Диссертация Авилова Е.А. - Российский онкологический научный

Федеральное государственное бюджетное научное учреждение
«Российский онкологический научный центр имени Н.Н. Блохина»
На правах рукописи
Авилова Екатерина Анатольевна
Роль протеинкиназы PAK1
в регуляции роста эстрогензависимого
и эстрогеннезависимого рака молочной железы
Специальность 14.01.12 – онкология
Диссертация на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Научный руководитель:
доктор биологических наук, профессор
МОСКВА – 2015
М.А. Красильников
ОГЛАВЛЕНИЕ
ОГЛАВЛЕНИЕ........................................................................................................2
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ...............................................5
ВВЕДЕНИЕ..............................................................................................................8
ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ..................................................................9
НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ.........................................................................11
НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ......................................................11
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.........................................................................12
1.1.
Механизм действия стероидных гормонов........................................12
1.2.
Пути развития гормональной резистентности РМЖ.........................20
1.2.1. Потеря рецептора эстрогена.....................................................20
1.2.2. Лиганд-независимая активация рецептора эстрогена..............22
1.2.3. Митогенные сигнальные пути, поддерживающие рост РМЖ в
отсутствие эстрогенов...................................................................26
1.3.
Терапия эстрогензависимого и эстрогеннезависимого РМЖ............32
1.4.
PAKs – важные регуляторы ключевых функций клеток...................34
1.4.1. Структура семейства PAK-киназ..............................................35
1.4.2. Механизмы регуляция PAK1....................................................36
1.4.3. Эффекторы PAK1........................................................................40
1.4.4. Особенности
экспрессии
PAK1
в
опухолях
молочной
железы........................................................................................43
1.5.
Роль PAK1 в регуляции гормональной чувствительности РМЖ.....45
1.5.1. Развитие
гормональной
резистентности
РМЖ
и
PAK1..........................................................................................45
1.5.2. Рецепторные тирозинкиназы и PAK1 в регуляции гормональной
чувствительности РМЖ..............................................................46
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ................................................................49
2.1.
Культивирование клеток...........................................................49
2.2.
Транзиторная трансфекция экспрессионных и репортерных
плазмидных конструкций........................................................................49
2
2.3.
Репортерный анализ...................................................................51
2.4.
Получение клеточных экстрактов для SDS-электрофореза в
полиакриламидном геле..........................................................................52
2.5.
Иммуноблоттинг........................................................................53
2.6.
Определение скорости роста клеток МТТ-тестом....................54
2.7.
Определение метилирования гена в культуре клеток...............54
2.7.1. Выделение геномной ДНК........................................................54
2.7.2. Определение метилирования гена................................................55
2.8.
Статистическая обработка результатов....................................57
2.9.
Список использованных реактивов...........................................57
2.10. Оборудование и приборы..............................................................59
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ......................................................................................60
3.1. Сравнительный анализ экспрессии РАК1 в клетках эстрогензависимого
и эстрогеннезависимого рака молочной железы...................................................60
3.1.1. Определение содержания РАК1 методом иммуноблотинга….....60
3.1.2. Изучение зависимости экспрессии PAK1 от плотности клеточной
культуры...................................................................................................61
3.1.3. Влияние ингибитора протеосомной деградации MG-132 на
содержание РАК1.....................................................................................62
3.2. Роль РАК1 в регуляции роста клеток эстрогензависимого и
эстрогеннезависимого рака молочной железы.......................................................63
3.2.1. Влияние РАК1 на рост клеток.......................................................63
3.2.2. Влияние РАК1 на активность митогенных сигнальных путей.......64
3.2.3. Роль α-Pix, ко-активатора РАК1, в регуляции активности
клеточных сигнальных белков.................................................................68
3.2.4. Влияние РАК1 на активность рецептора эстрогенов в клетках
эстрогензависимого рака молочной железы MCF-7.............................72
3.3. РАК1 и выживаемость клеток: роль РАК1 в регуляции роста клеток в
условиях гипоксии.....................................................................................................75
3
3.3.1. Сравнительный анализ чувствительности к гипоксии клеток MCF7 и HBL-100..............................................................................................75
3.3.2. Роль РАК1 в адаптации клеток MCF-7 к гипоксии.......................76
3.4. Метилирование РАК1 и его роль в регуляции дифференциальной
экспрессии РАК1 в клетках эстрогензависимого и эстрогеннезависимого рака
молочной железы....................................................................................................80
ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ........................................................86
4.1. Экспрессия PAK1 в различных линиях РМЖ…………………………..86
4.2. PAK1 в стимуляции митогенных путей в клетках РМЖ………………87
4.3. РАК1 и выживаемость клеток………………………….……………….89
4.4. Метилирование РАК1…………………………………..……………….90
ЗАКЛЮЧЕНИЕ…………………………………………..……….…………………..92
ВЫВОДЫ……………………………………………………..……………………….94
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ………..………………………95
4
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ
РМЖ - рак молочной железы
NR3 - подсемейство ядерных рецепторов 3
ER - рецептор эстрогена
ERα -эстрогеновый рецептор-α
ERβ - эстрогеновый рецептор-β
PR - прогестероновый рецептор
VD - N-концевой домен
AF1 – активаторная функция 1
AF2 - активаторная функция 2
LBD - лиганд-связывающий домен
DBD - ДНК-связывающий домен
HD (Hinge Domain) - шарнирный домен
NLS - последовательность сигнала ядерной локализации
СD - С-концевой домен
ERE - эстроген-респонсивный элемент
GPCR - поверхностные рецепторы, связанные с G-белками
RTK – рецепторные тирозинкиназы
EGF - эпидермальный фактор роста
EGFR (ErbB1 / HER1), HER2 (HER2/neu / ErbB2), ErbB3 (HER3), и ErbB4 (HER4) - рецепторs эпидермального фактора роста
EBP1 - ErbB3-связывающий белок
MAPK - митогенактивирующие протеинкиназы
Raf1 – серин-треониновая киназа, часть MAPK-каскада
ERK1/2 (Extracellular signal-regulated kinases) и MEK1/2 - MAP-киназы
PI3K - фосфоинозитид-3-киназа
AKT (PKB) - протеинкиназа В
PTEN
(фосфатидитинозитол-3,4,5-трифосфат-3-фосфотаза)
регулятор AKT
5
-
негативный
STAT (Signal transducers and activators of transcription) - сигнальные трансдукторы
и активаторы транскрипции
NF-κB - ядерный фактор-κB
RANKL - рецепторный активатор лиганда ядерного фактора κB
AP-1 - активирующий Fos/Jun-комплекс протеин-1
Рak1 - р21-активированная киназа 1
GEF (Guanine nucleotide Exchange Factors) – гуанин-нуклеотид обменный фактор
GAP (GTPase-activating proteins) - белки, активирующие ГТФазы
GDI (Guanine nucleotide-Dissociation Inhibitors) - ингибиторы диссоциации
гуанинового нуклеотида
Pix (PAK-interactive exchange factor) - фактор обмена, связывающийся с PAK
DH – домен, гомологичный Dbl
Dbl - трансформированный ген из клеток диффузной B-клеточной лимфомы
PH – домен, гомологичный плекстрину
SH3 – домен, гомологичный Src 3
PRD (Proline rich domain) - домен, богатый пролином
CBD (Cat-binding domain) - домен, связывающий Cat
LZ (leucine zipper) - лейциновая молния
CH (Calponin Homology) – домен, гомологичный с кальпонином
IPA3 (1,1'-Dithiodi-2-naphthol) – специфический ингибитор PAK1
dn-PAK1(K299R)
–
доминантно-негативный
PAK1
(киназно-неактивная
мутантная форма PAK1)
hPIP (human PAK1-interacting protein 1) - человеческий белок, связывающийся с
PAK1)
CRIPAK (Cys-rich inhibitor of PAK1) - цистеин-богатый ингибитор PAK1
GRB2 и NCK – адапторные белки
ETK - нерецепторные тирозинкиназы
PDK1 - фосфоинозитид-зависимая киназа-1
PKA - протеин-киназа A
PLC - фосфолипаза С
6
PIP2 - фосфатидилинозитол-4,5-бисфосфат
DAG - 1,2-диацилглицерин
IP3 – инозитолтрифосфат
PKC - протеинкиназа C
PLK1 - поло-подобная киназа-1
NCK, Grb2 – адапторные белки
CpG-островки - цитозин-гуанин богатые последовательности
SERMs - селективные модуляторы рецепторов эстрогена
TNBC (Triple Negative Breast Cancer) – ER-, PG-,Her2-негативные клетки РМЖ
EMT - эпителиально-мезенхимальный переход (
TGFβ - трансформирующий фактора рост-бета
HIF-1 (hypoxia-inducible factor-1) – индуцируемый гипоксией фактор-1
HRE - гипоксия-респонсивный элемент
5-aza-dC - 5-аза-2’-дезоксицитидин
ПЦР – полимеразная цепная реакция
7
ВВЕДЕНИЕ
Развитие гормональной резистентности злокачественных опухолей молочной
железы (РМЖ) – переход опухолевых клеток от эстрогензависимого к
эстрогеннезависимому
ограничивающих
росту
–
эффективность
является
одной
гормональной
из
терапии
главных
причин,
опухолей.
Ранее
считалось, что в основе становления гормональной резистентности лежит утрата
клетками РМЖ рецепторов эстрогенов (ER). Однако, снижение гормональной
чувствительности клеток РМЖ также может происходить и при сохранении ER –
при нарушении баланса между белками-активаторами и супрессорами данных
рецепторов, лиганд-независимой активации ER, стимуляции сигнальных путей,
идущих в обход ER. Среди последних ведущее значение принадлежит
рецепторным тирозинкиназам (EGFR, PI3K, NF-kB), активации которых
достаточно для прохождения митогенного сигнала без участия ER. До сих пор
неясно,
какие
из
эффекторов
тирозинкиназ
являются
ключевыми
для
поддержания эстрогеннезависимого роста и могут ли они играть самостоятельную
роль в развитии гормональной резистентности РМЖ.
Одним из важнейших эффекторов тирозинкиназных рецепторов является
РАК1 (р21-активированная киназа 1) – серин-треониновая протеинкиназа, которая
путем фосфорилирования различных сигнальных белков участвует в регуляции
ключевых функций в клетке: рост, выживаемость, организация цитоскелета,
клеточная подвижность. Одна из мишеней РAK1 – это ER, который активируется
в присутствие РАК1 независимо от лиганда, что может приводить, в случае
гиперэкспрессии
РАК1,
к
снижению
гормональной
зависимости
ER-
положительных клеток РМЖ. В ER-негативных опухолях действие РАК1
ограничивается стимуляцией митогенных стигнальных путей без участия ER. В
таких опухолях РАК1 участвует в поддержании уже эстрогеннезависимого роста
клеток, о чем косвенно свидетельствует описываемая в литературе повышенная
экспрессия Рak1 в ER-негативных клетках. С похожей ситуацией столкнулись и
мы в своих исследованиях, обнаружив высокий уровень экспрессии РАК в
8
культивируемых in vitro ER-негативных клеточных линиях. Поскольку РAK1
способна фосфорилировать большое количество различных эффекторов, можно
предположить ее участие в регуляции сигнальных путей, идущих в обход ER в
клетках РМЖ и приводящих к формированию гормональной резистентности.
Регуляция активации РAK1 происходит путем присоединения малых RhoГТФаз: Rac и Cdc42, переведенных с помощью гуанин нуклеотид обменных
факторов (GEF) в ГТФ-связанную активную форму. Таким вышележащим GEFфактором для PAK является Pix (PAK-interactive exchange factor). Ранее было
показано, что PAK1 фосфорилирует альфа-Pix по серину в 488 положении,
которое приходится на PH-домен, выполняющий функцию ко-активатора DHдомена в гуанин-нуклеотидном обмене на Rac и Cdc42. Однако, в целом, значение
взаимодействия Pix–РАК1 в реализации промитогенных эффектов последнего
остается неизвестным.
Цели и задачи исследования
Целью
данной
работы
явилось
изучение
некоторых
аспектов
функционирования протеинкиназы PAK1 в регуляции роста эстрогензависимого и
эстрогеннезависимого рака молочной железы.
Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
1. Сравнительный анализ экспрессии РАК1 в клетках эстрогензависимого и
эстрогеннезависимого рака молочной железы:
1.1. Определение содержания РАК1 методом иммуноблотинга;
1.2. Изучение зависимости экспрессии PAK-1 от плотности клеточной
культуры;
1.3. Влияние ингибитора протеосомной деградации MG-132 на содержание
РАК1.
9
2.
Роль
РАК1
в
регуляции
роста
клеток
эстрогензависимого
и
эстрогеннезависимого рака молочной железы:
2.1. Влияние РАК1 на рост клеток;
2.2. Влияние РАК1 на активность митогенных сигнальных путей: АР-1, бетакатенина и Snail1;
2.3. Роль α-Pix, ко-активатора РАК1, в регуляции активности клеточных
сигнальных белков;
2.4. Влияние РАК1
на активность рецептора эстрогенов в клетках
эстрогензависимого рака молочной железы MCF-7.
3. РАК1 и выживаемость клеток: роль РАК1 в регуляции роста клеток в
условиях гипоксии:
3.1.
Сравнительный анализ чувствительности к гипоксии клеток MCF-7 и
HBL-100;
3.2.
Роль РАК1 в адаптации клеток MCF-7 к хронической гипоксии.
4. Метилирование РАК1 и его роль в регуляции дифференциальной
экспрессии РАК1 в клетках эстрогензависимого и эстрогеннезависимого
рака молочной железы.
10
Научная новизна работы
В настоящей работе был проведен сравнительный анализ изменений
экспрессии PAK1 в эстрогензависимых и эстрогеннезависимых опухолях;
выявлены возможные эпигенетические причины сниженной экспрессии PAK1 в
ER-позитивных
клетках
рака
молочной
железы;
исследован
механизм
поддержания эстрогеннезависимого роста ER-негативных клеток, в том числе с
участием ключевых транскрипционных факторов AP-1, бета-катенина/TCF и
Snail1;
установлена
роль
Pix
в
регуляции
эффектов
РАК1;
впервые
продемонстрировано участие PAK1 в поддержании роста клеток РМЖ в условиях
гипоксии. Полученные данные свидетельствуют, что PAK1 является важным
фактором, участвующим в поддержании эстрогеннезависимого роста РМЖ, и
позволяют рассматривать РАК1 в качестве перспективного объекта таргетной
терапии рака молочной железы.
Научно-практическая значимость
Получены новые данные о роли РАК-сигнального пути в развитии и
поддержании гормональной резистентности клеток рака молочной железы, что
позволит установить механизмы регуляции РАК и его эффекторов для
эстрогеннезависимого роста клеток РМЖ, а также оценить перспективность
таргетной терапии РМЖ, направленной на подавление РАК.
11
Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Механизм действия стероидных гормонов
1.1.
Стероидные
гормоны
представляют
собой
группу
физиологически
активных веществ, участвующих в регуляции процессов жизнедеятельности в
клетке и в целом организме. Их синтез происходит из холестерина в коре
надпочечников, клетках Лейдига семенников, фолликулах и желтом теле
яичников, а также в плаценте, откуда стероидные гормоны, находящиеся, как
правило, в комплексе с белками, разносятся по крови к клеткам-мишеням, где они
взаимодействуют со специфическими рецепторами, которые, в свою очередь,
передают
гормональный
исследований
сигнал
рецепторы
в
клетке.
стероидных
В
гормонов
процессе
биохимических
обнаруживаются
как
на
плазматической мембране, так и в цитозоле и в ядре клеток-мишеней. Так
например, существуют данные о том, что рецепторы стероидных гормонов могут
транслоцироваться через липидный бислой цитоплазматической мембраны на
поверхность клетки для взаимодействия с гормонами, находящимися во
внеклеточном пространстве [1], или о том, что некоторые поверхностные
рецепторы, связанные с G-белками (GPCR), могут также выступать в качестве
этих рецепторов, как, например, GPR30 для эстрогена [2] [3]. Согласно
классической двухступенчатой модели, предложенной в 1972 году Дженсеном,
считается,
что
рецепторы
стероидных
гормонов
в
отсутствие
лиганда
располагаются в цитоплазме (рис. 1) [4]. Согласно этой модели стероидные
гормоны,
являясь
липофильными
молекулами,
легко
проникают
через
цитоплазматическую мембрану клетки-мишени, в цитозоле которой связываются
со специфическими рецепторами, изменяя их конформацию, приводя к
значительному повышению сродства последних к ядерному хроматину. В
результате активированный гормон-рецепторный комплекс транслоцируется из
цитоплазмы в ядро, где он связывается с акцепторными участками ДНК с
последующим изменением траскрипции определенных генов, после чего
12
происходит распад гормон-рецепторного комплекса под действием специальных
выключающих механизмов.
Рисунок 1. Механизм действия стероидных гормонов (модель Дженсена) (4)
На данный момент наиболее изученными являются рецепторы стероидных
гормонов, относящиеся к подсемейству ядерных рецепторов 3 (NR3), которое
включает рецепторы эстрогенов (группа NR3A) [5] и 3-кетостероидов (группа
NR3C) [6]. Подсемейтсво NR3 включает 3 группы ER-подобных рецепторов [7]:
Группа А - эстрогеновые рецепторы:
1. Эстрогеновый рецептор-α (ERα; NR3A1, ESR1)
2. Эстрогеновый рецептор-β (ERβ; NR3A2, ESR2)
Группа Б – эстроген-связанные рецепторы:
1. Эстроген-связанный рецептор-α (ERRα; NR3B1, ESRRA)
2. Эстроген-связанный рецептор-β (ERRβ; NR3B2, ESRRB)
3. Эстроген-связанный рецептор -γ (ERRγ; NR3B3, ESRRG)
Группа C: 3-кетостероидные рецепторы
13
1. Глюкокортикоидный рецептор (GR; NR3C1)
2. Минералокортикоидный Группа (MR; NR3C2)
3. Прогестероновый рецептор (PR; NR3C3, PGR)
4. Андрогеновый рецептор (AR; NR3C4, AR)
Все рецепторы стероидных гормонов, относящиеся к подсемейству NR3,
имеют в своей структуре 5 доменов [8] [9] (рис. 2):
Рисунок 2. Структура рецепторов стероидных гормонов
1. Вариабельный N-концевой домен (VD), структура которого зависит от
типа
рецептора.
Данный
домен
в
своей
структуре
содержит
последовательность, ответственную за активаторную функцию 1 (AF1)
рецептора [10], действие которой не зависит от присутствия лиганда и
сопряжено
с
аналогичной
активаторной
функцией
2
(AF2),
последовательность последней приходится на лиганд-связывающий
14
домен LBD. Данные активаторные функции участвуют в регуляции
транскрипционной активности рецепторов стероидных гормонов [11].
2. Крайне консервативный ДНК-связывающий домен (DBD), состоящий из
двух мотивов [12], отличных по пространственной структуре от
классических цинковых пальцев, так как в данном случае цинк
сопровождается
4-мя
цистеиновыми
остатками
в
отсутствие
гистидиновых.
3. Шарнирный
домен
(Hinge
Domain,
включающий
HD),
последовательность сигнала ядерной локализации NLS, ответственный за
перемещение активированного гормон-рецепторного комплекса в ядро.
4. Умеренно консервативный С-концевой лиганд-связывающий домен
(LBD), ответственный за связывание с гормоном и шапероном Hsp90
[13], а также за активаторную функцию AF2 [10, 11].
5. Вариабельный С-концевой домен (СD), структура которого также
зависит от типа рецептора.
Известно, что все рецепторы, входящие в группу ядерных рецепторов NR3,
действуют как транскрипционные факторы, перемещаясь в ядро при активации.
За данное перемещение ответственен регион сигнала ядерной локализации NLS,
приходящийся на шарнирную область рецептора. В отсутствие гормонов этот
регион закрыт белками теплового шока (HSPs), при этом рецепторы находятся в
неактивном состоянии в виде олигомерных комплексов. Например, было
показано, что
рецепторы
стероидных
гормонов образуют
комплексы с
шаперонами Hsp90, Hsp40 и Hsp70, иммунофилинами и другими белками [13],
что необходимо для созревания рецептора для высокоаффинного взаимодействия
с гормоном. После синтеза рецепторы стероидных гормонов проходят АТФзависимый
путь
сборки
с
Hsp90-ассоциированными
белками,
присоединяющимися к лиганд-связывающему доменому (LBD) рецептора.
Первоначально связывается шаперон Hsp40, далее присоединяются Hsp70 и Hip,
затем происходит связывание с Hop и Hsp90 с образованием промежуточного
рецепторного комплекса, который после модифицируется путем отсоединения
15
Hsp70 и Hop, что открывает возможость рецептору связываться с гормоном.
Привлечение p23 приводит к формированию зрелого рецепторного комплекса,
способного связываться с гормоном с высокой степенью аффинности и, также,
характеризующегося присутствием в комплексе дополнительных белковых
участников: шарнирный домен (Hinge Domain, HD последовательность сигнала
ядерной локализации NLS, С-концевой домен (СD). Взаимодействие стероидного
гормона с лиганд-связывающим доменом рецептора приводит к высвобождению
Hsp90
и
его
кошаперонов
и
конформационной
экспозиции
элементов,
необходимых для димеризации рецептора, его ядерной транслокации и
связыванию с ДНК. Ранее для рецептора глюкокортикоидов (GR) был обнаружен
регион в домене LBD длиной 114 аминокислотных остатков (550-653),
необходимый для взаимодействия с Hsp90 [14]. Также оказалось, что данный
регион включает консервативную и для других рецепторов стероидных гормонов
последовательность (577-596), возможно определяющую стабильность комплекса
рецептора с Hsp90 и его кошаперонами. В результате аналогичных исследований
для рецептора прогестерона (PR) и рецептора эстрогена (ER) также было
выявлено несолько участков LBD, ответственных за связывание с Hsp90. Однако
для ER также была определена роль C-концевого региона (аминокислотные
остатки 251-271), с которым связывается кошаперон FKBP52, что необходимо для
более стабильного взаимодействия LBD с Hsp90 [13].
Связывание гормона с рецептором приводит к диссоциации последнего от
белков теплового шока, его гомодимеризации, транслокации в ядро, где
активированный рецептор связывается со специфическими последовательностями
ДНК - гормон-респонсивными элементами, состоящие из инвертированных
повторов, разделенных разным количеством нуклеотидом. Так например,
известно, что рецепторы эстрогенов связываются с инвертированными повторами
A/GGGTCA, разделенными тремя нуклеотидами, а рецепторы андрогенов,
глюкокортикоидов и прогестинов - с инвертированными повторами AGA/GACA,
также разделенными тремя нуклеотидами [15, 16]. Образовавшийся комплекс
рецептор-ДНК
рекрутирует
значительное
16
число
других
белков
(транскрипционных сорегуляторов), что усиливает или ингибирует транскрипцию
в мРНК ассоциированного гена-мишени [17]. Функции этих сорегуляторов
включают перестройку хроматина, что делает ген более или менее доступным для
траскрипции, а также подготовку к взаимодействию с другими регуляторными
белками.
Данные
регуляторные
молекулы
могут
выступать
в
качестве
коактиваторов, которые обладают гистонацетилтрансферазной активностью, что
ослабляет связь гистонов с ДНК, и способствует транскрипции генов, или в
качестве корепрессоров с гистондезацетилазной активностью, что усиливает
ассоциацию гистонов с ДНК, и, следовательно, подавляет транскрипцию гена.
Ядерные рецепторы могут напрямую или опосредованно через другие белки
связываться
с
корегуляторами,
вовлекаясь
во
многие
внутриклеточные
сигнальные пути [18]. Наиболее распространенным механизмом действия
рецепторов
стероидных
гормонов
является
прямое
связывание
ядерных
рецепторов с гормон-респонсивными элементами, называемый трансактивация.
Однако некоторые ядерные рецепторы не могут непосредственно связываться с
ДНК,
обладая
трансрепрессорной
активностью
в
отношение
некоторых
транскрипционных факторов. Так например, глюкокортикоидный рецептор GR
ингибирует промотирующую транскрипционную активность AP-1 и NF-κB [19].
Для молочной железы основными стериодными гормонами, участвующими
в регуляции ее роста, являются эстроген и прогестерон [20, 21]. Данные гормоны
регулируют развитие молочной железы во время полового созревания,
беременности, а также вовлечены в процессы инициации и прогрессии РМЖ.
Самым важным из эстрогенов является эстрадиол (E2), секретируемый
яичниками от начала полового созревания до наступления менопаузы. Его
уровень
колеблется
в
течение
менструального
цикла,
достигая
пика
непосредственно перед овуляцией, после которой эстрадиол в сочетании с
прогестероном изменяет эндометрий матки для возможной имплантации
оплодотворенной яйцеклетки. В период беременности в дополнение к яичникам
эстрадиол секретируется также плацентой. Во время полового созревания,
эстрадиол способствует росту и развитию молочных желез и окружающих тканей.
17
В зрелом возрасте он способен усиливать пролиферацию и скорость деления
клеток молочной железы, активируя сигнальные пути ERK, PI3K и STAT [22].
Так, было показано, что в ER-позитивных клетках рецептор эстрогена напрямую
связывается
с
тирозинкиназой
c-Src
и
другими
цитоплазматическими
сигнальными и адапторными молекулами: Shc, PI3K, MNAR, и p130 Cas. С
помощью «knock-down» исследований было найдено, что в ответ на E2 и на
действие эпидермального фактора роста EGF, с участием c-Src происходит
фосфорилирование по тирозину транскрипционного фактора STAT5, после чего
последний
транслоцируется
в
ядро
для
запуска
транскрипции
генов
пролиферации клеток. Таким образом, существуют перекрестные связи между
действием стероидных гормонов, в частности эстрогена E2, и факторов роста, что
может играть важную роль в возможном снижении устойчивости некоторых
опухолей к эндокринной терапии.
Прогестерон секретируется яичниками во время менструального цикла
после овуляции (лютеиновой фазы) в том случае, если яйцеклетка не
оплодотворена, а также при наступлении беременности в течение первых
нескольких недель яичниками, а затем в течение всего срока беременности в
плаценте. Прогестерон регулирует развитие протоковой системы, альвеол,
необходимых для секреции и доставки молока [23], а также осуществляет
контроль за паракринными сигнальными путями через рецепторный активатор
лиганда ядерного фактора κ-B (RANKL). В середине и в конце беременности
прогестерон подавляет секреторную активность через перекрестные PR -,
пролактин/Stat5 - сигнальные пути. Потеря прогестеронвых рецепторов в
первичной опухоли ассоциируется со снижением дифференцировки, более
инвазивным фенотипом и плохим прогнозом.
Эстроген и прогестерон функционируют в клетках молочной железы через
связывание с соответствующими внутриклеточными рецепторами, ER и PR,
которые являются членами подсемейства ядерных рецепторов NR3 [6]. Так
эстроген, проникая в клетку, связывается с ER, который диссоциирует из
комплекса
с
белками
теплового
шока,
18
претерпевая
конформационные
перестройки, фосфорилирование и димеризацию, взаимодействуя с эстрогенреспонсивными элементами (ERE) эстроген-зависимых генов [4]. Также рецептор
эстрогена способен регулировать экспрессию генов без прямого взаимодействия
ER с ДНК, а именно через другие транскрипционные факторы, например
активирующий Fos/Jun-комплекс протеин-1 (AP-1), представляя неклассическое
геномное действие ER [24], [25]. В дополнение, рецептор эстрогена обладает
негеномным действием, в частности, участвуя в активации PI3k- и Aktсигнальных путей [26].
Для рецептора эстрогена известно 2 изоформы: ERα и ERβ, активация
которых приводит к изменениям в экспрессии многих генов, участвующих в
регуляции клеточной пролиферации и апоптоза [27]. Известно, что ERβ обладает
схожими с ERα аффинностью к эстрадиолу и способностью связываться в виде
гомодимера с эстроген-респонсивными элементами ДНК. Предполагается, что
эстрогеновый сигнальный путь может проходить как через ERα, так и ERβ, или
ERβ/ERα, в зависимости от того, какая изоформа эстрогенового рецептора более
экспрессирована в клетках. Кроме того, были получены данные о том, что
эстрадиол может оказывать быстрое негеномное воздействие на сигнальные пути,
взаимодействуя с мембранными рецепторами [2]. Прогестероновый рецептор
также представлен 2-мя основными изоформами: PR-А и PR-B, но в отличие от
ER подтипов, каждый из которых ассоциирован с отдельным геном, эти
изоформы транскрибируются из двух различных сайтов инициации транскрипции
в пределах одгого и того же гена [28]. Известно, что изоформы PR обладают
различной транскрипционнй активностью, например, PR-A способен как
ингибировать, так и усиливать активность изоформы PR-B. Также существует
укороченная на 594 нуклеотида с N-конца изоформа PR-С, которая может
образовывать гетеродимеры с PR-B. Формы PR-A и PR-В также способны
модулировать ER и эстрогензависимую экспрессию генов [27].
