ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ «НАУЧНЫЙ ЦЕНТР ПСИХИЧЕСКОГО ЗДОРОВЬЯ» РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ МЕДИЦИНСКИХ НАУК
advertisement
ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ «НАУЧНЫЙ ЦЕНТР ПСИХИЧЕСКОГО ЗДОРОВЬЯ» РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ МЕДИЦИНСКИХ НАУК На правах рукописи ШИЛОВ ЮРИЙ ЕВГЕНЬЕВИЧ НОВЫЕ МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МЕТАБОЛИТОВ ТРИПТОФАНА В ТРОМБОЦИТАХ И ПЛАЗМЕ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА ДЛЯ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ ДЕПРЕССИВНЫХ РАССТРОЙСТВ 03.01.04 – Биохимия Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: д.м.н., профессор Т.П. Клюшник Научный консультант: к.х.н. М.В. Безруков Москва – 2014 2 ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ.................................................................................................... 4 ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ............................................................ 11 1.1. Метаболиты триптофана в патогенезе эндогенных психических заболеваний ........................................................................................................ 11 1.1.1. Серотонин и его метаболиты ................................................... 16 1.1.2. Серотониновая гипотеза эндогенных депрессивных расстройств .................................................................................................... 21 1.1.3. Тромбоцитарный серотонин при депрессивных расстройствах ................................................................................................ 25 1.1.4. Кинуренин и его метаболиты .................................................. 29 1.1.5. Воспаление и метаболизм триптофана ................................... 33 1.1.6. Активация кинуренинового пути при депрессивных расстройствах ................................................................................................ 35 1.2. Методы определения метаболитов триптофана ........................... 42 1.2.1. Методы определения серотонина............................................ 42 1.2.2. Методы определения кинуренина и 3-гидроксикинуренина 44 Заключение .............................................................................................. 50 ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ .................................................... 52 2.1. Реактивы и растворители ................................................................ 52 2.2. Оборудование ................................................................................... 52 2.3. Исследуемые пациенты и добровольцы ........................................ 54 2.4. Забор крови и получение плазмы ................................................... 55 2.5. Метод определения серотонина в тромбоцитах крови человека 55 2.6. Метод определения кинуренина в плазме крови человека ......... 57 2.7. Метод синтеза алкиловых эфиров метаболитов триптофана ...... 59 2.8. Получение растворов HCl в абсолютных спиртах ....................... 59 3 2.9. ТСХ алкиловых эфиров метаболитов триптофана ....................... 60 2.10. MALDI-TOF масс-спектрометрия алкиловых эфиров метаболитов триптофана .................................................................................. 61 2.11. MALDI-TOF масс-спетрометрическая детекция триптофана, кинуренина и 3-гидроксикинуренина в плазме крови .................................. 61 2.12. Статистическая обработка ............................................................ 62 ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ .......................................... 63 3.1. Разработка метода определения серотонина в тромбоцитах крови человека .............................................................................................................. 63 3.2 Апробация метода определения серотонина в тромбоцитах крови человека .............................................................................................................. 67 3.3. Разработка метода определения кинуренина в плазме крови ..... 71 3.4. Апробация метода определения кинуренина в плазме крови ..... 75 3.5. Характеристика алкиловых эфиров метаболитов триптофана ... 77 3.6. MALDI-TOF масс-спетрометрическая детекция триптофана, кинуренина и 3-гидроксикинуренина в плазме крови .................................. 84 ВЫВОДЫ ..................................................................................................... 87 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ........................................................................ 89 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ .......................................................................... 91 4 ВВЕДЕНИЕ Проблема аффективных расстройств и, в первую очередь, депрессий является одной из приоритетных проблем современной психиатрии и медицины в депрессивных целом. Это расстройств связано среди с высокой населения, распространенностью а также сложностями диагностики и лечения этих заболеваний, что вытекает из недостаточной изученности и гетерогенности этиологии и патогенеза депрессивных расстройств. Эпидемиологические исследования показывают, что выявляемость депрессивных расстройств значительно возросла за последние 10 – 15 лет [1,2]. По некоторым данным, депрессивными расстройствами, страдают около 6% мужчин и 18% женщин [2,3], причем, в первую очередь, лица молодого и среднего возраста. Исследования социальных последствий депрессивных расстройств показывают, что депрессии приводят к ограничению социальной активности и трудоспособности [4], в связи с чем трудно недооценить социальную значимость этих заболеваний. Кроме того, низкая эффективность лечения депрессивных расстройств может приводить к трагическим последствиям – суицидам. Все вышесказанное обуславливает особую актуальность исследования депрессивных расстройств, включая изучение патогенеза, а также разработку более эффективных методов диагностики и лечения. Этиопатогенез депрессивных расстройств сложен и до конца не изучен. Он включает в себя нарушения в метаболических и рецепторных системах мозга, в иммунной и нейроэндокринной системах; нарушение взаимодействия этих систем между собой, воздействие психоэмоционального стресса и неблагоприятных факторов окружающей среды, таких как инфекции, которые реализуются при наличии определенной генетической уязвимости. Так, в патогенез депрессивных расстройств в той или иной степени вовлечены гиперактивация глутаматной нейротрансмиссии, гипофункция норадреналиновой и серотониновой систем мозга, нарушения 5 нейротрансмиссии дофамина, γ-аминомасляной кислоты, ацетилхолина, дефицит нейротрофических факторов. Кроме того, показано, что важную роль в патогенезе депрессивных расстройств играет активация системных воспалительных процессов [5–9]. Одним возникновения из возможных факторов хронификации разнообразных когнитивных заболевания нарушений и являются атрофические и нейродегенеративные изменения в головном мозге пациентов с депрессивными расстройствами. Эти изменения заключаются, в частности, в апоптозе нейронов и глиальных клеток мозга, что приводит к необратимому нарушению нейрональных и нейро-глиальных взаимодействий. Следствием этого может являться достоверное уменьшение у пациентов с депрессией объема гиппокампа [10,11] – части лимбической системы головного мозга, участвующей в формировании эмоций и консолидации памяти. Важную роль в патогенезе эндогенных психических заболеваний играют метаболиты незаменимой аминокислоты триптофана, такие как серотонин, кинуренин, 3-гидроксикинуренин, хинолиновая и кинуреновая кислоты. Серотонин, главный метаболит метоксииндольного пути метаболизма триптофана, играет роль важного нейромедиатора и нейромодулятора в центральной нервной системе. Гипофункция серотониновой системы мозга, в том числе снижение уровня серотонина в мозге, уже более 50 лет считается центральным патогенетическим фактором депрессии. Уровень серотонина в мозге может быть достаточно точно оценен по его концентрации в спинномозговой жидкости, однако это требует высокоинвазивной и болезненной процедуры пунктирования пациента. Поэтому для оценки уровня серотонина в мозге чаще используются альтернативные методы. Так, согласно ряду исследований, тромбоциты крови являются удобной экстрацеребральной моделью для изучения состояния центральных серотонинергических нейронов [12]. В этих клетках 6 присутствуют элементы серотониновой системы, фармакологически идентичные таковым в центральных нейронах: серотониновые рецепторы, система обратного захвата серотонина, система его везикуляции, хранения, высвобождения и метаболизма. Кроме того, почти весь серотонин крови депонирован в электронно-плотных гранулах тромбоцитов. Была выявлена высоко достоверная корреляция содержания серотонина в тромбоцитах и СМЖ. При этом содержание серотонина в плазме плохо коррелировало с его содержанием в СМЖ [13]. В ряде работ была показана высокая диагностическая и прогностическая значимость измерения уровня тромбоцитарного серотонина у пациентов с депрессивными расстройствами. Так, например, одни исследования выявили низкий уровень тромбоцитарного серотонина у больных депрессией, по сравнению со здоровыми добровольцами [14–16], а другие исследования тромбоцитарного показали, серотонина в что первые мониторирование дни и недели уровня лечения антидепрессантами может помочь в прогнозировании успешности терапии и раннем выявлении резистентности к лечению [17,18]. Одним из объяснений гипофункции серотониновой системы мозга при депрессивных расстройствах может служить наблюдающаяся у пациентов активация кинуренинового пути метаболизма триптофана, приводящая к снижению в мозге уровня триптофана, предшественника серотонина. Поскольку активация кинуренинового пути, осуществляемая провоспалительными цитокинами, кортизолом (“гормоном стресса”) и липополисахаридами клеточных стенок бактерий, приводит к повышенному образованию нейротоксических метаболитов кинуренинового пути, таких как 3-гидроксикинуренин и хинолиновая кислота, эта гипотеза объясняет связь между депрессией, воспалением, психоэмоциональным стрессом и нейродегенеративными процессами. А тот факт, что хинолиновая кислота является эндогенным агонистом глутаматных NMDA рецепторов, может объяснить гиперфункцию глутаматергической системы мозга при 7 депрессивных расстройствах. Кроме того, в ряде работ была показана высокая диагностическая и прогностическая значимость измерения уровня кинуренина и 3-гидроксикинуренина в плазме крови пациентов с депрессивными расстройствами [19–22]. Описанные в литературе методы количественного определения тромбоцитарного серотонина, а также кинуренина и 3-гидроксикинуренина в плазме крови имеют ряд методических ограничений, затрудняющих их использование в широкой клинической практике. Одни методы включают сложную и плохо масштабируемую процедуру пробоподготовки. Другие не обладают достаточной чувствительностью и поэтому требуют больших объемов образца или использования химической модификации аналитов. Третьи не обеспечивают химической сохранности аналитов во время анализа и при хранении образцов, в связи с чем обладают низкой точностью и воспроизводимостью. В связи с вышеизложенным, разработка новых, пригодных для клинической практики методов количественного определения тромбоцитарного серотонина, а также кинуренина и 3-гидроксикинуренина плазмы крови является несомненно актуальной задачей. Цель работы. Разработать точные и высокочувствительные методы определения метаболитов метоксииндольного и кинуренинового путей метаболизма триптофана, пригодные для клинико-лабораторных исследований. Задачи работы: 1. Разработать метод количественного определения серотонина в тромбоцитах крови человека с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с использованием флуориметрической детекции, пригодный для рутинной клинической практики. 8 2. Апробировать метод количественного определения серотонина в тромбоцитах крови человека на группе здоровых добровольцев и группе пациентов с эндогенными депрессивными расстройствами. 3. Разработать метод количественного определения кинуренина в плазме крови с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрической детекцией, пригодный для рутинной клинической практики. 4. Апробировать метод количественного определения кинуренина в плазме крови на группе пациентов с эндогенными депрессивными расстройствами. 5. Разработать способ повышения химической стабильности 3-гидроксикинуренина в образцах плазмы крови в условиях пробоподготовки и анализа. 6. Разработать метод детекции метаболитов триптофана в плазме крови в виде их алкиловых эфиров с помощью MALDI-TOF массспектрометрии. Научная новизна Впервые предложен метод определения содержания серотонина в тромбоцитах на основе ВЭЖХ с флуориметрической детекцией. Использован новый способ пробоподготовки при определении тромбоцитарного серотонина, отличающийся от предложенных в литературе способов тем, что экстракция серотонина из осадка тромбоцитов проводится путем замораживания/оттаивания водной суспензии тромбоцитов. Данный способ экстракции серотонина удобен в условиях клинической лаборатории и не требует работы с вредными для здоровья реактивами. Были подобраны оптимальные условия для осаждения белков при пробоподготовке плазмы крови для определения кинуренина, обеспечивающие его дополнительную стабилизацию и повышение выхода для анализа с помощью ВЭЖХ-МС. 9 Впервые предложен способ повышения стабильности 3-гидроксикинуренина в образцах плазмы крови путем получения его алкиловых эфиров. Впервые показана принципиальная возможность определения 3-гидроксикинуренина, кинуренина и триптофана в виде их алкиловых эфиров с помощью масс-спектрометрии. Практическая значимость работы В работе разработаны высокочувствительные методы количественного определения тромбоцитарного серотонина и кинуренина в плазме крови, пригодные как для научных исследований, так и для рутинной клиниколабораторной практики. На защиту выносятся следующие положения: 1. Разработан новый метод количественного определения серотонина в тромбоцитах детекцией, с использованием включающий в ВЭЖХ себя с флуориметрической модифицированный способ пробоподготовки. 2. Выявлены достоверные различия уровня тромбоцитарного серотонина у пациентов с депрессивными расстройствами и здоровых добровольцев. 3. Разработан новый метод количественного определения кинуренина с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографией с массспектрометрической детекцией в плазме крови. 4. Разработанный метод количественного определения кинуренина в плазме крови с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографией с масс-спектрометрической детекцией апробирован на пациентах с эндогенными депрессивными расстройствами. 5. Разработан новый гидроксикинуренина способ в условиях повышения стабильности пробоподготовки заключающийся в получении его алкиловых эфиров. и 3- анализа, 10 6. Разработан метод детекции 3-гидроксикинуренина, кинуренина и триптофана в виде их алкиловых эфиров с помощью MALDI-TOF массспектрометрии в плазме крови. Апробация работы Диссертация апробирована и рекомендована к защите на заседании научных сотрудников ФГБУ «Научный центр психического здоровья» РАМН 18 июня 2014 года. Материалы диссертационной работы были представлены на IV Международной интернет-конференции «Актуальные проблемы биохимии и бионанотехнологии» (Казань, 2013), Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Междисциплинарный подход в понимании и лечении психических расстройств: миф или реальность?» (Санкт-Петербург, 2014), Научной конференции молодых ученых, посвященной 11—летию со дня рождения А.В. Снежневского (Москва, 2014). Публикации По теме диссертации опубликованы 3 печатных работы в журналах, рекомендованных ВАК Минобразования и науки Российской Федерации, и 3 тезисов докладов на конференциях. Объем и структура диссертации Диссертация изложена на 124 страницах и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов, обсуждения полученных результатов работы, выводов и списка литературы. Диссертация проиллюстрирована 7 таблицами и 19 рисунками. Библиографический указатель содержит 270 литературных источников, из них 10 отечественных и 260 иностранных. Диссертационная работа выполнена в научной лаборатории нейроиммунологии (зав. д.м.н., профессор Т.П. Клюшник) ФГБУ «Научный центр психического здоровья» Российской академии медицинских наук. 11 ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Метаболиты триптофана в патогенезе эндогенных психических заболеваний Одну из ключевых ролей в патогенезе эндогенных психических заболеваний играют метаболиты триптофана (табл. 1). Триптофан (TRP) – одна из незаменимых аминокислот, поступающая в организм человека с пищей. В мозге и на периферии распад триптофана осуществляется по двум метаболическим путям: метоксииндольному и кинурениновому (рис. 1). Метоксииндольный 5-гидрокситриптофана путь (5-HTP) начинается с помощью с образования фермента триптофан гидроксилазы с последующем его декарбоксилированием до серотонина (5-гидрокситриптамин, 5-HT), который, в свою очередь, метаболизируется до мелатонина или 5-гидроксииндолуксусной кислоты (5-HIAA) [23]. Кинурениновый путь начинается с окислительного расщепления индольного кольца триптофана под действием фермента триптофан-2,3диоксигеназы (TDO) (в основном, в печени) или индоламин-2,3- диоксигеназы (IDO) (в почках, легких, кишечнике, селезенке, мозге, плаценте, эндокринных железах, макрофагах/моноцитах) с участием супероксидного радикала (О2–)в качестве кофактора с формированием N-формилкинуренина (NFK) и ведет к образованию кинуренина (KYN) и его метаболитов: 3-гидроксикинуренина (3-HK), кинуреновой кислоты (KYNA), 3-гидроксиантраниловой кислоты (3-HAA), хинолиновой кислоты (QUIN) и др. [24]. Хинолиновая кислота, в свою очередь, принимает участие в синтезе никотинамидадениндинуклеотида (NAD) – важнейшего кофермента, присутствующего во всех живых клетках, который входит в состав ферментов группы дегидрогеназ, катализирующих окислительно- восстановительные реакции. Важно отметить, что кинурениновый путь является основным эндогенным источником NAD в организме. 12 Кинурениновый путь – основной путь распада триптофана в организме. Около 99% триптофана, поступающего в организм с пищей и не участвующего в синтезе белков, метаболизируются по кинурениновому пути и только около 1% – по метоксииндольному [25]. Далее мы подробнее рассмотрим каждую ветвь метаболизма триптофана, его основные метаболиты, а также их свойства и роль в патофизиологии эндогенных психических заболеваний. 13 Рисунок 1. Схема метаболизма триптофана в организме человека. Сокращения: TRP – триптофан, 5-HTP – 5-гидрокситриптофан, 5-НТ – 5гидрокситриптамин (серотонин), 5-HIAA – 5-гидроксииндолуксусная кислота, MEL – мелатонин, NFK – N-формилкинуренин, KYN – кинуренин, KYNA – кинуреновая кислота, 3-НК – 3-гидроксикинуренин, XAN – ксантуреновая кислота, ANA – антраниловая кислота, 3-НАА – 3гидроксиантраниловая кислота, ACMS – 2-амино-3-карбоксимуконат семиальдегид, PIC – пиколиновая кислота, QUIN – хинолиновая кислота, NAD – никотинамидадениндинуклеотид; TH – триптофангидроксилаза, IDO – индоламин 2,3-диоксигеназа, TDO – триптофан 2,3-диоксигеназа, AADC – декарбоксилаза ароматических L-аминокислот, AFM – арилформамидаза, KAT – кинуренин аминотрансфераза, KMO – кинуренин 3-монооксигеназа, HAAO – 3-гидроксиантранилат фосфорибозилтрансфераза. диоксигеназа, QPRT – хинолинат 14 Таблица 1. Метаболиты триптофана. Структура и некоторые физикохимические свойства. pKa λabs(max), nm TRP pKa (COOH) = 218, 278, 287.5 C11H12N2O2 1.9 (0,1М НСl) [26] (204.23) pKa (α NH2) = Метаболит Структурная формула бруттоформула (MW) 9.6 KYN pKa (COOH) = 361 (H2O) C10H12N2O3 1.9 [27] (208.21) pKa (NH2 анил.) 360, 257, 230 (pH = 5.1 7) [26] pKa (NH2) = 8.5 KYNA C10H7NO3 pKa (COOH) ˂ 2 332, 344 (pH 7) pKa (N) = 3.65 [26] (189.17) pKa (OH) = 13.9 3-HK pKa (COOH) = 375 (H2O) C10H12N2O4 1.9 [27] (224.21) pKa (α NH2) = 368,267,228 (pH 9.6 7) [26] pKa (COOH) = 310 (pH 7) [26] ANA C7H7NO2 (137.14) 2.17 pKa (NH3+) = 4.85 15 3-HA рКа (NH2) = 5.19 298,235 (0,1М C7H7NO3 pKa (OH) = 10.12 НСl) (153.14) 315-320 (pH 7) [26] XA pKa(N) = 1.8 243, 342 [26] C10H7NO4 pKa(OH 1) = 7.3 (205.17) pKa(ОН 2) = 12.3 QUIN pKa(COOH) = 268 (кисл) 2.43 [26] C7H5NO4 (167.12) pKa (COOH) = 4.78 PIC pKa (N) = 1.03 265 (кисл) C6H5NO2 pKa(COOH) = [28] (123.11) 5.40 5-HTP pKa (COOH) = 278 (pH 6) C11H12N2O3 2,15 278,324 (pH 11) (220.23) pKa (α NH2) = [26] 9,18 5-HT pKa (NH2) = 9.8 275, 296 (pH 3,5) C10H12N2O pKa (OH) = 11.1 275,322 (pH (176.22) 11,6) [26] 16 5-HIAA pKa (COOH) = 277,299 (в C10H9NO3 4.22 МеОН) (191.18) MEL [26] pKa = 15.8 223, 278 (в 95% C13H16N2O2 EtOH) (232.28) [26] 1.1.1. Серотонин и его метаболиты Впервые серотонин был выделен в 1937 году из слизистой кишечника и охарактеризован Эрспамером В. и Виалли М. по способности сокращать гладкие мышцы и назван «энтерамином». Примерно в то же время Раппорт М. и соавторы выделили из сыворотки крови и охарактеризовали вещество, приводящее к сужению сосудов и повышению кровяного давления, и назвали его «серотонин» [29]. В дальнейшем структура выделенного серотонина была подтверждена химическим синтезом [30]. В 1953 году нейрофизиологи Пейдж И. и Твэрог Б. обнаружили серотонин в головном мозге [31]. Было показано, что серотонин в основном синтезируется и хранится в энтерохромаффинных клетках кишечника (около 95% всего серотонина в организме) [32], участвует в перистальтике кишечника и из кишечника поступает в кровь. Кроме того, серотонин синтезируется в нейронах головного мозга и участвует в передаче и модуляции нервного импульса. Серотонин играет роль нейромедиатора и нейромодулятора в центральной нервной системе, участвует в регуляции памяти, сна, 17 поведенческих и эмоциональных реакциях. Нарушения в функционировании серотониновой системы головного мозга вовлечены в патогенез психических и неврологических заболеваний, среди которых депрессия [21], шизофрения [33], расстройства аутистического спектра [34,35] болезнь Альцгеймера [36], болезнь Паркинсона [37], боковой амиотрофический склероз [38] и другие. Биосинтез серотонина Гидроксилирование триптофана до 5-гидрокситриптофана ферментом триптофан гидроксилазой (TH) – первая стадия синтеза серотонина. Образование серотонина происходит за счет декарбоксилирования 5гидрокситриптофана. Эта реакция катализируется ферментом декарбоксилазой ароматических L-аминокислот (AADC) с использованием пиридоксаль-5-фосфата (активная форма витамина В 6) в качестве кофермента. Поскольку активность AADC примерно в 75 раз выше активности TH, формирование 5-HTP с помощью TH считается скоростьлимитирующей стадией [39]. Уровень синтеза серотонина зависит от активности ферментов HT и AADC, а также от доступности триптофана как субстрата. В ряде работ было показано, что большие количества потребляемого с пищей триптофана повышают содержание серотонина в тканях, в то время как диеты с дефицитом триптофана приводят к снижению содержания серотонина [40,41]. Метаболизм серотонина Серотонин в организме метаболизируется различными путями: окислительным дезаминированием (моноаминоксидаза, МАО), конъюгацией с серной и глюкуроновой кислотами, N-ацетилированием, 5-О- метилированием и их комбинациями. Ферменты, катализирующие эти реакции, по-разному распределены между органами и тканями. Большая часть серотонина метаболизируется флавопротеином моноаминоксидазой (МАО) [42]. Этот фермент, локализованный, прежде 18 всего, на внешней мембране митохондрий, катализирует окислительное дезаминирование некоторых моноаминов до соответствующих альдегидов, аммиака и пероксида водорода. Известны, по меньшей мере, два типа моноаминоксидаз: МАО-А и МАО-В, различающиеся, прежде всего, по субстратной специфичности, органной локализации и ингибиторам. МАО-А высокоаффинна к серотонину, адреналину, норадреналину, мелатонину, гистамину, в то время как МАО-В более активна в дезаминировании бензиламина, фенилэтиламина и дофамина [43,44]. МАО-А локализована, главным образом, в клетках печени, желудочно-кишечном тракте и плаценте. МАО-B присутствует в тромбоцитах. Оба типа в значительном количестве присутствуют в нервной ткани – в нейронах и астроглии. Продукт окислительного дезаминирования серотонина, 5- гидроксииндолацетальдегид, может, в свою очередь, окисляться до 5гидроксииндолуксусной кислоты (5-HIAA) или распадаться до 5- гидрокситриптофола. Первая реакция является наиболее важной. Она катализируется альдегид дегидрогеназой с участием NAD в качестве кофермента. Альдегид дегидрогеназа обнаружена во многих тканях и органах, включая мозг и печень гидроксииндолацетальдегида до альдегид фермент редуктазой. Этот Распад [43,45]. 