На правах рукописи Корникова Евгения Сергеевна РОЛЬ МЕХАНО
advertisement
На правах рукописи Корникова Евгения Сергеевна РОЛЬ МЕХАНО-ГЕОМЕТРИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ В ПРОСТРАНСТВЕННОЙ ОРГАНИЗАЦИИ ОСЕВЫХ ДИФФЕРЕНЦИРОВОК У ЗАРОДЫШЕЙ ШПОРЦЕВОЙ ЛЯГУШКИ 03.03.05 – биология развития, эмбриология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва – 2010 Работа выполнена на кафедре эмбриологии биологического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова Научный руководитель: доктор биологических наук Белоусов Лев Владимирович Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова, Москва Официальные оппоненты: доктор биологических наук Васецкий Сергей Григорьевич Институт биологии развития имени Н.К. Кольцова РАН, Москва доктор биологических наук Зарайский Андрей Георгиевич Институт биоорганической химии имени академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Москва Ведущая организация: Санкт-Петербургский университет государственный Защита состоится 21 декабря 2010 года в 15 час 30 мин на заседании диссертационного совета Д.501.001.52 при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, д.1, стр.12, Биологический факультет МГУ, аудитория М-1. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова Автореферат разослан «…» 2010 г Ученый секретарь Диссертационного Совета, кандидат биологических наук Е.Н. Калистратова 2 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Вопросы, связанные с механизмами формирования осевых структур организма в период раннего эмбриогенеза, являются важнейшими вопросами классической биологии развития. На сегодняшний день на модели зародышей амфибий показано, что разметка будущих осевых структур обеспечивается благодаря возникающим еще до начала гаструляции градиентам растворимых факторов, таких как noggin, chordin, follistatin, BMP и др. [De Robertis et al., 2009]. Кроме того, важную роль в данных процессах играют клеточные движения конвергентной интеркаляции, основным центром которых является область, расположенная над дорсальной губой бластопора, или супрабластопоральная область (СБО). Движения конвергентной интеркаляции совершаются клетками зародыша в направлении, перпендикулярном средней линии СБО, и приводят к его продольному вытяжению. При этом если бы к началу гаструляции направление клеточной дифференцировки было определено окончательно, функция данных движений сводилась бы лишь к распределению клеток, в зависимости от их свойств, в пределах организма. Однако, судя по результатам ряда работ [Beloussov et al., 1988; Keller and Danilchik, 1988; Zaraisky, 1991], в действительности ситуация представляется значительно сложнее, а вопрос о том, каким образом определяется направление интеркаляционных движений, все еще остается открытым. Относительно новой областью в биологии развития стало исследование механических факторов, которые, как показано в многочисленных исследованиях [Reilly and Engler, 2010; Farge, 2003; Beloussov et al., 2006; Yang et al., 2000; Allioux-Guerin et al., 2009 и др.], наряду с химическими участвуют в пространственной организации и дифференцировке клеточных структур. Моделью в таких работах служат как отдельные клеточные культуры, так и развивающиеся организмы в целом. При этом клетка рассматривается как механически напряженная система, способная оказывать силовое воздействие на окружающие структуры, а также воспринимать подобный сигнал извне [Mammoto and Ingber, 2009]. В настоящее время описаны пути передачи силового сигнала с поверхности клетки или его создания самой клеткой, а также взаимосвязь этих процессов с генетической экспрессией [Wang et al., 2009]. В связи с вышеизложенным, большой научный интерес представляет экспериментальное изучение роли механо-геометрических изменений, сопровождающих развитие организма и дифференцировку его клеток. Исследования по передаче клетками механических сигналов имеют не только фундаментальное, но и прикладное значение. Во-первых, нарушения данных систем могут служить причинами разного рода патологий [Ingber, 2003], в том числе заболеваний сердечнососудистой системы, нарушений опорно-двигательного аппарата, онкологической 3 трансформации и др. Кроме того, продемонстрирована решающая роль механических условий при определении направления дифференцировки стволовых клеток [McBeath et al., 2004]. Основной задачей настоящей работы было исследование классических вопросов биологии развития, связанных с дифференцировкой осевых зачатков, принимая во внимание возможную роль механических факторов в регуляции данных процессов. Хорошо известно, что начальные этапы формирования осевых зачатков сопровождаются сложной структурной реорганизацией тканей зародыша. В первую очередь, это латеро-медиальная интеркаляция клеток и интенсивное продольное вытяжение нейроэктодермы, хордомезодермы и мезодермы сомитов. Во-вторых, это последовательные активные и пассивные сокращения и растяжения участков данных тканей в ходе образования нервной трубки [Jacobson and Gordon, 1976]. Касательно первой группы процессов необходимо отметить исследования, в которых наблюдали нарушения упорядоченности осевых структур у зародышей амфибий вследствие релаксации напряжений на стадии гаструлы [Beloussov et al., 1994], а также переориентацию интеркаляционных движений в ответ на искусственное растяжение СБО в направлении, перпендикулярном передне-заднему [Beloussov et al., 1988]. Относительно второй группы процессов, в научных публикациях не раз встречались свидетельства формирования у различных экспериментальных образцов нейральных закладок в направлении вогнутых и, возможно, подвергавшихся сжатию областях, а мезодермальных – в направлении выпуклых, возможно, подвергавшихся растяжению [Spemann et al., 1936; Saxen and Toivonen, 1963; SaintJeannet et al., 1994 и др.]. Данные наблюдения порождают вопрос о зависимости дифференцировки тканей осевых структур от механо-геометрических условий, в которых находятся их клетки-предшественники. В частности, важно выяснить, какова роль механических факторов при определении направлений движений конвергентной интеркаляции и взаимного расположения и ориентации осевых зачатков в пространстве. В качестве удобной модели для изучения и оценки молекулярных и физических факторов, участвующих в морфогенезе и дифференцировке клеток, в экспериментальной эмбриологии успешно используется зародыш шпорцевой лягушки Xenopus laevis. С одной стороны, для данного объекта разработан обширный ряд методик, позволяющих исследовать эти процессы. С другой стороны, в силу высокого консерватизма базовых механизмов раннего эмбриогенеза, результаты, полученные на Xenopus, могут быть в той или иной степени перенесены на других представителей группы позвоночных. 