Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Научно-исследовательский институт питания» Черняк Ольга Олеговна
реклама
Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Научно-исследовательский институт питания» На правах рукописи Черняк Ольга Олеговна ИЗУЧЕНИЕ АДИПОКИНОВ И ПОЛИМОРФИЗМА ГЕНОВ, РЕГУЛИРУЮЩИХ ОБМЕН ЛИПИДОВ У БОЛЬНЫХ С ОЖИРЕНИЕМ 03.01.04 – биохимия ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научные руководители академик РАН, д.м.н., профессор д.м.н., профессор Москва – 2014 Тутельян В.А. Сенцова Т.Б. 2 ОГЛАВЛЕНИЕ 1 ВВЕДЕНИЕ……………………………………………………………….. 1.1 Актуальность темы………………………………………………… 1.2 Научная новизна работы…………………………………………... 1.3 Практическая значимость…………………………………………. 1.4 Апробация работы…………………………………………………. 1.5 Структура и объѐм диссертации…………………………………... 4 4 6 7 7 8 2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ………………………………………………….. 2.1 Ожирение как медицинская и социальная проблема……………. 2.2 Геномный, протеомный и метаболомный анализы как методы изучения ожирения…………………………………………………….. 2.3 Заболевания, ассоциированные с ожирением: проблемы патогезена………………………………………………………………. 2.4 Диагностическая значимость биомаркеров в выборе профилактики, диетотерапии ожирения и ассоциированных с ним заболеваний…………………………………………………………….. 2.5 Обоснование выбора предмета исследования................…............ 9 9 10 14 19 36 3 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ....…………………………………………. 3.1 Клиническая характеристика обследованных больных…………. 3.2 Молекулярно-генетические методы исследования………………. 3.2.1 Выделение ДНК………………………………………………....... 3.2.2 Полимеразная цепная реакция в режиме реального времени..... 3.3 Биохимические методы исследования……………………………. 3.4 Иммуноферментные методы исследования……………………… 3.4.1 Исследование содержания грелина, резистина, висфатина, апелина, цитокинов, адгезивных молекул sICAM, аннексина V, LFABP в сыворотки крови…………………………………………………… 3.4.2 Исследование содержания адипонектина, МДАмодифицированных ЛПНП, окисленных ЛППН в сыворотки крови. 3.5 Методы статистического анализа результатов исследования…… 37 37 40 40 41 46 49 4 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ОБСУЖДЕНИЕ…….……….. 4.1 Изучение аллельных полиморфизмов генов ApoE и LPL у больных с ожирением………………………………………………….. 4.2 Характеристика геномномных, протеомных и метаболомных маркеров и оценка их диагностического значения у больных с ожирением и атеросклерозом………………………………................. 4.3 Характеристика геномномных, протеомных и метаболомных маркеров и оценка их диагностического значения у больных с ожирением и неалкогольной жировой болезнью печени...………….. 55 50 51 52 55 60 65 3 4.4 Изучение содержания адипокинов у больных ожирением……… 4.5 Изучение содержание цитокинов у больных с ожирением……... 4.6 Изучение содержания маркеров углеводного и липидного обменов у больных с ожирением……………………………………… 4.7 Характеристика геномномных, протеомных и метаболомных маркеров и оценка их диагностического значения у больных с ожирением……………………………………………………………… 4.8 Оценка эффективности диетотерапии при различных полиморфных вариациях генов ApoE и LPL у больных с ожирением……………………………………………………………… 69 74 5 ЗАКЛЮЧЕНИЕ........................................................................................... 97 6 ВЫВОДЫ…………………………………………………………………. 102 7 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ……………………………………………... 104 8 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ………………………………………………. 106 78 82 93 4 1 ВВЕДЕНИЕ: 1.1Актуальность темы: В настоящее время ожирение представляет собой актуальную медикосоциальную проблему. По данным Российского мониторинга экономического положения и здоровья населения в 2011 году среднее значение индекса массы тела (ИМТ) среди взрослого населения России составило 25,06. По сравнению с 2001 годом этот показатель вырос на 23,5% (Тутельян В.А., Батурин А.К. 2103). Экономические исследования, проведенные в период с 1990 по 2009 годы показали, что затраты на лечение ожирения и сопутствующих ему заболеваний составляет 0,7% и 2,8% от общих расходов на здравоохранение (Vajro P., Lenta S., Socha P., et al. 2012). Ожирение – доказанный фактор риска развития инсулинорезистености, сахарного диабета II-го типа, заболеваний сердечнососудистой системы, неалкогольной жировой болезни печени и некоторых видов онкологических заболеваний (Дедов И.И., Мельниченко Г.А. 2004). Благодаря развитию биологических наук в последнее десятилетие доказано, что выявление генетического риска имеет важное значение для разработки дифференцированного подхода к профилактике и лечению ожирения, а также ассоциированных с ним заболеваний (Дедов И.И., Тюльпаков А.Н., Чехонин В.П. 2012). Вместе с тем, сложность прогноза и расчета риска развития ожирения как мультифакторного заболевания, связана с различной степенью реализации наследственной предрасположенности и факторами внешней среды (Романцова Т.И. 2011). В частности, остаются недостаточно изученными методологические подходы к использованию результатов геномных и постгеномных технологий у больных с ожирением. На сегодняшний день в клинической медицине проводятся многочисленные исследования по выявлению «генов-кандидатов», структурные изменения которых могут рассматриваться как возможные факторы, определяющие предрасположенность к развитию дислипидемии и 5 ожирения (Дедов И. И., Мельниченко Г. А. 2006). Кроме того, анализ клинических работ по изучению генной регуляции липидного обмена у больных с ожирением показал чрезвычайную сложность механизмов белковометаболических взаимодействий, что определяет трудности в проведении диагностики (Батурин А. К., Сорокина Е.Ю., Погожева А.В., Тутельян В.А. 2012). Несмотря на значительные успехи в выявлении факторов, регулирующих энергетический обмен у больных с ожирением, ряд вопросов, касающихся диагностического значения протеомных и метаболомных биомаркеров при различных полиморфных вариантах гена ApoE и LPL у больных с ожирением, остается недостаточно изученным. В связи с этим, особую актуальность приобретает усовершенствование методов диагностики и подходов к персонализированной диетотерапии, применение которой неэффективно без данных геномных и постгеномных исследований. Целью исследования явилось изучение адипокинов и полиморфизмов Ser447Ter гена LPL, Cys112Arg и Arg158Cys гена ApoE у больных с ожирением. В задачи исследования входило: 1. Выявление взаимосвязи полиморфных аллелей Cys112Arg, Arg158Cys гена ApoE и Ser447Ter гена LPL с развитием ожирения. 2. Выявление геномных, протеомных и метаболомных предикторов развития атеросклероза и неалкогольной жировой болезни печени у больных с ожирением. 3. Исследование содержания адипокинов и маркеров воспаления у пациентов с ожирением при различном индексе массы тела. 4. Оценка эффективности диетотерапии при нарушении липидного обмена у больных с ожирением при наличии различных полиморфных вариантов генов ApoE и LPL. 5. Обоснование целесообразности определения полиморфизмов Cys112Arg, Arg158Cys гена ApoE и Ser447Ter гена LPL, уровней цитокинов и адипокинов 6 для диагностики и проведения персонализированной диетотерапии у больных с ожирением. 1.2 Научная новизна Впервые проведено изучение полиморфных аллелей Cys112Arg, Arg158Cys гена ApoE и Ser447Ter гена LPL, содержания адипокинов и цитокинов у больных с ожирением с последующим обоснованием их использования в диагностике у больных с ожирением. Доказано, что при выявлении полиморфного аллеля Arg158Cys (ε2) гена ApoE в большей степени увеличивается риск развития ожирения, чем при наличии аллелей Cys112Arg (ε4) и ε3. Впервые определено диагностическое и прогностическое значение выявления у больных с ожирением и атеросклерозом генотипа ε2/ε2/ε3 гена ApoE, повышения концентрации окисленных липопротеинов низкой плотности, L-FABP, ИЛ-6, sICAM и снижения уровня адипонектина. Выявлены такие предикторы развития неалкогольной жировой болезни печени у больных с ожирением, как генотип ε4/ε3/ε3 гена ApoE, увеличение синтеза L-FABP, окисленных липопротеинов низкой плотности и снижение концентрации адипонектина. Впервые показана взаимосвязь полиморфных вариантов Cys112Arg, Arg158Cys гена ApoE и Ser447Ter гена LPL с вариабельностью уровней адипокинов и иммунологических маркеров воспаления у больных с ожирением. Проведен метаболомный анализ у больных с различными степенями ожирения. Впервые показано, что максимально выраженные изменения протеомных и метаболомных биомаркеров диагностируется у пациентов с двумя и более нуклеотидными заменами в генах ApoE и LPL. Установлено положительное влияние на показатели липидного обменов использование гипокалорийной диетотерапии у пациентов с генотипами ε3/ε3, 7 ε2/ε3 гена ApoE и Ser447Ser гена LPL. Доказана перспективность использованного геномного, протеомного и метаболомного анализов в осуществлении принципов персонализированной диетотерапии. 1.3 Практическая ценность Анализ клинической картины и изучение полиморфизмов Cys112Arg, Arg158Cys гена ApoE и Ser447Ter гена LPL дает возможность определить вероятность развития ожирения и сопутствующих заболеваний, таких как атеросклероз и НАЖБП. На основании определения полиморфизмов Ser447Ter гена LPL, Arg158Cys (ε2) и Cys112Arg158 (ε4) гена ApoE, уровней адипокинов и цитокинов в крови разработаны диагностические и прогностические тесты, применение которых позволит повысить эффективность профилактических мероприятий у лиц с избыточной массой тела и персонализировать диетотерапию у больных с ожирением. Предложенный методологический подход к диагностике больных с ожирением рекомендуется для внедрения в работу стационаров диетологического и терапевтического профиля. Результаты работы внедрены в практическую деятельность отделения патологической и реабилитационной диетологии Клиники ФГБНУ «НИИ питания». 1.4 Апробация работы Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на: - The European Academy of Allergy and Clinical Immunology Congress (Geneva ,2012); - Всероссийской научной конференции молодых ученых-медиков «Инновационные технологии в медицине XXI века» (Москва, 2012); 8 - XIV Всероссийском Конгрессе диетологов и нутрициологов «Питание и здоровье» с международным участием (Москва, 2012); - 20th European Congress on Obesity (Liverpool, 2013); - 20th International Congress of Nutrition (Granada2013); - 21th European Congress on Obesity (Sofia2014); - The European Academy of Allergy and Clinical Immunology Congress (Milan, 2013); - The European Academy of Allergy and Clinical Immunology Congress(Copenhagen, 2014); - XV Всероссийском конгрессе диетологов и нутрициологов с международным участием (Москва, 2014) 1.5 Структура и объем диссертации Диссертация изложена на 124 страницах, состоит из введения, обзора литературы, объема и методов исследования, результатов собственных исследований и их обсуждения, выводов, указателя литературы, включает 180 источников, из них 97 отечественных и 83 зарубежных авторов, содержит 21 таблицу и 10 рисунков. 9 2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 2.1 Ожирение как медицинская и социальная проблема Согласно современным представлениям ожирение - это хроническое прогрессирующее заболевание обмена веществ, которое обусловлено комплексом экзогенных, генетических и иммунных факторов, опосредующих изменения энергетического метаболизма и избыточным накоплением жировой ткани в организме [17, 20]. По данным Всемирной организации здравоохранения избыточный вес и ожирение являются пятым по значимости фактором риска смерти в мире. От осложнений ожирения ежегодно умирают, по меньшей мере, 2,8 миллиона взрослых людей. Кроме того, излишний вес и ожирение обусловливают 44% случаев диабета, 23% случаев ишемической болезни сердца и от 7% до 41% случаев некоторых видов онкологических заболеваний [53]. К концу 20-го века около 30% населения земли имели избыточную массу тела [60]. В 2010 году более 40 миллионов детей в возрасте до 5 лет имели избыточный вес [53, 127]. Также велика доля детей, страдающих ожирением [124, 127]. Избыточный вес в детстве – значимый предиктор ожирения во взрослом возрасте: 50% детей, имевших избыточный вес в 6 лет, становятся тучными во взрослом возрасте, а в подростковом возрасте эта вероятность увеличивается до 80% [44, 47]. Отсутствие широкомасштабных эпидемиологических исследований в России не позволяет объективно оценить распространенность ожирения, однако по предварительным данным [Дедов И.И., 2006; Бокерия Л. А., 2010] около 30% россиян имеют избыточную массу тела, а 25% - страдают ожирением [44]. Обновленные данные свидетельствуют, что развитие эпидемии ожирения несколько замедлилось в течение последних десяти лет в развитых странах, что указывает на эффективность предпринимаемых мер по популяризации подходов к здоровому питанию и оптимизации физической 10 активности, профилактических мероприятий, ранней диагностики осложнений и оптимизации подходов к персонализированной терапии этого заболевания [133, 160]. Многочисленные экономического исследования градиента в выявили структуре наличие ожирения в социальносовременном индустриальном обществе. Распространенность избыточной массы тела и ожирения высока во всех возрастных группах во многих странах, но особенно вызывает беспокойство детское и подростковое ожирение в странах с развитой и переходной экономикой [143, 163]. Комплексная оценка данных экономических исследований в период с 1990 по 2009 годы показала, что затраты на лечение ожирения и сопутствующих ему заболеваний составляет от 0,7% до 2,8% общих расходов на здравоохранение. Кроме того, установлено, что расходы на медицинское обслуживание больных ожирением, были примерно на 30% больше, чем лиц с нормальной массой тела того же возраста [179]. Наиболее часто применяемым диагностическим критерием ожирения является избыток общей массы тела по отношению к норме, установленной статистически. Однако величина ИМТ недостаточно четко отражает тяжесть течения заболевания и вероятность его осложнения сопутствующими патологическими процессами, поскольку не учитывает соотношение жировой и мышечной массы. В этой связи достаточно актуальна разработка и внедрение в диагностику методов, позволяющих адекватно оценить вклад избыточной жировой массы в развитие метаболических нарушений при ожирении [17]. 