5-гидрокситриптофола использует 5- катализируется NADH в качестве кофермента. Формирование 5-гидрокситриптофола составляет около 1% от всего метаболизма серотонина в норме, однако, при алкоголизме и патологиях печени может происходить cдвиг от 5-HIAA в сторону 5-гидрокситриптофола [46–48]. Конъюгация серотонина с серной (с формированием серотонин-Осульфата) или глюкуроновой кислотой (с формированием серотонин-Оглюкуронида) представляет малую ветвь его метаболизма. Оба типа конъюгатов детектировали в моче здоровых людей [49–52]. Серотонин и 5-HIAA выделяются с мочой преимущественно в свободной форме, в то время как 5-гидрокситриптофол экскретируется, в основном, в виде 19 конъюгата [47]. Потребление серотонин-содержащих продуктов способно повышать выделение с мочой конъюгатов серотонина [53]. В процесс синтеза мелатонина (5-О-метил-N-ацетилсеротонин) в эпифизе вовлечены два высокоспецифичных фермента, катализирующих, в основном, N-ацетилирование и 5-О-метилирование серотонина. Мелатонин – гормон, принимающий участие в создании циркадного ритма, развитии репродуктивной системы, поведении [54,55]. Недостаточный синтез мелатонина и нарушение циркадных ритмов наблюдаются, в частности, у пациентов с депрессивными расстройствами [56,57]. Серотонин-N-ацетилтрансфераза была обнаружена как в мозге, так и в печени. В эпифизе ритмичностью, что ее функционирование приводит к отличается значительному циркадной повышению уровня мелатонина в плазме ночью [58]. Вторую стадию образования мелатонина катализирует гидроксииндол-О-метилтрансфераза. Этот фермент вызывает 5О-метилирование N-ацетилсеротонина с участием S-аденозилметионина в качестве донора метильной группы [59]. Механизмы клиренса серотонина Как писалось выше, большая часть (примерно 95%) серотонина в организме находятся в энтерохромаффинных клетках ЖКТ, из которых может высвобождаться в кишечную полость и в кровь в результате воздействия симпатических или парасимпатических нервных стимулов, повышенного внутрикишечного давления и изменения pH [60]. Однако, поскольку серотонин – вазоактивный амин, приводящий к повышению тонуса сосудов, его повышенная концентрация в плазме крови может быть опасной. Поэтому в организме существуют механизмы быстрого клиренса серотонина из плазмы крови или его дезактивации, среди которых: захват серотонина тромбоцитами, связывание c транспортными белками плазмы [61], катаболизм серотонина в печени и легких. 20 Циркулирующий в плазме серотонин захватывается тромбоцитами путем активного транспорта с помощью белка-переносчика серотонина (serotonin transporter, SERT) [62] и хранится в электронно-плотных гранулах тромбоцитов. Помимо активного транспорта, существует также и пассивный механизм транспорта серотонина в тромбоциты при высоких его концентрациях в плазме (больше 20 нмоль/109 тромбоцитов). Пассивный транспорт может играть важную роль у пациентов с секретирующими серотонин карциноидными опухолями [63,64], способными повышать концентрацию серотонина в плазме в десятки раз. Печень способна удалять из кровотока и утилизировать значительное количество серотонина с последующим его окислением до 5-HIAA. Так, эксперименты на животных показали, что разница между уровнями серотонина в воротной вене, несущей кровь к печени от ЖКТ, и печеночной вене, уносящей кровь из печени, составляет около 30%. Эта разница может повышаться до 80% при продолжении инфузии серотонина животному [65]. Утилизация циркулирующего в крови серотонина лёгкими – очень быстрый и эффективный процесс. Свыше 90% серотонина, введенного внутривенно или эндогенно секретированного, удаляется из крови за одно прохождение через легкие путем его захвата и окисления эндотелиальными клетками (преимущественно до 5-HIAA). Ингибиторы МАО-А предотвращают окислительное дезаминирование серотонина в легких, однако никак не влияют на скорость его утилизации легкими. Поэтому именно поглощение серотонина эндотелиальными клетками в легких принято считать скорость-лимитирующей стадией его общей легочной утилизации [66]. По сравнению с инактивацией в легких и печени, захват серотонина тромбоцитами – сравнительно медленный процесс. Эксперименты на животных показали, что на захват тромбоцитами 50% серотонина, не связанного с белками, требуется примерно 60 – 120 секунд [65]. 21 В плазме крови в норме концентрации 5-HT и 5-HIAA находятся в наномолярном диапазоне [67,68]. Из плазмы они также экскретируются почками, в основном, через транспортные системы органических катионов и анионов (OCTS, OATS) [69]. 1.1.2. Серотониновая гипотеза эндогенных депрессивных расстройств Снижение уровня серотонина в мозге уже более 50 лет считается центральным патогенетическим фактором депрессии. Серотониновая гипотеза депрессии возникла на основе случайных клинических наблюдений в 50-х годах ХХ века и получила мощное развитие благодаря последующим клиническим и фундаментальным исследованиям. Так, неожиданно выяснилось, что ипрониазид, лекарственное вещество, разработанное для лечения туберкулеза, проявляет антидепрессантную активность у больных туберкулезом, страдавших от депрессии. Как впоследствии оказалось, ипрониазид был способен ингибировать МАО-А и МАО-Б, ферменты, метаболизирующие 5-НТ и другие моноамины, и повышать уровень серотонина в мозге [70]. Имипрамин, один из первых трициклических антидепрессантов (ТЦА), изначально разрабатывался для лечения шизофрении. При испытаниях он не показал антипсихотического эффекта у больных шизофренией, однако он снижал депрессивные симптомы у больных шизофренией с сопутствующей депрессией, и впоследствии стал успешно использоваться в качестве антидепрессанта. В 60-х годах было показано, что имипрамин и другие ТЦА блокируют обратный захват серотонина и норадреналина [70]. В начале считалось, что именно дефицитом норадреналина при депрессии обусловлен положительный эффект ТЦА и ингибиторов МАО. На основе этой идеи была выдвинута норадреналиновая гипотеза депрессии [71]. Примерно в это же время выяснилось, что 5-гидрокситриптофан повышает уровень серотонина в мозге животных [72] и проявляет антидепрессантное действие у человека [73]. Более того, ТЦА кломипрамин показал антидепрессантную 22 эффективность, аналогичную другим ТЦА, обладая при этом способностью ингибировать обратный захват серотонина с аффинностью в 100 раз большей, чем захват норадреналина [74]. Эти наблюдения положили начало моноаминовой гипотезе [75] и, в конечном счете, серотониновой гипотезе депрессии [76,77], называющей дефицит серотонина в мозге центральным патогенетическим фактором депрессии. Более прямые доказательства вовлечения серотониновой системы в патофизиологию депрессивных расстройств были получены при использовании так называемых нагрузочных тестов на добровольцах. Так, гормональный нагрузочный тест фенфлюрамином (соединение, вызывающее высвобождение серотонина в синаптическую щель нейрона) у больных депрессивными расстройствами практически не приводит к повышению секреции гипофизарного нейрогормона пролактина в кровь, что наблюдается у здоровых добровольцев [78–81]. Известно, что секреция пролактина находится под положительным функциональным контролем серотониновой системы гипоталамуса [82], поэтому полученные данные однозначно свидетельствуют центральной в пользу серотониновой снижения функциональной системы у больных активности аффективными расстройствами. Аналогичные свидетельства в пользу вовлечения серотониновой системы в патогенез аффективных расстройств были получены при использовании в качестве нагрузки – диеты, дефицитной по триптофану, предшественнику серотонина. Его недостаток в диете приводит к снижению синтеза серотонина в мозге и, как следствие, к развитию гипофункции серотониновой системы. Было показано, что диета, практически не содержащая триптофана, вызывает обострение болезни у пациентов с эндогенными депрессиями, а у здоровых добровольцев вызывает появление депрессивной симптоматики [83]. В ряде работ была выявлена эффективность применения прекурсора серотонина, 5-гидрокситриптофана, для лечения депрессии, особенно в 23 комбинации с селективными ингибиторами захвата серотонина [84–86]. Также в экспериментах на животных было показано, что прием 5-НТР приводит к повышению уровня серотонина в серотонинергических нейронах [87]. Исследование содержания 5-гидроксииндолуксусной кислоты основного (5-HIAA), метаболита в серотонина, ликворе больных эндогенными депрессиями показало уменьшение концентрации этого метаболита в активной стадии болезни и повышение его концентрации при улучшении клинического состояния больных, что также свидетельствует о вовлеченности дефицита серотонина в патофизиологию депрессии. При этом содержание 5-HIAA было достоверно ниже у больных эндогенными депрессиями, имеющих суицидальные попытки, чем у аналогичных больных без суицидальных попыток [88]. Наконец существуют многочисленные генетические исследования, свидетельствующие о вовлеченности серотониновой системы в этиологию и патогенез аффективных расстройств. Несколько исследований выявили связь гена белка-переносчика серотонина с депрессией. Было показано, что полиморфизм, заключающийся в повторе 44 п.о. в промотерной области гена 5-HTTLPR, влияет на уровень экспрессии переносчика серотонина in-vitro. Мета-анализ 15-ти опубликованных исследований привел к заключению, что существует достоверная связь между этим полиморфизмом и лучшим терапевтическим ответом на лечение селективными блокаторами обратного захвата серотонина. Показано также, что этот полиморфизм является предиктором не только терепевтического ответа, но и длительности ремиссии [89]. Другие исследователи [90] показали, что люди с одной или более копиями короткого аллеля 5HTT промотера имеют повышенный риск возникновения депрессии при возникновении сложных жизненных ситуаций. Авторы другой большой работы [91] провели исследование образцов ДНК 1953 пациентов с депрессией для поиска предикторов терапевтического ответа на лечение циталопрамом (SSRI). Они не нашли подтверждение 24 влиянию генетических вариаций гена белка-переносчика серотонина на терапевтический ответ, однако сообщили о влиянии маркера в гене рецептора серотонина HTR2A на результат терапии. Таким образом, вовлеченности существуют серотониновой убедительные системы в доказательства этиологию и патогенез депрессивных расстройств. Эти данные свидетельствуют о многообразном характере нарушений этой системы, приводящих, в конечном итоге, к развитию гипофункции центральной серотониновой системы при эндогенной депрессии. При этом необходимо отметить, что факт снижения депрессивных симптомов путем фармакологической активации серотонинергической функции мозга не обязательно означает, что именно гипофункция серотониновой системы и дефицит серотонина вызывают депрессию. Кроме того, препараты, повышающие концентрацию серотонина в синаптической щели, например, селективные блокаторы обратного захвата серотонина (SSRI), недостаточно эффективны в сравнении с плацебо у пациентов с тяжелыми формами депрессии [92–94]. Клинически депрессивные расстройства исключительно гетерогенны [95]. Они могут иметь различную этиологию и симптоматику, по-разному поддаваться лечению антидепрессантами. Депрессивные симптомы могут возникать вторично у больных различными неврологическими заболеваниями (например, церебральный инсульт [96], болезни Альцгеймера [97], Паркинсона [98], Кройцфельдта-Якоба [99]), эндокринными заболеваниями (например, болезнь Кушинга [100]), у пациентов, проходящих терапию интерфероном [101]. Психоэмоциональный стресс различной этиологии также является важным фактором предрасположенности к депрессии [102–104], что указывает на патогенетическую значимость факторов внешней среды. Гетерогенность депрессивных расстройств обусловлена, в том числе, генетической компонентой [105], объединяющей генетические особенности разнообразных рецепторных и ферментативных систем, среди которых 25 серотониновая система является одной из центральных, но не единственной. Но, тем не менее, фармакологическое воздействие на серотонинергические структуры мозга и по сей день не утрачивает своей терапевтической важности при депрессии, а определение концентрации серотонина в биологических жидкостях и клетках организма больных депрессией имеет большое диагностическое и прогностическое значение. 1.1.3. Тромбоцитарный серотонин при депрессивных расстройствах Уровень серотонина в мозге может быть оценен более точно по его концентрации в спинномозговой жидкости, однако это высоко инвазивная и болезненная процедура. Поэтому для оценки уровня серотонина в мозге чаще используются альтернативные методы. Согласно многим исследованиям тромбоциты являются удобной экстрацеребральной моделью для изучения состояния центральных серотонинергических нейронов (рис. 2) [106]. На этих центральным обратного клетках нейронам захвата присутствуют элементы серотонина, фармакологически серотониновой система его идентичные системы: везикуляции, система хранения, освобождения и метаболизма, серотониновые рецепторы. Как тромбоциты, так и нейрональные клетки поглощают серотонин с помощью белка-переносчика серотонина (SERT), который транспортирует серотонин через клеточную мембрану, где серотонин запасается в электронно-плотных гранулах (в тромбоцитах) или синаптических пузырьках (в нейронах). У людей, как тромбоциты, так и серотонинергические нейроны содержат МАО-B, не проявляющую активность в отношении серотонина, и не содержат серотонин, значительных поэтому количеств серотонин, МАО-А, хранящийся в метаболизирующей этих клетках, мало метаболизируется и сравнительно стабилен. Таким образом, тромбоциты и серотонинергические нейроны используют одинаковый механизм транспорта серотонина внутрь клетки и схожие пути его запасания. 26 Рисунок 2. Тромбоцит – экстрацеребральная модель серотонинергического нейрона. Было показано, что в тромбоцитах содержится примерно в 25000 раз больше серотонина, чем в плазме. Ряд факторов могут временно повышать уровень серотонина в плазме, что делает ее менее надежной для измерения серотонина. Потребление богатых серотонином продуктов (например, сыр, мясо, фасоль, творог, яйца, рыба) может временно повышать концентрацию серотонина в плазме. Однако вследствие содержания в тромбоцитах очень высокого количества серотонина увеличение потребляемого с пищей серотонина не имеет существенного влияния на его уровень в тромбоцитах. Одно исследование показало, что уровень серотонина в цельной крови (содержащегося преимущественно в тромбоцитах) достоверно не изменяется спустя 15, 30 и 60 минут после приема пищи [107]. Другое исследование выявило высокую внутри-индивидуальную корреляцию уровней серотонина в тромбоцитах крови человека, измеренных 3 раза спустя 1 месяц [108]. Измерение серотонина в тромбоцитах, в этом смысле, аналогично измерению уровня гликогемоглобина вместо глюкозы в плазме крови, поскольку колебания уровня глюкозы гликированного гемоглобина. в плазме намного выше, чем уровня 27 Существенной проблемой измерения уровня серотонина в плазме является его очень низкая концентрация по сравнению с тромбоцитами, в связи с чем небольшое загрязнение плазмы тромбоцитарным серотонином в процессе пробоподготовки может сильно влиять на результат. Кроме того, содержание серотонина в плазме плохо коррелирует с его содержанием в СМЖ, в то время как была выявлена высокодостоверная корреляция содержания серотонина в СМЖ и тромбоцитах [13]. При использовании тромбоцитов для измерения серотонина некоторой проблемой является вариабельность их количества в крови, а также потеря части тромбоцитов при получении плазмы, обогащенной тромбоцитами (ПОТ). Однако концентрации эту проблему серотонина по можно обойти путем числу тромбоцитов нормирования в ПОТ. Уровень тромбоцитарного серотонина принято выражать в наномоль на миллиард тромбоцитов. Многочисленные исследования выявили низкий уровень тромбоцитарного серотонина у больных депрессией, по сравнению со здоровыми добровольцами [14–16]. Кроме того, было показано, что клинически успешное двухмесячное лечение селективными ингибиторами обратного захвата серотонина (SSRI) приводит к повышению уровня тромбоцитарного серотонина у пациентов [14]. При этом после начала терапии и в первые недели лечения выявлено достоверное снижение уровня серотонина в тромбоцитах, связанное, по-видимому с действием SSRI на белок-переносчик серотонина [14,109–113]. Причем у пациентов, положительно отвечающих на лечение SSRI уровень тромбоцитарного серотонина в первые недели после начала терапии был достоверно ниже, чем у пациентов, резистентных к лечению [17,18]. Эти факты потенциально позвволяют использовать мониторинг уровня тромбоцитарного серотонина для ранней предикции клинического ответа на лечение SSRI. Ряд исследований вывил, что снижение уровня тромбоцитарного серотонина связано также с суицидальным поведением пациентов с 28 депрессией. Так, авторы работы [114] выявили достоверное снижение уровня тромбоцитарного серотонина у суицидальных пациентов в сравнении с несуицидальными пациентами или здоровыми донорами. Авторы работы [115] измерили концентрации тромбоцитарного серотонина у ветеранов войны с посттравматическим стрессовым расстройством (ПТСР) и без него со склонностью и без склонности к суициду, а также у здоровых добровольцев. Концентрация тромбоцитарного серотонина была достоверно снижена у суицидальных пациентов с ПТСР и без ПТСР по сравнению с несуицидальными пациентами и здоровыми добровольцами. Суицидальное поведение выявлялось по шкале Hamilton Depression Rating Scale-17 (HDRS). По результатам исследования авторы сделали вывод о том, что сниженная концентрация тромбоцитарного серотонина связана с суицидальным поведением при ПТСР, и предложили использовать этот показатель в качестве биомаркера для предсказания суицидального поведения в психиатрической диагностике. Однако авторы работы [16] получили другие данные. Они измеряли концентрацию серотонина в тромбоцитах у больных депрессивным расстройством с и без попыток суицида Уровень тромбоцитарного серотонина был достоверно ниже у пациентов с депрессивным расстройством без попыток суицида в истории болезни по сравнению с аналогичными пациентами, предпринимавшими попытки суицида. Вышеизложенные данные показывают большую диагностическую и прогностическую значимость определения уровня тромбоцитарного серотонина у больных депрессией, а также большую важность изучения состояния серотониновой системы у разных групп пациентов и поиска новых клинико-биологических корреляций. 29 1.1.4. Кинуренин и его метаболиты Кинурениновый путь Кинурениновый путь – основная ветвь метаболизма триптофана в организме, по которой метаболизируется около 99% триптофана, не участвующего в синтезе белков [116,117]. На первой стадии кинуренинового пути происходит окислительное раскрытие индольного кольца триптофана ферментом ТDO (в основном, в печени) или IDO (в почках, легких, кишечнике, селезенке, мозге, плаценте, эндокринных железах, макрофагах/моноцитах) с образованием нестабильного соединения, N-формилкинуренина [118–120]. Следующая стадия заключается в превращении N-формилкинуренина в L-кинуренин, метаболит, который служит субстратом для различных ферментов: кинурениназы, которая катализирует образование антраниловой кислоты; кинуренин аминотрансфераз (КАТ I,II,III, IV) [121], катализирующих трансаминирование кинуренина с образованием кинуреновой кислоты; кинуренин 3-монооксигеназы, гидроксикинуренина. В свою катализирующей очередь, синтез 3-гидроксикинуренин 3может метаболизироваться ферментом КАТ с образованием ксантуреновой кислоты или кинурениназой с формированием 3-гидроксиантраниловой кислоты (3-HAA), которая может также образовываться из антраниловой кислоты с помощью антранилат 3-монооксигеназы (рис. 1). Фермент 3-НАА с 3-гидроксиантранилат диоксигеназа раскрывает образованием нестабильного 2-амино-3-карбоксимуконат промежуточного (неферментативно) продукта, трансформируется в кольцо семиальдегида, который хинолиновую немедленно кислоту. Кинурениновый путь завершается продукцией NAD+ из хинолиновой кислоты при участии фермента хинолинат фосфорибозилтрансферазы (QPRT) [122,123]. 