Биохимия патологических состояний
реклама
ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНТСТВО ПО ОБРАЗОВАНИЮ ГОСУДАРСТВЕННОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ «САМАРСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ» Кафедра биологической химии Н.А. Кленова БИОХИМИЯ ПАТОЛОГИЧЕСКИХ СОСТОЯНИЙ Утверждено Редакционно-издательским советом университета в качестве учебного пособия Самара Издательство «Самарский университет» 2006 УДК 612.015 ББК 28.902 К 484 Рецензенты : д-р мед.наук И.Г. Кретова; д-р биол. наук В.С. Григорьев Кленова Н.А. К 484 Биохимия патологических состояний: учебное пособие / Н.А. Кленова; Федеральное агентство по образованию. Самара: Изд-во «Самарский университет», 2006 – 216 с. Учебное пособие включает современные сведения о биохимических основах воспалительного процесса, параметрах гомеостаза и их регуляции, сдвигах гомеостаза при патологических состояниях. Подробно представлены диагностически важные ферментативные тесты с принципами определения. Содержатся современные данные о нарушениях обмена веществ, болезнях рецепции, «конформационных» болезнях. На основе новых исследований рассмотрены вопросы транспорта липопротеидных частиц кровью, взаимодействия их с клетками и современные механизмы развития атеросклероза. Предназначено для студентов биологических факультетов, специализирующихся по биохимии, а также для аспирантов, медиков. УДК 612.015 ББК 28.902 © Кленова Н.А.,2006 © Самарский государственный университет, 2006 © Издательство «Самарский университет», оформление, 2006 2 ОГЛАВЛЕНИЕ Предисловие……………………………………………………………………… Глава 1. Болезнь как извращенный жизненный процесс…………… 1.1. Биохимические основы процессов воспаления……………………… 1.2. Нарушения гомеостаза. Гомеокинез………………………………… Глава 2. Нарушения обмена веществ ……………………………………… 2.1.Нарушения обмена углеводов…………………………………………… 2.2. Нарушение обмена белков……………………………………………… 2.3. Нарушения обмена липидов и липоидов……………………………… 2.4. Нарушения регуляции обмена веществ……………………………… Глава 3. Механизмы нарушений метаболических процессов в клетках ………………………………………………………………… 3.1. Гипоксия как причина нарушений метаболических процессов в клетках. Окислительный стресс…………………………………… 3.2 Нарушения межклеточных взаимодействий. Канцерогенез…… 3.3. Действие ксенобиотиков на клетки………………………………… 3.4. «Изнанки метаболизма» – химические процессы в клетках и организме………………………………………………………………… Библиографический список………………………………………………… 3 4 7 7 28 82 82 93 116 130 160 161 177 193 204 208 ПРЕДИСЛОВИЕ Еще в глубокой древности люди пытались понять, что лежит в основе болезней человека. Основные отличия состояния болезни и здоровья, а также формирование понятий «здоровье», «предболезнь», «болезнь» происходят в конце XIX – начале XX веков. Выдвинутая Р. Вирховым концепция «болезни» как результата повреждения клеток была подвергнута критике со стороны многих физиологов в основном из-за трактовки Р. Вирховым организма как простой совокупности клеток. Хотя в самой концепции Вирхова, особенно в регистрации им характерных повреждений соединительной ткани в процессе воспаления, очень много рационального. Выдающийся физиолог И.В. Давыдовский трактовал болезнь как особую форму приспособленности. Причем Давыдовский высказывал мысль об относительной степени патогенности повреждающих факторов, которая определяется состоянием организма. Новый смысл понятие «болезнь» приобретает после формулировки состояния гомеостаза К.Бернаром. Вскоре У. Кэннон выдвигает концепцию нарушения гомеостаза как основу болезненного процесса [20]. Существенное значение для понимания реакции организма на действие повреждающих факторов и механизмов развития патологических процессов оказала концепция общего адаптационного синдрома Г.Селье, появившаяся в середине XX века [34]. Согласно современным представлениям, болезнь представляет собой «извращенный жизненный процесс», который включает как повреждения на уровне молекул и/или процессов, так и сдвиг гомеостаза (гомеокинез) и установление новых параметров системы, выходящих за рамки нормы реакции на изменение факторов среды. Если раньше основной причиной заболеваний считали действие факторов внешней среды на организм, то сейчас все большую популярность приобретает мнение, что молекулярные механизмы возникновения болезней заключены в самом организме, приводя в сочетании с факторами окружающей среды или самостоятельно к развитию заболевания [27]. Патологическая биохимия, представляя болезнь как нарушение физико-химических процессов в клетках и организме, исходит из положения, что любые изменения нормальных функций в организме имеют в своей основе нарушения на молекулярном уровне. 4 При понимании болезни как извращенного жизненного процесса можно привести яркий пример, иллюстрирующий разницу между изменениями под действием определенного фактора на организм и взаимодействием повреждающего воздействия и ответной реакции организма на него. Обнаружено, что, применяя определенную методику охлаждения, можно крысу заморозить до состояния кусочка льда (-30С), а потом, согревая, также особым способом снова вернуть ее к жизни. Результаты такого эксперимента вполне объяснимы с точки зрения процессов жизни, основанных на функциях определенных молекул. Дело в том, что большая часть сил, соединяющих молекулы в живых организмах, относятся к «слабым» силам: таковы ван-дер-ваальсовы, гидрофобные и электростатические взаимодействия, водородные и ионные связи. Все эти силы в нормальных условиях уравновешены энергией термических столкновений молекул. Это обеспечивает возможность постоянного образования и разрыва связей, а также участие молекул в реакциях за счет изменения конформации в процессе выполнения своей функции (например, ферменты). Снижение температуры среды, в которой протекает реакция, вызывает снижение термической энергии соударения молекул. Результатом является преобладание сил связывания, в итоге обусловливающих полную неподвижность молекул и прекращение реакций. Почему же при действии даже более высоких, чем минусовые, температур организм может погибнуть? И что за условия необходимы для неповреждающего замораживания-оттаивания? Оказывается, что при обычном замерзании ферментные системы и метаболические процессы не прекращаются сразу, а некоторое время работают более напряженно. Это связано с возбуждением терморецепторов и мобилизацией гипоталамусом защитных механизмов повышения теплопродукции за счет стимуляции обменных процессов. Активация процессов обмена ведет к накоплению недоокисленных продуктов распада углеводов, жиров и белков, которые не успевают утилизироваться из-за блокирования ферментативной активности и нарушения регуляции и оказывают токсическое действие на организм. После согревания организм становится настолько поврежденным, что возвращение к жизни уже невозможно. Если же с помощью определенных веществ блокировать терморецепторы или центр терморегуляции в гипоталамусе и снижать температуру со скоростью одного градуса в минуту для предотвращения выхода воды из клеток и ее кристаллизации, то можно избежать повреждающего замораживания. Согревание организма в том же режиме позволит сохранить все жизненные функции. Именно поэтому у хладнокровных организмов, где в ходе эволюции сформировались соответствующие механизмы предотвращения кристаллизации воды внутри клеток, мы встречаем благополучное возрождение после полного замерзания (насекомые, лягушки). Основные причины, приводящие к развитию заболеваний, в настоящее время делят на: 5 - генетические, метаболические Сюда относятся поломки в наследственном материале, повреждения мембран и значимых функциональных молекул; дефицит или избыток нутриентов. - экологические Повреждения, вызванные факторами внешней среды при взаимодействии с внутренними процессами жизнедеятельности: болезнетворные микроорганизмы, действие физических факторов, ксенобиотиков. - регуляторные Изменение порогов чувствительности рецепторов, эндокринные нарушения, нарушения иммунитета. У организмов имеется лишь ограниченный набор процессов реагирования на патогенные факторы. Наиболее универсальными из них являются воспаление, общий адаптационный синдром, склероз, дегенерация, гипертрофия и атрофия, неоплазия, фиброз, некроз и апоптоз клеток. В настоящей книге мы попытались представить молекулярнобиохимические механизмы развития основных патологических состояний клеток и организма человека и высших млекопитающих, а также рассмотреть диагностическую ценность некоторых показателей клеточного и организменного метаболизма. 6 ГЛАВА 1 БОЛЕЗНЬ КАК ИЗВРАЩЕННЫЙ ЖИЗНЕННЫЙ ПРОЦЕСС 1.1. Биохимические основы процессов воспаления [3,26,27,42] Воспалительная реакция – наиболее общая, универсальная (в определенном смысле) система процессов реагирования на действие разнообразных патологических факторов. Достаточно длительный период времени термин «воспаление» отождествлялся с определением болезни как таковой. Однако понятие «воспаление» очень сложно трактовать однозначно из-за чрезвычайного разнообразия явлений, сопровождающих развитие воспалительного процесса. С одной стороны, любое повреждение тканей, действие чужеродных агентов приводят к воспалительной реакции организма. С другой, течение воспалительного процесса при бактериальной инфекции или попадании эндотоксинов в организм отлично от воспаления, вызванного травмой, ожогом, охлаждением, или от воспаления, сопровождающего аллергические явления. В формировании представлений о природе воспалительного процесса существенное значение имели работы великих врачей-физиологов XIX века. Р. Вирхов, изучая состояние соединительной ткани при воспалении, выдвинул концепцию приоритета дегенеративных изменений клеток и основного матрикса соединительной ткани в развитии воспалительного процесса. Конгейм считал, что главным симптомом и следствием воспаления является повреждение сосудов. В 80-х годах XIX века И.И. Мечников обнаружил фагоцитарную активность лейкоцитов, скопление их и других мезехимальных клеток в месте воспаления. В настоящее время только комплексный подход к исследованию воспалительного процесса с точки зрения биохимических, патофизиологических, иммунологических и морфологических изменений позволяет осветить на достаточно хорошем уровне эту важную и очень сложную совокупность процессов. Общебиологическая роль воспаления. Раскрытие общебиологической роли системы воспалительных процессов являлось и продолжает даже в настоящее время являться одной из труднейших задач. Начало воспаления может восприниматься как безусловно защитная реакция организма на чуже- 7 родную агрессию или повреждение под действием физико-химических факторов внешней среды. Затем воспалительная реакция становится похожей на извращенный жизненный процесс и может трактоваться как болезнь. Наблюдается сдвиг гомеостатических параметров: повышение температуры, рост давления, увеличение частоты дыхания и сердечных сокращений, а также содержания глюкозы в крови, изменение гормонального и иммунологического статуса. И, наконец, в случае действия сильно повреждающих факторов воспалительная реакция становится похожей на самоубийство. Если последовательно проследить за стремительно развивающимся процессом, например, септическим шоком, то убеждаешься в том, что смерть организма в данном случае хорошо спланирована самим организмом. Лавинообразно нарастающий поток медиаторов воспаления наносит такие повреждения самому организму, что смерть становится неизбежной. Этот, казалось бы, парадоксальный эффект понятен с точки зрения эволюционной концепции. Как показали исследования, некоторые штаммы E.coli имеют неактивную форму специфической протеазы, которая активируется в условиях заражения штамма определенным вирусом. Активирует фермент небольшой вирусный полипептид, который связывается с ним. Активная протеаза расщепляет фактор элонгации трансляции EFTU, что приводит к прекращению синтеза белков и гибели клетки. Гибель зараженной вирусом бактерии предотвращает распространение опасной инфекции и спасает популяцию [38]. Раскрывая общебиологическую роль системы воспалительных процессов, необходимо рассмотреть фазы развития воспалительной реакции организма. Общепринято выделять следующие фазы воспалительных процессов: – освобождение низкомолекулярных медиаторов воспаления; – активация протеаз крови и тканей и образование высокомолекулярных медиаторов, представляющих собой фрагменты белков, распавшихся при усилении свертывания, фибринолиза, кининогенеза; – активация комплемента. Низкомолекулярные медиаторы воспаления. К низкомолекулярным медиаторам воспаления следует отнести гистамин, серотонин, кинины (главным образом, брадикинин), гепарин. Гистамин образуется в тучных клетках из гистидина под действием гистидиндекарбоксилазы: CH2 N NH H C CH2 COOH NH2 N CO2 Гистидин 8 CH2 NH Гистамин NH2 Наряду со специфическим ферментом эта реакция катализируется декарбоксилазой ароматических L-аминокислот, осуществляющей также декарбоксилирование дофамина (3,4-диоксифенилаланина), 5-гидрокси-триптофана, фенилаланина, тирозина и триптофана. Данная малоспецифическая декарбоксилаза in vivo и in vitro ингибируется α-метиламинокислотами, которые применяются в клинике в качестве гипотензивных средств [26]. Гистамин присутствует в тучных клетках в качестве готового продукта в виде гранул, содержащих также гепарин и серотонин. Небольшое количество гистамина обнаруживается у человека также в тромбоцитах [2]. Освобождение гистамина из тучных клеток происходит либо без их разрушения, либо после разрушения этих клеток, которое характерно для состояния анафилактического шока. Освобождение гистамина без разрушения тучных клеток представляет собой сложный и до конца еще не изученный процесс. Освобождение стимулируется взаимодействием с тучной клеткой комплекса антиген-антитело. Для реализации эффекта необходимо присоединение не менее двух комплексов с помощью Fc-фрагментов антител к клетке. При связывании происходит изменение проницаемости плазматической мембраны для ионов кальция, и кальций устремляется внутрь тучных клеток. Далее события развиваются по следующей схеме: Са2+→активация проэстеразы → активация эстеразы → активация профосфолипазы А → активация фосфолипазы А → лизис фосфатидов → каналы в мембране → выход гистамина. Роль кальция не сводится только к активации Са2+-зависимых ферментов (проэстеразы, эстеразы, фосфолипазы), но и включает запуск сократительной активности микротрубочек и микрофиламентов, продвигающих гранулы с гистамином к мембране. Основная роль в освобождении гистамина отводится фосфолипазе А. Действие фосфолипазы А включает ряд последовательных этапов: (1) превращение фосфатидов мембраны в лизофосфатиды путем отщепления арахидоновой кислоты, при этом уменьшается вязкость бислоя фосфолипидов, так как фосфатиды имеют слоистое строение, а лизофосфатиды – гранулярное; (2) отщепление специфического фосфолипида от рецепторного участка аденилатциклазы, что препятствует ее активации и образованию цАМФ, который угнетает освобождение гистамина; (3) подавление активности Са2+-АТФ-азы, осуществляющей откачку кальция из клеток. Регулирующее действие на освобождение гистамина оказывают цАМФ (тормозит освобождение) и цГМФ (стимулирует освобождение). Поэтому адреналин, активирующий аденилатциклазу через β-адренорецепторы, угнетает освобождение гистамина. Ингибиторы β-адренорецепторов (β-блокаторы), наоборот, стимулируют выход гистамина из тучных клеток. Препараты, воздействующие на α-адренорецепцию, повышают выделение гистамина за счет снижения уровня цАМФ. Наконец, вещества, угнетающие фосфодиэстеразу цАМФ 9 (фермент, разрушающий цАМФ), например никотинамид, подавляют освобождение гистамина за счет поддержания высокого уровня цАМФ. Механизмы взаимодействия гистамина с клетками-мишенями. Рецепторы, воспринимающие гистамин, относятся к семейству одноцепочечных рецепторных гликопротеидов, локализованных в плазматической мембране. Характерной особенностью данных рецепторов является наличие семи гидрофобных α-спирализованных «стопкообразных» структур в толще мембраны и соединяющих их трех примембранных петель. N-конец (экстрацеллюлярный) имеет два углеводных фрагмента и ответственен за связь с лигандом. С-конец (интрацеллюлярный) свободно погружен в цитозоль. Связывание гормона изменяет конформационное состояние «стопкообразных» структур и примембранных петель, резко повышая их сродство к ГТФ-зависимым белкам (G-белкам). В случае гистамина (α-адренорецепция) рецептор сопряжен с Gi-белком, α-субъединица которого блокирует активность аденилатциклазы, что сопровождается транслокацией в мембрану и активацией фосфолипазы А. Лизис фосфатидов ведет к резкому увеличению проницаемости плазматической мембраны клетки-мишени, чем и обусловлены физиологические эффекты гистамина: образование покраснения в месте локального действия, появление отека. Действие фосфалипазы А приводит также к освобождению арахидоновой кислоты и ее производных, обладающих высокой биологической активностью: простагландинов, простациклинов, тромбоксанов, лейкотриенов. Все эти соединения играют важную роль в развитии воспалительной реакции, обеспечивая такие физиологические эффекты, как повышение температуры, сосудистые изменения, активацию свертывающей и противосвертывающей систем крови и иммунокомпетентных клеток. Разрушение гистамина осуществляет фермент диаминоксидаза (К.Ф.1.4.3.6.), которая действует также на некоторые другие диамины: кадаверин и путресцин. Серотонин является производным триптофана и синтезируется в клетках пищеварительного тракта, нервных (серотонинэргических) и тучных клетках. Первой реакцией синтеза служит гидроксилирование под действием специфической гидроксилазы в 5-окситриптофан. Затем 5-окситриптофан с помощью 5-окситриптофандекарбоксилазы превращается в 5-окситриптамин (серотонин): + О2 + Н+ СО2 COOH NH2 HO NH 2 NH NH 10 Коферментом декарбоксилазы является пиридоксальфосфат, поэтому при недостатке пиридоксина (В6) уменьшается производство серотонина. Деградация серотонина происходит под влиянием аминоксидазы, которая превращает его в 5-индолилуксусную кислоту, выделяемую с мочой. Физиологические эффекты серотонина многообразны и во многом определяются клеткой-мишенью. Серотонин вызывает сокращение гладкомышечных волокон кровеносных сосудов, кишечника, бронхов, матки. Выброс серотонина приводит к повышению артериального давления, увеличению проницаемости сосудов – покраснение лица, шеи (приливы). Взаимодействие с клеткой-мишенью серотонин осуществляет с помощью рецепторов, относящихся к суперсемейству рецепторов, обладающих свойствами ионных каналов. Данные рецепторы объединяют в своей молекуле специфические рецепторные свойства и свойства натрий/кальциевых электрогенных каналов. Обычно они состоят из пяти субъединиц, внутри располагается канал прохождения ионов. Связывание серотонина сопровождается серией открываний-закрываний канала и способствует либо сокращению, либо проведению нервного импульса к гипоталамусу, который уже посылает сигналы к исполняющему органу. Это и обусловливает многообразие эффектов и сложную роль серотонина в реализации воспалительной реакции организма. Кинины – олигопептиды с высокой биологической активностью. Наиболее изученный представитель кининов – брадикинин – представляет собой нонапептид, отщепляемый от неактивных плазменных α-глобулинов, называемых кининогенами. В составе брадикинина кроме двух остатков аргинина на концах молекулы нет заряженных кислот, что может способствовать его гидрофобному взаимодействию с фосфолипидами мембран: Арг-про-про-гли-фен-сер-про-фен-арг Был также найден подобный брадикинину нонапептид – каллидин – с измененной последовательностью двух первых аминокислотных остатков: лиз-арг-про (далее как у брадикинина). Отщепление брадикинина осуществляют специфические протеазы, содержащиеся (в неактивном состоянии) в тканях и плазме и называемые прекалликреинами. В организме человека были обнаружены два пути кининогенеза: Плазменные фрагменты контактного фактора Хагемана (XII) Активаторы Прекалликреин Калликреин Плазминоген Плазмин Плазменный кининоген I КИНИНЫ 11 Железистый кининоген II Брадикинин относится к типичным медиаторам воспаления, так как легко переходит в кровь, усиливает местный кровоток, расширяет сосуды и резко повышает их проницаемость. Действие брадикинина реализуется через рецепцию, подобную адренорецепторам, активацию фосфолипаз и повышение проницаемости за счет как образования фосфолизинов, так и арахидоновой и других жирных кислот, являющихся (как и их производные) мощными регуляторами ионных каналов. Гепарин освобождается вместе с гистамином из тучных клеток. Он представляет собой гетерополисахарид, построенный из дисахаридных звеньев глюкуроновой (или идуроновой) кислоты и сульфатированного N-ацетилглюкозамина. Освобождение низкомолекулярных медиаторов воспаления «первого эшелона» ведет к лавинообразному нарастанию секреции мощных регуляторов разнообразных процессов: активации и агрегации тромбоцитов, констрикции и дилатации сосудов, повышении температуры, на которых мы остановимся ниже. Активация комплемента. Комплемент – группа белков (около десяти) плазмы крови. При электрофорезе они движутся с фракциями α, β и γглобулинов. Это группа ферментов, активация которых происходит по каскадному механизму, обеспечивающих наиболее всестороннюю защитную реакцию организма при развитии воспаления за счет формирования комплекса мембранной атаки, лизирующего клетки. В онтогенезе система комплемента возникает относительно рано в противоположность антителам, которые появляются в достаточном количестве только под влиянием сенсибилизации [26]. Различают 9 компонентов системы комплемента, которые обозначают С1 – С9, а в активной форме С1¯ – С9¯. Все ферменты системы комплемента являются сериновыми протеиназами. Общей чертой протеиназ комплемента является также то, что они гидролизуют в своих естественных субстратах пептидную связь, образованную карбоксильной группой аргинина. Большинство протеиназ комплемента обнаруживает большое сходство с трипсиноподобными ферментами, некоторые из них, подобно трипсину, обладают не только протеолитической, но и эстеразной активностью. Каждый из компонентов комплемента имеет собственный специфический ингибитор. Отличительным свойством ингибиторов комплемента является то, что действие они оказывают только на активированный комплемент, а не на нативный. Кроме того, существуют агенты, ускоряющие распад активированных компонентов, например DAF(фактор, ускоряющий распад). 12 Механизм активации комплемента можно разделить на две фазы. 1. Каскад реакций ограниченного протеолиза, завершающийся гидролизом компонента С5. 2. Сборка комплекса мембранной атаки и повреждение клеточных мембран. Первая фаза происходит минимум двумя путями: классическим и альтернативным. Классический путь запускается комплексом антиген-антитело. Fab-фрагмент антитела (иммуноглобулин G или M) соединяется с антигеном, а Fc-фрагмент с С1 – компонентом комплемента. Обнаружено, что С-реактивный белок (белок острой фазы воспаления) может самостоятельно активировать комплемент по классическому пути. Активный комплекс С1¯ классического пути активации комплемента образуется из неактивного мультимолекулярного комплекса С1qC1r2C1s2[9]. Компонент С1q – один из самых необыкновенных белков крови. Он состоит из 18 полипептидных цепей. Каждая цепь имеет коллагеноподобные участки («стебли») и «головки». «Головки» определяют взаимодействие с иммунными комплексами, а коллагеноподобные участки – взаимодействие с тетрамером С1r2С1s2. Для поддержания структуры и функционирования С1 необходимы ионы кальция, которые могут быть заменены на ионы Mn2+, Co2+, Ni2+, Zn2+, Cd2+. Диссоциация комплекса С1 при действии избытка NaCl свидетельствует об ионной силе взаимодействий между С1q и тетрамером. Однако ассоциация субъединиц увеличивается с повышением температуры, что предполагает участие гидрофобных взаимодействий. Установлено, что С1q непосредственно реагирует с субкомпонентом С1r. Кооперативности во взаимодействии субъединиц С1 и явлений аутокатализа не было обнаружено. Показано, что при взаимодействии С1 с Fc-фрагментом комплекса антиген-антитело происходит значительное усиление ассоциации С1q с тетрамером, что является пусковым механизмом активации С1 компонента комплемента. In vivo спонтанной активации не происходит из-за присутствия ингибитора С1−компонента специфического регуляторного белка. Он выступает как в роли ингибитора аутоактивации С1 (обратимое действие), так и ингибитора С1 – (необратимое действие). Этот же ингибитор способен инактивировать калликреин, плазмин, фактор Хагемана. Сформировавшийся активный комплекс С1 – является эстеразой и расщепляет С4 компонент на фрагменты С4а и С4b и компонент С2 на С2а и С2b, причем каталитическая активность связана с субкомпонентом С1s. Бóльшие фрагменты С4b и С2а объединяются и образуют активный комплекс С4⎯С2⎯, называемой С3–конвертазой. Этот фермент осуществляет протеолиз С3–компонента на С3a и С3b фрагменты. Фермент содержит ион магния. С3b–фрагмент присоединяется к С3–конвертазе, образуя С5– кон- 13 вертазу (С4bC2aC3b), которая действует на С5, расщепляя его на С5b и С5а. Последний уходит в жидкую среду. В результате формируется активный комплекс С1⎯С4⎯С2⎯С3⎯С5⎯, и первая фаза активации коплемента заканчивается. Низкомолекулярные фрагменты, отщепляющиеся от белков комплемента и уходящие в жидкую среду, являются следующей волной медиаторов воспаления. С2b обладает кининоподобной активностью, С3а и С5а имеют анафилактоксические свойства, С5а, кроме того, способен имитировать фактор, освобождающий лизосомальные ферменты (LRF), С4а способствует высвобождению серотонина из базофилов и тучных клеток. Данная фаза альтернативного пути значительно отличается от приведенного выше классического. Типичными активаторами данного пути являются вещества бактериальной природы: мембранные липополисахариды грамотрицательных бактерий, бактериальные эндотоксины, инсулин, иммуноглобулины А,D. В инициации требуется присутствие инициирующего фактора IF, который активирует белок пропердин (Р), а затем все идет по каскадному механизму: пропердин активирует α-глобулин (фактор D, трипсиноподобная протеаза). Активный фактор D активирует гликопротеид, богатый глицином (В-фактор). D-фактор гидролизует В-фактор на Вb и Ва фрагменты. Процесс требует обязательного присутствия С3b фрагмента и ионов магния. Вb образует комплекс с С3b, формируя комплекс С3bВb, обладающий свойствами С3-конвертазы. Поэтому вторая фаза активации комплемента является общей и для классического, и для альтернативного пути. К сформировавшемуся активному комплексу последовательно присоединяются компоненты С6, С7, С8 и С9. Возникший цитолитический комплекс повреждает структуру цитоплазматической мембраны. Гидрофобные цепи С5b и С7 погружаются в фосфолипидный бислой, затем при участии С6, С8 и С9 в мембране формируются каналы, количество которых постепенно нарастает, мембрана распадается (рис.1.1). Цитолитический комплекс, а также все продукты, возникающие в ходе активации системы комплемента, направлены на разрушение и удаление из организма чужеродных агентов. В то же время становится весьма возможным и повреждение собственных тканей организма. Большую роль в патологических процессах играет нефизиологический механизм активации комплемента за счет расщепления и активации его компонентов разнообразными ферментами, не входящими в каскадный механизм. Среди важнейших: трипсин, плазмин, тромбин, катепсины (лизосомальные протеазы), бактериальные протеазы. Многие из них способны активировать B-фактор, замещая физиологический его активатор – фактор D. 14 Классический путь Альтернативный путь Комплекс Антиген-антитело С-реактивный белок. Онкогенные вирусы. ДНК Полисахариды, липополисахариды бактерий, дрожжей, инсулин, Иммуноглобулины А,D IF С1q C1r ⎯ C1s P C1s⎯ Фактор D Фактор В C4C2 Фактор Вb С3b+ Mg2+ C4b⎯С2a⎯⎯ + C4a + C2b C3b⎯Bb C3 C3b⎯ C4b⎯С2a⎯ C4b⎯С2a⎯⎯C3b⎯ C5 + C3a C5b⎯ + C5a C5b⎯ + C6-9 C5b⎯C6-9 (цитолитический комплекс) Рис. 1.1. Активация системы комплемента. Непрерывные линии – воздействие; прерывистые – превращения [3] Имеются сведения об участии протеаз комплемента в других биохимических процессах. Так, фактор В вызывает распластывание макрофагов, С1s⎯ и C2 обусловливают увеличение проницаемости сосудов [8]. Регуляция системы комплемента и ее нарушения. Поскольку все протеазы комплемента катализируют реакцию гидролиза связей, образованной карбоксильной группой аргинина, то аргинин и его производные оказывают ингибирующее действие на их активность. Все комплексные протеазы комплемента стабилизируются двухвалентными катионами: Ca2+, Mg2+, Mn2+ и другими. Поэтому вещества, хелатирующие двухвалентные катионы (ЭДТА), полностью угнетают реакции каскадной активации компле15 мента. Поскольку комплекс С1⎯ формируется с участием кальция, агенты, избирательно связывающие ионы Са2+ (ЭГТА), угнетают активацию комплемента только по классическому пути. Стабильность комплексных протеаз различна при различных значениях рН: ферменты альтернативного пути проявляют бóльшую активность в кислой среде, а классического пути – в щелочной. Регуляция активности комплемента в плазме осуществляется с помощью ингибиторных белков. Важнейшими из них являются ингибиторы С1⎯ и С3⎯ В условиях дефицита ингибитора С1⎯, являющегося одновременно ингибитором активного контактного фактора, плазмина и калликреина, происходит чрезмерное выделение медиаторов воспаления, быстрое расходование С1-компонента комплемента. Ингибитор С1⎯ представляет собой α2-глобулин, который синтезируется в моноцитах и относится к подклассу ингибиторов сериновых протеаз. Он препятствует спонтанной активации С1 и медленно разрушает С1⎯, выполнившего свою функцию. Ингибитор С3⎯ компонента расщепляет его на неактивные фрагменты С3с и С3d. Одновременно он тормозит протеолиз В-фактора и, соответственно, блокирует активацию комплемента по альтернативному пути. Недостаток ингибитора С3⎯ приводит к истощению запасов остальных компонентов комплемента, то есть к снижению бактерицидных свойств организма и хроническим инфекциям. Патологией является как повышение, так и понижение способности к активации комплемента. Поскольку основной целью функционирования комплемента служит лизис клеток, особенно опасна его повышенная и неконтролируемая активность, обычно вызывающая повреждение клеток самого организма. Чаще всего к этому приводит избыток комплексов антиген-антитело, активирующих комплемент по классическому пути и приводящих к освобождению огромных количеств медиаторов воспаления, повреждающих ткани. Явления гиперактивации комплемента выражены при следующих заболеваниях: 1. Системная красная волчанка (СКВ). Образование большого количества комплексов антиген-антитело обусловлено генетической поломкой узнавания главного комплекса белков гистосовместимости (ГКГС) и формированием антител к ядрам собственных клеток. Болезнь сопровождается тяжелой почечной недостаточностью из-за отложения в почечных канальцах крупных комплексов: антигенантитело-комплемент и развитием вторичной иммунодефицитности из-за исчерпания резервов компонентов комплемента. 2. Хронический гломерулонефрит. Отложение в мембранах почечного эпителия производных компонента С3⎯. В плазме больных обнаруживается фактор, который активирует С3, образуя особый, дополнительный путь активации комплемента. Наличие этого фактора, 16 вызывающего постоянную активацию комплемента, приводит к отложению в почечном эпителии производных С3⎯ и постоянному расходованию компонентов комплемента, поэтому развивается его недостаточность. 3. Сывороточная болезнь. Введение в организм больших доз чужеродных веществ (белков) сопровождается синтезом большого количество антител и в результате образуется много комплексов антиген-антитело. Это сопровождается активацией комплемента, фактора Хагемана, выделением гистамина. 4. Иммуноваскулит. Поражение сосудов вследствие отложения комплексов антиген-антитело на интиме. Изменение интимы ведет к активации фактора Хагемана и микротромбозам. 5. Хронический ревматоидный полиартрит. Присутствие в плазме видоизмененных антител вызывает гиперактивацию системы комплемента и, как следствие, снижение уровня компонентов комплемента в суставной жидкости. Видоизмененные антитела определяются в плазме (α и γ-глобулины) и составляют так называемый ревматоидный фактор. 6. Амилоидоз. Патогенез связывают с накоплением веществ, которые являются производными или хотя бы приближаются по структуре к некоторым компонентам комплемента. При первичном амилоидозе накапливаются, прежде всего волокна иммуноглобулинов, при вторичном (осложнение тяжелых заболеваний) возникают белки, близкие к пропердину и С-реактивному белку. Среди генетически обусловленных состояний дефицита комплемента наиболее изучен дефицит С2 у человека. Подобный генетический дефект приводит к развитию ювенильного ревматизма, системной красной волчанки, бронхиальной астмы, экземы. Врожденный дефицит факторов начальных этапов активации обычно не вызывает тяжелых расстройств, так как есть возможность взаимозаменяемости активации по классическому или по альтернативному пути. «Вторая волна» медиаторов воспаления. Среди медиаторов воспаления «второй волны» особое значение имеют простагландины, лейкотриены, тромбоксаны, простациклины. Первичным источником всех выше названных биологически активных соединений, обладающих широким спектром воздействий, является арахидоновая кислота. Многочисленные биохимические превращения арахидоновой кислоты осуществляются различными ферментативными системами, среди которых особая роль принадлежит циклооксигеназе (ЦОГ), липоксигеназе (ЛОГ) и системе гидроксилаз, составляющих цитохром Р450. Превращению арахидоновой кислоты данными ферментными системами предшествует отщепление самой кислоты от фосфолипидов (в ос17 новном от фосфатидилинозитола) цитоплазматических мембран под действием фосфолипаз. Циклооксигеназное окисление арахидоновой кислоты. Арахидоновая кислота присутствует в мембранных фосфолипидах, в основном в составе фосфатидилинозитола. Освобождение ее происходит с помощью фосфолипазы А2. Активация самой фосфолипазы А2 сложный, рецепторнозависимый процесс. Транслокация и активация фермента сопряжены с диссоциацией комплекса G-белков (Gi-типа) и часто связаны с одновременной активацией фосфолипазы С: Фосфолипаза А2 Фосфатидилинозитол Арахидоновая кислота Фосфолипаза С Фосфолипаза А2 Диацилглицерол Арахидоновая кислота. В настоящее время есть основания предполагать, что в клетке фосфолипаза С ассоциирована с белком или липидом с М. 20 кДа [39].Фосфолипаза А2 обнаружена как в мембраносвязанном состоянии, так и в цитозоле (лизосомального происхождения). Оптимум рН для ее действия лежит в кислой области. Предполагается, что в активации цитозольного фермента участвует кальмодулин и Са2+[19]. После освобождения арахидоновая кислота подвергается превращению в циклическую эндоперекись (PGG2) под действием растворимой циклооксигеназы (ЦОГ). Изучение молекулярной организации ЦОГ показало, что для проявления ее активности необходимы гем и негемовое железо [21], а также транслокация фермента в интрацеллюларную область мембраны. Ингибитором активности ЦОГ служат ацетилсалициловая кислота и амидопирин. Это лежит в основе их жаропонижающего действия. В различных клетках циклическая эндоперекись претерпевает разнообразные превращения: во многих клетках под действием мультиферментного комплекса, называемого простагландинсинтетазой, производятся простагландины. Причем в большинстве клеток ЦОГ также входит в данный комплекс ферментов. Кроме ЦОГ в него входят пероксидазы, редуктазы и изомеразы. Установлено также участие в окислении арахидоновой кислоты и производстве биологически активных соединений цитохрома Р-450. Этот гемопротеид катализирует окисление различных эндогенных и чужеродных веществ и найден в клетках растений, микроорганизмов и животных [21]. Он является терминальной оксидазой моноаминоксидаз. Известны две группы первичных простагландинов – серий Е и F, отличающихся друг от друга тем, что первые содержат кетогруппу, а вторые – гидроксильную группу при С-9 циклопентанового кольца. Каждая из серий включает по три простагландина: Е1, Е2, Е3, F1α, F2α, F3α. Остальные 18 относятся к вторичным, так как являются продуктами ферментативного превращения первичных. Так, простагландины серии А образуются в результате дегидратации циклопентанового кольца простагландинов Е (ПГЕ), а серии В – из простагландинов А (ПГА) путем изомеризации двойной связи кольца. Всего различают 10 типов простагландинов, обозначаемых буквами латинского алфавита от А до J. Учитывая количество двойных связей, к буквам добавляется нижний индекс 1,2,3. В зависимости от пространственного положения гидроксила к индексам добавляются буквы α и β. Простагландины обладают широким спектром биологической активности: стимулируют сокращение матки, бронхов и миокарда, тормозят желудочную секрецию. В клетках эндотелия сосудов производные простагландинов – простациклины – вызывают вазодилатацию и тормозят агрегацию и активацию тромбоцитов. Конечные продукты биосинтеза простагландинов неодинаковы в различных органах и тканях. Простагландины типа F усиливают аллергическую реакцию, типа Е: ПГЕ1 – природный пироген, разобщитель окисления и фосфорилирования, ПГЕ2 ускоряет агрегацию тромбоцитов. Изучение комплекса ферментов, катализирующих превращение арахидоновой кислоты в тромбоцитах, показало существенные различия с другими клетками. Этот комплекс был назван тромбоксансинтетазой. Тромбоксансинтетаза локализована в мембранах эндоплазматической сети [9], здесь же обнаруживаются некоторые компоненты моноаминоксидазной системы: гемопротеид близкий к цитохрому Р-450, цитохром b5. Тромбоксансинтетаза катализирует превращение простагландина ПГН2 в тромбоксан А2 (ТрА2), который является мощным стимулятором активации и агрегации тромбоцитов. Установлено, что для нормального функционирования тромбоксансинтетазы необходимы гем и протопорфирин IX [Ho P.P.K., Walters C.P., Sullivan H.R., 1976, цит. 10]. Циклический АМФ в высоких концентрациях подавляет гидролитическое отщепление арахидоновой кислоты в фосфолипидах мембран тромбоцитов. Ингибитор цитохрома Р-450 имидазол блокирует процесс превращения простагландина ПГG2 в ПГН2, что угнетает производство тромбоксана А2 и активацию и агрегацию тромбоцитов в ходе воспалительного процесса. Цитохром Р-450 участвует также в синтезе простациклина ПГI2 в эндотелии, однако простациклины оказывают противоположное тромбоксанам действие – ингибируют активацию и агрегацию тромбоцитов. В связи с этим в ходе воспалительного процесса стимулируются как компоненты свертывающей, так и компоненты противосвертывающих систем. Преимущество в активности той или иной системы при развитии воспаления зависит от индивидуальных особенностей организма. Таким образом, в циклооксигеназном превращении арахидоновой кислоты на дальнейших этапах активно участвуют и ферменты системы гидроксилаз – цитохром Р-450. 19 Липоксигеназный путь превращений арахидоновой кислоты. Окисление данной кислоты осуществляет комплекс ферментов, называемый липоксигеназой. Различные липоксигеназы осуществляют окисление ненасыщенных жирных кислот, имеющих 4 двойные связи (арахидоновая или 5,8, 11,14-эйказатетраеновая кислота) в разных положениях двойной связи. Все известные в настоящее время биологически активные соединения окислены в 5-м положении под действием 5-липоксигеназы. Поскольку данные соединения содержат двойные связи и впервые были обнаружены в лейкоцитах, они названы лейкотриены. Помимо липидного компонента некоторые лейкотриены (ЛТ) содержат аминокислотные остатки. Общую формулу наиболее важных лейкотриенов можно представить следующим образом: OH COOH C5H11 X Х – аминокислотный фрагмент молекулы. Различные лейкотриены обозначаются латинскими буквами. В лейкотриене С аминокислотный участок представлен глутатионом, лейкотриен D содержит цистеилглицин, а лейкотриен Е – цистеин. Во всех случаях аминокислотные фрагменты присоединены к остатку жирной кислоты через атом серы цистеина. Наличие и количество двойных связей обозначаются нижним индексом. Например, ЛТС4, ЛТС3, ЛТС5 и т.п.[Samulson B., Borgeant P., Hammarstroms, 1979, цит. 12]. Лейкотриены являются сильными спазмогенами гладких мышц дыхательных путей и кишечника. В отличие от гистамина, лейкотриены вызывают более сильное и продолжительное сокращение, однако их действие развивается медленнее, чем под действием гистамина [3]. Лейкотриены проявляют выраженную активность в концентрациях –9 5·10 – 5,5·10–4М. Механизм их спазмогенного действия до конца еще не изучен, известно лишь, что он не связан с мобилизацией кальция из саркоплазматического ретикулума. Лейкотриены С4 и D4 повышают проницаемость сосудов кожи, оказывая подобное гистамину действие [Hanna C.J.and oll., 1981, цит. 12]. Основной функцией лейкотриенов В считают индукцию хемокинеза лейкоцитов, их агрегации и дегрануляции. ЛТВ4 – мощный фактор хемотаксиса для нейтрофилов и эозинофилов и сравним по действию с С5а фрагментом белков комплемента. 20 Спектр лейкотриенов, производимых различными лейкоцитарными клетками, весьма различен, но имеет малые видовые различия у млекопитающих [12]. В нестимулированных клетках синтез лейкотриенов идет очень медленно. Сигналом к ускорению производства ЛТ является взаимодействие с клеткой комплекса антиген-иммуноглобулин Е, а также ряд других комплексов антиген-антитело. Кроме того, стимуляция образования и выделения ЛТ идет под действием бактериальных липополисахаридов и других факторов активации альтернативного пути комплемента. Непосредственными стимуляторами являются фрагменты С3а и С5а (анафилотоксины) системы комплемента. Первой реакцией синтеза любого из ЛТ является окисление арахидоновой кислоты под действием 5-липоксигеназы, которое сопровождается присоединением молекулы кислорода в положении 5, в результате образуется 5-гидроперекись, дегидратирующаяся с образованием 5-оксидоарахидоновой кислоты, то есть лейкотриена А. Данный лейкотриен, обладающий биологической активностью, является нестабильным соединением. Время его полураспада около 3 минут. Лейкотриен А становится предшественником других ЛТ. При гидролизе ЛТА образуются ЛТВ. Образование других ЛТ связано с восстановлением ЛТА и включением аминокислотного фрагмента в положение 6. Способность ЛТ повышать проницаемость сосудов, вызывать клеточную инфильтрацию (хемотаксис лейкоцитов), стимулировать дегрануляцию полимормоядерных лейкоцитов свидетельствует о том, что эти соединения занимают одно из центральных мест в поддержании аллергического воспалительного процесса. Биохимические механизмы регуляции производства вторичных медиаторов воспаления. Вторичная волна медиаторов воспаления (простагландинов, тромбоксанов, лейкотриенов) приводит к активации таких мощных разрушительных процессов, как сужение сосудов и увеличение их проницаемости, тромбообразование или, наоборот, кровоточивость, повышение температуры, лизис клеток. Естественно, что существует система регуляции, препятствующая гиперпроизводству медиаторов и способствующая восстановлению гомеостаза организма. Одним из таких механизмов, как мы описывали выше, является альтернативный процесс превращения циклической эндоперекиси в сосудистом эндотелии в простациклин ПГI2, вызывающий расширение сосудов и подавление активации тромбоцитов. Кроме альтернативного синтеза соединений с противоположным действием, в клетках существуют сложные механизмы регуляции процессов образования биологически активных соединений по принципу обратной связи с помощью вторичных сигнальных молекул, производящихся в них в ответ на действие первичных сигналов (гормонов, медиаторов, цитокинов). 21 Рассмотрим возможную схему регуляции синтеза тромбоксанов в тромбоцитах млекопитающих [36,37]. В основе этого процесса регуляции лежит блокирование отщепления арахидоновой кислоты от фосфотидилинозита с помощью фосфолипазы А2 за счет ингибирования ее активности цГМФ (вторичная сигнальная молекула). Гуанилатциклаза (КФ 4.6.1.2.) катализирует образование циклического ГМФ (3′-5′ циклизация) из ГТФ. Фермент существует в двух формах: растворимой и мембраносвязанной. В настоящее время установлено, что это два различных фермента, с разными механизмами регуляции [36]. Характерной особенностью растворимых гуанилатциклаз (ГЦ) является наличие в молекуле гемовой структуры и активации гема с помощью NO, или соединений, содержащих в своем составе и образующих окись азота. Важная роль гема в регуляции активности ГЦ была показана в работах Монкадо [цит. по 36] , установившего в 1987 году эндогенную природу NO. Оказалось, что в эндотелии сосудов в ответ на действие гормонов и нейротрансмиттеров (ацетилхолина, брадикинина, гистамина) образуется эндотелиальный фактор, расширяющий сосуды (ЭДФР). ЭДФР был идентифицирован как NO, синтезирующийся из L-аргинина за счет окисления азота аминогруппы гуанидинового фрагмента под влиянием фермента L-аргинин-NO-синтетазы (NOS). Образование NO из L-аргинина было найдено во многих клетках и тканях, в том числе в клетках крови: тромбоцитах, эритроцитах, лейкоцитах. Эндогенный NO – мощный фактор гемостаза, эндогенный вазодилататор. Однако истинным активатором ГЦ является комплекс нитрозил-гем, который образуется при взаимодействии свободнорадикальной группы NO с гемом гуанилатциклазы, при этом железо выступает из плоскости порфириного кольца. Нитрозил-гемовые комплексы могут возникать и в результате взаимодействия NO или NO-соединений с гемом других гем-содержащих протеинов: гемоглобином, миоглобином, каталазой и другими. ГЦ характеризуется значительно более высоким сродством к нитрозил-гемовому комплексу, что определяет возможность его переноса на фермент с других гемсодержащих белков, но не наоборот. Было показано, что тиолы способствуют активации ГЦ NO-содержащими соединениями [35], что свидетельствует о наличии активных SH-групп в каталитическом центре фермента. Отличительным свойством растворимой гуанилатциклазы также является способность фермента активироваться свободными радикалами. В экспериментах было показано, что цГМФ тормозит освобождение арахидоновой кислоты из фосфолипидов тромбоцитов, но не влияет на скорость дальнейших превращений, то есть образование циклической эндоперекиси и тромбоксана А2. Это может служить основой для предположения ингибирующего действия цГМФ на фосфолипазы (рис.1.2). 22 Взаимодействие гормонов и медиаторов (адреналин, норадреналин, гистамин, ангиотензин II) с рецепторами тромбоцита (особенно с α-адренорецепторами) сопровождается активацией фосфолипаз, а именно фосфолипазы С, и распадом фосфатидилинозита, которое приводит к производству двух вторичных сигнальных молекул: инозитол-3-фосфата (И3Ф) и диацилглицерола (ДАГ). Кроме тромбоцитов, фосфолипазы С обнаружены и во многих других клетках (нейронах, гепатоцитах, энтероцитах, миоцитах, лимфоцитах и др.)[33]. ФОСФОЛИПИДЫ МЕМБРАН Фосфатидилхолин, фосфатидилэтаноламин ФОСФОЛИПИДЫ Свободные МЕМБРАН радикалы ненасыщенных жирных кислот Фосфатидилинозит Фосфолипаза А2 Арахидоновая кислота Фосфолипаза С ГЦ ГТФ Циклическая эндоперекись цГМФ ДАГ + И3Ф ПК С Мобилизация Са2+ Тромбоксансинтетаза Са2+кальмодулин Тромбоксан А2 NOS L-арг NO + цитрулин Активация и агрегация тромбоцитов Рис. 1.2. Схема синтеза тромбоксана А2 и активация тромбоцитов. Пунктирной линией показано блокирование фосфолипаз цГМФ [36,37] Фосфолипаза С из тромбоцитов имеет молекулярную массу 68 кДа. Она катализирует расщепление фосфоиноизитов при концентрации Са2+ от 150 мкМ до 5 мМ [40] и в области рН 5-7 [33]. В настоящее время есть основания предполагать, что в клетке фосфолипаза С ассоциирована с белком или липидом с молекулярной массой 20 кДа [40]. Она ингибируется рядом фосфолипидов: фосфатидилхолином, фосфатидилсерином. Возможно, при образовании гормонрецепторного комплекса и формировании кластеров, происходят разрушение комплекса и транслокация фермента в мембрану, где он осуществляет гидролиз фосфатидилинозита c образова23 нием ДАГ и И3Ф. Инозитол-3-фосфат стимулирует выход кальция из эндоплазматического ретикулума, а ДАГ активирует протеинкиназы С (ПК С) (ДАГ-зависимые), что лежит в основе каскадных процессов активации и агрегации тромбоцитов (рис.1.2). Циклический ГМФ блокирует активацию фосфолипазы С, что останавливает процесс активации. Запускается же обратная связь через активацию NOS комплексом Са2+-кальмодулин, являющимся природным активатором данного фермента (рис.1.2). Есть путь регуляции синтеза простагландинов через аденилатциклазную систему и цАМФ. Известно, что сами простагландины угнетают аденилатциклазу, а цАМФ активирует их синтез. При этом возникает отрицательная обратная связь: после активации фосфолипаз, аденилатциклазы и образования цАМФ образовавшиеся простагландины ингибируют аденилатциклазу и выключают свой синтез. Циклический АМФ активирует синтез простагландинов, вероятно, через протеинкиназы А, осуществляющие фосфорилирование и, соответственно, активацию простагландинсинтетазного комплекса ферментов. Делая заключение, можно сказать, что как сами жирные кислоты, так и их производные – простагландины, тромбоксаны, лейкотриены – являются мощными медиаторами воспаления, образующимися вслед за выбросом первичных медиаторов: гистамина, серотонина, кининов. Простагландины вызывают лихорадку, увеличение проницаемости сосудов и их сужение, действуют на болевые рецепторы. Повреждение тканей и процессы свертывания крови при воспалении. При воспалении обязательно происходит повреждение тканей, хотя бы местное в очаге воспалительного процесса. Любое повреждение тканей затрагивает сосуды и тем самым вызывает активацию свертывания. С патогенетической точки зрения особенно важно подчеркнуть возможность перехода фибриногена в фибрин не только под действием физиологического фактора – тромбина, специфической протеазы, отщепляющей пептид от фибриногена при превращении его в фибрин, но и под действием протеаз различного происхождения. Например, папаина (протеаза ряда растений), коагулазы стафиллококков, протеазы из яда змей. Подобно фрагментам комплемента, фрагменты, отщепляемые от белков свертывающей системы крови, выполняют роль медиаторов воспаления. После отщепления пептидного фрагмента от фибриногена, фибринмономеры соединяются между собой мощными амидными связями через ε-аминогруппу лизинового остатка одного мономера и γ-карбоксильной группой глутаминовой кислоты другого мономера. При этом их растворимость резко падает, а способность к полимеризазии и формированию сгустка возрастает. При расщеплении фибриногена под действием плазмина (протеолитический фермент противосвертывающей системы крови) отще24 пляемые пептиды получили название продуктов деградации фибриногена. Продукты плазминового гидролиза фибриногена различаются между собой молекулярным весом, иммунологическими свойствами, элекрофоретической подвижностью и термостабильностью. Молекулы фибрин-мономеров способны образовывать с продуктами деградации фибриногена (ПДФ) растворимые комплексы, устойчивые к действию тромбина. Однако в патологических условиях данные комплексы приобретают свойство полимеризоваться. Этот процесс получил название паракоагуляции. Паракоагуляция активизируется в присутствии четвертого тромбоцитарного фактора и протаминсульфата. Растворимые комплексы фибрин-мономеров с ПДФ имеют физиологическое значение, которое заключается, в частности, в образовании слоя, выстилающего интиму сосудов и обеспечивающего гладкость сосуда. При формировании атипичных фибрин-мономерных комплексов нарушается структура слоя, вследствие чего повышается проницаемость эндотелия и развивается кровоточивость. У различных продуктов расщепления фибриногена обнаруживается разная биологическая активность. Так антикоагуляционным действием, которое выражается в подавлении полимеризации фибрин-мономеров, обладают фрагменты, обозначаемые как X, Y, D. Пептидные фрагменты с низким молекулярным весом – А, B, C – усиливают действие гистамина и брадикинина, влияют на физикохимические свойства мембран, снижая порог физиологической чувствительности рецепторов. Количество растворимых комплексов фибрин-мономеров увеличивается при воспалении, что повышает вязкость крови, способствуя агрегации эритроцитов и повышению скорости их оседания (СОЭ). Концентрация ПДФ в плазме крови увеличена у больных с тяжелой диссеминированной внутрисосудистой коагуляцией [35]. Состояние диссеминированной внутрисосудистой коагуляции может возникать при гипертермии, укусе змеи, осложненных родах, внутрисосудистом гемолизе, инфаркте миокарда и др. Рассмотрим важнейшие факторы, нарушающие процессы свертывания крови при воспалении. 1. Бактериальные эндотоксины. Для ряда бактериальных эндотоксинов показана способность активировать процесс превращения фибриногена в фибрин по еще неизвестному механизму. 2. Тканевые тромбопластины. Источниками активного тромбопластина становятся поврежденные клетки, гемолизированные эритроциты. 3. Комплексы антиген-антитело или агрегированные антитела. Данные крупные комплексы, адсорбируясь на интиме, могут восприниматься контактным фактором Хагемана как повреждение поверхности эндотелия и активировать свертывание, фибринолиз, кининогенез. 4. Коллоидные молекулы, липидные агрегаты. Действуют по вышеописанному механизму. 25 5. Вирусы. Механизм активации – через активацию системы комплемента, образование комплексов антиген-антитело и повреждение сосудистого эндотелия. 6. Замедление кровотока, что приводит к активации внутрисосудистого свертывания. 7. Активация протеолитических ферментов, которые поступают из лизосом разрушенных клеток, а также из клеток бактерий и ядов. Нарушения процессов свертывания крови сопутствуют любому воспалительному процессу и проявляются при сильном воспалении либо в виде тромбозов, либо, наоборот, увеличении кровоточивости. Чем тяжелее клиническое течение воспалительного процесса, тем более выражены изменения свертывающей и антисвертывающей систем крови. В настоящее время установлено, что причиной этих расстройств является одновременная активация внутрисосудистого свертывания и фибринолиза, ведущая к постепенному истощению факторов свертывающей и противосвертывающих систем. Важная роль в активации данных систем принадлежит тромбоцитам. Под действием бактериальных, вирусных антигенов, а также иммунологических комплексов происходят активация тромбоцитов и их агрегация. Основной реакцией тромбоцитов после агрегации является их агрануляция, то есть распад гранул с выделением новых порций медиаторов воспаления: гистамина, серотонина, простагландинов. В развитии воспалительного процесса секреция медиаторов играет ведущую роль, так как это приводит к лавинообразному нарастанию воспалительной реакции за счет аутокаталитической активации все новых ферментных систем, образованию все новых медиаторов. Зачастую течение воспалительного процесса больше зависит от наличия медиаторов и наличие соответствующих ингибиторов, чем от собственно инициаторов воспаления. Классическим примером является врожденный вазомоторный ринит (отек слизистых носа). Изначально вызывается инициирующим фактором (например, холодным воздухом), а затем недостаток ингибитора С1¯ компонента комплемента обусловливает избыточную воспалительную реакцию за счет большого количества медиаторов воспаления. Действие медиаторов воспаления сопровождается освобождением лизосом из поврежденных клеток и выбросом лизосомальных ферментов в межклеточный матрикс. Лизосомы содержат около 40 различных гидролаз в неактивном состоянии. Кроме гидролаз присутствуют также оксидазы. Лизосомы содержат несколько видов гидролаз: эстеразы, фосфолипазы, фосфатазы, сульфатазы, гликозидазы и различные протеолитические ферменты. Система лизосомных протеаз получила название катепсинов. D-катепсины, Е-катепсины и коллагеназы являются эндопептидазами и осуществляют деградацию белков до полипептидов. Дальнейшее расщепление пептидов происходит под действием катепсина А. Катепсины 26 В и С - амино- и карбоксипептиды и завершают расщепление пептидов до аминокислот. Некоторые бактериальные токсины (например, стрептолизин С) обусловливают гибель клеток за счет освобождения лизосомальных ферментов и их выброс в экстрацеллюлярный матрикс. В плазме крови, подобно ингибиторам остальных ферментных систем, присутствуют ингибиторы лизосомальных ферментов, продуцируемые клетками печени. Они представляют собой гликопротеиды, количество которых увеличивается при развитии воспалительного процесса. В медицине эти белки получили название белков острой фазы воспаления. К ним относятся серомукоиды, гаптоглобин, α2макроглобулин. Последний белок является ингибитором В и D-катепсинов. Еще одним ингибитором катепсинов служит α1-антитрипсин, он менее специфичен и угнетает активность многих протеаз. Недостаток этого ингибитора приводит к чрезмерному повреждению тканей, перерождению легочной ткани (эмфиземе легких). Лисозомальные ферменты играют важную роль не только в процессах воспаления, но и в физиологических процессах внутриклеточного переваривания. Поэтому недостаток лизосомальных ферментов приводит к развитию так называемых болезней накопления, когда в организме накапливаются неразрушенные компоненты клеток, отслуживших свой срок. По современным данным, лизосомальные ферменты освобождаются из нейтрофилов и макрофагов не только при распаде этих клеток, но и под действием низкомолекулярных С3а и С5а фрагментов комплемента, называемых ФОЛ (LRF) – фактор освобождения лизосом. Особая роль в процессах патологического освобождения лизосомальных ферментов принадлежит иммунным комплексам. Одной из главных причин повреждения тканей при первичном полиартрите и гломерулонефрите считается освобождение лизосомальных ферментов под действием комплексов антиген-антитело и медиаторов воспаления. Также важная роль лизосомных ферментов была показана при развитии приступов подагры. Как оказалось, кристаллы мочевой кислоты, откладывающиеся в межклеточный матрикс, фагоцитируются нейтрофилами или макрофагами. Активация макрофагов ведет к выделению интерлейкинов и запуску через Т-хелперы производства антител В-лимфоцитами. Формирование иммунологических комплексов сопровождается активацией контактного фактора Хагемана с последующей стимуляцией систем свертывания, фибринолиза, кининогенеза и белков комплемента. Кроме того, доказано, что мононатриевые ураты способны взаимодействовать с мембранами лизосом и липосом, что приводит к выделению лизосомальных ферментов и нарушению обмена липидов и холестерола. Для процессов воспаления характерна некоторая степень видовой и индивидуальной специфичности. Она обусловлена, прежде всего полиморфизмом белковых и небелковых медиаторов воспаления. Кроме того, 27 особенности течения воспалительных процессов часто зависит от индивидуальной чувствительности к медиаторам. Как процесс инициации, так и его последующее течение во многом зависит от особенностей генотипа, так как главное значение имеет соотношение медиаторов воспаления и их ингибиторов, состояния иммунокомпетентных систем организма. Видовые отличия определяются, прежде всего резистентностью к одним антигенам и, наоборот, чувствительностью к другим по сравнению с другими видами. Например, некоторые микроорганизмы и другие патогенные факторы, вызывающие острые воспалительные процессы у человека, не патогенны для других животных. 1.2. Нарушения процессов гомеостаза. Гомеокинез [2,3,17,18,26,27,42] Состав и функции крови. Кровь как центральная внутренняя среда человеческого организма выполняет ряд важных функций: регуляторную, питательную, экскреторную, транспортную, защитную и другие. Регуляторная функция крови заключается в создании и поддержании гомеостаза – относительного, динамического постоянства внутренней среды и тканей организма. Изучение механизмов гомеостаза, а также его изменений – гомеокинеза – имеет чрезвычайно большое значение для диагностики патологических процессов, оценки тяжести их протекания, а также эффективности лечения. Главными параметрами гомеостаза, которые поддерживаются в жестких пределах изменений, являются рН и ионный состав, осмотическое давление, температура. Более лабильными, которые могут колебаться в довольно широких пределах являются соотношение метаболитов, продуктов обмена, иммунологический и гормональный статус. На долю крови приходится 1/13 часть всей массы тела человека. Количество крови изменяется при ряде патологических состояний. Чаще всего наблюдается уменьшение жидкой части крови, реже – увеличение. Удельный вес крови в норме колеблется от 1,050 до 1,060 при температуре +150С. У новорожденных немного выше. Удельный вес связан с вязкостью крови, которая в свою очередь определяется гематокритом, то есть соотношением форменных элементов и плазмы крови. Гематокрит выражается в виде коэффициента, который представляет собой часть, приходящуюся на форменные элементы. В норме гематокрит составляет 0,450,55. В норме вязкость крови – величина постоянная, изменяется она мало, так как вода, поступающая из кишечника, быстро связывается тканевыми белками и солями, часть экскретируется почками, выдыхается с воздухом, выделяется с потом. Снижение вязкости крови наблюдается при уменьшении содержания плазменных белков, что в свою очередь характерно для различных форм 28 поражения клеток печени, где синтезируются плазменные белки. Также снижение вязкости наблюдается при различных видах анемий – уменьшении количества эритроцитов или гемоглобина в крови. Все анемии принято делить на 4 вида. Рассмотрим коротко виды анемий и их причины. 1. Геморрагические Причиной являются кровопотери. Тяжесть анемии определяется уровнем кровопотери. Небольшие кровопотери стимулируют процессы эритропоэза и в некоторых случаях полезны. Небольшое снижение содержания гемоглобина можно наблюдать у некоторых женщин после обильной менструации. 2. Железодефицитные Патогенетический фактор – недостаточность железа для синтеза гемовых структур. Данный вид анемии может быть обусловлен алиментарным дефицитом при несбалансированном питании; нарушением процессов транспорта железа, замедленной его мобилизацией из депо; изменением распределения железа при инфекционных заболеваниях, воспалительных процессах и новообразованиях. 3. Фолиеводефицитные (пернициозные, мегалобластические анемии) Заболевание развивается вследствие дефицита витаминов В12 и фолиевой кислоты. Недостаточность цианкобаламина часто возникает вследствие мутации по гену, ответственному за синтез гастромукопротеина в клетках слизистой желудка и нарушения транспорта В12 в кровь. 4. Наследственные гемолитические анемии Обусловлены мутациями генов, участвующих либо в синтезе гемоглобина, либо ряда ферментов, определяющих устойчивость и жизнеспособность эритроцитов, но не связанных с непосредственным восстановлением самого гемоглобина. С нарушением синтеза гемоглобина (белковой части) связаны такие виды гемолитических анемий, как талассемия, серповидноклеточная анемия, метгемоглобинемия. При талассемии нарушается синтез α-цепей (α-талассемия) или β-цепей (β-талассемия) гемоглобина. Может быть нарушен синтез и α и β-цепей (σ-талассемия). Возникающие патологические формы гемоглобина обладают бόльшим сродством к кислороду и это приводит к нарушению транспорта кислорода. При всех видах талассемии страдают производство эритроидных клеток в костном мозге и насыщение гемоглобином эритроцитов. Серповидноклеточная анемия обусловлена присутствием в эритроцитах патологической формы гемоглобина – НвS. У НвS в 6 положении глутаминовая кислота заменена на валин. Замена одного аминокислотного остатка привела к существенному изменению конформации белка. В дезоксигенированном состоянии НвS образует длинные ассоциированные цепи и его растворимость снижается на 50% по сравнению с растворимостью 29 оксигенированной формы. Это приводит к потере клетками способности к изменению формы и гибели эритроцитов при входе в капилляры. Метгемоглобинемии могут быть результатом наследственного дефицита НАДФ-метгемоглобинредуктазы (К.