ПОЛОВЫЕ И ВИДОВЫЕ ОСОБЕННОСТИ NO–ЗАВИСИМЫХ

На правах рукописи
БИЛАЛОВ ИЛЬФАТ НУРАХМАТОВИЧ
ПОЛОВЫЕ И ВИДОВЫЕ ОСОБЕННОСТИ NO–ЗАВИСИМЫХ
МЕХАНИЗМОВ РЕГУЛЯЦИИ ДЕЯТЕЛЬНОСТИ ПОЧЕК
03.03.01 – физиология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Казань-2015
2
Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном
образовательном учреждении высшего профессионального образования
«Казанская государственная академия ветеринарной медицины имени
Н.Э.Баумана»
Научный руководитель:
Каримова Руфия Габдельхаевна
доктор биологических наук, доцент
Официальные оппоненты: Ситдиков Фарит Габдулхакович – доктор
биологических наук, профессор кафедры анатомии,
физиологии и охраны здоровья человека ФГБОУ ВПО
«Казанский (Приволжский) федеральный университет»
Мартусевич
Андрей
Кимович
–
доктор
биологических наук, старший научный сотрудник
отделения экспериментальной медицины ФГБУ
«Приволжский
федеральный
медицинский
исследовательский
центр»
Министерства
здравоохранения Российской Федерации
Ведущая организация:
Федеральное
государственное
бюджетное
образовательное
учреждение
высшего
профессионального образования «Ставропольский
государственный аграрный университет»
Защита диссертации состоится « 09 » октября 2015 года в « 16:00 » часов на
заседании диссертационного совета Д-220.034.02 при ФГБОУ ВПО «Казанская
государственная академия ветеринарной медицины имени Н.Э.Баумана» по адресу:
42009 г. Казань, Сибирский тракт,35.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального
государственного
бюджетного
образовательного
учреждения
высшего
профессионального
образования «Казанская государственная академия
ветеринарной медицины имени Н.Э.Баумана».
Автореферат разослан « 8 » августа 2015 года и размещён на сайтах
http://www.vak.ed.gov.ru/и http://www.ksavm.senet.ru/
Учёный секретарь диссертационного совета,
доктор биологических наук,
профессор
Гильмутдинов Рустам Якубович
3
1 Общая характеристика работы
Актуальность темы Оксид азота II (NO) является короткоживущей и легко
подвергающейся химическим трансформациям, высоко реактивной сигнальной
молекулой, оказывающей пусковое и модулирующее влияние на многие
физиологические процессы.
В 1980 г. R. F. Furchgott и J. W. Zawadzki впервые описали релаксацию кусочков
аорты с интактным эндотелием в ответ на ацетилхолин. Это свидетельствовало о
присутствии вещества, выделяемого эндотелиальными клетками и влияющего на
миоциты, которое было названо эндотелий-зависимым релаксирующим фактором
(EDRF) (Furchgott R.F., Zawadzki J.W. The obligatory role of endothelial cells in the
relaxation of vascular smooth muscle by acetylcholine // Nature. – 1980. – V. 286. –
Р. 373-376). Позже R.M.J. Palmer et al. установили, что эндотелий-зависимый
релаксирующий фактор – это оксид азота (II) (Palmer R.M.J., FerrigeA.G., Moncada S.
Nitric oxide release accounts for the biological activity of endothelium-derived relaxing
factor // Nature. – 1987. – V. 327. – Р. 534-526).
Оксид азота, синтезируемый в эндотелиальных, мезангиальных и эпителиальных
клетках почек участвует в регуляции ренального кровотока, водно-солевого обмена
(Марков Х.М. Окись азота в физиологии и патологии почек // Вестник РАМН. –
1996. – № 7. – С. 73-78) процессов фильтрации (The complex role of nitric oxide in the
regulation of glomerular ultrafiltration / R.C. Blantz, A. Deng, M. Lortie et. al // Kidney
Int. – 2002. – V. 61. – P. 782–785), реабсорбции, секреции, инкреции (Nitric oxide
production by mouse renal tubules can be increased by a sodium-dependent mechanism /
S. Kempson, N. Thompson, L. Pezzuto, H. Glenn Bohlen // Nitric Oxide. – 2007. – V.
17(1). – P. 33-43). Экспериментально доказано, что расположение изоформ NOсинтаз в почках имеет половую специфичность (Renal NOS activity, expression, and
localization in male and female spontaneously hypertensive rats / C.S. Jennifer, L.P.
Jennifer, A.H. Kelly,, S.P. Jennifer // Am. J. Physiol. – 2010. – V. 298. – P. 61-69) и более
высокая активность системы оксида азота выявлена у самок (Sex-related differences
in nitric oxide content in healthy and hypertensive rats at rest and under stress conditions/
O.V.Glushkovskaya-Semyachkina, T.G. Anishchenko, T.A. Sindyakova, O.V. Leksina,
V.A. Berdnikova // Bull. Exp. Biol. Med. – 2006. – V. 142. – P. 9-11). Однако вопрос о
состоянии системы NO у разных видов животных и половой специфичности
эффектов доноров оксида азота или ингибиторов его синтаз на регуляцию
деятельности почек, остается актуальным на сегодняшний день.
Степень разработанности темы Теоретической базой для исследования
системы оксида азота послужили труды Х.М. Маркова (1996-2001 г.г.), N.G.
Majmudar et al. (1999-2000 г.г.), O.V. Glushkovskaya-Semyachkina et al. (2006-2011
г.г.), C. Jennifer Sullivan et al. (2006-2010 г.г.), Р.Г. Каримовой (2009-2015 г.г.).
Х.М. Марков (1996) экспериментально доказал участие оксида азота в почечных
процессах и написал несколько обзоров о роли NO в физиологии и патологии почек
(Марков Х.М. Окись азота в физиологии и патологии почек // Вестник РАМН. –
1996. – № 7. – С. 73-78). O.V. Glushkovskaya-Semyachkina et al. (2006), N.G.
Majmudar et al. (2000) установили, что общая активность системы оксида азота в
организме у самок намного выше, чем у самцов животных (Sex-related differences in
nitric oxide content in healthy and hypertensive rats at rest and under stress conditions /
4
O.V. Glushkovskaya-Semyachkina, T.G. Anishchenko, T.A. Sindyakova, O.V. Leksina,
V.A. Berdnikova // Bull. Exp. Biol. Med. – 2006. – V. 142. – P. 9-11; Majmudar N.G.,
RobsonS.C., Ford G.A. Effects of the menopause, gender, and estrogen replacement
therapy on vascular nitric oxide activity // J. Clin. Endocrinol. Metab. – 2000. – V. 85. – P.
1577-1583). Исследования C.S. Jennifer et al. посвящены изучению активности
различных изоформ NO-синтаз в почечной ткани, которые выясняли половую
специфичность в их расположении (C.S. Jennifer et al. 2010). Исследования Р.Г.
Каримовой посвящены изучению комплексной нитроксидергической реакции
организма на соединения бензофуроксанового ряда, которые являются экзогенными
донорами оксида азота (Каримова Р.Г., Гарипов Т.В. Полезный приспособительный
эффект нитроксидергической системы // Известия Самарской сельскохозяйственной
академии. – 2011. – № 1. – С. 42-46).
Половая специфичность системы оксида азота, а также половые особенности
эффектов доноров NO и ингибиторов его синтаз на различные процессы,
протекающие в организме, в частности в почках, остается не изученной.
Цель исследования – изучить половые и видовые особенности
NO–зависимых механизмов регуляции деятельности почек.
В соответствии с целью были поставлены следующие задачи:
1. Определить половые особенности системы оксида азота у разных видов
животных;
2. Изучить зависимость физиологических эффектов доноров оксида азота и
ингибитора NO-синтаз на гидроуретическую функцию почек от пола животного;
3. Изучить зависимость физиологических эффектов доноров оксида азота и
ингибитора NO-синтаз на ионоуретическую функцию почек от пола животного;
4. Изучить зависимость физиологических эффектов доноров оксида азота и
ингибитора NO-синтаз на процессы фильтрации, реабсорбции, секреции в
почках от пола животного;
5. Изучить влияние доноров NO на процессы фильтрации, реабсорбции и секреции
на модели острой почечной недостаточности.
