005573 Область изобретения

005573
Область изобретения
Данное изобретение относится к способу лечения Т-клеточного нарушения у субъекта, предусматривающему разрушение передачи сигналов половых стероидов к тимусу и введение субъекту клеток костного мозга или гемопоэтических стволовых клеток (HSC).
Предпосылки изобретения
Тимус (вилочковая железа) находится в значительной степени под влиянием его двунаправленной
связи с нейроэндокринной системой (Kendal, 1988). Особенно важным является взаимодействие между
гипофизом, надпочечниками и половыми железами в действии на функцию тимуса, включающем в себя
как трофические (TSH и GH), так и атрофические эффекты (LH, FSH и АСТН) (Kendal, 1988; HomoDelarche, 1991). Действительно, одной из характерных особенностей физиологии тимуса является прогрессирующее ухудшение структуры и функции, которое пропорционально увеличению продукции половых стероидов в кровотоке в пубертатном периоде (Hirokawa and Makinodan, 1975; Tosi et al., 1982 и
Hirokawa, et al., 1994). Точная мишень этих гормонов и механизм, при помощи которого они индуцируют
атрофию тимуса, до сих пор не определены. Поскольку тимус является первичным местом для продуцирования и поддержания пула периферических Т-клеток, эта атрофия широко постулировалась как первичная причина увеличенной встречаемости нарушений на иммунной основе у пожилых людей. В частности, недостаточности иммунной системы, иллюстрируемые уменьшением иммунных функций, зависимых от Т-клеток, таких как цитолитическая Т-клеточная активность и митогенные реакции, отражаются увеличенной встречаемостью иммунодефицита, аутоиммунитета и опухолевой нагрузки в более позднем периоде жизни (Hirokawa, 1998).
Влияние атрофии тимуса отражается на периферии в том, что уменьшенный вклад тимуса в пул Тклеток приводит к менее разнообразному спектру рецепторов Т-клеток (TCR). Наблюдается измененный
профиль цитокинов (Hobbs et al., 1993; Kurashima et al., 1995); изменения в CD4+ и CD8+ субпопуляциях
и смещение в направлении Т-клеток с иммунологической памятью в сравнении с «необученными» Тклетками (Mackall et al., 1995). Кроме того, эффективность тимопоэза нарушается с возрастом, так что
способность иммунной системы регенерировать нормальные количества Т-клеток после Т-клеточного
истощения со временем утрачивается (Mackall et al., 1995). Однако, недавняя работа Douek et al., (1998)
показала, что, возможно, имеет место тимусный выброс у людей даже в старом возрасте. Были использованы эксцизионные ДНК-продукты реарранжировки гена TCR для демонстрации циркулирующих в кровотоке продуцированных de novo необученных Т-клеток после инфекции ВИЧ у старых пациентов. Скорость этого выброса и последующая регенерации пула Т-клеток должны быть дополнительно исследованы, так как пациенты, которые были подвергнуты химиотерапии, обнаруживают существенно увеличенную скорость регенерации пула Т-клеток, в частности, CD4+ Т-клеток, у постпубертатных пациентов в
сравнении с пациентами, которые были предпубертатными (Mackall et al., 1995). Имеется дополнительный пример в недавней работе Timm and Thoman (1999), которые показали, что, хотя CD4+ Т-клетки регенерируются у старых мышей после ВМТ, они, по-видимому, обнаруживают смещение в направлении
клеток с памятью вследствие более старого периферического микроокружения, связанного со слабым
продуцированием необученных Т-клеток.
Тимус (вилочковая железа) состоит, по существу, из развивающихся тимоцитов, разбросанных в
разнообразных стромальных клетках (преимущественно субпопуляциях эпителиальных клеток), которые
составляют микроокружение и обеспечивают факторы роста и клеточные взаимодействия, необходимые
для оптимального развития Т-клеток. Эта взаимосвязь симбиотического развития между тимоцитами и
эпителиальными субпопуляциями, которая контролирует их дифференцировку и созревание (Boyd et al.,
1993), означает, что ингибирование половыми стероидными гормонами могло бы происходить на уровне
каждого типа клеток, которые затем могли бы влиять на статус клеток другого типа. Менее вероятным
является то, что имеется присущий им дефект в самих тимоцитах, так как прежние исследования с использованием облученных химер показали, что возраст не влияет на стволовые клетки ВМ (костного
мозга) (Hirokawa, 1998; Mackall and Gress, 1997), и стволовые клетки имеют такую же степень потенциала репопулирования тимуса, что и молодые клетки ВМ. Кроме того, тимоциты у старых животных сохраняют их способность дифференцироваться по меньшей мере до некоторой степени (Mackall and Gress,
1997; George and Ritter, 1996; Hirokawa et al., 1994). Однако недавняя работа Aspinall (1997) показала дефект в популяции CD3-CD4-CD8- трижды негативных предшественников (TN), имеющийся на стадии
реаранжировки гена β-цепи TCR.
В конкретном случае для СПИДа, первичным дефектом в иммунной системе является деструкция
CD4+ клеток и в меньшей степени клеток миелоидных линий дифференцировки макрофагов и дендритных клеток (DC). Без них иммунная система является парализованной и пациент является крайне восприимчивым к условно-патогенной инфекции со смертью в виде обычного последствия. Существующее
лечение СПИДа основано на множестве антивирусных лекарственных средств, убивающих или истощающих вирус ВИЧ. Такие терапии становятся теперь более эффективными, причем вирусные нагрузки
являются разительно пониженными до точки, когда пациент может считаться находящимся в ремиссии.
Однако, главная проблема иммунодефицита все еще существует, так как все еще имеется лишь очень
мало функциональных Т-клеток, а те, которые действительно восстанавливаются, делают это очень мед-1-
005573
ленно. Следовательно, период иммунодефицита все еще является очень продолжительным, и в некоторых случаях механизмы иммунной защиты могут никогда не восстановиться в достаточной степени.
Причиной этого является то, что в постпубертатных людях тимус является атрофированным.
Для генерирования новых Т-лимфоцитов тимус требует клеток-предшественников; они могут быть
произведены из самого этого органа в течение короткого времени, но авторы данного изобретения показали, что после 3-4 недель такие клетки истощаются и должны поглощаться новые HSC (в нормальных
обстоятельствах это происходило бы из костного мозга через кровь). Однако даже в нормальном функциональном молодом тимусе поглощение таких клеток является очень медленным (достаточным для
поддержания продукции Т-клеток при гомеостатически регулируемых уровнях). В самом деле, вхождение клеток в тимус является крайне ограниченным и эффективно ограниченным HSC (или по меньшей
мере протимоцитами, которые уже имеют преферентивное развитие вместе с Т-клеточной линией дифференцировки). В случае тимуса, подвергающегося повторному омоложению вследствие потери ингибирования половых стероидных гормонов, авторы показали, что этот орган теперь является очень восприимчивым к новым клеткам-предшественникам, циркулирующим в крови, так что новые Т-клетки развиваются как из внутритимусных, так и внешних источников. Посредством увеличения уровня клетокпредшественников в крови, Т-клетки, произведенные из них, будут прогрессирующим образом доминировать в пуле Т-клеток. Это означает, что любой ген, введенный в эти предшественники (HSC), будет
пассирован на все потомство Т-клеток и в конце концов будет присутствовать фактически во всех клетках пула Т-клеток. Уровень доминирования этих клеток над клетками, произведенными из эндогенных
HSC хозяина, может быть легко увеличен до очень высоких уровней простым увеличением числа перенесенных экзогенных HSC.
Сущность изобретения
Авторы данного изобретения показали, что атрофия тимуса (индуцированная возрастом или являющаяся следствием условий, таких как химиотерапия или лучевая терапия) может быть основательно
обращена ингибированием продуцирования половых стероидных гормонов с фактически полным восстановлением структуры и функции тимуса. Авторы данного изобретения нашли также, что основа для
этой регенерации тимуса обусловлена отчасти начальной экспансией клеток-предшественников, которые
образуются как внутри тимуса, так и через кровоток. Это открытие предполагает, что можно "засеять"
тимус экзогенными гемопоэтическими стволовыми клетками (HSC), которые были инъецированы субъекту.
Возможность засеять тимус генетически модифицированными или экзогенными HSC разрушением
передачи сигнала половых стероидов к тимусу означает, что генотерапия в HSC может быть использована более эффективно для лечения Т-клеточных (и связанных с миелоидными клетками, которые развиваются в тимусе) нарушений. Терапия гемопоэтическими стволовыми клетками (HSC) имела небольшой
успех или не имела успеха до настоящего времени, так как тимус является покоящимся и неспособным
поглощать много HSC, если вообще способен их поглощать, причем продуцирование Т-клеток составляет при этом менее 1% от нормальных уровней.
Таким образом, в первом аспекте данное изобретение обеспечивает способ лечения Т-клеточного
нарушения у субъекта, причем этот способ предусматривает разрушение передачи сигналов половых
стероидных гормонов к тимусу у данного субъекта и пересадку субъекту костного мозга или гемопоэтических стволовых клеток (HSC).
В предпочтительном варианте Т-клеточное нарушение выбрано из группы, состоящей из вирусных
инфекций, таких как инфекция вируса иммунодефицита человека, Т-клеточного пролиферативного заболевания или любого заболевания, которое уменьшает число или функцию Т-клеток прямо или опосредованно. Предпочтительно, субъект имеет СПИД и имел вирусную нагрузку, уменьшенную антивирусным
лечением.
В следующем предпочтительном варианте этот субъект является постпубертатным.
Предпочтительно, ингибирование продуцирования половых стероидных гормонов достигается либо
кастрацией, либо введением аналога (аналогов) половых стероидных гормонов.
Предпочтительно, аналоги половых стероидов включают в себя эулексин, госерелин, лейпролид,
производные диоксалана, такие как трипторелин, метерелин, бусерелин, гистрелин, нафарелин, лутрелин, лейпрорелин, и аналоги гормона, высвобождающего лютеинизирующий гормон. В настоящее время
предпочтительным аналогом полового стероидного гормона является аналог гормона, высвобождающего
лютеинизирующий гормон. Более предпочтительно аналогом гормона, высвобождающего лютеинизирующий гормон, является деслорелин.
Еще в одном предпочтительном варианте аналог (аналоги) половых стероидов вводят с использованием препарата с замедленным высвобождением пептида. Примеры препаратов с замедленным высвобождением пептида представлены в WO 98/08533, все содержание которого включено здесь в качестве
ссылки.
В предпочтительном варианте этот способ предусматривает трансплантацию обогащенных гемопоэтических стволовых клеток (HSC) в субъекта. HSC могут быть аутологичными или гетерологичными,
хотя предпочтительными являются аутологичные HSC.
-2-
005573
В случаях, когда субъект инфицирован ВИЧ, предпочтительно, если HSC являются генетически
модифицированными, так что они и их потомство, в частности, Т-клетки, макрофаги и дендритные клетки, являются устойчивыми к инфекции и/или деструкции вирусом ВИЧ. Эта генетическая модификация
может включать в себя введение в клетки HSC одной или нескольких молекул нуклеиновой кислоты,
которые предотвращают репликацию, сборку и/или инфицирование вируса. Молекула нуклеиновой кислоты может быть геном, кодирующим антивирусный белок, антисмысловой конструкцией, рибозимом,
двухцепочечной РНК (dsPHK) и каталитической молекулой нуклеиновой кислоты.
В случаях, когда субъект имеет дефектные Т-клетки, предпочтительно, чтобы HSC были генетически модифицированными для нормализации этого дефекта. Для таких заболеваний, как Т-клеточные
лейкозы, эта модификация может включать в себя введение конструкций нуклеиновых кислот или генов,
которые нормализуют HSC и ингибируют или уменьшают вероятность их превращения в раковые клетки.
Специалистам в данной области должно быть понятно, что данный способ может быть полезным в
лечении любого Т-клеточного нарушения, которое имеет определенную генетическую основу. Предпочтительный способ включает в себя реактивацию тимусной функции посредством ингибирования половых стероидных гормонов для увеличения поглощения несомых кровью гемопоэтических стволовых
клеток (HSC). Обычно, после наступления полового созревания, тимус подвергается тяжелой атрофии
под влиянием половых стероидных гормонов, причем продуцирование им клеток уменьшается до менее
1% в сравнении с предпубертатным тимусом. Данное изобретение основывается на обнаружении, что
ингибирование продуцирования половых стероидов снимает ингибирование тимуса и делает возможной
полную регенерацию его функции, в том числе увеличенного поглощения происходящих из крови HSC.
Происхождение этих HSC может быть непосредственно инъекцией или из костного мозга после предварительной инъекции. Предполагается, что клетки крови, происходящие из модифицированных HSC, будут передавать генетическую модификацию на клетки их потомства, в том числе HSC, произведенные из
самообновления, и что развитие этих HSC вместе с линиями дифференцировки Т-клеток и дендритных
клеток в тимусе в значительной степени усиливается, если не полностью облегчается, посредством реактивации тимусной функции через ингибирование половых стероидов.
Способ данного изобретения применим, в частности, для лечения СПИДа, где это лечение предпочтительно включает в себя уменьшение вирусной нагрузки, реактивацию тимусной функции через ингибирование половых стероидов и перенос в пациентов гемопоэтических стволовых клеток (HSC) (аутологичных или из постороннего донора), которые были генетически модифицированными, так что все потомство (особенно Т-клетки, DC) является устойчивым в последующей инфекции ВИЧ. Это означает,
что пациент не только будет освобожден от вируса ВИЧ и не будет уже восприимчивым к общим инфекциям, поскольку Т-клетки возвращены к нормальным уровням, но и новые Т-клетки, являющиеся устойчивыми к ВИЧ, будут способны удалять любые остаточные инфицированные вирусом клетки. В принципе сходную стратегию можно было бы применять для генотерапии в HSC для любого Т-клеточного дефекта или любой вирусной инфекции, которая поражает Т-клетки.
Краткое описание фигур
Фиг. 1. Старых мышей (в возрасте 2 лет) хирургически кастрировали и анализировали на (а) вес тимуса относительно веса тела и (b) общее число клеток на тимус на 2-4 неделях после кастрации. Значимое уменьшение веса тимуса и насыщенности клетками наблюдали с увеличением возраста в сравнении
с молодыми взрослыми (2-месячными) мышами. Это снималось в результате кастрации. Через 3 недели
после кастрации наблюдали гипертрофию тимуса, и происходил возврат к уровням молодых взрослых
животных через 4 недели после кастрации. Результаты выражены в виде среднего ± 1SD для 4-8 мышей
на группу. ** = р ≤ 0,01; *** = р ≤ 0,001 в сравнении с молодыми взрослыми мышами и мышами после
кастрации.
