Измерение концентрации трийодтиронина в сыворотке

Трийодтиронин (Т3)
Хемилюминесцентные тесты CIA
Код товара: 175-300
Назначение:
Количественное определение концентрации общего трийодтиронина (Т3)
в
человеческой
сыворотке
или
плазме
при
помощи
хемилюминесцентного иммуноферментного теста.
ОБЩАЯ ИНФОРМАЦИЯ И ОПИСАНИЕ ТЕСТА
Измерение концентрации трийодтиронина в сыворотке рассматривается как ценный
инструмент в диагностике дисфункции щитовидной желез. Такая значимость
показателя послужила толчком для совершенствования методов анализа в
последние два десятилетия. Изобретение моноспецифичной антисыворотки и
открытие блокирующих агентов к связывающим протеинам Т3 в сыворотке сделало
возможным развитие простой процедуры радиоиммунологического анализа (1,2).
Данная методология микропланшетного иммуноферментного анализа обеспечивает
оптимальную чувствительность при минимуме действий оператора. Сначала в лунку
вносят калибраторы сыворотки, препарат пациента и контроли. Добавляют конъюгат
ферментов и Т3 и смешивают реагенты. Происходит реакция конкуренции между
конъюгатом ферментов и нативным трийодтиронином за ограниченное количество
антитело-комбинирующих участков, иммобилизованных на поверхности лунки.
После окончания указанного периода инкубации связанный антителами конъюгат Т3
и ферментов отделяют от несвязанного конъюгата Т3-ферментов при помощи
аспирации или декантации. Добавляют субстрат для определения активности
ферментов на поверхности лунки.
Используя несколько известных различных контрольных показателей концентрации
трийодтиронина, можно построить кривую дозовой зависимости и найти с ее
помощью неизвестную концентрацию Т3.
ПРИНЦИП
Конкурентный иммуноферментный тест:
Необходимые реагенты для иммуноферментного теста включают иммобилизованное
антитело, конъюгат антигена-ферментов и нативный антиген. После смешивания
иммобилизованного антитела, конъюгата ферментов и антигена и сыворотки с
нативным антигеном, происходит реакция конкуренции между нативным антигеном и
конъюгатом ферментов и антигена за ограниченное количество нерастворимых
связывающих участков.
Взаимодействие описывается следующим уравнением:
- моноспецифичное иммобилизованное антитело (постоянное количество)
- нативный антиген (любое количество)
- конъюгат ферментов и антигенов (постоянно количество)
- комплекс антиген-антитело
- комплекс конъюгата антигена-ферментов и антител
- постоянная скорость ассоциации
- постоянная скорость диссоциации
- равновесная постоянная
После достижения равновесия, фракцию связанных антител отделяют от
несвязанных антигенов при помощи декантации или аспирации. Активность
ферментов во фракции связанных антител обратно пропорциональна концентрации
нативного антигена. Используя несколько различных известных контрольных
показателей концентрации антигена, можно построить кривую дозовой зависимости и
найти с ее помощью неизвестную концентрацию антигена.
РЕАГЕНТЫ:
A. Калибраторы человеческой сыворотки (1.0 ml/пробирка) [Обозначения A – F]
Шесть (6) пробирок для сравнения со значением трийодтиронина для концентрации
0(A), 0.5(B), 1.0(C), 2.5(D), 5(E), и 7.5(F) ng/ml. Хранить при температуре 2-8°C.
Консервирующее вещество добавлено.
B. Меченый реагент общего Т3 —1.5 ml/пробирка
Одна (1) пробирка конъюгата пероксидазы из хрена на альбуминно-стабилизованной
матрице. Хранить при температуре 2-8°C.
Консервирующее вещество добавлено.
C. Буфер меченого индикатора общего T3/T4 -- 13ml –
Одна (1) бутыль, содержащая буфер, красный краситель, консервант и
связывающие ингибиторы протеина. Хранить при 2-8°C.
D. Лунки для реакции с Т3- 96 лунок - Значок
Белый микропланшет с 96 лунками, покрытыми овечьей антисывороткой и
упакованные в алюминиевую оболочку с осушающим реагентом. Хранить при
температуре 2-8°C.
E. Концентрат промывающего раствора -- 20ml – значок
Одна (1) пробирка, содержащая сурфактант в забуференном растворе. Добавлен
консервант. Хранить при температуре 2-30°C (см. Раздел по подготовке реагентов).