4 Цели и задачи исследования. I. Выяснение роли механических напряжений при определении направления клеточных движений конвергентной интеркаляции, а также пространственной ориентации осевых дифференцировок на модели зародышей шпорцевой лягушки X. laevis с релаксированной СБО. II. Изучение зависимости характера перемещения и изменения формы клеток, а также взаимного расположения нейро-мезодермальных закладок от сжатого/растянутого состояния участка СБО на модели изогнутых двойных эксплантатов СБО зародышей шпорцевой лягушки X. laevis. Исходя из I цели, были сформулированы следующие задачи: 1. Оценка основных градиентов механических напряжений у зародышей после релаксации СБО. 2. Наблюдение за направлением движений конвергентной интеркаляции у зародышей с релаксированной СБО. 3. Изучение расположения осевых дифференцировок (определяемых по паттернам экспрессии тканеспецифичных генов и гистологически) у зародышей с релаксировнной СБО. Для достижения II цели работы были поставлены следующие задачи: 1. Оценка изменения напряжения на поверхности изогнутых двойных эксплантатов СБО по сравнению с интактными (неизогнутыми). 2. Исследование активных клеточных реакций (таких, как изменение формы или перегруппировка) в ответ на искусственную деформацию двойных эксплантатов СБО. 3. Изучение расположения осевых дифференцировок (определяемых по паттернам экспрессии тканеспецифичных генов и гистологически) в изогнутых и интактных двойных эксплантатах СБО. Научная новизна работы. Впервые на зародышах шпорцевой лягушки показано, что направления движений конвергентной интеркаляции клеток на стадии гаструлы зависят от полей механических напряжений. В результате релаксации СБО, которая сопровождалась перемещением основного узла натяжений с дорсальной на вентральную губу бластопора, интеркаляционные движения наблюдались не в СБО, как при нормальном развитии, а в направлении вентральной средней линии и в области боковых губ – в направлении возникших после релаксации основных градиентов натяжений. Также впервые с помощью современных молекулярно-биологических методов показано, что полнота и упорядоченность осевых дифференцировок четко коррелирует с ориентацией клеточных движений и, прежде всего, с конвергенцией клеток к некоторой оси. В СБО 5 подавление данных движений нарушало формирование хорошо развитых и четко ориентированных осевых структур. Возникновение интеркаляционных движений в боковых губах, напротив, этому способствовало. Таким образом, конвергентная интеркаляция клеток осуществляется перпендикулярно основным градиентам натяжений и это определяет ориентацию и нормальный морфогенез осевых зачатков. Кроме того, мезодермальных впервые исследовали дифференцировок от зависимость взаимного сжатого/растянутого расположения состояния нейро- участков СБО. Показано, что искусственное растяжение или сжатие участков СБО может в течение достаточно коротких временных сроков вызывать активный ответ (в частности, изменение формы или перемещение) со стороны их клеток. Такие краткосрочные реакции сопровождались на более поздних сроках изменением классического распределения нейральных и мезодермальных закладок: наблюдали статистически значимое преимущественное расположение нейральных дифференцировок на вогнутых, подвергавшихся сжатию, сторонах. В свою очередь, мезодермальные закладки формировались в направлении выпуклых, подвергавшихся растяжению, областей, подковообразно огибая нейральные. Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были доложены на Междунородной конференции Европейского общества исследователей в области эволюции и эмбриологии «3rd Euro Evo Devo Conference» (Париж, 2010), Международной конференции по морфогенезу и клеточному поведению «Morphogenesis and cell behavior» (Барселона, 2008), Международной конференции, посвященной клеточной подвижности «Biological motility: achievements and perspectives» (Пущино, 2008), Международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам "Ломоносов" (Москва, 2009), XV Школе «Актуальные проблемы биологии развития» (Звенигород, 2008), Симпозиуме с международным участием «Клеточные, молекулярные и эволюционные аспекты морфогенеза» (Москва, 2007). Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ, включая 3 журнальные статьи. Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения и выводов, изложена на 102 страницах машинописного текста, содержит 33 рисунка и 5 таблиц. Список литературы включает 117 работ. 6 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Эксперименты проводили на зародышах шпорцевой лягушки (Xenopus laevis Daudin). Использовали стандартные растворы для инкубации (10%, 100% MMR, pH 7,4). Микрохирургические операции проводили на стадиях 10,5-11 (ранняя-средняя гаструла) [Nieuwkoop and Faber, 1967]. Проводили следующие варианты операций: 1. У зародыша вырезали собственный участок СБО (3-4 клеточных слоя), а вместо него немедленно (через несколько секунд) трансплантировали в то же положение без поворота (ортотопная трансплантация, ретрансплантация) такой же участок с меченого флуоресцеиндекстран амином (ФДА) зародыша той же стадии. 2. Вырезали участки СБО и соединяли их по 2 внутренними поверхностями так, чтобы передне-задняя полярность совпадала. Полученные двойные эксплантаты через 20-30 мин сгибали параллельно или перпендикулярно передне-задней оси, а затем не менее 3 ч инкубировали в агарозных лунках подковообразной формы. Оперированные зародыши и двойные эксплантаты инкубировали до 24 ч, затем фиксировали с целью гистологической обработки или проведения гибридизации in situ [Harland, 1991]. Тестирование механических напряжений проводили с помощью классического метода надсечений [Beloussov et al., 1975]. Для отслеживания кратковременных клеточных перемещений на дорсальную и на вентральную области оперированных и интактных зародышей наносили взвесь угольных частиц диаметром 5-15 мкм, а затем прослеживали за взаимными перемещениями пар надежно «узнаваемых» угольных меток и измеряли расстояния между ними. Коэффициенты анизотропии (АК) рассчитывали как отношение расстояния между метками, расположенными на продольной оси зародыша, к расстоянию между метками, расположенными на поперечной оси. Нормализованные АК получали, приняв их начальное значение за 1. За ∆АК принимали разность между нормализованными величинами АК в конце и начале выбранных временных периодов. Апикальные индексы клеток