Ф.1.6.7.1.). Обычно болезнь не имеет существенных последствий, так как не нарушены другие пути восстановления гемоглобина, и характеризуется снижением срока жизни эритроцитов и ускорением стимуляции эритропоэза. Следует отметить, метгемоглобинемии необязательно наследственные, они могут возникать при отравлении нитратами, нитритами, нитрозосоединениями, анилином, сульфониламидами, ацетиланилидом и бромидами. Энзимопенические анемии определяются недостаточностью глюкозо6-фосфатдегидрогеназы, 6-фосфоглюконатдегидрогеназы и глутатионредуктазы эритроцитов. Более подробно об этих ферментах будет рассказано в разделе, описывающем ферменты плазмы крови и форменных элементов. Повышение вязкости крови наблюдается при обезвоживаниях. Обезвоживание сопровождает дизентерии, диареи различной этиологии, холеру, рвоту, сахарный диабет, гипофункцию надпочечников. Особенно быстро развивается повышение вязкости крови у грудных детей при токсикозах, энтеритах и может привести к гибели детей. Состав плазмы крови. Плазма крови составляет около 55% от всей крови и на 90% состоит из воды. В воде растворено около 7% белков, около 1% других органических веществ и 1% неорганических соединений. Изучение состава плазмы и вообще крови дает представление об интенсивности обмена веществ, о функциях отдельных органов и тканей. Большинство патологических процессов сопровождается изменениями состава крови или количества и функций форменных элементов. Вода плазмы крови составляет лишь 8% от количества всей воды в организме человека, 66% воды находится внутри клеток, 33% во внеклеточной жидкости (из них 8% в плазме). Обычно молекулы воды свободно обмениваются между вне- и внутриклеточными средами, и их распределение зависит только от осмотических свойств этих сред. Общее содержание белков в плазме крови в норме колеблется от 60 до 85г/л. Биосинтез протеинов плазмы крови осуществляется преимущественно в гепатоцитах и клетках ретикулоэндотелиальной системы. Снижение содержания белков плазмы – гипопротеинемия – сопровождает многие патологические процессы: тяжелые поражения печени (как первичные, так и вторичные), злокачественные опухоли. Все гипопротеинемии делят на первичные и вторичные. Первичные гипопротеинемии – обычно наследственные формы или проявляются у недоношенных детей. Чаще всего наблюдается снижение 30 содержания альбуминов или их аномалия, связанная с мутацией гена синтеза альбумина в гепатоцитах. Вторичные гипопротеинемии в зависимости от происхождения могут быть обусловлены: – недостаточностью белка в питании или нарушением переваривания и всасывания белка после заболеваний; – врожденными дефектами переваривания и всасывания белков; – нарушением синтеза белков в печени; – усиленной потерей белка (острые и хронические кровопотери, большая раневая поверхность, генерализованная экзема, обширные ожоги, потери через желудочно-кишечный тракт в результате поносов и рвоты, протеинурия); – ускоренным распадом белков (гипертиреоидизм, болезнь Кушинга, острые инфекции, распад опухолевых тканей). Увеличение – гиперпротеинемия – наблюдается при острых воспалительных процессах, рвоте, обезвоживании. Качественный и количественный состав белков плазмы крови будет рассмотрен в специальном разделе. Среди других органических соединений важную роль играет глюкоза, количество которой составляет от 3,0 до 5,5 мМ/л натощак, после приема пищи уровень глюкозы может кратковременно достигать 7 мМ/л. В плазме крови постоянно находятся свободные аминокислоты, их количество и спектр значительно изменяются после приема пищи. Натощак уровень свободных аминокислот может превышать естественные колебания при экссудативном диатезе, заболеваниях печени, лихорадках. А также подъем содержания аминокислот в плазме крови наблюдается в условиях активного распада тканей (туберкулез, гангрена, злокачественные опухоли). В этих условиях можно обнаружить также повышение содержания пептидов в плазме крови. Кроме того, рост пептидных соединений характерен для острого воспаления (фрагменты плазменных протеаз), для тяжелых заболеваний печени и почек. К органическим продуктам обмена белков относятся мочевина, креатинин, индикан и др. К неорганическим – аммиак и аммонийные катионы. Эти вещества в совокупности с аминокислотами, нуклеотидами и другими азотсодержащими соединениями составляют фракцию остаточного азота плазмы крови. В процентном отношении главным компонентом остаточного азота является мочевина, на нее приходится 50%, аминокислоты составляют 25%, креатин – 5%, мочевая кислота – 4%, креатинин – 2,5%. У здорового человека уровень остаточного азота равен 14-25 мМ/л, у новорожденного он значительно больше – 42-71 мМ/л. На показатель остаточного азота (ОА) крови влияют такие факторы, как уровень поступления пищевого азота, интенсивность азотистого катаболизма в тканях, уровень выведения азотистых продуктов из организма. Повышение содержания ОА в крови обозначается азотемией. Различают продукционную и ретенционную азотемию. В основе 31 продукционной азотемии лежит увеличение поступления пищевого азота или усиленная деструкция тканей. Ретенционная азотемия – нарушение выведения конечных продуктов азотистого обмена организма. Содержание мочевины в норме колеблется от 2,5 до 8,3 мМ/л. Повышение фиксируется при почечной недостаточности, нефрозах, перитоните, инфекционных заболеваниях (холера, тиф, дизентерия), шоковых состояниях (ожег, отравление, другие тяжелые травмы). Желудочно-кишечные кровотечения также сопровождаются увеличением содержания мочевины в плазме крови. Нарушения гемодинамики при сердечно-сосудистых заболеваниях вследствие снижения клубочковой фильтрации также сопровождаются небольшим повышением уровня мочевины в плазме. Особенно высокое содержание мочевины в крови фиксируется при острой почечной недостаточности, когда количество мочевины достигает 50-80 мМ/л. Патологией является и снижение уровня мочевины, которое наблюдается при желтухе, острой печеночной дистрофии, циррозах, что связано с нарушениями цикла мочевины, протекающего только в гепатоцитах. Креатин и его производное креатинин по диагностической ценности не уступают мочевине. В организме существует два источника креатина: креатин пищевых продуктов (мясные продукты, печень), креатин, образующийся в организме из аргинина, глицина и метионина. Начальный этап синтеза креатина протекает в нефроцитах, заканчивается в гепатоцитах, откуда он поступает в кровь и захватывается клетками мышц, эритроцитами, нейронами. В мочу креатин в норме не поступает, креатинурия наблюдается только в период полового созревания (14-16 лет) или у стариков. В первом случае это следствие усиленного синтеза креатина, отражающего его потребность для мышечной ткани, а во втором – следствие атрофии мышц и неполного использования синтезируемого креатина. Также креатинурия может наблюдаться при беременности, употреблении с пищей продуктов, богатых креатином. К патологиям, сопровождаемым креатинурией, относятся различные миопатии, мышечные дистрофии, гипертермии, обширные ожоги и другие поражения мышечной ткани. Креатинурия может наблюдаться при поражениях печени, сахарном диабете, гипертиреозе, аддисоновой болезни, акромегалии, инфекционных заболеваниях, переохлаждении организма, в результате нарушения синтеза креатинфосфата. Креатинин в норме колеблется от 65 до 106 мкМ/л. Причем у женщин – 65-80, а у мужчин 80-106 мкМ/л. Увеличение его содержания обычно указывает на усиленный катаболизм белков, если не сопровождается ростом мочевины. Если рост креатинина происходит параллельно с увеличением содержания мочевины, то это – следствие почечной недостаточности. Однако нормальный уровень плазменного креатинина не всегда свидетельствует об отсутствии патологии. Пределы колебаний зависят от возраста и размера тела. Высокие значения креатинина могут определяться у некоторых групп населения, при этом у девушек это свидетельство аномалии 32 и требует исключения заболевания почек, а у юношей с хорошо развитой мускулатурой – результат усиления белкового обмена. У пожилых людей небольшое повышение креатинина отражает физиологическое снижение скорости гломерулярной фильтрации. Аммиачные катионы являются самой незначительной фракцией ОА, их абсолютное количество обычно не превышает 11,6 мкМ/л. Особенно много аммиака образуется в клетках печени, почек, мышечной ткани, ткани мозга, а также в клетках слизистой кишечника. Увеличение содержания аммиака наблюдается чаще всего при заболеваниях печени, когда нарушается процесс образования мочевины. У больных циррозом печени, хроническими гепатитами повышение концентрации аммиачных катионов может достигать 58 мкМ/л, но наиболее высокие концентрации характерны для печеночной комы – до 116 мкМ/л. Клиническими симптомами аммиачной интоксикации являются тошнота, расстройство сознания, летаргия. Мочевая кислота представляет собой конечный продукт обмена пуриновых оснований. К повышению концентрации уратов в сыворотке ведут многие нарушения метаболических процессов, в том числе и наследственные. Среди них подагра, лейкемии, нефриты с почечной недостаточностью, некоторые формы артритов, анемии, ряд отравлений, лучевая болезнь, распад тканей. Более подробно это будет рассмотрено в главе, описывающей нарушения обменных процессов. К неазотсодержащим продуктам обмена, содержащимся в плазме крови, относится билирубин. Билирубин является конечным продуктом обмена гемовых структур, источником которых служат гемоглобин, миоглобин, гемсодержащие ферменты. Распад железосодержащего протопорфирина осуществляется в клетках ретикуло-эндотелиальной системы, где ежедневно образуется около 450 мкМ билирубина. Часть билирубина поглощается гепатоцитами. Он получил название конъюгированного (прямого) билирубина. В гепатоциты билирубин поступает с помощью белкапереносщика, который доставляет его в эндоплазматическую сеть. С помощью фермента уридилдифосфат-глюкуронилтрансферазы билирубин связывается (конъюгирует) с глюкуроновой кислотой, образуя билирубинмоно- и билирубин-диглюкурониды, которые в большей степени растворимы в воде, чем свободный билирубин. Конъюгированный билирубин в норме экскретируется в желчь. Неконъюгированный (непрямой, свободный) билирубин транспортируется в связанной с белками плазмы форме (преимущественно, с альбумином). В таком виде билирубин может переноситься на другие белки, в частности, на мембранные белки. Этим объясняется токсичность чрезмерно повышенного содержания билирубина у новорожденных. В норме концентрация общего билирубина в сыворотке крови составляет 8,5-20,5 мкМ/л, причем прямого – 0,9-4,3 мкМ/л, непрямого – 6,4-17,1 мкМ/л. Гипербилирубинемия может быть результатом повышенного образования билирубина, нарушением его метаболизма, сни33 жение экскреции с желчью или сочетание данных факторов. Метаболизм билирубина будет рассмотрен в главе нарушений обмена веществ. Повышение содержания билирубина наблюдается при желтухах различной этиологии: гепатиты, циррозы, внутрисосудистый гемолиз, опухоли желчного пузыря, поджелудочной железы и другие. Повышение концентрации свободного билирубина чаще всего наблюдается при внутрисосудистом гемолизе, либо синдроме Жильбера (наследственный дефект метаболизма билирубина). Активность конъюгирующих ферментов печени обычно бывает низкой при рождении, отражением этого служит «физиологическая» желтуха новорожденных. Превышение концентрации свободного билирубина выше 340 мкМ/л вызывает билирубиновую энцефалопатию (поражение нейронов). Превышение концентрации конъюгированного билирубина свидетельствует об утечке его из гепатоцитов или желчевыводящей системы, когда нормальные пути его экскреции закрыты. рН и ионный баланс крови. Метаболические процессы в клетках обычно сопровождаются образованием кислот и углекислого газа, соединение которого с водой сопровождается образованием угольной кислоты. Уровень же протонов в крови поддерживается в области рН 7,35-7,40 (в среднем 7,36). Осуществляется это благодаря наличию буферных систем крови. Главными буферными системами крови являются гемоглобиновая и бикарбонатная, тогда как внутри клеток рН поддерживается в основном за счет фосфатной буферной системы и белков. Бикарбонатный буфер составляет основной и наиболее лабильный внеклеточный буфер. Его составными частями служат угольная кислота и бикарбонат натрия. Данная буферная система нейтрализует примерно 40% всех высвобождаемых ионов водорода. Уникальность бикарбонатной буферной системы в том, что угольная кислота легко диссоциирует на воду и углекислый газ. В то время как другие буферы быстро становятся неэффективными в результате связывания водородных ионов и анионов слабой кислоты, бикарбонатные работают за счет удаления углекислого газа с выдыхаемым воздухом. Кислотно-основное состояние (КОС) крови определяется исследованием бикарбонатной системы плазмы. Связывание протонов бикарбонатом происходит довольно быстро, но расщепление Н2СО3 до СО2 и Н2О происходит под действием фермента карбоангидразы, которая присутствует в эритроцитах, поэтому данная реакция там и осуществляется. Гемоглобиновый буфер представлен калиевыми солями гемоглобина. Его буферность определяется наличием полярных групп аминокислотных остатков цепей гемоглобина. Гемоглобин является слабой кислотой, относительно высокая буферная емкость определяется только его большим количеством. Важность гемоглобина для поддержания рН крови также определяется непосредственной связью системы гемоглобина с бикарбонатной системой. 34 Рассмотрим физиологические механизмы поддержания рН крови. КОС оказывается непосредственно связано с транспортом газов кровью и респираторной функцией легких, а также в этом процессе принимают участие органы выделения: почки, кожа, толстый кишечник. В кровь непрерывным потоком поступают углекислый газ и другие продукты обмена из тканей, кислоты и основания из эпителия тонкого кишечника. Все это могло бы привести к истощению буферных систем, если бы не включались физиологические факторы и рН не восстанавливался. Углекислый газ, образующийся в процессах биологического окисления, диффундирует из клеток и растворяется в межклеточной жидкости. Небольшая его часть химически взаимодействует с водой, образуя угольную кислоту. Хотя этот процесс идет медленно, но он приводит к некоторому увеличению концентрации протонов в межклеточной жидкости. Остальная часть СО2 диффундирует в плазму крови и путем диффузии поступает в эритроцит по градиенту концентрации. Здесь образование угольной кислоты катализируется карбоангидразой. Диссоциация угольной кислоты приводит к образованию протонов и бикарбонатного аниона: Н2СО3↔ Н+ + НСО3⎯. Бикарбонат сдвигает равновесие влево в следующем уравнении, характеризующим известный эффект Бора: Нb +4О2↔ Hb (O2)4 + (H+)n. И гемоглобин отдает кислород в ткани, при этом связывая протоны. НСО3⎯ пассивно через анионный канал по градиенту концентрации переходит в плазму крови. Так как протоны не могут перемещаться через мембрану эритроцита свободно, при выходе бикарбоната в эритроциты эквимолярно поступает Cl⎯. Такое двойное перемещение известно под названием хлоридного сдвига. Углекислый газ транспортируется в виде бикарбоната натрия плазмы в легкие. В легких оксигенация гемоглобина приводит к двум основным результатам: отдаче протонов гемоглобином и сдвиге диссоциации в сторону образования угольной кислоты; разрушению Н2СО3 карбоангидразой до углекислого газа и воды. Уменьшение содержания НСО3⎯ ведет к усилению его входа в эритроцит и выходу Сl⎯, то есть в легких наблюдается обратный хлоридный сдвиг. Следует отметить, что 1015% углекислого газа может связываться с незаряженными аминогруппами с образованием карбаминовых групп: RNH2 + CO2 ↔ RNHCOOH ↔ RNHCOO⎯ 35 + H+. В этой реакции участвуют остатки лизина и аргинина, боковые группы которых имеют высокие значения рКа и потому остаются преимущественно в незаряженном состоянии. Таким образом, значительные изменения в концентрации протонов в плазме крови связаны с транспортом кислорода и углекислого газа. Важной ролью в поддержании КОС обладают почки. Эта роль состоит в реабсорбции и регенерации бикарбонатов, экскреции водородных ионов и кислотных анионов. Ежедневно клубочками фильтруется 4000 мМ бикарбонатов, большая часть которых реабсорбируется проксимальными канальцами. Проксимальные тубулярные клетки непроницаемы для бикарбонатов, поэтому реабсорбция осуществляется превращением бикарбоната в СО2, процесс требует присутствия протонов, которые секретируются в просвет канальцев из клеток, и карбоангидразы: Н+ + НСО3⎯ ↔ Н2СО3; Н2СО3 ↔ Н2О + СО2 Карбоангидраза Реакции проходят в просветах канальцев, а образовавшийся углекислый газ поступает в клетки. Здесь осуществляются обратные реакции: карбоангидраза катализирует соединение СО2 с водой, а угольная кислота диссоциирует. При этом протоны возвращаются в просвет канальцев, а бикарбонат – в плазму крови. Электрохимический баланс поддерживается одновременной реабсорбцией натрия. Одновременно может происходить регенерация бикарбонатов, протекающая по похожему механизму, только источником бикарбонатов служат сами клетки почечных канальцев (он образуется из углекислого газа, возникающего в процессах метаболизма этих клеток). Экскреция протонов в просвет канальцев требует наличия буферной системы, которой служат фосфаты. С помощью фосфатного буфера связывается около 30 мМ Н+ ежедневно. Около 40 мМоль протонов экскретируется ежедневно в виде аммонийных солей. Данная буферная система мочи основана на аммиаке, который образуется в клетках почечных канальцев при дезаминировании глутамина. Фермент глутаминаза, который катализирует эту реакцию, индуцируется в нефроцитах при хроническом ацидозе (закисление плазмы крови), что обеспечивает увеличение продукции аммиака и, следовательно, усиление экскреции ионов водорода в составе аммонийных солей. Следует отметить, что аммиак свободно способен диффундировать через клеточные мембраны, тогда как аммонийные катионы к этому не способны. В поддержании КОС участвуют также органы желудочно-кишечного тракта: желудок, тонкий кишечник. Желудком секретируется соляная кислота и бикарбонаты, нарушения КОС возникают, если секреты желудка утрачиваются. 36 В организме человека и высших животных существует и еще одна система поддержания кислотно-щелочного равновесия, которую обозначают как метаболическую [11,29]. Чтобы рассмотреть данные механизмы гомеостаза КОС, нам необходимо остановиться на состояниях временного сдвига кислотно-щелочного равновесия. Многие патологические процессы в организме связаны с отклонениями концентрации ионов водорода и парциального давления диоксида углерода (РСО2) и парциального давления кислорода (РО2) от нормы. Нарушения кислотно-основного баланса классифицируются как респираторные или нереспираторные (метаболические) в зависимости от того, является ли их первопричиной сдвиг РСО2. Ацидозом называется сдвиг равновесия в кислую сторону, а алкалозом в щелочную. Ацидоз и алкалоз называют компенсированными, если существует лишь угроза сдвига, и декомпенсированными, если сдвиг произошел и сохраняется определенное время. Ацидоз. Различают газовый (респираторный) и негазовый (метаболический) ацидоз. Газовый ацидоз наступает при нарушениях вентиляции легких, когда замедляется процесс отдачи СО2. Это встречается при расстройствах сердечной деятельности (явлении застоя), эмфиземе, пневмонии, бронхиальной астме, нахождении в среде с повышенным содержанием СО2. Может возникать при наркозах (блокирование дыхательного центра). Для всех состояний респираторного ацидоза характерно возрастание РСО2 и поэтому он может быть устранен только путем восстановления нормального парциального давления углекислого газа. Однако, если оно удерживается долго, то может происходить компенсация за счет усиления экскреции ионов водорода почками. Нереспираторный (метаболический) ацидоз характеризуется увеличением продукции или снижением экскреции ионов водорода (в некоторых случаях и то и другое). Увеличение образования протонов характерно для кетоацидоза (диабетического или алкогольного), лактоацидоза (тяжелая физическая нагрузка, гипоксия различной этиологии), отравлениях этанолом, метанолом, этиленгликолем, салицилатами. Алиментарный (пищевой) ацидоз может наступить после поступления большого количества кислой пищи, белков (аминокислоты). Снижение экскреции протонов почками наблюдается при выраженной почечной недостаточности, действии ингибиторов карбоангидразы. Метаболический ацидоз развивается и при потере бикарбонатов при поносе и рвоте. Сахарный диабет сопровождается выраженным кетоацидозом за счет накопления кетоновых тел в крови и тканях. Аналогичный процесс наступает и при длительном полном голодании. Образование и накопление кетоновых тел и в случае сахарного диабета, и при полном голодании обусловлены активацией бета-расщепления жирных кислот в условиях недостатка пировиноградной кислоты. В данной ситуации избыток ацетил-КоА 37 не может полностью утилизироваться в цикле Кребса из-за недостаточного количества оксалоацетата, образующегося из пировиноградной кислоты, которая в свою очередь в основном образуется из глюкозы. Невозможность быстрого окисления всего образующегося ацетил-КоА ведет к взаимодействию двух молекул этого соединения между собой: СН3-С~S-КоА + СН3-С~S-КоА СН3-С-СН2-СОО¯ ⎟⎟ ⎟⎟ -КоАSH ⎟⎟ О О О Ацетоацетил Ацетоацетил под действием декарбоксилазы или же химическим путем дает ацетон: СН3-С-СН2-СОО¯ ⎟⎟ О -СО2 СН3-С-СН3 ⎟⎟ О Ацетон Также под действием НАДН-зависимой редуктазы ацетоацетил может восстанавливаться в β-оксибутират: СН3-С-СН2-СОО¯ ⎟⎟ О СН3-СН-СН2-СОО¯ ⎟ ОН β-Оксибутират Ацетоуксусная кислота, ацетон и β-оксибутират обозначаются как кетоновые тела. Алкалоз также подразделяется на газовый и негазовый алкалоз. Газовый алкалоз наблюдается при повышении легочной вентиляции. Подобные ситуации возникают на большой высоте, в условиях физической нагрузки, при пониженном парциальном давлении кислорода, некоторых заболеваниях нервной системы (энцефалит), гипертермии. Негазовый алкалоз связан с увеличением щелочных резервов. Это может быть следствием поступления извне большого количества катионов (основная пища, сода, натриевые и калиевые соли слабых органических кислот). При рвоте, если теряется много кислот, также может развиться алкалоз. Теперь приступим к рассмотрению метаболической системы кислотно-щелочного гомеостаза в организме человека и высших животных. Эта система представляет собой совокупность определенных изменений в направленности и интенсивности обмена углеводов, липидов, аминокислот, нуклеотидов (белков и нуклеиновых кислот), имеющих место непосредст38 венно в клетках в ответ на нарушение кислотно-щелочного равновесия в организме [29]. Изменения в обмене углеводов. Повышение концентрации протонов в тканях на фоне пониженных концентраций бикарбонатов (состояние метаболического ацидоза) обусловливает значительное усиление процессов глюконеогенеза за счет кислот, уходящих из цикла Кребса, лактата, пирувата, глицерата, ацетата. Концентрации кислот при этом, как правило, снижаются. Наблюдается возрастание скорости гликогенолиза. Считают, что одной из причин перечисленных изменений в обмене углеводов при ацидозах являются усиление образования катехоламинов и глюкокортикоидов [Nahas G.G. and oll., 1967, цит. 29], а также торможение образования инсулина [Henguin J.,C., Lambert А.E. ,1975 цит. 29]. При алкалозах в тканях усиливаются процессы гликолиза и гликогеногенеза, увеличивается концентрация лактата и пирувата, а также метаболитов цикла Кребса (особенно цитрата), возрастает их экскреция с мочой [29]. Указанные изменения в обмене углеводов имеют важное гомеостатическое значение. Под действием избытка протонов и СО2 в клетках усиливается превращение органических кислот в глюкозу, являющуюся электролитнонейтральным соединением, что будет обеспечивать снижение закисления внутри клеток. При алкалозах, наоборот, глюкоза усиленно превращается в лактат, пируват, цитрат и другие кислоты, что пополняет внутриклеточный пул протонов. Следует отметить, что специфика того или иного заболевания, которое сопровождается нарушением КОС, может привести к некоторым особенностям в изменениях обмена углеводов, определяемым самой болезнью. Изменения в обмене ацетата и липидов. Во многих работах показано, что биосинтез липидов в тканях угнетается при ацидозах (особенно метаболической его форме). При умеренных формах алкалозов интенсивность биосинтеза липидов в тканях возрастает. Установлено, что стимулирующим влиянием на липогенез обладает повышение как величины рН среды, так и концентрации бикарбонатов в ней [11]. Как уже говорилось выше, при ацидозах наблюдаются усиление образования кетоновых тел и повышенное удаление их с мочой, молоком, потом и выдыхаемым воздухом. В связи с этим от больного сахарным диабетом в тяжелом состоянии, а также от человека на определенной стадии полного голодания пахнет ацетоном. Сам процесс образования кетоновых тел является компенсаторным механизмом преодоления ацидоза, поскольку он сопряжен со снижением концентрации Н+ в среде. Это обусловлено несколькими моментами: 1) две молекулы уксусной кислоты конденсируются в одну – кетобутират (ацетоацетат), который может превратиться в ацетон (электоронейтрален) или β-оксибутират; 2) β-оксибутират и β-кетобутират более слабые кислоты, чем уксусная кислота. 39 Если также учесть, что кетоновые тела интенсивно удаляются из организма, то кетоацидоз – очевидное звено системы метаболического кислотно-основного гомеостаза [29]. Изменения азотистого обмена. При ацидозах резко усиливается экскреция аммиака с мочой. Как оказалось, основным механизмом этого является значительное увеличение активности глутаминазы и аминоксидаз в тканях. Таким образом, в условиях ацидоза значительная часть аминокислот и их амидов (прежде всего глутамина) используется для ликвидации избытка протонов в клетках за счет фиксации их в аммонийных катионах, удаляемых с мочой. Увеличивается также скорость производства мочевины, что свидетельствует о включении гомеостатического механизма предотвращения аммонийного токсикоза. Однако усиление производства мочевины требует затрат энергии АТФ, нормального функционирования цикла трикарбоновых кислот (ЦТК), а эти процессы в условиях хронического ацидоза угнетаются. Отсюда следует, что при хроническом ацидозе концентрация аммиака в тканях может нарастать и будет вызывать усиление аммонийного токсикоза. Изменения обмена белков и нуклеиновых кислот. В условиях ацидоза синтез белков и образование азотистых оснований тормозится. Алкалоз же, наоборот, сопровождается более интенсивным синтезом белков и нуклеиновых кислот. Баланс воды, натрия и калия. Транспорт воды в организме не является активным процессом. Обычно молекулы воды свободно обмениваются между вне- и внутриклеточными средами, и их распределение зависит только от осмотических свойств этих сред. Основной вклад в осмоляльность (концентрация ионов и молекул в расчете на 1 кг растворителя) плазмы и других внеклеточных жидкостей вносят катионы натрия и сопутствующие им анионы (хлоридные, бикарбонатные), внутри клеток роль натриевых ионов выполняют ионы калия. Существенный вклад в осмоляльность вносят глюкоза и мочевина. Участие белков в количественном отношении невелико, примерно 0,5%. Однако поскольку эндотелий сосудов непроницаем для белков, а их концентрация в плазме намного выше, чем в межклеточной жидкости, белки являются важным фактором в поддержании осмотического давления плазмы крови. Вклад белков в осмотическое давление плазмы крови называют коллоидным осмотическим или онкотическим давлением. В норме количество воды, поступающей в организм человека, примерно равно количеству, выводимому из организма. Вода поступает с пищей и образуется в процессе окислительного метаболизма, а выводится с мочой, потом и выдыхаемым воздухом. Для нормального выведения продуктов метаболизма необходимо образование минимум 500 мл мочи в сутки, а, учитывая другие потери, ежедневное поступление воды должно со40 ставлять около 1100 мл. Данное количество возрастает при усиленном потоотделении, поносе, рвоте, когда потери воды увеличиваются. Концентрация ионов натрия в плазме и межклеточной жидкости составляет в норме 135-145 мМ/л. Большинство клеточных мембран плохо проницаемы для натрия, но некоторое проникновение все же происходит и концентрация натрия в клетках составляет 4-10 мМ/л. Градиент натрия поддерживается за счет активного выведения натрия из клеток с помощью Na+,K+-АТФ-аз. Поступление натрия в организм и его выведение сбалансированны. Потери его через кожу, почки и кишечник не превышают 10 мМ в сутки, тогда как поступление его с пищей обычно составляет 100200 мМ/сутки. Несмотря на то, что избыточное количество натрия выводится через почки, оно может принести вред, способствуя в некоторых случаях развитию гипертензии. Осмоляльность внеклеточной жидкости в норме составляет 282-295 мМ/кг воды. Любая потеря воды внеклеточной жидкостью повысит ее осмоляльность и вызовет перемещение воды из внутриклеточной среды во внеклеточную. Небольшое увеличение осмоляльности вне клеток приведет также к стимуляции гипоталамического центра жажды и гипоталамических рецепторов, что вызовет высвобождение вазопрессина (антидиуретического гормона). Рецепторы к вазопрессину имеют клетки почечных канальцев, образование гормонрецепторных комплексов приведет к увеличению скорости реабсорбции воды и концентрированию мочи. Осморецепторы сосудов очень чувствительны к изменениям осмоляльности, реагируя на изменения порядка 1%. Если осмоляльность внеклеточной среды снижается, то ощущение жажды не развивается и вазопрессин не секретируется. Моча становится разбавленной, что увеличивает потери воды и осмоляльность восстанавливается. Увеличение осмоляльности за счет увеличения концентрации веществ, легко поступающих в клетки (например, мочевины), сопровождается увеличением осмоляльности внутри клеток, и осморецепторы не стимулируются. Секреция вазопрессина возрастает при действии ангиотензина II, активации артериальных и венозных барорецепторов и волюморецепторов (воспринимают изменения объема жидкости). Механизмы контроля осмоляльности всегда работают с перекрытием, то есть они обеспечивают поддержание постоянного объема внеклеточной жидкости даже за счет некоторого снижения осмоляльности крови. Объем внеклеточной жидкости прямо зависит от общего содержания натрия в организме, поскольку выведение и потребление воды регулируются так, чтобы поддержать постоянство концентрации натрия в плазме крови. Натриевый баланс поддерживается путем регуляции экстреции натрия почками. В норме примерно 70% профильтрованных в первичную мочу катионов натрия подвергается активному обратному всасыванию в проксимальных извитых канальцах и петле Генле. Менее 5% профильтрованного натрия 41 достигает дистальных извитых канальцев. Альдостерон, выделяемый корой надпочечников, в ответ на активацию ренин-ангиотензиновой системы стимулирует реабсорбцию натрия в дистальных извитых и собирающих протоках. Он является основным фактором, регулирующим экскрецию натрия почками. Другим гормоном, принимающим участие в сохранении баланса внеклеточного натрия, служит натрийуретический гормон (НУГ). НУГ представляет собой 28-членный пептид, он секретируется предсердиями в ответ на их растяжение, вызываемое повышением артериального давления (например, при увеличении объема внеклеточной жидкости). Натрийуретический гормон действует двояко: угнетает реабсорбцию натрия в дистальных канальцах и снижает секрецию ренина (а, соответственно, и альдостерона). Он является антагонистом норадреналина и ангиотензина II, обладает системным вазодилататорным действием и обеспечивает тонкую регуляцию гомеостаза натрия. Идентифицированы еще два пептида, напоминающих по действию НУГ: первый секретируется желудочками сердца, второй – эндотелием сосудов. В целом механизмы регуляции объема внеклеточной жидкости действуют не так быстро и точно, как механизмы регуляции осмоляльности, поддержание которой имеет приоритетное значение. Катионы калия (в отличие от натрия) являются основными катионами клеток, поэтому во внеклеточной жидкости их находится около 2% от их общего содержания в организме. В организме калий постоянно диффундирует из клеток во внеклеточную жидкость, но этому процессу препятствует работа Na+, K+-АТФ-зы. Баланс внеклеточного калия регулируется почками и в меньшей степени желудочно-кишечным трактом. Экскреция калия с мочой зависит от нескольких факторов: - количества натрия, доступного для реабсорбции в дистальных извитых канальцах и собирающих протоках; - относительной доступности протонов и калия в клетках дистальных канальцев и собирающих протоков; - способности этих клеток секретировать ионы водорода; - концентрации альдостерона в циркулирующей крови; - скорости тока жидкости в канальцах. Альдостерон стимулирует экскрецию калия как непрямым путем, усиливая активную реабсорбцию натрия в дистальных извитых канальцах и собирающих протоках, так и непосредственно увеличивая активную секрецию калия в периферической части дистальных извитых канальцев. Поскольку как протоны, так и ионы калия могут нейтрализовать мембранный потенциал, генерируемый в процессе активной реабсорбции натрия, гомеостаз ионов водорода и калия тесно взаимосвязан. При ацидозе преимущественно выводятся ионы водорода, а не калия; при алкалозе возрастает экскреция ионов калия. Таким образом, при ацидозе существует тенденция к гиперкалиемии, а при алкалозе – к гипокалиемии. 42 Здоровыми почками калий сохраняется не так интенсивно как натрий. Даже при отсутствии калия в пище его экскреция с мочой составляет 10-20 мМ/л. Поскольку неизбежные потери калия через кожу и кишечник равняется примерно 15-20 мМ/л в сутки, почки не способны компенсировать уменьшение суточного поступления калия ниже 40 мМ/л. Содержание калия в обычной диете выше этого уровня. На концентрацию калия в плазме значительное влияние оказывают его перемещения между внутри- и внеклеточным пространством. Поглощение калия клетками стимулируется инсулином. Ионы калия могут пассивно проникать из внеклеточной жидкости в обмен на ионы натрия, которые активно отсасываются АТФ-зой. Состояние гиперкалиемии может быть следствием снижения активности Na+, K+-АТФ-азы или повреждения цитоплазматической мембраны. Обеднение организма калием происходит, когда его выведение превышает поступление. Калий содержится во многих продуктах питания и, если не считать случаев лечебного голодания, неадекватное потребление редко бывает единственной причиной резкого снижения содержания калия. Возрастание потерь калия может происходить при приеме диуретиков, синдроме Кушинга, диареи, рвоте, избыточным потоотделении и приеме слабительных средств. Хотя концентрация калия в плазме плохо отражает общее содержание калия в организме, ее снижение до 3 мМ/л обычно означает дефицит калия порядка 300 мМ/л. Низкие содержания калия определяются при желтухе (особенно механической), введении большого количества глюкозы или инсулина, облучении ультрафиолетовыми лучами. Избыток может быть следствием избыточного поступления его в организм или сниженной экскреции. Повышение содержания калия в плазме наблюдается при ацидозах, значительных физических нагрузках, вегетативных неврозах, язвенной болезни желудка и 12-перстной кишки, раковых опухолях, артритах. Гомеостаз кальция, фосфатов и магния. В организме человека содержится 1,0-1,5 кг кальция, но свыше 98% из этого приходится на нерастворимые соли кальция костной ткани (преимущественно гидроапатиты). Лишь небольшая часть (около 1%) способна обмениваться с плазмой. Общее содержание в плазме в норме составляет 2,5 мМ/л. Примерно половина этого количества связана с белком, в основном с альбумином. Интенсивность связывания зависит от рН крови и снижается при ацидозе. Несвязанная часть катионов кальция представляет собой биологически активный кальций, его концентрация поддерживается как жесткая константа, так как от этого зависят проницаемость клеточных мембран, мышечные сокращения, секреция. Регуляция уровня активного кальция осуществляется с помощью двух гормонов: паратгормона и кальцитонина. Паратгормон представляет собой пептид, состоящий из 84 аминокислотных остатков, секретируется паращи43 товидными железами в ответ на снижение уровня кальция в плазме. Основное его действие направлено на резорбцию кальция из костей и реабсорбцию кальция в почечных канальцах. Кальцитонин также пептид, состоящий их 32 аминокислотных остатков и секретируемый С-клетками щитовидной железы. Он оказывает противоположное паратгормону действие. Процессы обмена кальция тесно связаны с обменом фосфора и магния. Производное кальциферола (1,25-дигидроксихолекальциферол) регулирует всасывание кальция и фосфатов в кишечнике за счет экспрессии синтеза белка, переносящего кальций через энтероциты. Этот стероидный гормон образуется из кальциферола (витамин D) последовательным гидроксилированием в гепатоцитах (в положении С-25) и нефроцитах (в положении С-1). Гидроксилирование в нефроцитах является паратгормон-зависимым. Снижение уровня кальция наблюдается при гипопаратиреоидизме (недостаток секреции паратгормона), дефиците витамина D, заболеваниях почек, псевдогипотиреоидизме (недостаточность тканевых рецепторов к паратгормону). Пониженные уровни кальция в плазме могут наблюдаться при беременности, так как происходит снижение секреции паратгормона. Наиболее частыми причинами гиперкальциемии являются первичный гиперпаратиреоидизм или опухоли, реже неадекватная дозировка витамина D. Повышением уровня кальция в крови сопровождаются грануломатозные заболевания: саркоидоз, туберкулез, лимфомы и тиреотоксикоз. Общее содержание фосфатов в организме взрослого человека составляет около 25 000 мМ/л. Почти 80% этого количества находится в костях в составе гидроапатитов, 15% - внутри клеток и только 0,1% - во внеклеточной жидкости. Таким образом, фосфаты являются наиболее представительными анионами внутри клеток, где их концентрация достигает 100 мМ/л. Большинство внутриклеточных фосфатов ковалентно связаны с липидами и белками. Изменение в уровне фосфатов сопровождается отложением или вымыванием кальция из костной ткани. Контроль внеклеточной концентрации фосфатов осуществляется почками, их канальцевая реабсорбция подавляется паратгормоном. Нереабсорбированные фосфаты действуют как важный буфер мочи. В плазме крови при физиологическом уровне протонов, фосфаты представлены в виде одно- и двузамещенных анионов. Общее содержание анионов фосфорной кислоты в плазме составляет 0,80-1,40 мМ/л. Около 20% фосфатов плазмы связано с белками, но в отличие от кальция это не имеет большого биологического значения. В плазме кальций и фосфаты чаще всего находятся в реципроктных отношениях, то есть повышенный уровень фосфатов коррелирует со снижением уровня кальция. Причинами высокого уровня фосфатов в плазме может стать почечная недостаточность, нарушающая их экскрецию. Этому способствует также гипопаратиреоидизм, так как низкий уровень паратгормона обусловливает увеличение реабсорбции фосфатов из мочи. Гемолиз приводит к увеличе44 нию уровня фосфатов в плазме из-за фосфатов эритроцитов, поэтому при определении неорганических фосфатов в плазме его необходимо избегать. Снижение содержания фосфатов в плазме наблюдается при гиперпаратиреоидизме за счет увеличения экскреции их с мочой. Встречаются врожденные дефекты канальцевой реабсорбции фосфатов, при которых фосфаты постоянно теряются организмом. Тяжелый пищевой дефицит, например при полном голодании, также сопровождается гипофосфатемией. Иногда гипофосфатемия отмечается у пациентов с онкологическими заболеваниями. Магний представляет собой второй по содержанию внутриклеточный катион после калия. Катионы магния участвуют в процессах энергетического катаболизма, образуя комплексы с нуклеозидфосфатами. Около 300 ферментных систем клетки являются магний зависимыми. Гомеостаз магния находится в непосредственной взаимосвязи с гомеостазом калия и кальция. Важным источником магния для человека служат зеленые растения, так как магний входит в состав хлорофилла. Среднесуточное поступление магния не должно быть меньше 15 мМ/л. Детям, беременным и кормящим женщинам требуется большее количество. Около 30% пищевого магния всасывается в тонком кишечнике и поступает в кровь. Наибольшее количество магния встречается в составе костной ткани (750 мМ), в мягких тканях его количество составляет 450 мМ, в плазме крови – 15 мМ. Ежедневные потери с мочой – 6-10 мМ/л. Увеличение содержание магния в плазме наблюдается нечасто, иногда сопровождает почечную недостаточность. Гипомагниемия обычно связана с дефицитом поступающего магния. Недостаток магния приводит к мышечной слабости, тремору, тетании, гипервозбудимости. Дефицит магния может возникать при тяжелых рвотах, диареи и других нарушениях желудочно-кишечного тракта; осмотическом диурезе (сахарный диабет); длительном применении диуретиков (особенно при недостаточном питании); лечении иммунодепрессантами, циклоспорином, цитотоксическими препаратами. Белки плазмы крови. Плазма содержит свыше 300 белков, большинство белков плазмы – гликопротеины, количество углеводов в их составе варьирует от 1%(альбумины) до 40% (α1-кислый гликопротеин). Концентрация белков плазмы определяется тремя основными факторами: скоростью синтеза, скоростью метаболизма и объемом жидкости, в котором распределены белки. Основная масса белков плазмы синтезируется в печени. Гепатоциты участвуют в синтезе 95% альбуминов, в синтезе фибриногена, α- и β-глобулинов, компонентов свертывающей системы. Большая часть β- и γ-глобулинов синтезируется в клетках иммунной системы. Различными методами разделения можно выделить от 5 до 100 фракций белков плазмы. 45 С помощью обычного электрофореза получают 5 стандартных фракций: альбумины и четыре фракции глобулинов:α1- α2- β- и γ-. Альбумин. Сывороточные альбумины присутствуют в наибольших концентрациях по сравнению с другими белками плазмы. Они представляют собой мономерные белки, с М. около 69 кДа, в молекуле имеется 3 функциональных домена с гомологией аминокислотной последовательности. Каждый домен содержит 6 дисульфидных мостиков. Относительно небольшая молярная масса и высокая плотность отрицательных зарядов определяют важность альбуминов в поддержании осмотического давления. Альбумины выполняют и транспортную функцию: переносят растворимые метаболиты, кальций, свободные жирные кислоты. Альбумин как транспортный белок обладает большой емкостью и низкой аффинностью для многих веществ, в частности для тиреоидных гормонов, кальция и жирных кислот. Он также связывает неконъюгированный билирубин. Гипоальбуминемия может вызываться физиологическими и патологическими причинами. Среди физиологических причин основной являются поздние сроки беременности, при которых объем распределения белка увеличивается. Патологические причины включают нарушение синтеза, увеличение объема распределения, а также потерь белка. Нарушение синтеза альбуминов очень редко встречается в наследственной форме, чаще причинами становятся недостаточное питание и хронические заболевания печени. Наиболее выраженная гипоальбуминемия выявляется при портальном циррозе, жировой дистрофии печени. При панкреатических циррозах, хронических гепатитах снижается фракция альбуминов, но увеличиваются фракции β- и γ-глобулинов. Снижение концентрации альбуминов может наблюдаться при длительных механических желтухах, опухолях печени, токсических гепатитах вследствие диффузной белковой дистрофии клеток печени. Изменения распределения альбуминов связаны с увеличением проницаемости капилляров и уходу части белка в лимфу. Это наблюдается как при некоторых заболеваниях печени (циррозы), так и после травм, оперативных вмешательств, тяжелых ожогов и инфекций. В последнем случае происходит также усиление катаболизма белков. Состояния увеличенных потерь белка характерны для заболеваний почек, желудочно-кишечного тракта (ЖКТ), небольшие потери наблюдаются при воспалительных процессах. Существуют несколько молекулярных форм альбумина. При редком наследственном заболевании бисальбуминемии в плазме встречается разновидность белка, отличного от обычного по электрофоретической подвижности, что приводит к появлению двух альбуминовых полос при электрофорезе. Клинически это состояние никак не проявляется и обнаруживается, как правило, случайно. Ряд белков плазмы имеет важное транспортное значение. Трансферрин – основной белок, транспортирующий железо. Относится к фракции 46 β-глобулинов, представляя собой основной белок этой фракции, количество которого составляет 2,0-2,3 г/л. В норме около 30% белка связаны с железом, причем каждая молекула несет два атома этого металла. Функция его состоит в транспорте железа из кишечника, перераспределении железа, предотвращении накопления Fe3+ в тканях и обеспечении синтеза гемовых структур в количестве, необходимом клеткам и организму в целом. Период полураспада трансферрина меньше, чем у альбумина и концентрация белка очень чувствительна к обеспеченности аминокислотами (то есть к полноценности питания). Концентрация трансферрина снижается, кроме несбалансированного питания, при заболеваниях печени, воспалительных процессах. Дефицит железа сопровождается увеличением скорости синтеза белка в гепатоцитах. Количественное определение трансферрина используется для измерения железосвязывающей емкости сыворотки крови. Повышение содержания трансферрина наблюдается у беременных женщин и больных с недостатком железа в организме. Гаптоглобины относятся к фракции α2-глобулинов. Это группа белков, связывающих гемоглобин, освобождающийся при внутрисосудистом гемолизе эритроцитов. Образующийся комплекс гемоглобингаптоглобин элиминируется клетками ретикулоэндотелиальной системы. Так как это сопровождается снижением концентрации гаптоглобина в плазме, определение концентрации гаптоглобина используют для регистрации внутрисосудистого гемолиза и оценки его интенсивности. Однако низкое содержание в плазме гаптоглобина также обнаруживается при хронических заболеваниях печени за счет уменьшения скорости синтеза данного белка. Гаптоглобин относят к белкам острой фазы воспаления (см. предыдущую главу) и его содержание возрастает при развитии острого воспалительного процесса. Гаптоглобины имеют выраженный генетический полиморфизм. Молекула гаптоглобина состоит из двух типов субъединиц – α и β. Строение β-цепей консервативно, тогда как для α-цепей существуют три аллели. Разные по αцепям белки функционально сходны. Концентрация гаптоглобина в норме составляет в сыворотке 0,3-1,9 г/л. Гемопексин (относится к фракции βглобулинов) связывает гем и предотвращает его экскрецию почками. Комплекс гем-гемопексин улавливается печенью, где железо вновь используется для синтеза гемовых структур. Концентрация гемопексина уменьшается при гемолизе, болезнях печени и почек и увеличивается при воспалительных процессах. Ретинолсвязывающий белок выполняет функцию транспорта ретинола, относится к фракции α1-глобулинов, однако в норме циркулирует в комплексе с преальбумином. Синтез данного белка зависит от обеспеченности аминокислотами, его концентрация нарушается при несбалансированном питании. Он имеет низкую молекулярную массу (21 кДа), поэтому может фильтроваться гломерулами и реабсорбируется почечными канальцами. Транскортин транспортирует стероидные гормоны, есть также белок, связывающий кобаламин (он синтезируется в клетках слизистой желудка), α и βглобулины, транспортирующие липиды. Липопротеины, их состав, функции, 47 синтез и механизмы взаимодействия с клеткой будут рассмотрены в главе, описывающей нарушения обмена веществ. Фибронектин представляет собой полифункциональный адгезивный гликопротеид с М. 440 кДа. Синтезируется в печени и фибробластах в форме димера. Две полипептидные цепи соединены на С-конце двумя дисульфидными мостиками. Такие же мостики имеются и внутри цепей. Фибронектин обладает специфическими доменными структурами для взаимодействия с рядом рецепторов плазматических мембран клеток, с С1g компонентом комплемента, коллагеном, фибриногеном, ДНК. Уровень фибронектина в плазме у мужчин в норме составляет 300 мг/л, а у женщин – 250 мг/л. Количество белка медленно нарастает с возрастом, имеет индивидуальные отличия, обусловленные группой крови и другими факторами. Наиболее известная функция фибронектина – очищение крови от чужеродных продуктов распада белков и клеток посредством их опсонизации (образования комплексов). Образовавшиеся комплексы захватываются гепатоцитами и разрушаются в них. Фибронектин плазмы относится к белкам с высокой скоростью обновления, период обновления всего фибронектина плазмы обычно равен 30-36 часам. Внеплазменный фибронектин синтезируется в фибробластах и входит в состав экстрацеллюлярного матрикса соединительной ткани. В ряде патологических состояний наблюдается снижение уровня фибронектина в крови за счет ускорения его утилизации при неизменной скорости синтеза (сепсис, ожоги, потеря крови) или за счет снижения скорости производства (циррозы, печеночная недостаточность). В клинической практике применяется как критерий оценки выживаемости больных, но методы определения количества фибронектина достаточно сложны: иммунологические, хроматографические. Белки острой фазы воспаления. В период воспаления в плазме крови фиксируется увеличение содержания белка за счет увеличения синтеза таких белков, как: С-реактивный белок, ингибиторы протеаз, α1 - кислый гликопротеин, гаптоглобин и др. Эти белки объединяют под названием белков острой фазы. С-реактивный белок назван так в связи со способностью образовать прочный комплекс с С-полисахаридом клеточной стенки грамотрицательных бактерий. Белок синтезируется, по-видимому, макрофагами и только при их активации, так как в норме в плазме не обнаруживается. Появление и увеличение содержания С-реактивного белка характерны для многих инфекционноаллергических заболеваний, например для ревматоидных. Функция этого белка до конца не изучена, предполагается, что он способствует фагоцитозу фрагментов бактериальных клеток, увеличивает подвижность лейкоцитов, активирует ряд иммунных реакций и, в частности, связывание комплемента. Уровень α1- кислого гликопротеина возрастает в ответ на острые и хронические воспалительные процессы. Функции этого белка изучены недостаточно. Ингибиторы протеаз играют важную роль в процессах свертывания крови, фибринолиза, в иммунных реакциях, кининогенезе и регуляции кровяного давления. В плазме крови обнаружено восемь ингибиторов протеаз: α1-антитрипсин, α2-макроглобулин, антитром48 бин III, α2-антиплазмин, ингибитор первого компонента комплемента, α1антихемотрипсин, интер- α-ингибитор трипсина, ингибитор активации плазминогена. Одним из важнейших плазменных ингибиторов протеаз является α2-макроглобулин, регулирующий активность различных протеолитических ферментов крови и тканей [5,6,7]. Согласно данным [Steibuch M., 1979; James K., 1980, цит.6], содержание α2-макроглобулина в плазме крови взрослых людей составляет 2,6-3,3 г/л, его количество варьируется в зависимости от возраста и пола. Уровень белка в плазме крови у женщин на 20% выше, чем у мужчин. У детей 1-3х лет содержание α2-макроглобулина выше и равно 4,5 г/л. Описаны три различные полиморфные формы этого белка у человека. Они отличаются электрофоретической подвижностью, и наследование их осуществляется по аутосомнодоминантному типу [Harpel P.S., 1975, цит.7]. Для определения α2-макроглобулина используют иммунологические и энзиматические методы. Первые основаны на применении специфических антисывороток, вторые – на способности белка образовывать комплекс с трипсином, не чувствительный к ингибитору из бобов сои [4]. Установлено, α2-макроглобулин представляет собой гликопротеид с М. 725 кДа. Молекула его состоит из двух нековалентно связанных субъединиц, связанных между собой дисульфидными связями. При взаимодействии с трипсином последний образует мостик между двумя фрагментами молекулы α2-макроглобулина и способствует стабилизации его четвертичной структуры. Связывание протеаз по данным Салвесена [Salvesen G.S., Barret A.J., 1980, цит.7], осуществляется определенным фрагментом субъдиницы α2-макроглобулина, не затрагивая каталитически активного центра фермента. Вероятно, при комплексовании α2-макроглобулина с протеазой происходит ограниченный протеолиз в молекуле ингибитора, которая подвергается конформационным изменениям, вследствие чего фермент не может взаимодействовать с высокомолекулярными субстратами [Barret a.J., Starkey P.H., 1973, цит.6]. Важно, что с α2-макроглобулином взаимодействуют только каталитически активные формы протеаз. Известно, что α2-макроглобулин обладает широким спектром действия и может взаимодействовать с протеазами различных подклассов КФ 3.4.21-24, включая металлопротеазы и SH-ферменты. Белок взаимодействует с сериновыми протеазами – трипсином, α-химотрипсином, плазмином, тромбином, калликреином, активатором плазминогена, урокиназой и др. Он реагирует со следующими тиоловыми и карбоксильными ферментами – папаином, фицином, бромелаином, катепсинами B и D. Из металлопротеаз α2-макроглобулин образует комплексы с коллагеназой и арвином, выделенным из яда некоторых змей. Все указанные ферменты в комплексе с данным белком либо полностью утрачивают активность, либо обладают низкой протеолитической активностью, однако сохраняют большую часть эстеразной и амидазной активностей [5,6,7]. 49 α2-Макроглобулин обладает уникальным действием ограничения субстратной специфичности большинства протеолитических ферментов, при этом протеазы превращаются в пептидазы и гидролизуют низкомолекулярные пептиды, являющиеся медиаторами воспалительных процессов. Помимо регуляции активности протеаз одной из предполагаемых функций белка в связи с его высокой реакционной способностью является удаление активированных ферментов протеолиза из кровотока. Кроме того, α2-макроглобулин идентифицирован как цинксвязывающий белок плазмы человека [Adham N.F., Sang M.K., 1977, цит. 7]. Нативный белок содержит 320-770 мкг цинка на 1 г белка. α2-Макроглобулин в комплексе с протеазой способен связываться с мембранами клеток ретикулоэндотелиальной системы (лимфоцитами, полиморфоядерными лейкоцитами, макрофагами). При этом изменяются реакции лимфоидных клеток на разнообразные стимулы: хемотоксические, митогенные факторы, лимфокины, лектины и чужеродные антигены [James K., 1980, цит.7]. Например, он подавляет хемотактическую реакцию моноцитов в ответ на воздействие активаторов плазминогена и калликреина, тормозит реакцию нейтрофилов на компоненты комплемента С3а и С5а [Buffe D., Rimbaut C., 1975, цит.7]. В больших количествах α2-макроглобулин подавляет синтез и секрецию фактора, ингибирующего миграцию макрофагов, который продуцируется сенсибилизированными лимфоцитами. Благодаря высокой реактивности, белок обладает способностью связывать лимфокины – растворимые соединения, образующиеся при взаимодействии сенсибилизированных лимфоцитов со специфическим антигеном. В связи с важной ролью белка в регуляции активности протеолитических ферментов плазмы крови уровень α2-макроглобулина имеет диагностическую ценность. Увеличение концентрации α2-макроглобулина наблюдается при воспалительных процессах; у нефротических больных (параллельно с возрастанием уровня антитромбина III); у больных с сахарным диабетом при нарушениях функций почек; в период интенсивной репарации при ранениях, ожогах, лучевой болезни; при злокачественных новообразованиях. Установлена также прямая корреляция между увеличением уровня белка и метастазированием опухоли. Показана возможность использования белка для стимуляции репаративных процессов при лучевой болезни и других патологических состояниях [5]. Специфическим ингибитором плазмина в плазме крови служит α2-антиплазмин. Он представляет собой одноцепочечный гликопротеин с М. 67 кДа, содержащий 13% углеводов (сиаловые кислоты, гексозы, глюкозамин). Белок имеет в своем составе три дисульфидных мостика. α2-Антиплазмин – ассиметричная, высокогидратированная молекула, состоящая на 16% из α-спиралей, 19% β-структур и 65% неупорядочной спиральной конформации. По аминокислотной последовательности выявляется слабая гомология с антитромбином III и α1-антитрипсином. Кроме плазмина α2-антиплазмин образует комплексы с трипсином, роль его как ингибитора 50 других протеаз несущественна. Концентрация α2-антиплазмина в плазме может падать до 30% от нормы при тяжелых заболеваниях печени (белок синтезируется гепатоцитами), увеличение содержания данного белка совпадает с острой фазой патологического процесса (белок острой фазы). Дефицит α2-антиплазмина сопровождается кровоточивостью, так как в этом случае плазмин существует дольше установленного нормального периода его полужизни. Если это обусловлено генетической поломкой синтеза белка, кровотечение возникает при малейшей травме и даже спонтанно [31]. Показана возможность использования белка для коррекции наследственного его дефицита, что связано с достаточно выраженной консервативностью аминокислотной последовательности. Хотя α2-антиплазмин составляет всего 2,2% общей антиплазминовой активности плазмы, он имеет самое сильное сродство к плазмину и является самым сильным ингибитором фибринолиза. Решающую роль при взаимодействии плазмина с α2-антиплазмином играет активный центр плазмина, но лизин-связывающий участок направляет и ускоряет их взаимодействие. Иммуноглобулины. Белки плазмы, функционирующие как антитела, распознающие и связывающие чужеродные антигены. Поскольку каждая молекула иммуноглобулина является специфической по отношению к одной антигенной детерминанте, существует огромное множество различных иммуноглобулинов. В основе всех иммуноглобулинов лежит сходная структура, включающая две идентичные «тяжелые» полипептидные цепи и две идентичные «легкие» цепи, соединенные дисульфидными мостиками. Тяжелые цепи могут быть пяти типов (γ,α, µ, δ, ε), легкие – двух типов (λ, κ). Именно тип тяжелой цепи определяет класс иммуноглобулинов. N-терминальная аминокислотная последовательность тяжелых и легких цепей в молекулах иммуноглобулинов специфична и ответственна за распознавание антигенных детерминант (Fab-область). Аминокислотная последовательность остальных участков цепей вариабельна незначительно и содержит гомологии у каждого класса иммуноглобулинов. Этот конститутивный фрагмент участвует в активации комплемента по классическому пути и взаимодействии с иммунокомпетентными клетками. В плазме обнаруживаются иммуноглобулины следующих классов: IgG (14,0 г/л, М. 146 кДа); IgA (3,5 г/л, М.160 кДа); IgM (1,5 г/л, М.970 кДа); IgD (0,03 г/л, М. 184 кДа); IgE (следы, М.188 кДа). При электрофорезе иммуноглобулины в основном движутся с фракцией γ-глобулинов, хотя IgA и IgM могут располагаться в β- или α2-глобулинах. Полоса γ-глобулинов представлена в основном IgG, так как их количество в плазме наиболее значительно. При рождении концентрации иммуноглобулинов А и М оказываются низкими, а затем постепенно нарастают, хотя содержание IgA может оставаться ниже, чем у взрослых, до конца первого десятилетия жизни. Иммуноглобулины G переносятся через плаценту в течение последней трети беременности, и их концентрация у новорожденных достаточно высока (за исключением недоношенных детей). Затем концентрация их снижается, так как мате51 ринские иммуноглобулины выводятся из организма, и происходит постепенное замещение их на собственные. Одной из причин восприимчивости новорожденных (особенно недоношенных) к инфекции является их физиологическая гипогаммаглобулинемия. Известны наследственные нарушения синтеза иммуноглобулинов, начиная с тяжелой, сцепленной с Х-хромосомой агаммаглобулинемии (болезнь Брутона), до более легкой дисгаммаглобулинемии. В тяжелой форме наблюдается развитие у детей рецидивирующих бактериальных инфекций. Наиболее часто встречается недостаточность IgA (1 из 400 детей). Приобретенная гипогаммаглобулинемия возникает при злокачественных заболеваниях крови (лейкоз, множественная миелома, болезнь Ходжкина). Гипогаммаглобулинемия может проявляться как осложнение при потере белка (нефротический синдром), при употреблении цитостатических препаратов. Повышенное содержание иммуноглобулинов выявляется как при острых, так и при хронических инфекционных заболеваниях, аутоиммунных заболеваниях (ревматоидный артрит, системная красная волчанка и т.п.). Более подробно изменение белковых фракций в плазме крови будет рассмотрено в главе, анализирующей нарушения обмена веществ (белкового обмена). Ферменты плазмы крови. Клиническая энзимология [2,17,18]. Все обнаруживаемые в плазме крови ферменты (в норме или патологии) можно разделить на две группы: собственно ферменты плазмы (1); ферменты, попадающие в кровь из тканей или секретов (2). Первая группа больше в количественном отношении, а вторая представительнее в качественном разнообразии. Первая группа ферментов. Сюда относятся ферменты свертывающей и противосвертывающей систем крови, протеолитические ферменты и киназы, их активаторы, белки комплемента, оксидоредуктазы плазмы. Биологическая система, сохраняющая жидкое состояние крови и предупреждающая или тормозящая кровопотери путем поддержания целостности сосудистой стенки и образования тромбов в местах повреждения сосуда получила название системы гемостаза. Первичный или сосудисто-тромбоцитарный гемостаз обеспечивается сосудистой стенкой (микрососудами) и тромбоцитами. Ему принадлежит ведущая роль в начальной остановке кровотечения. Конечный результат – образование тромбоцитарной пробки в месте повреждения сосуда. Первичный гемостаз осуществляется эндотелием за счет его способности синтезировать и выделять на поверхности ингибитор простациклина; извлекать из кровотока активированные факторы свертывания. Наряду с эндотелием в первичном гемостазе участвуют тромбоциты, которые высвобождают вазоактивные вещества: серотонин, гистамин; осуществляют адгезию и агрегацию, формируя первичную пробку; выделяют тромбоцитарные факторы свертывания. Вторичный или коагуляционный гемостаз – многоэтапный ферментативный процесс, в котором участвуют ферментативные и неферментативные белки 52 плазмы и тканей, надмолекулярные образования и ионизированный кальций. Конечная цель – формирование фибринового сгустка, который повышает плотность тромба и закрепляет его на сосудистой стенке в месте повреждения [3]. Ферменты свертывающей системы представлены прежде всего пятью протеазами, активирующимися по каскадному механизму. Механизм включения каскада можно подразделить на внутренний и внешний. Внутренний механизм запускается в результате контакта фактора XII (фактор Хагемана) с поврежденной поверхностью сосуда. Фактор Хагемана представляет собой одноцепочечный полипептид, активирующийся при контакте с отрицательно заряженными поверхностями за счет изменения конформации. Физиологическими активаторами служат также катехоламины, коллаген, хондроитинсерная кислота, калликреин. Внешний механизм активируется в результате высвобождения тромбопластина из поврежденных тканей и тромбоцитов (рис. 1.3). Активация фактора Хагемана при контакте с поврежденной поверхностью приводит к ограниченному протеолизу профермента – фактора XI и так далее по каскадному механизу до формирования тромбопластина. Весь этот процесс составляет первую фазу свертывания крови. Из активированных тромбоцитов выделяется фермент протромбокиназа, которая вступает во взаимодействие с тремя антигемолитическими факторами плазмы: VIII, IX и X, в результате образуется тромбоцитарный тромбопластин. Тромбопластин представляет собой липопротеид, который поставляет фосфолипид, необходимый для превращения протромбина в тромбин, осуществляемого на второй стадии свертывания крови. Связыванию фосфолипида с протромбином способствуют иона кальция. Эта способность определяется увеличением числа хелатных центров связывания кальция в белке путем модификации глутаматных остатков в нескольких положениях в γ-карбоксиглутаматные. Модификация (введение дополнительных карбоксильных групп) осуществляется с помощью 1,4 нафтохинона (витамин К или антигеморрагический витамин). Превращением протромбина в активный тромбин заканчивается вторая стадия свертывания крови. На третьей стадии тромбин осуществляет ограниченный протеолиз фибриногена, превращая его в фибрин. Протромбин обозначается как II фактор свертывания крови, его содержание в плазме составляет 0,5-1,5 кЕД/л. Первым фактором свертывания считается фибриноген, его концентрация в норме равняется 2-4 г/л (табл.1.1). Фибриноген представляет собой центральный белок системы свертывания крови. Он является субстратом для фермента свертывающей системы – тромбина. Многие заболевания сопровождаются нарушениями равновесного состояния системы свертывания, при которых в кровяном русле резко изменяется концентрация фибриногена или появляются растворимые формы фибрина. 53 ПОВРЕЖДЕНИЕ ПОВЕРХНОСТИ СОСУДА Кининоген ------------ Кинины Коллаген, жирные кислоты, фосфолипиды, катехоламины Прекалликреин ----------Калликреин ф. XI ф. XIIa ф.XII ф. XIa ф.IX ф.IXa ф.VIII ТРОМБОЦИТЫ – Коллаген, – Тромбин – АДФ, эндотоксины Комплекс антиген-антитело Катехоламины, лекарства Са2+ ф.Х ф.III + Ca2+ ф.VII ф.III ф.Ха ф.VIIa ф.V ф. II (протромбин) ф. IIa (тромбин) ф. ХIII ф.I (фибриноген) ф. XIIIa ф.Iа (фибринмономер) фибрин растворимый Плазмин фибрин нерастворимый ПДФ Рис. 1.3. Свертывания крови по внешнему и внутреннему механизму активации. Непрерывные линии – воздействие, прерывистые – превращение, ломаная – освобождение [3] 54 Таблица 1.1 Факторы свертывания крови согласно международному Комитету по выработке номенклатуры факторов свертывания [3,42] № п/п Фактор I Фактор II Фактор III Фактор IV Фактор V Фактор VII Фактор VIII Фактор IX Фактор Х Фактор ХI Фактор XII Фактор XIII Название фактора Фибриноген Протромбин Тканевой тромбопластин Ионизированный кальций Проакцелерин, липопротеид – обеспечивает взаимодействие между факторами Xa и II Проконвертин, кальцийзависимый белок, активирующий фактор Х Антигемофилический глобулин. Гликопротеид, включает субъединицу, активирующую фактор Х, и субъединицу – кофактор агрегации Фактор Кристмаса – кальцийзависимый гликопротеид, активатор фактора VIII Ф. Стюарта-Провера – кальцийзависимый гликопротеид, катализирует превращение ф. II в тромбин Ф. Розенталя – гликопротеид, активатор ф. IX Ф.Хагемана Фибринстабилизирующий фактор Количество в плазме (норма) 2-4 г/л 0,5-1,5 кЕД/л Отсут. 2,3-3,0 мМ/л 0,5-2 кЕД/л 0,05 г/л 0,03-0,05 г/л Возрастание количества фибриногена в плазме крови обычно свидетельствует о наличии острого воспалительного процесса. В фибриногене три пары цепей Аα, Вβ и γ образуют химический димер с М. 340 кДа. Отдельные цепи в субъединице соединены между собой дисульфидными связями. Также соединены и сами субъединицы [23]. Все три цепи фибриногена отличает высокая степень гомологии, что свидетельствует об их происхождении от одной и той же полипептидной цепи. Общее число дисуль55 фидных связей в молекуле фибриногена – 29. К доменам молекулы фибриногена относят центральную его часть, включающую N-концевые участки всех шести цепей (димерный домен Е) и две периферические зоны, содержащие фрагменты каждой из трех цепей (мономерные домены Д). Продуктами конечного плазминового расщепления фибриногена являются фрагменты Д и Е. Первичная структура фибриногена определяет его пространственную организацию, возможность связывания с тромбином и отщепление пептидов А и В, спонтанную полимеризацию образующегося мономерного фибрина, стабилизацию его с помощью фактора XIII и, наконец, деструкцию фибринового сгустка плазмином. Регуляция заключительного этапа самосборки фибриновых волокон – сложный процесс, до конца еще не изученный. Известно, что фрагмент D – периферический домен фибриногена, вычленяющийся при плазминовом или трипсиновом расщеплении фибрина, способен тормозить полимеризацию, конкурируя с доменами D мономерного фибрина за центральный домен [43]. Однако в условиях физиологической нормы участие фрагмента D в регуляции самосборки фибрина проблематично, так как для его высвобождения необходим достаточно глубокий протеолиз молекулы фибриногена, осуществляющийся только при определенных условиях. В плазме крови и тканях человека обнаружен короткоцепочечный пептидный ингибитор, который образует комплексы с мономерным фибрином за счет электростатических и в малой степени гидрофобных взаимодействий, что приводит к снижению скорости полимеризации [43]. Фактор XIII – фермент из подкласса транспептидаз, катализирует образование ковалентных связей (поперечных сшивок) в фибрине, стабилизируя фибриновый сгусток. Почему при повреждении сосуда весь протромбин не превращается в тромбин и вся кровь не свертывается? Кроме торможения самосборки фибрина существуют, во-первых, механизмы удаления активированных ферментов из каскадной последовательности, во-вторых, имеется ферментная система, растворяющая сгусток крови, – антисвертывающая система. Центральным звеном противосвертывающей системы крови является фермент фибринолизин (плазмин), который, как и все протеазы крови, существует в двух формах: плазминоген (неактивная форма) и плазмин (активная форма). Активаторы плазминогена относят к протеазам регуляторного типа, обладающим высокой специфичностью. Хорошо изучена активация плазминогена, представляющая собой двухступенчатый процесс протеолитического расщепления одноцепочечной молекулы профермента с образованием двухцепочечной молекулы плазмина, связанной дисульфидными связями. Активаторы плазминогена представляют собой протеазы, вызывающие расщепление аргинил-валиновых связей в молекуле белка. Первой из 56 протеаз, активирующих фибринолиз, была обнаружена стрептокиназа, фермент агрессии стрептококков. Физиологическими активаторами плазминогена являются урокиназа (впервые обнаружена в моче), тканевой активатор, сосудистый активатор, плазменный активатор, Хагеманзависимый активатор, лизокиназозависимый активатор. Плазменные активаторы, кроме урокиназы, включают, возможно, четыре вида активаторов, отличающихся как происхождением, так и некоторыми свойствами [1]. Тканевые активаторы прочно связаны со структурными белками мембран клеток, отличаются гомологией при выделении из разных клеток. Тканевой активатор обычно считают сериновой протеазой с М. 60 кДа, обладающей высокой стабильностью в кислой среде и термостабильностью [1,3,16]. Сосудистый активатор имеет более высокую молекулярную массу (до 80 кДа), не обладает протеолитической активностью и имеет оптимум действия при рН 8,5. Урокиназа – протеаза, имеющая как протеолитическую, так и эстеразную активность. Термостабильна, кислотоустойчива. Известно две формы: высокомолекулярная ( 47 кДа) и низкомолекулярная (33,4 кДа). Высокомолекулярная состоит из двух цепей, связанных дисульфидным мостиком, и может каталитически превращаться в низкомолекулярную (ограниченный протеолиз). Схема активации плазминогена представлена на рис. 1.4. ПЛАЗМИНОГЕН Проактиватор плазмы Активатор плазмы Урокиназа Тканевой активатор Тканевые лизокиназы Сосудистый активатор Активный фактор Хагемана ИНГИБИТОРЫ ПЛАЗМИН Рис.1.4. Регуляция образования плазмина [3] Таким образом, большинство активаторов плазминогена представляют собой протеазы, осуществляющие ограниченный протеолиз плазминогена. Они участвуют во многих нормальных и патологических процессах, в которых необходим экстрацеллюларный протеолиз. Важнейшие биологические свойства активаторов, обеспечивающие выполнение системой фибринолиза физиологической роли, проявляются при наличии в крови 57 фибрина. При образовании фибрина происходят связывание с ним плазминогена через лизин-связывающие участки и одновременная адсорбция активаторов, присутствующих в плазме или высвобождающихся из клеток. Образующийся под их действием плазмин остается связанным с фибрином и поэтому очень медленно инактивируется α2-антиплазмином (ингибитор плазмина). После расщепления фибрина и образования продуктов деградации фибрина (ПДФ) плазмин очень быстро инактивируется ингибитором [39]. Так как от активности активаторов плазминогена зависит фибринолитическая активность крови, их содержание в крови и тканях оказывает влияние на возникновение и течение ряда заболеваний. Нарушенное высвобождение активаторов из клеток рассматривают как фактор риска в развитии тромбоэмболий и атеросклероза [24]. Снижение содержания активаторов плазминогена регистрируется в сосудах, закрытых тромбозом. Продукты плазминовой деградации фибриногена и фибрина проявляют антикоагуляционную активность, причем у продуктов расщепления фибрина она выражена более слабо. Установлено также ингибирующее влияние ПДФ, в частности фракции Е, на образование тромбопластина [39]. Антикоагуляционное действие ПДФ можно объяснить подавлением полимеризации фибрин-мономера, так так фрагменты белка образуют с фибрин-мономером высокомолекулярные комплексы, что и замедляет полимеризацию. Этот механизм, а также непосредственное включение ПДФ в сетку фибрина приводят к образованию «дефектного» сгустка с пониженной механической прочностью. ПДФ оказывают влияние и на функцию тромбоцитов, снижая их способность к агрегации, адгезии и вязкому метаморфозу [39]. К основным наследственным нарушениям системы свертывания крови относится гемофилический синдром (отсутствие или нарушение фактора VIII (гемофилия А). Болезнь связана с замедлением образования тромбопластина. Наследуется по рецессивному сцепленному с полом типу. Другие (более редкие) заболевания: гемофилия В (недостаток фактора IX); болезнь Провера-Стюарта (недостаток фактора Х); болезнь Хагемана (нарушение ХII фактора); болезнь Розенталя (нарушение фактора ХI) и т.