Научная новизна. Впервые установлено, что система оксида азота
видоспецифична и ее активность, а также физиологические эффекты доноров NO и
ингибитора NOS зависят от пола животного. Концентрация метаболитов оксида
азота в плазме крови и моче зависит от дозы и путей введения доноров оксида
азота и ингибитора его синтаз.
Выявлено, что изменение активности системы оксида азота путем введения
доноров оксида азота и ингибитора NO-синтаз, сопровождается изменением
почечных процессов фильтрации, реабсорбции и секреции в зависимости от пола
животного. Половая специфичность выявлена в процессе секреции при введении
эндогенного донора – L-аргинина, в процессе реабсорбции – при введении
экзогенного донора – хлофузана.
Впервые показано, что в модели острой почечной недостаточности введение
доноров оксида азота восстанавливает выделение ионов натрия, хлора, реабсорбцию
воды, а также снижает концентрацию мочевины и креатинина в сыворотке крови,
увеличивая их экскрецию с мочой. Восстановление экскреции мочевины и
креатинина с мочой, а также реабсорбции воды происходит более эффективно при
5
введении эндогенного донора – L-аргинина, а восстановление экскреции ионов с
мочой, при введении экзогенного донора – хлофузана.
Теоретическая и практическая значимость работы. Данная работа
содержит новые решения актуальной научной проблемы выявления половой
специфичности системы NO организма у разных видов животных. Установленные
факты о половой специфичности системы оксида азота позволяют научно
обоснованно организовывать эксперименты и создавать оптимальные условия для
грамотной интерпретации полученных результатов при физиологических и
патологических состояниях. Установленные изменения в организме при
поступлении доноров оксида азота и ингибитора NO-синтаз расширяют
представления о половой специфичности деятельности почек, что необходимо
учитывать для правильной дозировки препаратов, являющихся NO донорами, при
лечении различных заболеваний.
Доноры оксида азота можно применять как средства, восстанавливающие
процессы реабсорбции и секреции в почках при лечении нефропатий.
Результаты исследований внедрены в учебный процесс в ФГБОУ ВПО
«Казанская
государственная
академия
ветеринарной
медицины
имени
Н.Э. Баумана», а также могут быть использованы в учебно-методическом процессе
на биологических, ветеринарных и медицинских факультетах ВУЗов.
Методология и методы исследования Основой для наших исследований
явилось участие оксида азота в различных физиологических и патофизиологических
процессах в организме. Предметом исследования служила система оксида азота в
аспекте ее участия в регуляции различных процессов и функций почек.
Особенности NO-зависимых механизмов регуляции фильтрации, реабсорбции
и секреции у животных разного пола определяли при повышении и снижении
активности системы оксида азота за счет применения доноров NO и ингибитора его
синтаз. Активность системы оксида азота определяли по концентрации нитрат- и
нитрит-анионов в крови и моче.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Система оксида азота видоспецифична. В плазме крови и моче крыс, кошек,
коров, овец уровень метаболитов NO выше у самок; в плазме крови и моче
кроликов – у самцов. Физиологические эффекты доноров NO и ингибитора его
синтаз зависят от пола животного.
2. Концентрация метаболитов оксида азота в плазме крови и моче зависит от
дозы и путей введения доноров оксида азота и ингибитора его синтаз.
Максимально эффективная доза L-аргинина при внутрижелудочном
введении – 200 мг/кг, при внутрибрюшинном введении – 20 мг/кг; хлофузана
– 2 мг/кг; L-NAME – 20 мг/кг.
3. Объем суточного диуреза, интенсивность экскреции натрия и калия
положительно коррелирует с содержанием нитрат- и нитрит-анионов в плазме
крови. Повышение объема диуреза, натрийуреза и калийуреза при введении
доноров
NO
обусловлено
снижением
канальцевой
реабсорбции,
интенсивность которой при введении эндогенного донора оксида азота
L-аргинина ниже у самцов, а при введении экзогенного донора хлофузана – у
самок.
6
4. В модели острой почечной недостаточности введение доноров оксида азота
восстанавливает секрецию мочевины, экскрецию ионов хлора, натрия и
реабсорбцию воды. Восстановление экскреции мочевины и креатинина с
мочой, а также реабсорбции воды происходит более эффективно при введении
эндогенного донора L-аргинина, а восстановление экскреции ионов с мочой –
при введении экзогенного донора хлофузана.
Степень достоверности и апробация результатов Результаты исследования
обработаны с помощью компьютерной программы на базе Microsoft Eхel, степень
достоверности определена
по критерию Стъюдента. Основные результаты
исследований доложены и получили одобрение на: Международной научнотехнической конференции «Прикладная электродинамика, фотоника и живые
системы» (Казань, 2013); 17-ой международной Пущинской школы конференции
молодых ученых «Биология – наука ХХI века» (Пущино, 2013); ХХII съезде
физиологического общества имени И.П. Павлова (Волгоград, 2013);
Международной научной конференции «Научное и кадровое обеспечение
инновационного развития агропромышленного комплекса» посвященная 140-летию
академии (Казань, 2013); XIII Всероссийской молодежной научной конференции
«Физиология человека и животных: от эксперимента к клинической практике»
(Сыктывкар, 2014); 18-ой международной Пущинской школы конференции молодых
ученых «Биология – наука ХХI века» (Пущино, 2014); Всероссийской научнопрактической конференции «Ветеринарная медицина и зоотехния, образование,
производство: актуальные проблемы» (Казань, 2014); Международной научной
конференции «Актуальные вопросы зоотехнии и ветеринарной медицины: опыт,
проблемы и пути их решения», посвященная 95 летию зоотехнического образования
в Казанской государственной академии ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана
(Казань, 2015).
Основное содержание работы
2 Материалы и методы исследования
Исследования проведены в условиях лаборатории кафедры физиологии и
патофизиологии ФГБОУ ВПО «Казанская государственная академия ветеринарной
медицины имени Н.Э. Баумана» в период с 2010 по 2015 годы в соответствии с
планом научных исследований (номер государственной регистрации 01980002094).
Исследования проведены на 425 белых нелинейных крысах обоего пола
массой тела 220-250 г, на 10 крольчихах и на 10 кролях, на 10 овцематках и на 10
баранах, содержащихся в виварии кафедры физиологии и патофизиологии, на 10
кошках и на 10 котах неопределенной породы в ЛКЦ Казанской государственной
академии ветеринарной медицины, на 5 коровах и 5 быках в хозяйствах «Красный
восток» Апастовского района республики Татарстан. Для решения задач,
поставленных в рамках данной работы, исследовали 550 проб крови и 515 проб
мочи. У крыс кровь брали из хвостовой вены, у овец – из яремной вены, у кошек и
кроликов – из бедренной вены в строго определенное время - 8-9 часов дня.
Содержание животных соответствовало правилам по устройству,
оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев),
утвержденным МЗ СССР 06.07.73. Кормили лабораторных животных натуральными
7
и брикетированными кормами в соответствии с нормами, утвержденными приказом
МЗ СССР от 12.-8.77.
Таблица 1 – Общая схема исследований
Определение половой специфичности системы оксида азота в регуляции
деятельности почек
1. Половые особенности системы оксида азота у разных видов животных
Определение метаболитов оксида азота
(нитрат-, нитрит-анионов) в плазме крови и моче нелинейных крыс, кроликов,
кошек, овец, коров и быков
2. Зависимость физиологических эффектов доноров оксида азота и ингибитора NOсинтаз от пола животного
Интактные
крысы:
самцы
самки
Контрольнагрузка
дистил.
водой
Нагрузка L- аргинином в дозе:
Нагрузка
Нагрузка
хлофузаном L-NAME
Внутрижелудоч Внутрибрюшин в дозе:
в дозе:
ное введение
ное введение
1 мг/кг
10 мг/кг
2 мг/кг
20 мг/кг
20 мг/кг
100 мг/кг
200 мг/кг
500 мг/кг
1000 мг/кг
3. Зависимость физиологических эффектов доноров оксида азота и ингибитора NOсинтаз на гидроуретическую функцию почек от пола животного
Интактные
Контроль Нагрузка
Нагрузка
Нагрузка L-NAME
крысы:
нагрузка
L- аргинином хлофузаном в
в дозе:
в дозе:
дозе:
самцы дистил.
200 мг/кг
2 мг/кг
20 мг/кг
самки водой
4. Зависимость физиологических эффектов доноров оксида азота и ингибитора NOсинтаз на ионоуретическую функцию почек от пола животного
Интактные
Контроль Нагрузка
Нагрузка
Нагрузка L-NAME
крысы:
нагрузка
L- аргинином хлофузаном в
в дозе:
в дозе:
дозе:
самцы дистил.