2.2. Геномный, протеомный и метаболомный анализы как методы изучения ожирения В последнее время возникает все больше гипотез об ожирении, как о сложном полиэтиологическом и полипатогенетическом заболевании, 11 детерминированных новейшими открытиями в области геномики, протеомики и метаболомики. Актуальной задачей современной науки является поиск сигнальных молекул, запускающих механизм экспрессии генов, которые отвечают за синтез ключевых ферментов энергетического метаболизма, антиоксидантной защиты, регуляции апоптоза, иммунной системы и др. [65, 129, 134] Современные требования, предъявляемые к оценки метаболического синдрома у больных с ожирением, предусматривают комплексный подход, позволяющий охарактеризовать совокупность данных о генетической предрасположенности к заболеваниям и особенностях синтеза различных белков и ферментов [65, 122,134]. Многочисленные данные свидетельствуют, что геномные исследования могут лечь в диагностические основу предиктивной методы, медицины, профилактические и включающей лечебные себя стратегии. Генетический риск развития полигенных заболеваний, в том числе и ожирения, в большой степени зависит от наследственной предрасположенности и рассчитывается с помощью эмпирических данных [48, 65]. Сложность расчета риска развития мультифакториального заболевания связана с нелинейностью реализации наследственной предрасположенности, в основе которой лежит тесное взаимодействие факторов генетической предрасположенности и особенностей внешней среды [63]. Преимущество генетической диагностики заключается в возможности выявить предрасположенность к развитию метаболических нарушений до их клинических проявлений, профилактические своевременно подходы, реализовать предотвратить дифференциальные развитие ожирения и сопутствующих ему патологий или снизить тяжесть их течения, а также, с учетом индивидуальных особенностей, применять персонализированную диетотерапию [4, 5, 18]. 12 В современных клинических исследованиях при поиске генов, ассоциированных с ожирением, используются две основные стратегии - анализ ассоциаций и анализ сцепления. Анализ ассоциаций включает в себя исследование генов-кандидатов. Данная методика базируется на накопленных сведениях о возможном участии того или иного гена в процессах регуляции аппетита, энергозатрат, адипогенеза, распределения жировой ткани, метаболизма глюкозы и липидов. Целью ассоциативных исследований является выявление статистически значимых взаимосвязей между генетическим полиморфизмом и изучаемым фенотипом [63,70]. Метод сцепления основывается на поиске и картировании локусов, контролирующих фенотипические проявления нарушений метаболизма. Для решения этой задачи используется большое количество маркеров, охватывающих весь геном. При анализе сцепления исследуется выборка, состоящая из близких родственников с известным фенотипом. Далее анализируется совместное наследование изучаемого признака и маркерных генотипов. Значимое сцепление указывает регион, содержащий ген, высокопенетрантные аллели которого оказывают влияние на развитие ожирения [63]. Благодаря анализу сцепления в настоящее время разработана техника биочипов высокого разрешения. Очевидно, что процессы, задействованные в этиопатогенезе ожирения, невозможно полностью описать, основываясь только на геномных исследованиях. Не менее важной является информация о свойствах белков и их роли в энергетическом метаболизме. Успехи протеомики позволили расширить спектр исследований в клинической практики, на основании которых традиционные представления о метаболизме как о процессе воздействия нутриента на факторы адаптационно-компенсаторных механизмов организма претерпели значительные изменения [62]. Высокотехнологичные протеомные методы, направленные на исследование первичной структуру и посттрансляционных модификаций белков, позволяют решить проблемы поиска 13 диагностических биомаркеров, идентификации терапевтических мишеней и разработки методов оценки эффективности терапии [51]. Один из ключевых кластеров биоинформационных ожирения представляет собой метаболомный анализ, исследований предметом которого является состав метаболитов крови человека при различных физиологических и патологических состояниях. Метаболитный профиль, описывающий биохимическое состояние энергетического обмена, может существенно помочь в понимании процессов, которые происходят на молекулярном уровне при ожирении. Метаболомный анализ в настоящее время рассматриваться как одно из самых перспективных направлений развития молекулярных методов в области системной биологии и медицины. Исследование метаболома больных с ожирением позволяет клинически не практически проявляющиеся на молекулярном нарушения уровне энергетического выявлять обмена и своевременно, с учетом особенностей метаболизма пищевых и биологически активных веществ конкретного человека, персонализировать диетотерапию[71]. В настоящее время не вызывает сомнения положение о том, что взаимодействие генома, протеома и метаболома - это взаимосвязанный и взаимообуславливающий процесс. Известно, что механизмы генной регуляции включают взаимодействия с положительными и отрицательными обратными связями, которые индуцируются посредством кодируемой РНК, белков, метаболитов, ферментов и др.[81]. С одной стороны, генетический код генерирует сигналы (транскриптомы), определяющие состав протеома, который в свою очередь инициирует каталитические регулирует факторы геном метаболизма. посредством С другой специальных стороны, метаболом белково-метаболических взаимодействий. Следовательно, если геном ипротеом рассматриваются как возможные факторы при синтезе метаболитов, то нутриенты определяют непосредственную структуру метаболических систем (рисунок 1). 14 Рисунок 1. Схема взаимодействия нутриентов с геномом, транскриптомом, протеомом и метаболомом в регуляции адаптационно-компенсаторных механизмов. Важным практическим аспектом является тот факт, что исследование молекулярных, генетических и биохимических путей регуляции энергетического обмена позволять раскрыть механизмы развития ожирения, проводить раннюю доклиническую диагностику метаболических нарушений, а также разработать подходы к коррекции этих состояний, направленные на поддержание динамического равновесия и адаптационного потенциала организма [26]. 2.3 Заболевания, ассоциированные с ожирением: проблемы патогенеза Центральной проблемой современного здравоохранения является стремительное распространение ассоциированных с ожирением заболеваний. 15 Наиболее часто встречаются осложнения ожирения со стороны сердечнососудистой системы (артериальная гипертензия (АГ), атеросклероз, хроническая сердечная недостаточность, ишемический инсульт, тромбоэмболия легочной артерии), инсулинорезистеность, диабет 2-го типа, неалкогольная жировая болезнь печени (НАЖБП)[15, 17, 22, 40, 44, 49, 60]. Сердечно-сосудистые заболевания продолжают лидировать среди причин смертности в развитых странах. Ожирение является компонентом кластера атерогенных факторов, включающего инсулинорезистентность, гиперхолестеринемию, гипертриглицеридемию, повышение липопротеинов низкой плотности, и провоцируют предрасположенность к развитию АГ и атеросклероза [169]. Кроме того, нарушения обмена липидов, индуцированные накоплением жировой ткани, является ключевыми модифицируемыми фактором риска развития артериальной гипертензии [37, 45,49,55,116, 145]. Основными триггерами атеросклероза являются дислипопротеинемии (повышение концентрации ЛПОНП и ЛПОНП), артериальная гипертензия и инсулинорезистеность). Доказано, что процесс атерогенеза начинается с дисфункции эндотелия, что сопровождается накоплением в интиме сосудов гликозамингликанов, которые могут связываться с ЛПНП и ЛПОНП. Затем, винтиму проникают моноциты, где они преобразуются в макрофаги. ЛПНП и ЛПОНП под влиянием эндогенных окислителей окисляются и взаимодействуют с маллоновым диальдегидом. При этом образуются модифицированные липопротеиды, активирующие иммунную систему [19, 45, 49,55]. По мере прогрессирования атеросклероза в местах повреждения эндотелия усиливается накапливается пролиферация большое количество миоцитов и внеклеточных эндотелиоцитов, липидов, активируется цитокиновая система. Увеличение плазменной концентрации интерлейкина-6 (IL-6) и других воспалительных цитокинов многие исследования связывают с наличием эндотелиальной дисфункции у пациентов с ожирением [19, 92, 113, 118, 168] . Кроме того, высокие уровни фактора некроза (TNF-α) и IL-6, как 16 было показано, являются независимыми прогностическими факторами коронарной эндотелиальной функции [113, 167]. Течение ожирения нередко осложняется развитием артериальной гипертензией (АГ) [54], которая является фактором риска формирования сердечно-сосудистых гипертензии при патологий. ожирении Ведущими считаются причинами артериальной инсулинорезистентность и компенсаторная гиперинсулинемия [14, 37, 72]. Известно, что воспаление и окислительный стресс представляют собой тесно связанные процессы [103, 104]. Однако нет достоверных данных относительно роли воспалительных цитокинов и окислительного стресса в развитии эндотелиальной дисфункции в комплексе с оценкой адипокинового профиля и инсулинорезистентности у пациентов с ожирением. Изучение молекулярных механизмов развития ожирения позволит выявить научно-обоснованные критерии и методы ранней диагностики, профилактики и прогноза течения, сопутствующих ему заболеваний. Таким образом, выявление надежных ранних маркеров риска сосудистой патологии остается приоритетным направлением современной молекулярной диагностики [99]. Показано, что нарушения регуляторных взаимодействий энергетического гомеостаза приводят к избыточному депонированию жира в организме. На начальных этапах липиды накапливаются в адипоцитах [17, 22,44, 45, 54]. При их насыщении начинается избыточное накопление жира в клетках печени. Патогенез жировой болезни печени связывают с увеличением поступления липидов в гепатоциты, снижением синтеза и секреции ЛПОНП, торможением окисления липидов в гепатоцитах, а также комбинацией этих механизмов [8, 27, 55, 66, 97, 146]. В связи с этим различают 2 основных типа жировой инфильтрации печени. Первый тип возникает в результате увеличения содержания свободных жирных кислот в плазме крови, обусловленного либо мобилизацией жиров из жировой ткани, либо гидролизом триацилглицеролов, входящих в состав 17 липопротеидов и хиломикронов. При этом возрастает поглощение и этерификация свободных жирных кислот клетками печени. Образующихся липопротеидов в печени становится недостаточно и последние накапливаются в виде триацилглицеролов. Установлено, что увеличение поступления липидов в печень имеет место при гиперлипопротеинемии, быстрой утрате жировых запасов — в результате голодания, при ожирении, при сахарном диабете [8, 43, 117, 128, 173]. Второй блоком образования липопротеидов, вследствие нарушения синтеза апобелков и образования липопротеидов, тип связан недостаточным с метаболическим образованием фосфолипидов, а также нарушения механизма секреции [3, 43]. Существует гипотеза, что накопление липидов становится токсичным и вызывает стрессовую реакцию в печени, включая воспаление и окислительный стресс, что может привести к некрозу клеток и апоптозу, опосредующим развитие фиброза и НАЖБП. Более 30% пациентов с ожирением может иметь НАЖБП и 12 % -25 % имеют фиброз [125, 131,180] . Диабет и резистентность к инсулину может быть более важным условием развития НАЖБП и фиброза, нежели ИМТ [141,147] . НАЖБП является многофакторным заболеванием со сложной патофизиологией. Неалкогольная жировая болезнь печени (НАЖБП) является глобальной проблемой здравоохранения, распространенная с частотой 20% 30% в западных странах и 15% в странах Азии [107]. Спектр НАЖБП варьируется от простого стеатоза до безалкогольного стеатогепатита и цирроза печени. НАЖБП тесно связана с ожирением и рассматривается как печеночные проявления метаболического синдрома. Распространенность НАЖБП среди лиц с сахарным диабетом 2 типа, по оценкам, 65% -70%, что более чем в два раза среди лиц без диабета [153, 175]. Кроме того, НАЖБП может быть независимым предиктором будущего риска сердечно-сосудистых заболеваний среди больных диабетом[176]. Имеющиеся данные свидетельствуют, что 18 частота выявления НАЖБП превышает 65% у больных диабетом 2 типа и 90% у больных ожирением [131 , 176] Клинические признаки НАЖБП включают ожирение, резистентность к инсулину и дислипидемию [95, 173]. Ожирение связано с развитием воспалительного процесса, опосредованного гормонами и цитокинами, такими как фактор некроза опухоли и ИЛ-1. Печеночные нарушения регуляции липидного метаболизма, окислительный стресс и провоспалительные цитокины взаимодействуют синергически, способствуя накопление жира в гепатоцитах [94, 95]. По оценкам исследователей, НАЖБП