1
реклама
1 «Бактериальный вагиноз» НИИ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКОЙ МЕДИЦИНЫ Росздрава РФ Научно - производственная фирма “ЛИТЕХ” Московский Государственный университет им.М.В.Ломоносова Российская медицинская академия последипломного образования Кудрявцева Л.В., Ильина Е.Н., Говорун В.М., Минаев В.И., Зайцева С.В., Липова Е.В., Баткаев Э.А. БАКТЕРИАЛЬНЫЙ ВАГИНОЗ (ПОСОБИЕ ДЛЯ ВРАЧЕЙ) СОДЕРЖАНИЕ Введение.................................................................................................................................................................1 Нормоценоз ............................................................................................................................................................2 Бактериальный вагиноз .........................................................................................................................................7 Лабораторноя диагностика нарушений микроэкологии влагалища ...................................................................9 Предварительный диагноз БВ...............................................................................................................................9 Микроскопическое исследование........................................................................................................................10 Бактериологический метод..................................................................................................................................13 Рецепты основных питательных сред .........................................................................................................18 Рецепты индикаторов ...................................................................................................................................20 Рецепты питательных сред для определения ферментации углеводов ..................................................20 Метод газо-жидкостной хроматографии......................................................................................................21 Метод генодиагностики.................................................................................................................................21 Практические рекомендации ...............................................................................................................................24 Принципы лечения ...............................................................................................................................................24 Список литературы...............................................................................................................................................25 ВВЕДЕНИЕ Различные органы и полости человека с присущей им микрофлорой представляют собой единую экологическую систему - микробиоценоз. Микробиоценозы возникли в местах контакта человеческого организма с окружающей средой – кожа, слизистая желудочно-кишечного тракта, влагалище и находятся в состоянии динамического равновесия с изменяющимися условиями внешней среды. Микробиоценоз различных органов и полостей человека является весьма чувствительной индикаторной системой, которая способна реагировать качественными и количественными изменениями на любые физиологические и патологические сдвиги в состоянии макроорганизма и препятствовать инвазии патогенных микрорганизмов. Влагалище с присущей ему микрофлорой образуют единую экосистему в которой вагинальная среда контролирует микрофлору, а микрофлора, в свою очередь, оказывает воздействие на вагинальную среду [13, 21, 57]. Нормальная микрофлора влагалища подразделяется на облигатную (резидентная, индигенная), факультативную и транзиторную. К облигатной микрофлоре относятся микроорганизмы, постоянно входящие в состав нормальной микрофлоры влагалища (непатогенные, условнопатогенные). Участвуя в метаболизме организма хозяина, они препятствуют проникновению во влагалищный биотоп патогенных бактерий. Представители факультативной микрофлоры достаточно часто, но не всегда, встречаются у здоровых женщин. К транзиторной микрофлоре относятся случайно занесенные в генитальный тракт из окружающей среды непатогенные, условнопатогенные и патогенные микроорганизмы. При нормальном состоянии микроэкологии вагинального тракта эти микроорганизмы, как правило, не способны к длительному пребыванию в нем и не вызывают развитие патологического процесса. В случае нарушения микроэкологии генитального тракта, которое может происходить при воздействии на организм женщины разнообразных неблагоприятных внешних воздействий – в экстремальных условиях, стрессовых ситуациях, в случаях снижения иммунного статуса, при гормональных нарушениях, лечебных мероприятиях создаются и поддерживаются условия, приводящие к снижению колонизационной резистентности во влагалище по отношению к заселению его патогенными и условнопатогенными микроорганизмами. В результате этого может произойти внедрение транзиторной микрофлоры или дополнительное внедрение условно-патогенных микроорганизмов - представителей нормальной микрофлоры влагалища в слизистую оболочку его стенки с последующей транслокацией в мочевыводящие пути, цервикальный канал и другие органы и ткани [3, 19, 45, 88]. Антибиотикотерапия, с успехом используемая для профилактики и лечения инфекционных заболеваний, в то же время может привести к нарушению микроэкологии влагалища и толстой кишки или способствовать усилению степени уже существующих нарушений микроэкологии. «Бактериальный вагиноз» 2 Повреждающее действие на нормальную микрофлору влагалища могут оказывать гормональная и химиотерапия, длительное использование внутриматочных спиралей, лучевая терапия, хирургические воздействия, токсические факторы окружающей среды. Инфекционно-воспалительные заболевания женских половых органов занимают особое место в структуре общей заболеваемости. Их значимость обусловлена прежде всего тем, что эти болезни затрагивают органы и ткани, относящиеся к репродуктивной системе, а следовательно они могут оказывать непосредственное влияние на репродуктивную функцию. По данным многочисленных эпидемиологических исследований среди инфекционно-воспалительных заболеваний женских половых органов все большее значение приобретают воспалительные процессы, этиологическим агентом которых выступают условнопатогенные бактерии и грибы (U. urealyticum, Bacteroides spp., Corynebacterium spp., Candida spp. и др.), являющиеся составной частью нормальной микрофлоры. Отсутствие специфической картины воспаления, вялое, а зачастую бессимптомное течение осложняют диагностику этих заболеваний, что может способствовать хронизации процесса и развитию осложнений [4, 16, 49, 54, 81]. Обнаружение отдельных видов этих микроорганизмов в составе вагинальной микрофлоры не позволяет дать объективную оценку состояния микроценоза и решить вопрос о необходимости проведения этиотропной терапии. Только количественные исследования, определяющие соотношение отдельных видов микроорганизмов, а также исследование их биологических свойств в полной мере характеризуют вагинальный микроценоз. НОРМОЦЕНОЗ Влагалищная микрофлора строго индивидуальна и может даже в состоянии нормы подвергаться изменениям в различные фазы менструального цикла. Кроме того, понятие нормы может быть различным для разных возрастных, этнических групп и даже географических зон. В связи с этим врозможны варианты нормального микробиоценоза (нормоценоза) влагалища [12, 26, 39, 69]. Микроэкология влагалища во многом обусловлена его эмбриональным происхождением и гистоморфологическим строением. Влагалище покрыто многослойным неороговевающим плоским эпителием, который не содержит желез. Делящиеся клетки базального слоя эпителия созревают в процессе их продвижения к просвету влагалища. Процессы физиологического созревания эпителиоцитов, их слущивания и толщина поверхностного слоя подвержены циклическим изменениям в ответ на действие половых гормонов. Эпителий влагалища выполняя защитную функцию, обеспечивает его устойчивость к воздействию патогенных агентов (бактерии, вирусы, грибы). Важным показателем резистентности вагинального эпителия является количество гликогена, который содержится преимущественно в поверхностных клетках. Поскольку эти клетки постоянно слущиваются и подвергаются цитолизу, гликоген освобождается, обеспечивая питательный субстрат для нормальной микрофлоры. Гликоген также способствует регенерации тканей, является важным углеводным компонентом организма, принимающим участие в выработке иммунных тел. Количество гликогена в клетках вагинального эпителия колеблется у одной и той же женщины на протяжении жизни, а также в зависимости от фазы менструального цикла. Установлена взаимосвязь между содержанием гликогена в верхних слоях эпителия, транссудате влагалища и гормональной функцией яичников. Максимальное накопление гликогена приходится на момент овуляции [14]. Таким образом, возможные гормональные изменения на протяжении менструального цикла и жизни женщины (пубертат, менопауза, беременность) определяют интенсивность ферментативных процессов во влагалище и оказывают влияние на состояние его микрофлоры. На состав микрофлоры влагалища, как качественный, так и количественный, могут оказывать воздействие национальные особенности туалета половых органов, степень половой активности, а также всевозможные способы контрацепции. Следует отметить, что помимо эндокринной системы и взаимодействий на уровне бактерий - представителей нормофлоры влагалищного биотопа (определенные виды микроорганизмов способны доминировать над другими и продукты их метаболизма могут служить факторами ограничения общей популяции бактерий, входящих в состав нормальной микрофлоры влагалища) на микробиоценоз влагалища оказывают воздействие нервная и иммунная системы, которые действуют как единое целое. Нарушение в одном из этих звеньев неизменно приводит к определенным сдвигам в слаженой функции всего комплекса, в результате чего происходит нарушение микроэкологии влагалища, которое может в дальнейшем привести к развитию воспалительных процессов генитального тракта. В норме влагалище у новорожденных девочек в первые часы жизни стерильно. К концу первых суток после рождения оно колонизируется аэробными и факультативно-анаэробными микроорганизмами. Через несколько дней в вагинальном эпителии происходит накопление гликогена, который является идеальным субстратом роста для лактобактерий и в вагинальной микрофлоре у новорожденных девочек начинают преобладать лактобактерии. Гормоны яичников, стимулируя рецепторную активность вагинального эпителия также способствуют активной адгезии лактобактерий на поверхности вагинального эпителия. Лактобактерии, в свою очередь, расщипляют гликоген с образованием молочной кислоты. Это приводит к сдвигу рН вагинального содержимого в кислую сторону (до 3,8-4,5) и ограничению роста и размножения микроорганизмов, чувствительных к кислой среде. В этот период вагинальная микрофлора у новорожденных девочек имеет сходство с микрофлорой влагалища здоровых взрослых женщин. Через три недели после рождения у девочек происходит полное метаболизирование материнских эстрогенов. Эпителий становится тонким. Содержание гликогена в нем уменьшается. Это приводит к снижению количества нормальной микрофлоры, прежде всего лактобактерий, а также к снижению уровня органических кислот, которые продуцируются этими бактериями. В результате снижения уровня органических кислот происходит повышение рН вагинальной среды с 3,8-4,5 до 7,0. В микрофлоре начинают доминировать строго анаэробные бактерии. «Бактериальный вагиноз» 3 Начиная со второго месяца жизни и весь пубертатный период вплоть до активации овариальной функции происходит снижение общего количества микроорганизмов во влагалище у девочек по сравнению с периодом новорожденности [55]. В пубертатный период, с момента активации овариальной функции, в организме у девушек появляются "собственные", эндогенные эстрогены. Под влиянием этих эстрогенов в клетках вагинального эпителия накапливается гликоген и происходит формирование так называемого "эстроген-стимулированного эпителия". На поверхности вагинальных эпителиоцитов повышается число рецепторных участков для адгезии лактобактерий. Увеличивается толщина эпителиального слоя. С этого момента лактобактерии вновь становятся доминирующими микроорганизмами во влагалище и в последующем сохраняют это положение на протяжении всего репродуктивного периода у женщин. Метаболизм лактобактерий способствует стабильному сдвигу рН вагинальной среды в кислую сторону до 3,8-4,5 [52]. В вагинальной среде повышается окислительно-восстановительный потенциал, и это все создает неблагоприятные условия для роста и размножения строго анаэробных микроорганизмов. У здоровых женщин репродуктивного возраста эстрогены воздействуют на вагинальный эпителий в фолликулярную, или пролиферативную фазу менструального цикла, а прогестерон в лютеиновую, или секреторную фазу. В связи с этим, частота высеваемости и количество строго анаэробных и большинства аэробных представителей нормальной микрофлоры выше в пролиферативную фазу, чем в секреторную. Поэтому наибольшую информацию о количественном и качественном составе вагинальной микрофлоры можно получить на 2-14 дни менструального цикла [68]. Наименьшее количество микроорганизмов во влагалище определяется в период менструации [69]. Уровень лактофлоры при этом остается постоянным. Морфофункциональные, физиологические и биохимические изменения в генитальном тракте во время беременности приводят к тому, что вагинальная микрофлора становится более однородной. В течение беременности концентрация гликогена во влагалище у женщин увеличивается. Создаются благоприятные условия для жизнедеятельности лактобактерий, количества которых во влагалище беременных женщин значительно превышают таковые во влагалище у небеременных женщин [1, 27, 67]. В то же время уменьшаются количества бактероидов и других неспорообразующих строгих анаэробов [30], а также аэробных грамположительных кокковидных и грамотрицательных палочковидных бактерий [39]. Эти изменения достигают пика в III триместре беременности [65], что в последующем снижает вероятность контаминации плода условнопатогенными микроорганизмами при его прохождении через родовые пути [76]. Во время родов происходит первичная контаминация организма ребенка, в норме стерильного до рождения, вагинальной микрофлорой. Состав вагинальной микрофлоры роженицы в последующем определяет состав микрофлоры конъюктивы, желудочного аспирата, кожных покровов, которые идентичны микрофлоре родового канала матери, а риск развития инфекционного процесса у новорожденных находится в прямой зависимости от степени обсемененности околоплодных вод [48, 76]. Вагинальная микрофлора роженицы играет также важную роль в формировании нормальной микрофлоры кишечника у новорожденных. Таким образом, состояние микрофлоры влагалища матери оказывает существенное влияние на формирование микробиоценоза кишечника ребенка и на характер течения периода новорожденности. После родов в микрофлоре влагалища происходят существенные изменения - как качественные так и количественные. Эти изменения могут быть связаны со значительным снижением уровня эстрогенов, особенно в III триместре беременности, возможностью травматизации влагалища и его контаминацией кишечной микрофлорой во время родов. В послеродовом периоде существенно увеличиваются количества неспорообразующих грамотрицательных строгих анаэробов – Bacteroides spp. и грамотрицательных факультативно-анаэробных бактерий E.coli и происходит снижение уровней лакто- и бифидобактерий. Нарушения нормальной вагинальной микрофлоры в послеродовом периоде могут способствовать развитию инфекционных осложнений в матке и придатках. Изменения микрофлоры у рожениц являются транзиторными, и к 6-й неделе послеродового периода вагинальная микрофлора восстанавливается до нормы. При наступлении менопаузы в генитальном тракте существенно снижаются уровни эстрогенов и, соответтственно, гликогена. Снижаются количества лакто- и бифидобактерий. В этот период у женщин рН вагинальной среды приобретает нейтральные значения. Качественный состав микрофлоры становится скудным. Понижается общий уровень бактерий. Среди выявляющихся во влагалище микроорганизмов преобладают облигатно-анаэробные бактерии [44, 48]. Нормальная микрофлора влагалища у здоровых женщин репродуктивного возраста характеризуется большим разнообразием видов бактерий, жизнедеятельность которых во многом зависит от их способности к адгезии на клетки вагинального эпителия и возможности конкуренции между собой за места обитания и продукты питания [57, 64]. Микрофлора влагалища здоровых женщин репродуктивного возраста включает широкий спектр микроаэрофилов, факультативных и облигатных анаэробов (Tаблица 1). 