200 мг/кг
2 мг/кг
20 мг/кг
самки водой
5. Зависимость физиологических эффектов доноров оксида азота и ингибитора NOсинтаз на процессы фильтрации, реабсорбции, секреции в почках от пола
животного
при нагрузке донорами оксида азота и игибитором NOсинтаз
6. Влияние доноров NO на процессы фильтрации, реабсорбции и секреции на модели
острой почечной недостаточности
8
Коров и быков кормили сбалансированным рационом, утвержденным в
хозяйствах Апастовского района республики Татарстан. Экспериментальные группы
животных формировали с учетом массы тела и пола. При проведении
экспериментов
были
использованы
физиологические,
биохимические
(кинетические,
колориметрические,
спектрофотометрические)
методы
исследования.
Суммарную концентрацию нитрат- и нитрит-анионов в плазме крови и моче
определяли путем восстановления нитратов в нитриты цинковой пылью (ООО
«Арсенал», Украина) и последующим определением концентрации нитритов
спектрофотометрическим методом на "Фотометре фотоэлектрическом КФК – 3 – 01
– ЗОМЗ" (Россия) при длине волны 520 нм с использованием реактива Грисса.
Концентрацию натрия, калия, хлоридов, кальция, неорганического фосфора,
общего белка, мочевины и креатинина в сыворотке крови и моче определяли на
анализаторе биохимическом фотометрическом кинетическом «Би-Ан» (Россия) с
использованием набора реактивов («Ольвекс», Россия).
Скорость клубочковой фильтрации определяли пробой Реберга-Тареева по
формуле Кокрофта-Голта.
Статистическую обработку результатов эксперимента проводили с
использованием критерия Стьюдента.
3 Собственные исследования
1.1 Половые особенности системы оксида азота у разных видов животных
Установили, что содержание нитрат- и нитрит-анионов (NOх) в плазме крови
видоспецифично: у крыс составляет – 33…35 мкмоль/л, у овец – 34…39 мкмоль/л, у
кошек – 47…77 мкмоль/л, у кроликов – 51…87 мкмоль/л, у крупного рогатого скота
– 70…73 мкмоль/л. Наименьшая активность системы оксида азота отмечается у
крыс и овец. У крыс-самок концентрация метаболитов в плазме крови составляет
35,57±2,577 мкмоль/л, у крыс-самцов – 32,19±2,526 мкмоль/л, у овцематок –
39,19±0,782 мкмоль/л, баранов – 34,36±0,782 мкмоль/л.
У кроликов образование оксида азота происходит также интенсивно: у самцов
уровень метаболитов NO составляет 87,95±2,069 мкмоль/л (р<0,005), у самок –
51,99±1,024 мкмоль/л (р<0,001).
Видоспецифичность характерна и для содержания метаболитов NO в моче: у
кошек – 29…48 мкмоль/л, у крыс – 65…69 мкмоль/л, у овец – 77…93 мкмоль/л, у
кроликов – 77…104 мкмоль/л. Уровень содержания NOх в моче у крыс (самцы и
самки), овец (самки) и крольчих одинаков, находится в пределах 67…73 мкмоль/л.
При этом у кошек, котов, овцематок, крольчих отмечается отрицательная
корреляция с содержанием нитрат- и нитрит-анионов в плазме крови (у кошек
r= -0,99 (р<0,001), и котов r= -0,81 (р<0,005), овцематок r= -0,54 (р<0,001), крольчих
r= - 0,18 (р<0,001)); а у крыс (у самок r= 0,71; р<0,01 и у самцов r= 0,76; р<0,001),
баранов (r= 0,99; р<0,001), кроликов-самцов (r= 0,50; р<0,001) положительная
корреляция.
Результаты экспериментов показали, что система NO у разных видов животных
имеет половую специфичность. Образование оксида азота в организме у самок
протекает более интенсивно. Так, у баранов содержание NOх в крови выше на 13 %
(р<0,01), в моче на 21 % (р<0,001), чем у самок, у кошек этот показатель в плазме
9
крови выше на 63 % (р<0,001), в моче – на 65 % (р<0,005). Однако, у кроликов
отмечается обратная зависимость: у самцов концентрация NOх в плазме крови выше
на 70 % (р<0,001), уровень нитрат- и нитрит-анионов в моче выше – на 35 %
(р<0,005), относительно аналогичного показателя у самок.
Таким образом установлено, что система оксида азота, о которой мы судили
по содержанию стабильных метаболитов нитрат- и нитрит-анионов в крови и моче,
имеет видовую и половую специфичность.
3.2 Гендерная зависимость физиологических эффектов доноров оксида
азота и ингибитора NO-синтаз на гидроуретическую функцию почек
Ранее установленная зависимость активности системы оксида азота от вида и
пола животного вызвала необходимость изучения эффектов при нагрузке донорами
NO и ингибитором синтаз оксида азота.
3.2.1. Содержание суммарного количества нитрат-и нитрит-анионов в
плазме крови и моче белых крыс разного пола при нагрузке L-аргинином
Для выявления зависимости активности системы оксида азота при нагрузке
субстратом для NOS от пола, дозы и путей введения L-аргинина были созданы
10 групп крыс, состоявших из половозрелых самок (n=5) и 10 групп, состоявших из
самцов. L-аргинин вводили в виде 10 % раствора в дозах 20 мг/кг, 100 мг/кг,
200 мг/кг, 500 мг/кг и 1000 мг/кг внутрижелудочно (таблица 2).
Таблица 2 - Содержание метаболитов NO в плазме крови и моче крыс в
зависимости от пола (n=5)
Содержание метаболитов NOх, мкмоль/л
Группа животных
в плазме крови
в моче
самки
самцы
самки
самцы
2
2
Контроль
39,92±6,819
46,68±2,577
93,99±1,536
73,71±6,564
Интактные
35,57±2,577
32,19±2,526
67,19±5,702
67,43±1,982
2
1, 2
L-аргинин 20 мг/кг
43,78±5,640
43,54±2,911
109,68±3,331
99,06±4,5511, 2
L-аргинин 100 мг/кг
53,19±4,355 2
52,95±6,952 2 162,3±8,5891 2
110,16±2,4201, 2
L-аргинин 200 мг/кг 112,33±3,7041, 2 64,29±5,9051 2 111,36±6,9271 2 135,02±1,9391, 2
L-аргинин 500 мг/кг
42,09±2,069
26,88±2,526 1 208,65±7,3551 2 202,13±10,6471 2
L-аргинин
1000
25,19±0,5121, 2 57,29±3,3321, 2 128,27±3,7041 2 133,58±5,9791, 2
мг/кг
Хлофузан 1 мг/кг
56,57±3,7741, 2
65,26±3,4091, 2 134,78±2,5772
178,23±9,2222
Хлофузан 2 мг/кг
70,57±4,3551, 2
32,43±3,309
166,16±7,3552
120,54±18,9832
L-name 10 мг/кг
26,63±1,0242
23,98±1,5641, 2 44,74±4,1912
36,78±1,541, 2
L-name 20 мг/кг
18,43±1,2891, 2
9,98±1,0241, 2
32,67±1,289 1, 2 30,50±4,2941, 2
Примечание: 1 - достоверно по сравнению с контрольной группой (р<0,05)
2
- достоверно по сравнению с интактной группой (р<0,05)
Выявлены половые особенности и дозозависимый характер изменения
уровня содержания нитрат- и нитрит-анионов в крови и моче у крыс при введении
субстрата NO-синтаз – L-аргинина. Максимальное повышение концентрации
метаболитов NO отмечается при внутрижелудочном введении L-аргинина в дозе
200 мг/кг, при внутрибрюшинном – в дозе 20 мг/кг. Зависимость уровня нитрат- и
10
нитрит-анионов в крови и моче крыс от дозы L-аргинина носит параболический
характер (таблица 2).
Установлено, что повышение активности системы оксида азота при введении
эндогенного донора NO имеет половую специфичность. При внутрижелудочном
введении L-аргинина в дозе 200 и 500 мг/кг содержание нитрат- и нитрит-анионов в
плазме крови у крыс-самок выше в 1,75 раза (р<0,005) и 1,57 раза (р<0,01)
соответственно относительно уровня метаболитов NO. При внутрибрюшинном
введении L-аргинина (20 мг/кг) отмечается похожая картина.
