроорганизмов определенного вида. Затем
отбирается наиболее активный штамм, изучаются его биологические
свойства. При соответствии критериям, предъявляемым к промышлен­
ным микроорганизмам у селекционированного штамма путем направ109
ленного мутагенеза физическими и химическими мутагенами либо
генно-инженерной модификации многократно усиливается антибио­
тикопродуцирующая способность.
Известно, что микроорганизмы — продуценты в процессе мно­
гократного использования в технологическом процессе, в резуль­
тате систематических пересевов при поддержании рабочей культуры
нередко теряют антибиотикопродуцирующую активность, вследствие
спонтанных мутаций и фаголизиса. В результате спонтанных мутаций
штамм реверсирует в исходный малопродуктивный вариант. Фаголизис
обусловлен заражением из вне культуры микроорганизма-продуцента
бактериофагами;
- питательная среда, содержащая оптимальные концентрации
ингредиентов (источники азота, углерода, фосфора, минеральные
соли, витамины, метаболиты-предшественники антибиотика и др.).
Субстрат, используемый для подготовки питательной среды стандар­
тизирован. Питательная среда для получения маточной культуры во
флаконах и колбах в лаборатории и питательный субстрат, загружае­
мый в промышленный биореактор могут отличаться по ингредиентам,
по концентрации тех или иных компонентов;
- технологическое оборудование. Биореактор (ферментер) для
наращивания биомассы микроорганизма-продуцента. В процессе фер­
ментации в культуральной среде накапливается искомый антибиотик.
Далее нужны реагенты (органические растворители) и оборудование
(чаще колоночные хроматографы) для поэтапного выделения и очистки
антибиотика из культуральной среды; для стабилизации и хранения
необходимы лиофилизаторы или распылительные сушилки.
Технологический процесс получения разных антибиотиков путем
микробиологического синтеза принципиально одинаков. Типичным
примером является производство пенициллина. Штамм-продуцент
этого антибиотика - мицелиальный гриб Penicillium chrysogenum засе­
вается во флаконы и инкубируется при 25-27°С в течении 4-5 суток.
Полученная маточная культура, в основном содержащая споры мицелиального гриба рекультивируется в инокуляторах - лабораторных
емкостях большего объема, и уже затем после инкубации культуру
переносят в биореактор с питательным субстратом в соотношении 1:10.
Питательный субстрат содержит: кукурузный экстракт (2-3%), глюкоза
(2%), лактоза (1%), сульфат аммония и фосфаты (0,5-1%), а также
производные фенилуксусной кислоты, являющейся предщественником
антибиотика (0,3 - 0,6%). Лактоза обеспечивает полноценный синтез
антибиотика. Её потребление микроорганизмом - продуцентом начи­
нается в конце 1ад-фазы после накопления фермента лактазы, способ­
ной расщеплять данный субстрат.
В процессе ферментации соблюдается строгая асептика (посто110
ронняя микрофлора может продуцировать пенициллиназу, инактиви­
рующую синтез антибиотика). Ферментация длится до достижения в
культуральной среде нужной концентрации антибиотика. Интенсивный
синтез пенициллина начинается после накопления биомассы мицелия,
в стационарной фазе роста.
В процессе ферментации поддерживаются необходимая тем­
пература, pH среды, аэрация и гомогенизация. В динамике контро­
лируется концентрация ингредиентов питательной среды (источников
углерода, азота, фосфора, минеральных солей), активность продук­
ции антибиотика.
Источниками азота в питательном субстрате (соевая, кукурузная
либо пшеничная мука, кукурузный экстракт и др.) являются белки, поли­
пептиды и аминокислоты. Для многих микроорганизмов-продуцентов
антибиотических веществ легко усвояемыми формами азота служат
аминокислоты, непосредственно участвующие в метаболических про­
цессах микробной клетки. Они необходимы для синтеза клеточных
белков, они являются структурными компонентами некоторых анти­
биотиков. Наряду с аминокислотами востребованы неорганические
источники азота - аммонийные соли (нитриты и нитраты). Например,
биосинтез мицелиальными грибами пенициллина более активен в при­
сутствии в среде культивирования аммонийных солей (нитратов).
Источники углерода также оказывают существенное влияние на
метаболизм микроорганизмов и синтез антибиотиков. Для оптималь­
ной продукции мицелиальными грибами Penicillium chrysogenum того
же пенициллина необходимо присутствие в питательной среде глю­
козы и лактозы. Для синтеза бактериями рода Bacillus грамицидина С
в качестве источника углерода нужны глицерин и янтарная кислота.
Известные продуценты антибиотиков актиномицеты Streptomyces
griseus высокопродуктивны в присутствии глюкозы.
Столь же важно для максимальной продукции антибиотика стро­
гое соблюдение концентрации компонентов питательной среды. Так,
для синтеза актиномицетами Str. auerofaciens тетрациклина концентра­
ция глюкозы должна быть равна 50,0 мг/мл, а аммонийных солей - 2,4
мг/мл. Большие либо меньшие концентрации этих веществ в среде
культивирования снижают антибиотикопродукцию.
Фосфорсодержащие соединения также необходимы в составе
питательных сред. Одни группы промышленных микроорганизмов
активно продуцируют антибиотики при концентрации фосфора 10
мг/%, другие —при 20 мг/%. Антибиотикопродукция, равно как и актив­
ность роста штаммов зависит также от содержания в среде культиви­
рования макро- и микроэлементов (сера, марганец, магний, железо,
цинк, кобальт).
В синтезе антибиотиков существенна роль метаболитов111
предшественников. Это различные органические соединения, из кото­
рых на конечном этапе метаболического пути синтезируется антибио­
тик. При достаточной концентрации предшественников в питательной
среде антибиотикопродукция возрастает, при дефиците —снижается.
Например, при дефиците в питательной среде фенилуксусной кислоты
снижается синтез пенициллина мицелиальными грибами.
При постоянной аэрации и гомогенизации на поверхности среды
культивирования образуется пена, которая отрицательно влияет на
сам процесс ферментации и на антибиотикопродукцию. Для пеногашения используют различные поверхностно-активные вещества: рас­
тительные масла (соевое, подсолнечное), животный жир (лярд, кашалотовый жир), минеральные масла (вазелиновое, парафиновое), спирты и
высшие жирные кислоты, а также синтетические вещества (силиконы,
диазобуталкарбомил и др.).
В начальной (логарифмической) фазе развития культуры проис­
ходит рост и размножение микроорганизмов, накопление биомассы с
интенсивным потреблением основных компонентов субстрата (источ­
ников углерода, азота, фосфора и др.). Активная продукция антибио­
тика начинается в последующей (стационарной) фазе, когда увели­
чение биомассы прекращается. Антибиотик, в зависимости от вида
микроорганизма-продуцента либо накапливается внутри микробных
клеток, либо выделяется в межклеточную среду, в культуральную жид­
кость. Мицелиальный гриб продуцирует пенициллин во внеклеточное
пространство, поэтому антибиотик накапливается в культуральной жид­
кости. По окончании ферментации извлеченная из биореактора био­
масса путем мембранной фильтрации или центрифужной сепарации
разделяется на жидкую и твердую фазы. Мицелий гриба в дальнейшем
можно использовать в животноводстве как кормовую добавку, богатую
белками. Для последующего осаждения балластного белка, оставше­
гося в культуральной жидкости используется адсорбция солями алю­
миния, железа, цинка и другие способы. Дальнейший этап очистки
пенициллина осуществляется экстракцией органическими растворите­
лями из культуральной жидкости. В целях полной очистки антибиотика
от различных примесей его многократно переводят из одного раство­
рителя в другой с предварительным осаждением (кристаллизацией).
Такой прием носит название перекристаллизации. Для более глубо­
кой очистки применяется ионообменная и адсорбционная колоноч­
ная хроматография.
Штамм-продуцент стрептомицина Streptomyces griseus, относится
к почвенным актиномицетам. Посевной материал также готовится в
качалочных колбах, затем рекультивируется в лабораторной посуде
большего объема (инокулят), далее размножение продуцента в посев­
ном аппарате (лабораторные ферментеры), и только затем накоплен112
ная биомасса продуцента вносится в промышленный ферментер (соот­
ношение культуры продуцента и питательного субстрата 1:10). В каче­
стве питательного субстрата используется крахмал, соевая мука, куку­
рузный экстракт, сухие дрожжи, добавляются соли аммония, фосфора
и другие компоненты. Глубинная аэробная ферментация в течение 7-8
суток при 27-28°С. Затем следуют этапы очистки антибиотика, стаби­
лизации и сушки, проверки физико-химических констант и др.
Таким образом промышленное производство пенициллина, стреп­
томицина и ряда других антибиотиков осуществляется путем микро­
биологического синтеза и включает следующие стадии:
- селекция штамма сверхпродуцента антибиотика путем мутаге­
неза либо технологией рекомбинантной ДНК. Природные штаммы в
большинстве своем малоактивны и не могут использоваться для про­
мышленных целей. Поэтому для повышения их продуктивности приме­
няется технология направленного мутагенеза, позволяющая усилить
продукцию антибиотика. Эффективны мутагены физической природы
— ультрафиолетовое излучение, быстрые нейтроны и химические
вещества - в основном нитрозогуанидины. При получении штаммасверхпродуцента, наряду с физическими и химическими мутагенами,
используется технология рекомбинантной ДНК, нацеленная на усиле­
ние экспрессии гена, детерминирующего синтез антибиотика в клеткепродуценте (путем вставки генов сильного промотора, многокопийности плазмид, несущих целевой ген и др.);
- процесс биосинтеза в ферментерах начинается с загрузки аппа­
рата необходимым для роста биомассы гриба питательным субстра­
том. Его компонентный состав зависит от биологических свойств
штамма-продуцента. Затем из посевного аппарата вносится инокулят - культура мицелиального гриба Penicillium chrysogenum. Далее
процесс аэробной глубинной ферментации при контролируемой pH,
р02, температуре, гомогенизации и пеногашении. Антибиотик, явля­
ясь вторичным метаболитам, начинает синтезироваться только после
лимитации роста продуцента, в стационарной фазе);
- выделение антибиотика из культуральной жидкости и его очистка
вышеприведенными методами.
После выделения проверяется химическая структура, темпера­
тура плавления, молекулярная масс и другие физико-химические пара­
метры антибиотической субстанции.
Антимикробная активность антибиотика изучается по способ­
ности подавлять жизнедеятельность тест-штаммов в опытах in vitro,
и оценкой терапевтической эффективности препарата на лаборатор­
ных животных, зараженных тем или иным возбудителем инфекции.
Стандартизируется антибиотическая активность по способности задер­
живать рост тест-штаммов в жидкой либо на плотной питательных сре-
113
дах; выражается эта активность в условных единицах дозы (ЕД) пре­
парата - ЕД/мл и ЕД/мг. Например, за единицу антибиотической актив­
ности пенициллина принято считать минимальное количество препа­
рата, способное задерживать рост St.aureus, штамм 209 в 50 мл пита­
тельного бульона. Для стрептомицина за единицу активности принято
считать минимальное количество антибиотика, задерживающее рост
Е. coli в 1 мл питательного бульона.
Для оценки токсичности in vivo, антибиотик вводится эксперимен­
тальным животным в различных концентрациях внутривенно, внутрибрюшинно либо внутримышечно с последующим клиническим наблю­
дением и лабораторным анализом. Токсичность (в том числе генотоксичность) также оценивается на культуре клеток in vitro.
Антибиотической активностью обладают пептиды (содержат
30— 40 аминокислот), продуцируемые клетками животного и расти­
тельного происхождения, выделенные из микроорганизмов. Например,
молочнокислые бактерии Lactococcus casei продуцируют высокоактив­
ный пептид низин, широко применяемый в пищевой промышленности.
Ферментные препараты
Ферментные препараты подразделяются на:
1. Препараты животного происхождения:
- панкреатин, пензитал, мезим форте, панзинорм форте - Н, креон
и др.;
- фестал, дигестал, энзистал, панзинорм форте (в составе панкре­
атин, желчь, гемицеллюлазу и другие компоненты) и другие препараты.
2. Препараты растительного происхождения:
- нигедаза - липаза растительная (Nigella damascene)',
- вобэнзим - панкреатин , папаин, бромелаин, трипсин, химотрипсин, рутозид;
- меркэнзим - панкреатин, бромелаин, желчь;
- флогэнзим - бромелаин, трипсин, рутозид и другие препараты.
3. Препараты микробного происхождения:
- ораза - кислотоустойчивый комплекс протеолитических и амилолитических ферментов (из культуры гриба Aspergillus oryzae)',
- солизим - липолитический фермент, полученный из Penicillium
solitum\
- лонголитин - тромболитический препарат на основе фибринолитических ферментов мицелиального гриба Arthrobotrys longa,
- протосубтилин, фромаза, ренилаза -протеолитические фер­
ментные препараты из мицелиальных грибов, из бацилл;
лизостафин (диагностический препарат) - продуцент
Staphylococcus spp. и другие препараты.
4. Комбинированные и полиферментные ферментные препараты.
114
Актуальны полиферментные препараты, содержащие липолитические, протеолитические и амилолитические ферменты (в составе
подобных препаратов липаза, продуциремая бактериями родов
Bacillus и Pseudomonas, амилаза - плесневые грибы рода Rhizopus,
протеаза - плесневые грибы рода Aspergillus.p,nn системной энзимотерапии используют Вобэнзим, Флогэнзим и другие биопрепараты, пред­
ставляющие собой комбинацию гидролитических ферментов расти­
тельного и животного происхождения, оказывающих противовоспали­
тельное, фибринолитическое и иммунорегулирующее действия.
С целью усиления каталитической активности, повышения термо­
стабильности и устойчивости при хранении существуют методы хими­
ческой и биологической (изменение аминокислотной последователь­
ности, третичной структуры и др.) модификации ферментов.
В лечебной практике наиболее часто ферментные препараты при­
меняют:
- при воспалительных заболеваниях пищеварительной системы
(пепсин, панкреатин, абомин, а также препараты, содержащие в своем
составе несколько ферментов - фестал, дигестал и др.). Это ферменты
животного происхождения либо они продуцируются микроорганизмами
(дрожжевые и мицелиальные грибы);
- при гнойно-некротических процессах — ожоговые и раневые
поверхности, трофические язвы, пролежни, деструктивные процессы
в легких и бронхах. Это протеолитически активные ферменты - трип­
син, химопсин, химотрипсин, рибонуклеаза и др.;
- при инфаркте миокарада, тромбофлебитах и других заболева­
ниях с целью лечения и профилактики тромбообразования используют
фибринолитические ферменты - фибринолизин, стрептолиаза, урокиназа, тромболитин; при нарушении мозгового кровообращения и коро­
нарном атеросклерозе - цитохром С и др.
- ферментные препараты также применяют при онкозаболеваниях
(аспарагиназа при лейкозах). Применение в онкологической клинике
ферментов бактериальной природы - L-аспарагиназа (выпускается
в промышленных количествах и 1_-глутамин(аспарагин)аза для лече­
ния острых и хронических форм лейкозов и лимфогранулематозов.
В отличие от здоровых, опухолевые клетки не способны синтезиро­
вать соответствующие аминокислоты, необходимые для их роста и
размножения.
Помимо протеиназ, ряд других ферментов, в частности РНКаза,
ДМКаза, гиалуронидаза, коллагеназы, эластазы, отдельно или в смеси
с протеиназами используются при ожогах, для обработки ран, воспа­
лительных очагов, устранения отеков, гематом, келлоидных рубцов,
кавернозных процессов при туберкулезе легких и др. В состав проти­
вовоспалительных ферментов нередко включают антибиотики (неоми-
115
цин), обезболивающие средства (лидокаин, прометазин).
Важной и многообещающей областью энзимотерапии является
применение ингибиторов ферментов. Так, естественные ингибиторы
протеиназ (а,-трипсин, а,-химотрипсин, а-макроглобулин) нашли приме­
нение в терапии острых панкреатитов, артритов, аллергических забо­
леваний, при которых отмечается активация протеолиза и фибринолиза, сопровождающаяся образованием вазоактивных кининов.
С диагностической целью ферменты используют при разработке
тест-систем для определения содержания в организме глюкозы, моче­
вины, молочной кислоты, аминокислот, этанола, ацетальдегида, АТФ,
АДФ, полиненасыщенных жирных кислот, пенициллина, креатинфосфата и др.
Технология получения ф ерм ентов также как и антибиотиков осно­
вана на наращивании биомассы продуцента с последующим выделе­
нием и очисткой ферментов. При использовании в качестве продуцента
мицелиальных грибов эффективно поверхностное культивирование
на твердых питательных средах с последующим сбором мицелия с
поверхности питательной среды и выделения ферментов. В случае
же наращивания бактерий эффективно глубинное культивирование
в биореакторах.
При последующей очистке ферментов от бимассы микроорганиз­
мов вместо традиционной центрифужной сепарации культуральной
жидкости чаще используется мембранная тангециальная и микро­
фильтрация (рис.13). Преимущество не только в более эффективной
очистке, но и одноэтапности микрофильтрации, заменяющей два этапа
центрифужной сепарации (собственно сепарацию и предварительную
фильтрацию), также в снижение инвестиционных и эксплуатационных
расходов, повышение выхода фермента и упрощение последующих
этапов ее очистки и стабилизации. Важнейшие преимущества микро­
фильтрации перед традиционными способами очистки следующие:
- более высокая эффективность очистки ферментов, что повы­
шает выход продукта без ущерба для биологической активности;
- устраняется необходимость в предварительном фильтровании
через диатомовую землю или перлит, а с ней вместе и проблема уда­
ления отработанной фильтрующей среды. Также устраняется необхо­
димость приобретения и транспортировки фильтрующей среды и соот­
ветствующие расходы;
- при тангенциальной мембранной фильтрации проходящий поток
направлен вдоль мембраны, а не перпендикулярно к ней, как в фильтрпрессах. При необходимости такие фильтры легко очищаются мето­
дами безразборной мойки и стерилизации паром; - снижение расхо­
дов материальных и технических ресурсов.
116
В технологии получения ферментных препаратов очень важна ста­
билизация ее биологической активности. Достигается это не только с
помощью сушки и правильного хранения, но и использованием мето­
дов различных химических модификаций ферментной молекулы.
Рис. 13. Промышленная установка микрофильтрации
Фитопрепараты
Фитопрепараты - это группа экстракционных лекарств из расти­
тельного сырья, содержащих комплекс биологически активных соеди­
нений, максимально освобожденных от балластных веществ. Для их
производства используется более 500 видов лекарственных растений.
Лекарственные препараты растительного происхождения характери­
зуются многокомпонентностью функционального действия на организм,
«мягким» терапевтическим эффектом. Преимущество препаратов рас­
тительного происхождения именно в комплексном действии биоло­
гически активных соединений, обладающих противовоспалительным,
иммуномодулирующим, антиоксидантным и другими полезными свой­
ствами. Действующим веществом в растении может быть определен­
ное биологическое соединение, оказывающее основной терапевтиче­
ский эффект. Но чаще физиологический эффект достигается благо­
даря всему комплексу веществ, входящих в состав растения. Это раз­
личные сочетания по составу и концентрации алкалоидов, гликозидов,
дубильных веществ, сапонинов, флавоноидов, кумаринов и фурокумаринов, органических кислот, витаминов, эфирных масел, пектинов,
лигнанов и других биологически активных соединений. Кроме орга­
нических веществ растения обычно содержат комплекс минеральных
веществ - макроэлементов (калия, кальция, магния, кремния, фосфора,
железа и др.) и микроэлементов (меди, марганца, мышьяка, молибдена,
кобальта, никеля, цинка, йода и др.).
Фитопрепараты получают в основном из лекарственного расти­
117
тельного сырья, подвергнутого сушке с соблюдением условий, кото­
рые исключают разрушение содержащихся в них биологически актив­
ных веществ. Использование высушенного сырья несравнимо более
удобно, поскольку сухое сырье может быть заготовлено впрок и сохра­
няться в течение года и более, что позволяет обеспечивать им фарма­
цевтические предприятия круглогодично. Последнее обстоятельство
весьма важно с точки зрения организации плановой бесперебойной
работы предприятия. Высушенное лекарственное растительное сырье
на складах и предприятиях должно находиться в условиях, исключаю­
щих его отсыревание и порчу.
Перед экстракцией растительного сырья его сортируют, очищают
от примесей и измельчают. Наиболее удобная для экстракции степень
измельчения сырья - это фракция с размером частиц около 3-5 мм с
минимальным количеством растительной пыли. Измельчение расти­
тельной ткани облегчает процесс проникновения экстрагента и извле­
чения биологически активных веществ из биомассы. В этих целях при­
меняются различные устройства: мельницы, вальцы, дезинтеграторы,
дисмембраторы и др. При необходимости, методом ультрадисперги­
рования достигается очень тонкое измельчение с повреждением кле­
точных стенок. Это ускоряет процесс экстракции и полноту извлече­
ния экстрактивных веществ в несколько раз. Однако при этом значи­
тельно возрастает гидродинамическое сопротивление, особенно при
использовании водных растворителей, когда возможно разбухание рас­
тительного сырья.
Технология получения н а с то е к
Настойки, экстракты, максимально очищенные и индивидуаль­
ные препараты получают в следующей технологической последова­
тельности: получение вытяжки из растительного сырья; очистка; стан­
дартизация.
Для получения вытяжки применяются различные экстрагенты,
глубина очистки также различна - от содержания в экстракте комплекса
веществ до выделения индивидуального биологического соединения;
от простого отстаивания до хроматографического разделения.
Настойки представляют собой спиртовые, спиртово-эфирные
или водно-спиртовые извлечения из лекарственного растительного
сырья, попучаемые без нагревания и удаления данных экстраген­
тов. Полученные извлечения отстаивают не менее 2 сут. при темпера­
туре не выше 10 “С до получения прозрачной жидкости и фильтруют.
Настойки используются для приема внутрь и наружного применения.
Настойки никогда не готовят на воде и никогда не подвергают сгуще­
нию путем упаривания.
Мацерация или настаивание относится к наиболее простому спо118
собу получения извлечений, в течение многих лет являвшемуся основ­
ным методом изготовления настоек. Настаивание осуществляют сле­
дующим образом. Высушенное и соответствующим образом измель­
ченное сырье заливают в закрывающемся сосуде (настойнике) рассчи­
танным количеством экстрагента и настаивают при 15-20 °С при пери­
одическом перемешивании в течение 7 сут, если специально не ука­
зан иной срок. Затем образовавшуюся вытяжку сливают, оставшееся
в настойнике сырье тщательно отжимают с помощью пресса, промы­
вают небольшим количеством чистого экстрагента и вновь отжимают,
после чего отжатые вытяжки объединяют с основой.
Разработаны и применяются усовершенствованные технологии
мацерации:
- ускоренная дробная мацерация (экстрагент делят на порции и
сырье заливают этими порциями последовательно);
- мацерация с циркуляцией экстрагента (образующуюся вытяжку
периодически сливают из нижней части настойки и заливают в него
сверху);
- мацерация с центробежной экстракцией (осуществляется при
помощи фильтрующей центрифуги и заключается в прохождении экс­
трагента сквозь располагающийся по периферии слой растительного
сырья).
- сочетание мацерации с обработкой экстрагируемого раститель­
ного сырья ультразвуком либо импульсной кавитацией.
В качестве экстрагента чаще используют этиловый спирт различ­
ной концентрации, в зависимости, главным образом, от свойств экстра­
гируемого сырья. Концентрацию экстрагента всегда подбирают таким
образом, чтобы он в максимальной степени извлекал действующие и
в минимальной - балластные вещества.
Перколяция (вытеснение) основана на непрерывной фильтрации
экстрагента с заданной скоростью сквозь слой извлекаемого сырья
(термин «перколяция» произошел от латинского слова percolare, что
означает «процеживать»). При этом извлекаемые вещества перехо­
дят из сырья в экстрагент в результате их растворения и диффузии.
Вначале (до перколяции) высушенное и измельченное растительное
сырье смачивают равным количеством экстрагента, выдерживают в
таком состоянии 4-6 ч (за это время осуществляются капиллярная про­
питка сырья экстрагентом и образование концентрированного сока),
после чего укладывают порциями в емкость (перколятор) и заливают
доверху экстрагентом и вновь оставляют на 1-2 сут. Этот период необ­
ходим для создания плотного однородного слоя экстрагируемого мате­
риала без воздушных «мешков» (пустот), мешающих нормальному
течению процесса перколяции.По окончании настаивания открывают
нижний, спускной кран перколятора, регулируя его таким образом,
119
чтобы из перколятора за 1 ч поступала вытяжка, равная 1/24 или 1/48
части рабочего объема перколятора. При такой скорости прохожде­
ния (процеживания) сквозь растительное сырье экстрагент успеваете
максимальной степени обогатиться извлекаемыми веществами. Для
постоянного получения вытяжки в перколятор сверху подают чистый
экстрагент со скоростью, равной скорости истечения вытяжки из ниж­
него крана. Перколяцию продолжают до получения требуемого объ­
ема настойки.
Очистка настоек. Полученные настаиванием или перколяцией
вытяжки представляют собой мутные жидкости с большим или меньшим
количеством взвешенных частиц, требующие обязательной очистки.
Очистка настоек сводится к их отстаиванию при температуре не выше
8°С в течение нескольких суток. В этих условиях из вытяжек выпадают
осадки, в основном балластные вещества. Затем вытяжка фильтру­
ется. При фильтрации настоек фильтруемая жидкость должна быть
предварительно очищена от крупных остатков растительного сырья.
Стабильность настоек зависит от соблюдения технологии их про­
изводства на всех этапах, включая отстаивание и обработку холодом.
При низких температурах, особенно в условиях хранения, наблюда­
ется агрегация коллоидных частиц с образованием осадка. Фильтрация
позволяет удалить мелкие коллоидные частицы, находящиеся в рас­
творе и тем самым «снять опалесценцию». Для фильтрации настоек,
характеризующихся высоким содержанием коллоидных частиц, таких
как настойка пиона, настойка календулы, применяется двухэтапная
фильтрация, которая позволяет получать фильтрат необходимого каче­
ства. При этом глубинный фильтр первой ступени принимает на себя
основную грязевую нагрузку, увеличивая в 3-5 раз ресурс фильтра вто­
рой ступени. Мембранный фильтр второй ступени обеспечивает соот­
ветствие фильтрата требованиям к качеству продукта. Целью филь­
трации растворов, которые не склонны к агрегации коллоидных частиц
(например, муравьиный спирт), является осветление и удаление меха­
нических включений. Поэтому для очистки этих растворов допустимо
использовать одну ступень фильтрации через глубинный фильтр.
Ресурс, а соответственно и стоимость фильтрации 1 л жидкости
зависит от содержания в фильтруемой жидкости механических приме­
сей, характеристик используемого фильтра и от возможности регене­
рирования используемых фильтрующих элементов. Ресурс (количе­
ство жидкости, профильтрованной до забивания) фильтрующих эле­
ментов с учетом их регенерируемости может существенно отличаться
от ресурса без регенерации. Соответственно будут различаться и
затраты на фильтрацию.
Стандартизация настоек. Ценность настоек как лекарств должна
определяться по количеству действующих веществ. В большинстве
120
настоек содержание действующих веществ, так называемых основ­
ных субстанций или тех субстанций, которые считаются эффектив­
ными определяют химически (настойки, содержащие дубильные веще­
ства, алкалоиды, эфирные масла, органические кислоты и ряд других
веществ) или биологически (настойки, содержащие гликозиды сердеч­
ной группы и горькие вещества). В случае необходимости настойки
доводят до требуемого содержания действующих веществ или до соот­
ветствующей активности (выражаемой в единицах действия, ЕД) при­
бавлением чистого экстрагента или настойки с большим содержанием
действующих веществ.
Технологии получения экстр а кто в
Экстракты - это концентрированные извлечения из растительного
сырья, очищенные от балластных веществ. По консистенции различают
экстракты жидкие, экстракты густые, с содержанием влаги не более 25
%, экстракты сухие, с содержанием влаги не более 5 % и масляные
экстракты. Экстракты одного и того же растения могут содержать раз­
ные ингредиенты и в различной концентрации в зависимости от того,
какой растворитель применялся, какая технология была использована.
Вспирте растворяются одни субстанции, в масле другие, а в воде - тре­
тьи. Так, масляное извлечение из травы сушеницы оказывает раноза­
живляющее действие, т.к. содержит значительное количество каротиноидов, а водное извлечение (настойка) обладает гипотензивным дей­
ствием из-за присутствия флавоноидов. Отвар и настойку корневищ
аира используют как горечь (средство, стимулирующее работу желез
пищеварительного тракта), а порошок корневищ этого растения пода­
вляет секрецию желудочного сока.
При изготовлении жидких экстрактов полученные извлечения
отстаивают не менее 2 суток при температуре не выше 10° С до полу­
чения прозрачной жидкости и фильтруют. Извлечения для густых экс­
трактов освобождают от балластных веществ осаждением спиртом,
применением адсорбентов, кипячением и другими способами с после­
дующим фильтрованием. Очищенные извлечения сгущают выпарива­
нием под вакуумом до надлежащей консистенции.
Сухие экстракты получают высушиванием густых экстрактов или
непосредственно из жидких экстрактов, используя технологию рас­
пылительного высушивания. Густые и сухие экстракты, так называе­
мые экстракты-концентраты используют в аптечной сети как исходный
материал для приготовления в аптеке жидкого экстракта и настойки
путем растворения в соответствующем объеме воды.
Масляные экстракты получают двумя способами:
непосредственно экстрагированием сырья маслом. Для экстра
ции лекарственного сырья применяют растительные масла: подсол121
нечное, соевое, арахисовое. Полученную масляную вытяжку охлаж­
дают, сливают в отстойник, одновременно процеживая через марлю,
а остаток пропитанного маслом сырья отжимают под прессом, лучше
всего гидравлическим. Отжатую вытяжку сливают в тот же отстойник.
После отстаивания в течение 1-3 суток экстракт фильтруют в стериль­
ные емкости;
предварительным экстрагированием сырья органическим ра
творителем с последующим переводом извлеченных веществ в масло.
Масляные экстракты можно получать и перколяционным методом,
используя в качестве экстрагента 70% спирт, содержащий 1 % рас­
твор аммиака. Спиртовое извлечение фильтруют, смешивают с рав­
ным количеством подсолнечного масла, отгоняют спирт под вакуумом,
разбавляют полученный концентрат подсолнечным маслом до требу­
емой концентрации, отстаивают и фильтруют.
К традиционным относятся технологии экстрагирования с исполь­
зованием жидких растворителей. Это статические способы (мацера­
ция и ее варианты), когда сырье периодически заливают экстрагентом
и настаивают определенное время. При динамических способах (пер­
коляция и ее варианты) предусматривается постоянная смена либо
экстрагента, либо экстрагента и сырья. Среди динамических способов
особо выделяют непрерывные (с непрерывной подачей сырья) - пря­
моточные (экстрагент и сырье в одном потоке) и противоточные (актив­
ное движение навстречу экстрагента и растительного сырья).
Широко распространенные способы экстракции сырья, основан­
ные на процессах перколяции и мацерации с использованием органи­
ческих растворителей, спирта позволяют выделить не более 15-25%
биологически активных веществ, находящихся в лекарственном рас­
тении. При таких способах выделения биологически активных веществ
в экстрактах вместе с ними попадает достаточно большое количество
балластных веществ (смолистые вещества, терпены, углеводороды,
клетчатка, волоски растений). Эти вещества, с одной стороны, могут
обладать сами отрицательным действием на организм. С другой сто­
роны, они способствуют образованию различных комплексов, которые
связывают биологически активные вещества и выводят их из экстрак­
тов. Несмотря на вышеуказанные издержки, малая энергоемкость и
определенная рентабельность позволяют и в настоящее время широко
использовать эти технологии.
В одно-спиртовая экстр а кц и я заключается в промывании рас­
тительного сырья 60-80% водным раствором спирта. Часть содер­
жащихся в растительном сырье ценных веществ, не растворимых в
спирте, остается, тогда как прочие компоненты растворяются и уда­
ляются. Полученный концентрат затем нейтрализуют и высушивают.
122
Масляная экстракция чаще осуществляется подогретым расти­
тельным маслом. Его пропускают через сырье, в процессе чего жиро­
растворимые вещества из сырья переходят в растительное масло. Но
в технологии получения масляных экстрактов трудно достигнуть высо­
ких выходов биологически активных веществ, поскольку из-за высокой
вязкости экстрагентов и малых коэффициентов диффузии скорость
массообменных процессов и степень извлечения активных веществ
чрезвычайно мала. Кроме того, из сырья нельзя извлечь ценные водо­
растворимые вещества. Но следует отметить, что масла, являясь липофильными растворителями, позволяют экстрагировать целую группу
ценных жирорастворимых компонентов, содержащихся в растительном
сырье, таких как каротиноиды и стероиды, токоферолы, ретинол, хло­
рофилл, целый ряд ненасыщенных жирных кислот, витамины К и D
(кальциферол), глюкозиды, эфирное масло.
С02-экстракция. Экстрагирование биологически активных сое­
динений из растительного сырья сжиженным диоксидом углерода (С02
- экстракция) подразделяется на докритическую и сверхкритическую
технологии. Докритическая С 02-экстракция осуществляется при дав­
ление ниже 70 атм. и температуре экстрагирования 15-27°С, а сверхкритическая —при давлении свыше 70 атм. и температуре 50-80°С.
Докритическая С 02-экстракция более щадящая, нежели условия
сверхкритического воздействия на извлекаемые из растительного
сырья биологически активные соединения. Вместе с тем при сверхкритической С02-экстракции спектр выделяемых из растительного сырья
биологически активных соединений гораздо шире, чем при примене­
нии традиционных экстрагентов (табл.10).
Таблица 10. Количество выделенных биологически активных
веществ из календулы различными методами экстракции
Количество выделенных БАВ
Экстрагент
Сверхкритическая С 0 2-экстракция
77
28
Растительное масло
8
Пропиленгликоль (органический
растворитель)
26 (жиров нет)
Водно-спиртовая экстракция
При С02- экстракции полученные экстракты не содержат балласт­
ных веществ в отличие от традиционных технологий. В среде угле-
123
кислого газа, при высоком барометрическом давлении контаминация
экстракта посторонними микроорганизмами резко ограничена. Но С02экстракция энергоемкая, более затратная технология в сравнении с
традиционными технологиями.
После завершения процесса экстракции (органическими раство­
рителями, СОг-экстракцией и др.) осуществляется фракционирование
сложных смесей полученных экстрактов:
- последовательным выводом из экстракта фракций от самой лег­
кой до максимально тяжелой, что наилучшим образом подходит для
выделения в чистом виде индивидуальных фото- и термолабильных
соединений;
- последовательной обработкой образца растительного сырья
одним экстрагентом в нескольких технологических режимах. При этом
экстрагируются различные по физико-технологическим параметрам
биологические вещества из экстракта.
Если первый способ выделения более технологичен, то второй
значительно доступнее и чаще используется на практике, так как для
большинства растительных экстрактов допускается в составе какое-то
количество близких по структуре сопутствующих веществ.
Балластные вещества из экстракта удаляются путем:
- осаждения, достигаемого сменой растворителя, высаливанием,
применением солей тяжелых металлов;
- жидкостной экстракции, в основе которой лежит переход бал­
ластного вещества из первой жидкости, содержащей биологически
активные вещества растений в другую, не смешивающуюся с первой;
- сорбции - активного поглощения балластного вещества из экс­
тракта сорбентом. Наиболее распространенными сорбентами явля­
ются активированные угпи, окись алюминия, различные ионообмен­
ные смолы.
Перколяция алкалоидов. Для выделения из лекарственного рас­
тения алкалоидов применяются периодическая и непрерывная пер­
коляция. При периодической перколяции растительное сырье, загру­
женное в экстрактор обрабатывается растворителем с добавлением
незначительного количества уксусной, лимонной либо иной кислоты
для образования солей алкалоидов. По окончании процесса экстра­
гирования, из экстракта путем фракционирования выделяются соли
алкалоидов. При выделение алкалоидов в виде свободных основа­
ний, вместо кислот растительное сырье дополнительно обрабатыва­
ется подходящим для данного растения раствором щелочи (аммиак,
сода, едкий натр) и затем осуществляется перколяция.
При непрерывной перколяции экстрагент в определенном объеме
постоянно подается в экстрактор, а экстракт в том же объеме сливается
124
из емкости через нижнее выходное отверстие. Обычно используется
несколько последовательно установленных («батарея») экстракторовперколяторов, загруженных сырьем и через которые поэтапно прохо­
дит все более насыщающийся биологически активными веществами
экстракт.
С целью дальнейшей очистки и выделения соли алкалоидов осаж­
даются из экстракта подщелачиванием или извлекаются соответству­
ющим органическим растворителем (бензолом, амиловым спиртом,
эфиром), не смешивающимся с водой. Такую обработку часто прово­
дят многократно.
В качестве экстрагентов в технологии перколяции алкалои­
дов предпочтительна вода либо спирт. Нежелательное явление при
использовании этих растворителей - это попутное растворение бал­
ластных веществ (белки, смолы, дубильные вещества и др.), присут­
ствие которых затрудняет последующее выделение алкалоидов из
таких растворов.
В случае спиртовых экстрактов по окончании экстрагирования
спирт удаляется отгонкой на водяной бане, а загустевший экстракт раз­
бавляется водой и фильтруется. В последующем из фильтрата выде­
ляются алкалоиды.
Далее фракционируются алкалоиды на отдельные группы путем
применения разных экстрагентов при разных температурных режи­
мах. Более тонкая очистка осуществляется адсорбционной колоночной
хроматографией. При прохождении экстрагируемого раствора через
колонки смесь алкалоидов осаждается на сорбенте. Затем соответ­
ствующим экстрагентом с сорбента извлекается конкретная фракция
алкалоидов. При извлечении алкалоидов из водных или спиртовых
экстрактов также возможно адсорбирование их природными глинами
либо искусственными смолами.
Экстракторы
К типичным экстракторам периодического действия, основан­
ным на применение жидких экстрагентов (органические ратсворители,
водно-спиртовые и спиртовые вытяжки, растительное масло) относятся
экстракторы ступенчатого (батарейного) типа. Они состоят из отдель­
ных емкостей (диффузоров), соединенных между собой коммуникаци­
ями, по которым в каждый диффузор подводится подогретая до опре­
деленной температуры экстрагирующая жидкость (органический рас­
творитель, спирт, вода, масло) и выводится экстракт. В каждый диф­
фузор через верхнее отверстие загружается подготовленное расти­
тельное сырье, подлежащее экстрагированию, а через нижнее выгру­
жается экстракт.
Существуют конструкции экстракторов, основанные на техноло-
125
гиях противоточной экстракции, градиентной экстракции, вихревой экс­
тракции, циркуляционной экстракции, экстракции в сочетании с филь­
трацией, экстракции с использованием электромагнитных колебаний и
ультразвука, электроплазмолиза, электродиализа и др. При этом под­
бирая полярность растворителя, можно варьировать спектр извлека­
емых веществ или делить экстрактивные вещества на фракции.
Например, ускоряется и становится более эффективной по сте­
пени извлечения биологических соединений технология экстраги­
рования высушенного растительного сырья водой при температуре
40-60°С с одновременным воздействием на экстрагируемую смесь уль­
тразвуковых колебаний с частотой в пределах 100-150 кГц. Этот спо­
соб обеспечивает получение экстракта высокой степени прозрачно­
сти без потерь вкусо-ароматических соединений и без компонентов
с неприятным горьким или вяжущим вкусом. При этом одновременно
осуществляется стерилизация экстракта благодаря действию ультра­
звуковых волн.
Для интенсификации процесса экстракции применяется кавитаци­
онная технология получения экстрактов из растительного сырья, осно­
ванная на применении роторного аппарата. Импульсное возбуждение,
кавитация повышает степень диспергирования сырья, ускоряет экстра­
гирование из него фенольных соединений, аминокислот, минераль­
ных веществ. При этом уменьшаются потери спирта, нет необходимо­
сти подогревать смесь, упрощается технологическая схема получения
спиртовых экстрактов из растений.
