Структурно-временная организация печени, лимфатической
реклама
Всякие УДК, ББК, ISBN, авторы и пр. БОРОДИН Ю.И., ТРУФАКИН В.А., МИЧУРИНА С.В., ШУРЛЫГИНА А.В. СТРУКТУРНО-ВРЕМЕННАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ПЕЧЕНИ, ЛИМФАТИЧЕСКОЙ, ИММУННОЙ, ЭНДОКРИННОЙ СИСТЕМ ПРИ НАРУШЕНИИ СВЕТОВОГО РЕЖИМА И ВВЕДЕНИИ МЕЛАТОНИНА ВВЕДЕНИЕ Монография содержит результаты многолетней работы сотрудников Федерального государственного бюджетного учреждения «Научно-исследовательского института клинической и экспериментальной лимфологии» СО РАМН и Федерального государственного бюджетного учреждения «Научно-исследовательского института физиологии» СО РАМН, посвященной изучению структурно-временной организации печени и основных гомеостатических систем организма (лимфатической, иммунной, эндокринной) в условиях нарушения светового режима. Последнее является в современном обществе значимым экологическим фактором антропогенного происхождения и приводит к нарушению синтеза мелатонина и развитию десинхроноза. В книге приводится обширный фактический материал, основанный на результатах собственных исследований, о суточной временной организации и последствиях ее нарушения в печени с позиции ее лимфатического региона (концепция академика РАМН Ю.И. Бородина). Рассмотрены взаимосвязи лимфатического региона печени с лимфатической, иммунной, 3 ВВЕДЕНИЕ эндокринной системами. Охарактеризованы особенности клеточного пула как рециркулирующего, так и центральных и периферических органов иммунитета (тимус, селезенка, лимфатические узлы). В приведенных исследованиях применялся интегральный подход с оценкой изучаемых объектов на молекулярном, субклеточном, клеточном, тканевом уровнях и уровне межсистемных взаимодействий с учетом биоритмов. Важный круг вопросов касается изучения молекулярных особенностей клеточной гибели в печени и ее регионарных лимфатических узлах. Проведенные исследования позволили установить развитие взаимосвязанного каскада реакций в печени и ее лимфатическом регионе в условиях светового десинхроноза, свидетельствующего, что состояние органа и его лимфатического аппарата может находиться не только в прямой, но и в обратной взаимосвязи. Авторы показывают, что в этих условиях механизмы апоптоза способствуют нормализации гомеостаза в печени и ее лимфатическом регионе и, усиливая детоксикационную функцию регионарных лимфатических узлов, способствуют ее более полной реализации. Впервые в эксперименте в модели измененного светового режима (круглосуточного освещения) показана возможность коррекции нарушенных циркадианных биоритмов иммунной системы с помощью мелатонина и его индуктора амитриптилина. Изучены синхронизирующие и иммуномодулирующие эффекты мелаксена при лечении больных с атопическим дерматитом и бронхиальной астмой, которые ассоциируют4 ВВЕДЕНИЕ ся с повышением клинической эффективности терапии этих тяжелых, социально значимых заболеваний. Книга может быть полезна для анатомов, гистологов, лимфологов, иммунологов, патофизиологов, гепатологов, врачей (терапевтов, дерматологов), студентов и преподавателей биологических и медицинских вузов. 5 ВВЕДЕНИЕ Список сокращений АД — атопический дерматит АОК — антителообразующие клетки АТФ — аденозинтрифосфат БА — бронхиальная астма ГЗТ — гиперчувствительность замедленного типа ГЭР — гранулярный эндоплазматический ретикулюм ДНК — дезоксирибонуклеиновая кислота ИЛ — интерлейкин ИРИ — иммунорегуляторный индекс ИФА — иммуноферментный анализ ИФН — интерферон МАТ — моноклональные антитела МТ — мелатонин НК — натуральные киллеры ОСМА — оптико-структурный машинный анализ РНК — рибонуклеиновая кислота ФИТЦ — флюоресцеин-изотиоцианат ФНО — фактор некроза опухоли ФР — физиологический раствор NaCl ФЭ — фикоэритрин ЦНС — центральная нервная система ЭПР — эндоплазматический ретикулюм CD — кластер дифференцировки HLA — human leukocyte antigen Ig — иммуноглобулин NKT-клетки — Т-клетки со свойствами натуральных киллеров TCR — Т-клеточный рецептор (T-cell receptor) Th — Т-хелперы 6 ВВЕДЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ Ритмичность функционирования — фундаментальное свойство всех живых систем. Биологические ритмы свойственны биохимическим и физиологическим процессам организма человека и животных. Они определенным образом синхронизированы между собой и образуют единую временную организацию. Это обеспечивает необходимую последовательность всех жизненных процессов, эффективность адаптационных реакций, наиболее экономичный режим функционирования всех органов и систем. Суточный ритм является базовым [15], так как на его основе строятся другие периодические программы (месячные, годовые, приливные), он сформировался и закрепился в эволюции под влиянием смены темного и светлого времени суток. Таким образом, суточный ритм имеет внешний «времязадатель», действующий с астрономической точностью, в условиях которого проходила эволюция живых систем с момента их первого появления на планете. Ритмический характер функционирования играет важнейшую роль в обеспечении нормальной жизнедеятельности. На основании биологических ритмов строятся периодические программы, обеспечивающие необходимый порядок протекания биопроцессов, реализации адаптивных реакций, оптимальный уровень функционирования системы в каждый данный момент времени [22, 94]. Биологиче7 ВВЕДЕНИЕ ские ритмы различных органов и систем организма определенным образом синхронизированы между собой, образуя «внутреннюю временну́ю упорядоченность», которая является эндогенной и генетически обусловленной, но, тем не менее, стабилизируется под действием периодических факторов внешней среды — синхронизаторов, или «времязадателей». Известно, что световой режим — один из самых сильных синхронизаторов суточных биологических ритмов у млекопитающих. Его нарушение вызывает состояние десинхроноза — рассогласования во времени физиологических процессов — и искажение периодической программы [15, 96]. Следует отметить, что в случае восстановления нормального режима через какое-то время происходит ресинхронизация биологических ритмов. С другой стороны, если организм длительное время находится в условиях не свойственного для него светового режима, то устанавливается соответствующая ему, новая временна́я организация. При этом период перестройки биологических ритмов, во время которого нарушается периодическая программа организма (период острого десинхроноза), является значительным стрессовым фактором, который может привести к развитию той или иной патологии, особенно если к ней есть предрасположенность, или адаптационные возможности организма ослаблены. В современных условиях все большее число людей находится в ситуациях, когда их привычный жизненный уклад полностью или частично перестраивается. Перемещения с большими скоростями через не8 ВВЕДЕНИЕ сколько часовых поясов, работа в ночные смены (или по «скользящему» графику) врачей, диспетчеров, сотрудников МЧС, военнослужащих, в условиях вахтовой организации труда в Сибири, областях Приполярья и на Крайнем Севере, ночное освещение городов и другие обстоятельства меняют привычный ритм жизни, приводят к рассогласованию функций организма во времени и развитию десинхроноза. Установлено, что у людей в этих условиях развиваются симптомы дневной усталости, снижение бдительности, когнитивных навыков, происходит нарушение цикла сна и бодрствования. Смена часовых поясов у пассажиров воздушных судов может усугублять аффективные расстройства и приводить к развитию сердечнососудистых нарушений, заболеваний желудочно-кишечного тракта и расстройствам психики [163]. Все большее воздействие на человеческую популяцию оказывает активная деятельность в условиях искусственного освещения, приводящего к удлинению светового периода суток. Ночное освещение улиц городов и внутренних пространств жилых и производственных помещений уже практически сгладило естественный ритм чередования дня и ночи, а активная жизнь в ночное время приводит к ухудшению состояния здоровья, ускорению процессов старения, а, по данным некоторых авторов, и к развитию рака [38]. Известно, что синтез мелатонина осуществляется в организме в темное время суток, с максимумом — после полуночи. Установлено, что пребывание человека и животных в условиях круглосуточного освещения 9 ВВЕДЕНИЕ приводит к подавлению синтеза мелатонина (функциональной эпифизэктомии) и развитию десинхроноза [164]. Десинхроноз, нарушая согласованность работы гомеостатических регуляторных систем, может также усугублять патогенность других повреждающих влияний. Показано, что у людей, часто попадающих в условия нарушенных циркадианных ритмов, увеличивается риск развития иммунодефицитных состояний, аллергических заболеваний, онкологических болезней [108, 135]. В условиях нарушенного светового режима значительная нагрузка ложится на гомеостатические системы, обеспечивающие резистентность организма: эндокринную, лимфатическую, иммунную системы, систему крови. Современная лимфология включает в объект своего исследования три составляющие — лимфатическую (дренажную, сосудистую) систему, часть лимфоидной (иммунной) системы и систему рыхлой соединительной ткани (интерстиция) [16]. Эти компоненты в своем взаимодействии образуют единую протективную систему, или «систему биобезопасности» [42, 43], морфофункциональной единицей которой является лимфатический регион, включающий в себя транспортную и детоксикационную составляющие [17, 19]. Лимфатический регион охватывает регионарный лимфатический аппарат органа (части тела) и бассейн его лимфосбора. Установлено, что в механизмах регионарного клеточно-тканевого дренажа в качестве первого этапа правомерно рассматривать перемещение мобильной тканевой воды в интерсти10 ВВЕДЕНИЕ циальных тканевых пространствах (тканевых щелях) к корням лимфатической системы, завершающееся лимфообразованием [16, 18]. Функции лимфатического региона не исчерпываются дренажным компонентом. В его состав входят элементы, которые обеспечивают контроль антигенно-структурного гомеостаза и в каждом конкретном лимфатическом регионе. Это лимфоидные (иммунокомпетентные) клетки, находящиеся в интерстиции органа, а также образующие паренхиму регионарных лимфоузлов. Функции данных клеточных элементов разнообразны. Это и иммунологические реакции на проникновение инфекционного антигена, и аутоантигены, и регуляция процессов пролиферации и дифференцировки клеток другой тканевой принадлежности, и выработка биологически активных веществ — цитокинов и гормонов, которые взаимодействуют с нейроэндокринной системой. Таким образом, лимфатический регион органа во многом определяет его функциональное состояние. Клеточные элементы лимфоидной системы образуются и дифференцируются в ее центральных органах, общих с центральным звеном кроветворения и иммунитета — красном костном мозге и тимусе. После прохождения этапа центральной дифференцировки эти клетки заселяют и периферические органы иммунной системы в лимфатических регионах. Особенностью гистофизиологии лимфатической и лимфоидной системы является их чрезвычайная динамичность. В них постоянно идут процессы клеточной пролиферации, дифференцировки, миграции, 11 ВВЕДЕНИЕ кооперации, апоптоза, рециркуляции в комплексе с циркуляцией лимфы и тканевой жидкости. Эта динамичность обусловливает необходимость рассмотрения их функционирования в пространственно-временном аспекте [92]. В данной монографии мы приведем собственные результаты и данные литературы о суточной временной организации и последствиях ее нарушения на разных уровнях системы — уровне лимфатического региона печени, рециркулирующего клеточного пула и уровне центральных и периферических органов, общих с системой иммунитета (тимус, селезенка). Степень патогенности для организма любого из повреждающих факторов лимитируется интегральными взаимодействиями между печенью и гомеостатическими системами, обеспечивающими резистентность организма (лимфатической, иммунной, эндокринной). Печень, являющаяся по своей системной значимости и многообразию выполняемых функций «метаболическим мозгом» организма, координирует разнообразные потоки материала, организуя сложные формы «метаболического поведения», адаптируя его к потребностям организма [55]. Печень является основным органом детоксикации, и на нее ложится значительная нагрузка при действии неблагоприятных факторов внешней среды, к каковым относится десинхроноз. Выступая в роли своеобразного фильтра, печень очищает венозную кровь, возвращающуюся от органов желудочно-кишечного тракта. Установлено, что до 70% лимфы грудного лимфатического протока поступает из печени. При этом регионарные лимфа12 ВВЕДЕНИЕ тические узлы печени выступают в роли периферических фильтров, очищающих лимфу, образующуюся в печени. Показано синхронное с печенью участие регионарных лимфатических узлов в гомеостатических реакциях органа при воздействии круглосуточного освещения [21, 68, 66], полициклических ароматических углеводородов [41, 63], CCl4, алкоголя [64], высоких температур [36, 69, 70], магнитного поля промышленной частоты [65, 67]. Морфофункциональные преобразования в печени и ее регионарных лимфатических узлах также зависят от временного фактора, однако до настоящего времени остается не изученным вопрос о влиянии нарушенного светового режима на лимфатический регион печени. Установлено, что морфофункциональное состояние тканевого микрорайона печени может свидетельствовать о реакции организма в целом, тогда как оценка степени изменений региональных лимфатических узлов позволяет рассматривать последние в качестве маркера состояния самого органа [41]. При этом основные метаболические процессы в органах реализуются на уровне тканевого микрорайона. Сопоставление накопленных данных о роли соединительной ткани в передаче информации структуры и поддержании иммуно-структурного гомеостаза, обеспечении клеток паренхимы энергетическим и пластическим материалом, о защитно-охранительной роли капилляро-прекапиллярных структур при воздействии повреждающих факторов позволило В.П. Казначееву и М.Я. Субботину [33, 34] сформулиро13 ВВЕДЕНИЕ вать концепцию микрорайона как модуля микроциркуляторного русла, обслуживающего определенный регион паренхимы, между которыми существует обратная связь. Принимая концепцию микрорайона В.П. Казначеева, мы предлагаем расширенное понимание этого термина, включая в понятие «микрорайон» не только кровеносный капилляр и окружающую соединительную ткань, но также лимфатический капилляр, дренирующий интерстиций и паренхиматозные клетки органа в данном микроскопическом пространстве. Мы полагаем также, что к фигурантам микрорайона следует отнести пути несосудистой микроциркуляции тканевой жидкости в интерстиции, которая, резорбируясь в лимфатический капилляр, образует лимфу — прелимфатики, по терминологии M. Foldi и G. CaslySmith (16). Изучение структурно-функциональных особенностей клеток печени показало, что именно кооперативные взаимодействия высокоспециализированных паренхиматозных клеток печени — гепатоцитов и синусоидальных клеток, располагающихся по ходу кровеносных синусоидных капилляров, и работа в строго определенном ритме помогают печени выполнять более 500 функций [78]. Изучение циркадианной организации организма показало, что в отличие от «центральных часов» (супрахиазматического ядра) периферические органы также имеют циркадианную организацию, контролируемую генами. В печени, желудочно-кишечном тракте и жировой ткани обнаружена временная регуляция клеточного цикла 14 ВВЕДЕНИЕ (a clock-regulating cell cycle) и «такт»-регулирующие клетки, участвующие в обеспечении организации циркадианных ритмов [107, 113, 147]. Циркадианные часы, как сообщается, регулируют обмен веществ, энергетический гомеостаз в печени и других тканях и органах. Это достигается за счет активности ключевых ферментов метаболизма и транспортных систем. В свою очередь, ключевые ферменты метаболизма и транскрипции активаторов взаимодействуют и влияют на организацию клеточного ритма. В настоящее время известно, что у млекопитающих, в начале периода активности, печень выделяет наибольшее количество желчи, расходует гликоген и накапливает жиры. В конце активной фазы — накапливает гликоген, причем суточный ритм гликогенолиза и гликогенеза регулируются генами, контролирующими циркадианную ритмичность и экспрессирующимися в клетках печени — Clock, Bmal1, Cry1, Cry2, Per1, Per2, Per3 [107, 120, 172]. Суточному ритму подчиняется синтез ДНК, как в интактной, так и в регенерирующей печени мышей [141]. Установлено наличие суточных вариаций размеров ядер гепатоцитов, ядерноцитоплазматического отношения, размеров коркового и мозгового вещества печеночных лимфатических узлов у мышей линии (CBA×C57 BL)F1 и соотношения субпопуляций лимфоцитов в тимусе и селезенке, содержавшихся в условиях нарушенного светового режима [68, 71, 99, 100]. Гепатоциты также выделяют специфический ядерный фактор NF-B, который снижает повышенную экспрессию генов воспалительного ответа и 15 ВВЕДЕНИЕ активизацию клеток Купфера в ответ на прием жирной пищи, а также провоспалительные цитокины ФНОальфа, ИЛ-6 и ИЛ-1 [160, 118]. Помимо этого, в экспериментах на животных с мутациями в генах получены доказательства связи между циркадианной организацией и метаболическим гомеостазом. Необходимо отметить, что такие метаболические нарушения, как ожирение, гипертония и резистентность к инсулину, являются последствием нарушения циркадных ритмов [126]. Следует отметить, что функции печени и лимфоидной (иммунной) системы теснейшим образом связаны между собой. Внимание иммунологов, гепатологов, вирусологов все больше приковывается к вопросам понимания роли печени в иммунологических реакциях организма. В последние годы доказано, что сама печень является иммуноактивным органом: в ней содержится большое количество резидентных макрофагов (клеток Купфера). Т-лимфоциты, проходящие через печень, проходят в ней определенные этапы своей дифференцировки. Открытие апоптоза (программированной гибели клеток), отличающегося от некроза, как по морфологическим, так и по биохимическим признакам, перевернуло сложившиеся годами представления о клеточной гибели. Апоптоз является активным процессом, направленным на блокаду ДНК-зависимых синтетических реакций. Он необходим для нормального протекания процессов эмбрио-, морфогенеза и дифференцировки клеток. Посредством апоптоза организм постепенно избавляется от «ненужных» в функциональном отношении 16 ВВЕДЕНИЕ на данный момент клеток. При этом не нарушается нормальное функционирование соседних клеток, что позволяет сохранить структуру органа. Если клетка не в состоянии произвести апоптоз (из-за мутации или заражения вирусом), она может начать делиться бесконтрольно, что приводит к развитию опухоли. Апоптоз является одним из основных механизмов регулирования иммунной системы. Исследователи I.N. Crispe и W.Z. Mehal выявили, что в печени происходит апоптоз Т-клеток [115]. Ими представлена гипотеза, что печень является «ловушкой» для откликающихся Т-клеток, вызывает их уничтожение, индуцируя, таким образом, клеточную толерантность. Элиминируя аутореактивные Т-киллеры, апоптоз играет важную роль в обеспечении гомеостаза тканей, предотвращая деструкцию собственных клеток. Апоптоз зрелых лимфоцитов, преимущественно Т-хелперов, является средством регуляции интенсивности и продолжительности иммунного ответа. В патогенезе многих лимфопролиферативных и аутоиммунных заболеваний присутствуют механизмы нарушения апоптоза по типу негативной активации, приводящей к неудержимой клеточной пролиферации «запрещенных» клонов лимфоцитов. Многие приобретенные иммунодефициты также могут быть связаны с этим эффектом. Несмотря на то, что апоптоз могут активировать различные экзо- и эндогенные факторы, все они опосредуются конкретными внутриклеточными регуляторами апоптоза, однако вопрос влияния нарушения светового режима на молекулярные переключатели апоп17 ВВЕДЕНИЕ тоза в печени и ее регионарных лимфатических узлах до настоящего времени остается открытым. В печень мигрируют NKT-клетки, дифференцирующиеся в тимусе, большинство из которых способны к продукции интерферона-гамма. При этом как количество данных клеток, так и их интерферон-продуцирующая функция ритмично изменяются с периодом около 24 часов [145]. Таким образом, вполне закономерным является изучение комплексной реакции печени, ее лимфатического региона и иммунной системы на действие дестабилизирующих факторов внешней среды, к которым относится нарушение светового режима. Известен феномен ритмичности функционирования лимфоидной системы: в течение суток в интактном организме в несколько раз изменяется сила ответа на антигенный стимул, уровень устойчивости к цитотоксическим веществам и другие параметры резистентности организма. Из всех колебательных процессов именно формирование суточных биоритмов лимфоидных органов оказывает заметное влияние на состояние естественной резистентности и хронорезистентности организма [52]. В условиях влияния на организм человека антропогенных экологических факторов иммунный гомеостаз выступает в роли интегрального показателя здоровья индивидуума. Оптимальный уровень функционирования иммунной системы зависит от ее циркадианной периодической программы, представленной комплексом биоритмов, находящихся между собой в определенных фазовых взаимоотношениях [92, 97]. 18 ВВЕДЕНИЕ Изменение естественного ритма чередования света и темноты оказывает десинхронизирующее действие на иммунную систему (изменяет суточный ритм клеточного состава лимфоидных органов и крови и вызывает развитие иммунодефицитного состояния) [22]. В настоящее время получены данные о чрезвычайной значимости циркадианных ритмов в регуляции функций лимфоидной (иммунной) системы и поддержании ее «оптимального морфофункционального состояния» [91]. На протяжении суток закономерно и циклично меняется функциональное состояние иммунной системы, метаболический статус, субпопуляционный состав клеточных элементов центральных и периферических лимфоидных органов, пролиферация иммунокомпетентных клеток и продукция ими цитокинов [22, 39, 116, 144]. Обнаружено, что характер 24-часовых ритмов количества В- и Т-клеток, Т-лимфоцитов, Т-хелперов и Т-супрессоров/киллеров, экспрессии поверхностных молекул CD45, CD5, CD3 и CD4 на лимфоцитах крыс зависит от светового режима и меняется при содержании животных в условиях постоянного света или постоянной темноты [119, 150]. Доказано, что при нахождении в условиях круглосуточного освещения, а также при инверсии светового режима у лабораторных мышей и крыс изменяется суточная динамика клеточного состава лимфоидных органов и крови, ускоряется развитие генетически обусловленного аутоиммунного заболевания (мыши Swiss), снижается гуморальный и клеточный иммунный ответ на Т-зависимый антиген, усиливает19 ВВЕДЕНИЕ ся повреждающее действие бензпирена на показатели иммунного статуса [22, 153, 155, 100]. Возможно, что с иммунологическими дисфункциями, наступающими в результате нарушения синхронизирующего влияния светового режима, связана повышенная онкологическая заболеваемость у людей, занятых на сменной работе, при ночных дежурствах, у пилотов [135]. Тесная функциональная связь многих показателей иммунной системы позволяет предположить, что в норме существует их синхронизация, которая обеспечивает оптимальное состояние иммунитета в каждый данный момент времени и может нарушаться как при развитии иммунных и воспалительных реакций, так и при действии внешних десинхронизирующих факторов. Механизмы иммунных нарушений, возникающих при десинхронозе, могут базироваться на рассогласовании суточных биоритмов различных проявлений функциональной активности иммунокомпетентных клеток: пролиферации, апоптоза, дифференцировки, миграции, кооперации, продукции цитокинов. Можно предположить, что при рассогласовании по фазе циркадианных ритмов функционирования различных органов организма — десинхронозе, может измениться степень или направленность воздействия повреждающих факторов. Ведущим синхронизатором циркадианных ритмов у млекопитающих и человека является гормон эпифиза мелатонин (МТ), обладающий широким спектром биологической активности. Мелатонин участвует в регуляции функций центральной и вегетативной нервной систем, эндокринных органов, им20 ВВЕДЕНИЕ мунной системы и их суточной ритмической активности. Иммуномодулирующее действие мелатонина обусловлено рецепцией мелатонина некоторыми субпопуляциями лимфоидных клеток, а также опосредовано влиянием опиоидов, тимических гормонов, ряда цитокинов и др. [139]. Известно, что продукция мелатонина имеет четкий суточный ритм со значительным перепадом уровня гормона в точках минимума и максимума. Показано также, что суточный ритм свойственен и субпопуляционному составу пула иммунокомпетентных клеток, состоянию их рецепторного аппарата и метаболического потенциала [93, 99]. Таким образом, на протяжении суток меняется как содержание и активность иммунокомпетентных клеток, так и уровень мелатонина. Однако неясно, в каких соотношениях находятся суточные колебания этих параметров в норме и при иммунопатологии. Хотя мелатонин является общепризнанным главным гормональным синхронизатором циркадианной системы организма млекопитающих, в том числе и человека, использование его в этом качестве достаточно ограниченно. В настоящее время основной сферой фармакологического применения мелатонина является нарушение сна и депрессивные состояния [37]. Есть данные о том, что мелатонин восстанавливает нарушенные суточные ритмы дыхательной системы при бронхиальной астме [82]. Однако неизвестно, может ли мелатонин влиять на циркадианные ритмы иммунной системы в условиях их нарушения при заболеваниях или в результате изменений светового режима. В 21 ВВЕДЕНИЕ связи с этим встает вопрос о возможности коррекции десинхроноза в лимфоидной системе воздействиями на центральные синхронизаторы организма, в частности эпифиз и синтез в нем мелатонина. В работах И.И. Дедова с соавт. [27], посвященных изучению биоритмов гормонов, установлено, что нарушение ритмичности работы нейроэндокринной системы является патогенетическим фактором развития многих заболеваний эндокринной системы, при этом установлена важная связь между циркадианными ритмами гормонов, физиологическими функциями и реактивностью иммунной системы. Учитывая то, что печень и иммунная система играют особую роль в опосредовании системных эффектов гормонов, важно было посмотреть изменение тиреоидных и половых гормонов у животных, находившихся в условиях круглосуточного освещения. В отдельности адаптивные и патологические реакции вышеупомянутых систем и органов на изменение светового режима в той или иной степени изучены, но остается открытым вопрос о значимости их согласованной интегральной работы в обеспечении процессов адаптации и резистентности при рассогласовании биоритмов («десинхронозе», по Б.С. Алякринскому [5]). Таким образом, в данном исследовании особое место было отведено изучению печени и ее лимфатического региона в комплексе с центральным и периферическим клеточным пулом лимфоидной системы, во взаимодействии с другими гомеостатическими системами в условиях воздействия на организм кру22 ВВЕДЕНИЕ глосуточного освещения. Изучались молекулярные особенности апоптоза в печени и ее лимфатическом регионе в условиях десинхроноза, вызванного нарушением светового режима. Применялся интегральный подход с оценкой изучаемых объектов на молекулярном, субклеточном, клеточном, тканевом уровнях и уровне межсистемных взаимодействий с учетом биоритмов, являющихся необходимым компонентом адаптационного процесса. Впервые в эксперименте в модели измененного светового режима (круглосуточного освещения) показана возможность коррекции нарушенных циркадианных биоритмов иммунной системы с помощью мелатонина и его индуктора амитриптилина. Изучены синхронизирующие и иммуномодулирующие эффекты мелаксена при лечении больных с атопическим дерматитом и бронхиальной астмой, которые сопровождаются повышением клинической эффективности терапии этих тяжелых, социально значимых заболеваний. 23 ГЛАВА 1. Глава 1. ЛИМФАТИЧЕСКИЙ РЕГИОН, ТКАНЕВОЙ МИКРОРАЙОН, ГЕМАТОЛИМФАТИЧЕСКИЙ БАРЬЕР ПЕЧЕНИ Ю.И. Бородин, С.В. Мичурина Современная лимфология включает в объект своего исследования три составляющие — лимфатическую (дренажную, сосудистую) систему, лимфоидную (иммунную) систему и систему рыхлой соединительной ткани (интерстиция) [16, 18]. Эти компоненты в своем взаимодействии образуют единую протективную систему, или «систему биобезопасности» [43], морфофункциональной единицей которой является лимфатический регион. В настоящее время сформулировано понятие лимфатического региона, включающего в себя транспортную и детоксикационную составляющие. Согласно концепции Ю.