Testosterone RIA kit

RK-61MACE090617
Набор тестостерон [125I] RIA
(Номер по каталогу: RK-61М)
Описание
Система радиоиммунного анализа [125I] Тестостерон позволяет проводить прямое
количественное определение тестостерона in vitro в сыворотке крови человека.
Количественное определение тестостерона может проводиться в диапазоне 0-35 нмоль/л,
при этом используются образцы сыворотки объемом 50 мкл. Каждый набор содержит
материалы для 100 пробирок для количественного определения, что позволяет построить
одну стандартную кривую и выполнить количественное определение 41 неизвестного
образца и 1 контроля в двух экземплярах.
Введение
Уровень тестостерона в крови является важным индикатором большого количества
патологических состояний.
Увеличение концентрации тестостерона у мужчин свидетельствует о: раннем половом
созревании, врожденном дефиците 21-гидроксилазы, гиперплазии надпочечников
(синдром Кушинга), опухолях яичек.
Увеличение концентрации тестостерона у женщин свидетельствует об: опухолях
яичника или эндометрия, синдроме Штейна-Левенталя, гиперплазии надпочечников
(синдром Кушинга), гирсутизме, терапии глюкокортикостероидами.
Снижение концентрации тестостерона у мужчин свидетельствует о: синдроме
Кляйнфельтера, агонадизме, анорхизме, крипторхизме, синдроме Кальмана, аплазии
клеток Лейдига, нарушении функционирования гипофиза.
У женщин снижение концентрации тестостерона наблюдается в постменопаузе.
Принцип метода
Принцип данного количественного определения основан на конкурентном связывании
немеченого тестостерона и определенного количества тестостерона, меченного 125I, с
ограниченным количеством мест для связывания на тестостерон-специфичных антителах.
В ходе реакции заданного количества радиоактивного индикатора и антитела с различным
количеством немеченого лиганда, количество радиоактивного индикатора, связанного с
антителом, будет обратно пропорционально концентрации немеченого лиганда. После
добавления магнитного иммуносорбента комплекс антиген-антитело связывается на
твердых частицах, которые затем отделяются магнитной седиментацией или
центрифугированием. Определение радиоактивности твердой фазы позволяет построить
стандартную кривую и провести количественное определение образцов.
Содержимое набора
1. 1 флакон МЕТКИ, концентрированный раствор. Содержит < 150 кБк 125I-тестостерона в
1 мл органического раствора.
2. 6 флаконов СТАНДАРТНОЙ СЫВОРОТКИ(1-6), лиофилизированой.
0.5 мл на флакон, содержащий 0 (S1), 0.43 (S2), 1.73 (S3), 4.3 (S4), 17.3 (S5), 35 (S6)
нмоль/л в 0.5 мл сыворотки с 0,1% NaN3.
3. 1 флакон АНТИСЫВОРОТКИ, лиофилизированой. Содержит поликлональный
антитестостероновый IgG (кроличий) в буферном растворе.
4. 1 флакон КОНТРОЛЬНОЙ СЫВОРОТКИ, лиофилизированой. 0,5 мл человеческой
сыворотки, содержащей 0,1% NaN3. Концентрация контрольной сыворотки указана в
прилагаемом сертификате качества.
5. 1 флакон МАГНИТНОГО ИММУНОСОРБЕНТА (МИС), готового к использованию, 55
мл во флаконе, содержит парамагнитные частицы в буферном растворе с 0.1% NaN3.
6. 1 флакон БУФЕРА МЕТКИ, готового к использованию. 24 мл фосфатного буфера
содержит 0.1% NaN3.
Сертификат качества 1 шт.
Листок-вкладыш 1 шт.
Необходимые материалы и оборудование
Пробирки с круглым дном из полистирола или полипропилена для количественного
определения (размером приблизительно 12 х 75 мм), пластиковая пленка для
запечатывания пробирок, высокоточные пипетки (50, 100, 200 и 500 мкл, с одноразовыми
наконечниками), вихревый смеситель, магнитный сепаратор (или центрифуга), штативы
для декантирования, гамма-счетчик, абсорбирующая ткань.
Рекомендуемые инструменты и оборудование
Циркулярный шейкер, пипетки для серийных впрыскиваний.
Приготовление реактивов
Добавить 2-4 мл буфера метки в концентрат метки и перелить полученный раствор во
флакон буфера метки.
Восстановить антисыворотку путем добавления к ней 10 мл дистиллированной воды.
Добавить точно 500 мкл дистиллированной воды в каждый флакон со стандартом.
Добавить точно 500 мкл дистиллированной воды в лиофилизированную контрольную
сыворотку. Убедиться в полном растворении, после чего дать раствору уравновеситься в
течение как минимум 20 минут при комнатной температуре.