п. Наследственная а-(гипо)фибриногенемия проявляется умеренной кровоточивостью, удлинением времени кровотечения после травм, носовыми и десневыми кровотечениями, плохим заживлением ран. При дисфибриногенемиях (молекулярные аномалии фибриногена) наблюдаются синяки при малейших ушибах, небольшая кровоточивость при травмах. Часто протекает бессимптомно. Есть также ряд заболеваний, характеризующихся кровоточивостью, обусловленных тромбоцитарной недостаточностью. Рассмотрим ряд патологий, в основе которых лежит уменьшение числа тромбоцитов или их неполноценность [3]. К группе заболеваний, обозначенных как тромбоцитопении, относят состояния ускоренного разрушения или недостаточного об58 разования тромбоцитов, исключая те из них, которые связаны с наследственным дефектом метаболизма, приводящим к тромбоцитопении. Аутоиммунная тромбоцитопения характеризуется значительным укорочением продолжительности жизни клеток (2-4 часа вместо 7-10 дней) и ускоренным производством в 2-6 раз от нормы. При наследственных формах укорочение продолжительности жизни обусловлено энзимопатией гликолиза или цикла Кребса, при иммунных – появлением антитромбоцитарных или антимегакариоцитарных антител. Основными клиническими проявлениями служат гемотомы на передней поверхности конечностей и туловища, кровоизлияния в местах инъекций, высыпания. Реже – желудочно-кишечные кровотечения, гематурия, длительные кровотечения после травм. Изменения лабораторных показателей выражаются в значительном снижении числа тромбоцитов (иногда полном их отсутствии), увеличении размеров тромбоцитов, появлении мелкозернистых клеток, пойкилоцитозе. Время кровотечения удлинено, уменьшено время ретракции сгустка. Свертываемость крови и показатели аутокоагуляционного теста не изменены (табл. 1.2). Таблица 1.2 Показатели антикоагуляционного гемостаза [3] Показатель 1. Время свертывания крови 2. Время рекальционирования по Berderhof-Roka 3.Толерантность плазмы к гепарину по Sigg 4. Протромбиновый индекс (тромбопластиновое время) 5. Тромбиновое время 6. Время фибринолиза 7. Количество тромбоцитов 8. Ретракция кровяного сгустка по В.П.Балуда и соавт. Значение (норма) 8-12 минут 60-120 секунд 6-9 минут 90-105 % (45-60 минут) 15-18 секунд 230-370 минут 174-426 тыс. клеток/мкл 48-64% Однако еще большую опасность (так как чаще приобретаются в процессе жизни, а не обусловлены наследственными поломками) представляют процессы гиперкоагуляции, играющие весьма важную роль в генезе заболеваний сердца и сосудов. Факторы, способствующие гиперкоагуляции, это высокое артериальное давление, повышенная иммунизация, атеросклероз, изменения в системе фибринолиза. Обычно наблюдается снижение процессов активации плазминогена (биохимические причины полностью 59 пока невыяснены), уменьшение количества плазмина, что приводит к увеличению содержания фибрина, а его пристеночное отложение внутри сосудов – к формированию бляшек и тромбов. Наиболее часто наблюдается синдром диссеминированного внутрисосудистого свертывания – ДВС-синдром, который представляет собой общепатологический процесс, вызванный проникновением в кровоток активаторов свертывания крови и агрегации тромбоцитов. Это ведет к тромбинемии, активации и истощению свертывающего, калликреин-кининового, фибринолитического потенциалов, к развитию микротромбозов, геморрагий, сопровождаемых состояниями гипоксии и ацидоза, интоксикации продуктами распада белков и других соединений. Ключевое звено в ДВСсиндроме – тромбинемия различной этиологии. Провокационные факторы разнообразны: инфекция, шок, тяжелые травмы, ожоги, острый внутрисосудистый гемолиз, деструкция тканей, иммунные заболевания и аллергические реакции, лекарства, вызывающие агрегацию и активацию тромбоцитов, антикоагулянты и фибринолитики. Течение процесса может быть острым или затяжным, рецидивирующим, хроническим и латентным. К белкам собственно плазмы крови относятся также белки системы комплемента, которые подробно рассмотрены выше и система оксидоредуктаз, обеспечивающая необходимый транспорт электронов, нейтрализующая (в какой-то мере) активные формы кислорода. Некоторые из них играют роль аккумуляторов активных двухвалентных катионов. Рассмотрим наиболее важные оксидоредуктазы плазмы крови. Церулоплазмин представляет собой медьсодержащую оксидоредуктазу. Выполняет роль транспортирующего и аккумулирующего медь компонента фракции α-глобулинов. Проявляет оксидазную активность в присутствии некоторых субстратов, например, п-фенилендиамина. Молекулярная масса составляет 151 кДа, содержит 8 атомов меди на одну молекулу, четыре атома в виде Cu+, четыре могут переходить из Cu+ в Cu2+. Чистый белок имеет интенсивно голубую окраску. Церулоплазмин – неспецифическая оксидаза, может окислять различные полиалкоголи, гидрохиноны, катехолы. Оптимум рН составляет 5,6-6,0, ингибируется цианидами и азидами, активируется Fe2+. Биохимическое название фермента – орто-дифенилоксидаза (К.Ф. 1.10.3.1), общая реакция, катализируемая церулоплазмином, выглядит следующим образом: Ортофенол + О2 → ортохинон + 2Н2О Церулоплазмин Может окислять монохиноны и аскорбиновую кислоту. Содержание фермента в плазме около 3 мг/л, почти вся медь плазмы аккумулирована в этом белке. Физиологическая роль как фермента остается неясной, так как неизвестны естественные субстраты плазмы и нет доказательств, что 60 оксидазная активность церулоплазмина проявляется in vivo. Изучена активность (при добавлении искусственного субстрата) при некоторых заболеваниях. Снижение наблюдается при нарушениях обмена меди (гепатолентикулярная дегенерация), нефротическом синдроме. Низкие уровни (норма) характерны для новорожденных. Повышение – поздние сроки беременности (норма), цирроз, инфаркт миокарда [32]. Супероксиддисмутаза недавно выделена из плазмы крови человека в чистом виде [13]. Обнаружить активность в плазме крови непросто: существует в неактивной форме, в виде профермента. Активность регулируется специфической протеазой с помощью ограниченного протеолиза. Активация, вероятно, связана с определенным состоянием антиоксидантной системы крови, например, снижением содержания низкомолекулярных антиоксидантов в плазме. Псевдоацетилхолинэстераза (К.Ф. 3.1.1.8) проявляет меньшую специфичность по отношению к ацетилхолину по сравнению с истинной ацетилхолинэстеразой (мембраносвязанной). Катализирует расщепление не только ацетилхолина, но и других эфиров уксусной кислоты и холина с другими кислотами. Роль фермента в плазме до конца не выяснена. Наибольшие изменения зафиксированы при заболеваниях печени, так как здесь осуществляется синтез фермента. Снижение содержания связано с поражением паренхимы печени (цирроз), при механической желтухе – норма. Это служит диагностическим тестом для дифференциации этиологии желтух. Ферменты, поступающие в плазму крови. В основном обнаружение активности (то есть содержания) большинства этих ферментов уже является патологией, так как они поступают в плазму при повреждении клеток и тканей. Рассмотрим ряд наиболее диагностически важных ферментов, проявляющих свою активность при развитии патологических процессов в организме человека. А. Дегидрогеназы Алкогольдегидрогеназа (К.Ф. 1.1.1.1) – НАДН-зависимая оксидоредуктаза, содержащая цинк в составе молекулы. Катализируемая реакция: СН3СН2ОН + НАД+ ↔ Этанол СН3СОН + НАДН + Н+ Уксусный альдегид Фермент проявляет недостаточную специфичность по отношению к субстратам и может восстанавливать ряд альдегидов, например, п-бутиральдегид, бензальдегид, формальдегид, ретиналь. Ингибируется конкурентно оксалоацетатом, неконкурентно – цианидом и солями тяжелых металлов. Имеет несколько конформационных вариантов – конформеров и около 9 изоферментных форм. Локализован в гепатоцитах (в основном), 61 появление в плазме свидетельствует о повреждениях и нарушениях функций гепатоцитов. Резкое повышение – острые гепатиты, при циррозах – норма. При гепатитах исчезает из плазмы быстрее, чем аминотрансферазы. Существуют индивидуальные колебания активности фермента, связанные с индуцибельностью (увеличением скорости синтеза под действием этанола). Активность определяется с использованием теста Варбурга (увеличение оптической плотности на длине волны 340 нм при переходе НАД+ из окисленного в восстановленное состояние). Если в качестве субстрата используется этанол, оптимум рН составляет 9,6. Лактатдегидрогеназа (К.Ф. 1.1.1.27) – цитозольный НАДН-зависимый фермент многих клеток, также цинксодержащий. Катализирует реакцию обратимого превращения пировиноградной кислоты в молочную. Кроме пировиноградной кислоты, может восстанавливать α-кетобутират. Отличается гетерогенностью, то есть имеет множество изоферментных форм. Хорошо изучены пять изоферментов, но найдены также атипичные формы и шестой изофермент. Фермент состоит из четырех субъединиц. Различают Н, М и Х-субъединицы (табл. 1.3). Таблица 1.3 Изоферментные формы лактатдегидрогеназы [28,35] Изоферменты ЛДГ1 ЛДГ2 ЛДГ3 ЛДГ4 ЛДГ5 ЛДГ6 Субъединицы Основная локализация 4Н 3Н1М 2Н2М 1Н3М 4М 4Х Кардиомиоциты Миоциты и многие клетки Миоциты и многие клетки Миоциты и многие клетки Миоциты и гепатоциты Яички, после полового созревания Атипичные формы ЛДГ представляют собой разнообразное сочетание субъединиц, отличающихся от указанных выше, и встречается у больных со злокачественными новообразованиями. Диагностическая значимость определения активности в плазме невелика, так как фермент встречается во многих клетках и его происхождение трудно установить. Однако локализация 90% ЛДГ1 в кардиомиоцитах, ЛДГ5 – в гепатоцитах дает возможность использовать определение этих изоформ в диагностических целях. Значительное повышение активности ЛДГ1 обнаруживается на вторые сутки после инфаркта миокарда и держится в течение 5-6 дней. Тест имеет прогностическое значение. Чем выше активность в начале заболевания, тем неблагоприятнее прогноз. Увеличение активности ЛДГ5 обнаруживается в случае вирусного гепатита, при циррозах и механической желтухе – норма. Общая активность ЛДГ увели62 чена в плазме при злокачественных заболеваниях и других болезнях, связанных с нарушением целостности клеток. Для определения активности используется тест Варбурга. Так как ЛДГ1 обладает наибольшим сродством к молочной кислоте, то для определения именно этого изофермента используют прямую реакцию и рН 8,08,5, а для определения ЛДГ5 (высокое сродство к пирувату) и общей ЛДГ – обратную и рН 7,2-7,4. Малатдегидрогеназа (К.Ф. 1.1.1.37). Широко распространенный фермент, катализирующий обратимую реакцию превращения малата в оксалоацетат. Есть НАДН и НАДФН-зависимые формы малатдегидрогеназы. Различают митохондриальные и цитозольные изоферменты. Ферменты встречаются в большом количестве в кардиомиоцитах, миоцитах, гепатоцитах, нефроцитах. Оптимум рН достаточно широк и располагается в пределах 7,48,1. В присутствии НАДН малатдегидрогеназа (МДГ) может окислять, кроме малата, другие гидрокарбоновые кислоты. Митохондриальный изофермент обладает наибольшим сродством к малату, тогда как цитозольный – к оксалоацетату. В клетках встречаются и НАДФН-зависимые МДГ, в плазме обнаруживается только НАДН-зависимая форма. Для определения активности используется тест Варбурга, однако возникают проблемы. Равновесие in vitro сдвинуто в сторону образования малата и реакция ингибируется избытком оксалоацетата. Оксалоацетат – соединение нестойкое и быстро разрушается до пировиноградной кислоты и СО2 химическим путем. Пировиноградная кислота может восстанавливаться имеющейся в плазме ЛДГ, и результаты оказываются завышенными. Диагностическая ценность ввиду широкого распространения невелика, повышение активности в плазме регистрируется после инфаркта миокарда и при других заболеваниях, характеризующихся разрушением клеток. По причине присутствия малатдегидрогеназной активности в эритроцитах, при определении активности в плазме гемолиз недопустим. Появление в плазме крови митохондриального изофермента МДГ свидетельствует о тяжелых клеточных повреждениях: некрозах, апоптозной гибели клеток при распаде тканей. Изоцитратдегидрогеназа (ИЦДГ) – фермент цикла трикарбоновых кислот. Катализирует обратимую реакцию превращения изоцитрата в α-кетоглутарат. В клетках встречаются НАДН- и НАДФН-зависимые формы. Для проявления активности требуется присутствие ионов Mn2+. НАДН-зависимая форма является митохондриальным изоферментом. НАДФН-форма широко распространена в тканях: печень, сердце, скелетная мускулатура. Ионы марганца могут быть заменены на Mg2+ и Ca2+. Фермент отличается значительной гетерогенностью. Открытие гетерогенности дало объяснение факту отсутствия активности ИЦДГ в плазме после инфаркта миокарда, хотя в кардиомиоцитах очень много этого фермента. 63 Изоферментная форма из кардиомиоцитов оказалась нестойкой и при попадании в плазму быстро теряет свою активность. При заболеваниях печени в плазме появляется активность ИЦДГ, так как гепатоцитарный изофермент стабилен. Активность определяется по тесту Варбурга, оптимум рН 7,5, в качестве активатора используется соль Mn2+, субстратов – изоцитрат и НАДФ. Клиническое значение: в основном диагностика заболеваний печени. Высокие значения активности в плазме – острый гепатит, повышенный уровень – хронические гепатиты. 6-фосфоглюконатдегидрогеназа (К.Ф. 1.1.1.44) – НАДФ-зависимый фермент пентозофосфатного окисления глюкозы. Катализирует окисление и декарбоксилирование 6-фосфоглюконата до рибулозо-5-фосфата. Активируется ионами магния и марганца (двухвалентного), ингибирующее влияние оказывает Cu2+ и Hg2+. Широко распространен в клетках, есть генетически детерминированные формы, которые отличаются электрофоретически. В эритроцитах различают А, В и С формы. Биохимическая активность в плазме не выявляется из-за отсутствия специфического для фермента микроокружения (фермент локализован в мембране). Добавление в инкубационную среду модификатора – цистеина – несколько увеличивает проявление каталитической активности в плазме. Оптимум рН 7,5; субстраты: 6-фосфоглюконат и НАДФ. Для определения активности используется тест Варбурга. В клинике применяется в основном для выявления генетической недостаточности 6-фосфоглюконатдегидрогеназы в эритроцитах. Есть тесная корреляция между возрастом эритроцитарных клеток и активностью фермента (в молодых активность выше)[4]. В плазме повышение активности регистрируется при заболеваниях печени. Следует помнить, что фермент нестоек при нарушении мембраны, и определение активности нужно проводить в максимально короткие сроки после забора крови. Наличие гемолиза, даже небольшого абсолютно недопустимо. Глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа. Первый и лимитирующий скорость пути фермент пентозофосфатного окисления глюкозы. Катализирует окисление глюкозо-6-фосфата до 6-фосфоглюколактона. НАДФ-зависимый олигомерный фермент, локализован в мембранах клеток. Легко диссоциирует на субъединицы при изменении микроокружения. Крайне нестоек при нарушении мембран. Активируется Mg2+, ингибируется Zn2+, Cu2+, Hg2+. Может использовать НАД в качестве кофермента (второго субстрата), но скорость окисления глюкозы намного ниже, чем при использовании НАДФ. Специфичен по отношению к субстрату, может окислять кроме глюкозо-6-фосфата галактозо-6-фосфат и 2-дезоксиглюкозо-6-фосфат (все субстраты только в D-форме). В эритроцитах фермент поставляет НАДФН для метгемоглобинредуктазы и глутатионредуктазы, в надпочечниках – для восстановления аскорбиновой кислоты, участвующей в синтезе стеро64 идных гормонов. Восстановленный НАДФ также необходим для синтеза жирных кислот и холестерола, поэтому фермент широко распространен в тканях. В плазме без гемолиза фермент не выявляется, так как в клетках хорошо структурирован и выходит из них со значительными повреждениями каталитической функции. Применяется определение активности в гемолизатах для оценки функционального состояния метгемоглобинредуктазных систем эритроцитов, есть генетически обусловленные нарушения активности глюкозо-6фосфатдегидрогеназы эритроцитов, приводящие к более быстрому старению и разрушению клеток. Глутатионредуктаза (К.Ф.1.6.4.2). Широко распространенный фермент, в большом количестве обнаруживается в гепатоцитах, нефроцитах, кардиомиоцитах, эритроцитах и других клетках. Есть НАДФ и НАДНзависимые формы, первые встречаются чаще. Катализирует обратимое превращение окисленного глутатиона в восстановленный. Глутатион, в свою очередь, поддерживает сульфгидрильные группы белков в необходимом для эффективного функционирования состоянии. В норме можно обнаружить небольшую активность в плазме, куда фермент поступает в основном из разрушенных эритроцитов. Эритроцитарный фермент дает две полосы при электрофорезе. У пациентов с генетическими нарушениями фермента обнаруживается только одна фракция. Клинически используется только для оценки функционального состояния эритроцитов. Недостаточность сразу трех ферментов: 6-фосфоглюконатдегидрогеназы, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы и глутатионредуктазы эритроцитов – причина тяжелых генетически детерминированных (ферментных) форм анемий. Определение активности по тесту Варбурга, оптимум рН 7,5, фосфатный буфер, НАДФН и окисленный глутатион – в качестве субстратов. Диаминоксидаза (К.Ф.1.4.3.6). Фермент окисляет гистамин. Первоначально назывался гистаминазой. Проявляет относительную специфичность к гистамину и способен окислять еще некоторые диамины. Уровень активности в плазме заметно повышается во время беременности, так как он продуцируется плацентой и плодом (норма). Понижение уровня фермента в плазме во время беременности связывают с патологией беременности. Активность измеряется с помощью изотопных методов, поэтому методика сложна и требует специального оборудования и реактивов. Так как высокие уровни активности определяются в ранние сроки беременности, фермент имеет прогностическое значение. Низкая активность – атрофия плода, внутриутробная гибель и другие осложнения. 65 Б. Трансферазы Орнитилкарбомоилтрансфераза (К.Ф. 2.1.3.3)/ Ключевой фермент. цикла мочевины. Осуществляет перенос карбомоильной группировки с карбомоилфосфата на орнитин с образованием цитруллина: H2N-(CH2)3-CH-COOH + H2N-CO~O-PO3H2 Орнитин | Карбомоилфосфат NH2 H2N-CO-NH-(CH2)3-CH-COOH | NH2 Цитруллин Имеет диагностическую ценность, поскольку цикл мочевины осуществляется только в гепатоцитах. Повышение активности в плазме регистрируется при заболеваниях печени. В норме в сыворотке обнаруживается низкая активность. Оптимум рН варьирует от 6,7 до 7,15. Относительно стабильный фермент, в плазме долго сохраняет свою активность. Устойчив к замораживанию-оттаиванию, ингибируется п-хлормеркуриобензоатом, что свидетельствует о наличие функциональных сульфгидрильных групп в активном центре фермента. Методы определения активности сложны, применяются радиоактивные изотопы, колориметрический метод очень трудоемок, требует инкубирования сыворотки с цитруллином и арсенатным буфером в течение 24 часов. Затем белок осаждают и определяют ионы аммония по реакции с фенолгипохлоритом. Клиническое применение. Повышение активности – инфекционный гепатит (максимум в период появления желтухи), цирроз (очень высокие значения активности), злокачественные опухоли, токсические поражения печени. Является очень чувствительным тестом-индикатором токсичности различных веществ по отношению к печени. Однако ввиду сложности определения в клинической практике используется редко. γ-Глутамилтрансфераза (К.Ф. 2.3.2.1). Катализирует перенос γ-глутаминовой группы с γ-глутамилпептида на акцепторный пептид или L-аминокислоту. Активность обнаруживается в ряде органов человека: почках, печени, поджелудочной железе. Имеется несколько изоферментных форм. В норме определяется активность наиболее быстрого изофермента, при гепатите и механической желтухе увеличивается содержание более медленных изоферментов. Локализован фермент в микросомах, принадлежит к частично индуцибельным формам, синтез индуцируется этиловым спиртом и некоторыми лекарственными препаратами. γ-Глутамилтрансфераза менее чувствительный фермент к нарушениям гепатоцитов, чем аминотрансферазы, однако его активность в плазме заметно повышается при механической желтухе, панкреатите и раке печени, тогда как 66 активность аминотрансфераз в данном случае – норма. Некоторые исследователи отмечают увеличение активности этого фермента в плазме сразу после инфаркта миокарда, но так как в кардиомиоцитах его почти нет, это скорее всего вторично и связано с повреждением при инфаркте гепатобилиарной системы. Rosalki и Rau (1972)[17] показали, что у лиц, страдающих чрезмерным потреблением алкоголя, сывороточный уровень γ-глутамилтрансферазы коррелирует с потреблением алкоголя и является более чувствительным показателем нарушения функции печени, чем активность аминотрансфераз. Для определения активности (Rosalki, 1970) используют смесь субстратов γ-глутамил-п-нитроанилида и глицилглицина в трис-буфере с рН 9,0. После добавления сыворотки смесь инкубируют 30 минут при 370С. Реакцию останавливают добавлением уксусной кислоты и регистрируют изменение оптической плотности λ405 нм, ξ= 9900 М-1см-1. Аспартатаминотрансфераза (К.Ф. 2.6.1.1). Катализирует трансаминирование аспарагиновой кислоты в оксалоацетат. Аминогруппа переносится на α-кетоглутаровую кислоту с образованием глутаминовой: L-Аспартат + α-Кетоглутарат ↔ L-Глутамат + Оксалоацетат Трансаминирование играет ключевую роль в промежуточном метаболизме, так как обеспечивает и синтез, и разрушение аминокислот в клетке. Особенно активно превращаются путем трансаминирования три аминокислоты: глутаминовая, аспарагиновая и аланин. Они трансаминируются в соответствующие кетокислоты: α-кетоглутаровую, щавелевоуксусную и пировиноградную, которые могут включаться в цикл Кребса. Трансаминирование обеспечивает аспартатом цикл мочевины в гепатоцитах. Коферментом аминотрансфераз (трансаминаз) служит пиридоксальфосфат, который осуществляет перенос аминогруппы за счет способности образовывать пиридоксаминовые производные с аминокислотами. Пиридоксальфосфат замещает аминогруппу аминокислот-субстратов на карбонильную второго субстрата с промежуточным образованием Шиффовых оснований. Аспартатаминотрансфераза (АсАТ) – высокоспецифичный фермент, аспартат и оксалоацетат могут быть заменены только на цистеат и кетомаланат соответственно, но реакция идет с очень низкой скоростью. Это достаточно широко распространенный фермент в тканях человека, наиболее богаты этим ферментом гепатоциты, кардиомиоциты, миоциты, нефроциты. Также АсАТ содержится в тканях поджелудочной железы, селезенки, легких, но в значительно меньших количествах. Уровень активности в эритроцитах низкий и слабый гемолиз не оказывает влияния на величину плазменной активности. 67 Определение активности этого фермента в плазме после инфаркта миокарда (La Due et.all., 1954, цит.2) послужило толчком к развитию диагностической клинической энзимологии. В настоящее время это наиболее часто используемый в диагностике ферментативный тест. При электрофорезе обнаруживаются в экстрактах из кардиомиоцитов и гепатоцитов две основные фракции фермента. Источником катионного изофермента являются митохондрии, анионного изофермента – цитоплазма. Они отличаются по каталитическим константам: оптимуму рН, Кm и иммунохимическим свойствам. Цитозольные изоферменты из различных клеток идентичны, так же как и митохондриальные. В плазму в большом количестве поступает обычно цитозольный изофермент, появление митохондриального – свидетельство значительного повреждения клеток (некроз при инфаркте миокарда). Определение активности. Методика основана на реакции пирувата с 2,4-динитрофенилгидразином. Оксалоацетат ингибирует фермент, поэтому необходимо, чтобы в ходе реакции он не накапливался. Необходимо избегать фосфатный буфер, ионы фосфата ингибируют митохондриальный изофермент. Метод унифицирован, для определения активности используются наборы реактивов. Существенным недостатком стандартных наборов является относительная нестабильность субстратных смесей, при хранении в них накапливается пируват за счет протекания химической реакции между субстратами. Клиническое применение. Широко используется для подтверждения диагноза инфаркта миокарда, заболеваний печени и мышц. После инфаркта миокарда уровень активности АсАТ повышается в 4-5 раз и сохраняется в течение 3-5 дней от начала заболевания. При заболеваниях печени наиболее высокие уровни активности дает острый гепатит (в 50 раз от нормы), цирроз. Общая активность АсАт повышается также при мышечной дистрофии. Аланинаминотрансфераза (К.Ф. 2.6.1.2). Также широко распространенный фермент, но самое большое количество его содержится в гепатоцитах. Имеет наибольшее диагностическое значение для регистрации повреждений тканей печени. Обратимо катализирует реакцию превращения L-аланина в пировиноградную кислоту: L-Аланин + α-Кетоглутарат ↔ Пируват + L-Глутамат Коферментом аланинаминотрансферазы (АлАТ) служит пиридоксальфосфат, фермент проявляет высокую специфичность по отношению к субстратам. В настоящее время отсутствуют данные об изоферментных формах. Для определения активности используется стандартный унифицированный метод, в основе которого реакция пирувата с 2,4динитрофенилгидразином. 68 Клиническое применение. Высокая активность характерна для заболеваний печени: гепатиты, циррозы, токсические повреждения печени (ядами, химикатами, лекарственными препаратами, токсинами, образующимися в организме при инфекционных заболеваниях и распаде злокачественных опухолей). Широко используемый в клинической практике тест. Креатинфосфокиназа (К.Ф. 2.7.3.2). Фермент обратимо катализирует фосфорилирование креатина при помощи АТФ: Креатин + АТФ ↔ Креатин-фосфат + АДФ Равновесие смещено в сторону обратной реакции, оптимум рН которой 6,8, а скорость прямой реакции максимальна при рН 9,0. Ионы магния, марганца и кальция двухвалентных активируют, а цинка, меди, ртути и ряд тиоловых соединений – ингибируют. Восстановители сульфгидрильных групп – глутатион, дитиотрептол, цистеин – активизируют креатинфосфокиназу (КФК). Фермент содержит в активном центре две тиоловые группы, участвующие в катализе. Наиболее богаты КФК скелетная мускулатура, значительное количество обнаруживается в кардиомиоцитах, мозге, щитовидной железе, ткани легких. В эритроцитах активности не обнаруживается. Креатинфосфокиназная реакция регулирует пул аденозинфосфатов. Избыток образованной АТФ активирует передачу макроэргической связи на креатин. Креатинфосфат более стабильное соединение, чем АТФ, и позволяет сохранить энергию для нужд клетки. КФК отличается множественностью форм – изоформы, конформеры, аллозимы (атипические, патологические формы), наличием макромолекулярных комплексов. Изоферменты представлены цитоплазматическими и одним митохондриальным изоферментами. Цитоплазматические изоферменты представлены 3 видами: ММ; МВ и ВВ-изоферментами. Все три формы способны к обмену субъединицами. Митохондриальный изофермент также состоит из двух субъединиц, отличных как от М, так и от В-субъединицы. В мышцах (скелетной мускулатуре) в основном содержится цитозольный изофермент ММ, а в мозге – ВВ. Изоферментный спектр более сложен в кардиомиоцитах: 1/3 активности КФК представлена митохондриальным изоферментом, 1/3 цитозольным ММ изоферментом и 1/3 цитозольным МВ изоферментом. Конформеры присущи ВВ изоферменту, они представляют собой его структурные варианты. Макромолекулярные комплексы разнообразны: (1) высокомолекулярные комплексы ВВ с гаммаглобулинами G и A; (2) высокомолекулярные агрегаты митохондриального изофермента с белками внешней поверхности внутренней мембраны митохондрий, где он структурирован; (3) комплексы ММ-изоформы с липопротеидами и некоторыми другими белками; (4) полимеры, образованные не69 сколькими молекулами КФК. Атипичные формы КФК по некоторым данным [15] – гликозилированные молекулы фермента. Активность и изоферментный спектр КФК – прекрасный тест на морфологическое и функциональное состояние различных клеток и тканей организма. В эмбриогенезе изменение активности идет параллельно с дифференциацией тканей. При формировании мышечного волокна возрастает активность КФК за счет замены ВВ изофермента на ММ изофермент. При мышечной дистрофии происходит возврат к ВВ типу. Креатинфосфокиназа – в основном конститутивный фермент, но может индуктивно синтезироваться под действием инсулина, тироксина, эстрадиола, креатина. Четкая локализация КФК и ее изоферментов определила высокую значимость для использования с целью диагностики, прогнозирования, регистрации тяжести течения заболевания. Увеличение активности КФК в плазме крови регистрируется при инфаркте миокарда и служит наиболее специфическим тестом при постановке диагноза даже при отсутствии характерных изменений ЭКГ. По изоферментному спектру можно рассчитать и зону некроза. Сроки нормализации, а также рецидивные повышения активности – незаменимые показатели для терапевта при разработке тактики лечения. Определение КФК-ной активности и изоферментного спектра весьма информативны также при прогрессирующей мышечной дистрофии и полимиозитах. Повышение активности регистрируется у практически здоровых людей при сверхвысоких физических нагрузках и является неблагоприятным признаком. Определение активности. Один из методов основан на реакции креатинфосфата и АДФ, образующийся при этом креатин реагирует с α-нафтолом, диацетил служит катализатором этого взаимодействия (метод Коровкина), интенсивность розового окрашивания измеряется фотометрически. Унифицированный метод основан на сопряженных реакциях и требует присутствия в инкубационной среде двух ферментов: КФК Креатин-фосфат + АДФ ↔ Креатин + АТФ АТФ + Глюкоза → Глюкозо-6-фосфат + АДФ Гексокиназа Глюкозо-6-фосфат + НАДФ → 6-Фосфоглюколактон + НАДФН + Н+ Глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа Активность регистрируется по изменению оптической плотности на длине волны 340 нм (тест Варбурга). Протеканию этих реакций мешает аденилаткиназа, катализирующая реакцию: 2АДФ ↔ АТФ + АМФ Аденилаткиназа 70 В смесь вводится АМФ, который служит ингибитором аденилаткиназы. Хотя эритроциты не содержат КФК, но в них содержится аденилаткиназа, поэтому гемолиз нежелателен. Аденилаткиназа (К.Ф. 2.4.4.3). Фермент имеет малую молекулярную массу – около 21 кДа и электрофоретически гомогенен. Катализируемая реакция указана выше. Содержится практически во всех клетках (изначально обнаружена в миоцитах). В нормальной плазме активность фермента весьма значительна из-за присутствия тромбоцитов. Клинического значения не имеет, но имитирует активность КФК в нормальной плазме, о чем следует помнить. В. Гидролазы Липаза (К.Ф. 3.1.1.3). Фермент ведет себя как эстераза, гидролизуя жиры большой молекулярной массы. Особенно активна липаза по отношению к эфирам жирных кислот. Оптимум рН варьирует в пределах от 7,0 до 9,0. В кислой среде фермент разрушается. Наиболее важен с клинической точки зрения фермент поджелудочной железы, хотя в клетках различных тканей встречается ряд других липаз. Некоторые из них высоко специфичны: фосфолипаза А, С и другие. Панкреатическая липаза – водорастворимый фермент и ее действие проявляется только с поверхности жировых капель. Поэтому эффективность действия липазы зависит от степени эмульгирования жиров. Это осуществляется с помощью желчных кислот, гликохолата и таурехолата натрия. Панкреатическая липаза разрушает эфирные связи в α-положении более легко, чем в β-положении. Ингибируется продуктами реакции – жирными кислотами. Активация катионами кальция связана с образованием нерастворимых кальциевых солей жирных кислот и подавлением их ингибирующего действия. Гемоглобин ингибирует липазу, поэтому при определении активности в плазме крови следует избегать гемолиза. Липаза постоянно поступает в плазму из поджелудочной железы, в норме наблюдаются значительные уровни активности. Клиническое применение. Повышение активности липазы регистрируется при остром панкреатите, карциноме поджелудочной железы, остром гепатите, острых и хронических заболеваниях почек. Щелочная фосфатаза (К.Ф. 3.1.3.1). Это целая группа ферментов, неспецифически гидролизующих в щелочных условиях ряд ортофосфорных эфиров. Действуют они либо как гидролазы, либо как фосфотрансферазы: R – O – PO32– R1 – O – PO32– + H2O → R + H3PO4 Гидролаза + R2-OH → R1-OH + R2 – PO32– 71 Акцептором фосфата могут стать сахара. Максимальная активность при рН 9,0-10,0. Щелочная фосфатаза широко распространена в тканях человека: особенно много ферментов обнаруживается в слизистой кишечника, остеобластах, плаценте, печени. Они расположены на клеточной мембране, принимают участие в транспорте фосфата. Нативный фермент является димером. Гетерогенен, разнообразие форм связано с локализацией фермента в различных тканях: печеночные, костные, кишечные изоферментные формы. В сыворотке в норме источником фермента, видимо, являются гепатоциты. Естественные субстраты для данной группы ферментов пока не обнаружены. Для определения активности используется 12 субстратов, наиболее часто – β-глицерофосфат, п-нитрофенилфосфат, фенилфталеинмонофосфат. Щелочные фосфатазы способны гидролизовать и пирофосфат, поэтому в физиологических значениях рН могут действовать как пирофосфатазы. Основными активаторами щелочной фосфатазы служат ионы Mg2+, в незначительной степени – Mn2+, Ca2+. При определении в сыворотке крови ионы магния дополнительно не вводят, так как они содержатся в ней в достаточном количестве. Ингибиторы щелочной фосфатазы: ЭДТА (связывает ионы магния и кальция), ионы цинка, меди, ртути (двухвалентных), что предполагает наличие в активном центре функциональных SH-групп. Фермент ингибируется также избытком фосфата, желчными кислотами, некоторыми аминокислотами, особенно L-фенилаланином. Ингибирование мочевиной носит сложный характер. Практически все щелочные фосфатазы ингибируются обратимо и неконкурентно, но существует также необратимое ингибирование в зависимости от температуры и рН среды. Это имеет значение при определении источника фермента в плазме. Необратимо и полностью ингибируется изофермент из костной ткани, а печеночный изофермент – частично. Щелочные фосфатазы различаются также по устойчивости к действию низких рН и высоких температур. Щелочная фосфатаза (ЩФ) из костной ткани практически полностью ингибируется при инкубации в течение 20 минут в среде с рН 3,5, тогда как печеночный и кишечный изоферменты сохраняют свою активность соответственно на 50 и 100%. Щелочную фосфатазу из гепатоцитов можно осадить из сыворотки 20% этанолом, тогда как другие формы не осаждаются. Изоформы отличаются также по действию высоких температур. Наиболее устойчив плацентарный изофермент, ЩФ из костной ткани инактивируется при 560С, гепатоцитов – при 610С, слизистой кишечника – при 700С. Щелочные фосфатазы обнаруживаются и в других биологических субстанциях кроме сыворотки: моче, кале, желчи, слюне, молоке, лимфе. Определение активности. Измеряется по скорости гидролиза субстратов. Для каждого субстрата подбираются оптимальные условия катализа, особенно рН. Для β-глицерофосфата оптимум – 9,4; для п-нитрофенилфосфата – 9,8. 72 Если в качестве субстрата используется п-нитрофенилфосфат, то в щелочной среде образуется нитрофенол, имеющий желтую окраску, интенсивность которой измеряется фотометрически. Данный метод имеет преимущественное значение, так как позволяет изучать кинетику реакции. Недостаток – изофермент из слизистой кишечника плохо гидролизует п-нитрофенилфосфат. Клиническое значение. Увеличение активности происходит при заболеваниях костной системы: рахитах, болезни Педжета (деформирующее воспаление костей), остеогенной саркоме; при заболеваниях печени: механической желтухе (наиболее чувствительный тест для регистрации закупорки желчевыводящих путей). Вирусный гепатит – норма. Исследование изоферментов имеет существенное значение для диагностики злокачественных опухолей, определения локализации метастазов. Снижение активности в лейкоцитах регистрируется при болезни Дауна, лейкемии. Кислая фосфатаза (К.Ф. 3.1.3.2). Наибольшее содержание данного фермента обнаруживается в предстательной железе, где активность в 1000 раз выше, чем в печени, селезенке, почках, костной ткани. Активность в нормальной плазме появляется после достижения половой зрелости. Оптимум рН составляет 5,0. Кислая фосфатаза относительно нестабильна при рН, превышающих 7,0. Эритроциты, лейкоциты, тромбоциты содержат значительное количество кислой фосфатазы (КФ), поэтому при хранении образца результаты искажаются за счет выхода фермента из форменных элементов, тогда как активность других изоферментов падает. Изофермент из клеток крови более устойчив к действию высоких рН. Если образцы необходимо хранить, то рекомендуется сразу отделить сыворотку от форменных элементов и закислить до рН 5,0-6,0. Электрофорез определяет от 4-х до 14-ти полос активности КФ. Для определения источника фермента целесообразно использовать избирательное ингибирование. В клетках кислая фосфатаза локализована в основном в лизосомах. Эритроцитарный изофермент полностью можно ингибировать формальдегидом, а изоформу из предстательной железы – L-тартратом. Определение активности. Используются те же субстраты, что и для определения ЩФ. В качестве буферов применяется ацетатный или цитратный со значением рН от 4,9 до 5,6. Об активности судят по накоплению фенола, если субстрат фенилфосфат, или по накоплению фосфата, если субстрат β-глицерофосфат. Клиническое применение. В основном применяется для ранней диагностики и наблюдения за ходом лечения карциномы предстательной железы. Повышение активности регистрируется также при карциноме молочной железы и лимфобластной лейкемии. 5΄-Нуклеотидаза (К.Ф. 3.1.3.5). Фермент является фосфомоноэстеразой, специфически гидролизирующей нуклеозид-5΄-фосфаты. Типичными 73 субстратами являются аденозин-5΄-фосфат и инозил-5΄-фосфат. Сложность состоит в том, что те же субстраты гидролизует и щелочная фосфатаза. Фермент активируется ионами магния и ингибируется ионами никеля. Есть практически во всех клетках, локализован в мембранах. Наибольшее количество обнаруживается в гепатоцитах, лейкоцитах, эритроцитах. Клиническое значение. Фермент служит маркером структурной деградации фосфолипидного слоя мембран, так как его активность зависит от микроокружения. Кроме того, он одним из первых выходит из поврежденной мембраны. Часто используется для оценки функционального состояния печени при других заболеваниях, прямо не касающихся данного органа (инфаркт миокарда, инсульт), обнаружения метастазирования опухолей в печень. В лейкоцитах фермент определяет функциональную активность по производству активных форм кислорода («респираторный взрыв»), так как непосредственно связан с обменом аденозина, выполняющего регуляторную роль в нейтрофилах. Определение активности. В качестве субстрата используют АМФ, ЩФ ингибируется добавлением ЭДТА, фермент активируется ионами магния. Активность определяют по количеству освобожденного фосфата за единицу времени. α-Амилаза (К.Ф. 3.2.1.1). Открыта в 1833 г., гидролизует α-1,4-гликозидную связь в амилозе. Представляет собой эндогликозидгидролазу, для проявления активности необходимо присутствие хотя бы трех α-1,4-гликозидных связей. Конечные продукты гидролиза амилозы – мальтоза и мальтотриоза; крахмала – мальтоза, мальтотриоза, изомальтоза. Две связи на нередуцирующем конце и одна связь на редуцирующем конце устойчивы к действию амилазы. Методы определения. Принцип определения основан на реакции крахмала с йодом. Обычно используется фосфатный буфер с рН 7,2, 0,24% раствор крахмала и 30-минутная инкубация при 370С. Затем количество оставшегося крахмала определяется по реакции с йодом. Интенсивность синего окрашивания измеряется фотометрически. Фермент имеет малую молекулярную массу (48 кДа), это приводит к тому, что фермент легко фильтруется почечными клетками и появляется в моче. Основными источниками α-амилазы у человека являются соки поджелудочной и слюнных желез, незначительная активность обнаруживается в других тканях. Активность амилазы значительно возрастает в присутствии NaCl, оптимум рН колеблется от 6,5 до 7,5 в зависимости от индивидуальных особенностей фермента. Амилаза содержит 1 грамм-атом Са2+на 1 молекулу и ингибируется в присутствии ЭДТА, оксалоацетата, цитрата. Ферменты из поджелудочной и слюнных желез не имеют существенных отличий, не различаются иммунохимически и почти идентичны по электрофоретической подвижности (располагается в области γ-глобулинов. 74 Клиническое применение. Повышение активности фиксируется при остром панкреатите (в 10-50 от нормы). Резко увеличивается также содержание фермента в моче. Тест применяется для дифференциальной диагностики приступа острого холецистита (нет повышения активности) и панкреатита, так как клинические симптомы схожи. Интересным является факт обнаружения значительной активности в сыворотке крови некоторых людей, не страдающих панкреатитом, причем активность в моче остается в пределах нормы. Это явление получило название «макроамилаземия» и объясняется склонностью амилазы данных людей к образованию макромолекулярных комплексов с γ-глобулинами, которые не фильтруются почками. β-Глюкуронидаза (К.Ф. 3.2.1.31). Фермент гидролизует большое количество алифатических и ароматических эфиров β-D-глюкуроновой и определенных эфиров β-галактуроновой кислот. β-Глюкуронидаза (β-ГУ) встречается практически во всех тканях, но особенно много ее в печени, где она распределена в различных субклеточных частицах. β-ГУ проявляет свою активность при относительно низких значениях рН, имеет три оптимума рН для трех различных изоформ: 3,8; 4,5 и 5,2. Фермент специфически ингибируется сахарозо-1,4-лактином и инактивируется ионами тяжелых металлов. Определение активности. Субстратами служат различные фенольные глюкурониды. Обычно после инкубации определяют фенол с реактивом Фолина-Чекалтэу. Если в качестве субстрата используется фенолфталеинглюкуронид, то применяется глициновый буфер с рН 10,4 и измеряют интенсивность розового окрашивания (λ550 нм). Следует помнить, что активность фермента в щелочной среде достаточно низка. Клиническое применение. Основные заболевания, при которых отмечается повышение активности β-ГУ, – злокачественные заболевания и болезни печени. Активность β-ГУ прогрессивно нарастает во время беременности и быстро снижается после родов. Повышение активности β-ГУ в моче найдено при раке мочевого пузыря. Лейцинаминопептидаза (К.Ф. 3.4.1.1). Фермент особенно эффективно гидролизует пептидную связь, если с N-конца располагается остаток L-лейцина, но может также гидролизовать пептидные связи с N-концевыми остатками фенилаланина, триптофана, гистидина или тирозина. Лейцинаминопептидаза широко распространена в тканях человека, причем наиболее богатые источники ее тонкий кишечник, почки и печень. Молекулярная масса фермента 80 кДа, он активируется ионами кальция, марганца и магния в зависимости от используемого субстрата и тканевого источника фермента. Ингибируют лейцинаминопептидазу цианиды и ЭДТА. Обнаружено существование множественных форм фермента в сыворотке крови человека, которые представляют собой изоферменты из пече75 ни, плаценты, почек, поджелудочной железы, кишечника. Больше всего в сыворотке изофермента из гепатоцитов. Определение активности. Для определения активности используется субстрат L-лейцил-β-нафтиламид, количество отщепленного β-нафтиламида оценивается флуориметрически или колориметрически по реакции с соответствующим хромогеном. Клиническое значение. Используется для диагностики заболеваний печени. Активность заметно повышена при механической желтухе, метастазах в печень, холециститах. Аланинаминопептидаза (К.Ф. 3.4.1.2). Представляет собой фермент, гидролизующий N-концевые пептидные связи, в основном представленные остатком аланина. Больше всего фермента в тканях почек, в меньшей степени содержится в кишечнике, поджелудочной железе и гепатоцитах. В разных клетках встречаются различные изоферменты, в настоящее время выделены пять изоферментов. По своим свойствам встречающийся в сыворотке изофермент наиболее близок к гепатоцитарному. Для определения активности используется субстрат L-аланин-βнафтиламид. Клиническое применение. Повышение активности в сыворотке крови отмечается при заболеваниях поджелудочной железы и печени, обычно сопровождается увеличением также активности щелочной фосфатазы. Эндопептидгидролаза желудочного сока (пепсин) (К.Ф. 3.4.4.1). Основной фермент желудочного сока секретируется в виде неактивного предшественника – пепсиногена. Пепсиноген устойчив в нейтральной и слабощелочной среде. При попадании пепсиногена в кислую среду начинается активирование фермента, которое затем осуществляется аутокаталитически уже образовавшимся пепсином. Молекулярная масса пепсиногена составляет 48 кДа, пепсина 34 кДа, что свидетельствует о механизме активации по принципу ограниченного протеолиза. Наивысшая активность пепсина наблюдается в интервале рН 1,5-2,0, но имеется изофермент с оптимумом рН от 3,3 до 4,0. Кроме желудочного сока пепсиноген обнаруживается почти во всех тканях, но происхождение сывороточного фермента из желудочного сока. Благодаря малой молекулярной массе пепсиноген легко фильтруется клубочками почечных канальцев и появляется в моче. Пепсин по свойствам представляет собой эндопептидгидролазу, расщепляющую пептидные связи, лежащие в глубине молекулы белка, поэтому для эффективного гидролиза необходима денатурация белковой молекулы под действием соляной кислоты желудочного сока. Природа аминокислотных остатков, образующих пептидную связь не имеет значения, то есть пепсин – неспецифическая эндопептидгидролаза. В диагностических целях определяют активность фермента в основном в желудочном соке, реже в плазме или моче. 76 Определение активности. Метод основан на инкубации образцов с белковым субстратом (гемоглобин, казеин, альбумин) в термостате в течение достаточно длительного времени (2-4 часа) в кислой среде. Затем определяют (после удаления остатков белка) количество ароматических аминокислотных остатков с реактивом Фолина-Чекалтеу. Трипсин и химотрипсин (К.Ф. 3.4.4.4) и (3.4.4.5). Оба фермента секретируются в виде неактивных предшественников. Трипсинген активируется специфической энтерокиназой, образующийся трипсин осуществляет дальнейшую активацию аутокаталитически. Процесс активации сопровождается отщеплением от трипсиногена гексапептида с N-конца. Так как молекулярная масса отщепляемого гексапептида незначительна, то молярная масса трипсина принимается за 23 800 Да. Химотрипсиноген активируется трипсином. При исследовании было выявлено, что оба фермента имеют идентичные активные центры, содержащие остатки серина и два гистидиновых остатка в петле, образуемой дисульфидными связями цистеинов. Трипсин и химотрипсин действуют на пептидные связи различной химической природы: трипсин гидролизует пептидные связи, включающие в состав карбоксильные группы лизина и аргинина; химотрипсин – пептидные связи, образованные карбоксильными группами тирозина и фенилаланина. Оба фермента ведут себя как эстеразы и амидазы в такой же степени, как и пептидазы. Трипсин стабилен в кислой среде и быстро разрушается при действии щелочей. Его оптимум рН составляет 8,0-9,0, но в этих условиях он, повидимому, подвергается самоперевариванию. Оба фермента инактивируются ионами тяжелых металлов и тиоловыми реагентами (п-хлормеркуриобензоат), фосфоорганические соединения также блокируют их активность. Конкурентно ингибируют трипсин и химотрипсин диэтиловый эфир и ряд ароматических углеводородов. В сыворотке крови присутствуют ингибиторы трипсина белковой природы: α1и α2-антитрипсины, концентрация их возрастатет при беременности и воспалительных процессах. Наследственная недостаточность α1-антитрипсина сопровождается ранним развитием эмфиземы (перерождение) легких. Определение активности. В качестве субстратов применяют как искусственные – α-бензоил-L-аргининамид; N-ацетил-L-тирозин – так и белковые субстраты: гемоглобин, казеин, альбумин. О скорости гидролиза судят по накоплению пептидов и аминокислот. Эти методы для сыворотки не являются специфическими, поскольку в получаемые результаты включается также активность других пептидгидролаз, содержащихся в плазме крови. Клиническое значение. Появление пищеварительных ферментов в плазме крови и моче может дать ценную информацию о состоянии желудочно-кишечного тракта в условиях патологии. Однако определить точно активность трипсина и других пептидгидролаз затруднительно, так как 77 мешает присутствие плазменных пептидаз. Трипсин в плазме взаимодействует с α2-макроглобулином, при остром панкреатите количество α2макроглобулиновых центров у трипсина снижается. Хронические панкреатиты сопровождаются увеличением α2-макроглобулинсвязывающей способности трипсина. Аргиназа (К.Ф. 3.5.3.1). Это фермент цикла мочевины, специфически гидролизует аргинин с образованием орнитина и мочевины. Наиболее богаты этим ферментом гепатоциты, так как цикл мочевины характерен только для этих клеток. В нормальной плазме не обнаруживается. Очищенный фермент имеет молярную массу 140 кДа, активируется ионами двухвалентного марганца, L-лейцин и L-орнитин оказывают ингибирующий эффект. Оптимум рН наблюдается при 9,0-9,5. Определение активности. Аргиназную активность обычно определяют при помощи измерения количества образующейся мочевины при инкубации ферментного препарата с аргинином. Определение в сыворотке требует освобождения от мочевины, которая всегда присутствует здесь. Это осуществляют с помощью гель-фильтрации. Клиническое применение. Активность аргиназы в сыворотке крови является высокочувствительным индикатором повреждения клеток печени. Высокие значения аргиназной активности отмечаются при циррозе, гепатите. Несмотря на специфичность, сложность метода определения активности фермента затрудняет применение его в клинической практике. Общая характеристика сывороточных ферментных тестов Большинство ферментов, представляющих интерес с точки зрения диагностики, имеют молярную массу свыше 90 кДа и не могут проникать через клеточные мембраны и поступать во внутреннюю среду, если мембраны клеток не повреждены. Уровень ферментативной активности в кровяном русле после повреждения ткани зависит в первую очередь от концентрации данного фермента в ткани, от степени повреждения клеток, от устойчивости и каталитической активности фермента вне клетки, скорости его разрушения и экскреции. Механизмы выхода ферментов из клеток еще недостаточно изучены. Было показано, что этому могут способствовать гипоксия и аноксия, глюкозное голодание и высокие концентрации калия, уменьшение скорости производства АТФ. Sweetin и Thomson [1973] обнаружили, что значимые количества альдолазы и лактатдегидрогеназы не выходят из эритроцитов человека до тех пор, пока имеющаяся глюкоза не израсходована почти полностью, из чего следует вывод, что для сохранения ферментных белков в клетках необходимо соответствующее количество АТФ. Учитывая тот факт, что клеточные мембраны содержат фосфолипиды, от состояния которых зависит мембранная проницаемость, изучали влияние фосфолипаз 78 на выход ферментов из лейкоцитов человека и лимфоцитов крысы. Фосфолипазы А и С усиливают выход внутриклеточных ферментов из обоих типов клеток, причем эффект более выражен для ферментов цитозоля [8]. Включение АТФ в среду инкубации защищало лимфоциты крысы от действия фосфолипазы А, вызывающей выход лактатдегидрогеназы. АТФ также уменьшает потерю ферментов лейкоцитов человека и лимфоцитов крысы при длительной инкубации в растворе Кребса-Рингера (370С). Таким же действием обладают УТФ и фосфоенолпируват. Важная роль АТФ в процессе выхода ферментов из клеток объясняет влияние гипоксии и глюкозного голодания. Высокие концентрации калия стимулируют действие К+, Na+-АТФ-азы, гидролизующей АТФ. Вероятно, одним из первых последствий нарушения клеточных функций при заболеваниях являются поломки в системе сложных взаимосвязанных реакций энергетического катаболизма, ведущих к синтезу АТФ. Снижение скорости производства АТФ клеткой сопровождается повреждением мембран и способствует выходу прежде всего неструктурированных или плохо структурированных ферментов из клеток. Для диагностических целей важна не только скорость поступления фермента из клеток и его источник, но и возможность выявления каталитической активности и скорость исчезновения фермента из кровяного русла. Данные механизмы также еще недостаточно изучены. Лабильность ферментного белка, поступившего из клеток, обусловлена сильным разведением, отсутствием необходимого микроокружения, коферментов и субстратов, модификаторов его активности, которые имеются в клетке. Фермент может быть расщеплен в плазме имеющимися протеазами. Показано, что Кm клеточных ферментов, поступивших в плазму крови, постепенно повышается, что свидетельствует о снижении сродства к субстрату и прогрессирующей деградации белка. За исключением некоторых ферментов с малой молекулярной массой, которые фильтруются почками, моча может содержать только следы ферментов, поступивших в плазму из клеток. Возможно, ферменты захватываются клетками активного эпителия кишечника, где подвергаются расщеплению как обычные пищевые белки. Приведенные факты указывают на то, что активность любого фермента есть функция скорости его выхода из клеток и скорости его исчезновения из кровяного русла. При острых состояниях происходит внезапное освобождение ферментов из поврежденных и омертвевших клеток, которое может продолжаться всего несколько часов. Очень важным является в использовании ферментативной активности с диагностической целью понятие «границы нормы». Есть внушительный список факторов, влияющий на границы сывороторной активности ферментов у здоровых людей: возраст, пол, раса, масса тела, физическая активность, время суток, сезон. Установить эталонные значения очень трудно, а для некоторых тестов невозможно. Поэтому используются нормы, 79 полученные в конкретных условиях, конкретной лабораторией, а также границы нормальных значений, указанных в стандартно применяемых методах. Появление и исчезновение в сыворотке определенных ферментативных активностей при различных патологических состояниях называются ферментным спектром данного заболевания. Рассмотрим примеры ферментных спектров характерные для сердечно-сосудистых заболеваний. Сердечная мышца использует глюкозу как основной источник энергии, которая окисляется по гликолитическому пути и в цикле трикарбоновых кислот. Кардиомиоциты не могут переносить гипоксию, так как гликолиз не способен обеспечить энергетические потребности сокращения миокарда, поэтому недостаток кислорода приводит к появлению болей, приступу ишемии. Важную роль в метаболизме кардиомиоцитов имеют реакции переаминирования и креатинкиназная реакция, позволяющая резервировать энергетические ресурсы на некоторое время в виде креатинфосфата. При инфаркте миокарда внезапная и полная закупорка коронарной артерии тромбом приводит к нарушению кровообращения в определенной зоне миокарда. Возникающая боль связана с некрозом ткани в этой зоне. Повреждение миокарда ведет к появлению ферментов из кардиомиоцитов в плазме крови. Их удаление идет с разной скоростью, поэтому для диагностики большое значение имеет временной фактор. Активность креатинфосфокиназы нарастает раньше других, определяется в первые 3-6 часов и иногда опережает явные нарушения ЭКГ. Максимальных значений активность КФК достигает через 24 часа и возвращается к исходным значениям к третьему дню (если нет рецидивов). Конечно, увеличение активности КФК – очень чувствительный тест, но на нее оказывают влияние физическая нагрузка, состояние щитовидной железы и внутримышечные инъекции лекарств. Наиболее надежным тестом, позволяющим также рассчитать зону некроза, служит определение МВ изофермента креатинфосфокиназы. В более поздние сроки наблюдается увеличение активности лактатдегидрогеназы и аспартатаминотрансферазы. Повышение активностей данных ферментов начинается через 6-8 часов после инфаркта и достигает максимума через 24-36 часов. Нормализация наступает к пятому дню. Упомянутые сроки могут варьировать у конкретных больных в зависимости от размера зоны некроза, наличия рецидивов, анамнеза. Распространение инфаркта (расширение зоны некроза) приводит к появлению второго пика активности сывороточной АсАТ, это важный диагностический тест, поскольку интерпретация данных ЭКГ в данном случае затруднена за счет уже имеющихся изменений и лечения. Лактатдегидрогеназа содержится во многих клетках других тканей, поэтому важно исключить или учесть наличие других заболеваний. Эффективным является определение изофермента ЛДГ-1, содержание которого в кардиомиоцитах наибольшее. 80 Аномальные ферментные спектры в сыворотке крови больных появляются при остановке сердца, следующей за инфарктом миокарда. Повреждения миокарда в данном случае заслоняются нарушением кровообращения других органов, особенно печени и скелетной мускулатуры. Очень высокая активность АсАТ (в 15-20 раз) сопровождается значительным увеличением активностей АлАТ и других типично гепатоцитарных ферментов. Например, увеличивается активность как ЛДГ-1, так и ЛДГ-5. Диагностическую ценность имеет и процент повышения активностей КФК, ЛДГ, АсАТ и сроки нормализации. Они ориентируют врача при выборе тактики лечения, так как позволяют прогнозировать развитие заболевания и не упустить рецидивы. Миокардиты любой этиологии (вирусные, бактериальные, волчаночные) сопровождаются преимущественным увеличением активности ЛДГ-1, которое можно обнаружить по наличию оксибутиратдегидрогеназной активности в сыворотке крови. При ревматических миокардитах активность диагностических сывороточных ферментов в пределах нормальных величин, но длительное применение аспирина может привести к поражению печени и увеличению активности ферментов, характерных для гепатоцитов (АлАТ, γ-глутамилтрансферазы, ЛДГ-5 и щелочной фосфатазы). Стенокардии характеризуются нормальными величинами активностей КФК, ЛДГ-1 и АсАТ вне приступа. Длительный болевой приступ может сопровождаться небольшим увеличением активностей данных ферментов (1,5-2 раза от нормы). Появление застоя кровообращения и сердечной недостаточности характеризуется появлением ферментов, свидетельствующих о повреждении гепатоцитов: АлАТ и ЛДГ-5. Таким образом, правильно подобранные для диагностической цели ферментные тесты позволяют врачу получить дополнительную крайне важную информацию не только о характере заболевания, но и подобрать соответствующее лечение, предупредить рецидивы, оценить эффективность применяемых лекарственных препаратов и процедур. В правильном подборе тестов помощь врачу должен оказывать квалифицированный биохимик, хорошо ориентирующийся в особенностях метаболизма и ферментативном спектре тех или иных органов. 81 ГЛАВА 2 НАРУШЕНИЯ ОБМЕНА ВЕЩЕСТВ 2.1. Нарушения обмена углеводов [2,3,10,11,15] Углеводы являются основными энергетическими метаболитами клеток, а также выполняют ряд других функций: входят в состав белков и липидов, формируя их антигенные структуры и обусловливая тканевую, организменную и видовую специфичность. Известна также и энергоемкая (запасающая) функция углеводов. Пятиуглеводные моносахара – рибоза и дезоксирибоза – входят в состав нуклеотидов и, соответственно, нуклеиновых кислот. В организм человека и животных углеводы поступают с пищей, главным образом, растительной. В овощах и фруктах содержится крахмал, ди- и моносахариды. Единственный дисахарид животного происхождения – лактоза – входит в состав молока. В пищеварительном тракте происходит расщепление поли-, олиго- и дисахаридов до моносахаридов, которые всасываются через эпителий тонкого кишечника в кровь. Нарушение процессов переваривания и всасывания углеводов. Переваривание углеводов начинается с ротовой полости под действием амилазы слюны, но приостанавливается в желудке после пропитывания пищевого комочка желудочным соком, так как кислая среда инактивирует фермент, денатурируя его. В условиях снижения кислотности желудочного сока (анацидный гастрит) возможно продолжение расщепления и использования образующихся из амилозы олигосахаридов микроорганизмами пищи (лактобактерии, дрожжи) в процессах брожения. Это сопровождается ощущением тяжести в желудке, отрыжкой углекислым газом, образующимся при брожении. У больных анацидным гастритом в желудочном соке часто обнаруживается молочная кислота. Расщепление крахмала и небольшого количества гликогена продолжается в 12-и перстной кишке под действием α-амилазы панкреатического сока до мальтозы, изомальтозы и мальтотриозы. Затем на эти продукты и дисахариды пищи (сахарозу и лактозу) действуют другие ферменты кишечного сока: α-глюкозидаза, β-фруктофуранидаза, β-галактозидаза, под действием которых на поверхности эпителия кишечника (пристеночное 82 пищеварение) происходит расщепление до моносахаридов: глюкозы, фруктозы и галактозы. Моносахариды, содержащиеся в пище, всасываются в неизменном состоянии. При нарушении переваривания углеводов ценным является исследование кала. В препаратах, окрашенных раствором Люголя, в данном случае обнаруживаются зерна крахмала синего цвета. Подобные патологии сопровождают недостаточность поджелудочной железы, поносы. Транспорт моносахаридов из просвета кишечника в клетки эндотелия кишечника может осуществляться путем облегченной диффузии и активного транспорта. При активном транспорте глюкоза и галактоза поступают в симпорте с ионами натрия. Энергия АТФ затрачивается на создание градиента натрия путем отсасывания его обратно из клеток в просвет кишки Na+, K+-АТФ-зой. Из клеток кишечника моносахариды перемещаются в кровь с помощью облегченной диффузии. Скорость всасывания моносахаридов в тонком кишечнике различна: быстрее всех всасываются галактоза и глюкоза, несколько медленнее – фруктоза и медленно – манноза, сорбоза, рибоза, дезоксирибоза, арабиноза и ксилоза. Скорость всасывания определяется интенсивностью фосфорилирования транспортных белков и самих моносахаридов, активностью специфических фосфатаз, осуществляющих дефосфорилирование, предшествующее выходу сахаров в кровь. Снижение скорости поступления моносахаров в кровь наблюдается при гипофункции коры надпочечников, так как уменьшаются темпы синтеза протеинкиназ, фосфорилирующих транспортные белки. Заболевания тонкого кишечника, сопряженные с нарушениями функции эпителия, влекут изменения в процессах всасывания углеводов и истощению. Изучены отклонения в переваривании дисахаридов: сахарозы, мальтозы, лактозы. Как правило, это врожденные наследственные заболевания, при которых отсутствуют ферменты, гидролизующие соответствующие дисахариды. Описаны непереносимость сахарозы, лактозы, мальтозы, изомальтозы. Непереносимость сахарозы. Отсутствие в кишечном соке β-фруктофуранидазы. Проявляется в раннем возрасте при переходе на смешенное кормление. Развивается диарея, это может привести к гибели ребенка. Меры лечения: исключение из диеты сахарозы и продуктов, ее содержащих, или использование ферментных препаратов. Непереносимость лактозы. Отсутствие фермента β-галактозидазы. Для наследственных форм характерно очень раннее проявление: рвота, понос, исхудание с получением материнского молока. С мочой выводятся очень большие количества лактозы и аминокислот: аланина, глицина, серина, глутаминовой кислоты, валина, лейцина. Лечение: замена молока на молочные смеси, не содержащие лактозы. 