Пункция фолликулов и качество ооцитов».

Некоторые методики, показания и (или) способы лечения, описанные в данном
материале для дистанционного обучения, могут быть недоступны в стране
вашего проживания или запрещены местным законодательством.
Ознакомьтесь с действующим законодательством в отношении местных
ограничений.
Предлагаем вашему вниманию главу 1.
Эта глава называется «Пункция фолликулов и качество ооцитов».
Автор — Greet Cauffman (Грит Кауфман).
1
В этой главе будут рассмотрены принципы пункции фолликулов и ряд
параметров, имеющих отношение к качеству ооцитов. Глава начинается с
обзора истории развития технологии получения яйцеклеток. Далее будут
описаны различные аспекты процедуры, в том числе необходимые меры
предосторожности, методы подготовки пациентки и лаборатории, технические
особенности процедуры. Затем будет рассматриваться ряд параметров,
имеющих отношение к качеству ооцитов. И, наконец, будут представлены
краткие сведения о созревании ооцитов в условиях in vitro.
2
Пункция фолликулов — это технология, применяемая при экстракорпоральном
оплодотворении для получения ооцит-кумулюсных комплексов (ОКК) из
фолликулов яичников, которая позволяет осуществить оплодотворение вне
человеческого тела.
3
На ранних этапах разработки метода ЭКО получение ооцитов было
трудновыполнимой задачей. Первые попытки забора яйцеклеток
осуществлялись лапароскопическим путем, под общей анестезией. Этот метод
впервые был описан Palmer (Палмером) в 1961 г. (во Франции) и, позднее,
Steptoe и Edwards (Стэптоэ и Эдвардсом), в 1970 г. (в Великобритании).
Лапароскопическая пункция фолликулов была технически сложной
процедурой, и доля успешных попыток составляла менее 50 % в расчете на
фолликул. Труднодоступные яичники, множественные спайки или тяжелое
поражение труб снижали эффективность метода (Lopata и соавт., 1974). В
1972 г. в публикации Kratochwil, посвященной ультразвуковой томографии
яичников, был предложен новый доступ. Однако только в 1982 г. Lenz и
Lauritsen продемонстрировали методику получения ооцитов путем
трансабдоминальной трансвезикальной пункции фолликулов под
ультразвуковым контролем. Во время данной процедуры длинная игла
подводилась к фолликулу яичника через кожу, переднюю брюшную стенку и
мочевой пузырь (см. рисунок). Доля успешных попыток получения ооцитов
была сравнима с таковой при лапароскопии, но это вмешательство
сопровождалось меньшим числом осложнений и обеспечивало более легкий
доступ к яичникам.
Рисунок. Трансабдоминальная трансвезикальная пункция фолликулов под
ультразвуковым контролем.
4
AW = брюшная стенка (abdominal wall), U = матка (uterus), B = мочевой пузырь
(bladder), F = фолликул (follicle), OV = яичник (ovary), G = ультразвуковой датчик
(guide)
Steptoe P, Edwards R. (1970) Laparoscopic recovery of preovulatory human oocytes
after priming of ovaries with gonadotrophins. Lancet; 1: 683-689.
Lopata A et al. (1974) Collection of human oocytes at laparoscopy and laparotomy.
Fertility and Sterility; 25: 1030-1038.
Kratochwil A et al. (1972) Ultrasonic tomography of the ovaries. Annales Chirurgiae et
Gynaecologiae Fenniae; 61: 211-214.
Lenz S, Lauritsen JG. (1982) Ultrasonically guided percutaneous aspiration of human
follicles under local anesthesia: a new method of collecting oocytes for in vitro
fertilization. Fertility and Sterility; 38: 673-677.
4
В последующие годы несколькими исследовательскими группами был описан
трансвагинальный метод получения яйцеклеток под ультразвуковым
контролем (Dellenbach et al., 1984). При этом трансвагинальная пункция
фолликулов осуществлялась под контролем трансабдоминального
ультразвукового датчика (рисунок а). По сравнению с предыдущими методами
данная процедура была в значительной мере усовершенствованной, однако
расстояние между ультразвуковым датчиком и яичниками оставалось
большим. Введение в практику вагинальных ультразвуковых датчиков привело
к дальнейшему развитию методики. Получение ооцитов методом
трансвагинальной пункции под ультразвуковым контролем впервые было
описано Wikland и соавторами в 1985 г. При этом для точной пункции
фолликулов и получения ооцитов игла направлялась вдоль влагалищного
ультразвукового датчика (рисунок b). Этот метод оказался простым и
эффективным — в связи с тем, что лучше визуализировались небольшие
фолликулы, следовательно, можно было получить большее количество
ооцитов. Также метод менее травматичен для пациенток. Благодаря простоте
и эффективности он получил широкую популярность и стал к настоящему
времени предпочтительным методом для проведения ЭКО.