нередко встречается и у детей и лиц молодого возраста[178], что делает профилактику, раннее выявление и лечение этой патологии важным вопросом современной диагностики. Еще одним заболеванием, усугубляющих течение ожирения, является инсулинорезистентность, которая представляет собой ведущее звено таких заболеваний, как метаболический синдром, ожирение, сахарный диабет 2 типа [104, 118, 132, 146]. По данным популяционных исследований, в 2004 году 3,4 миллиона человек умерли от последствий гипегликемии. Такое же число случаев смерти произошло, по оценкам, и в 2010 году. Более 80% случаев смерти от диабета происходит в странах с низким и средним уровнем дохода. По прогнозам ВОЗ, в 2030 году диабет станет седьмой по значимости причиной смерти [25]. Современные исследования отводят важнейшую роль в формировании инсулинорезистености дискоорднационным изменениям липидного обмена, адипокинам, а также явлению системного воспаления жировой ткани [100, 108, 111, 126, 174]. Анализ многочисленных литературных данных свидетельствуют, что адипокины обладают разнонаправленными эффектами в регуляции метаболизма. Нарушения эндокринной функции жировой ткани определяющую роль в развитии инсулинрезистентности [14, 36]. Так, адипонектин прямо коррелирует с чувствительностью тканей к инсулину, в то время как увеличение 19 экскреции резистина, апелина и висфатина связывают с формированием инсулинорезистености [2, 100, 108, 111, 126, 174]. Среди цитокинов, активно продуцируемых жировой ткань, выделяют ФНОα и ИЛ-6. Для этих цитокинов показана связь с развитием локальных и центральных эффектов, в том числе проявляющихся инсулинорезистеностью. Однако имеются и принципиальные отличия адипокиновых эффектов ФНОα и ИЛ-6. Показано, что ФНОα нарушает сигналы инсулина в мышечной и жировой ткани и тем самым может способствовать развитию инсулинорезистентности [2, 55, 85, 87, 89, 93]. Согласно современным представлениям, ИЛ-6 является веществом чувствительным к уровню глюкозы, способствует снижению уровня гликогена мышц, стимулирует выработку глюкозы в печени и улучшает поглощение глюкозы скелетной мускулатурой. У пациентов с сахарным диабетом 2 типа базальный уровень ИЛ-6 в плазме повышен [80]. Клинические исследования и многочисленные литературные данные свидетельствуют, что ожирение представляет собой мультифакториальное заболевание, при котором возможны различные варианты метаболических нарушений, требующие дифференцированного подхода к диагностике и персонализации диетотерапии. 2.4 Диагностическая значимость биомаркеров в выборе профилактики, диетотерапии ожирения и ассоциированных с ним заболеваний Несмотря на достижения современного здравоохранения, профилактика, диагностика и терапия метаболических нарушений требуют качественного повышения своей эффективности. До сих пор остаются дискутабельными вопросы о поиске диагностически значимых биомаркеров, критериев оценки эффективности терапии мероприятиям [26]. и резистентности к проводимым лечебным 20 В эпоху постгеномных технологий на стыке науки о питании, геномики и протеомики возникли (нутригеномика повысить и новые подходы нутриметаболомика), эффективность лечения, персонализированной которые позволят минимизировать медицины существенно побочные эффекты лекарственных препаратов, а также сократить расходы на здравоохранение [109]. Персонализированная медицина базируется на уникальных клинических, генетических и геномных особенностях каждого человека, используя междисциплинарные, интегрированные технологии, используемые для раскрытия молекулярных механизмов болезни с целью оптимизации профилактиктической стратегии [112, 122]. Персонализированная медицина включает в себя несколько ключевых подходов: 1. Предсказание вероятности развития того или иного заболевания на основе геномных данных; 2. Переход от клинической к персонализованной схеме диагностики заболеваний с учетом индивидуальных особенностей пациента, различных молекулярных биомаркеров. 3. Разработка персонализированной тактики лечения с учетом молекулярногенетических особенностей организма, с последующим мониторингом эффективности проводимой терапии на основании биомаркеров. 4. Индивидуальный подбор лекарственных и других лечебных средств с учетом особенностей генома и терапевтического мониторинга [23]. Анализ клинических работ по изучению генной регуляции энергетического метаболизма у больных с ожирением показал чрезвычайную сложность механизмов, которые контролируют белково-метаболические взаимодействия. Многочисленными исследованиями доказано, что развитие алиментарно-зависимых заболеваний обусловлено суммарным вкладом 21 измененных активностей различных генов [122, 129, 138]. Согласно этой теории фенотипические проявления генетического компонента в развитии ожирения могут возникнуть при наличии провоцирующего фактора внешней среды, макро- и микронутриентов пищи, что обуславливает актуальность изучения как алиментарных, так и наследственных триггеров ожирения [122, 144]. Известно, что ключевым фактором развития функциональных и органических нарушений при ожирении является энергетический дисбаланс, который реализуются на молекулярном и клеточном уровне. В связи с этим представляется актуальным поиск маркеров, задействованных на критически значимых этапах энергетического метаболизма [44]. Установлено, что липогенез в жировой ткани осуществляется посредством трех основных метаболических путей: 1. Поступление экзогенных жиров из энтероцитов в виде хиломикронов; 2. Поступление эндогенных жиров, синтезированных в гепатоцитах из глюкозы в виде ЛПОНП; 3. Образование жиров из глюкозы в адипоцитах. В основе первых двух механизмов лежит гидролитическая активность липопротеинлипазы, в результате которой образуются свободные жирные кислоты, используемые в дальнейшем для синтеза триацилглицеролов. Однако в адипоцитах отсутствует фермент глицеролкиназа, что делает невозможным фосфорилирование глицерола, необходимого для синтеза жиров. Единственный путь образования глицерол-3-фосфата дигидроксиацетонфосфата, образующегося в - это восстановление процессе гликолиза[7]. Следовательно, синтез жиров в адипоцитах возможен только при поступлении глюкозы в клетку с помощью белка-переносчика глюкозы ГЛЮТ-4, активного только в присутствии инсулина. При снижении поступления углеводов с пищей избыток белков также может использоваться как энергетический субстрат посредством ферментов глюконеогенеза, преобразовывающих аминокислоты в глюкозу [7, 21, 42, 64]. 22 Таким образом, все метаболические пути утилизации макронутриентов пересекаются на этапе липогенеза. Результаты многочисленных исследований показали, что в развитии нарушений липидного метаболизма при ожирении и сопутствующих ему заболеваний центральная роль принадлежит дисбалансу транспортных форм липидов, апобелков и дискоординационных изменений ферментов липолиза и липогенеза [40, 74, 97, 101, 142]. Так, самые крупные транспортные формы липидов – хиломикроны– синтезируются путем ресинтеза в энтероцитах при участии аполипопротеина В48, после чего путем экзоцитоза выделяются в лимфоток. В процессе циркуляции в лимфе, а затем, в крови с липопротеинов высокой плотности на формирующиеся хиломикроны переносятся аполипопротеины C-II и E (апоC-II и апоE). После этого зрелые хиломикроны подвергаются расщеплению под действием липопротеинлипазы эндотелиацитов внепечѐночных сосудов. При этом образующиеся жирные кислоты проникают в ткани, а активатор липопротеинлипазы апоC-II вновь переносится на липопротеины высокой плотности (ЛПВП). Остаточные ремананты поглощаются гепатоцитами за счѐт рецепторного связывания (через рецептор липопротеинов низкой плотности) эндотелия с апоE и последующего эндоцитоза, где подвергаются деградации. Таким образом, хиломикроны обеспечивают перенос (транспорт) пищевых липидов от кишечника к печени и другим тканям [69, 75, 76]. В образовании хиломикронов центральная роль принадлежит аполипопротеину C-II и липопротеинлипазе, функциональные нарушения которых могут привести к увеличению концентрации хиломикронов и остаточных реманантов в крови, что является доказанным фактором риска развития атеросклероза [35]. Ген апоС-II локализуется в хромосоме 19 и находится в кластере с другими аполипопротеинами апоЕ и апоС-I. Белок а апоС-II состоит из 79 аминокислот. Молекулярная масса белка невелика и составляет 8,8 кДа, что ставит его на границу между истинными белками и полипептидами [120]. Кроме этого, апоС- 23 II обладает низким сродством к липидам, что обуславливает его способность обмениваться между липопротеинами. Важнейшая функция апоС-II- активация липопротеинлипазы в качестве кофактора. Мутации гена апоС-II является редким наследственным заболеванием и приводит к гиперлипидемии I типа с высоким уровнем хиломикронов и остаточных реманантов в крови [137]. Установлено, что липопротеинлипаза, продукт гена LPL, представляет собой ключевой фермент метаболизма липидов, осуществляющий гидролиз триглицеридов с образованием свободных жирных кислот, которые депонируются в жировой ткани. Данный ген кодирует полипетид длиной 475 аминокислотных остатков (рисунок 2). Рисунок 2. Транскрипция и трансляция гена LPL Первый экзон кодирует 5'-нетранслируемую область, сигнальный пептид и первые 2 аминокислоты зрелого пептида. Следующие восемь экзонов кодируют остальные 446 аминокислот пептида и последний десятый экзон содержит 3'-нетранслируемую область составом из 1948 нуклеотидов [119, 142]. Выявлено, что полиморфный вариант Ser447Ter гена LPL приводит к замене цитозина на гуанин в позиции 1595 в 9 экзоне, что обуславливает 24 возникновение преждевременного стоп-кадона TGA и удаление двух аминокислотных остатков с С-конца липопротеинлипазы [165]. Липопротеины очень низкой плотности (ЛПОНП) по структуре и составу сходны с хиломикронами, однако их синтез осуществляется гепатоцитами. Основными структурно-функциональными белками, входящими в состав ЛПОНП: являются аполипопротеины апо В-100, апо Е и апо С-I, C-II, C-III [33]. ЛПОНП преимущественно состоят из эндогенных триглицеридов, также из эфиров холестерина, поэтому их повышенное содержание в плазме крови проявляется гипертриглицеридемией, которая в сочетании с низким уровнем липопротеинов высокой плотности, является фактором риска развития сердечно-сосудистой патологии. ЛПОНП подвергаются липолизу в плазме и превращаются в ЛППП [7, 69, 75, 76]. Данные клинических исследований установили, что гипертглицеридемия часто выявляется у больных с инсулиннезависимым сахарным диабетом, гипотиреозом, ожирением [171]. Учитывая этот факт, большой интерес представляет изучение полиморфных вариантов генов аполипопротеинов С-I, С-III и Е. К аполипопротеинам С относятся, по крайней мере, три индивидуальных апопротеина, которые являются основными компонентами ЛПОНП и минорными компонентами ЛПВП. АпоС-I относится к обмениваемым аполипопротеинам, является активатором лецитинхолестеринацилтрансферазы, ингибиром эфиры холестерина-переносящий белок (ЭХПБ),печѐночной липазы и фосфолипазы 2. Ген апоС-I картирован на хромосоме 19 в пределах кластера генов аполипопротеинов [28]. Кроме этого, до конца не ясна роль АпоС-III в липидном обмене. Однако доказана способность АпоС-III ингибировать фермент липопротеинлипазу. Ген апоС-III человека (APOС3) локализуется в хромосоме 11 и находится в тесном комплексе с аполипопротеинами апоА-I и апоА-IV. Известна редкая наследственная мутация, которая приводит к нарушению 2 белков — 25 недостаточность апоС-IIIи апоА-I, связанная с развитием раннего атеросклероза [130]. Аполипопротеин Е, кодируемый геном APOE, ассоциирован с липопротеинами и опосредует их связывание с рецепторами для последующего эндоцитоза [101]. Полиморфизм гена ароЕ представлен тремя аллелями (ε2, ε3 и ε4) и фенотипически реализуется в виде трех изоформ белка (Ε2, Ε3 и Ε4), которые имеют различное сродство к рецепторам [156]. Изоформа аполипопротеина Е4 имеет самую низкую скорость связывания с рецепторами. Выявлена связь аллельного варианта ε4 (Cys112Arg) с повышением содержания липопротеидов низкой плотности (ЛПНП) в крови, в то время как присутствие ε2 (Arg158Cys) аллеля ассоциируют со снижением уровня ЛПНП и триглицеридов [156, 159]. Масштабные популяционные исследования выявили частоту встречаемости полиморфных маркеров Е2 , Е3 и Е4 гена аполипопротеина Е в европейской популяции соответственно 7%, 77% и 15% [2]. Липопротеины низкой плотности (ЛПНП) являются основной транспортной формой холестерина, перенося его в виде эфиров в комплексе с апоВ-100 к клеткам тканей и органов [75, 76]. Повышенное содержание в плазме ЛПНП достоверно связано с развитием атеросклероза в коронарных артериях. Однако проатерогенной активностью обладают модицировнные ЛПНП, подвергшиеся перекисному окислению. Окисленные ЛПНП характеризуются нарушением лиганд-рецепторного взаимодействия с рецепторами гепатоцитов, а также способностью к хемоаттракции моноцитов. Активированные моноциты крови проникают в субэндотелиальное пространство сосуда, преобразовываясь в макрофаги, которые фагоцитируют модифицированные ЛПНП, а затем, в пенистые клетки. Активированные макрофаги и пенистые клетки высвобождают биологически активные вещества - факторы роста, провоспалительные цитокины, молекулы адгезии. В результате усиливаются процессы проницаемости эндотелия, что ведет к формированию атеросклеротической бляшки [8, 34, 76]. 