Циркуляционная экстракция позволяет с наименьшей затратой
времени и растворителей получить достаточно концентрированные
вытяжки. Технология основана на многократном экстрагировании мате­
риала чистым экстрагентом. В качестве экстрагента используют лету­
чие органические растворители, имеющие низкую температуру кипе­
ния - эфир, хлороформ, метилен хлористый или их смеси. Этиловый
спирт (даже 96%) для этих целей непригоден, так как он будет адсор­
бировать влагу, содержащуюся в сырье и изменять свою концентра­
цию, что приведет к изменению температуры кипения и экстрагирую­
щей способности.
Непрерывное противоточное экстрагирование заключается в
перемешивании сырья и экстрагента. Растительный материал при
помощи транспортных устройств перемещается навстречу движуще­
муся экстрагенту, т.е. сырье, непрерывно поступающее в экстракци­
онный аппарат, движется противотоком к экстрагенту. При этом све­
жее сырье контактирует с выходящим, насыщенным экстрактивными
веществами экстрагентом, который еще более насыщается, так как в
сырье концентрация еще выше. Истощенное сырье экстрагируется све­
жим экстрагентом, который еще полнее извлекает оставшиеся экстрак126
тивные вещества. С точки зрения теории экстрагирования этот способ
наиболее эффективен, так как в каждый момент процесса и в любом
поперечном сечении по длине (или высоте) аппарата имеет место раз­
ность концентраций биологически активных соединений в сырье и экс­
трагенте, что позволяет с наибольшим выходом и наименьшими затра­
тами проводить процесс. Технологический процесс автоматизирован,
минимизированы трудоемкие работы по загрузке и выгрузки сырья из
перколяторов.
Технология вихревой экстракции основана на вихревом переме­
шивании смеси сырья и экстрагента при помощи турбинной мешалки
со скоростью 8000-10000 об/мин.
Принцип работы С02-экстрактора производственной установки
состоит в следующем: подготовленное растительное сырьё загру­
жают в емкость аппарата, надевают самоуплотняющиеся люки, кото­
рые «запирают» подачей в емкость газообразного С02. Наряду с меха­
ническим измельчением высушенного сырья, внедряются технологии,
основанные на криодроблении, т.е. измельчении растений до пыле­
видного состояния в жидком азоте. Сырье подогревается до необходи­
мой для экстракции температуры, из специального резервуара пода­
ется сжиженный диоксид углерода, затем в емкости создается рабочее
(докритическое либо сверхкритическое) атмосферное давление. После
повышения атмосферного давления и нагрева диоксид углерода уже в
жидком состоянии протекает через сырьё в экстракторе и растворяет
экстрагируемые биологически активные соединения. Экстракт посту­
пает затем через клапан и теплообменник в сепаратор. Путём измене­
ния параметров давления и/или температуры растворяющая способ­
ность С02резко уменьшается, поэтому растворённые ранее вещества
выпадают в осадок и накапливаются в сепараторе. Газообразный С02
из сепаратора попадает в конденсор, где вновь сжижается, откуда он
затем снова попадает в сборный резервуар и процесс повторяется.
Диоксид углерода подвергается повторному сжижению и циркуляции
до тех пор, пока процесс экстракции не будет завершён.
На рисунке 14 представлен общий вид С02-экстрактора. Установка
предназначена для проведения как докритической, так и сверхкритической СОг -экстракции растительного сырья в диапазоне давлений
5-40 МПа с температурой экстракции 20 - 90° С и расходом С02до 2
л/мин. Контроль и управление давлением и температурой в магистра­
лях низкого и высокого давления осуществляются блоком управления
и индикации, который может работать как в ручном так и в автоматиче­
ском режиме . Управление расходом С02осуществляется дроссель­
ным клапаном с ручным регулированием. Величина расхода С02опре­
деляется относительным временем работы компрессора. Режим экс­
тракции - циркуляционный по замкнутому контуру. Разделение раство127
ренных при сверхкритическом экстрагировании веществ на экстракт и
газообразный С 0 2происходит в отдельной конструкции - рекуператоре.
Газообразный диоксид углерода оттуда подается через дисковый кран
в конденсатор, где происходит его конденсация. Температура экстракта
в емкости экстрактора дополнительно контролируется термометром,
вмонтированным в крышку аппарата. Основное требование к экстрак­
тору - обеспечить эффективность, т.е. используя минимальное количе­
ство экстрагента Максимально извлечь биологически активные веще­
ства из растительного сырья за минимальное время рабочего цикла,
включая затраты времени на перезагрузку экстрактора.
Рис. 14.Экстракторы производственной установки
(3 экстрактора, включая автоматическую крышку с быстродействующим
зажимом; емкостью по 500 л. при 500 бар экстракционного давления)
Э кс тр а ге н ты
Для экстрагирования лекарственного растительного сырья при­
меняют в основном органические растворители (ацетон, пропиленгликоль, гексан и д р .), этиловый спирт различной концентрации, расти­
тельное масло. Для экстракции неполярных и малополярных веществ
из растительного сырья используются сжиженные газы: двуокись угле­
рода (С02-экстракция), пропан (СэНв), бутан (С4Н10), хлор и фторсодер­
жащие углеводороды (хладоны, С(Н, Cl, F)2n+2). Очень низкая вязкость
сжиженных газов в отличие от органических растворителей, способ­
ствует большей ээфективности при выделении из растительного сырья
биологических соединений. Они химически индифферентны по отно­
шению к извлекаемым из перерабатываемого сырья веществам. Низкие
значения теплоты парообразования и температуры кипения сжижен­
ных газов указывают на сравнительно малые энергозатраты, требуе­
мые на испарение и конденсацию. Это позволяет быстро удалять газ
из экстрактов уже при незначительном температурном воздействии и
128
регулировать температуру отгонки растворителя. Мягкие температур­
ные условия испарения растворителей из экстрактов также благопри­
ятствуют сохранению от разрушения термолабильных соединений.
В фармпроизводстве наиболее распространено использование
сжиженной двуокиси углерода, так называемая СОг-экстракция. С02экстракция проводится в условиях высокого атмосферного давле­
ния (докритические условия - давление ниже 70 атм. и сверхкритические условия - давление выше 70 атм.)с получением широкого спектра
биологически активных соединений из экстрагируемого растительного
сырья. Модифицируя метод применением вспомогательных раствори­
телей (увеличивая полярность экстрагента) можно увеличить выход
экстрактов за счет извлечения полярных соединений. При сверхкритической С02-экстракции, варьируя термодинамическими и техноло­
гическими параметрами, можно получать из одного сырья различные
по составу и свойствам продукты.
Фторсодержащие сжиженные газы - хладоны используют для
извлечения эфирных и жирных масел, производных кумаринов, каротиноидов, токоферолов, сесквитерпенов, терпеноидов, стеринов, алка­
лоидов и ряда других биологически активных соединений из лекар­
ственных растений. Но эти газы не способны извлекать водораствори­
мые вещества (полисахариды, белки, фенольные соединения и др.).
Экстрагент должен обладать: а) избирательной (селективной) рас­
творимостью; б) высокими диффузионными способностями, обеспечи­
вающими хорошее проникновение его через поры частичек раститель­
ного материала и стенки клеток; в) способностью препятствовать раз­
витию в вытяжке посторонней микрофлоры; г) летучестью, возможно
низкой температурой кипения, легкой регенерируемостью.
Таким образом, основное назначение экстрагента - избирательно
извлечь комплекс действующих веществ, не извлекая при этом бал­
ластные вещества, или, наоборот, извлечь только последние, чтобы
после их удаления из сырья можно было выделить необходимые дей­
ствующие вещества. В связи с этим процесс экстракции осуществля­
ется не одним, а несколькими растворителями на отдельных стадиях
технологического процесса, смесью растворителей и комбинирован­
ным использованием жидких экстрагентов с газообразными
Максимально очищенные и ф итопрепараты индивидуальных
веществ
Максимально очищенные препараты — это почти полностью очи­
щенные от балластных веществ извлечения из растительного сырья,
содержащие в своем составе весь комплекс биологически активных
веществ растений. Глубокая очистка путем перекристаллизации и дру­
гими способами повышает их стабильность и сроки хранения, устра129
няет побочное действие ряда балластных веществ (смолы, стерины,
протеины и др.), позволяет использовать для инъекционного примене­
ния. Кроме того, в отличие от экстрактов, которые в ряде случаев стан­
дартизуют по сухому остатку, максимально очищенные препараты стан­
дартизируют биологическими или химическими методами по конкрет­
ным биологическим соединениям, т. е. по содержанию определенного
количества единиц действия или биологически активного вещества в
1 г или 1 мл. Для повышения стабильности к максимально очищенным
препаратам добавляют небольшие количества антимикробных средств
(спирт, хлорэтан, глицерин и др.).
Фитопрепараты индивидуальных веществ основаны на выделе­
нии из растительного сырья определнной группы биологически актив­
ных веществ (гликозиды, алкалоиды, флавоноиды и др.). Эти лекар­
ственные средства получают путем глубокой очистки (микро- и ультра­
фильтрация, адсорбционная хроматография и др.), вплоть до гомоген­
ного состояния.
Технология получения БАВ е суспензионной кул ьтур е кл е то к
Культивирование суспензии клеток растений in vitro основано на
их тотипотентности. Тотипотентность (лат. totus —весь, potentia - сила)
- это свойство растительной клетки реализовать генетическую инфор­
мацию, обеспечивающую её дифференцировку и развитие до целого
организма. В суспензионной культуры при росте и размножении клетки
достигают полной дифференцировки и синтезируют лекарственно цен­
ные биологически активные соединения, как и целое растение в при­
родных условиях.
Для получения суспензии клеток обычно используется каллусная ткань растения, состоящая из дедифференцированных клеток.
Каллусные клетки после ряда делений переходят на обычный для дан­
ного растения цикл развития, т.е. начинается дифференциация. Этот
процесс регулируют фитогормоны. При добавлении в среду культи­
вирования фитогормонов, в частности ауксинов усиливается процесс
дедифференцировки клеток, подготавливающих их к пролиферации, а
последующее внесение цитокинов усиливает процесс деления клеток.
В процессе роста и размножения суспензионная культура клеток
проходит следующие стадии:
- латентная, или лаг-фаза, где видимый рост не наблюдается;
- экспоненциальная фаза, наблюдается ускоренное размноже­
ние клеток;
- линейная фаза развития, когда скорость роста одинакова во
времени;
- фаза замедленного роста;
- стационарная фаза, когда численность жизнеспособных клеток
130
в суспензии постоянна;
- фаза деградации или постепенного отмирания клеток.
Накопление вторичных метаболитов возрастает в фазе замедлен­
ного роста клеточной популяции и достигает максимума в стационар­
ной фазе. Поэтому на производстве создаются оптимальные техноло­
гические условия (физико-химические параметры условий культивиро­
вания, компоненты питательной среды) для удлинения стационарной
фазе, фазы активной продукции вторичных метаболитов.
Если в начале экспоненциальной фазы роста растительные клетки
мелкие и плотные, то в стационарной фазе роста, в фазе активного син­
теза метаболитов они сильно увеличиваются в размерах и вакуолизируются. Однако вакуолизированные клетки подвержены механиче­
скому повреждению в процессе культивирования в биореакторе. При
этом наблюдается увеличение вязкости, повышение адгезии клеток,
образование конгломератов, что также нежелательно.
Время генерации (интервал времени между двумя последова­
тельными клеточными делениями) растительной клетки в 60—100 раз
превосходит время генерации микробной клетки и составляет 1-3 сут.
Поэтому цикл культивирования растительных клеток в биореакторе
занимает 2-3 недели, а столь длительное непрерывное культивирова­
ние повышает риск контаминации среды микроорганизмами.
Технология получения биологически активных соединений в
суспензионной культуре клеток растений включает:
1.
Подготовку среды для культивирования продуцента и посев
ного материала
Для каждого линии клеток - продуцентов БАВ, для каждой суспен­
зионной культуры растений разрабатывается своя оптимальная среда
культивирования, которая должна отвечать следующим требованиям:
- обеспечивать хороший рост биомассы и максимально возмож­
ное образование целевого продукта - алкалоидов, гликозидов, поли­
сахаридов и других продуктов вторичного синтеза;
- ее основные ингредиенты должны быть доступными по себестои­
мости (это источники углерода, регуляторы роста растений, минераль­
ные вещества, микроэлементы, витамины и др.).
Питательные среды содержат следующие основные компненты:
макроэлементы (азот,фосфор, калий, кальций, магний, серу, железо),
микроэлементы (бор, марганец, цинк, медь, молибден и др.), витамины,
углеводы - 2-3% сахарозы либо глюкозы, а также могут быть аминокис­
лоты, гидролизат казеина, этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА),
улучшающая доступность железа для клеток. Дополнительно вносятся
фитогормоны - ауксины и цитокинины). Это среды Гамборга, ШенкаХильденбрандта, Грессхофф-Доу; наиболее часто используется среда
Мурасиге-Скуга. Она характеризуется наиболее оптимиально сбалан-
131
сированным составом питательных веществ, дающим хороший рост
различных линий клеток растений.
Процесс культивирования начинается с внесения в биореактор
одной из вышеуказанных питательных сред и посевной культуры кле­
ток растения. Процесс культивирования начинается со стабилизации
в биореакторе необходимого уровня pH, р 0 2, установленной скорости
гомогенизации и температурным режимом. Стерилизация питатель­
ного субстрата осуществляется непосредственно в емкости биореак­
тора либо предварительно в специальных стерилизаторах горячим
паром под давлением.
Биопродуцент - так называемую материнскую культуру тканей
соответствующего лекарственного растения получают из научноисследовательских лабораторий либо из государственных коллекций.
Из материнской культуры пересаживают 7-9 дочерних культур и через
38-46 сут. роста в термостатируемом помещении отбирают колбы с
культурами тканей лучших ростовых признаков (быстрый рост, мак­
симальное использование питательной среды, цвет ткани от светложелтого до молочного, отсутствие некротических включений).
Для глубинного (суспензионного) метода культуру ткани предва­
рительно выращивают на агаризованной стерильной среде в пробир­
ках, затем из пробирок высевают в колбы с жидкой питательной сре­
дой и проводят две генерации глубинного выращивания на качалках в
течение 38-46 сут. для каждой генерации. Из второй генерации куль­
туры (в колбе) делают посев в небольшой (10 л) инокулятор (лабора­
торный биореактор), а затем хорошо развивающуюся культуру пере­
носят в промышленный биореактор;
2. Биосинтез биологически активных соединений
Стадия биосинтеза - основная стадия процесса получения БАВ из
культуры тканей. Выход целевого продукта зависит от биопродуцирую­
щей активности суспензионной культуры, состава питательной среды,
технологических условий культивирования в биореакторе. В процессе
наращивания клеток растений постоянно поддерживается необходи­
мая температура (25-37°С), pH, окислительно-восстановительный
потенциал, аэрация и гомогенизация
среды культивирования.
Продолжительность культивирования два-три месяца при постоян­
ном контроле физико-химических показателей суспензионной куль­
туры клеток в биореакторе.
Наряду с глубинным культивированием суспензионной культуры
возможно использование твердофазной ферментации при производ­
стве биологически активных соединений. Процесс осуществляется
в цилиндрических секционных емкостях. Засеянная на питательную
среду культура клеток последовательно перемещается из верхних
секций в нижние внутри устройства. Однако выход целевого продукта
132
невысок.
3. Выделение и очистка биологически активных соединений
Полученный целевой продукт находится в смеси с другими мета­
болитами растительных клеток, а также с компонентами среды куль­
тивирования. Выделение и очистка целевого биологически активного
соединения требует соблюдения стерильности всего технологического
цикла и максимального сохранения его фармакологических свойств.
Целевой продукт может локализоваться внутри клетки, либо выде­
ляться клеткой в культуральную среду. Поэтому в зависимости от
того, где БАВ сосредоточено (в культуральной среде или в клетке) при­
меняют соответствующие методы его извлечения.
Для разделения жидкой и твердой фаз культивирования приме­
няются фильтр-прессы, центрифуги-сепараторы, микрофильтрация и
другие методы. Извлечение БАВ осуществляют экстракцией органиче­
скими растворителями. Если БАВ находится в культуральной жидко­
сти, его выделяют методами экстракции растворителями, которые не
смешиваются с жидкой фазой, или осаждают в виде нерастворимого
соединения, или сорбируют ионообменной технологией.
Цель очистки - не только извлечение БАВ из культуральной жид­
кости или из клеток- продуцентов, но и его концентрация. БАВ под вли­
янием повышенной температуры, высокой кислотности или щелочно­
сти среды и других неблагоприятных факторов в процессе культиви­
рования клеток в ряде случаев теряют свои свойства, инактивируются.
Поэтому выделение и очистка необходимо осуществлять в щадящем
режиме.
Биологически активные соединения медицинского назначения
подвергаются процедуре тонкой очистки при помощи методов хрома­
тографического разделения, препаративного электрофореза, изоэлектрического фокусирования и ряда других методов. Эти методы исполь­
зуются в различных комбинациях и среди них наиболее широкое при­
менение находит хроматография.
Среди методов хроматографической выделения наиболее часто
используются:
- ионообменная хроматография (сорбент представляет собой
твердый носитель, содержащий ионизирующие группы, с которыми свя­
зываются с тем или иным сродством компоненты разделяемой смеси);
- распределительная хроматография (сорбент представляет
собой нейтральный твердый носитель, на котором сорбирована непод­
вижная фаза; подвижной фазой в данном случае является раство­
ритель, сам процесс основан на распределении компонентов смеси
между подвижной и неподвижной жидкими фазами);
- хроматография на молекулярных ситах (гель-проникающая хро­
матография, гель-фильтрация). Сорбент представляет собой гранулы
133
геля, имеющие поры определенного среднего размера, в которые могут
проникать молекулы биологически активных соединений меньшего раз­
мера и не могут проникать более крупные молекулы. В колонке, содер­
жащей такой носитель, объем растворителя доступного для молекул
разного размера, оказывается различным: малые молекулы диффун­
дируют как в межгранулярном, так и внутригранулярном объеме, круп­
ные молекулы могут диффундировать лишь в межгранулярном про­
странстве. Разделение достигается за счет разной скорости переме­
щения частиц с различными размерами молекул по колонке, при этом
частица большего размера движутся с большей скоростью;
- аффинная хроматография (сорбент представляет собой твер­
дый носитель, к которому химически присоединены функциональные
группы, избирательно связывающие какой-либо из компонентов разде­
ляемой смеси; остальные компоненты раствора не взаимодействуют с
носителем и выходят в свободном объеме колонки);
- препаративная хроматография позволяет разделять смеси на
индивидуальные соединения в промышленных масштабах. Как заклю­
чительная стадия процесса производства, препаративная хромато­
графия в настоящее время используется при получении большинства
современных фармацевтических субстанций. Она обеспечивает высо­
кую чистоту, выделенного вещества (95 - 99%).
После выделения и очистки биологически активные соединения (в
большинстве термолабильны) стабилизируются путем высушивания в
щадящих условиях лиофилизацией либо конвективной, распылитель­
ной сушкой. Стабилизированная субстанция биологически активного
соединения в виде сухого порошка подвергается тщательному анали­
тическому, биологическому и фармакологическому контролю.
Препараты крови
Ком поненты и препараты крови
К компонентам крови относятся: цельная кровь; эритроцитная
масса; концентрат тромбоцитов; свежезамороженная плазма; крио­
преципитат; концентрат гранулоцитов.
К препаратам относятся ряд белков плазмы крови: альбумин;
протеин; фактор VIII; протромбиновый комплекс; фактор IX; фактор
XI; фактор XIII; фибриноген; протеин С; антитромбин III; нормальный
иммуноглобулин; гипериммунный иммуноглобулин; С1 ингибитор;
альфа1-антитрипсин; холинэстераза; фибринолизин; гаптоглобин;
церулоплазмин.
Препараты крови получают из общего объема плазмы, взятой и
собранной вместе от нескольких тысяч доноров путем переработки,
очистки и стабилизации. Предварительно кровь каждого донора тща134
тельно тестируется. В первую очередь проверяется наличие вирусов,
так как существует риск передачи особо опасных вирусных инфекций,
в том числе ВИЧ, гепатит. В целом, повышенные требования к обе­
спечению и контролю особых условий безопасности соблюдаются при
заготовке, переработке, хранении и клиническом применении каждой
дозы донорской крови.
В технологии получения компонентов крови мало биотехноло­
гической составляющей в выделение и сохранение биоматериала.
А что касается препаратов крови, то в этом случае имеет место не
только разделение крови на жидкую часть и форменные элементы,
но и очистка, стабилизация биологически активного вещества (напр.,
фибриногена, выделенного из плазмы крови). В целом технологии полу­
чения препаратов крови основаны на выделении соответствующих
белков, очистке от сопуствующих компонентов и криоконсервации (лио­
филизации).
Используются препараты крови с терапевтической целью сразу же
после размораживания (криоконсервированные) либо после растворе­
ния (лиофилизированные); повторно препарат не используется. Также,
из крови получают реагенты для лабораторной диагностики: сыворотки
для определения групп крови, стандартные эритроциты, контрольные
материалы и т.д.
Плазма
В терапевтических целях применяются цельная плазма и ее ком­
поненты. Ценность цельной плазмы как лечебного препарата обу­
словлена содержанием большого количества биологически активных
веществ, в том числе белков, гормонов, ферментов, жиров и углево­
дов, макро- и микроэлементов, т.е. тех ингредиентов, которые необ­
ходимо для жизнедеятельности клеток и тканей. Идентифицировано
около 300 различных белков в плазме крови, в том числе, обладаю­
щие лечебные свойствами. Среди них такие уникальные по лечебной
эффективности препараты крови, как факторы свертывания VIII и IX,
иммуноглобулины, антитромбин III и др.
Технология получения плазмы или плазмаферез (aphairesis
- отнятие) заключается в отделении жидкой части от клеток крови
центрифугированием, основанном на принципе разделения клеток с
различной удельной массой (дискретный плазмаферез) либо пропу­
сканием через полупроницаемые мембраны (фильтрационный плаз­
маферез). Плазмофильтр - это одноразовое стерильное устройство,
состоящее из пористой мембраны. Поры в мембране пропускают через
себя плазму, а клетки крови задерживают. После экстракорпораль­
ного разделения крови, клеточная масса возвращается в кровеносное
русло донора, а плазма извлекается для последующего использования.
135
В донорской практике плазмаферез в основном используется
для заготовки свежезамороженной плазмы и получения препаратов
крови — альбумина, криопреципитата. Наиболее эффективна свеже­
замороженная плазма ввиду практически полной сохранности ее функ­
ций. Другие виды плазмы — нативная (жидкая), лиофилизированная
(сухая) — в значительной мере теряют лечебные свойства в процессе
изготовления, и их клиническое использование менее эффективно.
Свежезамороженную плазму получают вышеизложенными спо­
собами (дискретный и фильтрационный плазмаферез) с быстрым
последующим замораживанием (в первые 1— 2 ч с момента взятия
крови у донора). Она может храниться до 1 года при минус 1°-25°С и
ниже. В течение этого времени в ней сохраняются все факторы свер­
тывания крови, антикоагулянты, компоненты системы фибринолиза.
Непосредственно перед переливанием свежезамороженную плазму
оттаивают в воде при плюс 35— 37°С (для ускорения оттаивания
плазмы пластиковый мешок, в котором она заморожена, можно раз­
минать в теплой воде руками). Повторное замораживание и оттаива­
ние плазмы не допускается.
Дискретный и фильтрационный цитаферез применяется при полу­
чении клеточных элементов крови (эритроцитарной и тромбоцитарной, реже лейкоцитарной массы). В практической медицине процесс
получения форменных элементов крови чаще основан на принципе
разделения клеток с различной удельной массой методом центрифу­
гирования. Фракционаторы клеток крови различных моделей (фирмы
Gambro - ВСТ, Baxter - Amicus, Haemonetics и др.) снабжены специ­
альным одноразовым пластиковым ротором и комплектом системмагистралей , где происходит фракционирование клеток крови с раз­
делением эритроцитарной, тромбоцитарной и лейкоцитарной массы.
Так, при тромбоцитаферезе от одного донора получают не менее
300 млрд. трмбоцитов, при лейкоцитаферезе - не менее 10 млрд. кле­
ток, содержащих около 50% гранулоцитов. С целью увеличения коли­
чества выделяемых гранулоцитов доноров стимулируют кортикосте­
роидами, а в процессе лейкоцитафереза дополнительно используют
осаждающие растворы (полиглюкин, оксиэтил - крахмал).Оптимизация
технологии плазмоцитафереза нацелена на:
- получение максимального количества клеток крови;
- осуществление эффективной лейкоредукции (снижение при­
меси лейкоцитов в клеточном концентрате ниже минимальной дозы,
вызывающей у реципиента появление антилейкоцитарных антител).
Считается, что уровень содержания патогенов и биоактивных веществ
находится в определенной зависимости от конечной концентрации лей­
коцитов в препарате крови;
- максимальному исключению возможности микробной, вирусной
136
энтаминации компонентов и препаратов крови.
Альбумин, иммуноглобулин нормальный
Технологии выделения белков плазмы крови (альбумин, иммуоглобулин нормальный, факторы свертывания крови и др.) более
ложны, нежели фракционирование клеток крови. Они основаны на
ютодах специфической адсорбции из плазмы необходимых белкоых компонентов. Распространенной технологией выделения бел­
ов плазмы крови является аффинная хроматография в сочетании со
пиртовым осаждением. Вначале при помощи хроматографии избираельно извлекаются из плазмы белки, находящиеся в малой концентраии (20-200 мг/л плазмы) - это факторы свертывания крови, антитромин и др. А затем этиливым спиртом осаждаются альбумин (составляет
о 60% от общего количества белка крови здорового человека), иммуоглобулин нормальный.
Технология хроматографического выделения белков плазмы
орошо адаптируется к производственному процессу, рентабельна.
)на позволяет, меняя количество и тип сорбента, временно исклюая ту или иную ступень хроматографии извлекать из плазмы соотетствующие белки и в требуемом объеме. Гибкость хроматографиче1 ких технологий позволяет разрешить проблему снижения стоимости
I репаратов плазмы:
- во-первых, получением возможно большего количества препа<>атов из единицы сырья;
- во-вторых, повысить выход белка в процессе выделения;
- в-третьих, сократить стадии в технологическом процессе, в том
11исле, объединением стадий выделения.
Альбумин получают в виде 5, 10 и 20% растворов. Наряду с пре11аратом «Альбумин» нередко получают препарат «Протеин», содержа| ций кроме альбумина, примеси а- и (3-глобулинов. Благодаря добавI юнию стабилизаторов, растворы альбумина выдерживают пастери­
зацию, инактивирующую вирусы гепатита и ВИЧ-инфекции. Хранят
Ьти препараты при температуре 4° С, срок годности 3-5 лет. Растворы
Iальбумина восстанавливают гемодинамику, улучшают реологические
1;войства крови пациента. Иммуноглобулин нормальный содержит в
В-небольшом титре спектр антител, специфичных к возбудителям раз­
личных инфекций, применяется с лечебно-профилактической целью,
I : целью усиления пассивного иммунитета.
Среди препаратов крови наиболее востребованы, особенно
In трансфузиологии, альбумин, плазма, эритро- и тромбоцитарная
иассы, VIII и IX факторы свертывания. Особенностью технологии их
I «готовления является неукоснительное соблюдение мер безопасно­
с ти , направленных, прежде всего, на исключение вирусной контами-
137
контаминации компонентов и препаратов крови.
Альбумин, иммуноглобулин нормальный
Технологии выделения белков плазмы крови (альбумин, имму­
ноглобулин нормальный, факторы свертывания крови и др.) более
сложны, нежели фракционирование клеток крови. Они основаны на
методах специфической адсорбции из плазмы необходимых белко­
вых компонентов. Распространенной технологией выделения бел­
ков плазмы крови является аффинная хроматография в сочетании со
спиртовым осаждением. Вначале при помощи хроматографии избира­
тельно извлекаются из плазмы белки, находящиеся в малой концентра­
ции (20-200 мг/л плазмы) - это факторы свертывания крови, антитром­
бин и др. А затем этиливым спиртом осаждаются альбумин (составляет
до 60% от общего количества белка крови здорового человека), имму­
ноглобулин нормальный.
Технология хроматографического выделения белков плазмы
хорошо адаптируется к производственному процессу, рентабельна.
Она позволяет, меняя количество и тип сорбента, временно исклю­
чая ту или иную ступень хроматографии извлекать из плазмы соот­
ветствующие белки и в требуемом объеме. Гибкость хроматографиче­
ских технологий позволяет разрешить проблему снижения стоимости
препаратов плазмы:
- во-первых, получением возможно большего количества препа­
ратов из единицы сырья;
I во-вторых, повысить выход белка в процессе выделения;
- в-третьих, сократить стадии в технологическом процессе, в том
числе, объединением стадий выделения.
Альбумин получают в виде 5, 10 и 20% растворов. Наряду с пре­
паратом «Альбумин» нередко получают препарат «Протеин», содержа­
щий кроме альбумина, примеси а- и р-глобулинов. Благодаря добав­
лению стабилизаторов, растворы альбумина выдерживают пастери­
зацию, инактивирующую вирусы гепатита и ВИЧ-инфекции. Хранят
эти препараты при температуре 4° С, срок годности 3-5 лет. Растворы
альбумина восстанавливают гемодинамику, улучшают реологические
I свойства крови пациента. Иммуноглобулин нормальный содержит в
небольшом титре спектр антител, специфичных к возбудителям раз­
личных инфекций, применяется с лечебно-профилактической целью,
с целью усиления пассивного иммунитета.
Среди препаратов крови наиболее востребованы, особенно
в трансфузиологии, альбумин, плазма, эритро- и тромбоцитарная
массы, VIII и IX факторы свертывания. Особенностью технологии их
изготовления является неукоснительное соблюдение мер безопасно­
сти, направленных, прежде всего, на исключение вирусной контами-
137
нации. Наиболее распространенным технологическим решением полу­
чения лечебных препаратов на основе разделения плазмы донорской
крови является сочетание стадий хроматографиического фракциони­
рования и спиртового осаждения. Стадии хроматографического раз­
деления белков плазмы применяются при выделении минорных ком­
понентов плазмы, содержание которых лежит в интервале 20-200 мг
в литре плазмы. Последующее выделение альбумина и иммуноглобу­
лина осуществляется с помощью этилового спирта.
Технологический процесс получения препаратов крови основан на
фракционировании плазмы, осуществляемом при помощи реакторов,
суперцентрифуг, фильтров для осветляющей и стерилизующей филь­
трации, гомогенизаторов, насосов. Все процессы выполняются только
при отрицательных температурах. В зависимости от размещения тех­
нологического оборудования, предназначенного для осаждения бел­
ков плазмы, различают камерный и внекамерный способы производ­
ства. При камерном способе производства фракционирование белков
проводится в холодильных камерах. Передача рабочих растворов при
переходе с одной стадии фракционирования на другую осуществля­
ется насосами по нестационарно уложенным шлангам. Реакторы, мер­
ники, фильтры и т. д. при камерном способе производства не покры­
ваются теплоизоляцией. Постоянное расположение оборудования в
камерах с низкой температурой практически исключает контаминациию
микроорганизмами. Однако более распространен внекамерный способ
производства, при котором крупногабаритное технологическое обору­
дование (реакторы и мерники) размещают в специальных, оснащенных
в соответствии с требованиями пожаро- и взрывобезопасности поме­
щениях (реакторных залах), при комнатной температуре. Остальное
технологическое оборудование - суперцентрифуги, фильтры, насосы
и гомогенизаторы устанавливают в холодильных камерах. Процессы
осаждения белков плазмы осуществляются в реакторах из нержаве­
ющей стали, оснащенных мешалкой для равномерного размешива­
ния плазмы с осаждающими белки реагентами. Для поддержания низ­
кой температуры имеется охлаждающая рубашка, по которой цирку­
лирует хладоагент (этиленгликоль, спирты, фреоны и др.) при -20°С.
Осаждающий белки реагент распыляется в реакторе через форсунки
под давлением.
Для осветления или предварительной очистки плазмы от твер­
дой фазы чаще применяются фильтрующие цетрифуги-сепараторы.
Последующее осовобождение суспензии от денатурированных бел­
ков, липидов и микроорганизмов осуществляется на глубинных филь­
трах, где задержание частиц происходит не только на поверхности, как
это имеет место на мембране, но и при контакте с волокнами или дру­
138
гими материалами в толще фильтрующего матрикса. Для более тон­
кой очистки раствора альбумина или иммуноглобулинов применяются
ультра- и микрофильтрационные технологии.
В целом фильтрационная технология применяется на разных ста­
диях процесса для выполнения следующих задач:
- осветление белковых растворов на промежуточных этапах;
- стерилизация растворов на стадии получения готовой лекар­
ственной формы;
- очистки и концентрирования белковых полуфабрикатов;
- удаление вирусов.
Процессы фракционирования плазмы, фильтрации, получения
компонентов и препаратов крови осуществляются в условиях холо­
дильника, выделенные белки (альбумин, иммуноглобулины стабили­
зируются при помощи специальных реагентов-стабилизаторов. В соот­
ветствии с правилами GMP для очистки от микроорганизмов и виру­
сов, наряду с методами их физического удаления путем фильтрации,
используется инактивация температурой, изменением pH, обработкой
растворителями.
Иммунобиолгические препараты
Вакцины
Основу каждой вакцины составляют, прежде всего, протективные антигены, представляющие собой лишь небольшую часть микроб­
ной клетки или вирусной частицы и обеспечивающие развитие специ­
фического иммунного ответа. Протективные антигены—это наиболее
иммуногенные белки, гликопротеиды, липополисахариды микробной
клетки либо ее метаболиты (экзотоксины). У вирусов наиболее иммуногенны поверхностные антигены в составе капсида, суперкапсида.
Вместе с тем микробные компоненты и метаболиты должны быть не
только эффективны (антигенность и иммуногенность), но и безвредны
для человека.
В состав вакцины, кроме основного действующего начала, могут
входить и другие компоненты - сорбент, консервант, наполнитель,
стабилизатор и остаточные концентрации компонентов питательной
среды для культивирования клеток (белки сыворотки животных, анти­
биотики и др.
Наряду с традиционными вакцинами, получаемыми из цельных
микробных клеток, их компонентов и метаболитов (соответственно
живые, инактивированные, химические и анатоксины), существуют
современные вакцины, разработанные на основе ДНК, опухолевых
антигенов, высокоочищенных субъединиц микроорганизмов, химиче­
ски синтезированных пептидов. Это генно-инженерные (ДНК-вакцины,
139
векторные, съедобные), субъединичные и синтетические вакцины.
Векторные вакцины. Целевые гены, кодирующие синтез протективных антигенов, иммуногенных белков могут быть трансфицированы
в специальные клеточные системы (часто используются дрожжевые
клетки или кишечная палочка). Далее продукт синтеза - протективный антиген, иммуногеный белок выделяется из микробной биомассы,
очищается , стабилизируется. Так, при разработке рекомбинантной
вакцины против гепатита В, гены вируса, кодирующие синтез поверх­
ностного неинфекционного антигена - HBsAg встраиваются в вектор
на основе плазмиды. Далее этот вектор трансфицируется в клетки
Saccharomyces cerevisiae. Модифицированная дрожжевая клетка начи­
нает синтезировать HBsAg. Последний выделяется из культуральной
среды, очищается. Полученная таким образом рекомбинантная вак­
цина содержит около 95% HBsAg и до 5% дрожжевого белка, но в нем
полностью отсутствует ДНК дрожжевой клетки. Вакцинный антиген
адсорбируется гидроксидом алюминия.
ДНК-вакцины. Это целевые гены или фрагменты ДНК, выделен­
ные из клеток патогенных микроорганизмов, опухолевых клеток и др.;
они ответственны за синтез в организме вакцинированного протективных антигенов микроорганизмов, опухопеассоциированных анти­
генов и др., вызывающих иммунный ответ. Такие генетические струк­
туры при помощи плазмидных либо вирусных векторов трансфициру­
ются в клетки человеческого организма, экспрессируются и синтези­
руют in vivo опухолеспецифические, микробные и др. белки (протективные антигены), вызывающие, усиливающие иммунный ответ.
Съедобные вакцины. Целевыми генами трансфицируются расте­
ния, в последующем при культивированни трансгенных растений в их
клетках in vivo накапливается протективный антиген, иммуногенный
белок. При употребпении в пищу такого растения (салатные листья,
картофель и др.), в организме человека против иммуногенных белков
синтезируются специфические антитела, т.е. формируется активный
приобретенный иммунитет.
Субъединичные вакцины получают путем использования совре­
менных технологий выделения из микробной клетки или вирусной
частицы только целевых антигенов, обладающих высокой иммуногенностью и антигенностью. Отличительной чертой субъединичных вакцин
является высокая чистота препарата, отсутствие балластных, порой
реактогенных компонентов микроорганизмов. Например, субъединичная вакцна против гриппа содержит только поверхностные антигены
вируса - гемагглютинин и нейраминидазу.
Синтетические вакцины получают химическим синтезом из ами­
нокислот, образуются необходимые пептидные фрагменты, соответ­
ствующие по аминокислотной последовательности белковым структу­
140
рам микроорганизмов и вирусов, обладающим высокой антигенностью
и иммуногенностью. Важным преимуществом синтетических вакцин по
сравнению с традиционными является то, что они не содержат бакте­
рий и вирусов, продуктов их жизнедеятельности и вызывают иммунный
ответ узкой специфичности. Вместе с тем, синтетические вакцины слабоиммуногены.
Профилактические вакцины.Традиционные вакцины (аттенуирован­
ные, убитые, химические, анатоксины) создают в организме приобре­
тенный активный иммунитет против инфекции. Обычно поствакцинальный иммунитет эффективен при остротекущих инфекциях (гуморальная
форма иммунитета, высокий титр антител), менее выражен при хрони­
ческих инфекциях (клеточная форма иммунитета, синтез цитотоксических лимфоцитов).
Вакцины, разработанные современными технологиями (генноинженерные, субъединичные), направлены, прежде всего, на профилак­
тику тех актуальных инфекций, где традиционные вакцины мало эффек­
тивны. Это СПИД, вирусные гепатиты, вирусный папиломатоз человека,
индуцирующий развитие рака шейки матки и др.
Рак шейки матки - второй по распространенности вид рака среди
женщин во всем мире. Ежегодно от этого заболевания умирают более
250 тыс. женщин. Приблизительно в 70 % всех случаев развитие рака
шейки матки связано с типами 16 и 18 вируса папиломмы человека (ВПЧ).
вызывающими предопухолевые изменения в ткани. Разработана профи­
лактическая вакцина на основе вирусоподобных частиц, собранных из
рекомбинантных капсидных белков L1 ВПЧ типов 16 и 18, конъюгирован­
ных с адъювантом. Эти вирусоподобные частицы не содержат вирусный
генетический материал, а потому не являются инфекционными. При про­
филактической вакцинации в организме продуцируются антитела про­
тив капсидных белков ВПЧ , предупреждающие инфицирование шейки
матки патогеном.
Терапевтические вакцины. Известно применение традиционных,
цепьно-клеточных инактивированных вакцин с лечебной целью, с целью
стимуляции иммунного ответа при хронических, вялотекущих инфекциях
(хроническая гонорея, хроническая стафилококковая инфекция и др.).
Спектр терапевтического применения современных вакцин, в частно­
сти ДНК - вакцин значительно шире и охватывает не только актуальные
инфекции (вирусные гепатиты В и С, вирусный папилломатоз, ВИЧ), но и
злокачественные новообразования (прежде всего, мепаному, рак молоч­
ной железы и прямой кишки), аллергические и аутоиммунные болезни
(рассеянный склероз, диабет I типа, ревматоидный артрит).
141
Технологии получения вакцин
Вакцины в силу многокомпонентное™ ее состава и многостадийности технологического процесса разрешено производить на тех
предприятиях, которые могут соблюдать основные принципы GMP.