F. Сигнальный реагент А – 7мл/пробирка - Обозначение
Одна (1) бутыль с люминалом в буфере. Хранить при температуре 2-8°C. (см. Раздел
по подготовке реагентов).
G. Сигнальный реагент B – 7мл/пробирка - Обозначение
Одна (1) бутыль, содержащая перекись водорода (H2O2) в буфере.
Хранить при температуре 2-8°C (см. Раздел по подготовке реагентов).
I. Вкладыш в упаковку.
Примечание 1: Не используйте реагенты, у которых истек срок годности.
Примечание 2: Открытые реагенты стабильны в течение 60 дней при температуре 28°C.
Примечание 3: Реагенты предназначены для использования вместе с планшетом с
96-ю лунками.
МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ
Для диагностики In Vitro
Не предназначен для внутреннего или наружного употребление животными
или человеком.
Реагенты, содержащие сыворотку крови человека, тестировались на наличие
антител к ВИЧ 1 и 2, вирусу гепатита С, поверхностному антигену вируса гепатита В.
Были получены отрицательные результаты. Однако поскольку ни один тест не может
дать полной гарантии отсутствия инфекционных агентов, всю человеческую
сыворотку следует считать потенциально опасной и инфекционной и обращаться с
ней в соответствии с государственными нормами для биологически опасных веществ
2 группы. Подходящие лабораторные правила обращения с препаратами крови
можно найти в "Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories," 2-я редакция,
1988, HHS
СБОР И ПОДГОТОВКА ПРЕПАРАТОВ
Забор крови из вены руки следует производить согласно стандартной процедуре, с
соблюдением соответствующих мер предосторожности. Чтобы обеспечить
возможность сравнения с контрольными значениями, нужно собирать сыворотку у
пациента утром натощак. Для сбора крови используются простые пробирки с красной
крышкой без геля или
Дайте крови свернуться. Центрифугируйте препарат, чтобы отделить сыворотку от
клеток.
Для анализа можно использовать как свежеполученные образцы сыворотки крови,
так и образцы, хранившиеся при температуре от 2 до 8°С не более пяти (5) дней или
при температуре минус 20°С не более 30 дней. Не допускается повторное
замораживание-размораживание, приводящее к искажению результатов. Перед
тестом подождите, пока реагенты не нагреются до комнатной температуры (20-27С)
При тестировании с дубликатами требуется 0.10 мл препарата.
ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ МАТЕРИАЛЫ [НЕ ПОСТАВЛЯЕМЫЕ]:
1. Пипетка для раскапывания объема 50µl с точностью выше 1.5%.
2. Диспенсер(ы) для многократного распределения объемов в 0.100ml и 0.300ml с
точностью выше 1.5%.
3. Диспенсеры с регулируемым объемом (20-200µl) и (200-1000µl) для растворов
конъюгата и субстрата.
4. Промывающее устройство для микропланшетов или пластиковая бутыль
(дополнительно).
5. Люминометр с фотоумножителем для считывания световых единиц.
6. Пробирки для растворения конъюгата ферментов и субстратов А и В.
7. Абсорбирующая бумага для декантации лунок микропланшета.
8. Пластиковая оболочка или крышка микропланшета для проведения инкубации.
9. Вакуумный аспиратор (дополнительно) для промывания.
10. Таймер.
11. Материалы для контроля качества.
ПОДГОТОВКА И ХРАНЕНИЕ РЕАГЕНТОВ:
1. Рабочий раствор меченого реагента и конъюгата Т3-ферментов
Растворите меченый реагент T3 1:11 в буфером меченого реагента общего T3/T4 в
подходящей емкости. Например, растворите 160µl конъюгата в 1.6ml буфера для 16
лунок (получится небольшой избыток раствора).
Данный реагент надо использовать в течение 24 часов с момента приготовления.
Хранить при 2-8°C.
Общая формула:
Требуемый объем буфера = количество лунок * 0.1
Количество необходимого конъюгата Т3-ферментов = количество лунок * 0.01
например = 16 x 0.1 = 1.6ml для буфера конъюгата общего T3/T4.
16 x 0.01 = 0.16ml (160µl) для конъюгата T3-ферментов.