Таким образом, существуют перекрестные связи между действием
стероидных гормонов, в частности эстрогена и прогестерона и другими
19
сигнальными путями, что может играть важную роль в возможном снижении
устойчивости рака молочной железы к эндокринной терапии.
1.2.
Пути развития гормональной резистентности РМЖ
Одним из методов лечения рака молочной железы (РМЖ) является
гормональная или антиэстрогеновая терапия, действие которой направлено на
блокирование активности эстрогенов в опухолевых клетках. На сегодняшний день
содержание рецепторов эстрогенов (ER) относится к основным критериям
определения чувствительности больных раком молочной железы к гормональным
противоопухолевым препаратам [29-34]. Если опухолевые клетки содержат
рецепторы эстрогена (ER), то такой РМЖ является ER-позитивным или
эстрогензависимым. Примерно 70% случаев рака молочной железы оказывается
ER-положительным, большая часть которых также
содержит рецепторы
прогестерона [35].
Одной из основных причин, ограничивающих эффективность гормональной
терапии,
является
развитие
гормональной
резистентности.
Различают
врожденную и приобретенную гормональную резистентность РМЖ; если
приобретенная резистентность развивается в процессе гормональной терапии, то
врожденная резистентность, как правило, связана с предсуществующими
нарушениями гормонального сигналинга клеток. В обоих случаях снижение
гормональной зависимости может быть обусловлено рядом причин:
- уменьшение содержания или полная потеря рецептора эстрогена;
- лиганд-независимая активация ER;
- стимуляция митогенных сигнальных путей, идущих в обход рецептора
эстрогена.
1.2.1. Потеря рецептора эстрогена
Примерно 2/3 типов рака молочной железы экспрессируют ERα, остальная
1/3 – не экспрессируют и характеризуются резистентностью к гормональной
терапии, уменьшением степени дифференцировки и ухудшением клинического
20
прогноза [21]. Более того, от 30 до 40% метастазов из первичной ERположительной опухоли молочной железы устойчивы к эндокринной терапии, и
одной из причин такой устойчивости является снижение или полная утрата
клетками рецептора эстрогена [35].
Потеря экспрессии ERα может быть объяснена либо эпигенетическими
модификациями гена, либо утратой транс-активирующих факторов, необходимых
для экспрессии гена. Один из возможных механизмов, который может
блокировать транскрипцию, является метилирование цитозин-гуанин богатых
последовательностей, так называемых CpG-островков, располагающихся в 5’регуляторных регионах некоторых генов [36]. Опухолевые клетки часто
характеризуются повышенным паттерном метилирования. Например, для клеток
рака молочной железы было найдено, что гены E-кадгерина [37], BRCA1 [38] и
HIC-1
[39]
гиперметилированы.
располагаются
в
промотере
и
В
гене
первом
ERα
типичные
экзоне.
Они
CpG-островки
присутствуют
в
неметилированном виде и в нормальной ткани и в клетках, не экспрессирующих
ERα. Было показано, что метилирование данных CpG-островков ассоциировано с
потерей экспрессии ERα [40]; продемонстрировано,
что при обработке
деметилирующим агентом 5-аза-2’-дезоксицитидином (5-aza-dC) ER-негативных
клеток MDA-MB-231 происходит индукция экспрессии ERα [41]. Также было
найдено, что метилирование промотеров А и B гена ERα может как напрямую
влиять на активность рецептора в клетках РМЖ, так и опосредованно – через
транскрипционные факторы ERBF-1 и ER-фактор 1 (ERF-1), регулирующий
промотер А [42]. Известны и другие механизмы, приводящие к потере экспрессии
рецептора эстрогена, к которым относится гипоксия, гиперэкспрессия рецепторов
эпидермального фактора роста (EGFR или HER2), гиперактивация касакада
митогенактивирующих протеинкиназ (MAPK). Так например, гипоксия вызывает
протеосомную деградацию ER в клетках РМЖ ZR-75, что приводит к снижению
уровня белка [43]. Наблюдающаяся в ER-негативных клетках рака молочной
железы гиперэкспрессия EGFR и HER2 свидетельствует об активизации EGF- и,
следовательно,
MAPK-каскада,
что
может
21
способствовать
подавлению
транскрипции гена ER, и, в результате, эндокринной устойчивости [44, 45].
Существуют данные о том, что р53 регулирует экспрессию гена ER через
элементы, расположенные выше ER-промотера. Необходимо отметить, что
большая часть опухолей молочной железы с мутацией гена p53 являются ERнегативными [46, 47]. pRb2 / P130 также регулирует транскрипцию промотера ER
[48]. Стоит отметить, что некоторые мутации гена могут привести к снижению
активности ERα без потери его экспрессии. Об этом свидетельствуют данные
сайт-направленного мутагенеза в AF-2 области ERα, показавшие снижение
эстроген-зависимой транскрипции при сохраненной способности рецептора
взаимодейстовать с гормоном и связываться с ДНК [49], а также данные о замене
аспартата на глицин в 351 положении рецептора, что приводит к снижению
эффективности действия 4-гидрокситамоксифена [50].
Для изоформы рецептора ERβ, которая обнаруживается и в нормальных, и в
опухолевых клетках молочной железы [51, 52], показано снижение экспрессии в
преинвазивных опухолях по сравнению с доброкачественными и нормальными
тканями [53]. Установлено, что уровень мРНК ERβ примерно в 2 раза выше, чем
мРНК ERα в устойчивых к тамоксифену опухолях по сравнению с тамоксифенчувствительными [54]. Несмотря на схожие гомологию по доменам LBD и DBD и
сродство
к
эстрадиолу,
транскрипционными
изоформы
активностями
ERα
[55],
и
ERβ
однако
обладают
роль
ERβ
различными
в
развитии
резистентности к тамоксифену мало изучена.
Утрата клетками рецептора эстрогенов приводит к развитию гормональной
резистетности РМЖ, однако лишь у части (17%–28%) пациентов, для которых
гормонотерапия оказывается неэффективной, клетки не экспрессируют рецептор
эстрогена [56-58], в остальных случаях резистентность к тамоксифену развивается
при сохраненном рецепторе эстрогенов [59, 60].
1.2.2. Лиганд-независимая активация рецептора эстрогена
Гормональная
резистентность
также
может
развиваться
вследствие
независимой активации рецептора эстрогена в отсутствие лиганда при
22
сохраненной экспрессии рецептора (в ER-позитивных клетках). Как правило,
данная активация может происходить за счет вовлечения перекрестных
сигнальных
путей
с
фосфорилированием
рецептора,
что
приводит
к
конформационным изменениям последнего. Для ERα был определен ряд сайтов
фосфорилирования по серину и тирозину, которые влияют на устойчивость
клеток к тамоксифену (рис. 3) [61].
Рисунок 3. Лиганд-независимая активация рецептора эстрогена
Известно, что серины в положениях 102, 104 и 106 (S102, S104 и S106
соотвественно), приходящихся на N-концевую активаторную область AF-1 в
структуре ERα, фосфорилируются гликоген-синтазной киназой-3 (GSK-3), а также
участниками митогенного MAPK-каскада: киназами ERK1/2 и MEK1/2, что
приводит к лиганд-независимой активации ERα и уменьшению чувствительности
к тамоксифену [62]. Также было показано, что S104 и S106 могут быть
фосфорилированы киназой CDK2, находящейся в комплексе с циклином А [63],
причем циклин А может выступать в качестве прогностического маркера к
резистентности к тамоксифену у больных РМЖ [64].
Другим сайтом фосфорилирования рецептора эстрогена альфа является
серин в 118 положении (S118). Он является субстратом сразу для нескольких
сигнальных белков: MAPK, GSK-3, IKKα, CDK7, mTOR/p70S6K. Известно, что
MAPK-фосфорилирование
по
данному
положению
снижает
аффинность
рецептора к тамоксифену, повышает способность связываться с коактиватором
23
SRC3 [65], а также делает рецептор более чувствительным к эстрадиолу [66].
Было показано, что
фактор
роста
инсулина
IGF может индуцировать
фосфорилирование ERα по серину в 118 положении через сигнальный путь
RAS/MAPK, приводя к активации рецептора и повышению ответа на эстрадиол
[67]. Эстрадиол, а также эпидермальный фактор роста (EGF), запуская ERK1/2MAPK-каскад,
также
вызывают
фосфорилирование
Продемонстрировано фосфорилирование
ERα
по
S118
[68].
ERα по S118 киназами IKKα [69] и
CDK7 [70]. В клетках MCF7 рецепторная тирозинкиназа RET фосфорилирует ERα
по S118 и S167 через сигнальный путь mTOR/p70S6K [71], приводя к лиганднезависимой
активации
транскрипции
эстроген-зависимых
генов
и
к
устойчивости к тамоксифену [72]. Фосфорилирование S118 также влияет на
активность корегуляторов ERα-регулируемых генов: pS2, c-myc и циклин D1. По
одним данным, фосфорилирование рецептора по S118 связано с более
дифференцированным
фенотипом,
хорошим
прогнозом,
и
большей
чувствительностью к тамоксифену [69, 73]; в других работах было обнаружено,
что такое фосфорилирование приводит к прогрессии гормоннезависимых
опухолей [74].
Серин в 167 положении (S167)  еще один сайт фосфорилирования ERα
киназами Akt, p90RSK, и mTOR/p70S6K. Akt активируется через сигнальные
каскады EGF и IGF [75], p90RSK  EGF [76]. Гиперэкспрессия EGFR индуцирует
фосфорилирование ERα по S167, приводя к повышению связывания ERα с ДНК и
усилению взаимодействия с рецептором коактиватора SRC3 в присутствие E2, а,
следовательно, к повышению транскрипции. Данное фосфорилирование никак не
влияет на лиганд-связвающую функцию рецептора., но снижает чувствительность
к тамоксифену [65]. Среди прочих эффекторов, фосфорилирующих ERα по S167,
ERK1/2 MAPK [77] и казеиновая киназа II (CK2) [78]. Данные по клиническому
значению фосфорилирования по S167 противоречивы: с одной стороны,
у
больных с ER+РМЖ активация Akt (рАkt) ассоциирована с высоким риском
рецидивов и снижением выживаемости [79], что предполагает, что S167фосфорилирование связано с ухудшением прогноза, а с другой  высокая
24
чувствительность
к
эндокринной
терапии
РМЖ
коррелирует
с
фосфорилированием по S167 и более длительным сроком жизни после рецидива
[80, 77].
Также было показано, что ERα фосфорилируется по серину в 282
положении (S282), приходящимся на шарнирный домен, киназой CK2. Эстрадиол
повышает
S282-фосфорилирование,
стабилизируя
и
ER
индуцируя
его
транскрипционную активность [81]. Низкий уровень фосфорилирования по
данному сайту связан со снижением выживаемости пациентов с ER-позитивными
опухолями после терапии тамоксифеном, что свидетельствует о перспективности
использованиия S282-фосфорилирования в качестве прогностичнеского маркера
ответа на тамоксифен [82].
Серин,
располагающийся
в
305
положении,
приходится
на
многофункциональную шарнирную область, которая отвечает за регуляцию и
активность ERα, а также за связывание с корегуляторами [83]. Известно, что
одним из эффекторов ER, фосфорилирующим его по S305, является протеинкиназа А (PKA) [84-86]. Также данный регион контролирует убиквитинирование
и последующую протеосомную деградацию ERα [87]. Различные лиганды могут
вызывать конформационные перестройки ERα и, следовательно, они влияют на
доступ к шарнирной области для модифицирующих партнеров, таких как
убиквитинлигаза, что означает, что лиганды могут быть селективными в
отношении конкретных посттрансляционных модификаций. В шарнирной
области располагаются
деградации
ERα
[88].
лизины
K303
K302/303, участвующие
является
мишенью
для
в протеосомной
ацетилирования
(ингибирование активности ER) и для метилирования (стабилизирование ER,
повышение его активности) рецептора. S305-фосфорилирование предотвращает
ацетилирование K303 [89], стимулируя активность ER, и наоборот: мутация
K303R, часто встречающаяся при раке молочной железы, препятствует
ацетилированию, что увеличивает PKA-зависимое фосфорилирование по S305
[90]. Еще одним потенциальным эффектором, фосфорилирующим рецептор
эстрогена альфа по серину в 305 положении, может быть р21-активирующая
25
киназа-1 (PAK1), что также может привести к конформационным перестройкам,
затрагивающим 118 серин [91-93]. В подтверждение могут служить данные о том,
что данный эффект может быть заблокирован доминантно-негативным Rac1 [94],
который является прямым активатором PAK1. Интересно, что гиперэкспрессия
PAK1 ассоциирована с резистентностью к тамоксифену как in vitro [95], так и в
клинике [85, 86], а комбинация маркеров: PAK-1, активированный фосфо-PKA и
S305-фосфорилирование, выявляется в 60-70% случаев РМЖ, устойчивого к
тамоксифену [84, 86].
Показано, что тирозин в 537 положении (Y537) фосфорилируется
тирозинкиназами семейства Src, что приводит к подавлению димеризации
рецептора, связывания с эстрогеном и снижению транскрипционной активности
ERα [96]. Замена тирозина на аланин в 537 положении препятствует
фосфорилированию и стимулирует формирование активной конформации
рецептора в отсутствие лиганда [97]. Отмечалось, что фосфорилирование ERα по
Y537 киназами Src увеличивает аффинность рецептора к эстрадиолу и уменьшает
сродство к тамоксифену [65]. Нет никаких клинических данных о том, что Y537фосфорилирование влияет на чувствительность больных РМЖ к тамоксифену.
Очень редкая мутация с заменой 537-го тирозина на аспарагин (Y537N) в
метастазах РМЖ конститутивно активирует рецептор эстрогена, что может
способствовать прогрессированию рака молочной железы и устойчивости к
эндокринной терапии [98].
1.2.3. Митогенные сигнальные пути, поддерживающие рост
РМЖ в отсутствие эстрогенов
Эстрогеннезависимый рост и резистентность к гормональной терапии могут
развиваться вследствие активации митогенных сигнальных путей, идущих в
обход рецептора эстрогена, что может происходить вне зависимости от
экспрессии ER как в ER-позитивных, так и ER-негативных клетках РМЖ [29, 31,
99-104]. Среди данных сигнальных путей ведущее значение принадлежит
26
рецепторным тирозинкиназам (EGFR, PI3K, NF-kB), активации которых
достаточна для прохождения митогенного сигнала без участия ER.
Сигнальный
путь
EGFR
может
быть
запущен
рядом
лигандов:
эпидермальный фактор роста (EGF), трансформирующий фактор роста-альфа
(TGFα), амфирегулин (AREG), бетацеллулин (BTC), гепарин-связывающий EGFподобный фактор роста (HB-EGF) и эпирегулин (EPR), из которых самым
высокоаффинным к рецептору эпидермального фактора роста является сам EGF.
На сегодняшний день семейство EGFR включает EGFR (также известный как
ErbB1 или HER1), HER2 (HER2/neu или ErbB2), ErbB3 (HER3), и ErbB4 (HER4)
[105]. Все представители данного семейства являются трансмембранными
гликопротеинами, содержащими внеклеточный лиганд-связывающий домен и
внутриклеточный рецепторный тирозинкиназный домен. Активируясь они
передают сигнал в клетке через PI3К, Ras-Raf-MAPK, JNK и PLCγ, приводя ко
множеству биологических эффектов: индукция пролиферации, дифференцировки,
миграции, адгезии и выживаемости клеток (рис. 4) [106-108]. Взаимодействие
лиганда с внеклеточным доменом EGFR индуцирует димеризацию последнего,
активацию
его
внутренней
киназной
активности
с
последующим
аутофосфорилированием цитоплазматического домена по множеству остатков
тирозина (Y1016, Y1092, Y1110, Y1172, Y1197 и др.) [109]. Фосфотирозины
активированного рецептора рекрутируют цитоплазматические белки через их
SH2-домены [107]. Так, один из адапторных белков GRB2 связывается с
фосфотирозином в положении 1068, что привлекает к мембране гуанин-нуклеотид
обменный фактор (GEF) - SOS [110], который путем обмена ГДФ на ГТФ
активирует RAS, приводя к запуску MAPK-каскада через последовательное
фосфорилирование и активирование соответствующих киназ (RAS-RAF- MEKMAPK/ERK1,2), что, в свою очередь, приводит к фосфорилированию c-myc и cfos
[111], участвующих
в регуляции
клеточного цикла, пролиферации,
выживаемости и миграции клеток. Также GRB2 или другие адапторные белки,
такие как GAB, вовлекают в EGFR-сигнальный путь другой важный медиатор 
фосфатидилинозитол
3-киназу
(PI3K),
27
которая
конвертирует
фосфатидилинозитол-4,5-бисфосфат
(PIP2)
в
фосфатидилинозитол-3,4,5-
трифосфат (PIP3) [112]. PIP3 связывается с доменом PH киназы Akt
(протеинкиназы В), рекрутируя ее к цитоплазматической мембране, где
происходит фосфорилирование Akt с участием протеинкиназы PDK1. Под
контролем Akt находятся сигнальные белки самого широкого спектра действия,
контролирующие
выживаемость
клеток
[113]
и
клеточный
цикл
(PI3k/AKT/mTOR) [114, 115]. Также PI3K контролирует Rac-зависимый сигналинг
и перестройку цитоскелета через PIP3-активацию GEF, модулирующих Rac [116].
EGFR способен активировать фосфолипазу С [117], которая гидролизует PIP2 с
образованием инозитолтрифосфата (IP3) и 1,2-диацилглицерина (DAG): IP3
индуцирует высвобождение Ca2 + из эндоплазматического ретикулума, приводя к
активации кальций-зависимых сигнальных путей, задействованных в регуляции
клеточной подвижности; а DAG активирует сигнальный путь протеинкиназы C
(PKC),
вовлекая
в
сигналинг
транскрипционный
фактор
NF-κB
[118],
осуществляющий контроль за генами апоптоза. Киназа PKC модулирует
активацию G белков, таких как RAC и CDC42 [119], осуществляя контроль за
полимеризацией актина и подвижностью клетки.
28
Рисунок 4. Митогенные сигнальные пути, идущие в обход рецептора
эстрогена, поддерживающие рост РМЖ в отсутствие эстрогенов
Так как описанный выше сигнальный путь вовлечен в регуляцию
пролиферации, клеточного цикла, миграции и выживаемости клеток, его
нарушения часто ассоциированы с онкогенезом. Например, гиперэкспрессия
наблюдается
HER2
в
20-25%
случаев
рака
молочной
железы;
гиперэкспрессированный EGFR ассоциирован с большими размерами опухоли,
низкой стпепенью дифференцировки и плохим прогнозом [120-123]. Существуют
данные о том, что экспрессия EGFR и HER2 обратно коррелируют со статусом
ER,
а
гетеродимеры
EGFR
и
HER2
могут
увеличивать
вероятность
метастазирования РМЖ [124]. Чаще всего гиперэкспрессия EGFR наблюдается в
ER-негативных клетках, в которых также не экспрессированы прогестероновый
рецептор и Her2/neu (Triple Negative Breast Cancer, TNBC) [125, 126], для которых
29
одним
из
возможных
вариантов
лечения
является
таргетная
терапия,
направленная на подавление EGFR-сигналинга, например его основного
митогенного
пути
Ras/MAPK
[127].
Одной
из
возможных
причин
гиперэкспрессии EGFR в клетках рака молочной железы является амплификация
его гена [128], которая случается достаточно редко для обычного РМЖ: от 0,8%
до 14% случаев РМЖ [129, 130], и чаще для TNBC: около 25% [131, 132]; другой
причиной гиперэкспрессии EGFR могут быть активирующие мутации [133].
Достаточно часто для РМЖ встречаются мутации эффекторов рецептора
эпидермального фактора роста. Так например, примерно в 1/3 случаев рака
молочной железы мутирована киназа PI3K, и, как правило, в каталитическом
домене, что приводит к ее повышенной ферментной активности [134]. В ERпозитивных опухолях частота этих мутаций составляет более 30%, для TNBC –
частота мутаций ниже. Также существуют данные о гиперактивации и
гиперэкспрессии в клетках РМЖ других эффекторов EGFR-сигнального пути:
RAS [135, 136], MAPK [137, 138], Raf-1 [139]. Также необходимо отметить, что
нарушения сигнального пути EGFR (Ras-ERK) могут привести и к эпителиальномезенхимальному переходу (EMT), и, как следствие, к более злокачественному
фенотипу [140-142]. В активации ERK также могут быть задействованы киназа
RSK [143] и сигнальный путь трансформирующего фактора роста-бета (TGFβ)
[144], что может стимулировать клеточную подвижность и приводить к клеточной
инвазии.
Известно, что гиперэкспрессия и гиперактивация EGFR или HER2 могут
способствовать развитию гормональной резистентности через активацию MAPKи PI3K/AKT-сигнальных путей, которые приводят к усилению клеточной
пролиферации и выживаемости [145]. При трансфекции ER-положительных
клеток плазмидой, содержащей HER2, наблюдается подавление экспрессии
рецептора эстрогена и развитие устойчивости к тамоксифену [146, 147].
Существуют некоторые данные, подтверждающие роль HER2 в развитии
устойчивости к эндокринной терапии независимо от ER. Так, например, в
опухолях, которые приобрели устойчивость к фулвестранту, наблюдается
30
значительное
усиление
активности
HER-2
и
МАРК,
предположительно
способствующих развитию резистентного фенотипа [148]. ER-позитивные
ксенотрансплантаты с гиперэкспрессией HER2 характеризуются снижением ER,
нарушением синтеза рецептора прогестерона, увеличением экспрессии муцина
(MUC4) – одного из маркеров гормональной резистентности [149]. В клетках
MCF-7/HER2-18, характеризующихся гиперэкспрессией HER2 и ER, тамоксифен
выступает
в
роли
агониста
эстрадиола,
стимулируя
рост
клеток.
Фосфорилирование и активация как ER и EGFR/HER2-рецепторов, а также МАРК
и AKT сигнальных путей, и коактиватора рецептора  AIB1, повышены в этих
клетках по сравнению с MCF-7 дикого типа [150]. Также показано, что активация
PI3К-сигнального
пути
может
сопровождаться
развитием
гормональной
резистентности. Так нокдаун негативного регулятора AKT – фосфатазы PTEN,
увеличивает фосфорилирование PI3K и AKT в ER-позитивных клетках рака
молочной
железы,
стимулирует
эстроген-независимый
рост
клеток
и
устойчивость к тамоксифену и фулвестранту [151, 152]. Клинические данные
свидетельствуют
о
том,
что
активация
PI3K,
являющаяся
результатом
гиперэкспрессии HER2, рецептора фактора роста фибробластов 1 (FGFR 1) или
потери инозитолполифосфат-4-фосфатазы II типа (INPP4B), сопровождается
устойчивостью к тамоксифену у пациентов с ER-позитивным РМЖ [153].
Интересно, что мутация в каталитической субъединице PI3K является наиболее
распространенной
генетической
аномалией
для
ER-положительного
рака
молочной железы (около 30%), в то время как потеря PTEN в большей степени
связаны с ER-отрицательным РМЖ. Ингибиторы PI3K увеличивают проапоптотический эффект тамоксифена в клеточной линии с высоким эндогенным
уровнем активности AKT, что подтверждает связь актиации PI3K/AKTсигнального пути с развитием эндокринной устойчивости [154, 155]. Также
показано участие MAP киназ  p44/42 (ERK1/2) в развитии гормональной
резистентности опухолевых клеток [156]. В целом, имеющиеся на сегодняшний
день данные, однозначно свидетельствуют о ключевой роли тирозинкиназных
31
сигнальных каскадов в развитии и поддержании гормональной независимости
РМЖ.
Терапия эстрогензависимого и эстрогеннезависимого РМЖ
1.3.
В случае эстрогензависимого РМЖ прогрессию и регрессию опухоли можно
модулировать
с
направленных
на
опухолевые
больных
помощью
предотвращение
клетки.
раком
соответствующих
Основным
молочной
воздействия
критерием
железы
к
эндокринных
манипуляций,
стероидного
определения
гормональным
гормона
на
чувствительности
противоопухолевым
препаратам является содержание рецепторов эстрогенов (ER) [29-34]. Если
опухолевые клетки содержат рецепторы эстрогена (ER), то такой РМЖ является
ER-позитивным или эстрогензависимым. Примерно 70 % случаев рака молочной
железы оказывается ER-положительным [35], для которых на сегодняшний день
применяются достаточно эффективно следующие подходы в лечении:
1. Удаление или подавление функции яичников, как основного источника
эстрогенов у женщин в репродуктивном периоде. Удаление яичников может
быть сделано хирургически или путем обработки излучением. Для
подавления функции яичников используются агонисты гонадотропинрилизинг-гормона
(ГнРГ),
которые
препятствуют
передаче
стимулирующего сигнала от гипофиза к яичникам. Примерами таких
препаратов могут служить гозерелин [157] и леупролид [158].
2. Применение эндокринных агентов, специфически подавляющих активность
рецептора эстрогена:
- блокаторы синтеза эстрогенов (ингибиторы фермента ароматазы):
анастрозол [159] и летрозол [160], временно инактивирующие ароматазу, и
экземестан, который постоянно инактивирует фермент [161].
- блокаторы действия эстрогена, которые влияют на способность эстрогена
стимулировать рост клеток рака молочной железы. К этой группе относятся
селективные
модуляторы
рецепторов
эстрогена
(SERMs),
которые,
связываясь с рецепторами, предотвращают взаимодействие с ними
32
эстрогена, такие как: ралоксифен и тамоксифен [162], последний из которых
используется более 30 лет для лечения гормонзависимого рака молочной
железы. SERMs, связываясь с рецепторами эстрогена, могут, в зависимости
от типа ткани, не только блокировать активность эстрогена (т.е. служить
антагонистами эстрогена), но и, наоборот, имитировать его эффекты (т.е.
выступать в роли агонистов эстрогена). Так, например, тамоксифен
блокирует действие эстрогена в ткани молочной железы, но действует как
эстроген в матке и костной ткани, его также применяют для снижения риска
развития инвазивного рака молочной железы в постменопаузе [164]. Другой
антиэстроген, фулвестрант [163], обладает только антиэстрогеновой
активностью, его связвание с ER приводит к уничтожению последнего.
Исследования, проведенные на клетках эстрогензависимого РМЖ линии
MCF-7 показали, что длительное культивирование с тамоксифеном приводит к
активации
МАР
киназ
и
повышению
активности
ароматазы,
которые
сопровождают развитие устойчивости к тамоксифену. Было предложено 3 стадии
развития резистентности к тамоксифену:
1 стадия - тамоксифен ведет себя как антагонист эстрогена;
2 стадия - опухоль становится более чувствительной к агонистическому
действия тамоксифена;
3 стадия - опухоль приобретает повышенная чувствительность к эстрогену
(гиперчувствительность).
Опухолевые клетки с приобретенной гормональной резистентностью
характеризуются
гиперэкспрессией
IGF-1R,
HER2,
EGFR,
а
также
гиперактивацией PI3K/AKT/mTOR [165].
При
приобретает
лечении
эстрогеннезависимых
форм
РМЖ
большое
значение
таргетная терапия, направленная на подавление активности
митогенных сигнальных путей, идущих в обход ER, в частности – EGFRсигнального пути. Так например, рецептор эпидермального фактора роста,
который часто гиперэкспрессирован в клетках TNBC [125, 126], рассматривается
в качестве терапевтической мишени для таргетной терапии [166], и в клинике
33
применяются агенты, являющиеся его специфическими блокаторами. Среди таких
препаратов: гефитиниб  селективный ингибитор EGFR, трастузумаб (герцептин)
 моноклональное антитело, которое блокирует HER2 [167]. Была доказана
эффективность трастузумаба, а также ингибитора тирозинкиназной активности
HER2 - AG1478, на моделях клеток MCF-7 с приобретенной резистентностью к
тамоксифену и клеток BT-474 с гиперэкспрессией HER2. Также были
разработаны специфические ингибиторы mTOR – эверолимус (RAD001) и
PI3K/mTOR - BEZ235, подавляющие рост клеточных линий, подвергающихся
эндокринной терапии в течение длительного времени [168, 169].