И. Бородина [17–19] о лимфатическом регионе, дренируемый орган и регионарные лимфатические узлы представляют собой единую функциональную гомеостатическую систему, при этом лимфатический регион охватывает регионарный лимфатический аппарат органа (части тела) и бассейн его лимфосбора. Соответственно, внутри лимфатического региона выделяются три звена лимфатического дренажа: интерстициальные несосудистые пути массопереноса из перицеллюлярного пространства к корням лимфатического русла, лимфатические сосуды 24 Лимфатический регион, тканевой микрорайон... (капилляры, посткапилляры, сосуды) и регионарные лимфатические узлы. Установлено, что в механизмах регионарного тканевого дренажа в качестве первого этапа правомерно рассматривать перемещение мобильной тканевой воды в интерстициальных тканевых пространствах (тканевых щелях) к корням лимфатической системы, завершающееся лимфообразованием [16]. Нередко первыми лимфоидными (иммунными) образованиями на пути интерстициального массопереноса оказываются скопления лимфоидной ткани. Лимфатические регионы характеризуются наличием лимфоидных структур «таможенного типа» (термин В.П. Казначеева), которые носят либо постоянный характер, либо образуются в ответ на внешнюю агрессию. Кроме постоянных или временных лимфоидных структур, выполняющих функцию детоксикации, в этот процесс по мере необходимости включаются подвижные клеточные элементы (тканевые лимфоциты, моноциты, тучные клетки, эозинофилы), которые в большем или меньшем числе обычно присутствуют в интерстиции. Внутренняя среда организма представлена аморфным коллоидоподобным матриксом межклеточного основного вещества и волокнистым каркасом, образованным пучками коллагеновых и, в меньшей степени, эластических волокон. Синонимами понятия «внутренняя среда» является интерстиций, интерстициальное пространство, эндоэкологическое пространство (по Ю.М. Левину). Исторически сложилось так, что только в водной среде возможно существование 25 ГЛАВА 1. живой клетки. Нарушение водного гомеостаза в интерстиции приводит к нарушению всех внутриклеточных механизмов жизнеобеспечения. Губительным является как недостаток, так и избыток воды в интерстиции. Интенсивность гематотканевого обмена в значительной степени зависит от медленной скорости кровотока в синусоидах, что, в свою очередь, связано с особенностями их строения. Описаны прямые, ветвящиеся и анастомозирующие типы синусоидов. Два последних типа чаще встречаются в перипортальных отделах печеночной дольки [87]. Необходимо отметить специфичность строения микрососудистого русла печени. Внутридольковые печеночные капилляры относятся к синусоидному (до 30 мкм в диаметре) типу капилляров с прерывистой базальной мембраной. Они идут между тяжами печеночных клеток — печеночными балками, от которых отграничены синусоидальными клетками, представленными гетерогенной клеточной популяцией: эндотелиоцитами, клетками Купфера, клетками Ито, Pit-клетками [14, 41, 58, 59] и несут смешанную артериально-венозную кровь (rete mirabile) от вокругдольковых артерий и вен (периферия долек) и к центральным венам (центр печеночных долек). В печени несосудистое микроциркуляторное русло представлено тканевыми щелями, которые, с одной стороны, прилежат к печеночным балкам, с другой — к стенке кровеносных капилляров и известны как пространства Диссе. По мнению Диссе, стенка этих перикапиллярных пространств представляет собой пластинку, составленную из гомогенной основной 26 Лимфатический регион, тканевой микрорайон... субстанции и включенных в нее волоконец различного калибра. Очевидно, что речь идет об основном веществе соединительной ткани, армированном тонкими пучками коллагеновых волокон. Существуют ли в реальности эти тканевые щели, или они появляются лишь при отеке — единства мнений не существует. Однако в настоящее время большинство авторов считают, что перикапиллярные щели внутри печеночных долек, где лимфатических капилляров не обнаружено, реально существуют и дренируют паренхиму печени. Доказано, что пространства Диссе переполняются тканевой жидкостью всегда, когда лимфатические сосуды, дренирующие печень, блокируются [18]. Исследователи M. Feldi и S. Kubik [123] считают, что большая часть печеночной лимфы происходит из богатой белками жидкости, наполняющей пространства Диссе, которая вначале проникает в узкие щели между паренхимой печени и соединительной тканью, окружающей ветви воротной вены, так называемые пространства Малла. Здесь путем резорбции в лимфатические капилляры образуется печеночная лимфа, которая покидает печень по лимфатическим сосудам, сопровождающим в одну сторону воротную вену и печеночную артерию, а в другую — печеночные вены. Величина и качество интерстициального массопереноса существенно зависит от функциональных и, тем более, патологических изменений в печени. Несосудистое микроциркуляторное русло печени обладает двухуровневым механизмом накопления тканевой жидкости, прежде чем она резорбируется лимфатическим руслом. О том, в 27 ГЛАВА 1. чем биологический смысл этого каскада, и всегда ли используются оба этапа несосудистой микроциркуляции, можно лишь строить предложения. Являются ли прелимфатики только прелимфатиками? Думается, что их можно считать прелимфатиками, поскольку они содержат резерв тканевой жидкости для резорбции в лимфатические капилляры. Однако, жидкость, наполняющая тканевые щели, оттекает и в венозное русло. Этот процесс зависит от градиентов гидростатического и онкотического давлений в кровеносном капилляре, интерстиции, лимфатическом капилляре, а также от состава веществ (коллоиды, кристаллоиды, корпускулярные частицы) в тканевой жидкости. Пути тканевой несосудистой микроциркуляции при всем их разнообразии выполняют одну весьма важную функцию, формируя в интерстициальном «болоте» направленные потоки мобильной воды в зависимости от конкретной ситуации в интерстиции. Эта ситуация может существенно изменяться в зависимости от температуры, рН среды, степени полимеризации протеогликанов в основном веществе соединительной ткани, от содержания свободных радикалов, продуктов перекисного окисления липидов. Перемещение тканевой жидкости образует тканевой сектор внутриорганизменного круговорота воды. Как пополняется водное содержание интерстиция? Считается, что источником тканевой жидкости является ультрафильтрация плазмы крови из кровеносных капилляров на уровне микрорайона (по терминологии В.П. Казначеева) [33, 34]. Модифицируя понятие «микрорайон», мы, как было отмечено 28 Лимфатический регион, тканевой микрорайон... выше, вкладываем в него не только гемомикрососудистое содержание (артериола – капилляр – венула), но также интерстиций и лимфатический капилляр. В интерстиции молекулы воды в большей или меньшей степени связываются с белково-углеводными комплексами, формируя надмолекулярные структуры. Превышение депонирующих возможностей этих комплексов приводит к появлению в интерстиции свободной, мобильной воды, обеспечивая водные потребности клеток и одновременно вымывая из клеток в перицеллюлярное пространство клеточные метаболиты. Эта же «избыточная» мобильная тканевая вода является источником пополнения плазмы крови водой и кристаллоидами, а лимфы — водой, кристаллоидами, коллоидами и корпускулярными телами. Имеются данные, что примерно через 2 недели в человеческом организме происходит замена молекул воды [88]. Считается, что резорбция тканевой жидкости лимфатическими капиллярами определяется градиентом гидростатического и онкотического давлений в ткани и лимфатическом капилляре. В отличие от кровеносных, лимфатические капилляры отделяются от окружающей рыхлой соединительной ткани лишь одним слоем эндотелиальных клеток, лишенных базальной мембраны. Такое устройство стенки лимфатических капилляров способствует легкости проникновения воды и растворенных либо взвешенных в ней веществ как из интерстиция в просвет капилляра, так и из капилляра вовне. Судя по всему, транспорт жидкости происходит как путем диффузии через ци29 ГЛАВА 1. топлазму эндотелиоцита, так и через межэндотелиальные контакты. В последние годы стали писать и о так называемых течах, или макропорах, в стенке лимфатического капилляра. Такие особенности строения стенки лимфатического капилляра определяют пути резорбции веществ в лимфатические капилляры, поскольку кристаллоиды из интерстиция попадают преимущественно в кровеносное русло, в то время как коллоидные и корпускулярные тела резорбцируются в лимфатическое русло [18]. Согласно формуле Старлинга, перемещение жидкости из кровеносного капилляра в ткань и из ткани обратно в кровеносное русло, а также из ткани в лимфатические капилляры основывается на разности гидростатического и онкотического давлений в кровеносном капилляре — его артериальном и венозном отделах, в окружающем интерстиции и в лимфатическом капилляре. Правда, следует отметить, что если существование градиентов гидростатического давления между кровеносным капилляром и соединительной тканью принимается как установленный факт, то существование постоянных градиентов давления между тканью и просветом лимфатического капилляра не во всех случаях находит подтверждение. И все же эта гипотеза (в качестве рабочей) кажется удовлетворительной, поскольку стенка лимфатического микрососуда сращена с окружающим коллагеновым остовом соединительной ткани. Это также объясняет, почему при обводнении интерстиция лимфатический капилляр не только не сдавливается, но, напротив, 30 Лимфатический регион, тканевой микрорайон... расширяется и градиент давлений в ткани и сосуде сохраняется. При этом в процессе лимфообразования существенное значение имеет степень открытия межэндотелиальных контактов в стенке лимфатического капилляра. Считается, что межэндотелиальные контакты в стенке лимфатического капилляра не единственные, а возможно, и не главные «проводники» тканевой жидкости в лимфатическую систему, однако наблюдения А. Kastenholz [133] наглядно показали, что этот механизм лимфообразования действительно работает в режиме реального времени. При высоком тканевом давлении межэндотелиальные контакты открываются, подобно клапанам, при низком давлении они закрыты. Таким образом, давний спор о том, являются ли межэндотелиальные контакты закрытыми или открытыми, на сегодняшний день кажется исчерпанным. В зависимости от степени обводнения интерстиция межэндотелиальные контакты в стенке лимфатического капилляра могут варьировать от закрытости до полуоткрытости и полной открытости — «зияния». При этом степень открытости межэндотелиальных контактов в стенке лимфатического капилляра коррелирует со степенью наполнения окружающих капилляры тканевых щелей — прелимфатиков. Последние, по нашим наблюдениям, могут находиться в одном из трех функциональных состояний, которые мы обозначили как «покой», «напряжение», «недостаточность». Различные сочетания морфофункционального состояния тканевых щелей (прелимфатиков) и лимфатических капилляров, их дренирующих, в каждый данный 31 ГЛАВА 1. момент определяет эффективность лимфообразования. С учетом функциональной близости системы несосудистой микроциркуляции в интерстиции и лимфатических капилляров, дренирующих интерстиций, существует соблазн включить прелимфатики в лимфатическую систему. Однако, выстраивая схему регионарного лимфодренажного механизма, невозможно не заметить того факта, что: 1) ни в одном из интерстициальных «каналов» не обнаружен эндотелий и 2) нигде не найдены оформленные соустья между «каналами» и лимфатическими капиллярами. По нашему убеждению, речь может идти о сочетанной транспортной и дренирующей роли системы рыхлой соединительной ткани и лимфатической системы. Если же принять во внимание тот факт, что лимфатический дренаж всегда сочетается с иммунным контролем, который осуществляют лимфоидные структуры, присутствующие в лимфатическом регионе, то возникает представление о существовании единой функциональной системы (протективной системы, по В.И. Коненкову [42, 43]), обеспечивающей биологическую безопасность организма на всех его уровнях. Необходимо отметить, что в монофункциональных органах, например в мышцах, сухожилиях, несосудистое микроциркуляторное русло организовано сравнительно просто. Пути несосудистой микроциркуляции представлены в этих участках межтканевыми щелями между пучками коллагеновых волокон, в которые тканевая жидкость поступает через гистогематические и гистолимфатические барьеры. 32 Лимфатический регион, тканевой микрорайон... В таком же полифункциональном органе, как печень, несосудистое микроциркуляторное русло устроено сложнее, чем в монофункциональных органах. Организация путей движения жидкостей (кровь, лимфа, желчь) внутри классической печеночной дольки (ее паренхима — это трабекулы, состоящие из гепатоцитов, окружающие центральную вену) имеет свои особенности. Известно, что в «rete mirabile» кровеносных синусоидных капилляров печеночных долек смешанная кровь, поступающая из ветвей воротной вены и печеночной артерии (междольковые и вокругдольковые вены и артерии), движется от периферии классической дольки к ее центру, где расположена центральная вена дольки. Внутри классических печеночных долек несосудистое микроциркуляторное русло представлено тканевыми щелями, известными как пространства Диссе, которые, с одной стороны, прилежат к синусоидальному полюсу гепатоцитов, а с другой — к стенке кровеносных капилляров. Стенка синусоидов образована гетерогенной популяцией синусоидальных клеток (эндотелиальные клетки, имеющие большие «поры», клетки Купфера, Pit-клетки, клетки Ито), а также единичными ретикулиновыми волокнами и коллагеновыми фибриллами, поддерживающими структуру синусоида. Интенсивность гематолимфатического обмена в печеночной дольке зависит от особенностей строения гематолимфатического барьера печени, представленного кровеносным синусоидным капилляром и его 33 ГЛАВА 1. стенкой (включающей эндотелиальные клетки и клетки Купфера), пространством Диссе (с расположенными в нем единичными аргирофильными волокнами и коллагеновыми фибриллами, Pit-клетками, отростками перисинусоидальных липоцитов и тканевой жидкостью). При этом и стенки синусоидов, и «базальная», обращенная к пространствам Диссе, поверхность гепатоцитов лишены базальных пластинок, а интерстициальное пространство выступает как «пространство обмена», через которое осуществляются метаболические связи и транспорт, наиболее важным компонентом которого является гематолимфатический перенос жидкости, белка и других веществ. «Конечным этапом» этого транспортного пути являются лимфатические микрососуды, которые, согласно данным [12], способны выступать в качестве своеобразных регуляторов интерстициальных взаимодействий. Таким образом, если рассматривать движение тканевой жидкости (прелимфы) внутри пространства Диссе, то, помимо интимных взаимоотношений с клеточной выстилкой синусоида и гепатоцитами, осуществляется ее перемещение в область междольковых лимфатических сосудов, где она рассматривается уже в качестве лимфы. В паренхиме печени есть еще один жидкостный компартмент, который не совсем попадает под определение интерстициального [12] — это желчь. Потоки желчи ограничиваются плотными контактами между мембранами билиарных полюсов соседних гепатоци34 Лимфатический регион, тканевой микрорайон... тов печеночных балок. Движение желчи происходит от желчных капилляров в сторону желчных протоков, то есть в том же направлении, что и движение прелимфы и лимфы (рис. 1). Схема движения жидкостей в печеночной дольке Условные обозначения: 1. Печеночные балки. 2. Кровеносный синусоидный капилляр. 3. Пространство Диссе. 4. Центральная вена. 5. Междольковая артерия. 6. Междольковая вена. 7. Междольковый желчный проток. 8. Желчный капилляр. 9. Гепатоцит. 10. Синусоидальныя клетка. 11. Лимфоциты. 12. Коллагеновые волокна. 13. Лимфатический сосуд. Направление перемещения: - венозной крови - желчи - прелимфы и лимфы - из синусоидных капилляров в гепатоциты Рис. 1. Схема движения жидкостных составляющих в печеночной дольке (рис. С.В. Мичуриной) 35 ГЛАВА 1. Таким образом, движение жидкостных составляющих внутри печеночной дольки по двум сторонам гепатоцитов (тканевой жидкости внутри пространства Диссе и желчи внутри желчных капилляров) происходит в одном направлении, противоположном движению смешанной крови в кровеносных синусоидных капиллярах. В перемещении жидкостных составляющих внутри печени существенную роль играет ткань, окружающая портальную зону (междольковую соединительную ткань), в которой располагаются кровеносные сосуды, желчный проток, собирающий желчь из желчных капилляров (так называемая триада). Однако здесь же находятся и лимфатические капилляры, в которые поступает лимфа от печеночной дольки. При этом, говоря о сосудах портального тракта, не нужно забывать о наличии в меж- и вокругдольковой соединительной ткани печени лимфатических сосудов. Поэтому, рассматривая вопрос движения всех жидкостных составляющих, целесообразнее обращаться к понятию портальной (воротной) дольки, в которой паренхима — это ткань, окружающая портальную зону, поскольку в этой зоне содержится желчный проток, куда окружающие печеночные трабекулы выделяют желчь. Необходимо добавить, что там же находятся и лимфатические сосуды, в которые поступает лимфа от печеночной дольки. Учитывая вышеизложенное, для характеристики морфологических компартментов междольковой соединительной ткани печени целесообразно использовать термин «тетрада», который включает междольковую артерию, меж36 Лимфатический регион, тканевой микрорайон... дольковую вену, междольковый лимфатический сосуд и междольковый желчный проток. Следующим своеобразием лимфатического региона печени является известная автономность лимфатических путей, дренирующих паренхиму и капсулу печени. Поверхностная лимфатическая сеть дренирует капсулу печени и, как отмечают многие авторы, не контактирует или почти не контактирует с глубокими лимфатическими сосудами. По-видимому, «перемешивание» глубокой и поверхностной печеночной лимфы происходит в основном в регионарных лимфатических узлах, хотя и здесь есть своя особенность: глубокая лимфа оттекает в Inn. hepatici и в Inn. gastrocoeliaci вдоль v. portae и a. hepatica, а вдоль v. hepatica — в Inn. juxtaphreniei dextri. Поверхностная лимфа оттекает в Inn. hepatici, Inn. gastrocoeliaca, а также частично в Inn. Lumbales dextri [123]. Заключение В соединительнотканной капсуле печени, в междольковой соединительной ткани органа несосудистое микроциркуляторное русло организовано по принципу монофункциональных органов. Пути несосудистой микроциркуляции представлены в этих участках межтканевыми щелями между пучками коллагеновых волокон, в которые тканевая жидкость поступает через гистогематические и гистолимфатические барьеры соответствующих сосудов. 37 ГЛАВА 1. Внутри классических печеночных долек несосудистое микроциркуляторное русло представлено тканевыми щелями, известными как пространства Диссе, которые, с одной стороны, прилежат к синусоидальному полюсу гепатоцитов, а с другой, — к стенке кровеносных капилляров. Гематолимфатический барьер печени представлен кровеносным синусоидным капилляром и его стенкой (включающей эндотелиальные клетки и клетки Купфера), пространством Диссе (с расположенными в нем единичными аргирофильными волокнами и коллагеновыми фибриллами, Pit-клетками, отростками перисинусоидальных липоцитов и тканевой жидкостью). Движение жидкостных составляющих по двум сторонам гепатоцитов (тканевой жидкости внутри пространства Диссе вдоль синусоидального полюса гепатоцитов и желчи вдоль билиарного полюса гепатоцитов внутри желчных капилляров) происходит в одном направлении, противоположном движению смешанной крови в кровеносных синусоидных капиллярах. Характеризуя элементы портального тракта печени, необходимо учитывать присутствие в меж- и вокругдольковой соединительной ткани печени лимфатических капилляров, поэтому нам представляется целесообразным введение в научный оборот термина «тетрада» — вена, артерия, желчный проток, лимфатический сосуд. Рассматривая русло несосудистой микроциркуляции печени, в целом следует признать, что оно 38 Лимфатический регион, тканевой микрорайон... ГЛАВА 2. устроено достаточно сложно и состоит как минимум из двух «каскадов»: пространство Диссе — первый, и перипортальные пространства Мала — второй каскады. О смысле такой архитектоники можно только догадываться. Глава 2. ПЕЧЕНЬ И ЕЕ ЛИМФАТИЧЕСКИЙ РЕГИОН ПРИ ВОЗДЕЙСТВИИ КРУГЛОСУТОЧНОГО ОСВЕЩЕНИЯ 2.1. Суточные вариации морфометрических показателей тканевого микрорайона печени и ее регионарных лимфатических узлов у мышей линии (CBA×C57 BL)F1, содержавшихся в условиях круглосуточного освещения С.В. Мичурина Для моделирования экспериментального десинхроноза использовали мышей (CBA×C57 BL)F1 самцов в возрасте 3-4 мес., полученных из питомника НИИКиЭЛ СО РАМН, подвергая их в течение двух недель воздействию круглосуточного освещения. Контрольные группы содержались при обычном световом режиме. На 15-й день мышей декапитировали в 10.00, 15.00 и в 19.00 часов по 6-7 животных из каждой группы в каждую временную точку для определения суточных вариаций исследуемых показателей. Взятие образцов органов, изготовление и окраску гистологических препаратов (гематоксилином Майера и эозином) проводили по стандартным методикам. Морфометрический анализ светооптических препаратов осуществляли с помощью окулярной морфометрической сетки, состоящей из 25 тестовых точек и 5 линий, методом точечного счета [1]. На гистологических препаратах, полученных 39 40 Печень и ее лимфатический регион... от каждого животного, исследовали по 100 полей зрения. В печени при помощи морфометрической сетки определяли долю площади (%), занимаемой цитоплазмой и ядрами гепатоцитов, кровеносными синусоидными капиллярами и синусоидальными клетками (гетерогенная клеточная популяция, состоящая из эндотелиоцитов, клеток Купфера, клеток Ито и Pit-клеток). В гепатоцитах вычисляли ядерно-цитоплазматическое отношение. В лимфатических узлах определяли долю площади (%), занимаемую корковым и мозговым веществом. Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием пакета статистических программ «Statistica 5». Стандартная обработка вариационных рядов включала подсчет значений средних арифметических величин и их стандартных ошибок. Значимость различий оценивали по критерию Стьюдента при 95%-ном уровне значимости. Эксперименты выполнены с соблюдением принципов гуманности, изложенных в директивах Европейского сообщества (86/609/ЕЕС) и Хельсинской декларации. При обзорной микроскопии в печени животных, находившихся в условиях круглосуточного освещения в течение двух недель, выявлена неравномерность кровенаполнения кровеносных синусоидных капилляров (рис. 2), застойные явления в междольковых артериях, венах и желчных протоках, расширение в междольковой соединительной ткани лимфатических пространств Малла (рис. 3). Под влиянием круглосуточного освещения изменяются суточные вариации морфометрических показа41 ГЛАВА 2. телей тканевого микрорайона печени (рис. 4–6). К 15.00 происходит инверсия показателей объемной плотности цитоплазмы гепатоцитов. Ядерно-цитоплазматическое соотношение в 15.00 становится выше, чем у контрольных животных (см. рис. 4). Исчезает суточный ритм изменения показателей объемной и численной плотности синусоидальных клеток (см. рис. 5). Возрастает объемная плотность синусоидных капилляров печени: в 10.00 — в 1,5 раза, в 15.00 — в 2 раза, по сравнению с контрольной группой животных (см. рис. 6). Рис. 2 и 3. Микрофотографии печени животных, подвергнутых воздействию круглосуточного освещения. Окраска гематоксилином и эозином. Ув. об. × 40 42 Печень и ее лимфатический регион... ГЛАВА 2. ое , низк Растр ение разреш е низко , р т с Ра ение разреш Рис. 4. Изменение ядерно-цитоплазматического отношения гепатоцитов в норме и при воздействии круглосуточного освещения; * — различие статистически достоверно при р<0,05 Рис. 6. Объемная плотность кровеносных синусоидных капилляров печени в норме и при воздействии круглосуточного освещения; * — различие статистически достоверно при р<0,05 ое , низк р т с а Р ение разреш е низко , р т с Ра ение разреш Рис. 5. Относительная объемная плотность синусоидальных клеток печени в норме и при воздействии круглосуточного освещения; * — различие статистически достоверно при р<0,05 43 Рис. 7. Суточные вариации относительной объемной плотности коркового и мозгового вещества лимфатических узлов интактных животных; * — различие статистически достоверно при р<0,05 44 Печень и ее лимфатический регион... ГЛАВА 2. 2.2. Микро- и ультраструктурная организация печени крыс Вистар при воздействии круглосуточного освещения С.В. Мичурина, Ю.И. Бородин, Г.М. Вакулин, А.Д. Белкин ое , низк Растр ение разреш Рис. 8. Суточные вариации относительной объемной плотности коркового и мозгового вещества лимфатических узлов животных, находившихся в условиях круглосуточного освещения; * — различие статистически достоверно при р<0,05 При морфометрическом анализе лимфатических узлов животных, находившихся при постоянном освещении, выявлено (по сравнению с контролем) сглаживание суточного ритма показателей относительной объемной плотности коркового и мозгового вещества (рис. 7, 8). Заключение Таким образом, установлено, что круглосуточное освещение животных в течение 14 дней приводит к нарушению суточных вариаций морфометрических показателей тканевого микрорайона печени и к их сглаживанию в лимфатических узлах. Это свидетельствует о развитии десинхроноза, структурный след которого проявляется в печени и ее лимфатическом регионе. 45 Другая серия экспериментов была проведена на самцах крыс Вистар с исходной массой 180–220 г. Животные были разделены на 2 группы: 1-ю группу — контрольную, содержали в течение двух недель при естественном световом режиме (К), 2-я группа в течение этого периода находилась в условиях круглосуточного освещения (КО). По истечении этого срока животных декапитировали (под легким эфирным наркозом) в 10.00 (по 14 животных в контрольной и подопытной группах). Образцы печени и ее регионарные лимфатические узлы фиксировали в нейтральном 12%-ном формалине. Парафиновые срезы толщиной 5–7 микрон после депарафинизации окрашивали гематоксилином и эозином. Полученные гистологические препараты изучали при помощи светового микроскопа «Micros MC 300A». Цифровые фотографии получали с помощью цифровой камеры «CХ 13с» фирмы «Baumer». Морфометрический анализ светооптических препаратов осуществляли с помощью окулярной морфометрической сетки, состоящей из 25 тестовых точек и 5 линий, методом точечного счета [1] и программы 46 Печень и ее лимфатический регион... «ВидеоТесТ 4.0 — Мастер». На гистологических препаратах, полученных от каждого животного, исследовали по 100 полей зрения. В печени при помощи морфометрической сетки определяли долю площади (%), занимаемой цитоплазмой и ядрами гепатоцитов, кровеносными синусоидными капиллярами и синусоидальными клетками (гетерогенная клеточная популяция, состоящая из эндотелиоцитов, клеток Купфера, клеток Ито и Pit-клеток). В гепатоцитах вычисляли ядерно-цитоплазматическое отношение. Определяли численную плотность гепатоцитов, диплокариоцитов, синусоидальных клеток и индексы отношения численной плотности диплокариоцитов к общему числу гепатоцитов и синусоидальных клеток к общему числу гепатоцитов, коэффициент Визотто. В лимфатических узлах определяли долю площади (%), занимаемую корковым и мозговым веществом. Образцы органов для электронно-микроскопических исследований фиксировали в 4%-ном параформальдегиде на 0,1 М фосфатном буфере (рН 7,4) с последующей дофиксацией в 1%-ном растворе четырехокиси осмия на том же буфере, обезвоживали и заключали в «Эпон-812». Ультратонкие срезы получали на ультратоме «LKB8800» (Швеция), контрастировали насыщенным водным раствором уранилацетата и цитратом свинца и изучали в электронных микроскопах «JEM-100S/ SEC» (Япония). Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием пакета статистических программ «Statistica 5». Стандартная обработ47 ГЛАВА 2. ка вариационных рядов включала подсчет значений средних арифметических величин и их стандартных ошибок. Значимость различий оценивали по непараметрическому критерию Манна-Уитни с использованием дисперсионного многомерного анализа MANOVA и по критерию Стьюдента при 95%-ном уровне значимости. Эксперименты выполнены с соблюдением принципов гуманности, изложенных в директивах Европейского сообщества (86/609/ЕЕС) и Хельсинской декларации. В междольковой соединительной ткани печени животных, подвергавшихся круглосуточному освещению в течение 14 дней, выявлены застойные явления в междольковых артериях, венах и желчных протоках (см. рис. 9). Выявляется расширение щелей между паренхимой печени и соединительной тканью, окружающей ветви воротной вены, так называемых лимфатических пространств Малла, что свидетельствует о напряженном состоянии путей тканевой несосудистой микроциркуляции. Пространства Малла, также как и пространства Диссе авторы рассматривают как прелимфатики. В расширенных прелимфатиках и лимфатических сосудах печени наблюдается значительное число лимфоцитов и макрофагов. Вокруг кровеносных и лимфатических сосудов образуются периваскулярные инфильтраты (рис. 9, а–г). Ученые M. Greter, J. Hofmann, B. Becher [129] из Университетского госпиталя Цюриха доказали, что в некоторых случаях функцию лимфоузла может брать 48 Печень и ее лимфатический регион... а б в г ГЛАВА 2. рой образуются «неолимфоидные агрегаты» (вторичные лимфоидные узелки), где и активируются клетки Т-киллеры, способные самостоятельно уничтожать крупные чужеродные частицы. Также активируются Т-хелперы, «предназначенные» для дальнейшей стимуляции В-лимфоцитов, но из-за отсутствия необходимого для В-лимфоцитов микроокружения второй процесс у мышей без лимфоузлов не идет. В печеночных дольках животных, находившихся в условиях круглосуточного освещения, выявлено достоверное увеличение площади кровеносных синусоидных капилляров (рис. 10). Численная плотность одно- и двуядерных гепатоцитов увеличилась, а синусоидальных клеток не изменилась (рис. 11). Рис. 9. Застойные явления в междольковой соединительной ткани: а — расширение интерстициальных пространств; б — миграция в расширенные интерстициальные пространства и лимфатические сосуды лимфоцитов и макрофагов, в и г — формирование периваскулярных инфильтратов. Окр. гематоксилином Майера и эозином. Ув. об. × 40 на себя печень. В экспериментах на мышах линии (aly/ aly), генетически лишенной лимфатических узлов, ученые установили, что встреча антигенпрезентирующих клеток и Т-лимфоцитов у этих животных вместо лимфоузлов происходит именно в печени, в кото49 е низко , р т с Ра ение разреш Рис. 10. Морфометрические показатели печени при воздействии круглосуточного освещения; * — различие статистически достоверно при р<0,05 50 Печень и ее лимфатический регион... ое , низк Растр ение разреш Рис. 11. Численная плотность паренхиматозных и синусоидальных клеток печени при воздействии круглосуточного освещения; * — различие статистически достоверно при р<0,05 Хотя печеночные балки сохранены, отмечается гибель отдельных гепатоцитов. Известно, что при повреждении гепатоцитов продукты распада захватываются клетками Купфера. В ответ на захват продуктов некроза клетки Купфера начинают секретировать in situ цитокины, лейкотриены, активные формы кислорода, которые действуют на прилежащий эндотелий сосудов и переводят его в активное состояние. Активация эндотелия проявляется в том, что в его мембране появляется много адгезивных белков, в первую очередь таких Е-селектинов, как белок ЕLAM-1 (от англ. endothelium-leukocyte adhesion molecule), 51 ГЛАВА 2. притягивающих лейкоциты крови и выполняющих функцию якоря, фиксирующего нейтрофилы к сосудистой стенке. Сразу заметим, что одни адгезивные белки эндотелия связывают полиморфно-ядерные лейкоциты, другие — мононуклеарные клетки крови (лимфоциты и моноциты). Поэтому клеточный состав инфильтрата зависит от свойств эндотелия и программируется еще в самом начале процесса. Надо заметить, что полиморфно-ядерные лейкоциты не только активируют эндотелий, но и вырабатывают факторы деструкции (протеазы и активные формы кислорода), повреждающие стенку микрососудов печени. В свою очередь активные формы кислорода, наряду с другими свободными радикалами, включаются в липопероксидацию и деструкцию гепатоцитов [58, 59, 137]. Кроме этого нами обнаружено, что круглосуточное освещение обладает стимулирующим действием на паренхиматозные клетки печени. Об этом свидетельствует достоверное увеличение в 1,4 раза ядерноцитоплазматического отношения в гепатоцитах (рис. 12) и в 17 раз индекса отношения двуядерных гепатоцитов к одноядерным гепатоцитам, при отсутствии реакции со стороны синусоидальных клеток (рис. 13). Известно, что в условиях физиологической нормы процесс полиплоидизации является следствием конкуренции между ауто- и гетеросинтезами, когда клеткам не хватает пластических и энергетических запасов для полноценного митоза [23]. При патологических процессах в результате гибели части клеток в печени происходит стимуляция регенерации органа, 52 Печень и ее лимфатический регион... ое , низк Растр ение разреш Рис. 12. Изменение индекса ядерно-цитоплазматического отношения в гепатоцитах животных, содержавшихся в условиях естественного освещения и при круглосуточном освещении; * — различие статистически достоверно при р<0,05 ое , низк Растр ение разреш Рис. 13. Индексы отношения численной плотности диплокариоцитов и синусоидальных клеток печени к общему числу гепатоцитов у животных, содержавшихся в условиях естественного освещения и при круглосуточном освещении; * — различие статистически достоверно при р<0,05 53 ГЛАВА 2. основными клеточными механизмами которой являются пролиферация, полиплоидизация, как ведущие ДНК-синтетические процессы, что приводит в итоге к увеличению числа гепатоцитов и/или количества геномов в клетках [83, 84, 171]. По-видимому, в ответ на изменение гомеостаза в печени в условиях светового десинхроноза происходит мобилизация адаптационных процессов, приводящих к компенсаторному повышению синтетического потенциала гепатоцитов. Ультрамикроскопическое изучение образцов печени показало, что в условиях светового десинхроноза происходит расширение просветов кровеносных синусоидных капилляров, эндотелиальные клетки набухают и округляются (рис. 14). В эндотелиоцитах исчезает примембранный актин, и происходит снижение количества пиноцитозных пузырьков, нередко наблюдаются митохондрии с уплотненным матриксом. При этом часть эндотелиальных клеток разрушается, оголяя поверхность гепатоцитов, что свидетельствует о нарушении гематолимфатического барьера печени. Разбалансировка корней лимфатической системы приводит к нарушению гематолимфатического барьера в печени: разобщению контактов между эндотелиальными клетками, а в ряде случаев — разрушению эндотелиоцитов и, как следствие, разобщению паренхиматозных клеток органа, что создает условия для активации апоптоза. Клетки белой крови проходят либо через межэндотелиальные пространства при округлении эндотелиоцитов и увеличении щелей, либо непосредственно через 54 Печень и ее лимфатический регион... эндотелиальную клетку (цитопемзис) [85]. Округление и разрушение эндотелиальных клеток приводит к грубым нарушениям проницаемости, что позволяет из крови свободно проходить в пространство Диссе и далее в регионарные лимфатические узлы печени не только соединениям с низкой молекулярной массой, но и крупным молекулам альбуминов, глобулинов фибриногена, эритроцитам, клеткам белой крови, в том числе эозинофильным гранулоцитам (рис. 18 а, в). Важно отметить, что и стенки синусоидов, и «базальная», обращенная к пространствам Диссе, поверхность гепатоцитов лишены базальных пластинок, а интерстициальное пространство выступает при этом как «пространство обмена», через которое осуществляются метаболические связи и транспорт, наиболее важной составляющей которой является гематолимфатический перенос жидкости, белка и других веществ, «конечным этапом» которого являются лимфатические микрососуды, способные выступать в качестве своеобразных регуляторов интерстициальных взаимодействий [12]. В пространствах Диссе печени животных, содержавшихся в условиях круглосуточного освещения, обнаруживаются крупные скопления фибрилл коллагена, внедряющихся в цитоплазму гепатоцитов в виде дивертикулов, и единичные плазматические клетки. Нередко в пространствах Диссе определяется слабоосмиофильное мелкодисперсное вещество, а также клеточный детрит с отложением фибрина и фибрилл коллагена (см. рис. 14 а), что создает препятствие для осуществления процессов гематолимфатического переноса жидкости 55 ГЛАВА 2. и свидетельствует о затруднении транспорта лимфы из печени. Переполнение пространств Диссе обломками некротически измененных клеток коллагеновыми волокнами, клетками лимфоидного ряда, эритроцитами способствуют застою лимфы и развитию тканевой гипоксии, являющейся индуктором клеточной гибели. а б Рис. 14. Ультраструктурные изменения клеток печени у крыс в условиях круглосуточного освещения: а — сужение пространств Диссе и появление в них клеточного детрита с отложениями фибрина и фибрилл коллагена, ув. об. × 6600; б — фрагмент клетки Купфера с клеточным детритом, находящимся в гетерофагосомах, ув. об. × 11000 56 Печень и ее лимфатический регион... В клетках Купфера также определяется клеточный детрит (см. рис. 14 б). Часто встречаются клетки Купфера, приобретающие округлую форму из-за избытка захваченного материала (обломков погибших клеток). Отсутствие на таких макрофагах плазмолеммальных червеобразных отростков захвата также указывает на то, что клетки находятся фазе блокады фагоцитоза. На поверхности отдельных гепатоцитов происходит формирование гипоксических пузырей и инвагинаций, что свидетельствует о развитии апоптоза. Цитолемма ряда гепатоцитов утрачивает микроворсинки и десмосомы. Выявлена фрагментация и расхождение комплементарных поверхностей плотных межклеточных соединений гепатоцитов, свидетельствующих о нарушении межклеточных контактов (аноикис), что приводит к индукции апоптоза. В отдельных гепатоцитах отмечается конденсация хроматина по периферии ядра (морфологический признак апоптоза). При этом хроматин образует четко очерченные плотные массы различной формы и размеров. Механизм конденсации хроматина обусловлен расщеплением ядерной ДНК эндонуклеазами, что приводит к появлению большого количества коротких фрагментов ДНК. При развитии десинхроноза, индуцированного круглосуточным освещением, в цитоплазме гепатоцитов определяются баллонообразные расширения профилей каналов гранулярной эндоплазматической сети, их дегрануляция за счет утраты части рибосом 57 ГЛАВА 2. (осыпание рибосом). Наблюдается образование контактов каналов гранулярной эндоплазматической сети с плазмолеммой. Известно, что развитие «стресса эндоплазматического ретикулума» запускает каскад реакций, вызывающих высвобождение из ЭПР запасов Ca2+, инициирующего окислительный стресс и приводящего к активации апоптоза. Выявленные нами нарушения гемо- и лимфоциркуляции в органе приводят к развитию гипоксии, сопровождающейся, как правило, сдвигом клеточного рН, изменением концентрации ионов кальция и активных форм кислорода, что неблагоприятно сказывается на структуре и функциях митохондриального аппарата клеток [70, 137]. В митохондриях выявлена дезорганизация крист, неравномерность плотности матрикса, конденсированная конфигурация, что связывают с дефицитом кислорода, поскольку такие изменения возникают при ишемизации клеток. Накопились данные о том, что белки семейства Вcl-2 опосредуют свой эффект участия в апоптозных реакциях через митохондрии. Это выражается в падении трансмембранного потенциала внутренней митохондриальной мембраны и выходе в цитозоль проапоптозных составляющих митохондрий (в частности цитохрома-С и Apaf-1), что сопровождается активацией каспазного каскада. В известной мере толчком к этому служит передислокация белка индуктора апоптоз-специфического сигнала Bax из цитозоля в митохондрии, предшествующая активации каспаз. Снижение мембранного потенциала митохон58 Печень и ее лимфатический регион... дрий является следствием внезапного повышения проницаемости мембран митохондрий, которое приводит к выравниванию концентраций ионов по обе стороны мембран. Это проявляется в ослаблении положительного заряда внутренней поверхности мембран, а затем в выходе Са2+, снижении содержания в клетке восстановленного глютатиона, усиленном образовании супероксиданиона. Следствием повышения проницаемости мембран митохондрий является выход в цитоплазму факторов, способных вызвать деградацию хроматина в изолированных ядрах. Как только происходит полная утрата митохондриального потенциала, апоптоз становится неизбежным [58]. Цитоплазма гепатоцитов печени животных, находившихся в условиях круглосуточного освещения, обеднена каналами ГЭР, которые имеют многочисленные баллонообразные расширения; наблюдаются картины «обсыпания» рибосом. Мембраны эндоплазматического ретикулума часто окружают митохондрии, образуя комплексы-ассоциации «ГЭР-митохондрии» (рис. 15, 16). Напомним, что работами [110] показано, что на структурно-ассоциированных с митохондриями «мито-ГЭР»-комплексах происходит увеличение синтеза цитохрома Р-450 более чем в 3 раза, что создает оптимальные условия для обеспечения процессов окислительного гидроксилирования в условиях напряженного состояния организма. О напряженном состоянии процессов окислительного фосфорилирования свидетельствует выявленное нами в печени животных, находившихся в условиях круглосуточно59 ГЛАВА 2. го освещения, достоверное снижение концентрации диеновых конъюгатов (4,67±0,20 по сравнению с контролем 6,60±0,40; р<0,05). В цитоплазме гепатоцитов нередко выявляются скопления первичных лизосом и липидных капель. В ядрах гепатоцитов исчезает гетерохроматин, эухроматин приобретает глыбчатую структуру, появляются мелкие осмиофильные включения. Ядрышки теряют гранулярный компонент, что свидетельствует о снижении наработки прерибосом (см. рис. 15). По-видимому, повреждающие эффекты десинхроноза проявляются и в цепочке ДНК – РНК – белок, что приводит к появлению субклеточных признаков нарушения синтеза белка, наблюдаемых нами в гепатоцитах животных, содержавшихся в условиях круглосуточного освещения. Рис. 15. Ультраструктурные изменения в гепатоците при воздействии круглосуточного освещения. Ув. об. × 5000 60 Печень и ее лимфатический регион... Микроворсинки желчных капилляров гепатоцитов характеризуются измененной пространственной конфигурацией, они часто извиты, неравномерно утолщены, высота и количество их резко снижены. Сами желчные капилляры расширены (см. рис. 16), их просветы нередко заполнены электронно-плотным материалом, что свидетельствует о затруднении дренажа желчи у животных, находившихся в условиях круглосуточного освещения. ГЛАВА 2. ментов [80] показало, что при воздействии круглосуточного освещения происходит двукратное снижение активности бета-галактозидазы в желчи, в сыворотке крови активность N-ацетил-β,D-глюкозаминидазы снижалась более чем в 2 раза (по сравнению с контролем). Свободная активность лизосомных ферментов гомогената печени крыс, отражающая активацию лизосом и/или их повреждение при воздействии круглосуточного освещения, достоверно повышалась. Полученные результаты свидетельствуют о том, что у животных, находившихся в условиях круглосуточного освещения, нарушается синтез и выделение желчи. Учитывая, что элиминация желчи и многих метаболитов осуществляется посредством билиарной экскреции, затруднение этого процесса может также привести к нарушению внутрипеченочной микроциркуляции и, как следствие, к развитию печеночной недостаточности и избыточному развитию соединительной ткани, т.е. фиброзу печени. Рис. 16. Ультраструктурные изменения в печени при воздействии круглосуточного освещения: в гепатоците — расширенный желчный капилляр, уплотненный матрикс митохондрий, гидратированная эндотелиальная клетка, активно фагоцитирующая клетка Купфера. Ув. об. × 5000 Проведенное изучение влияния круглосуточного освещения на билиарную экскрецию лизосомных фер61 62 Печень и ее лимфатический регион... 2.3. Микро- и ультраструктурные особенности регионарных лимфатических узлов печени крыс Вистар при воздействии круглосуточного освещения С.В. Мичурина, И.Ю. Ищенко, Г.М. Вакулин Морфометрический анализ показал, что увеличение показателей объемной плотности кровеносных синусоидных капилляров тканевого микрорайона печени сопровождается синхронным увеличением суммарной объемной плотности синусной системы регионарных лимфатических узлов, что свидетельствует о затруднении дренажа лимфы (рис. 17). ое , низк Растр ение разреш Рис. 17. Изменение суммарной объемной плотности синусов регионарных лимфатических узлов и кровеносных синусоидных капилляров печени Наши результаты согласуются с данными I. Susko с соавт. [164], которые выявили факт расширения моз63 ГЛАВА 2. говых синусов в цервикальных лимфатических узлах крыс через 4 недели после пинеалэктомии. Нами установлено, что соотношение коркового и мозгового вещества в регионарных лимфатических узлах печени не изменилось (табл. 1), однако, внутри этих компартментов выявлены значительные структурные перестройки. В регионарных лимфатических узлах печени животных, находившихся в условиях круглосуточного освещения корковое вещество представлено В-зависимой зоной (лимфоидными узелками с наличием герминативных центров и без них) и Т-зависимой зоной (паракортексом); межфолликулярная зона содержит преимущественно Т-лимфоциты. Морфометрическое исследование выявило уменьшение площади лимфоидных узелков (на 16,3 %). Однако в последних достоверно возросла доля герминативных центров (на 39,4 %) (табл. 2). Удельные размеры паракортикальной зоны не изменились, но в ней отмечено увеличение содержания лимфоидных клеточных элементов за счет возрастания числа средних и малых лимфоцитов (табл. 3); количество бластов и ретикулярных клеток уменьшилось. Отмечено уменьшение площади межузелковой зоны (на 53,3 %). Как известно, в мозговом веществе лимфатических узлов выделяют мозговые тяжи (В-зависимая зона) и мозговые синусы. Нами обнаружено достоверное увеличение относительных размеров мозговых тяжей (на 9,7 %). При этом в них снижалось содержание клеточных элементов, в основном за счет уменьшения количества малых лимфоцитов (табл. 4). 64 Верна ли ссылка? Печень и ее лимфатический регион... Уменьшение относительной площади лимфоидных узелков и снижение содержания зрелых лимфоидных клеток в мозговых тяжах свидетельствует о снижении В-зависимых реакций в регионарных лимфатических узлах печени крыс, содержавшихся в условиях круглосуточного освещения. По-видимому, исключение из суточного периода темной фазы и, соответственно, снижение выработки мелатонина в результате круглосуточного освещения приводит к подавлению В-зависимых иммунных реакций. Исследователями [162] выявлена зависимость клеточного и гуморального иммунных ответов от суточного ритма мелатонина — в дневной период времени регистрировался максимальный ответ клеточного иммунитета, а в темное время суток — максимальный ответ гуморального иммунитета. Однако есть данные, согласно которым хирургическое удаление шишковидной железы приводило к снижению как клеточного, так и гуморального иммунного ответа [106, 146, 165]. Краевой синус, промежуточные синусы и мозговые синусы образуют синусную систему лимфоузла. Нами обнаружено, что увеличение размеров синусной системы (на 10,2 %) произошло, в первую очередь, за счет расширения краевого синуса (на 37,5 %). В мозговых синусах отмечено почти трехкратное снижение числа плазматических клеток (см. табл. 4). При ультрамикроскопическом исследовании в печеночных лимфатических узлах животных, находившихся под влиянием круглосуточного освещения, выявляются сквозные дефекты плазмалемм лимфоцитов. Верна ли ссылка? 65 ГЛАВА 2. Определяется осмиофильный, некротический детрит в пограничной области между тимусзависимой зоной и мозговым веществом, эритроциты, эозинофилы. Таблица 1 Соотношение структурно-функциональных зон регионарных лимфатических узлов печени (M±m) Показатели Контроль (n=253) S коркового вещества S мозгового вещества Т-зависимые зоны S паракортикальной зоны S межузелковой зоны В-зависимые зоны Суммарная S лимфоидных узелков Суммарная S герминативных центров Доля герминативных центров в лимфоидных узелках (%) S мозговых тяжей Синусы Суммарная S синусов S краевого синуса S мозговых синусов 56,9±1,9 43,1±1,9 Группа Круглосуточное освещение (n=442) 53,4±0,8 46,6±0,8 33,1±1,3 3,0±0,4 33,3±0,8 1,4±0,1* 18,4±1,4 15,4±0,6* 3,2±0,4 2,7±0,1 15,5±0,9 21,6±0,6* 25,8±1,0 28,3±0,5* 19,7±0,9 2,4±0,3 17,3±0,9 21,7±0,4* 3,3±0,3* 18,3±0,4 Примечание. S — площадь зоны на срезе, у.е.; * — отличия от контрольной группы достоверны при p<0,05. 66 Печень и ее лимфатический регион... Таблица 2 Клеточный состав герминативных центров и паракортекса печеночных лимфоузлов у крыс после воздействия круглосуточного освещения (количество клеток на стандартной площади исследования, M±m) ГЛАВА 2. Таблица 3 Клеточный состав мозговых тяжей и мозговых синусов печеночных лимфоузлов крыс после воздействия круглосуточного освещения (количество клеток на стандартной площади исследования, M±m) Группа Группа Контроль Клетки Герминативный центр Паракортекс Контроль Круглосуточное освещение Герминативный центр Паракортекс Лимфоциты: 21,45±1,01 24,20±1,11 22,72±1,27 31,64±0,98* – бласты 6,10±1,05 3,88±0,68 4,88±0,60 1,36±0,32* – средние лимфоциты 5,95±0,63 11,12±0,72 7,12±0,63 15,84±0,82* – малые лимфоциты 9,40±0,98 9,20±0,93 10,72±0,99 14,44±1,16* Макрофаги 1,65±0,28 1,40±0,20 1,44±0,21 0,96±0,18 Ретикулярные клетки 1,60±0,34 2,40±0,27 0,92±0,18 1,12±0,20* Все клетки 24,70±0,97 28,16±1,10 25,08±1,25 33,72±0,95 Примечание. * — отличия от группы «Контроль» достоверны при p<0,05. Клетки Круглосуточное освещение Мозговые Мозговые тяжи синусы 6,12±0,72* 8,32±0,76 Мозговые Мозговые тяжи синусы Лимфоциты: 9,32±0,77 6,40±0,64 – средние лимфоциты 2,00±0,34 1,28±0,22 1,76±0,27 1,72±0,26 – малые лимфоциты 7,32±0,60 5,12±0,58 4,36±0,55* 6,6±0,65 Плазматические клетки: 1,96±0,32 0,68±0,17* – бласты 2,04±0,23 0,72±0,18 1,88±0,31 0,32±0,13 – незрелые плазматические клетки 8,64±0,97 8,28±0,54 – зрелые плазматические клетки 1,88±0,30 2,04±0,36 Макрофаги 0,64±0,15 1,40±0,26 0,44±0,10 1,24±0,14 Ретикулярные клетки 1,72±0,27 2,40±0,30 1,44±0,20 2,00±0,30 Все клетки 24,24±0,77 12,92±0,85 20,68±0,62* 12,64±0,69 Примечание. * — отличия от группы «Контроль» достоверны при p<0,05. 67 68 Печень и ее лимфатический регион... а в ГЛАВА 2. зинофильных и базофильных гранулоцитов на фоне снижения кислородзависимой метаболической активности моноцитов [61]. Таким образом, полученные данные свидетельствуют о влиянии круглосуточного освещения на все звенья лимфатического региона печени, включая пути несосудистого интерстициального массопереноса, лимфатические капилляры и сосуды, регионарные лимфатические узлы. б г Рис. 18. Ультраструктурные изменения клеток регионарного лимфатического узла печени у крыс в условиях круглосуточного освещения: а — дефекты плазмолемм лимфоидных клеток, наличие эритроцитов, ув. об. × 6600; б — фрагменты разрушенных клеток в пограничной области между тимусзависимой зоной и мозговым веществом, ув. об. × 6600; в — наличие эозинофильных гранулоцитов, ув. об. × 7200; г — скопление плазматизированных В-лимфоцитов в зоне мозгового тяжа, ув. об. × 6600 Мозговые тяжи переполнены плазматическими клетками (см. рис. 18 а–г). В периферической крови нами также установлено достоверное возрастание эо69 Заключение При развитии десинхроноза, индуцированного круглосуточным освещением, установлено нарушение гемо- и лимфоциркуляции в печени и ее лимфатическом регионе, сопровождающееся разбалансировкой корней лимфатической системы, что приводит к нарушению морфологической организации гематолимфатического барьера, белоксинтетического и энергетического аппарата клеток, нарушению энергообеспечения клеток, развитию тканевой гистотоксической гипоксии, ухудшению дренажа желчи и в ряде случаев гибели клеток. Под влиянием круглосуточного освещения в лимфатическом регионе печени нарушается лимфатический дренаж во всех его звеньях, включая пути несосудистого массопереноса в интерстиции, лимфатические капилляры и сосуды, регионарные лимфатические узлы. Подтверждением этому является синхронное увеличение объемной плотности кровеносных синусоидных капилляров тканевого микрорайона печени и синусной системы регионар70 Печень и ее лимфатический регион... ных лимфатических узлов животных, подвергавшихся воздействию круглосуточного освещения. Регионарные лимфатические узлы печени после воздействия круглосуточного освещения увеличиваются в объеме. Хотя соотношение коркового и мозгового вещества в них не меняется, внутри этих компартментов выявлены значительные структурные перестройки: стимуляция В-зависимых зон и уменьшение объемной доли паракортекса. ГЛАВА 3. Глава 3. МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ОСОБЕННОСТИ АПОПТОЗА В ПЕЧЕНИ И ЕЕ ЛИМФАТИЧЕСКОМ РЕГИОНЕ У ЖИВОТНЫХ, СОДЕРЖАВШИХСЯ В УСЛОВИЯХ ЕСТЕСТВЕННОГО ОСВЕЩЕНИЯ И ПРИ ВОЗДЕЙСТВИИ КРУГЛОСУТОЧНОГО ОСВЕЩЕНИЯ 3.1. Молекулярные особенности апоптоза в печени у интактных животных и при воздействии круглосуточного освещения С.В. Мичурина, Ю.И. Бородин, В.А. Труфакин, С.А. Архипов По современным представлениям, апоптоз (программируемая смерть клеток) может быть включен в организме множеством внутренних и внешних сигналов. Апоптоз представляет собой процесс, посредством которого внутренние или внешние факторы, активируя генетическую программу, приводят к гибели клетки и ее эффективному удалению из ткани [62, 65, 67, 101, 102, 169, 170]. При активации апоптоза происходит освобождение органа от старых или наработанных в избытке клеток, а также от клеток с нарушениями дифференцировки и повреждением генетического аппарата. Апоптоз — это биохимически специфический тип гибели клетки, характеризую- 71 72 Молекулярные особенности апоптоза в печени... щийся активацией нелизосомных эндонуклеаз, которые осуществляют ферментативную дезинтеграцию ДНК до коротких олигонуклеотидов. Это определило наш интерес к изучению активности ядерных эндонуклеаз гепатоцитов при воздействии круглосуточного освещения в течение двух недель. Исследование ядерных эндонуклеаз гепатоцитов проводили на криостатных (8 микрон) срезах печени крыс. Срезы окрашивали 0,005%-ным раствором этидиума бромида. Использовали криостат «Microm HM-550», микроскоп «Axioscop FL-40 “Ziess”», программное обеспечение «AxioVision 3.1» (лицензионный номер 2100750). Для возбуждения и регистрации использовался модуль фильтров 14, CCD–Axiocam MrC «Ziess». Регистрация флюоресценции выполнялась при автоматической оптимизации работы камеры, каждое ядро маркировалось, после чего получались усредненные величины интенсивности флюоресценции, оцениваемые в черно-белом режиме, по яркости градаций серого. Иммуногистохимическим непрямым стрептавидин-авидиновым методом окрашивали срезы печени и ее регионарных лимфатических узлов на выявление белков регуляторов апоптоза в Вcl-2, Вах и Bad. Проведен количественный анализ препаратов печени для оценки уровня экспрессии Вcl-2 с использованием морфометрического комплекса, программы ВидеоТест-Морфо-4 и пакета статистических программ «Statistica 6». Результаты проведенного исследования представлены на рис. 19. Как видно из графика, при воздействии 73 ГЛАВА 3. круглосуточного освещения происходит достоверное повышение включения флюоресцентной метки (этидиума бромида) в клетках печени. Полученные нами данные усиления активности ядерных нуклеаз в гепатоцитах и синусоидальных клетках печени животных, находившихся в условиях нарушенного светового режима (в совокупности с морфологически данными), свидетельствуют об усилении активного суицидного процесса (апоптоза), направленного на предотвращение ДНК-зависимых синтетических реакций в этих клетках. Таким образом, нами установлена активация механизмов контроля и удаления дефектных клеток, возникающих при действии круглосуточного освещения, развивающаяся по пути дезинтеграции ядерного хроматина [62, 67, 70]. ое , низк Растр ение разреш Рис. 19. Интенсивность свечения флюоресцентной метки этидиума-бромида в гепатоцитах экспериментальных групп животных; * — различие статистически достоверно при р<0,05 74 Молекулярные особенности апоптоза в печени... Известно, что причины и способы формирования апоптотического сигнала, пути его передачи и формы реализации могут быть различными [25, 72]. Апоптоз сопровождается активацией ряда генов: интерлейкина1b, c- myc, p-53 и nur77. Решение жить или умереть клетке принимается на уровне белковых продуктов гена Р-53, которые являются либо индукторами (Bad, Bax, Bcl-Xs, Bik, Bid, Bak), либо ингибиторами (Bcl-2, Bcl Xl) апоптоза. При этом проапоптотическим сигналам противодействуют целые семейства белков с антиапоптотическими функциями, в частности белки Bcl-2 [25, 112]. Белки Bad, Bax являются антагонистами белка Bcl-2. Белки семейства Вcl-2 имеют в своем составе высококонсервативные гомологичные области, которые определяют их способность взаимодействовать друг с другом или с другими белками, не относящимися к этому семейству. Образование гомо- и гетеродимеров белками семейства Вcl-2 находится в постоянном динамическом равновесии, что, в конечном счете, влияет на развитие апоптоза клеток. Индукторы апоптоза (Bad, Bax и др.) способны образовывать комплекс с белком ингибитором апоптоза (Bcl-2), тем самым инактивируя его. Согласно современной модели регуляции апоптоза считается, что отношение Bcl-2 и Bad, Bax определяет чувствительность клеток к апоптотическим факторам и является «молекулярным переключателем», который определяет, будет происходить рост или атрофия ткани. Поэтому считается, что соотношение активных форм этих белков определяет «реостат» жизни и смерти клетки [25]. 