Уровень метаболитов оксида азота в крови крыс-самцов в 1,22 раза (р<0,05)
выше, чем у самцов. Следовательно, физиологический эффект L-аргинина у крыссамок проявляется более интенсивно, чем у самцов.
3.2.2 Объем суточного диуреза и потребляемой воды белых крыс разного
пола при нагрузке L-аргинином
При нагрузке L-аргинином в дозе 20 мг/кг у самок отмечено увеличение
объема мочи в 1,48 раза (р<0,001), в дозе 100 мг/кг – в 1,98 раза (р<0,001); в дозе 200
мг/кг – в 1,69 раза (р<0,001). Введение субстрата NOS в дозе 1000 мг/кг приводит к
уменьшению исследуемого показателя в 1,67 раза (р<0,001) относительно интактной
группы. У крыс-самцов при нагрузке L-аргинином в дозе 100 мг/кг объем мочи
увеличивается в 2,9 раза (р<0,001), в дозе 200 мг/кг – в 3,34 раза (р<0,001)
относительно интактной группы (таблица 3).
Таблица 3 - Количество суточного диуреза и объем выпитой воды за сутки у крыс
разного пола (n=5)
Доза, мг/кг
Объем мочи, мл/100г
самки
самцы
2,74±0,352
1,94±0,211
1,62±0,096
1,48±0,243
1,2
2,39±0,111
2,07±0,272
1,2
3,21±0,211
4,35±0,2661,2
2,74±0,1211,2 4,94±0,1011,2
2,07±0,286
1,46±0,231
1,2
0,97±0,066
1,06±0,0711
Контроль
Интактные
L-аргинин 20 мг/кг
L-аргинин 100 мг/кг
L-аргинин 200 мг/кг
L-аргинин 500 мг/кг
L-аргинин
1000
мг/кг
Хлофузан 1 мг/кг 7,11±1,9861,2
Хлофузан 2 мг/кг 8,35±0,6792
3,27±0,5661,2
1,80±0,3631,2
Объем воды, мл/100г
самки
самцы
1,2
4,92±0,217
4,34±0,258
8,8±0,262
6,17±0,436
1,2
6,27±0,511
6,78±,04361
6,93±0,8651,2 4,92±0,3491,2
5,85±0,3331,2 6,05±0,4141
6,1±0,7051,2
7,67±1,1681
4,06±0,3031,2 7,75±0,6141,2
8,98±0,1631
3,65±0,5131,2
9,37±0,6251,2
3,65±0,4391,2
L-name 10 мг/кг
0,92±0,1511,2 1,23±0,2251
2,78±0,5411,2 3,19±0,4151,2
L-name 20 мг/кг
2,38±0,1481,2 1,44±0,1091
5,01±0,3711,2 3,11±0,4151,2
Примечание: 1 - достоверно по сравнению с контрольной группой (р<0,05)
2
- достоверно по сравнению с интактной группой (р<0,05)
Следовательно, объем суточного диуреза зависит от продукции NO в
организме: чем больше образуется оксида азота, тем интенсивнее диурез. Между
содержанием нитрат- и нитрит-анионов в плазме крови и объемом суточного
11
диуреза наблюдается средняя положительная корреляция (r=0,58; р<0,01 для самок и
r=0,57; р<0,001 для самцов).
Эффект субстрата NOS – L-аргинина на диурез более выражен у самцов. Так,
при введении L-аргинина в дозе 100 мг/кг объем диуреза у крыс-самцов на 36 %
выше, чем у самок (р<0,01), а в дозе 200 мг/кг – на 80 % (р<0,001).
Объем потребляемой воды после нагрузки L-аргинином также изменяется в
зависимости от пола животного. Так, у крыс-самок интактной группы этот
показатель выше в 1,43 раза (р<0,05); после введения L-аргинина (100 мг/кг) – в
1,41 раза (р<0,05) по сравнению с самцами. После введения L-аргинина в более
высоких дозах (1000 мг/кг) объем потребляемой воды больше в 1,91 раза (р<0,05) у
крыс-самцов по сравнению с самками.
3.2.3 Содержание суммарного количества нитрат-и нитрит-анионов в
плазме крови и моче белых крыс разного пола при нагрузке хлофузаном
Для выявления гендерной зависимости физиологических эффектов
экзогенного донора оксида азота белым крысам вводили хлофузан внутрижелудочно
в виде 0,1 % суспензии в дозах 1 мг/кг и 2 мг/кг (таблица 2).
Установлено повышение уровня нитрат- и нитрит- анионов в крови и моче у
крыс при нагрузке экзогенным донором NO – хлофузаном.
Эффект экзогенного донора имеет половую специфичность, так при введении
хлофузана в дозе 2 мг/кг содержание нитрат- и нитрит-анионов в крови выше у
крыс-самок в 2,18 раза (p<0,001) относительно аналогичного показателя у самцов.
Нагрузка соединением фуроксанового ряда (хлофузаном) сопровождалась
дозозависимым изменением функциональной активности системы оксида азота в
организме белых крыс. Содержание метаболитов NO в моче при введении
соединения в дозе 1 мг/кг выше у крыс-самцов в 1,32 раза (p<0,01) по сравнению с
самками, в дозе 2 мг/кг выше у крыс-самок в 1,38 раза (p<0,001) по сравнению с
самцами. Таким образом, у самок зависимость уровня NOх от дозы прямая, а у
самцов – параболическая.
3.2.4 Объем суточного диуреза и потребляемой воды белых крыс разного
пола при нагрузке хлофузаном
Установлено повышение суточного диуреза при введении экзогенного
донора NO – хлофузана в дозе 1 и 2 мг/кг.
Установлено, что увеличение объема суточного диуреза при введении
экзогенного донора NO имеет половую специфичность, так при введении хлофузана
в дозе 2 мг/кг этот показатель выше у крыс-самок в 4,64 раза (р<0,001) по
сравнению с самцами.
Между содержанием нитрат- и нитрит-анионов в плазме крови и объемом
потребляемой воды наблюдается отрицательная корреляция у крыс-самок
(r= -1,0; р<0,05) и высокая положительная корреляция у крыс-самцов (r=1,0; р<0,05).
Полученные результаты указывают о большей выраженности эффекта
экзогенного донора у самок, чем у самцов.
3.2.5 Содержание суммарного количества нитрат-и нитрит-анионов в
плазме крови и моче белых крыс разного пола при нагрузке L-NAME
12
Для снижения образования оксида азота в организме белым крысам вводили
NG-nitro-L-arginine-methyl-ester (L-NAME) – неселективный ингибитор NO-синтаз в
дозах: 10 мг/кг и 20 мг/кг внутрижелудочно в виде 10 % водного раствора.
В условиях блокады NOS уровень метаболитов NO в крови у крыс снижается
в прямой зависимости от дозы вводимого ингибитора NOS. Между содержанием
нитрат- и нитрит-анионов в плазме крови при введении L-NAME в дозе 10 мг/кг и
20 мг/кг наблюдается средняя положительная корреляция у крыс-самцов (r=0,40;
р<0,01).
Степень ингибирования NO-синтаз зависит от пола животного. Так, у крыссамцов при введении в организм – L-NAME в дозе 10 мг/кг содержание метаболитов
NO в крови ниже в 1,11 раза (р<0,005) относительно их уровня у самок; а при
введении L-NAME в дозе 20 мг/кг – в 1,85 раза (р<0,05).
Концентрация нитрат- и нитрит-анионов в моче при ингибировании NOсинтаз также снижается.
3.2.6 Объем суточного диуреза и потребляемой воды белых крыс разного
пола при нагрузке L-NAME
При нагрузке L-NAME в дозе 10 мг/кг объем суточной мочи у самок
снижается в 1,76 раза (р<0,005), у самцов отмечается тенденция к снижению этого
показателя (таблица 3). Введение в организм L-NAME в дозе 20 мг/кг повышает
суточный диурез в 1,88 раза (р<0,05) по сравнению с интактной группой. У самцов
наблюдается снижение суточного объема мочи по сравнению с животными
контрольной группы в 1,35 раза (р<0,05).
Объем суточного диуреза зависит от активности NOS и от пола животного.
Так, при введении в организм L-NAME в дозе 20 мг/кг объем суточного диуреза у
крыс-самцов в 1,65 раза ниже (р<0,001), чем у самок.