Фиг. 2. Старых мышей (в возрасте 2 лет) хирургически кастрировали и анализировали на 2 и 4 неделях после кастрации на популяции периферических лимфоцитов. (а) Общие числа лимфоцитов в селезенке. Не наблюдали изменений в общих числах клеток селезенки при старении или после кастрации
вследствие периферического гомеостаза. (b) Отношение В-клеток к Т-клеткам не изменялось с возрастом
или после кастрации, однако, (с) с возрастом наблюдали значимое уменьшение отношения CD4+:CD8+ Тклеток. Оно восстанавливалось через 4 недели после кастрации. Данные выражены в виде среднего ±
1SD для 4-8 мышей на группу. *** = р ≤ 0,001 в сравнении с молодыми взрослыми мышами (2месячными) и 4-недельными мышами после кастрации.
Фиг. 3. Старых мышей (в возрасте 2 лет) кастрировали и субпопуляции тимоцитов анализировали
на основании маркеров CD4 и CD8. Репрезентативные профили FACS точечных диаграмм CD4/CD8 показаны для CD4-CD8-DN, CD4+CD8+DP, CD4+/CD8- и CD4-CD8+ SP-тимоцитов. Не наблюдали различий в соотношениях любой СD4/СD8-определенной субпопуляции с возрастом или после кастрации.
Фиг. 4.1. Старых мышей (в возрасте 2 лет) кастрировали и инъецировали один раз бромдезоксиуридином (BrdU) для определения уровней пролиферации. Показаны репрезентативные профили гистограмм
-3-
005573
доли BrdU+ клеток в тимусе в зависимости от возраста и после кастрации. Не было различий в доле пролиферирующих клеток в целом тимусе ни в связи со старением, ни после кастрации.
Фиг. 4.2. Старых мышей (в возрасте 2 лет) кастрировали и инъецировали один раз бромдезоксиуридином (BrdU) для определения уровней пролиферации. Выполняли анализ пролиферации в различных
субпопуляциях тимоцитов на основе экспрессии CD4 и CD8 в тимусе. (а) Доля каждой субпопуляции
тимоцитов в популяции BrdU+ не изменялась с возрастом или после кастрации. (b) Однако наблюдали
значимое уменьшение доли пролиферирующих DN (CD4-CD8-) тимоцитов с возрастом. После кастрации
она восстанавливалась и наблюдали значимое увеличение пролиферации в CD4-CD8+ SP-тимоцитах. (с)
Не наблюдали изменений общей доли BrdU+ клеток в субпопуляции TN с возрастом или после кастрации. Однако (d) наблюдали значимое уменьшение пролиферации в субпопуляции TN1 (CD44+CD25-) и
значимое увеличение пролиферации в субпопуляции TN2 (CD44+CD25+) с возрастом. Это уменьшение
исчезало после кастрации. Результаты выражены в виде среднего ± 1SD для 4-8 мышей на группу. * = р ≤
0,05, *** = р ≤ 0,001 в сравнении с молодыми взрослыми (2-месячными) мышами.
Фиг. 5. Старых мышей (в возрасте 2 лет) кастрировали и инъецировали внутритимусно FITC для
определения скоростей тимусного экспорта. Число FITC+ клеток в периферии рассчитывали спустя 24 ч.
(а) Значимое уменьшение числа недавних тимусных клеток-эмигрантов (RTE) наблюдали с возрастом.
После кастрации эти величины значимо увеличивались через 2 недели после кастрации. (b) Скорость
эмиграции (экспорт/общая насыщенность клетками тимуса) оставалась постоянной с возрастом, но значимо уменьшалась через 2 недели после кастрации, (с) С возрастом наблюдали значимое увеличение отношения CD4 + к CD8+ RTE, и оно нормализовалось спустя 1 неделю после кастрации. Результаты выражены в виде среднего ± 1SD для 4-8 мышей на группу. ** = р ≤ 0,01, *** = р ≤ 0,001 в сравнении с молодыми взрослыми мышами, Λ = р ≤ 0,001 в сравнении с кастрированными мышами.
Фиг. 6. Молодых мышей (в возрасте 3 месяцев) истощали по лимфоцитам с использованием циклофосфамида. Мышей либо ложно кастрировали, либо кастрировали в день обработки циклофосфамидом.
(а) Значимое увеличение числа клеток в тимусе наблюдали у кастрированных мышей в сравнении с ложнокастрированными мышами. (b) Кастрированные мыши обнаруживали также значимое увеличение числа клеток селезенки через 1 неделю после обработки циклофосфамидом. (с) Значимое увеличение насыщенности клетками лимфатических узлов наблюдали также у кастрированных мышей через 1 неделю
после обработки. Результаты выражены в виде среднего ± 1SD для 4-8 мышей на группу. *** = р ≤ 0,001
в сравнении с кастрированными мышами.
Фиг. 7. Молодых мышей (в возрасте 3 месяцев) истощали по лимфоцитам с использованием сублетального (625 Рад) облучения. Мышей либо ложно кастрировали, либо кастрировали в день облучения.
Кастрированные мыши обнаружили более высокую скорость регенерации тимуса в сравнении с ложно
кастрированными (а). Не было различия в числах клеток в селезенке (b) или лимфатических узлах (с) в
случае кастрированных мышей. Числа клеток в лимфатических узлах были все еще продолжительно низкими через 2 недели после обработки в сравнении с контрольными мышами. Результаты выражены в
виде среднего ± 1SD для 4-8 мышей на группу. * = р ≤ 0,05 в сравнении с контрольными мышами; *** =
р ≤ 0,001 в сравнении с контрольными и кастрированными мышами.
Фиг. 8. Молодых мышей (в возрасте 3 месяцев) истощали по лимфоцитам с использованием сублетального (625 Рад) облучения. Мышей либо ложно кастрировали, либо кастрировали спустя 1 неделю
после облучения. В случае кастрации наблюдали значимое увеличение регенерации тимуса (а). С кастрированными мышами не наблюдали различий в числах клеток в селезенке (b) или лимфатических узлах
(с). Числа клеток в лимфатических узлах были постоянно низкими через 2 недели после обработки в
сравнении с контрольными мышами. Результаты выражены в виде среднего ± 1SD для 4-8 мышей на
группу. * = р ≤ 0,05; ** = р ≤ 0,01 в сравнении с контрольными мышами; *** = р ≥ 0,001 в сравнении с
контрольными и кастрированными мышами.
Фиг. 9. Изменения числа клеток в тимусе, селезенке и лимфатическом узле после обработки циклофосфамидом, химиотерапевтическим агентом и хирургической или химической кастрации, выполняемых
в тот же самый день. Обратите внимание на быструю экспансию тимуса у кастрированных животных в
сравнении с некастрированной (только циклофосфамид) группой через 1 и 2 недели после обработки.
Кроме того, числа клеток селезенки и лимфатического узла группы кастрированных животных в большой степени увеличивались в сравнении с группой, получившей только циклофосфамид (n = 3-4 на каждую группу обработки и на каждую временную точку). Химическая кастрация является сравнимой с хирургической кастрацией в регенерации иммунной системы после обработки циклофосфамидом.
Фиг. 10. Старых мышей (в возрасте 2 лет) кастрировали и анализировали на реакцию против вируса-1 простого герпеса. (а) Старые мыши обнаружили значимое уменьшение общей насыщенности клетками лимфатических узлов после инфекции в сравнении как с молодыми мышами, так и с мышами после
кастрации. (b) Репрезентативные FACS-профили активированных (CD8+CD25+) клеток в LN у инфицированных HSV-1-мышах. Не наблюдали различия в долях активированных CTL (ЦТЛ) с возрастом или
после кастрации (с) Уменьшенная насыщенность клетками в лимфатических узлах старых мышей отражалась в значимом уменьшении чисел активированных CTL. Кастрация старых мышей восстанавливала
-4-
005573
иммунную реакцию на HSV-1 с числами активированных клеток, эквивалентными числам у молодых
мышей. Результаты выражены в виде среднего ± 1SD для 8-12 мышей.
** = р≤0,01 в сравнении как с молодыми (2-месячными) мышами, так и с контрольными мышами.
Фиг. 11. Подколенные лимфатические узлы извлекали из мышей, иммунизированных HSV-1, и
культивировали в течение 3 дней. Анализы CTL выполняли с неиммунизированными мышами в качестве
контроля на фоновые уровни лизиса (определяемого по высвобождению 51Сr). Результаты выражали в
виде среднего для 8 мышей, в трех повторностях + 1SD. Старые мыши обнаружили значимое уменьшение активности CTL при соотношении Е:Т как 10:1, так и 3:1, свидетельствующее об уменьшении процента специфических CTL, присутствующих в лимфатических узлах. Кастрация старых мышей восстанавливала CTL-реакцию до уровней молодых взрослых мышей. * = р ≤ 0,01 в сравнении с молодыми
взрослыми и старыми мышами после кастрации.
Фиг. 12. Анализ CD4+ Т-клеток-хелперов и vβ TCR-реакции на инфекцию HSV-1. Подколенные
лимфатические узлы извлекали в день 5 после HSV-1-инфицирования и анализировали ex vivo на экспрессию (a) CD25, CD8 и специфических TCRVβ-маркеров и (b) СD4/СD8-Т-клетки. (а) Процент активированных (CD25+) CD8+ Т-клеток, экспрессирующих либо vβ10, либо Vβ8.1 показан в виде среднего ±
1SD для 8 мышей на группу. Не наблюдали различия с возрастом или после кастрации. (b) С возрастом
наблюдали уменьшение в отношении CD4/CD8 в покоящейся популяции LN. Это отношение восстанавливалось после кастрации. Результаты выражали в виде среднего ±1 SD для 8-12 мышей на группу. *** =
р≤0,001 в сравнении с молодыми и кастрированными мышами.
Фиг. 13. Экспрессия vβ10 на CTL в активированных LN после инокуляции HSV-1. Несмотря на
нормальную реактивность на Vβ10 в старых мышах в общем, у некоторых мышей наблюдали полную
утрату экспрессии vβ10. Показаны репрезентативные профили гистограмм. Обратите внимание на
уменьшение клональной реакции у старых мышей и восстановление ожидаемой реакции после кастрации.
Фиг. 14. Изменения в числах клеток в тимусе, селезенке, лимфатическом узле и костном мозгу после трансплантации костного мозга конгенных мышей Ly5. Обратите внимание на быструю экспансию
тимуса у кастрированных животных в сравнении с группой без кастрации во всех временных точках после обработки. Кроме того, числа клеток в селезенке и лимфатическом узле группы кастрированных животных в большой степени увеличивались в сравнении с группой только с одним циклофосфамидом (n =
3-4 на каждую группу обработки и на каждую временную точку). Кастрированные мыши имели значимо
увеличенное число конгенных (Ly5.2) клеток в сравнении с некастрированными животными (данные не
показаны).
Фиг. 15. Изменение числа клеток в тимусе у кастрированных и некастрированных мышей после
восстановления фетальной печени.
(n = 3-4 для каждой тест-группы). (а) Через две недели число клеток тимуса кастрированных мышей
было при нормальных уровнях и значимо более высоким, чем число клеток некастрированных мышей
(*р<0,05). Наблюдали гипертрофию в тимусах кастрированных мышей после четырех недель. Числа клеток некастрированных мышей оставались ниже контрольных уровней. (b) CD45.2+ клетки - CD45.2+ является маркером, показывающим происхождение из донора. Спустя две недели после восстановления
происходящие из донора клетки присутствовали как у кастрированных, так и у некастрированных мышей. Спустя четыре недели после обработки приблизительно 85% клеток в тимусе кастрированных мышей были происходящими из донора. В тимусе некастрированных мышей не было происходящих из донора клеток.
Фиг. 16. FACS-профили CD4 против CD8 популяций происходящих из донора тимоцитов в сравнении с CD8-донором после летального облучения и восстановления фетальной печени с последующей
хирургической кастрацией. Проценты для каждого квадранта приводятся справа от каждого построения.
Профилем совпадающего по возрасту контроля является профиль тимуса восьмимесячной Ly5.1 конгенной мыши. Профили кастрированных и некастрированных мышей дискриминированы в клеточном сортере на CD45.2+ клетки, показывающие только происходящие из донора клетки. Спустя две недели после восстановления субпопуляции тимоцитов не различаются между кастрированными и некастрированными мышами.
Фиг. 17. Числа миелоидных и лимфоидных дендритных клеток (DC) после летального облучения,
восстановления фетальной печени и кастрации, (n = 3-4 мыши для каждой тест-группы). Контрольные
(белые) столбцы на следующих диаграммах основаны на нормальном числе дендритных клеток, обнаруживаемых в необработанных таких же по возрасту мышах. (а) Происходящие из донора миелоидные
дендритные клетки - Спустя две недели после восстановления DC присутствовали при нормальных
уровнях у некастрированных мышей. Было значимо больше DC у кастрированных мышей в той же самой
временной точке. (* р < 0,05). При четырех неделях число DC оставалось выше контрольных уровней у
кастрированных мышей. (b) Происходящие из донора лимфоидные дендритные клетки - спустя две недели после восстановления числа DC у кастрированных мышей были в 2 раза выше чисел некастрированных мышей. Спустя четыре недели после обработки числа DC оставались выше контрольных уровней.
-5-
005573
Фиг. 18. Изменения в общем числе и числе CD45.2+ клеток костного мозга у кастрированных и некастрированных мышей после восстановления фетальной печени. n = 3-4 мыши для каждой тест-группы,
(а) Общее число клеток - Спустя две недели после восстановления числа клеток костного мозга нормализовались, и не было значимого различия в числе клеток между кастрированными и некастрированными
мышами. Спустя четыре недели после восстановления было значимое различие в числе клеток между
кастрированными и некастрированными мышами (+ р<0,05). (b) Число клеток CD45.2+ - Не было значимого различия между кастрированными и некастрированными мышами в отношении числа CD45.2 клеток в костном мозге после восстановления. Число CD45.2+ клеток оставалось высоким у кастрированных
мышей через четыре недели. В той же временной точке не было происходящих из донора клеток у некастрированных мышей.