75 ГЛАВА 3. Нами проведено изучение влияния круглосуточного освещения на соотношение активных форм индукторов и ингибиторов апоптоза белковых продуктов гена Р-53 в печени экспериментальных животных. У интактных животных отмечается умеренная интенсивность окраски препаратов стрептавидин-авидиновым методом на Bcl-2. Исследуемый маркер сосредоточен в лимфоцитах, синусоидальных клетках, гепатоцитах, эпителии желчных протоков. Паренхиматозные клетки имеют гетерогенное окрашивание с преобладанием гепатоцитов, не имеющих сродства к красителю. Часть долек не окрашена (рис. 20). Выявляется более интенсивное окрашивание эндотелиальной выстилки сосудов в области центральных вен, триад и синусоидов. ковые Одина си? подпи а б Рис. 20. Окраска печени на белок Bcl-2 стрептавидинавидиновым методом с докраской гематоксилином. Ув. об. × 40, ок. × 10 У животных, находившихся в условиях круглосуточного освещения, выявляется высокая интенсивность окрашивания препаратов печени. В большин76 Молекулярные особенности апоптоза в печени... стве печеночных долек краситель сосредоточен вокруг центральных вен, а также в области триад. Также установлено усиление экспрессии Bcl-2 в лимфоцитах, эпителии желчных протоков, эндотелиальной выстилке междольковых артерий, вен, лимфатических сосудов, центральных и поддольковых вен печени животных. Наиболее выражено Вcl-2-позитивное окрашивание в лимфоцитах, синусоидальных клетках и отдельных гепатоцитах печеночных долек (рис. 21). Данные компьютерной морфометрии площади иммуногистохимической окраски на белок Вcl-2 показали достоверное увеличение этого показателя в печени животных, находившихся в условиях круглосуточного освещения (рис. 22). Известно, что повышение синтеза этого белка сигнализирует об «аварийности» ситуации, в которой находится организм, и свидетельствует о риске развития апоптоза [25, 70, 72, 77, 112]. а б Рис. 21. Окраска печени на белок Bcl-2 стрептавидинавидиновым методом с докраской гематоксилином. Ув. об. × 40, ок. × 10 77 ГЛАВА 3. е низко , р т с Ра ение разреш Рис. 22. Изменение площади иммуногистохимической окраски на белок Bcl-2 препаратов печени животных, находившихся в условиях круглосуточного освещения: по оси абсцисс — группы животных: К — контроль, КО — круглосуточное освещение; по оси ординат — площадь окраски (мкм2); * — отличия от группы «Контроль» достоверны при p<0,05 Повышение экспрессии Bcl-2 в тканях организма вызываются различными по природе факторами, способными индуцировать апоптоз [25, 20, 72]. Имеются данные [25, 77], что белки семейства Bcl-2 участвуют в регуляции апоптоза, связанного с открытием митохондриальных пор и увеличением митохондриальной проницаемости. Индукторы апоптоза (Bad, Bax) об78 Молекулярные особенности апоптоза в печени... разуют каналы в мембранах митохондрий, эндоплазматического ретикулума, ядерных мембранах, воздействуя на транспортировку ионов кальция и транслокацию белков. Сверхэкспрессия белка Bcl-2 ингибирует проницаемость митохондрий, в то время как сверхэкспрессия белка Вах индуцирует ее. В клетках, подвергшихся воздействию индуктора апоптоза, в наружной мембране митохондрий образуются гигантские поры. Открытие митохондриальных пор и увеличение митохондриальной проницаемости влияют на множество параметров, в том числе на ингибирование функции дыхательной цепи, увеличение уровня цитоплазматического кальция, на окислительно-восстановительный статус клетки и т.д. Это приводит к набуханию митохондрий, разрыву их наружной мембраны. В результате открытия митохондриальных пор происходит высвобождение ряда факторов (специфических протеаз), приводящих к активации апоптоза и запуску его терминальной стадии. К числу этих факторов следует отнести цитохром-С, необходимый для формирования апоптосомы и активации каспаз. Высвобождение в цитоплазму клетки цитохрома-С, прокаспазы-2, -3, -9, белка AIF (Apoptosis inducing factor) приводит к связыванию цитохрома-С с адапторной молекулой Apaf-1, активизирующей прокаспазу-9 и приводящей к образованию апоптосомы. Каспаза-9 в свою очередь активирует эффекторную каспазу-3 или -7, которые осуществляют каскад ферментативных реакций, направленных на разрушение белков клетки и реализацию апоптоза. 79 ГЛАВА 3. Поскольку в наших экспериментах воздействие антропогенного экологического фактора (круглосуточного освещения) индуцировало образование белка Bcl-2 в клетках печени, то это свидетельствует, вопервых, о поступлении в эти клетки проапоптотических сигналов и, во-вторых, об «аварийном» включении в этих клетках Bcl2-зависимой антиапоптотической защиты, связанной с появлением таких сигналов в организме. Необходимо отметить, что Bcl-2 обладает еще одной способностью: блокируя реакции перекисного окисления липидов в мембранах клеток, он защищает клетки от повреждения свободными радикалами. При этом в препаратах печени не выявлялись антиапоптотические белки (Baх и Bad). Заключение Таким образом, выявленное нами повышение активности ядерных эндонуклеаз в печени экспериментальных животных доказывает, что световой десинроноз является фактором, способным индуцировать апоптоз. При этом проапоптотическим сигналам противодействует возрастание в печени белков с антиапоптотическими функциями (Bcl-2), при отсутствии иммуногистохимического окрашивания препаратов на проапоптотические белки (Baх и Bad), что свидетельствует о попытке организма сбалансировать работу «молекулярных переключателей» апоптоза в органе и ограничить его развитие по митохондриальному пути. 80 Молекулярные особенности апоптоза в печени... 3.2. Активность молекулярных переключателей апоптоза (Bax, Bad и Bcl-2) в регионарных лимфатических узлах печени в норме и при воздействии круглосуточного освещения С.В. Мичурина, Ю.И. Бородин, В.А. Труфакин, С.А. Архипов Bcl-2-протеин при иммуногистохимической окраске непрямым стрептавидин-авидиновым методом препаратов печени выявлялся в цитоплазме клеток в виде зерен или включений коричневого цвета, а также в виде равномерного ее окрашивания в коричневый цвет. Нами установлено, что у животных, находящихся в условиях круглосуточного освещения, происходит уменьшение экспрессии Bcl-2 в лимфоцитах коркового и мозгового вещества, клетках ретикулярной ткани, при этом интенсивность окрашивания центров размножения остается на уровне контрольных значений (рис. 23). Регуляция апоптоза представляет собой пример сбалансированного механизма с многократным дублированием противовесов, призванным обеспечить надежный контроль за поддержанием клеточного гомеостаза в условиях действия стрессирующих и повреждающих факторов среды [101, 102]. Согласно концепции Ю.И. Бородина о лимфатическом регионе, дренируемый орган и регионарные лимфатические 81 ГЛАВА 3. узлы представляют собой единую функциональную гомеостатическую систему [17, 70]. Выявленное нами в условиях воздействия КО повышение экспресии белка Bcl-2 в клетках печени свидетельствует об «аварийном» включении в печени Bcl2-зависимой антиапоптотической защиты. Известно, что индукция экспрессии белка Bcl-2 вызывает закрытие неспецифических пор в митохондриях клеток, что предотвращает выход цитохрома-С и, соответственно, активацию клеточной гибели. Известно, что наряду с антиапоптотическими эффектами Bcl-2 препятствует развитию токсических эффектов гидроксильных радикалов, блокируя реакции перекисного окисления липидов в мембранах клеток [25, 77]. К КО Рис. 23. Выявление антиапоптотического белка Bcl-2 (иммуногистохимическая окраска непрямым стрептавидин-авидиновым методом) в регионарных лимфатических узлах печени животных, подвергавшихся воздействию круглосуточного освещения: К — контроль; КО — круглосуточное освещение. Ув. об. × 40, ок. × 10 82 Молекулярные особенности апоптоза в печени... Снижение экспрессии Bcl-2 в дренирующих печень лимфатических узлах можно рассматривать не только в качестве фактора, способствующего усилению клеточной гибели, но и как проявление компенсаторного механизма, направленного на удаление дефектных клеток, апоптотических телец (как поступающих из печени, так и возникающих в лимфатических узлах) в условиях круглосуточного освещения, что способствует полноценному осуществлению лимфодетоксикации. Компьютерный морфометрический анализ препаратов регионарных лимфатических узлов печени показал, что при воздействии круглосуточного освещения происходит статистически значимое уменьшение площади иммуногистохимической окраски на белок Bcl-2 по сравнению с контролем в клетках мозгового вещества регионарных лимфатических узлов печени (рис. 24). ГЛАВА 3. У животных, подвергавшихся воздействию круглосуточного освещения, выявлялось более выраженное Bad-позитивное окрашивание непрямым стрептавидин-авидиновым методом коркового вещества лимфатических узлов (мантийная зона фолликулов и паракортикальная зона) по сравнению с контролем (рис. 25, 26). Рис. 25. Выявление проапоптотического белка Bad в регионарных лимфатических узлах печени, контроль (окраска непрямым стрептавидин-авидиновым методом). Ув. об. × 40, ок. × 10 ое , низк р т с а Р ение разреш Рис. 24. Площадь иммуногистохимической окраски регионарных лимфатических узлов печени на белок Bcl-2: К — контроль; КО — круглосуточное освещение; * — отличия от группы «Контроль» достоверны при p<0,05 83 Рис. 26. Выявление проапоптотического белка Bad в регионарных лимфатических узлах печени, находившихся в условиях круглосуточного освещения (окраска непрямым стрептавидин-авидиновым методом). Ув. об. × 40, ок. × 10 84 Молекулярные особенности апоптоза в печени... Выявленное в регионарных лимфатических узлах при воздействии круглосуточного освещения уменьшение интенсивности окрашивания белка Bcl-2 на фоне выраженного окрашивания проапоптотического белка Bad свидетельствует о «снятии» в них антиапоптотической защиты и активации процессов апоптоза. Также выявлялось Baх-позитивное окрашивание коркового вещества лимфатических узлов в группе животных, находившихся в условиях круглосуточного освещения (рис. 27, 28). Маркер преимущественно выявлялся в мантийной зоне фолликулов и паракортикальной зоне лимфатических узлов. Установленное в регионарных лимфатических узлах печени при воздействии круглосуточного освещения увеличение активности проапоптотических белков Вах и Bad при параллельном снижении интенсивности Bcl-2 иммуногистохимического окрашивания в мозговом веществе свидетельствует о «снятии» в них антиапоптотической защиты и активации процессов апоптоза. Возможно, это является проявлением функции апоптоза как механизма элиминации дефектных клеток, образующихся в результате повреждения тканей при десинхронозе. С другой стороны, можно предположить, что круглосуточное освещение, вызывая процессы клеточной деструкции [65, 66], повышает антигенную нагрузку на лимфатические узлы, что приводит к стимуляции иммунокомпетентных клеток и их «активационному апоптозу». 85 ГЛАВА 3. Рис. 27. Выявление проапоптотического белка Baх в регионарных лимфатических узлах печени, контроль (окраска непрямым стрептавидин-авидиновым методом). Ув. об. × 40, ок. × 10 Рис. 28. Выявление проапоптотического белка Baх в регионарных лимфатических узлах печени, находившихся в условиях круглосуточного освещения (окраска непрямым стрептавидин-авидиновым методом). Ув. об. × 40, ок. × 10 86 Молекулярные особенности апоптоза в печени... Таким образом, снижение антиапоптотической защиты можно считать не только негативным фактором, способствующим усилению клеточной гибели, но и компенсаторным механизмом, направленным на удаление дефектных клеток и токсических веществ, т.е. на усиление детоксикационной функции регионарных лимфатических узлов печени. Заключение Результаты изучения молекулярных особенностей клеточной гибели в печени и ее регионарном лимфатическом аппарате свидетельствуют о развивающемся взаимосвязанном каскаде реакций в печени и ее лимфатическом регионе в ответ на воздействие нарушения светового режима. Выявленная нами активация внутриядерных эндонуклеаз в печени указывает на то, что процессы апоптоза клеток в органе при воздействии круглосуточного освещения развиваются по пути дезинтеграции ядерного хроматина. При этом проапоптотическим сигналам противодействует возрастание в печени белков с антиапоптотическими функциями (Bcl-2), при отсутствии иммуногистохимического окрашивания препаратов на проапоптотические белки (Baх и Bad), что свидетельствует о попытке организма сбалансировать работу «молекулярных переключателей» апоптоза в органе и ограничить его развитие по митохондриальному пути. Установленное в регионарных лимфатических узлах печени при воздействии круглосуточного освещения увеличение активности проапоптотических 87 ГЛАВА 3. белков Вах и Bad при параллельном снижении интенсивности Bcl-2 иммуногистохимического окрашивания в мозговом веществе свидетельствует о «снятии» в них антиапоптотической защиты и активации процессов апоптоза. Полученные данные свидетельствуют о взаимосвязанной реакции печени и ее регионарного лимфатического аппарата на воздействие круглосуточного освещения и показывают, что состояние органа и его лимфатического аппарата может находиться не только в прямой, но и в обратной взаимосвязи. Выявленные особенности процесса апоптоза в условиях светового десинхроноза показывают, что механизмы апоптоза способствуют нормализации гомеостаза в лимфатическом регионе печени и самом органе и, усиливая детоксикационную функцию регионарных лимфатических узлов, способствуют ее более полной реализации. 88 Периферическая кровь при воздействии освещения... ГЛАВА 4. Таблица 4 Показатели лейкоцитарной формулы периферической крови животных При изучении абсолютных показателей лейкоцитарной формулы выявлена достаточно четкая реакция клеточного состава крови на воздействие круглосуточного освещения (табл. 4). Отмечено снижение по сравнению с контролем содержания лейкоцитов (на 22,5– 27,9 %; р<0,05) в периферической крови в опытных группах и увеличение доли эозинофилов (на 49,2–52,0 %) в группах животных, содержавшихся в условиях круглосуточного освещения. Учитывая, что среднее количество лейкоцитов у здоровых крыс составляет 12,60±1,07 (109/л), а эозинофилов — 0,26±0,04 (109/л), то выявленные изменения следует рассматривать как относительную для данной когорты животных лейкопению и эозинофилию. В качестве основной тенденции при изучении абсолютных показателей отмечено общее снижение всего пула клеток периферической крови (за исключением эозинофилов в группах животных, содержавшихся при круглосуточном освещении). При изучении относительных показателей (относительно контрольной группы) выявлено значительно больше изменений (табл. 5). 89 К КО 11,1 ±0,2 8,5 ±0,3* 0,4 1,9 ±0,2 ±0,4 0,0 1,8 ±0,4 28,1 ±2,5 26,7 ±3,1 Лимфоциты Моноциты Базофилы Форменные элементы периферической крови, % Нейтрофилы Юные 4.1. Клеточный состав периферической крови крыс Вистар в условиях круглосуточного освещения А.Д. Белкин Кол-во лейкоцитов (×109/л) Эозинофилы Группа Палочкоядерные Сегментоядерные Глава 4. ПЕРИФЕРИЧЕСКАЯ КРОВЬ ПРИ ВОЗДЕЙСТВИИ КРУГЛОСУТОЧНОГО ОСВЕЩЕНИЯ 1,3 0,0 2,8 65,9 ±0,3 ±0,6 ±2,8 2,4 0,4 3,1 65,8 ±0,4 ±0,4 ±0,4 ±3,0 Примечание. К — контрольная группа животных; КО — нахождение животных в условиях постоянного освещения; * — различие с контрольной группой статистически достоверно при р<0,05. Таблица 5 Относительные показатели лейкоцитарной формулы периферической крови животных Группа К КО Относительно контроля, % Лейкоци- Нейтро- Эозино- Моноциты филы филы ты 100 100 100 100 76,6* 72,7* 141,4* 84,8* Лимфоциты 100 76,5* Примечание. К — контрольная группа животных; КО — нахождение животных в условиях постоянного освещения; * — различие с контрольной группой статистически достоверно при р<0,05. 90 Периферическая кровь при воздействии освещения... Диаметр эритроцитов периферической крови крыс Вистар в условиях круглосуточного освещения не меняется (табл. 6). Таблица 6 Средний диаметр эритроцитов в периферической крови животных Группа К КО Диаметр эритроцитов, мкм 6,19±0,05 6,22±0,04 Примечание. К — контрольная группа животных; КО — нахождение животных в условиях постоянного освещения. 91 ГЛАВА 4. 4.2. Морфофункциональное состояние моноцитов периферической крови крыс при воздействии круглосуточного освещения по данным НСТ-теста С.А. Архипов, С.В. Мичурина Кислородзависимую метаболическую и фагоцитарную активность моноцитов крови определяли следующим способом. Гепаринизированную кровь крыс вносили в лунки планшет для иммунологических исследований в объеме 0,1 мл. Одну из лунок использовали для инкубации с раствором нитросинего (НС) тетразолия (для оценки «спонтанного» восстановления НС-тетразолия — вариант НСТ-с), другую — в смеси НС-тетразолия с корпускулярным стафилококковым реагентом (S. Aureus), для оценки восстановления НС-тетразолия активированными моноцитами (вариант НСТ-а). Оба раствора вносили в соответствующие лунки с кровью в объеме 0,1 мл. НС-тетразолий разводили в среде 199 для культивирования в концентрации 0,1 %. Стафилококковый реагент разводили в среде 199, содержащей 0,1% НС-тетразолия, в концентрации 1 мг/мл, что соответствует наличию 0,5×107 корпускулярных частиц на лунку в конечном разведении. Кровь с соответствующими растворами инкубировали при температуре 37 °С в течение 1 часа, суспендировали, наносили на предметные стекла и делали мазки. Мазки фиксировали метанолом в течение 5 минут. Препараты окрашивали азур-эозином. Определе92 Периферическая кровь при воздействии освещения... ние процента мононуклеарных фагоцитов, способных восстанавливать НС-тетразолий до формазана и фагоцитировать, проводили на основе цитологического анализа 50 моноцитов. Фагоцитарный индекс рассчитывали по формуле: ФИ = (Nф/No)×100 %, где Nф — число моноцитов, обладающих поглотительной активностью; No — общее количество подсчитанных моноцитов. Фагоцитарное число рассчитывали по формуле: ФЧ = ∑ nф/no, где ∑ nф — общее количество частиц, поглощенных моноцитами, обладающими фагоцитозной активностью; no — число моноцитов, обладающих поглотительной активностью. Как известно, «спонтанный» НСТ-тест позволяет оценить уровень «фонового» кислородзависимого метаболизма фагоцитов и их потенциальную микробоцидность. Нами отмечена лишь тенденция к увеличению данного показателя в группе животных, подвергнутых воздействию КО (33,3±3,1 %), по сравнению с контролем (26,1±3,2 %). При помощи метода краткосрочного культивирования фракционированных лейкоцитов крови была изучена их адгезивная активность. Показано, что круглосуточное освещение не оказывало влияния на эту функцию лейкоцитов. Стимуляция моноцитов корпускулярным стафилококковым реагентом позволила оценить уровень «окис93 ГЛАВА 4. лительного стресса» в фагоцитах и уровень их резервного микробоцидного потенциала. Воздействие круглосуточного освещения приводило к снижению доли формазан-положительных клеток в стимулированном НСТ-тесте относительно контрольного уровня (соответственно 34,3±2,6 %, p<0,05; в контроле — 47,3±3,2 %). На фоне десинхроноза увеличиваются показатели спонтанного НСТ-теста. Таким образом, содержание животных в условиях круглосуточного освещения приводило к снижению резервного уровня потенциальной микробоцидности моноцитов крови. Достоверных изменений величины фагоцитарного индекса при влиянии на животных этого фактора не было выявлено. Влияние круглосуточного освещения на функциональную активность моноцитов крови наглядно отражено на рис. 29. На этом рисунке представлены поверхности 3-мерного пространственного распределения показателей спонтанного НСТ-теста (ось-Х), фагоцитарного индекса (ось-Y) и фагоцитарного числа (ось-Z), задаваемых векторами значений, при использовании метода интерполяции наименьших площадей. Как видно из рисунка, круглосуточное освещение существенным образом модифицирует (инвертирует) форму распределения данных параметров в 3-мерном пространстве. Представленные диаграммы свидетельствуют о сложных взаимосвязях, существующих между исследуемыми параметрами, а также о нелинейности процессов, определяющих морфофункциональные изменения моноцитов под влиянием нарушения светового режима. 94 Периферическая кровь при воздействии освещения... ГЛАВА 4. существенным образом модифицирует (инвертирует) форму распределения показателей спонтанного НСТтеста (ось-Х), фагоцитарного индекса (ось-Y) и фагоцитарного числа (ось-Z) в 3-мерном пространстве, влияет на продукцию активных метаболитов кислорода в моноцитах крови, модулирует их потенциальную бактерицидность и общую неспецифическую резистентность организма. ое , низк Растр ение разреш Рис. 29. Поверхности 3-мерного пространственного распределения показателей спонтанного НСТ-теста (ось-Х), фагоцитарного индекса (ось-Y) и фагоцитарного числа (ось-Z) Учитывая, что моноциты периферической крови являются важными элементами иммунной системы, можно предположить влияние данного фактора на основные гомеостатические механизмы организма. Вероятно, изменения морфофункциональных особенностей и функциональной активности моноцитов при воздействии круглосуточного освещения закладываются уже на гемопоэтическом уровне, то есть на уровне моноцитопоэза. Заключение Установлено, что нахождение экспериментальных животных в условиях круглосуточного освещения 95 96 Периферическая кровь при воздействии освещения... 4.3. Ферментный спектр лимфоцитов крови мышей и крыс при нормальном световом режиме и круглосуточном освещении А.В. Шурлыгина, Г.И. Литвиненко, В.А. Труфакин Лимфоцит — один из основных клеточных элементов лимфоидной системы, обеспечивающих оптимальное состояние внутренней среды организма, иммунологические реакции, направленные на связывание и выведение антигенного материала. Известно, что функциональная активность лимфоцитов определяется уровнем окислительновосстановительных процессов, протекающих в нем [29]. Активность окислительно-восстановительных ферментов, участвующих в процессах дыхания и энергообеспечения, дает возможность судить о функциональном состоянии клетки при физиологических и патологических процессах. Доказано, что уровень иммунореактивности определяется не только морфологическим составом иммунокомпетентных клеток и концентрацией иммуноглобулинов в сыворотке крови, но и уровнем метаболических процессов в иммунокомпетентных клетках, которые в значительной степени определяют функциональную активность иммуноцитов [47]. Лимфоцит, вступивший во взаимодействие со стимулирующим агентом (антигеном), претерпевает фазу активации. Активация клетки сопровождается усилением как гликолитического, так и 97 ГЛАВА 4. митохондриального типа ресинтеза АТФ [26]. Значимость каждого из этих механизмов в активации клетки существенна, поскольку их избирательное подавление приводит к нарушению определенных этапов взаимодействия с антигеном, что снижает функцию клетки [127]. Степень выраженности того или иного процесса в фазе активации зависит от условий — аэробных или анаэробных, в которых клетка находится. При коммитировании клетки к делению происходит повышение роли гликолиза в ресинтезе АТФ. Подавление гликолиза резко снижает синтез ДНК в лимфоцитах, стимулированных митогеном [152]. Нарушение окислительного фосфорилирования оказывает меньший эффект на процесс митогенеза [152]. Это указывает на относительно большую значимость гликолиза в делении клетки. Коммитирование к дифференцировке сопровождается усилением митохондриального ресинтеза АТФ [158]. Следовательно, если в энергообеспечении процесса активации принимает участие, как гликолиз, так и механизм окислительного фосфорилирования, то процессы дифференцировки и пролиферации обеспечиваются в основном одним из альтернативных источников АТФ: соответственно механизмом окислительного фосфорилирования или гликолизом. Активность дегидрогеназ в лимфоцитах крови исследовали методом Р.П. Нарциссова с использованием пара-нитротетразолия-фиолетового и количественно выражали средним числом гранул формазана в одной клетке [73]. Проведено исследование активности сукцинатдегидрогеназы (СДГ), лактатдегидроге98 Периферическая кровь при воздействии освещения... назы (ЛДГ) в лимфоцитах крови крыс, находившихся в условиях круглосуточного освещения. Определение данных параметров выполнено однократно в утреннее время суток. Как видно из табл. 7, в утреннее время суток в лимфоцитах крови крыс на более высоком уровне находится активность ЛДГ. Это свидетельствует о преобладании анаэробного гликолиза в энергообеспечении иммунокомпетентных клеток. Как было сказано выше, данный путь ресинтеза АТФ характерен для клеток, коммитированных к делению, что совпадает с данными литературы о том, что в утреннее время суток в иммунной системе лабораторных грызунов преобладают процессы клеточной пролиферации [22]. Круглосуточное освещение оказало стимулирующее влияние на содержание СДГ в лимфоцитах крови крыс с одновременным снижением активности ЛДГ. Таблица 7 Влияние круглосуточного освещения на активность дегидрогеназ лимфоцитов крови крыс Группа К КО Среднее количество гранул формазана в 1 лимфоците СДГ ЛДГ 9,8±0,3 21,6±1,1 14,5±0,3* 16,0±0,9* Примечание. К — контрольная группа животных; КО — нахождение животных в условиях постоянного освещения; * — различие с контрольной группой статистически достоверно при р<0,05. 99 ГЛАВА 4. Возможно, что выявленные изменения ферментного спектра отражают состояние тканевой гипоксии, о чем было сказано выше. В этом случае повышение активности СДГ можно рассматривать как компенсаторное усиление на ранних стадиях гипоксии сукцинатоксидазного пути окисления, в результате постепенно снижается синтез АТФ и нарушается специфическая функция клетки, а затем следует ее гибель [53, 76]. Снижение активности ЛДГ можно рассматривать как ограничение резервных возможностей, т.к. ЛДГ — это фермент, активация которого направлена на выработку дополнительных энергетических эквивалентов в условиях недостаточности аэробного пути ресинтеза АТФ [54]. Изучение суточных вариаций ферментативного спектра лимфоцитов крови проводилось в эксперименте на мышах (СВА×С57 ВL)F1. У интактных мышей достоверные суточные вариации обнаружены для СДГ и НАДФ-диафоразы (НАДФ-Д). Для СДГ выявлен минимум активности утром, подъем к 15.00 и небольшой спад к 20.00. Для НАДФ-Д обнаружена противоположная динамика. Это соответствует взаимоотношениям данных ферментов в цикле Кребса. При круглосуточном освещении происходят изменения суточной динамики ферментного спектра лимфоцитов. Появляются достоверные суточные вариации активности ЛДГ с максимальным значением в утренние часы и минимальным — в вечерние. При этом утром активность ЛДГ становится выше контроля, а уровни СДГ и НАДФ-Д снижаются. Днем снижена активность НАДФ-Д, а вечером — СДГ (рис. 30). 100 Периферическая кровь при воздействии освещения... ое , низк Растр ение разреш Рис. 30. Суточные вариации активности дегидрогеназ лимфоцитов крови мышей при нормальном световом режиме (Контроль) и круглосуточном освещении (КО); * — достоверные отличия от значения в 10.00; + — достоверные отличия от значения в 15.00; # — достоверные отличия от Контроля; по оси абсцисс — время суток, по оси ординат — активность фермента (гранул/лимфоцит) Полученные данные свидетельствуют о том, что в периферических лимфоцитах при воздействии круглосуточного освещения снижается доля аэробных процессов и повышается активность анаэробного пути энергопродукции. Возможно, в этом проявляется ограничение резервных возможностей энергетическо101 ГЛАВА 4. го метаболизма лимфоцитов в отношении реакции на воздействие круглосуточного освещения. Это предположение подтверждается снижением активности ЛДГ — ключевого фермента анаэробного гликолиза, являющегося компенсаторным путем энергообеспечения клетки. Анализ данных по динамике ферментного спектра лимфоцитов крови у крыс и мышей показывает несколько противоречивые результаты. У крыс при круглосуточном освещении нами обнаружено повышение активности СДГ (аэробный путь энергопродукции) и снижение ЛДГ (анаэробный гликолиз). У мышей отмечена противоположная динамика ферментного спектра: при неизменной активности СДГ происходит усиление анаэробного гликолиза (повышение ЛДГ) и снижение активности фермента цикла Кребса НАДФ-Д. Однако в обоих случаях эти изменения можно рассматривать как проявление тканевой гипоксии, признаки которой выявлены в печени и ее регионарных лимфоузлах. Так, показано, что при разных формах гипоксии снижается уровень макроэргов (аденозинтрифосфата (АТФ) и креатининфосфата). Происходит подавление активности никотинамидаденин-динуклеотидоксидазного (NADH) пути окисления и компенсаторное усиление на ранних стадиях сукцинатоксидазного пути окисления, в результате этого постепенно снижается синтез АТФ и нарушается специфическая функция клетки, а затем следует ее гибель [53, 76]. Возможно, что различная направленность изменений ферментного спектра лимфоци102 Периферическая кровь при воздействии освещения... тов при воздействии круглосуточного освещения объясняется межвидовыми различиями энергетического метаболизма у мышей и крыс. Из приведенных результатов следует, что нарушение светового режима приводит к изменению энергетического метаболизма лимфоцитов, причем меняется и уровень активности ферментов, и характер суточных вариаций ферментативного спектра. Заключение Таким образом, при воздействии круглосуточного освещения меняется содержание различных форм лейкоцитов периферической крови, функциональная активность моноцитов, параметры энергетического метаболизма лимфоцитов, что может приводить к нарушению иммунного статуса организма. На этом фоне возможен прорыв трансформированных клеток через нарушенный гематолимфатический барьер печени, развитие доброкачественных и злокачественных опухолей, а также обострение ряда хронических заболеваний. Эти данные следует учитывать при разработке лечебных, санитарно-гигиенических и профилактических мероприятий для групп людей с хронической патологией (включая онкологию) и лиц, постоянно подвергающихся действию факторов, дестабилизирующих суточные биоритмы организма. 