Для производства вакцин необходима специальная технологическая
линия, укомплектованная комплексом соответствующего оборудова­
ния. При этом важен автоматический контроль и регулирование техно­
логического процесса, включающие постоянную регистрацию и регу­
лирование отдельных этапов. Столь же актуально соблюдение сте­
рильности на всех этапах получения вакцин. Исключение как внешней
(через воздух,оборудование, персонал), так и внутренней (необходимо
использование стандартного, соответствующего ГОСТу субстрата для
подготовки питательных сред для культивирования в случае бактери­
альных вакцинных штаммов; использование животных тканей и кле­
ток, куриных эмбрионов, полученных от здоровых животных и птиц,
выращенных в специализированных хозяйствах в случае наработки
вирусных вакцинных штаммов) контаминации посторонней микрофло­
рой. Очень важно в производстве вакцин строгое соблюдение техно­
логии, применение стандартных методик, сырья и реактивов. В произ­
водстве используются только те химические вещества, которые отве­
чают требованиям международной или национальной фармакопеи и
подвергаются входному контролю. Также в процессе изготовления вак­
цин используются только такие растворители, стабилизаторы и консер­
ванты, которые не оказывают негативного влияния на качество вак­
цины и не вызывают побочного действия на вакцинируемый организм.
При хранении и транспортировке требуется соблюдение «Холодовой
цепочки», т.е. бесперебойное обеспечение оптимального температур­
ного режима хранения и транспортирования медицинских иммуноби­
ологических препаратов, в том числе вакцин на пути их следования от
предприятия -изготовителя до вакцинируемого.
Производство некачественной вакцины, нарушение условий хра­
нения и транспортировки, как и неправильная техника введения вак­
цины либо аллергия у прививаемого могут приводить к поствакцинальным осложнениям.
В технологии промышленного производства традиционных вакцин
обязателен этап наработки биомассы вакцинных штаммов в биореак­
торе. Так, при производстве живых и инактивированных вакцин пред­
варительно подготавливается из маточной культуры посевный мате­
риал и питательная среда. Биомасса вакцинных штаммов нарабаты­
вается в биореакторах глубинной ферментацией (бактерии, дрожжи)
или поверхностной на твердых питательных средах (мицелиальные
грибы). Строго соблюдаются асептические условия, исключающие кон­
таминацию посторонней микрофлорой, фагами. В случае получения
142
живой вакцины биомассу аттенуированного штамма концентрируют,
стандартизируют по количеству жизнеспособных микроорганизмов в
единице объема, лиофилизируют со стабилизирующей средой, фасуют
в ампулы или флаконы. Срок хранения лиофилизированных живых вак­
цин 1-2 года при 4 - 8°С. При получении убитых вакцин наработан­
ную биомассу микроорганизмов очищают, концентрируют, инактиви­
руют и стандартизируют по числу микробных клеток в единице объ­
ема. Далее следует лиофилизация, фасовка и упаковка во флаконы
или ампулы,хранение.
Получение вирусных вакцин. Вакцинные штаммы вирусов нара­
батываются в культуре тканевых клеток либо в куриных эмбрио­
нах. Предварительно подготавливается культура тканевых кле­
ток (первично-трипсинизированных или перевиваемых) или куриный
эмбрион (7-11дневный) для культивирования вирусов. В асептиче­
ских условиях вирусом заражается клеточная культура либо куриный
эмбрион. Вирус репродуцируется, накапливается в клеточной культуре
или в полости куриного эмбриона. Затем его выделяют, очищают, стан­
дартизируют, лиофилизируют, фасуют в ампулы и укупоривают (в слу­
чае цельновирионных вакцин, живых или инактивированных). Живые
вакцинные штаммы предварительно аттенуируются пассированием их
на соответствующей культуре клеток in vitro.
Для производства ДНК-вакцин требуется масштабная ПЦР- ампли­
фикация кДН К, кодирующего синтез белка - иммуногена. Затем кДНК
встраивается в вектор на основе плазмиды либо вирусов и трансфи­
цируется в клетки вакцинируемого организма. Чаще при разработке
ДНК- вакцины, целевые гены, кодирующие синтез протективного анти­
гена микроорганизма встраиваются в состав бактериальных плазмид,
способных к автономной репликации в цитоплазме клеток. Кроме
генов, кодирующих синтез иммуногенного микробного белка, в плаз­
миду встраивают генетические конструкции (инициирующий и терми­
нирующий кодоны, промотор), необходимые для активной экспрес­
сии трансфицированной ДНК- вакцины в клетках человеческого орга­
низма. В результате экспрессии продуцируется протективный микроб­
ный антиген, инициирующий выработку в организме иммунного ответа
против соответствующего возбудителя. ДНК-вакцина в составе плаз­
миды располагается в цитоплазме и не интегрирует с ДНК человече­
ской хромосомы, т.е. не вызывает генетические перестройки в орга­
низме. Подобные ДНК- вакцины вводятся в солевом растворе парен­
терально (внутримышечно, внутрикожно). После инъекции некоторая
часть генетического материала ДНК-вакцины в составе плазмиды
попадает из межклеточного пространства внутрь клеток.
Для доставки ДНК- вакцины в клетки организма вместо плазмиды
возможно использовать липосомы. Также ДНК-вакцину можно трасфи143
цировать внутрь клеток вакцинируемого, используя метод биобалли­
стики. Трансфицируемая ДНК адсорбируется на поверхности микро­
частиц золота либо платины, диаметром около 1-2 мкм. При помощи
специапьного устройства (генная пушка или пистолет) микрочасти­
цами бомбардируются клетки, ткани организма. Часть микрочастиц
проникает внутрь клеток (в фибробласты, миоциты), внося с собой и
ДНК-вакцину. Экспрессия трансфицированной генетической конструк­
ции приводит к синтезу соответствующего антигена, с последующим
формированием иммунного ответа на него. В зависимости от трансфи­
цированной ДНК, в организме вакцинированного синтезируются либо
протективные антигены микроорганизмов либо опухольассоциированные антигены.
ДНК- вакцины характеризуются достаточной термостабильно­
стью, устойчивостью при хранении, не требуют соблюдения Холодо­
вой цепочки (постоянное нахождение в условиях холодильника) при
транспортировке. Вместе с тем ДНК- вакцины пока характеризуются
слабой иммуногенностью, требуется совершенствование технологии
адресной доставки ДНК-вакцины в клетки вакцинируемого, необходима
более эффективная регуляция экспрессии трансфицированной ДНК.
Векторная вакцина разрабатывается на основе технологии реком­
бинантной ДНК, путем трансформации целевого гена, кодирующего
синтез иммуногена в клетки дрожжей или бактерий. Затем нарабаты­
вается биомасса модифицированных микроорганизмов в биореакто­
рах с последующим выделением, очисткой и стабилизацией иммуногенного белка, белка используемого в качестве вакцины.
При создании субъединичных вакцин клетки микроорганизмов
лизируют, выделяют вакцинный протективный антиген из клеточного
детрита путем сорбции, фильтрации, хроматографии и их комбинации.
Далее наработанный и очищенный антиген конъюгируется с иммуно­
модуляторами, адъювантами, стабилизаторами.
Для продукции синтетических, пептидных вакцин требуются в
качестве субстрата в достаточном количестве различные аминокис­
лоты и их производные, из которых химическим синтезом получают
необходимые аминокислотные последовательности искомого пептида.
Противоопухолевые вакцины, разрабатанные на основе аллогенных и аутологичных опухолевых клеток, несущих различные иммуногенные детерминанты, относятся к терапевтическим вакцинам, усили­
вающим противоопухолевый иммунный ответ в организме больного.
Их использование с целью профилактики ограничено из-за различ­
ной вариации, нестабильности антигенной специфичности опухолей.
Поэтому учитывая близость опухопевых антигенов к антигенам здоро­
вых тканей организма, т.е. их слабую иммуногенность, вакцинотерапия
опухолей чаще проводится в послеоперационном периоде для про144
филактики рецедивов и метастазирования. Для получения противоо­
пухолевых вакцин аутологичные или аллогенные опухолевые клетки
облучают или лизируют с целью инактивации и оптимизации опухоле­
ассоциированных антигенов. Их вводят больному вместе с адъювантом
(вакцинный штамм БЦЖ, полный адъювант Фрейнда и др.). При этом
более активно вовлекаются в иммунный ответ антигенпрезентирующие клетки - макрофаги, дендритные клетки. Имеет место продукция
большого количества цитокинов, активирующих пролиферацию хелперных и цитотоксических Т - лимфоцитов и усиливающих тем самым
их цитотоксическое воздействие на опухолевые клетки.
Аллогенные вакцины обычно готовят из смеси опухолевых клеточ­
ных линий с известным на сегодняшний день набором опухолеассо­
циированных антигенов, которые хранятся в банке клеточных культур.
Приготовлению аутологичных вакцин предшествует хирургическое
вмешательство, изъятие из удаленной ткани и наращивание опухоле­
вых клеток с индивидуальным, присущим данному больному спектром
опухолеассоциированных антигенов. Вакцины на основе опухолевых
клеток с адъювантом могут усилить иммунный ответ больного на опу­
холь в начальной стадии процесса, в то же время они малоэффективны
в поздней стадии заболевания.
Наиболее эффективный способ изготовления вакцин - это
использование инактивированных аутологичных опухолевых клеток.
Методически более сложен способ изготовления вакцины на основе
отдельных компонентов опухолевой клетки, обладающих антигенностью - это пептиды, белки теплового шока, полисахариды опухоле­
вых клеток.Пептидные противоопухолевые вакцины разрабатываются
на основе антигенов MAGE-1 и MAGE-3, типичных для меланом и рака
молочной железы, меланом и карцином головы и шеи; на основе СА
125(TD-1) при раке яичника; на основе PSA (TD-3) при раке простаты; на
основе MUC-1 (TD-4) - это муциновый антиген, выявляемый при раке
молочной железы, яичников, щитовидной железы, легких. Также раз­
рабатываются вакцины, в состав которых входит несколько высокоочищенных опухолевых антигенов или их синтетических аналогов (поли­
валентные вакцины), что повышает вероятность индукции иммунного
ответа в отношении различных клеточных клонов одной опухоли. С
целью усиления иммуногенности противоопухолевых антигенов приме­
няются адъюванты - БЦЖ, пектины, липид А, мурамилдипептид, глико­
пептиды бактерий и другие иммуномодуляторы. Иммуногенность опу­
холевых антигенов также можно усилить путем:
- химической модификации их структуры;
- конъюгацией с непатогенными вирусами и бактериями;
- усилением экспрессии генов, кодирующих синтез опухолевых
антигенов в организме вакцинируемого.
145
Около сотни противоопухолевых вакцин проходят клинические
испытания, в основном это аллогенные вакцины и лишь 20-25% ауто­
логичные, т.е. созданные на основе опухолевых антигенов, взятых у вак­
цинируемого больного. По специфичности оба типа вакцин (аллоген­
ные и аутологичные) подразделяются на антиген-специфические, поли­
валентные и дендритно-клеточные. Антиген-специфические вакцины
потенциально характеризуются большей избирательностью действия.
Наиболее перспективны разработки вакцин при раке молочной железы,
предстательной железы, толстого кишечника и легких. Повышен инте­
рес к разработке вакцин при меланоме и карциноме почек, так как эти
опухоли хорошо поддаются иммунотерапии.
Формы вакцинных препаратов
Современные технологии направлены на создание комбинирован­
ных, липосомальных, микрокапсулированных, мукозальных и других
форм вакцинных препаратов.
Комбинированные (ассоциированные) вакцины содержат в своем
составе протективные антигены нескольких групп микроорганизмов
(бактериальные и вирусные антигены, анатоксины), конъюгированных с
адъювантами. Например, биопрепарат «Инфарникс Гекса» - это комби­
нированная вакцина для профилактики дифтерии, столбняка, коклюша
(ацеллюлярный компонент), гепатита В, полиомиелита и заболевания,
возбудителем которого является Haemophilus influenzae ти п а b.
Микрокапсулированные вакцины - это вакцины в биодеградируемой оболочке. Например, препарат помещается в микрокапсулу из
защитных попимеров, которые в организме гидропизуются с образова­
нием молочной и гликолевой кислот. Они безвредны, относятся к мета­
болитам обмена веществ. При этом можно регулировать скорость расщеппения микрокапсул в организме и соответственно длительность
действия иммуногена: от нескольких дней до нескольких месяцев.
Липосомапьные вакцины. Липосомы представляют собой двух­
слойные микропузырьки из фосфолипидов для транспортировки анти­
генов к антигенпрезентирующим клеткам. Применение таких вакцин
позволит добиться снижения токсичности и удлинения срока действия
препарата в организме вакцинированного.
Мукозапьные вакцины. Это пероральные вакцины, формируют
«местный» мукозальный иммунный ответ в естественных воротах
(кожа, слизистые оболочки открытых полостей) проникновения инфек­
ционных агентов в организм. Кожа и слизистые отличаются богатым
содержанием клеток, принимающих участие в фагоцитозе, переработке
антигенного материапа и представлении антигена Т-клеткам. Хорошо
развитая сеть лимфатических сосудов и региональных лимфатических
узлов обеспечивают быстрое формирование иммунитета, накоппение
146
секреторного IgA и IgG.
Диагностикумы
Это стандартизованные препараты, применяемые для диагно­
стики бактериальных и вирусных инфекций. Представляют собой
взвесь убитых микроорганизмов или выделенные из их клеток анти­
гены. Используя их в качестве диагностических антигенов в крови боль­
ного можно выявлять специфичные им антитела в сыворотке исследуе­
мого больного и тем самым определять наличие той или иной инфекци­
онной болезни. В серодиагностике инфекционных заболеваний пред­
почтительны эритроцитарные диагностикумы (антигены микроорганиз­
мов, предварительно осаждаются на поверхность формализированных эритроцитов), так как они более чувствительны, нежели просто
диагностикумы.
Также в качестве диагностикумов могут применяться готовые
иммуноглобулины и сыворотки (эшерихиозные, холерные и др.; флю­
оресцирующие, агглютинирующие и др.), содержащие известные анти­
тела против конкретных инфекций. При помощи подобных диагности­
кумов в исследуемом материале, взятом от больного можно обнару­
жить специфичные им антигены возбудителей.
Однако диагностикумы (антигенные и антительные) менее чув­
ствительны по сравнению с ПЦР и ИФА, поэтому в настоящее время
не столь широко применяются в лабораторной практике.
Аллергены
Аллергены — это антигены, вызывающие у чувствительных к
ним людей аллергические реакции. В зависимости от происхождения
аллергены можно разделить на несколько групп:
- бытовые — домашняя пыль, дафнии;
- эпидермальные — шерсть, пух, перо, перхоть домашних живот­
ных (кошек, собак, морских свинок, хомяков, птиц, кроликов, лошадей,
овец и др.);
- инсектные — синантропные микроклещи, тараканы, жалящие и
кровососущие насекомые, паукообразные;
- пыльцевые — пыльца различных растений, чаще злаковых, сор­
ных трав, деревьев;
- пищевые — потенциально любой пищевой продукт может быть
аллергеном. Высокая степень аллергизирующей активности у коро­
вьего молока, рыбы, куриного белка, клубники, малины, цитрусовых,
шоколада, орехов и др.;
- лекарственные — аллергенами потенциально могут оказаться
любые лекарственные препараты, включая и противоаллергические
147
средства;
• грибковые — основной компонент домашней пыли, чаще речь
идет о плесневых и дрожжевых грибках;
- гельминтные — антигены аскарид, остриц, власоглава и др. гель­
минтов.
Лечебные и диагностические аллергены получают из вышепри­
веденных объектов, поэтому очень важно минимизировать вариа­
бельность их состава и концентрации, соблюдать однородность каче­
ственного и количественного состава исходного материала, очищать от
потенциально загрязняющих элементов (пестицидов, тяжелых метал­
лов, спор плесневых грибов и т. д.). Активно действующие начала из
различного сырья (преимущественно растительного и животного про­
исхождения) получают экстракцией водно-солевым раствором. Такие
водно-солевые экстракты помимо аллергенных содержат иные ком­
поненты, которые отражаются на качестве препарата. Поэтому экс­
тракты аллергенных препаратов обязательно очищаются теми спосо­
бами, которые позволяют сохранять аллергизирующие свойства аллер­
генных компонентов. Аллергенные препараты, предназначенные для
парентерального, интрабронхиального и конъюнктивального примене­
ния должны быть стерильны.
Качество аллергенных препаратов определяется качеством их
стандартизации по:
- суммарной аллергенной активности, определяемой по степени
вызываемой им кожной аллергической реакции на чувствительных к
данному аллергену пациентах;
- биологической активности, контролируемой по иммунологиче­
ской активности аллергенного экстракта на различных стадиях про­
изводства;
- содержанию в препарате главных аллергенов в единице
массы. Состав аллергенного препарата характеризуют при помощи
использования таких методов, как изоэлектрофокусирование, элек­
трофорез в додецилсульфате натрия - полиакриламидном геле,
lgE-иммуноблоттинг, перекрестный радиоиммуноэлектрофорез. IgEсвязывающие свойства препарата оценивают в реакции торможения
РАСТ (радиоаллергосорбентная техника).
ДНК-технологии позволили получить многие важные аллергены
(аллергены пыльцы растений, постельного клеща, эпидермиса некото­
рых животных, насекомых, ядов перепончатокрылых и др.) в виде инди­
видуальных рекомбинантных белков, имеющих сравнимую аллерген­
ную активность с соответствующими природными белковыми аллерге­
нами. Новая технология облегчила стандартизацию аллергенных пре­
паратов, позволив строго количественно определять главные аллер­
гены в производственных сериях лекарственных форм.
148
Д иагностические аллергены применяются при постановке кож­
ной пробы или при выполнении лабораторной аллергодиагностики.
Последная направлена на:
- выявление свободных антител в сыворотке крови и секретах;
- обнаружение антител, связанных с лейкоцитами (базофилами,
нейтрофилами), тромбоцитами и др.;
- определение Т-лимфоцитов, сенсибилизированных к аллергену.
Кожные аллергические пробы не всегда дают достоверную инфор­
мацию о наличии лекарственной аллергии и их нельзя использовать
при выраженных поражениях кожи, а также при анафилактическом
шоке или возможности его развития в связи с неясным анамнезом. У
детей раннего возраста, иногда у пожилых людей при лекарственной
аллергии кожные пробы отрицательны. Поэтому комплексные лабо­
раторные методы выявления аллергии по безопасности и возможно­
сти использования в любой период заболевания остаются предпочти­
тельными. В комплексные методы входят:
- выявление реакций анафилактического, lgE-зависимого типа;
- определение lgE-антител, связанных с базофилами;
- регистрацию иммунокомплексных реакций;
- определение реакции цитотоксического и промежуточного (отсро­
ченного) типа;
- диагностику клеточно-опосредованных, Т-клеточных и замед­
ленных реакций.
Аллерген-специф ическая иммунотерапия (АСИТ) - метод лече­
ния lgE-зависимых аллергических заболеваний, состоящий во введе­
нии в организм пациента возрастающих доз того аллергена, к кото­
рому выявлена повышенная чувствительность и который ответстве­
нен за клинические проявления аллергии. Целью лечения является
выработка у пациента толерантности к данному аллергену путем дози­
рованной «аллерговакцинации». Нередко вместе с аллергеном вво­
дятся адъюванты (гидроокись алюминия, фосфат кальция и др.) для
неспецифической стимуляции иммунного ответа. Также используются
консерванты для стабилизации биологической активности аллергена.
Бактериофаги
Фаги могут применяться в качестве диагностических препаратов
для установления рода, вида и подвида (фаготипа) бактерий, выделен­
ных из патологического материала. Однако чаще всего их используют
для лечения и профилактики некоторых инфекций путем перорального
введения или местной аппликации. Наиболее часто применяются сле­
дующие бактериофаги: поливалентный сальмонеллезный бактерио­
фаг; моновалентные бактериофаги - брюшнотифозный, дизентерий­
ный, протейный, синегнойный, холерный, стафилококковый, стрепто­
кокковый, кояи-фаг (фаг кишечной палочки); комбинированные пре­
параты поливалентных бактериофагов - колипротейный; пиобактериофаг включающий стафилококковые, стрептококковые, клебсиеллезные, эшерихиозные, протейные и синегнойные бактериофаги и другие.
Лечебное и профилактическое действие фагов основано на их
бактериолитической активности. Основным условием их успешного
применения является проверка выделенной культуры на чувствитель­
ность к соответствующему фагу. Активность фага выражают числом
частиц фага, содержащихся в единице измерения - в 1 мл суспензии
или в 1 таблетке. В отличие от антибиотиков, чувствительность микро­
организмов к бактериофагам более стабильна.
Пробиотики
Основными микроорганизмами, используемыми в качестве про­
биотических препаратов являются молочнокислые бактерии (бифидо­
бактерии, лактобациллы, молочнокислый стрептококк), реже бациллы,
энтерококки, кишечная палочка и др.
Микроорганизмы, используемые в качестве пробиотиков должны
быть:
живыми, антагонистически активными в отношении условн
патогенных и патогенных микроорганизмов, высокоадгезивными к
кишечному эпителию, устойчивыми к действию желудочного сока и
желчных кислот;
- не патогенными, не обладающими мутагенными свойствами,
безвредными для человека;
- резистентными к антибиотикам, с хромосомной локализацией
резистентности.
Пробиотические препараты разрабатывают на основе одного
или нескольких штаммов одного вида, консорциума из разных видов
микроорганизмов, а также используют композиции, сочетающие
микроорганизмы-симбионты с пребиотиком, сорбентом, ферментом,
иммуномодулятором. Пробиотические препараты подразделяются на:
- монопрепараты, содержат один вид микроорганизмов Бифидумбактерин (Bifidobacterium bifidum ), Лактобактерин (Lactobacillus
plantarum или Lactobacillus fermentum), Бактисубтил (Bacillus cereus) и др.;
- поликомпонентные, консорциумы из нескольких видов микро­
организмов - Линекс (Lactobacillus acidophilus, Bifidobacterium infantis,
Enterococcus faecium), Симбифлор (Lb.acidophilus, Str.thermophilus, B.longum, B. bifidum, E.coli), Биоспорин (Bacillus subtilis и Bacillus
lichiniformis), Бификол сухой (В. bifidum 1 и Escherichia coli М-17) и др.;
- комбинированные препараты - «Экофлор», относится к биоло­
гически активным добавкам, является пробиотиком нового поколе­
ния, содержит живые антагонистически активные штаммы лактоба150
цилл и бифидобактерий, сорбированных на энтеросорбенте СУМС-1;
«Эм-курунга» содержит в составе лактобациллы, бифидобактерии,
уксуснокислые, пропионовокислые бактерии, лактострептококки, дрож­
жевые клетки, а также ферменты, аминокислоты, витамины, минераль­
ные соли; Бифилиз сухой (B.bifidum и лизоцим); Кипацид (3 штамма
L.acidophilus NK-1, K-3LU-24, 100-АШ и лизоцим) и др.;
рекомбинантные пробиотические штаммы получают трансфек
цией в геном микроорганизмов генов, индуцирующих продукцию цитокина - IL-10 и регуляторного протеина - TFF-фактора (Lactoccocus lactis);
альфа-интерферона человека (B.subtilis), антител против ротавирусов
(Lactobacillus paracasei) и др.
В биотопах слизистой открытых полостей именно сообщество
микроорганизмов-симбионтов, в совокупе с неспецифическими фак­
торами защиты и иммунными силами обеспечивает колонизационную
резистентность организма. Поэтому перспективна разработка совре­
менных пробиотических препаратов на основе сообщества разных
видов и подвидов представителей нормальной микрофлоры.
Технологии получения пробиотиков
Входящие в состав пробиотиков микроорганизмы относятся к гете­
ротрофным, мезофильным культурам, растущим на самом разнообраз­
ном субстрате. Пробиотические штаммы характеризуются технологич­
ностью, то есть хорошо культивируются в промышленных биореакто­
рах, при этом стабипьно сохраняют биологическую активность.
Длительность ферментации в биореакторе 10-15 часов, процесс
останавливается в конце логарифмической - начале стационарной
фазы развития микроорганизмов, в период их наибольшей биологи­
ческой активности.
После окончания ферментации биомасса концентрируется в
центрифугах-сепараторах либо мембранной технологией; после
очистки вносятся стабилизаторы (желатин, сахароза, обезжиренное
молоко); затем суспензия чистой культуры пробиотического штамма в
стерильных условиях разливается в ампулы или флаконы, лиофилизируется.
Готовый препарат проверяется на отсутствие посторонней миклофлоры, определяется численность жизнеспособных микроорганизмовсимбионтов в КОЕ / г, мл; оценивается антагонистическая активность
в отношении тест-штаммов.
В зависимости от технологии производства современные проби­
отики можно разделить на две группы.
Первая группа пробиотиков (лечебные пробиотики) произво­
дится с использованием метода лиофильной сушки живых бакте­
рий. Препараты выпускают в форме порошка, таблеток, капсул или
151
свечей. Эти формы имеют длительные сроки годности и не требова­
тельны к непродолжительным изменениям температуры хранения.
Существенным является то, что процесс лиофилизации приводит бак­
терии в анабиоз (неактивное состояние). Для возвращения в актив­
ное физиологическое состояние им требуется 8-10 часов. Кроме того,
в процессе лиофилизации бактериальные клетки могут терять специ­
фические рецепторы - адгезины, поэтому длительность колонизации
ими кишечного биотопа уменьшается.
Вторая группа - жидкие пробиотики (биопогически активные
добавки - БАДы) из живых микробных кпеток. Они хранятся в форме
суспензии в активном состоянии и способны к колонизации желудочнокишечного тракта уже через 2 часа после приема. Однако существенно
сокращается длительность их хранения (1-1,5 месяца), выше риск кон­
таминации посторонней микрофлорой. Например, жидкий пробиотик
«Нормофлорин», включает в свой состав органические кислоты, ами­
нокислоты (в том числе незаменимые), микро- и макроэлементы, фер­
менты и пребиотики, а также бифидобактерии и лактобациллы в физи­
ологически активном состоянии.
Органопрепараты, биогенны е стимуляторы
О рганопрепараты - это лекарственные вещества, попучаемые
из органов и тканей животных. Действующими веществами органопре­
паратов являются продукты физиологического обмена, содержащиеся
или накапливающиеся в тканях, органах, биологических жидкостях (фер­
менты, гормоны, витамины и другие вещества). В зависимости от техно­
логии все органопрепараты разделяют на следующие группы:
- высушенные жепезы и ткани. Содержат почти полный комплекс
веществ (действующих, сопутствующих и балластных) исходного
животного сырья. Выпускаются, главным образом, в форме порошков
и таблеток;
- экстракционные препараты, получаемые в результате обработки
сырья какими-либо растворителями (экстрагентами). При таком способе
попучения экстракт освобождается от большинства сопутствующих и
балластных веществ. Выпускаются экстракты как в сухом (порошки,
таблетки), так и в жидком виде (для перорального применения);
- максимально очищенные органопрепараты, содержащие инди­
видуальные лекарственные компоненты из животного сырья. Получают
глубокой очисткой экстрактов методами адсорбции на ионообменных
смолах, мембранной фильтрацией и другими способами). Выпускаются
в виде инъекционных препаратов.
Для производства органопрепаратов сырье получают в основном
с боен мясокомбинатов. Органопрепараты получают из: предстатель­
ной железы, эпиталамо-эпифизарной области мозга, плаценты, крови,
152
селезенки, вилочковой железы, костного мозга, хрящей, трахеи, рого­
вицы, стекловидного тела глаза и др. Наиболее активно стимулируют
восстановительные процессы препараты из эмбриональных и феталь­
ных тканей. Изъятие необходимых органов, тканей, биологических жид­
костей осуществляется немедленно после забоя под строгим ветери­
нарным контролем. Поскольку животное сырье неустойчиво при хра­
нении и транспортировке, его по возможности быстро подвергают кон­
сервированию. Для консервирования органопрепаратов используются:
- органические растворители - спирт или ацетон (при этом сырье
одновременно обезвоживается и частично обезжиривается);
- хлорид натрия;
- замораживание (оптимальный и наиболее распространенный
способ);
- сублимационное высушивание.
Производство органопрепаратов осуществляется на эндокринных
заводах.
Технология получения органопрепарата щитовидной железы:
щитовидная железа животных размораживается, промывается водой
и измельчается до фарша. Фарш высушивается при 37-40°С в вакуумсушильных шкафах с последующим обезжириванием органическими
растворителями (ацетон, эфир). После удаления остатков раствори­
теля материал измельчается и в форме порошка стандартизируется по
содержанию органически связанного йода, таблетируется.
Биогенные стим уляторы представляют собой комплекс биоло­
гически активных веществ животного и растительного происхождения.
Получение биогенных стимуляторов осуществляют путем настаивания
сырья с холодной или горячей водой или перегонкой с водяным паром
(биогенные стимуляторы хорошо растворимы в воде и теплостойки). Из
лечебных средств, содержащих биогенные стимуляторы, фармацевти­
ческой промышленностью вырабатываются экстракты листьев алоэ,
иловой лечебной грязи и др.
Генно-инженерные биопрепараты
Рекомбинантные белки и пептиды медицинского назначения, проду­
цируемые генетически модифицированными микроорганизмами, транс­
генными растениями и животными относятся к современным медицин­
ским биопрепаратам. Это интерфероны, интерлейкины, факторы VIII
и IX свертывающей системы крови, инсулин, соматотропин, тканевый
активатор плазминогена, вакцина против гепатита В, моноклональные
антитела и др. Генно-инженерные биопрепараты подразделяются на:
диагностические. Как известно, антигены микроорганизм
используются в качестве диагностикумов. Однако получение их в про­
изводственных условиях путем наращивания биомассы микроорганизма
153
и выделения нужного антигена не всегда возможно, так как некоторые
возбудители плохо растут на питательных средах (возбудители сифи­
лиса, малярии и др.) либо опасно их культивировать в производственных
условиях (возбудители СПИДа, гепатита В и др.). А технология генетиче­
ской инженерии позволяет наращивать искомый антиген путем встраи­
вания генов, ответственных за их синтез в легко культивируемые апатогенные микроорганизмы (бактерии, дрожжи). Например, основные анти­
гены ВИЧ (р24, gp41, др120) получены путем культивирования рекомби­
нантных штаммов бактерий Е. соИ или дрожжей Sacch.cerevisiae, спо­
собных продуцировать эти антигены. На основе этих антигенов разра­
ботаны диагностические препараты для определения антител к вирусу
СПИДа. При исследовании сыворотки на хламидиоз разработаны ИФА
тест-системы на основе рекомбинантных белковых антигенов хламидий.
- профилактические. Например, применяется вакцина против гепа­
тита В, полученная путем встраивания гена,ответственного за синтез
HBs-антигена вируса гепатита в дрожжевую клетку. При наращивании
Sacch.cerevisiae одновременно в культуральной среде накапливается
HBs-антиген, используемый после очистки в получении вакцинного пре­
парата против гепатита В. Как компоненты противотуберкулезной вак­
цины получены рекомбинантные белки теплового шока М. tuberculosis.
- терапевтические. Ряд гормонов, иммуномодуляторов и цитокинов
очень востребованы в современной клинике, но получение их в промыш­
ленных масштабах нерентабельно.
Например, лейкоцитарный интерферон получаютиз донорской крови
человека. Из 1 л крови получают 2— 3 дозы высококонцентрированного
интерферона. На курс лечения онкологического больного требуются
сотни доз препарата. Следовательно, массовое производство и приме­
нение лейкоцитарного интерферона из крови нереально.
Производство лейкоцитарного интерферона методом генетической
инженерии значительно экономичнее и не требует дефицитного сырья
(крови). Его получают путем наращивания биомассы рекомбинантных
микроорганизмов, продуцирующих человеческий интерферон. Из 1 л
культуры рекомбинантных бактерий получают 100— 150 доз лейкоци­
тарного интерферона. Подобная ситуация с инсулином, соматотропином, цитокинами. Поэтому вышеуказанные биологически активные сое­
динения получают генно-инженерной технологией, используя в качестве
продуцента микроорганизмы, тканевые и растительные клетки. В зави­
симости от биологического действия терапевтические белки и пептиды
подразделяются на следующие группы:
- гормоны (инсулин, соматотропин и др.);
- цитокины (интерфероны, интерлейкины, факторы роста клеток
костного мозга - колониестимулирующие факторы и эритропоэтин, фак­
торы некроза опухолей и др.);
154
- факторы свертывания крови (рекомбинантный активатор ткане­
вого плазминогена - rt РА; рекомбинантный VIII фактор свертывания
крови; рекомбинантный активированный VII фактор свертывания или
проконвертин - rVlla и др.);
- ферменты (рекомбинантная проурокиназа, рекомбинантная
альфа-ДНК-аза и др.);
- вакцины (вирусный гепатит В, ротавирусная инфекция и др.).
К наиболее распространенным относятся рекомбинантные препа­
раты инсулина, эритропоэтина, интерферона, гранулоцитарного коло­
ниестимулирующего фактора и некоторых других цитокинов человека.
Основные продуценты —рекомбинантные штаммы кишечной палочки,
дрожжей-сахаромицетов и трансгенные клетки почек сирийского и
китайского хомячков.
Некоторые из рекомбинантных белков (инсулин, гормон роста) абсо­
лютно идентичны природным белкам человека. Другие, например реком­
бинантный эритропоэтин, имеющий гликопротеидную природу иденти­
чен эритропоэтину человека по структуре полипептидной цепи, но отли­
чается от них по строению боковых углеводных цепей в зависимости от
продуцирующей линии животных клеток. Кроме того, путем генетиче­
ской модификации изменяется аминокислотная последовательность и
у продуцируемого рекомбинантного белка, имевшего аналогичную при­
родным соединениям структуру и активность, тем самым усиливается,
изменяется первоначальная биологическая активность белка либо пеп­
тида, делая их более эффективными. Это в какой-то степени подобно
технологии получения полусинтетических антибиотиков, когда химиче­
ским путем модифицируя боковые группы бета-лактамного кольца при­
родного пенициллина получают ампициллин или оксациллин.
Технология получения рекомбинантны х белков включает следу­
ющие этапы:
- выделение из человеческих клеток генов (фрагменты ДНК, кДНК),
ответственных за синтез тех или иных терапевтических белков (инсу­
лина, интерферона, факторов свертывания крови и др.) при помощи
специфических рестриктаз;
- подготовка вектора на основе плазмид либо вирусного генома,
несущего в своем составе вышеуказанные гены. С этой целью вначале
трансфицируемый фрагмент ДНК обрабатывается ферментом рестриктазой. В результате образуется ДНК с «липкими концами», которая может
соединяться с любой молекулой ДНК, имеющей комплементарные лип­
кие концы. ДНК- лигаза ковалентно связывает две нити в одну рекомби­
нантную молекулу ДНК. Затем конструированная молекула ДНК встра­
ивается в вектор на основе генома вирусов либо плазмид. Для актив­
ной экспрессии рекомбинантного белка наряду с кДНК в вектор вводятся
155
промотор, сайт связывания с рибосомой и терминатор, а также маркер­
ный ген, обеспечивающий селекцию и идентификацию клеток, продуци­
рующих рекомбинантный белок;
трансфицирование ранее подготовленных клеток- продуцент
(микроорганизмы, клетки растительного или животного происхождения)
вектором, несущим целевые гены (фрагменты ДНК, кДНК).
В качестве продуцентов рекомбинантных белков более широко
используются микроорганизмы, чаще бактерии - Esherichia coli и дрожжи
- Saccharomyces cerevisiae. Микроорганизмы чаще используются потому,
что их проще культивировать в биореакторах; они не столь требова­
тельны к составу питательных сред, нежели суспензии растительных
или животных клеток; намного быстрее наращивают биомассу, бла­
годаря более быстрому циклу клеточного деления; технологичны, т.е.
легче адаптируются к условия технологического процесса. При этом в
прокаритной системе имеет место высокая экспрессия целевого гена с
продукцией достаточно большого количества рекомбинантного белка.
Вместе с тем, если при дрожжевой экспрессии имеет место опре­
деленная посттрансляционная модификация, синтезируется не гибрид­
ный, а нативный, функцинально активный, растворимый рекомбинант­
ный белок, то в прокариотах не имеющих системы посттрансляционной модификации, синтезируемый рекомбинантный белок часто сое­
динен с белками микробной клетки, т.е. он функционально не активен и
агрегируется. На начальных этапагенно-инженерных работ по синтезу
рекомбинантных белков в бактериальных клетках камнем преткнове­
ния была агрегация целевого белка и его внутриклеточное накопление,
представлявшие определенные сложности, дополнительные работы по
его выделению и очистке. Поэтому с целью предупреждения его дена­
турации, использовался стабилизатор - сывороточный альбумин (в тех­
нологии получения интерферона), либо вводилась композиция из моче­
вины, аминокислот и детергентов с последующей сублимационной суш­
кой (рекомбинантный эритропоэтин) и др. Из-за отсутствия посттрансляционных модификаций (гликозилирования, ацетилирования, фосфорилирования, карбоксилирования), продуцируемый рекомбинант­
ный белок не проявлял биологической активности. Например, инсулин
в клетках Лангерганса синтезируется в виде проинсулина и представ­
ляет собой одноцепочечную молекулу. После удаления специфическими
протеазами полипептидного сегмента он преобразуется в двухцепочеч­
ную молекулу с внутри- и межцепочечными дисульфидными мостиками.
Присоединение простетической группы с образованием сложных бел­
ков и объединение протомеров в олигомерный белок также происходит
после завершения трансляции. Подобные посттрансляционные моди­
фикации необходимы для получения биологически активного инсулина.
Современные, более совершенные генно-инженерные технологии,
156
молекулярные биотехнологии позволяют при определенных условиях in
vitro регулировать процессы фолдинга и рефолдинга продуцируемого
прокариотами рекомбинантного белка. Подобные возможности внесли
свои положительные коррективы в использование прокариотных систем
в качестве продуцентов рекомбинантных белков. Процесс формирова­
ния вторичной и высокоспецифической пространственной структуры
белка в ходе его рибосомного синтеза, называемый сворачиванием, или
фолдингом (folding) регулируется с помощью специфических низкомо­
лекулярных белков регуляторов - шаперонов и шаперонинов (те и дру­
гие относятся к белкам теплового шока). Использование этих белковых
систем позволяет успешно проводить рефолдинг ненативных (нефунк­
циональных) полипептидов, представляющих собой как цепи, новооб­
разованные в процессе биосинтеза, так и денатурированные формы
белков,возникшие в результате клеточного стресса.Агрегация рекомби­
нантных белков в цитоплазме бактерии в виде телец включения, благо­
даря новым технологиям оказывается дает определенные преимуще­
ства, а именно накопление большого количества целевого белка, высо­
кая степень его чистоты, защита рекомбинантного белка от протеолитического расщепления внутриклеточными ферментами, простота их
выделения из телец включения и отделения от бактериальных белков,
возможность ренатурации (рефолдинга) целевого белка.
Вместе с тем сохраняются такие проблемы, как контаминирование
минорными примесями (гидрофобные белки, компоненты клеточной
стенки), которые могут влиять на ренатурацию, трудность отделения
ренатурированного белка от его олигомерных форм, продуктов непра­
вильного фолдинга и частичного протеолиза. Одной из причин является
отсутствие универсальных, принципиально единых, хорошо отработан­
ных механизмов фолдинга in vitro.
Синтез рекомбинантных терапевтических белков осуществляется
ex vivo в биореакторах (культуры микроорганизмов и суспензии кпеток
животного и растительного происхождения), либо они накапливаются
in vivo в листьях, корнях, плодах трансгенных растений, в молоке и иной
ткани трансгенных животных. При последующем выделении и очистке
рекомбинантного белка наряду с технологией последовательной де- и
ренатурации с целью получения его в активной растворимой форме,
используются различные методы хроматографии. Очищенный реком­
бинантный белок исследуют на наличие микробных эндотоксинов, бел­
ков клеток хозяина или белков питательной среды методами иммуноана­
лиза и электрофореза в полиакриламидном геле, в присутствии натрия
додецилсульфата. Наличие остатков ДНК штамма-продуцента (оста­
точная ДНК) определяется ДНК-гибридизацией и УФ-спектрометрией.
Обязателен контроль на возможную контаминацию клеток-продуцентов
микоплазмами, вирусами и другими микроорганизмами.
157
Использование суспензии клеток высших растений и животного
организма в получении рекомбинантных белков в условиях биореак­
тора не столь распространено из-за определенных трудностей культиви­
рования последних in vitro, длительностью их культивирования и нара­
щивания биомассы, порой недостаточной экспрессией целевого гена в
этих клетках и др.