26 Существенный вклад в развитие нарушений липидного обмена вносят мутации гена рецептора ЛПНП (LDLR). Вследствие мутации количество нормально функционирующих рецепторов ЛПНП на поверхности гепатоцитов уменьшается, что ведет к недостаточному захвату ЛПНП и повышению уровня холестерина ЛПНП в плазме крови. Описано значительное количество дефектов гена рецептора ЛПНП, что отражает огромную молекулярную гетерогенность этого заболевания. Показано, что большинство мутаций гена рецептора ЛПНП являются либо небольшими делециями, инсерциями, дупликациями, либо точечными мутациями [46]. Известно, что количество функционирующих рецепторов ЛПНП на поверхности гепатоцитов является одним из важнейших факторов, влияющих на уровень ЛПНП в плазме [52]. Передовые исследования в области генетики метаболического синдрома связывают развитие многих форм ожирения с мутациями гена ApoB. В организме апоВ представлен двумя изоформами - апоВ-100 и апоВ-48. Обе изоформы экспрессиируются с одного гена. Ген АPOB человека содержит 29 экзонов, и его общая длина составляет 43 тысяч пар оснований. Длина мРНК этого гена, кодирующей ApoB-100 с молекулярной массой 512 кДа, составляет 14 тысяч оснований. В середине самого большого экзона 26 имеется глутаминовый кодон СAA, который в результате редактирования мРНК превращается в терминирующий кодон UAA[58, 75, 76]. В результате трансляции редактированных мРНК образуется укороченный APOB48 (241 кДа), который содержит 2152 N-концевых аминокислотных остатка APOB100. АпоВ-100 синтезируется в печени путем транскрибирования полной копии гена ApoB. В кишечнике, при участии транскрипта 48% гена ApoB синтезируется изоформа апопротеина апоВ-48[58]. Также выявлены мутации в гене, переноса триглицеридов (MTTP), кодирующем микросомальный белок который необходим для переноса триглицеридов на апоВ. Следовательно, эти мутации приводят к существенному повреждению процесса сборки и секреции ЛПОНП и к практическому отсутствию ЛПНП в плазме[52]. 27 Немаловажную роль в энергетическом обмене играют липопротеиды высокой плотности (ЛПВП), которые осуществляют обратный транспорт холестерина из сосудистой стенки и макрофагов в печень, откуда он экскретируется из организма в составе желчных кислот [50]. В их состав сходят апоЕ, апоС , фосфолипиды и свободный холестерин . В ходе дальнейших биохимических преобразований апоЕ замещается на апо А-I , а значительная часть холестерина подвергается процессу этерификации под действием фермента лецитинхолестеринацилтрансферазы (ЛХАТ) в крови. Нарушения синтеза ЛПВП приводят к существенному увеличению концентрации эфиров холестерина, что указывает на важную роль этих частиц в липидном обмене. Недавними исследования удалось картировать на 16 хромосоме ген, кодирующий фермент ЛХАТ (LCAT), однако, в полной мере изучены только случаи гомозиготных полиморфных генотипов, сопровождающиеся полным дефицитом ЛХАТ [155]. Кроме этого, до настоящего времени остается дискутабельным вопрос о частоте встречаемости аллельных полиморфизмов Ser447Ter гена LPL, а также ε4 и ε2 гена ApoE, определяющих характер липидного метаболизма у больных с ожирением [151,152]. Ключевым нарушения, звеном, развивающиеся объединяющим при различные ожирении, метаболические являются изменения функционирования жировой ткани на уровне адипоцитов [86, 90, 91]. Функционирование адипоцитов осуществляется посредством их рецепторов и системы вторичных мессенждеров, регулирующих процессы липогенеза и липолиза. Адипоциты обладают выраженной секреторной функцией, которая приобретает особое значение при избыточной массе тела и ожирении [83, 84, 85, 86]. Совокупность данных, полученных в результате многочисленных исследований доказали способность жировой ткани активно продуцировать адипокины-гормоноподобные биологически активные молекулы, обладающие широким спектром метаболических и нейроэндокринных эффектов [36, 40, 91, 90]. 28 На сегодняшний день нет убедительных данных, раскрывающих конкретный молекулярный механизм действия большинства адипокинов. Однако использование этих молекул в качестве биомаркеров риска развития сопутствующих ожирению заболеваний остается приоритетным направлением исследований [14, 15, 74, 79]. Одним из наиболее значимых адипокинов, специфическим для жировой ткани является адипонектин. Этот гликопротеид (известный также как Acrp30, АdipoQ, apM1) с молекулярным весом 30кДа состоит из аминотерминального коллагенового домена и карбоксилтерминального глобулярного домена, структурно подобен компоненту комплимента C1q и образует большие гомоолигомеры, которые претерпевают ряд пост-трансляционных модификаций [82]. Секреция Acrp30 повышается за счет инсулина, поэтому этот адипокин может являться фактором инсулин-регулируемого секреторного пути в адипоцитах. Уровень адипонектина в крови составляет в среднем 12-30 мкг/мл, мужчин – 830 мкг/мл и обратно пропорционален массе жировой ткани и индексу массы тела [91]. В крови адипонектин циркулирует в виде мультимерных комплексов[3, 45]. Ген, продуктом которого является адипонектин, локализован на хромосоме 3q27 в локусе, который геномные исследования связывают с риском развития висцерального ожирением и метаболического синдрома [116]. Методами молекулярно-генетического анализа было обнаружено два рецептора адипонектина, сходных по своей структуре - Аdipo1 и Аdipo2. Надмембранный участок рецептора - С-домен взаимодействует в адипонектином, а внутренний N-домен, aктивирует внутриклеточную (АМФК), протеинкиназу р38 и 5`aденозин-монофосфат киназу фактор транскрипции РРАR-α. Аdipo1 экспрессируется во всех тканях, а Аdipo2 только в мышечных клетках и гепатоцитах [82]. Секреция адипонектина детерминирована количеством жировой ткани, чем обуславливается ее снижение при выраженном ожирении. Уровень 29 адипонектина обратно пропорционален с индексом массы тела (ИМТ) и особенно массе висцеральной жировой ткани [9]. Адипонектин имеет регуляторные взаимосвязи с широким спектром биологически активных молекул. Так, ФНО-α, ИЛ-6, глюкокортикоиды угнетают секрецию адипонектина, а инсулино-подобный фактор роста-1 - стимулирует[36, 57, 82]. Получены убедительные экспериментальные данные на лабораторных животных о роли адипокнетина в регуляции углеводного обмена [40, 108, 154]. Однако остается дискутабльным вопрос о взаимодействии адипонектина и инсулина, а так же о механизме его действия в развитии инсулинорезистентности и сахарного диабета у человека[57, 126, 146, 149, 154]. Обнаружено, что, в отличии от большинства адипокинов, адипонектин оказывает противоспалительный и противоатерогенный эффект. Когда проатерогенные факторы (окисленные липопротеины низкой плотности, химические вещества или механическое воздействие) повреждают эндотелиальный барьер, адипонектин накапливается в субэндотелиальном пространстве сосудистой стенки путем связывания с субэндотелиальным коллагеном. Далее адипонектин проявляет антиатерогенные свойства в сосудистой стенке, подавляя связывание моноцитов с клетками эндотелия путем ингибирования экспрессии молекул адгезии VCAM-1, ICAM-1 и Е-селектина через ингибирование активации NF-kB. Адипонектин также уменьшает индуцированную факторами роста пролиферацию клеток гладкой мускулатуры сосудистой стенки путем ингибирования процессинга МАР-киназы. Кроме того, адипонектин подавляет формирование пенистых клеток путем ингибирования экспрессии скэвенджер-рецептора класса А [57, 80]. Многочисленные данные исследований позволяют выделить адипонектин в качестве ключевого компонента системы регуляции энергетического метаболизма[57].Особый интерес представляют адипокины, рассматриваемые в качестве предикторов инсулинорезистености – резистин, висфатин и апелин. 30 Резистин это цистеин-богатый пептид с молекулярной массой 12,5 кДа, один из трех представителей семейства резистин-подобных белков (RELMs), имеющих консервативный паттерн из 11 цистеиновых остатков на С-конце молекулы. Резистин секретируется преимущественно преадипоцитами, в меньшей степени зрелыми адипоцитами и макрофагами [11]. Предполагается, что резистин может быть связующим звеном между ожирением, воспалением и атеросклерозом у человека. Ряд исследователей считают, что резистин можно рассматривать как маркер коронарного атеросклероза [11, 36]. В экспериментальных исследованиях было обнаружено также, что резистин нейтрализует тормозящее влияние инсулина на продукцию глюкозы печенью и уменьшает поглощение глюкозы скелетными мышцами независимо от транспортеров глюкозы [11]. Висфатин - продукт гена PBEF, обладающий инсулин-миметическим эффектом участвующий в развитии сахарного диабета 2-го типа. В последнее время показано, что висфатина осуществляет так же важные внутриклеточные эффекты, гомологичные действию никотинамидфосфорибозилтрансферазе (NAMPT), играющей существенную роль в энергетическом гомеостазе. Висфатин (также известный как PBEF и Nampt) представляет собой белковую молекулу, молекулярной массой 52 кДа, состоящий из 473 аминокислотных остатков. Висфатин сочетает в себе свойства гормона и фермента, участвующего в биосинтезе никотинамид-аденин-динуклеотида, выполняя роль катализатора на первом этапе биосинтеза NAD из никотинамида. Экспрессия висфатина наиболее выражена в костном мозге, мышцах и в ткани печени, и в меньшей степени в легких, почках и в ткани сердца [174]. На сегодняшний день нет единого представления о физиологической и патофизиологической роли висфатина. Тем не менее, ряд исследователей установили взаимосвязь высоких уровней висфатина и метаболических нарушений, развивающихся на фоне ожирения. Висфатин стимулирует транспорт глюкозы в периферические ткани и тормозит продукцию глюкозы гепатоцитами [68, 111]. Показано, что висфатин участвует в активации 31 созревания В-клеток и ингибировании апоптоза нейтрофилов. В норме концентрации висфатина варьирует в диапазоне 15,8-32,5 нг/мл [68]. Апелин представлен несколькими изоформами (апелин-36, апелин17,апелин-13 и посттрансляционно модифицированные (Pyr1) апелин-13 и апелин- 12), образующимися из общего предшественника – димера длиной 77аминокислотных остатков. Все изоформы апелина содержат C-концевой фрагмент их 12 аминокислот, связывающий и активирующий рецепторы и обеспечивающий их биологическую активность[65, 106, 140]. Экспериментальные исследования указывают на то, что лечение больных с ожирением апелином приводит к снижению инсулина в крови, улучшению усвоения глюкозы и активации липолиза [68, 82]. Исследования, проведенные Castan-Laurell I. показали возможность контроля инсулином синтеза апелина. Установлено, что при ожирении и сахарном диабете 2-го типа плазменные уровни апелина, а также экспрессия гена апелина в жировой ткани увеличивается [106, 111]. Однако изучение концентрации апелина и его рецепторов имеет в основном описательный характер и в настоящее время представляет интерес для исследования его метаболических эффектов в норме и патологии, особенно при избыточной массе тела и ожирении. Одним из немногих адипокинов, для которого определен молекулярный механизм действия является грелин. Грелин представляет собой пептидный гормон, секретируемый преимущественно P/D1-клетками слизистой оболочки фундального отдела желудка и регулирующий энергетический гомеостаз посредством стимуляции секреции гормона роста, пролактина и адренокортикотропного гормона (АКТГ), повышения аппетита [136, 150]. Молекула грелина представляет собой пептид из 28 аминокислот. Ген грелина (GHRL) локализуется на хромосоме 3p25–26. Ген GHRL охватывает последовательность четырех экзонов длиной в 5199 пар оснований. Однако, позже было обнаружено, что это же ген кодирует другую пептидную молекулу – 32 обестатин, являющуюся по своему эффекту антагонистом грелину [88, 91, 136, 139, 150]. Грелин связывается со специфическим С-протеинсвязанным рецепторами мембран клеток различных органов и тканей, что ведет к активации протеинкиназы С, высвобождению кальция из внутриклеточного депо и торможению калиевых каналов. Обнаружение рецепторов грелина на нейтрофилах, лимфоцитах и макрофагах указывает на вовлеченность этого пептида в регуляцию иммунных процессов. Установлено, что под воздействием грелина усиливается секреция макрофагами провоспалительных цитокинов, таких как ФНОα, ИЛ-1[88, 96, 139]. Грелин регулирует энергетический гомеостаз в основном через гипоталамус при участии нейропептида Y и эндоканнабиноидной системы. Активация нейронов гипоталамуса приводит к стимуляции потребления пищи и снижению исследования скорости связывают катаболизма низкий липидов уровень [61]. грелина Многочисленные с риском развития инсулинорезистентности, гипертензии и диабета 2-го типа. Также, грелин принимает участие в долгосрочной регуляции массы тела за счет повышения уровня соматотропного гормона и стимулирования приема пищи [59, 139]. Показано, что грелин осуществляет свое регулярное метаболическое действие также посредством взаимодействия с периферическими регуляторными системами. Так, грелин оказывает антагонистическое действие по отношению к лептину, вырабатываемого жировой тканью. Данные многочисленных исследований указывают на реципрокную связь этих гормонов. Секрецию грелина в первую очередь стимулирует дефицит энергетических субстанций, а избыточное поступление нутриентов с пищей опосредует снижение выработки грелина[56]. Изучение физиологических эффектов грелина указывает на наличие сложных взаимосвязей в регуляции приема пищи и веса тела. Новейшими молекулярно-генетическими исследованиями было обнаружено, что ген GHRL кодирует еще одну пептидную молекулу – обестатин, являющуюся по своему 33 эффекту антагонистом грелину. Однако механизм запуска путей альтернативного сплайсинга до сих пор остается не выясненным[85, 86]. Таким образом, грелин представляет собой один