Рисунок а. Трансвагинальная аспирация под трансабдоминальным
ультразвуковым контролем.
Рисунок b. Трансвагинальная аспирация под трансвагинальным
5
ультразвуковым контролем.
AW = брюшная стенка (abdominal wall), U = матка (uterus), B = мочевой пузырь
(bladder), F = фолликул (follicle), OV = яичник (ovary), V = влагалище (vagina), G
= ультразвуковой датчик (guide), N = игла (needle)
Dellenbach P et al. (1984) Transvaginal, sonographically controlled ovarian follicle
puncture for egg retrieval. Lancet; 1(8392): 1467.
Wikland M et al. (1985) Transvesical and transvaginal approaches for the aspiration
of follicles by use of ultrasound. Annals of the New York Academy of Sciences; 442:
182–194.
5
В целях обеспечения надлежащей идентификации образцов требуется
жесткий контроль. За идентификацию пациенток несут ответственность как
клиницисты, так и сотрудники лаборатории. Имя и фамилия пациентки
передается в лабораторию непосредственно до и сразу после забора ооцитов.
Имя и фамилия проверяются при идентификации пациентки и записываются
медицинской сестрой и лаборантом или эмбриологом в лабораторном
журнале учета. Полученные ооциты собираются в чашках Петри с
маркировкой на крышке и дне с указанием фамилии, имени и уникального
идентификационного номера. Другим сотрудником выполняется перепроверка
маркированных чашек Петри. Каждая манипуляция с материалом пациентки
при осуществлении любых видов лабораторной деятельности требует
контроля со стороны не менее чем двух сотрудников. Месторасположение
чашки Петри в инкубаторе записывается в лабораторном журнале учета.
Все средства одноразового применения и расходные материалы должны
проверяться при помощи специальных методов биотестирования с учетом
данных по биосовместимости, по соответствию физиологическим
потребностям ооцитов и на отсутствие токсичности. Кроме того, все
манипуляции должны проводиться в чистом помещении, например, в
ламинарном потоке воздуха, с использованием стерильных материалов. И,
наконец, должна иметься возможность отслеживать все материалы,
контактирующие с ооцитами.
6
Прежде чем начинать пункцию фолликулов, следует иметь в виду, что ооциты
крайне чувствительны к изменениям температуры, особенно к ее снижению.
Доказано, что колебания температуры оказывают неблагоприятное
воздействие на мейотическое веретено деления. Нарушения организации
веретена, такие как дезорганизация микротрубочек в веретенах деления,
уменьшение плотности или количества микротрубочек, могут препятствовать
правильному расхождению хромосом (Pickering et al., 1990; Wang et al., 2001).
При выполнении манипуляций in vitro требуется поддерживать температуру на
уровне 37 °C. Следовательно, все материалы одноразового применения и
культуральные среды, вступающие в прямой или непрямой контакт с
ооцитами, предварительно прогреваются до 37 °C. Проводится регулярная
калибровка устройств для нагревания — таких как настольные инкубаторы,
нагревательные блоки, термопластины (в том числе для микроскопов), и
температура в них отслеживается при помощи откалиброванных термометров.
Во время созревания и оплодотворения внутриклеточный pH (pHi) ооцитов
составляет около 7,4. Ооциты сохраняют способность к регуляции уровня pHi
после щелочного шока, однако они крайне чувствительны к кислотному шоку
(Dale, 1998; Swain и Pool, 2009). Изменения pH во время манипуляций с
ооцитами могут иметь неблагоприятные последствия, так как динамика
цитоскелета и клеточный метаболизм в значительной степени зависят от
уровня pH. Чтобы избежать изменений внеклеточного pH и, как следствие,
непрямого влияния на внутриклеточный pH, ооциты помещаются в
7
культуральную среду с буфером HEPES (4-(2-гидроксиэтил)-1пиперазинэтансульфоновая кислота) или бикарбонатным буфером, имеющую
pH 7,3. Для использования среды с буфером HEPES не требуется атмосфера с
содержанием CO2. Присутствие CO2 необходимо при использовании среды с
бикарбонатным буфером, который требует предварительного уравновешивания
в инкубаторе. Следует следить за тем, чтобы время нахождения за пределами
инкубатора среды с бикарбонатным буфером было минимальным.