Технологии получения рекомбинантных белков в организме транс­
генных животных и растений, также как их получение в культуре микро­
организмов, растительных и животных клеток основаны на использова­
нии рекомбинантной ДНК, кДНК. Отличие в том, что кДНК в составе век­
тора вводится в организм растений либо животных и синтез рекомби­
нантных белков происходит не ex vivo, a in vivo. Эти технологии более
сложны, так как затрагивают систему целого организма, а не одной линии
клеток, к тому же существуют опредепенные биоэтические проблемы и
вопросы биобезопасности.
При приготовлении жидкой лекарственной формы рекомбинант­
ный белок растворяют в биосовместимом буферном растворе, содер­
жащем неионный детергент и в некоторых случаях дополнительно ста­
билизатор. Используются в качестве детергентов Tween, Nonidet и др. В
качестве биосовместимых буферных систем могут быть использованы
изотонические буферные растворы на основе цитратов, ацетатов, фос­
фатов и др. В ряде случаев для корректировки осмолярности растворы
могут содержать в качестве стабилизатора биосовместимые полимер­
ные компоненты - многоатомные спирты, декстрины, поливинилпирролидоны и др.
Технология получения реком бинантного инсулина
В медицинской практике применяются два основных типа гормонов,
различающихся по мопекупярному строению: стероидные и пептидные.
К стероидным гормонам относятся кортизон и преднизолон (широко при­
меняются при терапии бронхиальной астмы, ревматоидного артрита и
других болезней), эстроген (для оральной контрацепции,терапии иной
патологии). Пептидные гормоны (соматотропин, инсулин,интерлейкины
и интерфероны) получают в основном с помощью генетически модифи­
цированных микроорганизмов.
При получении генно-инженерного инсулина в качестве продуцента
чаще используются Escherichia coti и Sacch.cerevisiae. При этом пред­
шественник инсулина - проинсулин синтезируется как часть полипеп­
тида в виде телец включения, либо секретируется в периплазматическое пространство.
Технология получения рекомбинантного инсулина включает сле­
дующие стадии:
- конструируется вектор на основе плазмиды со встроенной кДНК
158
инсулина человека Полученная конструкция амплифицируется на
матрице одноцепочечной кДНК клеток Лангерганса поджелудочной
железы человека. Используются праймеры PI (прямой праймер) и Р2
(обратный праймер). Праймер PI совпадает с последовательностью
В-цепи гена инсулина человека, начиная с A rg 22препроинсулина чело­
века, и содержит участок распознавания эндонуклеазы Ndel, необходи­
мый для клонирования. Обратный праймер (Р2) является комплемен­
тарным амино- терминальному фрагменту A-цепи инсулина и содержит
EcoRI участок, также для целей клонирования. Далее плазмидная ДНК
расщепляется эндонуклеазами рестрикции Ndel и EcoRI, затем кДНК
которая была расщеплена теми же ферментами трансформируется в
данный вектор.
- трансформация клеток Е. coli полученным плазмидным вектором,
несущим кДНК, который кодирует синтез проинсулина с участками рас­
познавания трипсина в последовательности полученного слитого поли­
пептида;
- трансформированные плазмидым вектором клетки E.coli далее
выращиваются на соответствующей питательной среде в колбе или фла­
коне и инкубируются в течение 15 часов на шейкере при 37°С и 250 об/
мин. Последующие этапы наращивания биомассы модифицированного
микроорганизма проводятся в аэрируемых биореакторах с гомогени­
зацией и пеногашением, pH 7,0. Культивирование в этих условиях при­
водит к экспрессии кДНК и продукции рекомбинантных белков в форме
телец включения;
- разрушение клеток и выделение продуктов экспрессии.
Бактериальные клетки лизируют, чтобы высвободить тельца включе­
ния, содержащие полипептид- предшественник инсулина. Лизис клеток
проводят повторным замораживанием и оттаиванием, ультразвуковой
дезинтеграцией либо обработкой лизоцимом при температуре ниже
20°С.
- растворение полипептида в присутствии денатурантов и восста­
навливающего агента с последующим рефолдингом. Концентрирование
рефолдированного полипептида чаще проводится ультрафильтрацией
либо хроматографией (например, ионнообменной, гидрофобной или
афинной).
- протеолитическое расщепление полипептида, проинсулина осу­
ществляется одновременно двумя ферментами - трипсином и карбоксипептидазой В, получают инсулин;
- выделение и очистка инсулина.
Таким образом, последовательность синтеза инсулина следующая:
синтез проинсулина в Escherichia coli в форме гибридного полипептида;
рефолдинг (ренатурация) гибридного полипептида с целью формиро­
вания правильных дисульфидных связей; протеолитическое расщепле159
ние рефолдированного полипептида трипсином и карбоксипептидазой
В; очистка полученного продукта с использованием ионообменной хро­
матографии и высокоэффективной жидкостной хроматографии, после
ионообменной хроматографии кристаллы инсулина растворяют соответ­
ствующими реагентами с последующей микро- и ультрафильтрацией и
получением высокоочищенного инсулина.
При получении интерферонов в качестве продуцентов исполь­
зуются генетически модифицированные Е. coli и Sacch. cerevisiae,
культивируемые клетки насекомых (Drosophila) и млекопитающих.
Рекомбинантные интерфероны могут быть очищены не только выше­
приведенными методами, но и с использованием моноклональных анти­
тел, специфически связывающихся с данными белками. В отличие от
альфа-интерферонов, при получении бета и гамма - интерферонов пред­
почтительны в качестве продуцентов эукариотические клетки дрожжей
Sacch. cerevisiae, культуры фибробластов человека, генетически моди­
фицированные животные клетки и др.
Терапевтические антитела
Культуры клеток ex vivo, в лабораторных условиях используются
для получения терапевтических и диагностических моноклональных
антител при помощи гибридомной технологии; при диагноститке вирус­
ной инфекции и получении противовирусной вакцины, в технологии экс­
тракорпорального оплодотворения, при тестировании лекарственных
средств.
В основе получения гибридом, продуцирующих моноклональные
антитела лежит технология слияния атипичных (способных «беско­
нечно» делиться) и нормальных (способных продуцировать монокло­
нальные антитела) лимфоцитов в присутствие веществ, способству­
ющих слиянию мембран этих клеток (полиэтиленгликоль - ПЭГ, вирус
Сендай и др.).
Лабораторные животные (мыши, крысы) в течение 1-2 месяцев
повторно иммунизируются антигеном, против которого предполагается
получение моноклональных антител. Затем из селезеночной пульпы
иммунизированных животных выделяются лимфоциты, способные про­
дуцировать соответствующие антитела. А миеломные лимфоциты выде­
ляют из опухолевой ткани -миеломы. Затем оба типа клеток культиви­
руют в питательной среде, содержащей ПЭГ
После слияния клетки в течение 10-14 дней поддерживают в среде,
содержащей гипоксантин, аминоптерин и тимидин. Аминоптерин бло­
кирует синтез нуклеотидов, поэтому клетки материнской миеломы
погибают. В отличие от миеломы, гибридные клетки и В-лимфоциты,
выживают за счет использования гипоксантина как источника пури­
нов, но продолжительность жизни обычных лимфоцитов ограничена, и
160
через несколько недель в культуре остаются только клетки гибридомы.
Поскольку не все из них образованы путем слияния миеломы с лимфо­
цитами, производящими нужные антитела, клетки делят на линии, кото­
рые поддерживают в отдельных ячейках 96-луночных плашек. Далее в
среде над клетками определяют антитела и отбраковывают клеточные
линии, не производящие антитела или недостаточно быстро размножа­
ющиеся. При достаточно хорошем разведении клеточной суспензии в
одну пунку попадает не бопее одной гибридной клетки, но для гаран­
тированного качества и стабильности культуры отобранные клеточные
линии могут быть еще раз клонированы с тем, чтобы антитела произво­
дились потомками одной гибридной клетки, т.е. были моноклональными.
Клонированную культуру гибридомы затем пересевают из лунки
96-луночной плашки в сосуды большей емкости для размножения, хране­
ния в жидком азоте и получения большего количества антител для даль­
нейших исследований. Из культуральной среды можно получить от 1 до
60 pg/ml моноклональных антител. Большее количество можно получить
путем введения клеточной суспензии в брюшную попость мышей, где
гибридома размножается и секретирует антитела во внутриполостную
жидкость с образованием асцита. Таким образом, гибридомы получают
при слиянии нормальных В-лимфоцитов , продуцирующих антитела, с
подходящей опухолевой линией В- клеток. Гибридомы обладают свой­
ствами обеих родительских клеточных линий. Затем гибридомы отби­
рают в культуральной среде, неспособной поддерживать рост родитель­
ских клеток. Путем последовательных разведений и пересевов получают
одиночные клоны, которые можно выращивать в роллерных культурах
или в форме асцита в брюшной попости мышей. В последнем случае
удается попучать особенно высокие титры моноклональных антител.
Изначально моноклональные антитела, благодаря высокой спец­
ифичности взаимодействия с антигеном нашли широкое применение
в разработке тест-систем для диагностики инфекционных и соматиче­
ских болезней (иммуноферментный анализ, реакция иммунофлюорес­
ценции, радиоиммунный анализ). В последующем были разработаны
технологии адресной доставки лекарств к клеткам и тканям поражен­
ного органа путем конъюгирования лекарственного вещества с моно­
клональным антителом, избирательно взаимодействующим с рецепто­
рами соответствующих клеток организма.
Далее стали использоваться новые механизмы терапевтического
действия моноклональных антител на клетки-мишени: иммуноопосредованная (антитело- и комплементзависимая) цитотоксичность, стиму­
ляция фагоцитоза и блокада рецепторов опухолевых клеток, торможе­
ние роста опухоли за счет блокады образования в ней новых кровенос­
ных сосудов.
При применении с терапевтической целью моноклональных анти­
161
тел, полученных на мышиных гибридомах существует потенциальный
риск иммунной реакции организма на чужеродный белок. Поэтому для
снижения подобного риска были разработаны химерные, гуманизиро­
ванные и одноцепочечные антитела путем сочетанного использования
гибридомной технологии и технологии рекомбинантной ДНК:
а) химерные антитела. Химерные (или гибридные) антитела (chimaeric antibodies)- это антитела, в которых константный домен мышиных
антител замещен соответствующим константным доменом иммуноглобу­
лина человека. При помощи рекомбинантной технологии соединяются
разнородные молекулы ДНК, кодирующие человеческий Fc-фрагмент и
мышиный Fab-фрагменты антитела. Поскольку иммуногенные и эффекторные (взаимодействие с системой комплемента, фагоцитами и др.)
свойства антител определяются в основном его константным доменом,
а специфичность взаимодействия с антигеном определяется вариабель­
ным доменом, то, естественно, химерные антитела (Fc-фрагмент чело­
веческий, а Fab-фрэгмент мышиный) вызывают значительно меньше
осложнений при сохранении специфичности, аффинности и авидности,
свойственных мышиным моноклональным антителам;
б) гуманизированные антитела. В структуре гуманизированных
антител мышиное происхождение имеют только небольшие антигенсвязывающие гипервариабельные участки (CDR) вариабельного доменаFv-фрагмента. Если у химерных антител варибельный домен полностью
является мышиным, то у гуманизированных только его часть живот­
ного происхождения. Fv-фрагмент состоит из трех CDR участков (CDRI,
CDRII, CDRIII). С помощью олигонуклеотид-направленного мутагенеза
осуществляют последовательную замену только одного или двух CDR
участков ДНК человека на соответствующий CDR участок ДНК мыши.
Таким образом гуманизированные антитела в отличие от химерных
содержат еще меньше чужеродного белка (только часть CDR мыши­
ного происхождения) и соответственно вероятность иммунного оттор­
жения существенно ниже. Это в основном снимает проблему иммунного
ответа на введение антител больному с терапевтическими или диагно­
стическими целями;
в) одноцепочечные антитела. Наряду с полноразмерными химер­
ными и гуманизированными антителами генная инженерия позволяет
получать и одноцепочечные, мини-антитела, состоящие только из участ­
ков Fv- фрагмента (scFv). Это вариабельные домены легких и тяжелых
цепей (VL u Vh) иммуноглобулина, ковалентно соединенные гибким пеп­
тидным линкером; константные домены исходного мышиного антитела
полностью отсутствуют. Таким образом, одноцепочечные мини-антитела
представляют собой минимальный фрагмент молекулы иммуноглобу­
лина, который обладает достаточно хорошей антигенсвязывающей
активностью.
162
В перспективе будут созданы полностью человеческие рекомби­
нантные антитела путем объединения вариабельных доменов антител
человека, обладающих целевой активностью, с константными доменами
иммуноглобулинов человека нужного изотипа. Такие антитела синтези­
руют в эукариотических клетках, обеспечивающих правильную конфор­
мацию и гликозилирование молекул иммуноглобулинов.
Ключевой стадией в создании полноразмерных человеческих анти­
тел является получение вариабельных доменов, отвечающих за специ­
фичность антитела, его аффинность и биологические свойства. Одним
из способов их получения является отбор вариабельных доменов из ком­
бинаторных фаговых библиотек мини-антител. Каждый бактериофаг в
такой библиотеке экспонирует на своей поверхности только одно анти­
тело уникальной специфичности (фаговое антитело). Репертуар анти­
тел в таких библиотеках может достигать 1012различных мини-антител.
В ходе процедуры аффинной селекции (biopanning) можно существенно
обогатить исходную библиотеку бактериофагами, несущими на своей
поверхности мини-антитела нужной специфичности, и затем из обога­
щенной популяции отобрать мини-антитела с нужными свойствами. Для
получения рекомбинантных антител с заданными свойствами в насто­
ящее время широко используют комбинаторные библиотеки одноцепо­
чечных (scFv) антител и Fab-фрагментов, сконструированных на основе
нитчатых бактериофагов E.coli.
В настоящее время в лечебной практике применяется несколько
десятков препаратов на основе моноклональных антител. Особо важ­
ное значение имеет применение терапевтических антител для целена­
правленного токсического воздействия на опухолевые клетки, не затра­
гивая при этом здоровые ткани. Для повышения избирательности дей­
ствия на опухоли токсины и радиоактивные вещества предварительно
конъюгируют с антителами, что обеспечивает их доставку непосред­
ственно к опухолевым клеткам.
Моноклональные антитела, связанные с токсинами, называются
иммунотоксинами. Для их получения к антителам чаще всего присоеди­
няют бактериальные (дифтерийный, псевдомонадный) или раститель­
ные (рицин А, сапорин) токсины. Показана эффективность применения
иммунотоксинов для лечения лимфом и некоторых других опухопей.
С целью радиотерапии используются конъюгаты фрагментов моно­
клональных антител с радиоактивными изотопами (йод-131, иттрий-90
и др.). Учитывая малую проникающую способность нагруженных изо­
топами антител, их применение возможно для небольших опухолей и
метастазов, но не для крупных опухолевых очагов. Гуманизированные
моноклональные антитела применяются при трансплантации костного
мозга с целью связывания донорских Т-клеток и предупреждения реак­
ции «трансплантат против хозяина».
163
Перспективы создания новых лекарственных средств
Индивидуальность генома каждого человека проявляется отли­
чиями в экспрессии тех или иных генов и, соответственно, отличиями в
динамике метаболических процессов в организме. Поэтому чувствитель­
ность, реагирование каждого пациента на одно и то же лекарственное
средство будет отличаться. И такая вариабельность ответной реакции
больных на прием лекарственных препаратов, обусловленная генетиче­
скими различиями между представителями разных популяций, распро­
странена. Причем наследственная детерминированность особенностей
ответной реакции на данное лекарство достаточно стабильна.
Фармакогеномика позволяет оценить данную индивидуальную осо­
бенность реагирования на лекарственное средство в зависимости от
генетических особенностей организма и рекомендовать наиболее при­
емлемые и эффективные в каждом конкретном случае препараты, т.е.
позволяет проводить индивидуальную фармакотерапию.
Биоинформатика - наука о применении компьютерных технологий,
в частности в моделировании различных нуклеотидных последова­
тельностей (т.е. в определенной степени создание различных вариантов
генетических особенностей) и оценки влияния при этом тех или иных
препаратов на мишень (клетка,орган). Компьтерные технологии позво­
ляют проводить поиск и выявлять клетки, рецепторы, реагирующие на
исследуемое лекарственное средство и анализировать данную реак­
цию. Более того, модифицируя известные лекарственные средства, на
основе математических и статистических пространственных моделей
можно «спроектировать» лекарства с заданными параметрами, т.е. целе­
направленно создать новое лекарственное средство, его компьютерную
модель. А затем в лаборатории, разработав данный препарат провести
предкпнические и клинические испытания.
164
V. ВОПРОСЫ БИОЭТИКИ И БИОБЕЗОПАСНОСТИ
Классическая биотехнология, основанная на микробиологическом
синтезе и фармтехнологии, для медицинской отрасли является, прежде
всего, технологией получения биопрепаратов (антибиотики, ферменты,
аминокислоты, фармпрепараты). В качестве биообъектов использу­
ются лекарственные растения и промышленные микроорганизмы, а
инженерная составляющая - это биореакторы, в которых осуществля­
ется ферментационный процесс наращивания биомассы продуцента
и выделение из нее искомой биологической субстанции медицинского
назначения. Ферментационная технология с позиции биобезопасности
рассматривается как технология «двойного назначения», так как один
и тот же технологический процесс и комплекс оборудования (фермен­
теры, сепараторы, распылительные сушилки и др.) можно использовать
как для получения полезной биотехнологической продукции, так и для
наращивания биомассы особо опасного возбудителя, наработки ток­
синов микроорганизмов и др.
Современные биомедицинские технологии, основанные на генной
инженерии и молекулярной биологии, на использовании в качестве
терапевтического средства рекомбинантных ДНК и стволовых клеток
создают принципиально новые возможности в профилактике и лечении
болезней, в мониторинге и поддержании здоровья и качества жизни
человека. Это генная и клеточная терапия, трансплантация клониро­
ванных тканей и органов, экстракорпоральное оплодотворение.
Естественно, внедряемые в клинику современные биомедицин­
ские технологии требуют совершенствования, определенной стандар­
тизации и четкой предопределенности результатов их применения. Это
реально существующие проблемы как научного, так и практического
характера. Для общества стали более актульными проблемы биоэ­
тики, порождаемые современными биомедицинскими технологиями, в
том числе проблемы преступного бизнеса человеческими органами,
коммерциализация суррогатного материнства, не всегда обоснован­
ного применения стволовых клеток и т.д.
Биоэтика в биомедицинских технологиях
Биоэтика - учение о нравственной стороне деятельности чело­
века в медицине и биологии. На каждом этапе развития биологиче­
ской науки, теоретической и практической медицины имели и имеют
место соответствующие своему времени актуальные биоэтические
проблемы. Методические пути их регулирования основываются на
известных принципах (не «навреди», а «делай благо» пациенту; инфор­
мированное согласие пациента; справедливое и равное отношение к
165
пациентам; справедливое распределение ресурсов в системе здра­
воохранения) и правилах (сохранение конфиденциальности, макси­
мально квалифицированное лечение, коллегиальность медицинских
работников в оказании помощи пациенту, моральная поддержка боль­
ного и т.д.).
Когда в 1962 г. в больнице города Сиэтл (штат Вашингтон) поя­
вился первый аппарат «искусственная почка», врачи оказались перед
сложнейшей проблемой: как установить очередность в подключении
к аппарату, предоставляя лечение и спасая от верной смерти одних
пациентов, страдающих от почечной недостаточности, но тем самым
обрекая на смерть других — столь же нуждающихся. В Сиэтле, однако,
медики сочли, что они не вправе брать на себя ответственность за уста­
новление очередности доступа к аппарату, спасающему жизнь, учиты­
вая чрезвычайную моральную сложность проблемы. Для установле­
ния очередности они предложили создать комитет из уважаемых граж­
дан, названный в прессе «божественным комитетом», который решал,
кому предоставить возможность спасения, а кого обречь на неминуе­
мую смерть. Это был первый в истории этический комитет. В этом при­
мере, между прочим, отчетливо отразилась одна из ключевых черт био­
этики: вопрос о применении новой технологии рассматривался с уча­
стием не только специалистов, но и широкой общественности.
3 декабря 1967 г. южноафриканский хирург Кристиан Барнард пер­
вым в мире пересадил сердце от одного человека другому. Он спас
жизнь неизлечимому больному, изъяв бьющееся сердце у женщины,
мозг которой был необратимо поврежден в результате автомобильной
катастрофы. Общественная реакция на это революционное событие
оказалась крайне противоречивой. Одни превозносили Барнарда как
героя, создавшего метод спасения сотен тысяч неизлечимых больных.
Другие же, напротив, обвиняли его в убийстве: ведь он изъял еще бью­
щееся сердце! Прервал одну жизнь, чтобы спасти другую! Имел ли он
на это право? Или убийства не было, поскольку, если у человека погиб
мозг, то он фактически уже мертв независимо от того, бьется или не
бьется его сердце?
Этические вопросы, касающиеся больных СПИДом сегодня не
менее актуальны, чем вчера при возникновении данной проблемы.
Почему? Нравственные вопросы возникли в обществе после позна­
ния полового пути распространения инфекции. Далее сформировалась
проблема поддержки и защиты этих людей, так как болезнь, как оказа­
лось, передается не только половым путем; человек может заразиться
при перепивании крови, экстракции зуба и другими путями. Особо суще­
ственно в данной проблеме то, что болезнь радикально не излечива­
ется, больные и общество знают об этом. В данном случае социально­
этические проблемы обусловлены, прежде всего, высокой опасностью
166
и трудностью борьбы с возбудителем этой инфекции.
Вопрос о дальнейшем аппаратном поддержании жизни реани­
мационного больного, также имеет правовые и этические стороны.
Благодаря современным технологиям интенсивной терапии, не столь
редки случаи поддержания функционирования жизненно-важных орга­
нов больного, но при уже наступивших необратимых изменениях в коре
гоповного мозга.
Трансплантация органов (чаще почек) от умерших людей либо при­
жизненное изъятие органа у ближайших родственников всегда имеет
правовые и нравственные аспекты.
Проведение аборта, кроме законодательного решения, сопрово­
ждается проблемами этического характера.
Вышеприведенные примеры биоэтических проблем, возникаю­
щих между врачом и пациентом, научной средой и обществом обуслов­
лены применением новых технологий. Когда новая технология лече­
ния либо терапия, связанная с воздействием на генетический аппарат
впервые апробируется в клинике, то естественно, возникают как чисто
научные, так и этические вопросы и проблемы.
Вместе с тем, даже один успешный клинический результат при­
менения современной биомедицинской технологии уже дает право на
дальнейшие исследования по совершенствованию и использованию
данной технологии, особенно в тех случаях, когда нет альтернатив­
ных способов оказания помощи пациенту. При этом, несмотря на то,
что новая технология тщательно выверяется в эксперименте in vitro и
in vivo, существует огромный нравственный барьер, который необхо­
димо преодолеть как пациенту и врачу, так и обществу в целом, раз­
решая либо запрещая данную технологию. Поэтому биомедицинские
исследования по разработке и применению новых технологий лечения,
профилактики и диагностики заболеваний человека регулируются как
законодательно, так и этическими принципами и правилами.
В данной сфере человеческой деятельности проблемы этиче­
ского регулирования осуществляются в соответствии с принципами,
разработанными международными и национальными комитетами и
комиссиями по биоэтике, действующими в составе ООН, ЮНЕСКО,
ВОЗ, Совете Европы, Европейском Союзе и др. Эти принципы изложены во всеобщей декларации о биоэтике и правах человека (ЮНЕСКО,
1997г., 2005 г.), пояснитепьном докладе кдопопнительному протоколу к
Конвенции о правах человека, биомедицине и биомедицинских иссле­
дованиях (Совет Европы, Страсбург, 2004 г.), Хельсинкской деклара­
цией «Рекомендации для врачей, участвующих в биомедицинских
исследованиях» (1964 г.) Столь же действенны Декларация о клониро­
вании человека и юридически обязывающая Конвенция о защите прав
и достоинства человека в связи с применением достижений биологии
167
и медицины (ООН, 2005г.). Ранее разработанная Руководящим коми­
тетом по биоэтике Совета Европы Конвенция о правах человека и био­
медицине (1997г.) и дополнительные протоколы к ней акцентированы
на запрете клонирования человека. Высоким международным автори­
тетом пользуется и более поздний документ Хельсинской декларации
«Этические принципы проведения научных медицинских исследова­
ний с участием человека» (2000г.). Рабочая группа по биоэтике функ­
ционирует при Всемирной Организации Здравоохранения.
По мере того как расширялась практика биомедицинских иссле­
дований, совершенствовалась и деятельность этических комитетов.
В разных странах действуют свои схемы взаимодействия комитетов
различных уровней - местных, функционирующих на уровне лечебного
или исследовательского учреждения, региональных и, наконец, наци­
ональных. Национальные этические комитеты и комиссии функциони­
руют при органах законодательной либо исполнительной власти. Ими
изучаются и подготавливаются рекомендации и решения по наиболее
острым и актуальным проблемам биоэтики, по поводу которых сталки­
ваются интересы разных социальных, религиозных, этнических, поло­
возрастных и прочих групп населения.
Особенно актуальны этические проблемы, связанные с разра­
боткой и применением следующих современых биомедицинских тех­
нологий:
- ДНК-технологии (генная терапия);
- клеточные технологии (получение и применение стволовых кле­
ток, трансплантация и клонирование органов);
- репродуктивные технологии (оплодотворение in vitro).
Генная терапия и биоэтика
Первый клинический протокол генотерапии датируется 14 сен­
тября 1990 года. В этот день в Национальном институте здоровья
США была проведена первая операция для лечения довольно ред­
кого моногенного наследственного заболевания, обусловленного мута­
цией в гене аденозиндезаминазы. Наследственный дефект в син­
тезе этого фермента сопровождается тяжелейшим иммунодефици­
том и беззащитностью больного перед любой инфекцией. С лечеб­
ной целью у четырёхлетней пациентки из крови при помощи цитофереза выделили лимфоциты и трансфицировали их нормальным геном,
кодирующим синтез аденозиндезаминазы. Генетически модифициро­
ванные лимфоциты реинфузировали в кровеносное русло больной
девочки. Положительный эффект (усиление иммунной защищенно­
сти организма) не был постоянным, а наблюдался в течение несколь­
ких месяцев, после чего процедуру необходимо было повторять
(каждые 3-5 месяцев). Но в результате повторных реинфузий генно168
модифицированных лимфоцитов состояние пациентки настолько улуч­
шилось, что она смогла вести нормальный образ жизни, не бояться слу­
чайных инфекций и посещать школу.
Столь же сенсационным в истории генной терапии был и случай
генотерапии со смертельным исходом. Семнадцатилетний Д. Гелзингер
страдал тяжелым моногенным наследственным заболеванием печени
- недостаточностью фермента орнитинтранскарбомилазы (OTCD).
Больному был иньецирован непатогенный, генно-модифицированный
аденовирус, содержащий ген OTCD. Естественно, прежде чем при­
ступить к лечению таких больных, технология была апробирована на
лабораторных животных. Подобную операцию с успешным клиниче­
ским эффектом ранее перенесли семнадцать человек. Но Д.Гелзингер
скончался вследствие гиперреакции иммунной системы на введение
генно-модифицированного аденовируса. Этот случай стали достоя­
нием всей мировой научной и медицинской общественности. Почему?
Потому что в лечении наследственной патологии впервые была при­
менена новая технология, еще неизвестная общественности, еще не
совершенная по техники исполнения и предопределенности исхода
с научной точки зрения.
Вместе с тем понятно и то, что любое новое позитивное начало
в любой области человеческой деятельности, особенно в медицине и
биологии обязательно должно пройти через научный и общественный
резонанс, должно пройти испытание практикой.
Подавляющее большинство клинических протоколов в области
генной терапии направлены на лечение онкологических, сердечно­
сосудистых (постинфарктная сердечная недостаточность и др.) и моногенных наследственных заболеваний, а также социально особо акту­
альных инфекций (ВИЧ и др.), т.е. той патопогии, где на сегодня нет тех­
нологий радикального излечения.
Международным сообществом приняты документы о этическом и
правовом регулировании исследований по геномике,так и о примене­
нии ее достижений в медицинской практике и в других сферах жизни
общества, основанные на следующих положениях:
- приоритет интересов индивида над интересами науки, общества
и иными нтересами;
- допустимость вмешательства в геном человека только в терапев­
тических целях и тогда, когда оно не направлено на изменение генов в
потомстве исследуемого лица;
- недопустимость использования геномных исследований как
основы для дискриминации отдельных лиц или групп населения;
- необходимость получения добровольного информирован­
ного согласия от лиц, участвующих в исследованиях или подвергаю­
щихся диагностическим и терапевтическим вмешательствам в геном.
16 9
В Декларации ЮНЕСКО отмечается - и это характерная особенность
именно генетики человека - право каждого «решать, быть или не быть
информированным о результатах генетического анализа и его послед­
ствиях». Дело в том, что методы генетического анализа сегодня позво­
ляют предсказать, порой с очень высокой степенью вероятности, предраспложенность к той или иной наследственной патологии, наруше­
ниям обменных процессов. К сожалению, некоторые болезни не подда­
ются лечению, так что если генетическое тестирование покажет нали­
чие у человека генов, предрасполагающих к возникновению подобной
патологии, то будет ли для него полезно знать такую информацию;
- необходимость независимой этической экспертизы каждой
заявки на проведение геномных исследований;
- обязательная доступность генетического консультирования для
испытуемых или подвергающихся медицинским вмешательствам, при
этом консультирование должно быть, насколько это достижимо, неди­
рективным, то есть консультант не должен навязывать консультируе­
мому свой выбор;
- обеспечение конфиденциальности об испытуемых, проходящих
тестирование и подвергающихся медицинским вмешательствам.
Стволовые клетки и биоэтика
Актуальность исследования стволовых клеток обусловлена их
способностью к пролиферации и дифференциации в тканеспецифиче­
ские клетки, возможность их применения с заместительной терапев­
тической целью. Стволовые клетки выделяют из эмбриональной ткани
(эмбриональные стволовые клетки) либо из пуповинной крови, кост­
ного мозга, жировой и других тканей человеческого организма (взрос­
лые стволовые клетки).
Альтернативой технологии выделения стволовых клеток из той или
иной ткани является получение стволовых клеток клонированием ех
vivo, в чашке Петри путем внесения ядра соматической клетки в энукпеированную яйцеклетку. В случае успешного клонирования на 4-5 сутки
формируется 100-клеточная бластоциста. Из внутреннего слоя бласто­
цисты извлекают клеточную массу и культивируют in vitro с целью после­
дующего выделения эмбриональных стволовых клеток.
Введенные в поврежденные органы и ткани ствоповые клетки
(выделенные из ткани или полученные клонированием, из бластоци­
сты) дифференцируются в тканеспецифические функционально актив­
ные клетки соответствующего органа. В случае клонирования бласто­
цисты с использованием ядра соматической клетки самого пациента
при последующем применении эти стволовые клетки, благодаря почти
полной генетической идентичности с клетками рецепиента не вызы­
вают иммунной реакции.
170
А каковы в данной технологии этические проблемы? Использование
эмбриональной ткани в качестве источника стволовых клеток болез­
ненная для общества проблема. Наращивание ex vivo либо получение
путем прерывания беременности челевеческого эмбриона с после­
дующим его разрушением для использования стволовых клеток в экс­
периментальных исследованиях или для клинического применения
можно расценивать как прерывание жизни. Кроме того при приме­
нении стволовых клеток существует потенциальный риск появления
генетических нарушений в этих клетках, либо их иммунного отторже­
ния (так как в основном используются аллогенные стволовые клетки),
либо перерождения в опухолевые клетки. Пока недостаточно полно
изучены и раскрыты механизмы их дифференциации в необходимый
тип клеток, и соответственно отработаны технологии регуляции этого
процесса in vitro. Вышеприведенные проблемы технологии получения и
применения стволовых клеток порождают проблемы этического плана
и в самом научном сообществе.
Конвенция о правах человека и биомедицине не разрешает в
исследовательских целях выращивать эмбрионы. Комитет по биоэтике
ЮНЕСКО рассматривает эмбрион как существо, подлежащее защите. А
Европейская группа по этике при Европарламенте в этой связи выдви­
нула на первый план проблему прав женщин, возникающую в случае
разрешения на получение и применение эмбриональных стволовых
клеток, даже из зародыша. В экспериментальных исследованиях для
получения стволовых клеток часто используется зародыш (14 суток
после иньекции ядра соматической клетки в энуклеированную яйце­
клетку), а не эмбрион (более 14 суток). По мнению этического комитета,
если такой материал станет источником получения стволовых клеток,
то женщины могут попасть под особое давление.
В некоторых европейских государствах законодательно разрешено
получение эмбрионов для научных исследований, в других - запре­
щено, в третьих - можно работать только с уже существующими лини­
ями эмбриональных клеток. Более либо менее компромиссное законо­
дательное решение в том или ином государстве по работе со стволо­
выми клетками связано с проблемами этического характера, с суще­
ствующими в данном обществе правовыми и моральными нормами.
Очевидно, что новые законодательные инициативы должны разра­
батываться экспертами, в обстановке полной прозрачности и публич­
ности, с учётом интересов всех слоёв населения. Законодательство
с намеренной отсрочкой реагирует на новые конфликты интере­
сов потребителей и создателей новых биомедицинских технологий.
Обществу нужно время, чтобы созреть для новых консолидирующих
решений, которые со временем приобретают форму законов.
В целом, с учетом существующих в тех или иных государствах пра­
171
вовых и этических запрещающих и разрешительных законов по клини­
ческому применению стволовых клеток, в конечном итоге все издержки
в решении вопроса обусловлены уровнем «зрелости» результатов фун­
даментальных и прикладных исследований, исчерпывающей полнотой
конкретных знаний и умений по сути проблемы.
Актуализация этических проблем в обществе также обусловлена
коммерциализацией технологий получения и применения стволовых
клеток. Полуконфиденциальный вариант развития подобного бизнеса
сфокусирован не на скорейший прогресс общества, а на извлечение
максимальной прибыли из научных открытий.
Трансплантация, клонирование органов и биоэтика
Законами многих стран по статейно регламентированы правила
изъятия трансплантата у живого донора, у трупа, права и обязаности
донора и реципиента. В большинстве стран при трансплантации рас­
пределение донорских ресурсов идет по принципу равноправия. Тем
не менее, существуют критерии, лимитирующие этот принцип. Прежде
всего, это гистосовместимость ткани донора и реципиента. При про­
чих равных условиях, предпочтение отдается реципиенту, у которого
прогнозируется лучший эффект трансплантации (в первую очередь
трансплантация осуществляется лицам молодого возраста без тяже­
лой сопутствующей патологии). Существуют иного рода этические про­
блемы. Следует ли «отдавать» полученный орган лицам с асоциаль­
ным поведением (наркомания, алкоголизм и пр.). Будет ли справед­
ливо лечить подобных индивидов, в то время как в листе ожидания
находятся сотни детей, молодых трудоспособных людей? При нали­
чии совершенно разных аспектов этических проблем в трансплантоло­
гии, как правило, руководствуются тремя принципами: гистосовмести­
мость пары «донор-реципиент», длительность нахождения пациента
в листе ожидания и экстренность ситуации.
В случае изъятия органа у трупа либо у живого донора особенно
важно своевременное и качественное поддержание жизнеспособно­
сти ткани, от этого зависит успех последующей операции пересадки
органа донору. Трансплантация органов живых доноров с медицин­
ской точки зрения более эффективна, нежели использование органа
трупа, так как она проводится в плановом порядке с лучшим сохране­
нием жизнедеятельности донорского органа. Естественно, у живого
донора можно извлекать только те органы и ткани, отсутствие которых
не вызывает угрозы для жизни (чаще всего почку). Вместе с тем, учи­
тывая, что изъятие органов у живого донора так или иначе сказыва­
ется на его здоровье, более предпочтительным считается использо­
вание органов умерших доноров.
Особые этические вопросы возникают, когда донором органа
172
может быть реанимационный больной, находящийся на аппарате искус­
ственного дыхания и у которого констатирована смерть коры головного
мозга. С медицинской точки зрения мозговая смерть равносильна
биологической смерти человека. Однако в обществе, у родственни­
ков подобная смерть всегда связана с очень ранимыми моральными
вопросами, связанными с потерей близкого человека. Кроме того, ино­
гда остается место для сомнений в том, а действительно ли была ока­
зана максимальная помощь для спасения жизни больного, не поспе­
шили ли врачи признать его умершим. Такие подозрения могут быть
исключены только неукоснительным соблюдением самых строгих эти­
ческих и юридических норм, существующих в трансплантологии.
В обществе этическая проблема при трансплантации органов
от живого донора связана с возможностью криминального бизнеса,
незаконного изъятия и преступная торговля органами. И это вполне
реально, так как к одной из важнейших проблем современной транс­
плантологии относится недостаток донорских органов. Как известно,
состоятельные пациенты готовы платить огромные деньги за необхо­
димый им орган. Чтобы по возможности оградить доноров от финан­
сового, криминального и иного давления, принят ряд международных
документов. Согласно дополнительного протокола к Конвенции о био­
этике Совета Европы запрещена торговля органами и тканями чело­
веческого происхождения. Живым донором может быть только лицо,
находящееся в генетическом родстве с реципиентом (это, помимо всего
прочего, уменьшает вероятность отторжения пересаженного органа.).
К современным направлениям развития биотехнологий в обла­
сти регенеративной медицины и трансплантологии относятся ткане­
вая инженерия и терапевтическое клонирование органов. Тканевая
инженерия основана на технологии наращивания из клеток кон­
структа (ткани, органа) на искусственном каркасе ex vivo с целью
последующего замещения им поврежденного органа или ткани.
Достижения в данной области клинической трансплантологии более
связаны с реконструкцией костной, хрящевой ткани, ткани кожи. Но
есть клинические результаты при трансплантации конструктов иных
органов. Так, в 2008 году была проведена первая пересадка трахеи.
Трахея была создана по сложной технологии: медики использовали
трахею недавно умершего человека, и нейтрализовав в ней химиче­
скими препаратами живые клетки, они ввели в волокнистую белковую
ткань стволовые клетки, взятые из костного мозга пациентки —реци­
пиента подготавливаемого конструкта. Эти клетки культивировались
на поверхности каркаса (трахея донора) в питательной среде с внесе­
нием ростовых факторов; в течение 4 суток сформировался монослой
эпителиальных клеток на поверхности каркаса. Подготовленный кон­
структ был трансплантирован пациентке. Через месяц кровоснабже­
173
ние пересаженного органа полностью восстановилось.
В экспериментальных исследованиях показана возможность тера­
певтического клонирования тканей и органов из стволовых клеток ех
vivo (мочевой пузырь, роговица глаза, ткань печени, ткань кожи и др.).
Тогда почему бы не использовать технологию терапевтического клони­
рования в клинике при болезнях, связанных с необратимым поврежде­
нием органов и тканей, болезнях неизлечимых известными методами.
Это, например, болезнь Альцгеймера, при которой деградирует ткань
мозга; диабет, вызванный гибелью инсулинсинтезирующих клеток; миопатия Дюшенна, приводящая к деструкции мышечной ткани; цирроз,
связанный с замещением гепатоцитов соединительно-тканными эле­
ментами и т.д.
Если биомедицинские технологии создания костного конструкта,
искусственной кожи с целью последующей трансплантации пациенту
не вызывают проблем этического характера, то с терапевтическим кло­
нированием органов ситуация иная. Появление проблем моральнонравственного характера связано с тем, что технологии терапевти­
ческого и репродуктивного клонирования принципиально одинаковы.