Эффективность комбинированной терапии существенно возрастает при
сочетании ингибиторов EGFR-сигнального пути с другими противоопухолевыми
препаратами.
Так
например,
применение
трастузумаба
или
лапатиниба
(ингибитора тирозинкиназы, который прерывает митогенный сигнальный путь от
HER2) вместе с ингибитором ароматазы улучшает выживаемость пациентов с ERи HER2-позитивным метастатическим РМЖ [170]. Комбинированный ингибитор
EGFR, HER2 и VEGFR  AEE788 в комплексной терапии с тамоксифеном или
летрозолом обладает высокой противоопухолевой активностью при лечении
HER2-положительного РМЖ [171]. К максимальному подавлению пролиферации
клеток РМЖ приводит комбинация BEZ235 (PI3K/mTOR ингибитора) и
тамоксифена [172].
В целом, сочетание таргетной и гормональной терапии является на
сегодняшний день наиболее перспективным и активно разрабатываемым походом
в (нео)адьювантной терапии РМЖ.
1.4.
PAKs – важные регуляторы ключевых функций клеток
Одним из важнейших эффекторов тирозинкиназных рецепторов является
PAK1, относящаяся к семейству P21-активированных киназ (PAKs). PAKs
представляют
собой
серин-треониновые
протеинкиназы,
которые
путем
фосфорилирования различных сигнальных белков участвуют в регуляции
34
ключевых функций в клетке: рост, выживаемость, организация цитоскелета,
клеточная подвижность [173].
1.4.1. Структура семейства PAK-киназ
У человека известно 6 PAK-киназ, которые составляют 2 основные группы по
гомологичности структуры. Первая группа, представленная киназами PAK 1-3,
фосфорилирует множество субстратов, участвуя в регуляции цитоскелета,
пролиферативной и антиапоптотической активности. Вторая группа – PAK 4-6,
участвует в передаче сигналов через межклеточные контакты, а также
фосфорилирует некоторые субстраты 1-й группы [173]. В структуре всех PAKкиназ (рис. 5) имеется консервативный серин-треониновый киназный домен (250–
545
в
PAK1)
с
единственным
сайтом
аутофосфорилирования
(T423),
активирующимся при активации киназы; N-концевой регуляторный домен длиной
50 аминокислотных остатка, содержащий мотив CRIB, ответственный за
связывание с Rho-ГТФазами
Cdc42 и Rac1. PAK 1 имеет 3 консервативных
пролин-богатых домена SH3 (аминокислотные остатки 12–18, 40–45 и 186–203),
которые связываются с NCK, Grb2 и Pix (PAK-interacting exchange factors)
соответственно.
CRIB-домен
(75-95),
взаимодействующий
с
Cdc42/Rac1,
перекрывается с аутоингибирующим доменом AID (83–149), который связан с
консервативным киназным доменом. Домен «basic» ответственен за фосфолипидзависимую активацию PAK-киназы. Домены, ответственные за связывание с
адапторными белками: NCK [174] и Grb2 [175], определяют участие PAK1 в
регуляции EGF/РDGF и MAPK-сигнальных путей, соответственно. В структуре
PAK4 присутствует дополнительный домен, через который PAK4 связывается с
GEF-H1 [176].
35
Рисунок 5. Структура киназ PAKs.
1.4.2. Механизмы регуляции PAK1
Помимо
классического
димер-мономерного
механизма
ауторегуляции,
который описан ниже, существуют дополнительные пути активации PAK1,
например, фосфолипидами [177, 178]. В стуктуре PAK1 присутствует домен
«basic»,
который
связывает
такие
молекулы
как
сфинголипиды,
фосфатидилсерин- и фосфатидилинозитолфосфаты, взаимодействующие с PAK1
через два района, распложенных выше от домена CRIB [178]. Так было показано,
что PIP2, связываясь с доменом «basic», стимулирует PAK1, действуя вместе с
Rac1, что приводит не только к активации киназной активности PAK1, но также и
к ее рекрутированию к цитоплазматической мембране в ответ на внеклеточные
сигналы [179]. Также установлено, что киназа PAK1, рекрутируясь к
цитоплазматической мембране через взаимодействие с адапторными белками Nck
и Grb2 [180], может активироваться некоторыми сигнальными молекулами,
например, PDK1 (King et al., 2000) и PI3К [181].
Согласно классическому димер-мономерному механизму ауторегуляции,
PAK1 в неактивном состоянии представлен в виде димера [173], в удержании
которого играют роль пролин-богатый домен, ответственный за связывание с Pix
(PAK-interacting exchange factors или PAK-связывающий обменный фактор), через
который опосредуется участие PAK1 в фокальной адгезии, аутоингибирующий
36
домен AID и консервативный киназный. Взаимодействие активированного ГТФсвязанного
Rac1
конформационным
(Cdc42)
с
PAK1
перестройкам
в
через
CRIB-домен
аутоингибирующем
приводит
домене
AID
к
с
последующей диссоциацией AID от киназного домена и аутофосфорилированию
по многим сайтам, включая треонин в 423 положении (приходится на киназный
домен) [182], серин  в 144 (приходится на AID) [183] и серинов в 199 и 204
(домен, ответственный за связывание с PIX) [184], что, в свою очередь, приводит
к активации киназной активности PAK1 (рис. 6).
Рисунок 6. Механизм действия PAK1
В поддержку данной схемы ауторегуляции PAK1 служат данные о том, что
мутация домена AID приводит к конститутивной активации PAK1 в отсутствии
Cdc42 [185], в то время как мимикрия фосфорилирования (T423E), не проявляет
аутофосфорилирующих характеристик [186].
Согласно выше описанному механизму, в активации Рak1 участвуют малые
Rho-ГТФазы: Rac и Cdc42 [187], которые относятся к семейству ГТФ37
связывающих белков, контролирующих организацию цитоскелета, миграцию,
транскрипцию и пролиферацию [188, 189]. Все представители данного семейства
имеют в своей структуре последовательность, связывающую ГДФ или ГТФ с
высокой степенью сродства. Связывание ГТФ контролируется присоединением
регуляторных молекул: ГТФаз-активирующих белков (GAPs, GTPase-activating
proteins), гуанин-нуклеотид обменных факторов (GEFs, Guanine nucleotide
Exchange Factors) и гуанин
Guanine
нуклеотид-диссоциирующих ингибиторов (GDIs,
nucleotide-Dissociation
Inhibitors)
[190,
191].
Rho-ГТФазы
после
диссоциации от GDIs, которые удерживают их в цитозоле в неактивном ГДФсвязанном состоянии, претерпевают липидные модификации, локализуясь на
мембране, где они взаимодействуют с активирующими их путем обмена ГДФ на
ГТФ  GEFs, после чего происходит гидролиз ГТФ под действием GAPs,
ассоциация с GDI и возврат в цитоплазму. Таким образом, ключевая функция
активации Rho-белков принадлежит именно GEFs, представителей которых
объединяет наличие Dbl- и плекстрин-гомологичных доменов (DH и PH
соответсвенно) [191]. Для того, чтобы произошел гуанин-нуклеотидный обмен на
ГТФазе, необходимо ее взаимодействие с GEF белком, гуанин-нуклеотидом и
ионами Mg2+. Известно, что ГДФ - ГТФ обменная активность семейства GEFs
определяется, главным образом, DH-доменом, в структуре которого выделяют три
консервативные
района
CR1-CR3,
из
которых
CR1
имеет
в
своей
последовательности консервативный глутамат, а CR3 – высоко консервативный
лизин (рис.7). CR1-CR3 районы являются решающими для взаимодействия GEFs
с Rho-белками и для последующего ГДФ-ГТФ обмена на Rho-ГТФазах [192].
Функция PH-домена еще до конца не изучена, но предполагается, что он
усиливает ГДФ-ГТФ обменную активность DH-домена. Так, продемонстрирован
аллостерический механизм регуляции
PH-доменом DH-GEFs активности.
Согласно этому механизму PH-домен связывает фосфоинозитиды [193] и
обеспечивает локализацию Dbl-белков на плазматической мембране [194].
Правда, такая регуляция не является абсолютной, поскольку связывание одних и
38
тех же фосфоинозитидов с PH доменом одного и того же Tiam1 белка может как
ингибировать [195], так и активировать [196] обменную активность Tiam.
Рисунок 7. DH- и PH-домены GEFs
Одним из преставителей семейства регуляторов GEF является Pix (PAKinteractive exchange factor), участвующий в регуляции Cdc42- и Rac1-ГТФ-аз [197].
На данный момент описано три изоформы Pix: одна альфа (p90Cool-2) и две beta
(p85Cool-1 и p50Cool-1) (рис.8). Помимо DH-PH, несущих GEF-функцию, в
структуру Pix-белков входят SH3 (Src homology 3)  домен, ответственный за
взаимодействие с PAK, Cbl-b и другими белками, несущими обогащенный
пролином мотив; богатый пролином домен PRD (Proline rich domain),
связывающий p90Cool-2 и p85Cool-1 с SH3-содержащами партнерами; Catсвязывающий домен CBD (Cat-binding domain), ответственный за связывание с
Cat-белками, которые рекрутируют Pix-PAK комплекс к центросомам для
последующего фосфорилирования PAK Aurora-A-киназы [198]; C-концевой LZ
(leucine zipper) домен, ответственный за димеризацию Pix (90Cool-2 и p85Cool-1)
[197, 199]. Альфа-Pix также включает дополнительный CH (Calponin Homology)домен, необходимый для взаимодействия Pix с бета-парвином, который вовлекает
альфа-Pix в интегрин-опосредованную активацию Cdc42 и Rac1 [200]; есть
данные, что отсутствие или мутация CH-домена приводит к формированию Xсцепленной умственной отсталости [201]. Бета-Pix включает дополнительный T1домен, функция которого до конца еще не изучена. Тем не менее, показано, что
T1 влияет на Pix-регуляцию PAK активности [202]. Следует отметить, что члены
Pix-семейства, несмотря на структурное сходство, оказывают различное действие
39
на активность PAK-киназ: p90Cool-2 и p85Cool-1 активируют ее, p50Cool-1
игибирует, что может быть связано с наличием T1 домена у бета-Pix изформ.
Рисунок 8. Структура изоформ PIX
Несмотря на то, что PAK1 находится в сигнальной цепи ниже Rho-ГТФаз и
активирующего их Pix, он способен фосфорилировать альфа-Pix по серину в 488
положении (S488) и бета-Pix – по серину в 340 (S340) [203]. Данный сайт
попадает на домен PH (440-545 у альфа-Pix и 295-400 у бета-Pix), функция котого
мало изучена, но предполагается, что он задействован в регуляции GEFактивности DH-домена.
1.4.3. Эффекторы PAK1
Во внутриклеточном сигналинге функции PAK1 регулируются широким
спектром сигнальных молекул, среди которых малые Rho-ГТФазы Cdc42 и Rac
[187], фосфоинозитид-зависимая киназа-1 (PDK1) [204], протеинкиназа А (PKA)
[205], фосфоинозитид-3-киназа (PI3K) [181], AKT [206], GIT1 [207, 208], а также
фосфолипиды [178]. Активированные сигнальные молекулы стимулируют
вхаимодействие
PAK1 с рецепторными
(EGFR) и нерецепторными (ETK)
тирозинкиназами через адапторные белки GRB2 и NCK [209]. Активированный
PAK1 действует как ключевой регулятор пролиферации, выживаемости клеток,
клеточной подвижности через фосфорилирование соответствующих субстратов
(рис.9).
40
Рисунок 9. Сигнальный путь PAK1
Известно, что PAK1 активирует MAPK-каскад через фосфорилирование его
ключевых эффекторов: Raf1 по серину в 338 положении [210], MEKK1 – по
серину в 67 положении [211], а также MEK1 по 298-му серину [212], участвуя
таким образом в передаче митогенного сигнала в клетке. Также PAK регулирует
прохождение клеточного цикла: известно, что PAK фосфорилирует важную для
митоза киназу Aurora-A [198], находясь в центросомах, куда PAK1 рекрутируется
Pix через связывание с Cat – белками; в добавок PAK1 фосфорилирует гистон H3
[213] и поло-подобную киназу 1(PLK1) [214], задействованную в регуляции
G2/M-перехода. Кроме того, PAK1 участвует в RAS-зависимой регуляции
циклина D1, контролирующего G1/S-переход [215]. Существует данные об
ассоциации PAK1 с WNT-β-катениновым путем. Так, показано, что PAK1
фосфорилирует β-катенин по серинам в 663 и 675 положениях, что приводит к
41
стабилизации
и релокализации
в ядро последнего, где он
регулирует
транскрипцию многих генов, включая myc и циклин D1 [216]. Потеря PAK1
приводит к полной остановке роста за счет дестабилизации β-катенина и
снижению активности MAPK-каскада.
PAK1
участвует
в
регуляции
клеточной
выживаемости
через
фосфорилирование про-апоптотических белков. Так, киназа PAK1 фосфорилирует
агонисты
апоптоза
BAD
[217]
и
динеин
(DLC1)
[218],
подавляя
их
инактивирующее действие в отношении семейства белков BCL2, ответственных
за клеточную выживаемость. Также было показано, что PAK1 фосфорилирует
транскрипционный фактор FKHR [219], ингибируя его транслокацию, подавляя
способность FKHR активировать промотер Fas, который запускает апоптоз. Также
PAK1 стимулирует NFkB [220, 221], что может привести к ингибированию
каспазы-8, и, как следствие, к подавлению ТНФ-альфа–медиированного апоптоза
[222].
Было показано, что PAK1 играет важную роль в перестройке цитоскелета,
приводя к повышению клеточной подвижности. Известно, что активированный
PAK1
фосфорилирует
интегрин-связанную
киназу
(ILK)
[223],
взаимодействующую через белок PINCH с адаптерным белком NCK2(Grb4) [224],
который рекрутирует
PAK1 и WASP (Wiskott-Aldrich Sydrome protein)-
связывающий белок WIRE, приводя к активации комплекса актин-связанных
белков Arp2/3 и полимеризации актина; кроме этого, PAK1 способен напрямую
стимулировать комплекс Arp2/3 через фосфорилирование его субъединицы p41Arc [225]. Также показано, что PAK1 ингибирует активность легкой цепь миозина
(MLC) за счет фосфорилирования киназы легкой цепи миозина (MLCK), подавляя
тем самым формирование стрессовых волокон [226]. PAK1 фосфорилирует и
активирует киназу домена LIM (LIMK), которая, в свою очередь, фосфорилирует
актин-связанный
белок
деполимеризационной
кофилин
активности
с
F-актина
последующим
подавлением
[227].
того,
Кроме
PAK1
фосфорилирует филамин A [228], который связывает актиновые филаменты в
ортогональную сеть или паралеллельные пучки и может индуцировать
42
цитоскелетные перестройки через различные сигнальные пути: кофактор
тубулина B (TCoB) [229], задействованного в сборке альфа- и бета-тубулинов; и
статмин (OP18) [230], инактивируя промотирующую активность последнего в
отношении сборки микротрубочек.
Также субстратами для фосфорилирования киназой PAK1 являются и
некоторые другие, помимо FKHR, транскрипционные факторы, вовлекающие его
в эпителиально-мезенхимальный переход (EMT).Так, PAK1 регулирует важный
регулятор EMT – Snail, путем его фосфорилирования по 246-му серину, что
способствует накоплению последнего в ядре и реализации его транрепрессорной
активности [231]; усиливает экспрессию генов Wnt-пути за счет взаимодействия с
β-катенином [232]. Другим субстратом PAK1 является SHARP [233]  репрессор
Notch-каскада, ответственного за поддержание баланса между пролиферацией,
дифференцировкой и апоптозом в клетке и задействованного в EMT (связывание
и фосфорилирование PAK1 с SHARP усиливает его репрессорную активность в
отношении к Notсh). Также PAK1 фосфорилирует C-концевой-связывающий
белок 1 (CtBP1) [234], который действует как индуктор EMT и антагонист
апоптоза, а также подавляет экспрессию нескольких опухолевых супрессорных
генов. Установлено, что PAK1 координирует транскрипцию, сплайсинг и
трансляцию через фосфорилирование поли(rC)-связывающего белка 1 (PCBP1),
который экспрессируется во многих тканях и вовлечен в регуляцию траскрипции,
транспортировку РНК и сплайсинг мРНК.
1.4.4. Особенности экспрессии PAK1 в опухолях молочной
железы
Опухолевые клетки характеризуются нарушениями важных биологических
процессов:
рост,
выживаемость,
организация
цитоскелета,
клеточная
подвижность, что связано, как правило с дисфункцией их регуляторов, одним из
которых является серин-треониновая киназа PAK1. Продемонстрировано, что
киназа PAK1 гиперэкспрессирована более, чем в 50% случаев РМЖ [235], что
сопровождается активацией ее эффекторов  ERK-, АКТ- и WNT- сигнальных
43
путей [236-238]. Показано, что гиперэкспрессия конститутивно активной формы
PAK1, участвующей, в том числе, в регуляции инвазии и миграции клеток РМЖ
[239, 240], вызывает гиперплазию эпителия молочных желез через активацию
МАРK-каскада и ERα-сигнального пути [241]. Наиболее описанным механизмом
гиперэкспрессии и гиперактивации PAK1 являтся амплификация его гена,
находящегося в 11-й хромосоме (11q13), что наблюдается в 30% случаев рака
молочной железы [242, 243] и ассоциировано с плохим прогнозом. В ERпозитивных клетках РМЖ с высоким уровнем метастазирования также
наблюдается амплификация локуса 11q13 в гене PAK1 [244]. Однако, в некоторых
случаях наблюдается избыточная экспрессия мРНК и самого белка PAK1, а также
его гиперактивация в отсутствие амплификации генов [245], что может
происходить за счет мутаций его вышележащих эффекторов. Эксперименты по
поиску
ключевых
протеинкиназ,
которые
способны
трансформировать
иммортализованные клетки молочной железы, показали, что именно PAK1
обладает мощным трансформирующим действием [242]. В этих исследованиях
было
обнаружено,
что
гиперэкспрессия
РАК1,
часто
ассоциированная
амплификацией локуса 11q13, одновременно увеличивает активацию сигнальных
белков ERK и Met (рецептора фактора роста гепатоцитов (HGF)), последний из
которых активируется за счет ингибирования опухолевого супрессора Merlin.
Интересно, что данные трансформирующие эффекты PAK1 снижались при
использовании малых интерферирующих РНК [242, 246], что может говорить о
перспективном подходе при рассмотрении PAK1 в качестве мишени в таргетной
терапии РМЖ.
Уровень экспрессии PAK1 варьирует в опухолях молочной железы с
различным содержанием рецептора эстрогенов [247]. Причина этой разницы в
эспрессии PAK1 до сих пор мало изучена, не считая амплификацию гена, которая
наблюдается в 30% случаев рака молочной железы [242, 243]. Почему PAK1
гиперэкспрессирован в остальных случаях РМЖ, где нет амплификации гена, до
сих пор неясно, но, возможно, что это связано с эпигенетическими особенностями
регуляции транскрипции гена PAK1 на локусе 11q13, например, метилированием
44
промотера или 1-го экзона, или с отличными друг от друга путями,
модулирующими экспрессию PAK1, а также с присутствием ERα в клетках РМЖ.
1.5.
Роль PAK1 в регуляции гормональной чувствительности РМЖ
1.5.1. Развитие гормональной резистентности РМЖ и PAK1
Около 70% случаев рака молочной железы характеризуются сохранением
экспрессии ERα, для которых антиэстрогенновая терапия является эффективным
методом лечения [35]. Для лечения данной группы пациентов с ER-позитивным
статусом опухолей применяется тамоксифен, который является селективным
модулятором рецептора эстрогена [248], однако, эффективность гормональной
терапии часто ограничивается развитием гормональной резистентности опухолей.
Многие годы исследователи рассматривали потерю клетками РМЖ рецепторов
эстрогена как основную причину развития гормональной резистентности. Однако,
снижение гормональной зависимости РМЖ может происходить также и при
сохранении ER, в том числе
за счет нарушения баланса между белками-
активаторами и супрессорами ER, лиганд-независимой активации рецептора
эстрогена, стимуляции митогенные сигнальные пути, идущие в обход рецептора
эстрогена,
среди
тирозинкиназам
которых
(EGFR).
ведущее
Так,
значение
клетки
принадлежит
рецепторным
эстрогеннезависимых
опухолей
характеризуются гиперэкспрессией IGF-1R, HER2, EGFR, гиперактивацией
PI3K/AKT/mTOR [165].
Одним из важнейших эффекторов EGFR-сигнального пути является серинтреониновая протеинкиназа РАК1  регулятор ключевых функций в клетке: роста,
выживаемости, реорганизации цитоскелета, клеточной подвижности. Ранее выло
показано, что гиперэкспрессия PAK1 ассоциирована с резистентностью к
тамоксифену как in vitro [93], так и in vivo [85, 86, 95]. В связи с широким
спектром действия PAK1-киназа может быть вовлечена в поддержание
эстрогеннезависимого роста и развитие гормональной резистентности.
45
Как уже отмечалось, PAK1 фосфорилирует ER по серину в 305-положении
и стимулирует его трансактивацию в отсутствие эстрадиола [91- 93], что приводит
к развитию гормональной резистентности. Известно, что S305 рецептора
эстрогена также фосфорилируется протеинкиназой А (PKA), что также
ассоциировано с развитием гормональной устойчивости [84-86]. Однако, PKAфосфорилирование ER по S305 может быть заблокировано доминантнонегативным Rac1 [94], который является прямым активатором PAK1, что
свидетельствует о важной роли РАК1 и в случае РКА-зависимой активации ER.
1.5.2. Рецепторные тирозинкиназы и PAK1 в регуляции
гормональной чувствительности РМЖ
Рецепторы эпидермального фактора роста относятся к рецепторным
тирозинкиназам, вышележащим по отношению к PAK1 и запускающим
митогенные каскады, в том числе пути, регулирующие клеточный цикл,
выживаемость, миграцию клеток и EMT. Показано, что взаимодействие ErbB3/4,
одного из рецепторов ЭФР, с лигандом ̶ херегулином (HRG) приводит к
активации PAK1 с участием малой Rho-ГТФазой Rac1 в клетках рака молочной
железы [249]. Активация PAK1 через ErbB2 вызывает развитие резистентности к
тамоксифену
[250].
Гормонрезистентные
клетки
также
характеризуются
амплификацией гена PAK1 в локусе 11q13 и соответствующей гиперэкспрессией
и гиперактивацией белка PAK1, что является маркером рецидивов и устойчивости
к антиэстрогеновой терапии рака молочной железы в постменопаузе [85, 95].
Подобная активность PAK1 позволяет отнести его к группе потенциальных
онкогенов [251].
В свою очередь, биологическая активность рецепторов ErbB2 и ErbB3
регулируется большим количеством белков, которые могут быть потенциальными
мишенями для разработки новых таргетных препаратов для лечения гормоннезависимых опухолей. В частности, к таким белкам относится
ErbB3-
связывающий белок (EBP1) [252], гиперэкспрессия которого ингибирует рост
46
клеток
РМЖ,
экспрессирующих
ErbB2/3,
способствуя
G2/M-аресту
и
дифференцировке [253], а также подавляет активацию AKT и пролиферацию
клеток в ответ на HRG [254]. Известно, что активность EBP1 регулируется
фосфорилированием PKC по серину в 360 положении [255] и РАК1 по 261-му
треонину
[256].
Было
показано,
что
T261E-мутантная
форма
EBP1,
модулирующая фосфорилирование PAK1, индуцирует развитие устойчивости к
тамоксифену
гормончувствительных
клеток
MCF-7
[250].
Также
продемонстрировано, что EBP1 уменьшает уровень рецептора ErbB2, что играет
важную роль в стимуляции гормональной чувствительности. Таким образом,
T261-фосфорилирование EBP1 киназой PAK1 отменяет способность EBP1
снижать ErbB2, приводя к подавлению гормональной чувствительности.
Установлено значение некоторых эффекторов EGFR для роста клеток
эстрогеннезависимого РМЖ. Так, специфический ингибитор EHT 1864, который
удерживает
в
неактивном
состоянии
Rho-ГТФазу
Rac1
[257],
снижает
транскрипционную активность ERα через Rac1/PAK1-путь в эстрогензависимых
клетках, подавляет экспрессию циклина D1 [258] и снижает скорость роста [259]
клеток эстрогеннезависимого РМЖ.
В поддержании эстрогеннезависимого роста ключевое значение имеет
способность
PAK1 активировать MAPK-каскад [210-212], участвовать в
регуляции прохождения клеточного цикла [198, 213-215] и WNT-β-катенинового
пути [216], стимулировать антиапоптотический сигналинг [217-222]. Отдельный
интерес представляет фосфорилирование киназой PAK1 важного регулятора EMT
– транскрипционного фактора Snail1, также участвующего в активации
митогенных сигнальных путей [231, 232].
Продемонстрировано, что клетки
эстрогеннезависимого РМЖ могут отличаться повышенным уровнем экспрессии
Snail1, показано участие Snail1 в поддержании эстрогеннезависимого роста РМЖ
[260, 261]. Гиперэкспрессия Snail также приводит к относительной устойчивости
клеток к гипоксии, активизации Snail/β-катенинового пути и HIF-1-зависимых
генов,
снижению
фосфорилирования
5'АМФ-активируемой
протеинкиназы
(AMPK), контролирующей энергетический баланс клетки [262-264].
47
Учитывая столь широкий митогенный и антиапоптотический потенциал
РАК1, безусловную актуальность приобретают подходы, направленные на
подавление активности РАК1 в опухолевых клетках. Установлено, что некоторые
белки, такие как hPIP (human PAK1-interacting protein 1 или человеческий белок,
связывающийся с PAK1) и CRIPAK (Cys-rich inhibitor of PAK1 или цистеинбогатый ингибитор PAK1) могут препятствовать активации PAK1 [173]; известны
специфические ингибиторы PAK1, такие как IPA-3, который связывается с
доменом CRIB, предотвращая связывание PAK1 с Cdc42 [265, 266]. Показано, что
IPA-3 блокирует рост гормон-резистентных клеток РМЖ с гиперэкспрессией
PAK1 [250]. Для направленного подавления PAK1 могут быть использованы
миРНК к PAK1 в комбинации с некоторыми другими агентами, ингибирующими
как PAK1, так и его эффекторы [246]. Так, например, была показана наибольшая
эффективность миРНК в сочетании с IPA-3, гефитинибом (блокатор EGFR),
U0126 (ингибитор MEK1/2), дазатинибом (ингибитор киназ Src). Другой вариант
подавления PAK1 основан на применении доминантно-негативных генетических
конструкций РАК1 (например, K299R с заблокированной киназной активностью)
в комбинации с разными препаратами [267].
В целом, на сегодняшний день РАК1 рассматривается в качестве
перспективной мишени для таргетной противоопухолевой терапии, в том числе –
для терапии различных форм опухолей молочной железы.
48
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1.
Культивирование клеток
Клеточные линии рака молочной железы человека получены из коллекции
ФГБНУ РОНЦ им. Н.Н.Блохина:
- ER-позитивная эстрогензависимая линия MCF-7;
- ER-негативные эстрогеннезависимые линии: MDA-MB-231, HBL-100,
SKBR-3.
В процессе экспериментов были выделены следующие сублинии клеток:
MCF/TCF и HBL/TCF - стабильные клеточные сублинии MCF7, полученные
в результате стабильной трансфекции клеток MCF-7 и HBL-100, соответственно,
репортерной плазмидой, содержащей ген люциферазы под контролем TCF/LEFчувствительного промотора;
MCF-7/H - устойчивая к гипоксии сублиния, полученная в результате
длительного культивирования клеток MCF-7 при низком содержании кислорода.
Клетки культивировали в стандартной среде DMEM, содержавшей 5%-ную
эмбриональную сыворотку телят (HyClone, CША) и гентамицин (50 ед/мл)
(«Paneco», Россия) при 37° и 5%-ном СО2. Пересев производился каждые 3-4
суток в зависимости от особенностей роста каждой отдельной клеточной линии с
использованием
0.25%Трипсина-ЭДТА.
Для
моделирования
гипоксии
использовалась газовая смесь с содержанием О2 до 1%.
2.2.