Фиг. 19. Изменения в Т-клетках и дендритных клетках (DC) миелоидного и лимфоидного происхождения в костном мозге кастрированных и некастрированных мышей после восстановления фетальной
печени (n = 3-4 мыши для каждой тест-группы). Контрольные (белые) столбцы на следующих диаграммах основаны на нормальном числе Т-клеток и дендритных клеток, обнаруживаемых в необработанных
таких же по возрасту мышах. (а) Числа Т-клеток - Числа уменьшались спустя две и четыре недели после
восстановления как у кастрированных, так и у некастрированных мышей. (b) Происходящие из донора
миелоидные дендритные клетки - спустя две недели после восстановления DC присутствовали при нормальных уровнях как у кастрированных, так и у некастрированных мышей. В этой временной точке не
было значимого различия между числами клеток у кастрированных и некастрированных мышей. (с)
Происходящие из донора лимфоидные дендритные клетки - числа были при нормальных уровнях спустя
две и четыре недели после восстановления. Через две недели не было значимого различия между числами клеток у кастрированных и некастрированных мышей.
Фиг. 20. Изменение в общих числах клеток и числах донорских (CD45.2+) клеток селезенки у кастрированных и некастрированных мышей после восстановления фетальной печени, (n = 3-4 мыши для
каждой тест-группы). (а) Общее число клеток - спустя две недели после восстановления числа клеток
костного мозга уменьшались, и не было значимого различия в числе клеток между кастрированными и
некастрированными мышами. Спустя четыре недели после восстановления числа клеток приближались к
нормальным уровням у кастрированных мышей. (b) Число CD45.2+ клеток - Не было значимого различия между кастрированными и некастрированными мышами в отношении числа CD45.2+ клеток в селезенке спустя две недели после восстановления. Число CD45.2+ клеток оставалось высоким у кастрированных мышей через четыре недели. В той же временной точке не было происходящих из донора клеток
у некастрированных мышей.
Фиг. 21. Т-клетки и дендритные клетки (DC) миелоидного и лимфоидного происхождения в селезенке после восстановления фетальной печени (n = 3-4 мыши для каждой тест-группы). Контрольные
(белые) столбцы на следующих диаграммах основаны на нормальном числе Т-клеток и дендритных клеток, обнаруживаемых в необработанных таких же по возрасту мышах. (а) Числа Т-клеток - Числа уменьшались спустя две и четыре недели после восстановления как у кастрированных, так и у некастрированных мышей. (b) Происходящие из донора миелоидные дендритные клетки - спустя две или четыре недели после восстановления числа DC были нормальными как у кастрированных, так и у некастрированных
мышей. При двух неделях не было значимого различия между числами клеток у кастрированных и некастрированных мышей. (с) Полученные из донора (CD45.2+) лимфоидные дендритные клетки - числа клеток были при нормальных уровнях спустя две и четыре недели после восстановления. При двух неделях
не было значимого различия между числами клеток у кастрированных и у некастрированных мышей.
Фиг. 22. Изменения в общих числах клеток и числах донорских (CD45.2+) клеток лимфатических
узлов у кастрированных и некастрированных мышей после восстановления фетальной печени, (n = 3-4
мыши для каждой тест-группы). (а) Общее число клеток - спустя две недели после восстановления числа
клеток были при нормальных уровнях, и не было значимого различия между кастрированными и некастрированными мышами. Спустя четыре недели после восстановления числа клеток у кастрированных
мышей находились при нормальных уровнях. (b) Число CD45.2+ клеток - Не было значимого различия
между кастрированными и некастрированными мышами в отношении числа CD45.2+ клеток в лимфатическом узле спустя две недели после восстановления. Число CD45.2+ клеток оставалось высоким у кастрированных мышей через четыре недели. В той же временной точке не было происходящих из донора
клеток у некастрированных мышей.
Фиг. 23. Изменения в Т-клетках и дендритных клетках (DC) миелоидного и лимфоидного происхождения в мезентериальных лимфатических узлах кастрированных и некастрированных мышей после
восстановления фетальной печени (n = 3-4 мыши для каждой тест-группы). Контрольные (белые) столбцы являются числами Т-клеток и дендритных клеток, обнаруживаемых у необработанных совпадающих
по возрасту мышей, (а) Числа Т-клеток уменьшались спустя две и четыре недели после восстановления
как у кастрированных, так и у некастрированных мышей. (b) Происходящие из донора миелоидные дендритные клетки были нормальными как у кастрированных, так и у некастрированных мышей. Через четыре недели они уменьшались. Через две недели не было значимого различия между числами клеток у
кастрированных и у некастрированных мышей. (с) Происходящие из донора лимфоидные дендритные
-6-
005573
клетки - Числа были при нормальных уровнях спустя две и четыре недели после восстановления. Через
две недели не было значимого различия между числами клеток у кастрированных и у некастрированных
мышей.
Подробное описание изобретения
Определения
Фраза «модификация "makeup" популяций Т-клеток» относится к изменению природы и/или соотношения популяций Т-клеток, определяемого функционально и по экспрессии характерных молекул.
Примеры этих характерных молекул включают в себя, но не ограничиваются ими, рецептор Т-клеток,
CD4, CD8, CD3, CD25, CD28, CD44, CD62L и CD69.
Фраза «увеличение числа Т-клеток» относится к абсолютному увеличению числа Т-клеток у субъекта в тимусе, и/или в кровотоке, и/или в селезенке, и/или в костном мозге, и/или в периферических тканях, таких как лимфатические узлы, желудочно-кишечный тракт, мочеполовые пути и дыхательные пути. Эта фраза относится также к относительному увеличению в числе Т-клеток, например, в сравнении с
В-клетками.
«Субъект, имеющий депрессированную или атипичную Т-клеточную популяцию или функцию»
включает в себя индивидуума, инфицированного вирусом иммунодефицита человека, в частности, индивидуума, который имеет СПИД или любой другой вирус или инфекцию, при которой атакуются Тклетки, или любое Т-клеточное заболевание, для которого был идентифицирован дефектный ген.
Кроме того, эта фраза включает в себя любого постпубертатного индивидуума, в частности, старого
индивидуума, который имеет уменьшенную иммунореактивность и увеличенную частоту встречаемости
заболевания как следствие постпубертатной атрофии тимуса.
Во всем этом описании слово «содержат» или вариации этого слова, такие как «содержит» или «содержащий», должны пониматься как включение указанного элемента, целого числа или стадии, или
группы элементов, целых чисел или стадий, но не включение любого другого элемента, целого числа или
стадии, или группы элементов, целых чисел или стадий.
Разрушение передачи сигналов половых стероидных гормонов
Как будет легко понятно, передача сигналов половых стероидов к тимусу может быть разрушена
целым рядом способов, например, ингибированием продуцирования половых стероидных гормонов или
блокированием рецепторов половых стероидов в тимусе. Ингибирование продуцирования половых стероидов может быть достигнуто, например, кастрацией, введением аналога (аналогов) половых стероидов
и другими хорошо известными способами. В некоторых клинических случаях может быть пригодно перманентное удаление половых желез физической кастрацией. В предпочтительном варианте, передачу
сигналов половых стероидов к тимусу разрушают введением аналога полового стероидного гормона,
предпочтительно аналога гормона, высвобождающего лютеинизирующий гормон. В настоящее время
предпочтительно, чтобы этим аналогом был деслорелин (описанный в патенте США № 4218439).
Аналоги половых стероидных гормонов
Аналоги половых стероидных гормонов (половых стероидов) и их применение в способах терапии
и «химической кастрации» хорошо известны. Примеры таких аналогов включают в себя Эулексин (описанный в FR7923545, WO 86/01105 и РТ 100899), Госерелин (описанный в US 4100274, US 4128638, GB
9112859 и GB 9112825), Лейпролид (описанный в US 4490291, US 3972859, US 4008209, US 4005063, DE
2509783 и US 4992421), производные диоксалана, такие как описанные в ЕР 413209, Трипторелин (описанный в US 4010125, US 4018726, US 4024121, ЕР 364819 и US 5258492), Метерелин (описанный в ЕР
23904), Бусерелин (описанный в US 4003884, US 4118483 и US 4275001), Гистрелин (описанный в ЕР
217659), Нафарелин (описанный в US 4234571, WO 93/15722 и ЕР 52510), Лутрелин (описанный в US
4089946), Лейпрорелин (описанный в Plosker et al.) и аналоги LHRH, такие как описанные в ЕР 181236,
US 4608251, US 4656247, US 4642332, US 4010149, US 3992365 и US 4010149. Описания каждой из ссылок, указанных выше, включены здесь в качестве перекрестной ссылки.
Как должно быть понятно лицам с квалификацией в данной области, по меньшей мере некоторые из
способов для разрушения передачи сигналов половых стероидных гормонов к тимусу будут эффективными лишь до тех пор, пока вводится подходящее соединение. В результате, преимуществом некоторых
вариантов данного изобретения является то, что как только достигаются желаемые иммунологические
воздействия данного изобретения, (2-3 месяца), лечение может быть остановлено, и репродуктивная система субъекта вернется к норме.
Генетическая модификация гемопоэтических стволовых клеток (HSC)
Способы для выделения и трансдукции стволовых клеток и клеток-предшественников хорошо известны специалистам с квалификацией в данной области. Примеры этих типов способов описаны, например, в WO 95/08105, US 5559703, US 5339493, US 5061620, WO 96/33281, WO 96/33282, US 5681559 и
US 5199942.
Антисмысловые полинуклеотиды
Термин "антисмысловые", в применении здесь, относится к полинуклеотидным последовательностям, которые являются комплементарными полинуклеотиду данного изобретения.
-7-
005573
Антисмысловые молекулы могут быть получены любым способом, в том числе синтезом посредством лигирования представляющего интерес гена (генов) в обратной ориентации с вирусным промотором,
который обеспечивает возможность синтеза комплементарной цепи. При введении в клетку эта транскрибированная нить объединяется с природными последовательностями, продуцируемыми клеткой, с
образованием дуплексов. Затем эти дуплексы блокируют последующую либо транскрипцию, либо трансляцию. Таким образом могут быть получены мутантные фенотипы.
Каталитические нуклеиновые кислоты
Термин каталитическая нуклеиновая кислота относится к ДНК-молекуле или ДНК-содержащей молекуле (также известной в данной области как "дезоксирибозим" или "ДНК-зим") или РНК или РНКсодержащей молекуле (также известной как "рибозим"), которая специфически узнает определенный
субстрат и катализирует химическую модификацию этого субстрата. Основаниями нуклеиновой кислоты
в каталитической нуклеиновой кислоте могут быть основания А, С, G, Т и U, а также их производные.
Производные этих оснований хорошо известны в данной области.
Обычно каталитическая нуклеиновая кислота содержит антисмысловую последовательность для
специфического узнавания нуклеиновой кислоты-мишени и имеет расщепляющую нуклеиновую кислоту
ферментативную активность. Каталитическая цепь расщепляет специфический сайт в нуклеиновой кислоте-мишени. Типами рибозимов, которые применимы, в частности, в данном изобретении, являются
"молотоголовый" рибозим (Haseloff and Gerlach 1988, Perriman et al., 1992) и рибозим в виде шпильки
(Shippy et al., 1999).
Двухцепочечная (ds)PHK
Двухцепочечная РНК применима, в частности, для специфического ингибирования продуцирования
конкретного белка. Хотя и не желая ограничиваться теорией, Dougherty and Parks (1995) обеспечили модель для механизма, при помощи которого dsPHK может быть использована для уменьшения продуцирования белка. Эта модель была недавно модифицирована и расширена Waterhouse et al. (1998). Эта технология основана на присутствии молекул dsPHK, которые содержат последовательность, по существу
идентичную мРНК представляющего интерес гена, в этом случае мРНК, кодирующую полипептид в соответствии с первым аспектом данного изобретения. Удобно, если эта dsPHK может продуцироваться в
одной открытой рамке считывания в рекомбинантном векторе или клетке-хозяина, где смысловая и антисмысловая последовательности фланкированы неродственной последовательностью, которая позволяет
смысловой и антисмысловой последовательностям гибридизоваться с образованием молекулы dsPHK,
причем неродственная последовательность образует структуру петли. Конструирование и получение
подходящих молекул dsPHK для данного изобретения находится в компетенции лица с квалификацией в
данной области, особенно с учетом Dougherty and Parks (1995), Waterhouse et al. (1998), WO 99/32619,
WO 99/53050, WO 99/49029 и WO 01/34815.
Анти-ВИЧ-конструкции
Специалисты с квалификацией в данной области могли бы разрабатывать подходящие анти-ВИЧконструкции для применения в данном изобретении. В самом деле, ряд антисмысловых анти-ВИЧконструкций и рибозимов уже были разработаны и описаны, например, в US 5811275, US 5741706, WO
94/26877, AU 56394/94 и US 5144019.
Пример 1. Обращение индуцированной возрастом тимусной атрофии.
Материалы и способы
Животные.
Самцов мышей СВА/САН и C57B16/J получали из Central Animal Services, Monash University и содержали при общепринятых условиях. Возраст был в диапазоне от 4-6 недель до 26 месяцев, и он указывается, где это необходимо.
Кастрация
Животных анестезировали внутрибрюшинной инъекцией 0,3 мл 0,3 мг ксилазина (Rompun; Bayer
Australia Ltd., Botany NSW, Australia) и 1,5 мг гидрохлорида кетамина (Ketalar; Parke-Davis, Caringbah,
NSW, Australia) в солевом растворе. Хирургическую кастрацию выполняли скротальным разрезом, обнажением яичек, которые перевязывали швом и затем удаляли вместе с окружающей их жировой тканью.
Включение бромдезоксиуридина
Мыши получали две внутрибрюшинные инъекции BrdU (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) (100
мг/кг веса тела в 100 мкл ЗФР) с 4-часовым интервалом. Контрольные мыши получали только инъекции
носителя. Спустя один час после второй инъекции тимусы иссекали и либо готовили суспензию для
FACS-анализа, либо их сразу же заливали в Tissue Тек (О.С.Т. compound, Miles INC, Indiana), моментально замораживали в жидком азоте и хранили при 70°С до использования.