Технология репродуктивного клонирования начинается ex vivo с тех же
этапов, что и терапевтическое клонирование. Но на последующих эта­
пах в случае репродуктивного клонирования бластоцисты вводят при­
емной матери для продолжения ее развития вплоть до рождения кло­
нированного организма. Из бластоцисты клонируется целый организм,
идентичный донору ядра соматической клетки. Технология репродук­
тивного клонирования апробирована на животных (первой была овечка
Долли), но, принципиально возможно ее испльзование и для клони­
рования человека. Если разрешить терапевтическое клонирование с
целью получения эмбриональных стволовых клеток и их использова­
ния для лечения многих тяжелых заболеваний, то не будет ли парал­
лельно развиваться технология репродуктивного клонирования, ведь
начало технологий, основа технологий одна и та же? Потенциально
существует проблема «двойной технологии», когда вместо терапевти­
ческого проводится репродуктивное клонирование (не только живот­
ных, но возможно и человека). А клонирование человека запрещено
пибо наложен мораторий на подобные исследования.
Экстракорпоральное оплодотворение и биоэтика
К числу наиболее распространенных вспомогательных репродук­
тивных технологий относится экстракорпоральное оплодотворение
(ЭКО) или оплодотворение в «пробирке». В1978 году в Англии родился
первый ребенок, который был зачат вне материнского организма при
помощи ЭКО (в Казахстане в 1996 г.). Уже в 2005 г. в мире 2 миллионна
детей были рождены, благодаря применению технологии экстракорпо174
рального оплодотворения.
Наряду с ЭКО как вспомогательные репродуктивные технологии
применяются: искусственная инсеминация (ИИ) женщины спермой мужа
или донора и инъекция сперматозоида в цитоплазму ооцита (ИКСИ); экс­
тракорпоральное оплодотворение яйцеклетки (ЭКО) in vitro с последу­
ющей ее имплантацией женщине; вынашивание эмбриона/плода «сур­
рогатной матерью».
Существенным моментом ЭКО является тот факт, что после успеш­
ного проведения процедуры 85-90% жизнеспособных эмбрионов оста­
ются «неиспользованными». Такие эмбрионы либо уничтожаются, пере­
даются для имплантации другим женщинам, либо используются в экс­
периментах или в биопроизводстве. Если при аборте удаляется один,
редко большее число жизнеспособных эмбрионов, то при ЭКО жизне­
способным оставляется один из десятка. На 4-5 сутки из оплодотворен­
ной яйцеклетки формируется бластоциста, содержащая около 100 кле­
ток, далее развивающаяся в зародыш (до 14 суток после оплодотворе­
ния) и эмбрион (более 14 суток после оплодотворения). При импланта­
ции в матку нескольких зародышей возникает многоплодная беремен­
ность, вынашивание которой рискованно. Поэтому при беременности 7-8
недель производится редукция - под ультразвуковым контролем путем
введения иглы прекращается жизнеспособность «лишних» эмбрионов.
Во вовремя культивирования эмбриона ex vivo осуществляется
преимплантационная генетическая диагностика с целью исключения
наследственной патологии у эмбриона до имплантации. Также этим
методом возможно определить пол эмбриона. Технология данной вспо­
могательной репродуктивной технологии даже при всей ее востребован­
ности, прежде всего для тех, кто обращается за подобной помощью в
медицинское учреждение, порождает этические проблемы. Во-первых,
существуют рекомендации, согласно которым эмбрион человека, раз­
вившийся при ЭКО, обладает правом на жизнь и поэтому должен быть
трансплантирован в матку, а не подвергаться редукции. Но это право на
жизнь может быть исключено путем аборта при наличии медицинских
противопоказаний (здоровье женщины, выявленные генетические нару­
шения в эмбрионе и др.). Во-вторых, эмбрион обладает также правом
не быть использованным в исследовательских целях. Но исследования
должны проводиться с целью совершенствования техники ЭКО и в целом
репродуктивной технологии как отрасли медицины. Исследования про­
сто необходимы при установлении полноценности и отсутствия пато­
логии у эмбриона до момента переноса его в матку, т.е. для профилак­
тики рождения ребенка с генетической патологией. Ситуация, несмотря
на научную аргументированность необходимости исследования эмбри­
она ради здоровья матери и будущего ребенка, не исключает этические
проблемы.
175
При обсуждении медико-биологических, морально-этических
аспектов определения предельного возраста эмбриона, допустимого
для использования в эксперименте, ведущие эмбриологи мира назы­
вают, как правило, период от момента оплодотворения (стадия зиготы)
до 14-го дня развития (до начала формирования первичной полоски и
появления элементов нервной системы) или срок до 30-го дня развития
(начала дифференцировки структур головного мозга). Этически прием­
лемы исследования in vitro на эмбрионах до 14-го дня после оплодот­
ворения.
В научном сообществе есть и другое мнение о том, что суще­
ствование эмбриона человека, полученного в результате оплодотворения
in vitro, не должно поддерживаться дольше 14 суток, если он не перене­
сен в женский организм. А культивирование эмбриона человека in vitro
без соответствующего разрешения или более 14 дней следует класси­
фицировать как противозаконнное.
Суррогатное материнство и биоэтика
Суррогатное материнство (вынашивание оплодотворенной яйце­
клетки женщиной, которая после родов возвращает ребенка генетиче­
ским родителям) впервые успешно осуществлено в 1989 году. Программа
суррогатного материнства включает: выбор суррогатной матери; синхро­
низацию менструальных циклов генетической и суррогатной (биологиче­
ской) матерей; процедуру экстракорпорального оплодотворения с пере­
носом эмбрионов в матку суррогатной матери; вынашивание и рождение
ребенка; определение юридических отношений между генетическими
родителями и родившимся ребенком. Суррогатными матерями могут
быть здоровые женщины детородного возраста, прошедшие специаль­
ное медицинское обследование, давшие добровольное информирован­
ное согласие, родственники или знакомые бесплодной пары, специально
обследованные добровольцы. Суррогатное материнство:
- с одной стороны дает шанс иметь ребенка супружеским парам,
женщинам, у которых по разным причинам удалена матка или вынаши­
вание беременности им противопоказано из-за тяжелых заболеваний;
- с другой, во время вынашивания ребенка происходит разрушение
психической и духовной связи между генетической матерью и младен­
цем, и, наоборот, пренебрегается глубокая эмоциональная и духовная
близость, которая устанавливается между суррогатной матерью и мла­
денцем во время беременности.
В настоящее время законодательно суррогатное материнство
разрешено почти в двух десятках стран, в том числе в Казахстане.
Запрещено суррогатное материнство во Франции и Германии. В Англии
эмбрионы перед переносом в матку биологической матери заморажи­
ваются и хранятся в течение 6-ти месяцев карантина на ВИЧ. В Англии,
176
Канаде, Израиле суррогатное материнство допускается только на
некоммерческой основе. В Бразилии и Венгрии в роли биологической
матери может выступать только родственница генетических родителей.
Приоритетное право решать судьбу родившегося ребенка в одних госу­
дарствах отдается генетическим родителям, в других - биологической
матери. В последнем случае права генетических родителей признаются
только после отказа от ребенка суррогатной матерью. Далее при наличии
у ребенка аномалий и отказе от него генетических родителей финансо­
вая и юридическая ответственность ложится на биологическую мать. Как
правило, от такого ребенка биологическая мать также отказывается, и он
остается ненужным ни одной, ни второй матери и т.д. Вышеприведенные
противоположные примеры правового регулирования данной вспомо­
гательной репродуктивной технологии свидетельствуют о существова­
нии в обществе этически спорных проблем суррогатного материнства.
О запрещении использования суррогатного материнства в коммер­
ческих целях говорится в Брюссельской декларации Всемирной меди­
цинской ассоциации. Но пользующаяся все большим спросом техноло­
гия суррогатного материнства на практике приобретает рыночный меха­
низм, т.е. рожденные дети становятся объектом торговли. В такой ситу­
ации этические вопросы, морально-нравственные принципы не всегда
учитываются. Есть публикации о том, «что уже появились своеобразные
«питомники», где мамы из бедных стран рожают детей, добывая себе
на жизнь.... Нельзя не увидеть аналогии с человеческими «фермами»,
которые существовали в рабовладельческой Америке».
Безопасность биомедицинских технологий
Биологическая опасность при применении биомедицинских техно­
логий обусловленав двумя аспектами. Первое, это потенциальная воз­
можность использования технологического оборудования не для произ­
водства терапевтических биопрепаратов, а дпя попучения биологического оружия—биомассы живых возбудителей особо-опасных инфекций
и их токсинов. Биотехнопогическое производство антибиотиков, фермен­
тов, витаминов и других биологически активных субстанций основано на
испопьзовании биореакторов, ферментационной технопогии. Но, в том
же биореакторе можно наращивать культуру особо опасных возбудите­
лей антропонозной или антропозоонозной инфекции, в том числе полу­
ченных не законным путем из существующих национальных и между­
народных коллекций микроорганизмов. Также возможно нарастить био­
массу генно-модифицированного патогена. Да, есть отличия в режиме
культивирования, компонентах питательной среды, методах очистки и
стабилизации, но, к сожалению, технологически это далеко не принци­
пиальные отличия. Это технические ньюансы, никак не затрагивающие
суть данного технологического цикла, и не меняющие перечень основ­
177
ного и вспомогательного оборудования. Только используемый микро­
организм, в отличие от промышленных биопродуцентов, наделен пато­
генностью и может быть использован как биооружие. Использование
биотехнологического оборудования не по назначению определяется как
«двойная технология».
Ранее проблемы безопасности биотехнологий были связаны с воз­
можностью наработки биомассы возбудителей особо-опасных инфек­
ций с усиленной токсигенностью и вирулентностью,обладающим спо­
собностью к быстрыму распространению в окружающей среде и пора­
жении населения. Сейчас возникают проблемы, связанные с возможно­
стью селекции штаммов, не вызывающих острой симптоматики заболе­
вания, но избирательно подавляющих иммунные силы организма, воз­
действующих на организм в зависимости от различных абиотических и
биотических факторов. Существует возможность селекции и примене­
ния микроорганизмов, вызывающих деструкцию материальных компо­
нентов военного снаряжения и техники и т.п.
Сугубо специфичны проблемы биобезопасности в лабораториях,
занимающихся диагностикой и исследованием свойств патогенных
микроорганизмов, ГМО. Специфика заключается в обеспечении био­
логической защиты сотрудников, работающих с патогенными и генномодифицированными организмами, создание безопасных условий труда
в таких лабораториях. Биобезопасность зависит от квалификации работ­
ников, от технической оснащенности и состояния лабораторных поме­
щений. Это совершенно другой, третий аспект биобезопасности в меди­
цине, связанный с профессиональной деятельностью. Его соблюдение
регламентируется специальными санитарными правилами, стандартами
GLP и GMP. Всемирной Организацией Здравоохранения несколько раз
переиздавалось практическое руководство по биологической безопасно­
сти в лабораторных условиях. Оно включает правила соблюдения био­
логической безопасности при работе с рекомбинантной ДНК, с вирус­
ными и иными векторами. Центры ВОЗ в области биологической безопас­
ности функционируют в Швейцарии, Швеции, Канаде, США и Австралии.
Соблюдение биологической безопасности необходимо при прове­
дении научно-исследовательских работ по снижению заболеваемости
и предупреждению эпидемических ситуаций, обусловленных социально
опасными инфекциями (СПИД, птичий грипп и др.).
Существует аспект проблем биобезопасности, обусловленных
недостаточностью фундаментальных знаний, пока существующим несо­
вершенством современных технологий, не исключающих опасности их
отрицательного воздействия на человека. Так, генная терапия,связанная
с доставкой цепевого гена путем вирусной трансфекции, ядерной транс­
формации может вызвать в клетках, организме реципиента нежелатель­
ные мутации и эту потенциальную опасность полностью исключить
178
нельзя. Глубина знаний о межклеточных и внутриклеточных регулятор­
ных взаимоотношениях на уровне молекул нуклеиновых и аминокислот
также пока на стадии интенсивного научного исследования и разработок
соответствующих технологий in vitro. Это проблемы, связанные с иссле­
дованием, производством и потреблением генно-модифицированных
организмов и их продукции, регулируемые законодательными актами
и международными правилами. Особенно актуальна и в плане био­
безопасности проблема клонирования органов и тканей человека.
Клонирование человека запрещено.
Применение эмбриональных стволовых клеток помимо этических
вопросов, также имеет и чисто научные, еще не решенные задачи, а
именно не полностью изучены механизмы их дифференциации, не пол­
ностью отработаны технологии направленной регуляции их дифферен­
циации в организме реципиента, не исключается потенциальная воз­
можность ракового перерождения этих клеток в организме реципиента.
Основные принципы контроля в сфере биологической безопасно­
сти содержатся в Конвенции о запрещении разработки, производства
и накоппения запасов бактериологического (биологического) и токсин­
ного оружия и об их уничтожении (1971г.), а также во Всеобщей декла­
рации ООН о геноме человека и о правах человека, разработанной
Международным комитетом ЮНЕСКО по биоэтике (1997г.).
Существует Картахенский протокол - международное соглашение
о мерах и процедурах, необходимых для безопасного перемещения
через государственные границы, переработки и применения продуктов
современной биотехнологии, в том числе генно-инженерных медицин­
ских препаратов. Предпопагалось, что в 1999 г. в колумбийском городе
Картахена-де-Индиас составленный Протокол будет принят (отсюда и
его название). Однако окончательный вариант Протокола был принят в
2000 г. в Монреале. Протокол вступип в силу 11 сентября 2003 г., после
того, как он был ратифицирован 50-й страной-участницей (Казахстан
ратифицировал его в 2008 г.).
Э кологические аспект ы безопасности производства биопрепара­
тов медицинского значения обусповлены тем, что микробиологический
синтез и ферментационные технологии не являются безотходном про­
изводством.
К отходам производства медицинских биопрепаратов относятся:
твердые отходы (мицелий, клеточная биомасса продуцента), жидкие
отходы (отработанная культуральная жидкость), газообразные отходы.
Очистка твердых отходов: мицелий грибов, биомассу использованных
дрожжевых и других микроорганизмов после окончания ферментаци­
онного процесса высушивают и отвозят на городские свалки или поме­
щают в ямы на бетонный пол и перемешивают с землей —почвенные
микроорганизмы перерабатывают мицелий. Более распространенный
179
способ утилизации отработанной биомассы микроорганизмов, содержа­
щей большое количество белков и других полезных органических соеди­
нений - это термостерилизация и добавление в корм животных. В пер­
спективе возможна более глубокая утилизация - извлечение опреде­
ленных фракций липидов, белков для использования в других отраслях
производства. Очистка жидких отходов: в отстойник, затем в аэротенк
для размножения в культуральной среде микроорганизмов, формиро­
вание активного ила. Последний извлекается, подсушивается и исполь­
зуется в качестве удобрения на полях, как биофильтр при очистке сточ­
ных вод. Газообразные отходы сжигают на колонках при 300°С до С02.
В современных технологических схемах обязательно полное
соблюдение требований GMP, предусматривается безотходное произ­
водство.
Международные стандарты (ISO) и правила (GMP, GLP, GCP)
ISO (International Organization for Standardization, в русской транс­
крипции именуемая ИСО) - это международная неправительственная
организация, образованная в 1947 году с целью разработки междуна­
родных стандартов. Наибольшее распространение в мире получили
стандарты ИСО 9000 и ИСО 14000. ИСО 9000 - это стандарт управле­
ния качеством. ISO 14000 - это стандарт управления безопасностью
окружающей среды. Оба стандарта лишь помогают компаниям (в том
числе фармпроизводство, биотехнологическое производство) устано­
вить систему управления, направленную на достижение качества или
безопасности товаров и услуг(в том числе биомедицинских технологий
и биопрепаратов).
GMP, GLP, GCP
Good Manufacturing Practice (GMP), надлежащая производственная
практика —правила организации и единая система требований к про­
изводству и контролю качества лекарственных средств. Правила GMP
обязательны для всех предприятий, выпускающих продукцию медицин­
ского назначения и готовые лекарственные формы. Система была вве­
дена под эгидой ВОЗ. Правила GMP неоднородны - существуют меж­
дународные (ВОЗ), региональные (ЕЭС - Евросоюз, ассоциация стран
Юго-ВосточнойАзии) и национальные. Правила GMP включают 8 раз­
делов : терминология, обеспечение качества, персонал, здания и поме­
щения, оборудования, процесс производства, отдел технического кон­
троля, валидация (утверждение). В разделе «Персонал» особое вни­
мание уделяется профессиональным знаниям и практическому опыту
сотрудников, графику переподготовок персонала. В помещениях (раз­
дел «Здания и помещения») атмосферное давление должно быть на
180
несколько мм.рт.ст. выше нежели снаружи, поверхность стен гладкая,
округленные углы, двери герметичны (это удобно для поддержания
стерильности, проведения дезинфекции). Оборудование должно по
графику проходить метрологический контроль и сертификацию, чтобы
соответствовать технологическому процессу. Используемое в производ­
ственном процессе сырье должно быть сертифицировано по качеству.
Валидация —это оценка и документальное подтверждение соответствия
производственного процесса и качества продукции установленным тре­
бованиям. Она позволяет установить —соответствует ли технологичнеский процесс регламенту; соответствует ли качество продукции требо­
ваниям нормативной технологической документации; соответствует ли
оборудоване производственным целям. Повторная валидация назнача­
ется даже при замене производственного штамма, компонентов пита­
тельной среды и др.
Good Laboratory Practice (GLP), надлежащая лабораторная прак­
тика - устанавливает единый подход и единые требования к проведе­
нию доклинических (неклинических) испытаний биологически актив­
ных веществ, лекарственных средств и приравненной к ним продук­
ции на предмет их безопасности и изучения специфического действия.
Надлежащая лабораторная практика - это стандарт планирования, про­
ведения, мониторинга, аудита, документирования, анализа и представ­
ления результатов доклинических (неклинических), в том числе научных
исследований, являющиеся гарантией достоверности и точности полу­
ченных данных. Это функционирующая в постоянном режиме система
обеспечения качества. Как и в правилах GMP, основным объектом посто­
янного мониторинга и совершенствования является персонал, оборудо­
вание и технологии. Для обеспечения результатов надлежащего каче­
ства разрабатываются и внедряются системы стандартных операцион­
ных процедур (СОП), имеющие свои особенности в зависимости от рода
деятельности предприятия. В настоящее время в большинстве развитых
стран действуют международные или национальные Правила GLP, име­
ющие нормативный (обязательный) характер. Они направлены на обе­
спечение приемлемости результатов - доказательность и надежность
данных. Вместе с GMP и GCP, эти правила образуют комплекс базовых
стандартов или кодексов профессиональной практики, регулирующих
изучение, оценку и производство лекарственных препаратов.
Good Clinical Practice (GCP), хорошая клиническая практика - пра­
вила организации клинических испытаний. Лекарственные средства про­
шедшие лабораторные исследования допускаются к клиническим испы­
таниям на добровопьцах и бопьных, с их согласия. Существует медицин­
ский контроль, в ряде государств функционируют общественные советы
по контролю проведения клинических испытаний.
181
VI. БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКОЕ ОБОРУДОВАНИЕ
Классический технологический процесс производства биопрепа­
ратов медицинского назначения (производство субстанций антибио­
тиков, ферментов, аминокислот и др.) состоит из нескольких этапов:
- наработка биомассы клеток микробного, животного или расти­
тельного происхождения. В качестве целевого продукта может быть
использована либо сама биомасса полученных клеток, либо их мета­
болиты - биологически активные соединения;
- выделение и очистка целевого продукта;
- стабилизация биологической активности целевого продукта.
На каждом этапе используется соответствующее технологиче­
ское оборудование: для наработки биомассы нужны биореакторы, для
выделения и очистки - сепараторы и хроматографы, для стабилизации
продукта - распылительные сушилки и лиофилизаторы.Современное
биотехнологическое производство (производство рекомбинантных бел­
ков, регуляторных пептидов и цитокинов) в отличие от классического
измеряется не в тоннах целевого продукта, а в миллиграммах и грам­
мах активного вещества, сам продукт требует применения более глубо­
кой очистки, более щадящей технологии получения. Разрабатываются
технологии, исключающие многоэтапность процесса, уменьшающие
негативное влияние сопутствующих физико-химических и механиче­
ских факторов производственного цикла. Соответственно оптимизи­
руется, совершенствуется биотехнологическое оборудование, исполь­
зуются биореакторы с одноразовыми сосудами для культивирования
клеток и др.
Ферментационное оборудование
Биореакторы
Биореакторы (ферментеры) используются в микробиологическом
и фармацевтическом производстве для наращивания биомассы кле­
ток микробного, растительного и животного происхождения с целью
использования их для получения лечебно-профилактических биопре­
паратов (вакцины, пробиотики, антибиотики, ферменты, алкалоиды,
гликозиды и др.). Емкость лабораторных биореакторов составляет 3-10
литров, опытно-промышленных - 100-300 литров, а промышленных десятки и сотни тысяч литров. Конструкция этих аппаратов позволяет
создавать оптимальные технологические условия для быстрого роста
и размножения клеток, для пролонгирования стационарной фазы кле­
точного развития, во время которой максимально наращивается био­
масса клеток либо продуцируются биологически активные соедине­
ния. В таких биореакторах очень тщательно контролируются и под­
182
держиваются состав питательной среды, pH, температура, парциаль­
ное давление кислорода, окислительно-восстановительный потен­
циал, аэрация и гомогенизация культуральной среды, пеногашение.
В 1980-90-е годы была широко распространена конструкция биореак­
торов с механическими лопастями для гомогенизации культуральной
среды (рис.15).
Приведенные на рис. 16 биореакторы широко применяются в
микробиологической и фармацевтической промышленности для полу­
чения вакцин, антибиотиков и фармсубстанций. Биореакторы, исполь­
зуемые в фармпромышленности изготавливаются из высоколигированной нержавеющей стали, не подвержены коррозии и выдерживают
многократную стерилизацию паром и обработку дезинфицирующими
средствами.
На рис. 17 показаны современные лабораторные биореакторы
BioFio 110 (со сменными сосудами, емкостью от 3 до 14 л) и LiFlus
GX. BioFio 110 используется для скрининга клеток-продуцентов при
стандартных параметрах и для оптимизации условий культивирования
микроорганизмов (бактерий, дрожжей, грибов) и тканевых клеток (рас­
тительного и животного происхождения) в периодических, непрерыв­
ных условиях или в режиме с подпиткой. Снабжен сменными автоклавируемыми стеклянными сосудами с расположенными на крышке гнез­
дами для датчиков pH, р02, устройствами подачи субстратов, пеногашения, аэрации, асептического отбора проб.
привод
мешалки
инокуляция
выход газа
продувка
слив
воды или конденсата
183
а)
б)
в)
Рис.16. Биореакторы, емкостью 100 (а), 250 (б) и 500 (в) литров.
В основном эти биореакторы применяются в микробиологической и фарма­
цевтической промышленности
ш
а)
Рис.17. Лабораторные биореакторы BioFlo (а) и LiFlus GX (б)
Для культивирования тканевых клеток и микроорганизмов
Лабораторный биореактор модели LiFlus GX (рис.17) использу­
ется для периодического, непрерывного режима культивирования, а
также для культивирования с подпиткой. Контролируются следующие
параметры: датчики температуры, pH, р02, скорость перемешивания
культуральной среды, работа перистальтических насосов, пеногашение. Размер ферментера: внешний диаметр 190 мм, высота 355 мм
(1:1.8), изготовлен из боросиликатного стекла.
Современные биореакторы комплектуются мониторами для
постоянного измерения в реальном масштабе времени динамики роста
клеток, без проведения периодического пробоотбора. С этой целью
используется специальный зонд, позволяющий измерять непосред­
ственно в реакторе клеточную плотность бактерий, дрожжей, грибов
184
или тканевых клеток. Подобные зонды применяются в биореакторах
при производстве стартовых культур, вакцин и рекомбинантных бел­
ков. В соответствии с динамикой роста коррегируется дозировка пода­
ваемых ингредиентов питательной среды для обеспечения оптималь­
ного выхода конечного продукта.
Одноразовые биореакторы
Одноразовые биореакторы —это отдельные одноразовые шуттелируемые пробирки-биореакторы (рис.18), либо одноразовые реактор­
ные кассеты, помещаемые в лунки термостатируемой, шуттелируемой микропланшеты биореактора (рис.19), либо специальные пласти­
ковые пакеты (рис.20).
Одноразовый биореактор —CultiFlask 50 похож на классическую
50 мл центрифужную пробирку, оснащенную вентилируемой крыш­
кой с резьбой с пятью отверстиями различного диаметра для оптимапьного обмена газов с окружающей атмосферой. Полупроницаемая
мембрана, закрывающая эти отверстия является барьером, сохраня­
ющим стерильность в биореакторе и уменьшающем потерю жидко­
сти за счет испарения. Внутри биореактора-пробирки не установлено
никаких перемешивающих устройств или механизмов. Гомогенизация
культуральной среды в этих пробирках-биореакторах осуществпяется
в инкубационном шейкере, регулирующем температуру, С02и влаж­
ность, а также скорость и амплитуду встряхивания. Подобные устрой­
ства нашпи применение в технологии производства рекомбинантных
бепков клеточными культурами. Все линии культур клеток животных,
используемых для таких процессов, имеют индивидуальные характе­
ристики, более того разные стадии производства белка требуют раз­
личных условий процесса. Одноразовые биореакторы позвопяют про­
водить отработку технологического процесса, и особенно оптимиза­
цию состава питательных сред для обеспечения роста максимального копичества клеток и высокого выхода рекомбинантного белка.
Биореактор Micro-24 предназначен для культивирования микро­
организмов (Е. coli, Saccharomyces cerevisiae, Bacillus subtilis, Aspergillus
nidulans, Aspergillus oryzae, Trichoderma reesi) и культур клеток (CHO cells
, Cell-free expression), используя специальные одноразовые 24-реакторные кассеты, которые позволяют индивидуально контропировать
и наблюдать за условиями в каждом реакторе. Система способна осу­
ществлять 24 эксперимента одновременно. При этом каждый реак­
тор регулируется независимо по подаче газа, температуре и pH. Также
осуществляется непрерывный мониторинг растворённого кислорода,
температуры и pH в каждом реакторе. К дну каждой лунки в 24-луночной кассете присоединяется мембрана. Мембраны формируют асеп­
тическое и водное герметичное уплотнение между системами кон­
185
троля и самими реакторами. Кассеты реакторов соответствуют стан­
дартам SBS для 24-луночных культуральных планшетов (128x86 mm).
Кассеты поставляются стерильными (гамма стерилизация) и запеча­
танными в светонепроницаемую (чёрную) упаковку. Компьютерный кон­
троль и регуляция температуры, pH, р02 осуществляются индивиду­
ально в каждой кассете.
Биореактор Micro-Flask - это интегрированная, простая в исполь­
зовании и экономная технологическая платформа для быстрой и удоб­
ной работы и культивирования больших количеств микробных штам­
мов, библиотек клонов, банков мутантов и клеточных линий в формате
24- или 96-луночных планшетов
Рис.18. Одноразовый биореактор - CultiFlask 50
а)
б)
Рис.19. Биореакторы Micro-24 (а) и Micro-Flask (6)
186
Р и с .2 0 . Ф е р м е н т е р B IO S T A T C u ltiB ag R M o p tic a l
В современном биофармацевтическом и биотехнологическом про­
изводстве часто используют ферментеры Biostat CultiBag RM с одно­
разовыми сосудами, имеющими общий объем от 2 до 200 л (рис.20).
Микроорганизмы или тканевые клетки (животных, насекомых, расте­
ний) культивируются в одноразовом пластиковом пакете. Он оснащен
фильтрами входящего и отходящего воздуха или газа, а также устрой­
ствами для асептического посева, отбора проб, сбора культуральной
массы, датчиками температуры, pH и концентрации растворенного кис­
лорода. Мешок размещается на специальной качающейся платформе,
изготовленной из нержавеющей стали. Платформа, качаясь с заданной
частотой, создает волнообразное движение питательной среды вну­
три пластикового мешка. В результате обеспечивается эффективное
перемешивание при очень мягком динамическом воздействии на куль­
туру микроорганизмов или клеток. Качающаяся платформа оборудо­
вана системой управления углом и скоростью колебательных движе­
ний, системой термостатирования, а также встроенным компрессором
для аэрации культуры. Она подключается к блоку с современной циф­
ровой системой управления DCU-3. Последняя специально разрабо­
тана для управления разнообразными процессами ферментации и счи­
тается мировым эталоном. В сосуд могут подаваться четыре различ­
ных газа: воздух, углекислота, кислород, азот (отдельно или в смеси).
Каждая газовая линия имеет ротаметр с вентилем для измерения
и регулировки расхода подаваемого в сосуд газа. Блок управления
содержит два перистальтических насоса для добавления субстрата
в сосуд.
Экономическая эффективность при производстве лекарствен­
ных препаратов обусловлена следующими преимуществами однора­
зовых ферментеров:
- сократилось время на подготовку ферментеров к работе за счет
исключения процессов мойки и стерилизации оборудования и связан­
187
ных с ними контрольных операций;
- процесс ферментации существенно упростился и повысилась
надежность обеспечения стерильности процесса, что позволяет про­
водить ферментацию не только в чистых помещениях, но и в обычных
помещениях с неконтролируемой производственной средой;
- отпала необходимость в дополнительном оборудовании
(парогенераторах, компрессорах, установках С1Р).
В биологических и медицинских исследованиях для культивиро­
вания стволовых клеток используются как простые кюветы (рис.21),
так и роботизированное оборудование (рис.22). В кюветах компьютер­
ное мониторирование, датчики физико-химических показателей отсут­
ствуют, поэтому применяется внешнее термостатирование, шуттелирование, аэрация, С02 инкубация и пр. Поэтому в них сложно создать
стандартные условия культивирования по pH, р02, концентрации куль­
тивируемых клеток и другим показателям.
Рис.21. Культивирование
стволовых клеток в кюветах.
Рис.22. Система культивирования
стволовых клеток Hamilton
Роботизированный комплекс для культивирования стволовых кле­
ток Hamilton состоит из:
- дозирующей системы MicrolabSTAR, 8 каналов дозирования,
объем 1000 мкл с встроенной рукой-манипулятором (iSWAR) для пере­
мещения планшетов с культурой и функцией автозагрузки;
- подъемного приспособления для замены питательной среды;
- одного или двух инкубаторов из линейки Cytomat;
- автоматизированной центрифуги Thermo/Jouan GR4 AUTO, кото­
рая является уникальной в своем роде центрифугой, и разработана
специально для автоматизированного культивирования клеточных
культур;
- ламинарного шкафа Bigneat с НЕРА фильтром и активными уголь188
ными фильтрами для обеспечения стерильности в работе;
CATSH 25/26 - нагреваемого шейкера для планшетов, с макси
мальной амплитудой встряхивания 200 мм, со скоростью 50-200 кача­
ний в минуту.
Работа комплекса контролируется специальной компьютерной
программой.
Биореакторы в тканевой инженерии
Одноразовые биореакторы используются не только для куль­
тивирования клеток, но и в тканевой инженерии для получения кон­
структа на основе трехмерной полимерной матрицы и размножаю­
щихся, дифференцирующихся на ее поверхности стволовых, ангиогенных, соединительно-тканных клеток (рис.23,24).
%
'’ шняниш|
,ф
ф _
фПЯЯЯВЖЖНШ
Рис.23. Сканирующая электронная микроскопия клеточных
контейнеров с трехмерными культивированными клетками
HepG2 внутри.
Рис.24. С п е ц и а л и з и р о в а н н ы й б и о р е а к т о р д л я п о л у ч е н и я ЗО -кул ь ту р .
189
I I
Конструкция биореакторов этого типа рассчитана на создание
оптимальных условий для роста, размножения и дифференциации
стволовых клеток, для формирования трехмерного тканевого кон­
структа, включающего клетки, дифференцирующиеся в тканеспеци­
фичные, ангиогенные и соединительно-тканные структуры. В многоком­
понентной питательной среде для культивирования стволовых клеток
наряду с нативной сывороткой присутствуют ростовые факторы, регу­
ляторные пептиды. При получении тканевого конструкта в биореак­
тор помещается заранее заготовленный трехмерный каркас (матрица)
из полимерного материала; на его поверхности будут расти и размно­
жаться стволовые клетки с последующей дифференциацией в ткане­
специфичные клетки, формироваться капилляры и соединительно­
тканные элементы. В этих биореакторах наряду с физико-химическими
параметрами и ингредиентами среды культивирования, тщательно
контролируются факторы роста, оказывающие непосредственное вли­
яние на рост и дифференциацию клеток. Конструкция подобных биоре­
акторов совершенствуется в плане создания для культивируемых кле­
ток трехмерного пространства, имитирующего естественную тканевую
структуру. Известно, что трехмерные или 3D культуры клеток в сравне­
нии с двухмерными или 2D культурами, выращенными в обычной пла­
стиковых кюветах более стабильно сохраняют присущие им функции.
Поликарбонатный микроконтейнер термоформован из пленки,
обработанной с помощью технологии ионных треков. Микропоры обе­
спечивают двухстороннюю подачу клеточным агрегатам в контейнерах
растворенных питательных веществ и кислорода. Ожидается, что соче­
тание микротермоформования и различных технологий модификации
поверхности и самого материала, из которого изготовлена матрица,
позволит создавать более оптимальную микроокружающую среду
для наращиваемого тканевого конструкта.Клетки в специализирован­
ном биореакторе культивируются в трехмерном пространстве, а не в
двухмерном, как в кювете. Чтобы растущие и делящиеся в суспензии
клетки находились во взвешенном состоянии создается слабое маг­
нитное поле. Кроме того, устройство обеспечивает постоянное проточ­
ное обновление среды для культивирования. В таком биореакторе дифференцировка стволовых клеток в эктодермальные, энтодермальные
и мезодермальные структуры происходит быстрее, чем при исполь­
зовании кювет. Клетки культивируемые в трехмерном пространстве
в сравнении с полученными в двухмерном, больше похожи на клетки,
дифференцирующиеся в естественных условиях, в живом организме.
190
Оборудование для выделения и очистки
Сепараторы
Роторные сепараторы
Процесс отделения жидкой части от твердых веществ, разделения
жидкой и твердой фазы основан на методе центрифугирования, сепа­
рации (фракционирования). Наиболее широко в биотехнологическом
производстве используются тарельчатые сепараторы или сепараторы
Альфа Лаваль (рис.25-27). Они используются в технологии очистки
вакцин, при выделении субстанции антибиотиков, аминокислот, фер­
ментов и других веществ.
Принцип работы сепараторов основан на центробежном разделе­
нии суспензии при помощи вращающихся тарельчатых поверхностей.
Скорость вращения ротора достигает 10 ООО оборотов в минуту. Все
детали сепаратора, соприкасающиеся с обрабатываемым продуктом,
изготавливаются из коррозионно-стойких сталей.
Особенности технологии сепарирования зависят от локализа­
ции целевого продукта (внутриклеточная или внеклеточная), от типа
используемого микроорганизма-продуцента (бактерии, дрожжи, мицелиальные грибы). При сепарировании суспензии клеток животного или
растительного происхождения, легко травмируемых при физических
воздействиях, разарабатываются особые конструкции сепараторов,
позволяющих минимизировать подобные воздействия в процессе раз­
деления суспензии; при этом сохраняется герметичность и стериль­
ность процесса сепарирования.
Рис.25 Тарельчатый сепаратор
Рис.26 Пакет тарелок к сепаратору
191
Рис.27 Схема сепаратора для разделения суспензий
Оптимальный процесс сепарирования зависит от соблюдения
следующих требований к конструкции сепаратора и пакета тарелок:
- правильное проектирование зоны входа сепарируемого продукта
на вращающуюся тарельчатую поверхность, обеспечивающее щадя­
щее механическое воздействие на него, предотвращающее вспенива­
ние, уменьшение внутреннего трения и нагрева продукта;
- при отводе жидкой фазы из сепаратора испопьзуется откры­
тый выход, также соблюдается щадящее воздействие на продукт.
Для более интенсивного выхода жидкой фазы в необходимых случаях
сепараторы комплектуются специальным напорным диском, который
замедляет скорость движения продукта, преобразовывая его кинети­
ческую энергию в давпение. Отвод жидкости производится через спе­
циальные каналы напорного диска, а необходимое давление в системе
регулируется клапаном, установленным на выходном трубопроводе.
Для отвода твёрдых веществ (взвесей) испопьзуется сопло, располо­
женное на периферии барабана сепаратора;
- для качественного разделения суспензии на жидкую и твердую
фазы конструкция и расположение каналов в пакете тарелок должны
гарантировать равномерное распределение и оптимальную структуру
потока жидкости в межтарельчатом пространстве сепаратора;
- предотвращение контакта целевого продукта с кислородом воз­
духа и повышения температуры в процессе сепарации способствует
сохранению его биологических свойств.
192
Магнитные сепараторы
Технология магнитной сепарации клеток основана на использо­
вании магниточувствительных микросфер и разделительных колонок.
В качестве магниточувствительных микросфер используются магне­
тит (смесь двух- и трехвалентного оксида железа) и другие материалы.
Микросферы покрываются тонкой плёнкой биодеградируемого матери­
ала, обеспечивающего абсорбцию целевого биологически активного
соединения. Применяется либо природный биодеградируемый мате­
риал (целлюлоза, агароза, альбумин, желатин, декстран), либо син­
тетический (полистирол, сополимеры стирола или дивинилбензола,
полиакролеина, полиакриламида, поливинилового спирта, винилпиридина). Синтетические полимеры обладают рядом преимуществ: в
частности, наличием в структуре молекулы полимера различных функ­
циональных групп ( - ОН, - СОН, - СООН, - NH2, - S03H), которые
способствуют образованию неспецифических химических и физиче­
ских связей с биосубстратами. На поверхность полимерной матрицы
наносятся лиганды (стрептовидин, олигопротеин А и G, моноклональ­
ные антитела и др.), специфически взаимодействующие с целевыми
биомолекулами. В целом магниточувствительные полимерные микро­
сферы можно рассматривать как твердофазные носители монокло­
нальных антител, стрептовидина и других лигандов для специфиче­
ского связывания и сепарации целевых клеток, ферментов, микро­
организмов, вирусов, рекомбинантных белков, ДНК и др. Например,
на поверхность микросфер можно адсорбировать моноклональные
антитела, специфически связывающиеся с CD 34 рецепторами ство­
ловых клеток. Существует большой ассортимент магнитсодержащих
полимерных микросфер, которые отличаются как по размерам, так и
по содержанию магнитного материала. Однако в основной массе они
используются в технологии магнитной сепарации, а их размер состав­
ляет более 0,5 мкм.
Привлекательно использование магнитсодержащих полимер­
ных микросфер в иммунодиагностике, в иммуномагнитометрическом
анализе, основанном на использовании магнитных частиц в качестве
аналитических маркеров. Метод позволяет количественно определять
специфические комплексы антиген-антитело, меченные магнитными
метками, путем припожения внешнего магнитного поля и регистрации
соответствующей величины магнитной восприимчивости магнитного
материала метки, пропорциональной концентрации иммунокомплекса.
Необходимо отметить, что возможность проведения иммунных реак­
ций с использованием иммуноактивных веществ (антител, антигенов),
иммобилизованных на магниточувствительных микроносителях, позво­
ляет осуществить выделение требуемых целевых клеток и веществ
без использования сложного и дорогостоящего оборудования.
193
>I
Таким образом технология магнитной сепарации с использо­
ванием магниточувствительных микросфер позволяет существенно
упростить и ускорить процессы разделения биологически активных
соединений по сравнению с колоночной хроматографией. При этом
достигается глубокая очистка целевого вещества.
Технологический процесс магнитной сепарации начинается с
заполнения колонки биологическим материалом (кровь, суспензия
костного мозга и иной материал), при одновременном внесении микро­
сфер с осажденными на них лигандами. При пропускании через колонку
магнитного поля целевые клетки, рекомбинантные белки либо дру­
гие вещества, находящиеся в биологическом материале специфиче­
ски соединяются с лигандами на поверхности микросфер (рис.28).
Магниточувствительные микросферы с конъюгированным целе­
вым веществом сорбируются на колонке. Иные клетки и вещества,
не связавшиеся с микросферами вымываются из колонки промывоч­
ным буфером и переносятся во вторичный мешок для сбора супернатанта. Затем, используя специальные реагенты, целевое вещество
(клетки, рекомбинантный белок и др.) элюируются с колонки. Весь про­
цесс проходит в замкнутой системе, что обеспечивает стерильность
получаемого клеточного концентрата.