103 ГЛАВА 5. Глава 5. ИММУННАЯ СИСТЕМА ПОДОПЫТНЫХ ЖИВОТНЫХ В УСЛОВИЯХ КРУГЛОСУТОЧНОГО ОСВЕЩЕНИЯ 5.1. Клеточный состав лимфоидных органов крыс Вистар, содержавшихся в условиях обычного светового режима и в условиях круглосуточного освещения А.В. Шурлыгина, Л.В. Вербицкая, В.А. Труфакин Для определения содержания в лимфоидных органах экспериментальных животных различных субпопуляций лимфоцитов проводили обработку клеток моноклональными антителами (МАТ) меченными флюоресцеином-5-изотиоцианатом (ФИТЦ) к поверхностным лимфоцитарным антигенам CD3, CD4, CD8 и МАТ, мечеными фикоэритрином (ФЭ) к молекуле CD25 (Becton Dickinson) в соответствии с протоколом фирмы-изготовителя. Анализ проводили на проточном цитофлюориметре «FACS Calibur» (Becton Dickinson). Содержание крыс при постоянном освещении вызвало определенные изменения клеточного состава центральных и периферических органов иммунной системы. В печеночном лимфоузле повысился процент малых лимфоцитов и снизился процент бластов, что позволяет предположить снижение процессов пролиферации клеток. С другой стороны, вполне вероятно 104 Иммунная система подопытных животных... ГЛАВА 5. увеличение скорости клеточной дифференцировки, что может отражать активизацию специфических иммунных реакций в ответ на антигенную стимуляцию продуктами клеточного распада, поступающими из печени и образующимися непосредственно в самих лимфоузлах. Возросла общая численность тимоцитов, а также абсолютное количество малых лимфоцитов и бластов (рис. 31). Рис. 31. Суточные вариации клеточного состава тимуса и селезенки крыс Вистар при нормальном световом режиме и круглосуточном освещении. Достоверные отличия: * — от контроля в соответствующее время, # — от значения в 10.00, & — от значения в 15.00 105 106 Иммунная система подопытных животных... ГЛАВА 5. 5.2. Суточные вариации клеточного состава лимфоидных органов мышей (CBA×C57 BL)F1, содержавшихся условиях обычного светового режима и в условиях круглосуточного освещения Г.И. Литвиненко, А.В. Шурлыгина, В.А. Труфакин В результате исследования суточных вариаций субпопуляционного состава клеток лимфоидных органов было установлено, что при естественном световом режиме (интактный контроль, 1-я группа) общее количество клеток в тимусе и абсолютное количество тимоцитов CD4+, CD8+, CD4+8+ возрастают с 10.00 до 15.00 и еще больше возрастают к 20.00. У мышей, находившихся в условиях круглосуточного освещения (2-я группа), общее количество клеток в тимусе и абсолютное содержание тимоцитов с фенотипом CD8+ и CD4+8+ увеличиваются с 10.00 до 15.00 и далее не меняются. Однако в отличие от контрольной группы животных этот показатель снижается к 20.00. Абсолютное количество CD4+ тимоцитов у мышей 2-й группы в 15.00 и в 20.00 было выше, чем в 10.00. Отличительной особенностью данной группы животных от интактного контроля является то, что у них процентное содержание CD4+ тимоцитов увеличивается с 10.00 до 20.00, а у мышей 1-й группы не меняется. Единственным сходством 1-й и 2-й групп является суточная динамика абсолютного содержания CD4+ клеток в тимусе — их количество увеличивается с 10.00 к 20.00 (рис. 32). 107 е низко , р т с Ра ение разреш Рис. 32. Суточные колебания субпопуляционного состава лимфоцитов тимуса мышей при нормальном и круглосуточном освещении; * — достоверные отличия от группы с обычным световым режимом, # — достоверные отличия от значений в 10.00 Динамика исследованных показателей паховых лимфоузлов у животных 1-й группы характеризуется повышением абсолютного количества лимфоцитов CD4+ и CD8+ к 20.00 (рис. 33). Процентное содержание CD4+ клеток повышается с 10.00 до 15.00, а к 20.00 снижается. У животных, находившихся в условиях круглосуточного освещения, абсолютное количество CD4+ клеток увеличивается к 15.00 и остается повышенным в 20.00. Численность CD8+ лимфоцитов так же, как и в контроле, возрастает в вечернее время. Динамика процентного содержание лимфоцитов с фенотипом CD4+ характеризуется максимальным значением в середине 108 Иммунная система подопытных животных... дня (15.00) и снижением к вечеру (см. рис. 33). Однако вечерний уровень данного показателя при круглосуточном освещении был выше, чем в контрольной группе (соответственно 47,5±6,58 % и 42±2,97 %; p<0,05). ГЛАВА 5. Заключение Содержание животных в условиях круглосуточного освещения нарушает суточные вариации субпопуляционного состава клеток центральных и периферических лимфоидных органов, что может свидетельствовать о десинхронизирующем влиянии данного воздействия на циркадианную организацию пролиферации, дифференцировки и миграции клеток в иммунной системе. Возможно, это связано с ослаблением иммунорегулирующего влияния мелатонина, продукция которого в эпифизе резко снижается при круглосуточном освещении. ое , низк Растр ение разреш Рис. 33. Суточные колебания клеточного состава паховых лимфоузлов мышей при нормальном и круглосуточном режиме освещения; * — достоверное отличие от значения в 10.00; # — достоверное отличие от значения в 15.00; & — достоверное отличие от значения контрольной группы (p<0,05) 109 110 Иммунная система подопытных животных... 5.3. Влияние круглосуточного освещения на денситометрические характеристики ядерного хроматина лимфоцитов в центральных и периферических органах иммунной системы А.В. Шурлыгина, Л.В. Вербицкая, В.А. Труфакин Денситометрические характеристики ядерного хроматина определялись в мазках из клеточной суспензии лимфоидных органов и крови, фиксированных 100%-ным метанолом и окрашенных по Фельгену. Использовался метод оптико-структурного машинного анализа (ОСМА) с применением отечественного анализатора микроструктур (сканирующий световой микроскоп «Люмам ПМ-11», соединенный с компьютером) по специально разработанным в лаборатории иммуноморфологии программам. Гуморальный иммунный ответ на Т-зависимый антиген — эритроциты барана (ЭБ) — определяли по количеству антителообразующих клеток (АОК) в селезенке на 4-е сутки после внутрибрюшинного введения антигена по методу Cunningham [40]. Выявлено, что у мышей, находившихся в условиях круглосуточного освещения, изменяется структура ядерного хроматина лимфоцитов крови и брыжеечных лимфатических узлов, причем наиболее выраженные изменения были отмечены для лимфоцитов крови (табл. 8). В ядрах этих клеток увеличивался периметр и площадь структур, занимаемых как конденсированным, так и деконденсированным хроматином, а также 111 ГЛАВА 5. увеличивалась общая площадь ядер при сохранении интегральной оптической плотности на уровне контрольных животных. Это может быть следствием увеличения доли средних и больших клеточных форм в лимфоцитарном пуле периферической крови. Показано, что при различных экзогенных воздействиях происходят изменения структуры ядер лимфоцитов. Так, например, при радиационных поражениях [75] наблюдаются изменения, которые трактуются автором как компенсаторные, направленные на поддержание оптимальных ядерно-цитоплазматических взаимоотношений — увеличение доли клеток с крупными ядрами. При интенсификации процессов апоптоза наблюдается довольно быстрое исчезновение из крови малых лимфоцитов; средние и большие лимфоциты при этом набухают, размеры их ядер увеличиваются и количественное соотношение меняется в пользу больших лимфоцитов [74]. Такое объяснение совпадает с изложенными выше данными об усилении процессов апоптоза в лимфатических узлах. Показано, что воздействие гидрокортизоном приводит к увеличению средней площади ядер лимфоцитов [90]. Если учесть, что круглосуточное освещение является значительным стрессом для организма животных, то можно предположить увеличение ядер лимфоцитов крови вследствие стрессового увеличения продукции глюкокортикоидов, что может провоцировать интенсификацию апоптоза в лимфоидных клетках [169]. 112 Иммунная система подопытных животных... Таблица 8 Денситометрические характеристики ядерного хроматина лимфоцитов крови и брыжеечных лимфоузлов мышей при нормальном световом режиме и круглосуточном освещении (M±SE) Показатель Нормальный Круглосуточсветовой режим ное освещение Лимфоциты крови Периметр деконденсированного хроматина, мкм 17,638±0,272 19,520±0,599* Периметр конденсированного хроматина, мкм 13,325±0,248 15,030±0,319* Площадь распределения деконденсированного хромати9,428±0,245 11,275±0,579* на, мкм2 Площадь распределения конденсированного хроматина, 9,553±0,245 11,682±1,010* мкм2 Общая площадь распределе18,978±0,383 21,036±0,372* ния хроматина, мкм2 Интегральная оптическая плотность хроматина, у.е. 7,910±0,383 8,715±0,383 Лимфоциты брыжеечных лимфоузлов Площадь распределения деконденсированного хромати14,662±0,990 12,475±0,356* на, мкм2 Интегральная оптическая плотность деконденсированного хроматина, у.е. 2,400±0,175 1,970±0,030* Примечание. * — достоверные отличия от группы с нормальным световым режимом (p<0,05). В ядрах клеток лимфатических узлов при круглосуточном освещении уменьшилась площадь, занимае113 ГЛАВА 5. мая деконденсированным хроматином, и количество деконденсированного хроматина, что может свидетельствовать о компактизации хроматина. Однако, по-видимому, этот процесс не связан с продвижением клеток по пролиферативному циклу, так как не меняется общее количество ДНК, т.е. нет признаков наступления синтетической фазы клеточного цикла. Это совпадает с данными по усилению процессов апоптоза в лимфатических узлах, поскольку характерным признаком апоптотических клеток является крайняя степень конденсации хроматина [173]. Уменьшение доли эухроматина может также свидетельствовать о снижении синтетических процессов с участием ДНК (см. табл. 8). ое , низк р т с а Р ение разреш Рис. 34. Количество антителообразующих клеток в селезенке мышей, содержавшихся при обычном световом режиме и при круглосуточном освещении (КО). 4-е сутки после иммунизации ЭБ; * — отличия от контроля достоверны при p<0,05 Таким образом, нарушение светового режима, 114 Иммунная система подопытных животных... являющееся значительным стрессом для организма млекопитающих, отражается на состоянии ядерного хроматина клеток иммунной системы, что может приводить к снижению их функциональной активности. Об этом свидетельствует снижение гуморального иммунного ответа на Т-зависимый антиген — эритроциты барана (рис. 34). 115 ГЛАВА 6. Глава 6. ВЛИЯНИЕ КРУГЛОСУТОЧНОГО ОСВЕЩЕНИЯ НА ЭНДОКРИННУЮ СИСТЕМУ С.В. Мичурина Влияние круглосуточного освещения в течение двух недель на иммунную систему и лимфатический регион печени, по-видимому, во многом опосредуется мелатонином — эпифизарным гормоном, продукция которого имеет четкий суточный ритм и приурочена к темному времени суток [105]. Показано, что постоянное освещение подавляет синтез мелатонина, так что данную модельную ситуацию можно рассматривать как функциональную эпифизэктомию [164]. Известно, что гормон эпифиза мелатонин играет важную роль в восстановлении нарушенного гомеостаза и оптимизации функции различных органов и систем [125]. Также мелатонин участвует в регуляции секреции половых гормонов, процессов полового созревания, обеспечивая тем самым полноценное функционирование репродуктивной системы [45]. Нами проведено определение содержания половых гормонов в сыворотке крови животных радиоиммунологическим методом [89]. Как видно из табл. 9, выявлена направленность к снижению тестостерона в группах со световым десинхронозом. Содержание пролактина у животных, находившихся в условиях круглосуточного освещения, по сравнению с контролем было повышено. 116 Влияние круглосуточного освещения... Таблица 9 Среднее содержание половых гормонов в сыворотке крови крыс-самцов Гормон Группа Контроль Круглосуточное освещение Т, пг/мл 0,34±0,1 0,22±0,02 Прл, МЕ/л 32,4±2,0 52,6±7,2* ЛГ, МЕ/л 0,24±0,05 0,20±0,02 Примечание. Т — тестостерон; Прл — пролактин; ЛГ — лютеинизирующий гормон; * — отличия от группы контроля достоверны при p<0,05. Известно, что печень обладает высоким сродством к тиреоидным гормонам, быстро и в большом количестве накапливая их в своей паренхиме. Кроме этого, именно через печень происходит удаление из организма большей части тиреоидных гормонов. Липофильные сигнальные молекулы, к числу которых относятся тиреоидные гормоны, свободно проникают путем диффузии через плазматическую мембрану в клетки. Мишенью их действия является ядро, где они оказывают регуляторное влияние на транскрипцию генов или репликацию ДНК [25]. В физиологических дозах у млекопитающих преобладает стимулирующее действие гормонов на синтез РНК в ядре, приводящее к усилению синтеза белков митохондрий, увеличению числа рибосом, разрастанию цитоплазматических мембран. Все эти процессы способствуют по117 ГЛАВА 6. вышению метаболической активности большинства клеток, обслуживают гипертрофию клеток, усиление дыхания, синтез АТФ в митохондриях. Радиоиммунологическим методом [89] нами выявлено статистически значимое повышение уровня тиреоидных гормонов в сыворотке крови животных, содержавшихся в условиях круглосуточного освещения, по сравнению с интактными животными (табл. 10, рис. 35). Таблица 10 Содержание тиреоидных гормонов в сыворотке крови крыс-самцов Гормон Т3 общ., пг/мл Т3 св., пг/мл Т4 общ., нмоль/л Т4 св., пмоль/л Контроль 0,54±0,07 4,44±0,31 44,9±4,8 23,5±2,3 Группа Круглосуточное освещение 0,80±0,03* 5,75±0,2* 57,7±2,4* 26,8±1,5 Примечание. Т3 общ. — трийодтиронин общий; Т3 св. — трийодтиронин свободный; Т4 общ. — тироксин общий; Т4 св. — тироксин свободный; * — отличия от группы контроля достоверны при p<0,05. Известно, что гипо- и гиперфункция щитовидной железы приводят к одному и тому же конечному результату — усилению катаболических процессов. Однако механизмы их развития могут быть разными, что согласуется с показанными нами состояниями энергетического дефицита при воздействии круглосуточного освещения. 118 Влияние круглосуточного освещения... Важная роль в осуществлении апоптоза принадлежит и тироксину (Т4), который регулирует функционирование протеиновой тирозинкиназы, одного из элементов реализации сигнала смерти. При недостатке этого гормона происходит подавление апоптоза. ое , низк р т с а Р ение разреш Рис. 35. Содержание гормонов щитовидной железы в сыворотке крови крыс; * — отличия от группы контроля достоверны при p<0,05 119 ГЛАВА 6. Необходимо отметить, что при эндокринной сигнализации гормоны секретируются в интерстициальное пространство, диффундируют к капиллярам, разносятся током крови по всему организму, через капилляры вновь проникают в интерстициальное пространство и затем диффундируют к специфическим рецепторам на поверхности клеток-мишеней. При эндокринном типе сигнализации до достижения ткани-мишени первичные мессенджеры претерпевают сильное разбавление в крови и интерстициальной жидкости. Известно, что многие клетки обладают способностью реагировать на очень низкие концентрации сигнальных молекул в интерстициальном пространстве. Это связано с наличием внутриклеточного механизма каскадного усиления гормонального сигнала. По-видимому, развивающиеся в условиях круглосуточного освещения нарушения гемо- и лимфоциркуляции приводят к развитию застоя интерстициальной жидкости и, как следствие, дилятации корней лимфатической системы в печени, что может приводить к повышению концентрации сигнальных молекул в интерстициальной жидкости и нарушению процессов межклеточной коммуникации. При длительном нарушении светового режима, приводящего к нарушению нормального функционирования эндокринных желез, может произойти потеря способности клеток-мишеней реагировать на внешний стимул с прежней чувствительностью. Также отмечена выраженная тенденция к снижению уровня тестостерона в группах животных, находившихся в условиях круглосуточного освещения (рис. 36). 120 Влияние круглосуточного освещения... ГЛАВА 7. Глава 7. МЕЛАТОНИН В КОРРЕКЦИИ НАРУШЕНИЙ СУТОЧНОЙ ВРЕМЕННОЙ ОРГАНИЗАЦИИ ЛИМФОИДНОЙ СИСТЕМЫ А.В. Шурлыгина, Г.И. Литвиненко, Л.В. Вербицкая, В.А.Труфакин е низко , р т с Ра ение разреш Рис. 36. Содержание тестостерона в сыворотке крови крыс Плазматические мембраны печени и вентральной доли простаты обладают специфической способностью связывать андрогенные стероиды [44], являющиеся ингибиторами апоптоза, и их недостаток приводит к активации этого процесса. Таким образом, выявленные изменения в содержании половых и тиреоидных гормонов в сыворотке подопытных животных свидетельствуют о влиянии десинхроноза на их продукцию и, как следствие, на процессы апоптоза в печени, ее лимфатическом регионе и циркулирующих лимфоидных клетках. 121 Мелатонин обладает отчетливыми синхронизирующими свойствами [9]. Согласно результатам, полученным в опытах на животных с предварительно вызванным десинхронозом, регулярные инъекции мелатонина в определенное время суток восстанавливают утраченную периодичность колебательных процессов [111]. У людей под влиянием гормона быстрее ликвидируются признаки широтного десинхроноза, слабее выражены нарушения в деятельности центральной нервной системы и внутренних органов, возникающие при сменной работе [6]. В основе перечисленных эффектов может лежать нормализация отношений эпифиза с ведущим водителем суточного периодизма — супрахиазматическими ядрами гипоталамуса. На мембранах их нейронов обнаружена высокая плотность специфических мелатониновых рецепторов, через которые обеспечивается сдерживание мелатонином «хода» чрезмерно спешащих (в условиях десинхроноза) биологических часов [8]. Мелатонин также обладает иммунорегуляторной активностью при развитии нарушений функциониро122 Мелатонин в коррекции нарушений... вания иммунокомпетентных клеток [138, 156]. Нами были проведены эксперименты по влиянию стимулятора синтеза мелатонина амитриптилина [10] на суточные вариации клеточного состава лимфоидных органов крыс Вистар при круглосуточном освещении [50]. ГЛАВА 7. 7.1. Влияние индуктора синтеза мелатонина — амитриптилина — на суточные вариации клеточного состава лимфоидных органов крыс Вистар, содержавшихся при круглосуточном освещении В эксперименте были использованы животные в возрасте 4-х месяцев, самцы, весом 150–200 г, родившиеся и содержавшиеся в виварии Института клинической и экспериментальной лимфологии СО РАМН. Животные были разделены на 4 группы: 1-я группа содержалась при обычном световом режиме; 2-я, 3-я, 4-я группы — при круглосуточном освещении 14 суток. После этого всех крыс переводили на естественный световой режим. Животным 4-й группы внутримышечно вводили раствор амитриптилина по 0,06 мг в 0,2 мл воды для инъекций в 18.00 в течение 3-х дней, начиная с первого дня перевода на обычный световой режим, а животным 3-ей группы — 0,2 мл воды для инъекций в том же режиме. При исследовании суточных колебаний клеток в тимусе выявлено заметное синхронизирующее влияние амитриптилина. У данной группы крыс суточные колебания количества клеток в тимусе приобрели сходный характер с контрольными: утренний уровень показателя снижается к 15.00 и достигает максимума к 20.00 (p<0,05 между всеми временными точками). В селезенке отсутствовали достоверные суточные колебания количества клеток, как при десинхронозе, так и после введения препарата и его растворителя. 123 124 Мелатонин в коррекции нарушений... В паховых лимфатических узлах круглосуточное освещение и введение растворителя приводит к исчезновению достоверных суточных колебаний количества клеток. После введения амитриптилина они появляются, но их характер отличается от интактных животных. Таким образом, содержание крыс Вистар при постоянном освещении в течение двух недель привело к сглаживанию суточных колебаний всех исследованных показателей. Восстановление циркадианных вариаций клеточного состава после стимуляции синтеза мелатонина в ночное время (введение амитриптилина) наблюдалось только в тимусе и лимфатических узлах (рис. 37). Можно предположить, что центральные и периферические органы иммунитета имеют разные нейроэндокринные синхронизаторы. Суточные биоритмы клеток тимуса, видимо, в большей степени находятся под влиянием мелатонина [140]. Ритмичность же структурно-функциональных показателей клеток селезенки и лимфатических узлов, состоящих на 50% из B-клеток, вероятно, регулируется преимущественно системой гипоталамус–гипофиз–надпочечники [22], о чем свидетельствует десинхронизирующий эффект повторяющегося стрессового воздействия (инъекции растворителя) на их суточную динамику. С другой стороны, возможно, воздействие на высший отдел циркадианной системы организма — эпифиз, в первую очередь влияет на биоритмы клеточного состава центрального органа иммунитета — тимуса, а для восстановления нарушенной временной организации всей иммунной системы требуется более длительное 125 ГЛАВА 7. время. Следует отметить, что основные различия показателей контрольной и экспериментальных групп регистрируются в вечернее время суток, что свидетельствует о важности хронобиологического подхода к оценке результатов иммуноактивных воздействий. го ке все и н д о В исх афика! два гр ватает? о не х Одног Тимус Селезенка 126 Мелатонин в коррекции нарушений... ГЛАВА 7. колебания ряда исследованных параметров иммунной системы. Однако амитриптилин помимо мелатонининдуцирующего действия влияет и на другие функциональные и метаболические процессы. Поэтому в следующей серии экспериментов в качестве синхронизатора нарушенных суточных ритмов мы использовали непосредственно гормон эпифиза — мелатонин. ое , низк р т с а Р ение разреш Лимфоузел Рис. 37. Суточная динамика общего количества клеток в тимусе, селезенке и лимфатических узлах у крыс при естественном световом режиме, круглосуточном освещении, после инъекционного стресса и введения амитриптилина; * — p<0,05 от 10.00, ** — p<0,05 от 15.00, ФР — вода для инъекций Выявлено, что амитриптилин оказывает синхронизирующее влияние и на окислительновосстановительный метаболизм лимфоцитов, под его влиянием нормализуется утренняя активность ЛДГ, активность СДГ в дневное время, восстанавливается характер суточных вариаций НАДФ-диафоразы. Таким образом, применение индуктора синтеза мелатонина восстанавливает нарушенные суточные 127 128 Мелатонин в коррекции нарушений... 7.2. Влияние экзогенного мелатонина на иммунный статус мышей при нарушенном световом режиме В данной главе приведены результаты исследования действия экзогенного мелатонина на измененную суточную ритмику показателей клеточных элементов иммунной системы мышей, содержавшихся при круглосуточном освещении. В эксперименте были использованы мыши линии CBA в возрасте 4-х месяцев, самцы. Животные были разделены на 4 группы: 1-я группа находилась при обычном освещении 14 суток, 2-я группа — при круглосуточном освещении 14 суток, а затем животных переводили на обычный световой режим, при котором они содержались еще 3 суток. Мыши 3-ей группы находились при круглосуточном освещении 14 суток, затем их переводили на обычный световой режим и в течение 3-х дней вводили по 0,5 мл физиологического раствора внутрибрюшинно, 1 раз в сутки в 18.00. Животные 4-й группы содержались при тех же условиях, что и мыши 3-ей группы, но с 3-кратным введением мелатонина внутрибюшинно в дозе 0,02 мг в 0,5 мл физиологического раствора 1 раз в сутки в 18.00. На следующий день после последнего введения МТ и ФР животные забивались в 10.00, 15.00 и 20.00. Для исследования забирались тимус и паховые лимфоузлы, в которых определялись следующие параметры: общее количество клеток, субпопуляционный состав лимфоцитов и их абсолютное количество (CD4+, CD8+, CD4+8+), соотношение 129 ГЛАВА 7. CD4+/CD8+. Субпопуляции лимфоцитов определяли с помощью соответствующих моноклональных антител, меченных ФИТЦ и ФЭ (Pharmingen) на проточном цитометре «FACSCalibur» (Becton Dickinson). Статистическая обработка данных проводилась с использованием непараметрического критерия Манна-Уитни. Было установлено, что суточные вариации исследованных параметров иммунной системы при круглосуточном освещении изменяются относительно интактных животных, что свидетельствует о развитии внутреннего десинхроноза. После введения физиологического раствора животным, находившимся в условиях круглосуточного освещения (3-я группа), количество клеток в их тимусе снижалось как с 10.00 до 20.00, так и с 15.00 до 20.00. Абсолютное содержание лимфоцитов с фенотипом CD4+8+ также снижалось с 10.00 до 20.00 и с 15.00 до 20.00. Абсолютное содержание лимфоцитов CD8+ снижалось с 15.00 до 20.00 (рис. 38, табл. 11). Таким образом, инъекции растворителя мелатонина не приводят к восстановлению суточной динамики клеточного состава тимуса, нарушенной в результате содержания животных при круглосуточном освещении. Под действием МТ в тимусе мышей, находившихся при круглосуточном освещении, происходит снижение общего количества клеток, абсолютного числа тимоцитов CD4+8+, CD8+, CD4+ с 10.00 до 15.00 и повышение этих параметров к 20.00 (см. табл. 11). Следовательно, на отрезке времени с 15.00 до 20.00 направленность суточной динамики показателей ста130 Мелатонин в коррекции нарушений... ГЛАВА 7. новится аналогичной таковой у интактных мышей. Характер суточных колебаний процентного содержания CD4+8+ и CD8+ тимоцитов под влиянием инъекций МТ также нормализуется (см. рис. 38). Таблица 11 Суточные колебания субпопуляционного состава лимфоцитов тимуса после введения физиологического раствора или мелатонина ое , низк Растр ение разреш СубпопуКруглосуточное осве- Круглосуточное освеляция клеток щение + введение щение + введение физиологического расмелатонина твора 10.00 15.00 20.00 10.00 15.00 20.00 % CD4+ 13,3 ±3,5 16,4 ±6,7 13,8 ±2,3 23,4 ±8,7* 12,7 ±3,3 16,8 ±3,3 % CD4+8+ 77,9 ±2,1 72,9 ±3,4 72,9 ±2,8 64,4 ±6,1* 79,4 ±2,6 69,1 ±2,1+ Общее кол-во клеток, Х106 46,4 ±9,8 53,9 ±9,5 22,4 ±4,6# 60,1 12,9 ±10,2 ±2,9*# 18,3 ±3,5 CD4+, Х106 6,1 ±1,0 9,6 ±3,2 3,1 ±0,9 13,8 ±2,9* 1,8 ±0,5# 2,9 ±0,7# CD4+8+, Х106 36,3 ±8,2 38,3 ±5,5 16,2 39,6 ±3,1#+ ±8,9* 10,5 ±2,2 12,9 ±3,5# CD8+, Х 106 2,5 ±0,6 3,4 ±0,7 0,6 ±0,1 1,1 ±0,4 1,2 ±0,3 4,7 ±0,9 Примечание. Достоверные отличия (p<0,05): * — от контроля (введение ФР) в соответствующее время суток, # — от значения в 10.00 той же группы, + — от значения в 15.00 той же группы. 131 Рис. 38. Суточная динамика клеточного состава тимуса в зависимости от режима освещения, введения физиологического раствора или мелатонина; * — p<0,05 от 10.00, ** — p<0,05 от 15.00 132 Мелатонин в коррекции нарушений... После введения физиологического раствора (которое является стрессовым воздействием) отмечается усиление суточных колебаний общего количества клеток и абсолютного количества CD4+, CD8+ лимфоцитов лимфатических узлов, что проявляется в появлении 15-часового пика в динамике данных показателей. В группе мышей, которым вводили мелатонин, суточная динамика процентного содержания CD8+, абсолютного содержания CD4+ и общего количества клеток приближается к таковой у интактных животных (рис. 39). Таким образом, отмечается синхронизирующее влияние мелатонина на субпопуляционный состав иммунокомпетентных клеток тимуса и лимфатических узлов. Таким образом, содержание животных в условиях круглосуточного освещения нарушает суточные вариации субпопуляционного состава клеток центральных и периферических лимфоидных органов, что может свидетельствовать о десинхронизирующем влиянии данного воздействия на циркадианную организацию пролиферации, дифференцировки и миграции в иммунной системе. Регулярный инъекционный стресс, по-видимому, является своеобразным «времязадателем» для суточных биоритмов иммунной системы, причем в большей степени его синхронизирующий эффект проявляется на уровне периферических лимфоидных органов (паховые лимфоузлы). Синхронизирующее действие мелатонина в большей степени проявляется в отношении центрального органа иммунитета — тимуса. Это согласуется с данными [139] о том, что основные иммуномодулирующие эффекты 133 ГЛАВА 7. МТ связаны с влиянием на центральное звено дифференцировки Т-лимфоцитов. ое , низк Растр ение разреш Рис. 39. Суточная динамика клеточного состава лимфатических узлов в зависимости от режима освещения, инъекционного стресса и введения мелатонина. Достоверные отличия (p<0,05): * — от 10.00, ** — от 15.00 134 Мелатонин в коррекции нарушений... Итак, в модельных экспериментах нами установлено, что мелатонин и индуктор его синтеза амитриптилин могут, по крайней мере, частично корректировать нарушенные суточные ритмы морфофункциональных характеристик клеток иммунной системы. ГЛАВА 8. Глава 8. МЕЛАТОНИН В КОРРЕКЦИИ МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНОГО СОСТОЯНИЯ ЛИМФОИДНЫХ КЛЕТОК ПРИ ИММУНОПАТОЛОГИИ Г.И. Литвиненко, А.