83 Непереносимость мальтозы и изомальтозы. Недостаточность α-1,4гликозидазы и α-1,6-гликозидазы. Признаки появляются при употреблении в пищу крахмала (подкормка кашей). Лечение: прием ферментативных препаратов. Гомеостаз глюкозы крови и его нарушение. Поступающая из кишечника глюкоза с кровью воротной вены поступает к печени и частью захватывается гепатоцитами, оставшееся количество попадает в клетки других органов и тканей: миоциты, кардиомиоциты, клетки крови, нефроциты, нейроны и др. Потребление глюкозы клетками из кровотока происходит также с помощью облегченной диффузии при участии специфических транспортных белков. Скорость трансмембранного потока глюкозы зависит в основном от градиента ее концентрации. Исключением являются клетки мышц и жировой ткани (адипоциты), где активность транспортного белка зависит от гормона поджелудочной железы – инсулина. Обнаружено пять типов белков-переносчиков глюкозы (ГЛЮТ), имеющих сходную первичную структуру. ГЛЮТ-1 служит для обеспечения стабильного потока глюкозы в мозг. Он обнаруживается также в почках, плаценте, тонком кишечнике. ГЛЮТ-2 обнаружен в гепатоцитах, β-клетках островков Лангерганса, энтероцитах (активный эпителий тонкого кишечника). Именно этот белок переносит глюкозу в кровь из энтероцитов после всасывания. ГЛЮТ-3 обладает большим, чем ГЛЮТ-1, сродством к глюкозе. Он прежде всего представлен в нервной ткани, но содержится также в нефроцитах, плаценте. ГЛЮТ-4 – главный переносчик глюкозы в мышцах и адипоцитах. Инсулинозависим. В отсутствие инсулина данный транспортный белок практически полностью локализован в цитоплазме. При формировании гормонрецепторного комплекса за счет реализации тирозинкиназной активности рецептора происходят активация транслокации белка-переносчика в мембрану и доставка глюкозы к активному центру гексокиназы. ГЛЮТ-5 осуществляет перенос в симпорте с ионами натрия. Транспортный белок представлен в энтероцитах (со стороны кишечника), нефроцитах, в меньшей степени в скелетных мышцах, нервной ткани, адипоцитах. Может переносить фруктозу. Транспорт глюкозы из первичной мочи в клетки почечных канальцев происходит по вторично-активному механизму в симпорте с натрием. Благодаря этому глюкоза может поступать в плазму крови, если ее концентрация в первичной моче меньше, чем в крови. Глюкоза практически полностью (99%) реабсорбируется из первичной мочи в конечной части почечных канальцев [2]. В крови здорового человека поддерживается относительно постоянное количество глюкозы, которое натощак составляет от 3 до 5,5 мМ/л. 84 Кроме глюкозы в плазме крови содержится около 11,7-20,6 мг% гликогена и некоторое количество связанных с белками полисахаридов, а также обнаруживаются в небольшом количестве галактоза, фруктоза, рибоза и некоторые другие моносахара. Содержание глюкозы в плазме крови у разных людей и одного и того же человека в течение нескольких часов может колебаться на 20-30 мг%, что объясняется большой подвижностью нейроэндокринной регуляции обмена углеводов в организме. Уровень глюкозы в крови поддерживается несколькими источниками (пищевые поступления, распад гликогена, обратное всасывание из первичной мочи) за счет нейрогуморальных механизмов, регулируемых через гипоталамус. Важнейшая роль в этом принадлежит печени, так как в гепатоцитах происходит накопление гликогена, расщепление которого при необходимости способствует увеличению содержания глюкозы в плазме крови. В клетки печени глюкоза проходит при участии ГЛЮТ-2 независимо от инсулина. Концентрация глюкозы в гепатоцитах повышается в соответствии с ее уровнем в воротной вене. ГЛЮТ-2 и глюкокиназа, осуществляющая фосфорилирование глюкозы имеют высокую Кm (12 мМ/л), поэтому поступление глюкозы в гепатоцит происходит только при высоких ее концентрациях в плазме. Хотя инсулин не оказывает непосредственного влияния на транспорт глюкозы в клетки печени, но в настоящее время с ним связывают скорость синтеза глюкокиназы в гепатоцитах. Избыток глюкозы, поступившей в гепатоциты, используется для синтеза гликогена. Богатая глюкозой кровь, достигнув гипоталамуса, приводит к возбуждению части его клеток и сигнал поступает к островкам Лангерганса поджелудочной железы, что стимулирует секрецию инсулина. Инсулин способствует усилению поступления глюкозы в мышцы, где она используется либо в процессах катаболизма, либо для пополнения запасов гликогена; и в адипоциты, в которых через ацетил-КоА превращается в жиры. Глюкоза может синтезироваться в клетках в процессе глюконеогенеза из лактата, глицерола и глюкогенных аминокислот (аланин и другие). Лактат постоянно образующийся в мышцах, эритроцитах и других клетках, поступает в кровь, откуда активно захватывается гепатоцитами (цикл Кори) и превращается в глюкозу, а затем и в гликоген. Процесс глюконеогенеза стимулируется гормоном коры надпочечников – кортизолом. Переключение процессов синтеза и мобилизации гликогена в печени происходит при переходе состояния пищеварения в постабсорбционный период (после всасывания) или в печени и мышцах – состояния покоя на режим мышечной работы. В переключении этих метаболических путей участвуют гормоны: инсулин, глюкагон и адреналин (печень), инсулин и адреналин (мышцы). Инсулин и глюкагон постоянно присутствуют в крови, но изменяется их относительная концентрация: инсулин-глюкагоновый индекс. В постабсорбционный период индекс снижается, и решающим фактором становиться влияние глюкагона, который стимулирует распад гликогена в печени, 85 в период всасывания преобладает действие инсулина, который способствует поступлению глюкозы в мышцы и опосредованно увеличивает скорость поглощения глюкозы гепатоцитами. Кроме увеличения содержания глюкозы после приема пищи (алиментарная гипергликемия), еще ряд факторов приводит к росту количества глюкозы в плазме крови. При различных эмоциях возбуждение, возникшее в лимбической зоне коры, распространяется на продолговатый мозг, а оттуда по ветви симпатического нерва достигает мозговой части надпочечников, что сопровождается секрецией адреналина. Адреналин имеет клетки-мишени во многих органах и тканях. В данном случае он действует на β-адренорецепторы гепатоцитов, стимулируя гликогенолиз. Образующаяся глюкоза поступает из гепатоцитов в кровь, уровень ее в плазме возрастает. Это так называемая психическая гипергликемия. Шоковые состояния, высокие температуры также сопровождаются гипергликемией. При гипофункции островковой зоны поджелудочной железы происходит изменение соотношения инсулин/адреналин и наступает инсулярная гипергликемия. Замедление вовлечения глюкозы в обмен при воспалениях, сепсисе, токсикозах, наркозе приводит к гипергликемии вследствие нарушения функций ферментных систем. Одним из тяжелых заболеваний, связанных с нарушением углеводного обмена, является сахарный диабет. Сахарный диабет – это гетерогенная группа нарушений, характеризующаяся гипергликемией, глюкозурией и сопровождающаяся также нарушениями липидного и белкового обменов[15]. При сахарном диабете нарушаются либо синтез инсулина и секреция его поджелудочной железой, либо синтез рецепторов к инсулину в клетках-мишенях. В связи с этим различают два типа сахарного диабета: I тип – инсулинзависимый, характеризуется разрушением клеток островковой зоны и прекращением секреции инсулина; II тип – инсулиннезависимый – снижение секреции инсулина либо поломка рецепторов на клетках-мишенях. Первый тип возникает чаще в молодом возрасте, сопровождается похуданием, острым началом, отсутствием инсулина в плазме крови. Второй тип более распространен в среднем и пожилом возрасте, течение заболевания хроническое, снижение массы тела нехарактерно, часто наблюдается ожирение, концентрация инсулина может быть нормальной или даже повышенной. Однако в настоящее время известны случаи развития сахарного диабета II типа и в молодом возрасте, и наоборот. В развитии диабета второго типа большое значение имеет наследственный фактор и факторы окружающей среды: неправильное питание, низкая физическая активность, негативные стрессы, прием кортикостероидов и антагонистов β-адренорецепторов и другие. Диабет может быть связан с другими патологическими состояниями, в частности с панкреатическими и эндокринными заболеваниями, тогда он характеризуется как вторичный. Хронический панкреатит может приводить к 86 нарушению синтеза инсулина островковой зоной, а синдром Кушинга и акромегалия сопровождаются увеличением секреции гормонов-антагонистов инсулина: кортикостероидов и инсулиноподобных факторов роста. Нарушения обмена веществ при сахарном диабете. При сахарном диабете и первого и второго типа нарушается процесс поступления глюкозы в клетки. Результатом становятся быстрая утилизация гликогена и стимуляция глюконеогенеза в гепатоцитах, мышцах и других клетках. Альтернативными энергетическими катаболитами становятся жирные кислоты. Стимуляции β-окисления жирных кислот способствует активирование глюкагоном митохондриальной карнитинтрансферазы, осуществляющей перенос жирных кислот в митохондрию для окисления. Однако расщепление образующегося в процессах β-окисления ацетил-КоА эффективно осуществляется при достаточном количестве оксалоацетата, источником которого служит, прежде всего, пируват. Избыток ацетил-КоА при недостатке оксалоацетата приводит к образованию ацетоацетата, декарбоксилирование которого дает ацетон, а восстановление – β-оксибутират. Все три соединения: ацетоацетат, ацетон и β-оксибутират получили название кетоновых тел. Образование ацетоацетата сопровождается закислением и ведет к развитию кетоацидоза. В то же время ацетоацетат и оксибутират могут использоваться клетками мозга и мышцами в качестве энергетических метаболитов. Кетоацидоз развивается не только при тяжелой форме сахарного диабета, но в условиях полного голодания. Для диагностики и мониторинга сахарного диабета используют определение глюкозы и кетоновых тел в крови и моче. В норме глюкоза в моче отсутствует, пока ее уровень в плазме крови не поднимется до 10 мМ/л и выше. Однако уровень глюкозы в моче не является прямым отражением количества глюкозы в плазме крови. Все глюкозурии (появление глюкозы в моче) делят на инсулярные, неинсулярные и ренальные. Инсулярные глюкозурии вызываются недостатком инсулина и гипергликемией, что приводит к выведению ее с мочой и является важным симптомом сахарного диабета. Уровень глюкозы в моче при сахарном диабете может достигать 12 мг%. Неинсулярные глюкозурии обычно связаны с поражением других эндокринных органов (гиперфункция коры надпочечников, гипофиза, щитовидной железы), центральной нервной системы, а также могут быть обусловлены алиментарной гипергликемией. Глюкоза в моче может обнаруживаться при токсических, механических поражениях печени, сопровождающихся гипергликемиями, а также при нарушениях гликогенсинтезирующей функции гепатоцитов. Ренальные глюкозурии могут быть первичными, связанными с аномалиями реабсорбции глюкозы в почечных канальцах (ренальный, несахарный диабет), содержание глюкозы в крови в норме или снижено. Вторичные связаны с почечными патологиями: нефриты, нефрозы, нефросклерозы. 87 Гипогликемии обнаруживаются при длительном голодании или усиленной физической нагрузке. Запасы гликогена быстро исчерпываются и наблюдается усиленное расщепление глюкозы в тканях. Снижение содержания глюкозы в плазме крови обнаруживается при миксидеме, бронзовой болезни, гипофункции аденогипофиза, сопровождает нарушение почечного эпителия из-за отсутствия обратного всасывания глюкозы в кровь из первичной мочи. Гипогликемия опасна тем, что глюкоза является важным энергетическим метаболитом для мозга. Мозг может утилизировать кетоновые тела, но они не продуцируются со скоростью, достаточной для противодействия острой гипогликемии. Гипогликемия – это лабораторный диагноз, который ставится, если натощак в венозной цельной крови уровень глюкозы составляет менее 2,2 мМ/л (плазма – менее 2,5 мМ/л). Причины гипогликемии делят на обусловленные сниженным выходом глюкозы из гепатоцитов и увеличенной ее утилизацией. Сниженный выход глюкозы. Гипогликемия может быть осложнением заболеваний печени и развивается при массивной гепатоцеллюларной деструкции. Гипогликемия данного типа наблюдается также при нарушениях питания, злоупотреблении алкоголем и наследственных болезнях, обусловленных энзимопатией ферментов обмена углеводов. Реже подобная гипогликемия является следствием дефицита кортизола или соматотропина. Увеличенная утилизация глюкозы. Постоянная утилизация глюкозы мозгом может вызвать гипогликемию, если дефектна продукция кетоновых тел, что в свою очередь обычно связано со сниженным запасом жиров. Это наблюдается у недоношенных детей, скудном питании, голодании. Нарушение производства кетоновых тел может быть следствием дефекта окисления жирных кислот, что обусловлено либо дефицитом карнитина, либо недостаточностью карнитинацилтрансфераз или ацилдегидрогеназ. Аномалии карнитинового звена или ацилдегидрогеназ вызывают повышение содержания неэтерифицированных жирных кислот в плазме крови. Обе группы причин гипогликемии могут присутствовать одновременно. Такие ситуации характерны для инсулинóм – опухолей из панкреатических β-клеток, а также для первичных карцином печени. Гипогликемия – частое метаболическое нарушение у детей, ее диагностика и установление причин важны для предотвращения поражений мозга. В неонатальный период часто развивается преходящая гипогликемия из-за несовершенства нейрогуморальных механизмов регуляции уровня глюкозы в крови. Длительная и тяжелая гипогликемия подтверждает патологическую причину состояния. Для большинства новорожденных с преходящей гипогликемией характерен гиперинсулинизм, дефицит контринсулярных гормонов или ферментов глюконеогенеза и гликолиза. В условиях повышенной утилизации глюкозы, например при усиленной физической нагрузке или инфекционных заболеваниях, продукция глюкозы ограничена, что и приводит к гипогликемии. Минимально необходи88 мыми исследованиями в данном случае являются определение глюкозы в крови, инсулина в сыворотке и кетоновых тел в крови и моче. Одним из важнейших показателей как для диагностики диабета, так и для ряда других заболеваний является определение количества глюкозы в плазме крови. В настоящее время используется унифицированный глюкозоксидантный метод. Большое значение имеет глюкозотолерантный тест, который заключается в определении глюкозы в плазме крови через стандартные промежутки времени после нагрузки сахаром. Натощак определяется базальный уровень содержания глюкозы, затем пациент получает около 75 г глюкозы или 50 г сахарозы в 100 мл воды. Уровень глюкозы исследуют через 30 минут в течение двух часов. При сахарном диабете наблюдается быстрый рост содержания глюкозы в крови в ответ на нагрузку до 200% от начального уровня, через 2 часа уровень глюкозы в плазме не возвращается к исходным значениям. При заболеваниях щитовидной железы наблюдаются также быстрый рост до уровня, превышающего нормальный рост, но быстрая нормализация. Заболевания печени характеризуются более высоким подъемом, но меньшим, чем при диабете. Через 2 часа уровень превышает исходный на 20-30%. Нарушения обмена фруктозы и галактозы Эссенциальная фруктозурия обусловлена недостаточностью фосфофруктокиназы, фосфорилирующей ее по первому атому. Это исключает поступление фруктозы в клетки, так как моносахариды внутри клеток находятся только в фосфорилированном состоянии. Уровень фруктозы в крови повышается, и она появляется в моче. Клинически болезнь не проявляется, выявляется случайно при исследовании мочи на сахар. Для исключения сахарного диабета проводят реакцию Селиванова на фруктозу. Положительная реакция указывает на фруктозурию. Наследственная непереносимость фруктозы клинически проявляется при включении в рацион ребенка фруктов или соков. Признаки: рвота, боли в животе, диарея, гипогликемия. В основе – недостаточность фруктозо1-фосфатальдолазы. Накопление фруктозо-1-фосфата приводит к торможению гликогенолиза, так как он ингибирует гликогенфосфорилазу, а также метаболизма глюкозы из-за ингибирования фосфогексоизомеразы. Это уменьшает скорость утилизации глюкозы и производства АТФ, вызывает гипофосфатемию и служит сигналом для расщепления адениловых нуклеотидов – источников внутриклеточного фосфора. В диагностике наследственной непереносимости фруктозы особое значение имеет выяснение связи между приемами фруктозосодержащей пищи и приступами заболевания. Из лабораторных данных наиболее важны: выявление в моче редуцирующих веществ и их дифферециация (фруктоза или галактоза); результаты пробы на толерантность к фруктозе (прием 0,25г на 1 кг веса тела). Наследственная непереносимость фруктозы – довольно часто 89 встречающееся заболевание, потому что может быть также обусловлена дефицитом фруктозо-1,6-дифосфатазы. Механизм развития биохимических сдвигов примерно тот же, что и при недостатке фруктозо-1-фосфатальдолазы. Особое место среди патологий углеводного обмена занимает галактоземия. У больных в крови обнаруживается большое количество галактозы и галактозо-1-фосфата. Проявляется галактоземия в раннем возрасте и часто приводит к гибели детей, так как поражаются почки, печень, ЦНС, развивается катаракта. Сопровождается галактозурией, выделением аминокислот с мочой. В основе заболевания – нарушение ферментативных превращений галактозы в глюкозу. Метаболические превращения галактозы в клетках осуществляются по следующему пути: Галактоза + АТФ Галактозо-1-фосфат + АДФ Галактокиназа Галактозо-1-фосфат+УДФ-глюкоза→УДФ-галактоза+Глюкозо-1фосфат Галактозо-1-фосфат-уридилтрансфераза УДФ-галактоза УДФ-глюкоза Эпимераза Дефицит галактокиназы приводит к накоплению избытка галактозы, не вовлекаемой в метаболические процессы, и выведению ее с мочой. Заболевание проявляется ухудшением зрения и развитием катаракты. Это связано с увеличением вероятности восстановления галактозы при участии НАДФН в спирт (галактитол). Накапливаясь в стекловидном теле, галактитол связывает большие количества воды, что сопровождается разрывом зонулярных волокон [10]. Лабораторными показателями недостаточности галактокиназы служат снижение активности фермента в эритроцитах и наличие галактозы в моче. Дефицит галактозо-1-фосфат-уридилтрансферазы сопровождается накоплением и галактозы, и галактозо-1-фосфата. Недостаточность проявляется сразу после начала кормления в виде рвоты, диареи, желтушности, сохраняющейся более длительно, чем обычно. Биохимические изменения включают галактоземию, галактозо-1-фосфатемию, аминоацидурию, протеинурию. Лабораторная диагностика: снижение активности фермента в эритроцитах (от 10 до 50% от нормы при разных формах заболевания). Рекомендуется исключение продуктов, содержащих галактозу из пищи, переход на кормление смесями, не содержащими лактозу. Дефицит уридинфосфатгалактозо-4-эпимеразы – редкое явление, описан лишь у больных одной семьи: наблюдали гипергалактоземию и галактозурию при отсутствии каких-либо клинических проявлений. 90 Нарушения обмена полисахаридов. Среди нарушений углеводного обмена значительное место принадлежит врожденным наследственным заболеваниям – гликогенозам. Данная группа болезней вызвана необычным накоплением гликогена в печени, сердечной мышце и скелетной мускулатуре, нефроцитах и клетках селезенки. Характерный признак – гипогликемия при высоком содержании гликогена в тканях, который не поддается мобилизации адреналином и глюкагоном. Гликоген, накапливаясь в тканях, вызывает их перерождение, дегенерацию и гибель. Наблюдаются мышечная слабость, задержка роста, ожирение, поражение печени и почек. Причиной развития патологических изменений являются ферментативные нарушения, причем различные типы гликогенозов являются следствием снижения активности определенных ферментов. Гликогеноз I типа (болезнь Гирке). В основе заболевания – дефект глюкозо-6-фосфатазы в гепатоцитах. Ограничение дефосфорилирования глюкозы приводит к уменьшению ее выхода в кровь (переносчика глюкозо6-фосфата через мембрану в клетках нет). Глюкозо-6-фосфат вовлекается в метаболизм по гликолитическому и пентозофосфатному пути, в связи с чем увеличивается продукция лактата, снижается пул АТФ, ускоряется распад нуклеотидов до мочевой кислоты. Гипогликемия, обусловленная недостаточным поступлением глюкозы в кровь, сопровождается снижением уровня инсулина, что ускоряет липолиз и освобождение жирных кислот. Наличие гиперлактатемии, гиперурикемии и гипогликемии позволяет заподозрить болезнь Гирке. Уточнение диагноза можно провести, используя глюкагоновый тест, то есть отсутствие гипергликемической реакции на введение глюкагона. Течение заболевания характеризуется гипотрофией с гепатомегалией, гипогликемией, гиперлактатемией, гиперурикемией и кровоточивостью. Характерно выражение лица – «вид китайской куклы». Гликогеноз II типа (болезнь Помпе, генерализованный гликогеноз). Причина заболевания – дефект α-1,4-глюкозидазы (лизосомальной кислой мальтазы). В отсутствие фермента гликоген накапливается в лизосомах, а позднее – и в цитозоле. Болезнь проявляется уже в раннем возрасте, наблюдаются слабость, медленная прибавка в весе, цианотичность. Один из наиболее тяжелых гликогенозов характеризуется поражением печени, мышц, почек, нервной системы. Диагноз устанавливается только по исследованию биоптатов печени или мышцы и регистрации отсутствия кислой мальтазы. Возможно пренатальное установление дефекта по результатам исследования амниотических клеток. Как в случае гликогеноза первого типа, так и в случае гликогеноза второго типа строение гликогена обычное. Гликогеноз III типа (болезнь Кори и Форбса). В основе заболевания лежит дефект амило-1,6-глюкозидазы, нарушающей отщепление ветвлений в молекуле гликогена. Наблюдается сильное ветвление гликогена в 91 клетках, запасающих гликоген. Лабораторные показатели близки к болезни Гирке, только в отличие от гликогеноза первого типа введение галактозы или фруктозы повышает гликемию, так как глюкозо-6-фосфатаза функционирует. Проба с глюкагоном не вызывает гипергликемию, но и не увеличивает содержание лактата в плазме крови. В биоптатах печени снижена активность амило-1,6-глюкозидазы. Гликогеноз IV типа (болезнь Андерсона, амилопектиноз). Болезнь развивается из-за дефекта ветвящего фермента – амило-1,4;1,6трансглюкозидазы. Фермент лимитирует рост наружных ветвей, в его отсутствие гликоген отличается очень длинными цепями с редкими короткими ветвлениями. Заболевание сопровождается развитием цирроза печени, желтухой и печеночной недостаточностью. Позднее появляется мышечная слабость. Наличие печеночной недостаточности в качестве единственного признака требует исключения галактоземии и наследственной непереносимости фруктозы, тирозинемии и болезни Вильсона. Диагноз уточняют, исследуя активность ветвящего фермента в лейкоцитах. Гликогеноз V типа (болезнь Мак-Ардля). Гликогеноз мышц развивается за счет недостаточности мышечной гликогенфосфорилазы. Болезнь проявляется около 30 лет и характеризуется болями в мышцах, мышечной слабостью после умеренной физической нагрузки. Дефект диагностируется на основании результатов изучения активности ферментов в сыворотке крови после дозированной физической нагрузки. При наличии заболевания увеличивается активность в крови креатинфосфокиназы, альдолазы и лактатдегидрогеназы, уровень лактата не превышает нормы. Уровень лактата возрастает в плазме крови при потреблении мышечными клетками глюкозы, а в данном случае используется энергия расщепления жирных кислот. Гликогеноз VI типа (болезнь Херса, печеночный гликогеноз). В основе заболевания – нарушение активации печеночной гликогенфосфорилазы. Самый легкий по течению вариант гликогеноза. Участок нарушения активации у разных больных может быть различным: дефект активации протеинкиназы А, киназы фосфорилазы или самой гликогенфосфорилазы. У большей части больных фиксируется отсутствие киназы фосфорилазы. Диагноз подтверждается по тесту с глюкагоном, который не сопровождается гипергликемией, и оценкой активности фосфорилазного комплекса в лейкоцитах. Гипогликемия выявляется не всегда, строение гликогена обычное. Гликогеноз VII типа (болезнь Тэрье). Напоминает болезнь Мак-Ардля, так как мышечная нагрузка вызывает боли в мышцах, сопровождается лактат- и пируватемией, возможна миоглобинурия. В мышцах обнаруживается дефицит фосфофруктокиназы, что приводит к общему нарушению обмена углеводов. Диагноз устанавливают по снижению фосфофруктокиназной активности в эритроцитах. 92 Гликогеноз VIII типа (болезнь Хойджина). Причина – низкая активность гликогенфосфорилазы в гепатоцитах, может рассматриваться как уточненный вариант болезни Херса. Нарушения обмена мукополисахаридов (глюкозоаминогликанов) – мукополисахаридозы – патология, характеризующаяся отложением в разных тканях глюкозоаминогликанов. Причиной заболевания служат дефекты специфических лизосомных гидролаз. В условиях физиологической нормы в деградации глюкозоаминогликанов, участвуют различные лизосомные гликозидгидролазы. При дефекте какой-либо из этих гидролаз нарушается процесс утилизации глюкозоаминогликанов и продукты их неполного расщепления накапливаются почти во всех тканях (болезни накопления). Мукополисахаридозы отличаются прогрессирующим течением с различной степенью тяжести. Общие признаки разных форм: деформация черт лица и суставов, изменения скелета, поражения печени, селезенки, сердца, кровеносных сосудов. Наблюдается задержка умственного и психомоторного развития. Лабораторно регистрируется экскреция с мочой различных продуктов обмена глюкозоаминогликанов: гепарин- и дерматансульфатов, кератансульфатов, снижение активности разных для различных форм лизосомальных ферментов (α-L-идуронидазы, идуронатсульфатазы, N-сульфамидазы, N-ацетилглюкозаминидазы и других). 2.2. Нарушение обмена белков [3, 10,11,15] Белки – основные биополимеры, которые используются для строительства клеток и организмов. Кроме строительной, белки выполняют огромное количество важнейших функций: каталитическую, регуляторную, двигательную, транспортную, рецепторную, защитную и другие. Нарушения белкового обмена ведут к значительным патологическим изменениям метаболизма и развитию часто весьма тяжелых заболеваний. Нарушение переваривания и всасывания белков. В желудочнокишечном тракте человека белки расщепляются под действием разнообразных протеолитических ферментов желудочного, панкреатического и кишечного пищеварительных соков. Основные заболевания, связанные с нарушением переваривания и всасывания белков, обусловлены либо воспалительными процессами (гастриты, колиты, панкреатиты), либо врожденной недостаточностью некоторых ферментов, расщепляющих белки (целиакия). При целиакии наблюдается появление в крови пептидов и усиление выведения их с мочой. Пептидурия характерна также для абсцессов, гангрен, когда усиливается распад белков тканей организма. Раньше других в кишечнике в свободном виде появляются ароматические аминокислоты и триптофан. В норме имеется определенный разрыв между временем появления аминокислот в кишечнике и их всасыванием в 93 кровь. Этот разрыв не превышает двух часов, что не отражается на скорости процессов синтеза белков в тканях. При патологических процессах нередко происходит разрыв во времени между всасыванием незаменимых аминокислот и их появлением в кишечнике, достигающий 5-6 часов, что сопровождается нарушением синтеза белков в тканях. Чаще всего наблюдается после резекции желудка. Некоторые белки (трудноусвояемые) могут всасываться в неизменном виде и попадать в лимфу (сырой яичный альбумин), что влечет за собой развитие аллергической реакции. Такие явления характерны для детей. В этом случае выведение чужеродного белка с мочой служит защитной реакцией организма. Кроме яичного альбумина аллергические реакции часто вызывают около 15 белков сырого молока, при кипячении они денатурируют и их переваривание облегчается. Пищевые аллергии доминируют в первые 12 месяцев жизни в связи с несовершенством процессов переваривания и их регуляции. Нарушение обмена аминокислот. У людей имеют место возрастные изменения потребности организма в отдельных аминокислотах. Для нормального роста и развития детей пища должна содержать кроме 8 незаменимых аминокислот (фен, тре, мет, лиз, лей, изо, три, вал) еще цистеин и тирозин, так как они синтезируются на основе незаменимых метионина и фенилаланина, а поступление последних с пищей не покрывает этих затрат. Дети нуждаются также в относительно больших количествах лизина, треонина, валина и лейцина, чем взрослые. Условно заменимые для взрослого человека аминокислоты аргинин и гистидин для детей переходят в разряд незаменимых, так как скорость их синтеза не покрывает потребности в них растущего организма. Потребности человека в отдельных незаменимых аминокислотах зависят также от физиологического состояния организма. В период беременности, лактации, заживления ран, восстановления кровопотерь, воспалительных процессах организму человека требуется большее количество полноценных в пищевом отношении белков (животного происхождения). Недостаток некоторых аминокислот в пище сказывается на самочувствии: недостаток лизина ведет к повышению чувствительности к шуму, тошноте, головокружениям; недостаток аргинина – нарушению сперматогенеза; валина и триптофана – потере аппетита, тошноте. Метионин обладает липотропным действием и препятствует отложению жиров в печени и почках. Полное исключение белков из пищи сопровождается усиленным распадом собственных белков организма, потерей веса, дистрофией, перерождением печени. Недостаток тирозина может покрываться за счет фенилаланина, а цистеина – за счет метионина. При некоторых патологиях обмена аминокислот это становится невозможным. Например, при фенилпировиноградной олигофрении не происходит превращение фенилаланина в тирозин, и тирозин становится незаменимой аминокислотой. 94 Аминокислоты крови. На высоте пищеварительных процессов уровень аминного азота в крови достигает 2-4 мг%. Однако, аминокислоты быстро удаляются из крови, захватываясь клетками тканей. Аминокислоты крови можно подразделить на две группы: (1) идущие на построение белков; (2) не входящие в состав белков (α-аминомасляная, γ-аминомасляная, β-аланин, гомосерин и др.). Среди свободных аминокислот крови наибольшее количество приходится на глутамин, в значительных количествах обнаруживаются также аланин, цистин, цистеин, валин, треонин, лизин, лейцин, изолейцин, глутаминовая кислота, пролин. Обычно спектры разных людей в значительной степени совпадают, но зависят от возраста. Увеличение содержания свободных аминокислот отмечается в активной фазе ревматизма, при системной красной волчанке, тяжелой форме тиреотоксикоза (Базедова болезнь), диатезах, опухолях. Снижение характерно для активной формы туберкулеза, а также для периода выздоровления от травм (за счет усиления репаративных процессов). Выведение аминокислот с мочой. В моче здорового человека обнаруживаются незначительные количества всех содержащихся в плазме крови аминокислот. Экскреция имеет возрастные особенности: у детей – следовые количества, в старости – больше. При изучении процессов реабсорбции аминокислот в почечных канальцах было показано, что аргинин, глутаминовая кислота и лизин труднее поддаются обратному всасыванию, чем аланин, валин, глицин, изолейцин, триптофан, фенилаланин и метионин. Важным показателем состояния аминокислотного обмена служит азот аминокислот мочи, с возрастом содержание его нарастает, в период половой зрелости – max – 200 мг/сутки, затем снижается до 30-150 мг/сутки, что и является нормой. С мочой больше всего выводится глицина и гистидина, мало глутаминовой и аспарагиновой кислот, пролина, метионина и аргинина. Увеличение выделения аминного азота с мочой указывает на патологию и требует установления причин. Аминоацидурия является следствием (1) повышения содержания аминокислот в плазме; (2) снижения почечного порога реабсорбции аминокислот почками; или (1) и (2) вместе. Повышенная экскреция аминокислот наблюдается при ряде патологических состояний. Заболевания печени (гепатиты, циррозы, острая желтая дистрофия, болезнь Боткина) отличает повышение содержания аминокислот в крови и моче. Больше всего выделяется с мочой γ-аминомасляной кислоты, одновременно увеличивается выделение этаноламина. Это является важным диагностическим тестом заболеваний печени, так как нарушается процесс дезаминирования γ-аминомаслянной кислоты и синтеза фосфолипидов. Аминоацидурия наблюдается также при болезнях, характеризующихся распадом тканей: раковых опухолях, ожогах, тяжелых травмах и инфекциях, гемолитических анемиях, мышечных дистрофиях, гипертиреозах. Аминоацидурия, харак- 95 терная для заболеваний почек, сопровождается также глюкозурией, протеинурией, она получила название – аминовый диабет. Нарушение обмена конкретных аминокислот. Имеются наследственные заболевания, обусловленные недостатками определенных ферментов и нарушением обменных процессов ряда аминокислот. А). Нарушение обмена цистина и цистеина Встречается в двух формах. Цистинурия характеризуется отсутствием нарушений в промежуточном обмене цистина и цистеина. В крови концентрация цистина в норме, однако с мочой выделяется до 2 г в сутки. Причина – нарушение реабсорбции цистина из первичной мочи. Цистин плохо растворим в воде, при выведении выпадает в осадок, формируя камни в почках, мочеточниках и мочевом пузыре. В организме развивается цистиноз – отложение кристаллов цистина в тканях, особенно в ретикулоэндотелиальной системе, селезенке, соединительной ткани, коже, лимфоузлах, костном мозге, роговице, конъюнктиве. В печени накапливаются и цистин, и цистеин. Тяжелое заболевание, сопровождаемое нарушением обменных процессов в многих органах и тканях. Цистеинурия – врожденная аномалия обмена цистин-цистеин. Обычно наблюдается повышенное выведение цистеина с мочой без особых клинических проявлений. Б). Нарушения обмена фенилаланина и тирозина Превращение фенилаланина в тирозин осуществляется в клетках печени и мышц с помощью фермента фенилаланин-4-гидроксилазы. Механизм реакции сложен, требует присутствия Fe2+, восстановленных производных птеридина. Образование фенилаланина из тирозина у человека не происходит. Метаболизм фенилаланина и тирозина представлен на рис. 2.1. Встречаются следующие заболевания, связанные с нарушением обмена фенилаланина и тирозина – тирозиноз, алкаптонурия, фенилкетонурия, фенилпировиноградная олигофрения, альбинизм и другие. Тирозиноз. Заболевание связано с недостаточностью фермента тирозинаминотрансферазы, осуществляющей трансаминирование тирозина в глутаминовую кислоту. В крови накапливаются и интенсивно выводятся с мочой тирозин и продукт его расщепления – параоксифенилпировиноградная кислота. Клинически наблюдается поражение печени (опухоль). Алкаптонурия – редкая врожденная патология, вызванная недостатком фермента гомогензитиноксигеназы, катализирующей следующую реакцию: Гомогентизинат + О2 ↔ 4-малеилацетоацетат Наблюдается выделение гомогентизиновой кислоты с мочой, которая, окисляясь кислородом воздуха, превращается в алкаптохром, имеющий 96 темно-коричневую окраску. Обнаруживается в раннем детстве по пеленкам, окрашенным в темно-коричневый цвет. Гомогентизиновая кислота в тканях может переходить в алкаптохром, что приводит к окрашиванию кожи, хрящей, сухожилий в коричневый цвет. Клинических проявлений в детском возрасте нет, потом развивается охроноз за счет накопления в тканях продукта полимеризации гомогентизиновой кислоты – алкаптона. Фенилкетонурия. В основе заболевания – дефект фенилаланиноксидазы, что ведет к нарушению главного пути превращения фенилаланина в тирозин и ускорению второстепенного пути образования фенилпировиноградной, фенилмолочной и фенилуксусной кислот (рис.2.1). Избыток фенилпировиноградной кислоты тормозит транспорт тирозина через биомембраны и возникает его дефицит в клетках. Особенно опасным это становится для нервной ткани, так как на основе тирозина там осуществляется синтез катехоламинов и серотонина. Метаболические превращения фенилаланина в тканях человека Фенилаланин Фенилпируват Второстепенный путь Главный путь Тирозин Фениллактат 2,5-Оксифенилпируват Фенилацетат Параоксифенилацетат Параоксифенилпируват Гомогентизиновая кислота Малеилацетоацетат Фумарилацетоацетат Фумарат Ацетоацетат Рис.2.1. Метаболизм фенилаланина в клетках человека [10] Ранние симптомы болезни: повышенная возбудимость, гиперактивность, запах плесени от пота и мочи, экземоподобные сыпи. Для обнаружения парафенилпировиноградной кислоты в моче проводят реакцию Феллинга (с хлоридом железа). Положительная реакция до года выявляет97 ся эпизодически, после года жизни становится постоянной. В крови повышено содержание фенилаланина до 200 мг/л. Ограничение фенилаланина в диете позволяет избежать развития умственной недостаточности. Фенилпировиноградная олигофрения является разновидностью фенилкетонурии. Развивается из-за недостаточности дегидроптеридинредуктазы, катализирующей восстановление тетрагидробиоптерина. Ограничение содержания фенилаланина в диете не имеет успеха. Уточнению диагноза способствует обнаружение в моче только окисленных форм биоптерина. Характеризуется развитием умственной недостаточности. Альбинизм. Врожденная аномалия обмена тирозина, возникающая за счет недостаточности о-дифенилоксидазы, катализирующей первую стадию превращения 3,4-дигидрооксифенилаланина в меланин (рис.2.2). ТИРОЗИН Тирозиназа 3,4-дигидроксифенилаланин (ДОФА) Трийодтиронин (несколько стадий) Тетрайиодтиронин (тироксин) ЭУМЕЛАНИНЫ Норадреналин Адреналин Рис.2.2. Основные производные тирозина в клетках человека [10] Нарушается синтез меланина в клетках кожи, радужной оболочке глаз. Меланомы характеризуются нарушением обмена тирозина и фенилаланина, при котором значительная их часть используется для синтеза меланина клетками опухоли. Возникающий недостаток данных аминокислот ведет к нарушениям белкового обмена. В). Нарушения обмена глицина и гистидина Глицин подвергается в организме человека многообразным превращениям, но одной из важных реакций является образование метиленгидрофолата, необходимого как донор метильной группировки при синтезе азотистых оснований: Глицин + НАД++ тетрогидрофолат →СО2 + метилентетрагидрофолат + НАДН + Н+ 98 Дефицит фермента, катализирующего эту реакцию, полное его отсутствие в ткани мозга больных являются основой гиперглицинемии. Проявления характерны для периода новорожденности: отсутствие реакции на окружающее, отсутствие спонтанных движений, клонические судороги, икота и гипотрофия. У переживших период новорожденности – хронические судороги и задержка умственного развития. В моче обнаруживается большое количество глицина, превышающее нормальное в 10-20 раз. В крови уровень глицина в 3-4 раза выше нормы. Атомы α-углерода и азота глицина используются для синтеза порфиринового кольца гемоглобина. В сукцинат-глициновом цикле сукцинилКоА конденсируется с атомом α-углерода глицина, образуя α-амино-βкетоадипат, последний декарбоксилируется и превращается в δ-аминолевулинат – предшественник порфирина. Нарушения метаболизма гемовых структур будут рассмотрены ниже. Молекула глицина целиком используется для синтеза пуринов, поставляя атомы углерода в положения 4,5 и 7 пуринового остова. При конъюгировании глицина с холевой кислотой образуется гликохолевая кислота. С бензоатом глицин образует гиппурат. Количественная оценка способности печени превращать бензоат в гиппурат использовалась ранее в качестве теста на функцию печени. Глицин участвует также в синтезе креатина, так как саркозиновый компонент креатина (N-метилглицин) является продуктом реакции глицина с S-аденозилметионином. Гистидинемия обусловлена дефицитом гистидазы (гистидин-NH2-лиазы), катализирующей первую реакцию в цепи превращений гистидина в 5-форминотетрагидрофолевую кислоту. Эти превращения осуществляются наряду с декарбоксилированием гистидина в гистамин. Проявляется к концу первого года жизни в виде частых инфекционных заболеваний, задержки роста и развития, затем дефекта речи из-за нарушения слуховой памяти. Лабораторно выявляется по увеличению содержания гистидина в моче и крови до 20-270мг/л при норме 4-10 мг/л. Г. Нарушение обмена метионина и лизина Значение метионина определяется уникальной ролью инициатора синтеза белков, ролью донора метильных групп (в форме S-аденозилметионина), участием в образовании цистеина и полиаминов через гомоцистеин и цистатионин. Реакция образования цистатионина катализируется цистатионин-β-синтетазой. Дефект этого фермента, блокируя образование цистатионина, сопровождается усиленным превращением метионина в гомоцистин. Развивается гомоцистинурия. Гомоцистин в избытке тормозит образование нормальных поперечных сшивок в коллагене, блокируя активные группы лизина и оксилизина. Из патологических проявлений для больных характерен остеопороз, в половине случаев – умственная отсталость. Стойкая гиперлизинемия связана со значительным снижением активности лизин:α-кетоглутаратредуктазы, катализирующей две реакции в пре99 вращениях лизина – соединение лизина с кетоглутаровой кислотой (образование сахаропина) и редукцию сахаропина (появление аминоадипиновой кислоты). В типичных случаях наблюдаются глубокая задержка умственного развития, аутизм, низкорослость, глухота, судороги, разболтанность суставов. Главный лабораторный показатель – увеличение содержания лизина в крови и моче. Болезнь «кленового сиропа» обусловлена карбоксилазной недостаточностью. В моче резкое увеличение алифатических аминокислот и кетокислот. Моча приобретает специфический запах, напоминающий запах кленового сока. Развивается тяжелое заболевание с поражением ЦНС и дегенеративными нарушениями. Образование конечных продуктов азотистого обмена и его нарушения Аммиак как продукт окислительного дезаминирования аминокислот обезвреживается в гепатоцитах в цикле мочевины (большая часть) и выводится с мочой в виде аммонийных солей (незначительная часть) почечными канальцами, где ионы кальция, натрия, калия заменяются на ионы аммония. В виде аммонийных солей могут также выводиться некоторые органические кислоты. Количество аммиака в моче увеличивается при заболеваниях печени вследствие снижения скорости процессов мочевинообразования. У человека за сутки выводится 25-35 г мочевины. В норме содержание мочевины в плазме крови от 3 до 7 мМ/л. Снижение содержания мочевины характерно для циррозов, поскольку болезнь сопровождается поражением гепатоцитов. Генетически обусловленные формы нарушения синтеза мочевины связаны с недостаточностью ферментов цикла мочевины. Остановимся на некоторых видах подобных заболеваний. Недостаточность карбомилфосфатсинтетазы, катализирующей включение аммиака в орнитиновый цикл, проявляется в трех формах. Молниеносное течение: в период новорожденности после кормления у ребенка развивается кома, нейропения, судороги. Подострая форма характерна для первых месяцев жизни и сопровождается рвотой, трудностями вскармливания, гипотрофией, задержкой развития. Поздняя форма развивается на втором году жизни, появлению явных симптомов могут предшествовать задержка развития, судороги. Биохимические диагностические тесты: гипераммониемия до 1-3 г/л, низкая активность карбомоилфосфатсинтетазы в лейкоцитах. Недостаточность орнитинтранскарбамилазы, катализирующей конденсацию карбомоилфосфата с орнитином. Проявляется в период новорожденности и сопровождается летальным исходом у мальчиков в 100% случаев и у девочек в 33% случаев. Основной скринирующий тест – гипераммониемия после еды, а в период новорожденности постоянно. При микроскопировании мочи – кристаллы оротовой кислоты. Ее появление связано 100 с усилением использования карбомоилфосфата для синтеза пиримидиновых оснований, где промежуточным продуктом является оротат. Цитруллинемия вызвана дефектом аргининсукцинсинтетазы, катализирующей взаимодействие цитруллина и аспарагиновой кислоты с образованием аргининсукцината. Клинические проявления могут варьировать от смерти в новорожденный период до гиперцитруллинемии во взрослом состоянии. Наблюдается рвота, в основном после приема богатой белком пищи, иногда сопровождается увеличением печени. В моче обнаруживаются повышенное содержание нейтральных и кислых аминокислот, чрезмерное накопление цитруллина (в сотни и тысячи раз от нормальных значений). Аргининянтарная аминоацидурия обусловлена дефектом аргининсукциназы, расщепляющей аргининсукцинат на аргинин и фумаровую кислоту. При остром течении у новорожденных наблюдаются плохое сосание, повышенная сонливость, учащенное дыхание, судороги. Обычно младенцы редко доживают до трехмесячного возраста. Подострая форма, связанная с уменьшением активной концентрации фермента, регистрируется трудность вскармливания, задержка психомоторного развития, часто – тонкие крошащиеся волосы. Лабораторно характерно выделение аргининянтарной кислоты до 9 г/сутки. Активность аргининсукциназы снижена в эритроцитах, лейкоцитах, печени и почках. Недостаточность аргиназы – фермента, расщепляющего аргинин на мочевину и орнитин (завершающая реакция цикла мочевины). Чаще всего сильный дефект фермента приводит к гибели ребенка в период новорожденности. В крови, моче и спинномозговой жидкости значительно повышено содержание аргинина, в плазме – ионов аммония, снижена активность аргиназы в эритроцитах. Недостаточность орнитинаминотрансферазы, катализирующей синтез глутаматполуальдегида из орнитина с последующим образованием гуанидинацетата и креатина. Затрагивает процессы обмена креатина, характеризуется снижением остроты зрения из-за атрофии сетчатки, мышечной слабостью. Нарушения креатин-креатининового обмена. В организме поддерживается постоянный уровень креатина во всех тканях и в крови. Превращение креатина в креатинин – реакция необратимая и креатинин, образовавшийся из креатина в мышцах, удаляется с мочой. Процессы распада белков и аминокислот сопровождаются усилением превращения креатина в креатинин. Соотношение показателей мочевина-креатинин в плазме крови используется в оценке почечных нарушений. Однако концентрация креатинина в сыворотке – малочувствительный тест почечной функции, так как уровень креатина не повышается, пока скорость гломерулярной фильтрации не снизится на 50% от нормы. Увеличение уровня креатина в плазме регистрируется при любой патологии, сопровождающейся усиле101 нием распада белков: сильные ожоги, гангрена, туберкулез, злокачественные опухоли. Белковые фракции крови при некоторых заболеваниях Наибольшее значение имеет белковый коэффициент крови: отношение альбуминов к глобулинам. У здоровых людей белковый коэффициент составляет 1,2-2,2. Патологическим является только снижение коэффициента, которое наблюдается при острых гепатитах, нефрозах, сильных воспалительных процессах, туберкулезах. Различные заболевания характеризуются однообразным ответом: снижением фракции альбумина и увеличением глобулинов. Процентное содержание основных фракций белков в плазме крови изменяется с возрастом: у новорожденных больше фракция γ-глобулинов, к трем годам наблюдается приближение к обычным значениям у взрослых людей, кроме β-глобулинов, содержание которых у детей меньше. С возрастом фракция альбуминов уменьшается, а глобулинов увеличивается, то есть белковый коэффициент постепенно снижается. Острые инфекционные заболевания характеризуются нормопротеинемией, незначительной гипоальбуминемией, повышением содержания α1и α2-глобулинов, γ – норма или небольшое увеличение. Хронические воспалительные процессы – повышение содержания γ-глобулинов при норме или увеличении α1- и α2-глобулинов. Уровень α-глобулинов, особенно α2-глобулинов, служит признаком активности инфекционного процесса. Нарушения в содержании глобулинов при острых и хронических нефритах сходны с нарушениями, наблюдаемыми при других острых и хронических воспалительных процессах. Нефрозы характеризуются значительной гипопротеинемией в результате потери белков с мочой. Значительное увеличение α2-глобулинов при снижении содержания альбуминов – дифференциально-диагностический признак нефрозов. Гепатиты сопровождаются гипопротеинемией, гипофибриногенемией, гипоальбуминемией, повышением содержания β- и γ-глобулинов. Ишемическая болезнь сердца, артериальная гипертония, атеросклероз – наблюдается увеличение β-глобулинов, транспортирующих липиды. При инфаркте миокарда наблюдается длительное повышение содержания α2-глобулинов, в то же время увеличение α1 и β-глобулинов – кратковременно. Особый вид патологий белков плазмы – дефектопротеинемии. Афибриногенемия – врожденное заболевание, связанное с дефектом синтеза фибриногена, по клиническому течению близко к гемофилии. Агаммаглобулинемия и гипогаммаглобулинемия – врожденные аномалии, характеризующиеся отсутствием или снижением количества антител 102 в плазме. Пациенты страдают уменьшением сопротивляемости организма к инфекциям и хроническими воспалительными процессами. Выделение белков с мочой (протеинурия) в норме отсутствует. Протеинурии наблюдаются прежде всего при функциональных расстройствах почек: пиелонефритах, гломерулонефритах, нефросклерозах. Лихорадки и токсикозы различной этиологии сопровождаются протеинурией из-за функционального напряжения почек. Неспецифическая агрегация белков. «Конформационные болезни» Неправильный фолдинг и агрегация белков с образованием нерастворимых внутриклеточных комплексов и телец включения лежат в основе патогенеза значительной части дегенеративных и нейродегенеративных заболеваний у человека. Такие заболевания, как болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, болезнь Хантингтона, болезнь Мачадо-Джозефа (спинально-мозжечковая атаксия), прионные энцефалопатии, боковой амиотрофический склероз – болезнь Шарко, системный амилоидоз, фибрознокистозная дегенерация, представляют собой лишь часть заболеваний, известных в настоящее время как «конформационные болезни» [9,12]. Агрегация белков происходит при «ошибочных» взаимодействиях полностью или частично развернутых белковых молекул, приводящих к образованию агломератов произвольной формы. В основе агрегации лежат контакты гидрофобных поверхностей частично развернутых белков, что сопровождается ростом структурированных или аморфных агрегатов, характеризующихся низкой растворимостью в воде или детергентах и ненативной вторичной структурой. Белки в агрегированном состоянии функционально неактивны и во многих случаях обогащены антипараллельными β-цепями. Агрегация белков in vivo осуществляется как во внутриклеточных компартментах, так и во внеклеточном пространстве, если образование неправильно свернутых белков превышает способность клетки их деградировать. В клетках агрегация белков может быть следствием неправильного фолдинга, обусловленного ошибочным включением аминокислот в полипептиды в связи с мутациями или ошибками в трансляции, процессинге мРНК и трансляции. Помимо этого неблагоприятные факторы окружающей среды, такие как тепловой, окислительный и осмотический стрессы, а также продукты вирусных генов, способны оказывать влияние на фолдинг и ускорять агрегацию белков [9,12]. Согласно данным современных исследований, шаперонзависимая дезагрегация белковых агрегатов в клетках служит главным средством для восстановления нативных белков из токсичных агрегатов, таких, как обогащенные полиглутамином белки, амилоидные бляшки и прионы. Уменьшение экспрессии шаперонов типа Нsp в случае апоптоза или при старении организма может вызывать каскад внутриклеточных изменений, приводящих к агрегации белков. 103 Изучение процессов синтеза белков на рибосомах и фолдинга показало, что до 30% вновь синтезированных внутриклеточных белков дефектны и вскоре после синтеза расщепляются. Деградация основной части белков в клетках млекопитающих осуществляется убиквитин-протеазной системой, в частности 26S-протеасомами, обычно после связывания белков с полиубиквитиновой системой. Протеасомы распространены по всей цитоплазме и обнаруживаются также в ядре клеток эукариот. Цитоплазматические протеасомы связаны с центросомами, сетью цитоскелета и внешней мембраной ЭПС [9]. Отложение неправильно свернутых белков с образованием телец включения в нейронах является общим свойством многих нейродегенеративных заболеваний, что позволяет предположить существование общих для этих заболеваний механизмов, связанных с неспособностью нейронов эффективно удалять неправильно свернутые белки. Агрегация полипептидных цепей, подвергнутых неправильному фолдингу, приводит к образованию нерастворимых ядерных и цитоплазматических телец включения, токсичных для клеток. При аутопсии головного мозга людей, страдающих болезнью Альцгеймера, выявляются два типа отложений: внеклеточные отложения – амилоидные нейритные бляшки, представляющие собой отложения β-амилоидного пептида (βА), и внутриклеточные скопления нейрофибриллярных сплетений, представляющие собой пучки парных спиральных филаментов гиперфосфорилированного белка тау, связанного с микротрубочками нейронов. βА является продуктом деградации трансмембранного амилоидного белка-предшественника (АРР), процессинг которого происходит под действием α-, β-, γ-секретаз. В результате процессинга АРР в нормальных, физиологических условиях образуется растворимая форма βА, которая не образует агрегатов. При наследственной форме болезни Альцгеймера, связанной с мутацией гена, кодирующего АРР, образуется гидрофобный βА, который агрегирует, становясь зародышем образования амилоидных фибрилл, являющихся матрицей для формирования бляшек. Болезнь Паркинсона характеризуется образованием цитоплазматических белковых телец включения, известных как тельца Леви, и гибелью дофаминергических нейронов среднего мозга. Развитие болезни Паркинсона определяется отложением белков α-синуклеина и паркина, которые обнаруживаются в тельцах Леви. Полагают, что образование отложений α-синуклеина и паркина обусловлено мутацией этих белков и нарушением их деградации в убиквитин-протеасомной системе [9]. Нейрогенеративные полиглутаминовые болезни, характеризующиеся расстройством координации движений, такие как болезни Хангтингтона и Мачадо-Джозефа, вызываются одним и тем же типом мутаций. В результате генетического сбоя клетки начинают синтезировать аномальные белки с длинным хвостом, состоящим из повторяющихся остатков глутамина. 104 Нормальная форма белка содержит не более 20 повторений остатков глутамина, а мутантная – 40 остатков и обладает повышенной способностью к агрегации. Образование мутантных форм внутриклеточного прионного белка PrP лежит в основе патогенеза прионных болезней – инфекционных, спорадических или наследственных нейрогенеративных заболеваний млекопитающих [10,12]. У человека наиболее известны болезнь Крейцфельда-Якоба и синдром Гертсмана-Штраусслера-Шейнкера, а у овец – скрейпи (почесуха) и у крупного рогатого скота – губчатая энцефалопатия (коровье бешенство). Нативная форма PrP белка представляет собой мембраносвязанный гликопротеин, характеризующийся высоким содержанием α-спиралей и низким содержанием β-структур. Он растворим в детергентах, чувствителен к действию протеолитических ферментов и не склонен к агрегации. В настоящее время известно несколько мутантных форм прионных белков, вызывающих болезнь Крейцфельда-Якоба (Prp V2031, E211Q), и один, характерный для синдрома Гертсмана-Штраусслера-Шейнкера (PrpQ212P). Наиболее же изученной является инфекцирующая форма прионного белка PrPSc – причина инфекционной губчатой энцефалопатии. PrPSc образуется вследствие неправильного фолдинга, в основном имеет складчатую β-структуру, нерастворим в детергентах и устойчив к действию протеолитических ферментов. Прионные белки склонны к агрегации и формируют амилоидоподобные фибриллы, нарушающие функции клеток. Образование высокомолекулярных нерастворимых комплексов агрегированной супероксиддисмутазы (СОД) является причиной развития наследственного заболевания – бокового амиотрофического склероза, сопровождающегося дегенерацией двигательных нейронов в коре и стволе головного мозга, а также в спинном мозге. В исследованиях in vitro и in vivo показано, что мутантные формы СОД подвергаются неправильному фолдингу и приобретают повышенную способность к агрегации, что приводит к образованию телец включения и патологическим изменениям двигательных нейронов [9,12]. Причинно-следственная связь между агрегацией белков и нейродегенерацией в настоящее время в деталях еще не выяснена. Общепринято, что при многих наследственных нейродегенеративных заболеваниях агрегация белков занимает центральное место в причинах гибели клеток, однако не выяснено являются ли белковые агрегаты причиной или следствием нейротоксичности. Обнаружено, что сформированные в клетках агресомы могут связываться с лизосомами и расщепляться с повышенной скоростью. На основании этого предполагается защитная роль образования клетками телец включения для ускорения деградации токсичных белков. Патологии, возникающие при наличии в клетках большого количества агрегированных белков, могут быть следствием повреждения системы их быстрой утилиза105 ции, отсутствия функционально активных форм данных белков и повышенной токсичности мутантных форм. Нарушения обмена некоторых белков Из встречающихся нарушений отдельных белков наибольший интерес представляют изменения в метаболизме гемоглобина, муцинов и мукоидов, коллагенов. Обмен гемоглобина. Гемоглобин человека является далеко не однородным белком. В крови здоровых людей содержится 98% гемоглобина А (НbА) и 0,2-1% гемоглобина F (HbF)(фетальный). У эмбрионов 80% гемоглобина приходится на HbF, у новорожденных – 20%. Известно около 30 типов патологических форм гемоглобина, обозначаемых подряд буквами латинского алфавита, начиная с С. Определение типов гемоглобина имеет значение для диагностики формы анемии: (1) Талассемия – количество НbF от 50 до 90% (тяжелая форма). Фетальный гемоглобин обладает высоким сродством к кислороду, что приводит к нарушению его отдачи в тканях. (2) Врожденная гемолитическая анемия. Обнаруживается гемоглобин D, C. Эритроциты характеризуются более жесткой мембраной, преобладают сфероциты, которые улавливаются селезенкой и разрушаются. (3) Серповидноклеточная анемия. Характерен HbS, имеющий 3 сульфгидрильные группы, отличающийся большей гидрофобностью. Комбинация HbA + HbM описана при наследственной метгемоглобинемии. Подробнее анемии, связанные с патологией гемоглобина, рассмотрены в первой главе (раздел 1.2.). Снижение содержания гемоглобина обозначается как анемия, повышение обычно сопровождается увеличением количества эритроцитов – эритремии. Содержание гемоглобина в плазме в норме не должно превышать 10 мг%, увеличение свидетельствует о внутрисосудистом гемолизе. Появление гемоглобина в моче – гематурия – сопровождает травматические повреждения мочевыводящих путей, полипы мочевого пузыря. Первичные гематурии делят на спортивные (перегрузки), холодовые (сильно переохлаждение), гемолитические (внутрисосудистый гемолиз). Вторичные гематурии наблюдаются при токсикозах, особенно при отравлениях сульфаниламидами; переливании несовместимой крови, сильных инфекциях (сепсис, тиф, тяжелая ангина, скарлатина и т.п.). Синтез порфиринов и его нарушения. Порфирины – это циклические соединения, образованные четырьмя пиррольными кольцами, связанные между собой метенильными мостиками. Характерным свойством порфиринов является их способность образовывать комплексы с ионами металлов, связывающимися с атомами азота пиррольных колец. Гемы представляют собой железопорфирины. Порфирии – редкие заболевания, обусловленные нарушением биосинтеза порфиринов. Заболевания часто 106 сопровождаются желтухой, вызванной либо чрезмерным образованием билирубина, либо нарушением его экскреции. А желтухи характерны для многих болезней от вирусного гепатита до холестаза. Исходным субстратом для синтеза порфиринов служит сукцинил-КоА и глицин. Необходима активация глицина пиридоксальфосфатом, который образует с ним шиффово основание; затем α-углерод глицина присоединяется к карбонильному углероду сукцината. Продуктом конденсации является αамино-β-кетоадипиновая кислота, которая быстро декарбоксилируется с образованием δ-аминолевулеата (АЛК). Реакция катализируется АЛКсинтетазой. Синтез АЛК осуществляется в митохондриях и лимитирует скорость образования гемовых структур в гепатоцитах млекопитающих. В цитозоле другой фермент – АЛК-дегидратаза катализирует конденсацию двух молекул АЛК с образованием двух молекул воды и одной молекулы порфобилиногена. Фермент является Zn-содержащим и ингибируется ионами свинца. Образование порфирина идет путем конденсации четырех монопирролов, образующихся из порфобилиногена. Встречающиеся в природе порфирины являются соединениями, у которых 8 атомов водорода порфиринового ядра замещены различными боковыми группами. Из них основополагающими служат уропорфирины (I тип) и копропорфирины (III тип). Порфириями называют гетерогенную группу заболеваний, характеризующихся повышенным выделением порфиринов или их предшественников. Некоторые формы порфирий являются наследственными, другие – приобретенными. Наследственные формы делят на эритропоэтические, печеночные и смешанные. Для большинства наследуемых форм характерно наличие метаболических нарушений во всех тканях, однако проявляются они по каким-то причинам в каком-то одном типе тканей. Перемежающаяся острая порфирия (ПОП) – аутосомно-доминатная наследственная болезнь человека, которая обычно проявляется только при достижении половой зрелости. Ее причиной является частичная недостаточность уропорфириноген-1-синтетазы. Гетерозиготные больные имеют 50% от нормы активности фермента, с мочой экскретируют большие количества порфобилиногена и АЛК. Оба соединения бесцветны, но порфобилиноген на свету и воздухе образует два окрашенных в темный цвет продукта – порфобилин и порфирин. Болезнь сопровождается острыми болями в животе, рвотой, запором, сердечно-сосудистыми нарушениями, нервно-психическими расстройствами. На основании механизма регуляции синтеза АЛК-синтазы системой репрессии-дерепрессии, введение больным гематина может уменьшить индукцию АЛК-синтазы и облегчить протекание заболевания. 107 Врожденная эритропоэтическая порфирия – редкое врожденное заболевание, наследуется по аутосомно-рецессивному типу. Молекулярная природа болезни точно не выяснена. Установлено, что для заболевания характерен определенный дисбаланс относительных активностей уропорфириноген-III-косинтазы и уропорфириноген-I-синтазы. Образование уропорфириногена I в количественном отношении значительно превышает синтез уропорфириногена III, необходимого изомера на пути синтеза гема. Проявляется прежде всего в гемапоэтической ткани костного мозга. Пациенты экскретируют большие количества изомеров I типа уропорфириногена и копропорфириногена, которые в моче превращаются в уропорфирин I и копропорфирин I – красные флуоресцирующие пигменты. Вероятно, вследствие образования меньших количеств истинного предшественника гема, уропорфириногена III, и возникающего относительного дефицита гема в эритропоэтических тканях происходит индукция АЛК-синтазы. Она приводит к перепроизводству порфириногенов типа I и повышению образования и экскреции порфобилиногена и АЛК. Развиваются симптомы, похожие на ПОП, но, кроме этого, отмечаются светочувствительность кожи, трещины на коже, гемолитические явления. Наследственная копропорфирия – аутосомно-доминатное нарушение, обусловленное дефицитом копропорфириногеноксидазы. Это митохондриальный фермент, осуществляющий превращение копропорфириногена III в протопорфириноген (рис.2.3). Копропорфириноген III в больших количествах удаляется из организма в составе фекалий и с мочой. Как и уропорфириноген, копропорфириноген на свету и воздухе быстро окисляется, превращаясь в красный пигмент копропорфирин. Ограниченная способность к синтезу гема приводит к избыточному образованию АЛК и порфобилиногена и появлению у пациентов всех симптомов, связанных с избытком АЛК. При этом заболевании введение гематина также может вызвать по крайней мере частичную репрессию АЛК-синтазы и смягчение симптомов, обусловленных перепроизводством интермедиатов биосинтеза гема. 108 Гемопротеииы 2+ Fe Гем + Апобелки Феррохелатаза Протопорфирин Протопорфириноген Копропорфириноген Копропорфирин Уропорфириноген Уропорфирин Порфобилиноген АЛК-синтаза АЛК Сукцинил-КоА + Глицин Рис. 2.3. Последовательные стадии синтеза гемсодержащих белков [10] Мозаичная порфирия – аутосомно-доминантное нарушение, при котором происходит частичное блокирование ферментативного превращения протопорфириногена в гем. В норме это превращение осуществляется ферментами протопорфириногеноксигеназой и феррохелатазой. Оба фермента имеют локализацию в митохондриях. У пациентов с мозаичной порфирией наблюдается относительная недостаточность содержания гема в стрессовых условиях, а также дерепрессированное состояние печеночной АЛК-синтазы. Больные экскретируют с мочой избыточное количество АЛК, порфобилиногена, уропорфирина и копропорфирина, а с фекалиями выделяют уропорфирин, копропорфирин и протопорфирин. Моча больных пигментирована и флуоресцирует, а кожа чувствительна к свету так же, как и у нижеприведенной группы нарушений. Поздняя кожная порфирия. Является, возможно, наиболее распространенной формой порфирий. Обычно она связана с повреждением пече109 ни алкоголем или токсинами (ионы тяжелых металлов). Вероятной причиной может быть частичная недостаточность уропорфириногендекарбоксилазы. Нарушения, вероятно, передаются аутосомно-доминантным путем, но пенетрантность зависит от функционального состояния печени. Моча больных содержит повышенные количества уропорфиринов типа I и III; в то же время экскреция с мочой АЛК и порфобилиногена наблюдается редко. Главным клиническим проявлением поздней кожной порфирии служит повышенная светочувствительность кожи. Протопорфирия или эритропоэтическая порфирия обусловлена доминатно наследуемой недостаточной активностью феррохелатазы в митохондриях всех тканей. Клинически болезнь проявляется как острая крапивница, вызываемая воздействием солнечных лучей. Эритроциты, плазма и фекалии больных содержат повышенные количества протопорфирина IX, а ретикулоциты и кожа часто флуоресцируют красным светом. Приобретенная (токсическая) порфирия может быть вызвана действием токсических соединений, таких как гексахлорбензол, соли свинца и других тяжелых металлов, а также лекарственными препаратами. Тяжелые металлы являются ингибиторами ряда ферментов в системе синтеза гема, включая АЛК-дегидратазу, уропорфириногенсинтетазу и феррохелатазу. Распад гема и его нарушения. Разрушение эритроцитов и распад гемоглобина осуществляются в печени, селезенке и тканях костного мозга. Гемоглобин транспортируется в данные клетки при участии гаптоглобина. При поступлении в клетки от белка сначала отщепляется гем, который через ряд промежуточных стадий превращается в желчные пигменты – билирубин и биливердин. При условиях физиологической нормы в организме человека разрушается 1-2·108 эритроцитарных клеток в час. Белковая часть гемоглобина может быть либо снова использована, либо подвергнута расщеплению до аминокислот; железо гема включается в общий пул и также снова используется. Свободная от железа порфириновая часть гема обязательно деградирует. Это происходит в микросомальной фракции ретикулоэндотелиальных клеток печени, селезенки и костного мозга с помощью сложной ферментативной системы – гемоксигеназной. Сначала гем превращается в гемин за счет окисления железа в ферриформу; затем гемин связывается с альбумином с образованием метгемальбумина. Гемоксигеназная система является индуцибельной и локализуется вблизи микросомальной системы транспорта электронов. Гемин сначала восстанавливается в ферроформу с помощью НАДФН и гидратируется по α-метенильному мостику между пирррольными кольцами I и II с использованием еще одной молекулы НАДФН, а железо снова окисляется в Fe3+. При последующем присоединении кислорода происходят освобождение феррииона, выделение молекулы окиси углерода и образование в результате раскрытия тетрапиррольного 110 кольца эквимолярного количества биливердина IX-α. В этой реакции гем участвует в качестве катализатора. У птиц и земноводных зеленый пигмент биливердин IX-α экскретируется из организма; у млекопитающих фермент НАДФНбиливердинредуктаза катализирует восстановление метенильного мостика между пиррольными кольцами III и IV в метиленовую группу, в результате образуется желтый пигмент билирубин IX-α. Суточное образование билирубина у взрослого человека составляет около 250-350 мг. Дальнейшее превращение билирубина происходит в основном в печени и включает три процесса: поглощение билирубина паренхимальными клетками печени; конъюгацию билирубина в гладком ЭР и секрецию билирубина из эндоплазматического ретикулума в желчь. Билирубин слабо растворим в плазме и специфически связывается альбумином. Каждая молекула альбумина имеет два центра связывания билирубина – высоко- и низкоаффинный. Поэтому часть билирубина (около 25 мг на 100 мл плазмы) связывается прочно, а часть легко диссоциирует с молекулы белка. В печени происходит переход билирубина от альбумина на синусоидальную поверхность гепатоцитов при участии насыщаемой системы переноса, в функционировании которой участвует специфический переносчик. Эта система облегченного транспорта имеет очень большую емкость и даже при патологических условиях не лимитирует скорость метаболизма билирубина. Потребление билирубина зависит от его потребления в последующих метаболических процессах. В гепатоцитах к билирубину присоединяются полярные группировки, повышающие его растворимость в воде. Процесс получил название конъюгации, он осуществляется специальной системой ферментов ЭПС. У млекопитающих билирубин секретируется в кровь преимущественно в форме билирубиндиглюкуронида. При нарушении метаболизма билирубина его конъюгаты находятся в форме билирубинмоноглюкуронидов. Секреция конъюгированного билирубина в желчь идет против весьма высокого градиента концентрации и осуществляется с помощью механизма активного транспорта, который, вероятно, является скорость-лимитирующей стадией всего процесса метаболизма билирубина в печени. В условиях физиологической нормы практически весь секретируемый в желчь билирубин (97%) находится в коньюгированной форме. В толстом кишечнике билирубин подвергается воздействию специфических бактериальных ферментов и восстанавливается в группу бесцветных тетрапиррольных соединений, называемых уробилиногенами. Небольшая часть уробилиногенов всасывается из толстого кишечника в кровь и снова попадает в печень, совершая внутрипеченочный уробилиногеновый цикл. При патологических состояниях, например при накоплении избыточного количества желчных пигментов или при заболеваниях печени, нарушающих работу внутрипеченочного цикла, уробилиноген может выделяться с мочой. 