30 2-амино-3-карбоксимуконат семиальдегид (ACMS) может также преобразовываться в пиколиновую кислоту с участием фермента ACMS декарбоксилазы [124] или претерпевать цепочку превращений с образованием ацетилкоэнзима А, важного соединения в обмене веществ, используемого во множестве биохимических реакций (2-амино-3- карбоксимуконат-семиальдегид→2-аминомуканат-семиальдегид→2аминомуконат→2-кетоадипат→глутарил-КоА→кротонил-КоА→(S)-3гидроксибутаноил КоА → ацетоацетил-КоА→ацетил-КоА) с дальнейшим окислением до CO2 и воды. Поскольку кинуренин проникает через гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) [125], то он может поступать в мозг с периферии дополнительно к кинуренину, синтезированному в мозге. Показано, что 60% KYN в мозге поступают с периферии [126]. Несмотря на то, что некоторые нейроны также экспрессируют IDO и/или TDO-2 [127], в мозге метаболизм триптофана по кинурениновому пути происходит, в основном, в астроцитах и микроглии [128]. В то время как астроциты продуцируют, в основном, кинуреновую кислоту, ввиду отсутствия фермента КМО, микроглия и макрофаги продуцируют, главным образом, хинолиновую кислоту [129]. Астроциты метаболизируют хинолиновую кислоту, продуцируемую соседней микроглией [130] (рис. 3). Нейротропные свойства кинуренинов В литературе нет свидетельств о ярко выраженных нейротропных свойствах самого кинуренина, хотя и описано исследование, в котором математическими методами было показано, что кинуренин способен взаимодействовать с NR1 субъединицей глутаматного NMDA рецептора дрозофилы в качестве агониста [131,132]. Тем не менее, некоторые метаболиты кинуренина способствуют нейродегенеративным изменениям в мозге, в то время как другие, напротив, обладают нейропротекторными свойствами. Так, известно, что хинолиновая 31 кислота может способствовать дисфункции или гибели нейронов и глиальных клеток различными механизмами [133]: а) QUIN в патофизиологических концентрациях стимулирует N-метилD-аспартатные глутаматные рецепторы (NMDA-R), что приводит к входу ионов Са2+ в клетки, последующей активации протеаз и генерацией активных форм кислорода и азота, таких как супероксидный радикал (О2–) и оксид азота (NO), и может способствовать гибели нервных клеток. б) QUIN может повышать высвобождение глутамата нейронами, блокировать его захват астроцитами и ингибировать глутамин синтетазу в астроцитах, приводя к повышению концентрации глутамата во внеклеточной среде и способствуя глутаматной нейротоксичности. в) QUIN способна формировать комплекс с ионами железа (Fe2+). Перенос электрона от этого комплекса к кислороду приводит к образованию активных форм кислорода, которые вызывают перекисное окисление липидов. QUIN-Fe2+ комплексы обладают сильными окислительными свойствами и могут вносить вклад в нейротоксичность хинолиновой кислоты. г) QUIN способна нарушать целостность гематоэнцефалического барьера (ГЭБ). д) QUIN индуцирует активность NO-синтазы в нейронах и астроцитах, приводя к повышению продукции NO. е) QUIN может способствовать фосфорилированию клеточных структурных белков, приводя к дестабилизации цитоскелета. ж) QUIN в патофизиологических концентрациях способна вызывать апоптоз астроцитов. з) QUIN может вызывать аутофагию астроцитов и нейронов. Кинуреновая кислота, напротив, является антагонистом NMDA рецепторов [134] и способна защищать от эксайтотоксичности хинолиновой кислоты [135]. В случае активации кинуренинового пути, например, при 32 воспалении, несмотря на то, что баланс между 3-гидроксикинуренином и кинуреновой кислотой (KYNA) может сдвигаться в сторону образования 3гидроксикинуренина, концентрации кинуреновой кислоты также могут быть выше, чем в норме, вследствие общего повышения образования кинуренина. Так как KYNA является антагонистом рецепторов, NMDA ее сбалансированное повышение может сохранять гомеостаз, нейтрализуя токсическое действие хинолиновой кислоты через NMDA рецепторы. По некоторым данным кинуреновая кислота способна также подавлять дофаминергическую нейротрансмиссию [136,137] и, возможно, обладает антипсихотическим действием. Несмотря на то, что KYNA, в целом, рассматривается как защитный метаболит против физиологических хинолиновой уровней кислоты, способно накопление вызвать KYNA выше глутаматергическую гипофункцию и может способствовать снижению когнитивных функций [138]. Это связано еще и с тем, что, помимо NMDA рецепторов, KYNA является также антагонистом α7-никотиновых ацетилхолиновых рецепторов (α7nAch-R) и регулирует экспрессию других типов ацетилхолиновых рецепторов – non-α7nAch-R [139]. Таким образом, избыток KYNA может вызывать нарушения нейротрансмиссии холинергической системы и способствовать развитию когнитивных нарушений. Другой метаболит кинуренинового пути, 3-гидроксикинуренин, также заслуживает большого внимания. Показано, что в наномолярных концентрациях 3-НК способствует образованию свободных радикалов [140], приводя к апоптозу нейронов и нейродегенерации [141,142]. Более того, 3НК, как и его метаболит 3-HAA, также способны генерировать супероксидрадикал, гидроксил-радикал и пероксид водорода, в том числе, с участием ионов Cu2+, способствуя окислительному повреждению и белков [143]. Также было показано, что генерация свободных радикалов ответственна за потенцирование эксайтотоксичности при совместном действии 3-НК и QUIN [144]. Однако, по некоторым данным, 3-НК, 3-НАА и ксантуреновая кислота, 33 обладают также антиоксидантными свойствами, связывая пероксидные радикалы [145]. 1.1.5. Воспаление и метаболизм триптофана В физиологических условиях метаболизм триптофана идет, главным образом, в печени с участием фермента TDO через образование кинуренина. Однако воспалительные реакции и инфекции активируют экспрессию фермента IDO за пределами печени, в таких органах, как легкие, плацента, почки, селезенка, кровь и мозг [146], поэтому «внепеченочный» метаболизм триптофана сдвигает на второй план метаболизм триптофана в печени [147]. В этом случае распад триптофана по кинурениновому пути идет, в основном, в центральной нервной системе (ЦНС), крови и лимфоидных тканях [148]. Как показано на провоспалительными рис. 3, цитокинами, экспрессия такими как IDO индуцируется интерферон-γ (IFN-γ) [149,150], и ингибируется противовоспалительным интерлейкином 4 (IL-4) [151]. При психоэмоциональном глюкокортикоидов, в особенности стрессе кортизола, усиливается который секреция стимулирует экспрессию TDO и, соответственно, повышение образования кинуренина [152]. Вследствие низкой эффективности потребления внепеченочного кинуренина клетками печени его метаболизм происходит, в основном, в других органах и тканях. Экспрессия цитокинами КМО [146]. также Поэтому индуцируется при провоспалительными воспалении образование 3-гидроксикинуренина увеличивается намного быстрее, чем образование кинуреновой кислоты (с помощью фермента KAT), и баланс между формированием 3-HK и KYNA сдвигается в сторону 3-HK. При повышении образования 3-HK за счет действия КАТ увеличивается продукция ксантуреновой кислоты. Ксантуреновая кислота образует с инсулином комплекс, обладающий пониженной активностью (примерно в 2 раза). Образование комплекса затрудняет транспорт глюкозы в клетки, углеводный 34 обмен и вносит существенный вклад в развитие метаболического синдрома и диабета 2 типа [153,154]. При повышении генерации 3-гидроксикинуренина также может усиливаться образование хинолиновой кислоты. Обнаружено, что при активации макрофагов в условиях воспаления, они начинают активно продуцировать хинолиновую кислоту [155]. В мозге повышенный окислительный распад триптофана приводит к низкой доступности триптофана для синтеза серотонина. Более того, при воспалении и активации IDO серотонин может метаболизироваться не только с помощью MAO в 5-гидроксииндолуксусную кислоту, но также с помощью IDO до 5-гидроксикинурамина вследствие [156], чего равновесная концентрация серотонина в мозге снижается. Рисунок 3. Регуляция метаболизма триптофана в условиях воспаления и стресса При воспалении и усилении распада триптофана по кинурениновому пути дополнительные количества периферического кинуренина становятся доступными для ЦНС, так как кинуренин может проникать через ГЭБ. Таким образом, содержание KYN в мозге увеличивается за счет синтезируемого в ЦНС, и KYN из источников на периферии (рис 4). KYN, 35 1.1.6. Активация кинуренинового пути при депрессивных расстройствах В течение нескольких десятилетий нарушения в серотониновой системе мозга считались наиболее значимыми патофизиологическими механизмами депрессии. И хотя, бесспорно, роль серотонина в развитии депрессий велика, очевидно, что лишь снижением уровня серотонина невозможно полностью объяснить другие патофизирологические механизмы этого заболевания. Об этом, в частности, свидетельствует большой процент резистентных к терапии пациентов (по разным даным от 30 до 60%) при использовании для их лечения современных антидепрессанов, являющихся ингибиторами обратного захвата серотонина, т.е. повышающих уровень серотонина в синаптической щели. Последние 10 – 15 лет, стремительно набирает популярность гипотеза, постулирующая, что активация метаболизма триптофана по кинурениновому пути посредством воспаления и/или психоэмоционального стресса является ключевым связующим звеном между нейромедиаторными системами (серотониновая, глутаматная, ацетилхолиновая и др.) и системой иммунитета, а также одним из ключевых патогенетических факторов развития депрессии (рис. 4). Существуют многочисленные свидетельства вовлечения воспаления в патогенез депрессивных расстройств. Так, в ряде работ было выявлено повышение концентраций провоспалительных цитокинов IL-2, IL-6, растворимых рецепторов для IL-6, фактора некроза опухоли α (TNF-α) и IFN-γ, а также понижение уровней противовоспалительных цитокинов, таких как IL-4 и IL-10, в сыворотке крови больных депрессивными расстройствами [7–9]. 36 Рисунок 4. Роль активации кинуренинового пути в патогенезе депрессивных расстройств. Наиболее прямые доказательства участия воспаления в патогенезе депрессивных расстройств вытекают из исследований, в которых иммуностимулирующие агенты вызывают депрессивные симптомы у пациентов и/или здоровых людей. Так, известно, что широко распространенное лечение гепатита-С с использованием IFN-α вызывает у более чем 50% пациентов депрессивные симптомы, которые сохраняются на протяжении всего курса терапии, однако, исчезают через короткий период времени после ее прекращения [5,6]. Интересно, что у этих пациентов терапия IFN-α усиливала метаболизм триптофана по кинурениновому пути, повышая отношение концентраций КYN/ТRP, являющееся индикатором активности IDO [157]. Концентрация TRP, как правило, но не всегда [158], была понижена, а концентрация KYN повышена в образцах сыворотки крови пациентов с гепатитом-С во время терапии IFN-α. Изменение отношения KYN/TRP коррелировало с выраженностью симптомов депрессии и тревожности, оцененной по соответствующим шкалам: шкала Монтгомери- 37 Асберга для оценки депрессии (MADRS), шкала депрессий Бека (BDI), шкала Гамильтона для оценки тревоги (HARS) [6]. Повышенние продукции кинуренина и снижение уровня триптофана наблюдается также у больных раком, проходящих лечение IFN-α. У этих пациентов также было выявлено повышение отношения KYN/TRP, которое коррелировало с ухудшением прогноза заболевания и развитием депрессивных симптомов [159]. У здоровых добровольцев стимуляция иммунной системы приводит к повышению продукции провоспалительных цитокинов и повышенному образованию кинуренина, связанному с симптомами депрессии [160]. Как было сказано ранее, в случае воспалительных реакций, активирующих IDO, наблюдается пониженная доступность серотонина для серотонергической нейротрансмиссии, что является патогенетическим фактором развития депрессивных расстройств. Активация воспалительных реакций при депрессивных расстройствах приводит к повышению экспрессии не только основного фермента превращения триптофана в кинуренин – IDO, но и KMO – фермента, превращающего KYN в 3-гидроксикинуренин (3-OHK), что, в свою очередь, может привести к смещению метаболизма кинуренина в сторону образования 3-OHK и QUIN. предположение, что Голландскими дисбаланс исследователями между этими было высказано нейротоксическими метаболитами и нейропротекторной кинуреновой кислотой нарушает взаимодействие между нейронами и глией и может сделать нейроглиальную сеть более уязвимой к влиянию психоэмоционального стресса, что может приводить к хроническому течению депрессивных расстройств [161]. Нейротоксические метаболиты кинуренина могут вызывать апоптоз астроцитов и, в меньшей степени, нейронов, что ослабляет нейроглиальное взаимодействие и приводит к снижению синтеза нейротрофических факторов, таких как глиальный нейротрофический фактор (GDNF), мозговой нейротрофический фактор (BDNF) [162,163]. Гибель астроцитов может также 38 нарушать превращение глутамата в глутамин ферментом глутаматсинтетазой, которое, как известно, происходит, главным образом, в астроцитах [164]. Это приводит к нарушению катаболизма глутамата в мозге, повышению его концентрации в синаптической щели и способствовует глутаматергической эксайтотоксичности (за счет гиперактивации NMDА рецепторов). У нелеченных пациентов, страдающих депрессивными расстройствами, не принимавших лекарства, по крайней мере, 4 месяца, был показан дисбаланс между нейропротекторными и нейротоксическими ветвями кинуренинового пути с понижением концентраций нейропротекторных метаболитов. Соотношение между кинуреновой кислотой и кинуренином было достоверно ниже у депрессивных пациентов, чем у здоровых добровольцев. Более того, при шестинедельном лечении антидепрессантами, главным образом, серотонина, селективными метаболический ингибиторами дисбаланс обратного кинуренинового захвата пути не нормализовался. Поэтому авторы выдвинули гипотезу, что такой дисбаланс между кинуреновой кислотой и кинуренином может в дальнейшем вызывать нейродегенеративные изменения и способствовать хронификации болезни и появлению резистентности к терапии [165]. При некоторых формах тревожных расстройств выявлена повышенная концентрация кинуренина в плазме, а при депрессии она была понижена по сравнению со здоровыми донорами. После лечения эти показатели приходили в норму в обеих группах [19]. В этом исследовании концентрация кинуренина достоверно коррелировала с тяжестью тревожного расстройства. Результаты исследования показали, что повышение концентрации кинуренина в плазме может быть использовано как дополнительный критерий для дифференциальной диагностики тревожных расстройств с депрессивным настроением от эндогенной депрессии в клинической практике. 39 Недавно проведенное исследование [166] на постмортальных образцах тканей мозга больных с депрессивными расстройствами и доноров по определению содержания в них хинолиновой кислоты, определяемой иммуногистохимическим методом, показало повышение ее концентрации в префронтальной области коры головного мозга больных. Подобное повышение уровня хинолиновой кислоты у больных наблюдалось также в области гиппокампа. При депрессивных расстройствах существуют морфометрические свидетельства наличия нейродегенеративных изменений и гибели астроцитов Этим [167]. изменениям может способствовать повышение уровня токсических метаболитов кинуренина. В работе [168] было выявлено повышенное отношение концентраций KYN/TRP в плазме, коррелирующее с уровнем ангедонии (снижение или утрата способности получать удовольствие) у подростков с депрессивными расстройствами. Более того, у детей с меланхолической депрессией отношения KYN/TRP, 3-HAA/KYN и уровень кинуренина были связаны с тяжестью депрессивных симптомов [169]. При депрессивных состояниях, связанных с цитокиновой терапией, например, с терапией IFN-α больных гепатитом С, наблюдается понижение концентрации кинуреновой кислоты (KYNA) (и повышение отношения концентраций KYN/KYNA) в сыворотке крови, коррелирующее с тяжестью депрессии [170]. Другое исследование выявило повышение уровней как KYNA, так и принимающих в QUIN IFN-α цереброспинальной [171]; об отношениях жидкости между пациентов, концентрациями метаболитов этих двух ветвей кинуренинового пути в исследовании не сообщалось. Тем не менее, оба исследования указывают на повышение уровня распада кинуренина в триптофана, ответ на изменение терапию концентраций интерфероном-α возникновение депрессивных расстройств. и метаболитов последующее 40 О’Коннор и соавторы на экспериментальной животной модели депрессивного расстройства, связанной с введением мышам вакцины БЦЖ, показали повышение экспрессии IFN-γ, TNF-α и IL-1β, а также IDO в мозге. Блокирование фермента IDO 1-метилтриптофаном предотвращало депрессивные симптомы. Кроме того, у мышей с нокаутом гена рецептора к IFN-γ не было выявлено симптомов депрессивного поведения и повышения экспрессии IDO в ответ на введение БЦЖ, хотя экспрессия ИФН-γ, ФНО-α и IL-1β также повышалась. Приведенные результаты указывают на важную роль IFN-γ и IDO в развитии депрессивного поведения [172,173]. Несмотря на множество клинических исследований, подтверждающих роль вызванной воспалением дисрегуляции кинуренинового метаболизма при БДР, некоторые исследования демонстрируют отсутствие корреляции между воспалением, KYN/TRP и депрессивными симптомами.Так, в работе Hughes M.M. et al., несмотря на небольшое повышение уровней IL-6 и IFN-γ у пациентов с депрессией, не наблюдалось повышение активности кинуренинового пути, хотя уровень триптофана был понижен [174]. У этих пациентов также наблюдалось небольшое повышение уровня С-реактивного белка – индикатора воспаления (2.1 мг/л против 1.2 мг/л в контроле), однако оно оставалось в пределах нормы. Эти данные подкрепляют гипотезу о том, что при незначительном воспалении снижение уровня триптофана происходит независимо от кинуренинового пути и активации IDO. Противовоспалительная терапия оказалась эффективной при лечении депрессии у пациентов с высоким уровнем С-реактивного белка (>5 мг/л) [175]. Более того, провоспалительные цитокины, такие как IL-1β, TNF-α и фактор, ингибирующий предикторами миграцию клинического ответа макрофагов на (MIF), являются традиционную терапию антидепрессантами (SSRI) [176]. Кроме того, уровни TRP, KYN и 3-HAA коррелируют с ответом на лечение флуоксетином, согласно целому ряду клинических шкал [177]. 41 Исследования постмортальных образцов ткани мозга показал, что уровень хинолиновой кислоты повышен в передней поясной коре мозга депрессивных больных, но только у больных с тяжелой формой депрессии [166]. Было показано, что у суицидальных больных повышен уровнь кинуренина в плазме [178], а также хинолиновой кислоты и IL-6 спинномозговой жидкости [179]. Эти и описанные выше данные, возможно, свидетельствуют о том, что развитие депрессивных симптомов связано с нарушением кинуренинового пути только у пациентов с высоким уровнем воспаления. На экспериментальной модели было показано, что ферменты кинуренинового пути находятся под контролем половых гормонов: в частности, эстроген оказывает негативное влияние на активность у крыс фермента KAT, превращающего кинуренин в кинуреновую кислоту [180]. Вероятно, такие данные могут внести определенные вклад в гендерные различия в структуре заболеваемости депрессией [2,181]. Таким образом, на сегодняшний день известно, что стресс и воспаление сдвигают кинурениновый 3-гидроксикинуренина, путь следствием распада чего триптофана может являться в сторону повышение концентраций ряда нейротоксических метаболитов. Вышеизложенные факты дают основание для разработки новых методов лабораторной диагностики эндогенных депрессий, мониторинга состояния больных, а также новых терапевтических подходов к лечению депрессивных расстройств, направленных на измерение и нормализацию концентраций метаболитов триптофана за счет действия лекарственных средств. 42 1.2. Методы определения метаболитов триптофана 1.2.1. Методы определения серотонина Серотонин, как и все 5-гидроксииндолы, при нейтральных pH флуоресцирует при длине волны поглощения 300 нм и испускания 340 нм, что позволяет определять его по собственной флуоресценции классическими спектрофлуориметрическими методоми [182]. Однако исторически первые флуориметрические методы определения серотонина в биологических матрицах были неспецифичны и требовали разделения с интерферирующими соединениями. Для этого требовалось использование экстракции, ионобменной хроматографии и гель-фильтрации. Достаточно высокий предел детекции (примерно 1 нмоль) можно снизить примерно до 50 пкмоль, применяя дериватизацию нингидрином или о-фталевым альдегидом [183]. Повысисть чувствительность спектрофлуориметрического определения удается также за счет за счет формирования комплекса тройного серотонина с комплексом ацетилацетон-формальдегид [184]. Стремительное развитие аналитических технологий привело к появлению более специфичных и точных методов, среди которых: ● тонкослойная хроматография (ТСХ) [185–187]; ● радиоиммунный анализ (РИА) [188,189]; ● иммуноферментный анализ (ИФА) [190–192]; ● масс-спектрометрия (МС) [193]; ● газовая хроматография с МС-детекцией [194–196]; ● капиллярный электрофорез c флуоресцентной [197] и МС-детекцией [198]; ● иммуноцитохимический (с использованием проточного цитофлуориметра) [199], ● высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) с флуориметрической (по собственной флуоресценции [200–204], и с 43 помощью дериватизации [205–210], электрохимической [13,211–216], амперметрической [217] и МС-детекцией [190,218–226]. Среди этих методов наибольшее распространение получили методы, основанные на ВЭЖХ с электрохимической, флуориметрической или МСдетекцией. Тип детекции выбирают в зависимости от возможностей лаборатории и требований к разрабатываемому методу. Удивительным является то, что в литературе не описано метода ВЭЖХ для определения тромбоцитарного серотонина с использованием флуориметрического детектора, который обладает высокой чувствительностью и селективностью, а также доступностью, что, несомненно, важно для клинических лабораторий. Анализ серотонина в биологических образцах осложняется его чувствительностью к свету, кислороду, а также к высоким или очень низким значениям pH. Поэтому для предотвращения окисления желательно принять ряд превентивных мер, среди которых: снижение или исключение воздействия солнечного света, проведение пробоподготовки при охлаждении с последующим быстрым анализом или немедленным замораживанием образцов, подкисление образцов (pH>2), добавление антиоксидантов, таких как аскорбиновая кислота, ЭДТА или L-цистеин. Для проведения точного и правильного анализа на уровень серотонина в тромбоцитах, большое значение имеет предотвращение выхода серотонина из тромбоцитов на всех этапах от забора крови до проведения анализа. Особое значение это имеет при определении концентрации серотонина в плазме, свободной от тромбоцитов (ПСТ), поскольку в ней содержится менее 1% всего серотонина крови. В связи с этим, должны предприниматься меры для сохранения целостности тромбоцитов и предотвращения их активации. Особое внимание следует уделить процедурам забора крови и получения плазмы, обогащенной тромбоцитами (ПОТ). 44 В работе [227] было изучено влияние различных антикоагулянтов на стабильность тромбоцитов при получения плазмы и показано, что при использовании K3ЭДТА концентрация серотонина в ПСТ, примерно в 2 раза ниже, чем при использовании цитрата или Na2ЭДТА. Эти данные говорят о лучшей стабильности тромбоцитов при использовании K3ЭДТА и о прдедпочтительности использования этого антикоагулянта для измерения содержания серотонина в плазме и тромбоцитах. Помимо выбора антикоагулянта, важное значение имеет выбор параметров центрифугирования при получении ПОТ, ПСТ или осаждении тромбоцитов из ПОТ. Авторы работы [216] центрифугировали ПОТ 15 мин при +4°С и при разных скоростях от 1000 до 70000 g. Концентрация серотонина в супернатанте оказалась наименьшей при 6000 g. Снижение или повышение скорости центрифугирования приводило к повышению концентрации серотонина в получавшейся ПСТ вследствие неполного осаждения тромбоцитов или разрушения тромбоцитов, соответственно. ПОТ для последующего определения серотонина в тромбоцитах получают либо отстаиванием цельной крови с антикоагулянтом в течение 2 часов при +4°С [212], либо путем центрифугирования цельной крови. Экстракцию серотонина из тромбоцитов путем их разрушения осуществляют разными способами, среди которых: обработка растворами кислот (например, хлорной кислотой) [212], разрушение тромбоцитов под действием ультразвука [13]. 