удк 615.033+57.084.1 изучение особенностей фармакокинетики

УДК 615.033+57.084.1
ИЗУЧЕНИЕ ОСОБЕННОСТЕЙ ФАРМАКОКИНЕТИКИ
ПРЕПАРАТА ПАНАГЕН В ОРГАНИЗМЕ МЫШЕЙ
С.Г. Гамалей, Е.Д. Даниленко, А.В. Батенева, В.И. Масычева,
1
С.С. Богачев, Рогачев В.А., 2Якубов Л.А., 3Шурдов М.А.
Институт медицинской биотехнологии ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор», 1 ИЦиГ СО РАН,
2
Panagenic International Inc., USA, 3 ООО "Панаген", Горноалтайск
Резюме. Проведено изучение фармакокинетики субстанции препарата
панаген в организме мышей ICR. Радиоактивно меченый препарат
вводили внутривенно в дозе 2,5 мг/кг массы тела животных. Показано, что
препарат в исследуемой дозе быстро элиминировался из кровеносного
русла и распределялся по тканям. Наиболее высоким было накопление
препарата форменными элементами крови, тимусом, селезенкой, почками
и печенью. Панаген выводился из организма мышей, преимущественно,
почками. Процесс выведения препарата, в основном, завершался через
сутки после его внутривенного введения.
В течение многих лет интерес исследователей привлекают препараты экзогенных
ДНК в качестве лекарственных средств. В настоящее время накоплен значительный
объем данных, касающихся биологических свойств препаратов ДНК из разных
источников: эритроцитов цыплят, тимуса телят, бактерий, селезенки и печени мышей и
крыс, молок сельди, карпа, осетровых, лососевых и других видов рыб [1].
Продемонстрированы лейкостимулирующий, радиопротекторный, противоопухолевый,
иммуностимулирующий, ранозаживляющий и другие эффекты высокомолекулярной ДНК
[2-5].
В настоящее время в клинической практике широко применяются препараты
деполимеризованной ДНК, полученные из молок осетровых рыб (Деринат, Дезоксинат), а
также препарат Полидан, представляющий собой смесь ДНК и РНК того же
происхождения. Одним из основных показаний к применению этих препаратов являются
миелодепрессии, вызванные цитостатическими средствами или лучевой терапией в ходе
лечения онкологических заболеваний [1-4].
Однако важно отметить, что разрешенные к клиническому применению препараты
получены из гетерологичного для человека биологического материала. Интенсивность
лейкостимулирующего
эффекта
ДНК,
как
известно,
зависит
от
ее
видовой
принадлежности [5], что позволило говорить о перспективности создания новых
препаратов с гемостимулирующими свойствами на основе ДНК, выделенной из
гомологичного биологического материала.
В ООО “Панаген” разработан препарат Панаген, представляющий собой
фрагментированный нуклеопротеидный комплекс из плаценты человека. Способ
получения позволяет выделить полноценную геномную ДНК с сохранением тех ее
фрагментов, которые прочно ассоциированы с белками ядерного матрикса. Размер
фрагментированной ДНК колеблется от 500 до 3000 пар оснований.
Изучение специфической гемостимулирующей активности субстанции Панагена
показало, что внутрибрюшинное введение препарата в дозах 2,5 и 5 мг/кг мышам СВА с
депрессией кроветворения, вызванной введением циклофосфана, ускоряло восстановление
как общего числа клеток крови и костного мозга, так и их отдельных морфологических
форм.
Целью данной работы являлось изучение распределения субстанции препарата
Панаген по тканям внутренних органов мышей и особенностей его элиминации.
УСЛОВИЯ ЭКСПЕРИМЕНТА
Для регистрации распределения и элиминации препарата из организма лабораторных
животных субстанцию препарата Панаген метили фосфором (32Р).
В исследованиях использовали субстанцию препарата Панаген с концентрацией
ДНК 3,3 мг/мл. Радиоактивно меченый препарат ДНК получали nick-трансляцией в
присутствии трех дезоксинуклеотидтрифосфатов, [альфа-32Р]дATФ и фрагмента Кленова
ДНК полимеразы 1 по методу [6]. Меченую ДНК очищали от предшественников
двукратным переосаждением
изопропанолом согласно процедуре, описанной в [7].