Транзиторная трансфекция экспрессионных и репортерных
плазмидных конструкций
Трансфекция проводилась с помощью реактива Metafectene pro (Biontex
Laboratories GmbH) в течение 3-5 часов при 37оС и 5% СО2 в бессывороточной
среде, после чего клетки инкубировались в течение суток в стандартной среде
DMEM, содержавшей 5% сыворотки.
49
Для
репортерных
анализов
в
трансфекционных
экспериментах
использовались:
- плазмида ERE/Luc, содержавшая ген-репортер люциферазы под контролем
эстроген-респонсивного элемента (ERE) (любезно предоставлена Dr. G. Reid,
European Molecular Biology Laboratory, Meyerhofstrasse 1, Heidelberg, D-69116,
Germany) [268];
- плазмида E-cad/Luc, содержавшая ген-репортер люциферазы под
контролем Snail1-чувствительного промотора (любезно предоставлена Dr. Antonio
García de Herreros, Department of Experimental Sciences, Universitat Pompeu Fabra;
Barcelona, Spain) [269]; данная конструкция использовалась для определения
трансрепрессорной активности Snail1 [270].
- плазмида HRE/Luc, содержавшая ген люциферазы под контролем
гипоксия-респонсивного элемента (hypoxia response element, HRE);
- репортерная конструкция, содержавшая ген люциферазы под контролем
бета-катенин-чувствительного промотора, любезно предоставлена В.Татарским
(Российский онкологический научный центр им. Н. Н. Блохина РАМН, Москва,
Россия);
- плазмида AP1/Luc, содержавшая ген люциферазы под контролем AP-1чувствительного
промотора,
предоставлена
V.V.
Adler
(Division
of
Hematology/Oncology, University of Alabama, Birmingham 35294).
Для контроля эффективности трансфекции в клетки вместе с репортерными
плазмидами трансфецировали вектор для экспрессии β-галактозидазы (β-gal) с
последующим определением активности люциферазы и галактозидазы в каждом
образце.
Кроме того, в трансфекционных экспериментах использовались:
- плазмидные конструкции в векторе CMV6, содержавшие дикий вариант
гена РАК1 (любезно предоставленные Jonathan Chernoff, Fox Chase Cancer Center,
Philadelphia, PA, USA) [271];
- плазмидные конструкции в векторе CMV6, содержавшие дикий вариант
гена α-Рix-wt, а также мутантные с заменой серина в 488-ом положении на аланин
50
- α-Рix-A (препятствует фосфорилированию киназой PAK1) (любезно
предоставлена Jeffrey R Peterson, Fox Chase Cancer Center, Philadelphia, PA, USA)
[203];
- плазмида в векторе pcDNA3, содержащая дикий тип рецептора эстрогена
альфа;
- короткие интерферирующие РНК со следующими последовательностями:
scrambled siRNA (sense 5’-CAGUCGCGUUUGCGACUGGdTdT -3’), Snail1 siRNA
(sense 5`-aggccuucaacugcaaauadtdt -3`), а также соответствующие антисмысловые
олигонуклеотиды («Синтол», Россия). Конечная концентрация siRNA составляла
50 нМ.
Для выделения плазмид использовали стандартный протокол трансформации
в компетентные клетки E.Coli с селекцией по устойчивости к ампициллину с
последующим выделением плазмидной ДНК с помощью готового набора
(«Promega», США) в соответствие с рекомендациями фирмы-производителя.
Концентрация полученной ДНК измеряли на бескюветном спектрофотометре
NanoVue (GE Healthcare, США).
2.3.
Репортерный анализ
Клетки трансфицировали согласно выше описанному протоколу в 24-
луночных плато, затем клетки промывали физиологическом раствором (10 мM
Tris-HCl pH7,5; 0,14 M NaCl) и прямо в лунки добавляли лизирующий буфер (50
мМ Tris-HCl (pH=7,5), 1 мM EDTA, 150 мM NaCl, 1% NP-40, 1 мM DTT, 1мM
PMSF, 0,1 мM Na-ортованадат и 1%-ный апротинин), оставляли на 30 минут при
+4°С. В полученных таким образом экстрактах определяли активность βгалактозидазы и люциферазы.
Активность люциферазы определяли на люминометре Infinite 200 PRO
(Tecan, Швейцария) по стандартному протоколу с помощью соответствующего
готового набора Luciferase Assay System (Promega, США). Активность βгалактозидазы измеряли по стандартной методике, основанной на использовании
51
субстрата - O-нитрофенил-b-D-галактопиранозидазы (ONPG), который под
действием
β-галактозидазы
распадается
на
галактозу
и
О-нитрофенол,
окрашивающий раствор в желтый цвет; интенсивность окраски определяли
спектрофотометрически при длине волны 420 нм. Вкратце, к образцам в 96луночный планшет добавляли рабочий раствор (ONPG, 0,1 М Na2HPO4, (pH=7,5),
1 М MgCl2, β-меркаптоэтанол), после инкубации в течение 40 минут при
температуре 37°С окраску проб измеряли на плашечном спектрофотометре
Multiscan FC (ThermoScientific, США). Расчет активности люциферазы проводили
в
условных
(относительных)
единицах
(отношение
общей
активности
люциферазы к активности галактозидазы).
2.4.
Получение клеточных экстрактов для SDS-электрофореза в
полиакриламидном геле
Клетки на стадии формирования 80% монослоя промывали и снимали с
чашек в физиологическом растворе. Клетки центрифугировали 5 мин. при 3 тыс.
об/мин, к осадкам добавляли лизирующий буфер в 2-х вариантах:
- содержавший 50 мМ Tris-HCl (pH=7,5), 1 мM EDTA, 150 мM NaCl, 1%-ный
NP-40, 1 мM DTT, 1мM PMSF, 0,1 мM Na-ортованадат и 1%-ный апротинин
(выделение цитоплазматической фракции).
- содержавший 50 мМ Tris-HCl (pH=8,0), 10% глицерол, 0.1% Тритон X-100,
100мкг/мл лизозима, 3 ед. ДНКазы, 2 мМ MgCl (выделение тотальной фракции
белков). Образцы озвучивали на ультразвуковом дезинтеграторе Soniprep 150 plus
(MSE, Великобритания) при амплитуде 2 и 5-7 циклах в зависимости от образца
до полного исчезновения вязкости.
Полученные образцы оставляли на 30 мин на льду; затем центрифугировали в
течение 15 минут при 13 тыс. об./мин. при температуре +4°С. Концентрацию
белка определяли в надосадочной жидкости по методу Бредфорда [272, 273]
путем измерения оптической плотности при длине волны 595 нм на
52
спектрофотометре Ultrospec 2100 (GE Healthcare, США) или Multiscan FC
(ThermoScientific, США).
Электрофорез образцов, содержавших по 40-80 мкг белка, проводили в 10%ном SDS-полиакриламидном геле в течение 5 ч при 90 В в элеткрофоретической
камере miniVE или SE260 (GE Healthcare, США) согласно стандартному
протоколу [274]. Затем белки переносили на нитроцеллюлозные фильтры Hybond
(GE Healthcare, США) методом электропереноса в системе для влажного переноса
TE22 (GE Healthcare, США) при 150 мА в течение 12 часов.
2.5.
Иммуноблоттинг
Для иммуноблоттинга использовали антитела к РАК1, ERα (Cell Signaling
Technology, США), HIF-1 (Santa Cruz, США). Для оценки эффективности
нанесения экстрактов производили иммуноблоттинг с антителами к β-актину и αтубулину
(Cell
Signaling
Technology,
США).
Для
предотвращения
неспецифической сорбции нитроцеллюлозную мембрану обрабатывали 5%
раствором обезжиренного молока («Applichem», Германия) в TBST (25мМ ТрисHCl pH7.4, 150мМ NaCl, 0.1% твин-20), затем инкубировали с первичными
антителами в течение ночи при температуре +4оС, отмывали 4 раза по 10 мин
раствором ТBST при комнатной температуре, инкубировали в течение 1 часа с
вторичными антителами, конъюгированными с пероксидазой (GE Healthcare,
США), в 5% растворе бычьего сывороточного альбумина (БСА) в TBST,
отмывали аналогичным образом, затем наносили ECL-субстрат, содержащий
перекись и люминол. Хемилюминесцентную реакцию регистрировали на
ImageQuant Las 4000 (GE Healthcare, США). Полученные изображения
обрабатывали с помощью компьютерной программы ImageQuant TL (GE
Healthcare,
США).
Денситометрический
программы ImageJ (NIH).
53
анализ
проводился
с
помощью
Определение скорости роста клеток МТТ-тестом
2.6.
Для определения скорости роста клеток был использован МТТ-тест,
основанный
на
утилизации
живыми
клетками
МТТ-реагента
(3-[4,5-
диметилтиазол-2]-2,5-дифенилтетразол бромида) [275] с образованием голубых
кристаллов
формазана,
количество
которого
определяется
спектрофотометрически при длине волны 570 нм.
Вкратце, клетки отмывали PBS, в каждую лунку добавляли МТТ-реагент
(«Sigma-Aldrich», США), предварительно разведенный средой DMEM до
конечной концентрации 0,5 мг/мл. Клетки инкубировали в течение 40 мин при
37°С,
затем
отбрасывали
среду
и
клетки
экстрагировали
раствором
диметилсульфоксида (ДМСО), оптическое поглощение образцов измеряли при
570 нм на спектрофотометре Multiscan FC (ThermoScientific, США) в 96луночный планшетах. На основании полученных данных строили график
зависимости оптической плотности экстракта от количества жизнеспособных
клеток.
2.7.
Определение метилирования гена в культуре клеток
2.7.1. Выделение геномной ДНК
Клетки отмывали PBS, затем добавлялся 1 мл тризола, в котором клетки
гомогенизировались
путем
многократного
пипетирования,
полученные
гомогенизаты центрифугировались в течение 4 минут при 12000g и 4оС,
супернатант инкубировали 5 минут при комнатной температуре для полной
диссоциации
нуклеопротеинового
комплекса.
Затем
к
каждой
пробирке
добавлялось по 0,2 мл хлороформа, полученная смесь перемешивалась
интенсивным встряхиванием в течение 15-20 секунд на вортексе, инкубировалась
3 минуты при комнатной температуре, затем центрифугировалась при 12000g и
4оС в течение 15 минут до образования 3-х фаз: нижняя органическая фаза
(содержащая белок), интерфаза (содержащая ДНК) и верхняя бесцветная фаза
(содержащая РНК). Верхнюю бесцветную фазу убирали, а к оставшимся
54
интерфазе и органической фазе добавляли 0,3 мл этанола или изоропилового
спирта, перемешивали и инкубировали 3 минуты при комнатной температуре,
затем снова центрифугировали на 2000g на +4оС в течение 5 минут для осаждения
ДНК. Органическую фазу убирали, а полученный осадок, содержащий ДНК,
отмывали дважды раствором 0,1 М цитрата натрия в 10% этаноле (к каждому
образцу добавлялся 1 мл раствора с последующими 30-минутной инкубацией,
аккуратным перемешиванием и центрифугированием на 2000g на +4оС в течение
5 минут), затем 75% этанолом (по 1,5 мл 75% этанола на образец, инкубация 15
минут при комнатной температуре, перемешивание и центрифугирование на
2000g на +4оС, 5 минут). Полученный осадок ДНК высушивали в течение 3-5
минут на воздухе при комнатной температуре, затем ресуспендировали в 8 мМ
NaOH до полного растворения и определяли концентрацию на бескюветном
спектрофотометре NanoVue (GE Healthcare, США) на длине волны 280 нм.
2.7.2. Определение метилирования гена
Определение
метилирования
проводилось
методом
бисульфитного
секвенирования, полученные данные подтверждались метилчувствительной ПЦР
[276, 277].
Бисульфитное секвенирование. Дизайн праймеров для исследования
метилирования
программы
промоторной области гена PAKI был выполнен при помощи
MethPrimer.
В
результате
была
подобрана
последовательность праймеров: прямой - gtagtttttttgttttgaggggag
следующая
и обратный -
ataaataaacccaaaccccca. Для проведения бисульфитной конверсии геномную ДНК
денатурировали в присутствии NaOH (конечная концентрация 0,3 М) при
температуре 65°С в течение 15 мин. Модификацию ДНК осуществляли при
помощи бисульфита натрия и гидрохинона в конечных концентрациях
соответственно
2М
и
0,5 М
в
течение
15 ч
при
температуре
55ºС.
Модифицированную ДНК очищали на колонках Wizard DNA Clean-up system
(Promega, США), по протоколу производителя.
55
Реакционная смесь для ПЦР бисульфит-конвертированной матрицы,
объемом 25 мкл, включала 2,5 мкл десятикратного буфера для ПЦР (50 мМ КСl,
10 мМ трис-НCl pH 8,4), 4 мM MgCl2, по 200 мкМ dNTP, 10% ДМСО, 5%
глицерина, 2% деионизованного формамида, 50 - 100 нг ДНК и 1 ед.
термофильной ДНК-полимеразы. Смесь прогревали при температуре 95 ºС в
течение 6 мин и проводили 33 цикла с параметрами: 94 ºС - 40 с, 59 ºС - 30 с,
72 ºС - 40 с. Финальную элонгацию проводили при температуре 72 ºС в течение
7 мин.
Метилчувствительная ПЦР. Участки промотора и первого экзона гена PAK1
с набольшим количеством CG пар, потенциально открытых для метилирования,
были
определены
с
помощью
онлайн-ресурсов
(http://www.bioinformatics.org/sms2/cpg_islands.html) [278]. С помощью программ
Vector NTI и NEBcutter V2.0 (NEB, Великобритания) были определены сайты
метилчувствительной рестрикции и соответствующие рестриктазы. В программе
Oligo
6,71
и
MethPrimer
были
[279]
подобраны
праймеры:
и
(GGCAGGAGGGAGAAAGTGAAG)
прямой
обратный
(TTCCATGCAGAAGGAACTGG), дающие продукт длиной 543 п.о. Все праймеры
были синтезированы в Синтоле (Россия).
Для полученных праймеров были подобраны следующие условия ПЦР:
1) Прогрев реакционной смеси до 95оС в течение 5 минут для полной
денатурации матрицы и праймеров.
2) 32 цикла, каждый из которых состоит из следующих этапов:
- денатурация двухцепочечной ДНК путем кратковременного нагрева на 30
секунд до 95оС;
- отжиг праймеров на денатурированую матричную ДНК путем охлаждения
до 62оС в течение 40 секунд;
- денатурация двухцепочечной ДНК при 95оС в течение 1 минуты.
3) Элонгация ДНК 5 минут при 72оС.
56
ПЦР проводили на ДНК-амплификаторе T100 (BioRad, США), полученные
в
результате
ПЦР
продукты
анализировали
методами
вертикального
электрофореза в ПААГ с последующей окраской геля нитратом серебра и
горизонтального электрофореза в агарозном геле с бромистым этидием с
последующей гель-документацией на УФ-трансиллюминаторе ImageQuant Las
4000 (GE Healthcare, США), полученные данные анализировали программой
ImageQuant TL (GE Healthcare, США).
Для
метилчувствительной
рестрикции
использовались
метилчувствительные ферменты HhaI (ThermoScientific, Великобритания) и HpaII
(Сибэнзим) в буфере Tango (33 мМ Трис-ацетат (pH 7.9), 10 мМ Mg-ацетат, 66 мМ
K-ацетат, 0.1 мг/мл БСА), которые в отсутствие метилирования разрезают ДНК по
специфическим сайтам GCGC и CCGG соответсвенно, предотвращая тем самым
образование ПЦР продукта.
2.8.
Статистическая обработка результатов
Расчеты (среднее значение и стандартное отклонение в трех независимых
экспериментах) и обработку результатов проводили с помощью программ
“Статистика для Windows” (StatSoft Inc., 2001, версия 6.0) и Origin 6.0 (OriginLab
Corporation, 1999, США). Результаты представляли в виде среднего значения ±
стандартное отклонение. Во всех случаях критерии считали статистически
достоверными при p<0,05.
2.9.
Список использованных реактивов
- 17β-эстрадиол (10-9 М) (Sigma-Aldrich, США)
- 3-[4,5-диметилтиазол-2]-2,5-дифенилтетразол бромида - МТТ (Sigma-Aldrich,
США);
- 4-гидрокси-тамоксифен (Sigma-Aldrich, США)
- ДМСО – диметилсульфоксид (Sigma-Aldrich, США);
57
- IPA3 (1,1'-дитиоди-2-наптол) – специфический ингибитор PAK1
- O-нитрофенил-b-D-галактопиранозидаза, ONPG (ThermoScientific, США);
- Triton Х-100 (Sigma-Aldrich, США);
- β-меркаптоэтанол (Хеликон, Россия);
- антитела к РАК1, ERα, pAMPK, β-актину, α-тубулину (Cell Signaling
Technology, США);
- антитела к Hif1 (Santa Cruz, США);
- гентамицин (ПанЭко, Россия);
- дитиотриетол, DTT (Sigma-Aldrich, США);
- додецилсульфат натирия, SDS (Gibco, PAA, Австрия);
- закисленный изопропанол (Sigma Aldrich, США);
- йодистый пропидий, PI (Sigma Aldrich, США);
- Metafectene pro (Biontex Laboratories GmbH, Германия);
- натрия ортованадат (Sigma-Aldrich, США);
- Акриламид (GE Healthcare, США);
- N,N'-Метилен-бис-акриламид (GE Healthcare, США);
- персульфат аммония (Sigma-Aldrich, США);
- нитроцеллюлозная мембрана Hybond (GE Healthcare, США);
- нонилфеноксиполиэтоксиэтанол, NP-40 (Sigma-Aldrich, США);
- обезжиренное молоко (Applichem, Германия);
- БСА - бычий сывороточный альбумин (Applichem, Германия)
- олигонуклеотиды (Синтол, Россия);
- пероксидаза (Amersham, Великобритания);
- раствор Ponceau S (Sigma-Aldrich, США);
- раствор Версена (ПанЭко, Россия);
- раствор Трипсина (ПанЭко, Россия);
- DMEM - среда для культивирования эукариотических клеток (ПанЭко,
Россия);
- стерильные мембраны с диаметром пор 0,45 и 0,22 мкм (Millipore, США);
- тетраметиэтилендиамин, ТЕМЕD (Sigma-Aldrich, США);
58
- фенилметилсульфонилфторид, PMSF (Sigma-Aldrich, США);
- фосфатно-солевой буфер PBS в таблетках (ПанЭко, Россия);
- хемилюминесцентный реагент (GE Healthcare, США);
- хлорид натрия, NaCl (Химмед, Россия);
- цитрат натрия (Applichem, Германия);
- эмбриональная сыворотка телят (Gibco, PAA, Австрия);
- набор для определния люциферазной активности Luciferase Assay System
(Promega, США)
- набор для выделения плазмидной ДНК (Promega, США)
- Тризол (LifeTechnologies, США)
- HhaI - метилчувствительная рестриктаза (ThermoScientific, Великобритания)
- HpaII - метилчувствительная рестриктаза (Сибэнзим, Россия)
2.10. Оборудование и приборы
-
система
гель-документации,
детекции
хемилюминесценции
и
флуоресценции ImageQuant Las 4000 (GE Healthcare, США),
- камеры для вертикального электрофореза Mini VE, SE 260 (GE Healthcare,
США),
- система для мокрого электропереноса TE 22 (GE Healthcare, США),
- люминометр Infinite 200 PRO (Tecan, Швейцария),
- спектрофотометр Multiscan FC (ThermoScientific, США),
- спектрофотометр Ultrospec 2100 pro (GE Healthcare, США),
- центрифуга Eppendorf Centrifuge 5417R (Eppendorf, Германия),
- бескюветный спектрофотометр NanoVue (GE Healthcare, США),
- ДНК-амплификатор T100 (BioRad, США).
59
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ
3.1.
Сравнительный
анализ
экспрессии
РАК1
в
клетках
эстрогензависимого и эстрогеннезависимого рака молочной железы
3.1.1. Определение содержания РАК1 методом иммуноблотинга
Эксперименты проводились in vitro на клетках эстрогензависимого ERпозитивного
рака
молочной
железы
человека
(линия
MCF-7)
и
эстрогеннезависимого ER-негативного рака молочной железы (линии HBL-100,
MDA-MB-231, SKBR-3), культивируемых в стандартных условиях, описанных
выше.
Анализ содержания РАК1 проводился методом иммуноблотинга с
использованием моноклональных антител к PAK1 и α-тубулину (рис. 10).
Рисунок 10. Экспрессия PAK1 в клетках MCF-7, HBL-100, MDA-MB-231, SKBR-3.
Результаты иммуноблоттинга* и денситометрии, выполненной в программе
ImageJ; за 1 принимали значение показателя в линии MCF-7.
Определение
уровня
РAK1
выявило
его
высокое
содержание
в
эстрогеннезависимых ER-негативных клеточных линиях РМЖ (HBL-100, MDAMB-231, SKBR-3) по сравнению с клетками эстрогензависимой ER-позитивной
линии MCF-7.
*Здесь и далее на иллюстрациях представлены результаты одного из трех
независимых экспериментов
60
Для большинства последующих экспериментов были выбраны две линии
клеток, максимально различающиеся по степени экспрессии PAK1: с низким
уровнем PAK1 (ER-позитивная линия клеток MCF-7) и с самым высоким уровнем
PAK1 (ER-негативная линия клеток HBL-100).
3.1.2. Изучение зависимости экспрессии PAK1 от плотности клеточной
культуры
Клетки MCF-7, HBL-100 и MDA-MB-231 рассевали на 5-см чашки в 3-х
исходных вариантах таким образом, что к моменту снятия плотность для каждой
линии составляла 60, 80 и 100 % от максимального монослоя. Иммуноблотинг
образцов проводили с антителами к PAK1 и α-тубулину (рис. 11).
Рисунок 11. Влияние плотности клеточной культуры на уровень РАК1 в клетках
MCF-7, HBL-100, MDA-MB-231. Результаты иммуноблоттинга.
Как видно из полученных данных, экспрессия PAK-1 практически не
изменялась в зависимости от плотности клеточной культуры и различия в
экспрессии РАК1 между отдельными линиями сохранялись на любой стадии
роста клеток (рис.11).
61
3.1.3. Влияние ингибитора протеосомной деградации MG-132 на
содержание РАК1
Одним из возможных механизмов низкого эндогенного уровня PAK1 в
клетках MCF-7 могла быть активная протеосомная деградация белка. Для
проверки
этого
предположения
были
проведены
эксперименты
по
сравнительному анализу уровня РАК1 в присутствии протеосомного ингибитора
MG132, предотвращающего деградацию убиквитин-связанных белков [280].
Эксперименты проводились на клетках эстрогензависимого рака молочной
железы человека MCF-7, культивированных в течение суток в присутствии
MG132 в концентрации 0, 2 и 5 мкМ; последующий иммуноблоттинг проводился
с антителами к PAK1 и α-тубулину. Оказалось, что добавление
приводит к восстановлению уровня РАК1 в клетках,
MG132 не
что свидетельствует о
нарушениях транскрипции или трансляции как о наиболее вероятных причинах
низкого уровня РАК1 в клетках MCF-7 (рис. 12).
Рисунок 12. Экспрессия PAK1 и ERα в клетках MCF-7 в зависимости от
действия MG132. Результаты иммуноблоттинга
62
3.2. Роль РАК1 в регуляции роста клеток эстрогензависимого и
эстрогеннезависимого рака молочной железы
Известно, что активированная РAK1 контролирует путем фосфорилирования
широкий спектр сигнальных белков, ответственных за регуляцию ключевых
функций клеток: рост, выживаемость, организация цитоскелета. Оказалось, что
одной из мишеней для РAK1 является, в том числе, рецептор эстрогена, при этом
РАК-зависимое фосфорилирование последнего приводит к эстрогеннезависимой
активации ER и снижению гормональной зависимости ER-позитивных опухолей
молочной железы [91-93]. Так как РAK1 обладает широким спектром действия,
мы предположили, что и в ER-негативных опухолях активация PAK1-сигнального
пути
может
оказаться
необходимой
для
стимуляции
и
поддержания
эстрогеннезависимого роста клеток.
3.2.1. Влияние РАК1 на рост клеток
Для изучения участия РAK1 в регуляции клеточного роста, клетки MCF-7 и
HBL-100
культивировали
на
24-луночных
планшетах
в
присутствии
специфического ингибитора PAK1  IPA-3 в концентрации 10 мкМ в течение 3
суток, с последующим определением количества выживших клеток.
Результаты показали, что ингибитор PAK1 IPA-3 приводит к торможению
роста клеток, значительно более выраженному в ER-негативной линии HBL-100
по сравнению с ER-позитивной линией MCF-7, что свидетельствует об активном
участии РАК1 в поддержании эстрогеннезависимого роста клеток (рис. 13) .
63
Рисунок 13. Влияние ингибитора Рak1 IPA-3 в концентрации 10 мкМ на рост
клеток MCF-7 и HBL-100.**
3.2.2. Влияние РАК1 на активность митогенных сигнальных путей
Для дальнейшего изучения механизма рост-стимулирующих эффектов РАК1
исследовалось его влияние на активность митогенных транскрипционных
факторов: АР-1,
бета-катенина и Snail1. Был применен метод репортерного
анализа, позволяющий оценить транскрипционную активность факторов по их
способности взаимодействовать со специфическими участками связывания на
ДНК и активировать экспрессию гена-репортера люциферазы.
Для изучения роли
котрансфекция
РАК1 в регуляции активности АР-1 проводилась
эстрогензависимых
эстрогеннезависимых
ER-положительных
ER-отрицательных
клеток
клеток
HBL-100
MCF-7
и
плазмидными
конструкциями, содержавшими дикий вариант гена РАК1 (контроль – пустой
вектор CMV6), ген люциферазы под контролем AP-1-чувствительного промотора
(AP1/Luc),
а
также
плазмиду
эффективности трансфекции).
с
геном
β-галактозидазы
(для
контроля
Активность люциферазы определяли
набором
Luciferase Promega Assay в соответствие с рекомендациями фирмы-изготовителя.
**Здесь и далее на диаграммах представлены средние значения трех и более
независимых экспериментов.
64
Рисунок 14. Влияние трансфекции РАК1 на транскрипционную активность
АР-1.
Мы обнаружили, что гиперэкспрессия РАК1 приводит к выраженной
стимуляции транскрипционной активности АР-1, причем в обеих линиях клеток:
MCF-7 и HBL-100 (рис.14).
Для исследования роли РАК1 в регуляции бета-катенина были использованы
клеточные линии: MCF/TCF и HBL/TCF (клеточные линии MCF7 и HBL-100,
стабильно экспрессирующие репортерную конструкцию, содержащую ген
люциферазы под контролем TCF/LEF- промотора, чувствительного к бетакатенину). Клетки были котрансфицированы плазмидными конструкциями,
содержавшими дикий вариант гена РAK, и вектором для экспрессии βгалактозидазы (β-gal). Репортерный анализ показал, что гиперэкспрессия РАК1
приводит к выраженной стимуляции транскрипционной активности бетакатенина, также в обеих линиях клеток: MCF-7 и HBL-100 (рис. 15).
65
Рисунок 15. Влияние трансфекции РАК1 на транскрипционную активность
β-катенина.
Последним из митогенных белков был исследован
транскрипционный
фактор Snail1, один из ключевых белков эпителиально-мезенхимального перехода
[232],
повышенная
экспрессия
которого
характерна
для
многих
эстрогеннезависимых опухолей молочной железы, в том числе – для клеток HBL100 [260]. Кроме того, ранее была продемонстрирована способность PAK1
фосфорилировать Snail1 [231].
Клетки MCF-7 и HBL-100 трансфицировали плазмидными конструкциями,
содержавшими дикий вариант гена РAK1, ген-репортер люциферазы под
контролем Snail1-чувствительного промотора (E-cad/Luc) и β-галактозидазу.
Результаты
репортерного
анализа
показали,
что
РАК1
стимулирует
трансрепрессорную активность Snail1, определяемую по степени подавления
экспрессии репортерного гена E-cad/Luc [270], но только в ER-негативных
клетках HBL-100, тогда как в клетках MCF-7 активность Snail-1 практически не
менялась (рис. 16).
66
Рисунок 16. Влияние трансфекции РАК1 на транскрипционную активность
Snail1.