И, наконец, на качество ооцитов также могут влиять изменения осмолярности
вследствие испарения культуральной среды. Изменения осмолярности
приводят к сморщиванию или набуханию ооцитов. Испарения можно избежать,
покрыв среду слоем масла.
Pickering SJ et al. (1990) Transient cooling to room temperature can cause
irreversible disruption of the meiotic spindle in the human oocyte. Fertility and
Sterility; 54: 102-108.
Wang WH et al. (2001) The spindle observation and its relationship with fertilization
after intracytoplasmic sperm injection in living human oocytes. Fertility and Sterility;
75: 348-353.
Wang WH et al. (2001) Limited recovery of meiotic spindles in living human oocytes
after cooling-rewarming observed using polarized light microscopy. Human
Reproduction; 16: 2374-2378.
Dale B et al. (1998) Intracellular pH regulation in the human oocyte. Human
Reproduction; 13: 964–970.
Swain JE, Pool TB. (2009) New pH-buffering system for media utilized during gamete
and embryo manipulations for assisted reproduction. Reproductive Biomedicine
Online; 18: 799-810.
7
Чашки Петри с культуральной средой, которые будут использоваться при
получении ооцитов, подготавливаются заранее. Чашки, содержащие среду с
бикарбонатным буфером, готовятся за день до пункции фолликулов и
хранятся до самого утра в инкубаторе. Чашки, содержащие среду с буфером
HEPES, готовятся в день получения ооцитов. Все используемые при
получении ооцитов материалы должны быть стерильными. Материалы,
которые будут вступать в контакт с ооцитами, предварительно подогреваются
до 37 °C.
8
Для получения нескольких зрелых ооцитов пациенткам проводится
гормональная стимуляция. Функция гипофиза подавляется агонистами или
антагонистами гонадотропин-рилизинг-гормона (ГнРГ), в соответствии с
выбранным протоколом. Стимуляция яичников осуществляется при помощи
гонадотропинов. Ответ на стимуляцию отслеживается при помощи
ультразвукового обследования и определения уровней гормонов в крови. К
этим гормонам относятся эстрадиол, лютеинизирующий и
фолликулостимулирующий гормоны, прогестерон. Когда содержание гормонов
в крови достигает ожидаемых величин и если имеется не менее трех
фолликулов величиной более 17 мм, вводится хорионический гонадотропин
человека (ХГЧ), который завершает созревание ооцитов. (Для ознакомления с
обзором см. Muasher и соавт., 2006)
В качестве альтернативы у небольшой группы пациенток вспомогательные
репродуктивные технологии могут выполняться в естественном
менструальном цикле. В таком цикле стимуляция не проводится, и обычно
созревает только один фолликул. По достижении фолликулом размера 17 мм
также вводился ХГЧ для управления созреванием ооцита. Естественный
менструальный цикл может иметь преимущества при лечении пациенток с
«бедным» ответом на стимуляцию.
9
На рисунке показан пример протокола стимуляции с использованием
антагониста ГнРГ, в котором прослеживается уровень половых гормонов крови
в динамике.
9
Эхографическое изображение мониторинга количества и размера растущих
фолликулов. Ультразвуковое исследование выполняется регулярно, начиная с
девятого дня цикла и до получения ооцитов.
10
Ооциты получают через 36 часов после введения триггера овуляции, чтобы
избежать происходящей через 40 часов после инъекции ХГЧ овуляции.
Процедура происходит в манипуляционной комнате для пункции фолликулов и
ее проводит врач-репродуктолог, которому ассистируют медицинские сестры
центра репродуктивной медицины. Для процедуры используется вагинальный
датчик, оборудованный пункционной иглой-насадкой. После того как фолликул
яичника оказывается на одной оси с пункционной иглой-насадкой, что
контролируется по изображению на экране, игла проводится через стенку
влагалища в фолликул. Затем выполняется аспирация фолликулярной
жидкости вместе с ооцит-кумулюсным комплексом при помощи вакуумного
насоса (давление 100–120 мм рт. ст.). До и во время пункции фолликулов
необходимо следить за уровнем отрицательного давления и регистрировать
его значения. Дополнительно может проводиться промывка фолликулов 0,9 %
раствором хлорида натрия и гепарином (5000 МЕ). Фолликулярная жидкость
собирается в предварительно прогретую пробирку и содержится при
температуре 37 °C. Сразу после этого аспират исследуют в лаборатории на
присутствие ооцит-кумулюсных комплексов. Затем выполняется пункция
других фолликулов. После пункции всех фолликулов одного яичника игла
извлекается и процедура повторяется на другом яичнике. Весь процесс
занимает около 30 минут, и обычно проводится под обезболиванием с
сохранением сознания или легкой общей анестезией. После процедуры
пациентке назначают прогестерон для поддержки лютеиновой фазы цикла.