Интенсивность снижения потребляемой воды при ингибировании NO-синтаз
зависит от пола животного. Так, при введении L-NAME в дозе 20 мг/кг у крыссамцов объем выпитой в течении суток воды в 1,61 раза (р<0,05) ниже по сравнению
с самками.
3.3 Гендерная зависимость физиологических эффектов доноров оксида
азота и ингибитора NO-синтаз на ионоуретическую функцию почек
Ранее была установлена половая специфичность активности системы оксида
азота и ответной реакции организма на введение доноров оксида азота и
ингибиторов его синтаз. Дальнейшие исследования направлены на выявление
половой специфичности ионоуретической функции почек при разных уровнях
активности системы NO.
3.3.1 Натрийуретическая функция почек белых крыс разного пола при
нагрузке донорами оксида азота и ингибитором NO-синтаз
Для изучения обмена ионов в организме, а также для изучения экскреторной
функции почек, были поставлены эксперименты на белых нелинейных крысах. Для
этого были созданы 8 групп крыс, состоявших из половозрелых самок: первая
группа интактная, вторая группа с нагрузкой L-аргинином в дозе 200 мг/кг, третья
группа с нагрузкой ингибитором синтаз NO – L-NAME в дозе 20 мг/кг, четвертая с
нагрузкой экзогенным донором NO хлофузаном в дозе 2 мг/кг (n=5). Аналогичные
13
группы состояли из половозрелых самцов. Для сбора мочи крыс помещали в
специальные клетки обменники.
Установлено изменение натрийуреза у крыс при применении доноров NO и
ингибитора NO-синтаз. Повышение активности системы NO путем введения
L-аргинина привело к увеличению натрийуреза, снижение активности системы при
введении L-NAME не изменяет интенсивность экскреции натрия.
После нагрузки L-аргинином содержание натрия в моче повысилось в 2,69
раза (р<0,001) и 5,04 раза (р<0,05) у самок и самцов соответственно. Между
содержанием нитрат- и нитрит-анионов в плазме крови и концентрацией натрия в
моче наблюдается средняя положительная корреляция (r=0,98; р<0,001).
Установлено увеличение концентрации натрия в сыворотке крови после
введения хлофузана у самцов в 1,25 раза (р<0,05). Между содержанием нитрат- и
нитрит-анионов в плазме крови и концентрацией натрия в сыворотке крови
наблюдается средняя положительная корреляция (r=0,68; р<0,005). Экскреция
натрия с мочой закономерно снижается у самок в 1,93 раза (р<0,05), а у самцов
остается на том же уровне.
При нагрузке L-NAME (20 мг/кг) отмечается увеличение концентрации
натрия в крови крыс-самцов в 1,45 раза (р<0,05) относительно исходного уровня, у
самок имеет лишь тенденцию к увеличению. Между содержанием нитрат- и нитританионов в плазме крови и концентрацией натрия в сыворотке крови наблюдается
отрицательная корреляция (r= -0,91; р<0,001 у самок, r= -0,30; р<0,001 у самцов).
Значение исследуемого показателя в моче достоверно не меняется.
3.3.2 Калийуретическая функция почек белых крыс разного пола при
нагрузке донорами оксида азота и ингибитором NO-синтаз
В сыворотке крови белых крыс содержание калия составляет
4,59±0,342 ммоль/л и 5,68±0,222 ммоль/л у самок и самцов соответственно. Нагрузка
физиологическим донором NO привело к увеличению калия в крови у самок
в 1,19 раза (р<0,05), у самцов этот показатель не изменился.
Содержание калия в моче меняется в зависимости от активности системы
оксида азота так у самок после нагрузки L-аргинином увеличивается в 3,74 раза
(р<0,05) и аналогично у самцов в 5,5 раза (р<0,005) по сравнению с контрольной
группой.
При поступлении хлофузана концентрации калия в сыворотке крови у крыссамцов снижается 1,13 раза (р<0,05). Между содержанием нитрат- и нитрит-анионов
в плазме крови и концентрацией калия в сыворотке крови наблюдается высокая
положительная корреляция (r=0,77; р<0,001 у самок, r=0,86; р<0,001 у самцов).
3.3.3 Хлоруретическая функция почек белых крыс разного пола при нагрузке
донорами оксида азота и ингибитором NO-синтаз
Количество хлоридов в сыворотке крови у крыс интактной группы составило у
самок 92,8±3,104 ммоль/л, а у самцов 98±2,232 ммоль/л.
Установлено, что при нагрузке L-аргинином увеличивается экскреция
хлоридов с мочой в 6,44 раза (р<0,005) и 2,49 раза (р<0,05) у самок и самцов
соответственно. Между содержанием нитрат- и нитрит-анионов в плазме крови и
концентрацией хлоридов в моче наблюдается средняя положительная корреляция у
самок (r=0,54; р<0,001) и отрицательная у самцов (r=-0,57; р<0,001).
14
В сыворотке крови содержание хлоридов после повышения активности
системы оксида азота экзогенным донором имеет тенденцию к снижению у крыссамок, а у самцов снижается в 1,08 раза (р<0,01). Между содержанием нитрат- и
нитрит-анионов в плазме крови и концентрацией хлоридов в сыворотке крови
наблюдается отрицательная корреляция у крыс-самок (r=-0,92; р<0,05) и
положительная корреляция у крыс-самцов (r=0,98; р<0,001). Экскреция хлоридов с
мочой снижается в 5,33 раза (р<0,05) и в 9,33 раза у самок и самцов соответственно.
Между содержанием нитрат- и нитрит-анионов в плазме крови и концентрацией
хлоридов в моче наблюдается средняя положительная корреляция (r=0,61; р<0,001 у
самок, r=0,97; р<0,001 у самцов).
После нагрузки L-NAME содержание хлоридов в сыворотке крови у самцов
снижается в 1,19 раза (р<0,001). Экскреция хлоридов с мочой аналогично снижается
у самцов крыс в 3,09 раза (р<0,05), а у самок крыс наблюдается лишь тенденция к
снижению по сравнению с исходными значениями. Между содержанием нитрат- и
нитрит-анионов в плазме крови и концентрацией хлоридов в моче наблюдается
положительная корреляция (r=0,21; р<0,001 у самок, r=0,97; р<0,001 у самцов).
3.3.4 Кальцийуретическая функция почек белых крыс разного пола при
нагрузке донорами оксида азота и ингибитором NO-синтаз
В сыворотке крови белых крыс содержание кальция имеет тенденцию к
снижению после нагрузки L-аргинином по отношению к исходному значению.
Соответственно происходит увеличение в моче ионов кальция у самок 2,75 раза, у
самцов – в 23,33 раза (р<0,001). Между содержанием нитрат- и нитрит-анионов в
плазме крови и концентрацией кальция в моче наблюдается положительная
корреляция: у самок (r=0,60; р<0,001) и отрицательная корреляция у самцов (r=-0,97;
р<0,001).
Введение хлофузана в организм белых крыс сопровождается увеличением
кальция в сыворотке крови у самок в 1,36 раза (р<0,001), у самцов в 1,87 раза
(р<0,001) по сравнению с исходным значением, которая имеет отрицательную
корреляцию. Экскреция кальция достоверно не меняется, имеется лишь тенденция к
увеличению у крыс обоего пола.
Снижение активности синтаз оксида азота привело к увеличению кальция в
сыворотке крови в 1,49 раза (р<0,001) и в 1,93 раза (р<0,005) у самок и самцов
соответственно. Между содержанием нитрат- и нитрит-анионов в плазме крови и
концентрацией кальция в сыворотке крови наблюдается отрицательная корреляция
(r= -0,28; р<0,005 у самок, r= -0,47; р<0,005 у самцов). Экскреция кальция с мочой
увеличивается у самок в 3,09 раза (р<0,005), у самцов – в 3,25 раза (р<0,001) по
сравнению с исходными значениями.
Эффект субстрата NO–синтаз L-аргинина на экскрецию кальция имеет
половую специфичность. Так, у крыс-самцов концентрация кальция в моче выше в
3,38 раза (р<0,001) по сравнению с самками. Ингибирование NO-синтаз влияет на
экскрецию кальция сильнее у самок, чем у самцов (выше в 1,75 раза; р<0,05).