Удельная радиоактивность образцов субстанции Панагена, меченой фосфором, составляла
1,35- 3,3*107 имп/мин/мкг. В качестве препарата сравнения использовали препарат [альфа32
Р]дATФ.
Эксперименты проводили на самцах белых беспородных мышей ICR с массой тела
18-23 г, полученных из питомника ГНЦ ВБ «Вектор». Животные были разделены на две
экспериментальные группы, по 20 особей в каждой. Мышам первой, опытной, группы
вводили смесь немеченой и меченой субстанции Панагена в дозе 50 мкг/мышь и 0,7 млн.
имп/мин/мышь, соответственно. Использованная доза препарата составляла 2,5 мг/кг
массы тела и относилась к диапазону его эффективных доз. Препарат растворяли в 10 мМ
натрий-фосфатном буфере, содержащем 0,9% NaCl, (рН7,4) и вводили однократно
внутривенно в хвостовую вену мышей в объёме 0,1 мл на животное.
Контролем служили животные, которым
вводили смесь немеченой субстанции
Панагена и [альфа-32Р]дАТФ в дозах, эквивалентных дозам введения в опытной группе (50
мкг на мышь и 0,7 млн. имп/мин/мышь, соответственно), и том же объеме (0,1 мл).
С момента введения препаратов до забоя животных содержали группами в коробках,
выстланных фильтровальной бумагой. Мышей не кормили, но воду они получали в
неограниченном количестве. Через 0,08; 0,5; 1; 4; 24 часа после введения препаратов
животных забивали мгновенной дислокацией шейных позвонков и забирали на анализ
образцы крови, печень, почки, желудок, толстый и тонкий кишечник, тимус, селезёнку,
головной мозг, сердце, семенники, образцы кожи и мышцы. Кровь собирали в пробирки,
обработанные гепарином, и разделяли на плазму и коагулят. Желудок очищали от
содержимого, которое собирали в отдельные флаконы. Органы взвешивали и помещали в
сцинтилляционные флаконы. Определение радиоактивности образцов проводили с
помощью жидкостного сцинтилляционного счётчика mini Rakc Betta (LKB WALLAC,
Швеция).
Данные экспериментов обрабатывали методами вариационной статистики с
помощью пакета программ “Statgraphics, Vers.5.0” (Statistical Graphics Corp., USA).
Достоверность
обнаруженных
различий
оценивали
по
t-критерию
Стьюдента.
Фармакокинетические параметры рассчитывали, используя метод частевых моделей [8].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Анализ полученных данных показал, что содержание меченой ДНК, действующего
начала субстанции Панагена, в плазме крови было максимальным через 5 мин после
внутривенного введения препарата (рис.1).
Рис. 1. Динамика изменения содержания меченой субстанции Панагена (опыт) и
[альфа-32Р]дАТФ (контроль) в плазме крови мышей (в % от введенной дозы)
Концентрация меченого препарата в этот период была равна 3540 нг/мл, что
составляет 7,38% от величины введенной дозы. Содержание [альфа-32Р]дАТФ в крови
мышей контрольной группы в этот срок также достигало своего максимального уровня,
который, однако, был в 5,8 раз ниже радиоактивности крови мышей опытной группы.
Через час после инъекции препаратов радиоактивность плазмы крови опытных мышей
снижалась до контрольных значений, и в последующие сроки значения показателей в
опытной группе не отличались от контроля. Содержание меченой субстанции Панагена и
[альфа-32Р]дАТФ в плазме крови, соответственно, опытных и контрольных мышей через 4
и 24 ч после введения не превышало 0,12% от величины введенной дозы препаратов.
График зависимости содержания меченой субстанции Панагена в плазме крови
мышей от времени в полулогарифмических координатах представлен на рисунке 2.