1.2.2. Методы определения кинуренина и 3-гидроксикинуренина На сегодняшний день разработано большое количество методов определения кинуренина и 3-гидроксикинуренина. Несмотря на это, многие из них имеют ряд недостатков, ограничивающих их применение для рутинных клинико-лабораторных анализов. Большинство методов основаны на высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с различными способами детекции: 45 ● по поглощению в УФ области (УФ-детекция) [228–234]; ● флуоресцентная [231,234–239]; ● электрохимическая [240–242]; ● МС детекция [234,243–250]. Меньшую распространенность получили методы капиллярного электрофореза [251,252], газовой хроматографии [253,196], тонкослойной хроматографии [254]. ВЭЖХ с УФ-детекцией УФ-детекция (при 360 нм), как правило, обладает меньшей чувствительностью, чем флуоресцентная, электрохимическая и массспектрометрическая. Поэтому для успешного проведения анализа требуется процедура концентрирования и большие объемы образца (плазмы крови), что ограничивает применение ВЭЖХ с УФ-детекцией KYN и 3-HK в клинической практике. Кроме того, в биологических жидкостях соединений, поглощающих УФ, значительно больше, чем флуоресцирующих соединений, что способствует появлению на хроматограмме пиков, которые трудно разделить с пиками аналитов. В связи с этим, точность и специфичность УФдетекции обычно значительно ниже, чем у флуориметрической и, особенно, масс-спектрометрической детекции. ВЭЖХ с флуориметрической детекцией Кинуренин флуоресцирует при λex = 361, λem = 500; 3-гидроксикинуренин – при λex =375, λem =557 [27]. Однако квантовый выход флуоресценции этих соединений очень невелик. Поэтому для определения кинуренина и 3-гидроксикинуренина по флуоресценции, с целью повышения чувствительности, а также для возможности одновременного определения различных по оптическим свойствам веществ, проводят процедуру дериватизации, например, ортофталевым альдегидом [231]. Однако эта 46 дополнительная стадия делает анализ более сложным и менее производительным. Ряд работ флуоресценции [236,237] в посвящены виде цинковых определению комплексов, кинуренина получаемых по при использовании подвижной фазы, содержащей ацетат цинка. Однако, стоит отметить, что использование буферов с ацетатом цинка для ВЭЖХ не желательно, т.к. он обладает невысокой растворимостью, может выпадать в осадок в виде кристаллов и наносить вред механическим частям хроматографической системы. ВЭЖХ с масс-спектрометрической детекцией Существуют методы определения кинуренина и 3-гидроксикинуренина с помощью тандемной хроматомасс-спектрометрии с ионизацией электроспреем (ESI), которая позволяет определять концентрации аналитов с очень высокой специфичностью, за счет присущего каждому соединению уникального набора молекулярных и дочерних ионов, и не требует полного хроматографического разделения анализируемых соединений. Кроме того, современный масс-детектор позволяет определять соединения с высокой чувствительностью без использования процедур дериватизации. Однако, при всех приемуществах хроматомасс-спектрометрии, существует ряд проблем, которые необходимо решать при разработке и оптимизации качественных и воспроизводимых методик. Среди них – подавление ионизации анализируемых веществ коэлюирующимися компонентами матрицы (белки, фосфолипиды плазмы крови, например), что, в свою очередь, может приводить к значительному снижению массспектрометрического отклика анализируемых веществ и, соответственно, повышению предела определения. Для снижения влияния матрицы на определение кинуренина и 3гидроксикинуренина, исследователи применяют ряд способов, среди которых осаждение белков хлорной кислотой [229,243,244], трихлоруксусной 47 кислотой [246] или органическими растворителями [234,249] и твердофазная экстракция (ТФЭ) [245,248]. Наиболее эффективным способом является твердофазная экстракция, однако она усложняет анализ, приводит к разбавлению образца и поэтому часто требует последующего упаривания (или лиофилизации) и перерастворения, что увеличивает время проведения метода и может вносить погрешность на каждом этапе. Для рутинных клинических анализов требуется разработка быстрых и простых методик, позволяющих проводить десятки анализов в день, поэтому осаждение белков является компромисным, но приемлемым способом, хоть и не столь эффективным как ТФЭ. Осаждение белков концентрированными расстворами кислот (хлорная, трихлоруксусная) может способствовать разложению соединений, нестабильных в кислых условиях. К тому же, работа с сильными кислотами в условиях клинических лабораторий не желательна. Поэтому осаждение белков растворами органических растворителей (ацетонитрил, метанол) является наиболее удобным. Снижению влияния хроматографическое матрицы разделение может пиков способствовать анализируемых также соединений и компонентов матрицы. Иногда для повышения чувствительности при масс- спектрометрическом детектировании используют процедуру дериватизации кинуренина [250], однако зачастую это усложняет и удлиняет анализ, а также является источником дополнительных погрешностей. С целью повышения точности определения в некоторых работах используется метод внутренних стандартов, при котором концентрация аналита определяется по соотношению площади хроматографического пика аналита к площади пика внутреннего стандарта – вещества, в известном количестве добавленного в образец на стадии пробоподготовки. Это вещество должно обладать физико-химическими свойствами, сходными со свойствами анализируемого соединения. Наиболее предпочтительным является использование в качестве внутренних стандартов дейтерированных 48 аналогов кинуренина [245,246,250] и 3-гидроксикинуренина [246] из-за практически идентичных физико-химических свойств, однако они являются очень дорогостоящими и делают метод нерентабельным при использовании для рутинных клинических анализов. Поэтому некоторые исследователи пытаются заменить их на другие, сходные с КИН и 3ГК по свойствам, соединения, D,L-этионин в числе [247], которых: метиловый эфир триптофана этил-4-гидрокси-2-хинолинкарбоксилат [244], [248], 7-аминогептановая кислота [249] и теофиллин (для определения триптофана, кинуренина и 3-гидроксикинуренина) [229]. Автоокисление 3-гидроксикинуренина Исследователи, ставящие перед собой цель разработки метода определения 3-гидроксикинуренина сталкиваются с проблемами, связанными с его склонностью к быстрому окислению в присутствии кислорода [255]. Автоокисление 3-гидроксикинуренина приводит к формированию различных продуктов, включая ксантоматин (2а), гидроксиксантоматин (2б), 2-карбокси-4,6-дигидрохинолин-5,8-хинон (3) и генерации супероксиданиона и пероксида водорода (рис. 5). 49 Рисунок 5. Схема окисления 3-гидроксикинуренина кислородом [255]. 1 – 3-гидроксикинуренин, 2 а – ксантомантин, 2 б – гидроксиксантомантин, 3 – 2-карбокси-4,6-дигидрохинолин-5,8-хинон. 3-Гидроксикинуренин характеризуется временем «жизни» около 3 часов при температуре 35 °С и pH 7 в присутствии кислорода [256]. Кроме того, было показано, что инкубация 3-гидроксикинуренина с белками в присутствии кислорода приводит к ковалентному связыванию окисленных форм 3-гидроксикинуренина с белками [257]. Помимо окисления кислородом, 3-гидроксикинуренин, как, впрочем, и кинуренин, способны претерпевать спонтанное дезаминирование и декарбоксилорование при температуре 37 °С и pH 7. Причем при щелочных значениях pH реация дезаминирования значительно ускоряется [258,259]. 50 Ряд исследователей пытались решить проблему низкой стабильности 3-гидроксикинуренина путем добавления антиоксидантов, таких как аскорбиновая кислота, в процессе пробоподготовки. Как оказалось, этот подход достаточно хорош в 3-гидроксикинуренина антиоксиданта не для процессе предотвращает декарбоксилирования. 3-гидроксикинуренина Кроме и предотвращения анализа. процессы того, кинуренина Однако добавление дезаминирования продукты способны окисления и дезаминирования вступать в реакции присоединения с антиоксидантами, в числе которых аскорбиновая кислота и глутатион [258–260]. Таким образом, в 3-гидроксикинуренина, при связи разработке с низкой стабильностью методов его количественного определения необходим поиск подходящих способов его стабилизации. Заключение Приведенные выше данные литературы убедительно свидетельствуют о том, что активация кинуренинового пути распада триптофана вовлечена в патофизиологию эндогенных психических заболеваний. Исследование концентраций метаболитов триптофана и их соотношений, а также изучение взаимосвязей между этими метаболитами и клиническими особенностями пациентов, является одной из важнейших задач биологической психиатрии на ближайшие годы. Кроме того, сравнение этих показателей с одним из показателей состояния серотониновой системы – уровнем тромбоцитарного серотонина – позволит получить наиболее полную картину о метаболизме триптофана у пациента в динамике лечения, что, безусловно, поможет объективизировать его состояние, оценить эффективность терапии, и составить персонифицированный план лечения. Выявленные изменения активности кинуренинового пути метаболизма триптофана при разных нозологиях представляют значительный интерес для 51 поиска эффективных фармакологических препаратов. В настоящее время проходит клинические испытания ряд ингибиторов ферментов, катализирующих распад триптофана по кинурениновому – ингибиторы TDO, IDO, KMO, кинурениназы. В экспериментах показано, что эти ингибиторы способны снижать образование нейротоксических метаболитов, таких как 3-гидроксикинуренин, хинолиновая кислота, 3-гидроксиантраниловая кислота, и повышать образование нейропротекторного метаболита – кинуреновой кислоты, предотвращая развитие симптомов депрессии [261– 263]. Представляет интерес также исследование метаболитов кинуренина при психической патологии в качестве возможных биомаркеров для ранней диагностики, прогноза, мониторинга состояния пациентов и оценки эффективности лекарственной терапии. Существующие в настоящее время способы определения метаболитов триптофана на основе ВЭЖХ, капиллярного электрофореза или массспектрометрии нуждаются в усовершенствованиях, и работы по их усовершенствованию активно проводятся в мире. 52 ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 2.1. Реактивы и растворители Серотонин гидрохлорид с чистотой не менее 99% (Acros Organics, США), L-кинуренин сульфат с чистотой не менее 99%, 3-Гидрокси-D,Lкинуренин, L-триптофан, бикарбонат аммония, лимонная кислота, Na2ЭДТА дигидрат, монофосфат трифторуксусная аммония, кислота, азид натрия, гептафтормасляная муравьиная кислота, кислота, 2,5- дигидроксибензойная кислота, p-толуолсульфохлорид, метанол, пропанол, изопропанол (все Sigma, США), ацетонитрил (Sigma, США; Merck, Германия; Scharlau, Испания), этилацетат, пиридин, уксусная кислота, диэтиловый эфир, иодистый калий, перманганат калия, соляная кислота (все хч или чда), крахмал картофельный растворимый для нефелометрии (Реахим, Россия), деионизированная вода с сопротивлением 18 МОм/см, получаемая с помощью установки Simplicity UV System фирмы или Milli Q (Millipore, Франция). Для получения плазмы крови использовали вакутейнеры Vacuette Premium К3ЭДТА (Greiner Bio-one, Австрия). 2.2. Оборудование Определение концентрации серотонина в образцах проводили на жидкостном хроматографе System GOLD (Beckman Coulter, США) c флуориметрическим детектором FP-2020+ (JASCO, Япония), насосом 128 с двумя аналитическими головками по 10 мл, инжектором Rheodine 7725i и аналитической колонкой c C18 обращенной фазой Ultrasphere XL ODS (70 мм × 4,5 мм, 3мкм) (Beckman Coulter, США). Сбор и обработку данных осуществляли с использованием программного обеспечения 32 KARAT (Beckman Coulter, США). Для центифугирования вакутейнеров с К3ЭДТА и кровью и получения плазмы крови, обогащенной тромбоцитами (ПОТ) использовали центрифугу 53 СМ6M (ELMI, Латвия). Для осаждения тромбоцитов ПОТ и для осаждения разрушенных тромбоцитов использовали центрифугу Allegra X-300 (Beckman Coulter, США). Для встряхивания тромбоцитов использовали орбитальный шейкер со скоростью встряхивания 600 оборотов в минуту и амплитудой встряхивания от 3 мм. Для подсчёта тромбоцитов в цельной крови и ПОТ, использовали гематологический анализатор KX-21N (Sysmex, Япония). Коэффициент вариации метода составлял от 4 до 10%. Дегазацию растворителей для ВЭЖХ проводили с использованием мембранного вакуумного насоса KNF Laboport (модель № 820.3 АN18, Weigand International, Германия) в вакууме при перемешивании на магнитной мешалке. Определение концентрации кинуренина в образцах проводили на жидкостном хроматографе Agilent 1200 Series LC (США), включающем дегазатор, бинарный насос, автосамплер, термостат колонок, квадрупольный масс-спектрометр Agilent 6410-2K Triple Quad LC-MS(QQQ) (США) с использованием метода ионизации электроспреем (источник ESI). Для генерирования азота особой чистоты использовали установку NitroFlow ®Lab (Parker Filtration, Нидерланды). Хроматографическое разделение осуществляли на колонке ZORBAX Eclipse XDB-C18 (Agilent, США) (150 × 4,6 мм; 5 мкм) с предколонкой Zorbax SB-C18 (12,5мм × 4,6мм, 5 мкм). Сбор и обработку данных осуществляли с использованием программного обеспечения Agilent MassHunter B.01.04. Для пробоподготовки и анализа метаболитов триптофана в виде алкиловых эфиров использовали следующее оборудование: MALDI-TOF масс-спектрометр Ultraflex II BRUKER (Германия), оснащенный УФ лазером (Nd), лиофилизатор фирмы VirTis, центрифуга Allegra X-300 (Beckman Coulter, США), термостат, колбонагреватель. Для тонкослойной хроматографии использовали камеру для ТСХ (Camag, Швейцария), HTPLC пластинки Silica Gel 60 F254 на стеклянной подложке (Merck, Германия). 54 2.3. Исследуемые пациенты и добровольцы Апрбоция методов определения тромбоцитарного серотонина и кинуренина в плазме крови проводилась на пациентах, госпитализированных в отдел по изучению эндогенных психических расстройств и аффективных состояний ФГБУ «НЦПЗ» РАМН (руководитель – академик РАМН А.С. Тиганов). Критериями включения пациентов в исследование служили наличие острого или эндогенного затяжного депрессивного приступа в рамках аффективного психоза в традиционном понимании, приводившего больных к необходимости госпитализации в психиатрический стационар; необходимость проведения больным активной и интенсивной психофармакотерапии; информированное согласие пациента на участие в исследовании; соблюдение современных норм биомедицинской этики при обследовании больных. Критериями исключения являлись: клинические и лабораторные признаки острого инфекционного или вирусного заболевания, выявленного в течение 1 – 2 месяцев, предшествующих обследованию, а также аллергических заболеваний; признаки зависимости от психоактивных веществ в анамнезе. Состояние пациентов определялось наличием эндогенной депрессии, что отвечало критериям рубрик F31.3, F31.4, F32.1, F32.2., F33.1, F33.2 по Международной классификации болезней. Апробация метода определения тромбоцитарного серотонина проводилась на группе пациентов и контрольной группе. Первая группа включала 30 пациентов (17 женщин, 13 мужчин) в возрасте 20-61 года (средний возраст 35 лет). Контрольную группу составили 10 здоровых добровольцев (5 женщин, 5 мужчин), соответствующие по возрасту и полу группе пациентов. Их обследование проводилось в рамках диспансеризации в ФГБУ «НЦПЗ» РАМН. 55 Апробация метода определения кинуренина в плазме крови проводилась на группе пациентов (14 человек: 8 женщин, 6 мужчин) в возрасте 21-57 года (средний возраст 36 лет). 2.4. Забор крови и получение плазмы Забор крови из вены производили натощак в вакутейнер Vacuette Premium фирмы Greiner Bio-one (Австрия), содержащий раствор К3ЭДТА. ПОТ для определения тромбоцитарного серотонина получали центрифугированием крови при 200×g в течение 10 минут. Плазму для определения кинуренина получали центрифугированием крови при 1300×g в течение 15 минут при 4 °С и хранили до анализа при температуре минус 20 °С. 2.5. Метод определения серотонина в тромбоцитах крови человека Пробоподготовка ПОТ получали по процедуре, описанной выше. Сразу после центрифугирования 400 мкл ПОТ переливали в пластиковую пробирку Eppendorf. Для получения осадка тромбоцитов ПОТ центрифугировали при 6000×g в течение 40 мин при 4 °С, после чего декантировали супернатант. Выделение серотонина из тромбоцитов осуществляли с помощью процедуры замораживания/оттаивания водной суспензии тромбоцитов: к осадку тромбоцитов, находящемуся в пластиковой пробирке, добавляли 400 мкл дистиллированной воды, охлажденной до 4±2 °С, после чего разбивали тромбоциты на шейкере в течение 0,5 мин и замораживали пробирку с пробой при минус 80 °С. Затем не раньше, чем через 1 час, размораживали и центрифугировали при 6000×g в течение 20 мин при 4 °С. Из полученного супернатанта отбирали 20 мкл и проводили аналитическую хроматографию на колонке с С18 обращенной фазой. 56 Перед нанесением на колонку растворы серотонина следует в замороженном виде при минус 15°С и размораживать перед определением холодной водой. После забора пробы и проведения хроматографии пластиковую пробирку с раствором серотонина можно замораживать и хранить при минус 80°С до 1 года. Хроматографический анализ Высокоэффективную жидкостную хроматографию проводили на хроматографе фирмы Beckman Coulter (США) с конфигурацией, описанной выше. Детектирование флуоресценции серотонина осуществляли при длине волны поглощения 300 нм и длине волны испускания 330 нм, при коэффициенте усиления (Gain) 100 и ширине спектральной линии 18 нм. При хроматографии в качестве буфера А использовали растворенные в 1л воды с сопротивлением 18 Мом/см 12,16 ммоль лимонной кислоты; 11,70 ммоль монофосфата аммония; 1,11 ммоль динатриевой соли ЭДТА (дигидрат); 11,61 ммоль бикарбоната аммония и 1,54 ммоль азида натрия (pH 4,05 – 4,20). В качестве буфера Б использовали смесь 200 частей ацетонитрила и 20 частей воды (v:v). Буфер Б дегазировали в течение 2 – 3 минут. После данной процедуры буферная система Б может храниться в плотно закрытом сосуде неделю при 4±8 °C. При уменьшении концентрации ацетонитрила и увеличении времени удерживания серотонина буфер Б заменяют. Буфер А можно хранить в холодильнике 1 месяц. Хроматографию водных экстрактов тромбоцитов, содержащих серотонин, проводили изократическим элюированием со скоростью потока 1,5 мл/мин 4% буфера Б в буфере А в течение 2,5 мин; далее колонку отмывали от примесей линейным градиентом от 4% до 70 % буфера Б от 2,5 до 3 минут; от 3 до 5 минуты колонку промывали 70% буфера Б; затем от 5 до 10,5 минуты колонку переуравновешивали 4% буфера Б. Время удерживания серотонина составляло 1,90 ± 0,25 минут. 57 Построение калибровочной кривой Основой для количественного определения серотонина служили калибровочные зависимости. Для построения калибровочной кривой (рис. 7) готовили модельные растворы гидрохлорида серотонина в 3% ацетонитриле с концентрациями в пересчете на свободный серотонин: 8,8; 17,6; 88,1; 176,3 и 352,5 нг/мл. Модельные растворы получали последовательным растворением навески 5 мг гидрохлорида серотонина с 99% хроматографической чистотой. Чистота подтверждалась тонкослойной хроматографией (ТСХ) на силикагеле Merk Art 5642 в системах этилацетат: уксусная кислота: вода 3:1:1 (R f 0,50) и н-бутанол:уксусная кислота: вода 4:0,5:5,5 ( Rf 0,51). При тонкослойной хроматографии нанесенный серотонин проявлялся одним пятном в УФ свете, или также одним пятном при помощи проявителей для тонкослойной хроматографии [264,265]. Дальнейший хроматографический анализ модельных растворов проводился, как описано выше. Каждая проба анализировалась три раза. Калибровочный график строили по результатам ВЭЖХ анализа на основе измерений площади хроматографических пиков с использованием функции Area программы 32 KARAT (Beckman Coulter, США). 2.6. Метод определения кинуренина в плазме крови человека Пробоподготовка К 200 мкл плазмы крови добавляли 20 мкл H2O и 400 мкл метанола, содержащего 0,2% муравьиной кислоты и 0,05% трифторуксусной кислоты (в качестве источников протонов, а также для повышения стабильности кинуренина). После перемешивания и центрифугирования в течение 5 мин при 3000×g супернатант объемом 200 мкл переносили в аналитические виалы и 5 мкл инжектировали в хроматограф. Все работы по пробоподготовке велись на холоде (использовали лёд, t=0°C). 58 Условия хроматографии Хроматографическое разделение осуществляли на колонке с С18 обращенной фазой с предколонкой. Состав подвижной фазы: смесь ацетонитрила и воды (80:20, v/v). Элюирование производилось в изократическом режиме. Скорость подвижной фазы составляла 0,6 мл/мин; объем инжектируемой пробы – 5 мкл; температура термостата колонки 30 °C. Время удерживания кинуренина в данных условиях составило 2,77±0.02 мин. Масс-спектрометрическая детекция Детектирование кинуренина проводилось с использованием ионизации электрораспылением (ESI) при положительной полярности работы источника в режиме мониторинга заданных масс (MRM – multiple reaction monitoring). Детектор фиксировал MRM-переходы (m/z 209,0 → 192,1; m/z 209,0 → 146,1). В таблице 2 представлены условия масс-спектрометрического детектирования кинуренина. Таблица 2. Условия масс-спектрометрического детектирования кинуренина. Ионизация ESI (ионизация электрораспылением) Режим Positive (положительная ионизация) Тип сканирования MRM (режим детектирования заданных масс) Параметры ионизации Расход газа N2 – 7 л/мин Температура газа – 350°С Давление небулайзера – 30 psi Параметры фрагментации Fragmentor (энергия фрагментатора) = 100В Collision Energy (энергия столкновений) = 5В, 15В Молекулярный ион [M+H]+ m/z = 209.0 Дочерние ионы m/z = 146.1; 192.1 Программное обеспечение Agilent MassHunter B.01.04. 59 Построение калибровочной кривой Основой для количественного определения серотонина служили калибровочные зависимости. Калибровочную кривую строили согласно официальному руководству FDA (Food and Drug Administration, U.S.) по валидации хроматографических методов Для [270]. построения калибровочной кривой (рис. 12) готовили модельные растворы сульфата кинуренина в плазме крови здорового добровольца путем добавления к 200 мкл плазмы 20 мкл водного раствора сульфата кинуренина соответствующих концентраций для достижения следующих итоговых концентраций вносимого кинуренина в образце: 21,2; 42,5; 85,0; 170,0; 339,9; 679,8 нг/мл (в пересчете на свободный кинуренин). Дальнейшая процедура пробоподготовки с последующим анализом проводилась, как описано выше. Калибровочную кривую строили по результатам анализа на основе измерений площади хроматографических пиков с учетом вычета площади пиков эндогенного кинуренина, содержащегося в плазме крови добровольца. 2.7. Метод синтеза алкиловых эфиров метаболитов триптофана Метиловые, пропиловые и изобутиловые эфиры гидроксикинуренина, кинуренина и триптофана получали обработки раствором HCl в соответствующем 3-D,L- путем их абсолютным спирте (метиловом, пропиловом, изобутиловом). Реакция проходила в течение 2 часов при 68° С. Затем реакционную смесь упаривали в вакууме досуха и характеризовали с помощью ТСХ и MALDI-TOF масс-спектрометрии. 