Для исследования роли Snail1 в регуляции роста клеток HBL-100 был
использован метод малых интерферирующих РНК, позволяющий блокировать
экспрессию Snail1 при трансфекции в клетки коротких фрагментов РНК. Клетки
HBL-100 были трансфицированы короткой интерферирующей РНК для Snail1 (siSnail) или контрольной scrambled siRNA (случайная последовательность) с
последующим определением количества выживших клеток (рис. 17).
Рисунок 17. Влияние si-Snail1 на скорость роста клеток HBL-100.
67
Мы показали, что подобный генетический нокдаун Snail1 приводит к
значительному, более чем в 2 раза, снижению скорости роста ER-негативных
клеток HBL-100, свидетельствуя о важной роли, которую играет Snail1 и
сигнальный путь PAK1/Snail1 в регуляции роста эстрогеннезависимых клеток.
3.2.3. Роль α-Pix, ко-активатора РАК1, в регуляции активности
клеточных сигнальных белков
Известно, что регуляция активности РAK1 происходит путем присоединения
малых Rho- ГТФаз: Rac и Cdc42, переведенных с помощью гуанин нуклеотидобменных факторов (GEF) в ГТФ-связанную активную форму; таким GEFфактором для PAK является Pix (PAK-interactive exchange factor), в частности, его
форма - α-Pix. Ранее было показано, что PAK1, являясь эффектором α-PixRac1(Cdc42), в то же время фосфорилирует α-Pix по серину в 488 положении
[203], которое приходится на PH-домен, выполняющей вместе с доменом DH
функцию гуанин-нуклеотидного обмена на Rac и Cdc42. Значение данного
фосфорилирования для клетки до сих пор изучено не было. Мы предположили,
что подобное фосфорилирование
митогенной
активности
PAK,
α-Pix может участвовать в регуляции
в
частности
–
при
его
действии
на
транскрипционные факторы АР-1, бета-катенин и Snail1.
Влияние α-Pix на сигнальный путь PAK1/АР-1. Проводилась котрансфекция
клеток MCF-7 и HBL-100 плазмидными конструкциями, содержавшими дикий
вариант гена α-Рix-wt, ген люциферазы под контролем AP-1-чувствительного
промотора (AP1/Luc) и β-gal.
68
Рисунок 18. Влияние трансфекции α-Pix на транскрипционную активность
AP-1.
Мы обнаружили, что гиперэкспрессия α-Pix в обеих линиях клеток: MCF-7 и
HBL-10, никак не влияет на транскрипционную активность АР-1 (рис. 18).
Влияние α-Pix на сигнальный путь PAK1/β-катенин. Для проведения анализа
влияния α-Pix на активность бета-катенина были использованы клеточные линии:
MCF/TCF и HBL/TCF, стабильно экспрессирующие репортерную конструкцию,
содержащую ген люциферазы под контролем TCF/LEF- промотора). Клетки были
котрансфицированы плазмидными конструкциями, содержавшими дикий вариант
гена α-Рix-wt, и β-gal. Результаты репортерного анализа показали, что
гиперэкспрессия α-Pix в обеих линиях клеток приводит к выраженной стимуляции
транскрипционной активности бета-катенина (рис. 19).
69
Рисунок 19. Влияние трансфекции α-Pix на транскрипционную активность
β-катенина.
Влияние α-Pix на сигнальный путь PAK1/Snail1. Проводилась котрансфекция
клеток MCF-7 и HBL-100 плазмидными конструкциями, содержавшими дикий
вариант гена α-Рix-wt, ген-репортер люциферазы под контролем Snail1чувствительного промотора (E-cad/Luc) и β-gal.
Рисунок 20. Влияние трансфекции α-Pix на транскрипционную активность
Snail1.
70
Результаты репортерного анализа (рис. 20) показали, что α-Pix стимулирует
трансрепрессорную активность Snail1, определяемую по степени подавления
экспрессии репортерного гена E-cad/Luc [270], но только в ER-негативных
клетках HBL-100, тогда как в клетках MCF-7 активность Snail1 практически не
менялась, что согласуется с данными, полученными нами ранее в отношении
PAK1.
Роль PAK1-зависимого фосфорилирования а-Pix по S488 в активации Snail.
Для исследования значения PAK1-зависимого фосфорилирования а-Pix в
регуляции
Snail
клетки
HBL-100
котрансфицировали
плазмидными
конструкциями, содержавшими дикий вариант гена α-Рix-wt, мутантные с заменой
серина в 488-ом положении на аланин - α-Рix-A (препятствует фосфорилированию
киназой PAK1) [203], ген-репортер люциферазы под контролем Snail1чувствительного промотора (E-cad/Luc) и β-gal. Репортерный анализ показал (рис.
21),
что
гиперэкспрессия
α-Pix
дикого
типа
приводит
к
повышению
трансрепрессорной активности Snail1, в то время как замена серина в 488-ом
положении на аланин (гиперэкспрессия α-Рix-A) приводит к снижению
трансрепрессорной активности Snail1, свидетельствуя о важной роли
PAK1-
зависимого фосфорилирования α-Pix (S488) в стимуляции трансрепрессорной
активности Snail1.
Рисунок 21. Роль PAK-зависимого фосфорилирования α-Pix по S488 в
активации Snail.
71
Таким образом, α-Pix, возможно действуя через Rac1(Cdc42)/PAK1сигналинг, участвует в регуляции β-катенинового пути в эстрогензависимых и
эстрогеннезависимых клетках, а также стимулирует
трансрепрессорную
активность Snail1 – но только в эстрогеннезависимых клетках РМЖ, причем
последний эффект зависит от PAK-зависимого фосфорилирования α-Pix по S488
[232].
Полученные данные существенно расширяют известные представления о
действии PAK1 в клетках и позволяют более полно охарактеризовать значение
вышележащих и нижележащих эффекторов PAK1 в регуляции роста клеток РМЖ.
3.2.4. Влияние РАК1 на активность рецептора эстрогенов в клетках
эстрогензависимого рака молочной железы MCF-7
РAK1 и регуляция экспрессии ER. Мы изучали возможные изменения
содержания ER при трансфекции в клетки MCF-7 плазмиды Рak1 или действия
специфического ингибитора PAK1 – IPA-3. Результаты иммуноблоттинга
образцов показали, что трансфекция РAK1 приводит к заметному увеличению
экспрессии ER в клетках MCF-7; при добавлении IPA-3 экспрессия ERα
возвращается к исходному уровню (рис. 22).
Рисунок 22. Экспрессия ERα в клетках MCF-7 при трансфекции PAK1+/IPA-3. Результаты иммуноблоттинга и денситометрии, выполненной в
программе ImageJ; за 1 принимали значение показателя в контроле.
РAK1 и транскрипционная активность ER. Аналогичные эксперименты
были проведены по исследованию влияния РАК1 на транскрипционную
активность ER; для определения активности ER применялся репортерный анализ
72
с
использованием гена-репортера люциферазы
под
контролем
эстроген-
респонсивного элемента (ERE) (ERE/Luc). Как и в предыдущей серии
экспериментов, результаты показали, что гиперэкспрессия РАК1 приводит к
стимуляции ER, а подавление РАК1 в присутствии IPA-3 сопровождается
снижением активности ER (рис. 23).
Рисунок 23. Анализ транскрипционной активности ER после трансфекции
РАК1 или действия ингибитора РАК1 IPA-3 в клетках MCF-7
Значение РАК1/ ER-сигнального пути в регуляции активности Snail1
(эксперименты выполнены совместно с О.Е.Андреевой). Как уже отмечалось, в
клетках ER-негативного РМЖ наблюдается гиперэкспрессия PAK1, при этом
Snail находится под позитивным контролем PAK1. Напротив, клетки ERположительного РМЖ (MCF-7) характеризуются низким уровнем экспрессии
PAK1, и РАК1, даже в случае дополнительной транзиторной трансфекции, никак
не влияет на активность Snail1 (см. рис.10, 16). Мы предположили, что причина
нарушения передачи сигнала от РAK1 к Snail1 в клетках MCF-7 может быть
связана с активацией системы внутриклеточного сигналинга, ответственного за
негативный контроль Snail1 со стороны ER.
73
Целью ниже описанных
экспериментов явилось изучение роли сигнального пути РАК1/ER в негативной
регуляции Snail1 в ER-позитивных клетках.
Клетки MCF-7, культивируемые в стандартных условиях в 24-луночных
плашках, были трансфицированы плазмидой с геном-репортером люциферазы
под контролем Snail1-чувствительного промотора (E-cad/Luc) с последующей
обработкой эстрадиолом или антиэстрогеном тамоксифеном в течение 24 час.
Результаты репортерного анализа показали, эстрадиол приводит к подавлению, а
тамоксифен – к стимуляции
транрепрессорной активности Snail1, что
свидетельствует об участии ER в негативной регуляции Snail1 (рис. 24).
Рисунок 24. Влияние эстрадиола и тамоксифена на трансрепрессорную
активность Snail1 в клетках MCF-7
Действительно ли активный ER предотвращает РАК-зависимую стимуляцию
Snail1 (характерную для ER-негативных клеток)? Для ответа на этот вопрос мы
сравнили эффект IPA-3, ингибитора РАК1, на активность Snail1 в клетках MCF-7
в отсутствие или присутствии антиэстрогена тамоксифена. Оказалось, что если в
74
отсутствие тамоксифена IPA-3 никак не влияет на активность Snail1, то на фоне
тамоксифена IPA-3 вызывает существенное торможение трансрепрессорной
активности Snail1, демонстрируя восстановление в таких клетках способности
РАК1 позитивно регулировать Snail1 (рис. 25).
Рисунок 25. Эффект комбинированного действия тамоксифена и IPA-3 на
трансрепрессорную активность Snail1 в клетках MCF-7
3.3. РАК1 и выживаемость клеток: роль РАК1 в регуляции роста клеток
в условиях гипоксии
3.3.1. Сравнительный анализ чувствительности к гипоксии клеток
MCF-7 и HBL-100 (эксперименты выполнены совместно с
В.А.Шатской)
Эксперименты проводились in vitro на клетках эстрогензависимого рака
молочной железы человека MCF-7 и эстрогеннезависимого ER-негативного рака
75
молочной железы линии HBL-100. Анализ скорости роста клеток после перевода
в условия гипоксии (1% О2) показал резкое снижение роста клеток MCF-7 при
сохранении относительно устойчивой пролиферации ER-негативных клеток HBL100 (рис. 26). Как уже отмечалось, клетки HBL-100 отличаются высоким уровнем
РАК1,
что
позволило
предположить
участие
последнего
в
регуляции
количество клеток отн.ед.
чувствительности клеток к гипоксии.
контроль
гипоксия, 1%О2
MCF-7
HBL-100
Рисунок 26. Сравнительный анализ чувствительности к гипоксии клеток
MCF-7 и HBL-100.
3.3.2. Роль РАК1 в адаптации клеток MCF-7 к гипоксии
Для дальнейшего изучения протективной роли РАК1 и путей его
физиологической регуляции в клетках РМЖ мы исследовали активность РАК1 в
клетках MCF-7 в условиях гипоксии. Было продемонстрировано, что острая
гипоксия (1% О2, 18 час) приводит к выраженному увеличению экспрессии РАК1
в клетках (рис.27), что в целом свидетельствовало о возможном участии РАК1 в
развитии ответа клеток на гипоксию.
76
Рисунок 27. Влияние острой гипоксии на содержание РАК1 в клетках MCF7. Результаты иммуноблоттинга и денситометрии, выполненной в программе
ImageJ; за 1 принимали значение показателя в контроле.
В какой мере РАК1 участвует в поддержании роста клеток при гипоксии –
для ответа на этот вопрос следующая серия экспериментов была проведена на
клетках MCF-7, культивированных в условиях хронической гипоксии. Для
моделирования условий хронической гипоксии клетки эстрогензависимого рака
молочной железы MCF-7 культивировали в атмосфере с пониженным (до 1%)
содержанием кислорода в течение 30 сут. Ранее мы продемонстрировали, что если
острая, в течение 3 сут, гипоксия вызывает значительное торможение клеточной
пролиферации, то на фоне хронической гипоксии торможение роста оказывается
существенно меньшим. Полученная в условиях хронической гипоксии сублиния
клеток получила название MCF-7/H; в предыдущих работах мы показали, что
подобная толерантность к гипоксии может сохраняться в течение не менее 60
суток после возвращения клеток в среду с нормальным содержанием кислорода
[281]. Все последующие эксперименты проводились на сублинии MCF-7/H,
поддерживаемой после перевода в среду с нормальным содержанием кислорода
не более 60 сут.
Анализ содержания РАК1 в клетках MCF-7 и MCF-7/H в условиях нормоксии
выявил существенное повышение базального уровня РАК1 в клетках MCF-7/H
(рис.28).
77
Рисунок 28. Сравнительный анализ содержания РАК1 в клетках MCF-7 и
MCF-7/H. Результаты иммуноблоттинга и денситометрии, выполненной в
программе ImageJ; за 1 принимали значение показателя в в линии MCF-7.
Мы показали, что трансфекция дикого варианта гена РАК1 в клетки MCF-7
сопровождалась
развитием
частичной
толерантности
к
гипоксии,
что
100
контроль
гипоксия 1%
50
гипоксия 1% + wPak1
0
количество клеток отн.ед.
150
подтверждало протективную роль РАК1 при гипоксии (рис.29).
MCF-7
Рисунок 29. Влияние трансфекции wPAK1 на чувствительность к гипоксии
клеток MCF-7. Результаты МТТ теста, проведенного через 3 суток роста в
гипоксии с уровнем O2 не более 1%.
Для дальнейшего изучения механизма действия РАК1 при гипоксии
исследовалось влияние РАК1 на активность HIF-1, одного из ключевых факторов,
определяющих реакцию клеток на гипоксию. Было обнаружено, что трансфекция
в клетки дикого варианта гена РАК1 приводит к увеличению транскрипционной
78
активности HIF-1 на фоне острой гипоксии, демонстрируя участие РАК1 в
1500
контроль
500
1000
wPak1
0
активность люциферазы
(HRE/luc), усл.ед.
активации HIF-1-сигнальных путей (рис. 30).
Норма
Гипоксия
Рисунок 30. Влияние трансфекции wPAK1 на транскрипционную активность
HIF-1. Результаты репортерного анализа.
Механизм активации РАК1 в клетках MCF-/Н. Анализ скорости роста клеток
в присутствии IPA-3, специфического ингибитора РАК1, показал, что его
добавление приводит к выраженному снижению скорости роста клеток MCF-7/H,
контроль
50
100
IPA-3
0
количество клеток отн.ед.
150
отличающихся повышенным базальным уровнем РАК1 (рис.31).
MCF-7/H
Рисунок 31. Рост клеток MCF-7/Н в присутствии IPA-3. Результаты МТТ
теста.
79
50
100
контроль
гипоксия 1%
0
количество клеток отн.ед.
150
Анализ скорости роста клеток MCF-7/H в присутствии IPA-3 в условиях
гипоксии выявил, что подавление РАК1 с помощью IPA-3 приводит к увеличению
чувствительности клеток к гипоксии (рис. 32).
- IPA
+IPA
Рисунок 32. Влияние IPA-3 на чувствительность к гипоксии клеток MCF7/Н. Результаты МТТ теста.
Следует отметить, что подобный протективный эффект РАК1 характерен и
для клеток ER-негативного рака молочной железы. Так, ранее мы показали, что,
как минимум, некоторые ER-негативные опухоли молочной железы отличаются
повышенной конститутивной экспрессией РАК1 и высокочувствительны к
антипролиферативному действию IPA-3 (см. рис. 10 и 13).
Таким образом, гиперэкспрессия РАК1, как приобретенная (в случае клеток
MCF-7/H), так и конститутивная (в случаях ER-негативных опухолей) может
выступать в роли одного из факторов, поддерживающих автономный рост и
выживаемость клеток.
3.4. Метилирование РАК1 и его роль в регуляции дифференциальной
экспрессии РАК1 в клетках эстрогензависимого и эстрогеннезависимого
рака молочной железы
В качестве одного из вероятных путей регуляции РАК1 в клетках опухолей
молочной железы мы исследовали возможность метилирования/деметилирования
CpG-островка, расположенного в 5’-регуляторном регионе и определяющего
80
эффективность
экспрессии
РАК1.
Был
проведен
сравнительный
анализ
метилирования гена РАК1 в клетках MCF-7 и HBL-100 методом бисульфитного
секвенирования ДНК, в основе которого лежит бисульфитная конверсия
неметилированного цитозина в тимин, при этом
метилированный цитозин
конверсии не подвергается. Результаты показали высокий уровень метилирования
РАК1 в клетках MCF-7 и полное отсутствие метилирования в ER-негативных
клетках HBL-100.
а
б
Рисунок 33. а) Бисульфитное секвенирование промотора РАК1 в клетках
HBL-100 и MCF-7. Нуклеотидная последовательность СpG-островка,
расположенного в промотерной области
PAK1. Цветом выделены
метилированные цитозины, которые не изменяются в результате бисульфитной
конверсии. б) Бисульфитное секвенирование промотора РАК1 в клетках HBL-100
и MCF-7. Результаты метил-специфического секвенирования CpG-островка,
расположенного в промотере РАК1 в культурах клеток HBL-100 и MCF-7.
Параллельно
был
проведен
анализ
метилирования
РАК1
методом
метичувствительной ПЦР. Метод метилчувствительной ПЦР основан на
использовании метилчувствительных рестрикционных нуклеаз, расщепляющих
81
ДНК при отсутствии метилирования цитозинов в сайтах рестрикции. В случае
метилированных цитозинов гидролиза ДНК не происходит и последующее
использование гидролизованной ДНК в качестве матрицы для ПЦР позволяет
получать продукты только при наличии метилированных цитозинов. Вкратце,
выделенные тризолом (LifeTechnologies, США) геномные ДНК из клеток MCF-7 и
HBL-100
подвергали
12-часовой
рестрикции
метилчувствительными
рестриктазами HhaI (ThermoScientific) и HpaII (Сибэнзим) по сайтам GCGC и
CCGG соответственно, содержащими неметилированный цитозин в CG-паре.
После рестрикции с HhaI проводили ПЦР в присутствие пары праймеров 5’регуляторной области гена РАК1: прямой - ggcaggagggagaaagtgaag и обратный –
ttccatgcagaaggaactgg; а после рестрикции с HpaII в ПЦР использовали также
независимую пару праймеров для внутреннего контроля ПЦР - фрагмент гена
CUX1 (прямой - agggcctggacggggtcggac и обратный - agcccacacggaacaggagga).
Продукты ПЦР анализировали методом вертикального электрофореза в ПААГ с
последующей окраской геля нитратом серебра или методом горизонтального
электрофореза в агарозном геле с бромистым этидием с последующей гельдокументации полученных результатов на УФ-трансиллюминаторе с помомощью
ImageQuant Las 4000 и анализом программой ImageQuant TL.
Условия ПЦР, а также рестрикции, подбирались и отрабатывались на линии
клеток MCF-7 (рис.34 и 35).
Рисунок 34. Подбор оптимальной температуры отжига праймеров. ПЦРпродукты длиной 543 п.о. промотерной части и области 1-го экзона гена PAK1
после электрофореза в агарозном геле.
82
Рисунок 35. Подбор оптимального количества циклов. ПЦР-продукты длиной 543
п.о. промотерной части и области 1-го экзона гена PAK1 после электрофореза в
агарозном геле.
В результате подбора условий ПЦР определили, что оптимальными для
обеих пар являются: температура отжига - 62оС (рис. 34), количество циклов ПЦР
–
32
(рис.
35).
В
результате
отработки
рестрикции
также
выявили
гиперметилирование промотерной части и области 1-го экзона гена PAK-1 в
клетках MCF-7.
В соответствии с разработанными условиями проводили сравнительный
анализ
наличия
или
метилчувствительными
отсутствия
продуктов
рестриктазами
HhaI
и
ПЦР
HpaII,
после
обработки
которые
разрезают
неметилированные последовательности GCGC и CCGG соответсвенно таким
образом, что ПЦР не идет и продукт в геле не детектируется (рис. 36а,б ).
Полученные
данные
по
2-м
независимым
метил-чувстительным
рестрикциям полностью подтвердили результаты бисульфитного секвенирования,
продемонстрировав наличие метилированных участков промотора РАК1 в
клетках MCF-7 и отсутствие их в клетках HBL-100.
83
Рисунок
36.
Анализ
метилирования
промотора
РАК1
методом
метилчувствительной ПЦР. а) ПЦР после рестрикции HpaII. Определяются два
фрагмента, верхний соответствует промотору РАК1, нижний - внутреннему
контролю CUX1; б) ПЦР после рестрикции HhaI. Определяется один фрагмент,
соответствующий промотору РАК1. В клетках MCF-7 рестрикция ДНК не
происходит из-за метилирования цитозинов в СG-динуклеотидах, синтез
фрагмента РАК1 сохраняется. В клетках HBL-100 происходит рестрикция ДНК,
фрагмент с промотора РАК1 не синтезируется.
Исследование метилирования РАК1 в клетках
MCF-7/H не выявило
существенных изменений в уровне метилирования РАК1– несмотря на
увеличение содержания РАК1 в клетках MCF-7/H по сравнению с клетками MCF7 (рис.37).
MCF-7/H
Рис.37. Бисульфитное секвенирование промотора РАК1 в клетках MCF-7/Н .
84
Каков механизм активации РАК1 в случае клеток MCF-7/H – остается до
конца непонятным, скорее всего подобная активация РАК1 может быть
результатом
действия
определенных
сигнальных
белков
–
позитивных
регуляторов РАК1. Мы предполагаем, что в качестве таких регуляторов могут
выступать белки, ассоциированные с гипоксией, в том числе – HIF-1. Учитывая
описанную выше способность РАК1 стимулировать активность HIF-1, можно
предположить, что эти белки связаны положительными регуляторными связями,
которые и обеспечивают конститутивное повышение их уровня при хронической
гипоксии.
85
ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
На сегодняшний день содержание рецепторов эстрогенов (ER) относится к
основным критериям определения чувствительности больных раком молочной
железы к гормональным противоопухолевым препаратам [29-34]. Основной
причиной снижения эффективности
гормональной терапии РМЖ является
переход опухолевых клеток от эстрогензависимого к эстрогеннезависимому
росту, что может быть обусловлено как уменьшением содержания рецептора
эстрогена, так и рядом других факторов, таких как нарушение баланса между
белками-активаторами и супрессорами ER, лиганд-независимая активация ER; а
также стимуляция митогенных сигнальных путей, идущих в обход ER и
поддерживающих тем самым рост РМЖ в отсутствие эстрогенов. Среди
последних ведущее значение принадлежит рецепторным тирозинкиназам. До сих
пор остается неясным, какие из эффекторов тирозинкиназ являются ключевыми
для
поддержания эстрогеннезависимого
роста и
могут ли
они играть
самостоятельную роль в развитии гормональной резистентности РМЖ.
Одним из важнейших эффекторов тирозинкиназных рецепторов является
серин-треониновая протеинкиназа PAK1, которая путем фосфорилирования
различных сигнальных белков участвует в регуляции ключевых функций в
клетке: рост, выживаемость, организация цитоскелета, клеточная подвижность
[173]. Мы предположили, учитывая широкий спектр активности Рak1, ее участие
в
регуляции
митогенных
сигнальных
путей,
поддерживающих
эстрогеннезависимый рост РМЖ и определяющих развитие гормональной
резистентности опухолей.
4.1. Экспрессия PAK1 в различных линиях РМЖ
Целью первой части работы явилось исследование экспрессии PAK1 в
различных линиях рака молочной железы, выявление возможной корреляции с
ER-положительным
или
ER-отрицательным
статусом
и
гормональной
зависимостью РМЖ, а также определение вероятных причин, определяющих
86
различия в экспрессии PAK1 в опухолях. В качестве экспериментальных моделей
использовались клеточные линии, которые соответствуют основным типам РМЖ:
эстрогензависимая ER-положительная линия MCF-7, эстрогеннезависимые ERнегативные линии клеток MDA-MB-231, SKBR-3 и HBL-100. Определение уровня
Рak1 выявило его высокое содержание в эстрогеннезависимых ER -негативных
клеточных линиях РМЖ (HBL-100, MDA-MB-231, SKBR-3) по сравнению с
эстрогензависимыми
ER-позитивными
клетками
(MCF-7).
Полученные
результаты согласуются с данными других исследователей, демонстрировавших
повышенный уровень PAK1 в ER-отрицательных клетках РМЖ, в то время как в
ER-положительных он практически отсутствовал [247], а также с данными о том,
что PAK1 гиперэкспрессирована более, чем в 50% случаев РМЖ [235].
Для большинства последующих экспериментов были взяты 2 крайние по
степени экспрессии PAK1 клеточные модели: с самым низким уровнем PAK1
(ER-позитивная линия клеток MCF-7) и с самым высоким уровнем PAK1 (ERнегативная линия клеток HBL-100). Культура клеток HBL-100 при выращивании
в монослое образовывала характерные колонии со сниженной адгезивной
способностью, что соответствовало мезенхимальному фенотипу.
4.2. PAK1 в стимуляции митогенных путей в клетках РМЖ
Для определения роли активации PAK1 в стимуляции митогенных путей в
клетках рака молочной железы мы исследовали особенности роста клеток РМЖ
при подавлении PAK1, а также влияние PAK1 на некоторые эффекторы,
задействованные в передачу митогенного сигнала в клетках РМЖ, в частности
АР-1, бета-катенин и Snail.
Так как Рak1 обладает широким спектром важных для клетки функций: рост,
выживаемость,
организация
цитоскелета,
мы
предположили,
что
его
гиперэкспрессия в ER-негативных клетках может оказаться необходимой для
стимуляции и поддержания эстрогеннезависимого роста клеток. Действительно, в
экспериментах по изучению влияния Рak1 на пролиферацию клеток РМЖ мы
87
наблюдали, что ингибитор PAK1 ̶ IPA-3 приводит к торможению роста клеток,
значительно более выраженному в клетках ER-негативных линий по сравнению с
клетками MCF-7, что свидетельствует об активном участии Рak1 в поддержании
роста эстрогеннезависимых клеток. При дальнейшем изучении механизма ростстимулирующих эффектов Рak1 мы показали, что PAK1 стимулирует AP-1 и
WNT-β-катениновый путь как в эстрогензависимых, так и эстрогеннезависимых
клетках РМЖ. Полученные результаты согласуются с литературными данными о
роли PAK1 в стимуляции клеточного цикла и пролиферации [236-238], а также
активации эффекторов ERK-, АКТ- и WNT- сигнальных путей.
В исследованиях влияния PAK1 на транскрипционный фактор Snail1 –
ключевой
фактор
эпителиально-мезенхимального
экспрессия которого характерна, в том числе,
перехода,
повышенная
и для эстрогеннезависимых
опухолей [260], мы наблюдали, что Рak1 стимулирует трансрепрессорную
активность Snail1 только в ER-негативных клетках HBL-100, тогда как в клетках
MCF-7 активность Snail1 практически не менялась. Проведенный нами
генетический нокдаун Snail1 приводил к значительному, более чем в 2 раза,
снижению скорости роста ER-негативных клеток HBL-100, свидетельствуя о
важной роли, которую играет Snail1 в регуляции роста эстрогеннезависимых
клеток.
Мы показали, что α-Pix, один из вышележащих регуляторов РАК1,
стимулирует активность бета-катенина, не влияет на АР-1 в исследованных
линиях РМЖ, но стимулирует трансрепрессорную активность Snail1 только в ERнегативных клетках HBL-100.
Ранее было показано, что PAK1, являясь эффектором α-Pix-Rac1(Cdc42), в то
же время фосфорилирует α-Pix по серину в 488 положении [203]. Мы показали,
что замена в α-Pix серина в 488-ом положении на аланин приводит к снижению
трансрепрессорной активности Snail1, свидетельствуя о важной роли
зависимого
фосфорилирования
α-Pix
активности Snail1.
88
в
стимуляции
PAK1-
трансрепрессорной
Полученные данные помогают составить схему возможного действия PAK1,
а также его некоторых вышележащих и нижележащих эффекторов в поддержании
эстрогеннезависимого роста клеток РМЖ.
4.3. РАК1 и выживаемость клеток
Выше отмечалось, что ER-негативные клетки РМЖ характеризуются
высоким уровнем экспрессии PAK1 [247] и Snail1 [260], в то время как ERпозитивные клетки, напротив, имеют низкий уровень экспресии этих белков.