рассчитывали как отношение максимальной длины клетки к величине её апикального диаметра [Lee and Harland, 2007]. Расчеты проводили для не менее чем 10 отдельных клеток на 5 срезах каждого образца. Брали по 2-5 образцов для каждого случая. Для морфометрических измерений использовали программу ImageJ. Оценку асимметричности экспрессии генов проводили следующим образом. Изображение образца разделяли на две части при помощи средней линии, проведенной на равном расстоянии от их правой и левой поверхностей. Затем в относительных единицах измеряли площадь (S1 и S2, соответственно) экспрессии гена на противоположных частях, разделенных средней линией. Индекс асимметрии (А) вычисляли (в процентах) по следующей формуле: А=(S1-S2)/(S1+S2) ) × 100 7 Для изогнутых образцов за S1 принимали относительную площадь экспрессии гена Sox3 на той части эксплантата, которая расположена между средней линией и его вогнутой поверхностью. Для статистической оценки количественных результатов использовали программу Statistica 6.0, модуль Basic Statistics. Для оценки значимости результатов использовали критерий знаков [Van der Waerden, 1957]. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ I. Результаты ортотопной трансплантации СБО у зародышей шпорцевой лягушки на стадии ранней-средней гаструлы. 1.1 Изменения паттернов механических напряжений, вызванных ортотопной трансплантацией СБО. Показано, что существенным следствием операции по ортотопной трансплантации СБО была релаксация, а затем восстановление механических напряжений в маргинальной зоне (зоне, расположенной по периметру бластопора). Это сопровождалось перемещением основного узла натяжений, при нормальном развитии локализованного в СБО, на вентральную губу. Релаксация маргинальной зоны подтверждается, во-первых, формированием меньших по размеру щелей и углов отгиба надсеченной ткани у зародышей через 2-3 мин после нанесения надрезов на СБО по сравнению с интактными. Во-вторых, об этом свидетельствует очень быстрое (скорости клеток в несколько раз превышали скорости морфогенетических движений [Keller and Danilchik, 1988]) поперечное сокращение поверхностей дорсальной (Табл. 1, столбец «0-1 мин», строка 1) и вентральной (строка 3) областей. Восстановление напряжений в маргинальной зоне уже через 30 мин после ортотопной трансплантации СБО, а также тот факт, что на вентральной стороне после операции они превышали исходные, подтверждается формированием больших по размеру щелей и более интенсивного отгиба ткани на этих сроках. Продолжительность (более часа) сокращения вентральной поверхности у оперированных зародышей (Табл. 1, столбец «5-60 мин», строка 3) и отсутствие подобных процессов у интактных (Табл. 1, строка 7) свидетельствует о том, что это сокращение является активным клеточным ответом на предшествующую релаксацию. Данные результаты согласуются с гипотезой гипервосстановления механических напряжений [Beloussov and Grabovsky, 2006], согласно которой любое локальное изменение напряжения на поверхности зародыша вызывает активную ответную реакцию, направленную на его восстановление, причем, как правило, с превышением исходного. Коэффициенты анизотропии, рассчитанные во временном интервале от 5 до 105 мин после операции, подтверждают данные выводы (Табл. 2). В области релаксированных СБО нормальный анизотропный рост практически прекращался, что также наблюдалось на 8 вентральной стороне интактных зародышей. В свою очередь, на вентральной стороне оперированных зародышей, так же как и на дорсальной стороне интактных, он достаточно интенсивно возрастал. Таким образом, в результате релаксации СБО уже на коротких временных интервалах наблюдалась инверсия области анизотропного роста: она переходила с дорсальной на вентральную сторону. 1.2 Морфология зародышей с ортотопно трансплантированной СБО. Образцы, развивавшиеся из зародышей с ретрансплантированной СБО, по структуре имели много общего между собой, однако в значительной степени отличались от нормальных (Рис. 1). В большинстве случаев (30 из 43 образцов) происходило развитие по типу так называемой spina bifida. Зародыши вытягивались в дорсо-вентральном направлении, бластопор оставался незамкнутым, на дорсальной стороне формировалась присоска (Рис. 1 А, В, Г), в ряде случаев (12 из 30 образцов) на анимальной стороне формировались хвостоподобные выросты (Рис. 1 В, Г, З). Гистологическая обработка показала, что внутреннее строение оперированных зародышей также отличалась от интактных (Рис. 1 Д-З). Зачаток хорды имел вариабельную структуру (8 из 12 образцов), либо отсутствовал (4 из 12 образцов), нейральные дифференцировки наблюдались на дорсальной стороне. Кроме того, нейральные зачатки и зачатки сомитов формировались в боковых губах бластопора. Строение дорсальной области было морфологически сходно с головным отделом интактных зародышей (Рис. 1 Ж). По структуре фенотип, который формировали оперированные образцы, имел много общих черт с «фарингулой», узловой стадией развития высших позвоночных (Рис. 1 И). Однако, в противоположность тому, что наблюдается у типичных фарингул, дорсальная губа бластопора у экспериментальных образцов соответствовала головному концу зародышей высших позвоночных, а вентральная – их заднему концу. 1.3 В дорсальной области у зародышей с релаксированной СБО не наблюдалось классических движений латеро-медиальной интеркаляции; вместо этого они возникали в боковых губах бластопора и в направлении вентральной средней линии. В процессе нормального развития меченый ФДА материал СБО на стадии поздней гаструлы-нейрулы вытягивался в презумптивном передне-заднем направлении, совершая типичные движения латеро-медиальной интеркаляции (Рис. 2 А, Б, В). В свою очередь, у образцов с релаксированной СБО движения латеро-медиальной интеркаляции были подавлены. Меченый материал либо не совершал значительных перемещений (9 из 30 образцов, группа зародышей А) (Рис. 2 Ж), либо частично и, как правило, асимметрично «стекал» по боковым губам вытянутого и открытого бластопора в вентральном направлении, перемешиваясь с местным материалом (21 из 30 образцов, группа зародышей Б) (Рис. 2 Д, Е, З, И). При этом интеркаляция клеток наблюдалась в боковых губах бластопора (Рис. 2 И, направление 9 движений указано стрелками). У интактных зародышей меченые ФДА потомки вентральных бластомеров распространялись дорсо-латерально, перемешиваясь с другими клетками (Рис. 3 Б, В). В противоположность оперированным зародышам (11 из 11 образцов с фенотипом spina bifida), ни в одном случае не наблюдалось их концентрации вдоль вентральной средней линии и интеркаляционных движений в этом направлении (Рис. 3 Г, Д, Е). Таким образом, наблюдалась четкая корреляция между ориентацией клеточных движений и локализацией основных градиентов механических напряжений. В частности, перемещение основного узла натяжений на вентральную сторону сопровождалось блокировкой (группа зародышей А) или переориентацией (группа зародышей Б) интеркаляционных клеточных движений в СБО, которые, однако, возникали в вентро-медиальном направлении и в области боковых губ бластопора (Рис. 4). Данные результаты позволяют предположить, что в определении локализации и направления интеркаляционных движений участвуют поля механических натяжений. Наблюдаемое поведение клеток также соответствует модели тензотаксиса [Beloussov et al., 2000] - миграции клеток вверх по новому, инвертированному градиенту натяжений. 