2.8. Получение растворов HCl в абсолютных спиртах Безводный раствор HCl в спиртах, необходимый для синтеза соответствующих алкиловых эфиров, получали по реакции соответствующего абсолютного спирта (метанол, пропанол или изобутанол) 60 (10 мл) с p-толуолсульфохлоридом (10 г) при 35° С для метанола и 45° С для пропанола и изобутанола в течение суток с последующей перегонкой. Растворы имели молярность от 2 до 4,7 М, определяемую титрованием КОН. Полученные растворы при хранении при минус 80° С обладали высокой стабильностью. Концентрация HCl существенно не изменялась в течение месяца. Пример. Получение раствора HCl в абсолютном метаноле. В колбу с 10 мл абсолютного метанола добавляли 10 г p-толуолсульфохлорида (Sigma), растворяли при нагревании с обратным холодильником. После растворения p-толуолсульфохлорида колбу с реакционной смесью запечатывали и выдерживали при температуре 35° С в течение 20 часов. Затем производили перегонку раствора HCl в метаноле. Концентрация HCl в полученном растворе, определенная титрованием KOH, составила 4,7 моль/л. Аналогичным образом получали растворы HCl в пропаноле и изобутаноле. 2.9. ТСХ алкиловых эфиров метаболитов триптофана Для характеристики полученных производных использовали тонкослойную хроматографию на пластинках с силикагелем на стеклянной подложке. Состав подобранной нами подвижной фазы: этилацетат:пиридин:уксусная кислота:вода:эфир (5:5:1:3:4, по объемам). Пятна веществ характеризовали по фактору удерживания Rf (retention factor), который равен отношению расстояния, прошедшего веществом от линии старта, к расстоянию, прошедшему за то же время растворителем от линии старта. Пятна веществ проявляли хлором и крахмал иодидом. Для этого сначала хлорировали пластинку путем ее помещения в герметичную камеру с хлором на 1 минуту. Затем тщательно продували хлор с пластинки, после 61 чего опускали ее на несколько секунд в водный раствор, содержащий 1% иодистого калия, 1% крахмала и 1% азида натрия. Вещества проявляются в виде пятен синего цвета. Получение хлора для проявления: хлор получали в герметичной камере добавлением соляной кислоты (1 – 2 мл) к перманганату калия. Получение реагента для проявления: 20 мл водной суспензии, содержащей 3 г иодида калия, 3 г крахмала, а также 3 г азида натрия для предотвращения бактериального зарастания, добавляли при перемешивании к 270 мл дистилированной воды доведенной до кипения. После полного растворения крахмала оставляли при комнатной температуре до остывания. Получали прозрачный раствор, готовый к использованию. Раствор оставался пригодным к использованию несколько месяцев. 2.10. MALDI-TOF масс-спектрометрия алкиловых эфиров метаболитов триптофана Подготовка стандартных образцов для анализа проводилась следующим образом: 0,5 мг вещества растворяли в 200 мкл ацетонитрила, на мишени смешивали по 0,5 мкл раствора образца и раствора 2,5дигидроксибензойной кислоты (Sigma, США) (30 мг/мл в 20% водном ацетонитриле с 0.5% ТФУ). Полученную смесь высушивали на воздухе. Масс спектры были получены на MALDI-TOF масс-спектрометре Ultraflex II BRUKER (Германия), оснащенном УФ лазером (Nd) в режиме положительных ионов с использованием рефлектрона; точность измеренных моноизотопных [M+H]+ составляет 0,1 Да. 2.11. MALDI-TOF масс-спетрометрическая детекция триптофана, кинуренина и 3-гидроксикинуренина в плазме крови Пробоподготовка К 100 µl плазмы крови добавляли 400 µl смеси следующего состава: AcN/MetOH (80:20, v:v), 0,25% гептафтормасляной кислоты. Затем образец 62 перемешивали на вортексе в течение 1 мин и центрифугировали 10 мин при 10000×g при 4° С. Получившийся супернатант переносили в стеклянный пузырек, охлаждали до минус 80° С, после чего высушивали 12 часов на лиофилизаторе до получения сухого остатка. К полученному сухому остатку добавляли 2 мл раствора HСl в абсолютном изобутаноле, и проводили реакцию получения изобутиловых эфиров в течение 2 ч при 68° С. Затем охлаждали реакционную смесь до минус 80° С высушивали 12 часов на лиофилизаторе до получения сухого остатка. Масс-спектрометрический анализ Экстракт плазмы крови, прошедший обработку HCl в изобутаноле и лиофилизацию, растворяли в 200 мкл ацетонитрила. На мишени смешивали по 0,5 мкл раствора образца и раствора 2,5-дигидроксибензойной кислоты (30 мг/мл в 20% водном ацетонитриле с 0,5 % ТФУ). Полученную смесь высушивали на воздухе. Масс спектры были получены на MALDI-TOF массспектрометре в условиях, описанных выше для синтезированных стандартов. 2.12. Статистическая обработка Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием программных пакетов «Statistica 10» и «Microsoft Excel 2007». Вычисляли средние арифметические значения, стандартные отклонения, уравнения регрессионной зависимости, t-критерий Стьюдента для независимых выборок. 63 ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 3.1. Разработка метода определения серотонина в тромбоцитах крови человека Оптимизация пробоподготовки В процессе разработки метода были оптимизированы параметры получения тромбоцитов из ПОТ и извлечения серотонина из тромбоцитов. Выбор антикоагулянта K3ЭДТА для получения ПОТ сделали на основе анализа литературных данных, которые говорят о лучшей стабильности тромбоцитов при использовании K3ЭДТА и о предпочтительности использования этого антикоагулянта для измерения содержания серотонина в плазме и тромбоцитах [227]. Помимо выбора антикоагулянта, важное значение имеет выбор параметров центрифугирования при осаждении тромбоцитов из ПОТ. Для получения осадка тромбоцитов ПОТ центрифугировали при 6000×g в течение 40 мин при 4 °С, после чего декантировали супернатант. Данные параметры центрифугирования являются оптимальными, поскольку обеспечивают наилучшую сохранность тромбоцитов, более эффективное осаждение и, следовательно, более высокий выход серотонина для анализа. Для контроля метода после центрифугирования в супернатанте определяли содержание серотонина при помощи ВЭЖХ. Содержание серотонина в супернатанте было ниже предела детекции. Выделение серотонина из тромбоцитов осуществляли с помощью процедуры замораживания/оттаивания водной суспензии тромбоцитов. Данный способ выделения серотонина из тромбоцитов был применен впервые. Он имеет преимущества по сравнению с описанными в литературе способами (обработка раствором хлорной кислоты или ультразвуком), поскольку более удобен в условиях клинической лаборатории и не требует работы с вредными для здоровья реактивами. Полноту экстракции серотонина из тромбоцитов оценивали, анализируя содержание серотонина в 64 «тенях» тромбоцитов после экстракции, а также путем сравнения уровня тромбоцитарного серотонина после однократной и повторной процедуры замораживания/оттаивания. Содержание серотонина в «тенях» тромбоцитов было ниже предела детекции метода. Концентрации тромбоцитарного серотонина после однократной и повторной процедуры замораживания/оттаивания практически не отличались. Хроматографический анализ При разработке метода определения тромбоцитарного серотонина был произведен подбор условий хроматографии (состав элюирующих буферов и скорость элюирования), обеспечивающих выделение отдельного пика серотонина, не пересекающегося с пиками примесей (рис. 6). Время удерживания серотонина составляло 1,90 ± 0,25 минут и не изменялось после проведения более 1000 определений серотонина. Примеси, которые могут содержаться в использованной воде или образце экстракта тромбоцитов, элюировались с временами удерживания 0,45 – 0,6 мин и 4,7 – 6,8 мин и, таким образом, не мешали определению серотонина. Рисунок 6. Хроматограмма экстракта серотонина, выделенного из тромбоцитов крови добровольца. Время удерживания серотонина составлет 1.908 мин. I, отн. ед. – интенсивность флуоресценции; t, мин. – время удерживания; S – площадь хроматографического пика; [5HT], нг/мл – концентрация серотонина. 65 В работе впервые был использован флуориметрический детектор для определения серотонина в тромбоцитах с помощью ВЭЖХ, хотя его использование для определения серотонина в плазме описано в литературе. Флуориметрический детектор обладает высокой чувствительностью, селективностью, простотой в использовании и сравнительной доступностью, что, несомненно, делает его удобным для рутинных клинико-лабораторных исследований. Калибровочная кривая Полученная калибровочная кривая (рис. 7) описывается уравнением: y=11379 × x – 19966, где y – площадь хроматографического пика в относительных единицах, x – концентрация серотонина в нг/мл. Калибровочная кривая является линейной во всей области концентраций серотонина от 8,8 до 352,6 нг/мл, в которой производится определение серотонина в тромбоцитах. Линейность демонстрируется коэффициентом достоверности аппроксимации R2=0,9996. Предел количественного определения (LOQ) серотонина в 3% ацетонитриле составил 8,8 нг/мл, при значениях правильности и точности менее 20% (точность 11,3%, правильность 16,3%). Правильность (отличие расчетной концентрации он номинальной, выраженное в процентах) и точность (CV, коэффициент вариации) для каждого уровня на калибровочной кривой находились в приемлемых диапазонах (меньше 15%; меньше 20% для LOQ) (табл. 3). Для пересчета концентрации серотонина в нмоль/мл необходимо поделить полученное значение Х на молекулярный вес серотонина: 176,2. Уровень тромбоцитарного серотонина выражали в нмоль/109 тромбоцитов. 66 Рисунок 7. Калибровочная кривая (зависимость концентрации серотонина от величины площади хроматографических пиков). Таблица 3. Экспериментальные данные, использованные для построения калибровочной кривой для серотонина. С, нг/мл S, отн. ед. Точность, % Правильность, % 8,8 101445 11,3 16,3 17,6 202125 6,4 5,2 88,1 959411 2,8 7,8 176,3 1938476 4,2 7,9 352,5 4019324 3,5 5,1 С – концентрация серотонина (нг/мл); S – площадь хроматографического пика (отн. ед.); точность – коэффициент вариации (CV) для значения S (отношение стандартного отклонения к среднему арифметическому, выраженное в процентах); правильность – отличие расчетной концентрации от номинальной, выраженное в процентах. 67 3.2 Апробация метода определения серотонина в тромбоцитах крови человека Апробация метода проведена на образцах крови, полученных от пациентов с депрессивными расстройствами, а также от здоровых добровольцев. Среднее содержание тромбоцитарного серотонина у пациентов (N=30) составило 1,39±0,73 нмоль/109 тромбоцитов, а в группе здоровых добровольцев (N=10) 3,84±1,04 нмоль/109 тромбоцитов; t=8,25; p<0,001; что означает высокодостоверную разницу между группами, оцененную по Т-тесту для независимых переменных. Таким образом, выявлены достоверные различия уровня тромбоцитарного серотонина в группе пациентов с депрессивными расстройствами и в группе здоровых добровольцев (табл. 4). Описанные тромбоцитарного в литературе серотонина в нормальные значения нмоль/109 тромбоцитов концентраций находятся в следующих интервалах: для новорожденных 1,67 ± 0,74; для детей 4,09±1,04; для взрослых 3,87±0,87; для пожилых 2,57±1,12 [23,266]. Полученные нами нормальные значения концентраций тромбоцитарного серотонина для взрослых добровольцев согласуются с литературными данными, что так же иллюстрирует применимость разработанного метода. 68 Таблица 4. Результаты измерения уровня тромбоцитарного серотонина у здоровых добровольцев и пациентов с депрессивными расстройствами. № добровольца Д1 Д2 Д3 Д4 Д5 Д6 Д7 Д8 Д9 Д10 Концентрация серотонина, нмоль/109 тромбоцитов 2,19 4,51 2,68 3,91 4,18 4,6 2,3 4,87 4,71 4,48 № пациента П1 П2 П3 П4 П5 П6 П7 П8 П9 П10 П11 П12 П13 П14 П15 П16 П17 П18 П19 П20 П21 П22 П23 П24 П25 П26 П27 П28 П29 П30 Концентрация серотонина, нмоль/109 тромбоцитов 0,11 1,17 1,10 1,80 1,87 2,35 2,89 0,90 1,36 0,88 2,26 0,71 0,24 1,19 2,16 1,46 2,08 0,52 1,45 0,59 1,42 0,76 0,50 1,07 0,59 2,06 2,03 1,76 2,15 2,35 В целом, разработанный нами метод определения тромбоцитарного серотонина с помощью ВЭЖХ с флуориметрической детекцией имеет ряд преимуществ перед другими методами определения тромбоцитарного серотонина с помощью ВЭЖХ, описанными в литературе. 69 Методы определения серотонина, включающие ВЭЖХ с электрохимическим детектированием, являются более трудоемкими и, в связи с этим, недостаточно пригодными для рутинных анализов. Методы ВЭЖХ, включающие детектирование серотонина с помощью УФ-детектора, недостаточно чувствительны по сравнению с методами ВЭЖХ с флуориметрическим детектированием и требуют для анализа большого объема крови. Кроме того, селективность определения серотонина с помощью флуориметрического детектора значительно выше. Методы определения серотонина с помощью ВЭЖХ с массспектрометрической детекцией (ВЭЖХ-МС) обладают очень высокой селективностью, специфичностью и чувствительностью. Однако оборудование для ВЭЖХ-МС примерно в 4 – 10 раз превосходит по стоимости хроматографы с флуориметрическим детектором, и не каждая клиническая или научная лаборатория может позволить себе данное оборудование. Кроме того, разработанный нами метод определения серотонина не уступает методам ВЭЖХ-МС по чувствительности. Разработанный нами метод имеет также ряд преимуществ по сравнению с методами иммуноферментного анализа (ИФА) и радиоиммунного анализа (РИА). Как ИФА, так и РИА включают использование дорогостоящих антител. Кроме того, они не позволяют анализировать единичные образцы и являются более длительным по постановке. Подобранные нами условия хроматографического анализа обеспечивают приемлемое время хроматографии, что позволяет проводить 20 – 30 анализов в день, а также достаточно высокую селективность определения серотонина в присутствии других компонентов матрицы. Оптимизированная стадия пробоподготовки обеспечивает лучшую химическую сохранность серотонина, что повышает точность и правильность определения. Таким образом, разработанный хроматографический метод 70 является достаточно быстрым, точным, недорогим и пригодным для использования в клинико-лабораторной практике. Результаты апробации метода показали, что разработанный нами метод применим для исследования уровня тромбоцитарного серотонина у пациентов и здоровых добровольцев и является методической основой для последующих исследований клинико-биологических корреляций между уровнем тромбоцитарного серотонина и клиническими особенностями пациентов с депрессивными расстройствами. Таким образом, в разработанном нами методе принципиально новыми являются следующие положения: Впервые для количественного определения тромбоцитарного серотонина с помощью ВЭЖХ использован флуориметрический детектор. Использован оптимизированный способ пробоподготовки, отличающийся от предложенных в литературе способов тем, что экстракция серотонина из осадка тромбоцитов проводится путем замораживания/оттаивания водной суспензии тромбоцитов. Показано, что полнота извлечения серотонина из тромбоцитов путем замораживания/оттаивания составляет не менее 99%. Данный способ экстракции имеет преимущество по сравнению с обработкой хлорной кислотой [212] или ультразвуком [13], заключающиеся в обеспечении лучшей химической сохранности серотонина, а также удобстве и безопасности в условиях клинической лаборатории. Оптимизированы условия получения тромбоцитов из ПОТ. 71 3.3. Разработка метода определения кинуренина в плазме крови В основе разработанного нами метода определения кинуренина в плазме крови лежит ВЭЖХ с тандемным масс-спектрометрическим детектированием. Подбор условий пробоподготовки Были подобраны оптимальные условия для осаждения белков при пробоподготовке плазмы крови для определения кинуренина, обеспечивающие его дополнительную стабилизацию повышение выхода для анализа с помощью ВЭЖХ-МС. Степень извлечения кинуренина, измеренная для концентрации вносимого в плазму кинуренина 340 нг/мл, составила 68%. Оптимизация масс-спектрометрического детектирования При разработке метода были оптимизированы условия МС детекции, позволяющие определять чувствительностью и концентрацию специфичностью. кинуренина Детектирование с высокой кинуренина проводилось с использованием ионизации электрораспылением (ESI) – способа ионизации, типичного для анализа таких полярных соединений как аминокислоты, к которым относится кинуренин. Определение вещества проводили при положительной полярности работы источника в режиме мониторинга заданных масс (MRM – multiple reaction monitoring). Режим MRM обеспечивает эффективность в отсекании фона и, как следствие, значительно снижает предел определения. Массы материнского и дочернего ионов определяли в режиме сканирования масс (рис. 8, 9, 10). В качестве дочерних ионов для MRM-детекции выбраны ион с m/z = 146.1, и m/z = 192.1, как демонстрирующие максимальный отклик. Параметры работы детектора подбирались для достижения максимального выхода MRM (209.0→146.1 и 209→192.1) (табл. 4). В этих условиях достигнута оптимальная чувствительность количественного определения кинуренина (0,1 мкмоль/л). 72 Рисунок 8. Масс-спектр стандартного раствора кинуренина, полученный в режиме сканирования с установленным диапазоном детекции 200 – 230 m/z. Зарегистрирован максимальный отклик сигнала масс-спектрометрического детектора для m/z=209.0, соответствующий родительскому иону кинуренина. Рисунок 9. Масс-спектр стандартного раствора кинуренина, полученный в режиме сканирования после фрагментации исходного иона кинуренина (энергия столкновений 15В). Отсутствие сигнала в части спектра, соответствующей родительскому иону (m/z = 209), свидетельствует о полной фрагментации. 73 Рисунок 10. Масс-спектр стандартного раствора кинуренина, полученный в режиме сканирования после фрагментации исходного иона кинуренина (энергия столкновений 5В). Подбор условий хроматографии Был произведен подбор условий хроматографии (состав подвижной фазы, скорость элюирования, температура) для достижения максимального отклика кинуренина и приемлемого времени элюирования. На рисунке 11 представлена типичная MRM масс-хроматограмма образца плазмы пациента. Пик кинуренина (tуд = 2,77) симметричный, отвечает гауссову распределению, без признаков размывания и раздвоения. Рисунок 11. Масс-хроматограмма, полученная в режиме MRM 209.0→192.1; 209.0→146.1 при анализе образца плазмы крови пациента. 74 Калибровочная кривая Полученная калибровочная кривая описывается уравнением y = 7,915 × x + 891,61 (где y – площадь хроматографического пика в относительных единицах; x – концентрация кинуренина, нг/мл) (рис. 12). Для пересчета концентрации в мкмоль/л кинуренина необходимо поделить полученное значение X на молекулярный вес кинуренина – 208,22. Рисунок 12. Калибровочная кривая (зависимость концентрации кинуренина от величины площади масс-хроматографических пиков). Линейность калибровочной кривой в диапазоне концентраций 21,24 – 679,81 нг/мл кинуренина демонстрируется коэффициентом достоверности аппроксимации R2=0,999. Правильность и точность (CV, коэффициент вариации) для каждого уровня на калибровочной кривой находились в приемлемых диапазонах (меньше 15%; меньше 20% для LOQ) (табл. 5). 75 Предел количественного определения (LOQ) для кинуренина составил 0,1 мкмоль/л (21,2 нг/мл кинуренина) при значениях правильности и точности менее 20% (точность 3,7%; правильность 18,9%). Таблица 5. Экспериментальные данные, использованные для построения калибровочной кривой. С, нг/мл S, отн. ед. Точность, % Правильность, % 21,2 1026,2 3,7 18,9 42,5 1206,5 8,2 5,9 85,0 1587,5 7,8 3,7 170,0 2336,4 1,1 7,5 339,9 3496,9 8,2 3,2 679,8 6289,5 9,2 0,3 S – площадь хроматографического пика (отн.ед.); С – концентрация кинуренина; точность – коэффициент вариации (CV) для значения S (отношение стандартного отклонения к среднему арифметическому, выраженное в процентах); правильность – отличие расчетной концентрации от номинальной, выраженное в процентах. 3.4. Апробация метода определения кинуренина в плазме крови Апробация метода проведена на 14 образцах крови, полученных от пациентов с депрессивными расстройствами. Средняя концентрация кинуренина в плазме пациентов составила 1.63±0.54 мкмоль/л, что хорошо соотносится с литературными данными [165,246]. Диапазон полученных значений концентрации кинуренина составляет от 1,02 мкмоль/л до 3,11 мкмоль/л (табл. 6). Полученные результаты свидетельствуют о гетерогенности группы обследованных пациентов по концентрации кинуренина в плазме крови, что требует дальнейших исследований. 76 Таблица 6. Результаты измерения концентрации кинуренина в плазме крови пациентов с депрессивными расстройствами. № пациента S, отн. ед. Концентрация Концентрация кинуренина, кинуренина, нг/мл мкмоль/л К1 3369 312,9 1,50 К2 3343 309,7 1,49 К3 3253 298,4 1,43 К4 3756 361,9 1,74 К5 4264 426,0 2,05 К6 2981 263,9 1,27 К7 6012 646,9 3,11 К8 3165 287,3 1,38 К9 2927 257,1 1,23 К10 4051 399,2 1,92 К11 2864 249,2 1,20 К12 4404 443,7 2,13 К13 2571 212,1 1,02 К14 3041 271,5 1,30 Таким образом, нами был разработан метод количественного определения кинуренина в плазме крови, сочетающий простую и быструю стадию подготовки пробы с хроматомасс-спектрометрическим определением, обеспечивающим высокую чувствительность и селективность определения кинуренина. Разработанный метод является экспрессным, что позволяет проводить десятки анализов в день, используя небольшие объемы плазмы крови (200 мкл), что делает возможным его использование как для медико-биологических исследований, так и для рутинных клинических анализов. 77 3.5. Характеристика алкиловых эфиров метаболитов триптофана Нами были подобраны условия (температура и время реакции, способ синтеза) и произведен синтез алкиловых эфиров метаболитов триптофана. Синтез алкиловых (метиловых, пропиловых, изобутиловых) эфиров 3-гидроксикинуренина проводился с целью повышения его стабильности в условиях пробоподготовки и анализа, а также при длительном хранении образцов путем защиты карбоксильной группы 3-гидроксикинуренина и протонирования аминогрупп. Полученные эфиры использовались в качестве стандартов для разработки аналитического метода. Синтез алкиловых (метиловых, пропиловых, изобутиловых) эфиров триптофана и кинуренина проводился с целью получения стандартов для разработки метода одновременного количественного определения триптофана, кинуренина и 3гидроксикинуренина в виде их алкиловых эфиров. Синтезированные соединения были охарактеризованы с помощью ТСХ и MALDI-TOF массспектрометрии. Анализ методом тонкослойной хроматографии синтезированных алкиловых эфиров показал, что метиловые, пропиловые и изобутиловые эфиры получаются с количественными выходами или близкими к количественным. После проведения синтеза в реакционной смеси пятна 3-гидроксикинуренина на пластинке для ТСХ не было обнаружено. Структура спектрометрически полученных на эфиров MALDI-TOF подтверждалась масс-спектрометре (см. массглаву «Материалы и методы»). На масс-спектрах вышеуказанных алкиловых эфиров имелись высокоинтенсивные сигналы молекулярных ионов [M+H]+ с незначительной фрагментацией. На рисунке 13 приведена тонкослойная хроматограмма кинуренина (дорожка №1) и пропилового эфира кинуренина (дорожка №2). Процедуры проведения ТСХ и проявления хроматограмм описаны в главе «Материалы и методы». На хроматограмме видно, что выход пропилового эфира 78 кинуренина близок к количественному и составляет не менее 95% (дорожка №2). После проведения синтеза в реакционных смесях не было обнаружено пятен исходных метаболитов триптофана. Аналогичные результаты получали для других эфиров. На рисунках 14 – 16 приведены MALDI-TOF масс-спектры метилового, пропилового и изобутилового эфиров 3-гидроксикинуренина. На рисунках 17 и 18 приведены MALDI-TOF масс-спектры изобутиловых эфиров триптофана и кинуренина, соответственно. В таблице 7 приведены основные хроматографические (Rf) и массспектрометрические (значение m/z молекулярного иона) характеристики синтезированных эфиров метаболитов триптофана. Рисунок 13. Тонкослойная хроматограмма кинуренина (дорожка №1) и пропилового эфира кинуренина (дорожка №2) в системе этилацетат:пиридин: уксусная кислота:вода:эфир (5:5:1:3:4, v/v/v/v/v) после проявления хлором и крахмал иодидом. Факторы удерживания (Rf) кинуренина и пропилового эфира кинуренина (KYN-O-Pr) составляют 0.52 и 0.82, соответственно. 