Вероятно,
причина низкого уровня экспрессии Рak1 и Snail1 в ER-
положительных клетках может быть связана с особенностями внутриклеточного
сигналинга, ответственного за негативный контроль этих белков. Одним из таких
механизмов негативной регуляции является способность рецептора эстрогена
подавлять активность Snail1 через ER-зависимую активацию специфического
белка-супрессора Snail1 – MTA3 [282, 283].
В наших исследованиях мы продемонстрировали активацию рецептора
эстрогенов под действием РАК1, что можно рассматривать в качестве одного из
факторов, ограничивающих уровень Snail1 в ER-позитивных клетках РМЖ.
Участие
РАК1
в
поддержании
роста
клеток
MCF-7
было
продемонстрировано в экспериментах с IPA-3, специфическим ингибитором
РАК1: оказалось, что добавление IPA-3 существенно снижает скорость роста
клеток MCF-7. Для дальнейшего изучения протективной роли РАК1 и путей его
физиологической регуляции в клетках РМЖ мы исследовали активность РАК1 в
клетках MCF-7 в условиях гипоксии.
В какой мере РАК1 участвует в поддержании роста клеток при гипоксии –
для ответа на этот вопрос следующая серия экспериментов была проведена на
клетках MCF-7, культивированных в условиях хронической гипоксии.
моделирования
хронической
гипоксии
клетки
MCF-7
Для
культивировали
в
атмосфере с пониженным (до 1%) содержанием кислорода в течение 30 сут. Ранее
было установлено, что если острая, в течение 3 сут, гипоксия вызывает
значительное торможение клеточной пролиферации, то на фоне хронической
89
гипоксии происходит частичное восстановление роста клеток. Полученная в
условиях хронической гипоксии сублиния клеток получила название MCF-7/H;
было показано, что подобная толерантность к гипоксии может сохраняться в
течение не менее 60 суток после возвращения клеток в среду с нормальным
содержанием кислорода [281]. Все последующие эксперименты проводились на
сублинии MCF-7/H, поддерживаемой после перевода в среду с нормальным
содержанием кислорода не более 60 сут.
Анализ содержания РАК1 в клетках MCF-7 и MCF-7/H в условиях
нормоксии выявил существенное повышение базального уровня РАК1 в клетках
MCF-7/H. Для дальнейшего изучения механизма действия РАК1 при гипоксии
исследовалось влияние РАК1 на активность HIF-1, одного из ключевых факторов,
определяющих реакцию клеток на гипоксию. Было обнаружено, что трансфекция
в клетки дикого варианта гена РАК1приводит к увеличению транскрипционной
активности HIF-1 на фоне острой гипоксии, демонстрируя участие РАК1 в
активации HIF-1-сигнальных путей.
Анализ скорости роста клеток в присутствии IPA-3, специфического
ингибитора РАК1, показал, что его добавление приводит к выраженному
снижению скорости роста и увеличению чувствительности клеток к гипоксии.
Как уже отмечалось, подобный протективный эффект РАК1 характерен и
для клеток ER-негативного рака молочной железы: так, исследованные нами ERнегативные опухоли молочной железы отличались повышенной конститутивной
экспрессией РАК1 и высокой чувствительностью к антипролиферативному
действию IPA-3. Таким образом, гиперэкспрессия РАК1, как приобретенная (в
случае клеток MCF-7/H), так и конститутивная (в случаях ER-негативных
опухолей) может выступать в роли одного из факторов, поддерживающих
автономный рост и выживаемость клеток.
4.4. Метилирование РАК1
В качестве одного из вероятных путей регуляции РАК1 в клетках опухолей
молочной железы мы исследовали возможность метилирования/деметилирования
90
специфических цитозин-гуанин богатых участков гена, располагающихся в 5’регуляторных регионах [284-286] и определяющих эффективность экспрессии
РАК1.
Действительно,
проведенный
сравнительный
анализ
метилирования
промотора гена РАК1 методом бисульфитного секвенирования ДНК показал
высокий уровень метилирования в клетках MCF-7 и практически полное
отсутствие метилирования промотора в ER-негативных клетках.
Параллельно
был
проведен
анализ
метилирования
РАК1
методом
метичувствительной ПЦР.
Полученные данные полностью подтвердили
результаты
секвенирования,
бисульфитного
продемонстрировав
наличие
метилированных участков промотора РАК1 в клетках MCF-7 и отсутствие их в
клетках HBL-100.
Исследование метилирования РАК1 в клетках
MCF-7/H не выявило
существенных изменений в уровне метилирования РАК1 – несмотря на
значительное увеличение содержания РАК1 в клетках MCF-7/H по сравнению с
клетками MCF-7. Каков механизм активации РАК1 в случае клеток MCF-7/H –
остается до конца непонятным, скорее всего подобная активация РАК1 может
быть результатом действия определенных сигнальных белков – позитивных
регуляторов РАК1. Мы предполагаем, что в качестве таких регуляторов могут
выступать белки, ассоциированные с гипоксией, в том числе – HIF-1. Учитывая
описанную выше активацию РАК1 в условиях гипоксии и, вместе с тем,
способность РАК1 стимулировать активность HIF-1, можно предположить, что
эти белки связаны положительными регуляторными связями, которые и
обеспечивают конститутивное повышение их уровня при хронической гипоксии.
91
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
На сегодняшний день основным критерием определения чувствительности к
гормональным противоопухолевым препаратам является содержание рецепторов
эстрогенов [29-34]. Однако, гормональная резистентность может развиваться и
при сохранении ER: в результате дисбаланса белков-корегуляторов ER, лиганднезависимой активации ER, стимуляция сигнальных путей, независимых от ER и
поддерживающих тем самым рост РМЖ в отсутствие эстрогенов. Развитие
гормональной резистентности рака молочной железы связано с переходом
опухолевых клеток от эстрогензависимого к эстрогеннезависимому росту.
В настоящей работе при исследовании факторов, регулирующих развитие
гормональной
резистентности
продемонстрировали
участие
клеток
рака
серин-треониновой
молочной
железы,
протеинкиназы
Рак1
мы
в
поддержании эстрогеннезависимого роста опухолевых клеток. Мы установили,
что подобные митогенные эффекты РАК1 ассоциированы со стимуляцией
ключевых сигнальных путей опухолевой клетки: MAPK/ AP-1 каскада, WNT-βкатенинового пути, Snail1-сигнального пути. Продемонстрировано, что для
реализации действия РАК1 ключевым фактором является фосфорилирование αPix, ко-активатора РАК1, по серину в положении 488. Показано значение РАК1сигнальной системы в регуляции выживаемости опухолевых клеток, в том числе в
условиях гипоксии.
Полученные данные легли в основу предлагаемой схемы действия PAK1 с
участием его некоторых вышележащих и нижележащих эффекторов, а также
значения РАК1 в поддержании роста клеток РМЖ (рис. 38).
92
Рисунок 38. Роль PAK1 и его эффекторов в поддержании эстрогензависимого
и эстрогеннезависимого роста рака молочной железы.
В целом, полученные результаты свидетельствуют о перспективности
использования РАК1 в качестве маркера развития гормональной резистентности
РМЖ и потенциального объекта таргетной терапии опухолей молочной железы.
93
ВЫВОДЫ
1. Сравнительный анализ содержания серин-треониновой протеинкиназы РАК1 в
клетках культивируемых in vitro эстрогензависимой и эстрогеннезависимых
линий рака молочной железы показал значительное превышение уровня РАК1 в
эстрогеннезависимых сублиниях
2. Продемонстрировано, что РАК1 является одним из факторов, необходимых для
поддержания роста клеток рака молочной железы, в большей степени – для роста
эстрогеннезависимых опухолей молочной железы
3. Установлено, что митогенный эффект РАК1 ассоциирован со стимуляцией
ключевых сигнальных путей опухолевой клетки: MAPK/ AP-1 каскада, WNT-βкатенинового пути, Snail1-сигнального пути. Для реализации действия РАК1
необходимым фактором является фосфорилирование α-Pix, ко-активатора РАК1,
по серину в положении 488.
4. Продемонстрировано участие РАК1 в регуляции выживаемости клеток рака
молочной железы, в частности – в условиях хронической гипоксии. Одним из
возможных механизмов участия РАК1 в поддержании роста опухолевых клеток в
условиях гипоксии является обнаруженная нами способность РАК1
стимулировать транскрипционную активность HIF-1, одного из основных
гипоксия-зависимых протективных факторов клетки.
5. При определении статуса метилирования промотора гена РАК1 установлено,
что низкий уровень РАК1 в эстрогензависимых линиях ассоциирован с высоким
уровнем метилирования, в то время как в эстрогеннезависимых линиях,
отличающихся высоким содержанием РАК1, его промотор полностью
деметилирован.
6. В целом, полученные данные свидетельствуют, что эпигеномная регуляция
РАК1, в частности – метилирование ДНК, может являться одним из факторов,
определяющим повышение уровня РАК1 в эстрогеннезависимых клетках рака
молочной железы. Продемонстрированная нами протективная функция РАК1
позволяет рассматривать его в качестве перспективной мишени для таргетной
терапии рака молочной железы.
94
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1.
Luconi, M. Human spermatozoa as a model for studying membrane receptors
mediating rapid nongenomic effects of progesterone and estrogens / M. Luconi, F.
Francavilla, I. Porazzi et al. // Steroids – 2004. – Vol. 69, № 8–9 – P.553-559.
2.
Maggiolini, M. The unfolding stories of GPR30, a new membrane-bound
estrogen receptor / M. Maggiolini, D. Picard // J. Endocrinol. – 2010. – Vol. 204, № 2 –
P.105-114.
3.
Prossnitz, E.R. Estrogen signaling through the transmembrane G protein-coupled
receptor GPR30 / E.R. Prossnitz, J.B. Arterburn, H.O. Smith et al.// Ann. Rev. Physiol.
– 2008. – Vol. 70 – P.165-190.
4.
Jensen, E.V. Mechanism of action of the female sex hormones / E.V. Jensen, E.R.
DeSombre // Ann. Rev. Biochemistry – 1972. – Vol. 41 – P.203-230.
5.
Dahlman-Wright, K. International Union of Pharmacology. LXIV. Estrogen
receptors / K. Dahlman-Wright, V. Cavailles, S.A. Fuqua et al. // Pharmacol. Rev. –
2006. – Vol. 58, № 4 – P.773-781.
6.
Lu, N.Z. International Union of Pharmacology. LXV. The pharmacology and
classification of the nuclear receptor superfamily: glucocorticoid, mineralocorticoid,
progesterone, and androgen receptors / N.Z. Lu, S.E. Wardell, K.L. Burnstein et al. //
Pharmacol. Rev. – 2006. – Vol. 58, №4 – P.782-797.
7.
Whitfield, G.K. Steroid hormone receptors: evolution, ligands, and molecular
basis of biologic function / G.K. Whitfield, P.W. Jurutka, C.A. Haussler et al. // J Cell
Biochem – 1999. – Vol. Suppl 32-33, P.110-122.
8.
Kumar, R. The structure of the nuclear hormone receptors / R. Kumar, E.B.
Thompson // Steroids – 1999. – Vol. 64, № 5 – P.310-319.
9.
Klinge, C.M. Estrogen receptor interaction with co-activators and co-repressors /
C.M. Klinge // Steroids – 2000. – Vol. 65, № 5 – P.227-251.
10. Wärnmark, A. Activation functions 1 and 2 of nuclear receptors: molecular
strategies for transcriptional activation / A. Wärnmark, E. Treuter, A.P. Wright et al. //
Mol. Endocrinol. – 2003. – Vol. 17, № 10 – P.1901-1909.
11. Metivier, R. Synergism between ERalpha transactivation function 1 (AF-1) and
AF-2 mediated by steroid receptor coactivator protein-1: requirement for the AF-1
alpha-helical core and for a direct interaction between the N- and C-terminal domains /
95
R. Métivier, G. Penot, G. Flouriot et al. // Mol. Endocrinol. – 2001. – Vol. 15, № 11 –
P.1953-1970.
12. Schwabe, J.W. The crystal structure of the estrogen receptor DNA-binding
domain bound to DNA: how receptors discriminate between their response elements /
J.W. Schwabe, L. Chapman, J.T. Finch et al. // Cell – 1993. – Vol. 75, № 3 – P.567-578.
13. Ratajczak, T. Functional Protein Interactions in Steroid Receptor-Chaperone
Complexes / T. Ratajczak, R.K. Allan, C. Cluning et al. // Protein Interactions – 2012.
– Vol. 5 – P.71-102.
14. Pratt, W.B. Steroid receptor interactions with heat shock proteins and
immunophilin chaperons / W.B. Pratt, D.O. Toft // Endocrine Reviews – 1997. – Vol.
18 – P.306-360.
15. Mangelsdorf, D.J. The nuclear receptor superfamily: the second decade / D.J.
Mangelsdorf, C. Thummel, M. Beato et al. // Cell – 1995. – Vol. 83 – P.835-839.
16. Linja, M.J. Expression of androgen receptor coregulators in prostate cancer / M.J.
Linja, K.P. Porkka, Z. Kang, K.J. Savinainen, O.A. Jänne, T.L. Tammela, R.L. Vessell,
J.J. Palvimo, T. Visakorpi // Clin. Cancer Res. – 2004. – Vol. 10, № 3 – P.1032-1040.
17. Aranda, A. Nuclear hormone receptors and gene expression / A. Aranda, A.
Pascual // Physiol. Rev. – 2001. – Vol. 81, № 3 – P.1269-1304.
18. Copland, J.A. Sex steroid receptors in skeletal differentiation and epithelial
neoplasia: is tissue-specific intervention possible differentiation and epithelial
neoplasia: is tissue-specific intervention possible / J.A. Copland, M. Sheffield-Moore,
N. Koldzic-Zivanovic et al. // Bioessays – 2009. – Vol. 31, № 6 – P.629-641.
19. Lin, C. Trans-Activation and repression properties of the novel nonsteroid
glucocorticoid receptor ligand 2,5-dihydro-9-hydroxy-10-methoxy-2,2,4-trimethyl-5-(1methylcyclohexen-3-y1)-1H-1benzopyrano3,4-fquinoline (A276575) and its four
stereoisomers / C. Lin et al. // Molecular Pharmacology – 2002. – Vol. 62, № 2 – P.297303.
20. Russo, I.H. Role of hormones in mammary cancer initiation and progression /
I.H. Russo, J. Russo // J. Mammary Gland Biol. Neoplasia – 1998. – Vol. 3, № 1 –
P.49-61.
96
21. Lapidus, R.G. The loss of estrogen and progesterone receptor gene expression in
human breast cancer / R.G. Lapidus, S.J. Nass, N.E. Davidson // J. Mammary Gland
Biology and Neoplasia – 1998. – Vol. 3 – P.85-94.
22. Fox, E.M. Novel actions of estrogen to promote proliferation: integration of
cytoplasmic and nuclear pathways / E.M. Fox, J. Andrade, M.A. Shupnik // Steroids 2009. – Vol. 74, № 7 – P.622-627.
23. Obr, A.E. The biology of progesterone receptor in the normal mammary gland
and in breast cancer / A.E. Obr, D.P. Edwards // Mol. Cell Endocrinol. – 2012. – Vol.
357, № 1-2 – P.4-17.
24. Kushner, P.J. Estrogen receptor pathways to AP-1 / P.J. Kushner, D.A. Agard,
G.L. Greene et al. // J. Steroid Biochemistry and Molecular Biology – 2000. – Vol. 74 –
P.311-317.
25. De Nardo, D. Estrogen’s ability to stimulate breast cancer growth does not
require ER DNA binding / D. De Nardo, H. Kim, C. Thorn et al. // San Antonio Breast
Cancer Symposium – 2003. – Vol. 82. – Abstr. 1002.
26. Aquila, S. Estrogen receptor (ER)alpha and ER beta are both expressed in human
ejaculated spermatozoa: evidence of their direct interaction with phosphatidylinositol-3OH kievidence of their direct interaction with phosphatidylinositol-3-OH kinase/Akt
pathway / S. Aquila, D. Sisci, M. Gentile et al. // J. Clin. Endocrinol. Metab. – 2004. –
Vol. 89, № 3 – P.1443-1451.
27. Hansen, R.K. Tissue architecture and breast cancer: the role of extracellular
matrix and steroid hormones / R.K. Hansen, M.J. Bissell // Endocr. Relat. Cancer. –
2000. – Vol. 7, № 2 – P.95-113.
28. Giangrande, P.H. The A and B isoforms of the human progesterone receptor: two
functionally different transcription factors encoded by a single gene / P.H. Giangrande,
D.P. McDonnell // Recent Progress in Hormone Research – 1999. – Vol. 54 – P.291313.
29. Красильников, М. А. Современные подходы к изучению механизма
эстрогеннезависимого роста опухолей молочной железы / М. А. Красильников //
Вопросы онкологии.– 2004. - Т.50, № 4 - С.399-405.
30. Normanno, N. Mechanisms of endocrine resistance and novel therapeutic
strategies in breast cancer / N. Normanno, M. Di Maio, E. De Maio et al. // EndocrineRelated Cancer – 2005. – Vol. 12 – P.721-747.
97
31. Clarke, R. Antiestrogen resistance in breast cancer and the role of estrogen
receptor signaling / R. Clarke, M.C. Liu, K.B. Bouker et al. // Oncogene – 2003. – Vol.
22 – P.7316-7339.
32. Jordan, V.C. Targeting antihormone resistance in breast cancer: a simple solution
/ V.C. Jordan // Ann. Oncol. – 2003. – Vol. 14 – P.969-970.
33. Герштейн, Е.С. Биологические маркеры рака молочной железы:
методологические аспекты и клинические рекомендации / Е.С. Герштейн, Н.Е.
Кушлинский // Маммология – 2005. – Vol.1 – P.:65-69.
34. Henderson, B.E. Hormones, Genes and Cancer / B.E. Henderson, B.A.J. Ponder,
R.K. Ross // New York: Oxford University Press – 2003. – P.120-139.
35. Kuukasjärvi, T. Loss of estrogen receptor in recurrent breast cancer is associated
with poor response to endocrine therapy / T. Kuukasjärvi, J. Kononen, H. Helin et al. //
J. Clin. Oncol. – 1996. – Vol. 14, № 9 – P.2584-2589.
36. Bird, A.P. CpG-rich islands and function of DNA methylation / A.P. Bird //
Nature – 1986. – Vol. 321 – P.209-213.
37. Hiraguri, S. Mechanisms of inactication of E-Cadherine in breast cancer cell lines
/ S. Hiraguri, T. Godfrey, H. Nakamura et al. // Cancer Res. – 1998. – Vol. 58 – P.19721977.
38. Dobrovic, A. Methylation of BRCA1 gene in sporadic breast cancer / A.
Dobrovic, D. Simpfendorfer // Cancer Res. – 1997. – Vol. 57 – P.3347-3350.
39. Fujii, H. Methylation of the HIC-1 candidate tumor suppressor gene in human
breast cancer / H. Fujii, M.A. Biel, W. Zhou et al. // Oncogene – 1998. – Vol. 16 –
P.2159-2164.
40. Ottaviano, Y.L. Methylation of the estrogen receptor Cpg island marks loss of
estrogen receptor expression in human breast cancer cells / Y.L. Ottaviano, J.P. Issa,
F.F. Parl et al. // Cancer Res. – 1994. – Vol. 54 – P.2552-2555.
41. Ferguson, A.T. Demethylation of the estrogen receptor gene in estrogen receptornegative breast cancer cells can reactivate estrogen receptor gene expression / A.T.
Ferguson, R.G. Lapidus, S.B. Baylin et al. // Cancer Res. – 1995. – Vol. 55 – P.22792283.
42. Yoshida ,T. Distinct mechanisms of loss of estrogen receptor alpha gene
expression in human breast cancer: methylation of the gene and alteration of trans98
acting factors / T. Yoshida, H. Eguchi, K. Nakachi et al. // Carcinogenesis – 2000. –
Vol. 21, № 12 – P.2193-201.
43. Stoner, M. Hypoxia induces proteasome-dependent degradation of estrogen
receptor alpha in ZR-75 breast cancer cells / M. Stoner, B. Saville, M. Wormke et al. //
Mol. Endocrinol. – 2002. – Vol. 16 – P.2231-2242.
44. Creighton, C.J. Activation of mitogen-activated protein kinase in estrogen
receptor α-positive breast cancer cells in vitro induces an in vivo molecular phenotype
of estrogen receptor α-negative human breast tumors / C.J. Creighton, A.M. Hilger, S.
Murthy et al. // Cancer Res. – 2006. – Vol. 66 – P.3903-3911.
45. Stoica, A. Regulation of estrogen receptor-α gene expression by epidermal
growth factor / A. Stoica et al. // J. Endocrinol. – 2000. - Vol. 65 – P.371-378.
46. Angeloni, S.V. Regulation of estrogen receptor-α expression by the tumor
suppressor gene p53 in MCF-7 cells / S.V. Angeloni, M.B. Martin, P. Garcia-Morales et
al. //J. Endocrinol. - 2004 – Vol. 180 – P.497-504.
47. Martin, M.B. Regulation of estrogen receptor-α expression in MCF-7 cells by
taxol / M.B. Martin., S.V. Angeloni, P. Garcia-Morales et al. // J. Endocrinol. – 2004. –
Vol. 180 – P.487-496.
48. Macaluso, M. pRb2/p130-E2F4/5-HDAC1-SUV39H1-p300 and pRb2/p130E2F4/5-HDAC1-SUV39H1-DNMT1 multimolecular complexes mediate the
transcription of estrogen receptor-alpha in breast cancer / M. Macaluso, C. Cinti, G.
Russo et al. // Oncogene – 2003. – Vol. 22 – P.3511-3517.
49. Mahfoudi, A. Specific mutations in the estrogen receptor change the properties of
antiestrogens to full agonists / A. Mahfoudi, E. Roulet, S. Dauvois et al. // PNAS –
1995. – Vol. 92 – P.4206-4210.
50. MacGregor Schafer, J. Allosteric silencing of activating function 1 in the 4hydroxytamoxifen estrogen receptor complex is induced by substituting glycine for
aspartate at amino acid 351 / J. MacGregor Schafer, H. Liu, D.J. Bentrem et al. //
Cancer Research. – 2000. – Vol. 60 – P.5097-5105.
51. Fuqua, S.A. Expression of wild-type estrogen receptor beta and variant isoforms
in human breast cancer / S.A. Fuqua. R. Schiff, I. Parra et al. // Cancer Research – 1999.
– Vol. 59 – P.5425-5428.
99
52. Fuqua, S.A. Estrogen receptor beta protein in human breast cancer: correlation
with clinical tumor parameters / S.A. Fuqua. R. Schiff, I. Parra et al. // Cancer Research
– 2003. – Vol. 63 – P.2434-2439.
53. Roger, P. Decreased expression of estrogen receptor beta protein in proliferative
preinvasive mammary tumours / P. Roger, M.E. Sahla, S. Makela et al. // Cancer
Research – 2001. – Vol. 61 – P.2537-2541.
54. Speirs, V. Increased expression of estrogen receptor beta mRNA in tamoxifenresistant breast cancer patients / V. Speirs, C. Malone, D.S. Walton, M.J. Kerin, S.L.
Atkin // Cancer Research – 1999. – Vol. 59 – P.5421-5424.
55. Paech, K. Differential ligand activation of estrogen receptors ERalpha and
ERbeta at AP-1 sites / K. Paech, P. Webb, G.G. Kuiper et al. // Science – 1997. – Vol.
277 – P.1508-1510.
56. Johnston, S.R.Changes in estrogen receptor, progesterone receptor, and pS2
expression in tamoxifen-resistant human breast cancer / S.R. Johnston et al. // Cancer
Res. – 1995. – Vol. 55 – P.3331-3338.
57. Gutierrez, M.C. Molecular changes in tamoxifen-resistant breast cancer:
Relationship between estrogen receptor, HER-2, and p38 mitogen-activated protein
kinase / M.C. Gutierrez, et al. // J. Clin. Oncol. – 2005. – Vol. 23 – P.2469-2476.
58. Dowsett, M. Overexpression of HER-2 as a resistance mechanism to hormonal
therapy for breast cancer / M. Dowsett // Endocr. Relat. Cancer. – 2001. – Vol. 8 –
P.191-195.
59. Laenkholm, A.V. ESR1 gene status correlates with estrogen receptor protein
levels measured by ligand binding assay and immunohistochemistry / A.V. Laenkholm,
A. Knoop, B. Ejlertsen et al. // Mol. Oncol. – 2012. – Vol. 6, № 4 – P.428-36.
60. Conway, K. Risk factors for breast cancer characterized by the estrogen receptor
alpha A908G (K303R) mutation / K. Conway, E. Parrish, S.N. Edmiston et al. // Breast
cancer research: BCR – 2007. – Vol. 9, № 3 – R36.
61. De Leeuw, R. A Role for Estrogen Receptor Phosphorylation in the Resistance to
Tamoxifen / R. De Leeuw, J. Neefjes, R. Michalides // Int. J. Breast Cancer – 2011. art. ID 232435.
100
62. Thomas, R. S. Phosphorylation at serines 104 and 106 by Erk1/2 MAPK is
important for estrogen receptor-α activity / R. S. Thomas, N. Sarwar, F. Phoenix et al. //
J. Molecular Endocrinology – 2008. - Vol. 40, № 3-4, P.173-184.
63. Rogatsky I. Potentiation of human estrogen receptor α transcriptional activation
through phosphorylation of serines 104 and 106 by the cyclin A-CDK2 complex / I.
Rogatsky, J.M. Trowbridge, M. J. Garabedian // J. Biological Chemistry – 1999. – Vol.
274, № 32 – P.22296-22302.
64. Michalides, R. Cyclin A is a prognostic indicator in early stage breast cancer with
and without tamoxifen treatment / R.Michalides, H. van Tinteren, A. Balkenende et al.//
British J. Cancer – 2002. – Vol. 86, № 3 – P. 402-408.
65. Likhite, V.S. Kinase-specific phosphorylation of the estrogen receptor changes
receptor interactions with ligand, deoxyribonucleic acid, and coregulators associated
with alterations in estrogen and tamoxifen activity / V. S. Likhite, F. Stossi, K. Kim et
al. // Molecular Endocrinology – 2006. – Vol. 20, № 12 – P.3120-3132.
66. Vendrell, J.A. Molecular changes associated with the agonist activity of hydroxytamoxifen and the hyper-response to estradiol in hydroxy-tamoxifen breast cancer cell
lines / J. A. Vendrell, I. Bieche, C. Desmeiz et al // Endocrine-Related Cancer – 2005. –
Vol. 12, № 1 – P.75-92.
67. Kato, S. Activation of the estrogen receptor through phosphorylation by mitogenactivated protein kinase / S. Kato, H. Endoh, Y. Masuhiro et al.// Science – 1995. – Vol.
270, № 5241 – P.1491-1494.
68. Cheng, J. A functional serine 118 phosphorylation site in estrogen receptor-α is
required for down-regulation of gene expression by 17β-estradiol and 4hydroxytamoxifen / J. Cheng, C. Zhang, D. J. Shapiro // Endocrinology – 2007. – Vol.
148, № 10 – P.4634-4641.
69. Weitsman, G. E. Estrogen receptor-α phosphorylated at Ser118 is present at the
promoters of estrogen-regulated genes and is not altered due to HER-2 overexpression /
G. E. Weitsman, L. Li, G. P. Skliris et al.// Cancer Research – 2006., Vol. 66, № 20 –
P.10162-10170.
70. Chen, D. Activation of estrogen receptor α by S118 phosphorylation involves a
ligand-dependent interaction with TFIIH and participation of CDK7 / D. Chen, T. Riedl,
E. Washbrook et al.// Molecular Cell – 2000. – Vol. 6, №1 – P.127-137.
101
71. Morandi, A. RET in breast cancer: functional and therapeutic implications / A.
Morandi, I. Plaza-Menacho, C. M. Isacke // Trends Molecular Medicine – 2011. –Vol.
17, № 3 – P.149-157.
72. Duplessis, T.T. Phosphorylation of estrogen receptor α at serine 118 directs
recruitment of promoter complexes and gene-specific transcription / T.T. Duplessis,
C.C. Williams, S.M. Hill et al. // Endocrinology – 2011 - Vol. 152, №6 – P.2517–2526.
73. Kok, M. Estrogen receptor-α phosphorylation at serine-118 and tamoxifen
response in breast cancer / M. Kok, C. Holm-Wigerup, M. Hauptmann et al.// J.
National Cancer Institute – 2009. – Vol. 101, №24 – P.1725-1729.