4 «Бактериальный вагиноз» Таблица 1 Видовой состав микрофлоры влагалища здоровых женщин репродуктивного возраста Виды микроорганизмов Частота выделения(%) Способность вызывать заболевания Микроаэрофильные бактерии: Lactobacillus spp. L.fermentum, L.crispatus, L.jenseni, L.gasseri, L.acidophilus, L.plantarum, L.brevis, L.delbruckii, L.salivarius 71-100 - 6-60 + 5-30 - 12 - 10-25 + 25 5 + Mobiluncus spp. 30-90 + Peptostreptococcus spp. P.asaccharoliticus P.magnus P.prevotii P.tetradius 80-88 53 32 32 G. vaginalis Облигатно-анаэробные грамположительные бактерии: Lactobacillus spp. Bifidobacterium spp. B.bifidum, B.breve, B.adolescentis, B.longum Clostridium spp. Propionibacterium spp. P.acnes Облигатно-анаэробные грамотрицательные бактерии: Bacteroides spp. B.utealyticum, B.fragilis, B.vulgatus, B.ovatus, B.distasonis, B.uniformis, B.caccae, B.multiacidus 9-13 + Prevotella spp. P.bivia, P.disiens 60 + Porphyromonas spp. P.asaccharolitica 31 + Fusobacterium spp. F.nucleatum 14-40 - Veilonella spp. 11-14 - Факультативно-анаэробные грамположительные бактерии: Corynebacterium spp. С.aquatum C.minutissium C.equi C.xerosis C.bovis C.enzymicum C.kutsheri 30-40 - 8-10 возбудители оппортунистических инфекций Staphylococcus spp. S.epidermidis, S.saprophyticus 62 + Staphylococcus spp. S.epidermidis, S.saprophyticus 62 + 30-40 + заболевания органов дыхания, менингиты, сентицемия у новорожденных Streptococcus spp. S.viridans E.fecalis E.faecium S.agalactiae Enterobacteriaceae E.coli, Enterobacter spp, Klebsiella spp, , Proteus spp., P.aerugenosa 10-20 5-30 + 2-10 M.hominis 2-15 + U.urealyticum 6-7 + M.fermentans 2-5 - 15-20 + Дрожжеподобные грибы рода Candida: C.albicans, C.tropicalis, Torulopsis glabrata 5 «Бактериальный вагиноз» Чаще всего выделяют микроаэрофильные, продуцирующие H2O2 (71-100%), реже анаэробные (5-30%) грамположительные палочки – представителей рода Lactobacillus [52]. Среди представителей облигатных анаэробов с высокой частотой (30-90%) обнаруживают группу Peptostreptococcus, включающую в себя всех членов рода ранее известных как Peptococcus (за исключением P. niger) и все грамположительные анаэробные кокки, ранее идентифицированные как Gaffkya anaerobia. Грамположительные палочки, строгие анаэробы – Bifidobacterium spp. выявляются у здоровых женщин с частотой равной 12%, Clostridium spp. – в 10-25% случаев соответственно. В редких случаях (0-5%) в вагинальном отделяемом обнаруживают виды Mobiluncus [28, 46, 65, 68]. Типичными представителями нормальной микрофлоры генитального тракта у женщин являются Propionibacterium spp. (P. acnes), которые могут быть выделены с частотой до 25%. Грамотрицательные строго анаэробные палочковидные бактерии такие как Bacteroidides spp. (B. urealyticum, B. fragilis, B. vulgatus, B. ovatus, B. distasonis, B. uniformis, B. coccae, B. multiacidus), выявляются у 9-13% женщин, Fusobacterium spp. у 14-40%, Porphyromonas spp. у 31%, Prevotella spp. присутствуют во влагалище у женщин в 60% случаев. Значительное место отводится Pr. bivia и Pr. disiens – уникальным микроорганизмам женского полового тракта, роль которых приравнивается к роли B. fragilis в кишечнике [31, 57, 68, 70]. B. fragilis выделяют из половых путей здоровых женщин, по разным данным, в 5-12% случаев [29, 57, 65]. Микроаэрофилы во влагалище здоровых женщин помимо лактобактерий представлены G. vaginalis. По данным различных авторов G. vaginalis встречается в 6-60% случаев [12, 39, 65]. Среди факультативно-анаэробных микроорганизмов часто выделяют каталазопозитивные, коагулазонегативные S.epidermidis, и новобиоцин-резистентные S.saprophyticus (62%), Streptococcus spp. (стрептококки группы viridans – "зеленящие", альфа (или гамма), гемолитические, стрептококки серологической группы В (Str. agalactie) и стрептококки серологической группы D (энтерококки)), непатогенные коринебактерии (C. minutissium, C. equi (новое название Rhodococcus equi), C.aquaticum, C. xerosis) присутствуют у 30-40%. E. coli, по разным данным, выделяют у 5-30% женщин [27, 70, 76]. Прочие энтеробактерии (Klebsiella spp., Citrobacter spp., Enterobacter spp.) встречаются менее чем у 10% здоровых женщин. Для нормоценоза характерно присутствие генитальных микоплазм - M.hominis и U. urealyticum, которые встречаются у 2-15% сексуально активных женщин, в то время как M. fermentas определяются редко [26, 56]. Дрожжеподобные грибы рода Candida: C. albicans, C. tropicalis и Torulopsis glabrata (ранее Candida glabrata) выявляются во влагалище здоровых женщин в 15-20% случаев. Candida albicans – наиболее характерный вид, определяемый у 80-90% женщин, влагалище которых колонизировано грибами рода Candida. Отделяемое влагалища в норме содержит 108-1012 КОЕ/мл микроорганизмов, при этом факультативно-анаэробные 3 5 5 9 бактерии составляют 10 -10 КОЕ/мл, анаэробные – 10 -10 КОЕ/мл (Табл. 2) [19, 26, 55]. Таблица 2 Степень обсемененности вагинального отделяемого различными видами микроорганизмов здоровых женщин репродуктивного возраста Микроорганизм Микроаэрофильные бактерии: Lactobacillus spp. G.vaginalis Облигатно-анаэробные грамположительные бактерии: Lactobacillus spp. Bifidobacterium spp. Clostridium spp. Propionibacterium spp. Mobiluncus spp. Peptostreptococcus spp. Облигатно-анаэробные грамотрицательные бактерии: Bacteroides spp. Prevotella spp. Porphyromonas spp. Fusobacterium spp. Veilonella spp. Факультативно-анаэробные грамположительные бактерии: Corynebacterium spp. Staphylococcus spp. Streptococcus spp. Enterobacteriaceae M.hominis U.urealyticum M.fermentas Дрожжеподобные грибы рода Candida Количество (КОЕ/мл) 107-109 106 107-109 103-107 до 104 до 104 до 104 103-104 103-104 до 104 до 103 3 до 10 до 103 104-105 103-104 104-105 103-104 103 103 до 103 104 «Бактериальный вагиноз» 6 На фоне всего видового многообразия ведущее место в вагинальном микроценозе занимают микроаэрофильные 9 лактобактерии число которых может достигать 10 КОЕ/мл [33, 36]. Колонизируя слизистую влагалища, лактобактерии участвуют в формировании экологического барьера и обеспечивают тем самым резистентность вагинального биотопа. Защитные свойства лактобактерий реализуются по-разному: за счет антагонистической активности, способности продуцировать лизоцим, перекись водорода и адгезивных свойств. Однако основным механизмом, обеспечивающим колонизационную резистентность вагинального биотопа является способность лактобактерий к кислотообразованию. Молочная кислота – продукт метаболизма лактобактерий. Она образуется в процессе деструкции гликогена вагинального эпителия лактобактериями и определяет кислую реакцию рН вагинального содержимого, которое в норме составляет 3,8-4,5. Лактобактерии продуцируют молочную кислоту в количествах, достаточных для создания выраженной кислой среды вагинального отделяемого и, тем самым, препятствуют размножению ацидофобных бактерий. Таким образом, определяющим фактором состояния вагинального микроценоза является лактофлора, ее концентрация и совокупность свойств [22, 30, 79]. Бифидобактерии, входя в состав микроценоза влагалища, как и бактерии рода Lactobacillus, относятся к флоре Додерлейн. У здоровых женщин репродуктивного возраста они выявляются с меньшей частотой, в концентрациях 1037 10 КОЕ/мл. Как и лактобактерии, они относятся к кислотопродуцирующим микроорганизмам и участвуют в поддержании во влагалище низких значений рН. Бифидобактерии адгезируются на поверхности эпителиальных клеток влагалища, способны продуцировать бактериоцины, лизоцим, спирты, что также обеспечивает им участие в создании и поддержании колонизационной резистентности во влагалище по отношению к условно-патогенным и патогенным микроорганизмам. Бифидобактерии синтезируют аминокислоты и витамины, которые активно используются организмом хозяина в его метаболизме. Пептострептококки являются третьей составляющей частью флоры Додерлейн. Количество анаэробных кокков в вагинальном отделяемом составляет 103-104 КОЕ/мл. Несмотря на то, что пептострептококки составляют часть нормальной флоры женского полового тракта, их часто обнаруживают при септических абортах, трубно-яичниковых абсцессах, эндометритах и других тяжело протекающих инфекциях женских половых органов. В ассоциации с другими анаэробными бактериями пептострептококки в большом количестве случаев выделяют при бактериальном вагинозе. Пропионобактерии - комменсалы человеческого организма. За счет вырабатываемых ими органических кислот эти бактерии могут участвовать в поддержании колонизационной резистентности влагалища. Обладают 4 иммуностимулирующими свойствами. Выделяются в количествах не превышающих в норме 10 КОЕ/мл [10, 76]. В норме количественный уровень порфиромонасов, вейлонелл и фузобактерий не превышает 103 КОЕ/мл, а бактероидов и превотелл - 104 КОЕ/мл соответственно. [64]. Патогенные свойства строго анаэробных грамотрицательных бактерий связаны с их ферментативными системами. Так у B. fragilis выявлены гиалуронидаза, коллагеназа, фибринолизин, иммуноглобулин-протеазы, гепариназа и сиалидаза. B. fragilis обладают и другими факторами патогенности, например, капсульным полисахаридом. Кроме того бактероиды группы "fragilis" способны к продукции каталазы, что позволяет им противостоять действию H2О2 , вырабатываемой лактобактериями. Различные протеазы и коллагеназы были найдены у бактерий рода Porphyromonas. Протеазы и фибринолизин выявлены также у различных видов рода Prevotella. Fusobacterium necrophorum обладают способностью синтезировать гемолизин и факторы агрегации томбоцитов. У бактероидов, фузобактерий, а также у анаэробных стептококков и гарднерелл была выявлена высокая способность к продукции фосфолипазы А2. Последняя в свою очередь активирует продукцию простогландинов путем освобождения арахидоновой кислоты из ее эфирной формы. У беременных женщин бактериальные протеазы и липазы могут воздействовать на хорионамниотическую мембрану, приводя к ее разрыву. Нарушение целостности хорионамниотической оболочки в совокупности с увеличением концентрации простогландинов в амниотической жидкости инициируют преждевременные роды [9, 51]. Органические кислоты, продуцируемые грамотрицательными анаэробами, а также бактериями рода Mobiluncus, в частности янтарная кислота, ингибируют функциональную активность полинуклеарных нейтрофилов, с чем связывают малое количество последних или их полное отсутствие в выделениях из влагалища при бактериальных вагинозах. 6 Количество гарднерелл нередко достигает 10 КОЕ/мл исследуемого материала. Гарднереллы обладают выраженной способностью к адгезии на поверхности вагинальных эпителиоцитов. G. vaginalis могут продуцировать токсические биопродукты, к которым относятся муколитические ферменты и гемолизин, являющийся также лейкотоксическим фактором. 4 5 Во влагалище здоровых женщин коринебактерии обнаруживаются в количестве 10 -10 КОЕ/мл. 4 Генитальные микоплазмы, стафилококки выстречаются в количестве не более 10 КОЕ/мл [38, 62]. 4 Количество стрептококков в вагинальном отделяемом значительно варьирует и по разным данным составляет 10 5 10 КОЕ/мл. Инфицирование новорожденных S. agalactiae может произойти во время родов при прохождении через родовые пути в случае преждевременного разрыва плодных оболочек или при акушерских манипуляциях, сопровождающих сложные роды. Инфицирование новорожденных стрептококками этого вида может также происходить позднее при контаминации госпитальными штаммами. Стрептококки этого вида способны вызвать тяжелые заболевания органов дыхания, менингиты, септицемии, нередко приводящие к летальному исходу [39, 65]. Зеленящие стрептококки могут быть причиной постоперационных воспалительных осложнений. Энтерококки часто обнаруживаются при воспалительных заболеваниях мочеполовой системы. Энтеробактерии - E. coli, Proteus spp., Klebsiella spp., а также P. aerugenosa встречаются в количестве 103-104 КОЕ/мл и могут быть этиологическим агентом урогенитальных инфекционных заболеваний [44, 61, 73]. Грибы рода Candida определяются в количестве до 104 КОЕ/мл, не вызывая патологических процессов. Количество дрожжеподобных грибов может повышаться при беременности. Это связывают с тем, что при физиологической «Бактериальный вагиноз» 7 супрессии клеточного иммунитета, происходящей у беременных женщин и направленной на исключение возможности отторжения развивающегося плода, создаются благоприятные условия для роста и размножения дрожжеподобных грибов. Выявлено, что C.albicans обладает способностью прикрепляться к вагинальным эпителиоцитам при помощи специальных поверхностных структур, а также вырабатывать глиотоксин, который способен нарушать жизнеспособность и функцию человеческих лейкоцитов. С другой стороны, было обнаружено что C. albicans могут вырабатывать так называемый антинейссериа-фактор, который способен подавлять размножение и колонизацию влагалища N. gonorrhoeae [18]. Таким образом, бактерии - представители нормальной микрофлоры влагалища тесно взаимодействуя между собой и с клетками вагинального эпителия создают и поддерживают высокую колонизационную резистентность влагалищного биотопа, но иногда могут стать причиной воспалительных процессов урогенитального тракта. Ввиду того, что вагинальная микрофлора помимо защитной функции выполняет и ряд других важных функций - ферментативную, витаминообразующую, иммуностимулирующую и др., ее обычно рассматривают как индикатор состояния влагалища [12, 61, 62, 67]. БАКТЕРИАЛЬНЫЙ ВАГИНОЗ Нарушение микроэкологии влагалища - бактериальный вагиноз (БВ) – наиболее широко распространенное состояние у женщин репродуктивного возраста. В ряде отечественных и зарубежных работ было показано, что частота обнаружения БВ во многом зависит от контингентов обследуемых женщин. Она составляет 17-19% в группах планирования семьи, 24-37% среди лиц, находящихся на лечении в клиниках венерических заболеваний, 15-37% - у беременных женщин и у 61-87% среди пациенток с патологическими белями [50, 53, 58]. У женщин, проживающих на территории с повышенным радиационным фоном, БВ встречается в 62% случаев [89]. До 1955 года любой воспалительный процесс во влагалище, не связанный с гонореей, трихомониазом или кандидозом, относился к неспецифическим вагинитам. В 1955 году Gardner H.L. и Dukes C.D. описали синдром нарушения микрофлоры влагалища у пациенток с "неспецифическим бактериальным вагинитом" [40, 43]. При нарушении микрофлоры влагалища у женщин с "неспецифическим бактериальным вагинитом" отмечалось снижение количества молочнокислых бактерий и колонизация влагалища новыми, неизвестными ранее микроорганизмами, которые получили название Haemophilus vaginalis. В 1963 году этот микроорганизм переименовали в Corynebacterium vaginalis, и в 1980 году он был вновь переименован в Gardnerella vaginalis в честь H. L. Gardner, который впервые выделил и описал эти бактерии. Так, начиная с 1980 года неспецифические вагиниты стали относить к гарднереллезам – заболеваниям, вызываемым G.vaginalis. Однако, позднее было установлено, что G.vaginalis присутствует не только у пациенток с неспецифическими вагинитами, но и у 47% здоровых женщин, и что эти микроорганизмы являются не единственными возбудителями данного заболевания. В 1984 году на 1-м международном симпозиуме по вагинитам после анализа всех клинических, микроскопических и микробиологических данных, накопленных за предыдущее десятилетие, ввиду отсутствия воспалительной реакции в стенках влагалища (клинической и морфологической), отсутствия увеличения числа лейкоцитов в вагинальном отделяемом, было предложено современное название заболевания – бактериальный вагиноз [60]. В настоящее время клиническое значение БВ является общепринятым. Риск возникновения воспалительных заболеваний органов малого таза, хориоамнионит, преждевременные роды, внутриутробное инфицирование плода, послеродовой эндометрит – далеко не полный перечень возможных осложнений у пациенток, страдающих этим заболеванием [37, 43, 63]. К предрасполагающим факторам, ведущим к развитию БВ можно отнести следующие: -использование антибактериальных препаратов; -длительное использование внутриматочных контрацептивов; -использование пероральных контрацептивов; -перенесенные ранее воспалительные заболевания урогенитального тракта; -нарушение гормонального статуса, сопровождающееся нарушением менструального цикла, преимущественно по типу олигоменореи или аменореи; -изменение состояния местного иммунитета; -воздействие малых доз ионизирующего излучения; -стрессовые воздействия на организм. У 60% женщин, страдающих БВ, выявляются нарушения микроэкологии толстой кишки (дисбактериоз кишечника), что позволяет предполагать наличие дисбиотического процесса в организме с выраженным проявлением его либо в репродуктивной, либо в пищеварительной системе [82]. Эпидемиология бактериального вагиноза в настоящее время во многом остается неясной. С одной стороны, высокая частота обнаружения G.vaginalis у здоровых женщин и детей позволяет рассматривать эти микроорганизмы как составную часть нормальной микрофлоры влагалища. В пользу эндогенного происхождения БВ свидетельствуют следующие факторы: высокая частота обнаружения G.vaginalis у женщин, использующих внутриматочные спирали или пероральные контрацептивы; высокая частота обнаружения G.vaginalis и развитие клинических симптомов заболевания у беременных женщин, в послеродовом, послеабортном и менопаузальном периодах, что, вероятно, связано с напряжением адаптационных возможностей макроорганизма [16, 82]. С другой стороны, в пользу полового пути передачи заболевания свидетельствуют следующие факторы: одновременное выделение G.vaginalis из половых путей женщин, страдающих БВ, и от их сексуальных партнеров; высокая частота реинфекций у излеченных женщин, половые 8 «Бактериальный вагиноз» партнеры которых не лечились одновременно; достоверные случаи заболевания БВ женщин после половых контактов с мужчинами у которых обнаружены G.vaginalis [24, 32]. Отсутствие единого мнения по вопросу о путях передачи БВ, по-видимому, связано с тем, что одной передачи микробов не достаточно для того, чтобы вызвать данное заболевание. Скорее всего, для развития БВ необходимо наличие и предраспологающих факторов, о которых упоминалось выше. К настоящему времени достаточно хорошо изучен характер нарушений микрофлоры влагалища при БВ и спектр микроорганизмов, участвующих в развитии данного заболевания. БВ представляет собой комплекс изменений, как в качественном, так и в количественном соотношении, в вагинальной микрофлоре, которые характеризуются: -резким снижением количества или отсутствием преимущественно лактобактерий, продуцирующих Н2О2 [36]; -увеличением количества G.vaginalis, грамотрицательных анаэробных бактерий – Mobiluncus spp., Prevotella spp., Bacteroides spp., Fusobacterium spp., Peptostreptococcus spp. [16, 56], а также M.hominis и несколько реже U.urealyticum; -небольшим количеством грибов рода Candida [65, 89]. Резкое снижение уровня Н2О2-продуцирующих лактобактерий, вплоть до их полного исчезновения, является первичным проявлением комплекса предшествующих патологических сдвигов. На фоне понижения количества лактофлоры происходит колонизация влагалища G.vaginalis, которые выявляются более чем у 