Стойка для
первичного
биоматериала
Основная
магнитная
платформа
Вращающаяся
платформа
Вторичный
магнит
Мешок для
сбора
супернатанта
Основная
платформа
Рис.28. Магнитная сепарация клеток крови (с сайта)
К примеру, микросферы MACS представляют собой суперпарамагнитные частицы, с конъюгированными моноклональными антителами.
Эти частицы имеют диаметр примерно 50 нм, т.е. невидимы в свето­
вой микроскоп, биодеградируемы и не травмируют клетки. Поскольку
194
размер микросфер чрезвычайно мал, для удерживания целевых кле­
ток, связавшихся с моноклональными антителами необходимо наличие
высокоградиентного магнитного поля. Вся процедура выделения кле­
ток или очистки клеточной суспензии занимает менее 30 минут (вклю­
чая 15 минут прединкубации), при этом выделенные клетки сразу же
можно использовать в последующих экспериментах. На выходе полу­
чают не только фракции обычных клеток (например, Т -, В -, NK клетки
или моноциты), но и такие редкие популяции как стволовые клетки (с
классическим маркером CD 34 и новым маркером CD 133), антигенпрезентирующие Т-клетки, регуляторные Т-клетки и даже Th 2 Т -клетки,
субпопуляции дендритных клеток (не только микросферы для CD 14,
но и для DC : BDCA -1 + , BDCA -4 + -клеток).
Иммуномагнитная сепарация стволовых клеток (CD34 пози­
тивных клеток) из костного
мозга и крови при помощи магнито­
чувствительных микросфер начала широко использоваться в совре­
менной онкологии и гематологии при аутотрансплантации этих кле­
ток. Магниточувствительные частицы добавляются непосредственно
к образцу биологической жидкости. После 10-20-минутной инкубации
пробирка с образцом помещается в магнитный сепаратор, где клетки
интересующей популяции, связанные с магнитными частицами, улав­
ливаются, а супернатант удаляется. Выделенные целевые клетки ресуспендируются в буфере и анализируются. При необходимости магнит­
ные частицы впоследствии отделяются от целевых клеток (использу­
ются негативный либо позитивный методы выделения целевых кле­
ток). При негативном методе удаляются все ненужные популяции кле­
ток из биологического материала (кровь, костный мозг) при помощи
реагентов (подобно методу Кастеллани при очищении иммунной сыво­
ротки). При позитивном методе из биологического материала извлека­
ются только целевые клетки.
Для последующего отделения целевых клеток от парамагнитных
частиц вместе с адсорбированными на них моноклональными антите­
лами используются:
- поликлональные антитела, специфичные к Fab-фрагментам пер­
вичных моноклональных антител, конъюгированных с частицами. При
этом целевые клетки остаются жизнеспособными, экспрессия поверх­
ностных маркеров не нарушается (таким способом выделяются CD4,
CD8, CD19 и CD34 клетки человека).
- биотинилированные антитела, конъюгированные с частицами
через нуклеиновую кислоту, и ферментативный буфер, расщепляющий
ДНК-мостик. Применяются для удаления частиц с любой популяции
позитивно выделенных клеток. Целевые клетки, выделенные данным
способом пригодны для последующего культивирования и для цитометрического анализа.
195
Разработана технология использования парамагнитных частиц с
иммобилизованными на них хелатными комплексами кобальта для
выделения рекомбинантных белков с олигогистидиновой последова­
тельностью. Частицы на полистирольной основе, диаметром 1 мкм, с
ковалентно пришитым комплексоном, образующим координационные
связи с кобальтом и имидазольными группами гистидина рекомбинант­
ного белка.Частицы с повышенной селективностью связывают белки с
олигогистидиновой вставкой (рис.29).
Ъф о я
Рис.29. Схема образования ионами металлов координационных связей
с гистидиновыми группами белка
Для последующего анализа можно использовать белок, связан­
ный с частицами или элюировать его с их поверхности (рис.30).
Ш
!§<?
К
I
/\
I
Рис.30. Схема выделения рекомбинантных белков на микрочастицах с
иммобилизованными хелатными комплексами кобальта
(диаметр частиц 1,1 мкм, их концентрация 4 0 мг на 1 мл 20% этанопа, с 1 мг частиц
элюируется 10 мкг рекомбинантного белка с Mw - 3 0 кДа), с сайта.
196
При выделении рекомбинантного белка, экскретируемого клетками-продуцентами (генномодицированный штамм Е. со//, Pichia
pactoris и др.) во внеклеточную жидкость также возможно применять
агарозные магнитные гранулы с конъюгированными ионообменными
смолами, обеспечивающие аффинную адсорбцию прямо из культу­
ральной жидкости (без этапа отделения клеток, их лизиса и последу­
ющего осветления культуральной среды) искомого рекомбинантного
белка. Технология обеспечивает проведение процесса выделения
белка в одной пробирке или планшете без потребности в адсорбцион­
ных колонках или центрифугировании (рис.31). Используя в технологии
магнитного сепарирования специальные реагенты можно выделять
для HLA-типирования лимфоциты из образца цельной крови без ста­
дии центрифугирования в градиенте плотности. При инкубировании с
использованием перемешивающего устройства магниточувствитель­
ные микросферы связываются с целевыми клетками в образце цель­
ной крови, после чего целевая фракция выделяется и промывается.
Процесс выделения лимфоцитов осуществляются в одной и той же
пробирке в течение 15 минут. Выделенная фракция клеток характери­
зуется высокой степенью чистоты (более 99% составляют лимфоциты)
и жизнеспособностью.
Культура клеток
Добавьте реагент
PopCulture*
10 при ком. температуре
1
Добавьте аффинную
смолу
5' при ком. температуре
Промойте, элюируйте
w|
Чистый белок
Для магнитного
связывания используйте
Magnetight™ HT96™
Р и с. 31. Э т а п ы в ы д е л е н и я р е к о м б и н а н т н о го б е л к а P o p C u ltu re
р е а ге н т о м (с сайта)
197
При Т-клеточной иммунотерапии традиционно используются тех­
нологии, основанные на выделении популяции Т-клеток с последу­
ющим культивированием их in vitro и одновременной стимуляцией
антигенами для усиления иммуногенности этих клеток. А технология
иммуномагнитной сепарации позволяет in vitro проводить иммуномагнитную активацию при помощи парамагнитных частиц, при контакте
с которыми через CD3/CD28 рецепторы Т-лимфоциты получают сиг­
нал к активации и пролиферации. Для обеспечения стерильных усло­
вий выделения и культивирования вся процедура осуществляется на
базе специализированной магнитной установки Dynal ClinExVivo МРС.
Цитаферез клеток крови
Цитаферез также основан на цетрифужной сепарации и
осуществляется в автоматическом режиме. Например, сепаратор
AMICUS (рис.32) позволяет получать в полностью автоматиче­
ском режиме тромбоциты, эритроциты и стволовые клетки крови.
Программное обеспечение дает возможность заранее точно прогно­
зировать выделяемое количество тромбоцитов (до 9,0 х1011) и количе­
ство тромбоцитов у донора после процедуры. Индивидуальный кон­
троль подачи антикоагулянта, короткое время процедуры и ее гиб­
кость, возможность как одноигольного, так и двухигольного венозного
доступа облегчают процедуру для донора и гарантируют его полную
безопасность. На всех этапах процедуры, с помощью пяти встроен­
ных автоматических весов, аппарат непрерывно производит опреде­
ление массы компонентов крови и используемых в ходе процедуры
растворов. Точное перемещение компонентов и растворов в расхо­
дной системе обеспечивает шесть автоматических насосов и три авто­
матические многоходовые кассеты. Отдельный насос, гарантирующий
точную автоматическую подачу раствора антикоагулянта находится
под контролем двух систем, обеспечивающих безопасность донора
на основании его расчетного ОЦК и необходимую степень антикоа­
гуляции цельной донорской крови на основании соотношения АК:ЦК.
Система магистралей к аппарату размещается в пластиковом поддоне
(рис.33), который целиком устанавливается сверху на верхнюю панель
аппарата. Там же находится и легкоустанавливаемый центрифужный
узел. Самозаправляющиеся насосы упрощают и ускоряют установку
систем магистралей аппарата. Аппарат позволяет получить лечебную
дозу тромбоцитов менее, чем за 40 мин.
198
Рис.32. Сепаратор клеток
крови AMICUS
Рис.33. Пластиковый поддон с
системой магистралей к аппарату
Рис.34. Система SEPAX для выделения стволовых клеток
Система SEPAX (рис.34) - система, позвопяющая выделять ство­
ловые клетки из пуповинной и периферической крови, а также из кост­
ного мозга с высоким уровнем жизнеспособности клеток после проце­
дуры. Система предназначена для применения в клеточной терапии,
где необходимо получение определенных компонентов крови, кото­
рые после процедуры выделения собираются в стандартные мешки и
готовы для дальнейшего использования (криоконсервация, наращива­
ние in vitro, переливание пациенту и др.). Принцип действия Sepax осно­
ван на сепарации центрифугированием, позволяющем разделять ком­
поненты крови в соответствии с их плотностью и размерами. Обработка
крови или ее компонентов происходит в закрытой стерильной системе.
Вся информация о текущем процессе отображается на жидкокристал­
лическом дисплее. Максимальная скорость центрифугирования состав­
ляет 8000 об/мин. Оптический линейный сенсор системы Sepax кон­
тролирует прохождение различных компонентов крови по магистрали.
199
Специальный детектор предназначен для измерения объема в цен­
трифужной камере с точностью + 1 мл. Электронная и компьютер­
ная системы для контроля автоматизированных процессов включают
в себя карту памяти и коммуникативный порт.
Рис.35. UVAR XTS - система для экстракорпорального фотофереза
Экстракорпоральный фотоферез представляет собой метод, осно­
ванный на сочетании лейкафереза и облучения лейкоцитов, предвари­
тельно обработанных фотосенсибилизатором (8-метоксипсораленом)
ультрафиолетовым светом диапазона А (320 - 400 нм).На сегодняшний
день этот метод успешно применяется как монотерапия, и как иммуно­
терапия в комплексном лечении ряда онкологических, аутоиммунных,
дерматологических и пролиферативных заболеваний: рефрактерная
кожная Т-клеточная лимфома; реакция трансплантат против хозяина
(РТПХ); склеродермия; дерматиты; рассеянный склероз; псориаз; рев­
матоидный артрит и т.д.
Принцип действия системы UVAR XTS. Действие прибора осно­
вано на заборе цельной крови у пациента, ее сепарации центрифуги­
рованием, позволяющем разделять компоненты крови в соответствии с
их плотностью и размером. Далее эритроциты и плазма возвращаются
пациенту, а лейкоцитарный слой обрабатывается фотосенсибилизиру­
ющим препаратом, который затем активируется непродолжительным
действием УФА излучения и сразу возвращается в кровоток пациента.
Хроматографы
При очистке биологически активных веществ выполняются сле­
дующие этапы:
а) Разделение веществ по растворимости путем фильтрации, седи­
ментации, центрифугирования (сепарирования) и флотации;
б) Первичное выделение биологически активных веществ при
200
помощи экстракции, сорбции, осаждения и ультрацентрифугирования;
в)
Глубокая очистка биологически активных веществ фракционным
осаждением, адсорбцией и хроматографическими методами.
Если сепараторы необходимы для разделения жидкой и твердой
фазы культуральной массы, то хроматографы в биотехнологическом
и в фармпроизводстве используются для более тонкой очистки биоло­
гически активных веществ. Широко распространенная колоночная хро­
матография позволяет получать чистые вещества из сложных много­
компонентных смесей с минимальными потерями как в исследователь­
ской лаборатории, так и в промышленном производстве (рис.36,37).
Рис.36. Схема простейшей хроматографической колонки
Хроматография является основным звеном в технологии очистки
субстанции антибиотиков, противовирусных вакцин, генно-инженерного
инсулина, интерлейкина, иных белков и пептидов медицинского назна­
чения.
Лабораторные хроматографические колонки изготовляют в основ­
ном из боросиликатного стекла с пластиковыми адапторами. Колонки
упаковываются самыми различными сорбентами, для извлечения раз­
личных веществ в гомогенной фракции. Размеры колонок варьируются
в широком диапазоне: диаметр 5 - 5 0 мм, длина от 5 -100 см, рабо­
чее давление может составлять 1 - 1 0 бар, в колонку помещается до
1,5-2 л сорбента. Для опытно-промышленного производства выпуска­
ются стеклянные колонны, конструктивно и по подбору материалов они
соответствуют требованиям GMP и могут использоваться в фармпро­
изводстве. Диаметр колонны от 7 до 20 см, длина от 50 до 95 см, мак­
симальный объем сорбента в колонне 25 л, максимальное давление 3
бар. Промышленные колонны производят из нержавеющей стали, реже
из акрилового полимера, их диаметр от 40 до 200 см, максимальный
объем сорбента достигает сотен литров, максимальное рабочее дав201
ление 3 бар. Отличительной особенностью колонн этого типа является
конструкция верхнего и нижнего сопел, позволяющая удобно и эффек­
тивно осуществлять упаковку колонн сорбентом, хроматографическое
разделение и распаковку колонн. Наиболее распространены хромато­
графические сорбенты Sephadex.Sepharose, Superose и Superdex.
Колоночная адсорбционная хроматография основана на следую­
щей технологии. Адсорбентом заполняется колонка (неподвижная фаза)
и через нее пропускается растворитель (подвижная фаза).Адсорбент
удерживается в колонке фильтрами. При прохождении растворителя
через адсорбент внутри колонки молекулы биологически активного
вещества, в результате межмолекулярных взаимодействий того или
иного типа, будут диффундировать внутрь пор адсорбента или адсор­
бироваться на его поверхности. Если гранулы адсорбента несут заря­
женные катионные (NH4) или анионные (S04) группы, то они способны
соответственно захватывать ионы противоположного заряда.
Ионообменная мембранная абсорбционная хроматография также
используется в биотехнологическом и фармпроизводстве. Технология
объединяет преимущества обычных ионообменных хроматографиче­
ских колонок в степени разделения и способности мембранной техно­
логии относительно перемещения массы, высокой пропускной способ­
ности и надежности. Ионообменная мембранная абсорбция использу­
ется при очистке терапевтических белков, антител, вирусов, ДНК, оли­
гонуклеотидов, факторов свертывания крови и др.
Рис.37. Современные хроматографы для глубокой очистки веществ
Имунно-аффинная хроматография основана на взаимодействии
антигенов и антител. Эта технология весьма эффективна для разде­
ления и очистки белковых и небелковых веществ, особенно при при­
менении в качестве лиганда моноклональных антител. Разработанный
на основании таких взаимодействий способ получил название имунноаффинной хроматографии, который существенно повысил разреша­
ющую способность при введении в практику использования монокло­
нальных антител. Блестящей иллюстрацией его эффективности явля202
ется высокая степень одноэтапной очистки человеческого интерфе­
рона (чистота повышается примерно в 500 раз). Преимущество аффин­
ной хроматографии состоит в том, что с ее помощью можно в одну ста­
дию осуществить полную очистку продукта из сложной многокомпонент­
ной смеси (культуральной жидкости, цельных клеточных экстрактов и
т. п.), тогда как другие способы требуют многоэтапной очистки. Однако
метод имеет и ряд недостатков, в частности высокая цена материалов,
используемых в аффинной хроматографии (например,веществ, приме­
няемых в качестве лигандов), а также быстрое забивание колонки про­
пускаемыми веществами. После каждого выделения продукта колонки
промывают и частицы заполняющего геля также подвергаются очистке.
Гель-хроматография основана на разделении веществ с различ­
ной молекулярной массой и диаметром частиц. Адсорбент захваты­
вает и удерживает, например, только низко-молекулярные соедине­
ния, пропуская соединения с более высокой молекулярной массой.
Гельхроматография заключается в пропускании суспензии через
колонку, заполненную пористым материалом. Целевое вещество про­
ходит через колонку без задержки, а примеси задерживаются. Для
заполнения колонки часто применяется макропористое стекло с диа­
метром пор порядка 100 нм, с удельной поверхностью 10-25 м2/г.
Флеш-хроматография —это современная модификация колоноч­
ной адсорбционной хроматографии (рис. 38). Колонки изготовлены в
форме съемных цельноблочных пластиковых картриджей, заполнен­
ных силикагелем (рис.39). Метод позволяет получать от миллиграммо­
вых до граммовых количеств целевого вещества. Уникальная цельно­
блочная конструкция картриджей обеспечивает герметичность и иде­
альную плоскость поверхности хроматографического разделения.
Рис.38 Система FLASH для хроматограф, разделения укомплектована
картриджами, градиентным насосом, УФ-детектором, коллектором
для ввода разделяемой смеси
203
Рис.39 Пластиковые картриджи для флеш-хроматографии
Установки для мембранной фильтрации
Мембранные микро- и ультрафильтрационные установки исполь­
зуются в биотехнологическом и фармпроизводстве на стадии очистки и
концентрирования ферментов, антибиотиков, витаминов, при получе­
нии вытяжки лекарственных растений (водноспиртовых настоек жень­
шеня, родиолы розовой и др.) и иных биологически активных соеди­
нений.
Микрофильтрация (МФ) позволяет удалять частицы в диапазоне
приблизительно 0,1-1 мкм. В целом, взвешенные частицы и крупные
коллоидные частицы задерживаются, в тоже время макромолекулы
и растворенные твёрдые частицы проходят через МФ мембрану. МФ
применяется для удаления бактерий, хлопьевидных материалов или
общей взвеси. Рабочее давление обычно составляет около 0.7 бар.
Ультрафильтрация (УФ) позволяет удалять частицы в диапазоне
приблизительно от 20 до 1000 Ангстрем (до 0.1 мкм). Все растворенные
соли и более мелкие молекулы проходят через мембрану. Вещества,
задерживаемые мембраной, включают коллоиды, белки, микробио­
логические загрязнения и крупные органические молекулы. Большая
часть УФ мембран имеет рейтинг по молекулярной массе между 1000
и 100 000. Рабочее давление обычно составляет около 1- 7 бар.
Синтез микро- и ультрафильтрационных мембран и производ­
ство фильтрационных установок осуществляется на основе полимеров
(целлюлозы, полисульфона, ароматических и алифатических полиа­
мидов, сополимеров акрилонитрида). К примеру, ультрафильтраци­
онные мембраны МИФИ/1 представляют собой пористые анизотроп­
ные пленки с тонким (0,5-5 мкм) активным слоем, опирающимся на
крупнопористую основу из того же полимерного материала. Мембрана
нанесена на армирующую подложку из нетканного полиэфира или про­
пилена, что придает ей необходимый комплекс механических харак-
теристик. Асимметричная структура обеспечивает сочетание высо­
кой производительности фильтра-ции и задерживания растворен­
ных веществ. Мембраны МИФИЛ производятся в виде непрерывного
полотна шириной 400 мм, хранятся и транспортируются в сухом виде.
Возможна поставка мембран в виде пластин и дисков. Фильтрационные
установки изготовленные на основе половолоконных элементов и кас­
сетных элементов (рис.40,41).
Рис.40. Ультрафильтрационный
модуль на основе кассетных
элементов
Рис.41. Ультрафильтрационный
модуль на основе
половолоконных элементов
Мембранные технологии востребованы при получении стерильной
и апирогенной воды, необходимой для изготовления медицинских пре­
паратов, вакцин и пр. (рис.42). В одной установке монтируется от 1 до 5
мембранных фильтров с поверхностью фильтрации от 0,1 до 0,5 кв. м.
Рис. 42. Промышленная фильтрационная установка
205
Оборудование для сушки и хранения
Распылительные сушилки
В биотехнологическом и фармпроизводстве широко применяется
распылительная сушка. Суспензия либо раствор, содержащий ткане­
вые и микробные клетки, биологически активные соединения распыливается в сушильной камере форсунками или центробежными дис­
ковыми распылителями. Горячий, сухой, стерильный воздух подается
в сушильную камеру по прямоточной или противоточной схеме и отво­
дится. Высушенный биоматериал попадает на прокалочные тарелки,
которые обогреваются тем же теплоносителем. Биоматериал переме­
шивается и пересыпается с тарелки на тарелку, а затем, после про­
хождения охлаждащей тарелки, выводится из сушилки.
При распылительной сушке, из-за развитой поверхности диспер­
гированных частиц биологически активных соединений и клеток проис­
ходит интенсивный тепло- и массообмен с теплоносителем (прогретым
стерильным воздухом), и распыленные частицы быстро отдают свою
влагу. Продолжительность процесса сушки составляет в среднем 10 30 с. При этом температура частиц биоматериала в сушильной камере
практически равна температуре испарения чистой влаги. Это связано
с тем, что частицы имеют насыщенную поверхность. Невысокая тем­
пература нагрева диспергированного биоматериала позволяет полу­
чить высококачественный сухой продукт. Такой метод сушки не вызы­
вает денатурацию белков.
Распылительные сушилки бывают разных конструкций и различа­
ются главным образом по приспособлению для распыления. Для сушки
фармпрепаратов более пригодны сушилки с дисками. Устройство такой
сушилки показано на рисунке 43.
206
Суспензия биоматериала из сборника 1 поступает в сушильную камеру 3 на рас­
пылительный диск 2, вращающийся со скоростью до 20 ООО об/мин. Благодаря центро­
бежной силе жидкость сбрасывается с диска с огромной скоростью и, распыляясь на
мельчайшие капли, образует вокруг диска горизонтальную зону тумана. Диаметр капель
при этом 10-50 мкм, так что суммарная поверхность 1 л распыленной жидкости может
достигнуть 600 м2. Воздух всасывается в сушилку с помощью вентилятора 5. Пройдя
через паровой калорифер 4, воздух в горячем состоянии поступает в камеру ниже
вращающегося диска и устремляется снизу вверх через полосу тумана. Вследствие
больших поверхностей происходит быстрое испарение влаги. Температура вводимого
воздуха обычно достигает 150 °С. Однако перегрев жидкости исключается вследствие
краткой экспозиции сушки. Высушенный биоматериал в форме порошка падает на дно
сушилки и вращающимися щетками 7 через отверстие на дне подводится к шнеку 8.
Современное производстве оснащено сушилками самой различной
конструкции, в том числе сушилками фирмы Ангидро, используемыми
при сушке фармпрепаратов, антибиотиков, вакцин и др. (рис.44).
Рис.44. С уш илки А нгид ро
Лиофилизаторы
Лиофилизаторы или аппараты для сублимационной сушки пред­
назначены для обезвоживания биоматериала (биологически активные
соединения, вакцины, белки, в том числе рекомбинантные, клетки и
ткани) при низкой температуре в условиях вакуума. Сублимационное
высушивание является щадящей технологией, позволяющей сохра­
нить структуру и биологическую активность клеток, тканей и другого
биоматериала. Хотя существуют различные типы лабораторных и про­
мышленных лиофилизаторов, технологический процесс сублимации
принципиально одинаков. Раствор либо суспензию биоматериала с
207
внесенной защитной средой, в ампулах или флаконах замораживают с
известной скоростью в камере лиофилизатора до эвтектической точки.
Эвтектическая точка- это полное замораживание суспензии в твердую
массу, так называемую эвтектику, состоящую из кристаллов льда и
солей, свободная вода отсутствует. Камера сообщается с конденсо­
ром, в котором создается и поддерживается низкая температура (-50
до -80°С). Высушивание осуществляется в условиях вакуума. Вначале
из биоматериала удаляется свободная вода, в процессе испарения
температура повышается до 0°С, остаточная влажность составляет
5-10%. Затем под вакуумом при плюс 30-40°С удаляется связанная
вода, влажность уменьшается до 1-3%. Удаление испаряемой влаги
осуществляется конденсацией на охлажденную поверхность конден­
сора (-40-50°С); также влага связывается химическими поглотителями.
Ампулы и флаконы с высушенным биоматериалом укупориваются под
вакуумом или после заполнения инертным газом. Флаконы хранятся
в условиях холодильника в течение одного года, ампулы несколько
лет. В лабораторных лиофилизаторах в случае отсутствия встроен­
ного конденсора биоматериал замораживают в низкотемпературном
холодильнике, а затем помещают в камеру лиофилизатора.
Процесс лиофилизации может влиять на стерильность биомате­
риала, так как содержащие их емкости во время сушки остаются откры­
тыми. Следовательно, биоматериал должен быть защищен от конта­
минации как во время его перемещения из зоны загрузки в камеру лио­
филизатора, так и в самой камере до тех пор, пока ампулы или фла­
коны будут укупорены. Пробки, используемые для закрытия флаконов
имеют специальные прорези или отверстия и частично вставляются
в горлышко до его транспортировки в лиофилизатор. По завершении
процесса лиофилизации укупорка флаконов происходит путем вдав­
ливания пробок с помощью специального устройства. Биоматериал в
ампулах по завершении сублимации запаивается.
Девакуумирование камеры после процесса лиофилизации должно
производиться стерильным воздухом, азотом либо другим инертным
газом, отвечающим фармакопейным требованиям и стерилизуемым с
помощью мембранных фильтров. Стерилизация лиофилизатора про­
водится горячим паром, соответствующим по чистоте воде, использу­
емой для инъекций.
Одна из типичных конструкций лиофилизаторов, выпускается фир­
мой CHRIST (рис.45). Конденсор располагается непосредственно под
сушильной камерой. Отверстие, через которое происходит сообщение
между камерой и конденсором увеличено. В нем установлена прямоу­
гольная запорная пластина с электрогидравлическим приводом, регу­
лирующая поток водяного пара. Большое сечение отверстия позво­
ляет пропускать достаточное количество пара, не создавая при этом
208
высокой разности давления между сушильной камерой и конденсо­
ром, особенно в начале процесса вакуумной сушки. Подобная кон­
струкция аппарата заметно увеличивает его производительность и эко­
номичность. В таком лиофилизаторе можно высушивать особо чув­
ствительные биоматериалы при температуре, близкой к эвтектической
точке, при укороченном времени высушивания.
Рис.45. Лабораторный и промышленный лиофилизаторы Christ
Современные конструкции сублимационных сушилок обеспечи­
вают постоянный мониторинг не только температуры высушивания био­
материала и динамики давления, но и его электрического сопротив­
ления, динамики уменьшения его веса в процессе сушки. Совместное
измерение электрического сопротивления и температуры биоматери­
ала позволяют более точно определять динамику процесса, обеспе­
чивают надежный режим работы во время процесса замораживания и
сушки. Непрерывное измерение в динамике высушивания веса отдель­
ной пробы биоматериала, размещенного в ячейке камеры дает воз­
можность опредепять скорость сушки во время тобой фазы процесса
при разных температурных условиях. Окончание сушки можно легко и
быстро определить по уменьшению веса биоматериала. Взвешиваемый
флакон с пробой располагается рядом с другими флаконами на пол­
ках камеры, тем самым обеспечивается репрезентативность резуль­
татов. Еще одна конструкторская инновация —это измерение темпе­
ратуры высушиваемого биоматериала при помощи специальных тер­
модатчиков, без использования кабелей, проводов. Кроме того, совре­
менные лиофильные установки снабжаются робототехникой для авто­
матической загрузки и выгрузки биоматериала (рис.46).
209
Рис.46. Применение роботов для автоматической загрузки и выгрузки
продукции из камеры лиофильной установки
Рис.47. Установка сублимационной сушки EPSILON 2-220DS.
EPSILON 2-220DS - это полностью автоматизированная система
загрузки и разгрузки высушиваемого биоматериала (рис.47).
Передвигающийся по рельсам робот может обслуживать 3 после­
довательно размещенные установки Epsilon 2-220DS (каждая с площа­
дью полок 15м2). Подобные установки востребованы в фармпроизводстве.
Консольные лиофилизаторы фирмы FreeZone (рис.48) предна­
значены для обработки умеренных количеств образцов с низкой эвтек­
тической точкой. Конструкция аппаратов этого типа снабжена двойной
системой охлаждения, позволяющей достигнуть более глубокого охлаж­
дения биоматериала (до -84 ° С) в процессе сублимации. Встроенный
датчик влажности предотвращает запуск лиофильной сушки при обна­
ружении влаги в области камеры коллектора. Автоматическое или руч­
ное управление и отображение вакуума в т В а г, Ра или Тогг и темпе­
ратуры в ° F или 0 С обеспечивают постоянный мониторинг процесса
сублимации. Конденсор и камера аппарата покрыты тефлоном для
защиты от коррозийных соединений
210
а)
б)
Рис.48. Консольные лиофилизаторы FreeZone 12 L(a), Plus 6 L(6)
и Plus 2.5 (в)
Рис.49. Промышленная лиофильные установка GZL 0.5
(производитель LPMIE, Германия)
LPMIE-лиофилизатор (рис.49) рассчитан на сублимацию крупных
партий биопрепаратов во флаконах. Конструкция и технология обо­
рудования соответствуют стандартам GMP. Сублимационная камера
с полками, конденсатор и клапан между ними изготовлены из высо­
кокачественной стали. Температура конденсера (минимальная)=-80°С.
Температура на полках может варьироваться от +55°С до -42°С. Уровень
вакуума в сублимационной камере регулируется открытием и закры­
тием впускного воздушного клапана, который обеспечивает подачу в
камеру стерильного воздуха, а также степенью раскрытия отсекающего
клапана между сублимационной камерой и конденсором.
Программные замораживатепи
Если для хранения биопрепаратов и клеток микроорганизмов
используются распылительные сушилки, лиофилизаторы и просто дьюары с жидким азотом, то при консервации тканевых клеток, особенно
стволовых клеток требуются более совершенные технологии, основан­
ные на программируемом процессе низкотемпературного хранения с
внесением в среду хранения специальных защитных реагентов - кри­
опротекторов.
Если лиофилизации вполне приемлема для хранения биологически
активных соединений и клеток микроорганизмов, то при хранении банка
стволовых клеток эта технология не применяется. Если можно ресуспендировать и использовать в медицинских целях высушенные живые
клетки микроорганизмов, то со стволовыми клетками так не происходит.
Программные замораживатели или фризеры - это комплексные
электронные устройства, предназначенные для обеспечения плано­
мерного и точного охлаждения различных биологических объектов до
низких и сверхнизких температур. В качестве хладагента во всех замораживателях используются пары жидкого азота. Жидкий азот подается
во фризер под давлением из баллона (цистерны, танка) или из обычного
дьюара открытого типа через специальный насос.
Программные замораживатели Кгуо 360-1.7 и Кгуо 440-3,3 (рис.50),
производитель PLANER, Великобритания) позволяют контролировать
и программировать условия охлаждения до сверхнизких температур
самого различного биоматериала в соломинах и ампулах (ткань кост­
ного мозга, стволовые клетки, пуповинную кровь, плазму, тромбо­
циты, сперму, яйцеклетки). Скорость замораживания варьирует от -0,01
до -50°С/мин при максимально низкой температуре -180°С. Активный
высокопроизводительный насос для жидкого азота LNP4 обеспечивает
высокие скорости охлаждения и позволяет устанавливать лаборатор­
ные дьюары большого объема. Объем камеры охлаждения от 1,7 до
30 л. Простой в использовании системный контролер MRV позволяет
устанавливать необходимые протоколы замораживания. На графиче­
ском дисплее отображаются данные о ходе процесса, которые доступны
для просмотра и распечатки на встроенном принтере после заверше­
ния протокола. Система обеспечивает просмотр и проверку протокопов
перед их запуском и сохраняет в памяти данные о 5-ти последних пусках.
Контролер в реальном времени отображает значения конечной темпе­
ратуры, температуру образца и камеры, стадию программы и текущий
профиль температур.
Рис.50. Программные замораживатели PLANER
212
Программные замораживатели производства COOLMIX (рис.51)
конструктивно отличаются возможностью перемешивания и поддер­
жания температуры для безопасного и автоматизированного добав­
ления протектора диметилсульфоксида в криомешок со стволовыми
клетками.
Аппарат АСР 215 (рис.52) предназначен для автоматизированной
криоконсервации эритроцитов. Снабжен 2 закрытыми сетами для глицеролизации и деглицеролизации замороженных эритроцитов, и для
отмывания суспензии эритроцитов. АСР 215 поставляется в комплекте
с шейкером и принтером, последний необходим для протоколирова­
ния процесса криоконсервации. Аппарат обеспечивает как криоконсер­
вацию эритроцитов для длительного хранения при -86°С, так и подго­
товку ранее законсервированных эритроцитов к использованию
Рис.51. Аппарат COOLMIX
для криоконсервации
стволовых клеток
Рис.52. Аппарат АСР 215
HAEMONETICS для
криоконсервации эритроцитов
Рис.53. Замораживатель BioArchive
Система BioArchive представляет собой автоматический, регули­
руемый, охлаждаемый азотом замораживатель общего назначения для
криоконсервации и хранения термолабильных биологических тканей и
клеток (рис.53). Ячейки стандартной формы для крепления образцов,
количество которых составляет 3626. Извлечение и загрузка образ­
цов осуществляется с помощью механической руки, управляемой ком­
пьютером. В компьютере находится база данных, в которой хранится
вся информация о клеточном материале (данные донора, параметры
хранения и т.д.). Каталогизация образцов ведется с использованием
системы штрих-кодов. Клеточный материал, подготовленный к хране­
нию, закладывается в специальные пластиковые контейнеры (муфты),
которые, в свою очередь, закладывают в программный заморажива­
тель, где и начинается процесс охлаждения по специальной программе,
которую можно менять по необходимости. В настоящее время система
BioArchive успешно используется во всем мире. Наибольшее примене­
ние она получила в банках стволовых клеток пуповинной крови, свя­
занных между собой в единую сеть, что позволяет довольно быстро и
эффективно подбирать пары донор-реципиент по всему миру.
Криобанк
При создании криобанка для хранения половых, стволовых и
соматических клеток используется следующее оборудование:
- программные замораживатели для подготовки и криоконсерва­
ции биоматериала (портативные и стационарные);
- сосуды дьюара для снабжения фризера жидким азотом, для
транспортировки и хранения криоматериала.
Криохранилище обычно представляет собой специально обору­
дованное помещение, где установлены сосуды дьюара большого объ­
ема (от 100 до 1000 л) с широкой горловиной для удобного доступа
внутрь и размещения материала (рис.54). Криохранилище оборудуют
системой сигнализации и компьютерного протоколирования уровня
жидкого азота, температурных параметров, влажности и оксигенации
в программных замораживателях.
Рис.54. Криохранилище
214
VII. ЧАСТНЫЙ РАЗДЕЛ КЛЕТОЧНЫХ ТЕХНОЛОГИЙ
Клеточная терапия при сердечной патологии
Актуальность клеточной терапии в кардиологии
Сердечно-сосудистая патология занимает ведущее место среди
заболеваний человека, как по распространенности, так и по высокой
смертности. Главный механизм патологического процесса при инфар­
кте, рефрактерной стенокардии, хронической сердечной недостаточ­
ности- это острое либо хроническое нарушение кровоснабжения мио­
карда, приводящее к склеротическим изменениям, некрозу кардиомиоцитов и в конечном итоге к снижению сократительной способности
сердечной мышцы.
Поэтому, наряду с медикаментозным и хирургическим лечением,
основанных на применении современных фармпрепаратов, использо­
вании аортокоронарного шунтирования и стентирования коронарных
артерий в кардиологии активно разрабатывается в эксперименталь­
ных исследованиях и начинает внедряться в клинике технология кле­
точной терапии.
Если шунтирование сосудов и их стентирование кардинально
улучшает, по сравнению с медикаментозной терапией кровоснабже­
ние миокарда, то клеточная терапия направлена на усиление ангио­
генеза и восполнение пула кардиомиоцитов путем дифференциации
введенных из вне стволовых клеток.
Увеличение числа кардиомиоцитов жизненно важно в силу сла­
бой регенераторной способности клеток миокарда. Одно время счита­
лось, что клетки сердечной мыщцы не способны к регенерации, кардиомиоцит считался окончательно дифференцированной клеткой, поэ­
тому реакцией на повреждение могла быть гипертрофия, но не гипер­
плазия кардиомиоцитов. В настоящее время показано наличие незна­
чительного регенераторного потенциала у кардиомиоцитов, на про­
тяжении жизни человека происходит обмен до 50% миоцитов. Однако
такая репаративная активность миокардиальных клеток недостаточна
при таких повреждениях, как обширный инфаркт и сердечная недоста­
точность. Эта способность минимальна и в норме она рассчитана на
компенсацию физиологических потерь, не более. Поэтому восполне­
ние клеточного пула, повышение сократительной активности сердеч­
ной мышцы путем разработки и внедрения технологий клеточной тера­
пии перспективно. При этом, учитывая способность сердца здорового
человека генерировать новые миоциты, не менее значима параллель­
ная разработка новых методов и механизмов медикаментозной стиму­
ляции регенеративных процессов в поврежденном миокарде.
215
Ретроспективный анализ применения стволовых клеток показал
тенденцию к снижению риска повторного инфаркта миокарада, выра­
женное снижение смертности, частоты повторных госпитализаций по
поводу сердечной недостаточности и необходимости повторной реваскупяризации сердечной мышцы.
Трансплантация целого органа - сердца в силу сложности подбора
донора по антигенам гистосовместимости, этических вопросов и про­
сто высокой стоимости операций такого рода удовпетворяет потреб­
ности лишь небольшого числа из нуждающихся в помощи пациентов.
Типы терапевтических клеток
1. По происхождению подразделяются на:
- аллогенные и аутологичные стволовые клетки человека.
Аутологичные клетки более предпочтительны в отличие от аллогенных, слабо экспрессирующих чужеродные антигены главного ком­
плекса гистосовместимости, несмотря на тщательный подбор донора.
2. По типу, используемых клеток:
- эмбриональные стволовые клетки. Эмбриональные стволо­
вые клетки обладают наиболее высоким пролиферативным потенци­
алом, плюрипотентны. Их можно получать при процедуре искусствен­
ного оплодотворения. Клиники, практикующие экстракорпоральное
оплодотворение, во время процедуры in vitro обычно используют более
одной оплодотворенной яйцеклетки, так как часто первая имплантация
может оказаться безуспешной, и требуется еще несколько повторов. В
результате остаются тысячи невостребованных яйцеклеток, которые
можно использовать для получения стволовых клеток. Также можно
использовать эмбрионы, полученные клонированием in vitro. Выделяют
эти клетки из внутренней клеточной массы донорских эмбрионов на
стадии ранней бластоцисты. Применение эмбриональных клеток в
клинической практике регламентируется законодательными актами и
сопровождается целым рядом этических проблем;
- мезенхимальные стволовые клетки (МСК) в основном выде­
ляют из костного мозга и жировой ткани человека с последующим
культивированием их на специальных средах, содержащих сыворотку
крови животных (в возможных случаях используется аутологичная
сыворотка пуповинной крови) для получения «терапевтической дозы»
клеток. Интервалы между пассажами составляют в среднем 7-9 суток, и
для получения 100 млн. МСК требуется около 6 недель. На протяжении
последующих 2-3 недель клеточная масса может быть увеличена еще
в 100 раз. При соблюдении существующих требований, предъявляемых
к продуктам крови, и условий асептического производства возможно
создание технологии эффективного культивирования клеток человека,
216
пригодных для клинического использования.
МСК способны к дифференцировке в хондроциты, остеобласты,
адипоциты и фибробласты, могут формировать строму костного мозга.
В эксперименте показана способность МСК дифференцироваться в
сердечную и скелетную мышечную ткань под действием 5-азацитидина (соединение, деметилирующее ДНК) и микроокружения, напри­
мер, взаимодействия «клетка-клетка» между МСК и мышечными клет­
ками. МСК участвуют в процессах стимуляции ангиогенеза и восста­
новлении сократительной функции поврежденного миокарда посред­
ством активации фактора роста стволовых клеток -SCF. Также выяв­
лено, что при трансплантации МСК с другими костномозговыми клет­
ками усиливается экспрессия генов семейства тенасцина с улучше­
нием симпатической иннервации сердца.