11
Рисунок a. Врач-репродуктолог выполняет пункцию фолликулов
Рисунок b. Температура аспирированной фолликулярной жидкости
поддерживается на уровне 37 °C
11
Манипуляционная комната для пункции фолликулов обычно непосредственно
связана с лабораторией ЭКО. В противном случае возможна транспортировка
полученных ооцитов в лабораторию при хранении их в стандартизированных
условиях в переносном инкубаторе. Каждый полученный образец
фолликулярной жидкости немедленно передается лаборанту или эмбриологу.
Пробирка с фолликулярной жидкостью опорожняется в предварительно
прогретые чашки Петри в ламинарном потоке воздуха. Содержимое чашек
изучается при температуре 37 °C под стереомикроскопом на предмет
присутствия ооцит-кумулюсных комплексов. Если в аспирате присутствуют
сгустки крови, они отделяются при помощи двух стерильных игл. Информация
о наличии или отсутствии в аспирате ооцита немедленно передается в
манипуляционную комнату для пункции фолликулов. Ооцит-кумулюсные
комплексы переносятся стерильной пипеткой Пастера в предварительно
прогретую чашку Петри с центральной лункой, в которой собираются все
полученные ооцит-кумулюсные комплексы. В чашке Петри находится
человеческая трубная жидкость (HTF), буферизованная бикарбонатом или
HEPES, чтобы предотвратить изменения pH. Если используется культуральная
среда с бикарбонатным буфером, чашка Петри хранится в настольном
инкубаторе с регулируемым составом атмосферы при температуре 37 °C. При
использовании буфера HEPES поддержание атмосферы не требуется. Чашку
Петри с «пустой» фолликулярной жидкостью следует удалять в отходы.
Данная процедура повторяется для каждого аспирата. Количество полученных
ооцитов регистрируется в индивидуальной карте пациентки.
12
Образцы полученных ооцитов:
На рисунке a изображена предварительно прогретая чашка Петри с
центральной лункой, в которой собраны все полученные ооцит-кумулюсные
комплексы (8), на рисунке b — ооцит-кумулюсный комплекс, который включает
в себя: ооцит, лучистый венец (corona radiata) — т. е. клетки кумулюса,
непосредственно окружающие ооцит, клетки кумулюса и сгусток крови. На
рисунке c представлено увеличенное изображение ооцит-кумулюсного
комплекса.
13
В конце процедуры собранные ооцит-кумулюсные комплексы промываются и
переносятся в новую чашку Петри. Для промывания и хранения ооцитов до
процедуры оплодотворения используется культуральная среда с
бикарбонатным буфером для оплодотворения in vitro. Для выполнения ЭКО
ооцит-кумулюсные комплексы хранятся отдельно или попарно в каплях
культуральной среды для оплодотворения in vitro объемом 25 мкл,
находящихся в маленьких чашках Петри для тканевых культур. Капли среды
покрываются маслом.
Для выполнения инъекции сперматозоида в цитоплазму ооцита (ИКСИ) ОКК
хранятся все вместе в 700 мкл среды в чашках Петри с центральной лункой,
вплоть до подготовки к денудации и микроинъекции. Чашки Петри переносятся
в инкубатор, где поддерживается температура 37 °C и газовая среда с
содержанием 6 % CO2, 5 % O2 и 89 % N2.
14
Качество ооцитов является фактором, ограничивающим фертильность
женщины. Считается, что судьба эмбриона главным образом определяется
качеством ооцита. Характеристики ооцитов, способные влиять на их качество,
можно разделить на морфологические, клеточные и молекулярные. В обычной
практике ЭКО качество ооцитов определяется преимущественно по их
внешнему виду и их свойствами в период после оплодотворения. Оценка
клеточных и молекулярных характеристик, способных определять качество
ооцитов, в настоящее время не применяется в обычной клинической практике.
Пока данные характеристики изучены недостаточно, однако они представляют
собой интересную и популярную на сегодняшний день тему для научных
исследований. Эти характеристики будут рассмотрены позже в данной главе.
15
Морфологические аномалии ооцитов человека наблюдаются часто и
выявляются у 13 % ооцитов, оставшихся неоплодотворенными после
процедуры ЭКО (Van Blerkom и Henry, 1992). После денудации клеток
кумулюса при подготовке к проведению ИКСИ, аномальные морфологические
характеристики отмечаются у 60–70 % ооцитов. К морфологическим
характеристикам ооцитов относятся: внешний вид кумулюса, зрелость ядра,
внешний вид первого полярного тельца, наличие мейотического веретена
деления, размер ооцита, характеристики цитоплазмы — грануляция, вакуоли,
гладкий эндоплазматический ретикулум, липофусциновые тельца,
экстрацитоплазматические характеристики — форма и цвет ооцитов, внешний
вид перивителлинового пространства и прозрачной оболочки. Определенные
морфологические характеристики могут быть полезны как индикаторы
качества ооцитов. Для ознакомления с обзором см. Balaban и Urman, 2006.