Рис.2. Зависимость концентрации субстанции Панагена, меченой фосфором, в плазме
крови мышей (в логарифмах) от времени
Видно, что полученные данные не удается линеаризовать (представить в виде одной
прямой)
в полулогарифмических координатах. Однако экспериментальные точки
удовлетворительно
аппроксимировались
уравнением,
описывающим
двухчастевую
модель [8]:
С(t) = А1*е-αt + А2*е-βt ,
где С(t) - концентрация субстанции Панагена в плазме крови мышей в момент
времени t, нг/мл;
А1
и А2 - количество препарата,
которое выводится из 1 мл плазмы крови,
соответственно, в первой и второй фазах процесса элиминации, нг/мл;
α и β - комплексные параметры, пропорциональные константе скорости выведения
препарата в первой и второй стадиях процесса.
Фармакокинетические параметры, рассчитанные в соответствии с [8], представлены
в таблице 1.
Таблица 1 – Фармакокинетические параметры субстанции препарата Панаген
Параметр
Количество препарата, которое выводится в быстрой
фазе процесса выведения
Количество препарата, которое выводится в медленной
фазе процесса выведения
Комплексный параметр, пропорциональный константе
скорости элиминации в первой фазе процесса выведения
препарата
Комплексный параметр, пропорциональный константе
скорости элиминации во второй фазе процесса выведения
препарата
Время полураспределения препарата
Время полувыведения препарата
Константа скорости выведения из центральной камеры (1)
в периферическую камеру (2)
Константа скорости элиминации препарата
Константа скорости выведения из камеры (2) в камеру (1)
Стационарный объем распределения
Площадь под фармакокинетической кривой (AUC)
Общий клиренс
Среднее время удержания
Анализ
полученных
данных
показал,
что
Краткое
обозначение,
размерность
А1, нг/мл
16032,5
А2, нг/мл
130
α, ч-1
9,55
β, ч-1
0,215
tα1/2, ч
tβ1/2, ч
k12, ч-1
0,0726
3,22
0,290
kel, ч-1
k21, ч-1
Vss, мл
S0→∞, нг*ч/мл
ClT, мл/ч
MRT, ч
7,08
2,395
27,5
2283
21,03
5,68
препарат
субстанции
Значение
Панагена
элиминируется из крови, преимущественно, в первой, быстрой, фазе процесса, фазе
распределения.
Объем распределения препарата в стационарной фазе составлял 27,5 мл, что
значительно превышает средний объем биологических жидкостей у мышей с данной
массой тела (0,9 - 1,15 мл) и свидетельствует о высокой степени проницаемости сосудов
для субстанции Панагена и его поглощении тканями организма.
Сравнение констант скорости выведения и элиминации показывает, что скорость
проникновения препарата из крови и высоко васкуляризованных тканей (условно
отнесенных к «центральной камере») в периферические ткани («периферическая камера»)
ниже скорости обратного выведения и элиминации. Эти данные позволяют предположить,
что субстанция Панагена интенсивно метаболизируется тканями организма, и продукты
метаболизма, попадая вновь в кровеносное русло, с высокой скоростью элиминируются.
Свидетельством активного процесса элиминации препарата является значение общего
клиренса, отражающее выведение препарата в течение часа из объема, в 18-23 раза
превышающего объем биологических жидкостей. Среднее время удержания препарата
плазмой крови составляло 5,68 ч.
Анализ динамики распределения субстанции Панагена по тканям внутренних
органов показывает, что наиболее высоким было накопление препарата форменными
элементами крови, лимфоидными органами (тимус, селезенка), почками и печенью
(табл.2). Причем, значения удельной радиоактивности в форменных элементах крови
(коагулят), печени и селезенке опытных мышей достоверно превышали уровень
контрольных показателей. Интенсивность накопления препарата в ткани семенников и
головного мозга существенно не отличалась от контрольных значений и была
наименьшей, по сравнению с показателями других исследованных органов.