1.4 Паттерны экспрессии тканеспецифичных генов у зародышей с ретрансплантированной СБО. В зародышах групп А и Б с помощью процедуры in situ гибридизации определяли области экспрессии пан-нейрального маркера - гена Sox3, маркера сомитов - гена кардиального αактина, а так же маркера переднего мозга - гена Otx2. Пан-нейральный маркер, ген Sox3, в зародышах групп А и Б экспрессировался в области трансплантата, а также достаточно симметрично в боковых губах бластопора (Рис. 5 Б, Б’, Д, Д’), в ряде случаев (4 из 13 образцов) достигая вентральной губы. Ген кардиального α-актина, маркер сомитов, у зародышей групп А и Б экспрессировался также достаточно симметрично в боковых губах бластопора (Рис. 6 В, B’, Д, Д’, Е, Ж). Кроме того, наблюдалась эктопическая экспрессия данного гена далеко от своих презумптивных положений: на анимальной стороне (Рис. 6 В’, В”, Д’) и в области хвостоподобных выростов (Рис. 6 Е, Ж). У оперированных зародышей происходила переориентация передне-задней полярности: экспрессия маркера переднего мозга, гена Otx2, наблюдалась в виде отдельных пятен в дорсальной области, очень близко к краю губы незамкнутого бластопора (Рис. 7 Б-Ж). В характере экспрессии гена Otx2, также как и других рассмотренных маркеров, наблюдалась значительная вариабельность. В целом расположение мезодермальных и нейральных дифференцировок в группах А и Б существенно не отличалось друг от друга и практически не коррелировало с локализацией материала трансплантата. У зародышей группы Б их расположение в боковых губах бластопора было значительно симметричнее, нежели локализация трансплантированного 10 ФДА-меченого материала. В случае перемешивания меченого материала СБО с местным, более вентральным, зоны экспрессии оставались, тем не менее, сплошными. Видно, что осевые комплексы в боковых губах бластопора формировались из перемешанного местного и СБОматериала, либо только из местного материала. Кроме того, их локализация (в особенности нейральных структур и хорды) мало соответствовала картам презумптивных зачатков. С другой стороны, у разных зародышей, подвергшихся одной и той же операции, наблюдалась значительная вариабельность в расположении осевых дифференцировок. У некоторых пан-нейральный ген экспрессировался в виде мощных скоплений на дорсальной стороне, а в ряде случаев зоны его экспрессии были прерывистыми и могли распространяться вдоль боковых губ бластопора вплоть до вентральной стороны. Экспрессия переднемозгового маркера также отличалась от зародыша к зародышу – от сплошных компактных областей до дисперсных островков. Зоны экспрессии маркера сомитов у некоторых образцов не только достигали, но даже сливались на вентральной стороне (3 из 17 образцов) в единый сплошной участок (такие результаты интересным образом соотносятся с наблюдаемым возникновением латеро-медиальной интеркаляции клеток в этой области). Данные результаты позволяют сделать вывод, что по крайней мере на стадиях раннейсредней гаструлы отсутствует «поклеточная» детерминация материала губы бластопора в дорсо-вентральном направлении. Если бы разметка маргинальной зоны осуществлялась до начала гаструляции, у зародышей группы А следовало ожидать более или менее точного воспроизведения карт презумптивных закладок, а в группе Б эти карты должны были быть деформированы в соответствии с вентральным «стеканием» клеточного материала. На самом же деле расположение зон экспрессии в группах А и Б существенно не отличалось друг от друга и мало соответствовало картам презумптивных закладок. Кроме того, несмотря на существенное «перемешивание» клеток ФДА-меченой СБО с местным материалом боковых губ бластопора и на асимметричность вентральной миграции клеток СБО, зоны экспрессии исследуемых генов были всегда сплошными и, как правило, симметричными относительно сагиттальной оси зародышей (даже в тех случаях, когда меченый материал трансплантата стекал лишь по одной из боковых губ). Это указывает на кооперативный характер дифференцировок, в которые вовлекаются соседние клетки вне зависимости от их исходного дорсо-вентрального расположения, а также на высокую лево-правую симметрию осевых дифференцировок. Полученные результаты позволяют предположить, что полнота и упорядоченность осевых дифференцировок четко коррелирует с наличием и ориентацией клеточных движений и, прежде всего, с конвергенцией клеток к некоторой оси (Рис. 4). В СБО подавление данных движений нарушало формирование хорошо развитых и четко ориентированных осевых 11 структур. Возникновение интеркаляционных движений в боковых губах бластопора, напротив, этому способствовало. Однако, не смотря на то, что конвергентные движения возникали также в вентро-медиальном направлении, формирования более или менее полного комплекса осевых структур в данной области все же ни в одном случае не наблюдалось. В целом результаты позволяют сделать вывод, что морфогенетические движения являются необходимыми факторами дифференцировки клеток маргинальной зоны. Наличие и направление этих движений зависят от внешних относительно СБО полей механических напряжений. Это позволяет предположить наличие прямой связи между механическими напряжениями, возникающими в ходе развития зародыша, и типом осевых дифференцировок, формирующихся впоследствии. Недавние работы по механозависимой экспрессии генов в развитии [Farge et al., 2003; Christen and Slack,1999; Krain and Nordheim, 1999] указывают на возможность корреляции между такими процессами. На стадии гаструлы СБО, в свою очередь, является не только химическим индуктором, но и механическим организатором клеточных потоков, от которых решающим образом зависит как морфологическая, так и дифференцировочная разметка всего зародыша в целом. II. Изучение роли