Van Blerkom J, Henry GH. (1992) Oocyte dismorphism and aneuploidy in
meiotically mature human oocytes after ovarian stimulation. Human Reproduction;
7: 379–390.
Balaban B, Urman B. (2006) Effect of oocyte morphology on embryo development
and implantation. Reproductive Biomedicine Online; 12(5): 608-615.
16
Оценка характеристик кумулюса состоит из трех компонентов: определения
количества слоев, степени экспансии кумулюса и контакта между клетками
кумулюса и ооцитом. В зависимости от количества слоев кумулюса выделяют
следующие группы: менее трех слоев, от четырех до девяти слоев, более
десяти слоев. Существуют следующие типы экспансии кумулюса: без
экспансии, или компактный кумулюс, экспансия клеток кумулюса, высокая
степень экспансии. Контакт кумулюса с ооцитом — клетки кумулюса могут
окружать ооцит полностью, частично, или не окружать вовсе, оставляя его
непокрытым. Наилучшей комбинацией, которая соответствует зрелости
кумулюса, является наличие более чем трех слоев полностью окружающих
ооцит клеток кумулюса с экспансией. Ранее считалось, что зрелость кумулюса
положительно коррелирует со зрелостью ядер ооцитов и частотой
оплодотворения, частотой формирования бластоцист и частотой наступления
беременности. Однако сообщалось о наличии различной степени асинхронии
между зрелостью ядер ооцитов и зрелостью кумулюса, а противоречивые
результаты в отношении частоты оплодотворения, доли развивающихся
эмбрионов и частоты наступления беременности ослабляют вышеописанную
гипотезу (Balaban и Urman, 2006).
17
Зрелость полученных ооцитов является важным фактором, определяющим
успех вспомогательных репродуктивных технологий. Обычно полученные
ооциты являются зрелыми, с задержкой на стадии метафазы второго деления
мейоза (MII). Однако некоторая часть (~15 %) ооцитов, полученных при
индукции овуляции, является незрелой: 4 % находятся на стадии метафазы
первого мейотического деления (MI) и 11 % — все еще на стадии профазы
первого мейотического деления, то есть на стадии зародышевого пузырька
(GV) (De Vos и соавт., 1999). Зрелость ядер ооцитов можно легко определить
по наличию первого полярного тельца. В ооцитах на стадии MI еще не
произошло выделение первого полярного тельца, но отсутствует зародышевый
пузырек, а в ооцитах на стадии GV явно виден зародышевый пузырек. При
культивировании в условиях in vitro некоторые ооциты способны к спонтанному
возобновлению мейоза и к переходу к стадии MII, на которой мейоз вновь
останавливается до момента оплодотворения. Таким образом, большее число
ооцитов становится доступным для выполнения инсеминации или
микроинъекции. Частота оплодотворения находившихся в метафазе-I и
созревших в условиях in vitro ооцитов ниже, по сравнению со зрелыми
ооцитами (метафаза-II), однако доля развивающихся эмбрионов является
сравнимой (Veeck, 1988; De Vos и соавт., 1999). Меньшая частота
оплодотворения созревших в условиях in vitro ооцитов может объясняться
незрелостью цитоплазмы таких ооцитов при зрелости их ядер. Созревшие в
18
условиях in vitro ооциты на стадии GV могут быть оплодотворены, однако в этом
случае резко снижается доля развивающихся эмбрионов (Nogueira и соавт.,
2000).
18
Оценка морфологии первого полярного тельца, а именно его фрагментации,
может использоваться для определения пост-овуляторного возраста ооцита.
Считалось, что наличие фрагментированных полярных телец сопровождается
худшим качеством эмбриона и меньшей частотой оплодотворения,
формирования бластоцисты, имплантации и наступления беременности, чем
при наличии интактных полярных телец (Ebner и соавт., 1999; Ebner и соавт.,
2000; Balaban и соавт., 2001; Ebner и соавт., 2002). Однако, так как
продолжительность существования первого полярного тельца весьма
небольшая, его морфология изменяется через несколько часов
культивирования in vitro. Следовательно, оценка морфологии полярного
тельца не может служить надежным маркером качества ооцита и его
способности к оплодотворению (Verlinsky и соавт., 2003; Ciotti и соавт., 2004;
De Santis и соавт., 2005). Вопрос о том, можно ли использовать морфологию
полярного тельца для оценки качества ооцита, остается спорным.
