Новые секретируемые рибонуклеазы из bacillus subtilis и bacillus

УДК 612.015.1(576.851.5)
НОВЫЕ СЕКРЕТИРУЕМЫЕ РИБОНУКЛЕАЗЫ
ИЗ BACILLUS SUBTILIS И BACILLUS INTERMEDIUS
Л.В. Знаменская, М.А. Скворцова, А.Р. Каюмов
Казанский государственный университет
Бациллы секретируют гуанилспецифичные РНКазы, состоящие из ~110
аминокислот и гидролизующие РНК до нуклеозид-3’-фосфатов. У B.subtilis
и B. intermedius обнаружены новые РНКазы (РНКаза Bsn и биназа II).
Кодирующие области генов bsn и birB идентичны на 65%. Белки, состоящие из ~240 аминокислот, идентичны на 72%. РНКаза Bsn неспецифически
гидролизует РНК до олигонуклеозид-5’-фосфатов. Ферменты синтезируются в стадии замедления роста культуры. Синтез двух секретируемых
рибонуклеаз B. intermedius — гуанилспецифичной биназы I и биназы II зависит от одного метаболического эффектора (неорганического фосфата),
но различия в промоторах указывают на разные системы регуляции их
экспрессии.
Внеклеточные рибонуклеазы секретируются практически всеми исследованными видами бацилл. Эти ферменты проявляют широкий спектр биологических
эффектов в отношении про- и эукариотических клеток. Тандем генов РНКазы B.
amyloliquefaciens барназы и ее внутриклеточного ингибитора барстара широко
используется в молекулярной селекции однодомных растений рапса, табака и др.,
а также устойчивого к фитофторозу картофеля (Hartley, 1997). В малых дозах бациллярные РНКазы оказывают стимулирующее действие на рост и физиологическую активность растений и микроорганизмов (Егоров и др., 1995, Колпаков и др.,
2000), проявляют противовирусное действие (Kurinenko et al., 1998). Исследование РНКаз с новыми свойствами и выяснение механизмов регуляции экспрессии
их генов позволит разработать новые препараты, обладающие разными видами
биологической активности, и создать эффективные продуценты для их получения.
К настоящему времени у представителей рода Bacillus описаны два типа секретируемых РНКаз: гуанилспецифичные, обнаруженные у большого количества
видов, и ферменты большой молекулярной массы, выделенные к настоящему
времени лишь у двух видов бацилл — B. intermedius и B. subtilis. Наиболее изученными являются гуанилспецифичные циклизующие рибонуклеазы (КФ
3.1.27.1), которые выделены в гомогенном состоянии и охарактеризованы у
B.amyloliquefaciens, B. intermedius, B. pumilus, B. thuringiensis, B. circulans,
B. coagulans, и др. При расщеплении РНК они образуют циклические 2',3'фосфодиэфиры, гидролизующиеся затем до соответствующих производных нуклеозид-3'-фосфатов. Эти ферменты обнаруживают сходство в физико-химических
и каталитических свойствах: белки состоят из ~110 аминокислот, идентичны по
первичной структуре на 85-100%, стабильны в широком диапазоне рН (3–10) с
оптимумом при рН 8.5, не требуют ионов металлов для проявления активности
(Дементьев, 1993). Гены ряда гуанилспецифичных рибонуклеаз клонированы,
60
Рис. 1. Аминокислотные последовательности, кодируемые генами биназы II (birB)
из B. intermedius и РНКазы Bsn из B.subtilis (bsn). Идентичные аминокислоты
обозначены вертикальными линиями, аминокислоты со сходными свойствами
отмечены двумя точками, N-конец ферментов — вертикальными стрелками.
Лидерные и пре-, про-последовательности выделены курсивом
61
350
300
250
200
150
100
50
0
Контроль*
ОП590,%.