Сравнение показателей удельной радиоактивности почек и органов желудочнокишечного тракта показывает, что более высоким содержание
субстанции Панагена,
также как и [альфа-32Р]дАТФ, было в ткани почек. Значения показателя в опытной группе
через 0,5 ч после введения составляли 24,1 ± 2,0 *103 имп/мин/г (20,8 ± 7,46 *103
имп/мин/г в контрольной группе) с последующим снижением в течение суток в 3 и 2 раза,
соответственно.
Повышение удельной радиоактивности органов желудочно-кишечного тракта
мышей обеих экспериментальных групп было более умеренным по величине.
Максимальное увеличение радиоактивности
кишечника и его содержимого в
контрольной группе наблюдали через 4 часа после введения препарата [альфа-32Р]дАТФ.
Радиоактивность кишечника в этот срок возрастала в 2,8 раза, по сравнению с исходными
значениями (5 мин после введения) и составляла 6,96 ± 0,48*103 имп/мин/г, его
содержимого-в 5,35 раз (7,33 ± 0,98*103 имп/мин/г), желудка -в 1,73 раза (8,59 ± 0,54*103
имп/мин/г). Значения радиоактивности этих органов контрольных мышей оставались
повышенными до конца эксперимента.
Таблица 2 – Удельная радиоактивность органов и крови после введения субстанции Панагена, меченой фосфором, и [альфа-32Р]дАТФ,
*103 имп/мин/г массы ткани
Орган
Препарат
Время после введения, ч
0,08
0,5
1
4
24
Плазма
Суб. Панагена
58,3 ± 12,0*
11,8 ± 2,8*
1,73 ± 0,42
0,912 ± 0,048
0,701 ± 0,032
[альфа-32Р] дАТФ 10,1 ± 2,1
2,71 ± 0,19
1,70 ± 0,12
1,00 ± 0,27
0,964 ± 0,042
Коагулят
Суб. Панагена
29,7 ± 8,8*
4,82 ± 1,40
1,54 ± 0,34*
3,50 ± 1,62
1,40 ± 0,12*
[альфа-32Р] дАТФ 3,39 ± 1,19
3,58 ± 0,71
3,41 ± 0,68
4,84 ± 1,86
2,81 ± 0,15
Печень
Суб. Панагена
12,2 ± 3,0*
18,7 ± 2,4*
15,9 ± 3,6*
9,03 ± 1,4*
6,00 ± 0,33
[альфа-32Р] дАТФ 3,45 ± 2,0
7,28 ± 0,71
6,51 ± 0,39
5,73 ± 0,54
5,84 ± 1,08
Почки
Суб. Панагена
15,8 ± 2,5
24,1 ± 2,0
13,9 ± 2,7
9,41 ±0,56*
7,99 ± 0,73
[альфа-32Р] дАТФ 20,8 ± 7,46
20,5 ± 0,75
13,7 ± 0,81
13,2 ± 0,46
9,66 ± 0,78
Кишечник
Суб. Панагена
0,93 ± 0,11*
2,96 ± 0,33*
4,13 ± 0,99
3,78 ± 0,20*
3,86 ± 0,28*
[альфа-32Р] дАТФ 2,46 ± 0,98
5,95 ± 0,33
6,09 ± 0,52
6,96 ± 0,48
5,92 ± 0,27
Содержимое
Суб. Панагена
0,43 ± 0,03
1,48 ± 0,22*
1,65 ± 0,48*
3,90 ± 0,38*
3,86 ± 0,28*
кишечника
[альфа-32Р] дАТФ 1,37 ± 0,84
3,38 ± 0,53
5,57 ± 1,35
7,33 ± 0,98
5,92 ± 0,27
Желудок
Суб. Панагена
3,25 ± 0,18
6,36 ± 0,49
6,54 ± 1,06
6,40 ± 0,14*
6,16 ± 0,46*
[альфа-32Р] дАТФ 4,97 ± 1,76
5,84 ± 0,57
6,72 ± 0,43
8,59 ± 0,54
10,2 ± 0,5
Сердце
Суб. Панагена
6,91 ± 0,64
7,49 ± 0,92
6,09 ± 1,08*
6,20 ± 0,55*
5,67 ± 0,44*
[альфа-32Р] дАТФ 7,06 ± 1,51
11,6 ± 2,0
10,7 ± 1,0
11,6 ± 1,0
8,58 ± 0,61