Одной из причин, ограничивающих клиническое применение аллогенных МСК, является необходимость размножения их в культуре. А
следствием присутствия в составе сред для культивирования кле­
ток высоких концентраций сыворотки крови животных (эмбриональ­
ной телячьей, лошадиной и другой сыворотки) может являться риск
инфицирования пациента агентами прионной природы или зоонозными
инфекциями, даже, несмотря на то, что сыворотки от ведущих произ­
водителей тщательно тестируются. Другая опасность заключается в
возможности иммунизации пациента ксеногенными белками, что особо
опасно при повторном введении клеточного материала. И то и другое
диктует необходимость поиска альтернативных путей культивирова­
ния МСК человека;
гемопоэтические стволовые клетки. Гемопоэтические ств
ловые клетки (ГСК) наиболее доступны для клинического примене­
ния. Получают эти клетки в основном из пуповинной крови. Кровь из
пуповины, несколько десятков миллилитров которой выливается при
рождении ребенка, содержит немало стволовых клеток, в основном
ГСК. Общая концентрация ГСК в пуповинной крови ниже, но число ран­
них клеток-предшественников значительно выше, чем в костном мозге
(например, в пуповинной крови содержится в 2 раза больше полипотентных ГСК, чем в таком же объеме трансплантанта костного мозга).
Но главное, пуповинную кровь не надо специально забирать с
помощью особого оборудования. Достаточно вовремя собрать ее после
родов в стерильный пластиковый контейнер, затем провести анализ
образца, заморозить с помощью жидкого азота и поместить на хране­
ние. За 1 раз может быть собрано в среднем около 80-100 мл пуповинР
ной крови. В среднем, для трансплантации достаточно 1 мл пуповин­
ной крови на 1 кг массы тела реципиента. Количество стволовых клеток
в пуповинной крови не достаточно велико, и эффективное их исполь­
зование возможно только однократно для самого ребёнка до Юлет.
217
Забор пуповинной крови производится в стерильные емко­
сти (шприцы или полиэтиленовые пакеты), содержащие изотониче­
ский антикоагулянт, с соблюдением мер асептики и предосторожно­
стей, исключающих инфицирование материала в процессе забора.
Транспортировка материала осуществляется при комнатной темпера­
туре в изотермическом транспортном контейнере. В процессе выделе­
ния стволовых клеток пуповинная кровь подвергается поэтапной обра­
ботке, в результате чего происходит освобождение от избытка плазмы,
практически всех форменных элементов красной крови и большинства
зрелых лейкоцитов. Данный способ получения концентрата гемопоэтических стволовых клеток является дорогим, но наиболее эффек­
тивным. Применяются различные методы сепарации стволовых кле­
ток (получения концентрата), в том числе центрифугирование на гра­
диенте плотности фиколла и седиментации гидроксиэтилкрахмалом.
Для последующего криогенного хранения концентраты ство­
ловых клеток в аутологичной плазме расфасовываются в криопро­
бирки и замораживаются в присутствии 10% ДМСО до температуры
-90 градусов Цельсия с последующим хранением в жидком азоте.
Жизнеспособность клеток после пробного размораживания (валида­
ции) составляет не менее 80%.
Улучшение сократительной способности миокарада после вве­
дения ГСК (чаще используют С034*и CD45* фракции этих клеток) объ­
ясняется не их дифференциацией в кардиомиоциты, а стимуляцией
ангиогенеза за счет дифференцировки их в эндотелиальные пред­
шественники, за счет выделения цитокинов и хемокинов, снижающих
воспаление в поврежденной.
- эндотелиальные клетки предшественники (ЭКП) являются
резидентами костного мозга, также они могут быть получены из мононуклеарной фракции периферической и пуповинной крови. ЭКП обла­
дают способностью дифференцироваться в эндотелиоциты, выстила­
ющие внутреннюю поверхность кровеносных сосудов и играют важ­
ную роль в антикоагуляционной активности, сокращении и расслабле­
нии стенок сосудов. Нарушение функции эндотелия предрасполагает
к сужению кровеносных сосудов, образованию тромбов и атероскле­
розу. Эти костномозговые клетки физиологически важны в сохранении
эндотелия, в процессе ангиогенеза;
При экспериментальном инфаркте показана способность вво­
димых эндотелиальных предшественников заселять ишемизиро­
ванные участки миокарда, стимулировать образование капилляров.
Избирательной миграции донорских эндотелиальных предшественни­
ков способствует повышенная экспрессия в условиях ишемизирован­
ного миокарда сосудистого фактора VEGF.
- фетальные клетки (ФК) получают из органов и тканей 17-21
218
недельного плода при прерывании беременности по социальным пока­
заниям, согласно рекомендации ВОЗ. Фетальная ткань практически
полностью состоит из прогениторных клеток с высоким потенциалом
миграции и репопуляции. Фетальные ткани и клетки в отличие от диф­
ференцированных клеток зрелой ткани обладают большей устойчиво­
стью к гипоксии, а биологически активные вещества из них большей
терапевтической эффективностью. Для получения изолированных
клеток используются ферментные, механические и комбинированные
методы диссоциации ткани. Далее отбирают суспензии с повышенным
содержанием прогениторных клеток. Для сохранения жизнеспособно­
сти выделенных клеток используются различные сложные питательные
среды и растворы для тканевых культур. При долгосрочном хранении
клеточных суспензий применяется программированная низкотемпе­
ратурная криоконсервация в присутствии стабилизатора клеточного
материала (глицерин, ДМСО и др.). В экспериментальных работах было
показано, что фетальные кардиомиоциты обладают способностью к
делению, и при трансплантации в область миокардиального рубца
формируют нормально функционирующие вставочные диски с кардиомиоцитами реципиента. Известно также, что фетальные кардиомио­
циты вовлечены в процесс выделения ангиогенных факторов, таких,
как VEGF, улучшающих микроциркуляцию в области поврежденного
ишемией миокарда. Однако трансплантированные фетальные кордиомиоциты характеризуются низкой выживаемостью. Количественным
ПЦР- анализом выявлена быстрая потеря этих клеток, через 2 недели
после трансплантации в области поврежденного миокарда остается
не более 15% фетальных кардиомиоцитов.
Существуют закрытый и открытый способы забора пуповинной
крови. При открытом способе кровь собирается в стерильную емкость
самотеком, после обработки конечного участка пуповины дезинфи­
цирующим раствором. С этой целью используют специальные трансфузионные системы, содержащие антикоагулянт и оснащенные дре­
нажной иглой для извлечения пуповинной крови самотеком. Однако
при таком способе риск микробной контаминации вагинальной микро­
флорой составляет 20-30%, что на порядок выше, чем при закрытом
способе (риск контаминации равен 1-2%). Закрытый способ заключа­
ется в активной эксфузии шприцем объемом 50 мл, частично запопненным антикоагулянтом. Предпочтителен антикоагулянт, состоящий
из цитрата и фосфата натрия, декстрозы и аденина, и обеспечиваю­
щий не только антикоагуляцию, но и протекторное действие в отно­
шение сохранности клеточных мембран извлекаемых клеток крови.
Объем извлекаемой пуповинной крови в пределах 60-80 мл, этого объ­
ема бывает достаточно для лечения онкогематологической патоло­
гии у детей.
219
Культивирование стволовых клеток
Для культивирования стволовых клеток используются известные
питательные среды, содержащие комплекс веществ, необходимых для
роста и выживания. Обязательно наличие аминокислот, витаминов, гор­
мональных и иных биологически активных соединений, минеральных
солей и многих других соединений, необходимых для жизнедеятельно­
сти клеток in vitro. Во многих прописях питательных сред присутствует
фетальная сыворотка животного происхождения. Культивирование
стволовых клеток требует соблюдения строго определенной темпера­
туры, соотношения углекислого газа и кислорода, абсолютную стериль­
ность, строго периодическую замену питательной среды, ежедневный
микроскопический контроль и, главное, своевременный пересев, доро­
гостоящие ростовые факторы и фетальную сыворотку. Белки сыво­
ротки полезны набором аминокислот, кроме того они содержат различ­
ные, как стимулирующие, так и тормозящие факторы роста.
При поддержании пула стволовых клеток in vitro обязательны
своевременные пересевы, иначе клетки во флаконах становятся на
путь необратимой дифференцировки,превращаясь в клетки сер­
дечной мышцы, костной или хрящевой ткани, жировые клетки и др.
Биоматериалы (костный мозг, пуповинная кровь и др.), используемые
для получения стволовых клеток обязательно тестируются на наличие
возбудителей вирусных инфекций методами ИФА и ПЦР.
При культивировании клеток либо непосредственно при проведе­
нии клеточной терапии обязательно используются различные факторы
роста. С целью индукции дифференцировки стволовых клеток в кардиомиоциты нередко используется 5-азацитидин. На рост и выживае­
мость кардиомиоцитов позитивно влияют инсулиноподобный фактор
роста 1 (insulin-like growth factor 1, IGF-1), интерлейкин 10, сосудистый
эндотелиальный фактор роста, фактор стромальных клеток, ангиопоэтин 1, фактор роста гепатоцитов и др.
Способы доставки клеток в поврежденный миокард
Интрамиокардиальное введение. Стволовые клетки могут быть
инъецированы в мышечную ткань по краям зоны инфаркта или в
область рубца во время операции артерио-коронарного шунтирования.
Кроме того, при помощи предварительной компьютерной диагностики
оценивается питание различных участков миокарда с помощью тонкого
катетера, введенного в полость сердца через периферическую арте­
рию. Затем в участки сердца с нарушенным кровоснабжением через тот
же катетер очень тонкой иглой вводят аутологичные стволовые клетки.
Внутрисосудистое введение. Введение клеток в коронарные
артерии либо вены через сосудистый катетер менее травматично по
сравнению с прямым интрамиокардиальным введением. Данный спо220
соб позволяет достичь «доставки к месту» с более равномерным рас­
пределением клеток по краям повреждения.
Тканевая инженерия. Культивирование и дифференциация ство­
ловых клеток в кардиомиоциты на искусственном каркасе in vitro с
последующей аппликацией биоинженерной ткани на область повреж­
денного миокарада оперативным путем.
Вместе с тем при всех вышеуказанных способах введения тера­
певтическая эффективность по численности жизнеспособных кле­
ток в зоне поражения и длительность их выживания пока ниже жела­
емых результатов.
Результаты клеточной терапии при патологии сердца
Анализ результатов клеточной терапии инфаркта миокарда
как в эксперименте, так и после первой фазы клинических испыта­
ний показал выраженное снижение смертности, частоты повторных
госпитализаций по поводу сердечной недостаточности и необходи­
мости повторной реваскуляризации. Оказалось, что введение ство­
ловых клеток при экспериментальной острой сердечной недостаточ­
ности эффективно только тогда, когда они вводятся в так называе­
мый «светлый» период. «Светлый» период, это отрезок времени между
воспалительно-некротическим и регенераторным процессами, когда
уже не столь активно воспаление и начинается репарация в области
поврежденного миокарада. В начальной, экссудативной фазе воспале­
ния в инфильтрированной ткани недостаточно кислорода, низкое pH,
а из некротизированных клеток выделяются многочисленные лизосомальные ферменты, лизирующие вводимые из вне стволовые клетки.
Также мало эффективно введение стволовых клеток после окончания
репаративных процессов, в период когда уже сформировался ткане­
вой рубец в зоне инфаркта. В «светлый» период наблюдается актива­
ция тканевого микроокружения, повышение в зоне повреждения кон­
центрации тканевых факторов роста, способствующих дифференци­
ации и росту стволовых клеток.
В экспериментах показано, что в случае клеточной терапии при
хронической недостаточности миокарда, на фоне развивающегося
кардиосклероза возможна активация микроокружения путем точеч­
ных радиочастотных повреждений с образованием зон микроинфар­
ктов. Если после такого воздействия ввести стволовые клетки, то они
активно вовлекаются в процессы регенерации, приводя к стабилиза­
ции развивающегося кардиосклероза.
Существуют поэтапные технологии клеточной терапии инфаркта
миокарда. Вначале (на 3-6 сутки после нарушения кровоснабжения
сердечной мышцы) в миокард вводятся мононуклеарные костномоз­
говые клетки, стимулирующие образование капилляров и улучшение
221
функциональной активности кардиомиоцитов. Затем (на 12-14 сутки)
на фоне активного ангиогенеза вводятся стволовые клетки предифференцированные в клетки сердечной мышцы с целью активизации
репаративных процессов в поврежденном миокарде.
Клинически апробирована с благоприятным эффектом при застой­
ной сердечной недостаточности минимально инвазивная технология
введения препарата из мезенхимальных стволовых клеток в сердеч­
ную мышцу путем катетеризации периферического сосуда.
Вместе с тем, оптимально положительные клинические резуль­
таты клеточной терапии при сердечной патологии не всегда имеют
место. Это обусловлено недостаточностью фундаментальных знаний
и молекулярных технологий по «управлению» регуляторными меха­
низмами дифференциации и пролиферации стволовых клеток в кардиомиоциты in vivo. Столь же актуальны дальнейшие исследования по
оптимизации взаимодействия имплантируемых донорских клеток с тка­
невым микроокружением хозяина, с клетками-сателлитами. Нет чет­
ких доказательств, особенно по результатам клинических испытаний,
о дифференциации введенных из вне стволовых клеток в кардиомиоциты (хотя в отдельных экспериментах на животных это доказано) и
их непосредственном участии в осуществлении сократительной функ­
ции миокарда. Улучшение функции миокарда во многом связывается
с паракринным эффектом, т.е.продукцией имплантированными клет­
ками различных факторов роста (интерлейкин 10, сосудистый эндоте­
лиальный фактор роста, фактор стромальных клеток, ангиопоэтин 1,
инсулиноподобный фактор роста 1, периостин и др.), которые активи­
зируют процессы ангиогенеза и тем самым способствуют улучшению
трофики миокарда. Также известно, что стволовые клетки выделяют
не только определенные ростовые, но и предотвращающие апоптоз
факторы и привлекают в зону некроза собственные стволовые клетки
организма, значительно ускоряя и улучшая процессы восстановления
сердечной мышцы.
Наряду со стволовыми клетками при клеточной терапии сердечной
патологии апробируются: локальная терапия цитокинами и введение
колониестимулирующих факторов с целью активной
мобилизации
резидентных клеток из костного мозга пациента.
Первый протокол клинического исследования клеточной терапии
заболевания сердца был начат в 1994 году, но общепризнанной эффек­
тивной технологии лечения на основе стволовых клеток пока нет.
222
Клеточная те р а п и я в о н ко гем ато л о ги и
Актуальность клеточной терапии в онкогематологии
Трансплантация костного мозга, содержащего гемопоэтические
стволовые клетки уже на протяжении десятилетий используется для
восстановления кроветворения при различных гематологических, онко­
логических и иммунологических заболеваниях. Эта технология кле­
точной терапии чаще применяется при злокачественных (острый миелобластный и лимфобластный лейкозы, хронический лимфоцитарный
и миелолейкозы, болезнь Ходжкина) и иных (апластическая анемия,
анемии Фанкони и Даймонда-Блекфана, большая талассемия, серпо­
видноклеточная анемия) заболеваниях крови.Среди тысяч выполнен­
ных пересадок костного мозга при онкогематологических заболеваниях
доминирует аллотрансплантация.
Наряду с костномозговой тканью в качестве источника гемопоэтических стволовых клеток в онкогематологии все чаще применяется
пуповинная кровь. Согласно данным Всемирной организации доно­
ров костного мозга в четверти случаев источником гемопоэтических
стволовых клеток для аллогенных трансплантаций является пуповин­
ная кровь.
С этой же целью нередко используются стволовые клетки,
извлеченные из периферической крови.
Терапевтический эффект трансплантации костного мозга, пупо­
винной крови обусловлен, прежде всего, популяцией гемопоэтических
стволовых клеток. В связи с этим, в настоящее время вместо термина
«трансплантация костного мозга», с учетом использования в качестве
трансплантата не только красного костного мозга, но и пуповинной и
периферической крови чаще применяется термин «трансплантация
гемопоэтических стволовых клеток».
Гзмопоэтические клетки костного мозга, пуповины и перифе­
рической крови
Костный мозг является комплексной тканью, состоящей из гемо­
поэтических клеток, красных и белых клеток крови и их предшествен­
ников, мезенхимальных стволовых клеток, а также из образующих сое­
динительную, стромальную ткань группу клеток, включающих фибробласты, ретикулоциты, адипоциты и эндотелиальные клетки. Клетки
стромы регулируют морфологическую дифференцировку гемопоэти­
ческих клеток посредством поверхностных клеточных белков и секре­
цией факторов роста, участвующих в образовании и поддержании
структуры кости.
У взрослого человека красный костный мозг содержится в ячей­
ках губчатого вещества плоских костей (грудина, крылья подвздошных
223
костей), в губчатом веществе и эпифизе трубчатых костей (бедренная
кость). Содержание стволовых клеток среди всей популяции клеток в
костном мозге составляет примерно 0,2-0,5%.
Особенностью гемопоэтических стволовых клеток является экс­
прессия на их поверхности антигена CD34. Клетки с иммунофеноти­
пом CD34-)- обладают высокой пролиферативной и клоногенной актив­
ностью, поэтому антиген CD34+ считается широко распространенным
маркером стволовых клеток. Определение количества клеток CD34+
является важным показателем. Стволовые клетки относятся к ядро­
содержащим клеткам, поэтому также важной характеристикой явля­
ется количество ядросодержащих клеток. Определение их количества
также относится к обязательному критерию при оценке качества транс­
плантата.
Забор костного мозга у пациента осуществляется в стационарных
условиях под анестезией. Специальной иглой прокалывается грудина,
бедренная или подвздошная кости и затем шприцем извлекается кост­
ный мозг (рис.55 и 58). Далее для отделения пула гепопоэтических ство­
ловых клеток применяется цитаферез. Это специальный метод, позво­
ляющий количественно и качественно различить клеточные популяции,
выделить и концентрировать стволовые клетки (рис.56,57).
Аутологичный трансплантат сразу же подвергается криоконсер­
вации - программированному низкотемпературному охлаждению. В
случае аллогенного костного мозга до замораживания путем цитофереза извлекаются Т-лимфоциты, чтобы снизить риск возможной реак­
ции «трансплантат против хозяина».
Пуповинную кровь получают после рождения ребенка и отделе­
ния его от последа, когда плацента еще находится в полости матки,
или после рождения последа, а также во время операции кесарева
сечения. Для сбора пуповинной крови используют специальную трансфузионную систему, содержащую антикоагулянт, и оснащенную дре­
нажной иглой. Предпочтителен антикоагулянт, состоящий из цитрата
и фосфата натрия, декстрозы, аденина и обеспечивающий не только
антикоагуляцию, но и мембранопротекторное действие в отношение
извлекаемых клеток крови. Существуют закрытый и открытый спо­
собы получения пуповинной крови. При закрытом способе после рож­
дения ребенка и пересечения пуповины, когда плацента находится
еще в полости матки, производят иглой дренирование пупочной вены,
кровь самотеком оттекает в трансфузионную систему. Предварительно
пупочный канатик обрабатывают раствором йода или этилового спирта.
В пупочном канатике проходят два сосуда: одна вена и две артерии.
Отличительными особенностями вены пуповины является больший
диаметр и меньшая извитость по сравнению с артериями. При открытом
способе забора пуповинной крови после рождения ребенка и отделе224
ния и рождения последа плаценту укладывают на специальную рамку
с отверстием для пуповины плодовой поверхностью вниз. После обра­
ботки пупочного канатика также дренируют пупочную вену и собирают
кровь в систему с антикоагулянтом. Каждый образец пуповинной крови
тестируется на количество ядросодержащих клеток, CD34+, КОЕ-ГМ. В
пуповинной крови содержится в 2 раза больше полипотентных ГСК в
расчете на 1 мл, чем в таком же объеме трансплантата костного мозга
(КОЕ-ГМ в пуповинной крови составляет примерно 1 • 104мл.). Также,
как и с аллогенным костномозговым трансплантатом проводится HLAтипирование, кроме того определяется группа крови по системе АВО
и резус-фактору. С целью исключения инфекции осуществляют бакте­
риологический и вирусологический анализы.
Перед криоконсервацией пуповинной крови проводят ее сепара­
цию для выделения ядросодержащих клеток, удаления эритроцитов и
гранулоцитов. Эти клетки при замораживании и размораживании лизируются и продукты лизиса могут вызывать неблагоприятные реакции
у реципиента. При наличии в консервируемой пуповинной крови эри­
троцитов существует риск развития реакции несовместимости по анти­
генам системы АВО и резус-фактора. Необходимо отметить, что при
одноразовом заборе от донора возможно извлечение около 1,0 литра
костного мозга, а пуповинной крови всего 60-80 мл. Но извлечение кост­
ного мозга —это все же достаточно травматичное оперативное вме­
шательство, в отличие от забора пуповинной крови.
Из периферической крови стволовые клетки можно получить мето­
дом цитофереза после предварительного введения препаратов, стиму­
лирующих выброс их в кровяное русло. Так, за сутки до забора крови
пациенту вводится колониестимулирующий фактор, усиливающий
выход в кровяное русло костномозговых клеток, в том числе гемопоэтических стволовых клеток. Для решения вопроса о начале цитофе­
реза после проведенной стимуляции, методом проточной цитофлуориметрии определяется концентрация гемопоэтических стволовых клеток
в периферической крови. Затем извлекается 50 мл венозной крови в
стерильном ламинарном боксе. Выделенные из крови автоматическим
сепаратором стволовые кпетки культивируются на специальных пита­
тельных средах с внесением ряда факторов роста. В течение недели
культивирования число ГСК увеличивается в 10-20 раз.
Технология забора и реинфузии костного мозга
После завершения курса химиотерапии в сочетании или без ради­
отерапии, проводится реинфузия аутологичного или инфузия аллогенного костного мозга, подобно переливанию крови. Костномозговые
клетки, в том числе гемопоэтические клетки циркулируют по организму
с кровотоком и в конечном счете оседают в полостях костей, где начи­
225
нается их рост и возобновляется процесс кроветворения. Существует
метод, когда определенное количество трансплантата пункцией вво­
дится непосредственно в костный мозг тазовой кости.
При аутологичной трансплантации у больного при онкогематологических заболеваниях извлекается костный мозг, в котором содер­
жится определенное количество ГСК и после проведенной лучевой
либо химиотерапии трансплантат реинфузируется.
Аутологичная трансплантация, способствуя более эффективному
восстановлению гемопоэза после химиотерапии, позволяет неодно­
кратно применять разовые дозы некоторых цитостатических препа­
ратов.
При аллогенной трансплантации используется донорский костный
мозг. Пересаживаемая ткань должна быть иммунологически идентич­
ной ткани реципиента. Наиболее предпочтительны пересадки костного
мозга от однояйцевых близнецов, затем от братьев и сестер, но на
практике чаще используется гистосовместимый трансплантат по HLA
антигенам, полученный из банка костного мозга и пуповинной крови.
После трансплантации костного мозга или пуповинной крови
согласно схеме назначаются факторы роста, в том числе гранулоцитарный колониестимулирующий (Г-КСФ), 9-гранулоцитарномакрофагальный (ГМ-КСФ) и др.
Результаты клеточной терапии в онкогематологии
Трансплантация красного костного мозга по праву относится к
ведущему методу лечения пациентов, страдающих лейкемией, лимфомой, миеломой и другими заболеваниями, связанными с иммунным
дефицитом. Стабильный и достаточно высокий лечебный эффект от
применения данного вида клеточной терапии обусловлен следующим:
- возможностью назначения радиотерапии и высоких доз хими­
опрепаратов для преодоления опухолевой резистентности (в случае
аутологичной трансплантации у пациента до радио- или химиотерапии
предварительно извлекается костный мозг);
- восстановлением популяции стволовых клеток имплантацией
костного мозга после токсического воздействия химиотерапии;
- замещением пораженного опухолью либо высокими дозами
химиопрепаратов костного мозга пациента.
Принцип трансплантации костного мозга - это возможность при­
менения очень высоких доз химиотерапии или облучения для уничто­
жения раковых клеток в организме с разрушением собственного кост­
ного мозга, продуцирующего эти клетки, и последующей реинфузией
здоровых клеток костного мозга, которые, развиваясь, восстанавли­
вают способность к кроветворению. Трансплантация гемопоэтических
стволовых клеток повышает эффективность химио- и радиотерапии,
226
увеличивает период ремиссии и продолжительность жизни онкогематологических больных.
Рис. 55.Игла BLE. Предназначена для трансплантации
костного мозга, снабжена мандреном, для отсасывания костного
мозга присоединяется шприц.
Рис. 56.M acoP ress -а в то м а ти ч е с ки й сепаратор крови.
Позволяет отделять и определять количество стволовых клеток
227
Рис. 57.Проточиый цитофлуориметр EPICS XL-MCL
Аппарат позволяет количественно и качественно различить клеточные
популяции, получить информацию о морфологии клеток, их поверхностных
антигенах, активности внутриклеточных ферментов, содержании ДНК и т.д.
Клеточная суспензия, предварительно меченная флюоресцирующими
моноклональными антителами или флуоресцентными красителями,
попадает в поток жидкости, проходящий через проточную ячейку
с лазерной детекцией клеток.
Рис.58. Пункция костного мозга (с сайта)
228
О плодотворение in vitro
Актуальность
Бесплодие является актуальной проблемой во всем мире и
Казахстан не исключение - по статистике 15 - 20% супружеских пар в
республике страдают бесплодием. О социальной значимости техноло­
гий преодоления бесплодия свидетельствует присвоение Нобелевской
премии в 2010 году Р. Эдвардсу, разработавшему технологию экстра­
корпорального оплодотворения (ЭКО) или оплодотворения in vitro. В
1978 году на свет появилась первая девочка, зачатая методом экстра­
корпорального оплодотворения, - Луиза Браун; через 11 лет - впер­
вые была использована программа суррогатного материнства; через
16 лет-оплодотворение in vitro было осуществлено интрацитоплазматической инъекцией единичного сперматозоида (метод ИКСИ, рис.59).
Число детей, рожденных «в пробирке», при помощи технологии экстра­
корпорального оплодотворения из года в год растет и уже исчисляется
несколькими миллионами.
Большая
микропипетка,
удерживающая
яйцеклетку
в неподвижном
сосотоянии
Сперматозоид в маленькой
стеклянной микропипетке, с
помощью которой
сперматозоид инъецируется в
яйцеклетку
Рис.59. Интрацитоплазматическая инъекция сперматозоида в яйце­
клетку (ИКСИ), при которой сперматозоид вводится непосредственно
внутрь яйцеклетки для ее оплодотворения (с сайта).
229
Технология оплодотворения in vitro
1. Технология экстракорпорального оплодотворения начинается
с предварительной стимуляции процесса овуляции, для достижения
созревания не 1-2 яйцеклеток, а 10-20. Стимуляция позволяет получить
достаточное количество яйцеклеток для их последующего оплодотво­
рения in vitro. С этой целью пациентке в течение двух недель вводят
гормональные препараты, активирующие процесс развития фоллику­
лов и созревания яйцеклеток. Чаще используют человеческий менопау­
зальный гонадотропин (ЧМГ), фолликулостимулирующий гормон (ФСГ),
хорионический гонадотропин человека (ХГЧ) и др. В последующем под
ультразвуковым исследованием у нее контролируется рост фоллику­
лов, зрелые фолликулы достигают 16-18 мм в диаметре.
2. После созревания фолликулов проводится инъекция ХГЧ с
целью регуляции во времени процесса наступления овуляции. Пункцию
яичников и извлечение фолликулов производят до наступления ову­
ляции, через влагалище под контролем ультразвукового исследова­
ния (рис.60). После пункции фолликулов из аспирата под микроско­
пом отбираются яйцеклетки, окруженные маленькими трофическими
клетками кумулюса, которые питают яйцеклетку. Обнаруженные яйце­
клетки отмывают от фолликулярной жидкости, оценивается зрелость
яйцеклеток, после чего их помещают в специальную среду культиви­
рования в чашках Петри либо культуральных планшетах и переносят
в инкубатор, для последующего экстракорпорального оплодотворения.
При невозможности получить яйцеклетки у пациентки (отсутствие яич­
ников, менопауза и пр.) могут быть использованы яйцеклетки другой
женщины- родственницы, знакомой или платного донора.
шЛ /Щ
в
щШ.ж
Фаллопиева т руба
7
Фолликулы
Шяичмокш
ЧЛ
/
V х?
\
|
Яичник
Аслирационная
“
'
V
"
' ------------------- -
Рис.60. Получение яйцеклеток.
Пункция фолликулов проводится через свод влагалища специальной иглой
под контролем ультразвука.
230
Сперматозоиды отмываются от семенной жидкости многократным
центрифугированием спермы в культуральной среде.
3. Собственно оплодотворение проводят одним из двух способов:
инсеминацией in vitro или интрацитоплазматической инъекцией (ИКСИ)
сперматозоидов. При первом, более простом способе к яйцеклеткам, кото­
рые находятся в питательной среде, добавляют суспензию сперматозои­
дов, из расчета 100 -200 тыс. мужских половых клеток на 1 яйцеклетку. В
последующие 2-3 часа сперматозоид из культуральной среды самостоя­
тельно проникает в яйцеклетку и тем самым оплодотворяет ее. При при­
менении метода ИКСИ сперматозоид вводят в яйцеклетку инъекцией под
контролем зрения с помощью микрохирургических инструментов. ИКСИ
-технология более травматична и используется строго по показаниям и в
среднем используется примерно в 10-15% случаев оплодотворения in vitro.
4. Оплодотворенная яйцеклетка (зигота, рис.61) в специальной среде
помещается в С02-инкубатор при 37 °С и 5-6 % С02на 3-5 суток до обра­
зования бластоцисты.
(<
Рис.61. Оплодотворенная яйцеклетка.
После одного цикла дробления и образования
двухклеточного эмбриона.
Зигота - это одна клетка с двумя пронуклеусами, несущими соот­
ветственно мужской и женский генетический материал. Яйцеклетки с ано­
мальным оплодотворением (например, содержащие три пронуклеуса вме­
сто двух) или вовсе не оплодотворившиеся не используются.Нормально
оплодотворившиеся яйцеклетки продолжают культивировать в инкуба­
торе. Среда для культивирования содержит основные минеральные соли
натрия, калия, кальция, магния, хлора и др.; углеводы (глюкоза, пируват, лактат) и аминокислоты (особенно, незаменимые), часто витамины
и белки сыворотки крови. В процессе инкубирования, на 5 сутки количе­
ство клеток эмбриона увеличивается до нескольких десятков. К этому вре­
мени внутри эмбриона формируется полость с жидкостью, и клетки диф­
ференцируются на два типа: те, из которых впоследствии сформируется
231
плод, и те, из которых сформируется плацента.
5.
Нормально развивающиеся 1-2 эмбриона имплантируются
матку. Перенос эмбриона в полость матки осуществляют мягким кате­
тером через влагалище (рис.62). Катетер для переноса эмбрионов пред­
ставляет собой длинную тонкую стерильную силиконовую трубку, диаме­
тром 1-2 мм. Наружный конец катетера соединяется со шприцем. Катетер
заполняется питательной средой, содержащей один или несколько эмбри­
онов. Как правило, перенос эмбрионов выполняется под контролем УЗИ.
Рис.62. Перенос эмбрионов через шейку матки.
6. Оставшиеся неиспользованными эмбрионы подвергают крио­
консервации. Если беременность не наступает, то через определенное
время процесс экстракорпорального оплодотворения можно повторить,
используя криоконсервированные эмбрионы. Беременность опреде­
ляется с помощью специального анализа, измеряющего содержание
гормона ХГЧ в сыворотке крови, спустя 10-14 дней после импланта­
ции эмбриона. Этот гормон синтезируется только клетками эмбриона.
7. До переноса эмбриона в полость матки в обязательном порядке
выполняется преимплантационная генетическая диагностика с целью
исключения наследственной или иной патологии. Эмбрион иссле­
дуется с целью исключения грубых пороков развития, хромосомных
болезней (болезнь Дауна и др.). Кроме генодиагностики дополнительно
может использоваться морфометрическая оценка состояния эмбри­
она при помощи специальной шкалы. Оценивается морфологическое
состояние как эмбриона в целом, так и отдельных клеток и внутрикле­
точных структур (ядра, ядрышки и др.).
232
Тканевая инженерия кости
Актуальность инженерии костной ткани
Травматические переломы костей нередко приводят к потере
опорно-двигательной функции вследствие того, что репаративные
процессы в костной ткани оказываются недостаточными для воспол­
нения образовавшегося дефекта. При поражении костной ткани деге­
неративными процессами ее физиологическое восстановление путем
регенерации становится вообще неосуществимым. И если дегенера­
тивные поражения наблюдаются чаще у человека в преклонном воз­
расте, то тяжелые переломы при авариях, несчастных случаях чаще
встречаются у молодых людей и количество подобных повреждений
просто огромно.
Тканевая инженерия позволяет вне организма конструировать
«новую кость» - костный конструкт, способный в определенной сте­
пени восполнить функцию пораженной естественной кости и восста­
новить утраченную опорно-двигательную функцию.
Естественно тканевая инженерия является логическим продол­
жением, дальнейшим развитием устоявшихся в ортопедии и травма­
тологии технологий - над- или внутрикостной фиксации переломов,
удлинении кости при помощи жесткой фиксации и вытяжения аппара­
том Илизарова, эндопротезирования крупных суставов (тазобедрен­
ного, коленного) и др.
Вместе с тем, тканевая инженерия —это новый этап развития, это
современные биотехнологии в травматологии и ортопедии, связан­
ные с достижениями клеточных технологий, молекулярной биологии и
генетики. Суть технологии в следующем:
- костный конструкт наращивается на матриксе, в биореакторе;
- для наращивания костной ткани используются плюрипотентные
стромальные или мезенхимальные стволовые либо остеобластопо­
добные клетки;
- для направленного стимулирования роста костной ткани in vitro
используются факторы роста —биологически активные соединения,
активирующие пролиферацию и дифференциацию стволовых клеток.
В состав костной ткани входят клеточные элементы и межклеточ­
ное вещество - костный матрикс, состоящий из прочных фибрилл кол­
лагена и минеральных солей (фосфат кальция в виде кристалликов
гидроксиапатита). Костная ткань покрыта надкостницей, состоящей из
двух слоев: наружного - волокнистого и внутреннего, прилегающего
к поверхности кости - остеогенного или камбиального, который явля­
ется источником клеток при физиологической и репаративной реге­
нерации костной ткани. Матрикс порист и заполнен клеточными эле­
ментами - это остеобласты, остеокласты, остеоциты, периваскуляр233
ные клетки, макрофаги. В результате белкового синтеза остеобласты
продуцируют коллаген и протеогликаны, формирующие остеоидные
пластинки. Последние образуют структурную единицу кости - остеон.
Остеоциты, происходят из остеобластов и участвуют во внутриклеточ­
ном и внеклеточном транспорте органических питательных веществ
и минеральных солей. Клетки, участвующие в остеогенезе, свое про­
исхождение берут из мезенхимальных (стромальных) клеток костного
мозга и находятся в эндосте и периосте (надкостнице). Количество
этих клеток регулируется биохимическими сигнальными молекулами
в процессе ремоделирования костной ткани и восстановления кост­
ных дефектов, местное клеточное микроокружение обусловливает
дифференцировку остеогенных клеток в остеобласты или хондробласты. Высокая васкуляризация костной ткани необходима для поступле­
ния нутриентов и кислорода, требующихся в большом количестве при
росте и развитии костной ткани. Известно, что костная ткань является
уникальной в своей способности к восстановлению путем образова­
ния идентичной ткани на месте утраченной. Во всех остальных орга­
нах восстановление поврежденного участка происходит посредством
замещения дефекта соединительной тканью.
Матриксы, характеристика
Матриксом называется изготовленная из прочного пористого мате­
риала, имеющая трехмерную пространственную структуру подложка,
по форме строго соответствующая естественной кости.Подложка
должна соответствовать основным характеристикам замещаемой
кости не только по механическим, физическим, структурным параме­
трам, но и изготавливаться из биосовместимого, биодеградируемого
материала.
Матрикс должен характеризоваться хорошей биосовместимостью
с тканями организма, минимальными проявлениями воспалитель­
ной и иммунной реакции при имплантации реципиенту; должен посте­
пенно резорбироваться и замещаться естественной тканью; быть пори­
стым, что позволяет пролиферирующим клеткам максимально засе­
лять поверхность подложки по всей трехмерной структуре и способ­
ствует прорастанию матрикса вновь образуемой капиллярной сетью.
Используемые в качестве матрикса остеопластические матери­
алы или скаффолды (scaffold —способность выполнять и поддержи­
вать объем дефекта) должны в условиях in vivo обладать не только
кондуктивными свойствами, но и быть остеоиндуктивным материалом.
К кондуктивным свойствам относятся вышеприведенные физические
характеристики матрикса, к индуктивным - способность к активации
процессов остеогенеза, наращивания костной ткани.
Для изготовления подложки применяется различный материал,
234
|
максимально соответствующий вышеприведенным требованиям; начи­
ная от аутологичной и аллогенной кости донора и до ксеногенных, син­
тетических материалов. Это могут быть губчатые и кортикальные кости,
не содержащие жизнеспособные клетки, а также костные сульфатированные гликозаминогликаны. В качестве матрикса может быть приме­
нена человеческая деминерализованная кость.
Широко используется в тканевой инженерии, в том числе при инже­
нерии костной ткани цельный коллаген. Существуют ряд методов полу­
чения коллагена из шкуры телят и других животных. Коллаген - это
фибриллярный белок, по аминокислотному составу почти одинаков у
многих организмов, поэтому слабо иммуногенен и используется в тка­
невой инженерии. При внесении коллагена в питательную среду обра­
зуется гель, создающий оптимальные условия для пролиферации куль­
тивируемых клеток.
Среди синтетических материалов хорошо себя зарекомендо­
вали материалы, созданные на основе коллагена и гидроксиапатита.
Гидроксиапатит -Са5(Р04)30Н, как и карбонатапатит, хлорапатит, фторапатит, трикальций фосфат являются естественными метаболитами
костной и дентальной тканей. Материалы, сочетающие гидроксиапатит
с коллагеном высоко биосовместимы и широко используются, особенно
в стоматологической практике («Биоматрикс», «Остеоматрикс» и др.).
Клеточный материал
Для заселения матрикса in vitro используются плюрипотентные
стромальные и мезенхимальные клетки, комитированные остеобла­
стоподобные клетки. Клетки могут быть выделены у самого пациента
(аутологичные) либо быть донорскими (аллогенные). Клетки чаще кост­
номозгового происхождения, из пуповинной крови или жировой ткани.
Предпочтительны аутологичные клетки, не несущие чужеродные анти­
гены гистосовместимости.
Индукторы остеогенеза
Для направленной дифференциации и пролиферации стволовых
клеток в остеобласты, остеокласты и остеоциты и формирования на
поверхности матрикса костной ткани применяются индукторы остео­
генеза. К наиболее известным факторам роста, используемым в тка­
невой инженерии кости относятся:
- трансформирующий фактор роста - TGF-p,
- инсулиноподобный фактор роста - IGF,
- фактор роста эндотелия сосудов - VEGF,
- фактор роста фибробластов b (FGF Ь).
Факторы роста или иначе костные морфогенетические белки воз­
действуют на пролиферацию и дифференцировку четырех типов кле235
ток - остеобластов, остеокластов, хондробластов и хондроцитов, а
также стимулируют ангиогенез.
Для индукции костеобразования могут быть использованы иные
цитокины, гормоны и биологически активные белки, такие как реком­
бинантный человеческий остеогенный протеин ОР-1 и др.
Технология создания костного конструкта
Создание in vitro костного конструкта или графта включает
несколько этапов:
1) Выделение, идентификация и культивирование аутологичного
либо аллогенного клеточного материала (стромальных, мезенхималь­
ных, остеобластоподобных клеток). Клетки наращиваются in vitro, из
расчета 10е клеток на 1 см3 поверхности матрикса.
2) Изготовление матрикса на основе биосовместимых материа­
лов. Биоинертные материалы предпочтительны при формировании
тканевого конструкта для пациентов с хорошей регенеративной актив­
ностью собственной костной ткани. На фоне остеопороза, дегенера­
тивных изменений собственной костной ткани лучше использовать в
качестве подложки биоактивные материалы с остеокондуктивными и
(или) остеоиндуктивными свойствами.