из ключевых факторов, определяющим пищевое поведение. Многосторонние физиологические эффекты грелина дают основания использовать его как эффективный прогностический маркер в оценке эффективности терапии у больных с ожирением [88]. Анализ литературных данных последних лет позволяет заключить, что при ожирении выявляется дисбаланс в синтезе адипокинов, что усугубляет метаболические нарушения и приводит к развитию таких заболеваний, как сахарный диабет 2-го типа, артериальная гипертония, ишемическая болезнь сердца и др. [22, 94, 95, 87, 89, 132] Однако внимание исследователей было сконцентрировано на изучении роли отдельных адипокинов в развитии той или иной патологии. Вместе с тем, до настоящего времени отсутствует комплексная оценка изменений профиля различных адипокинов с характеристикой метаболизма у больных с ожирением [14, 15, 36, 74]. Поскольку частота осложнений, сопровождающих развитие ожирения, неуклонно растет, то большую актуальность приобретает проспектовая диагностика патологических состояний различных органов и систем. Таким образом, адипокины являются клинически значимыми в качестве биомаркеров для изучения функционирования жировой ткани в норме и патологии, чувствительности к инсулину, хронического воспаления и обладают потенциалом для создания стратегий лечения ожирения и связанных с ним заболеваний[14, 74]. Представления о метаболическом синдроме как о комплексном патологическом процессе основываются на том, что при ожирении наблюдается дисбаланс различных метаболических факторов, в том числе и изменениями в секреции цитокинов, развитием внутриклеточной воспалительной реакции [83, 84, 85, 86, 91]. Совокупность данных, полученных в результате исследований регуляторных взаимосвязей между провоспалительными цитокинами и 34 молекулярными эффекторами жировой ткани доказали роль избыточной продукции жировой тканью IL-6, IL-1, TNFα в модуляции синтеза резистина, апелина, снижении продукции адипонектина посредством которых индуцируется инсулинорезистеность и другие биохимические процессы [24, 79, 84, 85, 90]. Прогрессирующее развитие метаболических осложнений при ожирении является результатом субклинического воспалительного процесса и активации иммунной системы и дисфункции жировой ткани как эндокринного и иммунного органа [39, 83,86]. Исследования последних лет свидетельствуют о важной роли воспалительных реакций и активации иммунной системы в развитии метаболических нарушений при различных заболеваниях. В популяционных исследованиях выявлена связь между маркерами липидного и углеводного обмена и иммунологическими факторами при ожирении, сердечно-сосудистых заболеваниях [6, 24, 83, 86]. Центральным звеном метаболических нарушений, которые рассматриваются как следствие и причина ожирения, является хронического воспаления жировой ткани [84]. Воспаление жировой ткани характеризуется клеточной инфильтрацией, фиброзом, изменениями микроциркуляции, дисбалансом в секреции адипокинов и нарушениями метаболизма жировой ткани, а также повышением в крови уровня таких неспецифических маркеров воспаления как С-реактивный белок, фибриноген, лейкоциты, молекулы адгезии, коррелирующих с выраженностью воспалительного процесса [24, 77, 84, 85, 90]. Доказано, что адипоциты продуцируют широкий спектр биологически активных молекул в тот числе провоспалительных цитокинов: адгезивные молекулы sICAM, фактора некроза опухоли-α (ФНО-α), интерлейкины-6 (ИЛ-6) и -1 (ИЛ-1), гормоноподобные субстанции – адипокины, а также хемокины (МСР-1 и RANTES) [83, 84, 85,86]. Биологическая роль ИЛ-6, в первую очередь, заключается в индукции восстановительных механизмов и активации иммунной защиты (активация и 35 дифференцировка Т-клеток, вызревание В-клеток, усиление гемопоэза). Важным достижением науки стало открытие способности адипоцитов в большом количестве синтезировать ИЛ-6, обосновывающим его регуляторную функцию при ожирении. У здоровых людей уровень ИЛ-6 в плазме крови колеблется в диапазоне 1-2 пг/мл [89, 93]. На фоне заболеваний, сопровождающихся хроническим воспалительным процессом, к которым относится и ожирение, секреция ИЛ-6 существенно возрастает. Важно отметить, что помимо адипоцитов, в системную воспалительную реакцию вовлекаются иммунные клетки, такие как макрофаги, инфильтрирующие жировую ткань [83, 89, 91,93]. Еще один провоспалительный цитокин, синтезируемый жировой тканью – ИЛ-1 - негативно сказывается на дифференциации адипоцитов, ингибирует секрецию инсулина, и имеет цитотоксический эффект на инсулин- продуцирующие бета-клеток поджелудочной железы, стимулируют синтез и секрецию лептина адипоцитами. Однако его роль в развитии воспаления жировой ткани остается неясной [85]. Одним из важнейших звеньев развития системного воспаления при ожирении является ФНОα, который снижает активность тирозинкиназы инсулинового рецептора и усиливает фосфорилирование серина субстрата инсулинового рецептора, что сопровождается ослаблением проведения сигнала инсулина, подавлением транскрипции гена транспортера ГЛЮТ-4 в мышечной и жировой ткани. Тем не менее, остается нераскрытым вопрос о роли ФНО-а в развитии инсулинорезистентности при ожирении [11]. Несмотря на широкомасштабные исследования эндокринной функции жировой ткани, роль гуморального звена иммунной системы у больных с метаболическими нарушениями в современных литературных источниках практически не освещается, что делает актуальным изучение ожирения с позиции расширения и углубления представлений о его патогенезе, в которой существенную роль играют иммуноопосредующие механизмы. Кроме этого, остается малоизученной связь аллельного полиморфизма генов-регуляторов 36 обмена липидов с проявлениями иммунного дисбаланса у больных с ожирением [6, 83,86]. В связи с этим, изучение механизмов участия иммунной системы в метаболических нарушениях у больных с ожирением и особенностей их генотипа остается актуальной задачей. Результаты этих исследований могут быть использованы в диагностике сопутствующих поражений внутренних органов, иметь важное прогностическое значение и позволить раскрыть некоторые звенья патогенеза ожирения. 2.5 Обоснование выбора предмета исследования В патогенезе ожирения одно из центральных мест принадлежит нарушению липидного обмена, дисбалансу адипокинов, изменениям регуляции на уровне цитокинов и адгезивных молекул. Несмотря на большой объѐм данных, описывающих количественные показатели адипокинового и цитокинового статусов, эти сведения нельзя признать исчерпывающими, поскольку они не рассматривают метаболическую активность адипоцитов в комплексе с индивидуальными особенностями генотипа и фенотипа больных с ожирением. Большинство исследований полиморфизмов ε2 и ε4гена ApoE и Ser447Ter гена LPL проведены в азиатских и африканских этнических группах, что объясняет невозможность экстраполировать результаты распределения частот генотипов на российскую популяцию. Вопреки ожирения, значительному остается прогрессу, дискутабельным достигнутому вопрос о в исследовании роли генетического полиморфизма и поиск биомаркеров риска развития сопутствующих ожирению заболеваний, что обуславливает актуальность и практическую значимость настоящего исследования. 37 3 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 3.1 Клиническая характеристика обследованных больных Было обследовано 242 пациентов в возрасте от 18 до 66 лет. В основную группу включены 217 больных (52 мужчин и 165 женщин), находящихся на лечении в отделении профилактической и реабилитационной диетологии ФГБНУ «НИИ питания» РАМ (зав.отделением – к.м.н. Гаппарова К.М.). Группу контроля составили 25 здоровых лиц в возрасте от 7 до 57 лет (11 мужчин и 14 женщин), посещавшие Клинику ФГБНУ «НИИ питания» с целью диспансерного обследования. Всем больным проводили физикальное и антропометрическое исследование: определяли рост, масса тела с последующим расчетом индекса массы тела (ИМТ) по формуле: ИМТ (кг/м2) =Масса тела (кг) / Рост2 (м) На основании ИМТ все больные были разделены на 3 группы: 1-ю группу составили больные с I степенью ожирения (n=55), 2-я группа – больные с II степенью ожирения (n=70), 3-я группа - больные с III степенью ожирения (n=92) (Таблица 3.1). Таблица 3.1 Клиническая характеристика больных с различными степенями ожирения (M ± m) Показатель I II III Возраст 36,74 ±2,24 41,68 ± 1,99 39,43 ± 1,53 Масса тела, кг 89,71 ± 1,38 104,5 ± 1,44 138,80 ± 3,53 Индекс массы тела, кг/м2 32,44± 0,22 37,49± 0,18 46,90± 0,93 Соотношение ОТ/ОБ 0,86 ±0,02 0,97 ±0,01 1,01 ±0,02 Жировая масса, кг 38,32 ±1,09 48,23 ±0,83 68,56 ± 2,25 Масса висцерального жира, кг 13,44 ± 0,38 18,16 ± 1,74 20,10 ± 0,76 38 Среди сопутствующей патологии отмечены гипертоническая болезнь, гиперлипидемия, атеросклероз, сахарный диабет, аллергические заболевания, заболевания гепатобилиарной системы и желудочно-кишечного тракта и др. Структура сопутствующей патологии у больных с ожирением представлена в таблице 3.2. Таблица 3.2 Структура сопутствующей патологии у больных с ожирением Сопутствующая патология abs % Гипертоническая болезнь 41 18,9 Атеросклероз 10 4,6 Гиперлипидемия 80 36,9 Сахарный диабет 29 13,4 Заболевания гепатобилиарной системы 13 6,0 Заболевания желудочно-кишечного тракта 10 4,6 Аллергические заболевания 9 4,1 Гинекологические заболевания 11 5,0 Оценка состояния сердечно-сосудистой системы проводилась в отделении сердечно-сосудистой патологии клиники ФГБНУ «НИИ питания» (зав.отделением – к.м.н. Богданов А.Р.) и включала определение показателей кардиограммы с помощью аппарата Schiller AT-2 plus (Германия), данные эхокардиографии, полученные с помощью ультразвукового аппарата Vivid 7 («General Electric», США). На основании выявленных результатов, была выделена группа больных со II-III степенями ожирения (n=73), осложненного атеросклерозом. 39 В ходе динамического наблюдения на базе отделения гастроэнтерологии и гепатологии клиники ФГБНУ «НИИ питания» (зав.отделением – д.м.н. Исаков В.А.) больным с ожирением проводили ультразвуковую эластографию и стандартное ультразвуковое исследование печени с использованием приборов «Echosenes» и ProSound 5500 SV фирмы «Aloka». На основании полученных результатов обследования было выделено 22 больных со II-III степенями ожирения, осложненного неалкогольной жировой болезнью печени. Анамнестические данные свидетельствуют о том, что у 29% (63 abs) больных дебют заболевания приходился на ранний детский возраст, на пубертатный период –8,7% (19 abs) и 13,4 % (29 abs)набирали вес после 40 лет. При анализе триггеров в развитии ожирения, ведущую роль играл алиментарный фактор. Также в качестве причин манифестации заболевания отмечались гиподинамия у 3,7% (8 abs), у 2,8% (6 abs) – реакция на перенесенный стресс, заболевания щитовидной железы (уэтиреоз, диффузный и узловой зоб) – у 5,5% (12 abs). Среди женщин 17% (28 abs) начали набирать вес в период после родов. При оценке манифестации заболевания и сроков проявления первых симптомов заболевания было установлено, что в группе больных с I степенью ожирения лишний вес с детства отмечался в 46,1% (18 abs) случаев, у больных со II степенью ожирения - 40% (21abs), у больных с III степенью ожирения – 42,7% (32 abs). Следовательно, манифестация ожирения у обследованных больных происходила в детском возрасте в 35,1% случаев. Наследственная отягощенность в группе с I степенью ожирения составила 20% (11 abs), в группе со II степенью ожирения – 25,7% (18 abs) и в группе с III степенью ожирения – 40,2% (37 abs). Таким образом, высокая частота случаев ранней манифестации ожирения и наследственно отягощенного анамнеза указывает на значительную роль генетических факторов в развитии ожирения. 40 3.2 Молекулярно-генетические методы исследования С целью проведения молекулярно-генетического анализа у больных ожирением натощак собирали 2-3 мл венозной крови в вакуумные пробирки с 0,05М раствором ЭДТА. 3.2.1 Выделение ДНК Выделение геномной ДНК проводили из цельной крови с использованием реактива «Проба-Рапид-Генетика» фирмы «ДНК-технология» (Россия). Последовательность действий при проведении процедуры выделения ДНК из цельной крови: 1. Маркируют необходимое количество пластиковых пробирок фирмы «Scientific Specialties Inc.» (США) объѐмом 1,5 мл с защѐлкой в соответствии с количеством анализируемых проб и одну пробирку для отрицательного контрольного образца «К–». 2. Вносят 600 мкл лизирующего раствора в каждую промаркированную пробирку. 3. Добавляют 100 мкл периферической крови, перемешанной переворачиванием пробирки, в соответствующую пробирку с лизирующим раствором. В пробирку, промаркированную «К–», вносят 100 мкл стерильного физиологического раствора. Закрывают крышки пробирок. Встряхивают пробирки на вортексе «Microspin FV-2400»фирмы «Biosan» (Латвия) в течение 3–5 сек. Биологический образец обрабатывают лизирующим раствором. В результате происходит деструкция клеточных мембран, других биополимерных комплексов и высвобождение ДНК. 41 4. Центрифугируют пробирки с использованием центрифуги «Sigma 1-14» фирмы «Sigma Laborzentrifugen» (Германия) при 13000 об/мин в течение 1 мин. Растворенная ДНК в комплексе с белками выпадает в осадок. 5. Удаляют надосадочную жидкость. Компоненты лизированного клинического материала остаются в растворе и удаляются. 6. Добавляют к осадку 300 мкл реактива «Проба-Рапид» фирмы «ДНКтехнология» (Россия), закрывают крышки пробирок и встряхивают пробирки на вортексе в течение 5–10 сек. 7. Термостатируют пробирки при 98°С в течение 10 мин в термостате «Гном» фирмы «ДНК-технология» (Россия). При добавлении буферного раствора и термостатировании происходит диссоциация белков от ДНК и высвобождение ее в раствор. В результате указанной процедуры получается высокоочищенный препарат ДНК, свободный от ингибиторов реакции амплификации. 