В. Шурлыгина Нарушение биологических ритмов является неизменным компонентом патологического процесса [51, 95, 122, 142, 143]. Известно, что нормализация функций организма сопровождается восстановлением биологических ритмов, что является благоприятным прогностическим фактором при оценке эффективности лечения [30, 48]. Поэтому в настоящем исследовании мы попытались, во-первых, оценить биоритмологические изменения в иммунной системе при заболеваниях, сопровождающихся морфофункциональными нарушениями лимфоидных клеток, и, во-вторых, выяснить эффективность введения синхронизатора суточных биоритмов — мелатонина — в схему лечения. В качестве заболеваний с иммунопатологическим и биоритмологическим патогенезом были выбраны атопические процессы — бронхиальная астма и атопический дерматит, что диктовалось их распространенностью, социальной значимостью, низкой эффективностью существующих методов лечения. В то же время доказано, что ведущую роль в патогенезе атопии играют нарушения функций клеток иммунной 135 136 Мелатонин в коррекции морфофункционального состояния... системы. Немаловажное значение придается и биоритмологическим сдвигам, характерным для данных заболеваний. В целом, атопия может быть определена как генетическая предрасположенность клеток иммунной системы к неадекватной реакции, возникающей в результате контакта с антигеном, который для остальных индивидуумов является безвредным, к примеру, клещи домашней пыли, пыльца растений или перхоть животных [114]. Ключевым моментом иммунопатогенеза БА и АД является значительное повышение уровня общего IgE сыворотки (при отсутствии паразитарной инфекции) к наиболее распространенным аллергенам [103] по сравнению с нормальной популяцией. Это обусловлено тем, что при атопии антигенная стимуляция приводит к активации Т-хелперов 2-го типа с высоким уровнем продукции ИЛ-4, который рассматривается в качестве критического цитокина аллергического воспаления [131, 104]. Активированные антигенспецифические клетки Th-2 типа взаимодействуют с аллерген-реактивными В-лимфоцитами путем множества сигналов, включающих связывание молекулы CD40 со своим лигандом, цитокинов ИЛ-4 и ИЛ-13 со своими рецепторами, а также предположительно участие в этом взаимодействии молекул адгезии и ряда гормонов [148, 168]. Есть данные, свидетельствующие о роли ИЛ-6, α-ИФН и растворимой формы CD23 в качестве усилителей этого Т-В взаимодействия [154]. Эти молекулы активируют пролиферацию и дальнейшую дифференцировку В-клеток, индуциру137 ГЛАВА 8. ют переключение классов иммуноглобулинов и секрецию аллерген-специфического IgE плазматическими клетками, который, в свою очередь, связывается с высокоафинными IgE-рецепторами на тучных клетках и базофилах. После повторного контакта с аллергеном происходит перекрестное сшивание этим аллергеном фиксированных на мембранах IgE, и сигнал передается через антиген-распознающие активационные структуры, включающие комплекс TCR-CD3 и Fc-рецептор [132]. Этот сигнал вызывает дегрануляцию клеток и высвобождение депонированных медиаторов, а также активацию транскрипции генов цитокинов и синтез de novo широкого спектра медиаторов аллергического воспаления [149]. Таким образом, формирование атопических аллергических заболеваний сопровождается развитием дисбаланса в функционировании Т-лимфоцитов-хелперов 1-го и 2-го типов (Th-1- и Th2-лимфоцитов) с преобладанием Th-2-клеток [11]. Атопические заболевания (бронхиальная астма и атопический дерматит) характеризуются четко выраженным биоритмологическим компонентом. В частности, при этом заболевании нарушен циркадианный ритм гормональной функции надпочечников [49], в течение суток снижено содержание мелатонина и кортизона в слюне [122], нарушен циркадианный ритм содержания мелатонина в сыворотке крови [134]. У детей, страдающих атопической бронхиальной астмой, наблюдаются циркадианные и сезонные нарушения ритмов содержания мелатонина и эндогенных опиоидов, играющих иммуномодулирующую роль 138 Мелатонин в коррекции морфофункционального состояния... [35, 128]. При бронхиальной астме нарушен суточный ритм продукции провоспалительных цитокинов — γ-ИФН, ФНО-α, ИЛ-1, ИЛ-12 [151]. Временная организация функций газотранспортной системы у больных бронхиальной астмой характеризуется низкоамплитудными циркадианными ритмами объемных, скоростных показателей вентиляции и параметров центральной гемодинамики [81]. Отклонения суточных биоритмов скорости форсированного выдоха свидетельствуют о нарушении бронхиальной проходимости. Изучение суточных биоритмов скрытого периода моторной реакции указывают на нарушение тормозно-возбудительных процессов в ЦНС больных [32]. У больных АД также выявлено отсутствие циркадианного ритма содержания МТ в сыворотке крови на фоне низких его значений в утренние и особенно ночные часы [161]. Работы, посвященные роли мелатонина в патогенезе бронхиальной астмы немногочисленны [28, 117]. В последние годы получены новые данные о механизмах, обеспечивающих комплексное взаимодействие между нервной, иммунной и эндокринной системами [2, 4]. Предполагается, что интегратором этого взаимодействия является эпифиз, а его основной гормон мелатонин участвует в регуляции деятельности центральной и вегетативной нервной систем, эндокринных органов и иммунной системы [7, 86, 124, 166]. Нарушение количественной продукции и ритма секреции мелатонина является пусковым моментом, приво139 ГЛАВА 8. дящим на начальных этапах к возникновению десинхроноза, за которым следует развитие органической патологии. Установлено, что любые изменения продукции мелатонина, выходящие за рамки нормальных физиологических колебаний, ведут к рассогласованию как собственно биологических ритмов организма между собой (внутренний десинхроноз), так и ритмов организма с ритмами окружающей среды (внешней десинхроноз) [56, 57, 121, 159]. С биоритмологических позиций сезонные обострения хронических болезней внутренних органов представляют собой клиническую реализацию дезадаптации организма в условиях, требующих повышенной активности адаптивной системы организма при изменении условий окружающей среды. Следовательно, даже сам факт нарушения ритма секреции мелатонина может стать причиной различных заболеваний, в частности бронхиальной астмы [35]. Поэтому дальнейшее изучение роли мелатонина при атопических заболеваниях необходимо для понимания их патогенеза и повышения эффективности проводимой терапии. Как было описано выше, эпифизарный гормон мелатонин обладает отчетливыми хронотропными и иммуномодулирующими свойствами. Мелатонин, с одной стороны, является ведущим синхронизатором циркадианных ритмов у млекопитающих и человека, а с другой — эффективным иммуномодулятором [139], стимулирующим дифференцировку Т-лимфоцитов [82, 109, 138, 167]. Путем прямого вмешательства в функцию иммунокомпетентных клеток либо опосре140 Мелатонин в коррекции морфофункционального состояния... дованно мелатонин способен усиливать иммунную реактивность в условиях ее ограничения, обнаруживая иммуностимулирующую активность. На фоне иммунной гиперактивности он может, напротив, обеспечивать супрессивный эффект. Очевидно, за счет подобных свойств гормон корректирует иммунный дефект при различных патологических процессах. 141 ГЛАВА 8. 8.1. Хроно- и иммунотропные эффекты мелаксена (синтетического аналого мелатонина) при введении его в схему лечения атопического дерматита Нами анализировались результаты клиникоиммунологического обследования в фазах обострения и медикаментозной ремиссии 146 пациентов с атопическим дерматитом, находившихся на стационарном лечении в клинике иммунопатологии НИИ клинической иммунологии СО РАМН с 2001 по 2007 гг. Диагноз АД выставлялся на основании международных диагностических критериев, предложенных J.M. Hanifin и G. Rajka [130], в модификации D.Y. Leung и др. [136]. Степень тяжести АД оценивалась по бальной шкале SCORAD (Scoring of Atopic Dermatitis), разработанной Европейской оперативной группой по атопическому дерматиту (1993). Всем пациентам, помимо стандартного общеклинического и аллергологического обследования, было выполнено исследование иммунного статуса, включающего комплекс показателей, принятых в клинике иммунопатологии НИИ клинической иммунологии СО РАМН [98]. Определение субпопуляций лимфоцитов и функциональных характеристик иммунокомпетентных клеток в крови проводилось методом лазерной проточной цитометрии. Определение содержания ИЛ-4, γ-ИФН проводили методом ИФА с помощью набора реагентов «Вектор-БЕСТ» (Россия) на ИФА-ридере «Multiscan» («Labsystems», Финляндия). Уровень эндогенного МТ определялся в сыворот142 Мелатонин в коррекции морфофункционального состояния... ке крови, взятой в 09.00 и в 21.00 иммуноферментным методом с применением набора Melatonin – Elisa – Kit (ICN — Biomedicals, Inc.) согласно протоколу фирмыизготовителя. Цитохимическое исследование активности дегидрогеназ лимфоцитов периферической крови проводили по методике Р.П. Нарциссова [73, 60]. Все исследования проводились дважды в сутки — в 09.00 и в 21.00 в фазу обострения заболевания и при достижении медикаментозной ремиссии на фоне стандартной терапии и после добавления к лечению мелаксена. В терапии атопического дерматита использовались антигистаминные, антимедиаторные, антисеротониновые препараты, топические стероиды (мометазона фуроат, флютиказона пропионат, гидрокортизон, бетаметазон), топические стероиды в комбинации с салициловой кислотой и антибактериальными, противогрибковыми препаратами, энтеросорбенты. Препарат мелатонина (Мелаксен, Unifarm, США) назначался в дозе 0,003 г ежедневно в 21.00 в течение трех недель в сочетании со стандартной терапией. После проведения стандартной схемы лечения у пациентов с атопическим дерматитом в иммунном статусе произошли следующие изменения. В 09.00 статистически значимо увеличилось процентное содержание CD20+ лимфоцитов и фагоцитирующих моноцитов, а также повысилось количество циркулирующих иммунных комплексов. В 21.00 повысилось процентное содержание Т-клеток (лимфоциты с фенотипом CD3+), Т-лимфоцитов-хелперов (CD4+) и иммунорегуляторный индекс (табл. 12). 143 ГЛАВА 8. Таблица 12 Показатели иммунной системы и уровень мелатонина в сыворотке крови здоровых доноров и пациентов с атопическим дерматитом до лечения и после лечения (М±SE) Показатель Количество лимф., мм3 % CD3+ % CD4+ % CD8+ ИРИ (CD4+/ CD8+) % CD20+ % CD16+ % FG % FM % HLA-DR+ моноцитов СДГ (гранул/ лимфоцит) ЛДГ (гранул/ лимфоцит) ПЭФ ФГА ЦИК, у.е. Здоровые 09.00 21.00 2146,2 1614,5 ±655,5 ±306,0 66,51±6,94 65,85±7,24 36,41±5,49 36,85±5,59 26,03±5,67 25,77±4,67 1,48 1,48 ±0,38 ±0,31 12,65±5,49 13,59±4,79 11,0±5,78 13,25±7,41 74,37±14,23 66,76±17,85 56,53±16,55 61,44±9,00 87,07 87,36±8,53 ±9,79 14,4 14,3 ±1,52 ±2,52 16,0 15,3 ±2,00 ±2,69 4,1±0,26 – – – IgE, МЕ/мл 313,1±41,1 – ИЛ-4, пг/мл 20,7±7,6 – γИФН, пг/мл Мелатонин, пкг/мл 12,6±3,0 66,57 ±41,0* – 115,3 ±21,7* До лечения 09.00 21.00 2082,0 3395,0 ±1011,1** ±2390,6 65,78±8,45 38,04±22,28 39,61±8,84 24,78±14,41 25,16±5,89 28,13±14,11 1,83 0,94 ±1,89 ±0,23 15,21±6,04 13,32±0,75 12,44±6,90 13,50±1,22 61,77±12,49* 70,61±16,85 54,52±11,49 54,38±17,33 91,30 92,76 ±5,02 ±3,59 11,4 10,9 ±1,49**** ±1,60**** 11,9 11,24 ±1,58**** ±1,58**** 5,14±0,11 – 18,53±7,82 – 516,88 501,33 ±394,46**** ±446,14 109,0 98,2 ±21,0*** ±17,41 10,9±2,8 14,5±1,3 28,66 25,68 ±6,41 ±4,73**** Примечание. * — p≤0,05 утренних от вечерних уровней показателей внутри групп, ** — p<0,05 от до лечения в соответствующее время суток, *** — p<0,05 достоверные отличия между группами после лечения без мелаксена и с мелаксеном в соответствующее время 144 Мелатонин в коррекции морфофункционального состояния... Таблица 12 (продолжение) После лечения М– 09.00 21.00 После лечения М+ 09.00 21.00 2700,5±131,4 2915,2±1571,8 1976,2±963,15 2566,6±1807,1 *** * 68,09±8,96 66,0±4,93** 65,18±8,70* 32,12±5,47 * 40,90±9,44 37,66±4,92** *** 42,15±0,67* 20,81±2,03* ** 38,71±1,45** * 21,53±0,36 * 26,66±5,96 25,5±8,36 1,65±0,71 1,61±0,54 ** *** 12,8±4,97** 10,83±4,02 12,83±7,27 10,66±3,44 65,05±8,14** 79,0±10,6** **** 65,50±3,76** * 62,5±12,01* 92,43±3,07*** 89,75±6,23 1,59±0,52 1,41±1,78 *** 11,18±3,36* 17,41±2,59 * 11,59±4,81* 39,18±9,53 * 77,51±1,82 ** 72,68±23,80 67,21±7,21** * 64,93±8,05 * 89,85±5,79 92,5±4,73 *** 12,4±1,80 * ** 11,2±1,72 **** **** * 11,3±1,52 **** 12,4±1,01 ** 11,6±2,89**** 11,6±1,54 **** * **** * 3,16±1,68 – 2,94±0,93 ** – 23,15±5,89** – 19,23±8,50*** – 466,94±430,3 504,36±367,8 440,66±489,28 – ** 10,4±1,13**** 11,3±1,27 **** 81,0±12,3 105,0±10,8 41,3±17,9 ** 46,2±8,4 ** 2,0±0,7 4,8±0,6 28,32±10,87 **** 9,5±1,2 * 19,8±4,3 * – – 25,75±9,02 суток, **** — p<0,05 от здоровых в соответствующее время суток, ПЭФ — показатель эффекторной функции, ЦИК — циркулирующие иммунные комплексы, ФГА — фитогемагглютинин, FG — фагоцитирующие гранулоциты, FM — фагоцитирующие моноциты. 145 ГЛАВА 8. В утреннее время процент фагоцитирующих гранулоцитов остался сниженным, а процент активированных моноцитов (HLA-DR+) повысился по сравнению со здоровыми людьми. В вечернее время процент фагоцитирующих гранулоцитов стал выше, чем у здоровых (см. табл. 12). У больных после обычного лечения утренневечерние различия были характерны только для процента фагоцитирующих моноцитов: утренний уровень этого показателя стал достоверно выше вечернего (p<0,05) (см. табл. 12). После лечения, так же как и до лечения, у больных с атопическим дерматитом сохраняется сниженный, по сравнению со здоровыми людьми, вечерний уровень мелатонина (рис. 40) и так же, как и до лечения, отсутствуют утренне-вечерние различия в содержании гормона в сыворотке крови (см. табл. 12). Это свидетельствует о сохраняющемся состоянии десинхроноза. После общепринятой терапии у пациентов с атопическим дерматитом сохраняются негативные изменения в характеристиках клеток иммунной системы, что стимулирует поиск более эффективных методов иммунокоррекции. Отсутствие положительной динамики концентрации мелатонина в сыворотке крови обосновывает целесообразность введения в схему лечения препарата мелаксен, который является синтетическим аналогом мелатонина. 146 Мелатонин в коррекции морфофункционального состояния... ГЛАВА 8. активность СДГ в лимфоцитах оказались достоверно выше в утреннее время, а общее количество лимфоцитов, процентное содержание CD20+, CD16+, активность ЛДГ в лимфоцитах, содержание γ-ИФН в сыворотке крови более высокого уровня достигали в вечернее время (рис. 41). ое , низк Растр ение разреш Рис. 40. Различия в содержании мелатонина (пкг/мл) в сыворотке крови в 21.00 у здоровых доноров и у больных с АД до лечения; * — достоверные отличия p<0,05 от здоровых людей После лечения с добавлением мелаксена у больных атопическим дерматитом зарегистрированы более выраженные изменения в иммунном статусе, которые свидетельствуют о его положительной динамике: на фоне увеличения количества лимфоцитов повысилось содержание CD8+, CD4+ клеток, фагоцитирующих моноцитов и гранулоцитов, снизился показатель эффекторных функций, при этом достоверно снизился уровень IgE и ИЛ-4 в сыворотке крови (см. табл. 12). При этом для ряда показателей иммунного статуса были обнаружены достоверные суточные вариации, отсутствовавшие до лечения и после стандартной терапии. Процентное содержание Т-лимфоцитов (CD3+), Т-лимфоцитовТ-лимфоцитов-хелперов (CD4+), + эффекторов (CD8 ), фагоцитирующих моноцитов, 147 Рис. 41. Суточные вариации содержания в периферической крови различных субпопуляций иммунокомпетентных клеток у больных с АД после лечения с добавлением мелаксена (M±SE); * — показатель достоверно (p<0,05) отличается от значения в утреннее время, Fg M — фагоцитирующие моноциты В обеих группах (после обычного лечения и после лечения с мелаксеном) зарегистрирован положительный клинический эффект. Однако в группе с мелаксеном он был статистически значимо выше. Так, в груп148 Мелатонин в коррекции морфофункционального состояния... пе больных, получавших наряду со стандартной терапией мелаксен, интенсивность и распространенность кожных проявлений по шкале SCORAD уменьшилась на 84%, тогда как в группе пациентов без мелаксена — на 60%. Положительный эффект лечения в группе пациентов без мелаксена зарегистрирован у 70% больных, а у получавших мелаксен — у 88% (p<0,05 по критерию χ2). Следует отметить, что в группе пациентов, получавших мелаксен, на 7-8 дней быстрее претерпели положительную динамику такие клинические составляющие индекса SCORAD, как нарушение сна и кожный зуд. Заключение Мелаксен, являясь синтетическим аналогом мелатонина, способствует нормализации функций иммунокомпетентных клеток, направляя иммунные реакции по Th-1-зависимому пути, что является благоприятным для купирования атопических процессов. Немаловажную роль в повышении эффективности лечения, по-видимому, играет синхронизирующее действие препарата на суточную ритмику морфофункционального состояния клеток иммунной системы. 149 ГЛАВА 8. 8.2. Хроно- и иммунотропные эффекты мелаксена (синтетического аналога мелатонина) при введении его в схему лечения бронхиальной астмы В работе анализировались результаты клиникоиммунологического обследования 233 пациентов в фазах обострения и медикаментозной ремиссии, находившихся на стационарном лечении в клинике иммунопатологии НИИ клинической иммунологии СО РАМН с 2001 по 2007 гг. с диагнозом бронхиальная астма смешанного генеза, средней и тяжелой степени тяжести. Диагноз и степень тяжести бронхиальной астмы верифицировались согласно международным критериям Консенсуса по этому заболеванию [24]. Всем пациентам, помимо стандартного общеклинического и аллергологического обследования, было выполнено исследование иммунного статуса, включающего комплекс показателей, принятых в клинике иммунопатологии НИИ клинической иммунологии СО РАМН [98], определение содержания ИЛ-4, γ-ИФН и гормона эпифиза мелатонина в сыворотке периферической крови, цитохимическое определение активности дегидрогеназ лимфоцитов периферической крови по методам, описанным в предыдущей главе. Все исследования проводились дважды в сутки — в 09.00 и в 21.00 в фазу обострения заболевания и при достижении медикаментозной ремиссии на фоне стандартной терапии и после добавления к лечению мелаксена. 150 Мелатонин в коррекции морфофункционального состояния... С целью купирования обострения бронхиальной астмы использовались топические стероиды (беклометазона дипропионат, флютиказона пропионат), бронхолитики (β-адреномиметики в качестве монопрепарата и в комбинации с антихолинергическими средствами) в виде дозированных аэрозолей и через небулайзер, метилксантины парентерально и перорально, транквилизаторы и седативные препараты по показаниям. Пациентам с бронхиальной астмой назначался также препарат мелатонина (Мелаксен, Unifarm, США) в дозе 0,003 г ежедневно в 21.00 в течение трех недель в сочетании со стандартной терапией. У пациентов с бронхиальной астмой достижение клинической ремиссии оценивали по следующим показателям: отсутствие приступов затруднения дыхания на фоне поддерживающей терапии, отсутствие потребности в ингаляциях бронхолитиков более 4 раз в сутки, значения пиковой скорости выдоха не менее 80% от нормативных величин, увеличение показателей функции внешнего дыхания. Функцию внешнего дыхания (ФВД) оценивали с помощью спироанализатора «Эльф-Ласпек 01». Анализировались в динамике следующие показатели: жизненная емкость легких (ЖЕЛ), % ЖЕЛ к должностной, объем форсированного выдоха за 1-ю секунду (ОФВ1), % ОФВ1 к должностному. Эти легочные функциональные тесты позволяют выполнять точные воспроизводимые исследования функционального состояния респираторной системы и дают возможность количественного измерения тяжести заболевания [3]. 151 ГЛАВА 8. При оценке количества и функциональных показателей клеток иммунной системы, а также концентрации мелатонина в сыворотке крови в группе пациентов, получавших стандартную терапию, после лечения выявлены следующие изменения (рис. 42). В утреннее и вечернее время процентное содержание Т-лимфоцитов (СD3+) повысилось до нормы. Произошло снижение процентного содержания В-клеток (лимфоциты с фенотипом CD20+), повышение уровня которых характерно только для стадии обострения заболевания [79]. Снизилось до нормы процентное содержание не только В-клеток, но и НК-клеток (CD16+). Процентное содержание CD4+ лимфоцитов после лечения возросло и стало выше, чем у здоровых лиц. Однако, количество активированных хелперов (HLA-DR+CD4+) снизилось, а так как HLA-DR является маркером поздней активации лимфоцитов, то это свидетельствует о снижении потенциальных возможностей Т-клеток [97]. Несмотря на то, что после лечения процент фагоцитирующих гранулоцитов повысился, его уровень всетаки остался ниже, чем в группе здоровых доноров. Однако пришло к норме процентное содержание фагоцитирующих и активированных моноцитов (моноциты с экспрессией HLA-DR+) (табл. 13). После обычного лечения отмечается снижение в утреннее время активности НАДФ-диафоразы в лимфоцитах. Снижается активность ГЗТ-эффекторов, что проявляется в уменьшении показателя эффекторных функций (ПЭФ), являющегося одним из маркеров персистенции аллергического воспаления. Это снижение 152 Мелатонин в коррекции морфофункционального состояния... может расцениваться как благоприятный прогностический признак в отношении наступления ремиссии данного заболевания [46]. Индекс ингибиции миграции фагоцитов (ИИМ) после лечения повысился (см. табл. 13), что свидетельствует о сохраняющихся нарушениях миграции этих клеток. В 21.00 в периферической крови нормализовалось процентное содержание Т-лимфоцитов (CD3+) и Т-лимфоцитов-хелперов (CD4+), а уровень В-лимфоцитов (CD20+) снизился. Процент фагоцитирующих гранулоцитов, моноцитов и иммунорегуляторный индекс перестали отличаться от показателей здоровых людей. Отмечается тенденция к повышению процента фагоцитирующих гранулоцитов, которое можно объяснить тем, что изменение поглотительной функции нейтрофилов у больных аллергическими заболеваниями имеет преходящий характер и в период ремиссии этот показатель близок к норме [31] (см. табл. 13). После лечения значительно меньшее количество показателей иммунограммы стало иметь утренневечерние различия. Количество лимфоцитов, так же как и до лечения, более высокого уровня достигает в вечернее время суток, а уровень экспрессии молекулы HLA-DR на моноцитах — в утреннее (см. табл. 13). Обращает на себя внимание тот факт, что после обычного лечения БА содержание мелатонина в сыворотке периферической крови в вечернее время остается сниженным, за счет чего оказываются сглаженными суточные вариации гормона, что свидетельствует о сохраняющемся состоянии десинхроноза (см. рис. 42). 153 ГЛАВА 8. Таблица 13 Морфофункциональные показатели лимфоидных клеток крови и уровень мелатонина в сыворотке крови здоровых доноров и больных с бронхиальной астмой до лечения, после стандартного лечения и после лечения с мелаксеном (М±SE) Показатель Здоровые 09.00 γИФН/ ИЛ-4 Мела- 66,57 тонин, ±41,0* пкг/мл Кол-во 2146,2 лимф./ ±655,5 мм3 66,51 % CD3+ ±6,94 % CD4+ 36,41 ±5,49 % CD8+ 26,03 ±5,67 ИРИ (CD4+/ СD8+) % СD20+ 1,48 ±0,38 12,65 ±5,49 11,0 % CD16+ ±5,78 % FG 154 74,37 ±14,23 До лечения После стан- После лечения дарт. лечения М+ 21.00 09.00 21.00 09.00 21.00 09.00 21.00 2,83 2,07 4,37 4,86 1,05 1,83 ±5,24 ±1,15 ±6,42 ±7,04 ±0,07 ±0,92 115,33 20,88 41,93 44,61 33,2 – – ±21,7* ±5,72 ±20,5 ±21,9 ±16,2 ● ● 1614,5 2280,6 2402,3 2306,9 4114,7 1771,9 3725,0 ±306,0 ±1096,0 ±1335,7 ±1342,2 ±2449,8 ±693,6 ±2278,4 * * ● 65,85 60,25 51,86 65,88 69,25 62,66 56,5 ±7,24 ±10,71* ±12,76 ±8,31 ±8,17 ±13,70 ±19,31 ● *● ** ** *** 36,85 36,7 32,12 40,05 40,62 34,83 34,83 ±5,59 ±9,86* ±9,63 ±8,25 ±6,65 ±9,77 ±8,68 *● ** ● ** 25,77 24,0 28,5 24,07 28,25 28,58 28,33 ±4,67 ±6,73 ±14,40 ±6,26 ±5,54 ±4,52 ±11,11 ** *** 1,48 1,68 1,41 1,75 1,49 1,27 1,46 ±0,31 ±0,81* ±1,37* ±0,52 ±0,39 ±0,57 ±0,76 ● ● *** 13,59 16,85 16,23 12,94 10,87 12,5 12,83 ±4,79 ±6,99 ±6,88 ±7,83 ±4,12 ±5,33 ±7,44 ● ** ** ** 13,25 15,70 15,08 12,17 15,12 14,18 11,5 ±7,41 ±10,12 ±7,89 ±6,92 ±8,85 ±6,43 ±7,86 ● ** 66,76 57,04 63,33 64,90 68,28 63,75 77,66 ±17,85 ±13,75 ±10,35 ±13,07 ±5,87 ±8,86 ±11,23 ● ● ** ● *● * Мелатонин в коррекции морфофункционального состояния... Примечание. * — p≤0,05 отличия утренних от вечерних уровней показателей внутри групп, ** — p≤0,05 от до лечения в соответствующее время суток, *** — p≤0,05 отличия между группами после лечения без мелаксена и с мелаксеном в соответствующее время суток, ● — p≤0,05 отличия от здоровых в соответствующее время суток. е низко , р т с Ра ение разреш Рис. 42. Суточные вариации содержания мелатонина в сыворотке крови у больных БА до и после стандартного лечения После лечения с мелаксеном большинство отличий в характеристиках иммунокомпетентных клеток у данной группы пациентов от группы как здоровых, так и больных до и после обычного лечения наблюдаются в 09.00. В 09.00 отмечается тенденция к снижению количества лимфоцитов. Процент Т-эффекторов/киллеров 155 ГЛАВА 8. (CD8+) становится выше, чем был до лечения и после лечения без мелаксена, снижается величина иммунорегуляторного индекса, что свидетельствует о нормализации взаимодействия субпопуляций Т-лимфоцитов [13]. Отмечается уменьшение процентного содержания В-лимфоцитов (CD20+), нормализуются уровни CD16+ и CD4+ клеток. Процент фагоцитирующих гранулоцитов остается сниженным только в утреннее время суток, нормализуется процент фагоцитирующих моноцитов (см. табл. 13). Наблюдается тенденция к восстановлению нормальных суточных вариаций содержания в плазме крови ИФН-гамма (рис. 43). После лечения с мелаксеном появляются корреляционные связи между среднесуточными уровнями цитокинов (γ-ИФН и ИЛ-4) и активированными моноцитами, а также между показателями клеточного и гуморального иммунитета: процент Т-лимфоцитов положительно коррелирует с уровнем IgM, процент Т-эффекторов оказывается в отрицательной корреляционной связи с концентрацией IgE (табл. 14). Следует отметить, что ни до лечения, ни после стандартного лечения корреляции между этими показателями в суточном цикле отсутствовали, что можно трактовать как десинхроноз в регуляторных взаимодействиях внутри иммунной системы. 156 Мелатонин в коррекции морфофункционального состояния... ГЛАВА 8. иммунокомпетентных клеток, появлением корреляционных связей между цитокинами и показателями иммунного статуса, а также между показателями клеточного и гуморального иммунитета в суточном цикле, что свидетельствует о синхронизации внутрисистемных регуляторных взаимоотношений. ое , низк р т с а Р ение разреш Таблица 14 Результаты корреляционного анализа показателей иммунного статуса пациентов с БА до лечения, после стандартного лечения и лечения с добавлением мелаксена (p≤0,05) Рис. 43. Суточные вариации содержания ИФН-гамма в сыворотке крови больных БА после обычного лечения и после лечения с мелаксеном Пара показателей ИЛ-4 — ИФН-γ После лечения с мелаксеном у всех больных отмечалось улучшение общего состояния. У достоверно большего процента пациентов увеличились такие показатели спирограммы, как фактическая жизненная емкость легких (табл. 15), процент жизненной емкости легких к должностной, объем форсированного выдоха за 1-ю секунду, процент объема форсированного выдоха за 1-ю секунду к должностному. Таким образом, можно заключить, что введение в схему лечения БА мелаксена оказало более выраженное положительное влияние на вентиляционную функцию легких. Это ассоциировалось с нормализацией значительно большего числа показателей, характеризующих состояние 157 Больные Больные с с БА до БА после лечения стандартного (r) лечения (r) Больные с БА после лечения с добавлением мелаксена (r) 0,42 – 0,81 ИЛ-4 — Уровень экспрессии HLADR на моноцитах – – –0,94 ИФН-γ — Уровень экспрессии HLADR на моноцитах – – 0,94 Общее количество лимфоцитов — IgM – – 0,67 CD8+ — IgE – – –0,73 Примечание. Все приведенные коэффициенты корреляции достоверны (p<0,05); прочерк — коэффициент корреляции недостоверен. 158 Мелатонин в коррекции морфофункционального состояния... Таблица 15 Направленность изменения показателей спирограмм пациентов, больных бронхиальной астмой, послекуразличных видов лечения ? Н ить е разб й ли яче Способ терапии БА Показатель спирограммы ЖЕЛ ОФВ1 Фактическая ↓ ↑ %к %к долж- Фактическая должностной ностной ═ ↓ ↑ ↓ Общепринятое лечение, 30 40* 30 % пациентов 30 70 20 60* 20 Лечение с добавлением 10 90* мелаксена, % пациентов 10 90* 10 90* – ↑ ═ – ↓ ↑ 40 60* 10 90* Примечание. * — достоверно различающиеся параметры (метод χ2, p<0,01); ЖЕЛ — жизненная емкость легких, ОФВ1 — объем форсированного выдоха за 1-ю секунду, ↓ — уменьшение показателя спирограммы после лечения, ↑ — увеличение показателя спирограммы после лечения, = — после лечения нет динамики показателя спирограммы. Заключение Десинхронизация суточных биоритмов функционирования иммунной системы может являться как причиной, так и следствием нарушения функций им159 ГЛАВА 8. мунокомпетентных клеток и развития иммунопатологических процессов. В нашем исследовании, проведенном на животных, выявлено десинхронизирующее влияние постоянного освещения на суточные колебания количества лейкоцитов и лимфоцитов периферической крови, общего количества клеток тимуса, селезенки и лимфатических узлов, субпопуляционного состава лимфоцитов тимуса, лимфатических узлов, окислительно-восстановительного метаболизма лимфоцитов. При введении животным, находившимся при постоянном освещении, мелатонина или индуктора его синтеза амитриптилина наблюдалось восстановление суточных вариаций клеточного состава тимуса и лимфатических узлов, окислительно-восстановительного метаболизма лимфоцитов. Известно, что любое заболевание сопровождается рассогласованием эндогенных биологических ритмов организма. Такое рассогласование обозначается понятием «десинхроноз». У пациентов с атопическим дерматитом и бронхиальной астмой выявлено снижение уровня мелатонина в сыворотке периферической крови и отсутствие его суточных вариаций. Это свидетельствует о состоянии внешнего и внутреннего десинхроноза, т.