механо-геометрических факторов в определении взаимного расположения нейро-мезодермальных дифференцировок в изогнутых двойных эксплантатах СБО. 2.1 Тестирование механических напряжений в изогнутых двойных эксплантатах СБО. Если двойные эксплантаты СБО находились в агарозных лунках в деформированном состоянии не более нескольких минут, то после изъятия из лунок они немедленно распрямлялись. Следовательно, эксплантаты были приведены в механически напряженное состояние. С другой стороны, через 30 мин после начала деформации изогнутая форма стабилизировалась. Это говорит о том, что напряжения, возникшие в процессе деформации эксплантатов, благодаря их внутренней реорганизации компенсировались. Поскольку надсечения, сделанные на выпуклой стороне изогнутых эксплантатов через 3 ч после деформации, вызывали формирование достаточно больших по размеру щелей, при общей сбалансированности в эксплантатах механических напряжений, их локальные значения существенно отличались от нулевых. Через 20 ч после изгибания характер распределения механических напряжений в двойных эксплантатах становился еще более сложным: интенсивность расхождения поверхностной эпидермальной ткани увеличивалась, а щель, образующаяся во внутренней клеточной массе, напротив, была значительно уже, чем у трехчасовых эксплантатов. Такая реакция указывает на существенное увеличение напряжения 12 поверхностной эпидермальной ткани вследствие её растяжения под давлением внутренней клеточной массы. 2.2 Наблюдение за перемещением и изменением формы клеток в двойных эксплантатах СБО после изгибания. Анализ гистологических срезов эксплантатов показал, что уже через 30 мин после начала их деформации на вогнутой стороне в области изгиба формировалось углубление (Рис. 8 Б), напоминающее инвагинацию, а клетки, окружающие его, принимали колбовидную форму (Рис. 8 Б2). Средние значения апикальных индексов клеток на выпуклой стороне изогнутых эксплантатов (3,4±1,2) уже через 5 мин становились заметно больше, чем на вогнутых (2,6±1,0). Далее они продолжали возрастать так, что через 30 мин значения апикальных индексов на выпуклой стороне (5,9±2,8) более чем в 5 раз (Р˂0,001) превышали их значения на вогнутой (1,1±0,3). При этом апикальные индексы эпидермальных клеток на противоположных сторонах интактных эксплантатов (1,6±0,5) и в СБО интактных зародышей (1,4±0,4) существенно не различались. В течение 3 ч углубление увеличивалось, а количество окружающих его колбовидных клеток возрастало. В интактных эксплантатах и у интактных зародышей подобных изменений не наблюдалось. Кроме того, в течение 3 ч после операции в изогнутых эксплантатах наблюдалось значительное, по сравнению с интактными, растяжение выпуклой поверхности и сокращение вогнутой. Так, за 3 ч инкубации разность нормализованных длин выпуклой и вогнутой сторон достигала 40-70%, в то время как сразу после операции она составляла только 12-33%. В интактных эксплантатах разность нормализованных длин сторон не превышала 10%. Достаточно большая продолжительность (несколько часов) описанных изменений свидетельствует о том, что они являлись активным ответом клеток на приложенную деформацию. 2.3 Паттерны экспрессии тканеспецифичных генов в изогнутых двойных эксплантатах СБО. Образцы, которые формировали интактные двойные эксплантаты через 24 ч инкубации, можно было разделить на две группы. В первой группе (14 из 18 образцов) наблюдалось сохранение удлиненной структуры и презумптивной передне-задней полярности: нейральные закладки формировались ближе к передней области эксплантатов, мезодермальные (хорда и сомиты) – ближе к задней (Рис. 9). Их расположение вполне соответствовало картам презумптивных зачатков. Кроме того, по своей структуре интактные двойные эксплантаты имели много общего с классическими сэндвичами Келлера, в состав которых, помимо СБО, входит краевой участок дорсальной губы бластопора [Wilson and Keller, 1991]. Остальные (4 из 18 образцов) теряли передне-задюю полярность и принимали шаровидную форму. В характере 13 экспрессии нейральных и мезодермальных генов у них наблюдалась значительная вариабельность (Рис. 10 А-В). Гистологический анализ показал, что формирования хорды в шаровидных образцах не происходило. Среди изогнутых эксплантатов (Табл. 3) 8 из 49 образцов, несмотря на искусственно «навязанную» деформацию, сохраняли симметричную, удлиненную форму. Они обладали передне-задней полярностью и внешне существенно не отличались от интактных образцов первой группы. 16 из 49, как интактные эксплантаты второй группы, принимали шаровидную форму. У них также наблюдалась высокая вариабельность и асимметричность экспрессии нейральных и мезодермальных маркеров (Рис. 10 Г-Е). Остальные 25 эксплантатов сохраняли искусственно «навязанную» изогнутую форму. Вне зависимости от того, в каком направлении изгибали эксплантаты (параллельно или перпендикулярно передне-задней оси), они утрачивали исходную полярность и осевую симметрию (Рис. 11). С помощью критерия знаков показано, что среди эксплантатов, сохранивших изогнутую форму, доля образцов с преимущественной локализацией экспрессии Sox3 на вогнутой стороне значительно превышала долю образцов с нейральными закладками, обращенными к выпуклой стороне (значимость 99%). У подавляющего большинства эксплантатов (22 из 25 образцов, значимость 99,5%) закладки сомитов подковообразно окружали нейральные с выпуклой стороны. В целом, для нейральных закладок величина среднего индекса асимметрии у изогнутых образцов была достаточно высокой (+68±44), и достоверно (Р˂0,0001) превышала его значение у интактных (4,37±3,5). Таким образом, несмотря на идентичность клеточного материала и свойств вогнутой и выпуклой сторон в двойных эксплантатах, наблюдалась статистически значимая тенденция преимущественного расположения нейральных закладок на вогнутой стороне, а закладок сомитов – на выпуклой. Хорда в формировалась изогнутых образцах в редких случаях в виде изменчивых по форме островков. Области экспрессии маркера переднего мозга, гена Otx2, также как и пан-нейрального, у изогнутых эксплантатов располагались на вогнутых поверхностях (Рис. 12 А-Д). Кроме того, наблюдалась тенденция его экспрессии вблизи одного из полюсов эксплантата, даже если этот полюс не совпадал с презумптивной передней областью (Рис. 12 В-Е). Преимущественное расположение нейральных закладок на вогнутой стороне, а мезодермальных – в сторону выпуклой поверхности может быть связано с особенностями клеточных перемещений на противоположных сторонах эксплантатов после изгибания. Как уже было сказано, через несколько минут после деформации выпуклая сторона начинала активно растягиваться, а вогнутая - сокращаться. Наблюдения за движениями ФДА-меченых клеток, поставленные Т.