90% женщин в 7 9 количествах достигающих 10 -10 (КОЕ/мл) исследуемого материала. Среди бактерий рода Bacteroides, которые обнаруживаются у 53-97% больных БВ, чаще всего выделяют B.bivies, B.disiens и группу B.melaninigenius. Среди грамположительных анаэробных кокков, которые выделяются в 29-95% случаев, чаще других выделяют P.anaerobius, P.prevotii, P.tetradius и P.asacharalyticus [47, 56]. Бактерии рода Mobiluncus, которые, как и G.vaginalis, одно время считались единственными возбудителями БВ, обнаруживают у 8-35% больных с 10 БВ и всегда в очень высоких количествах – 10 и более [74, 81, 82, 85]. Факультативно-анаэробные микроорганизмы (E.coli, E.fecalis, S.epidermidis и др.) выделяются в 23,4% случаев [6, 9] (Таблица 3). Уровень облигатных анаэробов при БВ может увеличиваться в 1000 раз. Удельный вес лактобактерий снижается до 30% от общего числа микроорганизмов [48]. Такая межмикробная ассоциация поддерживается специфическими катаболитами, которые вырабатываются, с одной стороны G.vaginalis и с другой – облигатно-анаэробными бактериями. Результаты исследований, показавшие возникновение нарушений функциональной активности лейкоцитов в присутствии G.vaginalis, объясняют отсутствие существенной лейкоцитарной реакции у пациенток с БВ. Однако, это не единственная причина супрессии лейкоцитов. Сукцинат, являющийся продуктом метаболизма бактерий рода Bacteroides, также присутствующих в больших количествах в вагинальных образцах, полученных от женщин с БВ, ингибирует хемотаксическую способность лейкоцитов и их фагоцитирующую способность. Таким образом, функции лейкоцитов подавляются синергестическим эффектом как гемолизина гарднерелл, так и сукцинатом бактероидов [9, 47]. Увеличение количества анаэробных микроорганизмов сопровождается продукцией протеолитических ферментов, которые взаимодействуют с вагинальными белками. В результате этого взаимодействия высвобождаются полиамины. Полиамины, в свою очередь, преобразуются в диамины (путресцин, кадаверин), соли которых и придают специфический запах "тухлой рыбы" вагинальному отделяемому при БВ [10, 64]. Обнаружение небольшого количества грибов рода Candida обусловлено, по-видимому, преобладанием в количественном отношении при БВ бактериальной флоры, которая является достаточно сильным антогонистом для мицетов ввиду продукции самых разнообразных бактериоцинов, без которых выживание бактерий в условиях исключительно мощной конкуренции стало бы невозможным [20]. Таблица 3 Видовой и количественный состав микрофлоры влагалища женщин с бактериальным вагинозом Микроорганизмы Частота выделения (%) Количество (КОЕ/мл) 0-11 90-100 до 104 107-109 Микроаэрофильные бактерии: Lactobacillus spp. G.vaginalis Облигатно-анаэробные грамположительные бактерии: Lactobacillus spp. Mobiluncus spp. Peptostreptococcus spp. 0-35 8-35 и до 50 29-95 до 104 1010 и более 105 и более Облигатно-анаэробные грамотрицательные бактерии: Prevotella spp. Bacteroides spp. Fusobacterium spp. до 80 53-97 105 и более 105 и более 104 и более Факультативно-анаэробные грамположительные бактерии: Staphylococcus spp. Streptococcus spp. Enterococcus fecalis Enterococcus faecium 45-65 5-25 более 105 M.hominis U.urealyticum 50-80 10-30 104 и более 104 и более «Бактериальный вагиноз» 9 Клинически БВ характеризуется отсутствием воспалительных изменений, присущих инфекционно-воспалительным заболеваниям аналогичной локализации, этиологическим агентом которых могут быть как условнопатогенные микроорганизмы (E.coli, P.aeruginosa, S.aureus, E.fecalis, E.faecium, U.urealyticum и др.), так и строгие патогены (N.gonorhoeae, C.trachomatis и др.), при колонизации которыми отмечаются лейкоцитоз с инфильтрацией слизистой и соответствующие серологические изменения (появление специфических антител). Инкубационный период составляет в среднем 10 дней. Основной симптом – жалобы на выделения с неприятным запахом, которые отмечают лишь 50% больных [81]. Выделения чаще умеренные, реже – обильные, в ряде случаев они могут вообще отсутствовать. Выделения при БВ серовато-белого цвета, гомогенны, без комков, имеют специфический "рыбный запах", который может быть постоянным, отсутствовать, появляться во время менструации и полового акта. Длительность существования этих симптомов может исчисляться годами. При длительно текущем процессе выделения приобретают желтовато-зеленую окраску, становятся более густыми, нередко напоминают творожистую массу, обладают свойством пениться, слегка тягучие и липкие, равномерно распределяются по стенкам влагалища. Другие жалобы, на зуд и дизурические расстройства, встречаются редко: они могут совсем отсутствовать или появляться периодически. Эти симптомы выявляются у 15,9 - 22,9% пациенток с нарушениями микрофлоры влагалища [2, 39, 87]. Нередко женщины с БВ предъявляют жалобы на обильное менструальное кровотечение, боли в области низа живота, аднексит [11]. В то же время, в ряде случаев у части больных не выявляют никаких объективных и субъективных симптомов [85]. Раздражение вульвы и влагалища наблюдается редко, что отличает БВ от кандидоза и трихомониаза, которые обычно сопровождаются сильным зудом. ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА НАРУШЕНИЙ МИКРОЭКОЛОГИИ ВЛАГАЛИЩА В полной мере оценить состояние микроэкологии влагалища возможно только при комплексом подходе с учетом данных анамнеза, жалоб пациентки, состояния влагалища непосредственно в момент осмотра и комбинации методов лабораторной диагностики. Предварительный диагноз БВ может быть поставлен уже во время гинекологического исследования. Осмотр начинают с наружных половых органов, при котором обращают внимание на окраску и отечность слизистой оболочки вульвы, парауретральных ходов, наружного отверстия уретры и выводных протоков больших желез преддверия влагалища. После этого при помощи влагалищных зеркал производят осмотр стенок влагалища, обращая внимание на их отечность. Для кандидоза характернна сильная гиперемия вульвы и влагалища, при трихомониазе отмечают поверхностную очаговую гиперемию вульвы, а также появление на слизистых оболочках шейки матки и стенок влагалища ярко-красных пятен. При осмотре шейки матки обращают внимание на наличие гнойного цервицита, эрозий или пролиферативных изменений. Во время осмотра отмечают наличие и характер выделений. Выделения – густые, обильные, беловатого цвета нередко сопровождают кандидоз; желтоватые или зеленовато-серые выделения, пенистые, часто зловонные обнаруживаются при инфекциях вызванных, T.vaginalis [9]. После осмотра производят взятие отделяемого из задненижнего свода влагалища. Для диагностики БВ не рекомендуется взятие мазков из цервикального канала или уретры, поскольку их микрофлора не идентична и не может характеризовать БВ, хотя и несет определенную информацию о наличии воспалительного процесса, но он, как правило, вторичен и является результатом БВ. Для проведения бактериологического исследования с целью определения качественного и количественного состава вагинальной микрофлоры, материал забирают при помощи стерильного ватного тампона, калиброванной петли диаметром 3 мм или ложечки Фолькмана и затем помещают в пробирку с универсальной транспортной средой (Stuart,s transport medium; BioMerioux, Becton Dickinson). Для определения рН вагинального содержимого взятие материала производится при помощи стерильного ватного тампона. Далее материал наносится на бумагу. Затем, используя, этот же тампон готовят два мазка на предметных стеклах, один для проведения темнопольной микроскопии, другой для проведения световой микроскопии мазка, окрашенного по Граму. При помощи темнопольной микроскопии материал изучают на присутствие T.vaginalis, Mobiluncus spp., нитей мицелия или дрожжеподобных грибов. На выделения, оставшиеся на тампоне, наносят несколько капель 10% КОН для проведения аминного теста. Диагноз БВ может быть поставлен при наличии 3-х из 4-х перечисленных признаков [24]: -специфический характер выделений; -рН >4,5; -положительный аминотест; -наличие "ключевых" клеток. Выполнение одного из 4-х тестов недостаточно для постановки диагноза. Определение рН вагинального отделяемого В норме водородный показатель вагинального отделяемого, характеризующий его кислотность, составляет 3,8-4,5. Значение рН вагинального отделяемого при БВ превышает нормативные показатели (более 4,5). Определение рН вагинального содержимого проводится с помощью различных модификаций рН метров, например, анализатором ABL330 (Radiometr). Так же возможно использование универсальной индикаторной бумаги (Lachema) с эталонной шкалой от 0 до 12 или лакмусовой бумажки, которые вводятся пинцетом во влагалище или помещаются в каплю выделений, нанесенных на предметное стекло. Во избежании ошибок в клиническом диагнозе обследование не проводят во время менструации, в течении 2-3 дней после полового сношения (сперма может изменять рН вагинального отделяемого), а также на фоне использования антибактериальных или гормональных препаратов. Чувствительность и специфичность этого метода составляют 89% и 85% соответственно [17, 34, 35]. «Бактериальный вагиноз» 10 Аминотест Для БВ характерен положительный аминотест. Вагинальное содержимое часто имеет запах "тухлой рыбы", который является результатом выработки диаминов (путрецин, кадаверин) в процессе реакции декарбоксилирования аминокислот облигатными анаэробами. Соли этих соединений превращаются в летучие амины при щелочном значении рН. При проведении аминотеста в каплю вагинального содержимого, нанесенного на предметное стекло вносится равное количество 10% раствора КОН. При положительном аминотесте определяется запах "тухлой рыбы". Вместе с тем, G.vaginalis, с высокой частотой выделяемая при БВ, не продуцирует эти соединения. Поэтому в случае полного доминирования G.vaginalis в составе вагинального микроценоза аминотест будет отрицательным. Тест на наличие специфического запаха явно субъективен, результаты его подвержены искажению в связи с индивидуальными особенностями личного восприятия процедуры непосредственным исполнителем. Тем не менее, чувствительность и специфичность этого диагностического теста равны 79% и 97% соответственно [17]. Микроскопическое исследование Для проведения микроскопического исследования мазки высушивают на воздухе, фиксируют и после этого окрашивают. Приготовление мазков Исследуемый материал распределяют тонким слоем по поверхности предметного хорошо обезжиренного стекла. Влагалищное отделяемое, нанесенное на предметное стекло ближе к узкому краю, накрывают другим предметным стеклом. Стекла слегка придавливают друг к другу. После этого свободные концы стекол захватывают I и II пальцами обеих рук и разводят в противоположные стороны так, чтобы при движении оба стекла плотно прилегали друг к другу. Таким образом, получаются мазки с равномерно распределенным материалом. Высушивание и фиксирование мазков Приготовленный на предметном стекле мазок высушивают на воздухе и после полного высыхания фиксируют. При фиксировании мазок закрепляется на поверхности предметного стекла, и поэтому при последующей окраске препарата микробные клетки не смываются. Кроме того, убитые микробные клетки окрашиваются лучше, чем живые. Различают физический способ фиксации, в основу которого положено воздействие высокой температуры на микробную клетку, и химические способы, предусматривающие применение химических средств, вызывающих коагуляцию белков цитоплазмы. - Физический способ фиксации Предметное стекло с препаратом берут пинцетом или I и II пальцами правой руки за ребра мазком кверху и плавным движением проводят 2-3 раза над верхней частью пламени горелки. Весь процесс фиксации должен занимать не более 2с. Надежность фиксации проверяют следующим приемом: свободную от мазка поверхность предметного стекла прикладывают к тыльной поверхности левой кисти. При правильном фиксировании мазка стекло должно быть горячим, но не вызывать ощущения ожога. - Химический способ фиксации Для фиксации мазков применяют также химические вещества и соединения - этиловый (винный) спирт 960, ацетон, смесь Никифорова (смесь спирта и наркозного эфира в соотношении 1:1), жидкость Карнуа (спирта 96% 60 мл, хлороформа 30 мл, ледяной уксусной кислоты 10 мл). Предпочтительнее считается щадящая химическая фиксация (ацетон, смесь Никифорова, жидкость Карнуа) [15]. Предметное стекло с высушенным мазком погружают в склянку с фиксирующим веществом на 10-15 минут и затем высушивают на воздухе. Далее проводится классическая окраска мазка по методу Грама. Для проведения этой окраски могут быть использованы специальные комерческие красители, например, фирмы BioMerioux или красители, приготовленные непосредственно в лаборатории. Окраска по Граму Окраска по Граму относится к сложному способу окраски. При сложных способах окраски на мазок воздействуют двумя красителями, из которых один является основным, а другой – дополнительным. Кроме красящих веществ, при сложных способах окраски применяют различные обесцвечивающие вещества: спирт, кислоты и т.д. Особенностью окраски по Граму является неодинаковое отношение различных микроорганизмов к красителям трифенилметановой группы: генциановому, метиловому или кристаллическому фиолетовому. Микроорганизмы, входящие в группу грамположительных (Грам+), например стафилококки, стрептококки, дают прочное соединение с указанными красителями и йодом. Окрашенные микроорганизмы не обесцвечиваются при воздействии на них спиртом, вследствие чего при дополнительной окраске фуксином Грам(+) микроорганизмы не изменяют первоначально принятый фиолетовый цвет. Грамотрицательные (Грам-) микроорганизмы (бактероиды, фузобактерии и др.) образуют с генциановым кристаллическим или метиленовым фиолетовым и йодом легко разрушающееся под действием спирта соединение, в результате чего они обесцвечиваются и затем окрашиваются фуксином, приобретая красный цвет. Отношение микроорганизмов к окрашиванию по Граму имеет большое диагностическое значение. Приготовление растворов Кристаллический фиолетовый (фуксин Циля карболовый) – карболовый раствор: 1г кристаллического метилового фиолетового растирают в фарфоровой ступке с 5г кристаллической карболовой кислоты и несколькими каплями глицерина. Во время растирания небольшими порциями прибавляют 10 мл спирта. После того как краситель хорошо разотрется, прибавляют при постоянном помешивании 100 мл дистиллированной воды. Раствор красителя фильтруют «Бактериальный вагиноз» 11 через влажный бумажный фильтр. Фуксин очень стойкий и может храниться долгое время во флаконе темного стекла с притертой пробкой. Раствор Люголя – 2г йодида калия растворяют в 5-10 мл дистиллированной воды, затем прибавляют 1г кристаллического йода, оставляют на несколько часов до полного его растворения и после этого приливают приливают 295-290 мл дистиллированной воды. Фуксин спирто-водный (раствор Пфейфера) – к 1 части карболового фуксина Циля приливают 9 частей дистиллированной воды. Раствор очень не стойкий, поэтому его готовят в небольших количествах непосредственно перед употреблением. Методика окраски 1. Фиксированный мазок окрашивают через фильтровальную бумагу основным красителем – раствором основного карболового кристаллического фиолетового. Прокрашивание длится 1-2 минуты. 2. Снимают бумагу, сливают избыток красителя и, не промывая препарата водой, наливают раствор Люголя на 1-2 минуты до почернения препарата. 3. Раствор Люголя сливают. Предметное стекло для обесцвечивания мазка погружают несколько раз в стаканчик со спитртом, процесс обесцвечивания считается завершенным, когда от мазка перестают отделяться окрашенные в фиолетовый цвет струйки жидкости. 4. Препарат тщательно промывают водопроводной водой. 5. Докрашивают спирто-водным раствором фуксина. Прокрашивание длится 1-2 минуты. Результаты окраски Грам(+) микроорганизмы окрашиваются основным красителем в темно-фиолетовый цвет, Грам(-), воспринимая дополнительную окраску, приобретают ярко-малиновый цвет. К недостаткам этого метода окраски следует отнести определенные трудности при отнесении выявленных микроорганизмов к Грам(+) или Грам(-) по цвету из-за их неоднородного прокрашивания ввиду возможности присутствия в вагинальном мазке большого количества слизи и разнообразных продуктов жизнедеятельности микроорганизмов. В этой связи Мавзютов А. Р. и соавт. предложили использовать для микроскопической диагностики БВ окраску метиленовым синим [15]. Окраска метиленовым синим Приготовление растворов: Раствор "А": 2,5 г кристаллического фиолетового растворить в 250 мл дистиллированной воды (годен 3-4 недели); Раствор "Б": 12,5 г натрия карбоната растворить в 250 мл дистиллированной воды (годен 2 нед., до выпадения кристаллов); Раствор йода: 1 г натрия гидроксида растворить в 7 мл дистиллированной воды, затем добавить 5 г кристаллического йода и 0,25 к калия йодида, к полученному раствору добавить дробно 243 мл дистиллированной воды; Смывная жидкость для обесцвечивания: 75 мл ацетона добавить к 175 мл этилового спирта; Раствор сафранина: 5 г сафранина растворить в 15-20 мл этилового спирта и добавить до 250 мл дистиллированной воды. Окраска мазков 1. Мазки фиксируют над пламенем горелки. На свободную от исследуемнго материала часть стекла одновременно наносят по 6 капель растворов "А" и "Б". Смешивают стеклянной палочкой и равномерно распределяют по стеклу. Экспозиция – 2 мин. 2. Удаляют остатки краски и наносят раствор йода на 2 мин. 3. Удаляют остатки йода и наносят 10-20 капель смывной жидкости, повторяют манипуляцию до полного обесцвечивания, постоянно покачивая стекло. 4. Промывают водопроводной водой. 