Проточный цитометрический анализ
Мышей умертвляли асфиксией и удаляли тимус, селезенку и мезентериальные (брызжеечные) лимфатические узлы. Органы продавливали осторожно через сито 200 мкм в смеси холодный
ЗФР/1%ФТС/0,02% азид, центрифугировали (650 g, 5 мин, 4°С) и ресуспендировали в смеси
ЗФР/ФТС/азид. Клетки селезенки инкубировали в лизисном буфере для эритроцитов (8,9 г/л хлорида
-8-
005573
аммония) в течение 10 мин при 4°С, промывали и ресуспендировали в смеси ЗФР/ФТС/азид. Концентрацию и жизнеспособность клеток определяли в двух повторностях с использованием гемоцитометра и
смеси бромид этидия/акридин оранжевый и рассматривали под флуоресцентным микроскопом
(Axioskop; Carl Zeiss, Oberkochen, Germany).
Для трехцветной иммунофлуоресценции тимоциты рутинно метили анти-αβ-TCR-FITC или антиγδ-TCR-FITC, анти-СD4-РЕ и анти-СD8-АРС (все полученные из Pharmingen, San Diego, CA) с последующим проточным цитометрическим анализом. Суспензии клеток селезенки и лимфатических узлов
метили либо αβTCR-FITC/CD4-PE/CD8-APC, либо В220-В (Sigma) с CD4-PE и CD8-APC. В220-В выявляли с использованием конъюгата Streptavidin-Tri-colour, от Caltag Laboratoties, Inc., Burlingame, CA.
Для детектирования BrdU клетки метили поверхностно CD4-PE и CD8-APC с последующей фиксацией и увеличением проницаемости, как описано ранее (Carayon and Bord, 1989). Вкратце, окрашенные
клетки фиксировали O/N при 4°С в 1% PFA/0,01% Твин-20. Промытые клетки инкубировали в 500 мкл
ДНКазы (100 единиц Куница, Boehringer Mannheim, W. Germany) в течение 30 мин при 37°С для денатурации ДНК. Наконец, клетки инкубировали с анти-BrdU-FITC (Becton Dickinson).
Для 4-цветной иммунофлуоресценции тимоциты метили на CD3, CD4, CD8, В220 и Мас-1, одновременно детектировали с использованием антикрысиного Ig-Cy5 (Amersham, U.K.) и негативные клетки
(TN) дискриминировали для анализа. Затем их дополнительно окрашивали на CD25-PE (Pharmingen) и на
CD44-B (Pharmingen) с последующим окрашиванием Streptavidin-Tri-colour (Caltag, CA), как описано
ранее (Godfrey and Zlotnik, 1993). Затем выполняли детектирование BrdU, как описано выше.
Пробы анализировали на приборе FacsCalibur (Becton Dickinson). Жизнеспособные лимфоциты дискриминировали в соответствии с профилями рассеивания света при 0°С и 80°С и данные анализировали с
использованием программного обеспечения Cell quest (Becton Dickinson).
Иммуногистология
Замороженные среды тимуса (4 мкм) получали с использованием криостата (Leica) и немедленно
фиксировали в 100% ацетоне.
Для двухцветной флуоресценции срезы метили двойной меткой с использованием панели моноклональных антител: MTS6, 10, 12, 15, 16, 20, 24, 32, 33, 35 и 44 (Godfrey et al., 1990; табл. 1), полученной в
лаборатории авторов, и коэкспрессию детерминант эпителиальных клеток оценивали с использованием
поливалентного кроличьего анти-цитокератин-антитела (АВ) (Dako, Carpinteria, СА). Связанные mАВ
обнаруживали при помощи FITC-конъюгированного овечьего антикрысиного Ig (Silenius Laboratories), a
анти-цитокератин-антитело обнаруживали с использованием TRITC-конъюгированного козьего антикроличьего Ig (Silenius Laboratoties).
Для детектирования бромдезоксиуридина срезы окрашивали либо анти-цитокератин-антителами с
последующим добавлением анти-кроличьего-TRITC, либо специфическими mАВ, которые затем выявляли с анти-крысиным Ig-Су3 (Amersham). Затем выполняли детектирование BrdU, как описано ранее
(Penit et al., 1996). Вкратце, срезы фиксировали в 70% этаноле в течение 30 мин. Полувысушенные срезы
инкубировали в 4 М НСl, нейтрализовали промыванием в боратном буфере (Sigma) и затем промывали
два раза в ЗФР. BrdU детектировали с использованием анти-BrdU-FITC (Becton Dickinson).
Для трехцветной иммунофлуоресценции срезы метили на специфические MTS mАВ вместе с антицитокератином. Затем детектирование BrdU выполняли, как описано выше.
Срезы анализировали с использованием флуоресцентного микроскопа Leica и конфокального микроскопа Nikon.
Исследования миграции
Животных анестезировали внутрибрюшинной инъекцией 0,3 мл 0,3 мг ксилазина (Rompun; Bayer
Australia Ltd., Botany NSW, Australia) и 1,5 мг гидрохлорида кетамина (Ketalar; Parke-Davis, Caringbah,
NSW, Australia) в солевом растворе.
Подробности способа FITC-мечения тимоцитов являются сходными с описанными в другом месте
(Scolly et al., 1980; Berzins et al., 1998). Вкратце, доли тимуса обнажали и каждую долю инъецировали
приблизительно 10 мкМ 350 мкг/мл FITC (в ЗФР). Рану закрывали хирургическим сшивающим аппаратом и мышей согревали до полного восстановления от анестезии. Мышей умертвляли асфиксией с использованием СО2 спустя приблизительно 24 ч после инъекции и лимфоидные органы извлекали для
анализа.
После счета клеток пробы окрашивали анти-СD4-РЕ и анти-CD8-АРС, затем анализировали при
помощи проточной цитометрии. Клетки-мигранты идентифицировали в виде живых-FITC+дискриминированных клеток, экспрессирующих либо CD4, либо CD8 (для пропускания аутофлуоресцирующих клеток и дублетов). Проценты FITC+ CD4- или СD8-клеток суммировали для обеспечения общего процента мигрантов для лимфатических узлов и селезенки, соответственно. Расчет скоростей ежедневного экспорта выполняли, как описано Berzins et al. (1998).
Данные анализировали с использованием непарного t-критерия Стьюдента или использовали непараметрический критерий Манна-Уитни для определения статистической значимости между результатами
контроля и теста для экспериментов, проводимых по меньшей мере в трех повторностях. Эксперимен-9-
005573
тальные величины, значимо отличающиеся от величин контроля, указываются следующим образом:
*р ≤0,05, **р ≤0,01 и ***р ≤0,001.
Результаты
Влияние возраста на популяции тимоцитов
(i) Вес тимуса и число тимоцитов.
С увеличением возраста имеется высокозначимое (р ≤0,0001) уменьшение как в весе тимуса (фиг.
1А), так и в общем числе тимоцитов (фиг. 1В) . Относительный вес тимуса (мг тимуса/г веса тела) в молодом взрослом имеет среднюю величину 3,34, которая уменьшается до 0,66 при 18-24 месяцах возраста
(отложение жира ограничивает точный расчет). Уменьшение в весе тимуса может быть отнесено к
уменьшению общих чисел тимоцитов: при 1-2 месяцах тимус содержит ~6,7 х 107 тимоцитов, с уменьшением до ~4,5 х 107 клеток при 24 месяцах. При удалении действий половых стероидных гормонов на
тимус кастрацией происходит регенерация, и спустя 4 недели после кастрации тимус является равноценным с тимусом молодого взрослого животного как по весу, так и по насыщенности клетками (фиг. 1А и
1В). Интересно, что имеется значимое (р ≤ 0,001) увеличение в числах тимоцитов через 2 недели после
кастрации (~1,2 х 108) , которое восстанавливается до уровней нормальных молодых животных спустя 4
недели после кастрации (фиг. 1В).
Уменьшение чисел Т-клеток, продуцируемых тимусом, не отражается в периферии, причем числа
клеток селезенки остаются постоянными с возрастом (фиг. 2А). Механизмы гомеостаза в периферии были очевидными, так как не было действия возраста на отношение В-клеток к Т-клеткам в селезенке и
лимфатических узлах и последующего уменьшения чисел Т-клеток, достигающих периферии (фиг. 2В).
Однако отношение CD4+ к CD8+ Т-клеткам значимо уменьшалось (р ≤ 0,001) с возрастом с 2:1 в 2месячном возрасте до отношения 1:1 в возрасте 2 года (фиг. 2С). После кастрации и последующего повышения чисел Т-клеток, достигающих периферии, не наблюдали изменения в числах периферических
Т-клеток: числа Т-клеток и отношение В:Т-клеток как в селезенке, так и лимфатических узлах не менялось после кастрации (фиг. 2А и В). Уменьшенное отношение CD4:CD8 в периферии с возрастом все еще
было очевидным через 2 недели после кастрации, но оно полностью обращалось через 4 недели после
кастрации (фиг. 2С).
(ii) Экспрессия αβTCR, γδTCR CD4 и CD8.
Для определения, было ли уменьшение чисел тимоцитов результатом истощения специфических
популяций клеток, тимоциты метили определяющими маркерами для анализа отдельных субпопуляций.
Кроме того, это позволяло провести анализ кинетики репопулирования тимуса после кастрации. Соотношение основных субпопуляций тимоцитов сравнивали с соотношением нормального молодого тимуса
(фиг. 3) и нашли, что оно остается однородным с возрастом. Кроме того, дальнейшее подразделение тимоцитов посредством экспрессии αβTCR и γδTCR не выявило изменения в соотношениях этих популяций с возрастом (данные не показаны). Через 2 и 4 недели после кастрации субпопуляции тимоцитов оставались в тех же самых соотношениях, и, поскольку числа тимоцитов увеличивались до 100-кратного
увеличения после кастрации, это указывает на синхронную экспансию всех популяций тимоцитов, а не
на связанное с развитием прогрессирование экспансии.
Таким образом, уменьшение чисел клеток, наблюдаемое в тимусе старых животных, является, повидимому, результатом сбалансированного уменьшения всех клеточных фенотипов без значимых изменений в детектируемых Т-клеточных популяциях. Регенерация тимуса происходит синхронным образом,
с пополнением всех субпопуляций Т-клеток одновременно, а не последовательно.
Пролиферация тимоцитов
Как показано на фиг. 4.1, 15-20% тимоцитов пролиферируют в возрасте 4-6 недель. Большинство
(~80%) их являются DP, a субпопуляция TN является второй наибольшей популяцией при ~6% (фиг.
4.2А). Таким образом, наибольшее деление наблюдается в субкапсуле и коре согласно иммуногистологии (данные не показаны). Некоторое деление наблюдается в медуллярных районах, причем FACSанализ обнаруживает соотношение делящихся клеток (9% CD4 Т-клеток и 25% CD8 Т-клеток) (фиг.
4.2В).
Хотя числа клеток значимо уменьшаются в старом тимусе, пролиферация тимоцитов остается постоянной, снижаясь до 12-15% в 2 года (фиг. 4.1), причем фенотип пролиферирующей популяции похож
на 2-месячный тимус (фиг. 4.2А). Иммуногистология выявила, что деление в возрасте 1 год отражает
деление в молодом взрослом животном, однако, в 2 года пролиферация видна в основном в наружной
коре и окружающей сосудистой сети (данные не показаны). Через 2 недели после кастрации, хотя числа
тимоцитов значимо увеличиваются, не наблюдается изменение в соотношении тимоцитов, которые являются пролиферирующими, что опять указывает на синхронную экспансию клеток (фиг. 4.1). Иммуногистология обнаружила, что локализация пролиферации тимоцитов и степень делящихся клеток сходна с
ситуацией в 2-месячном тимусе через 2 недели после кастрации (данные не показаны). При анализе доли
каждой субпопуляции, которая представляет пролиферирующую популяцию, было значимое (р ≤ 0,001)
увеличение процента CD8 Т-клеток, которые находятся в пролиферирующей популяции (1% в возрасте 2
месяца и 2 года, с увеличением до ~6% через 2 недели после кастрации) (фиг. 4.2А).
- 10 -
005573
Фиг. 4. 2В иллюстрирует степень пролиферации в каждой субпопуляции у молодых, старых и кастрированных мышей. Имеется значимое (р ≤ 0,001) уменьшение пролиферации в субпопуляции DN (35%
в 2 месяца - 4% в 2 года) . Пролиферация CD8+ Т-клеток также уменьшалась значимо (р ≤ 0,001), отражая
открытия, полученные иммуногистологией (данные не показаны), где деление не наблюдали в медулле
старого тимуса. Уменьшение пролиферации DN не возвращается до уровней нормальных молодых животных через 4 недели после кастрации. Однако пролиферация в субпопуляции CD8+ Т-клеток значимо
(р≤0,001) увеличивается через 2 недели после кастрации и возвращается к нормальным уровням молодых
животных через 4 недели после кастрации.
Уменьшение пролиферации в субпопуляции DN анализировали дополнительно с использованием
маркеров CD44 и CD25. Субпопуляция DN, наряду с предшественниками тимоцитов, содержит
αβTCR+CD4-CD8- тимоциты, которые, как считается, имеют пониженные оба корецептора при переходе
к клеткам SP (Godfrey and Zlotnik, 1993). Установкой дискриминирующих окон клеточного сортера на
эти зрелые клетки можно было анализировать истинный компартмент TN (CD3-CD4-CD8-), и эти клетки
показали отсутствие различия в их скоростях пролиферации с возрастом или после кастрации (фиг.
4.2С). Однако анализ субпопуляций, экспрессирующих CD44 и CD25, показал значимое (р ≤ 0,001)
уменьшение пролиферации субпопуляции TN1 (CD44+CD25-), с 20% у нормальных молодых животных
до приблизительно 6% в возрасте 18 месяцев (фиг. 4.2D), которая нормализовалась через 4 недели после
кастрации. Уменьшение пролиферации субпопуляции TN1 компенсировалось значимым (р≤0,001) увеличением пролиферации субпопуляции TN2 (CD44+CD25+), которая возвращалась к нормальным уровням молодых животных через 2 недели после кастрации (фиг. 4.2D).
Действие возраста на микроокружение тимуса
Изменения в тимусном микроокружении с возрастом исследовали с использованием иммунофлуоресценции с применением высокопроизводительной панели mАВ из MTS-серии, с двойной меткой в виде полинуклеотидных антицитокератин-антител.