В. Трошиной [Kornikova et al., 2010] показали, что потомки меченых дорсальных бластомеров выпуклой части 14 эксплантата в течение 15 ч активно распространялись, перемешиваясь с местными клетками, в латеральном направлении. Причем расстояния, на которые мигрировали клетки, в большинстве случаев в 3-5 раз превышали диаметр исходного меченого участка. На вогнутой стороне меченый материал, напротив, концентрировался в зоне изгиба. Важно также отметить, что ни в одном случае не наблюдалось вертикальной миграции меченых клеток из внешнего участка СБО двойного эксплантата во внутренний или наоборот. Как уже говорилось, поскольку описанные перемещения и изменения формы клеток осуществлялись в течение достаточно продолжительных временных интервалов, согласно модели гипервосстановления механических напряжений, они являлись активным ответом на изменение напряжений в результате искусственного изгибания. С этой точки зрения, значительная вариабельность в расположении нейро-мезодермальных зачатков у шаровидных эксплантатов может быть следствием статистической однородности в них механических напряжений, отсутствием каких-либо механо-геометрических «подсказок» для выбора клетками направления дифференцировки. 2.4 Возможные интерпретации результатов экспериментов по искусственному изгибанию двойных эксплантатов СБО. Можно было бы предположить, что возникновение углубления и формирование колбовидных клеток на вогнутой стороне эксплантатов является вторичным следствием самопроизвольной нейруляции (образования нервного желобка), но это не возможно по следующим причинам. Во-первых, начало инвагинации в изогнутых эксплантатах наблюдалось достаточно рано (не позднее 30 мин после изгибания), в то время как образование нервного желобка при нормальном развитии происходит на несколько часов позже (на стадии ранней нейрулы). Во-вторых, в области экспрессии нейральных маркеров у интактных образцов не было обнаружено никаких признаков подобной инвагинации. С другой стороны, можно было бы предположить, что наблюдаемое взаимное расположение нейро-мезодермальных закладок в изогнутых эксплантатах являлось следствием активной миграции их клеток- предшественников. Однако, как уже говорилось, в экспериментах с ФДА-мечеными клетками даже через 20 ч после изгибания ни в одном случае не наблюдалось вертикальной миграции меченых клеток между участками СБО двойного эксплантата, хотя признаки дифференцировки сомитов и структур, напоминающих нейральные, прослеживаются на гистологических срезах изогнутых эксплантатов уже через 3-4 ч после деформации. Кроме того, в случае самопроизвольного продолжительного изгибания интактных двойных эксплантатов в течение 20-24 ч инкубации (Рис. 9 В) у них не наблюдалось тенденции формирования нейральной ткани на вогнутой стороне, а мезодермальной – в направлении выпуклой. Таким образом, медленное самопроизвольное изгибание, скорее всего, не оказывает влияния на направление клеточной дифференцировки. 15 Как известно, процесс нейруляции сопровождается сложными механо-геометрическими изменениями в структуре зародыша [Jacobson and Gordon, 1976]. Формирование нервной трубки начинается с продольного вытяжения и поперечного сокращения нервной пластинки. Пассивное продольное растяжение нейроэктодермы (Рис. 13 Б, 2) вызвано активным удлинением хордомезодермы благодаря латеро-медиальной интеркаляции её клеток (Рис. 13 Б, 1) [Keller and Danilchik, 1988; Beloussov et al., 1994]. Согласно законам механики, при удлинении хордомезодермы механически связанный с ней клеточный материал нейроэктодермы должен испытывать не только продольное растяжение, но и поперечное сжатие (так называемая пуассоновская деформация) (Рис. 13 Б, 3). Кроме того, поперечному сокращению нейроэктодермы может способствовать вентро-дорсальное растяжение латеральной эктодермы [Colas and Schoenwolf, 2001]. В любом случае, до начала активного сокращения (Рис. 13 Б, 4), нервная пластинка подвергается достаточно интенсивному поперечному сжатию. Таким образом, при нормальной нейруляции, также как и в ходе экспериментальной деформации эксплантатов, имеет место последовательность «пассивное сжатие – активное сокращение» нейроэктодермы (Рис. 13 А, Б). Далее в процессе нейруляции следует активное сворачивание и замыкание нервной трубки, что вызывает пассивное дорсовентральное растяжение латеральных участков зародыша (Рис. 13 Б, 5). Данное растяжение, в свою очередь, должно запускать активные клеточные движения в вентро-дорсальном направлении (Рис. 13 Б, 6), сходные с теми, что наблюдались на выпуклой стороне изогнутых эксплантатов. То есть в целом процессы, наблюдаемые в двойных эксплантатах СБО после изгибания, имели много общего с механо-геометрическими изменениями в период нейруляции. Это сопровождается сходством в расположении нейро-мезодермальных закладок в изогнутых эксплантатах и на поперечном срезе нормального зародыша (Рис. 13 В, Г). Однако следует отметить, что в изогнутых эксплантатах отсутствовало интенсивное продольное вытяжение, имеющее место у зародышей при нормальном развитии и в некоторой степени у интактных эксплантатов. В связи с этим нарушение передне-задней полярности в изогнутых эксплантатах можно объяснить отсутствием дополнительного давления на нервную пластинку в продольном направлении в области будущего переднего мозга, также вызывающего её пассивное (Рис. 13 Б, 7), а затем активное сжатие (Рис. 13 Б, 8). 16 № Выборка Время после релаксации 0-1 мин 1-5 мин 5-60 мин 1 Релаксированная СБО, попер. -41±8 (р=0,002) -2,6±0,7 (р=0,008) +0,4±0,13 2 Релаксированная СБО, прод. -42±19 +4,5±1,03 (р=0,002) +0,8±0,5 3 Релаксированная вентральная область, попер. -29±14 (р=0,01) -2,6±9,5 -1,2±0,2 (р=0,03) 4 Релаксированная вентральная область, прод. 0 -4,1±2,9 +1,4±0,65 5 Интактная СБО, попер. -0,12±0,09 6 Интактная СБО, прод. +0,55±0, 002 (р=0,0001) 7 Интактная вентральная область, попер. -0,17±0,1 8 Интактная вентральная область, прод. -0,07±0,6 Табл. 1 Средние скорости (мкм/мин) увеличения (положительные значения) или уменьшения (отрицательные значения) расстояния между парами клеток, меченых с помощью угольных меток, расположенных на продольной (прод.) и поперечной (попер.) оси зародыша. Каждая серия измерений содержит от 7 до 10 образцов. Статистически значимые ненулевые значения выделены жирным шрифтом. СБО Вентральная область Интактный зародыш (n=8) 2.61±0.54 0.4±0.62 Зародыш с релаксированной СБО (n=8) 0.33±0.27 3.35±0.46 Уровень значимости p<0. 