5. Докрашивают сафранином 2 мин. Промывают водой, просушивают, микроскопируют. Результаты окраски При использовании данной окраски происходит оптимальное прокрашивание препарата метиленовым синим грамположительной флоры в голубые тона и грамотрицательной - в интенсивный иссиня-черный цвет. Непосредственную микроскопию лучше проводить под относительно небольшим увеличением (окуляр х 2-7) с целью увеличения поля зрения и максимального охвата всех присутствующих в материале объектов. С учетом современных достижений клинической бактериологии и знаний инфекционной патологии женских половых органов Кира Е. Ф. в 1994 году была разработана оригинальная классификация микроскопической характеристики биоценоза влагалища, в которой представлена микроскопическая характеристика 4 типов биоценоза влагалища и соответствующие каждому типу нозологические формы: 12 «Бактериальный вагиноз» Нормоценоз Доминирование лактобактерий, отсутствие грамотрицательной микрофлоры, спор, мицелия, псевдогифов, наличие единичных лейкоцитов и единичных "чистых" эпителиальных клеток соответственно фазе менструального цикла. Типичное состояние нормального биотопа влагалища. Промежуточный тип Умеренное или незначительное количество лактобактерий, наличие грамположительных кокков, грамотрицательных палочек. Обнаруживаются лейкоциты, моноциты, макрофаги, эпителиальные клетки. Часто наблюдается у здоровых женщин, редко сопровождается субъективными жалобами и клиническими проявлениями. Дисбиоз влагалища Незначительное количество или полное отсутствие лактобактерий, обильная полиморфная грамотрицательная и грамположительная палочковая и кокковая микрофлоры; наличие "ключевых" клеток. Количество лейкоцитов вариабильно, отсутствие или незавершенность фагоцитоза. Полимикробная картина мазка. БАКТЕРИАЛЬНЫЙ ВАГИНОЗ Вагинит Большое количество лейкоцитов, макрофагов, эпителиальных клеток, выраженный фагоцитоз, морфологический пейзаж воспалительного процесса. Неспецифический вагинит При обнаружении: гонококков, трихомонад, мицелия, псевдогифоф, спор выставляется соответствующий этиологический диагноз – Гонорея, Трихомониаз, Микотический вагинит [7, 8]. Предложенная классификация достаточно проста и информативна, так как сочетает в себе микробиологическую интерпритацию влагалищного мазка, характеристику клинической картины и соответствующую нозологическую форму. Наиболее важное диагностическое значение при БВ имеет выявление "ключевых" клеток. Формирование "ключевых" клеток происходит в случае увеличения колонизации G.vaginalis и последующей их адгезии на клетки вагинального плоского эпителия. Таким образом "ключевые" клетки представляют собой отторгшиеся от эпителиальной выстилки интактные или литически измененные клетки, колонизированные G.vaginalis. G.vaginalis покрывают всю поверхность эпителиальных клеток в виде облака или вуали, а в наиболее клинически выраженных случаях заполняют собой все межклеточное пространство. Однако, выявление "ключевых" клеток при микроскопии влажного неокрашенного мазка увеличивает вероятность получения ложноположительного результата, так как часто "ложноключевые" клетки (эпителиальные клетки с адгезированными на них лактобактериями) отождествляют с истинными, что ведет к гипердиагностике БВ. Некоторые авторы считают, что более достоверную информацию можно получить при микроскопии вагинальных мазков, окрашенных по методу Грама, когда "ключевые" клетки легко дифференцировать с "ложноключевыми". Чувствительность микроскопического метода диагностики составляет 93%, а специфичность 70% [6]. Микроскопический метод позволяет оценить не только морфологические особенности и соотношение отдельных компонентов вагинальной микрофлоры, но и получить информацию о состоянии слизистой влагалища и наличии лейкоцитарной реакции макроорганизма. Количественный критерий обнаружения "ключевых" клеток остается дискутабельным, поскольку до настоящего времени окончательно не решен вопрос о показаниях нормы для микрофлоры влагалища. Вместе с тем, общепризнанным является факт превалирования в норме бактерий рода Lactobacillus, что позволило использовать его в качестве основного при исследовании БВ. В пользу указанного свидетельствует невозможность чрезмерного развития сопутствующей флоры, а следовательно и наличие "ключевых" клеток, при сохраненном количественном уровне лактобактерий. Это автоматически исключает подщелачивание среды влагалища и т.д., характерные для БВ. В настоящее время существует несколько микроскопических классификаций БВ. Мавзютов А. Р. и соавт. предложили дифференцирование БВ по трем степеням: 1 степень – компенсированный, для которого характерно полное отсутствие в исследуемом материале микрофлоры при неизмененных эпителиоцитах. Указанное состояние слизистой влагалища не рассматривается в качестве патологического, но отсутствие лактобактериальной флоры свидетельствует о принципиальной возможности заселения «Бактериальный вагиноз» 13 пустующей экологической ниши попадающими с наружных половых органов микроорганизмами и последующим формированием БВ ввиду нарушения на фоне отсутствия лактобактерий естественной колонизационной резистентности слизистой. Описанные формы могут наблюдаться при микроскопии в результате "чрезмерной" подготовки пациентки к посещению врача или же после проведения интенсивной химиотерапии антибактериальными препаратами широкого спектра действия (Цефалоспорины, макролиды и т.п.). 2 степень – субкомпенсированный, характеризующийся количественным снижением лактобактерий, соизмеримым с возрастанием количества сопутствующей грамвариабельной полиморфной бактериальной флоры, и появлением в поле зрения единичных (1-5) "ключевых" клеток при относительно умеренном лейкоцитозе (15-25 в поле зрения). "Ключевые" клетки могут быть представлены как покрытыми бактериальной флорой снаружи эпителиоцитами, так и содержащими бактерии внутриклеточно ввиду неспецифического осуществления эпителиальными клетками функций фагоцитоза. 3 степень – декомпенсированный, являющийся клинически выраженным в соответствии с симптоматикой БВ и микроскопически характеризующийся полным отсутствием лактобактерий, когда все поле зрения заполнено "ключевыми" клетками. Бактериальная флора при этом может быть представлена самыми различными, за отсутствием лактобактерий, микроорганизмами как в монокультуре, так и в различных морфо- и видовых сочетаниях [15]. Одним из методов лабораторной диагностики, который позволяет в полной мере оценить качественные и количественные характеристики микрофлоры влагалища является бактериологическое исследование. C развитием этого метода изменялось и представление о составе микрофлоры влагалища. Усовершенствование бактериологического метода диагностики – улучшение качества питательных сред, методов культивирования, различных техник выделения и идентификации микроорганизмов способствовали изменению представлений о критериях нормы. Первоначально было установлено, что наряду с лактобактериями в составе нормальной микрофлоры могут быть и условно-патогенные микроорганизмы (стафилококки, стрептококки, некоторые грамотрицательные бактерии) [13, 14]. Внедрение с начала 70-х годов техники анаэробного культивирования привнесло новые существенные коррективы в понятие "нормальная" вагинальная микрофлора. По мере совершенствования анаэробной техники и идентификации строгих анаэробов заметно расширился спектр микроорганизмов, входящих в состав нормальной вагинальной микрофлоры [16, 17]. Однако, бактериологический метод исследования не универсален, пределы его возможностей весьма ограничены и зачастую зависят от ряда субъективных факторов, таких как оснащенность бактериологической лаборатории, качество используемых для выделения микроорганизмов питательных сред, уровень подготовки бактериологов и т.д. Поэтому результаты исследований различных авторов значительно варьируют и в настоящее время пока еще не определены четкие критерии "нормофлоры" влагалища, пограничных и патологических состояний. А это, в свою очередь, создает определенные трудности в постановке диагноза, прогнозировании тяжести течения патологического процесса и возможности его осложнений, а также в назначении адекватной этиотропной терапии. Бактериологический метод Классическое бактериологическое исследование отделяемого из влагалища позволяет оценить как качественный, так и количественный состав бактериальной микрофлоры. Дифференциация и идентификация микроорганизмов – определение родовой, видовой и типовой принадлежности микроорганизмов является наиболее трудоемким и ответственным этапом бактериологического исследования. Он осуществляется на основании изучения целого комплекса свойств: морфологических, тинкториальных, культуральных, ферментативных и антигенных. При идентификации микроорганизмов необходимо работать только с чистой культурой, поскольку присутствие посторонних микроорганизмов может исказить результаты исследования и послужить поводом для ошибочного заключения. Широкий спектр микрорганизмов, играющих роль в формировании микробиоценоза влагалища, а также в возникновении инфекционного процесса, требует изучения их ферментативной активности путем постановки большого количества различных биохимических реакций, позволяющих по сочетанию полученных результатов в комплексе с другими данными определить вид микроорганизма. Этот раздел работы наиболее трудоемкий, проводится в несколько этапов, требует приготовления большого количества питательных сред, дефицитных реактивов, посуды и т.д., что делает этот метод исследования достаточно дорогостоящим. В связи с этим, в настоящее время для идентификации микроорганизмов используются микрометоды – коммерческие микротест-системы или слайды для биохимической идентификации микроорганизмов различных групп. Важным фактором, значительно влияющим на успех бактериологической диагностики БВ, является корректный способ взятия и транспортировки исследуемого материала. Так, взятие материала должно всегда осуществляться до начала лечения биотерапевтическими или антибактериальными препаратами или не ранее чем через 10 дней после окончания их приема, а также до начала проведения других местных терапевтических вмешательств. Накануне взятия материала пациентка не должна иметь половую связь. Для предотвращения гибели бактерий, чувствительных к различным факторам окружающей среды, и во избежании размножения в исследуемом материале бактерийкомменсалов транспротировка взятого материала в лабораторию должна осуществляться в максимально короткие сроки и в специальных транспортных средах. В настоящее время бактериологи располагают большим арсеналом коммерческих универсальных транспортных сред, которые способны сохранять в жизнеспособном состоянии весь спектр культивируемых микроорганизмов. В зависимости от цели исследования, которая определяется в необходимости проведения точной количественной оценки микрофлоры или возможностью ограничиться ориентировочным (полуколичественным) методом, вагинальное отделяемое высевается на питательные среды двумя методами: 1.взятие вагинального отделяемого производится с помощью калиброванной петли (диаметр 3 мм) или ложечки Фолькмана, затем материал погружается в 1 мл жидкой транспортной среды, далее из материала готовят серийные разведения из расчета 10:1(объем/вес) и затем по 0,1 мл высевают на различные селективные питательные среды; «Бактериальный вагиноз» 14 2.взятие вагинального отделяемого производится микробиологическим тампоном и засевается на среду обогощения (тиогликолевая среда) и на половину чашки Петри с селективной питательной средой с последующим рассевом (метод истощения). Степень роста в первом случае определяется в пересчете на 1 мл вагинального отделяемого (КОЕ/мл). При полуколичественной оценке используется четыре уровня (градации) микробного обсеменения: со среды обогащения – рост только на жидкой среде, на плотной питательной среде рост отсутствует; скудный рост – на плотной питательной среде рост до 10 колоний микроорганизмов определенного вида; умеренный рост – на плотной питательной среде рост от 10 до 100 колоний микроорганизмов одного вида; обильный рост – на плотной питательной среде рост более 100 колоний микроорганизмов одного вида. Посев проводится на набор стандартных питательных сред, позволяющих выявить максимально возможный спектр микроорганизмов. Питательные среды должны: • содержать необходимые для питания микроорганизма питательные вещества; • Иметь реакцию рН, оптимальную для выращиваемого вида микроорганизма; • иметь достаточную влажность, так как микроорганизмы питаются по законам диффузии и осмоса; • обладать изотоничностью; • быть стерильными, обеспечивая тем самым возможность выращивания чистых культур микроорганизмов. Для выделения всего спектра факультативно-анаэробных микроорганизмов и определения их количественных характеристик обычно используется агар с добавлением 5% донорской крови. Стафилококки представляют собой широко распространенную в природе группу микроорганизмов, объединяющую в себе наряду с сапрофитическими и болезнетворные формы с различно выраженной степенью их патогенности и вирулентности. В связи с этим, выделение стафилококков из вагинального содержимого, содержащего смешанную флору, не может являться доказательством их этиологического значения. Только выделение монокультуры стафилококка из закрытых гнойных очагов, независимо от свойств штамма является бесспорным доказательством его патогенности. Для выделения стафилококков используют отечественные питательные среды – желточно-солевой агар Чистовича, молочно-солевой агар или коммерческую среду Staphylococcus agar (Becton Dickinson). Эти среды обладают элективными свойствами, обусловленными высоким содержанием хлорида натрия, а желточно-солевой агар, кроме того, позволяет более четко, чем кровяной агар, дифференцировать патогенные и непатогенные штаммы стафилококка. Стрептококки выделяют на среде Columbia agar (BioMerioux, Becton Dickinson, Oxoid) с добавлением лошадиной или бараньей дефибринированной крови (5%), налидиксовой кислоты (15 мг/л) и колистина (10 мг/л). Кроме стрептококков на этой среде растут коагулазопозитивные стафилококки. В связи с этим, перед идентификацией бактерии необходимо исследовать на наличие каталазы. Для выделения энтерококков (стрептококки группы D) используют Enterococcus agar (Serva), Enterococcus agar (Difco), Slanes and Bartley agar или Bile Esculine agar (Oxoid). При проведении количественного исследования посев -3 -5 производится из исходного материала в разведениях 10 и 10 . Во все среды, кроме Bile Esculine agar входит трифенилтетразолий хлорид (ТТХ), который, расщепляясь энтерококками, придает их колониям характерную розовую или малиновую окраску. В состав среды Bile Esculine agar входят соли желчи, к которым устойчивы энтерококки. Кроме того, в среду входят эскулин и цитрат железа. Энтерококки способны гидролизовать эскулин с образованием эскулетина и глюкозы. Эскулетин, связываясь с цитратом железа, образует комплекс черного цвета, который придает характерную черную окраску колониям энтерококков и среде вокруг них. Для выделения грамотрицательных неспорообразующих факультативно-анаэробных бактерий обычно используют среды MACCONKEY agar или Эндо (Oxoid, BioMerioux, Becton Dickinson). При количественном методе -5 -7 исследования посевы на эти среды осуществляют из разведений 10 и 10 . При учете колоний отмечают отдельно лактозонегативные и лактозопозитивные колонии. Для выделения дрожжеподобных грибов используется среда Сабуро с добавлением хлорамфеникола (400 мг/л). При проведении количественного исследования посев производят из разведения 10-3. Инкубация посевов проводится в 0 течении 24-48 часов при температуре +37 С. Для выделения G.vaginalis используют коммерческие селективные питательные среды Columbia CNA agar (Becton Dickinson), Gardneralla vaginalis agar (Oxoid) или HBT Bilayer medium (BBL) в которые добавляется 10% бараньей или донорской крови. Инкубация посевов проводится при 370С в атмосфере с 5% СО2 в течение 48 часов. Для транспортировки биологического материала при бактериологическом исследовании на микоплазмы используют только специальные транспортные среды, содержащие лошадиную сыворотку и дрожжевой экстракт производства BioMerioux или Becton Dickinson. Посев материала производится на плотную питательную среду A7 (BioMerioux, Becton Dickinson). Для культивирования, идентификации, количественного определения и определения чувствительности к антибиотикам микоплазм могут быть использованы тест-системы - Mycoplasma DOU (Sanofi Diagnostics Pasteur) или Mycoplasma IST (BioMerioux). Для выделения лактобактерий чаще всего используют агаризованные среды MRS (Difco, Oxoid). При количественном методе исследования посев проводят из разведений 10-3 и 10-5. Для того чтобы избежать роста дрожжеподобных грибов рода Candida в среду добавляют раствор сорбиновой кислоты в 1 М NaOH из расчета 14 г/л, простерилизованную фильтрованием. Инкубацию проводят в анаэростате с газовой смесью без палладиевого 0 катализатора при +37 С в течении 48 часов. «Бактериальный вагиноз» 15 Изоляция анаэробных бактерий остается самой деликатной процедурой. Для выращивания анаэробов необходимо создать определенные условия, сущность которых заключается в удалении молекулярного кислорода из питательной среды и пространства, окружающего эти культуры. Среды должны быть приготовлены ex tempore или, в том случае, если они приготовлены заранее, должны храниться в условиях анаэробиоза. Другим обязательным условием, обеспечивающим выделение анаэробов из исследуемого материала, является внесение большого количества посевного материала в питательную среду. Самым простым способом удаления растворенного кислорода из питательной среды является кипячение. Непосредственно перед посевом материала пробирки с питательными средами кипятят в водяной бане в течение 10-20 минут. При кипячении из среды вытесняется воздух и, следовательно, удаляется кислород. Свежеприготовленную питательную среду быстро охлаждают, погружая в лед или подставляя под струю холодной воды, чтобы не дать ей насытиться кислородом воздуха, и используют для посева. Для уменьшения диффузии кислорода из воздуха питательные среды заливают сверху стерильным вазелиновым или парафиновым маслом (толщина слоя 1-1,5 см). Посев биологического материала производят пипеткой сквозь масло в наклонном положении пробирки. В качестве редуцирующих веществ используют глюкозу, аскорбиновую