Антигены, узнаваемые этими mАВ, могут быть подразделены на три группы: эпителиальные субпопуляции тимуса, связанные с сосудами антигены и антигены, присутствующие как на стромальных
клетках, так и на тимоцитах.
(i) Антигены эпителиальных клеток.
Анти-кератин-окрашивание (панэпителия) тимуса 2-летней мыши обнаружило потерю общей архитектуры тимуса с серьезной дезорганизацией эпителиальных клеток и отсутствием кортико-медуллярной
границы. Последующий анализ с использованием mАВ, MTS 10 (медулла) и MTS44 (кора) показал определенное уменьшение размера коры с возрастом с менее существенным уменьшением медуллярного
эпителия (данные не показаны). Не содержащие эпителиальных клеток районы, или кератин-негативные
зоны (KNA, van Ewijk et al., 1980; Godfrey et al., 1990; Bruijntjes et al., 1993), были более заметными и
увеличивались в размере в стареющем тимусе, что видно из мечения антицитокератином. Имеется также
появление эпителиальных «цистоподобных» структур тимуса в старом тимусе, особенно заметных в медуллярных районах (данные не показаны). Жировые отложения, серьезное уменьшение размера тимуса и
уменьшение целостности кортико-медуллярной границы убедительно показаны окрашиванием антицитокератином (данные не показаны). Тимус начинает регенерацию через 2 недели после кастрации. Это
видно по размерам долей тимуса (а), увеличению коркового эпителия, обнаруживаемому по MTS 44 (b),
и локализации медуллярного эпителия (с). Медуллярный эпителий детектируется по MTS 10, и через 2
недели все еще имеются субкарманы эпителия, окрашиваемые MTS 10, рассеянные по всему корковому
веществу. Через 4 недели после кастрации имеются явные медулла (сердцевина) и кора и различимая
кортико-медуллярная граница.
Маркеры MTS 20 и 24 предположительно детектируют примордиальные эпителиальные клетки
(Godfrey, et al., 1990) и дополнительно иллюстрируют дегенерацию старого тимуса. Они присутствуют в
изобилии при Е14, детектируют кластеры выделенных медуллярных эпителиальных клеток на 4-6 неделях, но опять увеличиваются по интенсивности в старом тимусе (данные не показаны). После кастрации
все эти антигены экспрессируются при уровне, эквивалентном уровню тимуса молодых взрослых животных (данные не показаны), причем MTS 20 и MTS 24 обращаются до отдельных субкарманов эпителия,
локализованного при кортико-медуллярной границе.
(ii) Связанные с сосудистой сетью антигены.
Предполагается, что гематотимусный барьер является ответственным за иммиграцию Т-клетокпредшественников в тимус и эмиграцию зрелых Т-клеток из тимуса к периферии.
mАВ MTS 15 является специфическим в отношении эндотелия тимусных кровеносных сосудов, демонстрируя гранулярную диффузную картину окрашивания (Godfrey, et al., 1990). В старом тимусе экспрессия MTS 15 сильно увеличивается и отражает увеличенную встречаемость и увеличенный размер
кровеносных сосудов и периваскулярных пространств (данные не показаны).
Тимусный внеклеточный матрикс, содержащий важные структурные молекулы и молекулы клеточной адгезии, такие как коллаген, ламинин и фибриноген, детектируется при помощи mAB MTS 16. Рассеянная по всему тимусу нормальных молодых животных природа экспрессии MTS16 становится более
- 11 -
005573
широко распространенной и взаимосвязанной в старом тимусе. Экспрессия MTS 16 увеличивается дополнительно через 2 недели после кастрации, тогда как через 4 недели после кастрации эта экспрессия
представляет ситуацию, характерную для 2-месячного тимуса (данные не показаны).
(iii) Общие антигены.
Экспрессия МНС II в нормальном молодом тимусе, детектируемая mAB MTS 6, является сильно
положительной (гранулярной) на корковом эпителии (Godfrey et al., 1990) с более слабым окрашиванием
медуллярного эпителия. Старый тимус обнаруживает уменьшение экспрессии МНС II, причем экспрессия существенно увеличивается через 2 недели после кастрации. Через 4 недели после кастрации экспрессия опять уменьшается и кажется одинаковой с экспрессией 2-месячного тимуса (данные не показаны).
Эмиграция тимоцитов
Приблизительно 1% Т-клеток эмигрируют из тимуса ежедневно у молодых мышей (Scollay et al.,
1980). Авторы данного изобретения нашли, что эмиграция происходила при пропорциональной скорости, эквивалентной скорости у нормальной молодой мыши, в 14 месяцев и даже в возрасте 2 года (фиг.
5а и 5b), хотя она значимо (р ≤ 0,0001) уменьшалась по числу клеток. Через 2 недели после кастрации
наблюдали значимое увеличение RTE (клеток-эмигрантов) (р ≤ 0,01) в сравнении со старыми мышами.
Несмотря на изменения в числах эмигрирующих клеток, скорость эмиграции (RTE/общие тимоциты)
оставалась постоянной с возрастом (фиг. 5b). Однако через 2 недели после кастрации она значимо
уменьшалась (р ≤0,05), отражая увеличение чисел общих тимоцитов в это время. Интересно, что было
увеличение отношения CD4:CD8 этих RTE с ~3:1 в 2 месяца до ~7:1 в 26 месяцев (фиг. 5с). Через 1 неделю после кастрации это отношение нормализовалось (фиг. 5с).
Пример 2. Обращение вызываемой химиотерапией или облучением атрофии тимуса.
Кастрированные мыши (либо за одну неделю до обработки, либо в день обработки) показали существенные увеличения скорости регенерации тимуса после облучения или обработки циклофосфамидом.
В тимусе облученной мыши обнаруживается тяжелое разрушение архитектуры тимуса, одновременное с истощением быстро делящихся клеток. Коллапс коры, напоминающий старый/обработанный
гидрокортизоном тимус, свидетельствует о потере DN- и DP-тимоцитов. Имеется даунрегуляция (понижающая регуляция) экспрессии αβTCR на CD4+ и CD8+ SP-тимоцитах - доказательство подвергающихся
апоптозу клеток. В сравнении с этим, обработанные циклофосфамидом животные обнаруживают менее
тяжелое разрушение архитектуры тимуса и демонстрируют более быструю скорость регенерации DN- и
DP-тимоцитов.
Через 1 неделю после обработки кастрированные мыши показали значимую регенерацию тимуса
даже на этой ранней стадии (фиг. 6, 7 и 8). В сравнении с этим, некастрированные животные показали
тяжелую потерю DN- и DP-тимоцитов (быстро делящихся клеток) и последующее увеличение доли CD4
и CD8 клеток (устойчивых к облучению (радиоустойчивых)). Это лучше всего иллюстрируется различиями в числах тимоцитов, причем кастрированные животные показывают по меньшей мере 4-кратное
увеличение размера тимуса даже через 1 неделю после обработки. Через 2 недели некастрированные животные показали относительную нормальность тимоцитов с регенерацией как DN-, так и DP-тимоцитов.
Однако, соотношения тимоцитов еще не являются эквивалентными соотношениям тимуса контрольных
молодых взрослых животных. В самом деле, через 2 недели громадное различие в скоростях регуляции
между кастрированными и некастрированными мышами было максимальным (через 4 недели числа тимоцитов были эквивалентыми между группами обработок).
Интересно, что размер тимуса, по-видимому, превышает фон контрольного тимуса. Это указывает
на быструю экспансию в тимусе при отсутствии пока еще миграции этих недавно образовавшихся тимоцитов (для миграции через периферию и из нее тимоцитам требуется ~3-4 недели). Таким образом, хотя
соотношения в каждой субпопуляции являются одинаковыми, числа тимоцитов накапливаются перед
высвобождением тимоцитов в периферию.
Фиг. 9 иллюстрирует применение химической кастрации в сравнении с хирургической кастрацией в
усилении регенерации Т-клеток. Кинетика химической кастрации является гораздо более медленной, чем
кинетика хирургической, т.е. мыши требуется приблизительно на 3 недели больше времени для уменьшения уровней циркулирующих в кровотоке половых стероидов. Однако химическая кастрация все-таки
является эффективной в регенерации тимуса, как показано на фиг. 9.
Пример 3. Регенерация тимуса после ингибирования половых стероидов приводит к восстановлению недостаточной фукции периферических Т-клеток.
Для определения, может ли кастрация усиливать иммунную реакцию, исследовали иммунизацию
вирусом простого герпеса (HSV), так как она позволяет исследовать прогрессирование заболевания и
роль цитотоксических (ЦТЛ) Т-клеток. Кастрированные мыши имеют качественно и количественно
улучшенную реактивность в отношении этого вируса. Мышей иммунизировали в подушечку лапки и
подколенный (дренирующий) лимфатический узел анализировали на день 5 после иммунизации. Кроме
того, подушечку ступни удаляли и гомогенизировали для определения титра вируса в конкретных временных точках во время всего эксперимента.
- 12 -
005573
Через 5 дней после иммунизации кастрированные мыши имеют существенно большую насыщенность клетками лимфатического узла, чем старые мыши (фиг. 10а). Хотя не было изменения в доле активированных (CD8+CD15+) клеток с возрастом или после кастрации, числа активированных клеток в лимфатических узлах значимо увеличивались кастрацией в сравнении со старыми контролями (фиг. 10с).
Далее, числа активированных клеток коррелируют с числами, найденными для молодых взрослых мышей, указывая на то, что ЦТЛ активируются в большей степени у кастрированных мышей, но молодые
взрослые мыши могут иметь увеличенный лимфатический узел вследствие активации В-клеток. Это подтверждали ЦТЛ-анализом, детектирующим долю специфического лизиса, имеющего место с возрастом и
после кастрации (фиг. 11). Старые мыши показали значительно уменьшенный лизис клеток-мишеней при
отношениях эффектор:мишень 10:1 и 3:1 в сравнении с молодыми взрослыми (2-месячными) мышами
(фиг. 11). Кастрация восстанавливала способность мышей генерировать специфические ЦТЛ-реакции
после инфекции HSV (фиг. 11).
Имеется 40% смещение после иммунизации в отношении использования Vβl0 для ЦТЛ в ответ на
HSV. При анализе старых и кастрированных мышей на их экспрессию vβ было обнаружено, что экспрессия Vβl0 была преобладающей (фиг. 12а). Однако в пробе старых мышей не наблюдали такого смещения
(фиг. 13). Кроме того, уменьшение CD4+ Т-клеток в дренирующих лимфатических узлах наблюдали в
зависимости от возраста в сравнении как с молодыми взрослыми, так и с кастрированными мышами
(фиг. 12b). Эта фигура иллюстрирует жизненную необходимость увеличенного получения Т-клеток из
тимуса на протяжении всей жизни для получения максимальной иммунореактивности.
Пример 4. Ингибирование половых стероидных гормонов усиливает поглощение новых гемопоэтических клеток-предшественников в тимус, что позволяет использовать химерные смеси лимфоидных
клеток (Т-, В- дендритных клеток) хозяина и донора.
Предыдущие эксперименты показали, что образование микрохимер играет важную роль в приживляемости трансплантируемых органов. Было показано также, что дендритные клетки играют существенную роль в переносимости антигенов трансплантата. Таким образом, исследовали действия кастрации на
образование тимусных химер и число дендритных клеток.
Для сингенных экспериментов на одну группу обработки использовали 4 трехмесячные мыши. Все
контроли имели совпадающий возраст и были необработанными. Для конгенных экспериментов на одну
группу обработки использовали 3-4 восьмимесячные мыши. Все контроли имели совпадающий возраст и
были необработанными.
Изменения в тимусе после летального облучения, восстановления фетальной печени и кастрации
сингенных мышей
Общие числа клеток тимуса кастрированных и некастрированных прошедших восстановление мышей сравнивали с необработанными контролями того же возраста и результаты суммировали на фиг. 14.
Как через 2, так и через 4 недели после обработки общие числа лимфоцитов значимо увеличивались у
кастрированных мышей в сравнении с некастрированными мышами (р ≤ 0,05). Через б недель число клеток оставалось ниже контрольных уровней, однако, эти числа у кастрированных мышей были в три раза
более высокими, чем у некастрированных мышей (р ≤ 0,05) (фиг. 14А).
Изменения в селезенке после летального облучения, восстановления сингенной фетальной
печени и кастрации
Общие числа клеток в селезенке сильно уменьшались спустя 4 и 6 недель после облучения и восстановления как у кастрированных, так и у некастрированных мышей. Опять, кастрированные мыши
показали увеличенные числа лимфоцитов при этих временных точках в сравнении с некастрированными
мышами (p ≤ 0,05), хотя не было различия в числе общих клеток селезенки между кастрированными и
некастрированными обработанными группами через 2 недели (фиг. 14В).
Мезентериальные лимфатические узлы после летального облучения, восстановления сингенной
фетальной печени и кастрации
Числа клеток мезентериальных лимфатических узлов уменьшались спустя 2 недели после облучения и восстановления как у кастрированных, так и у некастрированных мышей. Однако при 4 недельной
временной точке числа клеток достигли контрольных уровней. Не было статистически значимого различия в числе клеток лимфатических узлов между кастрированными и некастрированными группами обработки (фиг. 14С).
Изменения в тимусе после летального облучения, восстановления фетальной печени и кастрации
конгенных мышей
У некастрированных мышей было сильное уменьшение числа тимоцитов на протяжении 4недельного периода с малой регенерацией или без заметной регенерации (фиг. 15А). Однако в кастрированной группе через две недели уже был интенсивный тимопоэз, который через четыре недели возвращался к контрольным уровням, которые были в 10 раз более высокими, чем у некастрированных мышей.
Проточный цитометрический анализ тимусов в отношении CD45.2 (происходящего из донора антигена)
показал, что полученные из донора клетки были детектируемыми в некастрированной группе через 4
неделях, но примечательно, что фактически все тимоциты у кастрированных мышей были происходя- 13 -
005573
щими из донора в этой временной точке (фиг. 15В). При условии этого интенсивного усиления тимопоэза из происходящих из донора гемопоэтических предшественников, важно определить, протекала ли
дифференцировка Т-клеток нормально. CD4, CD8 и TCR-определяемые субпопуляции анализировали
проточной цитометрией. Не было пропорциональных различий в соотношениях субпопуляций тимоцитов спустя 2 недели после восстановления (фиг. 16). Это наблюдение не было возможным через 4 недели,
так как некастрированные мыши не восстанавливались происходящими из донора клетками. Однако в
этой временной точке соотношения тимоцитов у кастрированных мышей являются нормальными.