19
Веретено деления образуется из микротрубочек, которые выстраиваются в
определенном порядке с точками присоединения с обеих сторон ооцита
(биополярно) и к которым прикрепляются хромосомы. В норме веретено
деления обладает свойством двойного лучепреломления. В зрелых ооцитах
веретено должно находиться в месте выделения первого полярного тельца.
Повреждение мейотического веретена деления, изменение его
местоположения или отсутствие веретена деления может привести к
нарушению расхождения хромосом и, как следствие, к анеуплоидии, гибели
клеток, снижению частоты оплодотворения и формирования бластоцист
(Hardarson и соавт., 2000; Eichenlaub-Ritter и соавт., 2002; Wang и соавт., 2001;
Rienzi и соавт., 2003). Также было показано, что ооциты без веретена деления
с двойным лучепреломлением не выдерживают замораживания с
последующим размораживанием.
Так как мейотическое веретено обладает двойным лучепреломлением, его
упорядочивание и вероятные разрывы можно выявить неинвазивным путем
при помощи интерференционной поляризованной световой микроскопии
(PolScope) (Wang и соавт., 2001). Метод PolScope может оказаться полезным
при процедуре ИКСИ. Он помогает определить местоположение генетического
материала, что позволяет избежать инъекции сперматозоида сквозь веретено
деления. Оценка структуры веретена деления может способствовать ранней
отбраковке эмбрионов с низким потенциалом развития, даже если из них
20
формируются морфологически нормальные бластоцисты.
Hardarson T et al. (2000) The position of the metaphase II spindle cannot be
predicted by the location of the first polar body in the human oocyte. Human
Reproduction; 15: 1372–1376.
Eichenlaub-Ritter U et al. (2002) Manipulation of the oocyte: possible damage to the
spindle apparatus. Reproductive Biomedicine Online; 5: 117–124.
Wang WH et al. (2001) The spindle observation and its relationship with fertilization
after intracytoplasmic sperm injection in living human oocytes. Fertility and Sterility;
75: 348–353.
Wang WH et al. (2001) Limited recovery of meiotic spindles in living human oocytes
after cooling–rewarming observed using polarized light microscopy. Human
Reproduction; 16: 2374–2378.
Rienzi L et al. (2003) Relationship between meiotic spindle location with regard to the
polar body position and oocyte developmental potential after ICSI. Human
Reproduction; 18: 1289–1293.
20
В норме диаметр ооцитов составляет 155 мкм. Диаметр незначительной части
(0,3 %) полученных ооцитов примерно на 30 % превышает диаметр
нормальных ооцитов (и составляет около 200 мкм). Такие ооциты называются
гигантскими. Неоплодотворенные гигантские ооциты, по всей видимости,
являются диплоидными. Следовательно, после оплодотворения в гигантских
ооцитах чаще всего обнаруживается три пронуклеуса — этот феномен
известен под названием «триплоидия вследствие дигинии». Образующиеся
зиготы способны к нормальному дроблению и развитию до стадии
бластоцисты. В связи с наличием хромосомной аномалии не рекомендуется
переносить такие бластоцисты, особенно во избежание невынашивания
беременности (Balakier и соавт., 2002; Rosenbusch и соавт., 2002).
Balakier H et al. (2002) Morphological and cytogenetic analysis of human giant
oocytes and giant embryos. Human Reproduction; 17: 2394–2401.
Rosenbusch B et al. (2002) Cytogenetic analysis of giant oocytes and zygotes to
assess their relevance for the development of digynic triploidy. Human
Reproduction; 17: 2388–2393.
21
Центральная грануляция является особенностью морфологии ооцита и
представляет собой крупную темную губчатую зернистую область в
цитоплазме. Эта аномалия соответствует недостаточной зрелости
цитоплазмы, она обнаруживается у 35 % ооцитов. Наличик грануляции не
влияет на частоту оплодотворения, на развитие и качество эмбриона, однако
коррелирует с низкой частотой развивающихся беременностей, которая
составляет в таких случаях всего 13 %. По данным преимплантационной
генетической диагностики, 52 % бластомеров, развивающихся из таких
ооцитов, являются анеуплоидными, что может объяснить высокую частоту
прерываний беременности (Kahraman и соавт., 2000).