кислоту, цистеин, гликокол, глютатион. Активно связываются с кислородом животные ткани паренхиматозных органов. На этом свойстве животных клеток основано приготовление питательной среды Китта-Тароцци, широко применяемой для выращивания анаэробов. В жидкие питательные среды помещают иногда пористые вещества: вату, пемзу, которые адсорбируют на своей поверхности пузырьки воздуха. Для создания бескислородных условий используют физические, химические и биологические факторы. Физические способы культивирования анаэробов Способ Виньяля-вейона. Берут 4-5 пробирок с 0,5% расплавленным и охлажденным до температуры 40-450С сахарным агаром. В содержимое одной из них вносят пипеткой небольшое количество исследуемого материала и тщательно размешивают. Для уменьшения концентрации материала с целью получения изолированных колоний засеянную среду в количестве, соответствующем объему внесенного материала, переносят из 1-й пробирки во 2-ю, из 2й в 3-ю. Затем содержимым каждой пробирки заполняют капилляры трех пастеровских пипеток. Чтобы предупредить застывание питательной среды в момент насасывания ее в пипетки, кончик их, пока он не обломан, погружают на 3-5 минут в стерильную воду при температуре 45-500С. После заполнения вытянутый конец трубки запаивают и помещают в стеклянный цилиндр с ватой на дне. Через 2-3 суток в столбике агара вырастают ясно видимые колонии микробов-анаэробов. Выросшие колонии легко изолировать. Для этого капилляр надрезают напильником выше уровня намеченной колонии, надламывают, а колонию микрорганизма, находящуюся в агаре, извлекают петлей и пересевают в свежую питательную среду. Выращивание анаэробов в условиях вакуума. Вакуумные условия для выращивания анаэробов создают в анаэростате или эксикаторе. Исследуемый материал или культуру микроорганизмов засевают в пробирки с жидкой средой или на чашки Петри с плотной питательной средой. Сразу после посева чашки со средами помещаются в микроанаэростат с палладиевым катализатором (Oxoid) для поглощения кислорода и индикатором для выявления свободного кислорода (Disposable anaerobic indicator BBL, Becton Dickinson). Катализатор перед употреблением 0 регенерируют в сухожаровом шкафу при температуре +175-180 С в течение часа. Затем микроанаэростат закрывают, удаляют из него воздух при помощи вакуумного насоса, после чего микроанаэростат заполняют нулевым поверочным азотом. Вновь удаляют газ из микроанаэростата, заполняют его газовой смесью (10% СО2, 10% Н2, 80% N2) и помещают в термостат. Анаэробные условия в микроанаэростате могут быть созданы и при использовании коммерческих газогенерирующих пакетов для анаэробов (BioMerioux; Becton Dickinson). После 48 часов инкубации проводят первый учет чашек с отсевом типичных колоний на жидкие питательные среды для анаэробов (Rosenow cysteine, Diagnostics Pasteur; Schadler with Vitamin K1, BBL, Becton Dickinson; Thioglycolate, Serva) для изучения культуральных свойств микроорганизмов и последующей идентификации, а также отсевов на плотные питательные среды, которые затем культивируют в аэробных условиях, чтобы убедиться, что выросшие микроорганизмы не являются факультативноанаэробными. После первого учета чашки возвращают в микроанаэростат и инкубируют еще в течение 72 часов. Затем повторно изучают морфологию колоний, обращая особое внимание на появление черного пигмента, и производят отсев в жидкие питательные среды материал из тех колоний, которые отсутствовали при первом учете чашек, т. е. через 48 часов инкубации. Микроаэрофилы (G.vaginaluis и Lactobacillus sp.) выращиваются в условиях пониженного содержания О2 в атмосфере СО2 в эксикаторе. Анаэростат – прибор для выращивания микроорганизмов в анаэробных условиях – представляет собой толстостенный металлический цилиндр с герметически привинчивающейся крышкой, на которой имеются вакууметр и два крана для присоединения к вакуум-насосу. Коммерческие микроанаэростаты (BbioMerioux, Becton Dickinson, Oxoid) представляют собой пластиковые цилиндры различного объема с металлическими плотно закрывающимися крышками, на которых также имеются вакууметр и два крана. Химические методы выращивания анаэробов (Метод Аристовского) Материал, исследуемый на наличие анаэробов, засевают на среду в чашки Петри и помещают их в эксикатор, на дно которого кладут химический поглотитель кислорода: гидросульфат натрия или пирогаллол. В расширенную часть сосуда устанавливают на подставке чашки с посевами. Прибор помещают в термостат при температуре 370С на 24-48 часов. Биологический метод выращивания анаэробов (по Фортнеру) «Бактериальный вагиноз» 16 В чашку Петри наливают толстым слоем 5% кровяной агар с 1-2% глюкозы. Посередине чашки в питательной среде вырезают стерильным скальпелем канавку шириной 1-1,5 см, которая делит питательную среду на две половины. Одну из них засевают культурой анаэробов или исследуемым на их наличие биологическим материалом, другую половину – культурой аэробов: Serratia marcescens или E.coli. Перед посевом чашки подсушивают в термостате, чтобы анаэробы вместе с капельками влаги не могли попасть на другую сторону чашки. Засеянные чашки закрывают, а свободное пространство между дном и крышкой заклеивают лейкопластырем, чтобы предупредить поступление в чашку кислорода извне. В термостате чашки устанавливают вверх дном. Быстрорастущие аэробы, поглощая находящийся в чашке кислород, создают тем самым благоприятные условия для роста анаэробов. Большинство грамотрицательных анаэробных бактерий могут быть изолированы на средах с добавлением канамицина (100 мг/л), ванкомицина (7,5 мг/л), гемина (10 мг/л), витамина К3 (менадион, 1,5 мг/л) или К1 (фитоменадион, 1,5 мг/л), а также бараньих эритроцитов (5%). К базовым относятся среды Columbia agar Base (BBL, Becton Dickinson; BioMerioux), Schaedler agar или Wilkins Chalgren agar (Oxoid). При количественном методе исследования материал засевают из 10-6, 10-7 и 10-8 разведений. Срок инкубирования составляет 48 часов при температуре 350С. Для выделения бифидобактерий используют среду Блаурокка. Для предотвращения роста аэробных бактерий в среду добавляют азид натрия в концентрации 100 мг/л. При количественном методе исследования посев производят из -5 -7 -9 10 , 10 и 10 разведений. При полуколичественном методе исследования посев проводят методом агаровых столбиков в полужидкой питательной среде, либо на плотной питательной среде на чашке Петри. Инкубацию проводят в микроанаэростате при +370С в течении 48 часов. В том случае, если посев производился в толщу среды, после инкубации отмечают образование зоны задержки роста и газообразование. В агаре бифидобактерии образуют характерные колонии, напоминающие гречишные зерна, но могут также образовывать колонии в форме дисков. Грамположительные анаэробные кокки выделяют на базовых средах (Columbia agar Base и др. см. выше), с добавлением бараньей крови (5%), налидиксовой кислоты (10 мг/л) и колистина (10 мг/л) или фенилэтилалкола (2,5 г/л). Выделение бактерий рода Mobiluncus проводят с использованием Columbia agar Base с добавлением 2,5% лошадиной сыворотки, 15 мкг/мл налидиксовой кислоты и 1,0 мкг/мл тинидазола. Возможно использование и другой селективной среды – Columbia agar Base с добавлением 5% бараньей крови, 10 мкг/мл колистина и 15 мкг/мл налидиксовой кислоты. Инкубация посевов производится в анаэробных условиях 4-5 дней при температуре +370С. Для выделения клостридий используют плотную среду RCM (Oxoid). В прбирки с расплавленной средой, разлитой по 9 мл и охлажденной до +480С, засевают взятый материал (при количественном методе исследования посев производят из 10-3, 10-5 и 10-7 разведений). Быстро ресуспендируют, затем в каждую пробирку добавляют небольшое количество (1,5 см) расплавленной среды RCM, содержащей метиленовую синьку в концентрации 1:20000 для того, чтобы предохранить среду от диффузии кислорода. Учет результатов производится через 16-18 часов инкубации. Для выделения C.perfringens используют селективную питательную среду TSC (Oxoid). В среду добавляют Д-циклодекстрин (400 мг/л) и эмульсию яичного желтка (50 мг/л) (Oxoid). С.perfringens на этой среде приобретают черный цвет, из за содержания в ней метабисульфита натрия и цитрата железа. Наличие эмульсии яичного желтка позволяет различить лецитиназопозитивные клостридии. Культуральные признаки микрооганизмов определяются характером их роста на питательных средах. Будучи постоянными для каждого вида микроорганизма, они являются важным диагностическим признаком. Идентификация выделенных чистых культур бактерий в зависимости от целей может быть ориентировочной (определение рода) или финальной (определение вида). Видовая идентификация выделенных чистых культур бактерий проводится общепринятыми методами с использованием номенклатуры Берджи и сведений, обобщенных в руководствах по клинической микробиологии. При видовой идентификации стафилококков учитываются пигмент, способность гемолизировать эритроциты, продуцировать лецитиназу, коагулировать плазму. Характерная пигментация колоний патогенных стафилококков, относящиеся к виду S. aureus, определяется при их росте на селективной питательной среде, содержащей высокую концентрацию NaCl (7,5%), маннит в качестве источника углеводов и желатин. Патогенные стафилококки, дают на этой среде колонии с желтой пигментацией. Ферментацию маннита определяют путем нанесения на изолированную колонию капли раствора бромтимолового синего (0,04%). В случае смены цвета красителя на желтый реакция считается положительной. На этой же среде возможно определение способности стафилококков сбраживать желатину. Для этого на изолированную колонию наносят каплю 20% водного раствора сульфосалициловой кислоты (реакция Stone). В случае положительной реакции через 10 минут вокруг колонии появляется прозрачная зона. Для подтверждения принадлежности бактерий к виду S.aureus проводятся тесты на выявление плазмокоагулазы и ДНК-азы. ДНК-азная активность выявляется на среде DNA agar (Oxoid) путем пересева материала из подозрительных колоний штрихами от центра к краю чашки. После инкубирования нуклеазная активность стафилококков выявляется при нанесении на среду красителя толуидинового синего (0,1%), при этом вокруг колоний, образованных S. aureus, появляется зона порозовения среды. Для подтверждения принадлежности стафилококков к виду S.aureus можно также воспользоваться идентификационными системами Staphyslide – Test (BioMerioux), принцип работы которых основан на агглюцинации эритроцитов, сенсибилизированных человеческим фибриногеном. Биохимическая идентификация стафилококков проводится при помощи тест-систем API 20 Staph и RAPIDEC staph (BioMerioux). Видовая идентификация стрептококков основана на их биохимической активности и может быть проведена при использовании тест-системы API 20 Strept (BioMerioux). Видовая идентификация грамотрицательных неспорообразующих факультативно-анаэробных бактерий производится при помощи тест систем API 20E (BioMerioux). Оксидазопозитивные бактерии (Pseudomonas spp., Aeromonas spp. и др.) идентифицируются с помощью тест системы API 20NE (BioMerioux). Для идентификации лактозопозитивных бактерий могут быть использованы тест-системы Enterofermtub, а лактозонегативных Oxifermtub (BioMerioux, Becton Dickinson). Кроме того, для идентификации всех грамотрицательных бактерий может быть использована тест-система BBL CRYSTAL (Becton Dickinson) или полуавтоматическая система "Sceptor" (Becton «Бактериальный вагиноз» 17 Dickinson) с использованием полистироловых планшетов для видовой идентификации грамотрицательных факультативно-анаэробных бактерий. При отсутствии вышеперечисленных тест-систем энтеробактерии могут быть идентифицированы с помощю 12 биохимических тестов, которые выявляют: -способность энтеробактерий ферментировать глюкозу, лактозу, мальтозу, -маннит, сахарозу; -способность расти на цитратном агаре Симмонса; -отношение к мочевине и молонату натрия; -подвижность и способность продуцировать сероводород и индол. Для видовой идентификации C.albicans, обладающей способностью продуцировать характерные для них хламидоспоры, подозрительные колонии (белые или розовые) пересевают со среды Сабуро на среду PCB (Diagnostics Pasteur) методом укола в толщу среды. Пробирки с пересевами инкубируют при комнатной температуре 24-48 часов. После инкубации определяют небольшой участок в зоне роста микроорганизмов и делают разветвленный мазок между двумя стеклами. Мазки изучают с помощью темнопольной микроскопии, при этом хламидоспоры ищут в зонах образования филаментов с находящимися на них бластоспорами. В случае отсутствия хламидоспор проводят повторный пересев. Если при этом вновь получают отрицательный результат, проводят биохимическую идентификацию дрожжеподобных грибов при помощи системы API 20C Aux (BioMerioux) или Micotube (BioMerioux, Becton Dickinson). Также видовая идентификация грибов рода Candida может быть проведена с помощью микробиологической системы Quantum (Abbot). При идентификации гарднереллы учитывается морфология колоний на селективной питательной среде через 2-4 дня инкубации. Обычно колонии бывают выпуклыми, шарообразными с гемолизом. При микроскопии – мелкие палочки или коккобациллы, по отношению к окраске по Граму – грамвариабильные. Каталазо- и оксидазоотрицательные, продуцируют кислоту при гидролизе крахмала и мальтозы, чувствительны к метронидазолу и триметоприму. Ориентировочная идентификация лактобактерий проводится микроскопическим методом (окраска мазка по Граму), которая позволяет оценить морфологию клеток. В мазках лактобактерии имеют вид прямых палочек, расположенных в виде блоков, не имеют спор. Бактерии рода Lactobacillus не образуют каталазы и оксидазы. Идентификация факультативно-анаэробных лактобактерий проводится с помощью систем индикаторных бумажных для идентификации лактобактерий (СИБ-Л) и планшета биохимического, дифференцирующего лактобактерии (ПБДЛ) (НИИЭМ, г. Нижний Новгород). Идентификации подвергаются грамположительные каталазоотрицательные палочки, выросшие через 48 часов на среде MRS. Для выделения чистой культуры проводится двукратное пассирование отдельных колоний. Дифференциация основана на выявлении ферментативных свойств штаммов по их действию на углеводы и многоатомные спирты (глюкоза, меллибоза, манноза, мелецитоза, рамноза, салицин). Учет результатов проводится через 72 часа инкубации при температуре +370С. Интерпритация результатов биохимического тестирования производится при помощи таблиц биохимических свойств лактобактерий. Анаэробные штаммы лактобактерий идентифицируются с помощью полуавтоматической системы "Sceptor" (Becton Dickinson), после предварительного исключения способности тестируемых бактерий к спорообразованию. Ориентировочная идентификация облигатно-анаэробных грамотрицательных бактерий проводится по следующим критериям: рост в присутствии желчи (диски 5 мг, BioMerioux), бриллиантового зеленого (диски 100 мкг, BioMerioux) и канамицина (диски 1000 мкг, BBL, Becton Dickinson), ферментация глюкозы, наличие черного пигмента. Используя эти тесты, бактерии делят на 4 группы: 1 группа - Bacteroides группы fragilis. Все бактерии этой группы сбраживают глюкозу и способны расти в присутствии желчи и канамицина, бриллилантовый зеленый подавляет их рост; 2 группа – бактерии рода Prevotella. Бактерии этой группы растут в присутствии канамицина, но не растут в присутствии желчи и бриллиантового зеленого, обладают сахаролитической активностью – сбраживают глюкозу. Некоторые виды могут образовывать черный пигмент на кровяных средах после 5-7 дней инкубации; 3 группа – род Porphyromonas. Асахоролитические бактерии, не растущие в присутствии желчи и бриллиантового зеленого, но растущие в присутствии канамицина, образуют черный пигмент. Бактерии этой группы чувствительны еще и к ванкомицину (диски 5 мкг, BBL, Becton Dickinson). 4 группа – бактерии рода Fusobacterium. Эти бактерии не растут в присутствии желчи и канамицина, но растут в присутствии бриллиантового зеленого. Для выявления группы Prevotella melaninogenica/ Porphyromonas asacharolytica и некоторых других строгих анаэробов (Fusobacterium spp., Clostridium dificile) первичные посевы возможно исследовать в лучах длинноволнового ультрафиолетового излучения, при использовании люминисцентного микроскопа с фильтрами ФС 1-2 и СЗС 24-4. При наличии микроорганизмов группы Pr.melaninogenica / P.asacharoliticus колонии светятся малиновым цветом. Зеленое свечение характерно для Fusobacterium spp. или Clоstridium dificile. Финальная идентификация облигатно-анаэробных грамотрицательных бактерий проводится с применением биохимической идентификационной системы для этих бактерий API (BioMerioux), а также на полуавтоматической системе "Sceptor" (Becton Dickinson) c использованием полистироловых планшетов для грамотрицательных облигатноанаэробных бактерий. Грамположительные анаэробные кокки могут быть идентифицированы на основании их чувствительности к новобиоцину (диски 25 мкг) и по их биохимическому профилю с применением биохимической идентификационной системы rapid ID32 A (API – BioMerioux) или полуавтоматической системы "Sceptor" (Becton Dickinson) с использованием полистироловых планшетов для видовой идентификации грамположительных анаэробных кокков. «Бактериальный вагиноз» 18 Ориентировочная идентификация бифидобактерий проводится микроскопическим методом (окраска мазка по Граму), который позволяет оценить морфологию клеток. В мазках бифидобактерии обычно имеют вид прямых или разветвленных палочек X,Y и V-образной формы с утолщениями на концах. Бактерии рода Bifidobacterium синтезируют фермент фруктозо-6-фосфатфосфокетолазу (Ф6-ФФК), не образуют индол и каталазу, не восстанавливают нитраты, не сбраживают адонит (рубит), дульцит, эритрит, глицерин, рамнозу и альфа-метил-D-маннозид. Биохимическая идентификация клостридий может быть осуществлена при помощи идентификационных систем API 20A или RapID Ana II (BioMerioux). Видовая идентификация гарднерелл проводится по морфологическим критериям (окраска по Граму – грамвариабильные коккопалочки) и на основании биохимической идентификации при помощи идентификационных систем API 20 Strep или API Zym (BioMerioux). Ввиду отсутствия единых представлений о показателях нормы из-за, прежде всего, технической сложности культивирования облигатно-анаэробных и микроаэрофильных микроорганизмов в настоящее время не определены четкие критерии нормоценоза вагинальной микрофлоры, пограничных состояний и БВ. Чаще всего при бактериологической диагностике вагинального отделяемого используются следующие критерии: Нормоценоз 6 8 -общее количество микроорганизмов в вагинальном отделяемом составляет 10 -10 КОЕ/мл; -абсолютное преобладание лактобактерий; 4 -условно-патогенные микроорганизмы в низком титре - <10 КОЕ/мл; Бактериальный вагиноз -массивное микробное обсеменение вагинального отделяемого с общим количеством микроорганизмов, превышающим 109 КОЕ/мл; -отсутствие лактобактерий или резкое снижение их титра до 104 КОЕ/мл и менее; -полимикробный характер микрофлоры с абсолютным преобладанием облигатно-анаэробных микроорганизмов и G.vaginalis [17]. При проведении классического бактериологического исследования необходимо учитывать тот факт, что само по себе обнаружение отдельных видов облигатных анаэробов и G.vaginalis не всегда равнозначно микробиологическому диагнозу БВ, т.