8. Центрифугируют пробирки при 13000 об/мин в течение 3 мин. 9. Надосадочная жидкость, содержащая выделенную ДНК, готова к внесению в реакционную смесь для амплификации. 3.2.2. Полимеразная цепная реакция в режиме реального времени Принципиальной особенностью режима Real-Time PCR является мониторинг и количественный анализ накопления продуктов полимеразной цепной реакции, а также автоматическая регистрация и интерпретация полученных результатов. 42 В реакционную смесь введены два ДНК-зонда (к двум аллелям исследуемого полиморфизма), каждый из которых содержит флуоресцентный краситель на 5`-конце и тушитель флуоресценции на 3`-конце. В исходном растворе фоновая флуоресценция минимальна, но в результате проведения амплификации флуоресцентные красители высвобождаются, что позволяет детектировать наличие в амплифицированной смеси того или иного аллеля образца ДНК. Генотипирование образцов проводили с использованием наборов фирмы «ГосНИИ генетика» (Россия), микропробирок фирмы «Greinerbio-one»(США) и детектирующего амплификатора «ДТ-96» фирмы ДНК-технология» (Россия). Состав реакционной смеси для ПЦР: 1. Taq-полимераза с 5`-нуклеазной активностью (растворена в буфере: 10 мМ HEPES; pH 8,0; 100мМ KCl; 1% Tween-20; 5 мМ DTT; 50% глицерин) 2. Смесь для ПЦР (670мМ Tris-HCl (pH 8,8 при 25оС) 0,1% Tween-20, 2мМ dNTPs, 10мМ праймеров, 5мМ зондов) 3. Деионизованная вода 4. Образец ДНК Таблица 3.3 Нуклеотидные последовательности праймеров целевая область последовательности праймеров (5’-3’) Arg158Cys F,gcgtaagcggctcctc гена ApoE R,ctcctgtagcggctgg Cys112Arg F,ctgtccaaggagctgca гена ApoE R,aggtcatcggcatcgc Ser447Ter F,cctgcggtatttgtgaaa гена LPL R,cagctttagcccagaatg 43 Таблица 3.4 Нуклеотидные последовательности флуоресцентных зондов целевая область последовательности зондов Модификация 5’-конца Модификация 3’-конца (5’-3’) Arg158Cys FAM- tgcagaagcgcctggc -BHQ1 FAM BHQ1 гена ApoE VIC- tgcagaagtgcctggc -BHQ2 VIC BHQ2 Cys112Arg FAM- aggacgtgcgcgg-BHQ1 FAM BHQ1 гена ApoE VIC- aggacgtgtgcggc-BHQ2 VIC BHQ2 Ser447Ter FAM- accagcctcacttcttat-BHQ-1 FAM BHQ1 гена LPL VIC- accagcctgacttcttat-BHQ-2 VIC BHQ2 Общая схема проведения ПЦР 1. Денатурация На первом этапе двойная спираль ДНК под действием высоких температур расплетается, с образованием одноцепочечных молекул. Для этого реакционную смесь нагревают до 92-95°С. Продолжительность этапа 1-2 минуты. 2. Отжиг На втором этапе праймеры присоединяются к одноцепочечной ДНКмишени. Отжиг происходит в соответствии с правилом комплементарностиЧаргаффа, согласно которому в любой молекуле ДНК количество аденина всегда равно содержанию тимина, а количество гуанина — количеству цитозина. После отжига праймеровTaq-полимераза начинает достраивание второй цепи ДНК с 3 '-конца праймера. Помимо пары праймеров, комплементарных участку, содержащему исследуемый ген, в реакционной смеси присутствуют дополнительные зонды, комплементарные внутреннему участку гена (мутантному аллелю и аллелю дикого типа). На 5’- конце зонда располагается флуоресцентная метка, 44 испускающая флуоресценцию, на 3’- конце присоединен гаситель флуоресценции. Специфические зонды связываются с исследуемыми областями ДНК по принципу комлементарности. 3. Элонгация На этапе элонгации температуру в реакционной смеси доводят до оптимума работы Taq-полимеразы, что обеспечивает синтез второй цени ДНК. Когда Taq-ДНК-полимераза, продвигаясь по одноцепочечной матрице, достигнет зонда, то произойдет его расщепление благодаря эндонуклеазной активности ДНК-полимеразы. После расщепления зонда краситель высвобождается, и сигнал флуоресценции, соответствующий этому аллелю, растет. Дуплекс с зондом с одним неспаренным нуклеотидом (второй аллель) имеет меньшую температуру плавления и не разрушается, а отщепляется полимеразой целиком. По отношению уровней флуоресценции от обоих зондов судят о наличии в пробе одного или другого аллеля. Температурный цикл амплификации многократно повторяется, обеспечивая на каждом цикле двукратное увеличение числа копий ДНК. Результатом циклического процесса является экспоненциальное увеличение количества специфического фрагмента ДНК, которое можно описать формулой: А = М*(2n-n-1)~2n,где А - количество специфических продуктов реакции амплификации; М - начальное количество ДНК-мишеней; n - число циклов амплификации. 4.Выход на «плато» Процесс накопления специфических продуктов амплификации ограничен по времени, затем его эффективность критически падает. "Эффектом плато" описывают процесс накопления продуктов ПЦР на последних циклах амплификации, когда количество ампликонов достигает Проведение дальнейшего анализа нецелесообразно. 0,3-1 пмолей. 45 Таблица 3.5 Расчет компонентов ПЦР-смеси (на 1 образец) Реагент Количество Деионизованная вода 6,9 мкл Смесь для ПЦР APOE-Arg158Cys 2,0 мкл Taq-полимераза 0,1 мкл Исследуемый образец (~30 нг ДНК /мкл) 1,0 мкл Суммарный объем 10 мкл Таблица 3.6 Режим проведения ПЦР для генотипирования полиморфизма Arg158Cys гена ApoE Первая денатурация 40 циклов 95оС – 2:00 мин 94оС – 0:10 мин 62оС – 1:00 мин Соответствие флуоресцентных красителей: Аллель Arg – канал FAM. Аллель Cys – канал VIC/Hex Таблица 3.7 Режим проведения ПЦР для генотипирования полиморфизма Cys112Arg гена ApoE Первая денатурация 95оС – 2:00 мин 40 циклов 94оС – 0:10 мин 62оС – 1:00 мин Соответствие флуоресцентных красителей: Аллель Arg – канал FAM. Аллель Cys – канал VIC/HEX. 46 Таблица 3.8 Режим проведения ПЦР для генотипирования полиморфизма Ser447Ter гена LPL Первая денатурация 40 циклов 95оС – 2:00 мин 94оС – 0:10 мин 58оС – 1:00 мин Соответствие флуоресцентных красителей: Аллель Ser – канал VIC/HEX. Аллель Ter – канал FAM. 3.3 Биохимические методы исследования Исследования уровней холестерина (ХС), липопротеидов высокой плотности (ЛПВП), липопротеидов низкой плотности (ЛПНП), триглицеридов, аполипопротеинов А и В проводили на биохимическом анализаторе Konelab 60i (Финляндия) с использованием тест-систем фирм «Vital Development Corporation» (Россия) и «Thermo Scientific» (Финляндия). Фотометрический блок прибора представлен одноканальным фотометром с интерференционными светофильтрами, в котором используется принцип референсного расщепления луча. Диапазон спектра измерения – 340800 нм. Анализатор осуществляет измерения в кинетическом, турбидиметрическом режиме и по конечной точке. Для оценки результатов применяли линейную, нелинейную калибровку и калибровку со смещением. При этом допускается калибровка отдельными образцами стандарта (калибратора). 1. Содержание глюкозы в сыворотки крови исследовали с применением системы ферментов глюкозооксидаза-пероксидаза фирмы «Vital Development Corporation» (Россия). Данный способ основан на окислении глюкозы глюкозооксидазой с выделением эквимолярного количества перекиси водорода, окисляющей субстрат (хромоген) в присутствии катализатора - 47 пероксидазы с образованием окрашенного соединения. Интенсивность окраски пропорциональна количеству выделившейся перекиси водорода и, следовательно, концентрации глюкозы в исследуемом материале. 2. Концентрация холестерина в исследованных образцах определяли с использованием реактивов фирмы «Vital Development Corporation» (Россия). Холестерин, высвобождающийся из эфиров холестеина при их гидролизе, окисляется кислородом образованием воздуха эквимолярного под действием количества холестеролоксидазы перекиси водорода. с Процесс окисления хромогенных субстратов перекисью водорода под действие пероксидазы сопровождается образованием окрашенных продуктов. По интенсивности окраски оценивают концентрацию холестерина. 3. Исследование содержания триглицеридов в сыворотке крови проводили с использованием тест-системы фирмы ««Vital Development Corporation» (Россия). Принцип метода определения концентрации триглицеридов выражается последовательностью реакций: триглицериды −липаза→ глицерин+ жирные кислоты; глицерин + АТФ −глицерокиназа→ глицерил-3-фосфат + АДФ; глицерил-3-фосфат +О2−ГФО→ диоксиацетон фосфат + 2Н2О2; Н2О2+ 4-ААР + 4-хлорфенол −пероксидаза→ хинонимин +4Н2О; Концентрация хинонимина, определяемая фотометрически, пропорциональна концентрации триглицеридов в пробе. 4. Для изучения содержания ЛПНП применяли тест-системы фирмы «Vital Development Corporation» (Россия), при этом к образцу крови добавляли специфический реагент, образующий комплекс, защищающий ЛПНП от действия ферментов – холестеролэстеразы и холестеролоксидазы, взаимодействующих с остальными фракциями липопротеидов. Образующая в 48 ходе этих реакций перекись разрушается каталазой. При добавлении следующего реагента (буфер рН=7, NaN3, пероксидаза, хромоген) происходит высвобождение ЛПНП из комплекса, а NaN3инактивирует каталазу. При гидролизе оставшихся в растворе ЛПНП холестеролэстеразой образуется свободный холестерин, который окисляется кислородом воздуха под действием холестеролоксидазы с образованием эквимолярного количества перекиси водорода. Процесс окисления хромогенных субстратов перекисью водорода под действие пероксидазы сопровождается образованием окрашенных продуктов. Интенсивность окраски пропорциональная концентрации ЛПНП. 5. Изучение уровня ЛПВП основана на способности антител к человеческим β-липопротеидам связывать все фракции липопротеидов, кроме ЛПВП. Образовавшийся иммунный комплекс не взаимодействует в ферментами. Холестеролэстераза и холестеролоксидаза реагируют только с ЛПВП, в результате чего образуется перекись водорода. Под действием пероксидазы перекись водорода окисляет хромогенные субстраты, продукты которых определят исходную концентрацию ЛПВП в исследуемом образце. Для проведения исследования уровня ЛПВП используют реактивы фирмы «Витал Девелопмент Корпорэйшн» (Россия). Методика определения концентрации аполипопротеинов А и В основана на измерении иммунопреципитации, усиленной полиэтиленгликолем (ПЭГ), при длине волны 340 нм. Для определения концентрации аполипопротеинов А и В применяют тест-системы фирмы «ThermoScientific» (Финляндия). В анализатор Konelab устанавливается исследуемый образец сыворотки крови пациента. Затем устанавливается реактив с буферным раствором, содержащий избыток специфической антисыворотки. В анализаторе автоматически проводится исследование пробы сыворотки крови пациента. Регистрируется увеличение иммунопреципитацией. Изменение поглощения света, светопоглощения вызванное пропорционально концентрации липопротеина, содержащегося в сыворотке крови пациента. 49 Результат исследования пробы сыворотки крови пациента после ее реакции с антисывороткой к липопротеину появляется на калибровочной кривой в виде точки. По горизонтали на графике указывается концентрация липопротеина в мг/л, а по вертикали - абсорбция. Следовательно, определяется значение абсорбции пробы, которая в автоматическом режиме обозначается результирующей концентрацией липопротеина, выраженной в мг/л. 6. Принцип метода определения концентрации АЛТ выражается последовательностью реакций: L-аланин + α-кетоглутарат ←АлАт→ пировиноградная кислота + L-глутамат; пировиноградная кислота + NADH + H+ ←лдг→ лактат + NAD+; Скорость окисления NADH в NAD+ пропорциональна активности АлАТ. Для проведения исследования уровня АЛТ используют реактивы фирмы «Витал Девелопмент Корпорэйшн» (Россия). 7. Принцип метода определения концентрации АСТ выражается последовательностью реакций: L-аспартат + α-кетоглутарат ←АсАт→ оксалоцетат + L-глутамат; оксалоцетат + NADH + H+ ←мдг→ L-малат + NAD+; Скорость окисления NADH в NAD+ пропорциональна активности АсАТ. Для проведения исследования уровня АСТ используют реактивы фирмы «Витал Девелопмент Корпорэйшн» (Россия). 3.4 Иммуноферментные методы исследования Кровь для исследования забирали из локтевой вены спустя не менее 12 часов после последнего приема пищи, центрифугировали при 1500g в течение 50 10-15 минут. Полученные сыворотки хранили при t минус 80°С до процедуры проведения анализа. 3.4.1 Исследование содержания грелина, резистина, висфатина, апелина, цитокинов, адгезивных молекул sICAM, аннексинаV, L-FABP в сыворотки крови Содержание резистина определяли с использованием наборов «BioVender R&D» (Чехия), аннексин V, ФНОα, ИЛ-1α, sICAM, CRP - с применением наборов Biosource фирмы «Bio Source International Inc», (Бельгия). Для исследования концентрации ИЛ-6 применяли тест-системы фирмы «Invitrogen» (США), грелина – тест-системы фирмы «Peninsula laboratories LLC» (США). Уровень апелина определи с использованием наборов фирмы «Phoenix Pharmaceuticals Inc». (США), висфатина – с использованием наборов «RayBio» (США), L-FABP – с применением наборов «Cusabio biotech LTD» (Китай). Для учета результатов и построения калибровочной кривой использовали вертикальный спектрофотометр Sunrise фирмы «Tecan»(Австрия) с прилагаемым программным обеспечением. Определение содержания адипокинов в сыворотки крови (адипонектин, грелин, резистин, апелин и висфатин) проводили с помощью иммуноферментного анализа (ELISA). При исследовании концентрации грелина, резистина, висфатина и апелина, sICAM, ИЛ-1α, ИЛ-6, аннексинаV, в процессе анализа стандарты и образцы инкубировали в лунках микропланшета, покрытых поликлональными антителами к исследуемым адипокинам. После первой инкубации и тщательной промывки фосфатным буферным раствором несвязанных протеинов в лунки добавляли биотинилированнные антитела к другому эпитопу исследуемой молекулы. 