009 p<0.0004 Табл. 2 Изменение коэффициента анизотропии (∆AК) во временном интервале 5-105 мин после операции на дорсальной и на вентральной сторонах зародышей с релаксированной СБО по сравнению с интактными. n – количество наблюдаемых образцов. A В Dors Б Dors Dors Г Dors Хв. выр. Прис. Прис. Хв. Выр. Бл. Бл. Vent Д Vent Vent Vent Е З Ж Сом И . Н.тк. Сом . Н. тк. Хор. Хор .. Сом . Хв. выр . Рис. 1 Общий вид (А-Г) и гистологические срезы (Д-З) зародышей с ортотопно трансплантированной СБО, а также классическое изображение «фарингулы» (И): A, В, Г: вид слева; Б: вид с анимальной стороны; Д, E, З: сагиттальный срез оперированных зародышей; Ж: поперечный срез дорсальной области; Красными кругами обозначена дорсальная губа бластопора; Бл. – бластопор; Н. тк. - нервная ткань; Хор. - хорда; Сом. сомиты; Хв. выр. –- хвостоподобный вырост; Прис. - присоска. Dors – дорсальная область; Vent – вентральная область. Масштабный отрезок 200 мкм. 17 An А Б Рис. 2 Перемещения ФДА-меченого материала СБО у интактных (А-В) и оперированных (Г-И) зародышей через 30 мин (А, Г), 11 ч (Б, Д) и 24 ч (В, Е-И) после операции, что соответствует стадиям гаструлы, ранней и поздней нейрулы. Вид со стороны бластопора (А-Ж) и с левой стороны (З, И). У интактных зародышей метили два дорсальных бластомера на стадии 32 бластомер. An – анимальный полюс; Veg – вегетативный полюс; Dors – дорсальная область; Vent – вентральная область. Стрелками указано направление интеркаляционных движений клеток. Масштабный отрезок 200 мкм. В Dors Dors Dors Veg Б’ Е Dors Г Dors Д Vent Ж Dors Е Vent З Dors Dors Vent И Vent Vent Рис. 3 Локализация ФДА-меченого вентрального материала у интактных ( Б, В) и оперированных (А, Г-Е) зародышей. А: Зародыш после операции, вид со стороны бластопора; Б: Стадия 22, вид сбоку; В: Стадия 22, вид с вентральной стороны; Г, Д: Оперированные зародыши через 11 и 17 ч после операции соответственно, вид с вентральной стороны; Е: Зародыш через 17 ч после операции, вид сбоку; Ж: Сагиттальный срез типичного зародыша фенотипа spina bifida. Хор. – хорда; Сом.– сомиты; Ant– Б В A Dors передний, Post –задний Post Ant Dors Ant Vent полюс; Dors–дорсальная, Vent–вентральная область. Vent Масштабный отрезок 200 мкм. Vent Post Е Д Г Dors Бластопор Vent Vent Dors. Ж Vent Бластопор. Хор. Vent Сом. Рис. 4 Схема перемещения градиентов натяжений и областей конвергентной интеркаляции клеток у оперированных зародышей. Dors Бластопор Vent Релаксация основного узла натяжений (волнистая двусторонняя черная стрелка) приводила к переходу доминирующего узла с СБО на вентральную сторону (большие красные односторонние стрелки). В результате формировались новые градиенты натяжений (красные двусторонние стрелки), по направлению к которым клетки совершали интеркаляционные движения (маленькие односторонние красные стрелки). В норме интеркаляция клеток осуществляется в дорсомедиальном направлении (синие пунктирные односторонние стрелки) области вытяжения организма вдоль презумптивной передне-задней оси (синие пунктирные 18 двусторонние стрелки). Dors – дорсальная область; Vent – вентральная область. 18 Dors А А’ Dors Ant Б А Post Vent В Dors Ant Г В Post Д Dors Vent Vent В’ Б’А’ В’ Г’ Dors Vent Dors Д’ Vent Dors А А’ Ant Ant Dors Post Post Vent Б В В’ Dors В” Dors Vent Vent Д Г Д’ Dors Dors Г’ Vent Vent Е Рис. 5 Области экспрессии паннейрального маркера, гена Sox3, у интактных зародышей на стадии 2425: вид сбоку (А) и сверху (А’). Миграция меченого материала СБО и экспрессия гена Sox3 у оперированных зародышей через 24 ч после операции: вид со стороны бластопора (Б-Д) и сбоку (Б’-Д’). Кадры Б, Б’, В, В’ относятся к одному и тому же зародышу, кадры Г, Г’, Д, Д’ – к другому зародышу. Ant – передний полюс; Post – задний полюс; Dors – дорсальная область; Vent – вентральная область. Масштабный отрезок 200 мкм. Dors Vent Сом Ж Dors З Vent 19 Рис. 6 Области закладок сомитов у интактных зародышей на стадии 2425 и у оперированных зародышей. Экспрессия гена кардиального αактина у интактных зародышей: вид сбоку (А) и сверху (А’). Миграция меченого материала СБО и экспрессия гена кардиального αактина у оперированных зародышей через 24 ч после операции: вид со стороны бластопора (Б, В, Г, Д), с левого бока (В’), с анимальной стороны (В”), с правого бока (Д’). Кадры Б, В, В’, В” относятся к одному и тому же зародышу, кадры Г, Д, Д’ – к другому зародышу. Эктопическая экспрессия гена кардиального α-актина в зоне хвостоподобного выроста (Е, Ж). Вид сбоку. Сагиттальный срез зародыша с участком хвостоподобного выроста (З). Стрелки указывают на область эктопической экспрессии маркера. Ant – передний полюс; Post – задний полюс; Dors – дорсальная область; Vent – вентральная область. Сом – закладки сомитов. Масштабный отрезок 200 мкм. А Dors Б Ant Vent Vent В Dors Dors Г Vent Dors Vent Д Vent Б’ Б” Dors Vent Dors Е Dors Vent Dors Ж Vent Vent Dors Рис. 7 Области экспрессии маркера переднего мозга, гена Otx2, у интактных зародышей на стадии 24-25, вид сбоку (А), и у оперированных зародышей через 24 ч после операции, вид со стороны бластопора (Б-Ж). Кадры Б-Б” относятся к одному и тому же зародышу. Б’ – вид с левого бока, Б” – с правого бока. Стрелка указывает на закладку глазного бокала. Ant – передний полюс; Dors – дорсальная область; Vent – вентральная область. Масштабный отрезок 200 мкм. А Б1 Б2 Б Колб. клетки В1 В Колб. клетки В2 Рис. 8 Полутонкие сагиттальные срезы двойных эксплантатов СБО, зафиксированных сразу (А), через 0,5 ч (Б) и через 3 ч (В) после изгибания. Б1, Б2, В1, В2 являются фрагментами кадров Б и В, соответственно. Колб. клетки - колбовидные клетки. Масштабный отрезок 100 мкм. 20 Число полученных экспериментальных образцов: Изгибали перпендикулярно презумптивной переднезадней оси Изгибали параллельно презумптивной передне-задней оси Общее число Неизогнутых, удлиненных в передне-заднем направлении Шаровидных Сохранивших изогнутую форму Среди них: Образцы, у которых нейральные закладки расположены только на вогнутой стороне Образцы, у которых нейральные закладки расположены только на выпуклой стороне Образцы, у которых нейральные закладки расположены на вогнутой стороне и подковообразно окружены мезодермальными 25 4 24 4 6 15 10 10 9 8 0 0 14 8 Табл. 3 Численные результаты операций по изгибанию двойных эксплантатов СБО. Рис. 9 Закладки нейральной ткани, сомитов и хорды у двойных эксплантатов СБО удлиненной формы через 20-24 ч инкубации: экспрессия пан-нейрального гена Sox3 (синего цвета), и маркера сомитов, гена