100
РНКаза,%
500
1000
2000
Специфическая активность,%
Рис. 2. Влияние неорганического фосфата на рост B. subtilis 3922 с плазмидой pJF28
и биосинтез биназы II. Специфическая активность определяется как отношение общей
активности РНКазы в культуральной жидкости к величине биомассы и является
показателем интенсивности биосинтеза фермента. Собственная активность РНКазы
B. subtilis 3922 (РНКаза Bsn) составляет не более 3-4% от активности РНКазы
рекомбинантного штамма
62
А
35
8000
30
7000
6000
25
5000
20
4000
15
3000
10
2000
5
1000
0
0
1
Б
3
5
7
9
11 13 15 17 19 21 23 25
1,6
1,4
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
22
24
Рис. 3. Динамика роста B.subtilis 3922 c плазмидой pJF28 (ген birB) и биосинтеза
биназы II (A) и удельные скорости роста культуры и синтеза фермента (Б).
1  биомасса (опт.ед); 2  РНКазная активность в культуральной жидкости,
опт.ед./(мл⋅ч); 3  потребление Фн (мкг/мл); 4  удельная скорость роста
культуры ( ), час-1; 5  удельная скорость синтеза биназы II ( ), час-1
63
секвенированы и представлены в базе данных международного банка генов (Нуркиянова и др., 1989, Znamenskaya et al., 1995, Шульга и др., 2000).
Геном B. subtilis не содержит последовательностей, гомологичных генам гуанилспецифичных рибонуклеаз, хотя бактерии этого вида обладают внеклеточной
РНКазной активностью. В 1992 году был клонирован ген bsn из B. subtilis, кодирующий внеклеточную рибонуклеазу Bsn (Nakamura, 1992). Молекула этого фермента включает 241 аминокислоту, молекулярная масса, определенная с помощью
гельфильтрации, составляет 27 кДа. В рекомбинантном штамме, трансформированном плазмидой pBN1 c геном bsn, фермент синтезировался после завершения
экспоненциальной фазы роста. РНКаза Bsn является Mg2+-активируемым ферментом и неспецифически гидролизует РНК до олигонуклеозидов с 5’-терминальным
фосфатом.
В Казанском университете клонирован в B. subtilis фрагмент хромосомы B.
intermedius размером 3,02 kb, несущий ген секретируемой рибонуклеазы (Chernokalskaya et al., 1989). Фрагмент оказался летальным для клеток E. coli, в том числе
и при клонировании в присутствии гена ингибитора гуанилспецифичных рибонуклеаз — барстара, т.е. содержал ген фермента, отличного от известной гуанилспецифичной РНКазы B. intermedius — биназы I. Дальнейшее субклонирование и
секвенирование этого фрагмента методом Сэнгера с использованием Seqenase
Version 2,0 (USB) показало, что он включает три полных и одну неполную открытые рамки считывания (ORF), причем ORF, соответствующая РНКазе, расположена на противоположной цепи ДНК и ориентирована навстречу трем другим
(Hahnen et al., 2000).
В соответствии с гомологией, обнаруженной при сравнении нуклеотидной последовательности фрагмента с данными международного банка генов (EMBL
GenBank), новые гены B. intermedius были названы fbiD, fbiC, atr и birB. Ген новой
РНКазы (birB) кодирует фермент биназу II, он абсолютно отличен от гена birA,
кодирующего биназу I, но сходен с геном РНКазы Bsn из B. subtilis (bsn). Кодирующие области генов birB и bsn идентичны на 65%, а кодируемые ими ферменты
— на 72% (рис. 1). Интересно, что промотор гена birB абсолютно отличен от промоторов генов birA и bsn. Гены fbiC и fbiD содержат фрагменты, идентичные генам оперонов транспорта железа E. coli (fecC, fecD), B. subtilis (fhuD) (Harle et al.,
1995, Schneider, Hantke, 1993) и других бактерий и, вероятно, представляют собой
3’-фрагмент оперона транспорта ионов железа B. intermedius. В базе данных Генбанка не было обнаружено последовательностей, идентичных гену atr, который не
имеет собственного промотора, и, по-видимому, является частью оперона Fbi.