111 В норме большая часть бесцветных уробилинногенов, образующихся в толстой кишке под действием кишечной микрофлоры, окисляется в уробилины (окрашенные соединения) и удаляется с фекалиями. Диагностическую значимость имеет определение общего билирубина, конъюгированного(прямого) и свободного (непрямого) билирубина в плазме крови. В норме количество общего билирубина составляет 8,5-20,5 мкМ/л; – свободного 6,4-17,1 мкМ/л; конъюгированного – 0,9-4,3 мкМ/л. Гипербилирубинемия может быть следствием образования билирубина в бόльшем количестве, чем то, которое нормальная печень может экскретировать или же быть следствием повреждений печени, нарушающих экскрецию билирубина. Помимо повреждений самой печени к развитию гипербилирубинемии приводит закупорка желчевыводящих протоков печени, препятствующая выделению билирубина. Накопление билирубина в крови по достижении им определенной концентрации приводит к диффундированию его в ткани и развитию желтухи. В зависимости от того, какой тип билирубина превышает норму, в плазме различают постгепатитную гипербилирубинемию (повышен неконъюгированный билирубин) и регургитационную гипербилирубинемию (повышен конъюгированный билирубин). В центральную нервную систему через гематоэнцефальный барьер может проникать неконъюгированный билирубин, поэтому энцефалопатия, связанная с токсическим действием билирубина, характерна только для постгепатитной гипербилирубинемии. Неконъюгированная гипербилирубинемия. Наиболее распространенной формой данного вида гипербилирубинемии является так называемая физиологическая желтуха, наблюдаемая как временное явление у новорожденных. Причиной этой гипербилирубинемии служат ускоренный гемолиз и незрелое состояние печеночной системы поглощения, конъюгации и секреции билирубина. При этом не только понижается активность УДФглюкуронилтрансферазы, но и, вероятно, сказывается недостаточность синтеза субстрата этого фермента – УДФ-глюкуроновой кислоты. Поскольку накапливающийся билирубин находится в неконъюгированной форме, то существует угроза развития у новорожденных с физиологической желтухой энцефалопатии. К данному типу гипербилирубинемии относится синдром Криглера-Найяра I и II типа. Синдром Криглера-Найяра I типа представляет собой метаболическое нарушение конъюгации билирубина. Причиной заболевания считается отсутствие активности билирубинУДФ-глюкуронилтрансферазы в гепатоцитах. Болезнь обычно приводит к летальному исходу в первые 15 месяцев жизни. Синдром Криглера-Найяра II типа – редкое наследуемое заболевание, характеризующееся менее серьезными дефектами в системе конъюгирования билирубина и более доброкачественным течением. Весь накапливающийся билирубин относится к неконъюгированному типу, хотя кровь больных содержит билирубинглюкуронид. Отсюда возникло предположение, что генетическое нарушение 112 может затрагивать печеночную УДФ-глюкуронилтрансферазу, которая катализирует присоединение второй глюкуронильной группировки к билирубинмоноглюкурониду. Было показано, что больные с этим синдромом поддаются лечению большими дозами фенобарбитала. Снижение гипербилирубинемии вызвано, вероятно, индукцией системы метаболизма билирубина, а не только стимуляцией конъюгирования билирубина. К этому виду гипербилирубинемии относится также болезнь Гильберта. Заболевание представляет собой гетерогенную группу нарушений, многие из которых являются следствием компенсированного гемолиза, сопряженного с неконъюгированной гипербилирубинемией. А также имеются повреждения паренхимы печени, приводящие к снижению поглощения билирубина этими клетками. У больных выявляется уменьшение активности билирубинУДФ-глюкуронилтрансферазы. Неконъюгированная гипербилирубинемия может быть следствием дисфункции печени, наступающей после токсического действия хлороформа, четыреххлористого углерода и других токсинов или как результат вирусного гепатита, цирроза. Большинство этих приобретенных нарушений наступает из-за повреждения паренхимы печени и обозначается как токсическая гипербилирубинемия. Конъюгированная гипербилирубинемия. Поскольку конъюгированный билирубин растворим в воде, то он обнаруживается в моче большинства больных конъюгированной гипербилирубинемией, поэтому ее называют холеурической желтухой. К конъюгированной гипербилирубинемии относится хроническая идиопатическая желтуха (синдром Дубина-Джонсона), которая представляет собой аутосомно-рецессивное нарушение печеночной секреции конъюгированного билирубина в кровь. Нарушение секреции конъюгированных веществ не ограничивается билирубином, оно касается также и других конъюгированных соединений: эстрогенов, пигментов, индикаторов. Конъюгированная гипербилирубинемия возникает также при холестазе – закупорке желчных протоков. В этом случае желчный пигмент, поступающий из крови в гепатоциты, не может экскретироваться и вновь поступает в печеночные вены и лимфатические сосуды. Некоторые особенности обмена гликопротеидов и его нарушения. Муцины и мукоиды содержатся в соединительной ткани и слюне. Небольшие количества мукоидов обнаруживаются в сыворотке крови и моче. При электрофорезе гликопротеиды движутся с фракцией α1- и α2-глобулинов. Увеличение содержания этих фракций характерно для тяжелых воспалительных процессов: туберкулеза, пневмонии, плеврита, ревматизма, аппендицита и др. При ревматизме определение гликопротеидов имеет прогностическое значение – служит для оценки тяжести процесса (повышение может составить 50-60%). 113 По природе связей между полипептидными и олигосахаридными цепями гликопротеиды можно разделить на 4 класса: 1) содержащие связь Сер (или Тре)—N-ацетилгалактозамин; 2) содержащие связь Сер— ксилоза; 3) коллагены, содержащие связь гидроксилизин—галактоза; 4) содержащие связь Асн—N-ацетилглюкозамин. Наиболее характерными нарушениями обмена гликопротеидов являются изменения соединительной ткани при патологических процессах: амилоидозы и коллагенозы. Амилоидозы объединяют разные патологические процессы, ведущие к образованию в тканях амилоида. Основной компонент амилоида – фибриллярные белки типа коллагена и плазменные гликопротеиды: α- и β-глобулины, фибриноген. Среди полисахаридов, присутствующих в амилоиде, преобладают хондроитинсульфаты. Амилоид имеет фибриллярную структуру, каждая фибрилла состоит из двух субфибрилл, расположенных параллельно друг другу. Клиническая картина зависит от локализации амилоида и интенсивности амилоидных отложений. Особенно четкие проявления свойственны поражениям почек, сердца, нервной системы и кишечника. Лабораторно регистрируется протеинурия (преимущественно альбуминурия) с потерей от 2 до 20 г белка в сутки. В крови диспротеинемия: снижение альбуминов при повышении уровня α 2- и γ-глобулинов, рост глико- и липопротеинов. Часть коллагенозов преимущественно связана с нарушениями иммуногенеза. Морфологически эти состояния проявляются генерализованной альтерацией внеклеточных компонентов соединительной ткани, в основном – коллагеновых волокон и самого коллагена. Отдельные заболевания из группы коллагенозов, такие как: системная красная волчанка, ревматизм, системная склеродермия, ревматоидный артрит, отличаются по клинической картине и этиологии. Однако общность патогенетических механизмов обусловливает тем не менее однородность биохимических проявлений коллагенозов. К ним относятся прежде всего биохимические признаки воспаления, рассмотренные нами в первой главе: рост уровня α 2- и γ-глобулинов, серомукоидов, появление С-реактивного белка, повышение содержания α1-антитрипсина и α1-гликопротеида, увеличение СОЭ и фибриногена и другие. Другая разновидность коллагенозов обусловлена аномалиями самого коллагена и его сборки. В тканях млекопитающих присутствует не менее пяти различных типов коллагенов. Наиболее характерная особенность коллагеновых белков – это их трехспиральная структурная организация. Каждая субъединица представляет собой левозакрученную спираль с шагом три аминокислотных остатка. Три такие левозакрученные спирали организуются в правозакрученную суперспираль. В результате формируется жесткая палочковидная молекула с диаметром 1,4 нм и длиной около 300 нм. Еще одной характерной особенностью молекул коллагенов является то, что каждый третий аминокислотный остаток тройной спирали 114 представляет собой глицин. Размеры глициновых остатков позволяют им разместиться под центральным ядром тройной спиральной молекулы. Таким образом, центральное ядро этой молекулы состоит из глициновых остатков всех трех субъединиц. Эту повторяющуюся структуру можно представить как (Гли-Х-Y)n, где X,Y – любые аминокислотные остатки. У коллагена млекопитающих около 100 Х-положений заняты пролином, около 100 Y-положений – 4-гидрооксипролином. Остатки гидрооксипролина придают структуре дополнительную стабильность за счет образования большого количества внутримолекулярных водородных связей (для этого используются окружающие молекулы воды). В некоторых Х-положениях коллагена содержится также 3-гидроксипролин, а в Y-положениях – 5-гидроксилизин. Тройная спираль коллагена стабилизируется многочисленными межцепочечными поперечными сшивками между лизиловыми и гидроксилизиловыми остатками. Зрелый коллаген представляет собой гликопротеин, содержащий сахариды, связанные с белковой цепью по остаткам гидроксилизина О-гликозидной связью. Молекулы коллагена ассоциируются в фибриллы. Коллагеновые фибриллы образуют продольные зигзагообразные структуры длиной чуть меньше ¼ длины тройной спирали. Между концом одной тройной спирали и началом следующей имеется пространство, которое может служить местом отложения кристаллов гидроксиапатита при формировании костной ткани. Синтез коллагена осуществляется в виде предшественника, который подвергается значительной посттрансляционной модификации. Наиболее ранним предшественником коллагена является препроколлаген, который содержит на N-конце лидерную (сигнальную) последовательность из 100 аминокислотных остатков. Препроколлаген образуется на рибосомах, прикрепленных к ЭПС. При поступлении в каналы ЭПС сигнальная последовательность отщепляется, пролиновые и лизиновые остатки подвергаются гидроксилированию по мере продвижения по ЭПС с помощью ферментов: пролил-4-гидроксилазы, пролил-3-гидроксилазы и лизилгидроксилазы. Фермент гликозилтрансфераза переносит глюкозу или галактозу на ряд остатков гидроксилизина. Молекула проколлагена содержит на концах пептиды, которые отсутствуют в зрелом коллагене. Оба пептида содержат остатки цистеина; N-концевой пептид образует за счет этих остатков только внутрицепочечные дисульфидные связи, С-концевой – и внутри- и межцепочечные. После образования этих связей идет формирование тройной спирали, что делает невозможным дальнейшее гидроксилирование пролиловых и лизиловых остатков, а также гликозилирование гидроксилизиловых остатков. После завершения этого процесса молекулы выводятся из клеток через аппарат Гольджи. Внеклеточные аминопротеаза и карбоксипротеаза отщепляют концевые пептиды, и цепи коллагена спонтанно собираются в фибриллы. Однако коллагеновые волокна приобретают зрелость только тогда, когда произойдет перекрестное связывание их ковалентными 115 связями. Процесс происходит с помощью фермента лизилоксидазы (медьсодержащей), осуществляющей окислительное дезаминирование ε-аминогрупп некоторых лизиловых и гидроксилизиловых остатков с образованием реактивных альдегидов. Перекрестное связывание цепей и спиральных молекул идет через Шиффовы основания и альдольную конденсацию и ε-аминогруппами других лизиловых, гидроксилизиловых и гликозилированных остатков. Клетки, секретирующие коллаген, образуют также фибронектин, который связывается с агрегирующимися коллагеновыми волокнами, а также с протеогликанами: гепаратсульфатами и дерматансульфатами, формируя экстрацеллюлярный матрикс соединительной ткани. Наследственные заболевания, связанные с нарушением синтеза и созревания коллагеновых волокон, включают несовершенный остеогенез, синдром Марфана, синдром Элерса-Данлоса, синдром Менке. Несовершенный остеогенез обусловлен генетической поломкой синтеза препроколлагена на рибосомах (нефункционирующие или неэффективно функционирующие аллели про-α-цепей коллагена I типа). Синдром Марфана – удлинение про-α-цепей коллагена II типа, нарушение формирования поперечных сшивок. Синдром Элерса-Данлоса – мутации, обусловливающие изменения про-α-цепей коллагена III типа, резкое уменьшение коллагена III типа; дефицит лизилгидроксилазы – нарушение образования поперечных связей; нарушение метаболизма меди – нарушение образования поперечных связей. Синдром Менке – нарушение метаболизма меди (дефицит лизиноксидазы и нарушение образования поперечных сшивок). 2.3. Нарушения обмена липидов и липоидов [3,8,10,11,13,14] Несмотря на значительную энергетическую ценность липидов, это не является их основной функцией в организмах. Компоненты пищевых липидов служат для синтеза фосфолипидов мембран клеток, облегчают поступление жирорастворимых витаминов, содержат незаменимые жирные кислоты: линолевую, линоленовую, арахидоновую. У людей арахидоновая кислота образуется из линолевой и не является эссенциальной (незаменимой), если линолевая присутствует в пище в достаточном количестве. На основе арахидоновой кислоты осуществляется синтез биологически активных соединений: лейкотриенов, простагландинов, тромбоксанов. Подкожная жировая ткань у млекопитающих участвует в теплоизоляции, а жировые капсулы внутренних органов защищают их от механических повреждений. Жироподобные соединения (липоиды), главным образом производные фенантрена, также необходимы как мембранные компоненты и предшественники биологически активных соединений: половых гормонов, кортикостероидов, кальциферолов. 116 Нарушения процессов переваривания и всасывания липидов Наибольшую часть пищевых липидов составляют триглицериды, меньше – фосфолипиды, стероидные соединения. Они подвергаются гидролитическому расщеплению под действием панкреатических ферментов: липазы, фосфолипазы А2 и холестеролэстеразы. Панкреатическая липаза действует на поверхности раздела жир-вода тонкоэмульгированных липидных капель. Оптимум рН липазы равен 7,8. Она выделяется в неактивной форме (колипаза). Для ее активации необходимы ограниченный гидролиз с помощью трипсина и желчные кислоты. Эмульгирование жиров также осуществляется желчными кислотами (их солями). Желчь, имеющая щелочной рН, способствует нейтрализации кислотности желудочного сока и оптимизации действия ферментов панкреатического сока. Панкреатическая липаза специфична в основном по отношению к гидролизу эфирных связей в 1 и 3 положениях, а гидролиз 2 связи затруднен. Удаление последней жирной кислоты требует изомеризации в первичную эфирную связь, что осуществляется в пищеварительной системе крайне медленно, поэтому продуктами переваривания триацилглицеролов оказываются преимущественно 2-моноацилглицеролы. До глицерола и жирных кислот расщепляются менее одной четверти триацилглицеролов. Панкреатический сок содержит фосфолипазу А2, также в виде проформы, которая активируется по тому механизму, что и липаза (ограниченный гидролиз трипсином). Для проявления активности фосфолипазы А2 необходимы ионы кальция. Фосфолипаза А2 гидролизует эфирную связь во 2 положении глицерофосфолипидов как желчного, так и пищевого происхождения с образованием лизофосфатидов. Холесторолэстераза катализирует гидролиз эфиров холестерина с жирными кислотами, холестерол всасывается затем в неэстерированной, свободной форме. 2-Моноацилглицеролы, жирные кислоты, небольшие количества 1-моноацилглицеролов диффундируют в смешанные мицеллы, состоящие из желчных солей, фосфатидилхолина и холестерола желчного происхождения. В мицеллы также поступают лизофосфатиды и пищевой холестерол. Мицеллы всасываются через щеточную каемку активными энтероцитами кишечника. Здесь происходит ресинтез триацилглицеролов по механизму, сходному с этим процессом в других клетках. Всосавшиеся лизофосфолипиды вместе с большей частью всосавшегося холестерола также реацитилируются ацил-КоА с регенерацией фосфолипидов и холестериловых эфиров. Все вновь синтезированные липиды, включая триглицериды, фосфолипиды, холестерол и его эфиры, свободные жирные кислоты, жирорастворимые витамины, объединяются в хиломикроны, которые в составе млечной жидкости (хилуса) собираются в лимфатических сосудах брюшной полости, а затем поступают в кровь через грудные лимфатические протоки. 117 Расстройства жирового обмена могут возникать в процессе переваривания и всасывания. Большое значение эта патология имеет в детском возрасте из-за несовершенства процессов пищеварения. Заболевания, связанные с нарушением процессов переваривания и всасывания жиров, можно разделить на четыре группы. I группа. Различные заболевания поджелудочной железы приводят к недостаточности панкреатической липазы: врожденное недоразвитие поджелудочной железы, аплазия выводного протока, некроз, фиброз, гипоплазия. Пациенты жалуются на тошноту и тяжесть при употреблении жирной пищи, рвоту, диарею; имеют малую массу тела. При непереваривании жиров они появляются в каловых массах. Жиры плохо перевариваются также при острых и хронических панкреатитах, раковых опухолях поджелудочной железы. II группа. Недостаточное поступление желчи в двенадцатиперстную кишку приводит к нарушению эмульгирования жиров и активации липазы. К таким заболеваниям относятся: врожденная аплазия желчных путей, гепатиты, циррозы печени. III группа. Желудочно-кишечные заболевания, связанные с ускорением прохождения пищи, анатомическое и функциональное поражение слизистой оболочки кишечника. IV группа. Воспаления кишечника различной этиологии: язвенные колиты, дизентерия. Для определения степени переваривания жиров определяют их наличие в каловых массах. Транспорт липидов кровью и взаимодействие липопротеидных комплексов с клетками. В плазме крови, куда липиды поступают из лимфы через лимфатические протоки, определяется в среднем 5,7 г/л общих липидов (от 4 до 8 г/л). Все липиды находятся в связанной с белками форме в виде липопротеидных мицелл. Свободные жирные кислоты составляют около 5% от всей липидной фракции и транспортируются в связи с альбумином. Липопротеины плазмы – водорастворимые белково-липидные комплексы – являются основной транспортной формой липидов в крови. Липопротеины делят на несколько классов по плотности и составу [1,5,14]: хиломикроны (ХМ), липопротеины очень низкой плотности (ЛПОНП); липопротеины низкой плотности (ЛПНП); липопротеины промежуточной плотности (ЛППП); липопротеины высокой плотности (ЛПВП); липопротеины очень высокой плотности (ЛПОВП). Все липопротеидные частицы включают в себя 5 основных компонентов: белки (апопротеины), фосфолипиды, холестерин, эфиры холестерина и триглицериды. Эфиры холестерина и триглицериды формируют гидрофобное ядро мицеллы, а свобод- 118 ный холестерин и фосфолипиды образуют поверхностный липидный монослой, в который встроены апопротеины. Хиломикроны образуются в эпителиальных клетках тонкой кишки (энтероцитах) в процессе всасывания пищевых жиров и характеризуются наименьшим содержанием апопротеинов (1-2%), среди которых преобладают апопротеины В и С. Диаметр частиц около 500 нм, а плотность составляет в среднем 0,94 г/мл. При низком содержании апопротеинов хиломикроны имеют высокий процент триглицеридов пищевого происхождения (86-94%) и являются транспортной формой последних на пути: кишечная стенка → грудной лимфатический проток → кровяное русло → жировая ткань и некоторые другие ткани. Липопротеины очень низкой плотности образуются в клетках печени. На долю белков в них приходится 7-10% от общей массы, причем преобладают апопротеины В, С и Е. Диаметр частицы составляет от 30 до 100 нм, плотность – 0,94-1,006 г/мл. От хиломикронов их отличает, кроме более высокого процента апопротеинов и их состава, то, что они являются транспортной формой эндогенно синтезированных триглицеридов. Липопротеины низкой плотности и липопротеины промежуточной плотности формируются в крови при частичном или полном распаде ЛПОНП. На долю белков приходится 22-25% от общей массы, диаметр частиц 15-20 нм, плотность – 1,006-1,063 г/мл. Доминирует апопротеин В. ЛПНП содержат самый высокий процент холестерина и его эфиров (до 50%) и около 30% фосфолипидов. Частицы представляют собой основную транспортную форму холестерина. Липопротеины высокой плотности характеризуются высоким содержанием белка (около 50%), частью формируются в печени или в энтероцитах, а другая часть образуется при распаде ХМ и ЛПОНП. Диаметр частиц 10-15 нм, плотность – 1,06-1,125 г/мл. Среди апопротеинов преобладают А-I и А-II, меньше апопротеина С. В условиях гиперхолестеринемии ЛПВП могут содержать в числе основных белков апопротеины Е. Основной функцией ЛПВП служит обратный транспорт холестерина из периферических тканей в печень для последующего окисления в желчные кислоты или выведения в составе желчи. Липопротеины очень высокой плотности открыты недавно, плотность может составлять от 1,125 до 1,21 г/мл. Частицы имеют особый состав: 27% белков, 65% липидов и 8% углеводов. По белковому составу апопротеин В – 65%; альбумин – 15%; специфический апопротеин – 20%. Функции данного класса еще не выяснены. Взаимодействие липопротеиновых мицелл с клетками Гидролиз триглицеридов ХМ и ЛПОНП протекает на поверхности капилляров жировой ткани, сердечной мышцы, легких, селезенки, почек, диафрагмы и, возможно, других тканей при действии на липопротеиновую частицу фермента липопротеинлипазы. Последняя локализована в мембра119 не эндотелия. В результате действия липопротеинлипазы на триглицериды хиломикронов образуются β-моноглицеролы и жирные кислоты. Гидролиз триглицеридов, расположенных в ядре мицеллы, сопровождается значительным уменьшением размера частицы, а неэтерифицированный холестерол, фосфолипиды и апопротеины оказываются в избытке. Показано, что апопротеины С и Е переходят на ЛПВП, а продукты гидролиза триглицеридов - β-моноглицеролы и жирные кислоты вместе с неэтерифицированным холестеролом и фосфолипидами поступают в клетки путем латеральной диффузии. В результате действия липопротеинлипазы на ХМ последние превращаются в «ремнантные» (остаточные) частицы, которые задерживаются в печени и распадаются. Подобным образом происходит и превращение ЛПОНП, при этом апопротеины С и Е переходят на ЛПВП, а апопротеины В остаются на ЛПОНП, которые становятся липопротеинами промежуточной плотности (ЛППП). ЛППП подвергаются атаке фермента триглицеридлипазы, секретируемой в кровь гепатоцитами. Этот фермент продолжает расщепление триглицеридного компонента. В конечном счете образуются мицеллы, обедненные триглицеридами, потерявшие большую часть апопротеинов С и Е, но обогащенные холестеролом и апопротеином В, то есть ЛПНП. В середине 70-х годов прошлого столетия было показано, что различные клетки – гладкомышечные, эндотелиальные, фибробласты и другие – имеют на своей мембране рецепторы для связывания ЛПНП. Такое связывание, осуществляющее транспорт холестерола в клетки, было названо рецепторно-опосредованным эндоцитозом [1,7]. Авторы отмечали, что данный процесс предполагает наличие специфических рецепторов, узнающих частицы и стимулирующих физиологический ответ: захват, образование кластеров – «окаймленных везикул», то есть мицелл, окруженных молекулами рецепторов, формирование эндоцитозных пузырьков и деградацию их в лизосомах клетки. Поступивший в клетку в составе мицелл холестерол подавляет активность 3-гидрокси-3-метилглутарил-КоА-редуктазы, катализирующей собственный биосинтез холестерола клеткой; активирует ацил-КоА-холестеролацилтрансферазу (АХАТ), которая этерифицирует внутриклеточный холестерол и подавляет синтез рецепторов. Рецепторы, обеспечивающие специфический захват ЛПНП, получили название В,Ерецепторов, поскольку они активно связывают липопротеидные частицы с высоким содержанием апопротеинов В и Е. Они обнаруживаются на клетках печени, фибробластах, гладкомышечных клетках, эндотелии сосудов, макрофагах. В мембранах гепатоцитов обнаружены также рецепторы другого типа – избирательно взаимодействующие с апопротеином Е – Ерецепторы. Регулируемый уровнем холестерола в клетках синтез рецепторов не сопровождается накоплением холестерина в клетках. Однако в последующем было показано наличие проникновения в клетку ЛПНП путем нерегулируемого эндоцитоза, который приводит к 120 избыточному поглощению клетками холестерола. Особенно характерен подобный механизм захвата ЛПНП для макрофагов. Исследования показали, что при высокой концентрации ЛПНП в среде нерегулируемый захват способны осуществлять такие клетки, как эндотелиальные, хотя интенсивность этого процесса невелика по сравнению с макрофагальными клетками [1]. В настоящее время экспериментально доказана ведущая роль нерегулируемого эндоцитоза в развитии атеросклеротического повреждения сосудов, кроме того показано, что химически модифицированные ЛПНП (ацетилированные, ацетоацетилированные, гликозилированные, переокисленные) захватываются клетками также путем нерегулируемого эндоцитоза и более активно, чем нативные [1,5,7]. Дислипидемии и дислипопротеидемии. Нарушение обмена холестерина Гиперлипидемия наблюдается при нефрозах, диабете (параллельно с ацидозом), заболеваниях печени. Характеризуется увеличением содержания липидов и продуктов их обмена в крови. Липидемии сопровождают экссудативный диатез. Причиной увеличения содержания липидов в плазме является снижение потребления жиров тканями организма. Эссенциальная гиперлипидемия характеризуется высокой степенью повышения содержания липидов в плазме крови. Причины не совсем ясны, в основе – нарушения распределения жиров между тканями и кровью. Гиполипемия наблюдается при дистрофиях, гипертиреозе. Липурия – повышенное выделение жиров с мочой обычно обусловлено присутствием в моче большого количества лейкоцитов и эпителиальных клеток. Примесь жира придает моче молочный вид при содержании жиров около 0,1%. Наблюдается при дисфункциях почек, воспалительных процессах в почках. Ожирение. Жировой обмен тесно связан с углеводным, так как избыток углеводов быстро переходит в жиры. Нормально в состав тела человека входит примерно 15% жиров. В случае ожирения содержание может доходить до 50%. Наиболее распространено алиментарное ожирение – следствие употребления высококалорийной пищи при небольших энергетических затратах. Способом возможности избежать алиментарного ожирения является сбалансированное, рациональное питание. Патологическое ожирение – следствие расстройств нейрогуморальной регуляции углеводножирового обмена: гипофункция передней доли гипофиза, щитовидной железы (миксидема), надпочечников, половых желез и гиперфункция островкового аппарата поджелудочной железы. Дислипопротеидемии – это отклонение от нормы в липопротеидном спектре крови, проявляющееся в изменении содержания одного или более классов липопротеидов. Природа дислипопротеидемии может быть наследственной или обусловленной факторами окружающей среды. 121 Гиперлипопротеидемии характеризуются сочетанным или избирательным накоплением в крови ХМ и их ремнантов; ЛПОНП и их ремнантов; ЛПНП. Основным белковым компонентом всех этих ЛП является апоВ. Только при некоторых типах гиперлипопротеидемий в крови накапливаются липопротеидные мицеллы, содержащие апоЕ. Нарушение метаболизма этих двух апопротеинов становится причиной развития ряда гиперлипопротеидемий. Типы гиперлипопротеидемий [14] Гиперхиломикронемия. Характеризуется высоким содержанием в крови хиломикронов натощак. Количество триглицеридов в плазме резко повышено, холестерина – норма. Плазма крови напоминает молоко. Причина – недостаток липопротеинлипазы, расщепляющей хиломикроны. Наблюдается уже в детском возрасте. Симптомы: увеличение селезенки, печени, нарушение процессов пищеварения (рвота, колики, жидкий стул). Клиническая картина напоминает панкреатит. Атеросклероз практически не развивается. Встречаемость заболевания очень редка. Гипербеталипопротеидемия. Встречается в виде двух подтипов: а) повышено содержание β-ЛП; пре-β-ЛП – норма; б) повышено содержание β-ЛП и пре-β-ЛП. Содержание холестерина выше нормы. Обнаруживается увеличение содержания апоВ в плазме крови в 2 раза. Наследственная предрасположенность может быть обусловлена либо отсутствием или недостатком В и Е-рецепторов к ЛПНП у клеток, либо накоплением в крови пре-β-ЛП, либо повышенным синтезом в гепатоцитах апоВ. Клинически проявляется ранним развитием атеросклероза преимущественно коронарных артерий, появлением в молодом возрасте обусловленной этим, ишемической болезни сердца (ИБС). Генетическая форма заболевания очень редка: гетерозиготы 1 из 500 тыс.; гомозиготы один из 1 млн человек. У гомозигот атеросклероз развивается в детском возрасте, инфаркт миокарда – в молодом. Дисбеталипопротеидемия. Характерна повышенная концентрация β-ЛПОНП. Плазма крови мутная, иногда повышено содержание ХМ. Содержание холестерина и триглицеридов высокое. β-ЛПОНП можно рассматривать как модифицированную форму ЛП, поскольку они обогащены холестеролом и обеднены триглицеридами, у них изменен и белковый состав – много апоЕ. Для больных характерна высокая степень поражения атеросклерозом многих артерий, обнаруживается преимущественно во взрослом состоянии. Кроме атеросклероза коронарных артерий и ИБС, наблюдается атеросклероз нижних конечностей. Встречается достаточно редко, среди лиц с высоким уровнем холестерина и триглицеридов в плазме (один случай на 100 человек). 122 Гиперпребеталипопротеидемия. В плазме повышен уровень ЛПОНП, высокое содержание триглицеридов, холестерин – норма. Причина – недостаточность липопротеинлипазы. Клинические проявления: поражение атеросклерозом как коронарных, так и периферических артерий. Развивается медленнее, чем в двух предыдущих случаях, проявляется в пожилом возрасте, часто в сочетании с диабетом и ожирением. Распространенность колеблется от 3 до 26%. Сочетание гиперхиломикронемии с гипербеталипопротеидемией. Повышенное содержание ХМ и ЛПОНП. Плазма мутная, повышено количество триглицеридов и холестерина. Биохимически обусловлено нарушением катаболизма ХМ и ЛПОНП, то есть нарушением превращений триглицеридов как эндогенного, так и экзогенного происхождения. Наблюдается снижение толерантности к жирам и углеводам, часто осложняется диабетом. Поражение сердечно-сосудистой системы не является ведущим, поражаются также сосуды головного мозга и периферические сосуды. Нарушение обмена холестерола Гипохолестеринемия – снижение уровня холестерина в крови может наблюдаться при базедовой болезни, анемии, колитах различной этиологии, ряде инфекционных заболеваний. Это обусловлено различными нарушениями процессов синтеза или усвоения экзогенного холестерина. Гиперхолестеринемии могут быть вызваны эмоциональным возбуждением, наблюдаются в постоперацинный период, во время беременности, сопровождают эндокринные нарушения: микседему, кретинизм, диабет, климакс. Повышение содержания холестерина в плазме характерно для многих заболеваний ЦНС: менингит, энцефалит, опухоли головного мозга, рассеянный склероз, инсульт, эпилепсии, шизофрении; а также заболеваний печени: гипертрофического цирроза, механической желтухи, желчекаменной болезни. Атеросклероз может сопровождаться как нормальным, так и повышенным содержанием холестерина в крови, является основным заболеванием связанным с нарушением обмена липопротеидов. Атеросклероз. В изучении патогенеза атеросклероза сохраняется приоритет за российскими учеными, который поддерживается до настоящего времени. У основания – холестериновая модель Н.Н. Аничкова и С.С. Халатова, созданная в начале XX века. В журнале ВОЗ «Здоровье мира» (1970) отмечается, что история изучения патогенеза атеросклероза начинается с экспериментов, выполненных «молодыми исследователями из Петербурга». Имена этих исследователей: Н.Н. Аничков, С.С. Халатов, А.И. Игнатовский, Н.В. Стукей, С.С. Салтыков, Д.Д. Крылов, Л.М. Старокадомский, Н.В. Веселкин, Л.В. Соболев [8]. В 1908 году А.И. Игнатовский наблюдал развитие атеросклероза аорты у кроликов, которых он кормил необычным для этих животных продуктом – мясом. Затем Н.В. Стукай получил аналогичные результаты путем 123 длительного кормления кроликов яичным желтком. Н.Н. Аничков и С.С. Халатов предположили, что причиной развития атеросклероза явилось высокое содержание в этих продуктах холестерина. Для проверки этой гипотезы они поставили эксперименты, которые впоследствии стали классическими: кормление кроликов чистым холестерином приводило к формированию атеросклеротических бляшек в стенке аорты. С учетом современных данных, атеросклероз следует рассматривать как хроническое очаговое поражение артерий, характеризующееся отложением и накоплением во внутренней оболочке сосуда (интиме) апопротеин В-содержащих липопротеидов и доставляемого ими холестерина, сопровождающееся как структурно-клеточными изменениями, так и реактивным разрастанием соединительной ткани с образованием фиброзных бляшек в артериальной стенке [Н.А. Климов, 1985][8]. Это определение подчеркивает, что атеросклероз – длительное заболевание, первичным субстратом служит холестерин, поставляемый липопротеидами, а завершением – формирование фиброзной бляшки. Атеросклероз не следует смешивать с артериосклерозом, заболеванием, характеризующимся уплотнением стенки артерий вследствие интрамурального фиброза и кальцинирования, связанного с физиологическим старением или воздействием болезнетворных агентов (сифилитический артериосклероз). Липопротеидные мицеллы сами по себе не оказывают повреждающего воздействия на артериальную стенку, пока не происходит их распад с освобождением холестерина, который не метаболизирует в артериальной стенке и оказывает на нее негативное действие. Эндотелий способен к регулируемому захвату ЛПНП с участием В, Е-рецепторов, что также не приводит к накоплению холестерина, так как он полностью используется клетками. Однако эндотелиальные клетки могут поглощать ЛПНП с помощью нерегулируемого эндоцитоза, подобного макрофагальному захвату. Вероятность подобного захвата возрастает при увеличении содержания ЛПНП в плазме, их химической модификации. Часть захваченных ЛПНП расщепляется, а часть выбрасывается в субэндотелиальное пространство интимы. Кроме того, ЛП могут поступать в интиму через межклеточные каналы эндотелия или его повреждения. Многие вещества способствуют увеличению межклеточных пространств эндотелия: адреналин, норадреналин, серотонин, ангиотензин II, брадикинин, никотин и сам холестерин. Повреждение эндотелия вызывают токсины, микротромбы, повышенная адгезия тромбоцитов, иммунные комплексы, турбулентные явления при повышении артериального давления. Проникшие в интиму различными путями ЛПНП, вступают во взаимодействие с гладкомышечными клетками и макрофагами. Макрофаги имеют множество рецепторов к ЛП и способны к нерегулируемому захвату частиц. Особенно интенсивно нерегулируемо захватываются модифицированные мицеллы: ацетилированные, ацетоацетилированные, гликозилиро124 ванные, содержащие перекиси ЛПНП, а также аутоиммунные комплексы ЛП-антитело, агрегаты липопротеидных частиц. Нерегулируемый захват липопротеидных частиц, содержащих много холестерола (ЛПНП), приводит к превращению их в «пенистые». Образование «пенистых» клеток – первый характерный морфологический признак развивающегося атеросклероза. Перегрузка пенистых клеток липопротеидными частицами ведет к их распаду и изливанию содержимого клеток в интиму. Избыток холестерола поглощается близлежащими клетками, что стимулирует синтез жирных кислот для его этерификации в этих клетках. Когда возможности утилизации холестерола клетками исчерпаны, реализуется сигнал на усиленную пролиферацию гладкомышечных и соединительнотканных клеток (фибробластов), что сопровождается формированием атеросклеротической бляшки – второго морфологического признака атеросклеротического повреждения артерий. Считается, что значительная роль в образовании бляшек принадлежит также тромбоцитам, так как повреждение эндотелия ведет к усилению адгезии и агрегации тромбоцитов. Агрегация активированных тромбоцитов на интиме способствует выделению ими митогенного фактора, стимулирующего пролиферацию фибробластов и ускоряющего рост фиброзной бляшки. Положение Н.Н. Аничкова (1915)[7] «без холестерина не может быть атеросклероза» с современной позиции звучит так: без атерогенных липопротеидов не может быть атеросклероза. Атерогенные липопротеидные частицы – ЛПНП – и особенно их модифицированные формы являются тем первичным субстратом, которые при взаимодействии с клетками интимы артерий инициируют атеросклеротический процесс. Атерогенность липопротеидных частиц снижается в ряду: ЛПНП>ЛППП>ЛПОНП. Атерогенность присуща апоВ-содержащим липопротеидам и она тем выше, чем больше они содержат холестерола. У человека бóльшая часть холестерола находится в составе ЛПНП, это характерно также для обезьян, кроликов, морских свинок, голубей и других животных, у которых развивается атеросклероз. У некоторых животных, например, собак, кошек, лошадей, крыс, холестерол в основном транспортируется в составе ЛПВП, для них атеросклероз не характерен. Рассмотренный нами выше механизм развития атеросклероза представляет собой основные положения патогенеза атеросклероза согласно теории липопротеидной инфильтрации интимы, впервые высказанной Н.Н.Аничковом, развитой и дополненной на основе полученных новых данных. Эта теория основывается на положении, что бóльшая часть энергетических потребностей артериальной стенки, особенно ее структур, лишенных собственного кровоснабжения, восполняется за счет липидов плазмы. При этом делалось допущение, что плазменные липиды поступают в сосудистую стенку путем просачивания (инфильтрации) плазмы в направлении от эндотелия к адвентиции. На современном уровне инфильтра125 ционная теория патогенеза атеросклероза представляется более сложной, чем теория липидной инфильтрации Н.Н. Аничкова. Показаны пути проникновения плазменных липопротеидов во внутреннюю оболочку артерий – интиму, а также механизмы взаимодействия липопротеидных мицелл с клетками сосудистой стенки. Появилось множество фактов, которые развивают и дополняют данную теорию, основанную на ведущей роли нерецепторного захвата ЛПНП макрофагами и другими клетками стенки артерий. Было обнаружено, что липопротеидные частицы, содержащие гидроперекиси липидов: фосфолипидов и холестерола, могут вызывать первичные повреждения интимы и ускорять развитие атеросклероза. При экспериментально вызванном атеросклерозе применение антиоксидантов (токоферолов, аскорбиновой кислоты, цистамина) задерживало процесс формирования атеросклеротических повреждений. Так называемая перекисная теория развития атеросклероза у нас выдвигалась и поддерживалась О.Н. Воскресенским (1974, 1981) и В.З. Ланкиным (1979)[7]. Американский исследователь F.A.Kummerow (1980) показал, что окисленные стерины, такие, как холекальциферол (D3) и 25-гидроксихолестерин, при введении животным в больших дозах вызывают прежде всего изменения, типичные для артериосклероза, то есть сопровождаются кальцинозом сосудов, но характеризуются также появлением пенистых клеток и внеклеточным отложением липидов [7]. Повреждения эндотелия способствуют усилению проникновения в артериальную стенку липопротеидных частиц, что предполагает активацию одновременно двух процессов: тромбообразования и липопротеидной инфильтрации. Согласно современным данным, допускается даже возможность заноса липидов тромбоцитами, так как показано, что тромбоциты могут связывать некоторые количества ЛПНП [Чазов Е.И. и др., 1983][13]. Активная адгезия и агрегация тромбоцитов сопровождаются выделением ими митогенного фактора, способствующего пролиферации клеток сосудистой стенки, а также тромбоксана, усиливающего агрегацию новых порций тромбоцитов. Американские ученые E.Benditt и J.Benditt (1973)[7] пришли к заключению, что гладкомышечные клетки, входящие в состав атеросклеротической бляшки, являются потомством одной мутировавшей клетки. Их заключение основывалось на наблюдении, что некоторые негритянки, гетерозиготные в отношении двух изоферментов глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, содержали в клетках атеросклеротических бляшек либо один изофермент, либо другой, тогда как в других тканях рядом лежащие клетки содержали то один, то другой изофермент. Авторы сделали вывод о переходе клеток в неопластическое состояние, что может быть стимулировано рядом мутагенов: вирусы, смолы табачного дыма и т.д. Однако моноклональная теория подтверждает только то, что in vivo пролиферации подвергаются наиболее чувствительные к высоким концентрациям холестерина клетки, и пролиферация их является следст126 вием накопления холестерина в артериальной стенке, а не наоборот. Кроме того, в процессе формирования атеросклеротической бляшки пролиферируют не только гладкомышечные клетки, но и макрофаги, фибробласты и эндотелиальные клетки [цит. 13]. Появление в крови человека и животных при развитии атеросклероза аутоиммунных комплексов ЛП-антитело легло в основу создания аутоиммунной теории патогенеза атеросклероза [Климов А.Н., 1974; Климов А.Н. и др., 1979; 1980; цит. 13]. Согласно этой теории, аутоиммунные комплексы ЛП-антитело обладают более выраженной атерогенностью, чем нативные ЛП, и поэтому образование их ведет к инициации и усугублению атеросклеротического процесса. Аутоиммунные комплексы, содержащие в качестве антигена ЛПНП или ЛПОНП, обнаруживаются в крови у 70% больных ИБС. Подобные комплексы были выделены из аорты человека, весьма возможно, что антигенным компонентом комплексов могут служить и другие апоВсодержащие ЛП, такие как ЛППП и β-ЛПОНП. В основе аутоиммунной теории патогенеза атеросклероза лежит следующая цепь последовательных событий: появление аутоантител к какому-то из классов апоВ-содержащих ЛП; формирование циркулирующих в крови иммунных комплексов ЛП-антитело в избытке антигена; фиксация комплексов на поверхности артериальной стенки и повреждение эндотелиального покрова, способствующее проникновению как самих комплексов, так и атерогенных ЛП во внутреннюю оболочку артерий; взаимодействие комплексов ЛП-антитело с клетками артериальной стенки; нерегулируемый захват комплексов клетками и превращение последних в пенистые клетки [Климов А.Н., 1985][8]. Антитела к ЛП могут образовываться в ответ на появление модифицированных ЛП мицелл, приобретающих аутоантигенные свойства. Повреждающее воздействие на эндотелий оказывают также иммунные комплексы, содержащие нелипопротеидные аутоантигены или гетероантигены различного происхождения [Minick C.R., 1980][цит.8]. Сюда могут входить антигены окружающей среды, в том числе пищевые, антигены вводимых в организм вакцин и сывороток, лечебных препаратов, что в какой-то мере объясняет широкую распространенность атеросклероза в настоящее время в высокоразвитых странах. Многое в патегенезе атеросклероза остается еще неизвестным или не до конца выясненным. Однако все более очевидным становится то, что атеросклероз представляет собой полиэтиологическое заболевание, в возникновении и развитии которого участвуют генетические, возрастные, алиментарные, гормональные, иммунные, нейрогенные и другие факторы во взаимодействии. Ускорению развития атеросклеротического процесса способствуют ряд факторов, получивших название факторов риска. Рассмотрим некоторые наиболее важные факторы риска развития атеросклероза. 127 Возраст. Атеросклероз – медленно развивающийся процесс, его проявления наиболее выражены в пожилом возрасте, поэтому возраст может быть условно отнесен к факторам риска. Несмотря на то, что старения невозможно избежать, но сроки развития тяжелых атеросклеротических поражений артерий можно существенно отодвинуть применением профилактических мер, ведением здорового образа жизни. Принадлежность к мужскому полу. Одной из причин большей распространенности и более ранних сроков развития выраженных атеросклеротических повреждений сосудов у мужчин является высокое содержание у них ЛПНП по сравнению с женщинами и низкое – антиатерогенных ЛПВП, ликвидирующих избыток холестерина за счет транспорта его в гепатоциты и превращения в желчные кислоты. Артериальная гипертония. Повышенное артериальное давление является ведущим фактором риска в развитии атеросклероза, одной из причин обострения сердечно-сосудистых заболеваний. Специальные исследования, в которых использовались меченные липопротеиды, показали, что чем выше артериальное давление, тем интенсивнее проникают липопротеиды внутрь аорты и артерий. Другая причина – утолщение интимы, в такой интиме легче задерживаются и накапливаются липопротеидные частицы. Курение. По мнению специалистов, для мужчин, которые выкуривают больше пачки сигарет в день, риск инфаркта миокарда в 2-3 раза выше, чем для тех, кто никогда не курил. При сочетании дислипопротеидемии, артериальной гипертонии и курения вероятность возникновения инфаркта увеличивается в 8 раз. Основная причина – действие никотина на эндотелий, повышающее его проницаемость для липопротеидных мицелл. Кроме того, никотин вызывает спазм артерий, повышает способность тромбоцитов к адгезии. Значительную роль играет также окись углерода, под действием которой наблюдается увеличение содержания холестерина в стенке аорты. Нарушение толерантности к глюкозе (диабет). При тяжелых формах сахарного диабета с абсолютным снижением уровня инсулина в крови резко увеличивается синтез холестерина и возрастает скорость мобилизации жирных кислот из жировых депо. Вместе с тем у больных сахарным диабетом вследствие высокого содержания глюкозы в крови образуются модифицированные липопротеиды – гликозилированные ЛПНП [Schleicher E. et al., 1981][13]. Если у больного диабетом имеется еще артериальная гипертония, то риск развития инсульта возрастает примерно в 6 раз по сравнению со здоровыми людьми. И, наоборот, у больных с атеросклерозом понижается толерантность к глюкозе и часто возникает предиабетическое состояние. Ожирение. Ожирение является косвенным, но далеко не второстепенным фактором риска. Оно ведет (независимо от причин возникновения) к повышению уровня атерогенных липопротеидов в крови (особенно 128 ЛПОНП) и очень часто к снижению количества ЛПВП. Кроме того, ожирение способствует развитию артериальной гипертонии, сахарного диабета, ускоряющих атеросклеротическое повреждение сосудов. Недостаточная физическая активность. Физическая нагрузка способствует поддержанию нормальной массы тела, снижению артериального давления, препятствует развитию сахарного диабета, что замедляет течение атеросклероза. Имеется немало наблюдений, показывающих, что среди лиц, выполняющих физически активную работу, атеросклероз и ИБС встречаются реже. Интересным является факт, что у животных, постоянно двигающихся или совершающих большую физическую работу (лошади), отмечается в крови более высокое содержание ЛПВП, а у мало двигающихся (свиньи) – апоВ-содержащих ЛПНП. У лошадей в отличие от свиней никогда не бывает спонтанного атеросклероза. Особенности личности и поведения. В ответ на частые эмоционально напряженные ситуации приспособительные реакции сердечнососудистой системы нарушаются из-за большого количества секретируемых в кровь катехоламинов. Это приводит, с одной стороны, к повышению проницаемости эндотелия для апоВ-содержащих, а с другой – к активации липолиза в жировой ткани и мобилизации неэстерифицированных жирных кислот, усилению синтеза триглицеридов и ЛПОНП в печени. Кроме того, увеличение уровня адреналина в крови приводит к артериальной гипертонии и ускоряет развитие атеросклероза. Наследственность. К настоящему времени имеются убедительные данные о важном значении генетических факторов в патогенезе атеросклероза. По наследству может передаваться тот или иной вид ДЛП (как говорилось выше), а также предрасположенность к развитию сахарного диабета, артериальной гипертонии. Подагра. Замечено, что у больных атеросклерозом часто повышен уровень мочевой кислоты в крови и наоборот. При обследовании 997 мужчин 40-59 лет, составляющих 15% случайную выборку из отобранной популяции мужчин Москвы и Ленинграда, обнаружена прямая корреляция между уровнем мочевой кислоты и содержанием триглицеридов в крови [Ловягина Т.Н. и др., 1980][13]. Причиной может служить усиление нерецепторного захвата ЛП частиц вместе с кристаллами мочевой кислоты, отложение которых в соединительной ткани характерно для подагры. В экспериментах наблюдали формирование липосом вокруг кристаллов уратов. Однако полного механизма ускорения развития атеросклероза на фоне нарушения обмена пуринов пока установить не удалось. Мягкость воды. В районах, где потребляют мягкую воду с недостаточным содержанием микроэлементов, атеросклероз встречается чаще и протекает тяжелее, чем в районах, где употребляют жесткую воду. К микроэлементам, недостаток которых способствует развитию атеросклероза, относят ванадий, магний, марганец и хром. 129 Сочетанное действие факторов риска. Чем больше факторов риска одновременно воздействует на человека, тем выше вероятность развития у него атеросклероза в более ранний период жизни. Согласно исследованию в Фремингеме (США), комбинация трех факторов (гиперхолестеринемия, повышенное диастолическое давление и курение) увеличивает число случаев смертности от коронарной недостаточности в 8 раз, комбинация двух факторов – в 4 раза, наличие одного из факторов в 2 раза по сравнению с контрольной группой лиц того же возраста, не имеющих данных факторов риска [13]. 2.4. Нарушения регуляции обмена веществ [3,4,10,11,15] Множество патологических состояний обусловлено невозможностью организма правильно регулировать метаболическую активность клеток, а, соответственно, и деятельность отдельных органов и систем органов. Метаболическая активность клеток имеет многоуровневую систему регуляции, которая включает как внутриклеточные механизмы, так и внеклеточные сигналы и их взаимодействие. Внутри клетки скорость течения и направление процессов метаболизма зависит от активных концентраций тех или иных ферментов, что определяется соотношением как внутриклеточных, так и идущих извне регуляторных сигналов. Наибольшее значение для регуляции имеют возможность и скорость образования коферментов, первичных и вторичных сигнальных молекул, состояние рецепторного аппарата клеток. Нарушения процессов обмена веществ при недостатке коферментов и других биологически активных соединений (витамины и витаминоподобные соединения). Большая часть коферментов синтезируется из предшественников, которые не образуются в клетках организма человека и высших животных или образуются только в определенных условиях. По этой причине предшественники отнесены к биологически активным соединениям, которые должны поступать в организм с пищей, синтезироваться симбионтами и т.п. Многие предшественники коферментов представляют собой витамины группы В. Тиамин (В1) поступает в организм с хлебом из грубых сортов муки, с мясом, молоком, бобами. Длительная термообработка продуктов способствует разрушению тиамина. Коферментная форма – тиаминдифосфат – синтезируется путем переноса пирофосфата с АТФ. Катализирует реакции окислительного дезаминирования, входит в состав пируватдегидрогеназы, α-кетоглутаратдегидрогеназы, транскетолазы. Недостаток тиамина ведет к нарушениям энергетического катаболизма: синтеза ацетил-КоА, цикла Кребса, пентозофосфатного пути окисления глюкозы. Так как образование ацетил-КоА может идти на основе жирных кислот, наиболее быстрым про- 130 явлением недостатка тиамина является нехватка восстановленного НАДФ, служащего источником протонов и электронов для процессов синтеза стероидных гормонов и жирных кислот, восстановления метгемоглобина. В крови наблюдается повышение концентрации пировиноградной кислоты, которая не утилизируется в цикле Кребса. Клинические проявления получили название заболевания бери-бери, характеризующееся атрофией мышц, периферическими полиневритами, потерей веса, нарушениями интеллекта. На фоне хронического алкоголизма заболевание может развиваться и при нормальном поступлении тиамина в организм за счет нарушения процессов его всасывания. Потребность в тиамине составляет 0,5 мг/1000 ккал, при избытке углеводов в пище она повышается. Рибофлавин (В2) необходим для образования флавинадениндинуклеотида и флавинмононуклеотида, являющихся коферментами флавинзависимых дегидрогеназ. Достаточное количество рибофлавина содержится в зеленых растениях, молоке, злаках, яйцах птиц. Основные коферментные функции – транспорт электронов и протонов от НАД-зависимых дегидрогеназ на убихинон в дыхательной цепи ферментов; участие в цикле Кребса (сукцинатдегидрогеназа) и окислении жирных кислот (ФАДзависимая дегидрогеназа бета-окисления жирных кислот); миелопероксидазной системе нейтрофилов. Недостаточность в чистом виде практически не встречается, обычно проявляется в комбинированном дефиците тиамина, рибофлавина, никотиновой кислоты и белкового голодания. Только недостаток рибофлавина характеризуется появлением следующих признаков: фуксиноподобный язык, трещины в углах рта и на губах, себорейный дерматит, васкуляризация роговицы. Может быть обнаружено по снижению содержания рибофлавина в эритроцитах. Суточная потребность такая же, как и у тиамина. Пантотеновая кислота (В3) служит предшественником коэнзима А (КоА), осуществляющего перенос ацетильных и ацильных групп в составе ацетил-КоА, сукцинил-КоА, малонил-КоА, ацил-КоА и т.п. Участвует в бетаокислении жирных кислот, пировиноградной кислоты, синтезе жирных кислот и других процессах. Пантотеновая кислота содержится во многих продуктах животного происхождения: молоке, мясе, яйцах; синтезируется микрофлорой кишечника человека, поэтому недостаточность у человека в чистом виде не выявлена. В экспериментах на крысах наблюдаются поседение шерсти, задержка роста и размножения. Суточная потребность 5-10мг. Никотиновая кислота (В5, РР) содержится в мясе, печени, растительных продуктах. В отличие от других витаминов может синтезироваться в организме человека из триптофана. В молоке и яйцах почти не содержится, но потребности покрываются при употреблении преимущественно этих продуктов за счет высокого содержания триптофана в них. Коферментные формы – НАД и НАДФ – входящие в состав НАД- и НАДФ131 зависимых дегидрогеназ. В клетках встречается множество подобных дегидрогеназ, участвующих в процессах окисления-восстановления различных органических соединений. НАД-зависимые дегидрогеназы в основном представлены в процессах катаболизма: гликолизе, молочнокислом и спиртовом брожениях, цикле Кребса и дыхательной цепи, а НАДФзависимые – как в катаболизме (пентозофосфатное окисление глюкозы), так и в анаболизме (синтез жирных кислот, стероидов). Недостаточность проявляется только в комплексе с другими витаминами группы В при скудном и однообразном питании в основном растительной пищей или голодании симптомами, получившими название пеллагры. Наиболее существенные признаки пеллагры: дерматит при повышенной чувствительности кожи к ультрафиолетовым лучам; диарея, слабость, слабоумие в тяжелых случаях. Пеллагра была распространена среди негритянского населения в США, работающего на кукурузных плантациях и питающегося преимущественно кукурузой, практически не содержащей в своих белках триптофана и в зернах – других витаминов группы В. Потребность 15-25 мг в сутки, частично может покрываться за счет микрофлоры кишечника. Пиридоксин (В6) содержится в зародышевой части и оболочках семян злаков, дрожжах, мясе, особенно в печени и почках. Пиридоксин фосфорилируется в гепатоцитах и окисляется до пиридоксальфосфата, который является коферментной формой, осуществляющей реакции переаминирования и декарбоксилирования аминокислот. Входит в состав ферментов трансаминаз, монои диаминоксидаз, синтетазы δ-аминолевулиновой кислоты, гликогенфосфорилазы. Соответственно участвует в процессах переаминирования, окислительного дезаминирования аминокислот и биогенных аминов (адреналина, норадреналина, серотонина, гистамина и др.); синтезе гема; гликогенолизе. Признаки недостатка пиридоксина могут появляться у младенцев при несбалансированном искусственном вскармливании в виде повышенной возбудимости с периодическими судорогами. У взрослых недостаток пиридоксина наблюдали на фоне лечения изониазидом (лечение туберкулеза): тошнота, рвота, утрата аппетита, трещины в углах рта и на губах, полиневрит и пелларгоподобный комплекс. Все нарушения устраняются введением В6. Ориентировочная потребность в пиридоксине 2-3 мг/сутки, которая, вероятно, увеличивается при обогащенном белковом питании и с возрастом. Биотин (Н) обычно в достаточном количестве производится микрофлорой кишечника, недостаточность в некоторой степени может возникать только при значительной гибели микрофлоры кишечника. Содержится в печени, дрожжах. Авидин яичного желтка тормозит всасывание биотина в кишечнике, его потребление в значительном количестве может спровоцировать нехватку биотина. Сульфаниламиды, стерилизующие кишечный тракт, также могут стать причиной гиповитаминоза по биотину. Биотин служит простетической группой ферментов, осуществляющих реакции карбоксилирования: ацетил-КоА-карбоксилазы, пропионил-КоА-карбоксилазы, метил132 малонил-транскарбоксилазы, пируваткарбоксилазы, ацетальдегидкарбоксилазы. При дефиците биотина способность включать СО2 в органические кислоты падает, соответственно снижается возможность образования оксалоацетата из пирувата, пирувата из ацетальдегида, что сопровождается снижением скорости окисления ацетил-КоА в цикле Кребса, утилизации этилового спирта и уксусного альдегида (синдром похмелья), синтеза жирных кислот за счет уменьшения образования малонил-КоА. Суточная потребность примерно 10 мкг. Фолиевая кислота (В9) содержится в продуктах растительного происхождения: салаты, капуста, томаты, шпинат. В энтероцитах образуется производное – тетрагидрофолиевая кислота и продукт ее N-метилирования – N-метилтетрагидрофолиевая кислота, которые служат коферментными формами переноса формильных и метильных групп. Ферменты, содержащие данные коферментные формы, катализируют реакции синтеза пуринов, пиримидинов, глицина, метионина. Недостаточность фолиевой кислоты часто является не столько следствием ограниченного поступления с пищей, сколько результатом нарушения всасывания. Характеризуется развитием фолиеводефицитной (мегалобластической) анемии, обусловленной нарушением синтеза ДНК и образования клеток крови. Истинная потребность – 25 мкг/сутки, но из-за плохого всасывания желательно – 50 мкг/сутки. Цианкобаламин (В12) содержится в дрожжах, молоке, печени, почках. Синтезируется микрофлорой кишечника. Всасывание цианкобламина обеспечивается белком, который синтезируется клетками слизистой желудка (гастромукопротеид). Комплекс гастромукопротеид-цианкобаламин всасывается энтероцитами тонкого кишечника, проникает в портальный кровоток и передает цианкобаламин другому белку – транскобаламину I (глобулин с М. 35 кДа). После выхода в общий кровоток цианкобаламин переходит на транскобаламин II (глобулин с М. 121 кДа). В клетках многих тканей цианкобаламин переходит в коферментные формы: метилкобаламин; дезоксиаденозилкобаламин. Первый служит коферментом гомоцистеинметилтрансферазы, катализирующей перенос метильной группы с N-метилтетрагидрофолиевой кислоты на гомоцистеин, что приводит к образованию метионина. Второй является коферментом метилмалонилКоА-мутазы, которая ускоряет превращение метилмалонил-КоА в сукцинил-КоА. Эта реакция обеспечивает окисление пропионил-КоА, остающегося при бета-окислении жирных кислот с нечетным числом атомов углерода. Известно также, что цианкобаламин участвует в образовании коферментных форм фолиевой кислоты и опосредованно в синтезе ДНК и пролиферации кроветворных клеток. Недостаточность цианкобаламина возникает при строго вегетарианском питании, при нарушениях всасывания (резекция желудка, гастрит, наследственный дефект гена, ответственного за 133 синтез гастромукопротеида), проявляется в виде пернициозной анемии (болезнь Адиссон-Бирмера). Биофлавоноиды (Р) представляют собой производные хромона и флавана, отличающиеся между собой числом или положением гидроксильных групп в ароматических кольцах. Наибольшей активностью обладают представители флавононов: гесперитин, нарингин, эридиктол; и флавонов: хризин, лютеолин, кверцитин, рутин. Содержатся преимущественно в цитрусовых, в плодах шиповника, ягодах черноплодной рябины, красном перце, плодах облепихи, черной смородины и вишни. Биологический эффект связан с уменьшением проницаемости капилляров, сосудоукрепляющим действием. Биохимический механизм действия флавоноидов еще до конца невыяснен. Возможно, что он определяется тормозящим влиянием на активность гиалуронидазы, катализирующей отщепление гиалуроновой кислоты и повышающей проницаемость капилляров. Также известно, что дефицит биофлавоноидов сопровождается снижением прочности лизосом, выход протеолитических ферментов из которых ведет к росту проницаемости сосудов. Биофлавоноиды являются синергистами аскорбиновой кислоты в процессе созревания коллагена, что приводит к укреплению соединительнотканной оболочки сосудов. Потребность точно не установлена, и по разным данным колеблется от 10 до 100 мг/сутки. Аскорбиновая кислота (С) содержится в свежих овощах и фруктах, наибольшее количество обнаруживается в шиповнике, черной смородине. В небольшом количестве содержится в молоке. Всасывается практически во всех отделах пищеварительного тракта, транспортируется с кровью частично в связанном, частично в свободном состоянии. В тканях окисляется до дегидроаскорбиновой, дикетогулоновой, щавелевой и других кислот. Может в неизменном виде выводиться с мочой. Основной функцией является участие в окислительновосстановительных реакциях в качестве донора электронов. Отдавая 2 электрона и два протона, превращается в дегидроаскорбиновую кислоту. Процесс восстановления катализирует фермент дегидроаскорбатредуктаза, донором протонов и электронов служит восстановленный глутатион. В качестве кофермента участвует в реакциях гидроксилирования: триптофана (синтез серотонина); ДОФА (образование норадреналина); гидроксифенилпирувата (синтез гомогентизиновой кислоты); стероидов (биосинтез кортикостероидов); бета-бутиробетаина (синтез карнитина); остатков пролина и лизина (созревание коллагена). Кроме того, аскорбиновая кислота участвует в обмене железа: в кишечнике обеспечивает восстановление трехвалентного железа в двухвалентное, что является обязательным условием всасывания железа, высвобождает железо из комплекса с трансферрином, что ускоряет его поступление в ткани. Недостаточность проявляется в виде рыхлости соединительной ткани, разшатывания зубов, анемии, снижении резистентности к инфекциям, 134 хрупкости сосудов. Общеукрепляющее действие аскорбиновой кислоты связано с ее антиоксидантным действием и участием в синтезе кортикостероидов, проявляющих противовоспалительную активность (иммунодепрессанты). Дефицит аскорбиновой кислоты обычно сопровождается недостатком флавоноидов, что усугубляет нарушения проницаемости сосудов. Суточная потребность составляет 50-100 мг, но поступление может быть увеличено до 1 г в сутки при необходимости. Ретинол (А) поступает в организм с продуктами животного происхождения – печень рыб, желток яиц, молоко. В виде предшественника – бетакаротина – содержится в оранжевых овощах и фруктах. В гепатоцитах происходит образование гормональных форм: ретинола, ретиналя и ретиноевой кислоты. В клетках других тканей ретинол превращается в эфиры: ретинилпальмитат, ретинилацетат и ретинилфосфат. Все производные находятся в трансконфигурации и лишь в сетчатке глаза образуются цисизомеры ретинола и ретиналя. Расщепление бета-каротина дает две молекулы ретиналя. Всасывание как ретинола, так и его предшественников требует присутствия жиров, так как они представляют собой водонерастворимые соединения. Ретиналь, ретинол и их эфиры регулируют процесс образования родопсина, рост и дифференцировку клеток у эмбрионов, превращение эпителия в слизистый. Ретиноевая кислота участвует в стимуляции роста костей и мягких тканей. Действие гормональных форм обусловлено ядерной рецепцией и стимуляцией процесса транскрипции и трансляции определенных белков. Некоторое отличие в действии характерно для 11-цисретиналя на фотохимический акт зрения. Оба зрительных пигмента: родопсин и йодопсин имеют 11-цис-ретиналь в качестве простетической группы. Кванты