кардиального α-актина (красного цвета) (А-Д); совмещение изображения эксплантата после выявления закладок нейральной ткани и сомитов и изображения его хорды с гистологического среза того же образца (В). Гистологический срез типичного образца удлиненной формы (Е). Прис. – присоска; Хор. – хорда. Масштабный отрезок 100 мкм. Рис. 10 Закладки нейральной ткани и сомитов у интактных (А-В) и изогнутых (Г-Е) двойных эксплантатов СБО, принявших шаровидную форму через 2024 ч инкубации: экспрессия паннейрального маркера, гена Sox3 (синего цвета), и маркера сомитов, гена кардиального α-актина (красного цвета). Масштабный отрезок 100 мкм. А Б В Г Д Е 21 А Б В Г Д Е Ж З И К Рис. 11 Закладки нейральной ткани и сомитов у изогнутых двойных эксплантатов СБО, сохранивших искусственно «навязанную» форму, через 20-24 ч инкубации: экспрессия паннейрального маркера, гена Sox3 (синего цвета), и маркера сомитов, гена кардиального α-актина (красного цвета). Эксплантаты изгибали параллельно (А-Д) или перпендикулярно (Е-К) презумптивной передне-задней оси. Масштабный отрезок 100 мкм. А Б В Г Д Е Рис. 13 Диаграммы пассивных (синие стрелки) и активных (красные стрелки) механических напряжений, а также расположение нейральных и мезодермальных закладок в изогнутых двойных эксплантатах СБО (А, В) и у интактных зародышей при нормальном развитии (Б, Г). Масштабный отрезок 100 мкм. Рис. 12 Области экспрессии маркера переднего мозга, гена Otx2, у изогнутых двойных эксплантатов СБО через 20-24 ч инкубации. Эксплантаты изгибали параллельно (А-В) или перпендикулярно (Г-Е) презумптивной передне-задней оси. Стрелки указывают на расположение зон экспрессии маркера на выпуклых поверхностях. Масштабный отрезок 100 мкм. А Б В Г 22 ВЫВОДЫ 1. Ортотопная трансплантация (ретрансплантации) участка супрабластопоральной области (СБО) у зародышей Xenopus laevis на стадии ранней-средней гаструлы приводила к релаксации механических напряжений в маргинальной зоне и перемещению основного узла натяжений с СБО на вентральную сторону. 2. В результате у оперированных зародышей полностью изменялось направление клеточных интеркаляционных движений: они были подавлены в СБО, но вместо этого возникали в области боковых губ бластопора и в направлении вентральной средней линии. Следовательно, в определении локализации и направления латеро-медиальной интеркаляции важную роль играют поля механических натяжений. 3. Судя по паттернам экспрессии нейральных и мезодермальных генов, для правильной пространственной организации осевых структур необходимы нормальные клеточные движения в период гаструляции и нейруляции, и, в первую очередь, движения латеро-медиальной интеркаляции. В отсутствие нормальных движений вариабельность в расположении и площади закладок осевых структур возрастает. С другой стороны, осевые дифференцировки обладают высокой лево-правой симметрией и по этому признаку устойчивы к включению в них клеточного материала иного дорсо-вентрального уровня. 4. Пассивное сжатие/растяжение двойных эксплантатов СБО зародышей Xenopus laevis на стадии ранней-средней гаструлы в течение более чем 30 мин вызывали активный ответ со стороны их клеток. В области сжатия формировалась впадина, клетки, окружающие её принимали колбовидную форму, а сам участок сокращался. Растянутый участок продолжал вытягиваться, создавая дополнительное активное давление на сжатую сторону. 5. На более поздних сроках (соответствующих стадиям поздней нейрулы-хвостовой почки) вне зависимости от направления изгибания относительно передне-задней оси наблюдали статистически значимое преимущественное расположение нейральных закладок на вогнутых участках СБО, подвергавшихся сжатию, а мезодермальных – на более растянутых, обращенных к выпуклой стороне участках. 6. Для формирования и нормального взаиморасположения нейральных и мезодермальных осевых дифференцировок необходимо возникновение правильных паттернов активного и пассивного сжатия/растяжения. Отмечается сходство этих паттернов в изогнутых двойных эксплантатах СБО и при нормальных нейруляционных движениях. 23 СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ: 1. Kornikova E.S., Korvin-Pavlovskaya E.G., Beloussov L.V. Relocations of cell convergence sites and formation of pharyngula-like shapes in mechanically relaxed Xenopus embryos // Dev. Genes Evol. 2009. V. 219. №1. P. 1-10. 2. Kornikova E.S., Troshina T.G., Kremnyov S.V., Beloussov L.V. Neuro-mesodermal patterns in artificially deformed embryonic explants: a role for mechano-geometry in tissue differentiation // Dev. Dyn. 2010. V. 239. №3. P. 885-96. 3. Белоусов Л.В., Корвин-Павловская Е.Г., Лучинская Н.Н., Корникова Е.С. Роль коллективных клеточных движений и механогеометрических условий в разметке осевых зачатков у зародышей шпорцевой лягушки // Онтогенез. 2007. Т. 38. № 3. С. 192-204. 4. Kornikova E.S. A role of mechano-geometry in tissue differentiation during Xenopus laevis early development and its evolutionary applications // Euro Evo Devo. Paris 2010. Conference information. 2010. P. 92. 5. Kornikova E.S. Role of mechanical tensions in regulating cooperative cell movements and tissuespecific genes expression patterns in Xenopus laevis embryos // Morphogenesis and cell behavior. Conference booklet. Barcelona BioMed Conferences. 2008. P. 50. 6. Kornikova E.S., Korvin-Pavlovskaya E.G. Role of Mechanical tensions in regulating cooperative cell movements and tissue-specific genes expression patterns in Xenopus laevis embryos // Biological motility: achievements and perspectives. Pushchino: Foton-Vek. 2008. V. 2. P. 224-226. 7. Корникова Е.С. Роль механических натяжений в регуляции морфогенетических движений и региональной экспрессии тканеспецифичных генов у зародышей шпорцевой лягушки // Ломоносов-2009: Международная конференция студентов, аспирантов и молодых учёных; секция «Биология»; 13-18 апреля 2009 г.; Москва, МГУ им. Ломоносова, биологический факультет: Тезисы докладов. М.: МАКСПресс. 2009. С. 300. 8. Корникова Е.С., Белоусов Л.В. Влияние инверсии дорсо-вентральных градиентов механических натяжений на морфогенетические движения и региональную экспрессию тканеспецифичных генов у зародышей шпорцевой лягушки // Клеточные, молекулярные и эволюционные аспекты морфргенеза. Симпозиум с международным участием. М.: Т-во научных изданий КМК. 2007. С. 89-91. 9. Корникова Е.С. Роль механических напряжений в регуляции морфогенетических движений и региональной экспрессии тканеспецифичных генов у зародышей шпорцевой лягушки // XV Школа «Актуальные проблемы биологии развития». Звенигород. 2008. С. 124. 24