2. Промывной Буфер
Растворите концентрат промывающего раствора в подходящем контейнере в
дистиллированной или деионизированной воде, так чтобы его объем составлял 1000
мл. Храните при комнатной температуре (20-27°C) в течение 60 дней.
3. Рабочий раствор индикаторного реагента – готовить ежедневно
Смешайте равные объемы раствора ‘A’ и раствора ‘B’ в чистом контейнере.
Используйте в течение 60 минут после этого. Например, добавьте 1 мл А и 1 мл В в
два стрипа с восьмью лунками (получится небольшой избыток раствора. Выбросьте
неиспользованную долю раствора).
ПРОЦЕДУРА ТЕСТА
Перед проведением теста, доведите все реагенты, контроли и калибраторы
сыворотки до комнатной температуры (20 - 27° C).
1. Подготовьте лунки микропланшета для калибраторов, контрольных проб и
препаратов пациента в дубликатах.
Поместите неиспользованные микрострипы обратно в алюминиевую упаковку,
закройте ее и храните при температуре 2-8°C.
2. Внесите 0.050 ml (50µl) калибраторов, контрольных проб и препаратов в
соответствующие лунки.
3. Добавьте 0.100 ml (100µl) рабочего раствора меченого реагента и конъюгата Т3ферментов в каждую лунку. Необходимо вносить все реагенты как можно ближе
ко дну лунки.
4. Осторожно поворачивайте планшет в течение 20-30 секунд, чтобы реагенты
перемешались. Закройте планшет пластиковой пленкой.
5. Инкубируйте в течение 45 минут при комнатной температуре.
6. Удалите содержимое лунок микропланшета при помощи декантирования или
аспирации. При декантировании тщательно удалите остатки жидкости из лунок при
использовании абсорбирующей бумаги.
7. Добавьте 300µl промывающего раствора (см. раздел о подготовке реагентов),
декантируйте или аспирируйте. Повторите еще два (2) раза (общее число
промываний – три (3)). Можно использовать автоматическое или ручное
устройство для промывания планшетов. В таком случае следуйте инструкциям
производителя по эксплуатации. При использовании бутыли, наполняйте
каждую лунку доверху, сжимая контейнер. Избегайте появления пузырьков.
Декантируйте и повторите еще два (2) раза.
8. Добавьте 0.100 ml (100µl) раствора субстрата во все лунки.
(см. раздел о подготовке реагентов). Всегда добавляйте реагенты в одном и
том же порядке, чтобы минимизировать разницу времени реакции у различных
лунок.
9. Инкубируйте при комнатной температуре в течение пяти (5) минут в темноте.
10. Считайте RLU (относительные световые единицы) при помощи люминометра на
96 лунок (0.5-1.0 секунды на лунку). Измерение должно проводиться в течение
тридцати (30) минут после остановки реакции.
Примечание: Для повторного анализа препаратов с концентрацией выше 750ng/dl,
внесите 25µl препарата и 25µl 0 калибратора сыворотки в лунку для пробы (для
поддержания равномерной концентрации белков). Умножьте полученное значение на
2, чтобы получить концентрацию трийодтиронина.
КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА
Каждая лаборатория должна проверять контроли в низком, среднем и высоком
диапазоне для мониторинга проведения теста. Значение этих контролей следует
определять во время каждой процедуры теста. Необходимо составлять графики
контроля качества для проверки поставляемых реагентов и выявлять тренды при
помощи подходящих статистических методов. Значительное отклонение от обычных
показателей указывает на незамеченное изменение в условиях проведения теста
или на деградацию реагентов в наборе. В этом случае используйте свежие реагенты,
чтобы определить причину отклонений.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Для нахождения неизвестной концентрации трийодтиронина в препаратах
используется кривая дозовой зависимости.
1. Запишите RLU (интенсивность сигнала люминесценции), указанную в распечатке
микропланшетного анализатора (Образец 1).
2. Постройте на миллиметровой бумаге график зависимости RLU каждого дупликата
калибраторов от концентрации Т3 в ng/dl. (не усредняйте значения калибраторов
перед построением графика).
3. Проведите через точки на графике наиболее подходящую кривую.