22
Вакуоли представляют собой цитоплазматические включения, окруженные
мембраной и содержащие жидкость, практически идентичную
перивителлиновой жидкости. Вакуоли могут появляться спонтанно во время
созревания ооцита, когда происходит выделение первого полярного тельца
(Van Blerkom, 1990), из уже существующих везикул, которые образуются из
эндоплазматического ретикулума или комплекса Гольджи (El Shafie и соавт.,
2000), либо они создаются искусственно после выполнения ИКСИ (Ebner et al.,
2005). Вакуоли образуются в 4 % ооцитов и оказывают неблагоприятное
влияние на частоту оплодотворения (49 % по сравнению с 65 %). Частота
оплодотворения отрицательно коррелирует с количеством и размером
вакуолей; пороговое значение составляет 14 мкм. Наличие вакуолей также
оказывает неблагоприятное влияние на формирование бластоцисты (de Sutter
и соавт., 1996; Ebner и соавт., 2005).
23
Скопление гладкого эндоплазматического ретикулума наблюдается только в
ооцитах на стадии MII, с частотой возникновения 2 %. В циклах с
использованием пораженных ооцитов частота может достигать 25 %.
Образование подобных структур может коррелировать с высоким уровнем
эстрадиола (Otsuki и соавт., 2004). Частота оплодотворения таких ооцитов не
снижается, если предпринимаются меры для того, чтобы не повредить
скопление. Наличие скопления гладкого эндоплазматического ретикулума
сопровождается снижением частоты формирования бластоцист (18 %),
худшими исходами беременности, частыми акушерскими осложнениями и
меньшим весом новорожденного (Ebner и соавт., 2008; Otsuki и соавт., 2004).
Рисунки. Два ооцита на стадии MII, в которых имеется скопление гладкого
эндоплазматического ретикулума.
Ebner T et al. (2008) Prognosis of oocytes showing aggregation of smooth
endoplasmic reticulum. Reproductive Biomedicine Online; 16: 801–807.
Otsuki J et al. (2004) The relationship between pregnancy outcome and smooth
endoplasmic reticulum clusters in MII human oocytes. Human Reproduction; 19:
1591–1597.
24
Липофусциновые гранулы состоят из смеси липидов и плотного материала
гранул. Они могут обнаруживаться на различных стадиях созревания ооцитов.
Только наличие крупных липофусциновых гранул, размером более 5 мкм,
сопровождается значимым снижением частоты оплодотворения и развития до
стадии бластоцисты (Otsuki и соавт. 2007).
Рисунки. Липофусциновые тельца в ооцитах, находящихся на стадиях MI и MII,
соответственно.
Otsuki J et al. (2007) Lipofuscin bodies in human oocytes as an indicator of oocyte
quality. Journal of Assisted Reproduction and Genetics; 24: 263–270.
25
К экстрацитоплазматическим аномалиям относятся — особенности формы
ооцита (круглая или овоидная форма ооцита на стадии MII) и его цвета
(светлый или темный), особенности перивителлинового пространства, такие
как его размер (широкое или узкое) и зернистость, особенности прозрачной
оболочки, такие как ее цвет (светлый или темный) и толщина.
Экстрацитоплазматические аномалии ооцитов не влияют на частоту
оплодотворения, процент развивающихся эмбрионов или способность к
имплантации (Balaban и соавт., 1998; Loutradis и соавт., 1999; Esfandiari и
соавт., 2006).
Balaban B et al. (1998) Oocyte morphology does not affect fertilization rate, embryo
quality and implantation rate after intracytoplasmic sperm injection. Human
Reproduction; 13: 3431–3433.
Loutradis D et al. (1999) Oocyte morphology correlates with embryo quality and
pregnancy rate after intracytoplasmic sperm injection. Fertility and Sterility; 72: 240–
244.
Esfandiari N et al. (2006) Brown oocytes: implications for assisted reproductive
technology. Fertility and Sterility; 86: 1522–1525.
26
В настоящее время интенсивно исследуются клеточные и молекулярные
прогностические факторы качества ооцитов, считающиеся более точными и
объективными характеристиками компетентного ооцита и качества эмбриона,
по сравнению с морфологическими параметрами.
С большим интересом изучаются следующие вопросы:
всесторонний анализ профилей экспрессии генов в ооцитах и связанных с
ними кумулюсных клетках при помощи технологии микрочипов;
определение генетической структуры и цитогенетический анализ полярных
телец путем сравнительной геномной гибридизации;
анализ экскретируемых ооцитом белков при помощи масс-спектрометрии
(протеомика);
метаболомические исследования для выявления индикаторов качества
ооцитов в фолликулярной жидкости и культуральной среде.