3.3.5 Фосфоруретическая функция почек белых крыс разного пола при
нагрузке донорами оксида азота и ингибитором NO-синтаз
15
Установлено, что количество неорганического фосфора в сыворотке крови
уменьшается во всех группах при введении доноров и ингибитора оксида азота.
Экскреция исследуемого вещества с мочой имеет тенденцию к увеличению при
введении L-аргинина у самок и самцов. При введении хлофузана и L-NAME
экскреция фосфора с мочой у самок имеет тенденцию к увеличению, у самцов
достоверно уменьшается.
Установлено, что концентрация фосфора в сыворотке крови увеличивается
при введении L-аргинина, у крыс-самцов более интенсивно, чем у самок (выше в
1,47 раза (р<0,05).
Экскреция неорганического фосфора с мочой имеет лишь тенденцию к
увеличению, без достоверных отличий.
При введении хлофузана содержание фосфора в сыворотке крови снижается в
1,77 раза (р<0,01) и в 1,92 раза (р<0,005) у самок и самцов соответственно. Между
содержанием нитрат- и нитрит-анионов в плазме крови и концентрацией фосфора в
сыворотке крови наблюдается положительная корреляция (r=0,98; р<0,005).
Выявлено достоверное снижение экскреции фосфора с мочой у самцов в 5,00 раз
(р<0,05), а у самок отмечено тенденция к увеличению. Между содержанием нитрати нитрит-анионов в плазме крови и концентрацией фосфора в моче наблюдается
высокая положительная корреляция (r=0,85; р<0,001).
Снижение активности системы оксида азота привело к снижению фосфора в
сыворотке крови у самок и самцов в 1,65 раза (р<0,005) соответственно в 1,86 раза
(р<0,01). Отмечается снижение экскреции фосфора с мочой у самцов в 6,52 раза
(р<0,05), что у самок наоборот имеет тенденцию к увеличению по сравнению с
исходным значением.
При нагрузке L-аргинином увеличение концентрации нитрат- и нитританионов в крови сопровождается увеличением объема выделяемой мочи, а также
повышением экскреции ионов натрия, кальция, хлора и калия с мочой. Выявлена
половая специфичность физиологического эффекта NO на ионоуретическую
функцию почек, который более выражен у самцов.
3.4 Гендерная зависимость физиологических эффектов доноров оксида
азота и ингибитора NO-синтаз на почечные процессы: клубочковую
фильтрацию, канальцевую реабсорбцию, канальцевую секрецию
При введении L-аргинина крысам происходит увеличение протеинурии у
самцов, что не наблюдается у самок. Содержание общего белка в крови при этом не
изменяется. Ингибитор синтаз оксида азота достоверно не меняет содержание
общего белка в сыворотке крови, но повышает протеинурию. Введение хлофузана
сопровождается снижением концентрации общего белка в крови у крыс-самок и
достоверно не влияет на протеинурию.
Содержание мочевины в крови у крыс контрольной группы составляет
5,62±0,382 ммоль/л и 5,04±0,785 ммоль/л у самок и самцов соответственно.
Выделение мочевины с мочой составляет 1,66±0,187 ммоль/100г/24часа и
2,11±0,381 ммоль/100г/24часа у самок и самцов соответственно. После нагрузки Lаргинином этот показатель, достоверно увеличивается у самок 3,69 раза (р<0,01) у
самцов – в 4,24 раза (р<0,005). Между содержанием нитрат- и нитрит-анионов в
16
плазме крови и концентрацией мочевины в моче наблюдается слабая положительная
корреляция (r=0,27; р<0,001).
Установлено, что содержание мочевины в сыворотке крови при введении
хлофузана меняется в зависимости от половой специфичности, так у крыс-самок
выше в 1,35 раза (р<0,05), чем у самцов. Ингибирование NO-синтаз сопровождается
увеличением содержания мочевины в сыворотке крови у крыс-самцов в 1,16 раза
(р<0,05) по сравнению с самками.
Введение донора оксида азота L-аргинина сопровождается тенденцией
снижения скорости клубочковой фильтрации у самок, а у самцов наоборот к
увеличению. Между содержанием нитрат- и нитрит-анионов в плазме крови и
скоростью клубочковой фильтрации наблюдается высокая положительная
корреляция (r=0,99; р<0,001).
Скорость клубочковой фильтрации по креатинину снижается после введения
хлофузана у самок в 2,19 раза (р<0,05). Между содержанием нитрат- и нитританионов в плазме крови и скоростью клубочковой фильтрации наблюдается средняя
отрицательная корреляция (r=-0,56; р<0,001). Скорость клубочковой фильтрации у
самцов имеет тенденцию к снижению.
Скорость клубочковой фильтрации при введении блокаторов синтаз оксида
азота сдвигается в сторону снижения, но достоверных изменений не выявлено.
Введение эндогенного донора оксида азота – L-аргинина сопровождается
снижением реабсорбции воды у самок на 0,35 % (р<0,05), у самцов – на 0,57 %
(р<0,05) по сравнению с интактной группой. Между содержанием нитрат- и нитританионов в плазме крови и скоростью клубочковой фильтрации наблюдается высокая
положительная корреляция (r=0,76; р<0,001 у самок, r=0,15; р<0,001 у самцов).
Блокада синтаз оксида азота сопровождается увеличением канальцевой
реабсорбции воды у самцов на 0,22 % (р<0,005). Между содержанием нитрат- и
нитрит-анионов в плазме крови и канальцевой реабсорбцией наблюдается высокая
положительная корреляция (r=0,98; р<0,001).
Таким образом, установлено, что изменение активности системы оксида азота
путем введения доноров и ингибитора NO-синтаз, сопровождается изменением
почечных процессов фильтрации, реабсорбции и секреции в зависимости от пола
животного.
3.5 Влияние доноров NO на процессы фильтрации, реабсорбции и
секреции на модели острой почечной недостаточности
3.5.1 Активность системы оксида азота при экспериментальной острой
почечной недостаточности
При экспериментальной глицериновой острой почечной недостаточности
содержание нитрат- и нитрит-анионов меняется на 3 сутки, в крови увеличивается, а
в моче уменьшается.
Установлено, что при введении эндогенного донора оксида азота – L-аргинина
содержание NOх в моче повышается в 2,25 раза (р=0,001), что свидетельствует о
активности синтаз оксида азота при поступлении субстрата оксида азота –
L-аргинина (рисунок 2).
17
Содержание в крови метаболитов NO мкмоль/л
Содержание в моче метаболитов NO мкмоль/л
Уровень нитрат- и нитританионов, мкмоль/л
160
**
140
120
**
100
**
80
*
60
*
*
40
20
0
инт. гр.
конт. гр.
L-аргинин
хлофузан
Рисунок 2 – Содержание метаболитов NO в плазме крови и моче крыс после
введении доноров и ингибитора оксида азота при экспериментальной острой
почечной недостаточности (n=5)
Примечание: * - достоверно по сравнению с интактной группой (р<0,01)
** - достоверно по сравнению с контрольной группой (р<0,01)
Установлено, что при нагрузке экзогенным донором оксида азота –
хлофузаном, происходит увеличение содержания NOх в крови и моче в 1,49 раза и в
3,14 раза (р<0,001) соответственно по сравнению с контрольной группой.
Суточная экскреция с мочой конечных стабильных метаболитов оксида азота
снижается при остром повреждении почек, что свидетельствует об угнетении
синтеза оксида азота в организме.
Экзогенный донор оксида азота имеет большую активность, по сравнению с
эндогенным донором, за счет того, что образование NO не происходит
ферментативным путем.
3.5.2 Гидроуретическая и ионоуретическая функция почек после введения
доноров оксида азота при лечении экспериментальной острой почечной
недостаточности
Выход свободного миоглобина при введении глицерина, оказывает
нефротоксическое действие, образует сгустки в канальцах нефронов, а также
связывает NO, вызывая интраренальную вазоконстрикцию и ишемию почечной
ткани. Все эти изменения сопровождаются нарушениями почечных функций.
Установлено, что моделирование острой почечной недостаточности (ОПН)
введением глицерина, сопровождается увеличением суточного диуреза в 2,49 раза
(р=0,001) по сравнению с исходным значением. При нагрузке физиологическим
донором оксида азота – L-аргинином происходит еще большее увеличение диуреза у
крыс по сравнению с интактной группой в 3,35 раза (р=0,001); тогда как введение
экзогенного донора – хлофузана не приводит каким либо изменениям (остается на
высоком уровне и составляет 16,47±0,962 мл/cут (р=0,001) против 6,54±0,877 мл/cут
у интактной группы).