Сбор и хранение образцов
Образцы сыворотки могут быть приготовлены согласно общепринятым методикам,
которые рутинно используются в клинической лабораторной практике. Сыворотка крови
может храниться в течение двух дней при температуре от 2°C до 8°C. При необходимости
проведения анализа в более поздние сроки образцы должны храниться в условиях
глубокого замораживания. Необходимо избегать повторного замораживания и
размораживания образцов. Запрещается использовать липемичные, гемолизированные и
мутные образцы. Образцы, в которых концентрация тестостерона выше, чем в стандарте с
максимальной концентрацией, должны разводиться и подвергаться повторному
количественному определению. В качестве раствора для разведения должен
использоваться нулевой стандарт.
Процедура количественного определения
(Краткое описание см. в Таблице 1.)
1) Уравновесить все реактивы до комнатной температуры.
2) Пометить в двух экземплярах пробирки для общего счета (T), нулевого стандарта
(Стандарт 1 = B0), стандартов (S2-6), контроля (С) и образцов (Sx).
3) Тщательно перемешать все реактивы и образцы перед использованием. Избегать
чрезмерного пенообразования.
4) С помощью пипетки поместить по 50 мкл стандартов, контроля и образцов в
предварительно промаркированные пробирки.
5) С помощью пипетки поместить в каждую пробирку по 200 мкл раствора метки.
6) С помощью пипетки поместить в каждую пробирку (за исключением пробирки Т)
по 100 мкл антисыворотки.
7) Тщательно перемешать содержимое всех пробирок (за исключением пробирки Т) с
помощью вихревого смесителя в течение 2-5 секунд. При наличии циркулярного
шейкера, оставить все пробирки в штативе, зафиксировать его на панели шейкера,
после чего в течение нескольких секунд выполнить аккуратное встряхивание.
8) Запечатать все пробирки пластиковой пленкой и оставить их инкубироваться на 3
часа при комнатной температуре.
9) Поместить пробирки Т на отдельный штатив. Аккуратно встряхнуть и перемешать
содержимое флакона с магнитным иммуносорбентом до достижения гомогенности.
Добавить по 500 мкл в каждую пробирку за исключением пробирки Т. При
использовании одинарной пипетки перемешивать содержимое флакона с МИС
после каждых 15-20 пробирок. При использовании пипетки для серийного
введения (напр., Эппендорф), необходимость повторной гомогенизации МИС
отсутствует.
10) Тщательно перемешать содержимое всех пробирок с помощью вихревого
смесителя с последующей их инкубацией в течение 5 минут при комнатной
температуре.
11) Отделить связанную фракцию с использованием одной из следующих методик.
Магнитная сепарация
Установить штатив на подставку магнитного сепаратора и убедиться, что каждая
пробирка соприкасается его панелью. Дать частицам МИС осесть в пробирках в
течение 5 минут. Не убирать штатив с подставки сепаратора после разделения
твердой и жидкой фаз. Слить супернатант. Удерживая сепаратор в перевернутом
состоянии, поместить все пробирки на абсорбирующую ткань и дать им высохнуть
в течение 2 минут.
Центрифугирование
Центрифугировать все пробирки в течение 15 мин при 1500 g и выше. Не
затрагивая осадок, слить супернатант.
12) Определить радиоактивность каждой пробирки в гамма-счетчике в течение как
минимум 60 секунд.
13) Рассчитать концентрацию в соответствиями с инструкциями, приведенными в
разделе «Расчет результатов».
Таблица 1. Протокол количественного определения, методика введения
(все объемы представлены в микролитрах)
Т=общий счет, S1-6=стандарты, Sх=образец, С=контроль,
НСС=неспецифическое связывание
Sx
С
Пробирки
T
НСС
S1-6
Реактив
Дистиллированная
100
вода
Стандарт
50
Образец
50
Контроль
50
Метка
200
200
200
200
200
Антисыворотка
100
100
100
Перемешать. Инкубировать в течение 3 часов при комнатной температуре
Магнитный
иммуносорбент
500
500
500
500
Перемешать. Инкубировать в течение 15 минут при комнатной температуре
Поместить пробирки в магнитный сепаратор на 5 мин или
центрифугировать в течение 15 мин при 1500 х g
Удалить супернатант и высушить пробирки
Определить радиоактивность во всех пробирках
Расчет результатов
Иллюстрация расчета результатов проводится с использованием репрезентативных
данных. Полученные данные должны быть схожими с теми, которые представлены в
Таблице 2.
Рассчитать среднее значение в минуту (СРМ) для каждой пары исследуемых пробирок.
Рассчитать процентное количество В0/Т для нулевого стандарта (S1) с использованием
следующей формулы:
B0/T % = 100*(S1 - НСС)/T
Рассчитать нормализованное процентное связывание для каждого стандарта, контроля и
образца, соответственно, с использованием следующей формулы:
B/B0 % = 100*(S2-6; C; Mx – НСС)/(S1 - НСС)
На полулогарифмической бумаге построить график В/В0% для каждого стандарта против
соответствующей концентрации тестостерона. На Рисунке 1 представлена типичная
стандартная кривая.
Определить концентрацию тестостерона в неизвестных образцах путем интерполяции
стандартной кривой. Запрещается экстраполировать значения, выходящие за пределы
диапазона стандартной кривой.