Селезёнка
Суб. Панагена
10,9 ± 1,8 *
17,5 ± 2,8
16,0 ± 2,5
14,7 ± 0,7*
16,6 ± 1,7
[альфа-32Р] дАТФ 4,74 ± 1,84
19,3 ± 2,9
15,3 ± 1,3
19,2 ± 1,7
18,3 ± 1,7
Тимус
Суб. Панагена
4,46 ± 0,39
9,44 ± 1,10*
9,64 ± 1,43*
15,7 ± 1,9*
21,4 ± 2,3
[альфа-32Р] дАТФ 8,44 ± 2,92
17,5 ± 1,8
16,4 ± 0,94
21,3 ± 2,4
24,8 ± 1,4
Семенники
Суб. Панагена
1,85 ± 0,40
2,85 ± 0,35
2,78 ± 0,50
2,59 ± 0,61
3,68 ± 0,43
[альфа-32Р] дАТФ 3,39 ± 1,17
3,62 ± 0,45
3,91 ± 0,42
3,57 ± 0,34
5,35 ± 0,58
Головной мозг
Суб. Панагена
0,95 ± 0,13
0,52 ± 0,09
0,41 ± 0,09
0,48 ± 0,04
0,96 ± 0,06
[альфа-32Р] дАТФ 0,74 ± 0,33
0,63 ± 0,05
0,64 ± 0,08
0,92 ± 0,10
1,68 ± 0,08
Мышца
Суб. Панагена
2,46 ± 0,02
4,98 ± 0,56*
6,31 ± 1,34*
6,81 ± 0,25*
6,16 ± 0,97
[альфа-32Р] дАТФ 4,48 ± 1,28
8,91 ± 0,74
11,3 ± 0,5
15,0 ± 1,8
6,13 ± 2,66
Кожа
Суб. Панагена
4,98 ± 0,45*
8,57 ± 1,06
7,09 ± 1,30
7,44 ±0,80
5,64 ± 0,69
[альфа-32Р] дАТФ 9,98 ± 1,95
10,7 ± 1,3
10,5 ± 0,6
11,1 ± 1,0
8,78 ± 0,82
* - достоверно по отношению к контролю, р<0,05
Максимальные значения показателя в кишечнике и желудке опытных мышей были
отмечены через 1 час после введения субстанции Панагена (4,13 ± 0,99 и 6,54 ± 1,06*103
имп/мин/г, соответственно), в содержимом кишечника-через 4 часа (3,90 ± 0,38 *103
имп/мин/г). Следует отметить, что показатели удельной радиоактивности органов
желудочно-кишечного тракта мышей опытной группы на протяжении всего эксперимента
были ниже контрольных значений.
На основании этих данных можно заключить, что основным органом выведения
субстанции Панагена из организма, также, как и [альфа-32Р]дАТФ, являются почки, в
меньшей степени препарат выводится через желудочно-кишечный тракт.
В таблице 3 приведены расчетные фармакокинетические параметры, отражающие
интенсивность проникновения и длительность удержания препарата периферическими
тканями. Видно, что наиболее высокие показатели параметра fт, свидетельствующего о
степени
тканевой доступности, установлены для лимфоидных органов, печени и
почек. Препарат не только накапливался в большей степени в тимусе и селезенке, чем
в других
органах,
но и дольше ими удерживался, о чем свидетельствуют высокие
значения времени удержания
(MRTт). В отличие от лимфоидных органов, время
удержания субстанции Панагена тканью печени было сравнительно небольшим и не
превышало показатель, определенный для ткани почек.
Расчетные показатели тканевой доступности и времени удержания, определенные
для форменных элементов крови, были не слишком высоки, хотя и превышали показатели
плазмы крови, что, по-видимому, является результатом кратковременности накопления
препарата этими клетками.