51 После второй инкубации и процедуры промывки в лунки добавляли коньюгат стрептовидина с ферментом пероксидазой хрена (HRP), который связывается с биотинилированными антителами. После заключительной инкубации и промывки в лунки добавляли хромогенный субстрат тетраметилбензидин (ТМБ), с которым взаимодействует HRP. Реакцию останавливали добавлением 0,2 М раствора серной кислоты. Абсорбцию получившегося окрашенного развара определяли спектрофотометрически при длине волны 450 нм. Абсорбция пропорциональна концентрации исследуемой молекулы в образце. Калибровочную кривую строили с использованием значений оптической плотности, полученных для стандартных образцов, входящих в состав набора. Концентрация исследуемой молекулы определяется непосредственно из калибровочной кривой. 3.4.2 Исследование содержания адипонектина, МДА-модифицированных ЛПНП, окисленных ЛППН в сыворотки крови Содержание адипонектина определяли с использованием наборов фирмы «BioVender R&D» (Чехия). Для изучение содержания MDA-oxLDL и oxLDL использовали тест-системы фирмы «Biomedica Gruppe» (Австрия). Для учета использовался результатов и вертикальный построения калибровочной спектрофотометр Sunrise кривой фирмы «TECAN»(Австрия) с прилагаемым программным обеспечением. При изучении концентрации адипонектина, MDA-oxLDL, oxLDL в сыворотке крови в процессе анализа стандарты и образцы инкубировали в лунках микропланшета. На дне лунок микропланшета были предварительно иммобилизованы рекомбинантные конъюгированные HRP. антитела к исследуемой молекуле, 52 После инкубации и промывки добавляли раствор субстрата (ТМБ). По достижению яркой окраски высокого контроля, реакцию останавливают добавлением раствора серной кислоты. Абсорбцию образцов оценивали на вертикальном спектрофотометре c длиной волны 450 nm. По интенсивности окрашивания стандартов с помощью программного обеспечения спектрофотометра строили калибровочная кривая с использованием 4-параметрического метода. Расчет содержания в пробе исследуемого антигена производился по калибровочной кривой. 3.5 Методы статистического анализа результатов исследования Статистическая обработка данных выполнена с помощью электронных таблиц «Microsoft Excel», и пакета прикладных программ «Statistica for Windows» v. 6.0, Stat SoftInc. (США), SPSS 13.0 Все полученные количественные анамнестические, клинические, лабораторные и инструментальные данные обработаны методом вариационной статистики. Для каждого количественного параметра были определены: среднее значение (М), среднеквадратическое отклонение (δ), ошибка среднего (m), медиана (Ме), 25% и 75% квартили, 95% доверительный интервал, для качественных данных - частоты (%). Для сравнения числовых данных (после проверки количественных данных на нормальное распределение) использовали t-критерий Стъюдентадля 2-х независимых выборок. Для сравнения непараметрических данных применяли критерий Манна-Уитни (для различий между 2-х групп) для несвязанных совокупностей. Для нахождения качественными показателями использовали метод χ2 с поправкой Йетса на непрерывность, для вычисления, которого прибегали к построению «сетки 2х2» и «3х2», а также точный критерий Фишера для небольших выборок. 53 Статистически значимыми считались отличия при р<0,05 (95%-й уровень значимости) и при р<0,01 (99%-й уровень значимости). Связь между изучаемыми показателями оценивали по результатам корреляционного анализа с вычислением коэффициента корреляции Пирсона (r) или Спирмена (R) и последующим установлением его значимости по критерию t. Частоту аллелей вычисляли по формуле: f=n/2N, где n – количество раз встречаемости аллеля (у гомозигот он учитывался дважды). Относительный риск (ОР) заболеваемости вычисляли по методу Woolf по формуле (a × d) / (b × c), где а – количество больных, имеющих данный генотип; b — количество больных, не имеющих данного генотипа; c – количество здоровых индивидуумов с данным генотипом; d – количество здоровых индивидуумов, не имеющих данного генотипа. В том случае, когда один из показателей был равен 0, относительный риск вычисляли по формуле, модифицированной Haldane для малых чисел: [(2a+1)(2d+1)]/[(2b+1)(2c+1)]. Объем проведенных исследований представлен в таблице 3.9. 54 Таблица 3.9 Объем и методы исследований Определяемые показатели Метод Используемые наборы «Витал Девелопмент Корпорэйшн» (Россия) «Витал Девелопмент Корпорэйшн» (Россия) «Витал Девелопмент Корпорэйшн» (Россия) «Витал Девелопмент Корпорэйшн» (Россия) «Витал Девелопмент Корпорэйшн» (Россия) «Thermo Scientific» (Финляндия) «Thermo Scientific» (Финляндия) «Витал Девелопмент Корпорэйшн» (Россия) «Витал Девелопмент Корпорэйшн» (Россия) Единицы измерения ммоль/л ммоль/л ммоль/л ммоль/л ммоль/л г/л г/л Ед/л Ед/л Число исследований 276 276 276 276 276 100 100 256 256 Глюкоза Холестерин Триглицериды ЛПВП ЛПНП АпоА АпоВ АЛТ АСТ Полиморфизмы Arg158Cys и Cys 112Arg гена ApoE Полиморфизм Ser447Ter гена LPL Адипонектин Грелин Резистин Апелин Висфатин sICAM CRP ИЛ-6 ИЛ-1α ФНОα MDA-oxLDL oxLDL L-FABP АннексинаV спектрофотометрия спектрофотометрия спектрофотометрия спектрофотометрия спектрофотометрия спектрофотометрия спектрофотометрия спектрофотометрия спектрофотометрия ПЦР «ГосНИИ генетика» - по 242 ПЦР ИФА ИФА ИФА ИФА ИФА ИФА ИФА ИФА ИФА ИФА ИФА ИФА ИФА ИФА «ГосНИИ генетика» «BioVender R&D» (Чехия) «Peninsula laboratories LLC» (США) «BioVender R&D» (Чехия) «Phoenix Pharmaceuticals Inc» (США) «RayBio» (США) «BioSource International Inc» (Бельгия) «BioSource International Inc» (Бельгия) «Invitrogen» (США) «BioSource International Inc» (Бельгия) «Bio Source International Inc» (Бельгия) Biomedica GruPPE» (Австрия) «Biomedica Gruppe» (Австрия) «Cusabio biotech LTD» (Китай) «BioSource International Inc» (Бельгия) мкг/мл пг/мл нг/мл нг/мл нг/мл нг/мл нг/мл пг/мл пг/мл пг/мл мкг/мл мЕ/мл пг/мл нг/мл 242 194 194 194 194 194 194 58 194 194 194 179 194 194 194 55 4. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ОБСУЖДЕНИЕ 4.1 Изучение аллельных полиморфизмов генов ApoE и LPL у больных с ожирением Ожирение представляет собой алиментарно-зависимое многофакторное заболевание, в основе которого лежит комплекс различных факторов, оказывающих сложные взаимоопосредующие эффекты на метаболизм [1, 13]. В последние годы внимание исследователей привлечено к выявлению генетических маркеров, обеспечивающих формирование фенотипических признаков организма [122, 129]. Совокупность биохимических и метаболических процессов представляет собой сложную сеть реакций между различными генами и их продуктами, однако эта связь в развитии ожирение остается недостаточно изученной. Остается актуальным изучение клеточных, субклеточных и молекулярных механизмов ассимиляции пищевых веществ, обуславливающих физиологические особенности каждого конкретного человека, на основе методов геномики, протеомики и метаболомики. В настоящее время уже известны некоторые гены, обуславливающие предрасположенность к ожирению [11, 39,122, 129, 134]. В многочисленных исследованиях были получены убедительные данные, свидетельствующие о значительной роли аллельного полиморфизма генов, регулирующих обмен липидов, в развитии ожирения [39]. Идентификация генетической предрасположенности к ожирению проводится на основании статистически достоверных различий частоты генотипов в группах больных и здоровых носителей полиморфный маркеров, позволяющих ассоциировать тот или иной аллельный вариант с развитием ожирения[70]. Современная концепция этиопатгенеза ожирения рассматривают геномные исследования в качестве базиса предиктивной медицины, основные функции которой сводятся к выявлению генетической предрасположенности к 56 развитию нарушений энергетического метаболизма до их клинической манифестации, реализации профилактических подходов, предотвращение развития сопутствующих ожирению заболеваний и применение эффективной персонализированной диетотерапии [122, 129]. В настоящее время принято считать, что развитие алиментарнозависимых заболеваний обусловлено взаимоопосредованным влиянием различных полиморфных локусов [39, 138]. Согласно этой концепции, фенотипическая реализация генетического триггера в развитии ожирения опосредована алиментарными факторами [13, 22, 54, 63, 144]. Доказано, что ключевым фактором развития функциональных и органических нарушений при ожирении является энергетический дисбаланс, который реализуются на молекулярном и клеточном уровне. В связи с этим представляется актуальным поиск маркеров, задействованных на критически значимых этапах энергетического метаболизма [22, 44]. Очевидно, что дальнейшие научные изыскания в области изучения этиопатогенеза ожирения должны быть сконцентрированы на поиске взаимосвязей между вариациями генотипов, их регуляторной роли и метаболических проявлениях, что будет способствовать кардинально новому пониманию функционирования организма на молекулярном уровне [121, 166]. Результаты исследования распределения частот полиморфных маркеров Ser447Ter гена LPL (c.1595C>G), Cys112Arg (c.388T>C) и Arg158Cys (c.526C>T) гена ApoE у больных с ожирением по сравнению с контрольной группой представлены в таблице 4.1. Сравнительный анализ распределения генотипов и аллелей полиморфного варианта Cys112Arg (ε4) у больных с ожирением по сравнению с контрольной группой не дал статистически достоверных результатов (p>0,05). При изучении полиморфизма Arg158Cys гена ApoE в общей выборки больных с ожирением и контрольной группе были выявлены статистически значимые результаты. Установлено, что частота генотипа ε3/ε2гена ApoE у больных с ожирением увеличена до 19,4%, в то время как у здоровых 57 индивидов данный генотип встречался с частотой 4,0%. Кроме этого, генотип ε2/ε2 ApoE у больных с ожирением был представлен в 18% случаев, в то время как в контрольной группе данный генотип не был обнаружен (Х2 =11,23; р=0,004). Доказано, что частота встречаемости полиморфного маркера Arg158Cys (ε2) гена ApoE была статистически достоверна выше по сравнению с контрольной группой (Х2 =15,73; р<0,001), что указывает на существенный вклад данного полиморфного локуса в развитие ожирения. Таблица 4.1 Распределение частот полиморфизмов генов LPLи ApoE у больных с ожирением Генотипы и аллели Больные с ожирением Абс. Частота Контрольная группа Абс. Х2 р OR (95% CI) Частота Полиморфный локус Cys112Arg (c.388T>C) гена ApoE T/T (ε3/ε3) 153 0,705 22 0,880 T/C (ε3/ε4) 64 0,295 3 0,120 C/C (ε4/ε4) 0 0,001 0 0,000 0,12 (0,00 – 6,04) 0,940 0,37 (0,11 – 1,22) N=217 T (ε3) 0,33 (0,09 – 1,13) 3,43 3,07 (0,89 – 10,61) N=25 0,853 2,88 C (ε4) 0,18 0,147 0,09 2,71 (0,82 – 8,97) 0,060 Полиморфный локус Arg158Cys (c.526C>T) гена ApoE C/C (ε3/ε3) 136 0,627 24 0,960 C/T (ε3/ε2) 42 0,194 1 0,040 TT (ε2/ε2) 39 0,180 0 0,000 N=217 N=25 0,07 (0,01 – 0,53) 11,23 0,004 5,76 (0,76 – 43,79) 11,29 (0,67 – 189,35) 58 Продолжение таблицы 4.1 Генотипы и аллели Больные с ожирением Абс. C (ε3) Частота Контрольная группа Абс. 0,724 Х2 0,05 (0,01 – 0,39) 0,980 0,276 OR (95% CI) Частота 15,73 T (ε2) р 0,00007 18,73 (2,56 – 137,13) 0,020 Полиморфный локус Ser447Ter(c.1595C>G) гена LPL C/C (Ser/Ser) 190 0,876 23 0,920 0,61 (0,14 – 2,74) C/G (Ser/Ter) 27 0,124 2 0,080 1,63 (0,36 – 7,32) G/G (Ter/Ter) 0 0,000 0 0,000 N=217 0,42 0,81 0,12 (0,00 – 6,04) N=25 0,39 0,53 C (Ser) 0,938 0,960 0,63 (0,14 – 2,72) G (Ter) 0,062 0,040 1,59 (0,37 – 6,90) Большой интерес представляет оценка риска развития ожирения у носителей различных генотипов. Так, при генотипе ε3/ε2 (C/T) гена ApoE риск развития ожирения был в 5,69 раз выше, а при генотипе ε2/ε2 (T/T) в 11,22 раза выше по сравнению с носителями генотипа ε3/ε3 (C/C). 59 Наблюдаемое распределение демонстрирует, что аллель ε2 значительно увеличивает риск развития ожирения в случае гомозиготного носительства. Известно, что полиморфный локус ε2 сопряжен со сниженным сродством к рецептору ЛПНП, что опосредует нарушение элиминации хиломикрон и ЛППП, а также развитие гиперлипопротеинемии [123]. Вероятно, в физиологических условиях на увеличение концентрации эгзогенных липидов организм отвечает компенсаторной активацией процесса липогенеза, обуславливающего их избыточное депонирование в адипоцитах. С другой стороны, генотип Ser/Ter гена LPL и ε3/ε4 гена ApoE встречались чаще в группе больных с ожирением по сравнению с контрольной группой, однако данный результат не достиг статистической значимости (р>0,05). Доказано, что ключевым фактором развития функциональных и органических нарушений при ожирении является метаболический дисбаланс, который реализуются на молекулярном и клеточном уровне [24]. Расчет риска развития ожирения как мультифакториального заболевания требует комплексного подхода к анализу факторов генетической предрасположенности и алиментарных факторов. Таким образом, впервые получены новые данные, свидетельствующие о том, что риск развития ожирения в российской популяции ассоциирован с носительством полиморфизма Arg158Cys (ε2) гена ApoE (OR=18,68; 95% CI [2,56 – 137,13]). На основании исследования 217 больных с различной степенью ожирения доказано, что носительство гетерозиготного генотипа ε2/ε3 гена ApoE увеличивает риск развития ожирения в ~6 раз (95% CI [0,76 – 43,79]), а гомозиготный генотип ε2/ε2 гена ApoE увеличивает риск развития ожирения в ~11 раз (95% CI [0,67 – 189,35]) по сравнению с генотипом ε3/ε3 (95% CI [0,01 – 0,53]). В связи с этим представляется актуальным использование исследований полиморфизма генов ApoE и LPL с целью применения результатов для проведения эффективной диетотерапии и своевременной профилактики сопутствующих ожирению заболеваний. 