79 Рисунок 14. MALDI-TOF масс-спектр 3-гидроксикинуренина; [M+H]+=239.09. метилового эфира 80 Рисунок 15. MALDI-TOF масс-спектр 3-гидроксикинуренина, [M+H]+=267.198. пропилового эфира 81 Рисунок 16. MALDI-TOF масс-спектр 3-гидроксикинуренина, [M+H]+=281.147. изобутилового эфира 82 Рисунок 17. MALDI-TOF масс-спектр изобутилового эфира триптофана, [M+H]+= 261.178. 83 Рисунок 18. MALDI-TOF масс-спектр изобутилового эфира кинуренина, [M+H]+= 265.190. 84 Таблица 7. Основные хроматографические (Rf) и масс-спектрометрические (значение m/z молекулярного иона) характеристики синтезированных эфиров метаболитов триптофана. Rf* m/z молекулярного иона, [M+H]+ Триптофан (TRP) 0.58 - Ожидаемое m/z молекулярного иона, [M+H]+ - Кинуренин (KYN) 0.52 - - 3-гидроксикинуренин 0.51 - - TRP метиловый эфир 0.76 219.056 219.113 TRP пропиловый эфир 0.83 247.237 247.145 TRP изобутиловый эфир 0.85 261.178 261.160 KYN метиловый эфир 0.73 223.123 223.108 KYN пропиловый эфир 0.82 251.175 251.139 KYN изобутиловый эфир 0.87 265.190 265.155 3-HK метиловый эфир 0.7 239.090 239.103 3-НК пропиловый эфир 0.8 267.198 267.134 3-НК изобутиловый эфир 0.9 281.147 281.150 Вещество (3-HK) * Хроматографическая система – Этилацетат: Пиридин: Уксусная кислота: Вода: Диэтиловый эфир (5:5:1:3:4, по объемам) 3.6. MALDI-TOF масс-спетрометрическая детекция триптофана, кинуренина и 3-гидроксикинуренина в плазме крови Пробоподготовку и MALDI-TOF масс-спектрометрический анализ триптофана, кинуренина и 3-гидроксикинуренина в виде их изобутиловых эфиров проводили как описано в главе «Материалы и методы». На рисунке 19 приведен MALDI-TOF масс-спектр изобутиловых эфиров триптофана, кинуренина и 3-гидроксикинуренина в плазме крови 85 человека. На приведенном масс-спектре отчетливо видны высокоинтенсивные пики молекулярных ионов изобутиловых эфиров. Наличие пика молекулярного иона изобутилового эфира 3-гидроксикинуренина ([M+H]+=281.171) дополнительно свидетельствует о его стабильности в условиях анализа, что указывает на принципиальную возможность разработки метода его количественного определения массспектрометрическими методами, а также на высокую чувствительность анализа, учитывая объем анализируемого образца 0,5 мкл и наномолярные концентрации 3-гидроксикинуренина в плазме крови. Рисунок 19. MALDI-TOF масс-спектр изобутиловых эфиров триптофана (1, [M+H]+=261.231), кинуренина (2, [M+H]+=265.215) и 3-гидроксикинуренина (3, [M+H]+=281.171) в плазме крови человека (объем нанесения: эквивалент 0,5 мкл плазмы крови). 86 Полученные нами алкиловые эфиры могут быть анализированы не только с помощью MALDI-TOF масс-спектрометрии, (недостатками которой является дороговизна оборудования, а также сложность количественного определения), но также с помощью ВЭЖХ с масс-спкектрометрической детекцией. Так, в литературе описан ряд методов количественного определения аминокислот в виде алкиловых эфиров с помощью ВЭЖХ-МС [267,268]. Авторы отмечают высокую чувствительность масс- спектрометрического определения аминокислот в виде эфиров за счет повышения их сродства к протону и, соответственно, более эффективной ионизации, что позволяет использовать для анализа минимальный объем образца и делает эти методы перспективным для клинического скрининга, в том числе, скрининга новорожденных. Особенно стоит отметить опубликованный совсем недавно метод определения хинолиновой кислоты в сыворотке крови в виде ее дибутилового эфира с помощью ВЭЖХ-МС, обладающий очень высокой чувствительностью и требующей минимальное количество образца [269]. Стоит также упомянуть, что точность и воспроизводимость метода можно повысить за счет использования в качестве внутренних стандартов гомологичных эфиров соответствующих метаболитов триптофана ввиду их сходных физико-химических свойств. В связи с вышеизложенным, в наших дальнейших исследованиях предполагается применение данного подхода для разработки метода одновременного количественного определения 3-гидроксикинуренина, кинуренина и триптофана в плазме крови в виде их алкиловых эфиров с помощью ВЭЖХ с масс-спектрометрической детекцией. Таким образом, полученные нами алкиловые эфиры кинуренина, 3гидроксикинуренина и триптофана могут быть использованы для MALDITOF масс-спетрометрической детекции этих метаболитов, но также являются первым шагом в разработке нового метода их количественного определения в плазме крови с помощью ВЭЖХ-МС. 87 ВЫВОДЫ 1. Разработан новый метод количественного определения серотонина в тромбоцитах крови человека с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии с флуориметрической детекцией, пригодный для использования в клинической практике. Предел количественного определения Оптимизирован способ серотонина (LOQ) пробоподготовки, – 8,8 нг/мл. способствующий химической сохранности серотонина, а также обеспечивающий максимальную целостность тромбоцитов при осаждении, что предотвращает потерю серотонина для анализа, в связи с его выходом в плазму. 2. Разработанный метод количественного определения серотонина в тромбоцитах крови апробирован на группе здоровых добровольцев и группе пациентов с эндогенными депрессивными расстройствами. Средний уровень тромбоцитарного серотонина у пациентов составил 1,39±0,73 нмоль/109 тромбоцитов, что достоверно ниже среднего уровня тромбоцитарного серотонина у здоровых добровольцев, который составил 3,84±1,04 нмоль/109 тромбоцитов (p<0,001). 3. Разработан новый метод количественного определения кинуренина в плазме крови с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрической детекцией, пригодный для использования в клинической практике. Предел количественного определения кинуренина (LOQ) – 21,24 нг/мл. 4. Разработанный метод количественного определения кинуренина в плазме крови апробирован на группе пациентов с эндогенными депрессивными расстройствами. Средний уровень кинуренина в плазме крови пациентов составил 1.63±0.54 мкмоль/л. Выявлена гетерогенность группы по концентрации кинуренина в плазме крови; диапазон полученных значений: от 1,03 мкмоль/л до 3,10 мкмоль/л кинуренина. 88 5. Для повышения стабильности 3-гидроксикинуренина в образцах плазмы крови в условиях пробоподготовки и анализа был разработан подход, заключающийся в защите его карбоксильной группы путем получения алкиловых эфиров, которые были охарактеризованы тонкослойной хроматографией и MALDI-TOF масс-спектрометрией. Подтверждена их стабильность в условиях масс-спектрометрического анализа и показана принципиальная возможность детекции 3-гидроксикинуренина в виде его алкиловых эфиров в плазме крови человека. 6. Синтезированы и охарактеризованы алкиловые эфиры триптофана, кинуренина и 3-гидроксикинуренина, которые могут быть использованы для дальнейшей разработки метода одновременного количественного определения этих метаболитов в плазме крови методом ВЭЖХ с масс-спектрометрической детекцией. 7. Совокупность разработанных методов определения метаболитов триптофана составляет методическую основу для изучения нарушений метаболизма триптофана при эндогенных депрессивных расстройствах, а также при других психических и соматических заболеваниях. 89 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ TRP – триптофан KYN – кинуренин 3-HK – 3-гидроксикинуренин KYNA – кинуреновая кислота QUIN – хинолиновая кислота 5-HAA – 5-гидроксиантраниловая кислота ANA – антраниловая кислота XAN – ксантуреновая кислота 5-HTP – 5-гидрокситриптофан 5-HT – серотонин (5-гидрокситриптамин) 5-HIAA – 5-гидроксииндолуксусная кислота PIC – пиколиновая кислота NAD – никотинамидадениндинуклеотид IDO – индоламин 2,3-диоксигеназа TDO – триптофан 2,3-диоксигеназа KMO – кинуренин монооксигеназа KAT – кинуренин аминотрансфераза TH – триптофан гидроксилаза AADC – декарбоксилаза ароматических L-аминокислот HAAO – 3-гидроксиантранилат диоксигеназа MAO – моноаминоксидаза QPRT – хинолинат фосфорибозилтрансфераза ВЭЖХ – высокоэффективная жидкостная хроматография МС – масс-спектрометрия ВЭЖХ-МС – высокоэффективная жидкостная кроматография с массспектрометрическим детектированием ТСХ – тонкослойная хроматография MALDI – матрично-активированная лазерная десорбция/ионизация (matrix-assisted laser /ionisation) 90 TOF – время-пролетный масс-анализатор (time-of-flight) ПОТ – плазма крови, обогащенная тромбоцитами 91 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. ВОЗ. Доклад о состоянии здравоохранения в мире 2001. Психическое здоровье: новое понимание, новая надежда.World Health Organization. – 2001. – С.37-38. 2. Wittchen H.U., Uhmann S. The timing of depression: an epidemiological perspective // Medicographia. – 2010. – V. 32, № 2. – P. 115-124. 3. Blazer D.G. Mood disorders: epidemiology. In: Sadock B.J., Sadock V.A., editors. Comprehensive Textbook of Psychiatry, Seventh Edition.Philadelphia: Lippincott, Williams and Wilkins. – 2000. – P. 1298-1308. 4. Kessler R.C., Walters E.E., Forthofer M.S.The social consequences of psychiatric disorders, III: probability of marital stability // Am J Psychiatry. – 1998. – V. 155, № 8. – P. 1092-1096. 5. Bonaccorso S., Marino V., Biondi M., Grimaldi F., Ippoliti F., Maes M. Depression induced by treatment with interferon-alpha in patients affected by hepatitis C virus // J Affect Disord. – 2002. – Vol. 72, № 3. – P. 237-241. 6. Bonaccorso S., Marino V., Puzella A., Pasquini M., Biondi M., Artini M., Almerighi C., Verkerk R., Meltzer H., Maes M. Increased depressive ratings in patients with hepatitis C receiving interferon-alpha-based immunotherapy are related to interferon-alpha-induced changes in the serotonergic system // J Clin Psychopharmacol. – 2002. – Vol. 22, №1. – P. 86-90. 7. Schiepers O.J., Wichers M.C., Maes M. Cytokines and major depression // Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry. – 2005. – V. 29, № 2. – P. 201-217. 8. Thomas A.J., Davis S., Morris C. et al. Increase in interleukin-1beta in late-life depression // Am J Psychiatry. – 2005. – V. 162, № 1. – P. 175177. 92 9. Raison C.L., Miller A.H. Is depression an inflammatory disorder? // Curr. Psychiatry Rep. – 2011. – V. 13, № 6. – P. 467-475. 10. McKinnon M.C., Yucel K., Nazarov A., MacQueen G.M. A metaanalysis examining clinical predictors of hippocampal volume in patients with major depressive disorder // J Psychiatry Neurosci. – 2009. – V. 34, № 1. – P. 41-54. 11. Savitz J., Drevets W.C., Smith C.M., Victor T.A., Wurfel B.E., Bellgowan P.S., Bodurka J., Teague T.K., Dantzer R. Putative Neuroprotective and Neurotoxic Kynurenine Pathway Metabolites Are Associated with Hippocampal and Amygdalar Volumes in Subjects with Major Depressive Disorder // Neuropsychopharmacology. – 2014. – Jul 30. [Epub ahead of print] 12.Pletscher A., Laubscher A. Blood platelets as models for neurons: uses and limitations // Journal of Neural Transmission. – 1980. – V. 16. – P. 7-16. 13. Audhya T., Adams J.B., Johansen L. Correlation of serotonin levels in CSF, platelets, plasma, and urine // Biochim Biophys Acta. – 2012. – Vol. 1820, № 10. – P. 1496-1501. 14.Quintana J. Platelet serotonin and plasma tryptophan decreases in endogenous depression. Clinical, therapeutic, and biological correlations // J Affect Disord. – 1992. – V. 24, № 2. – P. 55-62. 15.Muck-Seler D., Pivac N., Mustapic M., Crncevic Z., Jakovljevic M., Sagud M. Platelet serotonin and plasma prolactin and cortisol in healthy, depressed and schizophrenic women // Psychiatry Res. – 2004. – V. 127, № 3. – P. 217-226. 16.Ruljancic N., Mihanovic M., Cepelak I. Thrombocyte serotonin and serum cholesterol concentration in suicidal and non-suicidal depressed patients // Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry. – 2011. – V. 35, № 5. – P. 1261-1267. 93 17.Castrogiovanni P., Blardi P., De Lalla A., Dell'Erba A., Auteri A. Can serotonin and fluoxetine levels in plasma and platelets predict clinical response in depression? // Psychopharmacol Bull. – 2003. – Vol. 37, № 2. – P. 102-108. 18.Maurer-Spurej E., Pittendreigh C., Misri S. Platelet serotonin levels support depression scores for women with postpartum depression // J Psychiatry Neurosci. – 2007. – V. 32, № 1. – P. 23-29. 19.Orlikov A.B., Prakhye I.B., Ryzhov I.V. Kynurenine in blood plasma and DST in patients with endogenous anxiety and endogenous depression // Biol Psychiatry. – 1994. – V. 36, № 2. – P. 97-102. 20. Sublette M.E., Galfalvy H.C., Fuchs D., Lapidus M., Grunebaum M.F., Oquendo M.A., Mann J.J., Postolache T.T. Plasma kynurenine levels are elevated in suicide attempters with major depressive disorder // Brain Behav Immun. – 2011. – V. 25, № 6. – P. 1272-1278. 21.Maes M., Leonard B.E., Myint A.M. et al. The new '5-HT' hypothesis of depression: cell-mediated immune activation induces indoleamine 2,3dioxygenase, which leads to lower plasma tryptophan and an increased synthesis of detrimental tryptophan catabolites (TRYCATs), both of which contribute to the onset of depression // Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry. – 2011. – V. 35, № 3. – P. 702– 721. 22.Zhu H., Bogdanov M.B., Boyle S.H., Matson W., Sharma S., Matson S., Churchill E., Fiehn O., Rush J.A., Krishnan R.R.,Pickering E., Delnomdedieu M., Kaddurah-Daouk R. Pharmacometabolomics of response to sertraline and to placebo in major depressive disorder – possible role for methoxyindole pathway // PLoS One. – 2013. – V. 8, № 7. – e68283. 23.Eynard N., Flachaire E., Lestra C. et al. Platelet serotonin content and free and total plasma tryptophan in healthy volunteers during 24 hours // Clin Chem. – 1993. – Vol. 39, № 11. – P. 2337-2340. 94 24.Mangoni A. The “kynurenine shunt” and depression // Adv Biochem Psychopharmacol. – 1974. – V. 11, № 0. – P. 293-298. 25. Russo S., Kema I.P., Fokkema M.R., Boon J.C., Willemse P.H., de Vries E.G., den Boer J.A., Korf J. Tryptophan as a link between psychopathology and somatic states // Psychosom Med. – 2003. – V. 65, № 4. – P. 665-671. 26.Досон Р., Эллиот Д., Эллиот У., Джонс К. Справочник биохимика: Пер. с англ. – М.: Мир. – 1991. – C. 544. 27.Sherin P.S., Grilj J., Tsentalovich Y.P., Vauthey E. Ultrafast excited-state dynamics of kynurenine, a UV filter of the human eye // J Phys Chem B. – 2009. – V. 113, № 14. – P. 4953-4962. 28.Jellinek H.H.G., Urwin J.R. Ultraviolet Absorption Spectra and Dissociation Constants of Picolinic, Isonicotinic Acids and their Amides // J Phys Chem. – 1954. – V. 58, № 7. – P. 548 – 550. 29.Rapport M.M., Green A.A., Page I.H. Serum vasoconstrictor, serotonin; isolation and characterization // J Biol Chem. – 1948. – V. 176, № 3. – P. 1243–1251. 30.Erspamer V., Asero B. Identification of enteramine, the specific hormone of the enterochromaffin cell system, as 5-hydroxytryptamine // Nature. – 1952. – Vol. 169, № 4306. – P. 800-801. 31.Twarog B.M., Page I.H. Serotonin content of some mammalian tissues and urine and a method for its determination // Am J Physiol. – 1953. – V. 175, № 1. – P. 157–161. 32.Gershon M.D., Tack J. The serotonin signaling system: from basic understanding to drug development for functional GI disorders // Gastroenterology. – 2007. – Vol. 132, № 1. – P. 397-414. 33.Eqqers A.E. A serotonin hypothesis of schizophrenia // Med Hypotheses. – 2013. – Vol. 80, № 6. – P. 791-794. 95 34.Anderson G.M. Genetics of Childhood Disorders: XLV. Autism, Part 4: Serotonin in Autism // J. Am Child Adolesc Psychiatry. – 2002. – V. 41, № 12. – P. 1513-1516. 35.Mulder E.J., Anderson G.M., Kema I.P., et al. Platelet serotonin levels in pervasive developmental disorders and mental retardation: diagnostic group differences, within-group distribution, and behavioral correlates // J Am Acad Child Adolesc Psychiatry. – 2004. – V. 43, № 4. – P. 491-499. 36.Rodríguez J.J., Noristani H.N., Verkhratsky A. The serotonergic system in ageing and Alzheimer’s disease // Progress in Neurobiology. – 2012. – V. 99, № 1. – P. 15-41. 37.Rylander D. The serotonin system: a potential target for anti-dyskinetic treatment and biomarker discovery // Parkinsonism and Related Disorders. – 2012. – Suppl 1. – P. S126-S128. 38.Dupuis L., Spreux-Varoquaux O., Bensimon G. et al. Platelet serotonin level predicts survival in amyotrophic lateral sclerosis // PLoS One. – 2010. – Vol. 5, № 10. – e13346. 39.Hamon M., Glowinski J. Regulation of serotonin synthesis // Life Science. – 1974. – Vol. 15, № 9. – P. 1533-1548. 40.Culley W.J., Saunders R.N., Mertz E.T., Jolly D.H. Effect of a tryptophan deficient diet on brain serotonin and plasma tryptophan level // Proc Soc Exp Biol Med. – 1963. – Vol. 113. – P. 645-648. 41.Moir A.T. Interaction in the cerebral metabolism of the biogenic amines: effect of intravenous infusion of L-tryptophan on the metabolism of dopamine and 5-hydroxyindoles in brain and cerebrospinal fluid // Br J Pharmacol. – 1971. – V. 43, № 4. – P. 715-723. 42.Горкин В.З. Аминоксидазы и их значение в медицине / В.З. Горкин – М.: Медицина, 1981 – 336 с. 43.Kopin I.J. Catecholamine metabolism: basic aspects and clinical significance // Pharmacol Rev. – 1985. – V. 37, № 4. – P. 333-364. 96 44.Медведев А.Е., Иванов А.С., Веселовский А. В. Одна аминокислота не может определять различие каталитических и регуляторных свойств митохондриальных моноаминоксидаз А и Б // Биохимия. – 2001. – Т.66, № 5. – С. 581 – 583. 45.Erwin V.G., Deitrich R.A. Brain aldehyde dehydrogenase. Localization, purification, and properties // J Biol Chem. – 1966. – Vol. 241, № 15. – P. 3533-3539. 46.Davis V.E., Brown H., Huff J.A., Cashaw J.L. The alteration of serotonin metabolism to 5-hydroxytryptophol by ethanol ingestion in man // J Lab Clin Med. – 1967. – Vol. 69, № 1. – P. 132-140. 47.Helander A., Beck O., Borg S. Determination of urinary 5hydroxytryptophol by high-performance liquid chromatography with electrochemical detection // J Chromatogr. – 1992. – Vol. 579, № 2. – P. 340-345. 48.Beck O., Helander A. 5-hydroxytryptophol as a marker for recent alcohol intake // Addiction. – 2003. – Vol. 98 (suppl 2). – P. 63-72. 49.Snow P.J., Lennard-Jones J.E., Curzon G., Stacey R.S. Humoral effect of metastasising carcinoid tumors // Lancet. – 1955. – V. 269, № 6898. – P. 1004-1009. 50.McIsaac W.M., Page I.H. New metabolites of serotonin in carcinoid urine // Science. – 1958. – V. 128, № 3323. – P. 537. 51.Davis V.E., Huff J.A., Brown H. Free and conjugated serotonin excretion in carcinoid syndrome // J Lab Clin Med. – 1965. – Vol. 66, № 3. – P. 390-402. 52.Airaksinen M.M. Studies of the metabolism and antidiuretic action of 5hydroxytryptamine and the effect of the mode of administration // Ann Med Exp Biol Fenn. – 1963. – Vol. 41(suppl 4). – P. 1-91. 53.Kema I.P., Schellings AM, Meiborg G, Hoppenbrouwers CJ, Muskiet FA. Influence of a serotonin- and dopamine-rich diet on platelet serotonin 97 content and urinary excretion of biogenic amines and their metabolites // Clin Chem. – 1992. – V. 38, № 9. – P. 1730-1736. 54.Minneman K.P., Wurtman R.J. The pharmacology of the pineal gland // Annu Rev Pharmacol Toxicol. – 1976. – V. 16. – P. 33-51. 55.Shaw K.M. The pineal gland: a review of the biochemistry, physiology and pharmacological potential of melatonin and other pineal substances // Adv Drug Res. – 1977. – V.11. – P. 75-96. 56.Khaleghipour S., Masjedi M., Ahade H., Enayate M., Pasha G., Nadery F., Ahmadzade G. Morning and nocturnal serum melatonin rhythm levels in patients with major depressive disorder: an analytical crosssectional study // Sao Paulo Med J. – 2012. – V. 130, № 3. – P. 167172. 57.Li J.Z., Bunney B.G., Meng F., Hagenauer M.H., Walsh D.M., et al.Circadian patterns of gene expression in the human brain and disruption in major depressive disorder // Proc Natl Acad Sci U S A. – 2013. – V. 110, № 24. – P. 9950-9955. 58.Klein D.C., Weller J.L. Indole metabolism in the pineal gland: a circadian rhythm in N-acetyltransferase // Science. – 1970. – V. 169, № 3950. – P. 1093-1095. 59.Axelrod J., Weissbach H. Purification and properties of hydroxyindoleO-methyl transferase // J Biol Chem. – 1961. – Vol 236. – P.211-213. 60.Farthing M.J. 5-Hydroxytryptamine and 5-hydroxytryptamine-3 receptor antagonists // Scand J Gastroenterol Suppl. – 1991. – Vol. 188. – P. 92100. 61.Tamir H., Payette R.F., Huang Y.L., Liu K.P., Gershon M.D. Human serotonectin: a blood glycoprotein that binds serotonin and is associated with platelets and white blood cells // J Cell Sci. – 1985. – V. 73. – P. 187-206. 98 62.Hourani S.M., Cusack N.J. Pharmacological receptors on blood platelets // Pharmacol Rev. – 1991. – Vol. 43, № 3. – P. 243-298. 63.Kema I.P., de Vries E.G., Schellings A.M., Postmus P.E., Muskiet F.A. Improved diagnosis of carcinoid tumors by measurement of platelet serotonin // Clin Chem. – 1992. – V. 38, № 4. – P. 534-540. 64.Crawford N. Serotonin absorption by normal and "carcinoid" platelets // Clin Chim Acta. – 1967. – Vol. 18, № 2. – P. 297-307. 65.Thomas D.P., Vane J.R. 5-hydroxytryptamine in the circulation of the dog // Nature. – 1967. – V. 216, № 5113. – P. 335-338. 66.Gillis C.N., in: VanHoutte P.M. (Ed.). Serotonin and the cardiovascular system. Raven Press, New York. – 1985. – P. 199 67.Kirillova V.V., Nigmatullina R.R., Dzhordzhikiya R.K., Kudrin V.S., Klodt P.M. Increased concentrations of serotonin and 5- hydroxyindoleacetic acid in blood plasma from patients with pulmonary hypertension due to mitral valve disease // Bull Exp Biol Med. – 2009. – V. 147, № 4. – P. 408-410. 68.Brand T., Anderson G.M. The measurement of platelet-poor plasma serotonin: a systematic review of prior reports and recommendations for improved analysis // Clin Chem. – 2011. – Vol. 57, № 10. – P. 1376-1386. 69.Sebekova K., Spustova V., Opatrny K. J., Dzurik R. Serotonin and 5hydroxyindole-acetic acid // Bratisl Lek Listy. – 2001. – V. 102, № 8. – P. 351-356. 70.López-Muñoz F., Alamo C. Monoaminergic neurotransmission: the history of the discovery of antidepressants from 1950s until today // Curr Pharm Des. – 2009. – V. 15, № 14. – P. 1563-1586. 71.Schildkraut J.J. The catecholamine hypothesis of affective disorders: a review of supporting evidence // Am J Psychiatry. – 1965. – V. 122, № 5. – P. 509-522. 99 72.Udenfriend S., Weissbach H., Bogdanski D.F. Increase in tissue serotonin following administration of its precursor 5-hydroxytryptophan // J Biol Chem. – 1957. – V. 224, № 2. – P. 803-810. 73.Persson T., Roos B.E. 5-hydroxytryptophan for depression // Lancet. – 1967. – V. 2, № 7523. – P. 987-988. 74.Millan M.J., Gobert A., Lejeune F., Newman-Tancredi A., Rivet J.M., Auclair A., Peglion J.L. S33005, a novel ligand at both serotonin and norepinephrine transporters: I. Receptor binding, electrophysiological, and neurochemical profile in comparison with venlafaxine, reboxetine, citalopram, and clomipramine // J Pharmacol Exp Ther. – 2001. – V. 298, № 2. – P. 565-580. 