к. G.vaginalis и облигатно-анаэробные микроорганизмы могут быть частью индигенной микрофлоры. Поэтому, бактериологическая диагностика БВ должна, в первую очередь, основываться на интегральной оценке микрофлоры с учетом не только ее видового и количественного состава, но и количественного соотношения отдельных ее компонентов. РЕЦЕПТЫ ОСНОВНЫХ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД 1. Мясная вода Парную говядину или конину освобождают от костей, жира, сухожилий, пропускают через мясорубку. 1 кг полученного мясного фарша заливают 2 л водопроводной воды и кипятят в течении часа, накипь снимают. После кипячения мясную воду остужают для застывания жира, который легко при этом удаляется, фильтруют через ватно-марлевый фильтр до полной прозрачности, затем доливают водопроводной водой до первоначального объема, разливают в бутыли и 0 стерилизуют 20 минут при температуре +120 С. 2. Пептонная вода К 1л дистиллированной воды прибавляют 1- 2г пептона и 0,5г хлорида натрия, устанавливают необходимое значение рН, кипятят 30 минут, проверяют рН, фильтруют через бумажный фильтр до полной прозрачности и стерилизуют при 0 температуре +120 С в течение 30 минут. 3. Мясо-пептонный бульон К 1 л мясной воды добавляют 1г сухого пептона и 5мг хлорида натрия, устанавливают нейтральную рН, кипятят в течении 30 минут, после чего доводят уровень воды до первоначального объема. Затем фильтруют через бумажный фильтр, окончательно устанавливают насыщенным расвором гидрокарбоната натрия или 10% раствором едкого натра требуемую реакцию, стерилизуют 15-20 минут при температуре +1200С. Если после стерилизации в мясо-пептонном бульоне выпадает осадок, его фильтруют вторично и снова стерилизуют. Вторичная стерилизация производится при более низкой температуре, чем предшествующая, для предотвращения выпадения осадка. 4. Мясо-пептонный агар К 1л мясной воды прибавляют 1г пептона и 0,5г хлорида натрия, кипятят на слабом огне при постоянном помешивании до полного растворения добавленных ингредиентов. Приготовленный таким образом бульон фильтруют, устанавливают слабощелочную реакцию (рН 7,2-7,4) и добавляют 0,2-2г измельченного агар-агара (в зависимости от качества агар-агара и назначения среды). После добавления агар-агара жидкость кипятят на слабом огне при постоянном помешивании до полного растворения агара. При помутнении среды ее просветляют. Приготовленный агар фильтруют или декантируют, разливают в пробирки или во флаконы и стерилизуют в автоклаве при температуре +1200С в течение 20 минут. 5. Сахарный бульон (бульон с глюкозой) К 1л мясопептонного бульона нейтральной реакции прибавляют глюкозу в количестве 0,25мг-2г. Перед добавлением к бульону глюкозу растворяют в небольшом количестве дистиллированной воды. Приготовленную среду стерилизуют текучим паром 3 дня подряд по 30 минут или однократно в автоклаве при температуре +1150С 30 минут. 6. Триптический перевар Хоттингера Говяжье мясо освобождают от костей, жира, сухожилий, нарезают мелкими кусочками, взвешивают и опускают в кипящую воду из расчета 1 кг мяса на 1 л воды. Мясо кипятят в течение 15-20 минут, затем вынимают и пропускают «Бактериальный вагиноз» 19 через мясорубку. Бульон смешивают с фаршем и сливают в бутыль с таким расчетом, чтобы 1/3 бутыли оставалась свободной. К горлышку бутыли подбирают хорошо пригнанную резиновую пробирку. Смесь подщелачивают 20% раствором питьевой соды до рН 7,8-8,0, прибавляют очищенную от жира, соединительной ткани и дважды пропущенную через мясорубку поджелудочную железу в количестве 10% к имеющемуся объему (на 1 л жидкости 100 г железы). Вместо панкреатической железы можно прибавить панкреатин в количестве 0,5% и выше в зависимости от его активности. Через 1-2 часа после добавления фермента проверяют реакцию перевара и подщелачивают его повторно до рН 7,4-7,5. Отсутствие сдвига реакции смеси в сторону окисления после прибавления фермента указывает на его недоброкачественность. Содержание бутыли тщательно перемешивают, добавляют хлороформ из расчета 10-30 мл на каждый литр 0 перевара. Бутыль плотно закрывают резиновой пробкой и ставят в термостат при +37 С на 7-10 суток. В течении первого дня содержимое бутыли перемешивают вначале каждые 15-20 минут, затем через 2-3 часа, а в последующие дни – по нескольку раз в день, открывая при этом пробку для выхода избытков паров хлороформа. При стоянии в термостате мясо ферментируется, преврящаясь в однородный осадок серовато-желтого цвета, а жидкость из мутносерой становится совершенно прозрачной, соломенно-желтого цвета. Об окончании переваривания судят по образованию триптофана, обнаруживаемого следующим образом: в пробирку наливают 3-4 мл фильтрованного перевара, добавляют 3-4 капли бромной воды. При наличии триптофана жидкость принимает розово-фиолетовый цвет. Приготовление бромной воды. На 100 мл дистиллированной воды берут 3-3,5 мл чистого брома для получения насыщенного раствора. Хранят в склянке темного стекла. 7. Кровяной агар 0 Расплавляют 1л 2% мясо-пептонного стерильного агара, охлаждают его до температуры +45 С и прибавляют 5-10мл дефибринированной стерильно взятой крови лошади, кролика или барана. Добавление крови производят, соблюдая правила стерильности. Готовую среду разливают в стерильные чашки Петри (предварительно нагретые в термостате), дают ей застыть и подсушивают в термостате. Слой агара должен быть равномерно окрашен в красный цвет. 8. Бульон на переваре Хоттингера Для приготовления бульона основной перевар Хоттингера разводят в несколько раз дистиллированной или водопроводной водой, добавляя на 1л бульона 0,5мг хлорида натрия, 1мг двузамещенного фосфата калия, устанавливают рН 7,4-7,6 и кипятят 15-20 минут. Приготовленный таким образом бульон фильтруют через ватно-марлевый или бумажный фильтр, разливают во флаконы или пробирки и стерилизуют при температуре +1200С в течение 20-30 мин. 9. Желточно-солевой агар (Чистовича) Для приготовления желточно-солевого агара готовят впрок мясо-пептонный агар (рН 7,2-7,4) с содержанием 10% хлорида натрия. После разливки во флаконы по 100-200 мл агар стерилизуют в автоклаве в течение 20 минут при температуре +1200С. Перед употреблением расплавливают, охлаждают до +45-500С и добавляют 20% по объему) стерильной желточной взвеси (1 желток куриного яйца на 150-200 мл стерильного изотонического раствора хлорида натрия). Среду быстро помешивают, разливают в стерильные чашки, которые продолжительное время могут сохраняться в холодильнике. 10. Молочно-солевой агар К 1л расплавленного мясо-пептонного агара рН 7,2-7,4, содержащего 5-7,5г хлорида натрия, добавляют 10мл стерильного теплого хорошо обезжиренного молока, тщательно перемешивают и разливают в чашки. 11. Среда Эндо 0 Мясо-пептонный (100 мл) агар рН 7,4 растапливают и охлаждают до температуры +70 С, прибавляют 1 г лактозы, предварительно растворенной в стерильной пробирке в небольшом количестве дистиллированной воды и прокипяченной. В отдельных пробирках приготовляют: 2-3 мл спиртового насыщенного основного фуксина; 10 мл 10% водного раствора сульфида натрия. В стерильную пробирку отмеривают 1 мл фуксина и прибавляют раствор сульфида натрия до обесцвечивания фуксина (бледно-розовый цвет). Приготовленную смесь вливают в растопленный агар, хорошо перемешивают и разливают по чашкам. Горячий агар имеет бледно-розовый цвет, а при застывании становится бесцветным. Среду готовят в день ее использования. 12. Среда Ресселя К 100 мл мясо-пептонного агара (рН 7,2) прибавляют 1г лактозы, 1г глюкозы и 1 мл индикатора Андреде. Среду 0 разливают в пробирки в количестве 5-6 мл, стерилизуют в автоклаве при +112 С в течение 20 минут и скашивают так, чтобы на 2-3 см от дна пробирки агар оставался в виде столбика. Ферментацию лактозы определяют по появлению малиновой окраски соответственно добавленному индикатору Андреде в скошенной части среды, сбраживание глюкозы – по окраске столбика. При сбраживании лактозы и глюкозы происходит резкое покраснение всей среды: столбика и скошенной его части. Характер изменения цвета среды Ресселя определяется не одинаковой интенсивностью расщепления микроорганизмами азотистых веществ и образованием щелочных продуктов в аэробных и анаэробных условиях. Газообразование в среде определяют по вспениванию конденсационной жидкости на дне пробирки, а также по образованию трещин и разрывов в агаре. 13. Цитратный агар Симмонса «Бактериальный вагиноз» 20 Растворяют в 1 л дистиллированной воды сульфата магния 2мг, фосфата натрия-аммония 1,5 г, одноосновного фосфата калия 1 г, цитрата натрия кристаллического 3 г, Смесь стерилизуют в автоклаве. Прибавляют 20 г агар-агара, нагревают до его расплавления, устанавливают рН 7,2 и затем прибавляют 1 мл 1,5% спиртового раствора бромтимолового синего. 14. Среда Сабуро Помещают 18 г агара в 1 л дистиллированной воды и дают ему набухать 30 мин, нагревают, помешивая, пока не растворится агар, добавляют 10 г пептона и 40 г глюкозы или мальтозы. Стерилизация среды проводится в течение 15 0 мин при +115 С. 15. Среда Китта-Тароцци Печень животного, обычно говяжью, нарезают кусочками по 1,0-1,5 г, прибавляют по весу тройное количество мясопептонного бульона или бульона Хоттингера нейтральной реакции, кипятят 30 минут. Бульон отфильтровывают, печень промывают под краном на сите. Отфильтрованный бульон разливают по 7-10 мл в пробирки. В каждую пробирку кладут по 4-5 кусочков отмытой печени. Бульон сверху заливают слоем вазелинового масла и стерилизуют в автоклаве при давлении 0,5 атм 30 минут. 16. Кровяной агар Цейсслера К 1л 3% мясо-пептонного агара прибавляют 1г глюкозы, устанавливают рН 7,2, разливают во флаконы по 100 мл, стерилизуют при давлении 0,5 атм 30 минут. Перед употреблением к расплавленной и охлажденной до +450С среде прибавляют 20мл свежей дефибринированной крови. Среду разливают в чашки Петри. 17. Кровяной сахарный агар 0 Агар 2% на бульоне Хоттингера в объеме 100 мл расплавляют и охлаждают до +45 С, после чего добавляют к нему 10-15 мл свежевзятой стерильной дефибринированной крови кролика, барана или крупного рогатого скота и 10 мл 20% стерильного раствора глюкозы. Смесь взбалтывают так, чтобы не образовалось пузырей пены, и разливают по чашкам. РЕЦЕПТЫ ИНДИКАТОРОВ 1. Индикатор бромтимоловый синий Бромтимоловый синий позволяет определить изменение реакции среды в пределах рН 6,0-7,6. В щелочной зоне рН 7,6 индикатор имеет синий цвет, в кислой зоне рН 6,0 – желтый. При изменении рН в указанном диапазоне бромтимоловый синий изменяет окраску через различные оттенки зеленого цвета. В нейтральной точке рН 7,0 индикатор имеет характерный, легко запоминающийся травянистый оттенок. В работе применяют раствор бромтимоловый синий, приготовленный по следующей прописи. Бромтимоловый синий 0,4 г растворяют в 40 мл дистилированной воды, нагревая ее до кипения. После этого к раствору прибавляют 6,4 мл децинормального раствора едкого натра, в результате чего жидкость приобретает зеленоватый цвет, и доливают дистиллированной водой до 100 мл. Приготовленный таким образом индикатор может сохраняться в темном месте в склянке, закрытой притертой пробкой в течении длительного времени. 2. Индикатор Андреде Фуксина кислого 0,5 г растворяют в 16,4 г N раствора гидрата окиси натрия, прибавляют 100 мл дистиллированной 0 0 воды, настаивают 24 часа при +37 С, стерилизуют при температуре +100 С в течение 5 минут. Сохраняют во флаконах темного стекла с притертой пробкой. Приготовленной таким образом индикатор имеет соломенно-желтый цвет. При смещении рН в кислую зону индикатор Андреде приобретает ярко-малиновый цвет. 3. Индикаторная бумага на сероводород Для выявления сероводорода полоски фильтровальной бумаги смачивают в растворе следующего состава: - дистиллированная вода 100 мл - ацетат свинца 20 г - бикарбонат натрия 1 г. Бумагу высушивают, нарезают полосками шириной 0,2-0,4 мм и длинной 5-6 см. Перед употреблением бумага бесцветна, а при образовании микробной культурой сероводорода приобретает черно-бурый цвет. 4. Индикаторная бумага на индол Полоски фильтровальной бумаги пропитывают следующим реактивом: парадиметиламидобензальдегид – 5г, спирт этиловый 96% - 50 мл, фосфорная кислота (очищенная концентрированная) – 10 мл. После растворения порошка полученной тепловатой жидкостью смачивают полоски фильтровальной бумаги, высушивают и хранят их в банке темного стекла. Цвет бумажек желтый, при наличии индола – серовато-розовый до интенсивного малинового. 5. Индикатор для обнаружения оксидазы Нафтола 30-40 мг растворяют в 2,5 мл этилового спирта-ректификата, добавляют 7,5 мл дистиллированной воды и расворяют 40-60 мг диметил-П-фенилендиамина. РЕЦЕПТЫ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФЕРМЕНТАЦИИ УГЛЕВОДОВ Цветные среды Гисса с углеводами К 100 мл дистиллированной воды добавляют 1 г пептона, 0,5 г хлорида натрия. Пептон и соль растворяют при нагревании воды в течение нескольких минут, фильтруют через бумажный фильтр так, чтобы раствор был совершенно прозрачным, устанавливают рН 7,0-7,4, прибавляют 0,5-1 г одного из необходимых углеводов (лактоза, глюкоза, «Бактериальный вагиноз» 21 сахароза, маннит и т.д.), а затем индикатор Андреде в количестве 1 мл на 100 мл среды или 0,1 мл 1,6% раствора индикатора бромтимолового синего. Готовую среду разливают по 3 мл в пробирки, простерилизованные вместе с поплавками, расположенными 0 запаянным концом кверху. Среду стерилизуют текучим паром 3 дня подряд по 30 или 20 минут при температуре +112 С. Во время стерилизации поплавки заполняются доверху питательной средой. Основой сред, применяемых для определения ферментации углеводов, является пептонная вода. Мясной бульон для этой цели не пригоден, так как он содержит различные углеводы, что может привести к получению неправильных результатов. Среды Гисса с индикатором Андреде имеют соломенно-желтый цвет, с индикатором бромтимоловым синим – болотно-зеленый (рН 7,0-7,2). В результате роста бактерий, сопровождающегося расщеплением углевода с образованием кислых продуктов, цвет среды изменяется: в первом случае она приобретает ярко-розовый цвет; во втором – желтый. Образование газа в среде определяют по наличию пузырьков газа, собирающихся в поплавке. МЕТОД ГАЗОЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ Использование метода газожидкостной хроматографии при диагностике БВ основано на идентификации группы веществ – продуктов метаболизма микроорганизмов, связанных с БВ, и микроорганизмов, присутствующих в норме. К числу таких метаболитов относят летучие жирные кислоты (уксусная, изопропионовая, пропионовая, изомасляная, масляная, изовалериановая, валериановая) и нелетучие органические кислоты (молочная и янтарная). В качестве материала для исследования используются смывы вагинального отделяемого в физиологическом растворе. Для этого во влагалище вводится 3 мл стерильного физиологического раствора, делается смыв вагинального содержимого со стенок влагалища ватным микробиологическим тампоном и переносится в пробирку с притертой пробкой. Для анализа летучих жирных кислот готовятся их эфирные экстракты. К 1 мл образца добавляется 0,5-1 мл диэтилового эфира и экстрагируется в пробирке со шлифом в течении 1 минуты с помощью миницентрифуги "Vortex". После этого эфирный экстракт отделяется, использованием пастеровской пипетки с небольшим количеством безводного сульфата магния. Для анализа нелетучих компонентов образец подвергается метилированию: к 2 мл смыва добавляют 4 мл метанола, пробирку закрывают пленкой и на 45 минут помещают в морозильную камеру при температуре –200С. Далее жидкость переливается в герметическую пробирку и к ней добавляется 0,2 мл 50% раствора серной кислоты, после чего пробирка выдерживается в течении 30 минут при +800С. По завершении процесса этерификации содержимое пробирки охлаждается проточной водой и в нее добавляется 2 мл дистиллированной воды. Для экстракции летучих эфиров используется 1 мл хлороформа. 1 мкл подготовленных экстрактов вводится в инжекторхроматограф с помощью микрошприца. В качестве эталона используются экстракты водных растворов летучих жирных кислот и нелетучих органических кислот (внешний стандарт). Для проведения газожидкостной хроматографии возможно использование хромотографа "Chrom-5". Хромотограф "Chrom-5" оснащен пламенноионизационным детектором и стеклянными колонками, заполненными сорбентом FFAP 15% на Chromosorb W, 80-100 mesh. Рабочие условия: температура испарителя - +1900С, термостата - +500С, детектора - +2500С. Скорость газа-носителя (азота) и водорода 30 мл в минуту, воздуха – 300 мл в минуту. Идентификация анализируемых веществ проводится с учетем времени их удерживания, а концентрации анализируемых веществ определяются по площади пика на хромотограмме. Интерпритация результатов проводится в соответствии с руководствами по микробиологии и хроматографии. Метод газожидкостной хроматографии позволяет сравнить содержание в вагинальном отделяемом основных продуктов метаболизма лактобактерий и облигатно-анаэробных микроорганизмов – молочной и янтарной кислот. В норме соотношение янтарной и молочной кислот составляет 0,4, а при БВ более 0,4. Чувствительность и специфичность метода варьируют и, по данным, зарубежных авторов, составляют от 78-81% до 100% [11]. По данным Анкирской А.