света вызывают в родопсине и йодопсине изомеризацию 11-цисретиналя в трансретиналь, после чего происходит распад пигмента на свободные опсин и трансретиналь (при этом пигмент обесцвечивается). Так как пигменты встроены в мембраны светочувствительных клеток сетчатки, фотоизомеризация ретиналя вызывает местную деполяризацию мембраны. Это приводит к возникновению электрического импульса, который распространяется по зрительному нерву в зрительную зону коры больших полушарий. В зрительных рецепторах (палочках и колбочках) затем осуществляется медленная регенерация исходного пигмента (родопсина или йодопсина) при участии фермента ретиналь-изомеразы. В темноте регенерация родопсина происходит быстро через образование трансретинола, цисретинола и 11-цисретинола, который вновь вступает в комплекс с родопсином, и чувствительность к свету любой интенсивности восстанавливается. Недостаточность ретинола и его предшественников – каротиноидов – проявляется в нарушении темновой адаптации (куриная слепота), в молодом возрасте – в задержке роста, избыточном ороговении и сухости кожи, 135 роговицы (ксерофтальмия) с последующим размягчением ее под действием микрофлоры (кератомаляция). Исходом кератомаляции может быть образование стойкого помутнения роговицы (бельма), ведущего к слепоте (амблиопсии). Недостаточность может приводить к задержке роста клеток мозгового слоя почек (метаплазия), что приводит к образованию почечных камней, снижение интенсивности роста и пролиферации сперматогенной ткани ведет к стерильности самцов. Суточная потребность в витамине А 0,5-2,0 мг, у беременных до 4 мг. Производные каротиноидов токсичны, плохо выводятся из организма, поэтому длительное превышение поступления их с пищей может вызвать симптомы отравления: головные боли, тошноту, дерматит. Кальциферол (D) поступает с пищей животного происхождения: печень, молоко, сливочное масло, рыбий жир. Холекальциферол (D3) может синтезироваться в клетках кожи из 7-дегидрохолестерола, эргокальциферол (D2) – из эргостерина (содержится в растительной пище, компонент цитоплазматической мембраны растительных клеток). Холекальциферол транспортируется в гепатоциты, где гидроксилируется в 25 положении и превращается в 25-гидроксихолекальциферол, затем в почках происходит гидроксилирование в 1 положении с образованием активной гормональной формы – 1,25-гидроксихолекальциферола. Появление гормональной формы контролируется в почках паратгормоном околощитовидных желез. Поступая в энтероциты с током крови, 1,25-гидроксихолекальциферол обусловливает превращение белка предшественника в кальцийсвязывающий белок, по этому же механизму ускоряет реабсорбцию кальция в почках. Гормональные формы кальциферола действуют через ядерную рецепцию, обусловливая транскрипцию и трансляцию соответствующих ферментов, катализирующих превращение белков-предшественников в активные формы. Недостаточность наблюдается при дефиците витамина D в пище или недостаточном пребывании на солнце («болезнь подвалов»), заболеваниях почек и уменьшении продукции паратгормона. Дефицит сопровождается снижением содержания кальция и фосфора в костной ткани и в раннем возрасте приводит к развитию рахита (Х-образные голени, килевидная грудная клетка), у взрослых наблюдаются остеомаляция и кариес в период беременности. Отсутствие эффекта при лечении витамином D указывает на связь рахита с нарушением функции паращитовидных желез или почек – витамин-D-толерантный рахит. Потребность 12-25 мкг в сутки. Производные кальциферола токсичны, а также могут вызвать кальциноз сосудов, поэтому передозировка опасна. Особенно опасными в плане токсичности считаются производные витамина D3 – холекальциферола. Токоферолы (Е) содержатся во многих продуктах: растительных маслах, семенах, рыбьем жире. Известны четыре формы токоферолов: α-, β-, γ-, δ-; наиболее активной считается α-токоферол. Всасывание осуществляется в тонком кишечнике в присутствии желчных кислот (эмульгаторы) 136 и жиров (растворители). Транспортируются токоферолы в составе липопротеидных мицелл, а в клетках включаются в плазматические мембраны. Основной функцией токоферолов является регуляция свободнорадикальных процессов окисления в мембранах клеток. Это ограничивает развитие перекисного окисления жирнокислотных остатков бислоя фосфолипидов и препятствует быстрому старению мембран. Недостаточность у людей выявляется очень редко в связи с достаточным содержанием во многих продуктах питания. Иногда наблюдается у недоношенных детей в виде гемолитической анемии за счет уменьшения стабильности эритроцитарных мембран и быстрого старения и разрушения эритроцитов. У животных в экспериментах гиповитаминоз по токоферолам сопровождается атрофией семенников, бесплодием, рассасыванием плода на ранних сроках беременности. Потребность в токоферолах составляет 20-25 мг в сутки. Филлохиноны (К) поступают в основном с растительными продуктами: капуста, шпинат, фрукты, корнеплоды. Из животных продуктов богата филлохинонами ткань печени, кроме того, они синтезируются микрофлорой кишечника человека. Существует два ряда соединений, обладающих свойствами витамина К: менахиноны (растительного происхождения) и филлохиноны (животного и бактериального происхождения). Всасываются филлохиноны в тонком кишечнике при участии желчных кислот и панкреатической липазы, транспортируются в составе хиломикронов, в плазме крови связываются с альбумином, могут накапливаться в клетках печени, селезенки, кардиомиоцитах. Основной активной формой служит менахинон-4, который функционирует в качестве кофактора карбоксилирования глутаминовых остатков в протромбине и других белках свертывающей системы крови. Недостаток часто связан либо с нарушениями микрофлоры кишечника (дисбактериоз, вызванный сульфаниламидами и другими антибиотиками), либо нарушениями всасывания (недостаток поступления желчи). Основные признаки нехватки – кровоточивость при небольших повреждениях, удлинение времени свертывания. Соединения, которые отвечают основным свойствам витаминов, но их дефицит не вызывает специфического симптомокомплекса нарушений и они необязательно должны поступать с пищей, называются витаминоподобными веществами. Рассмотрим некоторые из них. Холин содержится в достаточном количестве в мясных продуктах, злаках, образуется микрофлорой кишечника. При всасывании в тонком кишечнике сразу фосфорилируется в фосфохолин. Биологическая роль заключается в участии в синтезе фосфатидов и ацетилхолина, может служить донором метильных групп в реакциях метилирования. Недостаточность у человека не выявлена, у экспериментальных животных проявляется в виде жировой дегенерации печени. Потребность 137 в холине может возрастать при недостаточном поступлении метионина, который обычно является поставщиком метильных групп. Липоевая кислота часто относится к витаминам, так как входит в состав кофермента липоиламида, не синтезируется некоторыми микроорганизмами и служит для них фактором роста. Липоиламид является коферментом дигидролипоилтрансацетилазы и дигидролипоилдегидрогеназы, обнаруживается в пируватдегидрогеназном и α-кетоглутарат-дегидрогеназном комплексах ферментов (метаболонах), осуществляющих окислительное декарбоксилирование пирувата и α-кетоглутарата. Липоевая кислота содержится во многих продуктах животного и растительного происхождения, и недостаток ее обычно не выявляется. Как сильный восстановитель липоевая кислота снижает потребность в токоферолах и аскорбиновой кислоте, так как она предотвращает их быстрое окисление. Оротовая кислота в достаточном количестве содержится в молоке, способна образовываться в организме человека, необходима для образования уридинфосфата и синтеза РНК и гликогена. Отклонения, связанные с дефицитом оротовой кислоты не описаны. Используется в качестве лекарственного препарата при нарушениях производства белков. Пангамовая кислота широко распространена и в достаточном количестве имеется в продуктах питания. Участвует в процессах переметилирования как донор метильных групп, активирует окислительновостановительные реакции, способствует производству макроэргических соединений, обезвреживанию токсинов, повышает устойчивость к гипоксии. Применяется в качестве лекарственного препарата при атеросклерозах, кислородном голодании. Пара-аминобензойная кислота (ПАБК) содержится в дрожжах, печени, семенах растений. Для человека не является витамином, так как синтезируется в клетках. Однако для многих микроорганизмов служит фактором роста, необходимым для образования тетрагидрофолиевой кислоты. Применение сульфаниламидов связано с их способностью включаться вместо ПАБК в структуру фолиевой кислоты и блокировать синтез ДНК. Поэтому длительное применение сульфаниламидов ведет к анемии и малокровию за счет снижения скорости образования клеток крови. Убихинон (Q) синтезируется в клетках на основе мевалоновой кислоты и продуктов метаболизма фенилаланина и тирозина. Недостаточность у человека не описана, но может возникать повышение потребности в убихиноне при мышечной дистрофии, некоторых заболеваниях миокарда и анемиях. Основная функция – акцептирование электронов и протонов в процессе дыхания. Метилметионилсульфоний содержится в овощах, особенно в капусте. Разрушается при термической обработке. Активный донор метильных групп, близкий по свойствам к метионину, производным которого и явля138 ется. Отнесен к липотропным факторам, применяется в лечении жирового перерождения печени. Обладает антигистаминными свойствами и служит противоязвенным фактором (гистамин стимулирует желудочную секрецию). Эссенциальные жирные кислоты (F) представляют собой незаменимые ненасыщенные жирные кислоты, которые не синтезируются в клетках организма человека. Содержатся в растительных маслах, рыбьем жире. Всасываются так же, как и насыщенные, с участием желчных кислот и транспортируются в составе хиломикронов. Используются в основном для образования фосфолипидов биомембран и для производства биологически активных соединений: простагландинов, простациклинов, тромбоксанов и лейкотриенов. Недостаточность у человека не описана, в клинической практике применяются для профилактики отложений холестерина в стенках сосудов при атеросклерозе и кожных заболеваниях (местно). Антивитамины. К антивитаминам относят вещества, которые затрудняют использование витаминов клеткой путем их разрушения, связывания в неактивные формы, конкуренции с ними. Согласно действию, антивитамины можно разделить на две группы: неспецифические (припятствующие проникновению в клетку, разрушающие, связывающие) и специфические (сходные по химической природе, структуре и конкурирующие с витамином). К первой группе относятся ферменты, разрушающие витаминные соединения (тиаминаза, аскорбиназа и др.), и вещества, образующие с ними комплексы, препятствующие их всасыванию (например, авидин). Антивитамины второй группы действуют в основном как антикоферменты, антиметаболиты. К ним относят следующие соединения. Гидроокситиамин может включаться вместо тиаминдифосфата, снижая активность ТДФ-зависимых ферментов и имитируя недостаточность В1. Дихлоррибофлавин включается в состав флавиновых коферментов, ингибируя флавинзависимые ферменты, нарушает процессы дыхания, активации нейтрофилов, цикл Кребса. Проявляется как гиповитаминоз по рибофлавину. Оба соединения получены методом органического синтеза и используются для получения экспериментальных гиповитаминозов. Возможна угроза загрязнения ими окружающей среды и попадания в продукты питания человека. Изониазид конкурирует с адениловой кислотой при включении в НАД, НАДФ, ФАД. Нарушает многие процессы биологического окисления. Используется при лечении туберкулеза. Опасно попадание соединения в окружающую среду, так как оно обладает выраженным цитолитическим действием. 139 Гомопантотеновая кислота заменяет пантотеновую кислоту при образовании коэнзима А. Приводит к нарушению всех процессов, идущих с участием КоА: синтез ацетил-КоА, окисление и образование жирных кислот, цикл Кребса. Используется для получения экспериментальных гиповитаминозов, возможно попадание гомопантотеновой кислоты в окружающую среду. Птеридин образуется из гуанина, служит для синтеза пигментов окраски крыльев и глаз у насекомых и кожи у амфибий. Птеридины играют роль защитных светофильтров в глазах насекомых, некоторые из них могут функционировать в качестве рецепторов света. Включается в восстановленные формы фолиевой кислоты, в печени участвует в гидроксилировании ароматических аминокислот. На основе птеридина синтезированы противораковые препараты: аминоптерин и аметоптерин (метотрексат), оба ингибируют дигидрофолатредуктазу, фермент, восстанавливающий дигидрофолаты в тетрагидрофолаты, как конкурентные ингибиторы. Ингибирующее воздействие оказывают на все быстро размножающиеся клетки, обладают цитостатическим действием. Сульфаниламиды могут включаться вместо ПАБК в фолаты, блокируя фолат-зависимые ферментативные реакции. Применяются при лечении инфекционных заболеваний, вызываемых ПАБК-зависимыми микроорганизмами. Блокируют реакции, катализируемые тетрагидрофолатзависимыми ферментами, ингибируют образование нуклеотидов и репликацию ДНК, приводят к развитию фолиеводефицитной анемии. Нарушения гормонального статуса и рецепции. Одним из основных свойств живых систем является способность к саморегуляции. Для высших организмов существует единая нейроэндокринноиммунная регуляция поддержания гомеостаза и процессов жизнедеятельности, где нейрорегуляция играет ведущую роль, эндокринная и иммунная ей иерархично подчинены. К особенностям эндокринной регуляции относятся беспороговый принцип реагирования, большое разнообразие эффектов, вызываемых гормонами. Согласно современной классификации биологически активных соединений, гормонами принято считать вещества, синтезируемые и секретируемые специальными клетками желез внутренней или смешанной секреции, некоторых органов (печень, почки и др.), поступающие в кровь и оказывающие генерализованное (эндокринное) действие на обмен веществ и физиологические функции организма. Биологически активные соединения, секретируемые многими неспециализированными клетками и поступающие преимущественно в межклеточную среду, действующие паракринно (на соседние клетки), относят к медиаторам. Вещества, регулирующие иммунные реакции, классифицируют как цитокины. Хотя подобная классификация весьма несовершенна, так как многие регуляторные соединения могут действовать и эндокринно, и паракринно, и даже аутокринно. На140 пример, гистамин служит как медиатором, так и гормоном. Аналогично ведут себя и адреналин, норадреналин, серотонин. Все группы перечисленных соединений объединяет то, что они являются информационными молекулами, воздействующими на клетку извне, то есть служат первичными посредниками между клеткой-мишенью и организмом. Действие их обеспечивается наличием на клетках-мишенях специфических рецепторов белковой природы, локализованных либо в мембране (мембранный тип рецепции), либо в цитоплазме и ядре (ядерный тип рецепции). Образование гормон-рецепторного комплекса приводит к каскадной активации механизмов, что сопровождается либо изменением активности имеющихся в клетке ферментов и/или проницаемости мембраны для ряда соединений (быстрый эффект), либо изменением содержания тех или иных ферментов (медленный эффект). Химическая природа биологически активных соединений регуляторного типа (гормонов, медиаторов, цитокинов) различна: это могут быть пептиды и белки; производные аминокислот, стероидные и жирнокислотные производные. Функциональная активность клеток, выражающаяся в интенсивности процессов биосинтеза и секреции информационных соединений, может значительно варьировать при различных состояниях данного организма. Она находится в зависимости от возраста, пола, времени дня, сезона, внешних и внутренних влияний на организм, передающихся через специальные системы. Оценка функционального состояния желез внутренней секреции – одна из важнейших задач теоретической и практической эндокринологии, в частности, клинической. Это определяется особой важностью систем регуляции для поддержания гомеостаза, а значит и нормального функционирования организма. Один из наиболее распространенных способов количественной оценки секреторной активности эндокринных желез у человека – определение концентрации гормонов в периферической крови. Этот способ оценки непрямой, так как отражает не только работу желез, но и степень связывания гормонов с белками крови, интенсивность гормонального метаболизма и экскреции. Кроме того, метод не учитывает регулирующего воздействия на эндокринные железы со стороны нервной системы (гипоталамус-гипофизарная регуляция) и регуляцию по механизму обратной связи ( ингибирующее действие избытка гормонов на собственную секрецию). Наряду с определением концентрации гормонов в крови в состоянии покоя существенное значение имеет измерение функциональных резервов железы, проводимое с применением функциональных проб. Так, для изучения функциональных резервов коры надпочечников проводят пробу с введением АКТГ, инсулярного аппарата – с введением глюкозы и п.т. Среди методов определения содержания гормонов в крови (биологических, флуориметрических, радиоизотопных) наибольшее внимание при141 влекают методы сатурационного или конкурентного белковосвязывающего анализа. В основе этих методов лежит вытеснение определяемым эндогенным гормоном меченного тритием (Н3) или радиоактивным йодом (I125) того же гормона из комплекса со специфическим связывающим его белком (иммунным, транспортным, рецепторным). Чем больше эндогенного гормона содержится в исследуемой пробе плазмы, тем большее количество метки он вытеняет из комплекса с белком. Методы сатурационного анализа, и особенно радио-иммунологические методы, в которых применяются в качестве связывающих белков антитела к гормону, обладают высокими специфичностью и чувствительностью. Другой достаточно адекватный, хотя также непрямой способ количественной оценки секреторной активности эндокринных желез, – измерение суточной экскреции с мочой гормонов или их специфических метаболитов. В случае нормальной работы печени и почек величины экскреции гормональных соединений могут пропорционально отражать интенсивность секреторных процессов в соответствующих железах. Гормоны циркулируют в крови в нескольких физико-химических формах: в свободном виде, в форме комплексов со специфическими белками плазмы, в форме неспецифических комплексов с плазменными белками, в форме комплексов с клетками крови. Все формы находятся в динамическом равновесии друг с другом, причем в состоянии покоя это равновесие сдвинуто в сторону комплексов со специфическими транспортными белками. Концентрация этой формы составляет 80% от суммарной концентрации данного гормона в крови. Комплексование гормонов с белками представляет собой спонтанный, обратимый и неферментативный процесс. К специфическим белкам, транспортирующим гормоны, относят транскортин, эстроген- и тестостерон-связывающие глобулины, тироксинсвязывающие глобулины и преальбумины. Неспецифически связывают гормоны трансферрин, трипсин, сывороточный альбумин, α1-кислый гликопротеин. Эритроциты, лимфоциты и моноциты активно связывают катехоламины, глюкокортикоиды, инсулин, кальцитонин и другие гормоны. Специфически связывающие протеины значительно тормозят метаболизм гормонов, увеличивают длительность их активного пребывания в крови и подавляют выведение гормонов из организма. Поэтому некоторые формы патологий эндокринных функций могут быть первично обусловлены нарушениями в связывании гормонов специфическими транспортными белками. Гиперкортицизм – избыток свободных глюкокортикоидов – является следствием пониженной концентрации транскортина. Есть форма сахарного диабета, обусловленная избыточным связыванием инсулина с транспортным белком. Большинство гормонов и их метаболитов удаляется из организма почти полностью через 48-72 часа, причем 80-90% попавшего в кровь гормона выводится уже в первые сутки. Исключение составляют тиреоидные гор142 моны, аккумулируемые в организме в течение ряда суток, главным образом в форме тироксина. В поддержании физиологического уровня гормонов в крови участвует целый ряд механизмов гомеостаза, причем нередко с участием посредника в виде гормонов тех или иных желез. Наиболее общим является механизм регуляции, основанный на отрицательной обратной связи. В особенности это свойственно системе гипоталамус-гипофиз-железа-мишень. В данном случае секреция рилизинг-фактора гипоталамусом, приводящая к выделению тропного гормона аденогипофизом и стимуляцией им секреции гормона железой-мишенью, ингибируется избытком последнего. Кроме того, блокировать секрецию рилизинг-фактора может и избыток тропного гормона гипофиза (короткая петля обратной связи). В других случаях отрицательная обратная связь осуществляется с помощью отдельных метаболитов или субстратов, концентрация которых в плазме крови меняется при воздействии гормона на ткань-мишень. Например, увеличение концентрации глюкозы сопровождается повышением секреции инсулина за счет стимуляции этого процесса гипоталамусом, воспринимающим изменение концентрации глюкозы в крови. Сигнал устремляется к поджелудочной железе по нервным путям, поэтому уровень глюкозы быстро возвращается к норме, и секреция инсулина снижается. При некоторых патологических состояниях ответная реакция инсулина может быть избыточной, и это приводит к гипогликемии. Физиологическим ответом на это угрожающее состояние служит выброс катехоламинов (также по сигналу гипоталамуса), глюкагона, АКТГ, что повышает уровень глюкозы в крови. Регуляция уровня гормонов может осуществляться и по механизму положительной обратной связи. Так, эстрогены и прогестерон способствуют выбросу лютеинизирующего гормона, стимулирующего овуляцию, формирование желтого тела и увеличивающего продукцию прогестерона желтым телом. При нарушении механизмов регуляции, обусловленных прерыванием “нормальных” обратных связей, возникают эндокринные и метаболические заболевания. Так как биологический эффект гормонов начинается с их связывания со специфическими рецепторами, то количество рецепторных молекул, экспрессированных на клетке-мишени, находится в динамическом постоянстве. Общее их число в отсутствии гормона обусловлено генетически и связано с природой клетки-мишени, скоростью экспрессии рецепторов и временем их обновления. Количество рецепторных молекул значительно снижается при формировании гормон-рецепторного комплекса, что делает данную клетку временно нечувствительной к повышающейся дозе сигнальной молекулы (лиганда) или агониста (соединение, схожее по химической природе с лигандом, способное активировать проведение сигнала, но обладающее меньшим сродством к рецептору). После терминации гормо143 нального цикла количество активных рецепторов к гормону у клеткимишени постепенно восстанавливается до прежнего уровня. В данном случае лиганды и их агонисты осуществляют понижающую регуляцию по отношению к собственным рецепторам. Некоторые гормоны (ангиотензин II, пролактин) осуществляют повышающую регуляцию своих рецепторов, ускоряя процесс их эксперессии и рециклизации. В настоящее время установлено, что в основе многих форм эндокринных заболеваний лежит не нарушение функций эндокринных желез, а нарушение чувствительности клеток-мишеней к информационным молекулам. Первая группа заболеваний, связанных с этим нарушением, может быть отнесена к патологиям иммунной системы, так как в их основе лежит образование антител против рецепторов определенных гормонов. Некоторые формы таких патологических состояний обусловлены нарушением регуляции экспрессии, поломкой синтеза, дефектом рецепторного белка. Поломки также могут быть связаны с дефектом звеньев каскадного механизма реализации гормонального сигнала в клетке-мишени. Подобные заболевания получили названия “болезни рецепции”. Тщательное изучение и коррекция данных болезней – задача будущего. Пока можно привести лишь некоторые примеры обнаруженных и изученных на настоящий момент “болезней рецепции”. Сюда относят болезнь Грейвса – гипертиреоидизм, связанный с формированием антител, стимулирующих рецептор тиреотропного гормона. Астма обусловлена выработкой антител, блокирующих связывание β-адренергических агентов с рецептором. Синдром тестикулярной феминизации – генетически обусловленное заболевание, проявляющееся в форме врожденного мужского псевдо-гермофродитизма (геном мужской, фенотип женский). Заболевание связано со снижением или полным отсутствием рецепторов к андрогенам (тестостерону) на клетках-мишенях. Нормальные семенники продуцируют нормальное количество андрогенов, но они не воспринимаются клетками-мишенями из-за отсутствия рецепторов. Производимые же в небольшом количестве эстрогены воспринимаются, так как рецепторы к ним имеются. Это приводит к формированию вторичных половых признаков женского фенотипа при наличии первичных половых признаков мужского. Ожирение – сопряжено с инсулинрезистентностью инсулинзависимых клеток вследствие понижающей регуляции рецепторов к инсулину. Ведет также к развитию инсулиннезависимой формы сахарного диабета. Изучение раковых заболеваний позволяет сделать вывод о значительных поломках рецепторного аппарата ряда клеток, претерпевающих трансформацию в злокачественные. При определенных формах гепатом, лимфоидных лейкозах, карциноме молочной железы наблюдается снижение экспрессии рецепторов ряда гормонов на клетках опухоли, а также на других клетках-мишенях. 144 Эндокринные заболевания могут быть также следствием гипер- или гипосекреции гормонов по разным причинам, нарушения их транспорта, метаболизма, соотношения. На практике многие эндокринные заболевания диагностируются без прямого определения концентрации гормонов, по тем изменениям в обмене веществ, которые являются результатом нарушения гормонального статуса организма. Например, диагностика наличия сахарного диабета осуществляется на основе повышения уровня глюкозы в крови и патологического гликемического профиля (нагрузка глюкозой). Гипертиреоидизм – по увеличению показателя интенсивности основного обмена. Гипоталамо-гипофизарные нарушения обмена веществ и других функций организма. В гипоталамических ядрах в области срединного возвышения в ответ на нервные или гуморальные воздействия секретируются и по специальной вене транспортируются в аденогипофиз биологически активные пептиды, получившие название рилизинг-факторы. В зависимости от действия (активирующее или ингибирующее секрецию аденогипофизарных гормонов) они делятся на либерины и статины. К ним относятся: кортиколиберин регулирует секрецию АКТГ; тиролиберин – ТТГ; люлиберин – лютеинизирующего гормона; фоллиберин – фолликулостимулирующего гормона; соматолиберин (статин) – соматотропина; пролактолиберин (статин) – пролактина; меланолиберин (статин) – меланоцитостимулирующего гормона. В аденогипофизе образуются тропные гормоны, контролирующие функции некоторых желез внутренней секреции. Тиреотропный гормон (ТТГ) – гликопротеид, состоящий из двух субъединиц, активирует продукцию гормонов щитовидной железы за счет ускорения поглощения йода из крови клетками железы и включения его в тиреоглобулин; а также убыстряет протеолиз тиреоглобулина и высвобождение тиреоидных гормонов. Мишенью гормона являются еще и клетки жировой ткани, где происходит активация липолиза. Эффект тиреотропного гормона реализуется через мембранный тип рецепции и вторичный посредник – цАМФ. Угнетение секреции ТТГ вызывается избытком тиреодных гормонов по принципу отрицательной обратной связи и соматостатином, дофамином, катехоламинами. В норме концентрация ТТГ в плазме составляет 0,1-0,4 мЕ/л. Возрастает секреция ТТГ под действием тиролиберина, выделение которого тоже тормозят гормоны щитовидной железы. При первичном гипотиреозе продукция ТТГ увеличена, при гипертиреозе – снижена. Недостаточность ТТГ может привести к развитию вторичного гипотиреоза, но гипертиреоз вследствие ТТГ-секретирующей опухоли – явление редкое. Соматотропный гормон (СТГ) – полипептид, включающий 191 аминокислотный остаток. Действует обычно опосредованно через стимуляцию синтеза в печени инсулинподобного фактора роста-1 (ИФР-1), известного также под названием соматомедин-С. Секреция соматотропина регулируется сомато145 либерином и соматостатином. Кроме того, в гипофизе соматомедин-С осуществляет отрицательную обратную связь, модулируя эффекты соматолиберина, а в гипоталамусе вместе с самим соматотропином он стимулирует выделение соматостатина. Соматостатин – гипоталамический олигопептид (14 аминокислотных остатков) выполняет разнообразные функции как в системе гипоталамусгипофиз, так и в других системах организма. Он тормозит кроме секреции СТГ выделение ТТГ, в кишечнике и островках поджелудочной железы ингибирует секрецию гастрина, инсулина и глюкагона. Описаны редко встречающиеся соматостатинсекретирующие опухоли поджелудочной железы, щитовидной железы и карциномы легких. Аналоги соматостатина используются для остановки кровотечения из верхних отделов желудочнокишечного тракта, ингибирования секреции самого гормона опухолями и лечения акромегалии. Концентрация СТГ в крови колеблется очень сильно в течение суток, часто ее не удается определить. Физиологическая секреция происходит в форме спорадических выбросов, длящихся 1-2 часа, преимущественно во время сна. Пиковые концентрации могут достигать 40 мЕ/л, секреция стимулируется стрессовыми ситуациями, физическими нагрузками, гипогликемией, голоданием, потреблением определенных аминокислот. Секреция тормозится гипергликемией. При избыточном производстве СТГ вследствие опухоли гипофиза развивается гигантизм у детей и акромегалия у взрослых (разрастание лицевых костей черепа, стоп, кистей). Недостаточность синтеза СТГ у детей сопровождается задержкой роста – карликовость, у взрослых проходит бессимптомно. Пролактин – полипептид, состоящий из 198 аминокислот, основное физиологическое действие – инициирование и поддержание лактации. Секреция пролактина регулируется путем высвобождения дофамина, который ингибирует ее. Повышенная секреция пролактина наблюдается в пролактинсекретирующих опухолях и опухолях гипофиза, которые нарушают кровоток от гипоталамуса и препятствуют дофаминзависимому торможению секреции пролактина. Секреция пролактина носит периодический характер, усиливаясь во время сна и при стрессе, у женщин зависит от эстрогенного статуса. Нормальные концентрации составляют около 400 мЕ/л, однако нижняя граница нормы не определена. Секреция пролактина возрастает во время беременности и начинает снижаться обычно через 3 месяца после родов, даже если женщина продолжает грудное вскармливание. Дефицит пролактина – редкое нарушение, но если и встречается, например. при инфаркте гипофиза, то единственное его проявление – отсутствие лактации. Гиперпролактинемия может быть следствием как физиологических причин: стресса, беременности, кормления грудью, так и действия лекарственных препаратов: блокаторов дофаминергических рецепторов, резерпин, эстрогены, ТТГ. Увеличение производства пролактина может быть следствием повреждения ги146 пофиза: пролактинсекретирующая опухоль (пролактинома); опухоль, блокирующая поступление дофамина в аденогипофиз; перерезка воронки гипоталамуса. Гиперпролактинемия является довольно распространенным эндокринным нарушением. Она рассматривается как важная причина бесплодия как у мужчин, так и у женщин. Эти эффекты, вероятно, обусловлены ингибированием пролактином периодического выделения гонадотропинрилизинг-факторов. Фолликулостимулирующий гормон (ФСГ) и лютеинизирующий гормон (ЛГ) – гликопротеины с М. около 30 кДа, они состоят из двух субъединиц: консервативной альфа и вариабельной бета-субъединицы. Стимулируется секреция этих тропных гормонов рилизинг-факторами гипоталамуса: люлиберином и фоллилиберином. Рилизинг-факторы секретируются эпизодически, что сопровождается волнообразным изменением концентрации гонадотропных гормонов в плазме. У мужчин ЛГ стимулирует синтез тестостерона клетками Лейдига. Тестостерон и эстрадиол, образованные в клетках Лейдига, блокируют по механизму обратной связи действие гонадотропинрилизинг-факторов на секрецию ЛГ. ФСГ совместно с тестостероном, присутствующим в семенниках в высокой концентрации, стимулирует сперматогенез. Секреция ФСГ тормозится ингибином – гормоном, образующимся в процессе сперматогенеза. В женском организме взаимодействие гормонов имеет более сложный характер. Секреция эстрагенов (прежде всего эстрадиола) яичниками стимулируется ФСГ в первую половину менструального цикла, что сопровождается созреванием фолликула. По мере увеличения концентрации эстрадиола по механизму отрицательной обратной связи уменьшается секреция ФСГ, а по механизму положительной обратной связи растет концентрация в крови ЛГ, который вызывает овуляцию и развитие желтого тела, продуцирующего прогестерон, угнетающего выделение ФСГ. Если не произойдет оплодотворения, то желтое тело деградирует, и концентрация прогестерона снижается, уровень эстрадиола также падает, что приводит к повышению уровня ФСГ. Цикл запускается вновь. В случае оплодотворения желтое тело превращается в желтое тело беременности, обеспечивающее постоянно высокий уровень прогестерона, эстрогенов и ЛГ. Цикличный характер процесса на время беременности исчезает. До периода полового созревания концентрации ЛГ и ФСГ в плазме очень низкие, при приближении полового созревания секреция ФСГ возрастает раньше, чем секреция ЛГ. Повышенные концентрации гонадотропинов выявляются у женщин при недостаточности яичников, обусловленной болезнью, или после менопаузы. Адренокортикотропный гормон (АКТГ) – одноцепочечный полипептид, состоящий из 39 аминокислотных остатков. Физиологическая функция АКТГ заключается в стимуляции секреции глюкокортикоидов корой надпочечников. АКТГ – это фрагмент более крупного предшественника – проопиомеланокортина, который является также предшественником 147 эндогенных опиоидных пептидов (эндорфинов) и β-липотропина. Механизмы регуляции высвобождения последних так до конца и не изучены, а секреция АКТГ находится под контролем кортикотропинрилизингфактора гипоталамуса. Выделение АКТГ происходит периодически с суточными колебаниями: максимальная концентрация гормона отмечается около 8 часов утра, минимальная – в полночь. Секреция АКТГ значительно возрастает при стрессе и тормозится кортизолом по обратной отрицательной связи. При стрессе, особенно хроническом, циркадные колебания и механизмы обратной отрицательной связи подавляются. Концентрация АКТГ в плазме в норме составляет 10-80 пг/мл. Повышенная секреция АКТГ гипофизом наблюдается при опухолях гипофиза (болезнь Кушинга) и при первичной недостаточности надпочечников (болезнь Аддисона). Гормон может выделяться и эктопически негипофизарными опухолями. Избыточная продукция АКТГ сопровождается гиперпигментацией, обусловленной мелано-стимулирующим действием гормона. Чаще всего недостаточная продукция АКТГ является проявлением общей недостаточности гипофиза, как самостоятельный феномен это встречается реже. Гипопитуитаризм – следствие поражения передней доли гипофиза или гипоталамуса. Наиболее частой причиной его развития становятся опухоли гипофиза. Когда опухоли секретирующие, обнаруживаются клинические признаки избыточной продукции гормонов передней доли гипофиза. Если нарушается секреция – развивается недостаточность аденогипофиза. Частичный гипопитуитаризм наблюдается чаще, чем полная утрата функций аденогипофиза. Проявления этого состояния зависят от ряда факторов, среди которых наиважнейшим становится возраст. Уменьшение секреции соматропина (СТГ) для детей может иметь катастрофические последствия, тогда как у взрослых сильных клинических проявлений не наблюдается. В целом секреция СТГ и гонадотропных гормонов (ГТГ) нарушается раньше, чем выделение АКТГ, а проявление гипотиреодизма не характерно. Избирательный дефицит гормонов передней доли гипофиза, как правило, врожденный. В большинстве случаев он обусловлен нарушением выработки соответствующего рилизинг-фактора гипоталамусом. При подозрении на гипофункцию гипофиза проводят тесты со стимуляцией для выявления способности железы вырабатывать гормоны введением рилизинг-факторов. Опухоли гипофиза бывают деструктивными (до 30%), а чаще являются функциональными и обусловливают избыточную секрецию гормонов. Частота встречаемости избыточности тропных гормонов гипофиза распределяется следующим образом: пролактин (чаще всего) >СТГ>АКТГ>ГТГ>ТТГ (очень редко). Акромегалия и гигантизм в 95% случаев являются следствием гиперсекреции СТГ опухолью гипофиза. Это приводит к усиленному росту мягких тканей и костей. Если процесс происходит до сращивания эпифизов длинных костей, развивается гигантизм. 148 Гормоны задней доли гипофиза – вазопрессин и окситоцин – синтезируются в гипоталамусе, по аксонам нейронов передаются в нейрогипофиз и оттуда поступают в кровоток. Окситоцин участвует в регуляции сократимости матки и продукции молока в лактирующей молочной железе. Нарушения его секреции достаточно редки и не имеют большого клинического значения. Напротив – вазопрессин – жизненно важный гормон, нарушения секреции которого хорошо известны. Основная физиологическая функция вазопрессина – усиление всасывания воды в эпителии почечных канальцев, опосредованная регуляция натриевого баланса. При снижении секреции вазопрессина наблюдается развитие несахарного диабета – нерегулируемая экскреция воды из организма, следствием которой является дегидратация. Несахарный диабет чаще всего вызван заболеваниями гипоталамуса и гипофиза и реже может быть следствием неспособности почек реагировать на гормон (нарушение рецепции на эпителии почек). В случае поломки рецепции уровень вазопрессина выше нормы. Дефицит вазопрессина вызывает постоянное чувство жажды и полиурию. Избыточная секреция вазопрессина приводит к задержке воды и дилюционной гипонатриемии. Гормоны надпочечников. Надпочечники состоят из двух функционально и структурно различных частей: коры и мозгового слоя. Кора надпочечников является жизненно важной и служит для выработки стероидных гормонов: глюкокортикоидов, минералокортикоиды и андрогены. Мозговое вещество является функциональным отделом симпатической нервной системы, и его роль в патологии связана в основном с возникновением редких катехоламинсекретирующих опухолей. Глюкокортикоиды. Основным из них является кортизол, секреция регулируется АКТГ и соответствующим рилизинг-фактором. Кортизол влияет на выработку АКТГ по механизму отрицательной обратной связи. Глюкокортикоиды относятся к гормонам, регулирующим углеводный и белковый обмен. Действуют через ядерный тип рецепции и стимулируют экспрессию ферментов глюконеогенеза, катаболизма аминокислот. Играют важную роль в адаптации к хроническому стрессу, служат иммунодепрессантами, подавляющими избыточную воспалительную реакцию. Большая часть кортизола ( около 95%) в плазме крови находится в связанном состоянии с кортизолсвязывающим глобулином – транскортином. При нормальных концентрациях гормона свободной формы очень мало и, соответственно, экскреция с мочой незначительна. Увеличение секреции сопровождается повышением выведения кортизола с мочой. Поэтому 24-часовое измерение экскреции кортизола является чувствительным тестом определения повышенной секреции гормона. Концентрации кортизола подвержены суточным колебаниям, причем самые высокие концентрации наблюдаются утром, а самые низкие – в ночное время. Секреция кортизола, опосредованная АКТГ, усиливается под воздействием стресса. Альдостерон 149 является наиболее важным минералокортикоидом человека. Он секретируется под влиянием ангиотензина II, продуцируемого в свою очередь из ангиотензина I при активации ренин-ангиотензиновой системы. Выброс ренина юкстагломерулярными клетками почек обусловлен уменьшением почечного кровотока и другими признаками уменьшения объема внеклеточной жидкости (гипотензия, снижение концентрации натрия). Секреция альдостерона стимулируется также непосредственно гиперкалиемией. Основное физиологическое действие альдостерона заключается в усилении реабсорбции натрия в дистальных извитых канальцах почек, который обменивается на ионы калия и водорода. Реализация сигнала идет через ядерную рецепцию и усиление экспрессии транспортных мембранных белков. АКТГ не столь физиологически значим для выделения альдостерона, как для глюкокортикоидов. Концентрация альдостерона в плазме варьируется в зависимости от положения тела человека. В горизонтальном положении она выше, чем в вертикальном. Андрогены, вырабатываемые корой надпочечников, служат для формирования вторичных половых признаков у детей до полового созревания. Здесь синтезируются дегидроэпиандростерон и дегидроэпиандростерон-сульфат. Клинические проявления избытка надпочечниковых андрогенов могут быть значительно выражены у женщин, страдающих нарушениями функции надпочечников и являются причиной вирилизации (появления волосатости лица). В настоящее время разработаны высокочувствительные методы иммунологического анализа стероидных гормонов коры надпочечников, которые вытеснили устаревшие флуориметрические и колориметрические методы определения. Наиболее часто используются методы определения содержания гормонов в плазме, но так как они подвержены флуктуациям по ряду причин, интерпретация этих данных должна проводиться с их учетом. Заболевания коры надпочечников могут проявляться симптомами как гипо-, так и гиперфункции. При врожденной гиперплазии надпочечников может наблюдаться комбинация симптомов. Гипофункция коры надпочечников получила название болезнь Аддисона. Причинами развития недостаточности коры надпочечников могут стать: лечение кортикоидами; аутоиммунное воспаление надпочечников, туберкулез, вторичные метастазы опухоли, амилоидоз, кровоизлияние в надпочечники, адреналэктомия и др. Раньше среди причин превальировал туберкулез, в настоящее время – аутоиммунные нарушения. Но наиболее часто причиной становится супрессия гипофизарно-адреналовой системы глюкокортикоидами, назначаемыми с терапевтической целью. Нормальная гипофизарно-адреналовая функция восстанавливается при отмене стероидных гормонов очень медленно, поэтому их отмена должна идти постепенно. Клинически недостаточность коры проявляется общей утомляемостью, слабостью, сонливостью, снижением массы тела, тошнотой, рвотой, головокружениями, гипотензией. Усиленная пигментация обусловлена высокой концентрацией АКТГ, кото150 рый оказывает меланоцит-стимулирующее действие. Повышение концентрации АКТГ возникает из-за отсутствия обратной отрицательной регуляции кортизолом. Надпочечниковая недостаточность обычно развивается постепенно, реже может возникнуть остро и требовать неотложной медицинской помощи. Надпочечниковый криз провоцируется стрессом, тяжелой инфекцией, травмой или операцией. Кровоизлияние в надпочечники развивается как осложнение антикоагуляционной терапии и при менингококковой септицемии и может привести к острой надпочечниковой недостаточности. Гиперфункция коры надпочечников, синдром Кушинга, является гипофизарнозависимой. Клинические проявления обусловлены в основном избытком кортизола, но и сам кортизол и его предшественники обладают некоторой минералокортикоидной активностью. Поэтому наблюдаются задержка натрия, гипертензия, гипокалеимический алкалоз. Следует подчеркнуть, что синтетические аналоги глюкокортикоидов не являются агонистами минералокортикоидов. В случае лекарственной формы синдрома Кушинга симптомы, связанные с избыточной минералокортикоидной активностью, не наблюдаются. Псевдосиндром Кушинга может возникать у алкоголиков и при тяжелой депрессии. Синдром Конна – избыточная секреция альдостерона (альдостеронизм) обычно обусловлен аденомой надпочечников, диффузной гипертрофией клеток клубочковой зоны, вырабатывающих альдостерон. В редких случаях заболевание является наследственным (доминантно-аутосомный тип), при котором синтез альдостерона регулируется АКТГ. Основное клиническое проявление – гипокалиемия – следствие повышенного выведения калия почками и гипертензия, обусловленная задержкой натрия. Высокие концентрации альдостерона наблюдаются также у пациентов с повышенной активностью ренин-ангиотензиновой системы. Это вторичный альдостеронизм, который встречается гораздо чаще, чем первичный (синдром Конна). Он связан с застойной сердечной недостаточностью, циррозом печени, нефротическим синдромом, опухолями, секретирующими ренин и др. Врожденная гиперплазия надпочечников (ВГН) охватывает целую группу наследственных метаболических нарушений процессов биосинтеза стероидных гормонов коры надпочечников. Примерно 95% всех случаев ВГН обусловлены дефицитом 21-гидроксилазы. Большая часть из оставшихся 5% приходится на дефицит 11β-гидроксилазы. Недостаточность 21-гидроксилазы обычно неполная, и нормальный синтез кортизола поддерживается за счет увеличения секреции АКТГ. Это вызывает гиперплазию надпочечников, накапливающийся из-за недостатка фермента его субстрат - 17α-гидроксипрогестерон – превращается в андрогены, что у девочек сопровождается аменореей и бесплодием, а у мальчиков более ранним половым созреванием. При полном отсутствии фермента вскоре после рождения развивается угрожающее жизни состояние потери солей, так как 151 невозможно поддержание нормального гомеостаза при недостатке кортизола и альдостерона. Частичный дефицит 11β-гидроксилазы также более распространен, чем его полное отсутствие. Он характеризуется гипертензией, обусловленной накоплением 11-дезоксикортикостерона, субстрата 11β-гидроксилазы, обладающего достаточно выраженным альдостероновым эффектом (задержка солей). Наблюдаются также избыточная выработка андрогенов и с вышеописанными последствиями. Другие формы ВГН, например дефицит 17-гидроксилазы, 18-гидроксилазы (нарушение секреции только альдостерона) и стероидной 3β-гидроксидегидрогеназы, ∆5-изомеразы, встречаются очень редко. Последствия подобных дефицитов можно предположить из схемы синтеза стероидных гормонов в коре надпочечников (рис. 2.4). Холестерин 17α-Гидроксилаза Прегненолон 17α-Гидроксипрегненолон 3β-Гидроксидегидрогеназа ∆5-изомераза 17α-Гидроксипрогестерон Прогестерон Дигидроэпиандростерон 17α-гидроксилаза 21-гидроксилаза 11-Дезоксикортикостерон 11-Дезоксикортизол Андростендион 11β-гидроксилаза Кортикостерон Кортизол Тестостерон 18-гидроксилаза 18-Гидроксикортикостерон Альдостерон Рис.2.4. Биосинтез надпочечниковых стероидных гормонов. Кортизол и андрогены синтезируются в ретикулярной (сетчатой) и фасцикулярной (пучковой) зонах коры, альдостерон – в гломерулярной зоне (клубочковой) [10] Заболевания мозгового слоя надпочечников. Основной патологией мозгового вещества надпочечников являются опухоли – феохромоцитомы. Опухоли секретируют катехоламины, становятся причиной гипертензии, приливов, потливости, тремора. При постановке диагноза важно исключить все другие болезни, при которых развиваются те же симптомы. Диагноз основывается на определении катехоламинов в плазме и моче. Заболевание встречается редко. В настоящее время не описаны симптомы, которые возникали бы при понижении функции мозговой ткани надпочечников. 152 Гормоны щитовидной железы. Щитовидная железа секретирует три гормона: тироксин, трийодтиронин (тиреоидные гормоны) и кальцитонин. Первые два являются йодированными производными тирозина, а кальцитонин – полипептид. Тироксин и трийодтиронин вырабатывается фолликулярными клетками, а кальцитонин С-клетками. Нарушения секреции йодированных производных тирозина встречаются довольно часто, тогда как кальцитонина – весьма редко. Тиреоидные гормоны действуют через ядерный тип рецепции и стимулируют экспрессию митохондриальных белков. Поэтому их основное влияние – усиление процессов дыхания, сильный катаболический эффект. Синтез и высвобождение тироксина ускоряются под воздействием тиреотропного гормона гипофиза. Тироксин действует на секрецию тиреотропного гормона по механизму обратной отрицательной связи, а также модулирует ответ гипофиза на тиреотропинрилизингфактор. Глюкокортикоиды, дофамин и соматотропин также подавляют секрецию ТТГ. Физиологическое значение этого явления неизвестно, но оно может стать причиной расстройства секреции гормонов щитовидной железы. Основным гормоном щитовидной железы является тироксин (тетрайодтиронин) (Т4). Трийодтиронина (Т3) вырабатывается в 10 раз меньше, хотя соотношение может возрастать при некоторых заболеваниях щитовидной железы. Активность же Т3 в 3-4 раза превышает активность Т4. Большая часть Т3 образуется в периферических тканях путем дейодирования Т4, процесс особенно активно протекает в клетках печени и почек. При дейодировании Т4 в другом положении йода образуется так называемый обратный Т3 (rT3), который не обладает физиологической активностью. Метаболизм Т4, таким образом, позволяет эффективно регулировать скорость катаболических процессов, то превращая его в более активную форму, то нейтрализуя в неактивную. Кроме стимуляции процессов дыхания, гормоны щитовидной железы увеличивают чувствительность сердечно-сосудистой и нервной системы к катехоламинам. В норме концентрации Т4 и Т3 в плазме крови составляют 60-150 нмоль/л и 1-3 нмоль/л соответственно. Оба гормона связаны с белками плазмы преимущественно (примерно на 99%) с тироксинсвязывающим глобулином. Общепринятым является мнение, что физиологической активностью обладают только свободные формы гормонов. Интенсивное связывание гормонов со специфическим белком создает буфер, который поддерживает на постоянном уровне концентрацию свободных гормонов, если возникает тенденция к ее изменению за счет клубочковой фильтрации и экскреции с мочой. Основной путь разрушения гормонов щитовидной железы – это дейодирование и метаболизм в тканях, но они также могут подвергаться конъюгации в печени и выводиться с желчью. Определение концентрации общего Т4 (оТ4) в плазме используется как тест функции щитовидной железы, но недостатком этого метода является зависимость результатов не только от активности щитовидной железы, но и от 153 концентрации тироксинсвязывающего белка, так как его увеличение способствует более длительной высокой концентрации гормона в плазме. Поэтому в настоящее время для оценки функциональной активности щитовидной железы используют определение содержания только свободных тироксина и трийодтиронина. Поскольку высвобождение ТТГ из гипофиза контролируется посредством механизма отрицательной обратной связи, определение его концентрации в плазме может применяться как показатель функции щитовидной железы. При клинически выраженном гипотиреозе содержание ТТГ возрастает значительно, нередко в десять и более раз превышая нормальные показатели. Однако концентрация ТТГ может увеличиваться и в случаях, не связанных с заболеваниями щитовидной железы (опухоль гипофиза), рекомендуется использование комбинированного теста с определением как содержания ТТГ, так и количества Т4. Метаболические проявления заболеваний щитовидной железы связаны либо с избыточной, либо недостаточной выработкой тиреоидных гормонов (гипер- и гипотиреоз). Клинический синдром, развивающийся при избытке тиреоидов, называется тиреотоксикозом. Причиной этого расстройства может стать болезнь Грейвса – аутоиммунное заболевание, которое характеризуется присутствием в крови тиреоидстимулирующих антител. Данные аутоантитела становятся агонистами ТТГ и, связываясь в его рецепторами на клетках щитовидной железы, активируют секрецию тиреоидов. Другими причинами являются: токсический многоузловой зоб; одиночная токсическая аденома; избыточный прием йодсодержащих препаратов или гормонов щитовидной железы; эктопическая тиреоидная ткань (зоб яичника); функционально активный метастатический рак щитовидной железы; опухоль гипофиза (редко). Клиническими проявлениями гипертиреоза становятся: снижение массы тела; потливость и непереносимость жары; быстрая утомляемость; сердцебиения и мерцательная аритмия; повышенная возбудимость и тремор; генерализованная мышечная слабость; диарея; увеличение основного обмена др. Лабораторная диагностика гипертиреоза основывается на обнаружении высокой концентрации сТ3 и сТ4 в плазме крови при низком содержании ТТГ. Эти же тесты используют для контроля лечения и наблюдения за пациентом. Транзиторный, обнаруживаемый биохимическими методами, но обычно бессимптомный гипертиреоз встречается почти у 5% женщин после беременности. Гипотиреоз может возникнуть первично и вторично в ответ на снижение тропной стимуляции при гипофункции гипофиза или заболевании гипоталамуса. Наиболее частой причиной развития гипотериоза является атрофическая микседема – конечный этап аутоиммунного разрушения щитовидной железы. Клинические проявления разнообразны: сонливость, быстрая утомляемость, увеличение массы тела, более позднее половое созревание, умственная отсталость. Клинический диагноз подтверждается обна154 ружением в плазме крови высокой концентрации ТТГ (если заболевание не обусловлено недостаточностью гипофиза) и низкой – сТ4. Определение концентрации Т3 не имеет диагностического значения при гипотиреозе. Гипотиреоз может быть врожденным, вызванным нарушением гормонального статуса, дефицитом поступающего в организм йода. Тиреоидит – воспаление щитовидной железы – может быть связано с инфекцией (обычно вирусной) или аутоиммунным заболеванием. При вирусном тиреоидите, вызванном вирусами Коксаки, эпидемического паротита и аденовирусом, воспаление приводит к высвобождению образованного ранее коллоида и повышению концентрации гормонов щитовидной железы в крови. Эта фаза продолжается 6 недель, за ней следует период примерно такой же продолжительности, во время которого выброс гормонов щитовидной железы может быть снижен. Затем восстанавливается нормальное содержание тиреоидных гормонов. Тиреоидит Хашимото – аутоиммунное заболевание, является причиной развития гипотиреоза. В крови присутствуют аутоантитела в высоком титре. Заболевание характеризуются аутоиммунным поражением многих органов. Зоб и рак щитовидной железы. Зоб – увеличение щитовидной железы, может возникать у пациентов с гипертиреозом, например, при болезни Грейвса, токсическом многоузловом зобе или аденоме щитовидной железы; а также у больных с гипотиреозом – тиреоидите Хашимото или дефиците йода, при доброкачественных и злокачественных опухолях щитовидной железы. Физиологическое увеличение железы может возникать в подростковом возрасте, не сопровождаясь изменениями функции. При постановке диагноза рака щитовидной железы лабораторные тесты не играют никакой роли, за исключением кальцитонинсекретирующей медуллярной карциномы. Кальцитонин – полипептидный гормон, синтезируемый С-клетками щитовидной железы, подавляющее действует на активность остеокластов, препятствуя вымыванию кальция из костной ткани. Кальцитонин может блокировать действие кальцитриола (гормональное производное кальциферола, образующееся в печени) на костную ткань, приводя к увеличению поступления кальция из кишечника без его потери из кости. Гомеостаз кальция существенно не нарушается при тотальной тиреоэктомии, а также у больных с карциномой щитовидной железы, секретирующей большие количества кальцитонина. Кальцитонин обнаружен во многих других тканях, в частности в кишечнике и ЦНС, где он, по-видимому, выполняет роль трансмиттера. В некоторых тканях мРНК кальцитонина транслируется в пептиды, отличные от данного гормона, функция которых еще до конца не выяснена. Гормон паращитовидных желез – паратгормон – также участвует в обеспечении гомеостаза кальция. Первичный гиперпаратиреидоз может стать причиной гиперкальциемии (увеличения уровня кальция в плазме 155 крови). Причем 90% увеличения количества кальция в крови приходится на гиперпаратиреидоз и злокачественные опухоли с метастазами в кости и без них. Причиной гиперкальциемии при злокачественном росте становится продукция опухолевыми клетками пептидов, сходных по аминокислотной последовательности с паратиреоидным гормоном (паратгормоном). Распространенность первичного гиперпаратиреоза составляет один случай на тысячу человек. Он может развиваться в любом возрасте, поражает как женщин, так и мужчин, однако наиболее часто наблюдается у женщин в постменструальном периоде. Причиной заболевания обычно является аденома околощитовидной железы, реже – диффузная гиперплазия желез, еще реже – карцинома паращитовидной железы. Половые железы. Андрогены. За синтез андрогенов отвечают яички, наиболее важным из них является тестостерон. Другими тестикулярными андрогенами служат андростендион и дегидроэпиандростерон (ДГЭА). Тестостерон представляет собой мощный анаболический гормон, секретируется клетками Лейдига в яичках под влиянием лютеинизирующего гормона. Концентрации тестостерона в плазме крови очень низки до периода полового созревания, но затем быстро растут и достигают нормальных значений, характерных для взрослых мужчин. В пожилом возрасте наблюдается небольшое снижение. В кровяном русле примерно 97% тестостерона связаны с белками, главным образом со специфическим глобулином, и в меньшей степени с альбумином и другими белками. Тканям доступен только свободный тестостерон. Расчет отношения концентраций тестостерон/тестостеронсвязывающий глобулин дает возможность оценить уровень свободного гормона. Биологическая активность обусловлена в основном дигидротестостероном (ДГТ). Последний образуется из тестостерона в клетках-мишенях в редуктазной реакции (5α-редуктаза). Термин гипогонадизм означает нарушение или сперматогенеза, или продукции тестостерона, или обоих этих процессов. Гипогонадизм может быть первичным, обусловленным заболеванием яичек или вторичным, связанным с заболеванием гипофиза или гипоталамуса. Первичный гипогонадизм иногда рассматривается как гипергонадотропный гипогонадизм (нарушение обратной связи, приводящее к увеличению секреции гонадотропина), а вторичный – как гипогонадотропный из-за дисфункции гипофиза или гипоталамуса. Первичный гипогонадизм может быть результатом нарушения функций клеток Лейдига или семенных канальцев, или обеих сразу. Нарушение функций семенных канальцев приводит к бесплодию из-за уменьшения выработки сперматозоидов, но вторичные половые признаки формируются нормально. При нарушениях функции клеток Лейдига страдают все процессы: и сперматогенез и развитие вторичных половых признаков. Секреция гонадотропинов и тестостерона происходит в пульсовом режиме, анализы должны проводиться на нескольких пробах крови, полученных в течение часа. Функцию семенных 156 канальцев можно оценить по анализу семенной жидкости, а у пациентов с низким числом сперматозоидов, если причину не удается установить клинически, полезным методом является биопсия яичка. Гинекомастия – рост молочных желез у мужчин связан с нарушением соотношения эстрогенов и андрогенов. В период полового созревания примерно у 50% мальчиков развивается гинемастия, обусловленная временным относительным увеличением секреции эстрогенов по сравнению с секрецией андрогенов. Легкая гинемастия может возникнуть также в пожилом возрасте в результате снижения секреции тестостерона. Все остальные случаи являются патологическими, их причинами могут стать: повышение концентрации эстрогенов при хронических заболеваниях печени; циррозах; понижение концентрации андрогенов, например, при синдроме Клайнфельтера; отсутствие чувствительности к андрогенам при тестикулярной феминизации; восстановительный период после голодания (повышение секреции ЛГ). Эстрогены. Основной овариальный гормон - 17β-эстрадиол, но яичники вырабатывают также некоторое количество эстрона. Эстрогены секретируются желтым телом и плацентой. Они отвечают за развитие многих женских вторичных половых признаков, стимулируют рост фолликулов и пролиферацию эндометрия матки в первой половине менструального цикла. Концентрации эстрогенов до полового созревания низки, в период полового созревания синтез эстрогенов увеличивается, и до менопаузы содержание их в плазме подвержено циклическим колебаниям (кроме периода беременности). После менопаузы они образуются только при метаболизме надпочечников андрогенов, поэтому концентрация гормонов в плазме снова очень низка. В плазме эстрогены находятся в связанной с белками форме, в свободном состоянии лишь – 2-3%. Эстрогены стимулируют синтез связывающих их глобулинов, а также тироксинсвязывающего глобулина и транскортина, увеличивая концентрацию общего тироксина и кортизола в плазме крови. Эстрадиол в небольшом количестве присутствует в плазме здоровых мужчин, примерно одна треть его синтезируется яичками, остальная образуется при метаболизме андрогенов в печени и жировой ткани. Медленно увеличивающиеся или постоянно высокие концентрации эстрогенов совместно с прогестероном подавляют секрецию гонадотропина гипофизом по механизму обратной связи, но быстрый рост концентрации эстрогенов, наблюдающийся непосредственно перед овуляцией, стимулирует секрецию ЛГ. Прогестерон является промежуточным продуктом синтеза стероидных гормонов надпочечников, но в значимых количествах секретируется только желтым телом и плацентой. Его концентрация в плазме повышается во второй половине менструального цикла, но затем снижается, если не происходит оплодотворения и желтое тело дегенерирует. В плазме прогестерон активно связывается с альбумином и транскортином, в свободной 157 форме находится 1-2% гормона. Уровень прогестерона в крови может быть измерен и применяется при выяснении причин бесплодия у женщин. Гормон играет важную роль в подготовке эндометрия матки к имплантации зародыша, тормозит развитие нового фолликула в период беременности. Оказывает пирогенный эффект при овуляции. Женский гипогонадизм проявляется у девочек задержкой начала пубертатного периода, отсутствием развития молочных желез и аменореей. Он может также быть первичным – недостаточность яичников – и вторичным – поражение гипофиза или гипоталамуса, заболевания кишечника, почечная недостаточность. Аменорея и олигоменорея. Аменорея (полное отсутствие менструаций) может быть первичной (никогда не было) или вторичной. Олигоменорея представляет собой скудные или редкие менструации и обычно является менее тяжелой формой аменореи. Аменорея является физиологической во время беременности и в климактерический период. Аменорея у нормально феминизированных женщин часто обусловлена гормональными нарушениями, приводящими к недостаточности яичников. Их причинами служат дисфункция гипоталамо-гипофизарной системы, связанная со снижением массы тела, аутоиммунное заболевание, повышенная продукция андрогенов. Тяжелый стресс, интенсивные и высокие физические нагрузки также могут привести к аменорее. Аменорея, обусловленная гиперсекрецией андрогенов, часто связана с гирсутизмом и даже вирилизацией. Гирсутизм и вирилизация представляют собой увеличение роста волос на теле по мужскому (андрогензависимому) типу, увеличение клитора, появление других вторичных половых признаков мужского типа, облысение. Наиболее частая причина – поликистоз яичников. Заболевание передается по наследству, у мужчин проявляется более ранним облысением. Многие женщины, страдающие поликистозом яичников, имеют избыточный вес, и их состояние описывается как «метаболический синдром» гиперинсулинемии, инсулинорезистентности и гиперлипидемии. Специфические гормональные изменения. Бесплодие. Хорионический гонадотропин. Бесплодие является распространенной клинической проблемой. Оно может быть первичным (зачатие никогда не происходило) или вторичным, обусловлено также может быть как заболеванием мужчины, так и женщины. Отсутствие овуляции, наиболее часто связанное с гиперпролактинемией или нарушением функции гипоталамо-гипофизарной системы, является причиной бесплодия примерно в 20% случаев. А нарушение продукции спермы – примерно в 25% случаев. Эндокринные причины бесплодия у мужчин встречаются редко. Для выяснения причин бесплодия требуются тщательные лабораторные обследования обоих партнеров. Достаточно надежным показателем (если нет анатомических нарушений фаллопиевых труб, а сперма содержит нормальное количество живых сперматозоидов) служит концентрация прогестерона в плазме, которая повышается после овуляции и должна в норме превышать 28 нмоль/л за 158 7 дней до начала менструации. Оплодотворение яйцеклетки препятствует развитию атрофических изменений в желтом теле. Наоборот, желтое тело увеличивается под воздействием гликопротеинового гормона человеческого хорионического гонадотропина (чХГ), вырабатываемого трофобластом развивающейся плаценты. Обнаружение этого гормона в моче является высокочувствительным и специфическим тестом для диагностики беременности. Этот гормон секретируется некоторыми опухолями и используется как маркер для их обнаружения. Количественное определение чХГ в плазме применяется также для диагностики при подозрении на внематочную беременность: если концентрация выше, чем 1000 Е/л, то вероятность эктопической беременности высока. Гормоны желудочного тракта и поджелудочной железы. Органами пищеварительной системы секретируется весьма значительное количество гормонов: гастрин – вырабатывается антральным отделом желудка, стимулирует секрецию соляной кислоты и пролиферацию слизистой желудка; холецистокинин – выделяется двенадцатиперстной и тощей кишкой, активирует секрецию панкреатических ферментов и сокращение желчного пузыря; секретин – двенадцатиперстной и тощей кишкой, стимулирует выработку бикарбоната натрия поджелудочной железой; панкреатический полипептид – поджелудочной железой – ингибирует экзокринную секрецию поджелудочной железы; желудочный полипептид – двенадцатиперстной и тощей кишкой – высвобождает инсулин в ответ на повышение содержания глюкозы и ингибирует секрецию соляной кислоты слизистой желудка; вазоактивный интестинальный пептид – всем желудочно-кишечным трактом (ЖКТ)– регулирует перистальтику и секреторную функцию ЖКТ; мотилин – двенадцатиперстной кишкой и тощей кишкой – стимулирует перистальтику ЖКТ. Основным эндокринным заболеванием, связанным с нарушением гормональной функции поджелудочной железы, является сахарный диабет. Подробное описание особенностей данного заболевания см. в разделах: нарушение гомеостаза и нарушения обмена углеводов. При ворсинчатом аденоматозе прямой кишки, опухолях, которые выделяют большие количества богатой калием слизи, и при опухолях, секретирующих вазоактивный интестинальный пептид (ВИП), развивается секреторная диарея. 159 ГЛАВА 3 МЕХАНИЗМЫ НАРУШЕНИЙ МЕТАБОЛИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ В КЛЕТКАХ В настоящее время раскрыты глубинные механизмы многих патологических состояний: повреждения мембран и межклеточных взаимодействий, старения и гибели клеток, их злокачественной трансформации, влияния ксенобиотиков, недостатка и избытка кислорода и других повреждающих факторов. В настоящей главе мы попытаемся рассмотреть некоторые биохимические аспекты данных патологий. 3.1. Гипоксия как причина нарушений метаболических процессов в клетках. Окислительный стресс [9,10,12,13,14,23] Гипоксия выступает как один из мощных регуляторов метаболизма и в то же время лежит в основе развития многих патологических состояний. Особенности реакции организма на влияние гипоксического фактора различной этиологии характеризуют его резервные компенсаторные возможности противостоять действию факторов окружающей среды. Классификация гипоксических состояний приведена в работе А.