3) В специальный биореактор, содержащий питательную среду
для культивирования тканевых клеток помещается матрикс из биосовместимого материала, имеющий форму создаваемого костного кон­
структа. Вносятся клеточный материал и индукторы остеогенеза. Для
каждого пациента факторы роста подбираются индивидуально, с уче­
том возраста и пола, корректируемой патологии. Питательная среда,
омывающая поверхность и микропоры матрикса содержит микро- и
макроэлементы, углеводы, аминокислоты, липиды и другие органо­
гены, необходимые для жизнедеятельности тканевых клеток. Нередко
дополнительно вносятся с целью стимуляции остеогенеза L-аскорбат,
натрия глицерофосфат, дексаметазон и другие соединения. В био­
реакторе стабильно поддерживаются р02, рС02 pH, окислительно­
восстановительный потенциал, температура, необходимые концентра­
ции всех ингредиентов.
Культивирование при соответствующих физико-химических усло­
виях продолжается с периодической сменой питательной среды (также
используется проточная система, когда питательная среда постоянно,
с определенной скоростью обновляется) на протяжении 2-5 недель, до
формирования костного графта, т.е. покрытия матрикса и его микропор
вновь образованной жизнеспособной костной тканью.
Для оценки дифференциации стволовых клеток в остеобласты
применяются морфологические критерии, оцениваемые микроскопией
клеток либо используются маркеры - гены остеопонтина и остеокаль236
цина. Экспрессия данных генов осуществляется методом ОТ-ПЦР при
помощи специфических праймеров.
Типичный пример графта для лечения дегенеративных и травма­
тических заболеваний костной ткани - матрикс из биосовместимого
коллаген-минерального комплекса, заселенный аутологичными или
донорскими мультипотентными мезенхимальными стромальными
клеткам из костного мозга или жировой ткани взрослых доноров в
фибриново-коллагеновом геле; концентрация клеток 5-7 млн. в 1 мл.
Состав среды обогащен тромбоцитами плазмы крови пациента для
стимуляции размножения и дифференциации клеток.
4)
костный конструкт или графт имплантируется непосредственн
в область дефекта либо предварительно помещается в подкожной
клетчатке пациента с целью усиления кровоснабжения, дополнитель­
ного прорастания пор матрикса сосудистой сетью (префабрикация) и
затем помещается в область тканевого повреждения, (рис. 63).
ОСТЕОГЕННЫЕ
КЛЕТКИ
ЦИСХ «осткоде «том* J
М М О К п у п ьп ы зу М - !
ММСДГяцромОтмя*, ;
\
НОСИТЕЛЬ
(SCAFFOLD)
I
ТКАНЕИНЖЕНЕРНЫЙ
ЭКВИВАЛЕНТ
КОСТНОЙ ТКАНИ КОСТНЫЙ ГРАФТ
1 Виосшпаллм, ' М.
д к и , папии»ры /.
:ОрМНиЧвСП/Х ЮКПОШ,
«мало* и го стж яо
•, шнврлплиОр. '
Р ис . 63. Схема создания костного графта
(с сайта)
Гидроксилапатит, карбонатаптит, хлорапатит, фторапатит и трикальций фосфат являются естествениным метаболитами костной и
дентальной тканей и потому относятся к классу биомиметиков и высоко
биосовместимы. Металлические имплантаты, биопротезы сосудов кла­
панов сердца необходимо максимально приблизить к заменяемым или
восстанавливаемым структурам, учитывая индивидуальные особенно­
сти организма, его строения и структуры.
Результаты тканевой инженерии кости
Обширные дефекты кости, требующие ткане-инженерной техноло­
гии восстановления образуются после травм, удаления опухоли кост­
ной ткани, при удлинении конечности и др. Тем не менее клинические
случаи успешной имплантации костно-инженерного конструкта пока
единичны и используемые технологии пока не стандартны.
Так, при восстановлении костного дефекта нижней челюсти, дли­
ной 7 см успешно осуществлена следующая технология костной инже­
нерии с восстановлением жевательной функции у пациента, потеряв237
шего эту способность 9 лет назад после обширной травмы. С помощью
трехмерной компьютерной томографии произведено компьютерное
моделирование будущей матрицы. Затем была изготовлена матрица
из минерализованной бычьей кости и пропитана бычьим коллагеном,
костномозговыми клетками самого пациента и ростовыми факторами.
Затем этот конструкт под общей анестезией был имплантирован под
широчайшую мышцу спины на 2 месяца с подшивкой к конструкту
сосудисто-мышечного лоскута для его активной васкуляризации. По
истечении этого срока наблюдалось заметное улучшение кровоснабже­
ния конструкта, позволившее реимплантировать его в область дефекта
нижней челюсти. Сосудистая ножка реимплантированного конструкта
была соединена с крупной артерией на шее, а сам конструкт механи­
чески фиксирован титановыми винтами к костям черепа. Через месяц
после операции пациент мог жевать и употреблять пищу. В данном слу­
чае технология тканевой инженерии кости с префабрикацией сочета­
лась с общепринятой технологией механической фиксации импланта.
Другой пример, когда после открытого перелома голени у боль­
ной развился остеомиелит с образованием обширного дефекта кости.
Также был подготовлен матрикс из минерализованной кости крупного
рогатого скота (фрагмент длиной 7,5 см), внесены аутологичные кост­
номозговые стволовые клетки и конструкт помещен в биореактор с
питательной средой и ростовыми факторами. Через 3 недели матрикс
имплантирован в область дефекта на голени. Спустя полгода паци­
ентка смогла ходить.
Известно применение тканевой инженерии костного дефекта при
наследственной патологии. Больному с синдромом Тричера Коллинза
(это генетическое заболевание, одним из проявлений которого явля­
ется отсутствие скуловых костей) при помощи тканевой инженерии
были созданы и имплантированы скуловые кости. В качестве матрикса
была использована трупная кость, применены аутологичные мезенхи­
мальные клетки из жировой ткани, факторы роста - морфогенетиче­
ский протеин-2 и гормон роста. Этот конструкт был буквально обернут
надкостницей, выделенной из бедренной кости пациента и фиксиро­
ван на месте скуловых костей к костям черепа. Через несколько меся­
цев отмечено приживление костного конструкта.
В травматологии в качестве матрицы чаще используются аутоло­
гичные или аллогенные человеческие кости, а также минерализован­
ная кость животного происхождения. Вместе с тем, пока нередки кли­
нические случаи неуспешных результатов графтинга.
238
Проблемы графтинга
В тканевой инженерии, как и в целом в трансплантологии суще­
ствуют проблемы двоякого рода. С одной стороны, это достижение пол­
ноценного приживления и функционирования графта, с другой, реак­
ция организма пациента на имплантируемый материал.
В первом случае особое место занимает проблема обеспечения
адекватного кровоснабжения имплантированного материала. Матриксы
больших размеров в условиях in vivo испытывают дефицит кровоснаб­
жения: клетки, находящиеся на периферии графта, получают боль­
шее количество кислорода и питательных веществ, чем в централь­
ной части, где клетки испытывают гипоксию и дефицит нутриентов.
Показано, что клетки, отдалённые от микроциркуляторного русла более
чем на 200-500 мкм погибают. Для стимуляции ангиогенеза исполь­
зуются разные методы. В частности, вводятся сосудистый эндотели­
альный фактор роста (VEGF) и фактор роста фибробластов b (FGF
Ь) - как модуляторы роста сосудов. Также применяется метод префабрикации — временное помещение созданной в лаборатории ткане­
вой конструкции в хорошо кровоснабжаемые ткани пациента (подкож­
ную или межмышечную ткани) для формирования в графте собствен­
ной капиллярной сети. Через определенное время, когда сосуды про­
растут весь объем графта, его переносят в область костного дефекта.
На завершающем этапе, этапе имплантации, сосуды, нарощенные на
костном конструкте в ряде случаев соединяют с сосудами тканей паци­
ента в области дефекта. Но подобные положительные эксперименты
не всегда успешны в клинических условиях.
Во втором случае на тканевой конструкт как на чужеродное соеди­
нение в организме пациента вначале развивается воспалительная и
иммунологическая реакции, с последующим доминированием регене­
раторных процессов. При благоприятном течении эти процессы завер­
шаются органическим соединением ткани имплантата с окружающими
тканями. В противном случае наблюдается отторжение имплантата,
хронизация воспалительного процесса, замещение тканевого дефекта
соединительной тканью. Возможно развитие, наряду с реакцией оттор­
жения импланта общей гиперэргической реакции организма и др.
239
Тканевая инженерия кожи
А кт уальност ь.
От ожогов страдают от 4 до 10% человек. Каждый пятый пациент
ожоговых отделений имеет критические и сверхкритические ожоги, тре­
бующие трансплантации кожи. Для восстановления кожного покрова
может потребоваться несколько пересадок кожи со здоровых участков
на пораженную поверхность. Подобные пересадки болезненны для
пациента, продолжительны во времени, с риском развития нагноительных процессов. Поэтому создание in vitro биосовместимого искусствен­
ного аналога кожи и его имплантация на раневую или ожоговую поверх­
ности более предпочтительна.
Кроме больных с дефектом кожной поверхности после травм, ожо­
гов, хронических воспалительных процессов и других повреждающих
воздействий, в настоящее время восстановление морфофункциональ­
ных характеристик кожи актуально в косметологии.
Матрикс
Кожа человека состоит из верхнего защитного слоя — эпидермиса
и слоя соединительной ткани— дермы. Основным внеклеточным мате­
риалом, формообразующим структурным белком дермы является кол­
лаген. К дерме подходят нервные окончания и кровеносные сосуды,в
ней расположены волосяные фолликулы.
Изначально в тканевой инженерии для изготовления матрикса
использовался аутологичный либо аллогенный коллаген. Коллагеновый
гель образует трехмерную структуру, на поверхности которой наращи­
ваются кератиноциты, в глубине - фибробласты, как в естественной
коже.
В последующих технологиях к коллагеновому гелю стали добав­
лять эластин, фибронектин, ламинин, гиалуроновую кислоту, т.е. ком­
поненты внеклеточного материала кожи.
В качестве формообразующей структуры применяются и иные
биоматериалы - фибрин плазмы, полисахаридный полимер - хитозан, агароза и др. К примеру, агарозо-фибринный комплексный биома­
териал, включающий аллогенный фибрин плазмы, транексамовую кис­
лоту (предохраняет фибрин от ферментативного расщепления), хло­
рид кальция (предупреждает коагуляцию фибрина) и 0,1% агарозы (биоинертный материал, в определенной степени укрепляющий матрикс).
Клеточный материал
Кожа человека состоит из верхнего защитного слоя — эпидермиса
и слоя соединительной ткани — дермы. Верхний слой эпидермоцитов
представляет собой ороговевшие, безъядерные клетки, которые легко
240
отделяются от кожи. Возобновляется же популяция эпидермальных
клеток за счет нижележащих бластных, стволовых клеток, постоянно
поддерживающих воспроизводство клеточной популяции.
Фибробласты - основные клетки соединительнотканного слоя кожи,
называемого дермой. Они представляют собой гетерогенную популя­
цию клеток мезенхимного ряда, секретируют факторы роста, стимули­
рующие процессы пролиферации и дифференциации клеток кожи, уча­
ствуют в метаболизме межклеточного вещества. Фибробласты проду­
цируют соединительно-тканнные белки: нидоген, ламинин, тинасцин,
хондроитин-4-сульфат, протеогликан. Этими внеклеточными белками
постоянно обновляется межклеточное вещество. Наряду с этим мета­
болиты фибробластов стимулируют жизнедеятельность клеток эпи­
дермального слоя, сосудистых эндотелиоцитов и клеток волосяных
фолликулов.
Для заселения матрикса используются эпидермальные клетки и
фибробласты. (рис. 64).
Факторы роста
)
В тканевой инженерии кожи применяются факторы роста эпидер­
мального и фибробластного происхождения. Это белки, в естествен­
ных условиях регулирующие пролиферацию и дифференциацию кле­
ток кожи, стимулирующие ангиогенез.
Более широко представлены факторы роста фибробластного про­
исхождения:
- факторы роста bFGF и TGF-бета, стимулирующие синтез
фибронектина,коллагена, эластина и активизирующие хемотаксис
фибробластов;
- фактор роста TGF-альфа влияет на ангиогенез;
- эпидермальный фактор роста - EGF усиливает пролиферацию и
миграцию кератиноцитов;
- фактор роста кератиноцитов- KGF усиливает заживление и эпителизацию ран.
Продуцируемые фибробластами факторы роста могут ускорять
восстановление пораженной дермы, что во многом объясняет стимули­
рующее воздействие аллогенных клеток на заживление кожных дефек­
тов. В качестве клеточного материала чаще используются аутологич­
ные фибробласты, выделенные со здоровой кожи пациента в области
предплечья, бедра и других участков тела. При выделении фибробла­
стов измельченная ткань обрабатывается коллагеназой, трипсином,
ЭДТА и другими протеолитическими ферментами. Культивируются
фибробласты в питательной среде для клеточных культур с добавле­
нием сыворотки животного происхождения. Для наращивания необхо­
димой клеточной массы выполняется несколько пассажей культуры
241
фибробластов. Фибробласты проверяются на контаминацию возбу­
дителями вирусных и бактериальных инфекций. Наработанная до 10е
кл/мл клеточная масса фибробластов должна быть использована в
течение одних суток. Суспензия фибробластов наносится на раневую
поверхность непосредственно, либо в составе матрикса.
Наряду с фибробластами в клеточной терапии для восстановле­
ния кожного дефекта активно разрабатываются технологии, основан­
ные на использовании мезенхимальных стволовых клеток костного
мозга.
Технология получения кожного конструкта
Этапы создания кожного конструкта:
- стерильный аллогенный или аутологичный кожный трансплантат
измельчается, подвергается частичному ферментативному расщепле­
нию с получением клеточной суспензии, из которой выделяются кератиноциты и фибробласты;
- клетки культивируются в питательной среде, содержащей все
необходимые факторы роста;
- нарощенные клетки кожи помещаются в коллагеновый матрикс,
в трехмерную гелевую основу из коллагена, На поверхности матрикса
пролиферируют кератиноциты, а в глубине-фибробласты);
• готовый к применению тканевой конструкт упаковывается в сте­
рильный пакет.
Изначально была разработана технология, заключающаяся в при­
готовлении раствора основного белка внеклеточного матрикса - колла­
гена, с последующим внесением в этот раствор суспензии фибробла­
стов. Раствор превращается в гель с формированием волокон, вдоль
которых размещаются фибробласты. Гель уплотняется до достаточно
прочной трехмерной, объемной структуры. Фибробласты сохраняют
жизнеспособность в таком матриксе на протяжении 3-4 недель.
В последующем технология была усовершенствована и позво­
лила получить двуслойную искусственную кожу, состоящую из поверх­
ностного слоя эпидермальных клеток - кератиноцитов и глубинного
- фибробластов. При этом в качестве матрикса используется коллаге­
новый гель, на поверхности которого наращивается культура кератино­
цитов, в толще геля пролиферируют фибробласты, образующие глу­
бинный, дермальный слой кожи. Для усиления прочности в гель поме­
щают биодеградируемый пористый полимерный материал.
Известна иная технология тканевой инженерии кожи. Аутологичные
фибробласты пролиферируют на поверхности агарозо-фибринового
геля, размеры искусственных тканевых лоскутов наращивают до 2-3
см в диаметре. Затем такими лоскутами инженерной ткани оборачи­
ваются микротрубочки из биодеградируемого материала, а их внутрен­
242
няя поверхность заселяется аутологичными сосудистыми эндотелиоцитами.
Существуют технологии культивирования эпидермальных клеток и
фибробластов не на плоских поверхностях, а на микроносителях - коллагеновых микросферах диаметром 200-330 мкм.
Рис.64. Фибробласты, культивированные на микроносителях
(сканирующая микроскопия, с сайта)
243
VIII. БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ СХЕМЫ
logos
Основы биотехнологии (Ь/о - биологические объекты - это клетки
растений и животных, микроорганизмы; texno - инженерные конструк­
ции и оборудование, технологический процесс для получения, выде­
ления и очистки биопродукции; logos - научные знания в области био­
химии, генетики, микробиологии, физиологии растений, животных и
человека, биоинформатики).
БИОТЕХНОЛОГИЯ
I------------------- 1----------- — Н -------------- - ч " "—
медицинская
пищевая
экологическая
промышленная
"I
сельскохозяйственная
Направления биотехнологии. По 5 основным направлениям
развиваются: 1.Классическая биотехнология, основанная на микро­
биологическом производстве, микроклональном размножении куль­
турных растений и селекции пород сельско-хозяйственных животных
ориентирована на агропромышленный комплекс;
2.
Современная биотехнология, основанная на генно-инженерн
технологиях более ориентирована на медицину и фармацевтику).
Схема 1. Биотехнология - основы, направления
244
Большинство генов прокариот, кодирующих белки, не имеют интронов.Характерно наличие в цитоплазме автономно реплицирующихся
и обладающих коньюгативной способностью плазмид, используемых
в качестве векторов. Прокариоты лишены митохондрий и хлоропластов, нет сплайсинга и процессинга; время удвоения бактериальной
клетки - 25-30 минут, а процесс культивирования - 1 - 3 суток, плотность
клеток при культивировании равна 107- 10е.
Эндоплазматичвс.кий ретикулум
(шсрохоиашй)
Ядрышко
Рибосомы
Ядернан пора
. Хромосомы
Крахмальные зорка
Клеточная мембрана
Свободные
рибосомы'
Клеточная стенка
Митохондрии
Эндоплаэматический ретикулум
(гладкий)
XнороиНОСI
Р астител ь ная кл етка
(http://www.csu.ru/main.asp.method=GetPage&p=1176).
245
В растительных клетках часто имеется одна большая центральная
вакуоль, накапливающая воду и позволяющая клетке быстро увеличи­
ваться в размерах. Эта функция необходима для быстрого роста расти­
тельной ткани. Но, увеличение клеток усиливает опасность их механиче­
ского повреждения при культивировании в биореакторе.
Растительные клетки содержат хлоропласты, имеющие опре­
деленное количество собственного генетического материала (ДНК)
и белок-синтезирующую систему (рибосомы и транспортные РНК).
Многокопийность хлоропластного ДНК используется для экспрессии
кДНК, кодирующего синтез рекомбинантного белка. Типичны процессы
синтеза и созревания РНК и белков (посттрансляционная модификация,
обеспечивающая их стабильнсть и функциональную активность). Время
удвоения растительных клеток 1-Зсут, а процесс культивирования зани­
мает несколько недель., что повышает требования к обеспечению асеп­
тических условий.
Животная клетка (http://www.csu.ru/main.asp.method=GetPage&p=1176)
После полиаденилирования мРНК эукариотных клеток подверга­
ется сплайсингу (от англ. splice — сращивать концы) — процессу выре­
зания не кодирующих белок участков - интронов из молекул РНК; мно­
гие белки в эукариотных клетках первоначально синтезируются в виде
более высокомолекулярных предшественников, которые в результате
специфического протеолитического расщепления - процессинга перехо­
дят в зрелую форму; время митотического деления животной клетки —в
среднем 1 сут, процесс культивирования длителен, несколько недель,
при глубинном культивировании плотность клеток равна 105-10®. Если
для развития суспензии растительных клеток необходимы фитогор­
моны, то для культивирования животных клеток требуются более слож­
ные по составу среды, зачастую содержащие нативную сыворотку.
Схема 2. Характеристика биообъектов
246
1. Суспензия микроорганизмов
Посев на питательную среду
Выделение из объектов окружающей среды (почва, вода, ткани
растений, организм человека и животных и др.) непатогенных микро­
организмов, продуцирующих полезные метаболиты (антибиотики, фер­
менты, аминокислоты, витамины и др.) либо характеризующиеся анта­
гонистической, кислотообразующей и иной биологической активно­
стью. В случае разработки вакцинных штаммов изначально выделя­
ются те или иные патогены человека с последующей их инактивацией
либо аттенуацией.
Фмм
KJletpot
<лгпч\1|> Ф цнтИсот
2. Выделение чистой культуры микроорганизмов
Отбор среди выделенных микроорганизмов штаммов, обладающих наи­
большей продуцирующей способностью либо биологической активностью. С
этой целью применяются различные нижеприведенные аналитические методы
оценки биологических свойств.
хроматографическое определение
концентрации метаболита
(антибиотик, аминокислота и др.),
продуцируемого микроорганизмом
| изучение биологической
активности (антагонизм,
кислотообразоеание и др.)
| при получении вакцинного штамма
оценка наличия патогенности
| (токсигенность, мутагенность,
ферменты патогенности и др.)
247
3. Мутационные изменения в структуре ДНК
Индуцированный мутагенез путем поэтапного воздействия на
культуру физическими (ультрафиолетовые лучи, радиация и др.) и
химическими (этиленимин, колхицин, нитрозогуанидин и др.) мута­
генами. Цель - многократно повысить продуцирующую способность
микроорганизма путем ненаправленных мутаций. В отличие от инду­
цированного при направленном мутагенезе изменения в ДНК вносятся
в заранее известный сайт (мутагенез по Кункелю, когда остатки тимина
заменены на урацил при помощи химически синтезированного прай­
мера либо мутагенез с помощью ПЦР с использованием двух прай­
меров, несущих мутацию).
4. Колония созданного штамма - биопродуцента
Фенотипическая (морфо-культуральные, биохимиические, анти­
генные и др.) и генотипическая (ПЦР, секвенирование и др.) иденти­
фикация штамма-продуцента. Оптимизация питательных сред и усло­
вий культивирования с целью повышения продуцирующей активности
штамма.Это подбор количественного и качественного состава компо­
нентов питательных сред, изучение и выявление наиболее оптималь­
ных физико-химических параметров культивирования - t°C, pH, р02
и др.
Схема 3. Селекции и мутагенез микроорганизмов биопродуцентов
248
И н ку б а т о р -ш е й ке р
1 этап - подготовительный: подготовка посевной культуры
штамма-продуцента.
Автоклавируемый биореактор
2 этап —ферментационный: загрузка в биореактор питательной среды,
посевной культуры, процесс биосинтеза целевого продукта (антибиотик,
фермент и др.).
249
_ L ... я-й за в
Центрифуга-сепаратор
3 этап - выделение и очистка целевого продукта путем сепарации/центрифу­
гирования, далее микро/ультрафильтрация, хроматографическая очистка.
Лабораторная лиофильная сушка
4 этап - лиофилизация, распылительное высушивание субстанции;
хранение.
Схема 4. Технология получения субстанции биопрепарата
микробиологическим синтезом
250
Бактериальная клетка
Плазмиды - это двуцепочечные кольцевидные ДНК, расположен­
ные в цитоплазме, способны к автономной репликации и конъюгацией
передаваться близкородственным клеткам. Плазмиды используются
в качестве вектора (небольшая молекула, имеет участки расщепления
рестриктазами и маркеры для селекции).
EcoRl
Плазмида pBR322
Плазмида содержит два гена, программирующие устойчивость
к двум различным антибиотикам - тетрациклину (ген tet) и ампицил­
лину (ген Ыа). В гене let находятся уникальные участки расщепления
рестриктазами Hindlll, BamHI и Sail, а в гене Ыа - участок расщепле­
ния Pstl.
251
Принцип введения чужеродной ДНК в бактериальную плаз­
миду с использованием эндонуклеазы (works.tarefer.ru/10/100212/
index.html)
Плазмида расщепляется в определенном сайте рестрикци­
онными эндонуклеазами с образованием липких концевых фраг­
ментов типа EcoRl, HlndlH, BamHI, Sail, Pstl и др. Из соответствую­
щей эукариотной клетки теми же рестриктазами выделяется фраг­
мент чужеродного ДНК, кодирующий синтез рекомбинантного белка
(инсулин, интерферон и др.) и встраивается в расщепленный участок
плазмиды,сшивается лигазами. В плазмиду также встраиваются мар­
керы (чаще это гены резистентности к антибиотикам), при необходи­
мости сильный промотор для активной экспрессии кДНК. Затем полу­
ченный вектор трансформируется в бактериальную клетку.
Схема 5. Плазмиды в качестве вектора
252
Клетки,
вырабатывающие
(ребусмый белок
Искусственна я
IH K -затравка
для синтеза
комплементарной
ДНК (к-Д Н К)
и-РНК
Гибрид
ДНК-РНК
Одноцелочечная
к-Д Н К
Синтез второй
цели к-Д Н К
S P ^ O O O ^
Р е ко м 6и *:
и а нтна я 1
пл азм ид а
Двухцелочечная
к-Д Н К - ген
требуемого бели а
Выделение
требуемого белка
С хем а 6. Технология пол учени я генно -м од и ф и циров анно го
м икр оо ргани зм а, пр о д уц ента реком б и нан тн ого белка (человече­
ский инсулин, интерлейкины , интерф ероны и пр.), с сайта (works.tarefer.
ru/10/100212/index.htm l)
i
253
polymerase
Структура вируса гепатита В
1-й этап. Из вирусной частицы выделяется HBs Ад; этот анти
ген обладает иммуногенностью, не инфекционен, серологический мар
кер гепатита В
Replication
Плазмида, несущая сильный промотор для активной экспрессии
HBs антигена и маркеры устойчивости к антибиотикам
2-ой этап. HBs антиген встраивается в плазмидный вектор
254
Saccharomyces cerevisiae
3-й этап. Рекомбинантная плазмида, несущая кДНК HBs анти­
гена трансформируется в эукариотные одноклеточные, дрожжевые
грибы - Saccharomyces cerevisiae
4-й этап. В биореакторе нарабатывается биомасса генномодифицированных дрожжей Saccharomyces cerevisiae, продуцирую­
щих HBs антиген. Антиген выделяется и очищается для изготовления
вакцины против гепатита В.
Схема 7. Технология получения HBs антигена на основе
генно-модиф ицированного штамма Saccharom yces cerevisiae
( f jb r e ( ^ )
Q
BironoH AdS
Аденовирусны й вектор Ad5
1.
Аденовирусный вектор Ad5 - это способный к репликации вир
он не патогенен, не интегрируется в геномную ДНК клетки-мишени, экс­
прессируется внехромосомно. Его трансфицирующая способность уси­
лена путем мутации капсидного белка fibre (IV). В вектор встроен ген
RTVP-1, имеющийся в нормальных клетках предстательной железы и
отсутствующий в опухолевых. Этот ген подавляет пролиферацию опу­
холевых клеток путем угнетения ангиогенеза, активации процесса
апоптоза раковой клетки.
■-п.-■‘У
ДьУ
Д ЦЛ
*5г
'шЩШт
Раковая клетка предстательной железы
(ув. х 3600, science.compulenta.ru/456562/)
2.
В ткань предстательной железы, в раковые клетки иньеци
ется аденовирусный вектор Ad5, несущий ген RTVP Вирус заражает
опухолевые клетки, размножается с активной экспрессией данного
антионкогена.
Схема 8. Генотерапия злокачественной опухоли
предстательной железы
256
Переливание цельной крови, плазмы, эритроцитарной массы
http://www.ng.ru/tag/donoryi/
Переливание крови, плазмы и эритроцитарной массы широко при­
меняется в лечебной практике. Кровь и ее компоненты хранятся при
низких температурах
тромбоциты красная кровяная
клетка
лимфоциты
бозофил
(разновидность
белого кровяного тельца)
- ■эозинофил
((разновидность красного
кровяного тельца)
стволовая
клетка
1
-------------------нейрофил
«разновидность красного
кровяного тельца)
| Я
кроветворный
костный мозг
питающая
артерия
Костны й мозг
(dic.academic.ru/dic.nsf/ntes)
257
Пункция костного мозга
п г и115 ™ рансплантация костного мозга. Забор красного костного мозга
осуществляется путем множественных аспираций из задних бугров и
гребней подвздошной кости, проводимых под эндотрахеальным нарко­
зом. При этом количество костномозговой суспензии составляет 15002000 мл. Затем проводится ее фракционирование, заключающееся в
удалении плазмы и эритроцитов (аутоэритромасса на следующий день
реинфузируется донору), с целью получения концентрата костного мозга.
Д л я криоконсервации применяются программные замораживатели, в
к о т о р ы х автоматически регулируется процесс замораживания костного
мозга. После кондиционирования (эрадикации опухолевого клона, хими­
отерапии и др.) проводится реинфузия костного мозга.
Схема 9а. Терапия клетками крови
8fo
ч а д **-**»
ЭРИТРОЦИТ ТРОМБОЦИТ ЛЕЙКОЦИТ
Альбумин,вторичная
структура (strf.ru)
Клетки крови
(http://www.so.gen .tr/biyoloji)
Препараты крови - белки (альбумин и иммуноглобулины) и
клетки (тромбоциты, лейкоциты, эритроциты). Технология их получения основана на выделении, очистке (цитаферез, хроматография) и
криоконсервации.
www.ttim -dlluu
линий ОТВОЛОвЫ* КГИ10Я
I ПИЛИПММИп
«МПм
подмпудочнои
Биоинженерная ткань
слизистой трахеи
Дифференциация
стволовых клеток in vitro
(http://www.mega-mir.com/news/section)
Терапия стволовыми клетками. Взрослые стволовые клетки (ГСК и
МСК) успешно применяются в онкогематологии, неврологии, ортопедии,
кардиологии, диабетологии. Применяются в регенеративной терапии,
в основном при наращивании кожи, костной и хрящевой ткани in vitro.
Биотехнологическая составляющая на этапе применения цельной
крови, эритроцитарной массы либо плазмы минимальна - это забор, раз­
деление и хранение крови. Такова примерно ситуация при фракциониро­
вании, криоконсервации и трансплантации костного мозга. Разработка и
применение технопогии цитафереза, хроматографической очистки суще­
ственно повысили технологическую компоненту по разделению, очистке,
хранению и применению компонентов и препаратов крови(второй этап).
На третьем этапе, этапе применения стволовых клеток наряду с совер­
шенствованием технологии культивирования клеток in vitro, использова­
нием более сложных по составу питатепьных сред огромна роль молеку­
лярной биологии, позволившей получить более глубокие знания о ство­
ловой клетке, о роли регуляторных пептидов в процессах пропиферации и дифференциации этих клеток.
Схема 96. Терапия клетками крови
259
А.
1)
2)
Стволовые клетки из костного мозга (1) и пуповинной крови (2).
Электронные микрофотографии (www.kardio.ru/cor/pr/jur_21.htm)
Стволовые клетки характеризуются способностью к пролифера­
ции и дифференциации в тканеспецифические клетки. В эксперимен­
тальных исследованиях и клинических испытаниях используются аллогенные и аутологичные стволовые клетки - гемопоэтические (ГСК) и
мезенхимальные (МСК), выделенные из костного мозга, пуповинной
крови и другой ткани.
Яйцеклетка
* Ядро
а
Плюрипотентные
___Слияние
О
Соматическая
клетка
стволовые 1ЛеТ«И
Стадии
8 клеток
Бластоцист
Культура стволовых
клеток
I
Д иф ф е ре нци а ци и
стволовых клеток
В.
Получение стволовых клеток из бластоцисты
(Таранов Г.И., 2004; www.kardio.ru/cor/pr/jur_21.htm)
Для получения стволовых клеток проводится забор костного мозга,
пуповинной крови, эмбриональной (как показано на рис.Б) и иной ткани
с последующим цитаферезом. Выделенные стволовые клетки культи­
вируются на специальных средах с добавлением и без содержания
сыворотки животного происхождения (в последнем случае существует
риск инфицирования пациента риск агентами прионной природы или
зоонозными инфекциями). Для наработки биомассы стволовых кле­
ток применяются различные биореакторы - от одноразовых, стерили­
зуемых до роботизированных.
ш Ш Blocked cardiac muscle results i
V . heart attack.
mu
m
Clot
Damaged Heart
Muscle
С.
Зона инфаркта и закупоренный коронарный сосуд (с сайта)
Во время операции коронарного шунтирования, одновременно в
коронарные сосуды либо в ткань миокарда вводится суспензия ауто­
логичных стволовых клеток. Их дифференциация в мышечные и ангиогенные клетки улучшает регенеративные процессы и ангиогенез в
зоне инфаркта
Схема 10 (А,В,С). Клеточная терапия при патологии сердца
Наиболее часто используются стволовые клетки, выделенные
из пуповинной крови, костного мозга. В эксперименте нередко при­
меняется технология наращивания и получения их из бластоцисты.
Стволовые клетки после тщательного биотестирования хранятся в
криобанке и затем во время операции вводятся в зону пораженного
миокарда.
261
а)
б)
Половые клетки - сперматозоиды (а) и яйцеклетка (б),
www.nt-creaz.org.ua/data/Zbirka-1.htm
Полученные чрезвлагалищной пункцией яичников яйцеклетки
отмывают от фолликулярной жидкости и переносят в стерильные чашки
Петри либо планшеты с культуральной средой. Посуду с яйцеклетками
помещают в С 0 2-инкубатор при 37°С и 5-6% содержании углекислого
газа, где они содержатся до оплодотворения. Полученную сперму под­
вергают криоконсервации в жидком азоте.
удерживающая
присоска
сперматозоид в
микроигле
Введение сперматозоида в яйцеклетку микрохирургическим способом
(www.nt-creaz.org.ua/data/Zbirka-1.htm)
Спустя 4-6 часов после забора яйцеклеток в культуральную среду
вносятся сперматозоиды. Оплодотворение происходит путем инсеми­
нации, т.е. сперматозоид из культуральной среды самостоятельно про­
никает в яйцеклетку либо путем интрацитоплазматической инъекции
(рис). После оплодотворения начинается развитие эмбриона in vitro в
инкубаторе.
262
Через 48-72 часа эмбрионы переносят в матку с помощью спе­
циального катетера. Эта процедура безболезненна и не нуждается в
обезболивании. Со дня переноса эмбрионов назначаются препараты,
поддерживающие их развитие. Криоконсервация эмбрионов — жизне­
способные эмбрионы замораживают и хранят при температуре жид­
кого азота. В дальнейшем эмбрионы могут быть разморожены и осу­
ществлен повторный перенос в матку для достижения беременности
Схема 11. Технология экстракорпорального оплодотворения
263
В-лимфоцит
+
Клетки миеломы
ГибРИДОМ ы
Слиянием В-лимфоцитов с миеломными клетками получают
гибридомные клетки, продуцирующие моноклональные антитела
(http://www.biovitrum.ru)
I.
Гибридомные технологии. Гибридомы получают путем слияни
присутствии полиэтиленгликоля мышиных клеток - антителопродуциру­
ющих лимфоцитов и миеломных клеток, способных к неограниченному
росту. Они продуцируют антитела одной специфичности, одного идиотипа - моноклональные антитела. Мышиные моноклональные анти­
тела широко применяются при разработке диагностических тест-систем
для постановки ИФА, РИА, РИФ.
264
Химерное антитело
(а - человеческий Fc-фрагмент, 6 - мышиный Fv-фрагмент),
www.jdaross.cwc.net
II.
Генно-инженерные технологии. Разработаны и примен
ются технологии получения химерных (Fv-фрагмент или варибельный фрагмент представлен мышиными белками) и гуманизированных
(только часть вариабельного фрагмента - гипервариабельный уча­
сток мышиного происхождения) моноклональных антител. С помощью
олигонуклеотид-направленного мутагенеза осуществляется после­
довательная замена вариабельного фрагмента или только его части
- гипервариабельного участка ДНК человека на соответствующий
участок ДНК мыши. Минимизация чужеродного белка и преобладание
аминокислотных последовательностей человека позволило исполь­
зовать их в качестве терапевтических антител, главным образом при
лечении аутоиммунных и онкологических заболеваний.
Мини- антитело представлено только V-областью, Vh и VL кон­
цевыми доменами. Мини - или доменные антитела, содержат только
вариабельные, Fv-фрагменты, представленные концами легких и
тяжелых цепей молекулы иммуноглобулина. Fc-фрагмент отсутствует.
Для получения мини-антител применяется технология фагового дис­
плея. Из большой популяции В-лимфоцитов человека выделяются
мРНК вариабельного фрагмента антител, затем на их основе амплифицируются кДНК и встраиваются по-отдельности в нитевые фаги.
Создается фаговая библиотека, содержащая множество кДНК, коди­
рующие разной специфичности вариабельные фрагменты антител.
При этом каждый фаг экспрессирует антитело только одной специ­
фичности. При репродукции рекомбинантных фаговых частиц в клетке
реципиенте одновременно нарабатывается искомое мини-антитело.
Мини-антитела слабоиммуногенны, но обладают достаточной аффин­
ностью, обеспечивающей специфичность взаимодействия с рецепорами клеток-мишеней. Они апробируются с терапевтической целью
в клинических испытаниях.
Схема 12. Технологии получения моноклональных и
химерных антител
265
СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ ............................................................................................ 2
I.
ЖИВЫЕ ОБЪЕКТЫ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ
В БИОМЕДИЦИНСКИХ ТЕХНОЛОГИЯХ.........................................4
Микроорганизмы - продуценты медицинских
.
биопрепаратов, основа вакцин и пробиотиков...............................
Растительные клетки и ткани, трансгенные организмы.............. 1
22
Животные клетки и ткани, трансгенные организмы.....................
II. ДНК-ТЕХНОЛОГИИ........................................................................ 27
27
Методы ДНК -диагностики.............................................................
49
Генотерапия....................................................................................
.53
Методы генной терапии.................................................................
Генотерапия заболеваний.............................................................. ®
ДНК -вакцины..................................................................................
Проблемы генотерапии..................................................................
III. КЛЕТОЧНЫЕ ТЕХНОЛОГИИ..........................................................
Клеточная терапия ........................................................................7
Клеточная иммунотерапия ...........................................................
Тканевая инженерия .....................................................................
■98
Экстракорпоральное оплодотворение........................................ ^
Технологии клеточных культур.....................................................
IV. ТЕХНОЛОГИИ ПОЛУЧЕНИЯ БИОПРЕПАРАТОВ..................... 108
Микробиологический синтез антибиотиков ............................... 1®
Ферментные препараты............................................................... ^
116
Фитопрепараты ............................................................................ 1
Препараты крови..........................................................................133
Иммунобиологические препараты..............................................138
Диагностикумы..............................................................................146
Аллергены ................................................................................... 146
266
Бактериофаги.................................................................................1 4 3
Пробиотики.....................................................................................
Органопрепараты, биогенные стимуляторы............................... 151
Генно-инженерные биопрепараты ..............................................152
Терапевтические антитела........................................................... 1 5 9
Перспективы создания новых лекарственных средств ........... 163
V. ВОПРОСЫ БИОЭТИКИ И БИОБЕЗОПАСНОСТИ..................... 164
Биоэтика в биомедицинских технологиях...................................164
Безопасность биомедицинских технологий................................176
GMP, GLP, GCP.............................................................................. 179
VI. БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКОЕ ОБОРУДОВАНИЕ........................... 181
Ферментационное оборудование............................................... 181
Оборудование для выделения и очистки....................................190
Сепараторы...................................................................................190
Хроматографы .............................................................................199
Установки для мембранной фильтрации ...................................203
Оборудование для сушки и хранения......................................... 205
VII. ЧАСТНЫЙ РАЗДЕЛ КЛЕТОЧНЫХ ТЕХНОЛОГИЙ.................... 214
Клеточная терапия при сердечной патологии...........................214
Клеточная терапия в онкогематологии...................................... 222
Оплодотворение in vitro................................................................228
Тканевая инженерия кости...........................................................232
Тканевая инженерия кож и...........................................................239
VIII. БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ СХЕМЫ........................................... 243
Схема 1. Биотехнология - основы, направления........................243
Схема 2. Характеристика биообъектов...................................... 245
Схема 3. Селекция и мутагенез
микроорганизмов-биопродуцентов.............................248
Схема 4. Технология получения субстанции
биопрепарата микробиологическим синтезом......... 250
267
Схема 5. Плазмиды в качестве вектора....................................252
Схема 7. Технология получения HBs антигена
на основе генно-модифицированного
штамма Saccharomyces cerevisiae.............................. 255
Схема 8. Генотерапия злокачественной опухоли
предстательной железы............................................. 256
Схема 9а. Терапия клетками крови............................................. 258
Схема 96. Терапия клетками крови............................................ 259
Схема 10 (А,В,С). Клеточная терапия
при патологии сердца................................................ 261
Схема 11. Технология экстракорпорального
оплодотворения.......................................................... 263
Схема 12. Технологии получения моноклональных
и химерных антител.................................................... 266
268