к. любые изменения продукции мелатонина, выходящие за рамки нормальных физиологических колебаний, способны привести к рассогласованию как собственных биологических ритмов организма между собой, так и ритмов организма с ритмами окружающей среды. Как внутренний, так и внешний десинхроноз может являться причиной различных патологических состо160 Мелатонин в коррекции морфофункционального состояния... яний и сопровождать заболевания внутренних органов. Таким образом, отсутствующие суточные вариации содержания мелатонина в периферической крови свидетельствуют о нарушении центральной регуляции циркадианной ритмичности функционирования клеток иммунной системы и десинхроноза, который является одним из патогенетических звеньев заболевания. Включение мелаксена в комплексную терапию больных АД и БА привело к более выраженному клинико-иммунологическому эффекту, вероятно, за счет его иммунопотенцирующего и синхронизирующего действия на структуру и функциональную активность пула иммунокомпетентных клеток. 161 ОБЩЕЕ ЗАКЛЮЧЕНИЕ. ОБЩЕЕ ЗАКЛЮЧЕНИЕ Приведенные в монографии результаты показали, что нарушение светового режима приводит к серьезным перестройкам в организме на уровне регуляторно-метаболических (гомеостатических) систем — лимфатической, иммунной, эндокринной. Круглосуточное освещение животных в течение 14 дней вызывает у них состояние десинхроноза во всех компонентах лимфоидной системы — в лимфатическом регионе печени, центральных и периферических лимфоидных органах и крови. Его структурный след проявляется в печени и ее регионарных лимфатических узлах, а также в характеристиках иммунокомпетентных клеток (клеточный состав органов иммунной системы, активность ферментов энергетического метаболизма лимфоцитов крови) и в функциональной активности иммунной системы (снижение гуморального иммунного ответа на тимусзависимый антиген). Это свидетельствует о том, что ритм чередования света и темноты является значимым фактором в поддержании структурно-временной организации и функционального состояния лимфоидной системы. Известно, что печень и лимфатическая система синхронно участвуют во многих гомеостатических реакциях, и если печень вследствие высокого уровня метаболических реакций осуществляет детоксикацию на организменном уровне, то регионарные лимфатиче162 ОБЩЕЕ ЗАКЛЮЧЕНИЕ ские узлы печени осуществляют первичную тканевую лимфодетоксикацию печени [41]. Нами установлено, что изменение светового режима ведет к нарушению суточных вариаций морфометрических показателей тканевых компартментов печени и дренирующих ее регионарных лимфатических узлов, что приводит к развитию в лимфатическом регионе печени (включая пути несосудистого интерстициального массопереноса, лимфатические капилляры и сосуды, регионарные лимфатические узлы) целого каскада микро- и ультраструктурных и молекулярных изменений. Обнаруженные микро- и ультраструктурные изменения свидетельствуют о разбалансировке корней лимфатической системы в тканевом микрорайоне печени, нарушении оттока лимфы от органа и застое желчи. Нарушения крово- и лимфообращения в органе приводят к сдавлению гепатоцитов, разрушению мембран как гепатоцитов, так и синусоидальных клеток печени, нарушению гематолимфатического барьера, развитию тканевой гистотоксической гипоксии, дискоординации функций клеток во всех звеньях лимфатического региона печени. В основе нарушений метаболизма клеток при гипоксии лежат дефицит энергопродукции и активация процессов перекисного окисления липидов, приводящая к возникновению порочного круга и нарушению белок-липидных взаимодействий в мембранах клеток. Известно, что подобные нарушения способствуют опухолевой прогрессии. Разрушение эндотелиальной выстилки кровеносных синусоидных капилляров печени приводит к про163 ОБЩЕЕ ЗАКЛЮЧЕНИЕ. никновению клеточных элементов крови и продуктов некроза в перисинусоидальные пространства и далее в регионарные лимфатические узлы. Выявленные в условиях круглосуточного освещения микро- и ультраструктурные изменения в пространствах Диссе (переполнение их обломками некротически измененных клеток, коллагеновыми волокнами, клетками лимфоидного ряда, эритроцитами и т.д.) также свидетельствуют об ухудшении дренажа тканевой жидкости и лимфы, что подтверждает синхронное увеличение показателей объемной плотности кровеносных синусоидных капилляров тканевого микрорайона печени и синусной системы регионарных лимфатических узлов. Известно, что печень обладает высоким сродством к тиреоидным гормонам, быстро и в большом количестве накапливая их в своей паренхиме. Кроме того, именно через печень происходит удаление из организма большей части тиреоидных гормонов. Нами выявлено статистически значимое повышение уровня тиреоидных гормонов в сыворотке крови животных, содержавшихся в условиях круглосуточного освещения, по сравнению с интактными животными. Это может свидетельствовать как об усилении тиреоидной секреции вследствие стресса, испытываемого животными в условиях круглосуточного освещения, так и о нарушении функции печени в отношении утилизации и выведения избытка тиреоидных гормонов. Регуляция апоптоза представляет собой пример сбалансированного механизма с многократным ду164 ОБЩЕЕ ЗАКЛЮЧЕНИЕ блированием противовесов, призванного обеспечить надежный контроль за поддержанием клеточного гомеостаза в условиях действия стрессирующих и повреждающих факторов среды. Важная роль в осуществлении апоптоза принадлежит и тироксину (Т4), который регулирует функционирование протеиновой тирозинкиназы, одного из элементов реализации сигнала смерти. Выявленная нами активация внутриядерных эндонуклеаз в печени на фоне повышения уровня тироксина указывает на то, что процессы апоптоза клеток в органе при воздействии круглосуточного освещения развиваются по пути дезинтеграции ядерного хроматина. При этом проапоптотическим сигналам противодействует возрастание в печени белков с антиапоптотическими функциями (Bcl-2), при отсутствии иммуногистохимического окрашивания препаратов на проапоптотические белки (Baх и Bad), что свидетельствует о попытке организма сбалансировать работу «молекулярных переключателей» апоптоза в органе и ограничить его развитие по митохондриальному пути. Необходимо отметить, что Bcl-2 обладает еще одной способностью — блокируя реакции перекисного окисления липидов в мембранах клеток, он защищает клетки от повреждения свободными радикалами. Полученные нами данные свидетельствуют о том, что структурно-функциональный ответ регионарных лимфатических узлов печени на воздействие круглосуточного освещения проявляется в значительных микроциркуляторных нарушениях (застой лимфы, 165 ОБЩЕЕ ЗАКЛЮЧЕНИЕ. расширение синусной системы), на фоне которых развивается тканевая гистотоксическая гипоксия клеток. Морфометрический анализ показал, что наибольшая степень реагирования на воздействия круглосуточного освещения выявлена в В-зависимых зонах. При воздействии круглосуточного освещения также нарушаются параметры лейкоцитов периферической крови, что может приводить к нарушению иммунного статуса организма. На этом фоне, особенно в случае дополнительных воздействий, возможен прорыв трансформированных клеток через тканевой барьер и развитие доброкачественных и злокачественных опухолей, а также обострение ряда хронических заболеваний. Однако наиболее характерным признаком при данном воздействии было ослабление функциональной активности моноцитов, что указывает на блокаду клеточного звена иммунной системы организма. Нахождение экспериментальных животных в условиях круглосуточного освещения также влияет на продукцию активных метаболитов кислорода в моноцитах крови, модулирует их потенциальную бактерицидность и общую неспецифическую резистентность организма. Выявленное в регионарных лимфатических узлах при воздействии круглосуточного освещения уменьшение интенсивности окрашивания белка Bcl-2 на фоне выраженного окрашивания проапоптотического белка Bad свидетельствует о «снятии» в них антиапоптотической защиты и активации процессов апоптоза. Возможно, что это является проявлением функ166 ОБЩЕЕ ЗАКЛЮЧЕНИЕ ции апоптоза как механизма элиминации дефектных клеток, образующихся в результате повреждения тканей при воздействии десинхроноза. С другой стороны, можно предположить, что круглосуточное освещение, вызывая процессы клеточной деструкции, повышает антигенную нагрузку на лимфатические узлы, что приводит к стимуляции иммунокомпетентных клеток и их «активационному апоптозу». Таким образом, снижение антиапоптотической защиты можно считать не только негативным фактором, способствующим усилению клеточной гибели, но и проявлением компенсаторного механизма, направленного на удаление дефектных клеток и апоптотических телец, т.е. лимфодетоксикации. Установленные молекулярные особенности клеточной гибели в печени и ее регионарном лимфатическом аппарате свидетельствуют о развивающемся взаимосвязанном каскаде реакций в печени и ее лимфатическом регионе в ответ на воздействие нарушения светового режима и показывают, что состояние органа и его лимфатического аппарата может находиться не только в прямой, но и в обратной взаимосвязи. При этом механизмы апоптоза направлены на нормализацию гомеостаза в печени и ее лимфатическом регионе, усиливая детоксикационную функцию регионарных лимфатических узлов, способствуют ее более полной реализации. Эти данные подтверждаются и иммунологическими исследованиями. Установлено, что у животных, находившихся в условиях постоянного освещения, из167 ОБЩЕЕ ЗАКЛЮЧЕНИЕ. меняется структура ядерного хроматина лимфоцитов крови и брыжеечных лимфатических узлов. В ядрах этих клеток увеличивался периметр и площадь структур, занимаемых как конденсированным, так и деконденсированным хроматином, а также увеличивалась общая площадь ядер при сохранении интегральной оптической плотности на уровне контрольных животных. Это может быть следствием увеличения доли средних и больших клеточных форм в лимфоцитарном пуле периферической крови. При интенсификации процессов апоптоза наблюдается довольно быстрое исчезновение из крови малых лимфоцитов. Средние и большие лимфоциты при этом набухают, размеры их ядер увеличиваются, и количественное соотношение меняется в пользу больших лимфоцитов. Такое объяснение совпадает с изложенными выше данными об усилении процессов апоптоза в лимфатических узлах. Если учесть, что круглосуточное освещение является значительным стрессом для организма животных, то можно предположить увеличение ядер лимфоцитов крови вследствие стрессового увеличения продукции глюкокортикоидов. Кстати, именно подъем глюкокортикоидов может провоцировать стимуляцию апоптоза в лимфоидных клетках. Выявленный нами характер метаболической реакции лимфоцитов крови на круглосуточное освещение (изменение суточной динамики соотношения аэробных процессов и анаэробного пути энергопродукции) можно рассматривать как проявление гипоксического состояния клеток лимфоидной системы, что согласуется с описанными 168 ОБЩЕЕ ЗАКЛЮЧЕНИЕ выше данными о развитии гипоксических изменений в клетках печени и ее лимфатического региона. Можно сделать заключение, что лимфоидная система в условиях нарушенного светового режима реагирует как единый комплекс, причем недостаточность и рассогласование во времени энергетических процессов в ее клеточных элементах и тканевых структурах является типичным проявлением этой реакции. Синхронизирующее влияние суточного режима освещенности на иммунную систему и лимфатический регион печени, по-видимому, в основном опосредуется мелатонином — эпифизарным гормоном, продукция которого имеет четкий суточный ритм и приурочена к темному времени суток [37]. Показано, что постоянное освещение подавляет синтез мелатонина, так что данную модельную ситуацию можно рассматривать как функциональную эпифизэктомию [164]. Освещение в ночное время суток приводит к рассогласованию суточных ритмов мелатонина и кортикостероидов, а также к нарушению ритмов экспрессии «часовых» генов в эпифизе и надпочечниках, что можно рассматривать как проявление десинхроноза в эндокринной системе, реализующееся на уровне генетического аппарата клеток [157]. Это с необходимостью должно отражаться на морфофункциональном состоянии лимфатической и иммунной систем, т.к. все их компоненты (клеточные элементы, интерстиций, сосуды) находятся под регулирующими нейроэндокринными влияниями. Нами установлено, что круглосуточное освещение, при котором значительно угнетается продукция МТ, 169 ОБЩЕЕ ЗАКЛЮЧЕНИЕ. приводит к нарушению структурно-функциональных показателей печени и ее лимфатического региона, центральной дифференцировки лимфоидных клеток в тимусе, изменяет баланс лимфоидных субпопуляций в лимфатических узлах, отражается на состоянии ядерного хроматина и ферментного спектра лимфоцитов, причем происходит рассогласование суточных ритмов данных показателей. Это сочетается с супрессией гуморального иммунного ответа, что свидетельствует о снижении функций иммунитета на системном уровне [91]. В связи с вышеизложенным становится очевидной возможность применения МТ для коррекции внутреннего десинхроноза в лимфоидной системе, развивающегося в результате нарушения светового режима или других десинхронизирующих факторов (стресс, болезнь и др.). Настоящая работа демонстрирует эту возможность в экспериментальном и клиническом исследовании. Установлено, что МТ и индуктор его синтеза амитриптилин способствуют коррекции внутреннего десинхроноза в лимфоидной системе, вызванного круглосуточным освещением. Применение синтетического аналога МТ мелаксена в лечении заболеваний с иммунопатологическим генезом (БА и АД) приводит к положительной динамике морфофункционального состояния лимфоидных клеток, биоритмологическим сдвигам в лимфоидной системе, что ассоциируется с повышением клинической эффективности терапии. Полученные данные свидетельствуют о том, что нарушение светового режима через рассогласование 170 ОБЩЕЕ ЗАКЛЮЧЕНИЕ деятельности эндокринных желез приводит к расстройствам регуляции лимфатической и иммунной систем. Как следствие развиваются нарушения лимфоциркуляции, лимфодренажа, иммунные дисфункции, дисбаланс клеточного состава лимфатических регионов организма, в том числе и лимфатического региона печени. Лимфоидные клетки лимфатических узлов, резидентные лимфоциты печени имеют тимусное или костномозговое происхождение, и только после соответствующих этапов дифференцировки приобретают способность к миграции из центральных органов иммунитета и заселяют периферические лимфоидные и нелимфоидные органы и ткани. Эти клеточные элементы (лимфоциты, макрофаги, дендритные клетки) играют важнейшую роль в процессах поддержания эндоэкологического баланса, дезагрегируя и удаляя антигены внешнего происхождения и аутоантигены, регулируя процессы пролиферации и дифференцировки клеток другой тканевой принадлежности; обеспечивают процессы физиологической и репаративной регенерации; продуцируя цитокины, оказывают влияние не только на иммунные реакции, но и на состояние межклеточного матрикса, проницаемость сосудистой стенки, процессы микроциркуляции, то есть в конечном итоге на дренажно-детоксикационные функции лимфатической системы. Необходимо отметить, что при эндокринной сигнализации гормоны секретируются в интерстициальное пространство, диффундируют к капиллярам, разносятся током крови по всему организму, через 171 ОБЩЕЕ ЗАКЛЮЧЕНИЕ. капилляры вновь проникают в интерстициальное пространство и лишь затем диффундируют к специфическим рецепторам на поверхности клеток-мишеней. При эндокринном типе сигнализации до достижения ткани-мишени первичные мессенджеры претерпевают сильное разбавление в крови и интерстициальной жидкости. Известно, что многие клетки обладают способностью реагировать на очень низкие концентрации сигнальных молекул в интерстициальном пространстве. Это связано с наличием внутриклеточного механизма каскадного усиления гормонального сигнала. По-видимому, развивающиеся в условиях круглосуточного освещения нарушения гемо- и лимфоциркуляции приводят к развитию застоя интерстициальной жидкости и, как следствие, дилятации корней лимфатической системы в печени, что может приводить к изменению концентрации сигнальных молекул в интерстициальной жидкости и нарушению процессов межклеточной коммуникации. При длительном нарушении светового режима, приводящего к нарушению нормального функционирования эндокринных желез, может произойти потеря способности клетокмишеней реагировать на внешний стимул с прежней чувствительностью. Как следствие наблюдается нарушение функций основных органов и систем, обеспечивающих гомеостаз в условиях действия негативных факторов среды, — печени (как «метаболического мозга» и основного органа детоксикации) и иммунной системы, поддерживающей антигенно-структурный гомеостаз организма 172 ОБЩЕЕ ЗАКЛЮЧЕНИЕ и защиту от инфекционных агентов. В результате возможно нарушение эндоэкологического равновесия, ускорение процессов старения, развитие дизрегуляционной патологии, снижение качества жизни и сокращение ее продолжительности. МТ и его аналоги, а также индукторы его синтеза могут рассматриваться как возможные протекторы и корректоры внутреннего десинхроноза в работе основных гомеостатических систем организма. Впервые в эксперименте в модели измененного светового режима (круглосуточного освещения) показана возможность коррекции нарушенных циркадианных биоритмов иммунной системы с помощью мелатонина и его индуктора амитриптилина. Изучены синхронизирующие и иммуномодулирующие эффекты мелаксена при лечении больных с атопическим дерматитом и бронхиальной астмой, которые ассоциируются с повышением клинической эффективности терапии этих тяжелых, социально значимых заболеваний. Результаты исследований, приведенные в монографии, являются базой для расширения сферы применения МТ в целях профилактики и лечения заболеваний. 173 Библиографический список Библиографический список 1. Г.Г. Автандилов. Медицинская морфометрия. Руководство / Г.Г. Автандилов. — М.: Медицина, 1990. — 384 с. 2. Адо А.Д. О взаимодействии нервной и иммунной систем (к механизмам влияния нервной системы на лимфоциты) / А.Д. Адо // Вестник РАМН. — 1993. — № 7. — С. 48–51. 3. Айсанов З.Р. Функциональные методы исследования / З.Р. Айсанов, А.В. Черняк, Е.Н. Калманова, С.Ю. Чикина, Г.В. Неклюдова // Респираторная медицина: Руководство / Под ред. академика РАМН А.Г. Чучалина. — Т. 1. — М.: ГЭОТАРМедиа, 2007. — С. 352–355. 4. Акмаев И.Г. Нейроиммуноэндокринные взаимодействия: их роль в дизрегуляторной патологии / И.Г. Акмаев // Патологическая физиология и экспериментальная терапия. — 2001. — № 4. — С. 3–10. 5. Алякринский Б.С. Биологические ритмы и организация жизни человека в космосе / Б.С. Алякринский. — М.: Наука, 1983. — 284 с. 6. Арушанян Э.Б. Гормон эпифиза мелатонин — новое ноотропное средство / Э.Б. Арушанян, Л.Г. Арушанян // Эксперим. и клинич. фармакология. — 2005. — Т. 68. — № 3. — С. 74–79. 7. Арушанян Э.Б. Модуляторные свойства эпифи- 174 Библиографический список зарного мелатонина / Э.Б. Арушанян, Л.Г. Арушанян // Проблемы эндокринологии. — 1991. — № 3. — С. 65–68. 8. 9. Арушанян Э.Б. Эпифизарный мелатонин как антистрессорный агент / Э.Б. Арушанян, Л.Г. Арушанян // Эксперим. и клинич. фармакол. — 1997. — Т. 60. — № 6. — С. 71–77. Арушанян Э.Б. Временная организация деятельности иммунной системы и участие в ней эпифиза / Э.Б. Арушанян, Э.В. Бейер // Успехи физиологических наук. — 2006. — Т. 37. — № 2. — С. 3–10. 10. Арушанян Э.Б. Хронобиологическое сходство специфического действия анксиолитических и антидепрессивных средств / Э.Б. Арушанян, Э.В. Бейер // Эксперим. и клинич. фармакология. — 2007. — Т. 70. — № 5. — С. 52–58. 11. Балаболкин И.И. Современная концепция патогенеза бронхиальной астмы у детей / И.И. Балаболкин, И.Е. Смирнов, В.А. Булгакова и др. // Иммунология, аллергология, инфектология. — 2006. — № 1. — С. 26–35. 12. Банин В.В. Механизм обмена внутренней среды / В.В. Банин. — М., 2000. — 276 с. 13. Баранова Н.И. Характеристика иммунного статуса больных аллергическими заболеваниями дыхательных путей с бактериальной сенсибилизацией / Н.И. Баранова, Е.М. Костина // Клиническая ла175 Библиографический список бораторная диагностика. — 2009. — № 8. — С. 21–23. 14. Бекетова Т.П. Синусоидальные клетки печени и их роль в патологических процессах / Т.П. Бекетова, С.М. Секамова // Арх. пат. — 1983. — Вып. 10. — С. 83–89. 15. Биологические ритмы. Т. 1–2 / Под ред. Ю. Ашоффа. — М.: Мир, 1984. — 414 с. 16. Бородин Ю.И. Внутренняя среда организма и корни лимфатической системы / Ю.И. Бородин // Проблемы лимфангиологии / Под ред. Ю.И. Бородина, В.И. Коненкова, А.Ф. Повещенко. — Новосибирск: Издательский дом «Манускрипт», 2010. — C. 7–25. 17. Бородин Ю.И. Лимфатический регион и регионарная лимфодетоксикация / Ю.И. Бородин // Хирургия, морфология, лимфология. — Бишкек, 2004. — Т. 1. — № 2. — С. 5–6. 18. Бородин Ю.И. Лимфатический регион: Лимфатический дренаж и лимфодетоксикация / Ю.И. Бородин // Проблемы лимфангиологии / Под ред. Ю.И. Бородина, В.И. Коненкова, А.Ф. Повещенко. — Новосибирск: Издательский дом «Манускрипт», 2010. — C. 26–33. 19. Бородин Ю.И. Регионарный лимфатический дренаж и лимфодетоксикация / Ю.И. Бородин // Морфология. — 2005. — Т. 128. — № 4. — С. 25–28. 176 Библиографический список 20. Бородин Ю.И. Экспрессия внутриклеточного молекулярного регулятора апоптоза Bcl-2-белка в печени при отдельных и сочетанных влияниях круглосуточного освещения и магнитного поля промышленной частоты / Ю.И. Бородин, С.В. Мичурина, С.А. Архипов, А.Д. Белкин, И.П. Жураковский // Клеточные технологии в биологии и медицине. — М., 2008. — № 2. — С. 80–83. 21. Бородин Ю.И. Реакция лимфатического региона печени и тимуса на изменение светового режима / Ю.И. Бородин, С.В. Мичурина, А.Д. Белкин, Г.М. Вакулин, С.А. Архипов, И.П. Жураковский, А.В. Шурлыгина, Т.В. Шантурова // Хирургия, морфология, лимфология. — Бишкек, 2007. — Т. 4. — № 7. — С. 10–12. 22. Бородин Ю.И. Циркадианные биоритмы иммунной системы / Ю.И. Бородин, В.А. Труфакин, А.Ю. Летягин, А.В. Шурлыгина. — Новосибирск: РИПЭЛ, 1992. — 207 с. 23. Бродский В.Я. Клеточная полиплоидия. Пролиферация и дифференцировка / В.Я. Бродский, И.В. Урываева. — М.: Наука, 1981. — 276 с. 24. Бронхиальная астма. Глобальная стратегия. Совместный доклад НИЗ (США) и ВОЗ (1993) // Пульмонология. — 1996. — 196 с. 25. Введение в молекулярную медицину / Под ред. М.А. Пальцева. — М.: ОАО «Издательство Медицина», 2004. — 496 с. 177 Библиографический список 26. Голубева Н.Н. Изменение плазматических мембран и метаболической активности лимфоцитов при антигенном воздействии / Н.Н. Голубева, Л.А. Цуцаева, К.М. Маркосян и др. // Иммунология. — 1982. — № 2. — С. 25–28. 27. Дедов И.И. Биоритмы гормонов / И.И. Дедов, В.И. Дедов. — М.: Медицина, 1992. — 253 с. 28. Евсюкова Е.В. Патогенез, диагностика и эффективное лечение пептидами эпифиза аспириновой бронхиальной астмы / Е.В. Евсюкова, Г.Б. Федосеев, Н.Н. Петрищев, В.Х. Хавинсон // Пульмонология. — 2003. — № 6. — С. 57–63. 29. Зарецкая Ю.М. Клиническая иммуногенетика / Ю.М. Зарецкая. — М.: Медицина, 1983. — 207 с. 30. Заславская Р.М. Мелатонин в комплексном лечении больных стабильной стенокардией и артериальной гипертонией / Р.М. Заславская, Э.А. Щербань, С.И. Логвиненко // Клиническая медицина. — 2008. — № 9. — С. 64–67. 31. Иванова И.П. Нормобарическая гипокситерапия больных бронхиальной астмой / И.П. Иванова, В.М. Непомнящих, В.С. Ширинский, В.С. Кожевников, Л.П. Коненкова, В.А. Козлов // Клиническая медицина. — 2001. — № 9. — С. 36–39. 32. Истошин Н.Г. Организация лечебного процесса детей, больных бронхиальной астмой / Н.Г. Истошин, Е.Н. Чалая, З.Ч. Вазиева, Л.Г. Даниэльян // II Международный конгресс «Восстановительная 178 Библиографический список Библиографический список медицина и реабилитация». — М., 2005. 33. Казначеев В.П. Очерки теории и практики экологии человека / В.П. Казначеев. — М.: Наука, 1983. — 259 с. 34. Казначеев В.П. Этюды к теории общей патологии / В.П. Казначеев, М.Я. Субботин. — Новосибирск: Наука, 1971. — 230 с. 35. Каладзе Н.Н. Характеристика адаптационного потенциала организма в период обострения бронхиальной астмы у детей / Н.Н. Каладзе, Л.И. Мурадосилова, Е.М. Соболева, М.Л. Бабак // Клиническая педиатрия. Здоровье ребенка. — 2006. — № 2(2). — С. 24–30. 36. Карелина С.В. Структурные изменения в печени и регионарных лимфоузлах после воздействия высоких температур и коррекции мелатонином (экспериментальное исследование): автореф. дис. канд. мед. наук / С.В. Карелина. — Новосибирск, 2009 — 38 с. 37. Кветная Т.В. Мелатонин: роль и значение в возрастной патологии / Т.В. Кветная, И.В. Князькин. — СПб., 2003. — 22 с. 38. Кветной И.М. Мелатонин в норме и патологии / И.М. Кветной, Т.В. Кветная, Н.Т. Райхлин. — М.: Медпрактика, 2004. — С. 34–47. 39. Ковшик И.Г. Суточные вариации морфофункциональных параметров лимфоцитов у мышей в нор179 ме и после введения интерлейкина-2 / И.Г. Ковшик // Автореф. канд. мед. наук. — Новосибирск, 2005 — 16 с. 40. Козлов В.А. Методическое руководство по применению метода локального гемолиза и статистическому оцениванию результатов / В.А. Козлов, О.Т. Кудаева, Е.Н. Наумова, Т.В. Елисеева. — Новосибирск, 1988. — 25 с. 41. Колесников С.И. Печень и ее регионарные лимфатические узлы при воздействии 3,4-бензпиреном / С.И. Колесников, С.В. Мичурина, А.В. Семенюк, Г.М. Вакулин. — Новосибирск: Изд-во СО РАМН, 1995. — 218 c. 42. Коненков В.И. Защитные функции лимфатической системы / В.И. Коненков // Хирургия, морфология, лимфология. — 2007. — Т. 4. — № 7. — С. 15–17. 43. Коненков В.И. Протективные функции лимфатической системы / В.И. Коненков // Бюллетень СО РАМН. — 2007. — № 2. — С. 60–64. 44. Конопля Е.Ф. Гормоны и старение: мембранные механизмы гормональной регуляции / Е.Ф. Конопля, Г.Г. Гащко, А.А. Милютин. — Минск 7: Навука i тэхнiка, 1991. — 205 с. 45. Коркушко О.В. Шишковидная железа: физиологическая роль в организме. Функциональная недостаточность в пожилом возрасте, возможные пути коррекции / О.В. Коркушко, В.Б. Шатило // 180 Библиографический список Библиографический список Медничий Всесвiт. — 2003. — Т. 3. — № 2. — С. 3–16. 46. Курамшина Д.В. Сравнительный анализ иммунологических особенностей патогенеза атопического дерматита и атопической бронхиальной астмы: автореф. дис. канд. мед. наук / Д.В. Курамшина. — СПб., 2005. — 24 с. 47. Куртасова Л.М. Метаболические аспекты иммунных нарушений у детей с заболеваниями органов дыхания / Л.М. Куртасова, А.А. Савченко, В.Т. Манчук. — Новосибирск: Изд-во СО РАМН, 2001. — 178 с. 48. Лабунец И.Ф. Влияние эпитоламина на ритмичность функционирования иммунной и эндокринной систем у больных хронической ишемической болезнью сердца / И.Ф. Лабунец, Г.М. Бутенко, О.В. Коркушко, В.Б. Шатило // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. — 2007. — Т. 143. — № 4. — С. 451–454. 49. Ландышев Ю.С. Суточные ритмы уровня АКТГ, кортизола и 17-оксикортикостероидов у больных бронхиальной астмой / Ю.С. Ландышев, В.П. Мищук // Тер. архив. — 1994. — № 3. — С. 12–15. 50. Литвиненко Г.И. Влияние амитриптилина на суточные колебания клеточного состава органов иммунной системы у крыс при экспериментальном десинхронозе / Г.И. Литвиненко, Л.В. Вербицкая, Л.В. Тараданова, Е.В. Мельникова, М.В. 181 Тендитник, А.В. Шурлыгина, В.А. Труфакин // Бюлл. эксп. биол. — 2000. — Т. 130.— № 11. — С. 589–592. 51. Лозовой В.П. Биоритмологические аспекты изучения иммунитета человека в Заполярье / В.П. Лозовой // Вестник АМН СССР. — 1979. — № 6. — С. 39–49. 52. Лозовой В.П. Структурно-функциональная организация иммунной системы / В.П. Лозовой, С.М. Шергин. — Новосибирск: Наука, 1981. — 224 с. 53. Лукьянова Л.Д. Биоэнергетическая гипоксия: понятие, механизмы и способы коррекции / Л.Д. Лукьянова // Бюл. экспер. биол. и мед. — 1997. — Т. 124. — № 9. — С. 244–254. 54. Луппа Х. Основы гистохимии / Х. Луппа. — М., 1980. — 458 с. 55. Мак-Мюррей У. Обмен веществ у человека: Пер с англ. / У. Мак-Мюррей. — М.: Мир, 1980. — С. 380. 56. Малиновская Н.К. Роль мелатонина в организме человека / Н.К. Малиновская // Клинич. медицина. — 1998. — № 10. — С. 15–22. 57. Мальцев С.В. Физиология и патофизиология мелатонина / С.В. Мальцев, Л.А. Ишкина // Казан. мед. журн. — 1999. — Т. 80. — № 5. — С. 390– 393. 58. Маянский Д.Н. Лекции по клинической патоло182 Библиографический список Библиографический список гии / Д.Н. Маянский // Руководство для врачей. — М.: ГОЭТАР-Медиа, 2007 (в тексте 2008). — 464 с. ной железы при отдельных и сочетанных воздействиях светового десинхроноза и бенз(а)пирена / С.В. Мичурина, Ю.И. Бородин, А.Д. Белкин, А.В. Шурлыгина, Г.М. Вакулин, С.А. Архипов, И.П. Жураковский // Вестник лимфологии. — 2008. — № 2. — С. 29. 