Спустя две недели после восстановления фетальной печени было значимо больше происходящих из
донора миелоидных дендритных клеток (определяемых как CD45.2+ Macl+ CD11C+) у кастрированных
мышей, чем у некастрированных мышей, различие было 4-кратным (р<0,05). Спустя четыре недели после обработки число происходящих из донора миелоидных дендритных клеток оставалось выше контроля у кастрированных мышей (фиг. 17А). Спустя 2 недели после восстановления фетальной печени число
происходящих из донора лимфоидных дендритных клеток (определяемых как CD45.2+ Macl- CD11C+) в
тимусе кастрированных мышей было вдвое более высоким, чем обнаруженное у некастрированных мышей. Спустя четыре недели после обработки число происходящих из донора лимфоидных дендритных
клеток оставалось выше контроля у кастрированных мышей (фиг. 17В).
Иммунофлуоресцентное окрашивание на CD11C, эпителий (антикератин) и CD45.2 (происходящий
из донора маркер) локализовало дендритные клетки в кортико-медуллярной границе и медуллярных зонах тимусов спустя 4 недели после восстановления и кастрации. С использованием программного обеспечения для колокализации было подтверждено донорское происхождение этих клеток (данные не показаны). Это подтверждалось данными проточной цитометрии, что предполагает, что через 4 недели после
восстановления приблизительно 85% клеток в тимусе являются происходящими из донора.
Изменения в костном мозгу после летального облучения, восстановления фетальной печени и кастрации
Числа клеток в костном мозге кастрированных и некастрированных мышей сравнивали с числами
клеток необработанных контролей того же возраста и суммировали эти данные на фиг. 18А. Числа клеток костного мозга были нормальными спустя две и четыре недели после восстановления у кастрированных мышей. Числа этих клеток у некастрированных мышей были нормальными через две недели, но разительно уменьшались через четыре недели (р < 0,05). Хотя в этой временной точке некастрированные
мыши не восстанавливались происходящими из донора клетками.
Проточный цитометрический анализ костного мозга в отношении CD45.2 (происходящего из донора антигена) установил, что происходящие из донора клетки не детектировались в костном мозге некастрированных мышей спустя 4 недели после восстановления, однако, почти все клетки у кастрированных
мышей были происходящими из донора в этой временной точке (фиг. 18В).
Спустя две недели после восстановления числа происходящих из донора Т-клеток как у кастрированных, так и у некастрированных мышей были явно более низкими, чем числа этих клеток, наблюдаемые у контрольных мышей (р <0,05). Через 4 недели в костном мозге некастрированных мышей не было
происходящих из донора Т-клеток и числа Т-клеток оставались ниже контрольных уровней у кастрированных мышей (фиг. 19А).
Происходящие из донора, миелоидные и лимфоидные дендритные клетки были обнаружены при
контрольных уровнях в костном мозге некастрированных и кастрированных мышей спустя 2 недели после восстановления. Спустя четыре недели после обработки числа уменьшались дополнительно у кастрированных мышей, и не наблюдали происходящих из донора клеток в некастрированной группе (фиг.
19В).
Изменения в селезенке после летального облучения, восстановления фетальной печени и кастрации
Числа клеток селезенки кастрированных и некастрированных восстановленных мышей сравнивали
с числами клеток необработанных контролей того же возраста и суммировали эти данные на фиг. 20А.
Спустя две недели после обработки числа клеток селезенки как кастрированных, так и некастрированных
мышей составляли приблизительно 50% от чисел контроля. Через четыре недели числа клеток кастрированных мышей приближались к нормальным уровням, однако, эти числа у некастрированных мышей
оставались уменьшенными. Анализ данных проточной цитометрии на CD45.2 (происходящий из донора)
показал, что не было значимого различия в числе происходящих из донора клеток у кастрированных и у
некастрированных мышей спустя 2 недели после восстановления (фиг. 20В). Происходящие из донора
клетки не были детектируемыми в селезенках некастрированных мышей через 4 недели, однако, почти
все клетки селезенки у кастрированных мышей были происходящими из донора.
Спустя две и четыре недели после восстановления было заметное уменьшение числа Т-клеток как у
кастрированных, так и у некастрированных мышей (р < 0,05) (фиг. 21А). Спустя две недели после восстановления фетальной печени происходящие из донора миелоидные и лимфоидные дендритные клетки
были обнаружены при контрольных уровнях у некастрированных и кастрированных мышей. Через 4 недели происходящие из донора дендритные клетки не были детектированы в селезенках некастрированных мышей и их числа оставались уменьшенными у кастрированных мышей.
Действия летального облучения, восстановления фетальной печени и кастрации на числа клеток в
мезентериальных лимфатических узлах.
- 14 -
005573
Числа клеток в лимфатических узлах кастрированных и некастрированных восстановленных мышах сравнивали с числами клеток необработанных контролей того же возраста и суммировали эти данные на фиг. 22А. Спустя две недели после восстановления числа клеток были на уровне контролей как у
кастрированных, так и у некастрированных мышей. Спустя четыре недели после восстановления числа
клеток у кастрированных мышей оставались на уровне контролей, но числа клеток у некастрированных
мышей значимо уменьшались (фиг. 22В).
Проточный цитометрический анализ в отношении CD45.2 предполагал, что не было значимого различия в числе происходящих из донора клеток у кастрированных и у некастрированных мышей спустя 2
недели после восстановления (фиг. 22В). Происходящие из донора клетки не были детектируемыми у
некастрированных мышей спустя 4 недели после восстановления. Однако фактически все клетки лимфатических узлов кастрированных мышей были происходящими из донора в той же временной точке.
Спустя две и четыре недели после восстановления числа происходящих из донора Т-клеток как у
кастрированных, так и у некастрированных мышей были более низкими, чем контрольные уровни. Через
4 недели эти числа оставались низкими у кастрированных мышей и не было происходящих из донора Тклеток в лимфатических узлах некастрированных мышей (фиг. 23). Спустя две недели после восстановления фетальной печени происходящие из донора миелоидные и лимфоидные дендритные клетки были
обнаружены при контрольных уровнях у некастрированных и кастрированных мышей (фиг. 23А и В,
соответственно). Спустя четыре недели после обработки число происходящих из донора миелоидных
дендритных клеток падало ниже контроля, однако, число лимфоидных дендритных клеток оставалось
неизмененным.
Общее обсуждение примеров
Авторы изобретения показали, что тимус у старых мышей, хотя и подвергшийся тяжелой атрофии,
сохраняет его функциональную способность с возрастом, причем пролиферация, дифференцировка и
миграция Т-клеток происходит на уровнях, эквивалентных уровням молодой взрослой мыши. Хотя
функция тимуса регулируется несколькими комплексными взаимодействиями между нейро-эндокринноиммунными осями, атрофия, индуцированная продукцией половых стероидных гормонов, оказывает
наиболее существенные и пролонгированные действия, иллюстрируемые степенью регенерации тимусом
после кастрации как лимфоидных, так и эпителиальных субпопуляций клеток.
Вес тимуса значимо уменьшается с возрастом, как показано ранее (Hirokawa and Makinodan, 1975,
Aspinall, 1997) и коррелирует со значимым уменьшением числа тимоцитов. Стресс, индуцируемый способом кастрации, который может привести к дополнительной атрофии тимуса вследствие действий кортикостероидов, преодолевается удалением влияний половых стероидов, причем тимус 2-недельных кастратов увеличивает его насыщенность клетками в 20-30 раз в сравнении с тимусом перед кастрацией. Через 3 недели после кастрации старый тимус обнаруживает значимое увеличение как размера тимуса, так
и числа клеток, превосходящее эти показатели тимуса молодых взрослых животных, предположительно
вследствие действий половых стероидных гормонов, уже проявляющих себя у 3-месячной мыши.
Данные авторов изобретения подтверждают предыдущие открытия, которые подчеркивают непрерывную способность тимоцитов дифференцироваться и поддерживать постоянные соотношения субпопуляций с возрастом (Aspinall, 1997). Кроме того, авторы показали, что дифференцировка тимоцитов
происходит одновременно после кастрации, что указывает на синхронную экспансию в субпопуляциях
тимоцитов. Поскольку числа тимоцитов значимо увеличиваются с возрастом, анализировали пролиферацию тимоцитов для определения, является ли она фактором, способствующим атрофии тимуса.
Пролиферация тимоцитов не испытывала действия индуцированной возрастом атрофии тимуса или
удаления влияний половых стероидов после кастрации, причем ~14% всех тимоцитов обнаруживали
пролиферацию. Однако локализация этого деления клеток различалась с возрастом: тимус 2-месячных
мышей обнаруживал изобилующее деление в субкапсулярной и корковой зонах (TN и DP Т-клетки) с
некоторым делением, происходящим также в медулле. Вследствие дезорганизации эпителия тимуса с
возрастом было трудно различить локализацию пролиферации, но, по-видимому, она была менее однородной по характеру, чем в молодом тимусе, и смещенной к наружной коре тимуса. Через 2 недели после
кастрации делящиеся тимоциты детектировались по всей коре и обнаруживались в медулле с распределением, сходным с распределением 2-месячного тимуса.
Фенотип пролиферирующей популяции, определяемый по анализу CD4 и CD8, не изменялся с возрастом или после кастрации. Однако, анализ пролиферации в субпопуляциях тимоцитов обнаружил значимое уменьшение пролиферации как TN-, так и CD8+ Т-клеток с возрастом. Дополнительный анализ в
субпопуляции TN на основе маркеров CD44 и CD25, выявил значимое уменьшение пролиферации TN1
(CD44+CD25-), которое компенсировалось увеличением популяции TN2 (CD44-CD25+). Эти аномалии в
популяции TN отражают открытия Aspinall (1997). Неожиданно субпопуляция TN пролиферировала при
нормальных уровнях через 2 недели после кастрации, свидетельствуя о немедленной реакции этой популяции на ингибирование действия половых стероидов. Дополнительно, как через 2 недели, так и через 4
недели после кастрации доля CD8+ Т-клеток, которые были пролиферирующими, заметно увеличивалась
в сравнении с контрольным тимусом, свидетельствуя, возможно, о роли в восстановлении пула периферических Т-клеток.
- 15 -
005573
Было показано, что миграция тимоцитов происходит при постоянном соотношении тимоцитов с
возрастом, что противоречит прежним данным Scollay et al. (1980), которые показали 10-кратное уменьшение скорости миграции тимоцитов в периферию. Различие в этих результатах может быть связано с
трудностями внутритимусного FITC-мечения тимусов 2-летних мышей или действиями отложения жира
на поглощение FITC. Однако, абсолютные числа мигрирующих Т-клеток значимо уменьшались, как показано Scollay, приводя к значимому уменьшению отношения RTE к пулу периферических Т-клеток. Это
будет приводить к изменениям в периферии с преимущественным влиянием на спектр Т-клеток (Mackall
et al., 1995). Прежние статьи (Mackall et al., 1995) показали искажение спектра Т-клеток с возрастом в
направлении фенотипа Т-клеток памяти, в сравнении с фенотипом «необученных» Т-клеток. Однако,
уменьшенный спектр Т-клеток может не справиться, если индивидуум встретится с новыми патогенами,
возможно, из-за повышения иммунодефицита у старых индивидуумов. Очевидно существует необходимость в восстановлении пула Т-клеток в индивидуумах с ослабленной иммунной системой. Кастрация
позволяет тимусу репопулировать периферию посредством значимого увеличения продуцирования необученных Т-клеток.
В периферии числа Т-клеток оставались на константном уровне, что доказывается соотношениями
В:Т-клеток селезенки и лимфатических узлов, предположительно вследствие периферического гомеостаза (Mackall et al., 1995; Berzins et al., 1998). Однако, нарушение клеточного состава в периферии было
очевидным, причем старый тимус обнаруживал значимое уменьшение в соотношениях CD4:CD8 с 2:1 у
молодых взрослых животных до 1:1 у 2-летней мыши, что, возможно, указывает на более чувствительную природу CD4+ Т-клеток в отношении возраста или на увеличение продуцирования CD8+ Т-клеток из
внетимусных источников. Через 2 недели после кастрации это отношение нормализовалось, что опять
отражает немедленную реакцию иммунной системы на хирургическую кастрацию.
Описанные выше открытия показали прежде всего, что старый тимус способен функционировать по
типу, эквивалентному функционированию препубертатного тимуса. В этом отношении, числа Т-клеток
значимо уменьшаются, но способность тимоцитов к дифференцировке не разрушается. Их общая способность пролиферировать и в конечном счете мигрировать к периферии также не подвергается влиянию
связанной с возрастом атрофии тимуса. Однако были отмечены два важных открытия. Во-первых, повидимому, существует вредное действие на TN Т-клетки в их способности пролиферировать, коррелирующее с открытиями Aspinall (1997). Этот дефект может быть отнесен к дефекту, присущему самим
тимоцитам. Тем не менее, данные авторов изобретения и предыдущие исследования показали, что дифференцировка тимоцитов, хотя и уменьшенная, все еще происходит, и вхождение стволовых клеток из
ВМ также не повреждается старением (Hirokawa, 1998; Mackall and Gress, 1997). Это предполагает, что
строма тимуса является мишенью для действия половых стероидных гормонов и вследствие этого действия происходит аномальная регуляция этой субпопуляции предшественников Т-клеток. Во-вторых, CD8+
Т-клетки значимо уменьшали их пролиферативную способность с возрастом, и, после кастрации, значимо увеличивалась доля пролиферированных CD8+ Т-клеток в сравнении с 2-месячной мышью. Считается, что пролиферация зрелых Т-клеток является конечной стадией перед миграцией (Suda and Zlotnik,
1992), так что значимое уменьшение пролиферации CD8+ Т-клеток может указывать уменьшение их миграционного потенциала. Эта гипотеза подтверждается открытием авторов изобретения, что отношение
CD4:CD8 Т-клеток в RTE увеличивалось с возрастом, свидетельствуя об уменьшении мигрирующих CD8
Т-клеток. Альтернативно, если эпителий тимуса обеспечивает ключевой фактор для поддержания CD8 Тклеток, будь это лимфостромальная молекула или влияние цитокина, этот фактор может быть разрушен
увеличенным продуцированием половых стероидов. Посредством удаления влияния половых стероидоа,
популяция CD8 Т-клеток может опять оптимально пролиферировать. Таким образом, необходимо определить, в деталях, статус эпителиальных клеток тимуса до и после кастрации.