Таблица 2. Типичные данные количественного определения
Пробирки
Т
S1
S2
S3
S4
S5
S6
C
НСС
значение
CPM1
43864
19136
17972
14976
10821
6300
4436
8361
486
значение CPM2
44478
19852
17454
14290
10622
6415
4758
7823
416
Среднее значение
B/T % B/B %
CPM
44171
19494
43.1
100.0
17713
39.1
90.6
14633
32.1
74.5
10722
23.3
53.9
6358
13.4
31.0
4597
9.4
21.8
8092
17.3
40.1
451
1.02
Рисунок 1.
Типичная стандартная кривая
(Не использовать для расчета значений образцов)
Перевод в единицы СИ может быть выполнен по следующей формуле:
1 нмоль/л = 0.29 нг/мл
Характеристика количественного определения
Параметры количественного определения
НСС/T
B0/T
ED-50
< 3%
45.0 ± 10%
4.2 ± 1,1 нмоль/л
Специфичность
Перекрестная реактивность определялась по массе 50% уровня смещения, выраженного в
процентах.
Анализируемое
Перекрестная
вещество
реактивность %
Тестостерон
100
35
5α-дигидротестостерон
0.8
5β-дигидротестостерон
0.01
17β-эстрадиол
Кортизол
0.01
Ожидаемые справочные значения
Мужчины: 9 – 38 нмоль/л (2.6 - 11 нг/мл)
Женщины: 0.9 – 4.5 нмоль/л (0.26 - 1.3 нг/мл)
Рекомендуется, чтобы каждая лаборатория определяла собственный диапазон эталонных
значений. Полученные результаты должны интерпретироваться только в контексте общей
клинической картины. Ни один из наборов для диагностики in vitro не может
использоваться как самостоятельное и единственное доказательство наличия какого-либо
заболевания или расстройства.
Дополнительная информация
Хранение
Хранить реактивы при температуре от 2°С до 8°С. При такой температуре каждый реактив
остается стабильным до окончания срока годности. Особое внимание необходимо уделять
предотвращению замораживания магнитного иммуносорбента.
Доступность
Доступны на складе.
Срок хранения
Минимальный срок хранения реактивов, содержащихся в наборе, составляет 8 недель со
дня производства. Фактический срок годности указан на этикетке упаковки и в
сертификате качества. Для получения максимальных преимуществ долговременной
стабильности рекомендуется планировать дату заказа новой партии наборов в
соответствии с календарем их производства, который публикуется каждый год. Не
следует смешивать или заменять компоненты из различных партий или из наборов разных
производителей.
Меры предосторожности и предупреждения
Радиоактивность
Данный набор содержит радиоактивный материал. Заказ, получение, владение и
использование радиоактивных материалов является предметом регулирования и
лицензирования национальных и международных регуляторных органов. Пользователь
несет ответственность за соблюдение местных законов и правил по использованию
радиоактивных материалов.
Потенциально инфекционно опасные материалы
Продукты человеческой крови, которые используются в наборе, были получены от
здоровых доноров. Они были подвергнуты индивидуальным исследованиям с
использованием утвержденных методик ИФА (иммуноферментный анализ), по
результатам которых были получены отрицательные результаты на наличие антител к
вирусу иммунодефицита человека (ВИЧ-АТ) и поверхностных антигенов вируса гепатита
В (HBsAg).
При работе с образцами, полученными от человека, которые подлежат исследованию с
использованием диагностических наборов, необходимо всегда соблюдать осторожность.
Даже если пациент прошел необходимые обследования, ни один из методов не может дать
полной гарантии отсутствия возбудителей вируса гепатита В, вируса иммунодефицита
человека (ВИЧ) или других инфекционных агентов. Все образцы крови человека должны
рассматриваться как потенциально инфекционно опасный материал.
Химическая опасность и другие виды опасности
Некоторые компоненты набора в качестве антибактериального агента содержат азид
натрия (0.1 % м/о). При утилизации отходов их необходимо смывать большим
количеством воды для предотвращения накопления взрывоопасных азидов металлов в
водопроводе, который может содержать части из меди и свинца. Общее содержание
азидов в каждой упаковке составляет 82.5 мг.
УСЛОВНЫЕ ОБОЗНАЧЕНИЯ
Использовано
Номер партии
Температурное
ограничение
Внимание,
обратитесь к
сопроводительным
документам
Биологическая
опасность
Обратитесь к
инструкции по
использованию
Устройство для
проведения
диагностики in vitro
Магнитный
иммуносорбент
Производитель
Буфер метки
Номер по каталогу
Радиоактивный
материал
Контроль
Стандарт
Метка
Антисыворотка
WEB site: http://www.izotop.hu
Technical e-mail: immuno@izotop.hu
Commercial e-mail: commerce@izotop.hu
INSTITUTE OF ISOTOPES Ltd.
1535 Budapest. Pf.: 851.
Tel.: (+36)1-392-2577,
Fax: (+36)1-395-9247
*01427*