П. Симоненкова [23]. Выделены следующие виды гипоксии: экзогенная; респираторная; гипоксия, обусловленная дисфункцией сердечной мышцы; гипоксия, обусловленная дисфункцией гладкой мускулатуры сосудов; гемическая гипоксия; тканевая гипоксия; смешанная гипоксия. Независимо от вида гипоксии, в основе характерных для нее нарушений лежит невозможность основной энергопродуцирующей системы – процессов митохондриального окислительного фосфорилирования – к продукции АТФ. В условиях недостатка кислорода как акцептора электронов компоненты клетки становятся более восстановленными и могут передавать электроны либо непосредственно на кислород, либо на низкомолекулярные посредники, которые инициируют свободно-радикальные процессы. Мишенью свободных радикалов становятся нуклеиновые кислоты, структурные белки и белки-ферменты, липиды. Как оказалось, митохондриальная дыхательная цепь ферментов является не только источником макроэргических соединений, но и мощным регулятором кислородзависимых свободнора- 160 дикальных процессов в клетке. Поддержание оптимального функционирования митохондрий в условиях пониженного парциального давления кислорода может выступать одним из ведущих средств коррекции энергообеспечения клеток [23]. Согласно выдвинутой в 1985 году гипотезе о нейротрансмиттерно-субстратнонуклеотидных системах существуют прямые связи между рецепторным аппаратом и энергетическим обменом в клетках [6]. На уровне клеток работают две противоположно направленные системы: катехоламины – янтарная кислота – цАМФ – АТФ; ацетилхолин – α-кетоглутарат – цГМФ – ГТФ. Катехоламины усиливают образование и окисление сукцината, который аллостерически активирует сукцинатдегидрогеназу и моноаминоксидазу. Ацетилхолин наряду с торможением окисления сукцината активирует окисление α-кетоглутарата, проявляющего холиномиметический эффект. Последний связан с ингибированием ацетилхолинэстеразной активности при одновременном повышении содержания ацетилхолина в крови и тканях [6]. Указанная реципрокность обеспечивает клеткам возможность направленной регуляции эффективности митохондриального окислительного фосфорилирования в зависимости от энергетических и пластических потребностей клетки, а также коррекции гипоксического состояния [12]. Свободнорадикальные процессы. Окислительный стресс Смещение баланса в сторону избыточной генерации свободных радикалов при дефиците антиоксидантов принято называть окислительным стрессом, который сопровождает гипоксические повреждения. Окислительный стресс и повреждение мембран. Кроме биохимических (высокоинтегрированных, в несколькими уровнями регуляции) реакций, в клетках могут протекать и химические процессы. В основном источником химических превращений в клетках служат высокоагрессивные, реакционноспособные соединения, среди которых есть продукты метаболизма: мочевина, различные альдегиды, спирты, кетоны; промежуточные амфиболиты: аскорбиновая кислота, глутатион, токоферолы, гидрохиноны, филохиноны; основные метаболиты: глюкоза, фруктоза и их производные. Реакции, протекающие в клетках чисто химическим путем (без участия ферментов), получили название изнанки метаболизма и будут рассмотрены позже, в отдельном разделе. Весьма агрессивными в химическом отношении соединениями являются активные кислородные метаболиты (АКМ). Известно, что реакция восстановления кислорода до воды лежит в основе энергетики кислороддышащих организмов. Однако, наряду с сопряженным с дыханием окислительным фосфорилированием, в которое вовлекается 90% потребляемого кислорода, в клетках постоянно протекают реакции с образованием АКМ: супероксидного радикала (О2-), перекиси водорода (Н2О2), гидроксильного (НО•), хлоридного (НОCL•) и перекисного радикалов (RO2•). 161 Кислород в своем основном состоянии – бирадикал, два неспаренных электрона которого с параллельными спинами располагаются на разрыхляющих молекулярных π-орбиталях. Это делает его относительно инертной молекулой. Вместе с тем кислород активно взаимодействует с органическими радикалами, имеющими неспаренный электрон. Данная реакция имеет важное значение в живых организмах, запуская цепные процессы свободнорадикального окисления липидов, являющихся легко окисляемыми соединениями. Радикальные процессы перекисного окисления липидов (ПОЛ) протекают во всех клетках живых организмов, главным образом, в фосфолипидных структурах мембран. В основе современного представления о механизмах ПОЛ лежит выдвинутая в 1887 году гипотеза А.Н.Баха о возможности непосредственного присоединения молекулярного кислорода к органическим молекулам с образованием гидроперекисей. Субстратом окисления в биологических системах являются, в первую очередь, полиненасыщенные жирные кислоты (ПНЖК), входящие в состав триглицеридов и фосфолипидов. Как все цепные реакции, процессы ПОЛ делят на три фазы: зарождение цепей, развитие цепных реакций и обрыв цепей. Зарождение цепей начинается в результате образования свободного радикала окисляющегося соединения. Источником могут стать радикалы, образующиеся под действием ионизирующих излучений, УФ-излучений, озона, свободных радикалов дыма табака, свободных радикалов химических реакций, АМК и других воздействий. Первая фаза является узким местом всей цепной реакции, и от ее скорости зависит скорость всего ПОЛ. На следующей стадии свободные радикалы быстро взаимодействуют с кислородом, который выступает в качестве акцептора электронов. В результате такого взаимодействия образуется перекисный радикал RO2•. Очень важно, что в молекулах гидроперекисей линолевой, линоленовой и арахидоновой кислот может формироваться система сопряженных двойных связей. Последовательность реакций в случае линоленовой кислоты: ―СН2―СН═ СН―СН2―СН═ СН―СН2― 8 9 10 11 12 13 14 ―СН2―СН― СН―СН2―СН― СН―СН2― │ │ │ │ + О2 ―СН2―СН― СН═ СН―СН═ СН―СН2― │ О―О― 162 Молекулы с двумя сопряженными двойными связями могут быть обнаружены спектрофотометрически с max поглощения λ233 нм. Они получили название диеновых конъюгатов и служат чувствительным тестом на обнаружение гидроперекисей ПНЖК. Поскольку диеновые конъюгаты появляются в сущности на стадии образования свободных радикалов (СР), то увеличение их количества говорит о ускорении их возникновения. Так как конъюгация может произойти примерно у 50% СР, образовавшихся из ПНЖК, теоретически отношение числа гидроперекисей к числу диеновых коньюгатов равно 2, что подтверждается и экспериментальными данными. Большая часть липидных гидроперекисей в биологических мембранах образуется из ПНЖК, находящихся в β-положении мембранных фосфолипидов. В качестве наиболее окисляемых жирнокислотных остатков выступают арахидоновая, линолевая и деказогексаеновая кислоты, расположенные в β-положении фосфатидилэтаноламина (ФЭА) и фосфатидилхолина (ФХ). Появление диеновых кетонов обусловлено реакцией дегидрирования гидроперекисей, количество диеновых кетонов можно зарегистрировать при λ273 нм [13]. Возникающие в результате окисления органические перекиси могут включаться в процесс генерации радикалов в присутствии металлов переменной валентности, так как в этом случае наблюдается их разложение с образованием реакционного алкоксильного радикала: ROOH + Men+ RO• + OH- + Me(n+1)+ Самой распространенной из подобных реакций является реакция Фентона, так как в клетках больше всего двухвалентного железа: ROOH + Fe2+ RO• + OH- + Fe3+ Двухвалентное железо в составе гемовых структур способно прочно связываться липидами биомембран, становясь центром радикалообразования. Кроме того, ионы железа участвуют еще в двух реакциях, приводящих к формированию радикалов: (1) Fe2+ + O2 + H+ HO•2+ RH RO2• + RH (2) Fe2+ + RO2• Fe2+ + R• Fe3+ + HO•2 H2O2 + R• ROOH + R• продукты ПОЛ (альдегиды, кетоны) продукты ПОЛ (альдегиды, кетоны) 163 Обрыв цепных реакций ПОЛ возможен также при взаимодействии с антиоксидантами: глутатионом, аскорбиновой кислотой, токоферолами, убихиноном, мочевой кислотой, билирубином и др. Тормозят свободнорадикальное окисление (СРО) и специальные ферментативные системы антирадикальной защиты (супероксиддисмутаза, каталаза, глутатионпероксидаза, глутатионтрансфераза). ПОЛ как часть СРО имеет важное значение, так как служит сигналом к обновлению фосфолипидного бислоя мембран. Поэтому системы антиоксидазной защиты (АОЗ) направлены на поддержание ПОЛ на стационарном уровне. Недостаток антиоксидантов, действие внешних прооксидантов, а также активация эндогенного производства АКМ приводят к напряжению механизмов АОЗ и развитию окислительного стресса, который имеет проявления на клеточном, тканевом и организменном уровнях. Производство АКМ в ферментативных реакциях. Активация кислорода в биологических системах происходит прежде всего в оксидазных реакциях. В состав ферментов оксидаз входят металлы переменной валентности. В 1978 году был составлен первый каталог оксидаз, в который вошло 220 ферментов [9]. Все они представляют собой металлсодержащие протеиды, в состав функциональных доменов которых входят железо, медь, цинк, молибден, марганец, кобальт. По строению активного центра их делят на пять основных классов. (1) Определяющее состояние кислорода – О2. Сюда относятся гемопротеиды, не являющиеся ферментами: гемоглобин, миоглобин, гемоэритрин, гемоцианин. Окисления металла при выполнении функции обычно не происходит. (2) Определяющее состояние кислорода – О2- (ксантиноксидаза. НАДФН-оксидаза). Реакция окисления субстрата происходит по схеме: ХН2 + О2 → Х + О2- + 2Н+. (3) Преобладающее состояние кислорода – О22- (аминоксидазы, каталаза, пероксидазы, супероксиддисмутаза). Осуществляют перенос двух электронов на кислород: ХН2 + О2 → Х + Н2О2. (4) Перенос четырех электронов, разрыв связи –О-О- и образование двух молекул воды (цитохромоксидаза; аскорбатоксидаза): 2ХН2 + + О2 → 2Х + 2Н2О. (5) Преобладающее состояние кислорода – О23-, что также приводит к разрыву –О-О- связи и образованию воды, а также О•, который обычно встраивается в субстрат окисления по схеме: Х + О2 + АН2 → ХО + Н2О + А (циклооксигеназа, липоксигеназа и цитохромы Р-450) [9]. Таким образом, все оксидазы (включая неферментативные гемопротеиды, транспортирующие кислород) в определенных условиях способны генерировать АКМ, которые могут утилизироваться системами АОЗ или обусловливать неферментативное ПОЛ. Часть же оксигеназ, суб164 стратами которых служат жирные кислоты, активируют как ферментативное, так и неферментативное ПОЛ. Циклооксигеназа окисляет жирные кислоты до циклических эндоперекисей, запускающих производство как свободных радикалов неферментативным путем, так и образование простагландинов, простациклинов, тромбоксанов в соответствующих ферментных комплексах. Цитохромы Р-450 гидроксилируют и эпоксилируют жирные кислоты и различные ксенобиотики, липоксигеназы окисляют жирные кислоты по двойным связям, внося перекисный радикал, превращая их в лейкотриены. Активация производства АКМ лежит в основе не только процессов обновления фосфолипидного бислоя мембран, но и апоптозной и некрозной гибели клеток, защитной функции нейтрофилов [10]. Характеристика основных форм активных кислородных метаболитов (1) Супероксидный анион-радикал О2-. Супероксидный радикал более реакционноспособен, чем О2, характеризуется наличием неспаренного электрона, в водных растворах присоединяет протон и переходит в форму НО2•, являющуюся слабой кислотой. Время жизни в биологических субстратах – 10-6с. В виде супероксида имеет заряд и плохо проходит через мембрану, служит слабым окислителем, может стать и донором электронов, восстанавливая ряд соединений. Супероксидный анион является промежуточным продуктом во многих биохимических реакциях: окисление тиолов, флавинов, хинонов, катехоламинов, птеринов, в метаболизме ксенобиотиков. Основные источники: ферментативные системы НАДФНоксидаз, ксантиноксидаза, митохондриальная цитохром-с-оксидаза и микросомальная система монооксигеназ. Рассмотрим некоторые ферментативные системы производства супероксида и их функции. Миелопероксидазная система нейтрофилов. Данная система представляет собой НАДФН-оксидазный ферментативный комплекс, восстанавливающий кислород до супероксида. Комплекс мембраносвязан, состоит по меньшей мере из трех компонентов: ФАДпротеид; цитохром-в558 и убихинона. При активации НАДФН-оксидазы происходит самосборка ферментативного комплекса, осуществляющего перенос электронов с цитозольного НАДФН на О2: -• О2 НАДФН → ФАД-Е → убихинон → Цитохром-в558 → О2 → + О2-• → Н2О2 → + Cl- (Br-; I-; SCN-) → НОСl; HOBr; HOI; HOSCN CОД МПО СОД – супероксиддисмутаза; МПО – миелопероксидаза. Таким образом, генерация супероксид-аниона является пусковым механизмом образования Н2О2 и других реакционноспособных цитотоксических радикалов. Фагоцитирующие клетки, обладающие низкой активно165 стью НАДФН-оксидазы, проявляют слабую бактерицидную способность. Кроме того, супероксидный радикал участвует в реакции Фентона, восстановление трехвалентного железа в двухвалентное ведет к генерации ОНрадикала, очень реакционно агрессивного. Ксантиноксидаза представляет собой интересный фермент, участвующий в механизмах регуляции многих процессов жизнедеятельности клетки. В нормальных условиях находится преимущественно в дегидрогеназной форме и может обратимо или необратимо переходить в оксидазную, что наблюдается, в частности, при ишемии или гипоксии. Необратимая активация ксантиноксидазы – пусковой механизм направления клетки на апоптозную гибель. Супероксидный радикал генерируется также в митохондриях при транспорте электронов по дыхательной цепи ферментов. В частности, генерация осуществляется в ходе окисления↔восстановления убихинона (Q : QH2 + O2 → QH• + H+ + O2-•; QH• + O2-• → Q + H+ + O2-•. В восстановленном состоянии убихинон является антиоксидантом, нейтрализуя супероксидный анион: 2 O2-• + QH2 → H2O2 + O2 + Q + 2 ē. Для регуляции уровня генерации супероксидного радикала служит супероксиддисмутаза (СОД), фермент антиоксидантной защиты. Молекулярная масса СОД – 31 тыс. Да. Существует несколько изоферментных форм СОД: медь-, цинк-; марганец-; железосодержащие супероксиддисмутазы. Медь- и цинксодержащие СОД локализованы в цитоплазме и межмембранном пространстве митохондрий у эукариотов, чувствительны к цианиду. Марганецсодержащая СОД – цианрезистентна, локализована в матриксе митохондрий и встречается у бактерий, хотя для них более характерна железосодержащая СОД. Экзоцеллюлярная СОД существует в виде профермента с молекулярной массой около 150 тыс. Да. СОД осуществляет реакцию: O2-• + O2-• + 2 Н+ → Н2О2 + О2 и инактивируется избытком перекиси водорода. (2)Перекись водорода относится к окислителям средней силы. В отсутствие каталазы, глутатионпероксидазы или ионов металлов Н2О2 относительно стабильна и может мигрировать из клетки в межклеточное пространство и проникать в другие клетки. Источники перекиси водорода – оксидазы, переносящие 2 ē на молекулу кислорода: аминоксидазы, иногда ксантиноксидаза и супероксиддисмутаза. Около 80% перекиси водорода, генерируемой фагоцитами в очаге воспаления, образуется в супероксиддисмутазной реакции. Перекись водорода служит источником ОНрадикала, взаимодействуя с двухвалентным железом или другими метал166 лами переменной валентности. А также она является субстратом миелопероксидазы для образования высокореакционных гипогалоидов. Генерация перекиси водорода приводит к закислению среды в очаге воспаления и обусловливает гибель многих бактериальных клеток. Большинство эукариотических клеток устойчивы к перекиси водорода за счет присутствия разлагающих ее ферментов: каталазы; глутатионпероксидазы (ГПО); причем ГПО эффективно работает при малых концентрациях Н2О2 (высокая Кm), каталаза – при более высоких (низкая Km). Каталаза локализована в пероксисомах, а ГПО – в цитозоле и митохондриях. Они катализируют следующие реакции: 2Н2О2 → 2Н2О + О2 каталаза 2GSH + Н2О2→ GSSG + 2H2O глутатионпероксидаза. Глутатион (GSH) способен также взаимодействовать с другими перекисными соединениями, эффективно тормозя ПОЛ: 2GSH + ROOH → GSSG + ROH + H2O. Гипогалоиды образуются при реакции перекиси водорода с галидами, катализируемой миелопероксидазой (МПО) нейтрофилов и пероксидазой эозинофилов. Ферменты отличаются по структуре и субстратной специфичности. Основным продуктом МПО является ОНСl-, пероксидазы эозинофилов – ОНBr-. Миелопероксидаза локализуется в гранулах нейтрофилов. Дегрануляция приводит к освобождению МПО и образованию гипогалоидов. Применение к продуктам миелопероксидазной реакции термина «активные формы кислорода» не совсем верно, так как это по сути активные формы галогенов, но активными кислородными метаболитами их называть можно. Гипогалоиды ингибируют α1-антитрипсин (ингибитор сериновых протеаз), что приводит к активации протеолиза. Также они активируют коллагеназу, что обусловливает разрушение экстрацеллюларного матрикса в местах воспаления, окисляют лейкотриены, иммуноглобулины, альбумин, могут индуцировать ПОЛ. При взаимодействии с белками окисляют сульфгидрильные группы, но все же их главный эффект связан с нейтрализацией ингибиторов протеингидролаз. Гидроксильный радикал (ОН•). Наиболее реакционноспособен из всех АКМ. Может разрывать любую С-Н и С-С связь. Образование этого радикала идет в реакции Габера-Вейса: О2-• + Н2О2 → ОН- + ОН• + О2. 167 В реакциях окисления арахидоновой кислоты, при макросомальном окислении жирных кислот также генерируется ОН-радикал. Однако основной источник этого агрессивного радикала – реакция Фентона: ROOH + Fe2+ RO• + OH- + Fe3+ или НOOH + Fe2+ ОН- + OH- + Fe3+ Обратное восстановление Fe3+ возможно при взаимодействии с супероксидным радикалом: Fe3+ + О2-• → Fe2+ + О2, а также при реакциях с аскорбиновой кислотой, глутатионом, цистеином. Цитотоксическое и канцерогенное действие ионизирующих излучений на живые организмы напрямую связано с генерацией ОН-радикала в процессе радиолиза воды: Н2О → ОН• + Н+ + ē. Радикалы ОН• участвуют в микробицидном и цитотоксическом действии гранулоцитов, моноцитов, Т-лимфоцитов. Генерация ОН-радикалов существенно лимитируется наличием ионов железа. Данные радикалы повреждают многие клеточные структуры, индуцируют образование органических радикалов и запускают процессы ПОЛ. Специфических ферментов, превращающих ОН-радикалы, подобных СОД, нет. Защиту осуществляют в некоторой степени низкомолекулярные соединения: урацил, мочевая кислота, глюкоза, диметилсульфоксид и др. Синглетное состояние кислорода. Основное состояние молекулярного кислорода – триплетное. Изменение спина одного из электронов, находящихся на π-орбиталях в молекуле кислорода, приводит к образованию возбужденного синглетного состояния, энергия которого на 96,3 кДж/моль больше, чем энергия триплетного. Высокая реакционная способность синглетного кислорода ведет к тому, что он легко вступает в окислительные реакции с органическими соединениями, инициируя ПОЛ [9]. ПОЛ и его продукты в эволюционном плане представляют один из наиболее ранних регуляторных механизмов и выступают в роли первичного медиатора стрессовой ситуации. Образование АКМ – неотъемлемое звено существования высших форм живых организмов. Они принимают активное участие в деструкции тканей в ходе воспалительного процесса, образуются в результате активации фагоцитов, регулируют пролиферацию и гибель клеток, участвуют в поддержании тонуса сосудов. Производство АКМ служит главным регулятором процессов обмена, апоптоза клеток и организма, играет значительную роль в эволюционном процессе. В 1967 г. Р.Х. Мак Артур и Е.О. Уилсон выдвинули гипотезу о существовании в популяциях стратегий жизни двух типов: тип R предполагает бурное размножение и короткую продолжительность жизни; тип К – низкие темпы размножения и долгую жизнь. К-стратегия характерна для благоденствия популяции в уже захваченном ареале и в относительно стабильных условиях среды. Эволюционный процесс в такой популяции идет медленно. Изменение условий среды приводит к переключению на страте168 гию R, что сопровождается ускорением темпов размножения и жизни, сокращению продолжительности жизни. Что же лежит в основе выбора стратегии, каков механизм восприятия изменений условий жизни? В 1998 году Э.Мур получил трансгенное растение табака с повышенной экспрессией одного из генов, кодирующего шаперон mHsp70. Трансгенный табак был вдвое выше нормального, втрое увеличилось количество митохондрий в клетках и скорость процессов дыхания. Оказалось, что резкое повышение производства mHsp70 ускоряло импорт и фолдинг митохондриальных белков, ответственных за дыхание и фосфорилирование. Усиление дыхания и синтеза АТФ и стимулировало рост растения. Таким образом, суперпродукция mHsp70 может быть молекулярным механизмом переключения стратегий. Ухудшение условий среды существования организма приводит к усилению экспрессии mHsp70, активирует дыхательный процесс, что увеличивает производство АКМ. Повышенный выход АКМ способствует активации мутационного процесса, появлению большего генетического разнообразия и формированию приспособлений к изменившимся условиям среды. Однако ускорение производства АКМ способствует и более быстрому старению и гибели клеток и уменьшению продолжительности жизни организма [24]. Внутриклеточный окислительный стресс и апоптоз клеток В организме в качестве физиологических индукторов апоптоза выступают цитокины и стероидные гормоны. Одна из главных причин развития окислительного стресса под действием стероидных гормонов – снижение уровня производства ферментов-антиоксидантов: каталазы, супероксиддисмутазы, а также уменьшение концентрации восстановленного глутатиона. К цитокинам – индукторам апоптоза – относят факторы некроза опухолей (ФНО) и интерлейкин 1β (ИЛ-1β). Интерлейкин1β в комбинации с интерфероном γ, ФНО активирует синтез NO-синтезы (NOS) и продукцию NO-радикалов. Эндогенные и экзогенные NOрадикалы индуцируют гибель макрофагов, β-клеток поджелудочной железы, гладкомышечных клеток, опухолевых клеток. В основе повреждающего действия радикала окиси азота лежит образование сильного окислителя – пероксинитрита: O2-• + NO• → ONOO-. Пероксинитрит способен окислять аминогруппы и тиоловые группы белков, индуцировать процессы переокисления липидов в мембранах, способствует образованию ОН-радикалов [10]: 2ONOO- + 2 H+ → ONOOH → OH• + NO2. 169 В присутствии пероксинитрита или продуктов его распада образуются радикалы глутатиона и инициируется ПОЛ. В то же время есть основания рассматривать процесс генерации окиси азота в нитратсинтазной системе клеток как фактор адаптационной защиты при гипоксических состояниях. Н.Н. Кургалюк и соавторы [14] показали, что особенности развития биоэнергетической гипоксии у животных с разной резистентностью к кислородной недостаточности определяются NO-зависимыми эффектами. Среди них NO-зависимое снижение интенсивности окисления, вызванное активацией холинергических мускариновых M2- и брадикиновых ВК2- рецепторов в скелетных мышцах. Оксид азота выполняет роль и вторичного посредника, синтезируемого в клетках из L-аргинина под влиянием нитратсинтазы (NOS). Эффекты окиси азота реализуются через активацию растворимой гуанилатциклазы и синтеза другого вторичного посредника – цГМФ, что сопровождается блокированием фосфолипаз и входа кальция в клетку. Этим объясняются стресс-лимитирующие эффекты NO. Установление роли ацетилхолина как эндогенного вазоактивного регулятора, стимулирующего продукцию NO, показывает стратегию адаптационных изменений в условиях гипоксии. Основной физиологический эффект ацетилхолина состоит в экономизации поглощения кислорода и его использования тканями за счет переключения на «быстрый» цикл Кребса (повышение роли аминотрансферазных реакций) при стрессах и гипоксии. С установлением локализации NO-синтазы на внутренней мембране митохондрий были описаны прямые эффекты влияния окиси азота на функционирование дыхательной цепи. Прямое измерение продукции NO в интактных митохондриях подтвердило высказанную раньше гипотезу, что оксид азота, продуцируемый митохондриями, изменяет показатели дыхания и синтеза АТФ через ингибирование цитохромоксидазы (ЦО). Цитохромоксидаза осуществляет превращение оксида азота в нитрит- и нитратанионы. В настоящее время большое внимание привлекает возможная роль окиси азота как регулятора процессов дыхания в связи с тем, что митохондриальная нитратсинтаза располагается вблизи ЦО. Показано, что в условиях острой гипоксии активность ЦО повышается, она сохраняет способность к транспорту электронов на кислород даже при тяжелой гипоксии [16], когда выключается НАД-зависимое окисление субстратов и тормозится окисление на участке от цитохрома b к цитохрому с1. Ингибирование ЦО в этих условиях активирует цикл окиси азота. На роль сенсорных элементов, определяющих степень гипоксического влияния могут претендовать и другие гемсодержащие белки: гемоглобин, миоглобин, цитохром Р-450, переводя клетки на режим нитратно-нитритного дыхания в условиях дефицита кислорода [16]. Ускорение производства АКМ в условиях перехода от гипоксии к реоксигенации, инициация ПОЛ, разрушение мембран ведет к освобождению 170 лизосомальных ферментов и активации каспаз и гибели клеток. В некоторых случаях это приводит к феноптозу – запрограммированной смерти организма. Как оказалось, во многих случаях гибель клеток обусловлена не только внешними, но и внутренними причинами. Некоторые штаммы E.coli образуют неактивную форму специфической протеазы. Если бактериальная клетка заражается определенным вирусом, один из небольших вирусных полипептидов связывается с протеазой и активирует ее. Активированная протеаза расщепляет фактор элонгации EF-TU и, прекращая синтез белка, убивает клетку, что ограничивает размножение бактериофага и спасает популяцию от инфекции. Многие тяжелые заболевания сопровождаются массовой продукцией ФНО и других цитокинов, индуцирующих апоптоз. Например, септический шок – смерть организма, хорошо спланированная самим организмом. Нарастание медиаторов воспаления, гиперпроизводство АКМ нейтрофилами и макрофагами, активация ПОЛ и ксантиноксидазы ведет к активации каспаз, определенной группы протеолитических ферментов, стимулирующих апоптоз. Высокий уровень гибели функционально важных клеток организма может привести к феноптозу – смерти организма. Подобная программа гибели всего организма, вероятно, сформирована в ходе эволюционного процесса и оправдана остановкой распространения опасной инфекции в популяции [25]. Опасность ускорения апоптозной гибели клеток резко возрастает в условиях перехода от состояния гипоксии (недостатка снабжения клеток кислородом) к реоксигенации (восстановлению высокого содержания кислорода в тканях). Это происходит в результате некоторого накопления в условиях недостатка кислорода восстановленных форм железа (Fe2+). При реоксигенации возрастает вероятность реакции Фентона: Н2О2 + Fe2+ → ОН• + ОН- + Fe3+. Кроме того, в условиях увеличения парциального давления кислорода в тканях индуктивно сопровождается повышением продукции ксантиноксидазы и, соответственно, АКМ. При ишемии миокарда реокисигенации наиболее опасна, так как может стать причиной стимуляции апоптозной гибели большого числа клеток, окружающих зону некроза и сделать нормальную работу миокарда невозможной. Затормозить апоптоз, вызванный реоксигенаций, можно с помощью антиоксидантов и ингибиторов каспаз (рис.3.1). Аноксия 171 Fe3+ → Fe2+ Хелаты ионов железа Повышение уровня Ксантиноксидазы Аллопуринол Взрыв АКМ при реоксигенации Антиоксиданты, ингибиторы каспаз Апоптоз клеток – суперпродуцентов АКМ и соседних клеток Дисфункция жизненно важных органов Смерть организма Рис.3.1. Пути развития апоптоза и феноптоза в условиях перехода от аноксии к реоксигенации [25]. Пунктирными стрелками показаны возможные блокирующие воздействия Гибель организма от инфаркта и инсульта во многом определяется уровнем апоптозной гибели клеток жизненно важных органов, однако стойкое снижение запрограммированной гибели клеток означает повышение риска развития злокачественных новообразований. В.П. Скулачев (1999)[25], выдвигающий гипотезу запрограммированной смерти организма (феноптоза) как результата чрезмерной апоптозной гибели функционально важных клеток, предлагает стратегию блокирования основных путей развития апоптоза с целью предотвращения феноптозной гибели. Основные возможности блокирования на настоящий момент показаны на рис.3.1 стрелками с пунктирной линией. Согласно В.П. Скулачеву, защита от окислительного стресса может осуществляться как результат «мягкого» разобщения дыхания и фосфорилирования, сопряженного с возрастанием скорости потребления кислорода и снижением уровня восстановления компонентов дыхательной цепи. Это приводит к снижению концентрации кислорода и скорости продукции АКМ в клетках. Механизм мягкого разобщения может быть основан на обратном открытии неселективных пор во внутренней мембране митохондрий. Экспериментально показано, что низкие концентрации прооксидантов, в частности АМК, могут индуцировать открытие этих пор в митохондриях, активировать дыхание и собственное производство [10]. Молекулярные механизмы развития апоптозной гибели клеток. Основополагающая работа в этой области принадлежит Керру (1972), который выдвинул гипотезу о существовании двух видов клеточной смерти: апоптоза и некроза. Апоптоз представляет собой многоэтапный процесс, начинающийся внутри клеток после принятия сигнала, гибель клетки осуществляется по определенной программе. Морфологически наблюдается перераспределение фосфолипидов в цитоплазматической мембране, переме172 щение фосфатидилсерина из внутреннего монослоя ЦПМ в наружный, сморщивание клетки, конденсация ядра, разрывы ДНК, фрагментация клетки в мембранных везикулах. При этом в везикулах сохраняется целостность мембран, формируются апоптозные тельца – фрагменты клеток, окруженные мембраной [19,21]. Этапы реализации программы апоптоза. Начальный момент – прием сигнала к апоптозу. Сигнал может приходить как извне, так и возникать в самой клетке. Существование программы клеточной смерти даже в безъядерных клетках (эритроциты, бактерии) показывает, что наличие ядра не является обязательным для реализации процесса апоптоза. Существует несколько путей индуцирования апоптоза: путь, опосредованный физиологическими индукторами, действие которых идет через клеточные рецепторы, специально предназначенные для включения программы клеточной гибели; а также путь, связанный с изменением соотношения регуляторных молекул внутри клеток, мутацией генов, ответственных за регуляторные белки, участвующие в реализации жизнедеятельности клетки. В клетках животных и человека апоптоз связан с активацией каспаз, представляющих собой семейство консервативных цистеиновых протеаз, специфично расщепляющих белки после остатков аспарагиновой кислоты. Индукторы апоптоза – факторы некроза опухолей – действуя на рецепторы обычно через ГТФ-зависимые белки, приводят к активации тирозинкиназной активности и фосфорилированию каспаз «первого эшелона». Активированные каспазы «первого эшелона» с помощью ограниченного протеолиза приводят в активное состояние «каспазы второго эшелона» [1,21]. На этапе активации каспаз «первого эшелона» жизнь клетки еще можно спасти, так как существуют регуляторы, которые блокируют их действие. К ним относятся внутриклеточные регуляторные белки семейства Bcl-2: A1, Bcl-N, Bcl-Xu, Brag-1, Mcl-1, NRB. Однако есть регуляторные белки – промоторы апоптоза, усиливающие действие каспаз. Это белки семейства Bax: Bad, Bak, Bcl-5, Bik, Bim, Hrk, Bax, Mtd. Соотношение этих регуляторных белков и будет определять судьбу данной клетки. На следующем этапе под действием каспаз «второго эшелона» реализуются следующие события: расщепление белков, блокирующих реализацию программы апоптоза – семейства Bcl-2. Далее – протеолиз ингибитора ДНК-зы, фермента, осуществляющего фрагментацию ДНК. И, наконец, расщепление поли-(АДФ-рибозо)-полимеразы, участвующей в процессах репарации повреждений ДНК. Данный фермент катализирует АДФрибозилирование белков, связанных с ДНК. Донором АДФ-рибозы служит НАД+[21]. В последние годы возрос интерес к биологическим функциям сфингозина, метаболита сфинголипидов в реализации программы апоптозной гибели клеток [1]. Установлено, что он является эндогенным ингибитором протеинкиназы С и оказывает таким образом ингибирующий эффект на 173 многие клеточные процессы, зависящие от активации протеинкиназ данного типа, включая процессы пролиферации, дифференцировки и программируемой гибели клеток. Показано, что сфингозин влияет на рост и дифференцировку клеток, агрегацию тромбоцитов, стимуляцию митогенеза, обладает противоопухолевой и бактерицидной активностью. Выяснение механизмов подобной активности сфингозина привело к обнаружению у него способности индуцировать апоптоз. В организмах сфингозин образуется при активации фермента сфингомиелиназы, отщепляющей от сфингомиелина церамид. Далее фермент церамидаза расщепляет церамид с выделением сфингозина. Взаимодействие сигнальных молекул с рецепторами индуцирует резкую активацию липолитических ферментов (фосфолипазы А2, С, D и сфингомиелиназы), что приводит к накоплению продуктов гидролиза фосфолипидов: арахидоновой кислоты, диацилглицерола, церамида. Однако только продукты сфингомиелинового цикла (церамид и сфингозин) обладают ярко выраженным проапоптозным действием при непосредственном контакте с клеткой. Продукты сфингомиелинового цикла служат токсическим звеном в проведении сигнального апоптоза (рис.3.2)[1]. Таким образом, сфингозин регулирует активность протеинкиназ С , в ядре оказывает влияние на деградацию ДНК путем непосредственного взаимодействия с ней, а также через ингибирование экспрессии Bcl-2. В нормальном организме программируемая смерть клеток – механизм поддержания гомеостаза и нормального функционирования организма, освобождение от ненужных клеток, выполнивших свою функцию, трансформированных или поврежденных клеток. Чрезвычайно часто апоптоз встречается у растений, этот механизм клеточной гибели лежит в основе реализации многих процессов жизнедеятельности растений [21]. 174 ФНОα Рецептор Фосфолипаза А2 Фосфолипаза D Фосфолипаза С Лизофосфатиды, Арахидоновая кислота Фосфатидная кислота И3Ф ДАГ ПКС + АТФ Сфингомиелиназа ВыходСа2+ Сфингомиелин Церамид Активация нуклеазы Церамидаза Ингибирование ПКС Сфингозин Блокирование Ингибирование экспрессии Bcl-2 АПОПТОЗ Рис. 3.2. Схема участия сфингозина в апоптозе [1]. Пунктирными линиями показаны процессы, которые блокируются сфингозином Ксилемогенез и флоэмогенез. Клетки, которым предстоит стать трахеидами ксилемы, претерпевают дробление протоплазмы на везикулы, характерные для апоптоза животных. Те же процессы наблюдаются при развитии ситовидных трубок. Формообразование листьев. Очертания листьев формируются, по-видимому, через реализацию механизма апоптозной гибели. Места перфораций определяются зонами смерти клеток на ранних стадиях развития. Аэрохимогенез – адаптивная реакция растений на дефицит кислорода, заключающаяся в образовании полостей, заполненных воздухом за счет элиминации некоторых клеток с полным разрушением клеточных стенок с участием активирующихся гидролитических ферментов. Клетки корневого чехлика также гибнут по механизму программируемой смерти даже в условиях выращивания растений гидропонным способом. Опадание листьев и созревших плодов. Эти процессы сопровождаются избирательной гибелью клеток отделительной зоны, расположенной между основанием черешка листа или плода и стеблем, которая активируется благодаря экспрессии так называемых Sag-генов. Клетки в отделительной зоне 175 секретируют ферменты, разрушающие клеточные стенки – пектиназы и целлюлазы. Данные ферменты локально действуют на определенные участки, растворяют частично клеточную стенку в отделительном слое, а сами клетки этой зоны подвергаются автолизису, включая программу апоптозной гибели. Прорастание пыльцевой трубки. Процесс осуществляется в результате гибели клеток на пути прорастающей пыльцевой трубки. Индукторы программируемой клеточной смерти видоспецифичны, выделяются клетками, на которые воздействует пыльца. В семенах однодольных растений имеются алейроновые клетки, которые секретируют ферменты, катализирующие гидролиз запасных питательных веществ. Будучи ненужными для последующего развития, алейроновые клетки погибают путем апоптоза: ядерная ДНК фрагментируется, образуются везикулярные пузырьки. Процесс стимулируется гибберелловой кислотой и блокируется абсцизовой. Механизм действия: через синтез активаторов или ингибиторов нуклеаз. Апоптозные везикулы у растений разрушаются ферментами, секретируемыми соседними клетками. Программируемая клеточная смерть лежит у растений и в основе иммунной реакции на патоген. Наряду с индукцией синтеза фитоалексинов и гидролитических ферментов в инфицированных клетках и соседних вблизи очага инфекции, активируется программа собственной гибели. Образуется зона мертвых клеток: обезвоженных, служащих барьером для распространения инфекции. Процесс сопровождается «дыхательным взрывом», генерацией супероксидного радикала при участии НАДФН-оксидазы цитоплазматической мембраны, подобной данному мембранному комплексу нейтрофилов и макрофагов. Кроме НАДФН-оксидазы, в клетках растений образуется перекись водорода при участии пероксидаз клеточной стенки, оксалатоксидазы, а также при окислении НАД-зависимых субстратов или сукцината комплексами I и II дыхательной цепи митохондрий. Этот механизм получил название – гиперчувствительный ответ (ГО), который на одном или нескольких листьях ведет к развитию иммунитета в других листьях, не имевших контакта с патогеном. Патологической формой гибели клеток является некроз, который в отличие от программируемого апоптоза представляет собой разрыв мембраны клеток и излияние содержимого в межклеточное пространство. Некроз характеризуется разрушением цитоплазматической мембраны и органелл, высвобождением лизосомальных ферментов. Некротической гибели клеток способствует снижение в клетках уровня АТФ и НАД+, ее может провоцировать специальный цитолизирующий комплекс: антигенантитело-белки комплемента. Между апоптозной и некрозной гибелью клеток в растительных и животных тканях существует взаимосвязь. У растений перекись водорода в малых концентрациях стимулирует апоптоз, а в высоких – некроз. Апоптозная гибель клетки сопровождается расщеплением и фрагментацией ДНК. Чрезмерная активация поли-(АДФ-рибозо)176 полимеразы при массированных разрывах ДНК, сильно снижая содержание НАД+, ведет к подавлению гликолиза и митохондриального дыхания и вызывает гибель клетки по варианту некроза. При бактериальном и вирусном заражении большая часть клеток гибнет по варианту некроза, а соседние с ними клетки по варианту апоптоза. Программируемой гибели подвергаются старые или трансформированные клетки [19]. Особую форму апоптоза, вероятно, претерпевают эритроциты млекопитающих. Биогенез эритроцитов из стволовой клетки в костном мозге включает ряд промежуточных этапов. На этапе эритробласта ядро выталкивается из клетки и пожирается макрофагами [21]. Однако существует альтернативное мнение о постепенном кариорексисе (деструкции ядра) с образованием телец Жолли и последующим распадом внутри клетки. Безъядерная клетка, называемая ретикулоцитом, в дальнейшем теряет митохондрии и рибосомы (утрачивая возможность обновления) и превращается в эритроцит. Потерю ядра эритробластом можно рассматривать как особую форму ядерного апоптоза. Лишенный ядра, митохондрий и рибосом, эритроцит, исполнив свое назначение, по-видимому, включает программу гибели, поступая в распоряжение макрофагов печени и селезенки. Так как отдельные эритроциты человека живут от одного до трех месяцев, можно предположить, что выполнение программы апоптоза можно ускорить или затормозить. Очевидно, что скорость реализации программы жизни эритроцита зависит от условий функционирования клеток. Такие факторы как гипоксия, окислительный стресс, наступающий в момент реоксигенации или действия различных прооксидантов, ацидоз и влияние соединений, генерирующих окись азота, способствуя более быстрому повреждению клеток, ускоряют апоптозную гибель эритроцитов[11]. 3.2. Нарушения межклеточных взаимодействий. Канцерогенез [2,4,8,15,17,18, 22] Эмбриональное развитие, поддержание архитектоники тканей, воспалительный и иммунный ответы, заживление ран представляют собой процессы, связанные как с межклеточным взаимодействием, так и с взаимодействием клеток и межклеточного матрикса. Взаимодействия клетка-клетка и клетка-межклеточный матрикс обеспечиваются различными семействами рецепторов. В настоящее время идентифицировано несколько семейств адгезивных рецепторов, участвующих в реализации подобного рода взаимодействий: интегрины (гетеродимерные молекулы, функционирующие как клеточно-субстратные, так и межклеточно-адгезивные рецепторы); адгезивные рецепторы суперсемейства иммуноглобулинов (участвуют в межклеточной адгезии и особенно важны в эмбриогенезе, заживлении ран и иммунном ответе); селектины (адгезивные молекулы, лектинподобный домен которых обеспечивает ад177 гезию лейкоцитов к эндотелиальным клеткам); кадгерины (кальцийзависимые межклеточные адгезивные белки); хоминговые рецепторы (молекулы, обеспечивающие попадание лимфоцитов в специфическую лимфоидную ткань) [18]. Межклеточные взаимодействия в процессах воспаления и репарации повреждений. При остром воспалительном процессе первым видимым этапом становятся гемодинамические изменения. Сосуды в месте воспаления резко расширяются и возникает стаз клеток крови с последующим выходом лейкоцитов из кровяного русла в месте повреждения органа или ткани. В настоящее время известно, что вазодилатация обеспечивается такими медиаторами воспаления как простациклин ПГI2, эндотелиальным релаксирующим фактором (окись азота). Стимуляция их образования эндотелиальными клетками осуществляется тромбином, гистамином, лейкотриеном С4. Синтез простациклина зависит от дозы агонистов (тромбина, гистамина, лейкотриена), активности фосфолипазы А2 и циклооксигеназно-простациклинсинтетазного комплекса в эндотелии. Активность последних повышается ИЛ-1 (интерлейкин-1) и ФНОα [Zavoico G.B. et al., 1989, цит.18]. Кроме того, эндотелиальные клетки продуцируют констрикторы, способствующие сокращению гладкомышечных клеток. Но в зоне воспаления, как правило, преобладает вазодилатационный эффект. В зоне воспаления замедляется кровоток и усиливается сосудистая проницаемость. Наблюдается четыре вида изменений эндотелиальных клеток, связанных с усилением проницаемости сосудов: 1) сокращение клеток; 2) реорганизация цитоскелета и контактов этих клеток; 3) повреждение эндотелия с ретракцией, лизисом и отслойкой; 4) отслойка эпителия без лизиса. Сокращение эндотелиальных клеток происходит очень быстро и приводит к усилению проницаемости для жидкости и плазменных белков (но не для клеток крови). Медиаторы воспаления имеют различный срок действия на эндотелий: гистамин вызывает эффекты, продолжающиеся не более 30 минут; некоторые лейкотриены (В4) действуют час и больше. Цитокины вызывают структурную реорганизацию цитоскелета эндотелиальных клеток, что приводит к длительному эффекту увеличения сосудистой проницаемости. Лейкоциты, особенно нейтрофилы и лимфоциты, могут повреждать эндотелиальные клетки с помощью АКМ и протеолитических ферментов, что приводит к их сокращению и лизису, а также к отслойке клеток от подлежащей базальной мембраны. Интерлейкин-1 и ФНОα не повреждают эндотелия, но, активируя лейкоциты, косвенно способствуют его повреждению. Таким образом, процесс развития воспаления характеризуется усилением эндотелиально-лейкоцитарных взаимодействий. Эндотелиально-лейкоцитарные взаимодействия при воспалении. Адгезия нейтрофилов к эндотелиальным клеткам представляет собой наиболее ранний этап острого воспаления. Степень выраженности аккумуляции 178 нейтрофилов и число адгезированных клеток зависят от природы воспалительного агента. Активация нейтрофилов в гомеостатическом воспалении строго регулируется, но выделение протеолитических ферментов, образование АКМ и производных арахидоновой кислоты способствуют развитию повреждения сосудистой стенки. Нейтрофилы постоянно экспрессируют на своей поверхности адгезивные молекулы, число и функциональный статус которых быстро изменяются в ответ на действие специфических стимулов, к ним относятся прежде всего β2-интегрины и L-селектин. Каждый из трех β2-интегринов постоянно присутствует в плазматической мембране нейтрофилов. Моноклональные антитела против каждого димера ингибируют адгезию нейтрофилов к эндотелию. Врожденный дефицит поверхностной экспрессии β2-интегринов, возникший из-за мутации, заметно снижает аккумуляцию нейтрофилов в местах попадания инфекционного агента или заживления раны [4]. Лектиновый домен L-селектина также вовлекается в процесс адгезии нейтрофилов к эндотелию. После активации этот домен быстро «слущивается» вблизи трансмембранного домена. L-селектин может взаимодействовать с Е-селектином, который появляется на эндотелиальных клетках, активированных цитокинами. β2-Интегрины и L-селектин могут синергично взаимодействовать при миграции нейтрофилов в зону воспаления. Полагают, что L-селектин обеспечивает эффект «катящихся» нейтрофилов по поверхности эндотелиальных клеток. Лиганды на эндотелиальных клетках, которые взаимодействуют с L-селектином на «катящихся» нейтрофилах, пока не идентифицированы. Начальное связывание, обеспечиваемое L-селектином, может быть важным этапом для дальнейшей работы интегриновой системы. Быстрое слущивание L-селектина и функциональное усиление авидности β2-интегринов лежат в основе механизма контроля нейтрофил-эндотелиального взаимодействия, регулируемого адгезивным фенотипом нейтрофилов [Zimmerman G.A. et al.,1990, цит.18]. Клетки активированного эндотелия синтезируют ряд биологически активных молекул, в частности ФАТ (фактор активации тромбоцитов), обеспечивающих адгезию гранулоцитов к эндотелиальным клеткам. ФАТ постоянно не присутствует в покоящихся эндотелиальных клетках, но синтезируется в течение нескольких минут после их стимуляции тромбином, гистамином, лейкотриеном С4 и другими агонистами. Синтез ФАТ требует активации с помощью фосфорилирования Са2+-зависимой фосфолипазы А2 и специфической ацетилтранферазы. Он не выделяется эндотелием в жидкую среду, а экспрессируется на поверхности мембраны в виде мембраносвязанного медиатора и активирует нейтрофилы при взаимодействии с поверхностным рецептором лейкоцитов. Данный рецептор принадлежит к семейству ГТФ-зависимых белков (G-белков). Связывание этого рецептора с ФАТ усиливает экспрессию семейства β2-интегринов (CD11a/CD18; CD11b/CD18). Явление адгезии и активации клеток-мишений мембранос179 вязанными молекулами других клеток получило название юстакринной активации. Юстакринная активация нейтрофилов мембраноассоциированным ФАТ вызывает усиление ответа гранулоцитов на действие хемотаксических факторов, так как стимулирует слущивание L-селектина. Под влиянием другой группы агонистов – ИЛ-1, ФНОα и липополисахаридов бактериальных клеток – эндотелиальные клетки синтезируют другую сигнальную молекулу – ИЛ-8. После стимуляции эндотелия синтез ИЛ-8 осуществляется в течение 4-24 ч. Он является потенциальным хемоаттрактантом для нейтрофилов и может влиять на трансмиграцию лейкоцитов в случае синтеза его эндотелием. В отличие от ФАТ большая часть его выделяется в жидкую фазу, а меньшая остается связанной с базальной мембраной эндотелия. ИЛ-8 активирует нейтрофилы, связываясь со специфически рецептором, также принадлежащим к семейству G-белков. В результате действия ИЛ-8 повышается плотность β2-интегринов, усиливается адгезия нейтрофилов к покоящимся эндотелиальным клеткам и субэндотелиальному экстрацеллюлярному матриксу (ЭЦМ), но уменьшается адгезия к цитокинактивированному эндотелию, экспрессирующему Е-селектин. Механизм подобного ингибирования лейкоцитарной адгезии пока неизвестен, но может быть связан со слущиванием L-селектина на активированных ИЛ-8 нейтрофилах [Smith C.W. et al., 1991, цит.18]. Подобно нейтрофилу, эндотелиальные клетки экспрессируют на своей поверхности ряд адгезивных молекул. Кроме лигандов для L-селектина и β2-интегринов идентифицированы Р и Е-селектины. Р-селектин транслоцируется из эндотелиальных секреторных гранул на поверхность клеток после стимуляции их тромбином или гистамином, затем происходит его быстрая интернализация. Такая транзиторная экспрессия происходит параллельно с адгезией нейтрофилов к активированному эндотелию (рис.3.3), обеспечивая механизм временной регуляции адгезивного взаимодействия. Так как активация эндотелиальных клеток определенными оксидантами пролонгирует экспрессию Р-селектина на поверхности клеток, механизм интернализации может управляться рецепторноопосредованными агонистами (тромбин, гистамин)[22]. Эндотелиальные клетки, стимулированные ИЛ-1, ФНОα и липополисахаридами, синтезируют Е-селектин. Для поверхностной экспрессии Е-селектина требуется около 1 часа. Адгезия нейтрофилов к эндотелию, обусловленная Е-селектином, имеет важную особенность – после исчезновения Е-селектина наблюдается локальное усиление адгезии [Carlos T.M., Harlan J. M., 1990, цит.18]. Е-селектиновая адгезия осуществляется без активации β2-интегриновой системы. Однако моноклональные антитела к β2интегринам ингибируют адгезию нейтрофилов к цитокинактивированному эндотелию, экспрессирующему Е-селектин в различной степени в зависимости от условий [Carlos T.M., Harlan J]. M., 1990, цит. 18]. Контррецепторы для Р- и Е-селектинов еще недостаточно изучены, важной их частью 180 являются сиаловые кислоты, что обусловливает молекулярное разнообразие их форм. При эндотелиально-лейкоцитарном взаимодействии отдельные молекулярные системы действуют комплексно, в определенной комбинационной последовательности. Коэкспрессия ФАТ и Р-селектина необходима для начального этапа адгезии нейтрофилов к стимулированному гистамином или тромбином эндотелию. Такая коэкспрессия обеспечивает специфичность данного взаимодействия, так как тромбоциты, например, имеют рецепторы для ФАТ, но не имеют их для Р-селектинов. Участие β2-интегринов повышает плотность адгезии, что очень важно, поскольку экспрессия Р-селектина осуществляется транзиторно. Комбинация молекулярных систем взаимодействия используется и для других гранулоцитов: эозинофилов и базофилов. Эозинофилы связываются с рецептором, относящимся к иммуноглобулинам (VCAM-1), который присутствует только на цитокинактивированном эпителии с помощью β1-интегрина (VLA-4), которого нет на нейтрофилах. Юстакринная роль ФАТ, вероятно, не ограничивается только начальными этапами адгезии. Поляризация нейтрофилов, стимулированных ФАТ, усиление функциональной активности β2-интегринов и повышенная чувствительность к действию хемотаксических факторов могут играть важную роль в процессе клеточной миграции [Gasic A.C. et al.,1991, цит. 18]. Воспаление является очень динамичным процессом. Уже спустя 4 часа в воспалительном инфильтрате и сосудистом русле начинаются изменения: уменьшается число нейтрофилов и возрастает число мононуклеарных лейкоцитов. Изменения коррелируют со сменой адгезивных молекул, экспрессируемых эндотелиальными клетками. Если в начале воспаления экспрессируются адгезивные молекулы, участвующие во взаимодействии активного эпителия с нейтрофилами, то через 6-8 часов появляются рецепторы и адгезивные молекулы, относящиеся к суперсемейству иммуноглобулинов (ICAM-1; ICAM-2: VCAM). Это сопровождается взаимодействием с эпителием Т-лимфоцитов, мигрирующих в очаг воспаления. Они появляются в ответ на действие ИЛ-8 (как и нейтрофилы). Моноциты появляются в очаге воспаления еще позднее, так как не чувствительны к действию ИЛ-8, но реагируют на моноцитарный хемотаксический белок (МСР-1). ИЛ-1 и ФНОα стимулируют эндотелиальные клетки к синтезу данного белка. Активированные моноциты экспрессируют на поверхности β1-интегриновые молекулы, связывающиеся с иммуноглобулиновыми рецепторами. Кроме интерлейкинов и фактора некроза опухоли в очаге воспаления выделяется интерферон γ (ИФНγ), он усиливает экспрессию ICAM-1, особенно в поздние сроки воспаления (24-72 часа). В процессе миграции, как и в процессе адгезии, также наблюдается взаимодействие лейкоцитов с эндотелием. Цитокины: ИЛ-1; ФНОα, ИФНγ; трансформирующий фактор роста β (ТФРβ) изменяют протеазно181 антипротеазный баланс в сторону увеличения активности протеаз, что приводит к повреждению белков базальной мембраны в очаге воспаления. Межклеточные взаимодействия в процессах репарации За повреждением экстрацеллюларного матрикса в ходе развития воспалительного процесса следует стадия репарации (восстановления). Данная стадия имеет некоторые особенности в различных тканях, но в общих чертах сходна с репарацией соединительнотканного экстрацеллюларного матрикса. Центральную роль в процессах репарации играют мононуклеарные клетки, поскольку они продуцируют медиаторы, вызывающие пролиферацию фибробластов и усиление ими продукции компонентов экстрацеллюларного матрикса (ЭЦМ). В зоне репарации также наблюдается скопление тромбоцитов, которые служат источником ТФРβ – ведущего цитокина репарации. Дегрануляция тромбоцитов и высвобождение ТФРβ сопровождаются развитием сложного процесса, включающего усиление хемотаксиса нейтрофилов, моноцитов и фибробластов, индукцию ангиогенеза, контроль продукции других цитокинов и различных медиаторов воспаления [Wahl S. M. Et al., 1987; Barnard J.A., et al., 1990, цит.18]. Важная роль в процессах репарации принадлежит также Т-лимфоцитам, причем увеличение числа Т-клеток приводит к сдвигу соотношения супрессоры/хелперы в сторону Т-хелперов. Моноциты, активированные цитокинами Т-хелперов, выделяют фибриногенные цитокины, усиливающие пролиферацию фибробластов и синтез коллагенов. Показано, что на пролиферацию фибробластов непосредственно оказывают влияние тромбоцитарный фактор роста (ТцФР) и ТФРβ, опосредованно, через стимуляцию продукции вторичных цитокинов и метаболитов арахидоновой кислоты, – ИЛ-1α и ИЛ-1β. ФНОα может вызывать как стимулирующий, так и ингибирующий эффект: низкие его концентрации активируют пролиферацию фибробластов, высокие – блокируют рост клеток [Thorton S.C. et al., 1990, цит.18]. Для индукции синтеза элементов ЭЦМ, и, в частности коллагенов, в большей степени, чем межклеточные взаимодействия, необходимы медиаторы, выделяемые эффекторными клетками: макрофагами, тромбоцитами, лимфоцитами. ТФРβ является наиболее изученным фиброгенным агентом, стимулирующим экспрессию генов и синтез белков внеклеточного матрикса [Sporn M.D., Roberts A.B., 1990, цит. 18]. Сообщения некоторых авторов свидетельствуют об усиливающем действии ФНОα на синтез коллагена, других – о противоположном действии. Индукция ТФРβ синтеза компонентов внеклеточного матрикса приводит к появлению в зоне повреждения значительных количеств фибронектина и протеогликанов. В процессе иммунологического или механического повреждения в результате дегрануляции тромбоцитов и моноцитов/макрофагов происходит местное выделение ТФРβ и ТцФР. Тромбоци182 тарный фактор роста вызывает усиление экспрессии гена ТФРβ в клеткахмишенях и влияет на продукцию ими других цитокинов, таких как ИЛ-1, ФНОα, фактор роста фибробластов (ФРФ) и эпидермальный фактор роста (ЭФР). ТФРβ является мощным хемоаттрактантом для моноцитов/макрофагов. Инфильтрация зоны повреждения этими клетками приводит к дополнительной продукции ТФРβ и выраженному накоплению элементов внеклеточного матрикса. Одновременно ТФРβ блокирует процесс деградации ЭЦМ путем снижения синтеза протеолитических ферментов и увеличения уровня ингибиторов протеаз. ТФРβ усиливает также плотность интегринов и изменяет их качественное соотношение на поверхности клеток в сторону усиления адгезии к ЭЦМ [Ignotz R.A., Messague J., 1987, цит.18]. Все вышеперечисленные процессы способствуют репарации поврежденной ткани. Однако существует опасность чрезмерной активации продукции ЭЦМ и перерастания адаптивной реакции в патологическую, приводя к развитию фиброза или рубца. Спустя определенный период времени экспрессия гена ТФРβ в клетках зоны повреждения исчезает, уменьшается производство компонентов внеклеточного матрикса, и начинается процесс их деградации. В обеспечении процесса репаративной регенерации важная роль принадлежит плазминоген/плазминовой системе, поддерживающей нормальную деградацию ЭЦМ. Разрушение ЭЦМ является двухэтапным процессом и начинается с ферментативного или химического повреждения (например, радикалами кислорода) с последующим эндоцитозом компонентов и перевариванием их лизосомными протеазами, такими как катепсины. Серино- и металлопротеиназы играют важную роль на первом этапе, поскольку они активны при нейтральном значении рН и вовлекаются в плазминоген/плазминовый каскад. Металлопротеиназы (коллагеназы, желатиназы, стромолизин) способны катаболизировать все основные компоненты ЭЦМ и выполняют ведущую роль в его ремоделировании в норме и при заживлении ран. Существуют многочисленные механизмы, контролирующие активность металлопротеиназ и действующие на различных уровнях, включая синтез и секрецию, активацию во внеклеточном пространстве вблизи субстрата, ингибирование комплексом активированных ферментов с естественными ингибиторами. Синтез и секреция проформ металлопротеиназ и их ингибиторов регулируются некоторыми факторами роста, гормонами. Наиболее сильными индукторами служат ИЛ-1β и ФНОα. Второй путь, контролирующий разрушение ЭЦМ металлопротеазами, определяется степенью превращения проферментов в их активные формы, которое осуществляется с помощью ограниченного протеолиза. Для коллагеназы этот процесс наиболее изучен: профермент с М. 52 кДа превращается в активную форму с М. 42 кДа. Активация приводит к конформационным изменениям, затрагивающим вовлечение цинка в интрамолекуляр183 ный протеолитический процесс. Естественными ингибиторами металлопротеиназ являются α2-макроглобулин и комплекс тканевых ингибиторных белков (TIMP)(третий путь регуляции) [18]. Канцерогенез. Межклеточные взаимодействия при опухолевом росте R.A.Willis [1967] определяет опухоль как «патологическую массу ткани с чрезмерным, некординированным ростом, который сохраняется даже после прекращения действия факторов, его вызывающих». J.A.Ewing, H.C. Pilot [1986] дают определение злокачественного роста как «наследственно поврежденного автономного роста тканей». По мнению А.И.Струкова и В.В.Серова [1985], это «патологический процесс, характеризующийся безудержным размножением клеток, не подчиняющихся регуляторным влияниям организма» [цит.18]. Автономный, или бесконтрольный, рост – первое из основных свойств опухолей. Но автономность опухоли не следует понимать как полную ее независимость от окружающей среды, от организма-опухоленосителя. Опухолевые клетки должны получать питательные соединения и кислород для осуществления роста, пролиферации и инвазии. Если кровоснабжение опухоли ухудшается, в ней возникают зоны некроза, что сопровождается распадом тканей. Кроме того, опухолевые клетки все время испытывают влияние нормальных клеток, элементов ЭЦМ, иммунной системы, различных цитокинов. Сами опухолевые клетки тоже постоянно продуцируют различные метаболиты, токсические вещества, онкобелки, факторы роста, гормоны, воздействующие на организм, носитель опухоли. В основе автономности опухолевых клеток лежит нарушение межклеточных взаимодействий за счет ауто-, пара- и эндокринных воздействий онкобелков и цитокинов (факторов роста, некроза опухоли, интерферонов). Одна из главных причин нарушений межклеточных взаимодействий при опухолевом росте – это геномные и/или эпигеномные перестройки в опухолевой клетке, ведущие к изменениям структуры и функции данной клетки. Характер нарушений межклеточных взаимодействий в опухоли постоянно меняется в ходе опухолевой прогрессии. При этом автономность опухоли достигает максимума на стадии метастазирования. Ключевым вариантом повреждения генома клетки при ее злокачественной трансформации являются активация протоонкогенов и превращения их в активные клеточные онкогены. Активация протоонкогенов может осуществляться под действием различных канцерогенных факторов: вирусных, химических, физических и физико-химических. Известны четыре основных механизма активации протоонкогенов[18]: 1. Активация при участии ретровирусов и реже ДНК-содержащих вирусов (паповавирусы). Вирусы интегрируют свои гены в ДНК клетки-хозяина и модулируют активность близлежащих протоонкогенов хозяина. 184 2. Транслокация участков хромосом, несущих протоонкогены. Это может приводить к контакту протоонкогенов с сильными модуляторами генной экспрессии. 3. Амплификация генов. Умножение копий протоонкогенов приведет к увеличению вероятности их активации в онкогены. 4. Точечные мутации. Они могут сопровождаться активацией протоонкогенов. После активации онкогенов усиливается или начинается синтез белков, которые получили название онкобелков. Все известные онкобелки участвуют в передаче митогенных сигналов клеток с той лишь разницей, что могут действовать на различных этапах передачи ростового сигнала. По функциональной активности и сходству с элементами митотической цепи сигналов все онкобелки можно подразделить на: (1) онкобелки – гомологи факторов роста (c-sis; int-r; k-fgt; c-erbB; c-neu); (2) онкобелки – гомологи рецепторов для факторов роста (семейство ras); (3) онкобелки, связанные с работой рецепторов – аналоги G-белков (src; fps; fes; abl; met); (4) онкобелки, передающие ростовые сигналы на ДНК (семейства fos; jun; myc). Онкобелки способны стимулировать пролиферацию опухолевых клеток, включаясь в митотический цикл. Переход G0 в G1 контролирует “немедленно реагирующие” онкогены – семейства fos, jun. С-myc также действует на этот переход, но позже, а с-ras – на переход G1 в S и требует дополнительного действия факторов роста или активации генов двух первых семейств. Переход же G2 в М контролируется фактором промоции митоза (ФПМ), который представлен несколькими белками, не являющимися онкобелками. Однако один из белков ФПМ – Са2+-зависимая протеинкиназа (eds 2), активируется через фосфорилирование с участием онкобелка c-src. В ходе опухолевого роста происходят различные изменения в системе: фактор роста – чувствительная опухолевая клетка. Нередко в опухолях регистрируется усиление продукции факторов роста и одновременно синтез соответствующих рецепторов, что приводит к стимуляции роста опухоли по аутокринному механизму. Продукция факторов роста опухолевыми клетками может вызвать также активацию протоонкогенов и пролиферацию неопухолевых близлежащих клеток по паракринному пути. В клетках имеются гены – супрессоры деления клеток (антионкогены). Это прежде всего ген, кодирующий белок (фосфопротеин) р53. При мутации гена р53 или химической модификации белка р53, его связывания в клетке – происходит стимуляция клеточного роста. В клетках также обнаруживаются белки, имеющие высокую степень гомологии с р53 – р63 и р73, которые в отличии от р53 экспрессируются лишь в избранных тканях и в определенные периоды развития [17]. Другим антионкогеном является ген Rb-1, одним из его продуктов – белок р105 Rb, который формирует комплекс с Т-антигеном онкогенного вируса SV-40 и с онкобелком EIA. Следовательно, не только потеря антионкогена, но и его супрессия приво185 дят к трансформации клеток. Инактивация р105 Rb происходит под действием многих ДНК-содержащих вирусов: аденовирусов; вирусов полиомы и папилломы, SV-40. Химические канцерогены в основном вызывают точечные мутации и способствуют активации промоторов, что приводит к превращению протоонкогенов в активные онкогены. В качестве классических канцерогенов можно назвать N-ацетиламинофлюорен, нитрохинолин-1-оксид, полициклические углеводороды типа 3,4-бензапирена, винилхлорид. К проканцерогенам, превращающимся уже в организме в канцерогены, относятся диметилсульфат, β-пропиолактон, метилметансульфонат, азотистый иприт, диалкилнитрозамин, циказин, этионит, уретан и четыреххлористый углерод. Активация химических проканцерогенов может протекать двумя путями [8]. Первый тип реакций – окислительные реакции, катализируемые монооксидазами (гидроксилазами). Ферменты локализованы в ЭПР гепатоцитов, в результате катализируемых реакций гидроксилирования возникают гидрооксидериваты и эпоксиды, которые под действием эпоксигидроксилаз превращаются в еще более опасные диолэпоксиды. Второй тип реакций осуществляют ферменты, катализирующие реакции превращения нерастворимых проканцерогенов в растворимые формы, что увеличивает их канцерогенную активность. Канцерогены реагируют со структурами молекул ДНК, образуя с пиримидиновыми и пуриновыми основаниями ковалентные связи: алкилирующие – с N-7 и О-6 атомами остатков гуанина, с N-1, N-3, N-7 атомами остатков аденина и N-7 группой цитозина. Ароматические ариламины и ариламиды чаще связываются с С-8 атомами гуаниновых остатков. Полициклические углеводы могут внедряться в пространства между основаниями в молекулах ДНК или взаимодействовать с теми структурами ДНК, которые не принадлежат азотистым основаниям. Не исключена возможность реакции между канцерогенами и регуляторными белками или информационной РНК [8]. Процесс химической трансформации достаточно продолжителен, латентный период составляет до 50 дней. Это свидетельствует о том, что трансформация не возникает за счет одноразового воздействия на структуру ДНК. В пользу последнего утверждения следует рассматривать и способность клеток к восстановлению поврежденной ДНК. Среди физических факторов, воздействие которых приводит к злокачественному перерождению клеток, наибольшее значение имеют ультрафиолетовое, рентгеновское и гамма-излучение, инородные тела, гипертермия. Первичной причиной трансформации при действии ультрафиолетового излучения и ионизирующей радиации является их мутагенное воздействие. Трансформация так же, как и в случае химического мутагенеза, происходит только при большом количестве результативных повреждающих 186 действий, направленных на одни и те же клетки, и характеризуется следующими закономерностями: - появление опухоли зависит от вида и дозы облучения; - длительная экспозиция малых доз опаснее, чем кратковременное воздействие больших доз или повторное прерывистое действие; - опухоли преимущественно появляются в тканях, непосредственно подверженных облучению; - радиация вызывает опухоли там, где под ее воздействием произошла гибель клеток или их повреждение. Действие инородных тел (протеазы различного типа, внутриматочные контрацептивные средства и т.