Кора, по-видимому, спадается с возрастом вследствие отсутствия тимоцитов, доступных для экспансии сети эпителия. Наиболее разительным изменением в эпителии тимуса после кастрации была увеличенная сеть коркового эпителия, детектируемая по MTS 44, иллюстрирующая значимое увеличение
чисел тимоцитов. Через 2 недели после кастрации KNA являются обильными и, по-видимому, вмещают
пролиферирующие тимоциты, что указывает на то, что развитие тимоцитов происходит при более высокой скорости, чем скорость, с которой может справиться этот эпителий. Увеличение коркового эпителия
обусловлено, по-видимому, растяжением архитектуры тимуса, а не пролиферацией этого подтипа, так
как пролиферация эпителия не была замечена с BrdU-окрашиванием при помощи иммунофлуоресценции.
Медуллярный эпителий является нечувствительным к воздействиям возраста, наиболее вероятно,
вследствие меньшего числа Т-клеток, накапливающихся в этой зоне (>95% тимоцитов теряются на стадии DP (корковых Т-клеток) из-за событий отбора). Однако старый тимус обнаруживает тяжелое разрушение эпителиальных Т-клеток, различимое по отсутствию разграничения кортико-медуллярной границы с медуллярным эпителием, включающимся в корковый эпителий. Через 2 недели после кастрации
медуллярный эпителий, определяемый по окрашиванию MTS 10, до некоторой степени реорганизуется,
однако, субкарманы все еще присутствуют в корковом эпителии. Через 4 недели после кастрации корко- 16 -
005573
вый и медуллярный эпителий является полностью реорганизованным, с явной кортико-медуллярной границей, сходной с границей тимуса молодых взрослых животных.
Незначительные изменения наблюдали также после кастрации, наиболее очевидные в уменьшенной
экспрессии антигенов МНС класса II и гематотимусного барьера, в сравнении с тимусом перед кастрацией. Экспрессия MHCII (детектируемая по MTS6) увеличивается в старом тимусе, возможно, в связи с
уменьшением в контроле, развивающимися тимоцитами, вследствие их уменьшенных чисел. Альтернативно, это может быть обусловлено просто отсутствием маскирования тимоцитами, иллюстрируемым
также в тимусе после облучения (Randle and Boyd, 1992), который истощен по тимоцитам DP (корковым
Т-клеткам). Как только числа тимоцитов увеличиваются после кастрации, антигенсвязывающие сайты
опять блокируются накоплением тимоцитов, уменьшая таким образом детектирование при помощи иммунофлуоресценции. Антигены, детектирующие гематотимусный барьер (MTS12, 15 и 16) , опять увеличиваются в старом тимусе, а также обращаются до экспрессии в тимусе молодой взрослой мыши после
кастрации. Отсутствие маскирования тимоцитами и тесная близость антигенов вследствие атрофии тимуса могут объяснять это увеличение экспрессии. Альтернативно, развивающиеся тимоциты могут обеспечивать необходимые механизмы контроля над экспрессией этих антигенов, следовательно, когда они
являются истощенными, экспрессия не контролируется. Примордиальные эпителиальные антигены, детектируемые по MTS 20 и MTS 24, увеличиваются по их экспрессии в старом тимусе, но обращаются до
субкарманов эпителия при кортикомедуллярной границе после кастрации. Это указывает на отсутствие
сигналов для дифференцировки этого подтипа эпителиальных предшественников у старых мышей. При
удалении блока, налагаемого половыми стероидами, эти антигены могут дифференцироваться для экспрессии корковых эпителиальных антигенов.
Описанные выше открытия указывают на дефект в эпителии тимуса, делающий его неспособным
обеспечивать развивающиеся тимоциты необходимым стимулом для развития. Однако, симбиотическая
природа эпителия тимуса и тимоцитов затрудняет определение точного пути деструкции влияниями половых стероидных гормонов. Медуллярный эпителий требует корковых Т-клеток для его правильного
развития и поддержания. Таким образом, если эта популяция уменьшается, медуллярные тимоциты могут не получать адекватных сигналов для развития. По-видимому, это особенно действует на CD8+ популяцию. Мыши IRF-/- обнаруживают уменьшенное число CD8+ Т-клеток. Таким образом, представляло
интерес определение пролиферативной способности этих клеток.
Дефект в пролиферации субпопуляции TN1, который наблюдали, указывает на то, что потеря коркового эпителия влияет на развитие тимоцитов на решающей стадии реаранжировки гена TCR, посредством чего корковый эпителий обеспечивает факторы, такие как IL-7 и SCF, необходимые для тимопоэза
(Godfrey and Zlotnik, 1990; Aspinall, 1997) . Действительно, мыши IL-7-/- и IL-R-/-обнаруживают морфологию тимуса, сходную с морфологией, наблюдаемой у старых мышей (Wiles et al., 1992; Zlotnik and
Moore, 1995; von Freeden-Jeffry, 1995). Необходима дополнительная работа для определения изменений в
IL-7 и IL-7R с возрастом.
В заключение можно сказать, что старый тимус все еще сохраняет его функциональную способность, однако, тимоциты, которые развиваются у старых мышей, не находятся под строгим контролем
эпителиальных клеток тимуса, как это наблюдается у нормальной молодой мыши, вследствие отсутствия
структурной целостности микроокружения тимуса. Таким образом, пролиферация, дифференцировка и
миграция этих клеток не будут находиться при оптимальном регулировании и могут приводить к увеличенному высвобождению аутореактивных/иммунодисфункциональных Т-клеток в периферию. Дефекты
как в популяции TN, так и, в частности, CD8+ популяции, могут приводить к изменениям, наблюдаемым
в периферическом пуле Т-клеток с возрастом. Кроме того, авторы данного изобретения подробно описали действия кастрации на развитие и реорганизацию эпителиальных клеток тимуса. В настоящее время
исследуются механизмы, лежащие в основе атрофии тимуса, с использованием анализов связывания рецепторов стероидных гормонов, и роль субпопуляций эпителиальных клеток тимуса в регенерации тимуса после кастрации. Восстановление функции тимуса кастрацией обеспечит существенное средство для
регенерации пула периферических Т-клеток и, следовательно, восстановления иммунитета у индивидуумов с ослабленной иммунной системой.
Влияние кастрации на структуру тимуса и продуцирование Т-клеток исследовали в моделях иммуноистощения животных. Конкретно, пример 2 исследует действие кастрации на восстановление иммунной системы после сублетального облучения и обработки циклофосфамидом. Эти формы иммуноистощения действуют посредством ингибирования синтеза ДНК и, следовательно, поражают быстро делящиеся клетки. В тимусе этими клетками являются преимущественно незрелые корковые тимоциты, однако, действию подвергаются все субпопуляции (Fredrickson and Basch, 1994). У нормальных здоровых
старых мышей эти качественные и количественные отклонения в периферических Т-клетках редко приводят к патологическим состояниям. Однако основные проблемы возникают после тяжелого истощения
Т-клеток вследствие уменьшенной способности тимуса в отношении регенерации Т-клеток. Такие повреждения встречаются в ВИЧ/СПИДе и, в частности, после химиотерапии и лучевой терапии при лечении рака (Mackall et al. 1995).
- 17 -
005573
Как у сублетально облученных, так и у обработанных циклофосфамидом мышей кастрация заметно
усиливала регенерацию тимуса. Кастрацию проводили в тот же самый день и за семь дней перед иммуноистощением для оценки действия преимущественно индуцированной кортикостероидом, стрессовой
реакции на хирургическую кастрацию на регенерацию тимуса. Хотя увеличения насыщенности клетками
и архитектуры тимуса наблюдались уже через одну неделю после иммуноистощения, основные различия
наблюдались спустя две недели после кастрации. Они имели место независимо от того, проводилась ли
кастрация в тот же самый день или за неделю до иммуноистощения.
Иммуногистология показала, что во всех случаях спустя две недели после кастрации архитектура
тимуса казалась фенотипически нормальной, хотя архитектура некастрированных мышей была дезорганизованной. Панэпителиальные маркеры показали, что иммуноистощение вызывало коллапс в корковом
эпителии и общее разрушение архитектуры тимуса в тимусах некастрированных мышей. Это открытие
подтвердили медуллярные маркеры. Интересно, что одним из первых признаков индуцируемой кастрацией регенерации тимуса была явная повышающая регуляция во внеклеточном матриксе, идентифицируемом по антигену MTS 16.
Данные проточного цитометрического анализа показали значимое увеличение числа клеток во всех
субпопуляциях тимоцитов у кастрированных мышей, в соответствии с иммунофлуоресценцией. В каждой временной точке было синхронное увеличение всех CD4, CD8 и αβ-TCR-определяемых субпопуляциях после иммуноистощения и кастрации. Это является необычным, но постоянным результатом, так
как развитие Т-клеток является прогрессирующим процессом, и ожидалось, что могло бы быть первоначальное увеличение клеток-предшественников (содержащихся в популяции, получаемой с дискриминирующим окном возбуждения флуоресценции сортера для CD4-CD8- Т-клеток), и это могло происходить
до первой временной точки. Кроме того, поскольку предшественники представляют очень малую долю
общих тимоцитов, смещение в их числе может быть недетектируемым. Анализировали также действия
кастрации на другие клетки, в том числе макрофаги и гранулоциты. В целом, было небольшое изменение
чисел макрофагов и гранулоцитов в тимусе.
Как в модели с облучением, так и в модели с циклофосфамидом иммуноистощение чисел тимоцитов было максимальным через две недели и уменьшалось через четыре недели после обработки. Почти
сразу после облучения или химиотерапии вес и насыщенность клетками тимуса уменьшались очень
сильно, и спустя приблизительно 5 дней начиналась первая фаза регенерации тимуса. Первая волна восстановления (дни 5-14) вызывалась пролиферацией устойчивых к облучению (радиоустойчивых) тимоцитов (преимущественно дважды-негативных), которые приводят к увеличению чисел всех субпопуляций тимоцитов (Penit and Ezine 1989) . Второе уменьшение, наблюдаемое между днями 16 и 22, было
вызвано ограниченной пролиферативной способностью радиоустойчивых клеток, связанной с уменьшенным продуцированием тимусных клеток-предшественников костным мозгом (также пораженным
облучением). Вторая фаза регенерации была обусловлена пополнением тимуса происходящими из костного мозга предшественниками (Huiskamp et al. 1983).
Важно отметить, что у взрослых мышей развитие из HSC до зрелой Т-клетки занимает приблизительно 28 дней (Shortman et al., 1990). Таким образом, неудивительно, что малое изменение наблюдалось
в периферических Т-клетках до четырех недель после обработки. Периферия могла бы поддерживаться
некоторым экспортом из тимуса, но можно было бы ожидать, что большинство Т-клеток, обнаруживаемых в периферии до четырех недель после обработки, являются пролиферирующими устойчивыми к
циклофосфамиду или облучению клонами, развивающимися в отсутствие истощенных клеток. Несколько долгосрочных изменений в периферии могли бы ожидаться после кастрации, в том числе, что наиболее важно, образование разностороннего спектра TCR вследствие увеличения тимусного экспорта. Кастрация не влияла на периферическое выделение других лейкоцитов, в том числе В-клеток, макрофагов и
гранулоцитов.
Пример 4 показывает влияние кастрации на трансплантацию сингенного и конгенного костного
мозга. Starzl et al. (1992) сообщили, что микрохимеры, обнаруживаемые в лимфоидной и нелимфоидной
ткани, были хорошим прогностическим признаком для трансплантации аллотрансплантата. Т.е постулировалось, что они были необходимы для индукции толерантности к этому трансплантату (Starzl et al.
1992). Происходящие из донора дендритные клетки присутствовали в этих химерах, и считается, что они
играют существенную роль в элиминации отторжения трансплантата (Thomson and Lu, 1999). Известно,
что дендритные клетки является ключевыми факторами в процессах негативного отбора тимуса, и, если
происходящие из донора дендритные клетки присутствуют в тимусе реципиента, могут быть делетированы трансплантат-реактивные Т-клетки.
Для определения, способна ли кастрация увеличивать образование химер, проводили исследование
с использованием трансплантации сингенной фетальной печени. Результаты показали усиленную регенерацию тимусов кастрированных мышей. Эти тенденции наблюдались опять, когда повторяли эти эксперименты с использованием конгенных (Ly5) мышей. Благодаря присутствию конгенных маркеров
можно оценить химерный статус этих мышей. Спустя всего лишь 2 недели после восстановления фетальной печени в тимусе детектировались происходящие из донора дендритные клетки, причем числа их
у кастрированных мышей были в четыре раза более высокими, чем их числа у некастрированных мышей.
- 18 -
005573
Спустя четыре недели после восстановления некастрированные мыши, по-видимому, не были восстановлены происходящими из донора клетками, что позволяет предположить, что кастрация может действительно увеличивать возможность образования химер. При условии, что кастрация увеличивает не только
регенерацию тимуса после летального облучения и восстановление фетальной печени, но и увеличивает
также число происходящих из донора дендритных клеток в тимусе, наряду с трансплантацией стволовых
клеток, этот подход увеличивает вероятность приживления трансплантата.
Все упомянутые в приведенном выше описании публикации включены здесь в качестве ссылки.
Специалистам с квалификацией в данной области будут очевидны разнообразные модификации и вариации описанных способов и системы данного изобретения без отклонения от объема и сути данного изобретения. Хотя данное изобретение было описано в связи с конкретными предпочтительными вариантами, должно быть понятно, что данное изобретение, как оно заявлено здесь, не должно быть чрезмерно
ограничено такими конкретными вариантами. Фактически предполагается, что различные модификации
описанных способов для проведения данного изобретения, которые является очевидными специалистам
в области молекулярной биологии и родственных областях, находятся в рамках следующей формулы
изобретения.
Ссылки
Aspinall, R. 1997. Age-associated thymic atrophy in the mouse is due to a deficiency affecting rearrangement of the TCR during intrathymic T cell development. J. Immunol. 158:3037.