74. Sarwar, N. Phosphorylation of ERα at serine 118 in primary breast cancer and in
tamoxifen-resistant tumours is indicative of a complex role for ERα phosphorylation in
breast cancer progression / N. Sarwar, J. S. Kim, J. Jiang et al. // Endocrine-Related
Cancer – 2006 – Vol. 13, № 3 – P.851-861.
75. Martin, M. B. A role for Akt in mediating the estrogenic functions of epidermal
growth factor and insulin-like growth factor I / M. B.Martin, T. F. Franke, G. E. Stoica
et al.// Endocrinology – 2000ю – Vol. 141, №12 - P.4503-4511.
76. Joel, P. B. pp90rsk1 regulates estrogen receptor-mediated transcription through
phosphorylation of Ser-167 / P. B. Joel, J. Smith, T. W. Sturgill et al. // Mol. Cell.
Biology – 1998. – Vol. 18, №4 - P.1978-1984.
77. Yamashita, H. Phosphorylation of estrogen receptor alpha serine 167 is predictive
of response to endocrine therapy and increases postrelapse survival in metastatic breast
cancer / H. Yamashita, M.Nishio, S. Kobayashi et al.// Breast Cancer Research – 2005.
– Vol. 7, №5 – P.R753-764.
78. Arnold, S. F. Serine 167 is themajor estradiol-induced phosphorylation site on the
human estrogen receptor / S. F. Arnold, J. D. Obourn, H. Jaffe et al. // Molecular
Endocrinology – 1994. – Vol. 8, № 9 – P.1208-1214.
79. Kirkegaard, T. AKT activation predicts outcome in breast cancer patients treated
with tamoxifen / T. Kirkegaard, C. J. Witton, L. M. McGlynn, et al.// J. Pathology –
2005. – Vol. 207, № 2 – P.139-146.
80. Yamashita, H. Low phosphorylation of estrogen receptor α (ERα) serine 118 and
high phosphorylation of ERα serine 167 improve survival in ER-positive breast cancer /
H. Yamashita, M. Nishio, T. Toyama et al.// Endocrine-Related Cancer – 2008. – Vol.
15, №3 – P.755-763.
102
81. Williams, C.C. Identification of four novel phosphorylation sites in estrogen
receptor α: impact on receptor-dependent gene expression and phosphorylation by
protein kinase CK2 / C.C. Williams, A. Basu, A. El-Gharbawy et al. // BMC
Biochemistry – 2009. – Vol. 10, № 1 – Article 36.
82. Skliris, G. P. A phosphorylation code for oestrogen receptor-α predicts clinical
outcome to endocrine therapy in breast cancer / G.P. Skliris, Z.J. Nugent, B.G. Rowan
et al. // Endocrine-Related Cancer – 2010. – Vol. 17, №3 – P.589-597.
83. Barone, I. Estrogen receptor mutations and changes in downstream gene
expression and signaling / I. Barone, L. Brusco, S. A. W. Fuqua // Clinical Cancer
Research – 2010. – Vol. 16, №10 – P.2702-2708.
84. Holm, C. Phosphorylation of the oestrogen receptor α at serine 305 and prediction
of tamoxifen resistance in breast cancer / C.Holm, M. Kok, R.Michalides et al.// J.
Pathology – 2009. – Vol. 217, №3 – P.372-379.
85. Kok, M. PKA-induced phosphorylation of ERα at serine 305 and high PAK1
levels is associated with sensitivity to tamoxifen in ER-positive breast cancer / M. Kok,
W. Zwart, C. Holm et al.// Breast Cancer Research and Treatment – 2011. – Vol. 125,
№1 – P.1-12.
86. Bostner, J. Estrogen receptor-α phosphorylation at serine 305, nuclear p21activated kinase 1 expression, and response to tamoxifen in postmenopausal breast
cancer / J. Bostner, L. Skoog, T. Fornander et al. // Clinical Cancer Research – 2010. –
Vol. 16, Ή5 – P.1624-1633.
87. Wijayaratne, A. L. The human estrogen receptor-α is a ubiquitinated protein
whose stability is affected differentially by agonists, antagonists, and selective estrogen
receptormodulators / A. L.Wijayaratne, D. P. McDonnell // J. Biological Chemistry –
2001. – Vol. 276, №38 - P.35684-35692.
88. Eakin, C. M. Estrogen receptor α is a putative substrate for the BRCA1 ubiquitin
ligase / C. M. Eakin, M. J. MacCoss, G. L. Finney et al. // Proceedings of the National
Academy of Sciences of the United States of America – 2007. – Vol. 104, №14 –
P.5794-5799.
89. Cui, Y. Phosphorylation of estrogen receptor α blocks its acetylation and
regulates estrogen sensitivity / Y. Cui, M. Zhang, R. Pestell et al. // Cancer Research –
2004. – Vol. 64, №24 – P.9199-9208.
103
90. Giordano, C. Growth factor-induced resistance to tamoxifen is associated with a
mutation of estrogen receptor α and its phosphorylation at serine 305 / C. Giordano, Y.
Cui, I. Barone et al.// Breast Cancer Research and Treatment – 2010. – Vol. 119, №1 –
P.71-85.
91. Wang, R.A. P21-activated kinase-1 phosphorylates and transactivates estrogen
receptor-alpha and promotes hyperplasia in mammary epithelium / R.A. Wang, A.
Mazumdar, R.K. Vadlamudi et al. // EMBO J. – 2002. – Vol. 21 – P.5437-5447.
92. Michalides, R. Tamoxifen resistance by a conformational arrest of the estrogen
receptor α after PKA activation in breast cancer / R.Michalides, A. Griekspoor, A.
Balkenende et al. // Cancer Cell – 2004. – Vol. 5, №6 – P.597-605.
93. Rayala, S.K. P21-activated kinase 1 regulation of estrogen receptor-α activation
involves serine 305 activation linked with serine 118 phosphorylation / S.K. Rayala,
A.H. Talukder, S. Balasenthil et al.// Cancer Research – 2006. – Vol. 66, №3 – P.16941701.
94. Gururaj, A.E. p21-activated kinase signaling in breast cancer /A.E. Gururaj, S.K.
Rayala, R. Kuma // Breast Cancer Res. – 2005. – Vol.7 – P.5-12.
95. Bostner, J. Amplification of CCND1 and PAK1 as predictors of recurrence and
tamoxifen resistance in postmenopausal breast cancer / J. Bostner, M. A. Waltersson, T.
Fornander et al. // Oncogene – 2007. – Vol. 26, №49 – P.6997-7005.
96. Arnold, S. F. Estradiol-binding mechanism and binding capacity of the human
estrogen receptor is regulated by tyrosine phosphorylation / S. F. Arnold, M. Melamed,
D. P. Vorojeikina et al. // Molecular Endocrinology – 1997. – Vol. 11, №1 – P.48-53.
97. Skafar, D. F. Formation of a powerful capping motif corresponding to start of
”Helix 12” in agonist-bound estrogen receptor-α contributes to increased constitutive
activity of the protein / D. F. Skafar // Cell Biochemistry and Biophysics – 2000. – Vol.
33, №1 – P.53-62.
98. Zhang, Q. X. An estrogen receptor mutant with strong hormone-independent
activity from a metastatic breast cancer /Q. X. Zhang, A. Borg, D. M.Wolf et al. //
Cancer Research – 1997. - Vol. 57, №7 – P.1244-1249.
99. Берштейн, Л.М. Современная эндокринология гормонозависимых опухолей
/ Л.М. Берштейн // Вопросы онкологии – 2002. – Т. 48, № 4 – С.496-504.
104
100. Красильников, М.А. Сигнальные пути, регулируемые фосфатидилинозит-3киназой, и их значение для роста, выживаемости и злокачественной
трансформации клеток/ М.А. Красильников // Биохимия – 2000 – Т. 65, №1 – C.6878.
101. Kurebayashi, J. Endocrine-resistant breast cancer: underlying mechanisms and
strategies for overcoming resistance / J. Kurebayashi // Breast Cancer – 2003. – Vol. 10,
№2 – P.112-119.
102. Roop, R.P. Endocrine resistance in breast cancer: molecular pathways and
rational development of targeted therapies / R.P. Roop, C.X. Ma // Future Oncol. –
2012. – Vol. 8, № 3 – P.273-292.
103. Щербаков, А.М. Молекулярные механизмы гормональной резистетности
рака молочной железы / А.М. Щербаков, М.А. Красильников, Н.Е. Кушлинский //
Бюллетень экспериментальной биологии и медицины – 2013. – №3 – С.363-376.
104. Павличенко, О.В. Молекулярный механизм адаптации злокачественных
опухолей к гормональным препаратам: роль фосфатидилинозит-3-киназы и
фосфоинозитидзависимых белков / О.В. Павличенко, В.А. Шатская, Е.В. Лузай и
др. // Вестник Российской Академии медицинских наук – 2004. – N 12 – С.20-25.
105. Mendelsohn, J. Status of epidermal growth factor receptor antagonists in the
biology and treatment of cancer / J. Mendelsohn, J. Baselga // J. Clin. Oncol. – 2003. –
Vol. 21 – P.2787-2799.
106. Eccles, S.A. The epidermal growth factor receptor/Erb-B/HER family in normal
and malignant breast biology / S.A. Eccles // Int. J. Dev Biol. – 2011. – Vol. – P.685696.
107. Schulze, W.X. Phosphotyrosine interactome of the ErbB-receptor kinase family /
W.X. Schulze, L. Deng, M. Mann // Mol. Syst. Biol. – 2005. – Vol.1 – P.2005-2008.
108. Kandasamy, K. NetPath: A public resource of curated signal transduction
pathways / K. Kandasamy et al.// Genome Biology – 2010. – Vol. 11 – P.R3.
109. Assiddiq, B.F. EGFR S1166 phosphorylation induced by a combination of EGF
and gefitinib has a potentially negative impact on lung cancer cell growth / B.F.
Assiddiq, K.Y. Tan, W. Toy et al. // Proteome Res. – 2012. – Vol. 11, № 8 – P.41104119.
105
110. Zarich, N. Grb2 is a negative modulator of the intrinsic Ras-GEF activity of
hSos1 / N. Zarich, J.L. Oliva, N. Martínez, et al.// Mol. Biol. Cell – 2006. – Vol. 17, №
8, P.3591-3597.
111. Cargnello, M. Activation and Function of the MAPKs and Their Substrates, the
MAPK-Activated Protein Kinases / M. Cargnello, P.P. Roux. // Microbiol. Mol. Biol.
Rev. – 2011. – Vol 75, № 1, P.50-83.
112. Nebl,T. Membrane cytoskeleton: PIP(2) pulls the strings / T. Nebl, S.W. Oh, E.J.
Luna //Current Biology – 2000. – Vol. 10 – P.R351-R354.
113. Song, G. The activation of Akt/PKB signaling pathway and cell survival / G.
Song, G. Ouyang, S. Bao // J. Cell. Mol. Med. – 2005. – Vol. 9, № 1, P.59-71.
114. Hahn-Windgassen, A. Akt Activates the Mammalian Target of Rapamycin by
Regulating Cellular ATP Level and AMPK Activity / A. Hahn-Windgassen, V.
Nogueira, C. Chen et al. // J Biol Chem. – 2005. – Vol. 280, № 37 – P.32081-32089.
115. Fingar, D.C. mTOR controls cell cycle progression through its cell growth
effectors S6K1 and 4E-BP1/eukaryotic translation initiation factor 4E // D.C. Fingar,
C.J. Richardson, A.R. Tee et al. // Mol. Cell Biol. – 2004. – Vol. 24, №1 – P.200-216.
116. Heidi, C.E. Phosphoinositide 3-kinase-dependent activation of Rac / C.E. Heidi,
W. Welcha, J. Coadwellb et al. // FEBS Letters – 2003. – Vol. 546 – P.93-97.
117. Wahl, M. Selective phospholipase C activation / M. Wahl, G. Carpenter //
Bioassays – 1991. – Vol. 13 P.107-113.
118. La Porta, C.A. PKC-dependent modulation of IkB alpha-NFkB pathway in low
metastatic B16F1 murine melanoma cells and in highly metastatic BL6 cells / C.A. La
Porta, R. Comolli // Anticancer Res. – 1998. – Vol. 18, № 4A – P.2591-7.
119. Brand, D. Protein Kinase C Induces Actin Reorganization via a Src- and Rhodependent Pathway / D. Brand, M. Gimona, M. Hillmann et al. // J. Biological
Chemistry – 2002. – Vol. 277 – P.20903-20910.
120. Sainsbury, J.R. Epidermal-growth-factor receptor status as predictor of early
recurrence of and death from breast cancer / J.R. Sainsbury, J.R. Farndon, G.K.
Needham et al. // Lancet – 1987. – Vol. 1 – P.1398-1402.
121. Salomon, D.S. Epidermal growth factor-related peptides and their receptors in
human malignancies / D.S. Salomon, R. Brandt, F. Ciardiello et al. // Crit. Rev. Oncol.
Hematol. – 1995. – Vol. 19 – P.183-232.
106
122. Lurje, G. EGFR signaling and drug discovery / G. Lurje, H.J. Lenz // Oncology –
2009. – Vol. 77 – P.400-410.
123. Martinazzi, M. Relationships between epidermal growth factor receptor (EGF-R)
and other predictors of prognosis in breast carcinomas. An immunohistochemical study
/ M. Martinazzi, F. Crivelli, C. Zampatti et al. // Pathologica – 1993. – Vol. 85. – P.
637-644.
124. Menard, S. HER-2-positive breast carcinomas as a particular subset with peculiar
clinical behaviors / S. Menard, A. Balsari, P. Casalini et al.// Clin. Cancer Res. – 2002.
– Vol. 8 – P.520-525.
125. Burness, M.L. Epidermal growth factor receptor in triplenegative and basal-like
breast cancer: promising clinical target or only a marker? / M.L. Burness, T.A. Grushko,
O.I. Olopade // Cancer J. – 2010 – Vol. 16 – P.23-32.
126. Rakha, E.A. Prognostic markers in triple-negative breast cancer / E.A. Rakha,
M.E. El-Sayed, A.R. Green et al. // Cancer – 2007. – Vol. 109 – P.25-32.
127. Giltnane, J.M. Rationale for Targeting the Ras/MAPK Pathway in TripleNegative Breast Cancer / J.M. Giltnane, J.M. Balko // Discov. Med. – 2014. – Vol. 17,
№ 95 – P.275-283.
128. Al-Kuraya, K. Prognostic relevance of gene amplifications and coamplifications
in breast cancer / K. Al-Kuraya, P. Schraml, J. Torhorst et al.// Cancer Res. – 2004. –
Vol. 64 – P.8534-8540.
129. Ro, J. Amplified and overexpressed epidermal growth factor receptor gene in
uncultured primary human breast carcinoma / J. Ro, S.M. North, G.E. Gallick et al. //
Cancer Res. – 1988. – Vol. 48 – P.161-164.
130. Spyratos, F. Epidermal growth factor receptors and prognosis in primary breast
cancer / F. Spyratos, J.C. Delarue, C. Andrieu et al. // Breast Cancer Res. Treat. – 1990.
– Vol. 17 – P.83-89.
131. Reis-Filho, J.S. EGFR amplification and lack of activating mutations in
metaplastic breast carcinomas / J.S. Reis-Filho, C. Pinheiro, M.B. Lambros et al. // J.
Pathol. – 2006. – Vol. 209 – P.445-453.
132. Bhargava, R. EGFR gene amplification in breast cancer: correlation with
epidermal growth factor receptor mRNA and protein expression and HER-2 status and
107
absence of EGFR-activating mutations / R. Bhargava, W.L. Gerald, A.R. Li et al.//
Mod. Pathol. – 2005. – Vol. 18 – P.1027-1033.
133. Weber, F. Variability in organspecific EGFR mutational spectra in tumour
epithelium and stroma may be the biological basis for differential responses to tyrosine
kinase inhibitors / F. Weber, K. Fukino, T. Sawada et al.// Br. J. Cancer. – 2005. – Vol.
92 – P.1922-1926.
134. Baselga, J. Targeting the Phosphoinositide-3 (PI3) Kinase Pathway in Breast
Cancer / J. Baselga // The Oncologist – 2011. – Vol.16, Supplement 1 – P.12-19.
135. Von Lintig, F.C. Ras activation in human breast cancer / F.C. Von Lintig, A.D.
Dreilinger, N.M. Varki et al. // Breast Cancer Res Treat. – 2000. – Vol. 62, №1 – P.5162.
136. Niemitz, E. Ras pathway activation in breast cancer / E. Niemitz // Nature
Genetics – 2013. – Vol. 45 – P.1273.
137. Sivaraman, V.S. Hyperexpression of mitogen-activated protein kinase in human
breast cancer / V.S. Sivaraman, H. Wang, G.J. Nuovo et al. // J. Clin. Invest. – 1997 –
Vol. 99, № 7, P.1478-1483.
138. Wang, Z. Expression of extracellular signal-regulated kinase and its relationship
with clinicopathological characteristics of breast cancer /Z. Wang, S. Wang, F. Zhu et
al. // Zhonghua Zhong Liu Za Zhi – 2002. – Vol. 24, № 4 – P.360-363.
139. Callans, L.S. Raf-1 protein expression in human breast cancer cells / L.S. Callans,
H. Naama, M. Khandelwal et al. / Ann. Surg. Oncol. – 1995. – Vol. 2, № 1 – P.38-42.
140. Sainsbury, J.R. Epidermal growth factor receptor status of histological sub-types
of breast cancer / J.R. Sainsbury, S. Nicholson, B. Angus et al. // Br J Cancer – 1988. –
Vol. 58 – P.458-460.
141. Ozawa, S. Prognostic significance of epidermal growth factor receptor in
esophageal squamous cell carcinomas / S. Ozawa, M. Ueda, N. Ando et al. // Cancer –
1989. – Vol. 63 – P.2169-2173.
142. Viale, G. Invasive ductal carcinoma of the breast with the "triple-negative"
phenotype: prognostic implications of EGFR immunoreactivity / G. Viale, N.
Rotmensz, P. Maisonneuve et al.// Breast Cancer Res Treat. – 2009. – Vol. 116 – P.317328.
108
143. Doehn, U. RSK is a principal effector of the RAS-ERK pathway for eliciting a
coordinate promotile/invasive gene program and phenotype in epithelial cells / U.
Doehn, C. Hauge, S.R. Frank, C.J. Jensen, K. Duda, J.V. Nielsen, et al.// Mol Cell. –
2009 – Vol. 35 – P.511-522.
144. Xie, L. Activation of the Erk pathway is required for TGF-beta1-induced EMT in
vitro / L. Xie, B.K. Law, A.M. Chytil et al. // Neoplasia – 2004. – Vol. 6 – P.603-610.
145. Nicholson, R.I. Growth factor signalling in endocrine and anti-growth factor
resistant breast cancer / R.I.Nicholson, I.R. Hutcheson, H.E. Jones et al. // Rev. Endocr.
Metab. Disord. – 2007. – Vol. 8 – P.241-253.
146. Benz, C.C.Estrogen-dependent, tamoxifen-resistant tumorigenic growth of MCF7 cells transfected with HER2/neu / C.C. Benz, G.K. Scott, J.C. Sarup et al. // Breast
Cancer Res. Treat. – 1992. – Vol. 24 – P.85-95.
147. Chung, Y.L. Resistance to tamoxifen-induced apoptosis is associated with direct
interaction between Her2/neu and cell membrane estrogen receptor in breast cancer.
Y.L. Chung, M.L. Sheu, S.C. Yang et al. // Int. J. Cancer – 2002. – Vol. 97 – P.306-312.
148. Massarweh, S. Mechanisms of tumor regression and resistance to estrogen
deprivation and fulvestrant in a model of estrogen receptor-positive, HER-2/neupositive breast cancer / S. Massarweh, C.K. Osborne, S. Jiang et al. // Cancer Res. –
2006. – Vol. 66 – P.8266-8273.
149. Chen, A.C.Upregulation of mucin4 in ER-positive/HER2-overexpressing breast
cancer xenografts with acquired resistance to endocrine and HER2-targeted therapies /
A.C. Chen, I. Migliaccio, M. Rimawi et al.// Breast Cancer Res. Treat. – 2012. – Vol.
134 – P.583-593.
150. Shou, J. Mechanisms of tamoxifen resistance: Increased estrogen receptorHER2/neu cross-talk in ER/HER2-positive breast cancer / J. Shou, S. Massarweh, C.K.
Osborne et al. // J. Natl. Cancer Inst. – 2004. – Vol. 96 – P.926-935.
151. Li, J. PTEN, a putative protein tyrosine phosphatase gene mutated in human
brain, breast, and prostate cancer / J. Li, C. Yen, D. Liaw, K. Podsypanina et al.//
Science – 1997. – Vol. 275 – P.1943-1947.
152. Miller, T.W. Loss of Phosphatase and Tensin homologue deleted on chromosome
10 engages ErbB3 and insulin-like growth factor-I receptor signaling to promote
antiestrogen resistance in breast cancer / T.W. Miller, M. Perez-Torres, A. Narasanna et
al.// Cancer Res. – 2009. – Vol. 69 – P.4192-4201.
109
153. Miller, T.W. Mutations in the phosphatidylinositol 3-kinase pathway: Role in
tumor progression and therapeutic implications in breast cancer / T.W. Miller, B.N.
Rexer, J.T. Garrett et al. // Breast Cancer Res. – 2011. – Vol. 13 – P.224.
154. Clark, A.S. Constitutive and inducible Akt activity promotes resistance to
chemotherapy, trastuzumab, or tamoxifen in breast cancer cells / A.S. Clark, K. West, S.
Streicher et al. // Mol. Cancer Ther. – 2002. – Vol. 1 – P.707-717.
155. Шатская, В.А. Роль фосфатидилинозитольного сигнального пути в развитии
в развитии гормональной резистентности опухолевых клеток / В.А. Шатская,
М.А. Красильников // Вопросы онкологии – 2001. – Т. 2 – С.218-223.
156. Generali, D. Phosphorylated ER{alpha}, HIF-1{alpha}, and MAPK signaling as
predictors of primary endocrine treatment response and resistance in patients with breast
cancer / D. Generali, F.M. Buffa, A. Berruti et al. // J. Clin. Oncol. – 2009. – Vol. 27 –
P. 227-234.
157. Rody, A. Use of goserelin in the treatment of breast cancer / A. Rody, S. Loibl,
G. Von Minckwitz et al. // Expert Rev. Anticancer Ther. – 2005., Vol. 5, № 4, P.591604.
158. Harvey, H.A. Medical castration produced by the GnRH analogue leuprolide to
treat metastatic breast cancer / H.A. Harvey, A. Lipton, D.T. Max et al. // J. Clin.
Oncol. – 1985. – Vol. 3, № 8 – P.1068-1072.
159. Cuzick, J. Anastrozole for prevention of breast cancer in high-risk
postmenopausal women (IBIS-II): an international, double-blind, randomised placebocontrolled trial /J. Cuzick et al.// Lancet – 2014. – Vol. 383, № 9922 – P.1041-1048.
160. Dombernowsky, P. Letrozole, a new oral aromatase inhibitor for advanced breast
cancer: double-blind randomized trial showing a dose effect and improved efficacy and
tolerability compared with megestrol acetate / P. Dombernowsky P, et al.// J. Clin.
Oncol. – 1998. – Vol. 16, №2 – P.453-461.
161. Deeks, E.D. Exemestane: a review of its use in postmenopausal women with
breast cancer / E.D. Deeks, L.J. Scott // Drugs – 2009. – Vol. 69, №7 – P.889-918.
162. Bentrem, D.J. Tamoxifen, raloxifene and the prevention of breast cancer / D.J.
Bentrem, V. Craig Jordan // Minerva Endocrinol. – 2002. – Vol. 27, №2, P.127-39.
163. Johnston, S.J. Fulvestrant - a novel endocrine therapy for breast cancer / S.J.
Johnston, K.L. Cheung // Curr. Med. Chem. – 2010. – Vol. 17, №10, P.902-14.
110
164. Vogel, V.G. Effects of tamoxifen vs raloxifene on the risk of developing invasive
breast cancer and other disease outcomes: the NSABP Study of Tamoxifen and
Raloxifene (STAR) P–2 trial / V.G. Vogel, J.P. Costantino, D.L. Wickerham et al.//
JAMA – 2006. – Vol. 295, №23, P.2727-2741.
165. Garcia-Becerra, R. Mechanisms of Resistance to Endocrine Therapy in Breast
Cancer: Focus on Signaling Pathways, miRNAs and Genetically Based Resistance / R.
Garcia-Becerra, N. Santos, L. Diaz et al. // Int. J. Mol. Sci. – 2013. – Vol. 14 – P.108145.
166. Герштейн, Е.С. Рецепторы семейства c-erbB как мишени молекулярнонаправленной противоопухолевой терапии: достижения, проблемы, перспективы /
Е.С. Герштейн, Н.Е. Кушлинский, М.И. Давыдов // Молекулярная медицина –
2010. – Т. 4 – С.5-10.
167. Ганьшина, И.П. Применение Герцептина в неоадъювантном и адъювантном
лечении больных раком молочной железы с гиперэкспрессией HER2 / И.П.
Ганьшина // Фарматека. Спецвыпуск АSСО – 2007. - С. 13-17
168. Красильников, М.А. Сигнальный путь mTOR: новая мишень терапии
опухолей / М.А. Красильников, Н.В. Жуков // Современная онкология – 2010. – Т.
12, №2 – C.9-16.
169. Miller, T.W. Hyperactivation of phosphatidylinositol-3 kinase promotes escape
from hormone dependence in estrogen receptor-positive human breast cancer / T.W.
Miller, B.T. Hennessy, A.M. Gonzalez-Angulo et al. // J. Clin. Invest. – 2010. – Vol.
120 – P.2406-2413.
170. Johnston, S. Lapatinib combined with letrozole versus letrozole and placebo as
first-line therapy for postmenopausal hormone receptor-positive metastatic breast cancer
/ S. Johnston, J. Jr. Pippen, X. Pivot et al. // J. Clin. Oncol. – 2009. – Vol. 27 – P.55385546.
171. Evans, A.H. EGFR/HER2 inhibitor AEE788 increases ER-mediated transcription
in HER2/ER-positive breast cancer cells but functions synergistically with endocrine
therapy / A.H. Evans, S. Pancholi, I. Farmer et al. // Br. J. Cancer – 2010. – Vol. 102 –
P.1235–1243.
172. Creighton, C.J. Proteomic and transcriptomic profiling reveals a link between the
PI3K pathway and lower estrogen-receptor (ER) levels and activity in ER+ breast
111
cancer / C.J. Creighton, X. Fu, B.T. Hennessy, A.J. Casa et al.// Breast Cancer Res. –
2010. – Vol. 12 – P.R40.
173. Zhao, Z.S. PAK family kinases: Physiological roles and regulation / Z.S. Zhao, E.
Manser // Cellular Logistics – 2012. – Vol. 2, №2 – P.59–68.
174. Poitras, L. PAK interacts with NCK and MLK2 to regulate the activation of jun
N-terminal kinase / L. Poitras, S. Jean, N. Islam et al. // FEBS Letters – 2003. –Vol.
543, Issues 1–3 – P.129-135.
175. Puto, L.A. p21-activated kinase 1 (PAK1) interacts with the Grb2 adapter protein
to couple to growth factor signaling / L.A. Puto, K. Pestonjamasp, C.C. King et al. // J.
Biol. Chem. – 2003. – Vol. 278, №11, P.9388-9393.
176. Callow, M.G. PAK4 mediates morphological changes through the regulation of
GEF-H1 / M.G. Callow, S. Zozulya, M.L. Gishizky et al. / J. Cell Sci. – 2005. – Vol.
118 – P.1861-72.
177. Zenke, F.T. Identification of a central phosphorylation site in p21-activated
kinase regulating autoinhibition and kinase activity / F.T. Zenke, C.C. King CC, B.P.
Bohl, G.M. Bokoch // J. Biol. Chem. – 1999. – Vol. 274 – P.32565-32573.
178. Bokoch, G.M. A GTPase-independent mechanism of p21-activated kinase
activation. Regulation by sphingosine and other biologically active lipids / G.M.
Bokoch, A.M. Reilly, R.H. Daniels et al.// J. Biol. Chem. – 1998. – Vol. 273, P.81378144.