Таблица 3 – Фармакокинетические параметры распределения субстанции препарата
Панаген в тканях внутренних органов и биологических жидкостях
Орган/биологическая
жидкость
Плазма
Коагулят
Печень
Почки
Кишечник
Содержимое кишечника
Сердце
Желудок
Селезенка
Тимус
Семенники
Головной мозг
Мышца
Кожа
Тканевая доступность, fT
1,71
5,31
5,94
2,38
2,28
3,76
3,93
9,78
10,9
1,92
0,43
4,03
4,17
Среднее время удержания,
MRT, ч
5,68
7,68
9,31
10,5
12,2
12,7
11,6
11,9
12,6
14,1
13,8
15,6
11,7
10,7
Наименее проницаемыми для субстанции Панагена, в соответствии со значениями
fT, были ткани головного мозга и семенников, при этом эти органы отличались наиболее
высокими значениями показателя MRT. Эта закономерность, по-видимому, обусловлена
низкой скоростью циркуляции крови в этих органах и
существованием гисто-
гематических барьеров, препятствующих свободному перемещению препарата
между
кровеносными сосудами и межклеточным пространством.
Следует отметить, что значения удельной радиоактивности всех внутренних
органов, за исключением головного мозга, через 24 ч после введения меченой субстанции
Панагена превышали ее содержание в крови (табл.2). При этом ни в одном из органов
мышей опытной группы уровень остаточной радиоактивности не превышал контрольных
значений показателя. Вероятнее всего, это свидетельствует о том, что компоненты
препарата Панаген, полученные в результате его метаболических превращений, способны
включаться в метаболизм клеток и/или клеточные синтезы, причем, через те же
механизмы, что и свободные нуклеотиды.
Уровень остаточной радиоактивности в периферических органах опытных и
контрольных мышей был чрезвычайно низок (в пределах от 0,1 до 0,4 % от введенной
дозы), за исключением печени и кишечника, где значения показателя составляли 1,3-1,8%
от величины введенной дозы. На основании этих данных можно заключить, что как
субстанция Панагена, так и препарат сравнения в течение суток после введения, в
основном, выводились из организма мышей.
Таким образом, показано, что препарат субстанции Панагена при его внутривенном
введении в терапевтической дозе быстро элиминировался из кровеносного русла и
распределялся по тканям внутренних органов. Процесс элиминации препарата из крови
носил двухфазный характер.
Установлено, что основными органами-мишенями субстанции Панагена являются
печень, тимус и селезенка, форменные элементы крови, что может свидетельствовать о
том, что эти клетки и органы являются мишенями его фармакологического действия.
Основным путем выведения субстанции препарата Панаген, также как контрольного
препарата, являются почки. Интенсивность выведения субстанции Панагена через
желудочно-кишечный тракт была ниже элиминации контрольного препарата. Процесс
элиминации субстанции препарата Панаген из организма лабораторных мышей, в
основном, завершался к концу первых суток после введения.
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
1. Беседнова Н.Н., Эпштейн Л.М. Дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК) из молок
рыб - перспектива клинического применения. Владивосток, 2002.-38 с.
2. Пашук Л.К., Апрышко Г.Н., Трещалина Е.М.//Хим-фарм.журн.-1995.-№6.-С.61-64.
3. Рыкова Е.Ю., Лактионов П.П., Власов В.В.//Усп.совр.биол.-2001.-Т.121.-С.160-171.
4. Sparwasser T., Hultner L., Koch E.S. et.al.//J.Immunol.-1999.-Vol.162.-P.2368-2374.
5. Stacey K.J., Sester D.R., Sweet M.J. et.al.//Curr.Top.Micribiol.Immunol.-2000.Vol.247.-P.41-58.
6. Бычков М.Б., Бодягин Д.А., Борисов В.И. и др. //Клинический вестник.- 1997.- №1.С.85-86.
7. Трещалина Е., Бычков М., Бодягин Д.// Врач.- 1996.-№2.- С.26-27.
8. Соловьев В. Н., Фирсов А. A., Филов В. А. Фармакокинетика. М:
Медицина,1980.