75.Coppen A. The biochemistry of affective disorders // Br J Psychiatry. – 1967. – Vol. 113, № 504. – P. 1237–1264. 76.Lapin I.P., Oxenkrug G.F. Intensification of the central serotoninergic processes as a possible determinant of the thymoleptic effect // Lancet. – 1969. – V. 1, № 7586. – P. 132-136. 77.Mendels J., Stinnett J.L., Burns D., Frazer A. Amine precursors and depression // Arch Gen Psychiatry. – 1975. – V. 32, № 1. – P. 22-30. 78.Siever L.J., Murphy D.L., Slater S., de la Vega E., Lipper S. Plasma prolactin changes following fenfluramine in depressed patients compared to controls: an evaluation of central serotonergic responsivity in depression // Life Sci. – 1984. – V. 34, № 11. – P. 1029-1039. 79.Lichtenberg P., Shapira B., Gillon D., Kindler S., Cooper T.B., Newman M.E., Lerer B. Hormone responses to fenfluramine and placebo challenge in endogenous depression // Psychiatry Res. – 1992. – V. 43, № 2. – P. 137-146. 80.O'Keane V., Dinan T.G. Prolactin and cortisol responses to dfenfluramine in major depression: evidence for diminished responsivity of central serotonergic function // Am J Psychiatry. – 1991. – V. 148, № 8. – P. 1009-1015. 100 81.Mann J.J., McBride P.A., Malone K.M., DeMeo M., Keilp J. Blunted serotonergic responsivity in depressed inpatients // Neuropsychopharmacology. – 1995. – V. 13, № 1. – P. 53-64. 82.Emiliano A.B., Fudge J.L. From galactorrhea to osteopenia: rethinking serotonin-prolactin interactions // Neuropsychopharmacology. – 2004. – Vol. 29, № 5. – P. 833-846. 83.Miller H.L., Delgado P.L., Salomon R.M., Licinio J., Barr L.C., Charney D.S. Acute tryptophan depletion: a method of studying antidepressant action // J Clin Psychiatry. – 1992. – V. 53. – Suppl: 28-35. 84.Birdsall TC. 5-Hydroxytryptophan: a clinically-effective serotonin precursor // Altern Med Rev. – 1998. – Vol. 3, № 4. – P.271-280. 85.Turner E.H., Blackwell A.D. 5-Hydroxytryptophan plus SSRIs for interferon-induced depression: synergistic mechanisms for normalizing synaptic serotonin // Med Hypotheses. – 2005. – V. 65, № 1. – P. 138144. 86.Turner E.H., Loftis J.M., Blackwell A.D. Serotonin a la carte: supplementation with the serotonin precursor 5-hydroxytryptophan // Pharmacol Ther. – 2006. – V. 109, № 3. – P. 325-338. 87.Lynn-Bullock C.P., Welshhans K., Pallas S.L., Katz PS. The effect of oral 5-HTP administration on 5-HTP and 5-HT immunoreactivity in monoaminergic brain regions of rats // J Chem Neuroanat. – 2004. – V. 27, № 2. – P. 129-138. 88.Roy A., De Jong J., Linnoila M. Cerebrospinal fluid monoamine metabolites and suicidal behavior in depressed patients. A 5-year followup study // Arch Gen Psychiatry. – 1989. – V. 46, № 7. – P. 609-612. 89.Serretti A., Kato M., De Ronchi D., Kinoshita T. Meta-analysis of serotonin transporter gene promoter polymorphism (5-HTTLPR) association with selective serotonin reuptake inhibitor efficacy in depressed patients // Mol Psychiatry. – 2007. – V. 12, № 3. – P. 247-257. 101 90.Caspi A., Sugden K., Moffitt T.E., Taylor A., Craig I.W., Harrington H., McClay J., Mill J., Martin J., Braithwaite A., Poulton R. Influence of life stress on depression: moderation by a polymorphism in the 5-HTT gene // Science. – 2003. – Vol. 301, № 5631. – P. 386-389. 91.McMahon F.J., Buervenich S., Charney D., Lipsky R., Rush A.J. et al. Variation in the gene encoding the serotonin 2A receptor is associated with outcome of antidepressant treatment // Am J Hum Genet. – 2006. – V. 78, № 5. – P. 804-814. 92.Khan A., Leventhal R.M., Khan S.R., Brown W.A. Severity of depression and response to antidepressants and placebo: an analysis of the Food and Drug Administration database // J Clin Psychopharmacol. – 2002. – V. 22, № 1. – P. 40-45. 93.Kirsch I., Deacon B.J., Huedo-Medina T.B., Scoboria A., Moore T.J., Johnson B.T. Initial severity and antidepressant benefits: a meta-analysis of data submitted to the Food and Drug Administration // PLoS Med. – 2008. – V. 5, № 2: e45. 94.Papakostas G.I., Fan H., Tedeschini E. Severe and anxious depression: combining definitions of clinical sub-types to identify patients differentially responsive to selective serotonin reuptake inhibitors // Eur Neuropsychopharmacol. – 2012. – V. 22, № 5. – P. 347-355. 95.Chen L., Eaton W.W., Gallo J.J., Nestadt G. Understanding the heterogeneity of depression through the triad of symptoms, course and risk factors: a longitudinal, population-based study // J Affect Disord. – 2000. – Vol. 59, № 1. – P. 1-11. 96.Скворцова В.И., Петрова Е.А., Брусов О.С., Савина М.А., Шаклунова Н.В., Клюшник Т.П., Георгиевская Н.А., Фактор М.И. Патогенетические особенности развития постинсультных аффективных расстройств // Журнал Неврологии и Психиатрии. – 2010. – Т. 110, № 7. – P. 35-40 102 97.Burns A., Jacoby R., Levy R. Psychiatric phenomena in Alzheimer's disease. III: Disorders of mood // Br J Psychiatry. – 1990. – Vol. 157, № 81-86. – P. 92-94. 98.Veazey C., Aki S.O., Cook K.F., Lai E.C., Kunik M.E. Prevalence and treatment of depression in Parkinson's disease // J Neuropsychiatry Clin Neurosci. – 2005. – V. 17, № 3. – P. 310-323. 99.Wall C.A., Rummans T.A., Aksamit A.J., Krahn L.E., Pankratz V.S. Psychiatric manifestations of Creutzfeldt-Jakob disease: a 25-year analysis // J Neuropsychiatry Clin Neurosci. – 2005. – V. 17, № 4. – P. 489-495. 100. Krystal A., Krishnan K.R., Raitiere M., Poland R., Ritchie J.C., Dunnick N.R., Hanada K., Nemeroff C.B. Differential diagnosis and pathophysiology of Cushing's syndrome and primary affective disorder // J Neuropsychiatry Clin Neurosci. – 1990. – V. 2, № 1. – P. 34-43. 101. Dieperink E., Willenbring M., Ho S.B. Neuropsychiatric symptoms associated with hepatitis C and interferon alpha: a review // Am J Psychiatry. – 2000. – Vol. 157, № 6. – P. 867-876. 102. Kendler K.S., Karkowski L.M., Prescott C.A. Causal relationship between stressful life events and the onset of major depression // Am J Psychiatry. – 1999. – V. 156, № 6. – P. 837-841. 103. Kendler K.S., Kuhn J., Prescott C.A. The interrelationship of neuroticism, sex, and stressful life events in the prediction of episodes of major depression // Am J Psychiatry. – 2004. – V. 161, № 4. – P. 631636. 104. Meltzer H., Bebbington P., Brugha T., Jenkins R., McManus S., Stansfeld S. Job insecurity, socio-economic circumstances and depression // Psychol Med. – 2010. – V. 40, № 8. – P. 1401-1407. 105. Levinson D.F. The genetics of depression: a review // Biol Psychiatry. – 2006. – V. 60, № 2. – P. 84-92. 103 106. Pletscher A., Laubscher A. Blood platelets as models for neurons: uses and limitations // Journal of Neural Transmission. – 1980. – V. 16. – P. 7-16. 107. Anderson G.M., Feibel F.C., Wetlaufer L.A., Schlicht K.R., Ort S.M., Cohen D.J. Effect of a meal on human whole blood serotonin // Gastroenterology. – 1985. – Vol. 88, №1 (Pt 1). – P. 86-89. 108. Jernej B., Banović M., Cicin-Sain L., Hranilović D., Balija M., Oresković D., Folnegović-Smalc V.Physiological characteristics of platelet/circulatory serotonin: study on a large human population // Psychiatry Res. – 2000. – V. 94, № 2. – P.153-162. 109. Schäfer A., Scheurlen M., Seufert J., Keicher C., Weissbrich B., Rieger P., Kraus M.R. Platelet serotonin (5-HT) levels in interferontreated patients with hepatitis C and its possible association with interferon-induced depression // J Hepatol. – 2010. – V. 52, № 1. – P. 1015. 110. Sagud M., Pivac N., Mustapic M., Nedic G., Peles A.M., Kramaric M., Jakovljevic M., Muck-Seler D. The effect of lamotrigine on platelet serotonin concentration in patients with bipolar depression // Psychopharmacology (Berl). – 2008. – V. 197, № 4. – P. 683-685. 111. Blardi P., De Lalla A., Leo A., Auteri A., Iapichino S., Di Muro A., Dell'Erba A., Castrogiovanni P. Serotonin and fluoxetine levels in plasma and platelets after fluoxetine treatment in depressive patients // J Clin Psychopharmacol. – 2002. – Vol. 22, № 2. – P. 131-136. 112. Blardi P., de Lalla A., Urso R., Auteri A., Dell'Erba A., Bossini L., Castrogiovanni P. Activity of citalopram on adenosine and serotonin circulating levels in depressed patients // J Clin Psychopharmacol. – 2005. – Vol. 25, № 3. – P. 262-266. 113. Maurer-Spurej E., Pittendreigh C., Solomons K. The influence of selective serotonin reuptake inhibitors on human platelet serotonin // Thromb Haemost. – 2004. – V. 91, № 1. – P. 119-128. 104 114. Marcinko D., Pivac N., Martinac M., Jakovljević M., Mihaljević-Peles A., Muck-Seler D. Platelet serotonin and serum cholesterol concentrations in suicidal and non-suicidal male patients with a first episode of psychosis // Psychiatry Res. – 2007. – V. 150, № 1. – P. 105108. 115. Kovacic Z., Henigsberg N., Pivac N., Nedic G., Borovecki A. Platelet serotonin concentration and suicidal behavior in combat related posttraumatic stress disorder // Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry. – 2008. – V. 32, № 2. – P. 544-551. 116. Watanabe Y., Fujiwara M., Yoshida R. et al. Stereospecificity of hepatic L-tryptophan 2,3-dioxygenase // Biochem J. – 1980. – V. 189, № 3. – P. 393-405. 117. Leklem J.E. Quantitative aspects of tryptophan metabolism in humans and other species: a review // Am J Clin Nutr. – 1971. – V. 24, № 6. – P. 659-672. 118. Hayaishi O., S. Rothberg, A. H. Mehler, and Y. Saito, Studies on oxygenases; enzymatic formation of kynurenine from tryptophan // The Journal of Biological Chemistry. – 1957. – Vol. 229, № 2. – P. 889–896. 119. Hayaishi O. Properties and function of indoleamine 2,3-dioxygenase // Journal of Biochemistry. – 1976. – Vol. 79, № 4. – P. 13-21. 120. Hirata F., Hayaishi O. Possible participation of superoxide anion in the intestinal tryptophan 2,3-dioxygenase reaction // The Journal of Biological Chemistry. – 1971. – Vol. 246, № 24. – P. 7825–7826. 121. Han Q., Cai T., Tagle D.A. et al. Structure, expression, and function of kynurenine aminotransferases in human and rodent brains // Cell Mol Life Sci. – 2010. – Vol. 67, № 3. – P. 353-368 122. Stone T.W. Neuropharmacology of quinolinic and kynurenic acids // Pharmacol Rev. – 1993. – V. 45, № 3. – P. 309-379. 105 123. Belenky P., Bogdan K.L., Brenner C. NAD+ metabolism in health and disease // Trends Biochem Sci. – 2007. – Vol. 32, № 1. – P. 12-19. 124. Grant R.S, Coggan S.E., Smythe G.A. The physiological action of picolinic acid in the human brair // Int J Tryptophan Res. – 2009. – Vol. 2. – P. 71-79. 125. Fukui S., Schwarcz R., Rapoport S.I., Takada Y., Smith Q.R. Bloodbrain barrier transport of kynurenines: implication for brain synthesis and metabolism // J Neurochem. – 1991. – Vol. 56, № 6. – P. 2007-2017. 126. Gal E.M., Sherman A.D. L-kynurenine: its synthesis and possible regulatory function in brain // Neurochem Res. – 1980. – Vol. 5, № 3. – P. 223-239. 127. Miller C.L., Llenos I.C., Dulay J.R. et al. Expression of the kynurenine pathway enzyme tryptophan 2,3-dioxygenase is increased in the frontal cortex of individuals with schizophrenia // Neurobiol Dis. – 2004. – V. 15, № 3. – P. 618-629. 128. Grant R.S, Naif H., Espinosa M. et al. IDO induction in IFN-gamma activated astroglia: a role in improving cell viability during oxidative stress // Redox Rep. – 2000. Vol. 5, № 2-3. – P. 101-104. 129. Guillemin G.J., Smythe G.A., Takikawa O. et al. Expression of indoleamine 2,3 - dioxygenase and production of quinolinic acid by human microglia, astrocytes, and neurons // Glia. – 2005. – Vol. 49, № 1. – P. 15-23. 130. Guillemin G.J., Kerr S.J., Smythe G.A. et al. Kinurenine pathway metabolism in human astrocytes: a paradox for neuronal protection // J Neurochem. – 2001. – Vol. 78, № 4. – P. 842-853. 131. Журавлев А. В. Молекулярные механизмы действия метаболитов кинуренинового пути обмена триптофана на глютаматергическую и холинергическую системы нейротрансмиссии у мутантов дрозофилы: автореф. дис. … канд. биол. наук: 03.03.01, 03.02.07 / Журавлев Александр Владимирович. – СПб., 2012. – 20 c. 106 132. Журавлев А.В., Захаров Г.А., Саввафтеева-Попова Е.В. Молекулярные механизмы действия метаболитов кинуренинового пути обмена триптофана холинергическую системы на глютаматергическую нейротрансмиссии у и мутантов дрозофилы // Материалы съезда. – VII Сибирский съезд физиологов. – 2012. – C. 182-183. 133. Guillemin G.J. Quinolinic acid, the inescapable neurotoxin // FEBS. – 2012. – Vol. 279, № 8. – P. 1356-1365. 134. Perkins M.N., Stone T.W. An iontophoretic investigation of the actions of convulsant kynurenines and their interaction with the endogenous excitant quinolinic acid // Brain Res. – 1982. – V. 247, № 1. – P. 184-187. 135. Kim J.P., Choi D.W. Quinolinate neurotoxicity in cortical cell culture // Neuroscience. – 1987. – V. 23, № 2. – P. 423-432. 136. Wu H.Q., Rassoulpour A., Schwarcz R. Kynurenic acid leads, dopamine follows: a new case of volume transmission in the brain? // J Neural Transm. – 2007. – V. 114, № 1. – P. 33-41. 137. Okuno A., Fukuwatari T., Shibata K. High tryptophan diet reduces extracellular dopamine release via kynurenic acid production in rat striatum // J Neurochem. – 2011. – V. 118, № 5. – P. 796-805. 138. Olney J.W., Labruyere J., Wang G. et al. NMDA antagonist neurotoxicity: mechanism and prevention // Science. – 1991. – V. 254, № 5037. – P. 1515-1518. 139. Hilmas C., Pereira E.F., Alkondon M. et al. The brain metabolite kynurenic acid inhibits alpha7 nicotinic receptor activity and increases non-alpha7 nicotinic receptor expression: physiopathological implications // J Neurosci. – 2001. – Vol. 21, № 19. – P. 7463-7473. 140. Eastman C.L., Guilarte T.R. Cytotoxicity of 3-hydroxykynurenine in a neuronal hybrid cell line // Brain Res. – 1989. – Vol. 495. – P. 225–231. 107 141. Chiarugi A., Meli E., Moroni F. Similarities and differences in the neuronal death processes activated by 3OH-kynurenine and quinolinic acid // J Neurochem. – 2001 – Vol. 77, №5. – P. 1310–1318. 142. Okuda S., Nishiyama N., Saito H. et al. 3-Hydroxykynurenine, an endogenous oxidative stress generator, causes neuronal cell death with apoptotic features and region selectivity // J Neurochem. – 1998. – V. 70, № 1. – P. 299-307. 143. Goldstein L.E., Leopold M.C., Huang X. et al. 3-Hydroxykynurenine and 3-hydroxyanthranilic acid generate hydrogen peroxide and promote α-crystallin cross-linking by metal ion reduction // Biochemistry. – 2000. – Vol. 39. – P. 7266–7275. 144. Guidetti P., Schwarcz R. 3-Hydroxykynurenine potentiates quinolinate but not NMDA toxicity in the rat striatum // Eur J Neurosci. – 1999. – Vol. 11. – P. 3857–3863. 145. Christen S., Peterhans E., Stocker R. Antioxidant activities of some tryptophan metabolites: possible implication for inflammatory diseases // Proc. Natl Acad. Sci. USA. – 1990. – Vol. 87, №7. – P. 2506–2510. 146. Mellor A.L., Munn D.H. Tryptophan catabolism and T-cell tolerance: immunosuppression by starvation? // Immunol Today. – 1999. – V. 20, № 10. – P. 469-473. 147. Moffett J.R., Blinder K.L., Venkateshan C.N. et al. Differential effects of kynurenine and tryptophan treatment on quinolinate immunoreactivity in rat lymphoid and non-lymphoid organs // Cell Tissue Res. – 1998. – V. 293, № 3. – P. 525-534. 148. Moffett J.R., Namboodiri M.A. Tryptophan and the immune response // Immunol Cell Biol. – 2003. – V. 81, № 4. – P. 247-265. 149. Carlin J.M., Borden E.C., Sondel P.M. et al. Biologic-responsemodifier-induced indoleamine 2,3-dioxygenase activity in human peripheral blood mononuclear cell cultures // J Immunol. – 1987. – Vol. 139, № 7. – P. 2414-2418. 108 150. Yasui H., Takai K., Yoshida R. et al. Interferon enhances tryptophan metabolism by inducing pulmonary indoleamine 2,3-dioxygenase: its possible occurrence in cancer patients // Proc Natl Acad Sci USA. – 1986. – V. 83, № 17. – P. 6622-6626. 151. Musso T., Gusella G.L., Brooks A. et al. Interleukin-4 inhibits indoleamine 2, 3-dioxygenase expression in human monocytes // Blood. – 1994. – V. 83, № 5. – P. 1408-1411. 152. Salter M., Pogson C.I. The role of tryptophan 2,3-dioxygenase in the hormonal control of tryptophan metabolism in isolated rat liver cells. Effects of glucocorticoids and experimental diabetes // Biochem J. – 1985. – V. 229, № 2. – P. 499-504. 153. Kotake Y., Ueda T., Mori T. et al. Abnormal tryptophan metabolism and experimental diabetes by xanthurenic acid (XA) // Acta Vitaminol Enzymol. – 1975. – V. 29, № 1-6. – P. 236-239. 154. Murakami E., Kotake Y. Studies on the xanthurenic acid-insulin complex. 3. Distribution of xanthurenic acid and formation ofxanthurenic acid-insulin complex in serum // J Biochem. – 1972. – V. 72, № 2. – P. 251-259. 155. Chiarugi A., Calvani M., Meli E. et al. Synthesis and release of neurotoxic kynurenine metabolites by human monocyte-derived macrophages // J Neuroimmunol. – 2001. – Vol. 120, № 1-2. – P. 190198. 156. Pertz H., Back W. Synthesis and resolution of chiral ring-opened serotonin analogs of the 5-hydroxykynuramine type // Pharm Acta Helv. – 1988. – V. 63, № 4-5. – P. 128-131. 157. Capuron L., Neurauter G., Musselman D.L., Lawson D.H., Nemeroff C.B., Fuchs D., Miller A.H. Interferon-alpha-induced changes in tryptophan metabolism. Relationship to depression and paroxetine treatment // Biol Psychiatry. – 2003. – Vol. 54, № 9. – P. 906-914. 109 158. Comai S., Cavalletto L., Chemello L., Bernardinello E., Ragazzi E., Costa C.V., Bertazzo A. Effects of PEG-interferon alpha plus ribavirin on tryptophan metabolism in patients with chronic hepatitis C // Pharmacol Res. – 2011. – Vol. 63, № 1. – P. 85-92. 159. Kurz K., Schroecksnadel S., Weiss G., Fuchs D. Association between increased tryptophan degradation and depression in cancer patients // Curr Opin Clin Nutr Metab Care. – 2011. – V. 14, № 1. – P. 49-56. 160. Eisenberger N.I., Inagaki T.K., Mashal N.M., Irwin M.R. Inflammation and social experience: an inflammatory challenge induces feelings of social disconnection in addition to depressed mood // Brain Behav Immun. – 2010. – Vol. 24, № 4. – P. 558-563. 161. Myint A.M., Kim Y.K. Cytokine-serotonin interaction through IDO: a neurodegeneration hypothesis of depression // Med Hypotheses. – 2003. – V. 61, № 5-6. – P. 519-525. 162. Appel E., Kolman O., Kazimirsky G., et al. Regulation of GDNF expression in cultured astrocytes by inflammatory stimuli // Neuroreport. – 1997. – Vol. 8, №15. – P. 3309-3312. 163. Shimizu E., Hashimoto K., Okamura N. et al. Alterations of serum levels of brain-derived neurotrophic factor (BDNF) in depressed patients with or without antidepressants // Biol Psychiatry. – 2003. – V. 54, № 1. – P. 70–75. 164. Lavoie J., Giguere J.F., Layrargues G.P. et al. Activities of neuronal and astrocytic marker enzymes in autopsied brain tissue from patients with hepatic encephalopathy // Metab Brain Dis. – 1987. – V. 2, № 4. – P. 283-290. 165. Myint A.M., Kim Y.K., Verkerk R. et al. Kynurenine pathway in major depression: evidence of impaired neuroprotection // J Affect Disord. – 2007. – V. 98, № 1-2. – P. 143-151. 166. Steiner J., Walter M., Gos T., Guillemin G.J., Bernstein H.G., Sarnyai Z., Mawrin C., Brisch R., Bielau H., Meyer zu Schwabedissen L.,Bogerts 110 B., Myint A.M. Severe depression is associated with increased microglial quinolinic acid in subregions of the anterior cingulate gyrus: evidence for an immune-modulated glutamatergic neurotransmission? // J Neuroinflammation. – 2011. – V. 8:94. 167. Rajkowska G., Miguel-Hidalgo J.J., Wei J. et al. Morphometric evidence for neuronal and glial prefrontal cell pathology in major depression // Biol Psychiatry. – 1999. – V. 45, № 9. – P. 1085-1098. 168. Gabbay V., Ely B.A., Babb J., Liebes L. The possible role of the kynurenine pathway in anhedonia in adolescents // J Neural Transm. – 2012. – Vol. 119, № 2. – P. 253-260. 169. Gabbay V., Liebes L., Katz Y. et al. The kynurenine pathway in adolescent depression: preliminary findings from a proton MR spectroscopy study // Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry. – 2010. – Vol. 34, № 1. – P. 37-44. 170. Wichers M.C., Koek G.H., Robaeys G. et al. IDO and interferonalpha-induced depressive symptoms: a shift in hypothesis from tryptophan depletion to neurotoxicity // Mol Psychiatry. – 2005. – V. 10, № 6. – P. 538-544. 171. Raison C.L., Dantzer R., Kelly K.W. et al. CSF concentrations of brain tryptophan and kynurenines during immune stimulation with IFNalpha: relationship to CNS immune responses and depression // Mol Psychiatry. – 2000. – V. 15, № 4. – P. 393-403. 172. O’Connor J.C., Lawson M.A., Andre C. et al. Lipopolysaccharideinduced depressive-like behavior is mediated by indoleamine 2,3dioxygenase activation in mice // Mol Psychiatry. – 2009. – V. 14, № 5. – P. 511-522. 173. O’Connor J.C., Andre C., Wang Y. et al. Interferon-gamma and tumor necrosis factor-alpha mediate the upregulation of indoleamine 2,3dioxygenase and the induction of depressive-like behavior in mice in 111 response to Bacillus Calmette-Guerin // J Neurosci. – 2009. – V. 29, № 13. – P. 4200-4209. 174. Hughes M.M., Carballedo A., McLoughlin D.M., Amico F., Harkin A., Frodl T., Connor T.J. Tryptophan depletion in depressed patients occurs independent of kynurenine pathway activation // Brain Behav. Immun. – 2012. – Vol. 26, № 6. – P. 979-987. 175. Raison C.L., Rutherford R.E., Woolwine B.J., Shuo C., Schettler P., Drake D.F., Haroon E., Miller AH. A randomized controlled trial of the tumor necrosis factor antagonist infliximab for treatment-resistant depression: the role of baseline inflammatory biomarkers // JAMA Psychiatry. – 2013. – V. 70, № 1. – P. 31-41. 176. Cattaneo A., Gennarelli M., Uher R., Breen G., Farmer A., Aitchison K.J. et al. Candidate genes expression profile associated with antidepressants response in the GENDEP study: differentiating between baseline ‘predictors’ and longitudinal ‘targets’ // Neuropsychopharmacology. – 2013. – Vol. 38, № 3. – P. 377-385. 177. Mackay G.M., Forrest C.M., Christofides J., Bridel M.A., Mitchell S., Cowlard R., Stone T.W., Darlington L.G. Kynurenine metabolites and inflammation markers in depressed patients treated with fluoxetine or counseling // Clin Exp Pharmacol Physiol. – 2009. – V. 36, № 4. – P. 425-435. 178. Sublette M.E., Galfalvy H.C., Fuchs D., Lapidus M., Grunebaum M.F., Oquendo M.A., Mann J.J., Postolache T.T. Plasma kynurenine levels are elevated in suicide attempters with major depressive disorder // Brain Behav Immun. – 2011. – V. 25, № 6. – P. 1272-1278. 179. Erhardt S., Lim C.K., Linderholm K.R. et al. Connecting inflammation with glutamate agonism in suicidality Neuropsychopharmacology. – 2013. – Vol. 38, № 5. – P.743-752. // 112 180. Mason M., Manning B. Effects of steroid conjugates on availability of pyridoxal phosphate for kynureninase and kynurenine aminotransferase activity // Am J Clin Nutr. – 1971. – V. 24, № 7. – P. 786-791. 181. Zender R., Olshansky E. Women's mental health: depression and anxiety // Nurs Clin North Am. – 2009. – V. 44, № 3. – P. 355-364. 182. Crosti P.F., Lucchelli P.E. An easy method to determine the serotonin content of human platelets // J. Clin. Pathol. – 1962. – V. 15. – P. 191193. 