К более специфическим исследованиям относятся оценка состояния
митохондрий и активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы 1 в ооцитах,
апоптоза фолликулярных клеток и содержания веществ, принадлежащих к
надсемейству трансформирующего фактора роста β, в фолликулярной
жидкости (Patrizio и соавт., 2007; Gilchrist и соавт., 2008; Revelli и соавт., 2009).
27
Так как большинство вышеуказанных тестов можно выполнить неинвазивно,
ожидается, что эти новые методы окажутся оптимальными для идентификации
ооцитов, способных производить жизнеспособные эмбрионы с нормальной
хромосомной структурой и высокой вероятностью рождения живого плода, что
повысит общую эффективность технологии ЭКО.
Patrizio P et al. (2007) Molecular methods for selection of the ideal oocyte.
Reproductive Biomedicine Online; 15: 346–353.
Gilchrist RB et al. (2008) Oocyte-secreted factors: regulators of cumulus cell function
and oocyte quality. Human Reproduction Update; 14: 159–177.
Revelli A et al. (2009) Follicular fluid content and oocyte quality: from single
biochemical markers to metabolomics. Reproductive Biology and Endocrinology; 7:
40.
27
Созревание ооцитов в условиях in vitro (IVM, in vitro maturation) — это
репродуктивная технология, позволяющая ооцитам, которые были получены
из яичников, не подвергавшихся стимуляции гонадотропинами или при
небольшой стимуляции, созревать в условиях in vitro (Edwards, 1965; Smitz et
al., 2004; Piquette, 2006). Преимуществами метода IVM являются — меньшая
гормональная стимуляция (и следовательно, более низкий риск
нежелательных побочных эффектов) и возможность получить большое
количество ооцитов из яичника. Первая беременность, наступившая в
результате использования метода IVM, описана в 1991 г. (Cha и соавт., 1991). С
тех пор технология IVM развивалась медленно, и доля успешных попыток
остается низкой. Среди прочих, решению подлежат следующие проблемы —
необходимость синхронизации между созреванием цитоплазмы и ядра,
сохранения связи между ооцитами и гранулезными клеткам и синхронизации с
эндометрием. Кроме того, требуются дополнительные исследования для
изучения плоидности ооцитов, структуры веретен деления ооцитов, и, что не
менее важно, эпигенетики ооцитов. Также может быть полезным поиск
дополнительных молекулярных маркеров качества ооцитов.
Edwards RG. (1965) Maturation in vitro of human ovarian oocytes. Lancet; 2: 926–
929.
Smitz JE, Cortvrindt RG. (2004) In vitro growth and maturation of oocytes in human
and non-human primates. Gynecologic and Obstetric Investigation; 57: 18–21.
28
Piquette GN. (2006) The in vitro maturation (IVM) of human oocytes for in vitro
fertilization (IVF): is it time yet to switch to IVM-IVF? Fertility and Sterility; 85: 833–
835.
Cha KY et al. (1991) Pregnancy after in vitro fertilization of human follicular oocytes
collected from nonstimulated cycles, their culture in vitro and their transfer in a donor
oocyte program. Fertility and Sterility; 55: 109–113.
28
В настоящее время общепринятым методом получения ооцитов для
процедуры ЭКО является трансвагинальная пункция фолликулов под
ультразвуковым контролем. К двум самым важным факторам, требующим
строгого контроля во время процедуры получения ооцитов, относятся
температура и pH. Определяющими характеристиками способности ооцита к
развитию являются зрелость ядра, внешний вид веретена деления, размер
ооцита и свойства его цитоплазмы. Выраженные изменения в цитоплазме
ооцита, такие, как центральная грануляция, вакуоли, скопление гладкого
эндоплазматического ретикулума, липофусциновые тельца, изменения
веретена деления, и, в особенности, комбинация нескольких дефектов,
нарушает способность эмбриона к развитию и имплантации.
Экстрацитоплазматические отклонения не влияют на способность эмбриона к
развитию и имплантации. В дополнение к стандартной морфологической
оценке эмбриона может использоваться изучение морфологии ооцитов в
качестве прогностического маркера качества эмбриона и его способности к
имплантации.
Обзор литературных источников, упоминавшихся в данной главе.
Обзор литературных источников, упоминавшихся в данной главе.
Обзор литературных источников, упоминавшихся в данной главе.
Обзор литературных источников, упоминавшихся в данной главе.
Обзор литературных источников, упоминавшихся в данной главе.
Обзор литературных источников, упоминавшихся в данной главе.
Обзор литературных источников, упоминавшихся в данной главе.
Обзор литературных источников, упоминавшихся в данной главе.
Обзор литературных источников, упоминавшихся в данной главе.