179. Strochlic, T.I. Phosphoinositides are essential co-activators for p21-activated
kinase 1 (PAK1) / T.I. Strochlic, J. Viaud, U.E. Rennefahrt et al. // Mol. Cell. – 2010. –
Vol. 40, №3 – P.493-500.
180. Bokoch, G.M. Interaction of the Nck adapter protein with p21-activated kinase
(PAK1) / G.M. Bokoch, Y. Wang, B.P. Bohl et al. // J Biol Chem – 1996. – Vol. 271 –
P.25746-25749.
181. Yang, Y. Activation of Rac1-PI3K/Akt is required for epidermal growth factorinduced PAK1 activation and cell migration in MDA-MB-231 breast cancer cells / Y.
Yang, J. Du, Z. Hu et al. // J. Biomed. Res. – 2011. – Vol. 25, №4 – P.237-245.
182. Malecka, K.A. Face-to-face, PAK-to-PAK / K.A. Malecka, J.R. Peterson//
Structure – 2011. – Vol. 19 – P.1723-1724.
112
183. Chong, C. The mechanism of PAK activation. Autophosphorylation events in
both regulatory and kinase domains control activity / C. Chong, L. Tan, L. Lim et al. //
J. Biol. Chem. – 2001. – Vol. 276 – P.17347-17353.
184. Zhao, Z.S. Interaction between PAK and nck: a template for Nck targets and role
of PAK autophosphorylation / Z.S. Zhao, E. Manser, L. Lim // Mol. Cell. Biol. – 2000.
– Vol. 20 – P.3906-3917.
185. Zhao, Z.S. A conserved negative regulatory region in alphaPAK: inhibition of
PAK kinases reveals their morphological roles downstream of Cdc42 and Rac1 / Z.S.
Zhao, E. Manser, X.Q. Chen et al. // Mol. Cell. Biol. – 1998. – Vol. 18 – P.2153-2163.
186. Ng, Y.W. Why an A-loop phosphomimetic fails to activate PAK1: understanding
an inaccessible kinase state by molecular dynamics simulations / Y.W. Ng, D.
Raghunathan, P.M. Chan et al.// Structure – 2010. – Vol. 18 – P.879-890.
187. Manser, E. A brain serine/threonine protein kinase activated by Cdc42 and Rac1 /
E. Manser, T. Leung, H. Salihuddin et al. // Nature – 1994. – Vol. 367, № 6458 – P.4046.
188. Etienne-Manneville, S. Rho GTPases in cell biology / S. Etienne-Manneville, A.
Hall // Nature – 2002. – Vol. 420 – P.629-635.
189. Ridley, A.J. Rho GTPases and actin dynamics in membrane protrusions and
vesicle trafficking / A.J. Ridley // Trends Cell Biol. – 2006. – Vol. 16 – P.522-529.
190. Cherfils, J. Regulation of small GTPases by GEFs, GAPs, and GDIs / J. Cherfils,
M. Zeghouf // Physiol. Rev. – 2013. – Vol. 93, №1 – P.269-309.
191. Rossman, K.L. GEFs means go: turning on Rho-GTPases with guanine
nucleotide-exchange factors / K.L. Rossman, C.J. Der, J. Sondek // Nature Reviews
Molecular Cell Biology – 2005. – P.167-180.
192. Hoffman, G.R. Signaling to the Rho GTPases: networking with the DH domain /
G.R. Hoffman, R.A.Cerione // FEBS Lett. – 2002. – Vol. 513, №1 – P.85-91.
193. Rossman, K.L. Multifunctional roles for the PH domain of Dbs in regulating Rho
GTPase activation / K.L. Rossman et al.// J. Biol. Chem. – 2003. – Vol. 278 – P.1839318400.
194. Kubiseski, T.J. Functional analysis of the Caenorhabditis elegans UNC-73B PH
domain demonstrates a role in activation of the Rac GTPase in vitro and axon guidance
113
in vivo / T.J. Kubiseski, J. Culotti, T. Pawson // Mol. Cell. Biol. – 2003. – Vol. 23 –
P.6823-6835.
195. Fleming, I.N. Regulation of the Rac1-specific exchange factor Tiam1 involves
both phosphoinositide 3-kinase-dependent and -independent components / I.N. Fleming,
A. Gray, C.P. Downes // Biochem J. – 2000. – Vol. 351, Pt1 – P.173-182.
196. Mertens, A.E. Regulation of Tiam1-Rac signalling / A.E. Mertens, R.C. Roovers,
J.G. Collard // FEBS Lett. – 2003. – Vol. 546 – P.11-16.
197. Baird, D. The Cool-2/alpha-Pix protein mediates a Cdc42-Rac signaling cascade /
D. Baird, Q. Feng, R.A. Cerione // Curr. Biol. – 2005. – Vol. 15, № 1 – P.1-10.
198. Cotteret, S. PAK GITs to Aurora-A / S. Cotteret, J. Chernoff // Dev. Cell. – 2005.
– Vol. 9, №5 – P.573-574.
199. Feng, Q. Novel regulatory mechanisms for the Dbl family guanine nucleotide
exchange factor Cool-2/alpha-Pix / Q. Feng, D. Baird, R.A. Cerione // EMBO J. – 2004.
– Vol. 23, № 17 – P.3492-3504.
200. Rosenberger, G. Interaction of αPIX (ARHGEF6) with β-parvin (PARVB)
suggests an involvement of αPIX in integrin-mediated signaling / G. Rosenberger, I.
Jantke, A. Gal, K. Kutsche // Human Molecular Genetics – 2003. – Vol. 12, № 2 – P.
155-167.
201. Kutsche, K. Mutations in ARHGEF6, encoding a guanine nucleotide exchange
factor for Rho GTPases, in patients with X-linked mental retardation / K. Kutsche, et
al.// Nat. Genet. – 2000. – Vol. 26, №2 – P.247-50.
202. Feng, Q. Regulation of the Cool/Pix proteins: key binding partners of the
Cdc42/Rac targets, the p21-activated kinases / Q. Feng, J.G. Albeck, R.A. Cerione et al.
// J. Biol. Chem. – 2002. – Vol. 277, №7 – P.5644-5650.
203. Rennefahrt, U.E. Specificity Profiling of PAK Kinases Allows Identification of
Novel Phosphorylation Sites / U.E. Rennefahrt, S.W. Deacon, S.A. Parker et al. // J.
Biol. Chem. – 2007. – Vol. 282, № 21 – P.15667-15678.
204. King, C.C. p21-activated kinase (PAK1) is phosphorylated and activated by 3phosphoinositide-dependent kinase-1 (PDK1) / C.C. King, E.M. Gardiner, F.T. Zenke et
al. // J. Biol. Chem. – 2000. – Vol. 275, № 52 – P.41201-41209.
114
205. Howe, A.K. Regulation of anchorage-dependent signal transduction by protein
kinase A and p21-activated kinase / A.K. Howe, R.L. Juliano // Nat. Cell Biol. – 2000. –
Vol. 2, № 9 – P.593-600.
206. Zhou, G.L. Akt phosphorylation of serine 21 on PAK1 modulates Nck binding
and cell migration / G.L. Zhou, Y. Zhuo, C.C. King, B.H. Fryer, G.M. Bokoch, J. Field
// Mol. Cell Biol. – 2003. – Vol. 23, № 22 – P.8058-8069.
207. Bokoch, G.M. Biology of the p21-activated kinases / G.M. Bokoch // Ann. Rev.
Biochem. – 2003. – Vol. 72 – P.743-781.
208. Hoefen, R.J. The multifunctional GIT family of proteins / R.J. Hoefen, B.C. Berk
// J. Cell Sci. – 2006. – Vol. 119 – P.1469-1475.
209. Kumar, R. p21-activated kinases in cancer / R. Kumar, A.E. Gururaj, C.J. Barnes
// Nature Reviews Cancer – 2006. – Vol. 6 – P.459-471.
210. Beeser, A. Role of group A p21-activated kinases in activation of extracellularregulated kinase by growth factors / A. Beeser, Z.M. Jaffer, C. Hofmann et al. // J. Biol.
Chem. – 2005. – Vol. 280, № 44 – P.36609-36615.
211. Gallagher, E.D. Binding of JNK/SAPK to MEKK1 is regulated by
phosphorylation / E.D. Gallagher, S. Xu, C. Moomaw et al. // J. Biol. Chem. – 2002. –
Vol. 277, №48 – P.45785-45792.
212. Slack-Davis, J.K. PAK1 phosphorylation of MEK1 regulates fibronectinstimulated MAPK activation stimulated MAPK activation / J.K. Slack-Davis et al.//
JCB – 2003. - Vol. 162, № 2 –P.281-291.
213. Li, F. p21-activated kinase 1 interacts with and phosphorylates histone H3 in
breast cancer cells / F. Li, L. Adam, R.K. Vadlamudi et al. // EMBO Rep. – 2002. –
Vol. 3, №8 – P.767-773.
214. Maroto, B. P21-activated kinase is required for mitotic progression and regulates
Plk1 / B. Maroto, M.B. Ye, K. Von Lohneysen et al. // Oncogene – 2008. – Vol. 27,
№36 – P.4900-4908.
215. Nheu, T. PAK is essential for RAS-induced upregulation of cyclin D1 during the
G1 to S transition / T. Nheu, H. He, Y. Hirokawa et al. // Cell Cycle – 2004. – Vol. 3,
№1 – P.71-74.
115
216. Arias-Romero, L.E. PAK1 kinase links ErbB2 to β-catenin in transformation of
breast epithelial cells / L.E. Arias-Romero, O. Villamar-Cruz, M. Huang et al. // Cancer
Res. – 2013. – Vol. 73, №12 – P. 3671-3682.
217. Ye, D.Z. p21-Activated kinase 1 (PAK1) phosphorylates BAD directly at serine
111 in vitro and indirectly through Raf-1 at serine 112 / D.Z.Ye, S. Jin, Y. Zhuo et al. //
PLoS One – 2011. – Vol. 6, № 11 - P:e27637.
218. Vadlamudi, R.K. Dynein light chain 1, a p21-activated kinase 1-interacting
substrate, promotes cancerous phenotypes / R.K. Vadlamudi, R. Bagheri-Yarmand, Z.
Yang et al. // Cancer Cell – 2004. – Vol. 5, № 6, P.575-585.
219. Mazumdar, A. Estrogen regulation of PAK1 and FKHR pathways in breast
cancer cells / A. Mazumdar, R. Kumar // FEBS Letters – 2003. – Vol. 535, № 1-3 – P.610.
220. Frost, J.A. Stimulation of NFkappa B activity by multiple signaling pathways
requires PAK1 / J.A. Frost, J.L. Swantek, S. Stippec et al. // J. Biol. Chem. – 2000. –
Vol. 275, №26 – P.19693-19699.
221. Friedland, J.C. α6β4 integrin activates Rac-dependent p21-activated kinase 1 to
drive NF-κB-dependent resistance to apoptosis in 3D mammary acini / J.C. Friedland,
J.N. Lakins, M.G. Kazanietz et al. // J. Cell. Sci. – 2007. – Vol. 120 – P.3700-3712.
222. Wang, C.-Y. NF-κB Antiapoptosis: Induction of TRAF1 and TRAF2 and c-IAP1
and c-IAP2 to Suppress Caspase-8 Activation / C.-Y. Wang, M.W. Mayo, R.G.
Korneluk et al. // Science – 1998. – Vol. 281, №. 5383 – P.1680-1683.
223. Acconcia, F. Phosphorylation-dependent regulation of nuclear localization and
functions of integrin-linked kinase / F.Acconcia, C.J. Barnes, R.R. Singh et al. // Proc.
Natl. Acad. Sci. USA – 2007. – Vol. 104, № 16 – P.6782-6787.
224. Wu, C. Integrin-linked kinase and PINCH: partners in regulation of cellextracellular matrix interaction and signal transduction / C. Wu // J. Cell Science –
1999. – Vol. 112, Pt. 24 - P.4485-4499.
225. Vadlamudi, R.K. p41-Arc subunit of human Arp2/3 complex is a p21-activated
kinase-1-interacting substrate / R.K. Vadlamudi, F. Li, C.J. Barnes, R. BagheriYarmand et al. // EMBO Rep. – 2004. – Vol. 5, № 2 – P.154-160.
116
226. Chew, T.L. Phosphorylation of non-muscle myosin II regulatory light chain by
p21-activated kinase (gamma-PAK) / T.L. Chew, R.A. Masaracchia, Z.M. Goeckeler et
al. // J. Muscle Res. Cell Motil. – 1998. - Vol. 19, № 8 – P.839-854.
227. Edwards, D.C. Activation of LIM-kinase by PAK1 couples Rac/Cdc42 GTPase
signalling to actin cytoskeletal dynamics / D.C. Edwards, L.C. Sanders, G.M. Bokoch et
al. // Nat. Cell Biol. – 1999. – Vol. 1, № 5 – P.253-259.
228. Vadlamudi, R.K. Filamin is essential in actin cytoskeletal assembly mediated by
p21-activated kinase 1 / R.K. Vadlamudi, F. Li, L. Adam, D. Nguyen et al. // Nature cell
biology – 2002. – Vol. 4, № 9 – P.681-690.
229. Vadlamudi, R.K. p21-activated kinase 1 regulates microtubule dynamics by
phosphorylating tubulin cofactor B. / R.K. Vadlamudi, C.J. Barnes, S. Rayala et al. //
Mol. Cell Biol. – 2005. – Vol. 25, № 9 – P.3726-3736.
230. Wittmann, T. Regulation of microtubule destabilizing activity of Op18/stathmin
downstream of Rac1 / T. Wittmann, G.M. Bokoch, C.M. Waterman-Storer // Biol.
Chem. – 2004. – Vol. 279, №7 – P.6196-6203.
231. Yang, Z. PAK1 Phosphorylation of Snail, a Master Regulator of Epithelial-toMesenchyme Transition, Modulates Snail’s Subcellular Localization and Functions / Z.
Yang, S. Rayala, D. Nguyen et al. // Cancer Res. – 2005 – Vol. 65, № 8 – P.3179-3184.
232. Stemmer, V. Snail promotes Wnt target gene expression and interacts with βcatenin / V. Stemmer, B. de Craene, G. Berx et al. // Oncogene – 2008. – Vol. 27 –
P.5075-5080.
233. Vadlamudi, R.K. An essential role of PAK1 phosphorylation of SHARP in Notch
signaling / R.K.Vadlamudi, B. Manavathi, R.R. Singh et al. / Oncogene – 2005. – Vol.
24 – P.4591-4596.
234. Liberali, P. The closure of PAK1-dependent macropinosomes requires the
phosphorylation of CtBP1/BARS / P. Liberali, E. Kakkonen, G. Turacchio et al. //
EMBO J. – 2008. – Vol. 27, №7 – P.970-981.
235. Balasenthil, S. p21-activated kinase-1 signaling mediates cyclin D1 expression in
mammary epithelial and cancer cells / S. Balasenthil et al.// J. Biol. Chem. – 2004. –
Vol. 279 – P.1422-1428.
117
236. Arias-Romero, L.E. p21-activated kinases in Erbb2-positive breast cancer: A new
therapeutic target? / L.E. Arias-Romero, J. Chernoff // Small GTPases – 2010. – Vol. 1
– P.124-128.
237. Arias-Romero, L.E. A tale of two PAKs / L.E. Arias-Romero, J. Chernoff // Biol.
Cell – 2008. – Vol. 100 – P.97-108.
238. Wang, Z. p21-Activated Kinase 1 (PAK1) Can Promote ERK Activation in a
Kinase-independent Manner / Z. Wang et al. // J. Biol. Chem. – 2013. – Vol. 288 –
P.20093–20099.
239. Adam, L. Heregulin regulates cytoskeletal reorganization and cell migration
through the p21-activated kinase-1 via phosphatidylinositol-3 kinase / L. Adam, R.
Vadlamudi, S.B. KondaPAKa et al. // J. Biol. Chem. – 1998. – Vol. 273 – P.2823828246.
240. Adam, L. Regulation of microfilament reorganization and invasiveness of breast
cancer cells by kinase dead p21-activated kinase-1 / L. Adam, R. Vadlamudi, M.
Mandal et al. // J. Biol. Chem. – 2000. – Vol. 275 – P.12041-12050.
241. Авилова,
Е.А.
Значение
протеинкиназы
PAK1
в
регуляции
эстрогеннезависимого роста клеток рака молочной железы / Е.А. Авилова, О.Е.
Андреева, В.А. Шатская, М.А. Красильников // Биомедицинская химия – 2014 – Т.
60, №3 – C.322-331.
242. Shrestha, Y. PAK1 is a breast cancer oncogene that coordinately activates MAPK
and MET signaling / Y. Shrestha et al.// Oncogene – 2012 – Vol. 31 – P.3397–3408.
243. Lundgren, K. Gene products of chromosome 11q and their association with
CCND1 gene amplification and tamoxifen resistance in premenopausal breast cancer /
K. Lundgren, K. Holm, B. Nordenskjold et al. // Breast Cancer Res. – 2008. – Vol. 10 –
P.R81.
244. Bekri, S. Detailed map of a region commonly amplified at 11q13q14 in human
breast carcinoma / S. Bekri, J. Adelaide, S. Merscher et al. // Cytogenet. Cell Genet. –
1997. – Vol. 79 – P.125-131.
245. Radu, M. PAK signalling during the development and progression of cancer / M.
Radu, G. Semenova, R. Kosoff, J. Chernoff / Nat. Rev. Cancer. – 2014 – Vol. 14, №1 –
P.13-25.
118
246. Ong, C.C. Targeting p21-activated kinase 1 (PAK1) to induce apoptosis of tumor
cells / C.C. Ong et al.// Proc. Natl. Acad. Sci. USA – 2011. – Vol. 108 – P.7177-7182.
247. Holm, C. Association between PAK1 expression and subcellular localization and
tamoxifen resistance in breast cancer patients / C. Holm, S. Rayala, K. Jirstrom et al. //
J. Natl. Cancer Inst. – 2006. – Vol. 98, №10 – P.671-680.
248. McDonnell, D.P. The molecular pharmacology of SERMs / D.P. McDonnell /
Trends Endocrinol. Metab. – 1999. – Vol. 10 – P.301-311.
249. Vadlamudi, R.K. Regulatable expression of p21-activated kinase-1 promotes
anchorage-independent growth and abnormal organization of mitotic spindles in human
epithelial breast cancer cells / R.K. Vadlamudi, L. Adam, R.A. Wang et al. // J. Biol.
Chem. – 2000. – Vol. 275 – P.36238-36244.
250. Ghosh, A. Regulation of tamoxifen sensitivity by a PAK1–EBP1 signalling
pathway in breast cancer / A. Ghosh, S. Awasthi, J.R. Peterson et al. // Br. J. Cancer –
2013. – Vol. 108 – P.557-563.
251. Shrestha, Y. PAK1 is a breast cancer oncogene that coordinately activates MAPK
and MET signaling / Y. Shrestha, E.J. Schafer, J.S. Boehm et al. // Oncogene – 2012. –
Vol. 31, №29 – P.3397-3408.
252. Yoo, J.Y. Interaction of the PA2G4 (EBP1) protein with ErbB-3 and regulation of
this binding by heregulin / J.Y. Yoo, X.W. Wang, A.K. Rishi et al. // Br. J. Cancer –
2000. – Vol. 82 – P.683-690.
253. Lessor, T.J. Ectopic expression of the ErbB-3 binding protein ebp1 inhibits
growth and induces differentiation of human breast cancer cell lines / T.J. Lessor, J.Y.
Yoo, X. Xia, N. Woodford, A.W. Hamburger // J. Cell. Physiol. – 2000. – Vol. 183 –
P.321-329.
254. Zhang, Y. Inhibition of heregulin mediated MCF-7 breast cancer cell growth by
the ErbB3 binding protein EBP1 / Y. Zhang, D. Akinmade, A.W. Hamburger // Cancer
Lett. – 2008. – Vol. 265 – P.298-306.
255. Ahn, J.Y. Nuclear Akt associates with PKC-phosphorylated Ebp1, preventing
DNA fragmentation by inhibition of caspase-activated DNase / J.Y. Ahn, X. Liu, Z.
Liu, L. Pereira et al. // EMBO J. – 2006. – Vol. 25 – P.2083-2095.
119
256. Akinmade, D. Phosphorylation of the ErbB3 binding protein Ebp1 by p21activated kinase 1 in breast cancer cells / D. Akinmade, A.H. Talukder, Y. Zhang et al.
// Br. J. Cancer – 2008. – Vol. 98 – P.1132-1140.
257. Yang, C. Essential role for rac in heregulin beta1 mitogenic signaling: a
mechanism that involves epidermal growth factor receptor and is independent of ErbB4
/ C. Yang, Y. Liu, M.A. Lemmon, M.G. Kazanietz // Molecular and Cellular Biology –
2006. – Vol. 26 – P.831-842.
258. Xie, J.W. Extracellular matrix, Rac1 signaling, and estrogen-induced proliferation
in MCF-7 breast cancer cells / J.W.Xie, S.Z. Haslam // Breast Cancer Research and
Treatment – 2008. – Vol. 110 – P.257-268.
259. Rosenblatt, A.E. Inhibition of the Rho GTPase, Rac1,decreases estrogen receptor
levels and is a novel therapeutic strategy in breast cancer / A.E. Rosenblatt, M.I. Garcia,
L. Lyons et al. // Endocrine-Related Cancer – 2011. – Vol. 18 – P.207-219.
260. Scherbakov, A.M. Snail/beta-catenin signaling protects breast cancer cells from
hypoxia attack / A.M. Scherbakov, L.B. Stefanova, D.V. Sorokin, S.E. Semina, L.M.
Berstein, M.A. Krasil'nikov // Exp Cell Res. – 2013. – Vol. 319, №20 – P.3150-3159.
261. Андреева, О.Е. Значение транскрипционного фактора Snail1 в регуляции
гормональной чувствительности культивируемых in vitro клеток рака молочной
железы / О.Е. Андреева, А.М. Щербаков, В.А. Шатская, М.А. Красильников //
Вопросы онкологии – 2012. – Т. 1 - С.71-76.
262. Singh, P. HIF-1alpha and AMPK interactions regulate cellular hypoxia adaptation
in the subtotal nephrectomy model of CKD // FASEB J. – 2013. – Vol 27 – P.910.10.
263. Щербаков, А.М. Сигнальный путь В-катенина и устойчивость клеток рака
молоч ной железы к гипоксическим условиям / А.М. Щербаков, Л.Б. Стефанова,
И.А. Якушина, М.А. Красильников // Клиническая лабораторная диагностика –
2013. – Т. 10 - С.37-40.
264. Стефанова, Л.Б. Чувствительность к гипоксии культивируемых in vitro
клеток рака молочной железы: роль аппарата рецептора эстрогенов / Л.Б.
Стефанова, А.М. Щербаков, О.Е. Андреева, Н.А. Болотина, И.В. Терешкина, М.А.
Красильников // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической
химии – 2012. – Т. 10 - С.60-63.
120
265. Deacon, S.W. An isoform-selective, small-molecule inhibitor targets the
autoregulatory mechanism of p21-activated kinase / S.W. Deacon, A. Beeser, J.A.
Fukui, U.E. Rennefahrt et al. // Chem Biol. – 2008. – Vol. 5, №4 – P.322-331.
266. Viaud, J. An allosteric kinase inhibitor binds the p21-activated kinase
autoregulatory domain covalently / J. Viaud, J.R. Peterson // Mol. Cancer Ther. – 2009.
– Vol. 8, № 9 – P.2559-2565.
267. Singhal, R. The response to PAK1 inhibitor IPA3 distinguishes between cancer
cells with mutations in BRAF and Ras oncogenes / R. Singhal, E.S. Kandel //
Oncotarget – 2012. – Vol. – P.714-708.
268. Reid, G. Cyclic, proteasome-mediated turnover of unliganded and liganded
ERalpha on responsive promoters is an integral feature of estrogen signaling / G. Reid,
M.R. Hübner, R. Metivier et al. // Mol. Cell. – 2003. – Vol. 11 – P.695-707.
269. Vincent, T. A SNAIL-SMAD3/4 transcriptional repressor complex promotes
TGF-beta mediated epithelial-mesenchymal transition. T. Vincent, E.P. Neve, J.R.
Johnson, A. Kukalev, F. Rojo et al.// Nature cell biology – 2009. – Vol. 11 – P.943-950.
270. Batlle, E. The transcription factor snail is a repressor of E-cadherin gene
expression in epithelial tumour cells / E. Batlle et al. // Nat. Cell. Biol. – 2000. – P.8489.
271. Sells, M.A. Human p21-activated kinase (PAK1) regulates actin organization in
mammalian cells / M.A. Sells, U.G. Knaus, S. Bagrodia et al. / Curr. Biol. – 1997. –
Vol. 7 – P.202–210.
272. Bradford, M. M. A Rapid and Sensitive Method for the Quantitation of
Microgram Quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein-Dye Binding / M.M.
Bradford // Anal. Biochem. – 1976. – Vol. 72 – P.248-254.
273. Кнорре, Д.Г. Биологическая химия / Д.Г. Кнорре, С.Д.Мызина. Москва:
Высшая школа, 2000. 479 с.
274. Остерман, Л.А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот:
Электрофорез и ультрацентрифугирование (практическое пособие) / Л.А.
Остерман. М.: Наука, 1981. 288 с.
275. Merlin, J.L. MTT assays allow quick and reliable measurement of the response of
human tumour cells to photodynamic therapy / J. L. Merlin, S. Azzi, D. Lignon et al.//
Eur. J. Cancer. – 1992. – P.1452-1458.
121
276. Gardiner-Garden, M. CpG islands in vertebrate genomes / M. Gardiner-Garden,
M. Frommer // J. Mol. Biol. – 1987. – Vol. 196 – P.261-282.
277. Li L.C. MethPrimer: designing primers for methylation PCRs / L.C. Li, R.
Dahiya // Bioinformatics – 2002. – Vol. 18, № 11 – P.1427-1431.
278. Кузнецова, Е.Б. Новые маркеры метилирования и экспрессии генов при раке
молочной железы / Е.Б. Кузнецова, Т.В. Кекеева, С.С. Ларин, В.В. Землякова, О.В.
Бабенко, М.В. Немцова, Д.В. Залетаев, В.В. Стрельников // Молекулярная
биология – 2007 - Т .41, №4, С. 624-633.
279. Katargin, A. Hypermethylation of genomic 3.3-kb repeats is frequent event in
HPV-positive cervical cancer / A. Katargin, L. Pavlova, F. Kisseljov, N. Kisseljova //
BMC Medical Genomics – 2009. - Vol. 2 - P.30.
280. Alexandrova, A. Effects of proteasome inhibitor, MG132, on proteasome activity
and oxidative status of rat liver / A. Alexandrova, L. Petrov, A. Georgieva, M. Kirkova,
M. Kukan // Cell Biochem. Funct.- 2008. – Vol. 26 – P.392-398.
281. Сорокин, Д.В. Механизм адаптации клеток рака молочной железы к
гипоксии: роль АМРК/mTOR-сигнального пути / Д.В.Сорокин, А.М.Щербаков,
И.А.Якушина, С.Е.Семина, М.В.Гудкова, М.А.Красильников // Клеточные
технологии в биологии и медицине – 2015 - В печати.
282. Dhasarathy, A. The transcription factor snail mediates epithelial to mesenchymal
transitions by repression of estrogen receptor alpha / A. Dhasarathy, M. Kajita, P.A.
Wade // Mol. Endocrinol. – 2007. – Vol. 21 – P.2907-2918.
283. Fujita, N. MTA3, a Mi-2/NuRD complex subunit, regulates an invasive growth
pathway in breast cancer / N. Fujita, D.L. Jaye, M. Kajita et al.// Cell – 2003. – Vol. 113
– P.207-219.
284. Zhang, X. Genome wide analysis of DNA methylation in rat lungs with
lipopolysaccharide induced acute lung injury / X. Zhang, C. Lv, X. Liu et al. //
Molecular Medicine Reports – 2013 – Vol. 7.5 – P.1417-1424
285. Yi, C. Validation of the p21-Activated Kinases as Targets for Inhibition in
Neurofibromatosis Type 2 / C. Yi et al.//Cancer research – 2008. – Vol. 68, №19 – P.
7932-7937.
122
286. Киселева, Н.П. Эпигеномика и канцерогенез: уникальность паттерна
метилирования ДНК опухолевой клетки / Н.П. Киселева, А.Н. Катаргин, Д.В. Гра
// Вопросы онкологии – 2007, № 1 – С.14.
123