Ранее было показано, что экспрессия гена биназы I активируется в условиях
дефицита неорганического фосфата (Фн) в среде и регулируется по типу генов
PHO регулона B. subtilis (Znamenskaya et al., 1999). Исследование влияния Фн на
экспрессию гена биназы II в рекомбинантном штамме B. subtilis 3922 с плазмидой
pJF28 показало, что, увеличивая биомассу продуцента, Фн ингибирует синтез
фермента (pис. 2). На оптимизированной питательной среде биназа II синтезируется в стадии замедления роста культуры, вызванного исчерпанием фосфата из
среды (pис. 3). Таким образом, биосинтез обеих секретируемых рибонуклеаз
B. intermeius зависит от одного и того же метаболического эффектора — неорганического фосфата среды, но различия в промоторах указывают на разные системы регуляции экспрессии генов.
64
ЛИТЕРАТУРА
Дементьев А.А. Межвидовые структурные различия внеклеточных рибонуклеаз бацилл. Дисс. … канд. биол. наук. М.: ИМБ РАН, 1993.
Колпаков А.И., Куприянова-Ашина Ф.Г., Лещинская И.Б. Зависимость влияния
РНКазы Bacillus intermedius на рост пекарских дрожжей от концентрации экзогенного
фермента // Микробиология. 2000. Т. 69. С. 478–482.
Нуркиянова К.М., Шульга А.А., Захарьев В.М. и др. Клонирование и определение
нуклеотидной последовательности гена РНКазы Bacillus intermedius // ДАН СССР. 1989.
T. 309. № 6. С. 1476–1479.
Шульга А.А., Знаменская Л.В., Морозова О.В. и др. Рибонуклеаза из Bacillus
thuringiensis var. subtoxicus. Структура гена и регуляция биосинтеза // Биоорган. химия.
2000. Т. 26. №. 9. С. 673–679.
Chernokalskaya E.B., Romakhina E.R., Balaban N.P. et al. Cloning in B.subtilis of the
gene intensifying extracellular ribonuclease production // Structure and chemistry of ribonucleases. Proc. of the 1st. Int. Meet. 28 Nov - 2 Dec. Moscow. 1989. Р. 338–348.
Hahnen E., Znamenskaya L., Koczan D. et al. Novel secreted ribonuclease from Bacillus
intermedius: genetic structure and regulatory control //Molecular and General Genetics. 2000.
№ 263. Р. 571–580.
Harle C., Kim I., Angere A., Broun V. Signal transfer through three components: transcription initiation of the E.coli ferric citrate transport system from the cell surface // EMBO J. 1995.
№ 14. Р. 1430–1438.
Hartley С.Ю., Наумова Э.С., Алимова Ф.К. и др. Разработка методов применения биологического перпарата — РНКазы в качестве стимулятора роста овощных и декоративных
культур // Вестник Российской академии сельскохозяйственных наук. 1995. Вып. 2. С. 42–
44.
Hartley R.W. Barnase and Barstare // Ribonucleases: structures and Functions / Ed by
G. D’Alessio and J.F. Riordan. Academic Press, 1997. Р. 51–100.
Kurinenko B.M., Bulgakova R.Sh., Davydov R.E. Effect of ribonuclease from Bacillus intermedius on human blood lymphocytes // FEMS Immunol. Med. Microbiol. 1998. V. 21. P. 117–
122.
Nakamura A., Koide Y., Miyazaki H. et al. Gene cloning and characterization of a novel
extracellular ribonuclease of Bacillus subtilis // Eur. J. Biochem. 1992. V. 209. P. 121–127.
Schneider R., Hantke K. Iron-hydroxymate uptake systems in Bacillus subtilis: identification
of a lipoprotein as a part of binding protein-dependent transport system // Mol. Microbiol. 1993.
№ 8. Р. 111–121.
Znamenskaya L.V., Gabdrachmanova L.A., Chernokalskaya E.B. et al. Phosphate
regulation of biosynthesis of extracellular RNases of endospore-forming bacteria // FEBS Letters.
1995. V. 357. P. 16–18.
Znamenskaya L.V., Vershinina O.A., Vershinina V.I. et al. Expression of the genes for
guanyl-specific ribonucleases from Bacillus intermedius and Bacillus subtilis is regulated by the
two component signal transduction system PhoP-PhoR in B. subtilis // FEMS Microbiol. Lett.
1999. V. 173. P. 217–222.
65