Содержание натрия в сыворотке крови на третий день ОПН достоверно не
меняется, а при введении L-аргинина имеет тенденцию к увеличению, хлофузаном
увеличивается в 1,13 раза (р=0,005) по сравнению с контрольной группой. Между
18
содержанием нитрат- и нитрит-анионов в плазме крови и содержанием натрия в
сыворотке крови наблюдается средняя положительная корреляция (r=0,64; р=0,01).
Оксид азота увеличивает экскрецию натрия с мочой при повышении
активности системы оксида азота, в данном случае этот эффект не наблюдается.
Экскреция натрия с мочой за сутки в контрольной группе имеет тенденцию к
увеличению, по сравнению с интактной группой. Введение эндогенного донора –
L-аргинина привело к уменьшению экскреции натрия в 2,43 раза (составило
0,21±0,027 ммоль/100г/24 часа; р=0,05), что достоверно не отличается от значений
интактных крыс (0,27±0,015 ммоль/100г/24 часа). Между содержанием нитрат- и
нитрит-анионов в плазме крови и содержанием натрия в моче наблюдается низкая
положительная корреляция (r=0,05; р=0,01). При введении экзогенного донора
происходит уменьшение экскреции натрия в 5,10 раза (р=0,03; р=0,001) по
сравнению с контрольной группой, что отрицательно коррелирует с содержанием
нитрат- и нитрит-анионов в крови (r=-0,75; р=0,05). Экзогенный донор – хлофузан
вызывает уменьшение экскреции натрия, когда объем диуреза остается на том же
высоком уровне как в контрольной группе без лечения.
Установлено, что содержание калия в крови в контрольной группе достоверно
не меняется, а при введении доноров оксида азота увеличивается. При введении
L-аргинина содержание калия в сыворотке крови выше в 1,20 раза (р=0,08; р=0,05),
что отрицательно коррелирует с содержанием нитрат- и нитрит-анионов в крови
(r=-0,09; р=0,05), а при введении хлофузана выше в 1,51 раза (р=0,001) по сравнению
с исходным значением и который положительно коррелирует с содержанием
нитрат- и нитрит-анионов в крови (r=0,26; р=0,001).
Экскреция калия с мочой увеличивается у крыс с ОПН в 1,80 раза (р=0,01), что
положительно коррелирует с содержанием нитрат- и нитрит-анионов в крови
(r=0,62; р=0,001). Введение доноров оксида азота привело к еще большему эффекту,
так при введении L-аргинина отмечается лишь тенденция к увеличению, а при
введении хлофузана выше в 1,56 раза (р=0,01), по сравнению с контрольной
группой. При этом наблюдается отьрицательная корреляция с содержанием нитрати нитрит-анионов в крови (r=0,27; р=0,001).
Установлено, что выход свободного миоглобина после введения глицерина,
сопровождается уменьшением содержания хлоридов в крови на 3 сутки в 1,10 раза
(р=0,05) и увеличением экскреции с мочой в 4,81 раза (р=0,001). Между
содержанием нитрат- и нитрит-анионов в плазме крови и содержанием хлоридов в
моче наблюдается высокая положительная корреляция (r=0,99; р=0,001). Экскреция
хлоридов с мочой имеет тенденцию к снижению при введении L-аргинина,
достоверно снижается при введении хлофузана в 2,85 раза (р=0,01), по сравнению с
контрольной группой, который слабо отрицательно коррелирует с содержанием
нитрат- и нитрит-анионов в крови (r=-0,25; р=0,05)
Содержание кальция при почечной недостаточности на 3 сутки увеличивается
в крови в 1,35 раза (р=0,01), что положительно коррелирует с содержанием нитрати нитрит-анионов в крови (r=0,90; р=0,001) и в моче в 5,00 раз (р=0,005) по
сравнению с исходным значением и достоверно не меняется в группах крыс где
производили лечение с донорами оксида азота (имеется лишь тенденция к
увеличению по сравнению с контрольной группой).
19
Выявлено увеличение фосфора в крови у крыс с ОПН в 2,44 раза (р=0,005).
Введение эндогенного донора оксида азота – L-аргинина привело к снижению
фосфора в крови в 2,44 раза (р=0,05) до исходного значения (по сравнению с
контрольной группой), что положительно коррелирует с содержанием нитрат- и
нитрит-анионов в крови (r=0,26; р=0,001). Введениие экзогенного донора –
хлофузана также снижает в крови содержание фосфора в 1,53 раза (р=0,05), что
отрицательно коррелирует с содержанием нитрат- и нитрит-анионов в крови (r=0,96; р=0,05)) и увеличивает экскрецию с мочой в 2,58 раза (р=0,01).
3.5.3 Динамика изменения почечных процессов: фильтрации, реабсорбции и
секреции после введения доноров оксида азота при лечении
экспериментальной острой почечной недостаточности
Экспериментальная острая почечная недостаточность вызванная глицерином,
сопровождается увеличением содержания мочевины в крови в 13,35 раза (р<0,001) и
уменьшением экскреции с мочой в 3,25 раза (р=0,05), что отрицательно коррелирует
с содержанием нитрат- и нитрит-анионов в крови (r=-0,87 (р=0,05)). Введение
L-аргинина снижает содержание мочевины в крови в 1,41 раза (р=0,05), что
отрицательно коррелирует с содержанием нитрат- и нитрит-анионов в крови (r=-0,99
(р=0,01). Аналогично экскреция мочевины с мочой увеличивается в 8,80 раза
(р=0,01) по сравнению с контрольной группой, что положительно коррелирует с
содержанием нитрат- и нитрит-анионов в крови (r=0,82 (р=0,001)). Введение
хлофузана сопровождается тенденцией к снижению мочевины в крови и
достоверным увеличением экскреции с мочой в 8,37 раза (р=0,005), но с
отрицательной корреляцией с содержанием нитрат- и нитрит-анионов в крови
(r=-0,39 (р=0,05)). Оксид азота увеличивает экскрецию мочевины, большую
активность проявляет эндогенный донор.
Содержание креатинина в крови — величина довольно постоянная, тем не
менее почечная недостаточность сопровождается увеличением его в 13,90 раза
(р<0,0001) и снижением секреции с мочой в 3,25 раза (р=0,08), что положительно
коррелирует с содержанием нитрат- и нитрит-анионов в крови (r=0,06; р=0,01).
Введение L-аргинина сопровождается снижением креатинина в крови 2,86 раза
(р=0,01), что отрицательно коррелирует с содержанием нитрат- и нитрит-анионов в
крови (r=-0,57; р=0,01) и тенденцией к увеличению экскреции его с мочой по
сравнению с контрольной группой. Аналогичное снижение креатинина в крови
происходит при введении хлофузана.
Скорость клубочковой фильтрации при этой патологии также снижается в
30,69 раза (р=0,005), что отрицательно коррелирует с содержанием нитрат- и
нитрит-анионов в крови (r=-0,07; р=0,05). Скорость клубочковой фильтрации при
введении L-аргинина имеет тенденция к увеличению по сравнению с контрольной
группой.
Установлено, что при экспериментальной ОПН снижается канальцевая
реабсорбция воды на 46 % (р=0,01) по сравнению с исходным значением, что
положительно коррелирует с содержанием нитрат- и нитрит-анионов в крови (r=0,09
(р=0,001). При введении L-аргинина происходит повышение реабсорбции на 35,53
% (р=0,05), что положительно коррелирует с содержанием нитрат- и нитрит-анионов
20
в крови (r=0,65; р=0,001), а при введении хлофузана отмечается лишь тенденция к
увеличению по сравнению с контрольной группой.
Таким образом, увеличение активности системы оксида азота путем введения
доноров, облегчает течение экспериментальной острой почечной недостаточности,
вызванный глицерином.
Заключение
1. Система оксида азота видоспецифична: уровень нитрат- и нитрит-анионов в
плазме крови крыс составляет 33…35 мкмоль/л, у овец – 34…39 мкмоль/л, у кошек
– 47…77 мкмоль/л, у кроликов – 51…87 мкмоль/л, у крупного рогатого скота –
70…73 мкмоль/л. Уровень нитрат- и нитрит-анионов в моче крыс составляет –
65…69 мкмоль/л, кошек – 29…48 мкмоль/л, овец – 77…93 мкмоль/л, кроликов –
77…104 мкмоль/л.