59. Маянский Д.Н. Хроническое воспаление / Д.Н. Маянский. — М.: Медицина. — 1981. — 272 с. 60. Меркурьева А.В. Биохимические и цитохимические методы определения активности ферментов и фермент-субстратных систем различной клеточной локализации / А.В. Меркурьева, Г.Л. Билич, Р.П. Нарциссов // Методические рекомендации. — М. – Йошкар-Ола, 1982: 1. 61. Мичурина С.В. Влияние магнитного поля промышленной частоты и постоянного освещения на периферическую кровь крыс / С.В. Мичурина, А.Д. Белкин, А.В. Шурлыгина, С.А. Архипов, Ю.С. Бугримова, Л.В. Вербицкая // Гигиена и санитария. — 2005. — № 5. — С. 78–80. 62. Мичурина С.В. Влияние функциональной эпифизэктомии на морфологическую организацию лимфатического региона печени и механизмы программируемой клеточной гибели: Тез. Х Междунар. конф. «Фундаментальные проблемы лимфологии и клеточной биологии» 3–4 октября 2011 / С.В. Мичурина, Ю.И. Бородин, С.А. Архипов, П.М. Ларионов, И.Ю. Ищенко, Г.М. Вакулин. — Новосибирск, 2011. — С. 202–204. 63. Мичурина С.В. Морфология лимфатического региона печени и содержание гормонов щитовид183 64. Мичурина С.В. Лимфатический регион печени крыс Вистар в условиях сочетанного влияния алкогольной интоксикации и круглосуточного освещения / С.В. Мичурина, Ю.И. Бородин, И.Ю. Ищенко и др. // Бюлл. СО РАМН. — 2008. — № 5. — С. 44–49. 65. Мичурина С.В. Продукция белка Bcl-2 в лимфатическом регионе печени при отдельных и сочетанных воздействиях магнитного поля промышленной частоты и круглосуточного освещения / С.В. Мичурина, Ю.И. Бородин, В.А. Труфакин, А.Д. Белкин, С.А. Архипов, И.П. Жураковский, А.В. Шурлыгина // Вестник лимфологии. — 2010. — № 5. — С. 12–17. 66. Мичурина С.В. Микроциркуляция в печени и процессы апоптоза при сочетанных воздействиях магнитного поля промышленной частоты и круглосуточного освещения / С.В. Мичурина, Ю.И. Бородин, В.А. Труфакин, А.Д. Белкин, С.А. Архипов, А.В. Шурлыгина, И.П. Жураковский, П.М. Ларионов // Морфологические ведомости. — 2008. — № 3–4. — С. 52–54. 184 Библиографический список 67. Мичурина С.В. Микро- и ультраструктурные особенности печени и активность ядерных эндонуклеаз в гепатоцитах при сочетанных воздействиях магнитного поля промышленной частоты и круглосуточного освещения / С.В. Мичурина, Ю.И. Бородин, В.А. Труфакин, А.Д. Белкин, Г.М. Вакулин, П.М. Ларионов, А.В. Шурлыгина // Морфология. — 2010. — Т. 138. — № 5. — С. 47–51. Библиографический список П.М. Ларионов, Г.М. Вакулин. — Новосибирск, 3–4 октября 2011. — С. 202–204. 71. Мичурина С.В. Изменения печени и некоторых параметров иммунной системы животных в условиях круглосуточного освещения / С.В. Мичурина, А.В. Шурлыгина, А.Д. Белкин, Г.М. Вакулин, Л.В. Вербицкая, В.А. Труфакин // Морфология. — 2005. — Т. 128. — № 4. — С. 65–69. 68. Мичурина С.В. Суточная динамика морфометрических показателей тканевого микрорайона печени и брыжеечных лимфатических узлов у мышей, находившихся при естественном и измененном световом режимах / С.В. Мичурина, А.В. Ефремов, Ю.С. Бугримова, А.Д. Белкин, А.В. Шурлыгина // Морфология и хирургия: Сб. науч. тр. под ред. проф. В.А. Головнева и проф. А.В. Волкова. — Новосибирск, 2003. — Вып. 4. — С. 10–11. 72. Мушкамбаров Н.Н. Молекулярная биология / Н.Н. Мушкамбаров, С.А. Кузнецов. — М: ООО «Медицинское информационное агентство», 2007. — 536 с. 69. Мичурина С.В. Печень и регионарные лимфатические крыс после воздействия высокой температуры / С.В. Мичурина, С.В. Карелина, И.Ю. Ищенко, Г.М. Вакулин // Бюл. СО РАМН. — 2011. — № 2. — С. 121–127. 74. Оганджанян Э.Е. Оценка степени тяжести лучевого поражения собак по денситогеометрическим параметрам лимфоцитов крови. // Радиобиология. — 1989. — T.XXIX., Вып.2. — С.226–229. 70. Мичурина С.В. Влияние функциональной эпифизэктомии на морфологическую организацию лимфатического региона печени и механизмы программируемой клеточной гибели. Фундаментальные проблемы лимфологии и клеточной биологии: Мат. Х Международной конференции / С.В. Мичурина, Ю.И. Бородин, С.А. Архипов, 185 73. Нарциссов Р.П. Применение пара-нитротетрозолия фиолетового для количественной цитохимии дегидрогеназ лимфоцитов человека / Р.П. Нарциссов // Арх. анат. — 1969. — № 5. — С. 85–91. 75. Оганджанян Э.Е., Погосян А.С., Саакян Д.Г. с соавт. Клиническая по апробация метода биоиндикации малых уровней радиации денситогеометрическим параметрам лимфоцитов периферической крови / Э.Е. Оганджанян, Р.С. Будагов, B.C. Нестеренко, А.А. Оганджанян // Мед. радиол. — 1991. — Т. 36. — С. 21–23. 76. Оковитый С.В. Антигипоксанты / С.В. Оковитый, 186 Библиографический список 77. Библиографический список А.В. Смирнов // Экспериментальная и клиническая фармакология. — 2001. — Т. 64. — № 3. — С. 76–80. мой при лечении мелаксеном / О.Н. Рагозин, М.В. Баликин, Е.И. Чарикова // Клиническая медицина. — 2001. — № 2. — С. 59–60. Пальцев М.А. Молекулярная медицина и прогресс фундаментальных наук / М.А. Пальцев // Вестник РАН. — 2002. — Т. 72. — № 1. — С. 13–21. 83. Сакута Г.А. Клеточные механизмы регенерации циррозной печени крыс. I Соотношение процессов пролиферации, полиплоидизации и гипертрофии клеток после прекращения хронического воздействия CCl4 / Г.А. Сакута, Б.Н. Кудрявцев // Цитология. — 1996. — Т. 38. — № 11. — С. 1158– 1171. 78. Подымова С.Д. Болезни печени. Руководство для врачей / С.Д. Подымова. — М.: Медицина, 1998. — 704 с. 79. Порядин Г.В. Иммунологические механизмы выхода больных атопической бронхиальной астмой из обострения / Г.В. Порядин, Н.Е. Журавлева, Ж.М. Салмаси и др. // Russian Journal of Immunology. — 2002. — Vol. 7(3). — P. 259–264. 80. Пупышев А.Б. Влияние бензпирена и светового режима на состояние лизосомального аппарата печени крыс и билиарную экскрецию лизосомных ферментов / А.Б. Пупышев, Е.М. Гутина, Р.Г. Федина, С.В. Мичурина, A.В. Шурлыгина, Л.В. Вербицкая // Бюлл. экспериментальной биологии и медицины. — 2004. — Т. 139. — № 1. — С. 40– 43. 81. Рагозин О.Н. Биоритмологические эффекты прерывистой нормобарической гипоксии у больных бронхиальной астмой: автореф. дис. докт. мед. наук / О.Н. Рагозин. — СПб., 2003. — 47 с. 82. Рагозин О.Н. Циркадианные ритмы параметров внешнего дыхания у больных бронхиальной аст187 84. Сакута Г.А. Клеточные механизмы регенерации цирротически измененной печени крыс. II Влияние частичной гепатэктомии на пролиферацию, полиплоидизацию и гипертрофию гепатоцитов / Г.А. Сакута, Б.Н. Кудрявцев // Цитология. — 2005. — Т. 47. — № 5. — С. 379–387. 85. Саркисов Д.С. Очерки истории общей патологии / Д.С. Саркисов. — М.: Медицина, 1993. — 512 с. 86. Семичева Т.В. Эпифиз: современные данные о физиологии и патологии / Т.В. Семичева, А.Ю. Гарибашвили // Проблемы эндокринол. — 2000. — Т. 46. — № 4. — С. 38–44. 87. Серов В.В., Лапиш К. Морфологическая диагностика заболеваний печени / В.В. Серов, К. Лапиш. — М.: Медицина, 1989. — 336 с. 88. Струков А.И. Морфологический эквивалент функции (методологические основы) / А.И. Струков, 188 Библиографический список О.К. Хмельницкий, В.П. Петленко. — М.: Медицина, 1983. — 207 с. 89. Таранов А.Г. Диагностические тест-системы: радиоиммунные и иммуноферментные методы диагностики / А.Г. Таранов. — Новосибирск: Изд. НГУ. — 2000. — 260 с. 90. Торбек В.Э. Влияние нейроэндокринных и иммунологических факторов на развитие лимфоидных органов и морфофункциональное состояние лимфоцитов в эмбриогенезе: автореф. дис. док. мед. наук / В.Э. Торбек. — М., 1986. — 25 с. 91. Труфакин В.А. Проблемы центральной регуляции биоритмов иммунной системы. Роль мелатонина / В.А. Труфакин, А.В. Шурлыгина // Вестник Российской АМН. — 2006. — № 9–10. — С. 121– 127. 92. Труфакин В.А. Проблемы гистофизиологии иммунной системы / В.А. Труфакин, А.В. Шурлыгина // Иммунология. — 2002. — № 1. — С. 4–8. 93. Труфакин В.А. Суточные вариации метаболической реакции лимфоцитов крови людей на гормональные стимулы в норме и при развитии иммунодефицита / В.А. Труфакин, А.В. Шурлыгина, Т.И. Дергачева, Г.И. Литвиненко // Бюл. эксперим. биол. и мед. — 1995. — № 2. — С. 181–183. 94. Труфакин В.А. Структурно-временная организация иммунной системы / В.А. Труфакин, А.В. Шурлыгина, Г.И. Литвиненко, Т.И. Дергачева // 189 Библиографический список Бюл. СО РАМН. — 1997. — № 2. — С. 36–41. 95. Туаев В.С. Клеточные факторы иммунитета. Под ред. В.П. Лозового / В.С. Туаев, В.С. Кожевников, О.Т. Кудаева. — Новосибирск, 1981. — С. 104– 112. 96. Хронобиология и хрономедицина. Руководство. Под ред. акад. Ф.И. Комарова / В.С. Туаев, В.С. Кожевников, О.Т. Кудаева. — М., 1989. — 402 с. 97. Цибулькин А.П. Выраженность экспрессии маркеров дифференцировки и активации лимфоцитов периферической крови больных бронхиальной астмой, находящихся на базисной терапии глюкокортикостероидами / А.П. Цибулькин, О.В. Скороходкина, В.Н. Мустафин, В.Н. Цибулькина //Иммунология. — 2004. — № 2. — С. 94–97. 98. Ширинский В.С. Характеристика иммунного статуса у больных с рецидивирующей герпетической инфекцией / В.С. Ширинский, Н.М. Старостина, С.М. Петрова, А.В. Тешукова, В.С. Кожевников, Е.В. Евсюкова // Бюллютень СО РАМН. — 1999. — № 3–4. — С. 52–55. 99. Шурлыгина А.В. Суточные вариации соотношения субпопуляций лимфоцитов в тимусе и селезенке у мышей / А.В. Шурлыгина, И.Г. Ковшик, Л.В. Вербицкая, В.А. Труфакин // Бюллетень СО РАМН. — 1999. — № 5. — С. 129–133. 100. Шурлыгина А.В. Влияние экспериментального десинхроноза на иммунотоксичность бенз(а)пи190 Библиографический список рена у мышей (CBA×C57 BL)F1 / А.В. Шурлыгина, С.В. Мичурина, Л.В. Вербицкая, Е.В. Мельникова, С.Ю. Бугримова, В.А. Труфакин. // Бюл. эксперим. биол. — 2005. — Т. 139. — № 2. — С. 223–227. Библиографический список — 2005. — Vol. 104. — № 1. — P. 47–56. 107. Balsalobre A. Clock genes in mammalian peripheral tissues / A. Balsalobre // J. Biol. Rhythms. — 2004 Oct;19(5): 388–99. 101. Ярилин А.А. Апоптоз: природа феномена и его роль в норме и при патологии / А.А. Ярилин // Актуальные проблемы патофизиологии. Под ред. Б.Б. Мороза. — М.: Медицина, 2001. — С. 13–56. 108. Borugian M.J. Twentyfour-hour light exposure and melatonin levels among shift workers / M.J. Borugian, R.P. Gallagher, M.C. Friesen et al. // J. Occup. Environ. Med. — 2005. — Vol. 47. — № 12. — P. 1268–1275. 102. Ярилин А.А. Апоптоз. Природа феномена и его роль в целостном организме / А.А. Ярилин // Патол. Физиол. эксп. терап. — 1998. — № 2. — С. 38–48. 109. Bourne R.S. Sleep disruption in critically ill patientspharmacological considerations / R.S. Bourne, G.H. Mills // Anasthesia. — 2004, Apr. — Vol. 59 (4). — P. 374–384. 103. Aas K. Societal implications of food allergy: coping with atopic disease in children and adolescents / K. Aas // Ann Allergy. — 1987 Nov;59(5 Pt. 2): 194–9. 110. Cascarano J. Rough endoplasmatic reticulum — mitochondrial complexes from rat liver. An extra mitochondrial succinic dehydrogenase associated with this rough endoplasmatic reticulum / J. Cascarano, D.F. Montisano, C.B. Picken, T.W. James // Exp. Cell. Res. — 1982. — Vol. 139. — P. 39–50. 104. Andrew N.J. McKenzie. Regulation of T helper type 2 cell immunity by interleukin-4 and interleukin13 / McKenzie Andrew N.J. // Pharmacology and Therapeutics. — 2000. — Vol. 88. — № 2. — P. 143–151. 105. Arendt J. Melatonin and human rhythms / J. Arendt // Chronobiol. Int. — 2006. — Vol. 23. — № 1. — P. 21–27. 106. Baltaci A.K. Effects of zinc deficiency and pinealectomy on cellular immunity in rats infected with Toxoplasma gondii / A.K. Baltaci, R. Mogulkoc, C.S. Bediz, A. Pekel // Biol. Trace Elem. Res. 191 111. Cassone V.M. Effects of melatonin on suprachiasmatic nucleus / V.M. Cassone // Trends in Neurosci. — 1990. — № 13. — P. 457–464. 112. Chevalier R.L. Chronic ureteral obstruction in the rat suppresses renal tubular Bcl-2 and stimulates apoptosis / R.L. Chevalier, C.D. Smith, J. Wolstenholme // Exp. Nephrol. — 2000. — Vol. 8. — P. 115–122. 113. Clock genes in mammalian peripheral tissues //J. 192 Библиографический список Biol. Rhythms. — 2004. — Vol. 19. — № 5. — Р. 388–399. 114. Coombs R.R. Immunopathological mechanisms / R.R. Coombs // Proc. R. Soc. Med. — 1974 Jun;67(6 Pt 2): 525–30. 115. Crispe I.N. Strange brew: T Cells in the Liver / I.N. Crispe, W.Z. Mehal // Immunology Today. — 1996. — Vol. 17. — № 11. — Р. 522–525. 116. Cutolo M. Circadian rhythms: glucocorticoids and arthritis / M. Cutolo, A. Sulli, C. Pizzorni et al. // Ann. N. Y. Acad. Sci. — 2006. — Vol. 1069. — P. 89–299. 117. Dawson D. Integrating the action of melatonin on human physiology / D. Dawson // Ann. Med. — 1998. — Vol. 30. — № 1. — P. 95–102. 118. Day C.P. Natural History of NAFLD: Remarkably benign in the absence of cirrhosis / C.P. Day // Gastroenterology. — 2005. — Vol. 129. — P. 375– 378. 119. Depres-Brummer P. Persistent T lymphocyte rhythms despite suppressed circadian clock outputs in rats / P. Depres-Brummer, P. Bourin, N. Pages etal. // Am. J. Physiol. — 1997. — Vol. 273. — № 6, Pt 2. — Р. 1891–1899. 120. Doi R. CLOCK regulates circadian rhythms of hepatic glycogen synthesis through transcriptional activation of Gys2 / R. Doi, K. Oishi, N. Ishida // J. Biol. Chem. 193 Библиографический список — 2010. — Vol. 285. — № 29. — P. 22114–22121. 121. Dollins A.B. Effect of inducing nocturnal serum melatonin concentration in daytime on sleep, mood, body temperature and performance / A.B. Dollins, I.V. Zhadonsva, R.J. Wurtman // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. — 1997. — P. 8–18. 122. Fei G.H. Alterations in circadian rhythms of melatonin and cortisol in patients with bronchial asthma / G.H. Fei, R.Y. Liu, Z.H. Zhang, J.N. Zhou // Acta Pharmacol. Sin. 2004. — Vol. 25. — № 5. — P. 651–656. 123. Feldi M. Lerbuch der Lymhpologie / M. Feldi, S. Kubik. — Stuttgart. New York. — 1989. 124. Forsling M.L. The role of the pineal in the control of patterns of neurohypophysial hormone secretion / M.L. Forsling, R. Stonghton, S. Foucart // J. Pineal. Res. — 1993. — Vol. 14. — P. 45–51. 125. Fraschini F. Melatonin actions on immune responce / F. Fraschini, F. Scaglione, G. Demartini // in: «Advances in pineal research» (Reiter R., Lukaszuk A. Eds.). London. — 1994. — P. 225–230. 126. Froy O. Metabolism and circadian rhythmsimplications for obesity / Froy O. // Endocr Rev. — 2010. — Vol. 31. — № 1. — P. 1–24. 127. Garmus B.J. Copping of mouse spleen lymphocyte C 3 receptor: Еffect of pharmacologic agents / B.J. Garmus, M.L. Bassara, M.A. Arneson, M.E. Coplan 194 Библиографический список // J. Immunol. — 1980. — Vol. 124. — № 6. — P. 27–47. 128. Giron-Caro F. Bronchial asthma by children / F. Giron-Caro, A. Munoz-Hoyos, C. Ruiz-Cosano et al. // Int. Arch. Allergy Immunol. — 2001. — Vol. 126. — № 1. — P. 91–96. 129. Greter M., Neo-lymphoid aggregates in the adult liver can initiate potent cell-mediated immunity / M. Greter, J. Hofmann, B. Becher // PLoS Biol. — 2009. — Vol. 5. — № 7(5). — Р. e1000109. 130. Hanifin J.M. Diagnostic features of atopic dermatitis / J.M. Hanifin, G. Rajka // Acta. Derm. Venerol. — 1980. — Vol. 92. — P. 44–47. 131. Hershey G.K. The assotiation of atopy with a gainof-function mutation in the alpha subunit of the IL-4 receptor / G.K. Hershey, M.F. Friedrich, L.A. Esswein, M.L. Thomas, T.A. Chatila // N. Engl. J. Med. — 1997. — Vol. 337. — P. 1720–725. 132. Irving B.A. The cytoplasmic domain of the T cell receptor zeta chain is sufficient to couple to receptorassociated signal transduction pathways / B.A. Irving, A. Weiss // Cell. — 1991. — Vol. 64. —№ 5. — P. 891–901. 133. Kastenholz A. Functional mirroanatomy of initial Lymphatics with special consideration of the extracellular matrix / A. Kastenholz // Lymphology. — 2007. — Vol. 33. — P. 101–118. 195 Библиографический список 134. Kos-Kudla B. Circadian rhythm of melatonin in postmenopausal asthmatic women with hormone replacement therapy / B. Kos-Kudla, Z. Ostrowska, B. Marek, D. Kajdaniuk et al. // Neuro Endocrinol. Lett., 2002. Jun. — Vol. 23(3). — P. 243–248. 135. Kwiatkowski F. Chronobiology and immunity / F. Kwiatkowski, F. Levi // Pathol. Biol. (Paris). — 2005. — Vol. 53. — № 5. — P. 251–254. 136. Leung D.Y. Atopic dermatitis: immunobiology and treatment with immune modulators / D.Y. Leung // Clin. Exp. Immunol. — 1997. — Vol. 107 (Suppl.1). — P. 25 — 30. 137. Lluis J.M. Critical role of mitochondrial glutathione in the survival of hepatocytes during hypoxia / J.M. Lluis, A. Morales, C. Blasco, A. Colell, M. Marí, C. García-Ruiz, J.C. Fernández-Checa // J. Biol. Chem. — 2005. — Vol. 280. — № 5. — Р. 3224–3232. 138. Maestroni G.J. Melatonin and the immune system / G.J. Maestroni // Melatonin and the pineal gland. — Paris, 1992. — P. 59. 139. Maestroni G.J.M. Melatonin and the immunehaematopoetic systhem. Therapeutic and adverse pharmacological correlates / G.J.M. Maestroni, A. Conti // Neuroimmunomodulation. — 1996. — Vol. 3. — № 6. — P. 325–332. 140. Maestroni G.J.M. Role of the pineal gland in immuniti. Circadian synthesis and release of melatonin modulates the antibody response and antagonizes the 196 Библиографический список immunosuppressive effect of corticosterone / G.J.M. Maestroni, A. Conti, W. Pierpaoli // J. Neuroimmunol. — 1986. — Vol. 13. — № 1. — P. 19–30. 141. Martin C.A. DNA synthesis and nucleolar organizer regions circadian rhythm in mouse regenerating liver hepatocytes / C.A. Martin, J.M. Surur, M.N. Garcia, A.F. Badran // Biocell. — 2000. — Vol. 24. — № 2. — P. 151–155. 142. Martini E. Disappearance of CD4 lymphocyte circadian cycle in HIV-infected patients: early event during asymptomatic infection / E. Martini, J.Y. Muller, C. Doinel, C. Gastal et al. // AIDS. — 1988. — № 2. — P. 133–134. 143. Martini E. Disappearance of CD4 lymphocyte circadian cycle after autologous bone marrow transplantation / E. Martini, N.C. Yorin, C. Gastal, C. Doinel et al. // Biomed. Pharmacother. — 1988. — Vol. 42. — P. 357–359. 144. Miles M.P. Diurnal variation, response to eccentric exercise, and association of inflammatory mediators with muscle damage variables / M.P. Miles, J.M. Andring, S.D. Pearson et al. // J. Appl. Physiol. — 2008. — Vol. 104. — № 2. — P. 451–458. 145. Mocchegiani E. The variations during the circadian cycle of liver CD1d-unrestricted NK1.1+TCR gamma/delta+ cells lead to successful ageing. Role of metallothionein/IL-6/gp130/PARP-1 interplay in very old mice / E. Mocchegiani, R. Giacconi, C. 197 Библиографический список Cipriano et. al. // Exp. Gerontol. — 2004. — Vol. 39. — № 5. — P. 775–788. 146. Moore C.B. Pineal melatonin secretion, but not ocular melatonin secretion, is sufficient to maintain normal immune responses in Japanese quail (Coturnix coturnix japonica) / C.B. Moore, T.D. Siopes, C.T. Steele, H. Underwood // Gen. Comp. Endocrinol. — 2002. —Vol. 126. — № 3. — P. 352–358. 147. Okamura H. Clock genes in cell clocks: roles, actions, and mysteries / H. Okamura // Cell. Tissue Res. — 2002. — Vol. 309. — № 1. — Р. 193–199. 148. Parronchi P. Cytokine production by allergen (Der pI)-specific CD4+ T cell clones derived from a patient with severe atopic disease / P. Parronchi, R. Manetti, C. Simonelli, F.S. Rugiu, M.P. Piccinni, E. Maggi, S. Romagnani // Int. J. Clin. Lab. Res. — 1991. — Vol. 21. — № 2. — Р. 186–189. 149. Paul W.E. Interleukin-4 production by Fc epsilon R+ cells / W.E. Paul // Skin. Pharmacol. — 1991. — № 4. — Suppl. 1. — P. 8–14. 150. Pelegri C. Circadian rhythms in surface molecules of rat blood lymphocytes / C. Pelegri, J. Vilaplana, Castellote et al. // Am. J. Physiol. Cell. Physiol. — 2003 — Vol. 284 (1). — P. 67–76. 151. Petrovsky N. The chronobiology of human cytokine production / N. Petrovsky, L.C. Harrison // Int. Rev. Immunol. — 1998. — Vol. 16. — № 5–6. — P. 635– 649. 198 Библиографический список Библиографический список 152. Petrovsky N. Diurnal rhythms of pro-inflammatory cytokines: regulation by plasma cortisol and therapeutic implications / N. Petrovsky, P. Mcnair, L.C. Harrison // Cytokine. — 1998. — Vol. 10. — № 4. — P. 307–312. 1–2. — P. 171–178. 153. Polgar P.R. Glycolysis as an energy source for stimulation of lymphocytes by phytohemaglutinin / P.R. Polgar, J.M. Foster, S.R. Cooperband // Exp. Cell. Res. — 1968. — Vol. 49. — P. 231–238. 154. Prendergast B.J. Short day lengths enhance skin immune responses ni gonadectomised Siberian hamsters / B.J. Prendergast, S.D. Bilbo, R.J. Nelson // J. Neuroendocrinol. — 2005. — Vol. 17. — № 1. — P. 18–21. 155. Punnonen J. Interferon (IFN)-alpha, IFN-gamma, interleukin (IL)-2, and arachidonic acid metabolites modulate IL-4-induced IgE synthesis similarly in healthy persons and in atopic dermatitis patients / J. Punnonen, K. Punnonen, C.T. Jansén, K. Kalimo // Allergy. — 1993. — Apr;48(3). — P. 189–95. 156. Quaglino D. The effect on rat thymocytes of the simultaneous in vivo exposure to 50-Hz electric and magnetic field and to continuous light / D. Quaglino, M. Capri, L. Zessa et al. // Scient. Wld. J. — 2004. — Vol. 20. — № 4. — Suppl. 2. — P. 91–99. 157. Rafiielidrissi M. Immunomodulation quality of melatonin / M. Rafiielidrissi, J.R. Calvo, D. Pozo et al. // J. Neuroimmunol. — 1995. — Vol. 57. — № 199 158. Rahman S.A. Selectively filtering short wavelengths attenuates the disruptive effects of nocturnal light on endocrine and molecular circadian phase markers in rats / S.A. Rahman, A. Kollara, T.J. Brown, R.F. Casper // Endocrinology. — 2008. — Vol. 149. — № 12. — P. 6125–6135. 159. Roberts P.J. Development of cytochrome B and an active oxydase system in association with maturation of human promyelocytic (HC-60) cell line / P.J. Roberts, A.R. Cross, O.T.G. Jones, A.W. Segal // J. Cell. Biol. — 1982. — Vol. 95. — P. 720–726. 160. Sack R.L. Circadian rhythm abnormalities in totally blind people: incidence and clinical significance / R.L. Sack, M.L. Blood, L.D. Keith // J. Clin. Endocrinol. — 1992. — Vol. 75. — P. 127–134. 161. Samuel V.T. Cytokine signaling proteins in hepatic steatosis, insulin resistance, and the metabolic syndrome in the mouse / V.T. Samuel, Z.-X. Liu, X. Qu, B.D. Elder et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. — 2004. — Vol. 101. — P. 10422–10427. 162. Schwarz W. Alterations of melatonin secretion in atopic eczema / W. Schwarz, N. Birau, O.P. Hornstein, B. Heubeck, A. Schönberger, C. Meyer, J. Gottschalk // Acta Derm. Venereol. — 1988;68(3): 224–9. 163. Siopes T.D. Diurnal variation in the cellular and humoral immune responses of Japanese quail: role of melatonin / T.D. Siopes, H.A. Underwood // Gen. 200 Библиографический список Comp. Edocrnol. — 2008. — Vol. 158. — № 3. — Р. 245–249. 164. Srinivasan V. Jet lag: therapeutic use of melatonin and possible application of melatonin analogs / V. Srinivasan, D.W. Spence, S.R. Pandi-Perumal, I. Trakht, D.P. Cardinali // Travel Med. Infect. Dis. — 2008. — Vol. 6. — № 1–2. — Р. 17–28. 165. Stevens R.G. Artificial lighting in the industrialized world: circadian disruption and breast cancer / R.G. Stevens // Cancer Causes Control. — 2006. — Vol. 17. — P. 501–507. 166. Susko I. Early changes in rats cervical lymph nodes after pinealectomy / I. Susko, Z. Mornjaković, S. Alicelebić // Med. Arh. — 2006. — Vol. 60. — № 3. — P. 149–152. 167. Waldhauser F. Clinical aspects of the melatonin action: impact of development, aging and puberty, involvement of melatonin in psychiatric of neuroimmunoendocrine interactions / F. Waldhauser, B. Ehrhart, E. Forster // Neuroimmun. Rev. — 1993. — № 1. — P. 671–681. 168. Wang. Y. Immunopathogenesis bronchial asthma // Y. Wang, Y.T. Zhonghua Er, S.L. Chen, Xu S. Ke Za Zhi. — 2004. — Vol. 42. — № 2. — P. 94–97. ОГЛАВЛЕНИЕ 170. Wyllie A.H. Glucocorticoid-induced thymocyte apoptosis is associated with endogenous endonuclease activation / A.H. Wyllie // Nature. — 1980. — Vol. 284. — Р. 555–556. 171. Wyllie A.H. Chromatin cleavage in apoptosis: association with condensed chromatin morphology and dependence on macromolecular synthesis / A.H. Wyllie, R.G. Morris, A.L. Smith, D. Dunlop // J. Pathol. — 1984. — Vol. 142. — Р. 67–77. 172. Young T.A. Chronic ethanol consumption decreases mitochondrial and glycolytic production of ATP in liver / T.A. Young, S.M. Bailey, C.G. Van Horn, C.C. Cunningham // Alcohol and alcoholism. — 2006. — Vol. 41. — № 3. — Р. 254–260. 173. Zhang E.E. Cryptochrome mediates circadian regulation of cAMP signaling and hepatic gluconeogenesis / E.E. Zhang, Y. Liu, R. Dentin et al. // Nat. Med. — 2010. — Vol. 16. — № 10. — P. 1152–1156. 174. Zhu M.T. Oxidative stress and apoptosis induced by iron oxide nanoparticles in cultured human umbilical endothelial cells / M.T. Zhu, Y. Wang, W.Y. Feng et al. // J. Nanosci. Nanotechnol. — 2010. — Vol. 10(12). — P. 8584–8590. 169. Worm M. Molecular regulation of human IgE synthesis / M. Worm, B.M. Henz // J. Mol. Med. (Berl). — 1997. — Jun;75(6). — P. 440–7. 201 202 ОГЛАВЛЕНИЕ ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ 7 Глава 1. Лимфатический регион, тканевой микрорайон, гематолимфатический барьер печени. Ю.И. Бородин, С.В. Мичурина ..................................... 0 Глава 2. Печень и ее лимфатический регион при воздействии круглосуточного освещения ............. 2.1. Суточные вариации морфометрических показателей тканевого микрорайона печени и ее регионарных лимфатических узлов у мышей линии (CBA×C57 BL)F1, содержавшихся в условиях круглосуточного освещения С.В. Мичурина ......................................................... 2.2. Микро- и ультраструктурная организация печени крыс Вистар при воздействии круглосуточного освещения С.В. Мичурина, Ю.И. Бородин, Г.М. Вакулин, А.Д. Белкин .............................................................. 2.3. Микро- и ультраструктурные особенности регионарных лимфатических узлов печени крыс Вистар при воздействии круглосуточного освещения С.В. Мичурина, И.Ю. Ищенко, Г.М. Вакулин ....... 24 40 34 40 39 39 46 53 63 203 ОГЛАВЛЕНИЕ Глава 3. Молекулярные особенности апоптоза в печени и ее лимфатическом регионе у животных, содержавшихся в условиях естественного освещения и при воздействии круглосуточного освещения 3.1. Молекулярные особенности апоптоза в печени у интактных животных и при воздействии круглосуточного освещения С.В. Мичурина, Ю.И. Бородин, В.А. Труфакин, С.А. Архипов 3.2. Активность молекулярных переключателей апоптоза (Bax, Bad и Bcl-2) в регионарных лимфатических узлах печени в норме и при воздействии круглосуточного освещения С.В. Мичурина, Ю.И. Бородин, В.А. Труфакин, С.А. Архипов Глава 4. Периферическая кровь при воздействии круглосуточного освещения 4.1. Клеточный состав периферической крови крыс Вистар в условиях круглосуточного освещения А.Д. Белкин 4.2. Морфофункциональное состояние моноцитов периферической крови крыс при воздействии круглосуточного освещения по данным НСТ-теста С.А. Архипов, С.В. Мичурина 204 72 62 72 70 0 81 89 77 77 89 79 92 ОГЛАВЛЕНИЕ 4.3. Ферментный спектр лимфоцитов крови мышей и крыс при нормальном световом режиме и круглосуточном освещении А.В. Шурлыгина, Г.И. Литвиненко, В.А. Труфакин Глава 5. Иммунная система подопытных животных в условиях круглосуточного освещения 5.1. Клеточный состав лимфоидных органов крыс Вистар, содержавшихся в условиях обычного светового режима и в условиях круглосуточного освещения А.В. Шурлыгина, Л.В. Вербицкая, В.А. Труфакин 5.2. Суточные вариации клеточного состава лимфоидных органов мышей (CBA×C57 BL) F1, содержавшихся условиях обычного светового режима и в условиях круглосуточного освещения Г.И. Литвиненко, А.В. Шурлыгина, В.А. Труфакин 5.3. Влияние круглосуточного освещения на денситометрические характеристики ядерного хроматина лимфоцитов в центральных и периферических органах иммунной системы А.В. Шурлыгина, Л.В. Вербицкая, В.А. Труфакин 83 3 97 104 90 104 92 107 95 5 111 205 ОГЛАВЛЕНИЕ Глава 6. Влияние круглосуточного освещения на 100 эндокринную систему 0 С.В. Мичурина 116 Глава 7. Мелатонин в коррекции нарушений суточной временной организации лимфоидной системы А.В. Шурлыгина, Г.И. Литвиненко, Л.В. Вербицкая, В.А.Труфакин 7.1. Влияние индуктора синтеза мелатонина — амитриптилина — на суточные вариации клеточного состава лимфоидных органов крыс Вистар, содержавшихся при круглосуточном освещении 7.2. Влияние экзогенного мелатонина на иммунный статус мышей при нарушенном световом режиме 106 6 122 124 129 Глава 8. Мелатонин в коррекции морфофункционального состояния лимфоидных 8 клеток при иммунопатологии Г.И. Литвиненко, А.В. Шурлыгина 136 8.1. Хроно- и иммунотропные эффекты мелаксена (синтетического аналого мелатонина) при введении его в схему лечения атопического дерматита 142 8.2. Хроно- и иммунотропные эффекты мелаксена (синтетического аналога мелатонина) при введении его в схему лечения бронхиальной астмы 150 206 ОГЛАВЛЕНИЕ Общее заключение Библиографический список Оглавление 162 174 203 выходные данные Приносим благодарность за техническую помощь, оказанную при работе над монографией: главному специалисту инженеру-программисту Белану И.Б., в.н.с. к.м.н. Белкину А.Д., лаборанту-исследователю Черновой Л.И., фотолаборанту по электронной микроскопии Ложкину М.И. 207