4. Чтобы определить неизвестную концентрацию Т3, отложите среднее RLU каждого
препарата на вертикальной оси графика, найдите точку пересечения с кривой и по
горизонтальной оси графика определите концентрацию (в ng/ml) (можно найти
среднее для дубликатов препаратов с неизвестной концентрацией). В приведенном
ниже примере, среднее RLU (37807) пересекает калибровочную кривую при
концентрации Т3 3.13 ng/ml. (См. рисунок 1).
Примечание 1: Для обработки данных можно использовать программное
обеспечение для иммунолюминометрических тестов. (найдите среднее для
дубликатов препаратов с неизвестной концентрацией) (см. рис. 1).
Примечание 2: Monobind может оказать помощь в покупке и установке
оборудования/программ
для
расчета
и
интерпретации
результатов
иммунолюминометрического теста.
Рис. 1
RLU
неизвестное
Значения Т3 в ng/ml
* Данные на образце 1 и на рисунке 1 представлены только для демонстрации
и не должны использоваться вместо кривой дозовой зависимости, составляемой при
проведении каждого теста. Кроме того, RLU калибраторов нормализованы до
@100,000 RLU для калибратора
‘A’ (самый интенсивный сигнал). Такое
преобразование ликвидирует разницу в способности различных приборов
определять интенсивность света.
ОБРАЗЕЦ 1
ПАРАМЕТРЫ QC (КОНТРОЛЯ КАЧЕСТВА)
Результаты анализа считаются достоверными при выполнении следующих
условий:
1. Кривая дозового ответа (пересечения в 80%; 50% и 20%) должна находиться в
установленных пределах.
2. Четыре из шести контролей должны находиться в установленном диапазоне.
ОГРАНИЧЕНИЯ ПРОЦЕДУРЫ
A. Проведение теста
1. Время реакции во всех лунках должно быть одинаковым, чтобы обеспечить
воспроизводимость результатов.
2. Пипетирование проб не должно занимать более десяти (10) минут во избежание
смещения результатов теста.
3. При использовании более одного (1) планшета, рекомендуется повторять
построение кривой дозового ответа.
4. Недостаточное промывание лунок планшета при аспирации или декантации
может привести к получению искаженных результатов.
5. Используйте компоненты из одного набора. Не смешивайте реагенты из разных
наборов.
В. Интерпретация
1. При использовании компьютерной программы для интерпретации результатов
теста, требуется, чтобы прогнозируемые значения калибраторов оказывались в
пределах 10% от соответствующих концентраций.
2. Общая концентрация трийодтиронина в сыворотке зависит от множества
факторов: функции щитовидной железы и ее регуляции, концентрации
тироксинсвязывающего глобулина (TBG) и связывания трийодтиронина с TBG (3, 4).
Поэтому только показателя концентрации трийодтиронина недостаточно для оценки
клинического состояния пациента.
3. Снижение общего содержание трийодтиронина может быть вызвано потерей
белков, определенными заболеваниями печени, приемом тестостерона, дифенина
или салицилатов. Список лекарств и состояний, которые влияют на концентрацию
общего трийодтиронина был составлен Journal of the
American Association of Clinical Chemists3.
Для определение ожидаемых результатов теста T3 CIA было проведено изучение
населения с нормальной функцией щитовидной железы. Полученные среднее (R),
стандратное отклонение (σ) и примерные ожидаемые значение (±2 σ) указаны в
таблице 1. Общее количество проведенных тестов -105.
ТАБЛИЦА I
Ожидаемые результаты теста Т3 CIA
(в ng/dl)
Среднее (Х)
Стандартное отклонение (s)
Ожидаемые результаты теста (±2 s)
118.5
33.4
52 - 185
Помните, что нахождение диапазона нормальных значений для популяции зависит от
множества факторов: специфичности метода, тестируемой популяции и точности
метода, используемого лаборантом.
Поэтому любая лаборатория должна
использовать указанный производителем диапазон только до тех пор, пока
выработает собственные пределы нормальных значений, основываясь на
результатах анализов людей, живущих там же, где расположена лаборатория.
ХАРАКТЕРИСТИКИ АНАЛИЗА
A. Сходимость
Внутри- и межаналитическая точность системы оценивалась при помощи анализов
на трех различных уровнях смешанной контрольной сыворотки. Номер, среднее
значение, стандартное отклонение и коэффициент вариации для каждой пробы
контрольной сыворотки приведены в таблицах 2 и 3.