2. Активность системы оксида азота и физиологические эффекты доноров NO и
ингибитора его синтаз зависят от пола животного. В организме самок крыс, кошек,
коров, овец уровень метаболитов NO выше, чем в организме самцов. В организме
кроликов активность системы NO выше у самцов.
3. Концентрация метаболитов оксида азота в плазме крови и моче зависит от дозы и
путей введения доноров оксида азота и ингибитора его синтаз. Зависимость
концентрации нитрат- и нитрит-анионов в крови и моче при внутрижелудочном
введении доноров NO и ингибитора его синтаз, а также при внутрибрюшинном
введении в крови – параболическая, а в моче при внутрибрюшинном введении –
прямолинейная.
4.1. Физиологический эффект L-аргинина как эндогенного донора оксида азота в
максимально эффективной дозе (200 мг/кг) более выражен у самок. Концентрация
метаболитов оксида азота в организме при этом повышается в 3,16 раза (р<0,01), а
организме самцов - в 2,0 раза (р<0,001) по сравнению с исходным уровнем.
4.2. Максимально эффективной дозой хлофузана для самок является – 2 мг/кг
(уровень метаболитов NO увеличивается в 1,98 раза; р<0,001), для самцов – 1 мг/кг
(уровень метаболитов NO увеличивается в 2,03 раза; p<0,001).
4.3. Физиологический эффект L-NAME как блокатора NOS (20 мг/кг) более выражен
у самцов. Концентрация метаболитов оксида азота в организме при этом снижается у
крыс-самцов в 3,22 раза (р<0,05), а у самок – в 1,93 раза (р<0,05).
5. Содержание нитрат- и нитрит-анионов в плазме крови положительно коррелирует с
объемом суточного диуреза (r=0,58; р<0,01). При нагрузке эндогенным донором
оксида азота в дозе 200 мг/кг интенсивность повышения суточного диуреза выше у
самцов (в 3,34 раза; р<0,001) относительно интактной группы), а при нагрузке
экзогенным донором – у самок (увеличение в 5,16 раза; р<0,001).
6.1. Повышение экскреции натрия, калия, хлоридов, кальция и фосфора при введении
L-аргинина в организме самок положительно коррелирует с содержанием нитрат- и
нитрит-анионов в моче. В организме самцов-крыс повышение экскреции натрия и
фосфора положительно коррелирует с концентрацией метаболитов NO в моче, а
интенсивность экскреции хлора и кальция – отрицательно. Интенсивность выделения
кальция с мочой выше у крыс-самцов в 3,38 раза (р<0,001) по сравнению с самками.
6.2. Нагрузка экзогенным донором оксида азота приводит к снижению экскреции
ионов хлора с мочой у самцов в 5,33 раза (р<0,05), у самок – в 9,33 раза
21
соответственно и снижению экскреции ионов фосфора у самцов в 5,00 раз (р<0,05)
через сутки после введения.
7. Канальцевая реабсорбция воды при введении доноров оксида азота снижается.
Реабсорбция воды при введении эндогенного донора оксида азота – L-аргинина ниже
у самцов, а при введении экзогенного донора (хлофузана) – у самок. Концентрация
мочевины в моче увеличивается при нагрузке эндогенным донором NO и этот эффект
более выражен у самцов.
8. В модели острой почечной недостаточности введение доноров оксида азота
восстанавливает секрецию мочевины, экскрецию ионов хлора, натрия и реабсорбция
воды. Восстановление экскреции мочевины и креатинина с мочой, а также
реабсорбции воды происходит более эффективно при введении эндогенного донора –
L-аргинина, а восстановление экскреции ионов с мочой, при введении экзогенного
донора – хлофузана.
Рекомендации учебному и практическому процессу
1. При изучении системы оксида азота у разных видов животных необходимо
учитывать половую и видовую специфичность влияния доноров и
ингибиторов оксида азота и других факторов, изменяющих состояние этой
системы.
2. Результаты исследований рекомендуется использовать при анализе
патофизиологических процессов нефропатий, а также при дозировании
препаратов, являющихся NO-донорами и применяемых для лечения
различных заболеваний.
3. Теоретические и практические результаты диссертации рекомендуются
использовать в учебном процессе в профильных ВУЗах и факультетах
повышения квалификации специалистов, а также при написании учебных
пособий по физиологии, терапии, диагностики сельскохозяйственных и
домашних животных.
4. Доноры NO могут применятся как лечебные средства при острой почечной
недостаточности.
Перспективы дальнейшей разработки темы заключается в том, что полученные
нами результаты являются основой для изучения влияния оксида азота и доноров
NO на различные физиологические и патофизиологические процессы в организме и
в частности почках у разных видов животных в клинической практике.
Список работ, опубликованных по теме диссертации
1. Каримова Р.Г., Гарипов Т.В., Билалов И.Н. Водный обмен крыс при различных
уровнях активности системы оксида азота // Ученые записки КГАВМ им. Н.Э.
Баумана – 2012. – Т. 211. – С. 353-358.*
2. Билалов И.Н., Каримова Р.Г. Образование оксида азота у разных видов
животных // Прикладная электродинамика, фотоника и живые системы:
Материалы международной научно-технической конференции / Казанский
национально исследовательский технический университет имени А.Н.
Туполева – КАИ. – Казань – 11 - 13 апреля – 2013 – С. 105-106.
3. Билалов И.Н., Каримова Р.Г. Половая специфичность физиологических
эффектов L-аргинина и L-NAME // Биология – наука ХХI века: Материалы 17ой международной Пущинской школы конференции молодых ученых /
22
Пущинский государственный естественно-научный институт. – Пущино – 2126 апреля – 2013. – С. 396-397.
4. Билалов И.Н., Каримова Р.Г. Видовая и половая специфичность образования
оксида азота в организме // ХХII съезд физиологического общества имени
И.П. Павлова: Тезисы докладов. – Волгоград: Изд-во ВолгГМУ, 2013. – С. 63.
5. Каримова Р.Г., Билалов И.Н., Мухамеджанова А.Г. Гидроуретическая функция
почек при различных уровнях активности системы оксида азота // Ученые
записки КГАВМ им. Н.Э. Баумана – 2013. – Т. 215. – С. 164-169.*
6. Билалов И.Н., Каримова Р.Г. Ионоуретическая функция почек при повышении
продукции оксида азота // Ученые записки КГАВМ им. Н.Э. Баумана – 2014. –
Т. 217. – С. – 164-169.*
7. Билалов И.Н., Каримова Р.Г. Влияние активности системы оксида азота на
ионоуретическую функцию почек // Биология – наука ХХI века: Материалы
18-ой международной Пущинской школы конференции молодых ученых /
Пущинский государственный естественно-научный институт. – Пущино – 2125 апреля – 2014. – С. 319.
8. Билалов И.Н., Каримова Р.Г. Половая специфичность ионоуретической
функции почек при повышенной продукции оксида азота // Физиология
человека и животных: от эксперимента к клинической практике: Материалы XIII
Всероссийской молодежной научной конференции / Института физиологии
Коми научного центра Уральского отделения РАН. – Сыктывкар – 22-23 апреля
– 2014. – С. 20-22.
9. Мухамеджанова А.Г., Каримова Р.Г., Билалов И.Н. Активизация образования
оксида азота в организме крыс различными факторами // Физиология человека
и животных: от эксперимента к клинической практике: Материалы XIII
Всероссийской молодежной научной конференции / Института физиологии
Коми научного центра Уральского отделения РАН. – Сыктывкар – 22-23 апреля
– 2014. – С. 99-101.
10.Билалов И.Н., Каримова Р.Г. Влияние экзогенного донора оксида азота
хлофузана на ионоуретическую функцию почек // Ученые записки КГАВМ им.
Н.Э. Баумана – 2014. – Т. 218. – С. 58-62.*
11.Билалов И.Н., Каримова Р.Г. Экскреция натрия и хлора у крыс при изменении
активности системы оксида азота / Биорадикалы и антиоксиданты – 2014. – Т. 1.
- № 1(1). – С.47-54.
12.Каримова Р.Г., Билалов И.Н., Гарипов Т.В. Влияние различных факторов на
продукцию оксида азота в организме крыс // Фундаментальные исследования
– Нижний Новгород – 2015. - № 2. – С. 53-57.*
*- Издания рекомендованные ВАК РФ