Berzins, S.P., Boyd, R.L. and Miller, J.F.A.P. 1998. The role of the thymus and recent thymic migrants in
the maintenance of the adult peripheral lymphocyte pool. J. Exp. Med. 187:1839.
Boyd, R.L., Tucek, C.L., Godfrey, D.I., Wilson, T.J, Davidson, N.J., Bean, A.G.D., Ladyman, H.M., Ritter,
M.A. and Hugo, P. 1993. The thymic microenvironment Immunology Today 14:445.
Bruijntjes, J.P., Kuper, C.J., Robinson, J.E. and Schutirman, H.J. 1993. Epithelium-free area in the thymic
cortex of rats. Dev. Immunol. 3:113.
Carayon, P., and Bord, A. 1992. Identification of DNA-replicating lymphocyte subsets using a new method
to label the bromo-deoxyuridine incorporated into the DNA. J. Imm. Methods 147:225.
Douek, D.C., McFarland, R.D., Keiser, P.H., Gage, E.A., Massey, J.M., Haynes, B.F., Polis, M.A., Haase,
А.Т., Feinberg, M.B., Sullivan, J.L., Jamieson, B.D., Zack, J.A., Picker, L.J. and Koup, R.A. 1998. Changes in
thymic function with age and during the treatment of HIV infection. Nature 396:690.
Fredrickson, G.G. and Basch, R.S. 1994. Early thymic regeneration after irradiation. Development and
Comparative Immunology 18:251.
George, A. J. and Ritter, M.A. 1996. Thymic involution with ageing: obsolescence or good housekeeping?
Immunol. Today 17:267.
Godfrey, D.I, Izon, D.J., Tucek, C.L., Wilson, T.J. and Boyd, R.L. 1990. The phenotypic heterogeneity of
mouse thymic stromal cells. Immunol. 70:66.
Godfrey, D. I, and Zlotnik, A. 1993. Control points in early T-cell development Immunol. Today 14:547.
Hirokawa, K. 1998. Immunity and Ageing. In Principles and Practice of Geriatric Medicine. M. Pathy, ed.
John Wiley and Sons Ltd.
Hirokawa, K. and Makinodan, T. 1975. Thymic involution: the effect on T cell differentiation. J. Immunol.
114:1659.
Hirokawa, K., Utsuyama M., Kasai, M., Kurashima, C, Ishijima, S. and Zeng, Y.-X. 1994. • Understanding
the mechanism of the age-change of thymic function to promote T cell differentiation. Immunology Letters
40:269.
Hobbs, M.V., Weigle, W.O., Noonan, D.J., Torbett, B.E., McEvilly, R.J., Koch, R.J., Cardenas, G.J. and
Ernst, D.N. 1993. Patterns of cytokine gene expression by CD4+ T cells from young and old mice. J. Immunol.
150:3602.
Homo-Delarche, R. and Dardenne, M. 1991. The neuroendocrine-immune axis. Seminars in Immunopathology,
Huiskamp, R., Davids, J.A.G. and Vos, О. 1983. Short- and long- term effects of whole body irradiation
with fission neutrons or x-rays on the thymus in CBA mice. Radiation Research 95:370.
Kendall, M.D. 1988. Anatomical and physiological factors influencing the thymic microenvironment. In
Thymus Update I, Vol. 1. M. D. Kendall, and M. A. Ritter, eds. Harwood Academic Publishers, p. 27.
Kurashima, C, Utsuyama, M., Kasai, M., Ishijima, S.A., Konno, A. and Hirokawa, A. 1995. The role of
thymus in the aging of Th cell subpopulations and age-associated alteration of cytokine production by these
cells. Int. Immunol. 7:97.
Mackall, C.L. et. al. 1995. Age, thymopoiesis and CD4 + T-lymphocyte regeneration after intensive chemotherapy. New England J. Med, 332:143.
Mackall, C.L. and Gress, R.E. 1997. Thymic aging and T-cell regeneration. Immunol. Rev. 160:91.
Penit, С and Ezine, S. 1989. Cell proliferation and thymocyte subset reconstitution in sublethally irradiated
mice: compared kinetics of endogenous and intrathymically transferred progenitors. Proc. Natl. Acad. Sci,
U.S.A. 86:5547.
- 19 -
005573
Penit, C, Lucas, В., Vasseur, F., Rieker, T. and Boyd, R.L. 1996. Thymic medulla epithelial cells acquire
specific markers by post-mitotic maturation. Dev, Immunol. 5:25.
Plosker, G.L. and Brogden, R.N. 1994. Leuprorelin. A review of its pharmacology and therapeutic use in
prostatic cancer, endometriosis and other sex hormone-related disorders. Drugs 48:930.
Randle-Barrett, E.S. and Boyd, R.L. 1994. Thymic microenvironment and lymphoid responses to sublethal
irradiation. Dev. Immunol. 4:1.
Scollay, R.G., Butcher, E.G. and Weissman, I.L. 1980. Thymus cell migration. Quantitative aspects of
cellular traffic from the thymus to the periphery in mice. BUT. J. Immunol. 10:210.
Shortman, K., Egerton, M., Spangrude, G.J. and Scollay, R. 1990. The generation and fate of thymocytes.
Seminars in Immuno. 2:3.
Starzl, Т.Е.,.Demetris, A.J., Murase, N., Ricardi, C. and Truce, M. 1992. Cell migration, chimerism, and
graft acceptance. Lancet 339:1579.
Suda, Т., and Zlomik, A. 1991. IL-7 maintains the T cell precursor potential of CD3-CD4-CD8- thymocytes. J. Immunol. 146:3068.
Timm, J.A. and Thoman, M.L. 1999. Maturation of CD4+ lymphocytes in the aged microenviroment results in a memory-enriched population. J. Immunol. 162:711.
Thomson, A.W. and Lu, L. 1999. Are dendritic cells the key to liver transplant? Immunology Today 20:20.
Tosi, R., Kraft, R., Luzi, P., Cintorino, M., Fankhause, G., Hess, M.W. and Cottier, Н. 1982. Involution
pattern of the human thymus. 1. Size of the cortical area as a function of age. Clin. Exp. Immunol. 47:497.
van Ewijk, W., Rouse, R.V. and Weissman, I.L. 1980. Distribution of H-2 microenvironments in the mouse
thymus. J. Histochem. Cytochem. 28:1089.
von Freeden-Jeffry, U., Vieira, P., Lucian, L.A., McNeil, Т., Burdach, E.G. and Murray, R. 1995. Lymphopenia in interleukm (IL)-7 gene-deleted mice identifies IL-7 as a nonredundant cytokine. J. Exp. Med.
181:1519.
Wiles, M.V., Ruiz, P. and Imhof, B.A. 1992. Interleukin-7 expression during mouse thymus development.
Eur. J. Immunol. 22:1037.
Zlotnik, A. and Moore, T.A. 1995. Cytokine production and requirements during T-cell development. Curr.
Opin. Immunol. 7:206.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Способ лечения или предотвращения Т-клеточного нарушения у субъекта, где способ предусматривает разрушение передачи сигналов половых стероидных гормонов у этого субъекта и введение субъекту костного мозга или гемопоэтических стволовых клеток (HSC).
2. Способ по п.1, где Т-клеточное нарушение выбрано из группы, состоящей из вирусных инфекций, Т-клеточно-пролиферативного заболевания и любого заболевания, которое вызывает уменьшение
числа Т-клеток или функции Т-клеток.
3. Способ по п.2, где вирусная инфекция является инфекцией вируса иммунодефицита человека.
4. Способ по п.1, где Т-клеточное нарушение представляет собой лейкемию и/или имеет определенную генетическую основу.
5. Способ по любому из пп.1-4, где HSC генетически модифицируют до введения субъекту.
6. Способ по п.5, где генетическая модификация предусматривает введение по меньшей мере одной
молекулы нуклеиновой кислоты, которая предотвращает вирусную репликацию, сборку и/или инфицирование.
7. Способ по п.5 или 6, где генетическая модификация HSC передается на клетки их потомства.
8. Способ по п.5, где HSC генетически модифицируют таким образом, что HSC и их потомство являются устойчивыми к инфекции и/или деструкции вирусом ВИЧ.
9. Способ по любому из пп.5-8, где генетическая модификация предусматривает введение в HSC
одной или нескольких молекул нуклеиновых кислот, выбранных из группы, состоящей из молекулы нуклеиновой кислоты, которая кодирует антивирусный белок, антисмысловой конструкции, рибозима,
dsPHK и каталитической молекулы нуклеиновой кислоты.
10. Способ по любому из пп.1-9, где HSC являются гетерологичными или аутологичными.
11. Способ модификации вида популяции Т-клеток или увеличения числа Т-клеток у субъекта,
имеющего депрессированную или атипичную Т-клеточную популяцию или функцию, где способ предусматривает разрушение передачи сигналов половых стероидных гормонов у этого субъекта.
12. Способ по п.11, где модификации вида популяции Т-клеток характеризуется изменением природы и/или соотношения популяции Т-клеток, определяемого функционально и/или по экспрессии характеристических молекул, где характеристические молекулы выбраны из группы, состоящей из рецептора
Т-клетки, CD4, CD8, CD3, CD25, CD28, CD44, CD62L и CD69.
13. Способ по п.11 или 12, где увеличение числа Т-клеток у субъекта проявляется в относительном
увеличении числа Т-клеток по сравнению с другими лимфоидными клетками.
- 20 -
005573
14. Способ по любому из пп.11-13, где общее и/или относительное количество периферических
CD25 + CD8 + Т-клеток у субъекта увеличено.
15. Способ по любому из пп.11-14, где общее и/или относительное количество необученных Тклеток у субъекта увеличено.
16. Способ по любому из пп.11-15, где различия Т-клеточных рецепторов увеличено.
17. Способ по любому из пп.11-16, где тимусный выброс увеличен.
18. Способ по любому из пп.11-17 для лечения или предотвращения рака у субъекта, где субъект
подвергся или будет подвергаться химиотерапии и/или лучевой терапии.
19. Способ по любому из пп.11-17 для лечения или предотвращения состояния, вызванного инфекционным агентом.
20. Способ по п.19, где инфекционный агент является вирусом иммунодефицита человека.
21. Способ по п.20, где способ предусматривает снижение вирусной нагрузки, разрушение передачи
сигналов половых стероидных гормонов и перенос субъекту генетически модифицированных HSC.
22. Способ по п.19, где инфекционный агент не является вирусом иммунодефицита человека.
23. Способ продуцирования у субъекта химерных клеток хозяина и донора, где способ предусматривает разрушение передачи сигналов половых стероидных гормонов и трансплантацию клеток субъекту
от донора.
24. Способ по п.23, где клетки донора являются лимфоидными клетками или их предшественниками.
25. Способ по п.24, где лимфоидные клетки являются Т-клетками и/или дендритными клетками.
26. Способ по п.23, где клетки донора являются гемопоэтическими клетками-предшественниками.
27. Способ по любому из пп.23-26, где Т-клетки субъекта истощены.
28. Способ по любому из пп.23-27 для усиления приживаемости трансплантанта у субъекта, где
способ дополнительно включает трансплантирование клеток и/или органа от донора субъекту.
29. Способ по любому из пп.23-27 для увеличения числа донорских производных дендритных клеток у субъекта, где способ предусматривает разрушение передачи сигналов половых стероидных гормонов и трансплантацию субъекту от донора дендритных клеток или их предшественников.
30. Способ по п.29, где число донорских производных дендритных клеток в тимусе у субъекта увеличено.
31. Способ увеличения иммунного ответа на антиген у субъекта, где способ предусматривает разрушение передачи сигналов половых стероидных гормонов и введение антигена, где антиген не приводит к иммунному ответу, который разрушает передачу сигналов половых стероидных гормонов.
32. Способ по п.31, где антиген представляет собой HSV антиген.
33. Способ по любому из пп.1-32, в котором разрушена передача сигналов половых стероидов к тимусу.
34. Способ по любому из пп.1-33, в котором разрушение передачи сигналов половых стероидов
достигается либо кастрацией, либо введением аналога (аналогов) полового стероидного гормона.
35. Способ по п.34, в котором аналог полового стероидного гормона выбран из группы, состоящей
из эулексина, производных диоксалана и аналогов гормона, высвобождающего лютеинизирующий гормон.
36. Способ по п.35, в котором аналог полового стероидного гормона выбран из группы, состоящей
из трипторелина, метерелина, бусерелина, гистрелина, нафарелина, лутрелина, лейпрорелина, госерелина, лейпролида и деслорелина.
37. Способ по любому из пп.1-36, в котором субъект является постпубертатным.
38. Применение соединения, которое разрушает передачу сигналов половых стероидных гормонов
для производства лекарственного средства для лечения или предотвращения Т-клеточного нарушения у
субъекта.
39. Применение соединения, которое разрушает передачу сигналов половых стероидных гормонов
для производства лекарственного средства для модификации вида популяции Т-клеток или увеличения
числа Т-клеток у субъекта, имеющего депрессированную или атипичную Т-клеточную популяцию или
функцию.
40. Применение соединения, которое разрушает передачу сигналов половых стероидных гормонов
для производства лекарственного средства для продуцирования химерных клеток хозяина и донора у
субъекта.
41. Применение соединения, которое разрушает передачу сигналов половых стероидных гормонов
для производства лекарственного средства для увеличения иммунного ответа на антиген у субъекта, где
субъекту водят указанное соединение и антиген, где антиген не приводит к иммунному ответу, который
разрушает передачу сигналов половых стероидных гормонов.
- 21 -
005573
Фиг. 1
Фиг. 2
- 22 -
005573
Фиг. 3
Фиг. 4.1
Фиг. 4.2
- 23 -
005573
Фиг. 5
Фиг. 6
- 24 -
005573
Фиг. 7
Фиг. 8
- 25 -
005573
Фиг. 9
Фиг. 10
- 26 -
005573
Фиг. 11
Фиг. 12
- 27 -
005573
Фиг. 13
Фиг. 14
- 28 -
005573
Фиг. 15
Фиг. 16
- 29 -
005573
Фиг. 17
Фиг. 18
- 30 -
005573
Фиг. 19
Фиг. 20
- 31 -
005573
Фиг. 21
Фиг. 22
- 32 -
005573
Фиг. 23
Евразийская патентная организация, ЕАПВ
Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2/6
- 33 -