183. Tachiki K.H., Aprison M.H. Fluorometric assay for 5- hydroxytryptophan with sensitivity in the picomole range // Anal Chem. – 1975. – V. 47, № 1. – P. 7-11. 184. Peng Q., Jiang C. A new spectrofluorimetric method for determination of trace amounts 5-hydroxytryptamine in human urine and serum // J. Fluoresc. – 2007. – V. 17, № 3. – P. 339-343. 185. Eaton J.L., Mullins D.E. Quantitative high-performance thin-layer chromatography of dansyl derivatives of biogenic amine // Anal. Biochem. – 1988. – Vol. 172, № 2. – P. 484-487. 186. Alemany G., Nicolau M.C, Gamundí A, Rial R. Thin-layer chromatographic determination of brain catecholamines and 5hydroxytryptamine // Biomed Chromatogr. – 1993. – V. 7, № 6. – P. 315316. 187. Kato N, Kojima T, Yoshiyagawa S, Ohta H, Toriba A, Nishimura H, Hayakawa K. Rapid and sensitive determination of tryptophan, serotonin and psychoactive tryptamines by thin-layer chromatography/fluorescence detection // J. Chromatogr. A. – 2007. – V. 1145, № 1-2. – P. 229-233. 188. Engbaek F., Voldby B. Radioimmunoassay of serotonin (5hydroxytryptamine) in cerebrospinal fluid, plasma, and serum // Clin Chem. – 1982. – Vol. 28, № 4, Pt 1. – P. 624-628. 189. Haritou S.J., Zylstra R., Ralli C., Turner S., Tortonese D.J. Seasonal changes in circadian peripheral plasma concentrations of melatonin, 113 serotonin, dopamineand cortisol in aged horses with Cushing's disease under natural photoperiod // J Neuroendocrinol. – 2008. – Vol. 20, № 8. – P. 988-996. 190. Torfs S.C., Maes A.A., Delesalle C.J., Deprez P., Croubels S.M. Comparative analysis of serotonin in equine plasma with liquid chromatography-tandem mass spectrometry and enzyme-linked immunosorbent assay // J Vet Diagn Invest. – 2012. – V.24, № 6. – P. 1035-1042. 191. Nichkova M.I., Huisman H., Wynveen P.M., Marc D.T., Olson K.L., Kellermann G.H. Evaluation of a novel ELISA for serotonin: urinary serotonin as a potential biomarker for depression // Anal Bioanal Chem. – 2012. – V. 402, № 4. – P. 1593-1600. 192. Chauveau J., Fert V., Morel A.M., Delaage M.A. Rapid and specific enzyme immunoassay of serotonin // Clin Chem. – 1991. – Vol. 37, № 7. – P. 1178-1184. 193. Kuo T.R., Chen J.S., Chiu Y.C., Tsai C.Y., Hu C.C., Chen C.C. Quantitative analysis of multiple urinary biomarkers of carcinoid tumors through gold-nanoparticle-assisted laser desorption-ionization time-offlight mass spectrometry // Anal. Chim. Acta. – 2011. – V. 699, № 1. – P.81-86. 194. Nguyen D.T., Cho I.S., Kim J.W., Kim K.R., Lee G., Paik M.J. Acidic metabolite profiling analysis of catecholamine and serotonin as Oethoxycarbonyl/tert-butyldimethylsilyl derivatives by gas chromatography-mass spectrometry // Biomed. Chromatogr. – 2013. – V. 27, № 2. – P. 216-221. 195. Tsang C.W., Chan C.L., Li P., Pang S.F. Analysis of 5methoxytryptamine at the femtomole level in the rat and quail brain by gas chromatography-electron-capture negative-ion chemical ionization mass spectrometry // J Chromatogr B Biomed Appl. – 1996. – V. 682, № 2. – P. 185-194. 114 196. Sano M., Ferchaud-Roucher V., Nael C., Aguesse A., Poupeau G., Castellano B., Darmaun D. Simultaneous detection of stable isotopelabeled and unlabeled l-tryptophan and of its main metabolites, lkynurenine, serotonin and quinolinic acid, by gas chromatography/negative ion chemical ionization mass spectrometry // J Mass Spectrom. – 2014. – V. 49, № 2. – P. 128-135. 197. Hsieh M.M., Chang H.T. Discontinuous electrolyte systems for improved detection of biologically active amines and acids by capillary electrophoresis with laser-induced native fluorescence detection // Electrophoresis. – 2005. – V. 26, № 1. – P. 187-195. 198. Peterson Z.D., Lee M.L., Graves S.W. Determination of serotonin and its precursors in human plasma by capillary electrophoresis-electrospray ionization-time-of-flight mass spectrometry // J. Chromatogr. B. Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. – 2004. – V. 819, № 1. – P. 101-110. 199. Maurer-Spurej E., Dyker K, Gahl W.A., Devine D.V. A novel immunocytochemical assay for the detection of serotonin in platelets // Br. J. Haematol. – 2002. – V. 116, № 3. – P. 604-611. 200. Sa M., Ying L., Tang A.G., Xiao L.D., Ren Y.P. Simultaneous determination of tyrosine, tryptophan and 5-hydroxytryptamine in serum of MDD patients by high performance liquid chromatography with fluorescence detection // Clin. Chim. Acta. – 2012. – V. 413, № 11-12. – P. 973-977. 201. Atkinson W., Lockhart S.J., Houghton L.A., Keevil B.G. Validation of the measurement of low concentrations of 5-hydroxytryptamine in plasma using high performance liquid chromatography // J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. – 2006. – V. 832, № 1. – P. 173-176. 202. Wang H., Walaszczyk E.J., Li K., Chung-Davidson Y.W., Li W. High-performance liquid chromatography with fluorescence detection and ultra-performance liquid chromatography with electrospray tandem mass spectrometry method for the determination of indoleamine 115 neurotransmitters and their metabolites in sea lamprey plasma // Anal. Chim. Acta. – 2012. – V. 721. – P. 147-153. 203. Zagajewski J., Drozdowicz D., Brzozowska I., Hubalewska-Mazgaj M., Stelmaszynska T., Laidler P.M., Brzozowski T. Conversion Ltryptophan to melatonin in the gastrointestinal tract: the new high performance liquid chromatography method enabling simultaneous determination of six metabolites of L-tryptophan by native fluorescence and UV-VIS detection // J. Physiol. Pharmacol. – 2012. – V. 63, №. 6. – P. 613-621. 204. Chin J.R. Determination of the catecholamines and serotonin, their precursors tyrosine and tryptophan, and their main metabolites in rat brain using reversed-phase high-performance liquid chromatography with fluorimetric and oxidative amperometric detection in series // J Chromatogr. – 1992. – Vol. 578, № 1. – P. 17-30. 205. Ishida J., Takada M., Hitoshi N., Iizuka R., Yamaguchi M. 4Dimethylaminobenzylamine as a sensitive chemiluminescence derivatization reagent for 5-hydroxyindoles and its application to their quantification in human platelet-poor plasma // J. Chromatogr. B. Biomed. Sci. Appl. – 2000. – V. 738, № 2. – P.199-206. 206. Yoshitake T., Kehr J., Todoroki K., Nohta H., Yamaguchi M. Derivatization chemistries for determination of serotonin, norepinephrine and dopamine in brain microdialysis samples by liquid chromatography with fluorescence detection // Biomed. Chromatogr. – 2006. – V. 20, № 3. – P. 267-281. 207. Yoshitake M., Nohta H., Ogata S., Todoroki K., Yoshida H., Yoshitake T., Yamaguchi M. Liquid chromatography method for detecting native fluorescent bioamines in urine using post-column derivatization and intramolecular FRET detection // J. Chromatogr. B. Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. – 2007. – V. 858, № 1-2. – P. 307312. 116 208. Yoshida H., Kido F., Yoshitake M., Todoroki K., Nohta H., Yamaguchi M. Determination of catecholamines and indoleamines in human urine based on intramolecular excimer-forming derivatization and fluorescence detection // Anal. Sci. – 2007. – V. 23, № 4. – P. 485-488. 209. Sakaguchi Y., Yoshida H., Hayama T., Itoyama M., Todoroki K., Yamaguchi M., Nohta H. Selective liquid-chromatographic determination of native fluorescent biogenic amines in human urine based on fluorous derivatization // J. Chromatogr. A. – 2011. – V. 1218, № 33. – P. 55815586. 210. Chan EC, Wee PY, Ho PY, Ho PC. High-performance liquid chromatographic assay for catecholamines and metanephrines using fluorimetric detection with pre-column 9-fluorenylmethyloxycarbonyl chloride derivatization // J Chromatogr B Biomed Sci Appl. – 2000. – Vol. 749, № 2. – P. 179-189. 211. Liu Y., Zhang J., Xu X., Zhao M.K., Andrews A.M., Weber S.G. Capillary ultrahigh performance liquid chromatography with elevated temperature for sub-one minute separations of basal serotonin in submicroliter brain microdialysate samples / /Anal. Chem. – 2010. – V. 82, № 23. – P. 9611-9616. 212. Tekes K. HPLC determination of serotonin and its metabolites from human platelet-rich plasma; shift to 5-hydroxytryptophol formation following alcohol consumption // J. Chromatogr. Sci. – 2008. – V. 46, № 2. – P.169-173. 213. Sasaki T., Fukushima T., Ohishi M., Toyo’oka T. Development of a 6hydroxychroman-based derivatization reagent: application to the analysis of 5-hydroxytryptamine and catecholamines by using high-performance liquid chromatography with electrochemical detection // Biomed. Chromatogr. – 2008. – V. 22, № 8. – P. 888-899. 214. Parrot S., Neuzeret P.C., Denoroy L. A rapid and sensitive method for the analysis of brain monoamine neurotransmitters using ultra-fast liquid 117 chromatography coupled to electrochemical detection // J. Chromatogr. B. Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. – 2011. – V. 879, № 32. – P. 38713878. 215. Patel B.A., Arundell M., Parker K.H., Yeoman M.S., O'Hare D. Simple and rapid determination of serotonin and catecholamines in biological tissue using high-performance liquid chromatography with electrochemical detection // J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. – 2005. – V. 818, № 2. – P. 269-276. 216. Picard M., Olichon D., Gombert J. Determination of serotonin in plasma by liquid chromatography with electrochemical detection // J Chromatogr. – 1985. – V. 341. – P. 445-451. 217. Pussard E., Guiqueno N., Adam O., Giudicelli J.F. Validation of HPLC-amperometric detection to measure serotonin in plasma, platelets, whole blood, and urine // Clin. Chem. – 1996. – V. 42, № 7. – P. 10861091. 218. de Jong W.H., Wilkens M.H., de Vries E.G., Kema I.P. Automated mass spectrometric analysis of urinary and plasma serotonin // Anal. Bioanal. Chem. – 2010. – V. 396, № 7. – P. 2609-2616. 219. Ji C., Li W., Ren X.D., E.I.-Kattan A.F., Kozak R., Fountain S., Lepsy C. Diethylation labeling combined with UPLC/MS/MS for simultaneous determination of a panel of monoamine neurotransmitters in rat prefrontal cortex microdialysates // Anal. Chem. – 2008. – V. 80, № 23. – P. 91959203. 220. Zhu K.Y., Fu Q., Leung K.W., Womg Z.C., Choi R.C., Tsim K.W. The establishment of a sensitive method in determining different neurotransmitters simultaneously in rat brains by using liquid chromatography-electrospray tandem mass spectrometry // J. Chromatogr. B. Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. – 2011. – V. 879, № 11-12. – P. 737-742. 118 221. Huang X., Mazza G. Simultaneous analysis of serotonin, melatonin, piceid and resveratrol in fruits using liquid chromatography tandem mass spectrometry // J. Chromatogr. A. – 2011. – Vol. 1218, № 25. – P. 38903899. 222. Xu N., Qiu C., Wang W., Wang Y., Chai C., Yan Y., Zhu D. HPLC/MS/MS for quantification of two types of neurotransmitters in rat brain and application: myocardial ischemia and protection of Sheng-MaiSan // J. Pharm. Biomed. Anal. – 2011. – V. 55, № 1. – P. 101-108. 223. Moriarty M., Lee A., O'Connell B., Kelleher A., Keeley H., Furey A. Development of an LC-MS/MS method for the analysis of serotonin and related compounds in urine and the identification of a potential biomarker for attention deficit hyperactivity/hyperkinetic disorder // Anal. Bioanal. Chem. – 2011. – V. 401, № 8. – P. 2481-2493. 224. Monaghan P.J., Brown H.A., Houghton L.A., Keevil B.G. Measurement of serotonin in platelet depleted plasma by liquid chromatography tandem mass spectrometry// J. Chromatogr. B. Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. – 2009. – V. 877, № 22. – P. 2163-2167. 225. Hammad L.A., Neely M., Bridge B., Mechref Y. Fast liquid chromatography separation and multiple-reaction monitoring mass spectrometric detection of neurotransmitters / /J. Sep. Sci. – 2009. – V. 32, № 14. – P. 2369-2376. 226. Hows M.E., Lacroix L., Heidbreder C., Organ A.J., Shah A.J. Highperformance liquid chromatography/tandem mass spectrometric assay for the simultaneous measurement of dopamine, norepinephrine, 5hydroxytryptamine and cocaine in biological samples // J Neurosci Methods. – 2004. – V.138, № 1-2. – P. 123-132. 227. Middelkoop C.M., Dekker G.A., Kraayenbrink A.A., Popp-Snijders C. Platelet-poor plasma serotonin in normal and preeclamptic pregnancy // Clin Chem. – 1993. – V. 39, № 8. – P. 1675-1678. 119 228. Badawy A.A., Morgan C.J. Rapid isocratic liquid chromatographic separation and quantification of tryptophan and six kynurenine metabolites in biological samples with ultraviolet and fluorimetric detection // Int J Tryptophan Res. – 2010. – Vol. 3. – P. 175-186. 229. Zhen Q., Xu B., Ma L., Tian G., Tang X., Ding M. Simultaneous determination of tryptophan, kynurenine and 5-hydroxytryptamine by HPLC: application in uremic patients undergoing hemodialysis // Clin. Biochem. – 2011. – V. 44, № 2-3. – P. 226-230. 230. Krcmova L., Solichova D., Melichar B., Kasparova M., Plisek J., Sobotka L., Solich P. Determination of neopterin, kynurenine, tryptophan and creatinine in human serum by high throuput HPLC // Talanta. – 2011. – V. 85, № 3. – P. 1466-1471. 231. Presits P., Molnar-Perl I. HPLC of tryptophan and its metabolites using simultaneously UV, native fluorescence and pre-column fluorescence derivatization // Chromatographia. – 2003. – V. 57, № 1. – Suppl. – P. S87-S92. 232. Zhang X., He Y., Ding M. Simultaneous determination of tryptophan and kynurenine in plasma samples of children patients with Kawasaki disease by high-performance liquid chromatography with programmed wavelength ultraviolet detection // J. Chromatogr. B. Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. – 2009. – V. 877, № 16-17. – P. 1678-1682. 233. Hervé C., Beyne P., Jamault H., Delacoux E. Determination of tryptophan and its kynurenine pathway metabolites in human serum by high-performance liquid chromatography with simultaneous ultraviolet and fluorimetric detection // J. Chromatogr. B. Biomed. Appl. – 1996. – V. 675, № 1. – P. 157-161. 234. Lesniak W.G., Jyoti A., Mishra M.K., Louissaint N., Romero R., Chugani D.C., Kannan S., Kannan R.M. Concurrent quantification of tryptophan and its major metabolites // Anal Biochem. – 2013. – V. 443, № 2. – P. 222-231. 120 235. Mitsuhashi S., Fukushima T., Tomiya M., Santa T., Imai K., Toyo'oka T. Determination of kynurenine levels in rat plasma by high-performance liquid chromatography with pre-column fluorescence derivatization // Anal. Chim. Acta. – 2007. – V. 584, № 2. – P. 315-321. 236. Zhao J., Gao P., Zhu D. Optimization of Zn2+-containing mobile phase for simultaneous determination of kynurenine, kynurenic acid and tryptophan in human plasma by high performance liquid chromatography // J. Chromatogr. B. Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. – 2010. – V. 878, № 5-6. – P. 603-608. 237. Vignau J., Jacquemont M.C., Lefort A., Imbenotte M., Lhermitte M. Simultaneous determination of tryptophan and kynurenine in serum by HPLC with UV and fluorescence detection // Biomed. Chromatogr. – 2004. – V. 18, № 10. – P. 872-874. 238. Shibata K., Onodera M. High-performance liquid chromatographic determination of 3-hydroxykynurenine with fluorimetric detection; comparison of preovulatory phase and postovulatory phase urinary excretion // J. Chromatogr. – 1991. – V. 570, № 1. – P. 13-18. 239. Mawatari K., Iinuma F., Watanabe M. Fluorimetric determination of kynurenine in human serum by high-performance liquid chromatography coupled with post-column photochemical reaction with hydrogen peroxide // J. Chromatogr. – 1989. – V. 488, № 2. – P. 349-355. 240. Vaarmann A., Kask A., Maeorg U. Novel and sensitive highperformance liquid chromatographic method based on electrochemical coulometric array detection for simultaneous determination of catecholamines, kynurenine and indole derivatives of tryptophan // J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. – 2002. – V. 769, № 1. – Р. 145-153. 241. Liu L., Chen Y., Zhang Y., Wang F., Chen Z. Determination of tryptophan and kynurenine in human plasma by liquid chromatographyelectrochemical detection with multi-wall carbon nanotube-modified 121 glassy carbon electrode // Biomed. Chromatogr. – 2011. – V. 25, № 8. – P. 938-942. 242. Maneglier B., Rogez-Kreuz C., Cordonnier P. et al. Simultaneous measurement of kynurenine and tryptophan in human plasma and supernatants of cultured human cells by HPLC with coulometric detection // Clin. Chem. – 2004. – V. 50, № 11. – P. 2166-2168. 243. Amirkhani A., Heldin E., Markides K.E., Bergquist J. Quantitation of tryptophan, kynurenine and kynurenic acid in human plasma by capillary liquidchromatography-electrospray ionization tandem mass spectrometry // J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. – 2002. – Vol. 780, №2. – P. 381-387. 244. Yamada K., Miyazaki T., Shibata T., Hara N., Tsuchiya M. Simultaneous measurement of tryptophan and related compounds by liquid chromatography/electrospray ionization tandem mass spectrometry // J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. – 2008. – V. 867, № 1. – P. 57-61. 245. de Jong W.H., Smit R., Bakker S.J., de Vries E.G., Kema I.P. Plasma tryptophan, kynurenine and 3-hydroxykynurenine measurement using automated on-line solid-phase extraction HPLC-tandem mass spectrometry // J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. – 2009. – Vol. 877, № 7. – P. 603-609. 246. Midttun О., Hustad S., Ueland P.M. Quantitative profiling of biomarkers related to B-vitamin status, tryptophan metabolism and inflammation in human plasma by liquid chromatography/tandem mass spectrometry // Rapid Commun Mass Spectrom. – 2009. – V. 23, № 9. – P. 1371-1379. 247. Soto M.E., Ares A.M., Bernal J., Nozal M.J., Bernal J.L. Simultaneous determination of tryptophan, kynurenine, kynurenic and xanthurenic acids in honey by liquid chromatography with diode array, 122 fluorescence and tandem mass spectrometry detection // J Chromatogr A. – 2011. – V. 1218, № 42. – P. 7592-7600. 248. Möller M., Du Preez J.L., Harvey B.H. Development and validation of a single analytical method for the determination of tryptophan, and its kynurenine metabolites in rat plasma // J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. – 2012. – V. 898. – P. 121-129. 249. Ohashi H., Iizuka H., Yoshihara S., Otani H., Kume M., Sadamoto K., Ichiba H., Fukushima T. Determination of L-tryptophan and Lkynurenine in human serum by using LC-MS after derivatization with (R)-DBD-PyNCS // Int J Tryptophan Res. – 2013. – V. 6. – Suppl 1. – P. 9-14. 250. Huang Y., Louie A., Yang Q., Massenkoff N., Xu C., Hunt P.W., Gee W. A simple LC-MS/MS method for determination of kynurenine and tryptophan concentrations in human plasma from HIV-infected patients // Bioanalysis. – 2013. – V. 5, № 11. – P. 1397-1407. 251. Arvidsson B., Johannesson N., Citterio A., Righetti P.G., Bergquist J. High throughput analysis of tryptophan metabolites in a complex matrix using capillary electrophoresis coupled to time-of-flight mass spectrometry // J Chromatogr A. – 2007. – V. 1159, № 1-2. – P. 154-158. 252. Сидорова А.А., Карцова Л.А. Исследование кинуренинового пути метаболизма триптофана методом капиллярного электрофореза и масс-спектрометрии // Журнал аналитической химии. – 2011. – Т.66, № 3. – С. 329-334 253. Notarangelo F.M., Wu H.Q., Macherone A., Graham D.R., Schwarcz R. Gas chromatography/tandem mass spectrometry detection of extracellular kynurenine and related metabolites in normal and lesioned rat brain // Anal. Biochem. – 2012. – V. 421, № 2. – P. 573-581. 254. Muñoz-Hoyos A., Molina-Carballo A., Macías M., RodríguezCabezas T., Martín-Medina E., Narbona-López E., Valenzuela-Ruiz A., 123 Acuña-Castroviejo D. Comparison between tryptophan methoxyindole and kynurenine metabolic pathways in normal and preterm neonates and in neonates with acute fetal distress // Eur. J. Endocrinol. – 1998. – V. 139, № 1. – P. 89-95. 255. Tsentalovich Y.P., Snytnikova O.A., Sagdeev R.Z. Photochemical and thermal reactions of kynurenines // Russian Chemical Reviews. – 2008. – V. 77, № 9. – P. 789-797. 256. Vazquez S., Garner B., Sheil M.M., Truscott R.J. Characterisation of the major autoxidation products of 3-hydroxykynurenine under physiological conditions // Free Radic Res. – 2000. – V. 32, № 1. – P. 1123. 257. Aquilina J.A., Carver J.A., Truscott R.J. Elucidation of a novel polypeptide cross-link involving 3-hydroxykynurenine // Biochemistry. – 1999. – Vol. 38, № 35. – P. 11455-11464. 258. Tsentalovich Y.P., Snytnikova O.A., Forbes M.D., Chernyak E.I., Morozov S.V. Photochemical and thermal reactivity of kynurenine // Exp Eye Res. – 2006. – V. 83, № 6. – P. 1439-1445. 259. Taylor L.M., Aquilina A.J., Jamie J.F., Truscott R.J. UV filter instability: consequences for the human lens // Exp Eye Res. – 2002. – V.75, № 2. – P. 165-175. 260. Kopylova L.V., Snytnikova O.A., Chernyak E.I., Morozov S.V., Tsentalovich Y.P. UV filter decomposition. A study of reactions of 4-(2aminophenyl)-4-oxocrotonic acid with amino acids and antioxidants present in the human lens // Exp Eye Res. – 2007. – V. 85, № 2. – P. 242249. 261. Stone T.W., Forrest C.M., Darlington L.G. Kynurenine pathway inhibition as a therapeutic strategy for neuroprotection // FEBS J. – 2012. – V. 279, № 8. – P. 1386-1397. 262. Corona A.W., Norden D.M., Skendelas J.P. et al. Indoleamine 2,3dioxygenase inhibition attenuates lipopolysaccharide induced persistent 124 microglial activation and depressive-like complications in fractalkine receptor (CX(3)CR1)-deficient mice // Brain Behav Immun. – 2013. – V. 31. – P. 134-142. 263. Dobos N., de Vries E.F., Kema I.P., et al. The role of indoleamine 2,3dioxygenase in a mouse model of neuroinflammation-induced depression // J Alzheimers Dis. – 2012. – V. 28, № 4. – P. 905-915. 264. Гершкович А.А., Киберев В.К. Химический синтез пептидов. – Киев: Наукова думка. – 1992. – C. 360 265. Лурье А.А. Хроматографические материалы (справочник). – М.: Химия. – 1978. – C. 367-381. 266. Flachaire E., Beney C., Salandre Y., Qnincyc Rehand B. Determination of reference values for serotonin concentration in platelets of healthy newborns children adults and elderly subjects by HPLC with electrochemical detector. Clinical chemistry 1990; 36(12):2117-2120. 267. Rashed M.S., Bucknall M.P., Little D., Awad A., Jacob M., Alamoudi M., Alwattar M., Ozand P.T. Screening blood spots for inborn errors of metabolism by electrospray tandem mass spectrometry with a microplate batch process and a computer algorithm for automated flagging of abnormal profiles // Clin Chem. – 1997. – V. 43, № 7. – P. 1129-1141. 268. Harder U., Koletzko B., Peissner W. Quantification of 22 plasma amino acids combining derivatization and ion-pair LC-MS/MS // J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. – 2011. – V. 879, № 78. – P. 495-504. 269. Meinitzer A., Tomaschitz A., Pilz S. et al. Development of a liquid chromatography-mass spectrometry method for the determination of the neurotoxic quinolinic acid in human serum // Clin Chim Acta. – 2014. – V. 436. – P. 268-272. 270. US DHHS, FDA and CDER. Guidance for Industry: Bioanalytical method validation. – 2001. Available from: http://www.fda.gov/downloads /drugs/guidancecomplianceregulatoryinformation/guidances/ucm368107.pdf