ТАБЛИЦА 2
Внутрианалитическая сходимость (ед.изм. - ng/dl)
ПРОБА
низкий
средний
высокий
N
16
16
16
X
77.8
192.0
355.0
σ
6.2
10.4
14.1
C.V.
7.9%
5.4%
3.9%
ТАБЛИЦА 3
Межаналитическая сходимость (ед.изм. - ng/dl)
ПРОБА
низкий
средний
высокий
N
10
10
10
X
75.9
185.4
342.5
σ
6.8
12.5
15.3
C.V.
8.9%
6.7%
4.5%
*данные получены в течение 10 дней в 10 экспериментах
дубликатов.
с использованием
B. Точность
Было проведено сравнение Monobind T3 CIA™ со стандартным
радиоиммунологическим методом путем анализа препаратов с нормальной, гипо и
гиперфункцией поджелудочной железы (диапазон значений от 15ng/dl до 800ng/dl).
Общее количество исследованных препаратов - 120. Уравнение регрессии методом
наименьших квадратов и коэффициент корреляции были рассчитаны для
трийодтиронина CIA по сравнению с обычным методом. Полученные данные
представлены в таблице 4.
Таблица 4.
Метод
Этот метод
Метод для
сравнения
Регрессия
методом
наименьших
квадратов
Среднее (х)
Коэффициент
корреляции
162
168
y=3.8+0.947(x)
0.987
Есть лишь небольшая разница в средних значениях, полученных по данному методу
(Т3 CIA™) и стандартному методу. Метод наименьших квадратов и коэффициент
корреляции показывают отличную согласованность методов.
C. Специфичность
Перекрестная реактивность антител трийодтиронина на выбранные вещества
оценивалась путем добавления дополнительных веществ в матрицу сыворотки в
указанных ниже концентрациях. Для определения перекрестной чувствительности
рассчитывается отношение между дозой дополнительного вещества и дозой
трийодтиронина, необходимых для вытеснения одного и того же объема меченого
реагента.
Вещество
I-Трийодтиронин
I-Тироксин
Йодотирозин
Дийодотирозин
Дийодотиронин
Фенилбутазон
Салицилат натрия
Перекрестная
реактивность
1.0000
< 0.0002
< 0.0001
< 0.0001
< 0.0001
< 0.0001
< 0.0001
Концентрация
10 mg/ml
10 mg/ml
10 mg/ml
10 mg/ml
10 mg/ml
10 mg/ml
D. Чувствительность
Чувствительность теста на Трийодтиронин равна 4.0 ng/dl.
Чувствительность
(предел обнаружения) оценивается при определении
вариабельности калибратора сыворотки с концентрацией 0 ng/dl при использовании
статистики 2σ (95% точности) для расчета минимальной дозы.
СПИСОК СПРАВОЧНОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
1. Gharib, H., Ryan, R.J., Mayberry, W.E., & Hockett, T., "Radioimmunoassay for
Triiodothyronine (T3):.Affinity and Specificity of Antibody for T3",J Clinical
Endocrinol., 33,509 (1971)
2. Chopra, I.J., Ho, R.S.,& Lam, R. "An improved radioimmunoassay of
triiodothyronine in human serum," J. Lab Clinical Med., 80, 729 (1971).
3. Young, D.S., Pestaner, L.C., and Gilberman, U., "Effects of Drugs on Clinical
Laboratory Tests." Clinical Chemistry, 21, 3660 (1975).
4. Sterling, L., Diagnosis and Treatment of Thyroid Disease, Cleveland CRC Press,
p.9-51 (1975).
5. Tietz N,Textbook of Clinical Chemistry. 3rd Ed. WB Saunders, Phiadelphia. 1999.
6. Harrison. ‘Principles of Internal Medicine’ 12th Ed. McGraw Hill. New York. 1998.
7. Surks MI, Chopra IJ, Mariash CN: ‘American Thyroid Association, Guidelines for use
of laboratory tests in thyroid disorders’ JAMA. 1990;263:1529-1532.
Редакция: 1.
Date: 07.20.02
Cat# 175-300.
Monobind Inc.
729 West 16th Street
Costa Mesa. CA 92627
Tel: 949-642-4830
Fax: 949-650-8459
Email: [email protected]
Вебсайт: www.monobind.com
Пожалуйста, посетите наш вебсайт, чтобы узнать больше о предоставляемых
нами товарах и услугах.