С. и соавт чувствительность и специфичность метода составляют 80% и 88,6% соответственно [2]. При БВ также выявляют высокие концентрации летучих жирных кислот, продуцируемых строгими анаэробами. На практике этот метод используется редко из-за высокой степени сложности и дороговизны. МЕТОД ГЕНОДИАГНОСТИКИ Молекулярно-биологические методы идентификации нуклеиновых кислот микроорганизмов находят все более широкое применение в практической медицине. Одним из основных приложений молекулярно-биологических подходов для решения медицинских задач остается изучение бактериальной микрофлоры, населяющей организм человека в норме и патологии. Причины этого кроются в самом характере микрофлоры, проводить лабораторную диагностику которой необходимо при нарушении микробиозинозов (дисбактериоз влагалища, желудочно-кишечного тракта и т.д.). При данных патологиях классическими лабораторными методами обследования являются культуральный посев и микроскопия. Золотым стандартом микробиологии считается культуральный посев - исследование, обладающее 100% специфичностью по отношению к данному возбудителю. Основным методическим приемом микробиологии является выделение и культивирование бактериальной флоры в виде чистой культуры. Этот этап накладывает существенные ограничения на возможности использования микробиологического анализа для полной оценки состояния микрофлоры. По различным данным мы способны культивировать не более 15% микроорганизмов, населяющих организм человека. Некультивируемые микроорганизмы могут быть представлены известными или неизвестными видами, неспособными расти в лабораторных условиях или находящимися в "дремлющем" состоянии (споры). Проблема культуральной диагностики БВ в том, что высеваемая микрофлора представлена анаэробными (облигатными и факультативными) микроорганизмами и микроаэрофилами. Если культивирование факультативных анаэробов не представляет особой сложности, то бактериологическое обнаружение строгих анаэробов и микроаэрофилов затруднено. Для проведения адекватного бактериологического исследования на анаэробы и микроаэрофилы необходимо наличие специальных сред, как транспортных, так и сред для культивирования, а также создание определенных условий инкубации. Несмотря на «Бактериальный вагиноз» 22 достигнутые успехи в области создания культуральных сред для обнаружения Gardnerella vaginalis, Mycoplasma hominis, Ureaplasma urealiticum и Mobiluncus spp., их культивирование и идентификация остаются деликатной процедурой, требующей длительного времени и опыта. Соблюдение всех этих требований часто оказывается невозможным для рядовой бактериологической лаборатории, но даже в хорошо оснащенных клинико-диагностических центрах процент высеваемости этих микроорганизмов составляет 12-60 %. Существенным недостатком культурального посева является также длительность исследования. Время роста отдельных микроорганизмов может составлять от нескольких дней до нескольких недель, в течение которых больной не получает адекватного лечения. В ряде случаев при БВ необходима видовая идентификация возбудителя (например, для представителей рода Mobiluncus, Fusobacteria), что требует дополнительных средств и времени при использовании микробиологического подхода. Отчасти проблему обнаружения анаэробной микрофлоры в лабораторных условиях решает использование световой микроскопии с окраской мазка по Грамму. При таком обследовании легко обнаружить микроорганизмы, имеющие характерную форму и локализацию. Как сказано выше, одним из критериев БВ яляется наличие "ключевых" клеток, которые можно увидеть в урогенитальном мазке под микроскопом. Это зрелая эпителиальная клетка, по всей поверхности которой плотно и в большом количестве прикреплены мелкие граммвариабельные палочки, представляющие собой G. vaginalis. Одновременно в таком мазке можно обнаружить представителей семейства Mobiluncus, имеющих характерную форму. При окраске по Граму они вариабельны или граммотрицательны, несмотря на строение клеточной стенки, характерной для граммположительных бактерий. Это связано с очень тонким пептидогликановым слоем, что снижает эффективность прокрашивания. Существенным недостатком микроскопического анализа мазка является невозможность видовой идентификации микроорганизмов. Качественная оценка микрофлоры заключается в характеристики только морфотипов бактерий: лактоморфотип, морфотипы гарднереллы, бактероидов, фузобактерий, мобилункуса, вейллонеллы, что является очень грубой оценкой состояния бактериальной микрофлоры. Решить проблему быстрого и качественного обнаружения представителей анаэробной микрофлоры и микроэророфилов способны методы генодиагностики (ДНК-ДНК гибридизация и ПЦР), позволяющие выявлять микроорганизмы непосредственно в урогенитальном мазке, минуя стадию культивирования и выделения чистой культуры. Методы генодиагностики основаны на детекции ДНК возбудителя в клиническом материале. Сходство физико-химических свойств всех нуклеиновых кислот позволило создать универсальные процедуры обнаружения ДНК любых микроорганизмов в биопробе, а уникальность генетического материала каждого конкретного возбудителя легла в основу специфичности метода, позволяющего проводить видовую идентификацию. Для проведения генодиагностики не требуется забор образцов в специальные транспортные среды и создания особых условий хранения и транспортировки, что существенно снижает себестоимость проводимого анализа. При этом время проведения анализа сопоставимо по скорости с микроскопическим исследованием и составляет 4,5-5 часов. Основным методом генодиагностики, используемым при обследовании больных с БВ, является полимеразная цепная реакция – ПЦР и ее модификации. В основе метода ПЦР лежит комплиментарное достраивание участка геномной ДНК или РНК возбудителя, осуществляемое in vitrо с помощью фермента термостабильной ДНК-полимеразы. Специфичность метода определяется уникальностью генетического материала выявляемых инфекционных агентов, к которому подобраны олигонуклеотидные праймеры, участвующие в процессе амплификации. ПЦР-анализ клинического образца включает в себя три основных этапа: пробоподготовка, амплификация и регистрация результатов. Забор клинических образцов для проведения ПЦР диагностики не требует специальных транспортных сред. Объектом исследования может служить любой биоматериал (соскоб клеток цервекального канала, уретры, отделяемое содержимое влагалища) взятый от больного и на холоду доставленный в ПЦР лабораторию. В результате несложных манипуляций из полученного биоматериала выделяют нуклеиновые кислоты (ДНК или РНК), являющиеся матрицей в реакции амплификации. Реакция амплификации представляет собой многократно повторяющиеся циклы синтеза специфической области ДНК-мишени в присутствии термостабильной ДНК-зависимой ДНК-полимеразы. В каждом цикле происходит удвоение числа копий амплифицируемого участка, что позволяет за 30-40 циклов наработать фрагмент ДНК, ограниченный парой специфических праймеров, в количестве, достаточным для его детекции. Детекция продуктов амплификации осуществляется с помощью электрофореза в агарозном геле (большинство отечественных тест-систем) либо путем гибридизации со специфическим к последовательности ампликона олигонуклеотидным зондом (диагностические системы фирмы Roche, наборы серии ПлаТАн НПФ "Литех"). Отличительной особенностью ПЦР диагностики является универсальность подхода для выявления различных инфекционных агентов. Так как объектом исследования служит молекула ДНК, обладающая сходными химическими свойствами у всех организмов, процедуры выявления вирусной, бактериальной, человеческой ДНК одинаковы, что позволяет проводить комплексное исследование биопробы методом ПЦР. Наряду с культуральным методом и микроскопией, ПЦР является прямым методом выявления возбудителя, но при этом обладает существенно большей чувствительностью. Чувствительность ПЦР достигает единичных копий возбудителя в биопробе, что позволяет существенно повысить эффективность выявления инфекционных агентов непосредственно в клиническом образце, минуя стадию бактериологического посева. Особенно эффективен метод ПЦР для диагностики представители микрофлоры с внутриклеточной или мембранной локализацией (Chlamydia trachomatis, представителей семейства Mycoplasma и др.), а также трудно-культивируемых, некультивируемых и персистирующих форм микроорганизмов, поскольку этот метод позволяет избежать сложностей, связанных с выращиванием таких микроорганизмов в лабораторных условиях. Применение метода ПЦР диагностики позволяет избежать сложностей идентификации микроорганизмов, имеющих малые физические размеры и разнообразные формы, так как снимаются ограничения на размер и формы возбудителя, накладываемые использованием световой микроскопии с окраской мазка по Грамму. Особенностью протекания микоплазменных инфекций является стертый имунный ответ организма хозяина и «Бактериальный вагиноз» 23 высокая антигенная изменчивость самого возбудителя, что делает неэффективным использование методов ИФА и выводит на первый план ПЦР-диагностику. В урогинекологической практике наиболее рационально и экономически обоснованно использование метода ПЦР для выявления Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae [32], представителей семейства Mycoplasma [41, 42], Gardnerella vaginalis [66, 86] и вирусных инфекций (урогенитального герпеса и цитомегаловируса) [78]. В последнее время ПЦР активно используется для выявления представителей анаэробной флоры – Вacteroides spp, Mobiluncus curtissi, Fusobacterium nucleatum. Исследование больной с БВ методом ПЦР позволяет в первую очередь исключить наличие безусловно патогенной микрофлоры (Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae и Trichmonas vaginalis), требующей назначения адекватного этиотропного лечения. Первые стандартизированные тест-системы AMPLICOR Chlamydia trachomatis (фирма "Roche") были внедрены в клиническую практику в 1992 году, а в 1993 начато их массовое производство. Позднее, в 1995 году появился новый набор AMPLICOR Chlamydia trachomatis / Neisseria gonorrhoeae (фирма "Roche"), позволяющий одновременно выявлять эти возбудители. По данным зарубежных и отечественных исследователей Chlamydia trachomatis обнаружена у 5 - 16 % больных, обследованных по поводу БВ [32]. Применение ПЦР технологии для детекции Trichmonas vaginalis позволяет в ряде случаев повысить специфичность анализа и существенно сократить время его производства. В ходе клинической апробации тест-системы для обнаружения ДНК Trichmonas vaginalis в вагинальных выделениях, предложенной Лин П.Н. с соавт. (1997 г), были получены данные по сравнению эффективности ПЦР диагностики, микроскопии и культурального посева. Из 165 клинических образцов 16 были положительны по данным ПЦР и росту культуры и только 9 из них были выявлены с помощью микроскопии [59]. В настоящее время тест-системы для обнаружения ДНК Trichmonas vaginalis (в том числе и отечественные) активно используются в практике клинико-диагностических лабораторий. Широкое использование ПЦР диагностики Trichmonas vaginalis в практической медицине вскрыло другую проблему – высокий процент ложноположительных результатов по данным микроскопии мазка. По данным медицинского диагностического центра "Медикур" (Москва) в течение 4-х лет проводившего массовые обследования пациентов только у 0,7% больных выявляется Trichmonas vaginalis методом ПЦР и культуральным методом, тогда как по данным микроскопии встречаемость в 2,5 раза выше. По данным клинико-диагностической лаборатории НПФ "Литех" среди больных, обследуемых по поводу БВ, процент выявляемости Chlamydia trachomatis составляет 5,7 %, Trichmonas vaginalis – 1,1%. Обнаружение представителей безусловно патогеной микрофлоры на фоне БВ ведет к установлению пациенту соответствующего диагноза – хламидиоз, трихомониаз или гонорея. Чаще всего ПЦР-диагностика позволяет выявить у больных с выраженным БВ представителей условно-патогенной микрофлоры Mycoplasma hominis, Ureaplasma urealiticum и Gardnerella vaginalis. По данным зарубежных исследователей Gardnerella vaginalis выявляется почти у всех обследованных пациенток с выраженным БВ (10 из 11) и у 40% женщин вне зависимости от их клинического статуса [66]. При выявлении условно-патогенных представителей семейства микоплазм использование ПЦР позволяет повысить эффективность и специфичность проводимых анализов. Так, при обследовании 50 больных с урогенительными патологиями у 12 -ти (24%) Ureaplasma urealyticum обнаружена методом ПЦР и только у 5 (10%) путем культивирования [84]. Методы генодиангостики позволяют не только обнаружить присутствие Ureaplasma urealyticum в клиническом образце, но и оценить степень патогенности возбудителя. Показано, что популяция Ureaplasma urealyticum – это гетерогенная группа микроорганизмов. Описано 14 серотипов Ureaplasma urealyticum, которые с помощью молекулярнобиологических подходов объединены в два биовара: Parvo и T-960. Предполагается, что биовар Parvo является более патогенным, чем биовар Т-960, и именно ему принадлежит ведущая роль в развитии уреаплазменной инфекции [72]. Проведение ПЦР анализа клинических образцов позволяет установить принадлежность выявляемой Ureaplasma urealyticum к одному из биоваров и таким образом оценить степень ее патогенности. По данным НПФ "Литех" у 83% обследованных больных с уреаплазменной инфекцией выявляется Ureaplasma urealyticum, принадлежащая к биовару Parvo и у 17% к биовару Т-960 [5]. В лабораторной практике широко используется метод ПЦР для выявления в клинических образцах ДНК Mycoplasma hominis, что позволяет отказаться от трудоемкого и дорогостоящего культурального метода. В последнее время помимо Mycoplasma hominis, при БВ диагностируется M. genetalium (1,5 %) [71] и M. fermentas [83], хотя их роль в развитии патологического процесса обсуждается. На сегодняшний день в НПФ "Литех" проведены клинические испытания новых диагностических тест-систем, позволяющих выявлять методом ПЦР представителей анаэробной флоры – Mobiluncus curtissi, Prevotella (bacteroideа) bivia – в клиническом материале. Среди проанализированных образцов ДНК Mobiluncus curtissi выявлена в 12% случаев, ДНК Prevotella bivia – в 28%. Эти данные не противоречат общепринятым представлениям о высеваемости Mobiluncus curtissi и Prevotella bivia при БВ – 8-35% и до 80% соответственно. В научном плане ПЦР используется для установления устойчивости к тетрациклину и эритромицину высеваемой при БВ анаэробной флоры - Fusobacterium, Prevotella, Porphyromonas [25, 74], Mycoplasma hominis [23]. Применение этого метода также способствует развитию фундаментальных исследований в области изучения патогенеза хронических инфекционных заболеваний. Отдельно рассмотрим место ПЦР диагностики при обследовании больного с БВ. Метод ПЦР ни в коем случае не заменяет, а дополняет спектр традиционных методов (культуральный посев, микроскопия), используемых в диагностике БВ. Решающее значение он может иметь для диагностики представителей анаэробной микрофлоры, микроаэрофилов, внутриклеточных паразитов и вирусов. В некоторых случаях возможно совмещение метода ПЦР с культуральным посевом, что позволяет сократить суммарное время анализа и повысить его чувствительность. Но только совокупность всех доступных методов лабораторной диагностики позволяет провести всестороннее обследование пациентов для «Бактериальный вагиноз» 24 выявления этиотропного агента наблюдаемого дисбиоза, и как следствие, назначить адекватное лечение. Идея комплексной диагностики БВ воплощена в НПФ "Литех" путем слияния данных микроскопии мазка и ПЦР анализа для выявления анаэробной флоры – маркеров бактериального вагиноза. ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 1.Разнообразие причин, приводящих к дисбалансу микрофлоры влагалища и других слизистых урогенитального тракта, приводящих к нарушению микроэкологии влагалищного биотопа (дисбактериоз, бактериальный вагиноз) настоятельно определяет необходимость тщательного комплексного обследования пациенток. Диагностика БВ должна складываться из совокупности ряда клинических признаков и лабораторных тестов. 2.Бактерии, участвующие в патогенезе воспалительного процесса во влагалище, в норме могут являться коменсалами вагинального тракта женщины, поэтому результаты методов лабораторной диагностики, должны всегда носить не только качественный, но, в обязательном порядке, и количественный характер. 3.Если воспалительный процесс во влагалище обусловлен бактериальной флорой, необходимо проведение бактериологического исследования, которое позволяет не только выделить чистые культуры бактерий, но и оценить их чувствительность к антибактериальным препаратам. 4.При обследовании пациенток, в случаях когда вероятна специфическая инфекционная патология, ассоциированная с хламидиями, микоплазмами или другими микроорганизмами, следует учитывать тот факт, что на фоне выраженных форм БВ возрастает вероятность неспецифических как ложноположительных, так и ложноотрицательных результатов лабораторных тестов. В связи с этим, бактериальная инфекция должна быть подтверждена не менее чем 2-мя методами лабораторной диагностики, один из которых должен определять антиген возбудителя, а другой специфические антитела. ПРИНЦИПЫ ЛЕЧЕНИЯ Современные подходы к лечению БВ принципиально отличаются от таковых при специфических инфекционных процессах. Это обусловленно изменением в настоящее время представлений о БВ как нарушении микроэкологии влагалища (дисбактериозе влагалища). Вместе с тем, принципы лечения БВ не идентичны принципам лечения дисбактериоза толстой кишки. Так, при БВ не только допускается, а в некоторых случаях просто необходима антибактериальная терапия. Учитывая локальный характер поражений при БВ оптимальным считается проведение местных лечебных мероприятий. Наилучший лечебный эффект показан для препаратов из группы нитроимидазолов (метронидазол, трихопол, метрогил ит.