п.) сопровождается с небольшой частотой возникновением опухолей по типу саркомы. Инородные тела, контактирующие с тканями более 4-8 недель, окружаются соединительнотканными капсулами, основной компонент которых – коллаген. В капсуле присутствуют фибробласты, фиброциты, макрофаги и другие клетки. Среди них – перициты, клетки, способные превращаться в различные мезенхимные клетки. Ультраструктура этих клеток сходна с таковой в клетках саркомы, которые возникают из них. Многообразие причин, приводящих к развитию опухолей, является одним из основных препятствий на пути создания эффективных методов лечения онкологических заболеваний. На молекулярном уровне это многообразие наблюдается даже среди опухолей, относящихся к одному и тому же гистологическому типу [A.A. Abott, 2002, цит.2]. Единственным изменением, общим для подавляющего большинства злокачественных новообразований, является активация фермента теломеразы [N.W. Kim et all., 1994, цит.2]. Стимуляция неконтролируемого деления за счет активации онкогенов непосредственно связана с фактором репликации Е2F. Действие Е2F контролируется белком Rb. Этот белок существует в двух формах: фосфорилированной и нефосфорилированной. В нефосфорилированной форме он способен связываться с Е2F и блокировать его активность. В свою очередь Rb находится под контролем циклинзависимых киназ (Cdk). Ингибиторами данных киназ являются белки INK4, Kip 1, WAF1. Онкобелок из семейства myc препятствует действию ингибиторов циклинзависимых киназ и способен активировать ген Е2F [U.Krug et all., 2002; D.Levens, 2002; R.A. Steinman, 2002, цит.2]. Ионизирующая радиация или химические канцерогены активируют белок р53, который при посредстве WAF1 задерживает инициацию репликации до тех пор, пока ферменты репарации не завершат удаление повреждений в ДНК. Препятствуя мутагенезу вообще, р53 уменьшает риск возникновения и таких мутаций, которые способствуют превращению нормальной клетки в раковую [D.Sidransky, 1996, цит.2]. Отсутствие функционирующего р53 наблюдается приблизительно в 50% случаев рака у человека. Естественной защитой организма от опухолевых клеток являются их распознавание и уничтоже187 ние с помощью апоптоза. Однако известно, что трансформированные клетки приобретают значительную устойчивость к апоптозной гибели, в частности, за счет высокого уровня экспрессии белка bcl-2, останавливающего апоптоз, или из-за утраты функциональной активности р53. Известно, что в процессе репликации отстающая цепь ДНК первоначально образуется из дискретных отрезков (фрагментов Оказаки), каждый из которых является продуктом РНК-праймера. На следующем этапе синтеза запаздывающей цепи РНК-праймеры удаляются рибонуклеазой и пустующее пространство заполняется ДНК. ДНК-полимераза сама нуждается в праймере, роль которого выполняет 3΄-конец соседнего фрагмента Оказаки. Рибонуклеаза разрушает также праймеры, находящиеся на краю хромосомы. Однако данные РНК-праймеры не могут быть замещены на ДНК по причине отсутствия фрагмента Оказаки – праймера для ДНКполимеразы. В результате на месте крайних РНК-праймеров остается пустота. Таким образом, каждый акт репликации сопровождается невосполнимой потерей небольшого участка на конце хромосомы. Это явление получило название «проблемы концевой недорепликации», оно приводит к прогрессирующему укорачиванию хромосом в ряду клеточных делений [А.М. Оловников,1971; J.Marx, 2002, цит.2]. Укорачивание хромосом влечет в конечном итоге гибель клетки. На концах хромосом человека находится многократно повторяющаяся последовательность 5΄-TTAGGG, эта область называется теломерой. С каждым клеточным делением теломера укорачивается на 50-200 нуклеотидов [J.W.Shay et all., 2001, цит.2]. Наличие теломеры позволяет клеткам пройти определенное количество делений без потери жизненно важных участков. Способность к неограниченному росту опухолевых клеток определяется наличием фермента теломеразы, препятствующей укорочению хромосомы. Теломераза удлиняет 3΄-конец хромосомы, добавляя к нему звенья TTAGGG. Вторая нить достраивается обычным образом с участием праймазы, ДНК-полимеразы и ДНК-лигазы. За редкими исключениями, здоровые соматические клетки человека не имеют теломеразной активности. Большинство опухолей (~90%) имеют активную теломеразу [N.W. Kim et all., 1994; J.Marx, 2002, цит.2]. Теломераза выделяется из тканей в виде рибонуклеопротеида, состоящего из трех субъединиц: РНК (hTER), полипептида hTERT и полипептида ТЕР1. hTER содержит участок из 11 нуклеотидов комплементарный одной из цепей теломеры и выполняющий роль РНК-матрицы для удлинения этой цепи. Полипептид hTERT является обратной транскриптазой, синтезирующей цепь ДНК на матрице hTER [A.J. Davis, L.L. Siu, 2000, цит.2]. Белок ТЕР1, возможно, выполняет регуляторную функцию, поскольку активный фермент можно сконструировать без него. Активность теломеразы, по всей видимости, находится под контролем узловых компонентов системы клеточного деления – циклинзависимых киназ, белков Rb, E2F. Некоторые сигнальные молекулы: онкобелки myc, 188 эстрогены могут непосредственно действовать на промотор гена hTERT, а также опосредованно через действие на р53 или на ген ТЕР1. Вероятно, существует несколько уровней регуляции активности теломеразы, которые могут быть реализованы в разных условиях и тканях. Однако несомненным является факт, что активация теломеразы составляет ключевой момент трансформации нормальной клетки в злокачественную опухолевую клетку [2]. Таким образом, канцерогенез многоступенчатый процесс накопления в клетке генетических дефектов, обусловливающих ее постоянную митогенную стимуляцию, нечувствительность к антиростовым и проапоптотическим сигналам, неограниченный пролиферативный потенциал, ангиогенез, инвазию и метастазирование [15]. После трансформации и стимуляции пролиферации опухолевых клеток начинается формирование стромы опухоли. Стромообразование в опухоли является результатом взаимодействий опухолевых клеток с клетками соединительной ткани гистогенного и гематогенного происхождения. Образование стромы в опухоли – сложный многостадийный процесс, который включает: (1) секрецию опухолевыми клетками митогенных цитокинов, онкобелков, металлопротеаз, их активаторов и ингибиторов; (2) синтез опухолевыми клетками компонентов ЭЦМ стромы; (3) пролиферацию клеток соединительной ткани; (4) синтез клетками соединительной ткани ЭЦМ; (5) взаимодействие опухолевых клеток с клетками соединительной ткани и гематогенными клетками: макрофагами, NK-клетками, Т-лимфоцитами; (6) взаимодействие опухолевых клеток с ЭЦМ опухолевой стромы. Участие опухолевых клеток в образовании стромы многообразно. Вопервых, трансформированные клетки секретируют разнообразные факторы роста и онкобелки, способные стимулировать пролиферацию фибробластов, миоцитов, эндотелиальных клеток, а также усиливать синтез и секрецию зрелыми клетками элементов ЭЦМ. Во-вторых, опухолевые клетки сами секретируют в различных количествах компоненты ЭЦМ – коллагены. В-третьих, опухолевые клетки продуцируют вещества, участвующие в разрушении ЭЦМ – металлопротеазы, их активаторы и ингибиторы. Динамическое равновесие между металлопротеазами (коллагеназами I, II и III) и их ингибиторами обусловливает проявление инвазивных свойств опухоли. Важную роль в стромообразовании, а также в разрушении ЭЦМ играют соединительнотканные и гематогенные клетки. Они продуцируют факторы, стимулирующие образование стромы: факторы роста, ИЛ-1, ФНОα, ТФР, фибронектин и др., а также протеолитические ферменты. 189 Строма влияет на опухолевые клетки через адгезивные молекулы и интегриновые рецепторы, передающие сигнал через цитоскелет в геном клетки. Ангиогенез и опухоль. Рост солидных опухолей зависит от степени развитости в них сосудистой сети. Фолькман [цит.18] обнаружил, что клетки опухоли выделяют белковый фактор, потенциирующий врастание капилляров в опухолевую ткань. Этот фактор получил название ангиогенный фактор Фолькмана. Затем было обнаружено множество подобных факторов. Ангиогенез в опухоли происходит на фоне измененного ЭЦМ в условиях нарушенных межклеточных и паренхиматозно-стромальных взаимоотношений. Это приводит к развитию неполноценных сосудов преимущественно капиллярного типа, часто имеющих прерывистую базальную мембрану с нарушенной эндотелиальной выстилкой. Взаимодействие организма-опухоленосителя и опухоли. На опухолевые клетки влияет множество реакций организма-опухоленосителя: противоопухолевое действие иммунной системы, аллогенное торможение роста опухолевых клеток нормальными клетками, кейлонное ингибирование, канцеролизис, индуцированный липопротеидами крови, гормональные воздействия. Иммунная система является основной в защите организма от опухоли. Защита достигается благодаря прямым межклеточным контактам клеток иммунной системы с опухолевыми клетками, а также она опосредована влиянием растворимых цитокинов и гормонов. Иммунная система может реагировать на возникновение трансформированных клеток в организме, поскольку они могут продуцировать уникальные опухолевые антигены. Противоопухолевой иммунитет реализуется Т-киллерами, NK-клетками (субпопуляция гранулярных больших лимфоцитов) и макрофагами. Активность противоопухолевых Т-киллеров обусловливается присутствием на мембране опухолевой клетки антигенов I класса главного комплекса белков гистосовместимости (ГКГС). Она регулируется интерлейкинами, Т-супрессорами, Т-хелперами, макрофагами. Т-киллеры способны продуцировать ФНОβ (лимфотоксин), оказывающий прямое цитотоксическое действие на опухолевые клетки. NK-клетки оказывают деструктивное воздействие на опухоль без предварительной сенсибилизации. Для них не нужна экспрессия антигенов I класса ГКГС. Лизис осуществляется за счет непосредственно взаимодействия с опухолевыми клетками, через лектиновые рецепторы и лектинсвязывающие молекулы, а также через Fcфрагмент антиопухолевых антител. Иммунные макрофаги оказывают более сильное воздействие на опухолевые клетки, чем Т-киллеры. Их цитотоксический эффект проявляется при соотношении с опухолевыми клетками 1:1, а у киллеров 100:1. Макрофаг оказывает цитотоксическое действие прямое, а также опосредованно путем активации Т-лимфоцитов и NK-клеток цитокинами. 190 Прямому цитотоксическому действию макрофага на опухолевые клетки предшествует процесс распознавания. Распознавание протекает по универсальным механизмам: связывание Fc-фрагмента-рецептор макрофагов с Fc-фрагментами антиопухолевых антител, фиксированных к антигенам на поверхности опухолевых клеток. После этих контактов макрофаг способен повреждать ее с помощью секретируемых им факторов: ФНОα (интерферон), лизосомальных ферментов, активных форм кислорода. Макрофаг оказывает противоопухолевое действие и опосредованно путем выделения им опухолецидных монокинов, а также через активацию им Т-киллеров, NK-клеток и полиморфноядерных лейкоцитов. Основными опухолецидными цитокинами являются: ФНОα (кахектин), ИЛ-1, ИНФγ. Почему же иммунная система, как правило, не может эффективно защищать организм от развития опухоли? Причины данного явления могут быть следующие: 1. Антигенность большинства спонтанных опухолей низкая, что делает их трудно распознаваемыми клетками иммунной системы. 2. На поверхности клеток опухоли нарушена экспрессия антигенов к I классу ГКГС, что отрицательно сказывается на связывании Т-киллеров с опухолевой клеткой. 3. Ряд опухолей имеет упрощенный антигенный состав. 4. Рост опухоли при связывании его противоопухолевых антител усиливается, что маскирует ее от Т-киллеров и NK-клеток. 5. Имеется общая и местная иммунодепрессия. Клетки многих опухолей способны выделять простагландины и лейкотриены, вызывающие развитие функционального дефицита иммунной системы. Также они стимулируют их синтез клетками иммунной системы – макрофагами, В и Т-лимфоцитами. Опухолевый рост сопровождается прогрессирующим, генерализованным антигеннеспецифическим иммунодефицитом. В трансформированных клетках нарушен синтез кейлонов (вещества, способствующие дифференцировке), что может быть одной из причин изменения их дифференцировки. Многообразное действие на клетки оказывают гормоны. Стрессорные гормоны (адреналин, кортизон) блокируют деление опухолевых клеток. Гормоны яичников стимулируют развитие рака молочной железы, андрогены тормозят его развитие. Эстрогены же уменьшают скорость образования рака предстательной железы. Опухоль оказывает как местное, так и генерализованное воздействие на организм-опухоленоситель. Местные изменения возникают в результате паракринных воздействий на клетки прилежащих тканей и ЭЦМ стромы. Опухолевые клетки секретируют онкобелки, факторы роста, другие цитокины и метаболиты. Взаимодействие трансформированных клеток с компонентами ЭЦМ происходит за счет адгезивных молекул и интегриновых 191 рецепторов и имеет большое значение при инвазии и метастазировании. Системное действие опухоли выражается в развитии общей иммунодепрессии, кахексии и паранеопластических синдромов: нейропатий, миопатий, дерматопатий, тромбопатий, гормонального дисбаланса. Нейропатии нередко сопровождают рак легкого, молочной железы, яичников, нейроопухоли. Миопатии встречаются у больных с раком легкого, молочной железы, толстой кишки. Дерматопатии, дерматиты, экземы, герпес, пигментации встречаются у многих онкобольных. Пигментация очень часто сопровождает рак поджелудочной железы. Мигрирующий тромбофлебит характерен для карциномы желудка. Гормональные синдромы многочисленны и могут быть подразделены на синдромы, вызванные гормонально активными опухолями эндокринных желез; и синдромы, связанные с эктопической продукцией гормонов опухолями других тканей. Прогрессия опухоли – это сложный многостадийный процесс, который включает бесконтрольный автономный рост, поликлоновость, способность к инвазии и метастазированию. В ходе опухолевой прогрессии происходят качественные изменения опухолевой ткани, увеличивающие различия между ней и исходной нормальной тканью. Изменение метаболизма опухолевых клеток выражается в усилении гликолитических процессов, пентозофосфатного окисления глюкозы за счет недостаточного снабжения кровью и дефицита кислорода. Наблюдаются упрощение спектра и даже утрата ряда ферментов, регуляторных и структурных белков, а также рецепторов. Происходят антигенное упрощение опухолевых клеток или появление новых, опухолеспецифических антигенов, экспрессия эмбриональных антигенных структур. Автономность опухоли обеспечивается переходом на аутокринный и паракринный механизмы регуляции. Ключевыми событиями прогрессии опухоли становятся инвазия и метастазирование. Инвазия проходит в три стадии. 1). Ослабление контактов между опухолевыми клетками; снижение концентрации адгезивных молекул и Са2+ на поверхности клеток, что приводит к повышению клеточного заряда. Затем опухолевая клетка прикрепляется интегриновыми рецепторами к компонентам ЭЦМ. 2). Опухолевая клетка секретирует протеолитические ферменты, под действием которых разрушается ЭЦМ. Продукты деградации компонентов ЭЦМ являются хемоаттрактантами для опухолевых клеток, которые мигрируют в зону деградации ЭЦМ. 3). Рост опухоли в сторону деградации ЭЦМ. Метастазирование опухолевых клеток обеспечивается рядом свойств, которыми должны обладать клетки данной опухоли. Прежде всего, это возможность проникновения в мелкие кровеносные сосуды, оно может быть активным и пассивным. Далее клетки должны успешно отделиться от стенки сосуда в кровеносное русло, сохранить жизнедеятельность после 192 контакта в крови с иммунокомпетентными клетками и другими факторами иммунной защиты и осуществить инвазию и рост на новом месте, в новом окружении [18]. В настоящее время предлагается гипотеза, в которой раковые клетки рассматриваются как киллеры, запускающие программу гибели организма, в клетках которого превышен «критический уровень мутагенеза». Реализация программы гибели «выбраковывает» из популяции особь, генетическая ущербность которой представляет угрозу для популяции [15]. 3.3. Действие ксенобиотиков на клетки [3,20,26] Термин ксенобиотики означает в буквальном переводе «чужие для жизни». К ним относят действительно чужеродные для клеток и организмов соединения, обычно не встречающиеся в их составе. Такими веществами являются многие лекарственные соединения, пестициды, промышленные яды, отходы производств, ряд пищевых добавок, косметические средства и пр. Сам термин довольно условный, поскольку для одних организмов то или иное вещество может быть естественным, а для других будет ксенобиотиком. Например, алколоиды и яды растений, яд пчел, змей, бактериальные токсины. Некоторые соединения (например, этиловый спирт) могут быть одновременно естественными и чужеродными для одного и того же организма. Понятие о токсичности ксенобиотиков. Их классификация К ксенобиотикам относят: •различные газообразные вещества, загрязняющие биосферу; •тяжелые металлы; •удобрения; •органические соединения (лекарства, пестициды, гербициды и пр.); •радиоактивные вещества. Из газообразных соединений опасность представляют оксиды углерода, азота и серы. Монооксид углерода (угарный газ) образуется при неполном сгорании топлива, при активации вулканической деятельности, окислении метана. Много монооксида углерода содержится в выхлопных газах автомобилей, в табачном дыме и дыме, образующемся при сгорании органических веществ (в печах, кострах, при пожарах). Поступая в организм человека и животных, угарный газ вступает во взаимодействие с гемовыми структурами, образуя стойкие соединения, утрачивающие свою функцию. Прежде всего, опасно образование карбогемоглобина, который трудно подвергается расщеплению и неспособен присоединять кислород. Монооксид углерода химически агрессивен и образует высокотоксические соединения – карбонилы. Скорость связывания монооксида углерода с гемом зависит от его концентрации, интенсивности обмена веществ в клетках и организме, в частно193 сти, от частоты дыхания. Насыщение гемоглобина монооксидом углерода, содержание которого в воздухе составляет 0,1%, при интенсивности дыхания 10 л/мин происходит через 6 часов, а при значительных физических нагрузках и более интенсивном дыхании (30 л/мин) – через 2 часа [26]. Утилизацию выделяемого в атмосферу монооксида углерода осуществляют микроорганизмы, имеющие в клетках СО-дегидрогеназный комплекс ферментов, катализирующий реакцию включения монооксида в органические соединения. Особенно много бактерий, способных к данным превращениям, обитает в почве. Растения способны включать СО в метаболизм через реакцию связывания с серином и дальнейшего окисления в СО2. Оксиды азота и серы выбрасываются в атмосферу промышленными предприятиями при сжигании мазута, торфа, каменного угля и других ископаемых видов топлива. Количество выбросов оксидов азота и аммиака составляет примерно 200-300 млн тонн в год. Часть присутствующих в атмосфере оксидов азота и серы образуется естественным путем: при вулканических извержениях, электрических разрядах, жизнедеятельности бактерий. За счет естественных процессов в биосфере ежегодно накапливается 110 млн т оксидов азота, еще 53 млн т привносится антропогенно. Велико содержание оксида и диоксида азота в табачном дыме, выкуривание одной сигареты сопровождается выделением в воздух 160-500 г оксида азота. Основную токсикологическую опасность представляет диоксид азота. Его биохимические эффекты обычно связаны с быстрым снижением концентрации глутатиона в тканях легких и печени, вступлением в реакции с образованием нитритов и нитратов, ферментативным их восстановлением в окись азота и дальше в пероксинитрит. Опасность представляют также реакции с образованием нитрозоаминов. Диоксид азота в концентрациях 40-140 мг/л при экспозиции не более часа может вызвать развитие бронхита и бронхопневмонии. Наиболее опасное проявление острого отравления оксидами азота – отек легких. Выбросы крупных промышленных предприятий вместе с оксидами азота также содержат оксиды серы. При выплавке меди, свинца и цинка количество образующегося диоксида серы достигает 15 млн. т. Воздействие оксидов серы на дыхательные пути вызывает развитие респираторных заболеваний у человека и животных, ослабляет иммунную систему. Часть оксидов азота и серы сорбируется почвой, попадает в воду и выпадает в виде кислотных дождей, которые снижают интенсивность фотосинтетических процессов у растений, подкисляют водоемы и почву. При накоплении в атмосфере фторсодержащих углеводородов уменьшается содержание озона. Общие выбросы углеводородов в атмосферу составляют не менее 200 млн т в год. Особенно опасны для живых организмов полициклические ароматические углеводороды, в частности бензапирен, образующиеся при сгорании различных видов топлива и вызывающие канцерогенные и мутагенные эффекты. 194 К солям тяжелых металлов, отличающихся наибольшей токсичностью, относят соли ртути, свинца, кадмия и хрома. Соли цинка, меди, титана менее токсичны для наземных животных, но в малых концентрациях губительны для водных экосистем. Соли тяжелых металлов распространяются в биосфере за счет выброса их при переработке руд, при сжигании топлива, сбросов в водоемы сточных вод предприятий, с полей, где использовались пестициды, в состав которых они входят. Часто происходит депонирование металлов в придонных слоях, особенно в холодное время, при потеплении они переходят в растворенное состояние и отравляют водоемы. Токсичность тяжелых металлов в основном определяется их ингибирующим действием на ферментативную активность. Комплексы ферментов с ионами тяжелых металлов устойчивы, и ингибирование принимает необратимый характер. Многие металлы накапливаются в организмах, и при попадании их действие осуществляется длительный период времени. Кадмий, например накапливается в печени, почках, поджелудочной и щитовидной железах. Высокой чувствительностью к кадмию характеризуются водные организмы. Соли кадмия накапливаются в водных растениях и, поедая их, животные погибают. Основным источником свинца является этилированный бензин, много свинца содержится и в табачном дыме. Токсикологическое действие свинца обусловливается его активным всасыванием в пищеварительном тракте животных и последующим накоплением в костной и других тканях. Случаи хронического отравления свинцом отмечаются при содержании его в питьевой воде 0,04-1 мг/л. Биохимические механизмы отравляющего действия свинца связаны с необратимым ингибированием большого количества ферментов, особенно энергетического катаболизма, гемсодержащих ферментов. Свинцовая интоксикация вызывает нарушение биосинтеза гемовых структур за счет ингибирования левулинатдегидрогеназы и гемсинтетазы. В связи с этим отмечается нарушение функций всех гемсодержащих белков: цитохромов, гемоглобина и миоглобина. Определенную роль в накоплении свинца в экосистемах играют растения, поглощающие его из почвы. С растительной пищей свинец попадает в животные организмы. Ртуть и ее соли относятся к веществам общетоксического действия. Наиболее токсична двуххлористая ртуть (сулема), однократная летальная доза составляет для человека 0,2-0,5 г. Основной точкой приложения соединений ртути также являются ферменты, активность которых необратимо блокируется. Ртуть характеризуется высокой нефротоксичностью, поражением нервной системы и органов чувств. Самую большую и многообразную группу ксенобиотиков представляют органические соединения. Сюда относятся нефть и нефтепродукты, пестициды, поверхностно-активные соединения, лекарства, многие краси- 195 тели, органические токсины. Полную их характеристику можно найти в специальной литературе, посвященной ксенобиологии. Широкое использование ксенобиотиков-пестицидов (гербицидов, инсектицидов, фунгицидов) в сельском хозяйстве создает определенную опасность загрязнения окружающей среды, попадания этих соединений и их производных в растения, животных и человека. Поэтому немало усилий направлено на создание более эффективных, но менее опасных для других организмов ксенобиотиков-пестицидов. В настоящее время наиболее распространены два класса пестицидов: фосфорноорганические (ФОП) и хлорорганические (ХОП). Первые очень опасны для высших животных, в том числе человека. В основе их токсичности лежит необратимое ингибирование ацетилхолинэстеразы и нарушение обмена ацетилхолина, что сопровождается подавлением процессов передачи нервных импульсов в холинэргических синапсах. Кроме того, установлено повреждающее действие ФОП на мембраны клеток путем инициации перекисного окисления липидов, нарушения транспорта Са2+ в микросомах за счет ингибирования кальциевой АТФ-зы. Положительными сторонами ФОП является быстрая деградация их при попадании в почву. При попадании в водоемы ФОП подвергается гидролитическому расщеплению. Хлорорганические соединения еще более опасны, так как плохо деградируют и способны накапливаться как в почве, так и в некоторых организмах, особенно в организмах насекомых. Классическим примером является дихлордифенилтрихлорэтан (ДДТ), запрещенный к производству во многих странах в 60-е годы XX века. Длительное пребывание ДДТ в почве приводит к накоплению его в растениях. Липофильность ХОП определяет их повреждающее действие на биологические мембраны, также они влияют на активность ферментов углеводно-фосфорного обмена. Большинство ХОЛ, как мощные ксенобиотики, стимулируют индукцию микросомальных гидроксилаз, в частности системы цитохрома Р-450. В настоящее время серьезную угрозу экологического загрязнения представляют полихлорфенилы, применяемые в гидравлических системах, в трансформаторах, в составе смазочных масел и в качестве пестицидов. Неимоверно возросло производство поверхностно-активных веществ, которые, являясь амфифильными соединениями, легко переносятся в водную среду и распространяются на большие расстояния. Их эффекты обусловлены солюбилизирующим действием на мембраны. Детергенты растворяют водонерастворимые белки, удаляя их из мембран, модифицируют активность ферментов, активируя ряд их при низких концентрациях и ингибируя большинство при высоких. Негативное воздействие многих ксенобиотиков осуществляется за счет продвижения их по пищевым цепям и концентрации в организмах. Ряд ксенобиотиков относят к сильнодействующим ядам и токсинам. Яды и токсины – вещества высокой биологической активности и исключительной 196 селективности, вызывающие структурные и функциональные изменения, ведущие к развитию патологических состояний (отравлений). Поэтому все пищевые продукты, лекарственные соединения, биоактивные пищевые добавки, парфюмерные и косметические средства проходят тест на токсичность. Тот или иной ксенобиотик обладает своей мерой токсичности, которая обычно определяется как концентрация, вызывающая 50% гибель клеток (цитотоксичность LС50), или доза, вызывающую гибель 50% организмов (LD50). Тогда как многие яды в минимальных дозах используются как лекарственные соединения. Понятие токсичности часто отличают от понятия опасности. Тогда как токсичность – это мера несовместимости ксенобиотика с жизнью, опасность – вероятность появления вредных для организма эффектов при их соприкосновении с организмом. Наиболее токсичен ботулинический токсин – белок из Clostridium botulinum, из небелковых соединений очень токсичны майтотоксин и палитоксин. Цианид натрия слабее их по токсичности в 105 раз. В зависимости от источника и практического применения токсины делят на несколько групп: 1) промышленные яды (органические растворители, красители, химические реагенты органического синтеза); 2) химические удобрения и пестициды; 3) лекарства и отходы фармацевтической промышленности; 4) бытовые химикаты; 5) растительные и животные яды; 6) боевые отравляющие вещества. Для человека токсины классифицируют по преимущественному поражению тех или иных органов или клеток и подразделяют на следующие категории: 1) сердечные яды (сердечные гликозиды, трициклические антидепрессанты, растительные и животные яды); 2) нервные яды (ФОП, угарный газ, алкоголь, сероуглерод, лекарственные препараты); 3) печеночные яды (хлорированные углеводороды, органические растворители, спирты, фенолы, тяжелые металлы, грибные токсины); 4) почечные яды (соединения тяжелых металлов, этиленгликоль, щавелевая кислота); 5) гемические яды (бензол, анилин и его производные, нитриты, мышьяковистый водород, цианиды); 6) желудочно-кишечные яды (концентрированные кислоты и щелочи, соединения мышьяка и тяжелых металлов); 7) легочные яды (паракват, оксиды азота, фосген и др.). 197 Устойчивость живых систем к воздействию ксенобиотиков определяется не только интенсивностью влияния химического реагента (доза, длительность), но и способностью его к биотрансформации и производству токсичных продуктов, а также скоростью разрушения ксенобиотика в окружающей среде. В связи с этим ксенобиотики различают также по типу биологического действия на клетки и организмы (мембранотропный, разобщитель дыхания и фосфорилирования, ингибиторы ферментов и процессов синтеза ДНК, РНК); по видам токсичности и опасности (мутагенная, канцерогенная и пр.); по избирательности действия; по пороговым значениям токсического действия; по характеру фармакологического действия (нейролептики, снотворные, гормональные и пр.). Связь между структурой и действием ксенобиотиков. Основные механизмы действия ксенобиотиков В настоящее время эффективно применяется программа для установления предполагаемой биологической активности вновь синтезируемого ксенобиотика по его структуре и функциональным группам. Однако структура отражает только физические и химические свойства данного соединения, но не полностью определяет его активность по отношению к биологическому тест-объекту и различным организмам. Под активностью ксенобиотика понимают его способность к взаимодействию с центрамимишенями, цепь возможных химических реакций, следующих после взаимодействия, и формирующийся затем физиологический эффект. Как правило, биологическая активность ксенобиотиков коррелирует с его способностью определенным образом распределяться между липидной и водной фазами. Например, даже инертные в химическом отношении органические вещества, но растворимые в липидах обладают биологической активностью (обычно наркотической). Поэтому одним из самых значительных механизмов действия ксенобиотиков на биологические объекты являются мембранотропные эффекты. Под мембранотропным эффектом можно понимать как прямую, так и косвенную модификацию мембранных структур клеток: внедрение в фосфолипидный бислой; воздействие на рецепцию; нарушение транспортных процессов и др. Условно можно выделить следующие типы мембранотропности ксенобиотиков: •действие на мембранную рецепцию; •стимуляция или угнетение процессов, протекающих в мембранах; •изменения барьерно-транспортных свойств мембран; •функциональное взаимодействие с мембранотропными соединениями (лигандами, агонистами, антагонистами и т.д.). При рассмотрении всякого экзогенного влияния ксенобиотика на биологический объект предполагается, что молекула эффектора сначала свя- 198 зывается мембранными центрами, инициируя затем реакцию клетки. Анализ этого процесса делят на три этапа: - установление характера и локализации центров связывания в мембране; - оценка сродства к ним эффектора; - исследование развития реакции объекта на образование комплексов центров связывания с молекулами эффекторов [26]. Следует помнить, что большинство ксенобиотиков чужды клеткам и организмам, но многие из них (особенно лекарственные препараты) могут химически быть похожими на биологически активные соединения, к которым у клеток имеются специфические рецепторы. В этом случае ксенобиотики действуют либо как агонисты (ряд синтетических гормональных препаратов), либо как антагонисты (бета-блокаторы, антагонисты кальциевых каналов). Наибольшим мембранотропным эффектом обладают амфифильные ксенобиотики, так как бислой фосфолипидов также имеет амфифильный характер. Типичными амфифильными ксенобиотиками являются поверхностно-активные вещества (ПАВ) (детергенты). При поэтапной обработке клеток детергентом увеличивающейся концентрации выявлены четыре различные стадии: связывание детергента с мембраной; лизис; диссоциация мембраны на смесь комплексов липид-детергент; протеин-липиддетергент и высвобождение из комплексов чистых белков. Важное значение в механизме действия ксенобиотика на клетку имеет его способность проникать внутрь нее. Ксенобиотики могут поступать в клетки по всем известным на настоящий момент механизмам мембранного транспорта. В случае пассивной диффузии ксенобиотик проходит через мембрану в результате случайного молекулярного движения, причем так как сердцевина мембраны – гидрофобная область, неполярные соединения проходят по данному механизму сравнительно легко. Гидрофобные группировки способствуют пассивному транспорту, гидрофильные уменьшают его вероятность. Например, пропиловый спирт проникает в клетку в три раза быстрее, чем этиловый, а бутиловый – в 10 раз быстрее. Вещества, не растворимые в липидах, с размером молекул более 0,4 нм не диффундируют через мембраны. Типичным таким соединением является глюкоза, шестиатомный спирт с размером молекулы 0,42 нм. Однако глюкоза и другие гексозы прекрасно транспортируются в клетку за счет облегченной диффузии с помощью белка-переносчика. Наличие специфических переносчиков, взаимодействующих с веществами определенного строения, обусловливает резко выраженную зависимость проникающей способности вещества от его химической структуры, и в частности, от пространственной конфигурации его молекул [3,20]. Ксенобиотики могут изменять проницаемость мембран, а, поступив в клетку, вступают во взаимодействие с компонентами цитоплазмы, могут 199 вызвать гель-золь переходы, подвергаться химической деградации. Известно, что действие многих антибиотиков связано с изменением проницаемости бактериальных мембран за счет уплотнения фосфолипидного слоя, уменьшения гидрофильных пор, блокирования переносчиков, ингибирование синтеза белков, участвующих в транспорте. К подобным ксенобиотикам относятся хлорпромазин, таннин, уабаин, динитрофенол, цеклогексамид и др. Установлено, что в клетку плохо поступают антибиотики, обладающие выраженными кислотными или основными свойствами (пенициллин, стрептомицин, новобицин) и хорошо – нейтральные (левомицитин, тетрациклин). Основными путями поступления ксенобиотиков в организм человека являются проникновение через органы дыхания и кожу, а также через пищеварительный тракт. Через слизистую оболочку дыхательных путей поступают ксенобиотики, находящиеся в газо- и парообразном состоянии, в виде аэрозолей и пыли. Через кожу проникают преимущественно липофильные вещества, находящиеся в жидком или газообразном состоянии, при непосредственном контакте. В пищеварительный тракт ксенобиотики могут поступить случайно с отравленными продуктами питания, водой и закономерно с целью лечения (лекарственные препараты). Распределение ксенобиотиков в жидкостях и тканях организма человека определяется способностью данных соединений к абсорбции, механизмом транспорта внутрь клеток (активный, пассивный). Существенным моментом является липофильность ксенобиотика: чем больше, тем выше способность распределяться в тканях; а также возможность чужеродного соединения связываться с белками крови, в частности, с сывороточным альбумином. Довольно легко чужеродные соединения поступают в растения, накапливаются в них, а затем с растительной пищей попадают в организмы животных. Корневой системой растений поглощается широкий спектр как гидрофильных, так и липофильных ксенобиотиков: алифатических и ароматических углеводородов, спиртов, фенолов, аминов, гетероциклических веществ и др. При наличии ксенобиотиков в атмосфере (опыление или опрыскивание различными пестицидами или регуляторами роста) они поступают в растения через листовые пластинки. Ксенобиотик проникает в ткани листьев через устьица или кожицу листа. В распределении ксенобиотиков в тканях растения большую роль играют сосуды ксилемы и флоэмы. Ряд гербицидов, переносимых через сосуды ксилемы, поступает в корни растений и быстро создает токсические концентрации в различных наземных органах растений. В то же время очень редко отмечается аккумуляция ксенобиотиков, продвигающихся по флоэме. Ряд гидрофильных ксенобиотиков выделяется из организма в неизменном виде, но большая часть попавших в клетку ксенобиотиков подвергается метаболическим превращениям с участием в основном гидроксилаз, 200 эпоксилаз микросомальной системы цитохрома Р-450. Метаболические процессы превращения ксенобиотиков получили название биотрансформации. Биотрансформация не всегда связана с детоксикацией, иногда образующиеся в ходе ферментативных и неферментативных реакций соединения еще более токсичны, чем сам ксенобиотик. Процессы диссимиляции, которым подвергаются ксенобиотики, включают окислительновосстановительные или гидролитические реакции, а ассимиляции – реакции конъюгации. Общим является превращение экзогенного чужеродного соединения в более полярную форму и последующее связывание его с высокополярным опсонизатором, облегчая выведение из организма. У растений отсутствуют специальные органы выделения, их защитный механизм может включать связывание ксенобиотиков углеводами и накопление конъюгатов в вакуолях. Бактерии способны разрушать многие чужеродные органические соединения до неорганических. Скорость реакций трансформации зависит не только от организма, в который попал ксенобиотик, но и от природы данного соединения. В клетках высших организмов наиболее активной системой трансформации чужеродных соединений является система микросомальных ферментов. Все реакции биотрансформации принято делить на 4 класса: окисления; восстановления; гидролиза и конъюгации. Реакции окисления. Реакции окисления чужеродных соединений осуществляются микросомальными монооксигеназами. Монооксигеназные системы эндоплазматического ретикулума содержат терминальную оксигеназу – цитохром Р-450, который широко распространен в живой природе и обнаруживается не только у эукариот, но и в прокариотических клетках. Различают микросомальную, митохондриальную и бактериальную монооксигеназные системы цитохрома Р-450. Наиболее изученной является микросомальная монооксигеназная система, с состав которой входят два флавопротеида, цитохром b и ряд других цитохромов. Митохондриальная система монооксигеназ обычно принимает участие только в трансформации стероидов, бактериальная – в наибольшей степени изучена у Pseudomonas putida. Особенностями монооксигеназ системы цитохрома Р-450 являются различие в субстратной специфичности в зависимости от типа клеток и частичная индуцибельность. Биологическое окисление, катализируемое системами монооксгеназ, включает широкий спектр реакций, которые, в общем могут быть сведены к гидроксилированию. Для всех реакций требуется восстановленный НАДФ•Н или НАД•Н и кислород. Реакции восстановления. Восстановлению ксенобиотики подвергаются в том случае, если восстановленная форма легче экскретируется из организма. В ЭПР наряду с окислительными ферментами обнаруживаются также и восстанавливающие ферменты. Так, некоторые альдегиды и кетоны восстанавливаются до спиртов, нитро- и азогруппы – до аминогрупп. Процесс вос201 становления ароматических нитросоединений до соответствующих аминов катализируют нитроредуктазы, активность их зависит от наличия НАДФ•Н и НАД•Н, но ингибируется кислородом. Восстановление азосоединений катализируется азоредуктазами, в процессе принимают участие флавины, цитохром-с-редуктаза и цитохром Р-450. Микросомальная азоредуктаза менее чувствительна к действию кислорода и сохраняет большую часть своей активности в его присутствии. Восстановление N-оксидов осуществляют N-оксидоредуктазы, реакция нгибируется монооксидом углерода и кислородом. Ксантиноксидаза способна к восстановлению оксидов, реакция ингибируется цианидами и частично кислородом. Возможны также следующие реакции восстановления: восстановление дисульфидов, двойных связей и ароматических циклов; дегидроксилирование. Гидролиз. Ряд сложных чужеродных соединений может быть подвергнут гидролизу с помощью плазменных гидролаз или лизосомальных гидролаз гепатоцитов. Наиболее частыми реакциями являются гидролиз сложных эфиров карбоновых кислот; гидролиз амидов, гидразидов и нитрилов; гидролиз фосфороорганических соединений; гидролиз сульфоэфиров. Реакции конъюгации. Как большинство биосинтетических реакций, реакции конъюгации энергозависимы. Их подразделяют на две группы. К первой группе относят процессы активации конъюгирующего агента, идущие с затратой энергии, затем происходит образование комплекса ксенобиотика с активированным конъюгирующим агентом. Ко второй группе процессы образования активированного ксенобиотика и затем реакция конъюгации его с конъюгирующим агентом. По первому типу осуществляются реакции метилирования, ацетилирования, образования глюкуронидов, гликозидов и сульфатов, по второму – аминокислотная конъюгация. Реакции конъюгации катализируются трансферазами, переносящими заместитель на другое соединение. Примерами могут служить реакции конъюгации ацетата при участии ацетил-КоА с ароматическими аминами и сульфаниламидами, конъюгация глицина с бензойной кислотой с образованием гиппуровой кислоты. Глицин служит конъюгирующим агентом также при метаболизме никотиновой кислоты, при этом образуется N-никотиноилглицин. Глутатион является активным конъюгирующим агентом для биотрансформации нафталина, антрацена, фенантрена. Многие ксенобиотики выделяются в мочу в виде меркаптуровых кислот, которые представляют собой продукты взаимодействия глутатиона с ними. Реакцию катализирует глутатионтрансфераза. Метионин и этионин участвуют в реакциях алкилирования. Так осуществляется метилирование пиридина, пирогаллола, сульфитов, селенитов, теллуритов, которые в результате превращаются в летучие диметильные производные. Глутамин используется для конъюгации фенилуксусной кислоты и некоторых ее гетероциклических производных. Моносахариды, в частности глюкоза и рибоза, служат для конъюгации многих чужеродных фенольных соединений, при этом они превращаются в соответствующие гликозиды. Особенно этот 202 процесс распространен у растений. У человека реакции гликозилирования протекают в две стадии и катализируются УДФ-глюкозопирофосфорилазой и УДФ-глюкозилтрансферазой. Наиболее важным механизмом детоксикации ксенобиотиков у многих организмов является конъюгация их с глюкуроновой кислотой. В реакции участвует активная форма глюкуроновой кислоты – уридинфосфоглюкуроновая кислота (УДФГ). Катализирует процесс уридиндифосфатглюкуранозилтрансфераза, локализованная в мембранах ЭР гепатоцитов, клеток легких, кожи, кишечника, почек. Конъюгации подвергаются спирты, фенолы, карбоновые кислоты, амины, гидроксиамины, карбамиды, сульфонамиды и тиолы, при этом образуются соответствующие глюкурониды. В растениях обнаруживаются нерастворимые конъюгаты с лигнином. С лигнином ковалентно связывается ряд молекул пестицидов: 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота, пентахлорфенол, 3,4-дихлоранилин. Эволюционно наиболее древним видом биотрансформации служит сульфатирование. Этой реакции подвергаются фенолы, спирты, ароматические амины, гидроксиамины, некоторые стероиды. Катализируют процессы сульфатаденилтрансферазы и аденилсульфаткиназы. В последнем случае донорской молекулой является 3′-фосфоадено-5′-фосфосульфат. В некоторых реакциях сульфатная конъюгация приводит к образованию канцерогенов, взаимодействующих с нуклеиновыми кислотами. К преконъюгационным реакциям относят процессы дегалогенирования. Они очень важны, так как многие ксенобиотики представляют собой хлорсодержащие соединения. Различают гидролитическое, восстановительное и окислительное дегалогенирование. Гидролитическому отщеплению галогена подвергаются обычно ароматические пестициды, восстановительное осуществляется за счет замещения галоида на водород, окислительное же подразделяется на ряд классов: дегидрогалогенирование; окислительное дегалогенирование с образованием двойной связи и гидроксилирование с участием молекулярного кислорода. Основной сущностью процессов биотрансформации органических соединений в клетках высших организмов является снижение сложности молекул, введение в нее полярных заместителей для повышения растворимости и облегчения вывода из организма. Биотрансформация неорганических соединений изучена не так хорошо, как органических. В клетках живых организмов могут присутствовать в следовых количествах многие металлы, которые образуют с органическими веществами хелатные комплексы, которые в некоторых случаях оказываются чужеродными для данного организма. Легкие металлы: калий, натрий, кальций и магний обычно содержатся в большом количестве, так как они необходимы для осуществления биохимических процессов; тяжелые: медь, железо, молибден, кобальт, цинк и другие – содержатся в следовых количествах. Действие последних на организм двухфазно: в 203 небольшом количестве они необходимы для осуществления биохимических процессов, при увеличении концентрации обладают токсическим действием за счет антагонизма катионов. Большинство тяжелых металлов переменной валентности могут служить антагонистами кальция и магния, блокируя таким образом нормальное течение кальцийзависимых (все процессы движения, активность фосфолипаз, протеинкиназ и других ферментов) и магнийзависимых (энергетический обмен) реакций. Биотрансформация неорганических соединений включает реакции восстановления атомов с переменной валентностью, реакции метилирования и реакции конъюгации. В клетках могут происходить реакции превращения арсенатов в арсениты; селенатов в селениты; хлоратов в хлориты. Часто при такой трансформации токсичность соединений только возрастает. Микроорганизмы могут использовать реакции метилирования для превращения металлов в металлоорганические соединения. Например, реакция метилирования ртути в метил- и деметилртуть. Опасность отравления живых организмов ртутью при этом возрастает, так как метилртуть полностью поглощается и накапливается во всех клетках высших организмов. Неорганические соединения мышьяка трансформируются с образованием триметилированного производного, тогда как свинец, кадмий и цинк не способны метилироваться. Цианид обезвреживается за счет конъюгации с серой, в результате образуется тиоцианид. Фермент, осуществляющий катализ, содержится в митохондриях гепатоцитов животных, а также в митохондриях растительных клеток. Белки с низкомолекулярной массой и высоким содержанием цистеина путем конъюгации связывают ионы тяжелых металлов, наиболее это изучено в отношении ионов кадмия. 3.4.«Изнанки метаболизма» – химические процессы в клетках и организме Самыми типичными химическими реакциями в клетках и организме являются свободно-радикальные (СР) процессы. Часть этих процессов представляет собой неферментативное ПОЛ. Сущность неферментативного ПОЛ и основные реакции описаны ранее. Химические свойства полиненасыщенных жирных кислот, субстратов ПОЛ включают возможности сдвига электронной плотности от метиленовых мостиков между двойными связями, что создает условия для гомолитического отщепления водорода от метиленовой группы и образования пентадиенилового радикала с делокализованным неспаренным электроном. Роль акцептора водорода может играть любой из свободнорадикальных продуктов. Так как в клетках основная часть жирных кислот упакована в мембранах, пероксильные радикалы используют в качестве доноров водорода соседние жирнокислотные остатки, что приводит к развитию цепной реакции. Взаимодействие гидроперекисей с двухвалентным железом приводит к образованию алкосиль204 ных радикалов, гидроксильных радикалов и трехвалентного железа, которые могут инициировать образование пентадиенильных радикалов. Алкосильные радикалы претерпевают расщепления, при этом возникают пентан, гексанал и соответствующие алкеналы. Этан и пентан, не вступающие в реакции, выдыхаются и действительно содержатся в выдыхаемом воздухе вместе с другими летучими продуктами ПОЛ. Кроме алканалов в процессе ПОЛ образуются алкеналы и гидроксиалкеналы, главным из которых является 4-гидроксиноненал. Эти продукты ПОЛ моментально реагируют с любыми нуклеофилами (аминогруппы, сульфгидрилы, имидазольные группировки). Модифицированные таким образом белки обнаруживаются в нормальных тканях. При наличии в жирной кислоте трех или более гомоконъюгированных двойных связей образование 11-алкосильного радикала может сопровождаться эндоциклизацией с формированием эндоперекисей, структурно аналогичным простагландинам. Эти продукты – изопростаны – претерпевают катализируемое металлами переменной валентности разложение с образованием малонового диальдегида, склонного к формированию Шиффовых оснований с гуанином, лизином, этаноламином, серином. Мишенью действия гидроперекисей являются и двойные связи холестерина. Эпоксиды холестерина известны как сильные мутагены, а гидроперекиси отличаются своей цитотоксичностью. Кроме СР окисления в клетках и внутренней среде организма могут протекать и другие реакции. Без участия фермента происходит декарбоксилирование ацетоацетата в ацетон, а также оксалоацетата в пируват: СН3-СО-СН2-СОО– → СН3-СО-СН3 + СО2 Ацетоацетат Ацетон – ООС-СО-СН2-СОО– → –ООС-СО-СН3 + СО2 Оксалоацетат Пируват Первая реакция становится актуальной при гиперпроизводстве ацетоацетата, то есть при активации расщепления жирных кислот. Особенно опасным данный процесс будет в отсутствии углеводов, действительно уровень ацетона в плазме крови резко возрастает при голодании и тяжелой форме сахарного диабета[5]. Вторая реакция особой опасности не представляет, однако производство оксалоацетата из пирувата уже требует затраты энергии АТФ, поэтому химическое декарбоксилирование в пируват сопровождается непродуктивной затратой энергии. Очень важное значение имеют химические реакции, в которые вступают химически агрессивные моносахариды, в частности глюкоза. Главной мишенью действия глюкозы являются ε-аминогруппы лизиновых остатков белков. Процесс получил название гликирования. Модифицированные ос205 татками глюкозы белки обнаруживаются в тканях и биологических жидкостях человека как при различных формах патологии, так и в норме. Содержание гликированных белков растет с возрастом [D.R. Sell, M.A. Lane and oll., 1996, цит. 5]. Важным свойством неферментативно гликированных белков служит появление в ходе этого процесса новых оксогрупп, которые способны к реакции со свободными аминогруппами других белков, что сопровождается образованием неспецифических агрегатов белков. Кроме того, в ходе гликирования возможна генерация супероксидного радикала, так как остатки глюкозы подвергаются спонтанному окислению по типу глюкозоксидантного. В организме в ходе эволюционного процесса были сформированы биохимические механизмы ликвидации последствий гликирования. Внутри клеток СО-группы могут восстанавливаться различными карбонили альдегидредуктазами или обезвреживаться с участием глиоксалатной системы и глутатиона. Во внеклеточной среде гликированные белки распознаются специфическими рецепторами, имеющимися на плазматической мембране многих клеток [R.Salazar, R.Brandt, S. Krantz, 1995, цит. 5]. Предполагалось, что они существуют для того, чтобы удалять гликированные белки из клеточного окружения. Однако оказалось, что взаимодействие с ними гликированного альбумина или гликированных белков внеклеточного матрикса приводит к активации в клетках процессов, которые сопровождаются значительными изменениями их морфологии и функционального состояния. При диабете, когда концентрация глюкозы, а соответственно и гликированных белков растет, нарушаются системы регуляции жизнедеятельности многих клеток: нефроцитов, эндотелия сосудов, эритроцитов, лейкоцитов и др. Высокий уровень гликирования выявляется в белковых отложениях, которые выведены из обменных процессов организма: в атеросклеротических и амилоидных бляшках. Образование Шиффовых оснований с последующей перегруппировкой Амадори (образование 1-деокси-2кетозиламинов) присущи и другим сахарам, более того эта способность растет по мере снижения склонности к циклизации, а она у глюкозы наиболее высокая, то есть галактоза, фруктоза и пентозы еще более опасны в отношении процессов гликирования и неспецифической агрегации белков. Активными гликирующими агентами являются также все интермедиаты гликолиза и пентозофосфатного пути окисления глюкозы. Кроме того, многие интермедиаты химически более агрессивны, чем моносахара и вступают в различные химические реакции помимо ферментативных превращений. Так, глицеральдегид-3-фосфат может существовать в форме триозо-1,3-ендиол-3-фосфата. Близость ендиольной группировки к сложноэфирной связи с фосфатом дестабилизирует последнюю, приводя к ее гидролизу и образованию этиленгидроксиацеталя. Он трансформируется 206 в метилглиоксаль, или пирувальдегид, содержание которого в тканях может достигать 0,1-2 мкМ. Пирувальдегид считается токсичным соединением из-за его способности реагировать с макромолекулами, легко образуя аддукты с гуаниновыми основаниями ДНК, а в белках реагируя с аминогруппами и гуанидиновой группировкой аргинина [M.L. Riley, J.J.Harding, 1994, цит. 5]. К сшиванию белков способна аскорбиновая кислота, инкубация с ней белков приводит к образованию пентозидина, а также АДФ-рибоза, которая возникает в тканях при расщеплении НАДа с помощью НАДгликогидролазы [ E.L.Jacoobson and oll.,1994, цит. 5] С увеличением возраста клеток интенсивность химических реакций в них возрастает за счет истощения механизмов ферментативной репарации последствий. Нарастание эффективности «изнанок метаболизма» сопровождается увеличением неспецифических агрегатов макромолекул в клетках и реализацией механизма апоптозной гибели. Увеличение возраста организма снижает эффективность работы всех регуляторных систем, что неизбежно ведет к росту числа поврежденных клеток с истощенными механизмами ферментативной репарации, гибели большого количества функционально важных клеток, что и, в конечном счете, является причиной феноптоза (гибели организма). 207 БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК Глава 1 1. Андреенко, Г.В. Активаторы плазминогена и их физиологическая роль /Г.В. Андреенко // Укр. биохим.журнал. ─1983. ─ Т.55. ─ №3. ─ С. 329─343. 2. Асатиани, В.С. Ферментные методы анализа / В.С. Асатиани. ─М.: Наука, 1969. ─ 740 с. 3. Бышевский, А.Ш. Биохимия для врача / А.Ш. Бышевский, О.А. Тарсенов. ─ Екатеринбург: Уральский рабочий, 1994. ─ С.263-289. 4. Верболович, В.П. Зависимость резистентности эритроцитов от активности антиокислительных ферментов / В.П. Верболович, Ж.К. Макашев, Е.П. Петренко //Гем. и трансф. – 1985 – №5. – С.311–315. 5. Веремеенко, К.Н. Определение α2-макроглобулина в сыворотке крови человека и его клиническое значение / К.Н. Веремеенко, Л.И. Волхонская //Лаб.дело. – 1969. – №7. .– С.394–397. 6. Веремеенко, К.Н. О наличии двух видов ингибиторов трипсина в сыворотке крови / К.Н. Веремеенко, А.И. Кизим // Биохимия. – 1964. – Т.29. – Вып.1. – С.132–137. 7. Веремеенко, К.Н. α2- Макроглобулин: структура, свойства и физиологическая роль / К.Н. Веремеенко, О.С. Семенюта, А.И. Кизим, К.А. Лобунец // Укр. биохим.журнал. – 1983. – Т.55. – №2. – С. 218–233. 8. Владимиров, Ю.А. Роль нарушений свойств липидного слоя мембран в развитии патологических процессов/ Ю.А. Владимиров // Пат. физиол. и экспер. терапия – 1989. – №4. – С.7–19. 9. Галебская, Л.В. Строение и свойства системы комплемента / Л.В. Галебская, И.Г. Щербак, П.П. Бельтюков, Е.В. Рюмина // Укр. биохим. журнал. – 1990. – Т.62. – №6. – С.3–12. 10. Головенко, Н.Я. Цитохром Р-450-зависимый путь окисления арахидоновой кислоты и ее метаболитов / Н.Я. Головенко, Б.Н. Галкин // Укр. биохим.журнал. – 1986. – Т.58. – №2. – С.104–116. 11. Гулый, М.Ф. Роль углекислоты в регуляции обмена веществ у гетеротрофных организмов / М.Ф. Гулый, Д.А. Мельничук. – Киев: Наукова думка, 1968. – 243 с. 12. Добросоцкая, Л.В. Лейкотриены / Л.В.Добросоцкая, И.Г.Щербак // Укр. биохим. журнал 1984. – Т.56. – №4. – С.452–460. 208 13. Дубинина, Е.Е. Выделение и свойства супероксиддисмутазы плазмы крови человека / Е.Е. Дубинина, В.В. Туркин, Г.А. Бабенко // Биохимия. – 1992. – Т.57. – Вып.12. – С.1892–1900. 14. Зотова, Е.Г. С-реактивный белок: строение, свойства и способы его выделения / Е.Г. Зотова, Е.Б. Мысякин, С.Ж. Токсамбаева // Биоорган. химия. – 1995. – Т.25. – №10. – С.739–751. 15. Лызлова, С.Н. Полиморфизм и активность креатинкиназы. Диагностическое значение / С.Н. Лызлова, В.Е. Стефанов // Вестник АМН. – 1987. – Вып.7. – С.29–34. 16. Колодзейская, М.В. Аминопептидазы в клинической биохимии и диагностике (обзор литературы) / М.В. Колодзейская // Лаб. дело. – 1988. №12. – С.3–6. 17. Кочетов, Г.Л. Практическое руководство по энзимологии / Г.Л. Кочетов; под ред. С.Е. Северина. – М.: Наука, 1971. – 652 с. 18. Кретович, В.Л. Введение в энзимологию / В.Л. Кретович; под ред. С.Е. Северина. – М.: Наука, 1986. – 330 с. 19. Крутецкая, З.И. Модуляция активности ионных каналов клеток арахидоновой кислотой, продуктами метаболизма и другими жирными кислотами / З.И. Крутецкая, О.Е. Лебедев // Цитология. – 1995. – Т.37. – №1-2. – С.5–66. 20. Крутько, В.Н. Подходы к «общей теории здоровья» / В.Н. Крутько // Физиология человека. – 1994. – Т.20. – №6. – С.34–41. 21. Кучеренко, И.Е. Роль мембранных фосфоинозидов в опосредовании гормональных эффектов / И.Е. Кучеренко, Я.Б. Блюм // Укр. биохим. журнал. – 1986. – Т.58. – №1. –С.86–99. 22. Литвинов, Р.И. Влияние фибронектина на превращение фибриногена в фибрин / Р.И. Литвинов, Д.М. Зубаиров // Биохимия. – 1988. – Т.53. – Вып.7. – С.1203–1211. 23. Луговской, Э.В. Первичная структура фибриногена, ее связь с конформацией и функцией молекулы / Э.В. Луговской // Укр. биохим.журнал. – 1982. – Т.54. – №5. – С.578–590. 24. Макогоненко, Е.М. Методы получения и физико-химические свойства активаторов плазминогена / Е.М. Макогоненко //Укр. биохим. журнал. – 1983. – Т.55. – №3 – С.344–350. 25. Мансурова, И.Д. К методике определения активности 5′-нуклеотидазы в сыворотке крови / И.Д. Мансурова, Р.З. Стосман //Лаб.дело. – 1973. – №4. – С.228–229. 26. Марри, Р. Биохимия человека / Р. Марри, Д. Греннер, П. Мейес, В. Родуэлл; перевод с английского, под редакцией Л.М. Гинодмана. – М.: Мир, 1993. – Т.1. –381 с. 27. Маршалл, В.Дж. Клиническая биохимия / В.Дж. Маршалл. – СПб.: БИНОМ, 2002. –С.25-68; 218–250. 209 28. Махламова, М.М. Активность лактатдегидрогеназы и ее изоферментный спектр в плазме и форменных элементах крови первичных доноров / М.М. Махламова, Ш.Ш. Шамахмудов // Мед. журнал Узбекистана. – 1980. – Т.33. С.45–48. 29. Мельничук, Д.А. Метаболическая система кислотно-щелочного гомеостаза в организме человека и животных / Д.А. Мельничук // Укр. биохим. журнал. – 1989. – Т.61. – №3. – С.3–20. 30. Михайлов, Ю.Е. Ферментные и изоферментные тесты в диагностике инфаркта миокарда при аортокоронарном шунтировании / Ю.Е. Михайлов, М.А. Шишло, О.О. Лучина, М.Н. Селезнев // Лаб. дело. – 1989. – №5. – С.48–52. 31. Пилявская, А.С. Современные представления о структуре и функции α2антиплазмина / А.С. Пилявская, С.А. Кудинов // Укр. биохим. журнал. – 1985. – Т.57. – №2. С.93–102. 32. Пучкова, А.В. Некоторые свойства рецепторов церулоплазмина, выделенного из мембраны эритроцитов человека / А.В. Пучкова, И.А. Вербина, В.В. Денежкина //Биохимия. – 1990. – Т.55. – Вып.12. – С. 2182–2189. 33. Реутов, В.П. Физиологическая роль цикла окиси азота в организме человека и животных / В.П. Реутов, Л.П. Каюшин, Е.Г. Сорокина //Физиол.чел. – 1994 – Т.20. – №3. – С. 165-173. 34. Селье, Г. На уровне целого организма / Г.Селье. – М.: Мир, 1972. – 123 с. 35. Сабурова, Е.А. Кинетические исследования механизма снятия субстратного ингибирования лактатдегидрогеназы анионами и рН / Е.А. Сабурова, Л.О. Ягодина //Биохимия. – 1990. – Т.55. – Вып. 10. – С.1819–1825. 36. Северина, И.С. Растворимая гуанилатциклаза тромбоцитов. Значение гема в регуляции ферментативной активности, роль фермента в агрегации тромбоцитов / И.С.Северина //Биохимия. – 1994. – Т.59. – Вып.3. – С.325–339. 37. Северина, И.С. Растворимые формы гуанилатциклаз. Механизм активации оксидом азота, роль в агрегации тромбоцитов / И.С. Северина //Вест. Российской АН. – 1995 – Вып.2. – С.41–46. 38. Скулачев, В.П. Феноптоз: запрограммированная смерть организма / В.П. Скулачев //Биохимия. – 1999. – Т.64. – Вып.12. – С.1679–1688. 39. Тимошенко, Л.И. Продукты расщепления фибриногена и их биологическое значение (обзор литературы) / Л.И Тимошенко. // Биохимия. – 1988. – Т.53. – Вып.4. – С.515–518. 40. Ткачук, В.А. Фосфоинозитный обмен и осцилляция ионов Са2+ / В.А. Ткачук //Биохимия. – 1998. – Т.63. – Вып.1. – С.47–56. 41. Федоров, Н.А. Функциональное и клиническое значение фибронектина плазмы крови / Н.А. Федоров, И.Н. Овчарук, А.В. Федотов //Вестник АМН. – 1987. – Вып.7. – С.35–40. 210 42. Цыганенко, А.Я. Клиническая биохимия. / А.Я Цыганенко, В.И.Жуков, В.В. Мясоедов, И.В. Завгородний. – М.: Триада-Х, 2002. – С.71–145. 43. Чирятьев, Е.А. Механизм торможения самосборки фибрина ингибитором пептидной природы / Е.А.Чирятьев, О.П. Леонова, А.Ш. Бышевский // Биохимия. – 1988. – Т.53. – Вып.6. – С.1025–1032. Глава 2 1. Возиян, П.А. Структурная организация липопротеинов плазмы крови и их взаимодействие с клеткой / П.А. Возиян, Ю.Д. Холодова // Укр. биохим. журн. – 1989. – Т.61. – №3 –. С.22–37. 2. Биохимия. Краткий курс с упражнениями и задачами /под ред. Е.С.Северина и А.Я. Николаева. – М.: Геотар-мед., 2001. – 447 с. 3. Бышевский, А.Ш. Биохимия для врача / А.Ш. Бышевский, О.А. Тарсенов. – Екатеринбург: «Уральский рабочий», 1994. – С.263– 289. 4. Гарвави, Л.Х. Адаптационные реакции и резистентность организма / Л.Х. Гарвави, Е.Б. Квакина, М.А. Уколова. – Ростов н/Д: Изд-во Ростовского университета, 1977. – 119 с. 5. Gofman, J.W. Untracentrifugal studies of lipoproteins of human serum / J.W. Gofman, F.T. Lindgren, H. Elliot // J.Biol.Chem. – 1949.– 179.– P.973– 977. 6. Кузнецов, А.С. Конформация и локализация белка в липопротеинах низкой плотности в норме и при ишемической болезни сердца / А.С. Кузнецов, И.С. Парфенова, А.Ю. Сунгуров // Укр. биохим. журн. – 1989. – Т.61. – №3. – С.47–55. 7. Климов, А.Н. Липопротеины плазмы крови и их взаимодействие с клеткой / А.Н. Климов // Укр. биохим. журн. – 1984. – Т.56. – №3. – С.345–354. 8. Климов, А.Н. Современные представления о патогенезе атеросклероза в свете развития идей Н.Н. Аничкова (к столетию со дня рождения) / А.Н. Климов, В.А. Нагорнев // Арх. пат. – 1985. – №6. – С.12–23. 9. Маркосян, К.А. Фолдинг, неправильный фолдинг и агрегация белков. Образование телец включения и агресом / К.А. Маркосян, Б.И. Курганов //Биохимия. – 2004. – Т.69. – Вып.9. – С.1196–1212. 10. Марри, Р. Биохимия человека / Р.Марри, Д. Греннер, П. Мейес, В. Родуэлл. – М.: Мир, 1993. – Т.2. – 414 с. 11. Маршалл, В.Дж. Клиническая биохимия / В.Дж. Маршалл.– СПб.:БИНОМ, 2002. – С.25–68; 218–250. 12. Наградова, Н.К. Сворачивание белков в клетке: о механизмах его ускорения / Н.К. Наградова // Биохимия. – 2004. – Т.69. – Вып.8. – С.1021-1209. 13. Превентивная кардиология: Руководство / А.В. Виноградов, А.Н. Климов, А.И. Клиорин; под ред. Г.И. Косицкого. – М.: Медицина,1987. 512с. 211 14. Титов, В.Н. Молекулярные механизмы формирования гиперлипопротеидемий (обзор литературы) / В.Н. Титов, И.Ф. Чернядиева, М.М. Громадова //Биохимия. – 1988. – Т.53. – Вып.4. – С.707–714. 15. Цыганенко, А.Я. Клиническая биохимия. / А.Я. Цыганенко, В.И. Жуков, В.В.Мясоедов, И.В. Завгородний.– М.: Триада-Х, 2002. – С.71–145. Глава 3 1. Алесенко, А.В. Функциональная роль сфингозина в индукции пролиферации и гибели клеток (обзор) / А.В Алесенко //Биохимия. – 1998. – Т.63. – Вып.1. – С.75–82. 2. Альтшулер, М.Л. Теломераза в свете современных представлений о злокачественной трансфорации клетки / М.Л. Альтшулер, С.Е. Северин, А.И. Глухов //Биохимия. – 2003 – Т.68. – Вып. 12. – С.1587–1596. 3. Белоусова, З.П. Токсичность химических соединений / З.П. Белоусова, П.П. Пурыгин. – Самара: Изд-во «Самарский университет», 2004. – 111 с. 4. Берман, А.Е. Структура и сигнальные функции интегринов / А.Е. Берман, Н.И. Козлова, Г.Е. Морозевич // Биохимия. – 2003. – Т.68. – Вып.12. – С.1597–1615. 5. Голубев, А.Г. Изнанка метаболизма / А.Г. Голубев // Биохимия. – 1996. – Т.61. – Вып.11. – С.2018–2939. 6. Гордий, С.К. Адренергические и холинэргические механизмы регуляции эффективности дыхания секреторных клеток // С.К. Гордий, И.В. Шостаковская, Н.М. Долиба // Физиол. журн. укр. – 1994. – Т.40. – С. 46–56. 7. Долиба, Н.М. Синергизм действия α-кетоглутарата и ацетилхолина на энергетический обмен в митохондриях / Н.М. Долиба, Н.Н. Кургалюк, Ф.В. Музыка // Физиол. журн. укр. – 1993. – Т.39. – С.65–70. 8. Дятловицкая, Э.В. Сфинголипиды и злокачественный рост / Э.В. Дятловицкая //Биохимия. – 1995. – Т.60. – Вып.6. – С.843–849. 9. Зенков, Н.К. Активированные кислородные метаболиты в биологических системах / Н.К. Зенков, Е.Б. Меньщикова //Усп. совр. биологии. – 1993. – Т.113. – Вып.3. – С.286–297. 10. Зенков, Н.К. Внутриклеточный окислительный стресс и апоптоз / Н.К. Зенков, Е.Б. Меньщикова, Н.Н. Вольский, В.А. Козлов //Усп. совр. биол. – 1999. – Т.119. – №5. – С.440–450. 11. Кленова, Н.А. Биохимические механизмы дезинтеграции эритроцитов человека: дис. … д-ра биол. наук: 03.00.04; защищена 03.07.03: утв. 31.10.03 / Кленова Наталья Анатольевна. Тюмень, 2003. – 271 с. 12. Кондрашова, М.Н. Взаимодействие процессов переаминирования и окисления карбоновых кислот при разных функциональных состояниях ткани / М.Н. Кондрашова // Биохимия. –1991. – Т.56. – С.388–403. 13. Костюк, В.А. Спектрофотометрическое определение диеновых коньюгатов / В.А. Костюк, А.И. Потапович, Е.Ф. Лунец //Вопр. мед. химии. – 1984. – №4. – С.125–127. 212 14. Кургалюк, Н.Н. Оксид азота как фактор адаптационной защиты при гипоксии / Н.Н. Кургалюк // Успехи физиологических наук. – 2002. – Т.33. – №4. – С.65–77. 15. Лихтенштейн, А.В. Рак как программируемая гибель организма / А.В. Лихтенштейн // Биохимия. – 2005. – Т.70. – Вып.9. – С.1277–1288. 16. Малышев, И.Ю. Стресс, адаптация и оксид азота / И.Ю. Малышев, Е.Б. Манухина // Биохимия. – 1998. – Т.63. – С.992–1006. 17. Моргункова, А.А. Семейство генов р53: контроль клеточной пролиферации и программ развития организма / А.А. Моргункова // Биохимия. – 2005. – Т.70. – Вып.9. – С. 1157–1176. 18. Пальцев, М.А. Межклеточные взаимодействия / М.А. Пальцев, А.А. Иванов. – М.: Медицина, 1995. – 224 с. 19. Проскуряков, С.Я. Некроз – активная, управляемая форма программируемой клеточной гибели / С.Я. Проскуряков, В.Л. Габай, А.Г. Коноплянников // Биохимия. – 2002. – Т.67. – Вып.4. – С.467–491. 20. Пурыгин, П.П. Основы химической токсикологии / П.П. Пурыгин, З.П. Белоусова. – Самара: Изд-во «Самарский университет», 2004. – 49 с. 21. Самуилов, В.Д. Программируемая клеточная смерть / В.Д. Самуилов, А.В. Олескин, Е.М. Лагунова. // Биохимия. – 2000. – Т.65. – Вып.8. –С.1029-1046. 22. Серых, М.М. Основы молекулярной эндокринологии / М.М. Серых, В.В.Зайцев, Н.А. Кленова, А.М. Петров, В.Г. Подковкин, М.Ю. Языкова; под общ. ред. М.М.Серых и В.Г. Подковкина. – Самара, 2004. – 147 с. 23. Симоненков, А.П. Аргументы в пользу уточнения классификации гипоксических состояний / А.П. Симоненков // Бюлл. эксперим. биологии и медицины. – 1999. – Т.127. – С.146–151. 24. Скулачев, В.П. Снижение внутриклеточной концентрации О2 как особая функция дыхательных систем клетки / В.П. Скулачев //Биохимия. – 1994. – Т.59. – С.1910–1912. 25. Скулачев, В.П. Феноптоз: запрограммированная смерть организма / В.П. Скулачев //Биохимия. – 1999. – Т.64. – Вып.12. – С.1679–1688. 26. Юрин, В.М. Основы ксенобиологии / В.М. Юрин. – Минск: ООО «Новое знание», 2002. – 261 с. 213 Учебное издание Кленова Наталья Анатольевна БИОХИМИЯ ПАТОЛОГИЧЕСКИХ СОСТОЯНИЙ Учебное пособие Редактор Т.И.Кузнецова Компьютерная верстка, макет Н.П. Бариновой Подписано в печать 29.08.06. Формат 60х84 1/16 Бумага офсетная. Печать офсетная. Усл. печ.л. 12,53; уч.– изд. л. 13,5 Тираж 150 экз. Заказ № Издательство «Самарский университет» 443011 г. Самара. ул. Акад. Павлова,1. Отпечатано на УОП СамГУ. 214 ДЛЯ ЗАМЕТОК 215 216