д.), которые назначаются интравагинально в форме таблеток, тампонов или свечей [6, 9, 17]. Существуют различные схемы комплексного лечения БВ заключающиеся в применении нитроимидазолов, назначаемых перорально и местнодействующих средств (1% перекиси водорода, антисептического расвора "томицид", хлористых соединений бензалкония и др.), которыми проводят орошение влагалища. При пероральном назначении нитроимидазолов необходимо учитывать возможность появления побочных эффектов в виде дисфункции желудочно-кишечного тракта, головокружений и головной боли [9, 13, 17]. Ввиду высокой гепатотоксичности нитроимидазолов, при лечении БВ у беременных женщин, необходим индивидуальный подход в выборе схем лечения и дозировок. В тяжелых случаях течения БВ основополагающим принципом лечения является использование антибиотиков широкого спектра действия с целью общей санации слизистой влагалища (клиндамицин, олеандомицин, цефалоспорины). К сожелению антибиотикотерапия ликвидируя условно-патогенные микроорганизмы не способна создать условия для быстрого восстановления нормальной микрофлоры влагалища. В связи с этим, для ее восстановления пациенткам назначают интравагинально (свечи, тампоны) биопрепараты, такие как ацилакт, и лактобактерин. Лактобактерин представляет собой лиофилизированную культуру лактобактерий, которая способствует колонизации влагалища другими бактериями – представителями его нормофлоры. Эубиотик ацилакт стимулирует рост собственной лактофлоры влагалища. При назначении антибактериальных препаратов широкого спектра действия возможно появление большого количества побочных эффектов, включая дисбактериоз других полостей (кишечник и т.д.), общетоксический, тератогенный, онкогенный и др. В последние годы в отечественной и зарубежной литературе появились исследования по применению для лечения БВ препарата "Полижинакс", в состав которого входят два антибиотика – неомицин и полимиксин В. В состав этого препарата также входит нистатин – противогрибковый препарат. Все исследователи отмечают хорошую переносимость пациентками этого препарата при назначении его интравагинально [2, 11]. Поскольку причины возникновения и развития БВ до конца не понятны, необходимо их дальнейшее изучение. Это, в свою очередь, настоятельно определяет необходимость тщательного комплексного обследования пациенток на БВ. Возможность возникновения побочных эффектов на фоне проведения мощной антибиотикотерапии, а иногда, как например в случае беременности, необходимость в подборе индивидуальных доз и схем лечения, требует проведения терапии только в специализированных медицинских учереждениях и под контролем лабораторной диагностики. «Бактериальный вагиноз» 25 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Акопян Т.Э. Бактериальный вагиноз и беременность // Акуш. и гинек. –1996. -№6. –С 3-5. 2. Анкирская А. Е. Бактериальный вагиноз // Акуш. и гинек. – 1995. -№6. – С. 13-16. 3. Айламазян Э.К., Рябцева И.Т. Неотложная помощь при экспериментальных состояниях в гинекологии. –СПб: Гиппократ. – 1992. –С.176. 4. Баранов А.Н. // Журн. акушерства и женских болезней. – Спец.выпуск. – 1995. –С. 14. 5. Безруков В.М., Назаренко Е.Г., Доронина Е.П., Екимов А.Н., Файзуллин Л.З. Сухих Г.Т., Говорун В.М. Клиническое значение определения биоваров Ureaplasma urealyticum с использованием ПЦР-диагностики // Тезисы на II Всеросийской конференции "Полимеразная цепная реакция в диагностике и контроле лечения инфекционных болезней", Москва, 1998, стр. 31-34. 6. Кира Е. Ф. Бактериальный вагиноз (клиника, диагностика, лечение). Автореф. дис. докт. мед. наук. Санкт-Петербург, 1995. 40с. 7. Кира Е. Ф. Бактериальный вагиноз // Акуш. и гин. – 1990, 8. – С. 10-13. 8. Кира Е. Ф. Клиника и диагностика бактериального вагиноза // Акуш. и гинекол. – 1994. -№2. –С. 32-35. 9. Коршунов В. М., Володин Н. Н., Ефимов Б. А., Саркисов С. Э. и др. Микроэкология влагалища. Коррекция микрофлоры при вагинальных дисбактериозах, Москва. – 1999. – 80с. 10.Коршунов В. М., Кафарская Л. И., Багирова М. Ш. и др. Изучение влияния "Солкотриховата" на вагинальную микрофлору у больных с папилломавирусной инфекцией в ассоциации с цервикальной интраэпителиальной неоплазией // ЖМЭИ. – 1994. - №5, С. 13-17. 11.Кубанова А.А., Аковбян В.А., Федоров С.М., Бакалова Л.А., Халатов А.О. Состояние проблемы бактериального вагиноза // Вестн. дермат. и венерол. – 1996. -№3. – С.22-26. 12.Ларсен Б. Микрофлора родовых путей в норме. Репродуктивное здоровье. Перев. с англ. // Общие инфекции Т. 1. – М.: Медицина. – 1988. – С. 17-45. 13.Ленцер А.А., Ленцер Х. П. Актуальные проблемы микроэкологии человека // В кн.: Аутофлора человека в норме и патологии и ее коррекция. Горький, 1988.-С. 10-14. 14.Летучих А.А. Лечение и профилактика кольпита // Акуш. гинек.. –1995. -№7. –С. 65-68. 15.Мавзютов А.Р., Габидуллин З.Г., Ахунов Э.Д., Туйгунов М.М. и др. Бактериальный вагиноз – принципиальные вопросы этиологии, диагностики и лечения. 16.Мартикайнен З. Н. Коринебактерии, обнаруженные при кольпитах и пуерперальных осложнениях // Клин. лаб. диагн. – 1995. -№4. – С. 45-48. 17.Муравьева В. В. Микробиологическая диагностика бактериального вагиноза у женщин репродуктивного возраста // Дисс. Канд. мед. наук., Москва, - 1997. 18.Назарова Е.К., Гиммельфарб Е.И., Созаева Л.Г. Дисбактериозы влагалища: этиология, патогенез, клиника, лабораторная диагностика. М. –2000. – 7с. 19. Никонов А.П., Анкирская А.С., Нисилевич В.Ф. //Акушерство и гинекология. –1993. - №3. – С.20-23. 20.Пинегин Б. В., Коршунов В. М., Шкарупета М. М., Мальцева Н. Н. Индигенные микроорганизмы как иммуномодуляторы // В сборнике "Иммуномодуляторы", Москва. – 1987. – С. 149-156. 21.Савичева А. М., Башмакова М. А. Микробиоценозы влагалища и их регуляция // Тез. докл. научн. конф. "Дисбактериозы и эубиотики". – М., 1996. – С. 33. 22.Соловьева И. В. Характеристика микрофлоры влагалища в норме и патологии // Дисс. Канд. мед. наук., Москва, 1987. 23.Сорока А. Е., Акопиан Т. А., Тараскина А. М., Савичева А. М., Говорун В. М. Аллельный полиморфизм tetM детерминанты в клинических изолятах M. hominis, устойчивых к тетрациклину // Тезисы Международной конференции "Антибиотики и антибиотикорезистентность на пороге XXI века", Москва, 2000. 24.Amsel R., Totten P.A., Spiegel C.A., Chen K.S. et al. Nonspecific vaginitis: diagnostic criteria and microbial and epidemiologic assotiations // Am. J. Med. 1983, 74, 14-22. 25.Arzese AR, Tomasetig L, Botta GA. Detection of tetQ and ermF antibiotic resistance genes in prevotella and porphyromonas isolates from clinical specimens and resident microbiota of humans // J Antimicrob Chemother. 2000 May;45(5):577-82. 26.Bartlet J. G., Polk B. F. Bacterial flora of the vagina: quantitative study // Rev. Infect. Dis. 1984, 6, S67-S72. 27.Bartlett J. G., Moon N. E., Goldstein P. R. at al. Cervical and vaginal bacterial flora: ecologic niches in the female lower genital tract // Am. J. Obstet. Gonecol. 1987, 130,658-661. 28.Berg A. O. Heidrich F. E. Fihn S. D. Establiching the cause of genitourinary symptoms in women in a family practice: comparison of clinical examination and comprehensive microbioligy // JAMA. 1984, 251, 620-625. 29.Blackwell A.L., Phillips I., Fox A.R., Barlow D. Anaerobic vaginosis (non-specific vaginitis): clinical, microbiological, and therapeutic findings // Lancet, 1983, 13-79-1382. 30.Brown W. J. Variations in the vaginal bacterial flora: a preliminary report // Ann. Intern. Med. 1982, 96:6:2, 931-934. 31.Brown W. J., Sautter R. L., Pickrum H. M. Sequential quantitative evaluation of vaginal flora regularly menstruating normal women // J. Clin. Microbiol. 1980, 11, 479-484. «Бактериальный вагиноз» 26 32.Chapin-Robertson K. Use of molecular diagnostics in sexually transmitted diseases. Critical assessment // Diagn Microbiol Infect Dis. 1993 Feb;16(2):173-84. Review. 33.Corbach S. L., Menda K. B., Thadepalli H., Keith L. Anaerobic microflora of the cervix in healthy women // Am. J. Obstet. Ginecol. 1973, 117, 1053-1055. 34.Eschenbach D.A. Bacterial vaginosis: emphasis on upper genital tract complications // Obstet. Gynecol. Clin. North. Am. 1989, 16, 593-610. 35.Eschenbach D.A. Hystory and review of bacterial vaginosis // Am. J. Obstet. Gynecol. 1993, 169:2, 441-445. 36.Eshenbach D.A., Davick P.R., Williams B.L. et al. Prevalence of hydrogen peroxide-producing Lactobacillus species in normal women and women with bacterial vaginosis // J. Clin. Microbiol. 1989. 27, 251-257. 37.Faro S. Prevention of infections after odstertic and gynecologic surgery // J. Reprod. Med. 1988,33, 154-158. 38.Furr P. M., Taylor-R obinson D. Prevalence and significance of Mycoplasma hominis and Ureaplasma urealyticum in the uries of non-veneral disease population // Epidemiol. Infect. 1987, 98, 353-359. 39.Galask R. P., Larsen B., Ohm M. S. Vaginal flora and it is role in disease entities. // Clin. Obstet. Ginecol. 1976, 19:1, 61-81. 40.Gardner H. L., Dukes C. D. Haemophilus vaginalis vaginitis: a newly defined specific infection previously classified "nonspecific" vaginitis // Am. J. Obstet. Gynecol. 1955, 69:962, 76. 41.Gallia GL, Petroziello JM, Brogan JM, McCleskey FK, DelVecchio VG. Development of a diagnostic polymerase chain reaction assay for detection of Mycoplasm hominis. Mol Cell Probes. 1995 Dec;9(6):415-21. 42.Gil-Juarez C, Calderon BA, Montero J, Yanez A, Cedillo L. Detection of Mycoplasma hominis and Ureaplasma urealyticum in women sexually active or not. Rev Latinoam Microbiol. 1996 Apr-Jun;38(2):81-8. 43.Giorgi A., Torriani S., Dellaglio F., Bo G., Stola E., Bernuzzi L. Identification of Vaginal lactobacilli from asymtomatic women // Microbial. Rev. 1987, 377-384. 44.Goldacre M. J., Watt B. Vaginal microbial flora in normal young women // Brit. Med. J. 1979, 1, 1450-1453. 45.Gravett M. G., Eschenbach D. A., Spiegel-Brown C. A., Holmes K. K. Rapid diagnosis of amniotic fluid infection by gasliquid chromatography // N. Engl. J. Med. 1982, 306:12, 725-728. 46.Harnmann R., Kronibus A., Lang N., Werner H. Quantitative stadies on the vaginal flora of asymptomatic women and patients with vaginitis and vaginosis // Zbl. Bakt. Hyg. A. 1987, 265, 451-461. 47.Hawes S. E., Hillier S. L., Benedetti J., Stevens C. E. at al. Hydrogen peroxide-producing lactobacilli and acqusition of vaginal infections // J. Infect. Dis. 1996, 174, 1058-1063. 48.Hill G.B. Microbiology of bacterial vaginosis //Am. J. Obstet. Gynecol. 1993, 169, 450-454. 49.Hillier S. L., Krohn M. A., Rabe L. K., Klebanoff S. J., Eschenbach D. A. The normal vaginal flora, H2O2-producing Lactobacilli and bacterial vaginosis in pregnant women // Cln. Infect. Dis. 1993, 16(Suppl.), 273-281. 50.Hillier S., Holmes K. K. Bacterial vaginosis // In: Holmes K. K., Mardh P. A., Sparling P. F., Wiesner P. J. eds. Sexually transmitted diseases. 2nd. New York: McGraw-Hill. 1990, 547-560. 51.Hillier S.L., Martius J., Krihn M., Kiviat N. et al. A case-control study of chorioamnionic infection and histologic chorioamnionitis in prematurity // N. Engl. J. Med. 1988, 319, 972-980. 52.Hillier S.L., Krohn M.A., Rabe L.K., Klebanoff S.L., Eschenbach D.A. The normal vaginal flora, H2O2-producing lactobacilli and bacterial vaginosis in pregnant women // Clin. Infect. Dis. 1993, 16(Suppl), 273-281. 53.Holmes K. K., Spiegel C., Amsel R. at al. Nonspecific vaginisis //Scand. J. Infect. Dis. 1981, 26, S110-S114. 54.Holst E., Wathne B., Hovelins B., Mardh P.A. Bacterial vaginosis: microbiological and clinical findings // Eur. J. Clin. Microbiol. 1987, 6, 536-541. 55.Hurley R., Stanley V. C., Leask B. G., De Louvois J. Microflora of the vagina during pregnancy // Soc. Appl. Bacteriol. Symp. Ser. 1974, 3:0, 155-185. 56. Isenberg H.D., Painter B.D. Indigenous and pathogenic microorganisms of humans // in: Manual of Clinical Microbiol. – Eds. E. H. Lennette, A. Balows, W.J. Hausler et al. 3rd end. Washington: A.S.M. 1980. – 25-39. 57.Larsen B. Vaginal flora in health and disease // Clin. Obstet. Ginecol. 1993, 36:1, 107-21. 58.Levison M. E., Carman L. C., Carrington E. R., Kayo D. Quantitative micriflora of the vagina // Am. J. Obstet. Ginecol. 1977, 127, 80-85. 59.Lin PR, Shaio MF, Liu JY. One-tube, nested-PCR assay for the detection of Trichomonas vaginalis in vaginal discharges. Ann Trop Med Parasitol. 1997 Jan;91(1):61-5. 60.Mardh P.A. Bacterial vaginosis or ...? // Abstract book thid International symposium on vaginitis/ vaginosis. Funchal, Portugal. 1994, Abstr. 1. 61.McCormac W. M. The genital mycoplasmas // II. N. Engl. J. Med. 1980, 301, 1063-1067. 62.McCormack W. M. The genital mycoplasmas // I. N. Engl. J. Med. 1980, 302,1003-1010. 63.Mead P. B. Epidemiology of bacterial vaginosis // Am. J. Obsted. Gynecology. 1993, 169:2, 446-449. 64.Mehta A., Talwalkar J., Shetty C. V. et al. Microbial flora of the vagina // Microecology and Therapy. 1995, 23, 1-7. 65. Moberg P., Eneroth P., Harlin J. et al. Cervical bacterial flora in infertile and pregnant women // Med. Microbiol. Immunol. 1978, 165, 139-142. 66.Nath K, Sarosy JW, Stylianou SP. Suitability of a unique 16S rRNA gene PCR product as an indicator of Gardnerella vaginalis. Biotechniques. 2000 Feb;28(2):222-4, 226. 67.Oleen-Burkey M. A., Hillier S.L. Pregnancy complycations associated with bacterial vaginosis and their estimated costs // «Бактериальный вагиноз» 27 Infect. Dis. Obsted. Gynecol. 1995, 3, 149 157. 68. Ohashi A. Clinicobacteriological study on microbial flora in the vaginal microbial flora accordong to the menstrual cycle. J. ap. Ass. Infect. Dis. 1980, 54:7, 321-330. 69.Overmann B.A. The vaginal as an ecologyc sistem. Current understandin and clinical applications // J. Nurse Midwifery. 1993, 38:3, 146-151. 70.Paavonen J. Physiology and ecology of the vagina // Scand. J. Infect. Dis. 1980, 40, 31-35. 71.Palmer HM, Gilroy CB, Claydon EJ, Taylor-Robinson D. Detection of Mycoplasma genitalium in the genitourinary tract of women by the polymerase chain reaction // Int J STD AIDS. 1991 Jul-Aug;2(4):261-3. 72.Razin S., Yogev D., Naot Y. "Molecular biology and pathogenicity of mycoplasmas" // Microbiology and Molecular Biology Reviews, 1998, 1094-1156. 73.Redonodo-Lopes V., Cook R. L., Sobel J. D. Emerging role lactobacilli in the control and maintenance of the vaginal bacterial microflora // Rev. Infect. Dis. 1990, 12, 856-872. 74.Roberts M.C., Hillier S.L., Schoenknecht F.D., Holmes K.K. Comparison of Gram stain, DNA probe, and culture for the identification of species of Mobiluncus in female genital specimens // J. Infect. Dis. 1985, 152, 74-77. 75.Roberts MC, Pang Y, Riley DE, Hillier SL, Berger RC, Krieger JN. Detection of Tet M and Tet O tetracycline resistance genes by polymerase chain reaction. Mol Cell Probes. 1993 Oct;7(5):387-93. 76. Ross J.M., Needhem J.R. Genital flora during pregnancy and colonization of the newborn // J. Roy. Souc. Med. 1980, 73:2, 105-110. 77.Sheiness D., Dix K., Watanabe S., Hillier S.L. High levels of Gardnerella vaginalis detected with an oligonucleotide probe combined with elevated pH as a diagnostic indicator of bacterial vaginosis // J. Clin. Microbiol. 1992, 30, 642-650. 78.Shimizu C., Shimizu N., Mitsuda T., Tsukuda M., Ichikawa S., Yokota S. One-step determination of herpes simplex virus type I and II by polymerase chain reaction. Mol Cell Probes. 1994; 8:193-198. 79.Skarin A., Sylwan J. Vaginal lactobacilli inhibiting growth of Gardnerella vaginalis, Mobiluncus and other bacterial species cultured from vaginal content of women with bacterial vaginosis // Acta. Pathol. Microbiol. Immun. 1987, 94, 399-403. 80.Sobel J.D. Vaginitis in adult women // Am. J. Obstet. Ginecol. 1990, 36:10, 745-752. 81.Spiegel C. A., Amsel R., Eshenbach D. et al. Anaerobic bacteria in non-specific vaginitis // N. Engl. J. Med., 1980, 303, p. 271. 82.Spiegel C. A., Eshelbach D., Amsel R., Holmes K. K. Curved anaerobic bacteria in bacterial (nonspecific) vaginosis and their response to antimicrobial therapy // J. Infect. Dis. 1983, 148, 817-822. 83.Taylor-Robinson D, Furr PM. Genital mycoplasma infections. Wien Klin Wochenschr. 1997 Aug 8;109(14-15):578-83. Review. 84.Teng K, Li M, Yu W, Li H, Shen D, Liu D. Comparison of PCR with culture for detection of Ureaplasma urealyticum in clinical samples from patients with urogenital infections // J Clin Microbiol. 1994 Sep;32(9):2232-4. 85.Thomason J.L., Schreckenderger P.C., Spellacy W.N., Riff L.J., LeBeau L.J. Clinical and microbiological characterization of patients with nonspecific vaginosis with motile, curved anaerobic rods // J. Infect. Dis. 1984,149, 801-809. 86.van Belkum A, Koeken A, Vandamme P, van Esbroeck M, Goossens H, Koopmans J, Kuijpers J, Falsen E, Quint W. Development of a species-specific polymerase chain reaction assay for Gardnerella vaginalis // Mol Cell Probes. 1995 Jun;9(3):167-74. 87.Vejtorp M., Bollerup A.C., Vejtorp L. et al. Bacterial vaginosis: a double – blind randomized trial of the effect of treatment of the sexual partner // Brit J. Obstet. Gynecol. 1988, 95:9, 920-926. 88.Watts D. H., Eschenbach D. A., Kenny G. E. Early postpartum endometrities: the role of bacteria, genital mycoplasmas and Chlamidia trachomatis // Obstet. Gynecol. 1989, 73, 52-60. 89.Wilkins M., Thin R. N., Tabaqchall S. Quantitave bacteriology of the vaginal flora in genital disease // J. Med. Microbiol. 1984, 18:2, 217-231. th 90.Wilson G. S., Miles A. Principles of Bacteriology fbl Immunity // 6 end., II. – London: Arnold, 1975, 2604-2625. Topley end Wilsons.