60 4.2 Характеристика геномномных, протеомных и метаболомных маркеров и оценка их диагностического значения у больных с ожирением и атеросклерозом Согласно современным представлениям ожирение является компонентом кластера атерогенных факторов, включающего инсулинорезистентность, гиперхолестеринемию, гипертриглицеридемию, повышение липопротеинов низкой плотности, и провоцируют предрасположенность к развитию АГ и атеросклероза[55]. Кроме того, нарушения обмена липидов, индуцированные накоплением жировой ткани, является ключевыми модифицируемыми фактором риска развития артериальной гипертонии [37, 55,116]. В последние годы внимание исследователей привлечено к выявлению факторов, которые непосредственно влияют на развитие алиментарнозависимых заболеваний, а также опосредуют метаболические эффекты макро- и микронутриентов пищи [110]. Сравнительный анализ уровней адипокинов, цитокинов, показателей липидного и углеводного обменов выявил достоверное увеличение содержания глюкозы, холестерина, триглицеридов, апелина, ИЛ-6, sICAM, L-FABP и снижение содержания адипонектина у больных с ожирением и атеросклерозом по сравнению с группой больных с ожирением (таблица 4.2). Таблица 4.2 Протеомные и метаболомные маркеры у больных с ожирением и атеросклерозом (М±м; Me (Q1, Q3)) Показатель Глюкоза (ммоль/л) ХС общий (ммоль/л) ТГ (ммоль/л) ЛПВП (ммоль/л) Больные с ожирением (n=55) Больные с ожирением и атеросклерозом (n=73) P 4,99±0,16 5,72±0,21 <0,05 4,62±0,11 5,39±0,16 <0,05 1,13±0,06 1,74±0,11 <0,05 1,31±0,06 1,25±0,05 >0,05 61 Продолжение таблицы 4.2 ЛПНП (ммоль/л) oxLDL (мЕ/мл) L-FABP (пг/мл) Адипонектин (мкг/мл) Грелин (пг/мл) Резистин (нг/мл) Апелин (пг/мл) Висфатин (нг/мл) sICAM (нг/мл) CRP (нг/мл) ИЛ-6 (пг/мл) ФНОα (пг/мл) ИЛ-1α (пг/мл) 2,94±0,10 3,29±0,16 18,01 (0,48; 27,67) 9,39 (3,58; 13,40) 4,07 (2,07; 5,13) 40,26 (14,20; 113,70) 1,89 (5,44; 10,42) 1,67 (0,75; 3,25) 9,15 (2,25; 22,45) 71,88 (32,17; 117,00) 6384 (2447; 9990) 3,74 (2,71; 5,38) 5,72 (2,39; 8,89) 14,02 (7,48; 25,97) 89,97 (22,29; 217,5) 11,95 (6,78; 26,08) 1,79 (1,36; 3,20) 24,88 (2,18; 142,5) 3,03 (5,05; 9,06) 2,46 (1,59; 4,02) 10,63 (3,70; 32,32) 94,74 (73,58; 183,90) 6355 (3448; 10820) 5,25 (3,61; 9,20) 4,78 (2,92; 7,36) 10,17 (7,69; 15,78) >0,05 <0,05 <0,05 <0,05 >0,05 >0,05 <0,05 >0,05 <0,05 >0,05 <0,05 >0,05 >0,05 Данные геномных, протеомных и метаболомных исследований у больных с ожирением и атеросклерозом представлены в таблице 4.3. Проведенное исследование выявило следующие результаты. Обнаружено, что у больных с ожирением с генотипом ε2/ε2/ε3 гена ApoE были снижены концентрации адипонектина, резистина и общего холестерина и повышено содержание sICAM, ИЛ-6, триглицеридов, окисленных ЛПНП (oxLDL) и LFABP по сравнению с носителями генотипа ε3/ε3/ε3. Известно, что аллель ε2 сопряжен с более низкими концентрациями ЛПНП и триглицеридов в крови [177]. Однако у больных с ожирением и атеросклерозом липидный профиль крови свидетельствует о глубоком 62 нарушении элиминации липидных фракций и выраженном окислительном процессе, проявляющийся в увеличении содержания триглицеридов и oxLDL. Вероятно, в процессе атерогенеза ключевую роль играют комплекс генетических, иммунологических иметаболических механизмов. Кроме этого, полученные данные указывают на наличие дискоординационных изменений цитокинового статуса у больных с ожирением и атеросклерозом. Известно, что адипонектин обладает противоатерогенным свойством, а снижение его концентрации является фактором риска развития сосудистой дисфункции [82, 102]. У пациентов с генотипами ε4/ε3/ε3 и ε2/ε2/ε4 наблюдалось снижение уровня адипонектина и увеличение содержания oxLDL. Анализ полиморфизма гена LPL выявил достоверные различия в содержании резистина. Однако достоверных изменений адипокиновго и цитокинового статуса, а также липидного профиля выявлено не было. 63 Таблица 4.3 Протеомные и метаболомные маркеры у больных с ожирением и атеросклерозом при различных полиморфных вариантах генов ApoE и LPL (Me (Q1, Q3); М±м) Ген A p o E L P L Генотип 1. ε3/ε3/ε3 (n=41) 2. ε2/ε3/ε3 (n=4) 3.ε2/ε2/ε3 (n=9) 4. ε4/ε3/ε3 (n=15) 5. ε2/ε2/ε4 (n=4) Глюкоза (ммоль/л) ХС (ммоль/л) ТГ(ммоль/л) oxLDL (мЕ/мл) 23,43 (6,22;61,46) 20,97 (13,55;28,32) 114,9 (17,08;211,40) 112,6 (36,55;200,60) 55,91 (21,08;209) L-FABP (пг/мл) 8,98 (3,33;10,72) 13,80 (8,75;14,78) 24,88 (5,60;61,36) 11,95 (3,56; 33,07) 14,23 (3,14;50,62) 5,90±0,26 5,45±0,19 1,65±0,12 6,20±0,92 4,94±0,4 2,09±0,18 6,17±0,52 4,96±0,15 2,42±0,50 5,21±0,14 4,92±0,25 1,77±0,20 5,09±0,34 4,97±0,16 2,67±0,30 Р1-2 0,66 0,71 0,29 0,08 0,12 Р1-3 0,72 0,03 0,005 0,002 0,04 Р1-4 0,001 0,95 0,84 0,002 0,14 Р1-5 0,16 0,08 0,84 0,002 0,52 1.Ser/Ser (n=62) 5,77±0,19 5,25±0,14 1,90±0,11 51,57 (17,89;128,4) 10,39 (5,10;21,79) 2.Ser/Ter (n=11) 5,73±0,51 5,12±0,25 1,50±0,22 21,82 (5,74;190,80) 9,06 (5,61;31,81) 0,60 0,29 0,49 0,40 0,92 Р1-2 64 Продолжение таблицы 4.3 Ген A p o E L P L Адипонектин (мкг/мл) 3,40 (2,30;4,49) 3,79 (2,98;4,48) 1,65 (1,08;3,10) 1,72 (1,32;3,17) 1,31 (1,15;1,64) 0,62 Апелин (пг/мл) 2,35 (1,48;4,56) 4,01 (1,76;5,18) 3,81 (0,52;36,64) 3,03 (1,62;4,09) 2,31 (0,78;3,83) 0,44 sICAM (нг/мл) 70,36 (20,50;203,5) 72,06 (5,25;170,9) 211,7 (84,39;267,3) 70,89 (30,49;119,2) 117,2 (30,13;371,0) 0,75 ИЛ-6 (пг/мл) 3,82 (3,01;4,75) 3,67 (3,01;14,88) 5,75 (4,37;11,30) 3,67 (2,78;8,61) 3,44 (2,35;8,83) 0,78 Р1-3 0,05 0,83 0,05 0,04 Р1-4 0,02 0,94 0,73 0,99 Р1-5 0,01 0,35 0,51 0,78 3,14 (2,00;4,45) 4,10 (1,64;4,34) 0,98 2,35 (1,48;4,72) 4,38 (1,61;51,3) 0,49 72,54 (33,24;209,6) 97,01 (40,72;267,3) 0,47 3,940 (2,86;7,40) 3,480 (3,05;183,8) 0,67 Генотип 1. ε3/ε3/ε3 (n=41) 2. ε2/ε3/ε3 (n=4) 3.ε2/ε2/ε3 (n=9) 4. ε4/ε3/ε3 (n=15) 5. ε2/ε2/ε4 (n=4) Р1-2 1.Ser/Ser (n=62) 2.Ser/Ter (n=11) Р1-2 65 Известно, что окисленные липопротеины низкой плотности (oxLDL) обладают способностью инфильтрировать стенки кровеносных сосудов. Поскольку oxLDL поглощаются макрофагами, их избыточное содержание приводит к перерождению макрофагов в пенистые клетки, что является предиктором формирования атеросклеротической бляшки. Кроме того, oxLDL вызывают повреждение клеток эндотелия, стимулируют моноциты, подавляют обратный транспорт макрофагов в кровеносное русло [8, 19, 34, 74, 76]. Доказано, что адипоциты способны синтезировать значительное число регуляторных молекул, таких как провоспалительные цитокины ФНОα и ИЛ6[15, 74]. При генотипе ε2/ε2/ε3 увеличивается синтез молекул адгезии и цитокинов, что может способствовать развитию воспалительного процесса в сосудистой стенке. Таким образом, сравнительный анализ проатерогенных биомаркеров у больных с ожирением и атеросклерозом выявил, что у носителей гомозиготного генотипа ε2/ε2/ε3 гена ApoE достоверно увеличивается содержание триглицеридов (на 47%), окисленных липопротеидов низкой плотности oxLDL (на 390%), ИЛ-6 (на 51%), sICAM (на 201%), L-FABP (на 177%) и снижается уровень адипонектина (на 51%), что позволяет отнести их к клинически значимым предикторам атеросклероза. 4.3 Характеристика геномномных, протеомных и метаболомных маркеров и оценка их диагностического значения у больных с ожирением и неалкогольной жировой болезнью печени Известно, что печень играет ключевую роль в обмене жирных кислот и триглицеридов, обеспечивая синтез, накопление, секрецию и окисление жирных кислот [66]. Понятие неалкогольной жировой болезни печени (НАЖБП) включает в себя спектр поражений печени, таких как жировая дистрофия (неалкогольный стеатоз (НАС)), жировая дистрофию с воспалением и повреждением гепатоцитов (неалкогольный стеатогепатит (НАСГ)), фиброзс 66 возможностью прогрессии с исходом в цирроз печени. Особая актуальность проблемы своевременной и эффективной терапии НАЖБП обусловлена тем, что маркеры, позволяющие верифицировать НАСГ с исходом в цирроз печени достаточно сомнительны [30, 45, 97]. Результаты многочисленных исследований последних лет позволили выявить различные взаимосвязи НАЖБП с нарушениями энергетического обмена, такими сопровождающимися как инсулинорезистентность нарушениями механизмов и дислипидемия, инсулин-опосредованной супрессии липолиза и увеличения концентрации свободных жирных кислот [30, 97, 125, 162]. В свою очередь, избыточное поступление свободных жирных кислот в гепатоциты, способствует их накоплению в цитоплазме клеток и развитию жировой дистрофии печени. Наряду с этими сопровождающийся реакции, процессами формированием развивается окислительный неспецифической инициирующихнекротическую гибель стресс, воспалительной клеток и апоптоз, опосредующий развитие фиброза и НАЖБП [30, 31, 66, 117, 128, 173]. Липотоксичность при ожирении и гипергликемии является причиной активации перикисного окисления липидов, в связи со способностью печени расщеплять свободные жирные кислоты как энергетический субстрат [16, 145]. Актуальность ранней предиктивной диагностики НАЖБП обусловлена тем, что аккумуляция липидов в гепатоцитах может подвергаться регрессу при исчезновении патогенетических факторов. Большинство современных исследований рассматривают в качестве триггеров НАЖБП генетические и иммунологические звенья патогенеза. Доказано, что в патогенезе стеатоза важную роль гены PPARα, ENPP1/PC-1 Lys121GLN и IRS-1 Gly972Arg, PNPLA3 (регулятор синтеза адипонутрина) и др. [27, 55] Сравнительный анализ уровней адипокинов, цитокинов, показателей липидного и углеводного обменов выявил достоверное увеличение содержания глюкозы, триглицеридов, ФНОα, L-FABP и снижение содержания 67 адипонектина у больных с ожирением и НАЖБП по сравнению с группой больных с ожирением (таблица 4.4). Таблица 4.4 Протеомные и метаболомные маркеры у больных с ожирением и НАЖБП (М±м; Me (Q1, Q3)) Показатель Глюкоза (ммоль/л) ХС общий (ммоль/л) ТГ (ммоль/л) ЛПВП (ммоль/л) ЛПНП (ммоль/л) oxLDL (мЕ/мл) L-FABP (пг/мл) Адипонектин (мкг/мл) Грелин (пг/мл) Резистин (нг/мл) Апелин (пг/мл) Висфатин (нг/мл) sICAM (нг/мл) ИЛ-6 (пг/мл) ФНОα (пг/мл) Больные с ожирением (n=55) Больные с ожирением и НАЖБП (n=22) P 5,32±0,09 5,87±0,32 <0,05 5,14±0,09 5,58±0,21 1,75±0,15 2,99±0,90 1,28±0,03 1,21±0,08 3,30±0,08 3,41±0,20 32,24 (8,65; 118,60) 8,79 (3,56; 12,28) 2,98 (1,89; 4,44) 40,20 (9,17; 134,90) 5,66 (2,63; 10,42) 2,23 (1,02; 3,54) 2,42 (6,81; 17,66) 71,90 (36,46; 191,80) 3,53 (2,69; 5,87) 4,69 (2,17; 7,47) 30,30 (0,40; 107,20) 13,53 (11,62; 23,76) 1,57 (0,89; 3,21) 32,80 (6,46; 157,10) 8,00 (5,31; 12,98) 2,56 (1,03; 4,21) 22,00 (2,46; 361,50) 96,66 (67,00; 151,60) 5,06 (2,44; 14,53) 17,13 (14,88; 30,11) >0,05 <0,05 >0,05 >0,05 >0,05 <0,05 <0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 <0,05 68 Результаты молекулярно-генетического, протеомного и метаболимного анализа больных с ожирением и НАЖБП представлены в таблице 4.5. Таблица 4.5 Протеомные и метаболомные маркеры у больных с ожирением и НАЖБП при различных полиморфных вариантах генов ApoE и LPL (М±м ; Me (Q1, Q3)) Ген Глюкоза ТГ L-FABP Адипонектин ФНОα (моль/мл) (моль/мл) (пг/мл) (мкг/мл) (пг/мл) 6,33±0,62 2,07±0,20 13,13 4,04 18,55 (7,05; 13,55) (2,93; 4,75) (0,67; 24,96) 5,01±0,02 1,70±0,35 11,23 1,82 5,48 (11,23;14,78) (0,87; 3,79) (4,54; 16,68) 5,88±0,20 2,20±0,47 13,94 0,39 6,57 (13,34;14,53) (0,31; 0,46) (5,06; 8,08) 5,43±0,25 1,64±0,002 53,24 1,42 2,37 (26,75;79,72) (0,96; 1,71) (2,35; 2,63) Р1-2 0,001 0,76 0,99 0,22 0,70 Р1-3 0,02 0,34 0,34 0,002 0,63 Р1-4 0,04 0,001 0,03 0,05 0,70 Генотип 1. ε3/ε3/ ε3 (n=11) A 2. ε2/ε3/ ε3 p (n=4) o 3.ε2/ε2/ ε3 E (n=4) 4. ε4/ε3/ ε3 (n=3) У носителей полиморфного маркера ε2/ε3/ε3 было выявлено сниженное содержание глюкозы, а у носителей гомозиготного генотипа ε2/ε2/ε3 гена ApoE кроме этого установлено снижение концентрации холестерина, адипонектина и увеличение – окисленных ЛПНП по сравнению с группой пациентов с генотипом ε3/ε3/ε3. Полученные данные указывают на наличие выраженного процесса перекисного окисления липидов, что может являться фактором риска повреждения гепатоцитов и развития НАЖБП. 69 У пациентов с ожирением и НАЖБП, у которых был выявлен генотип ε4/ε3/ε3 гена ApoE, обнаружено снижение уровней общего холестерина, триглицеридов, глюкозы, адипонектина и увеличением содержания L-FABP. Как известно, перенос жирных кислот в гепатоциты осуществляется путем пассивной диффузии, а также специфическими мембранными транспортерами жирных кислот FATР (fatty acid transport protein). Внутри гепатоцита транспорт свободных жирных кислот осуществляется белками-транспортерами L-FABP (liver-specificfattyacid-bindingprotein), активность которых при НАЖБП повышается [115, 157, 173]. Возрастание концентрации L-FABP указывает, что в гепатоциты транспортируется высокая концентрация жирных кислот, образовавшихся в результате гидролиза триглицеридов, что объясняет снижение их уровня в крови [115, 162]. Избыточное поступление и накопление в гепатоцитах жирных кислот является доказанным фактором риска повреждения и стеатоза печени. Таким образом, достоверное увеличение концентрации LFABP опосредованно указывает на интенсификацию транспорта свободных жирных кислот в гепатоциты. Полученные данные позволяют рассматривать наличие ε4/ε3/ε3 гена ApoE, увеличение содержания глюкозы (5,55-6,19 ммоль/л), триглицеридов (2,09-3,89 ммоль/л), L-FABP (11,62-23,76 пг/мл), ФНОα (14,88-30,11 пг/мл) и снижение концентрации адипонектина (0,89-3,21 мкг/мл) в качестве предикторов развития неалкогольной жировой болезни печени у больных с ожирением. 4.4 Изучение содержания адипокинов у больных ожирением Данные многочисленных исследований свидетельствуют, что адипоциты обладают выраженной секреторной функцией, которая приобретает особое значение при избыточной массе тела и ожирении. Клетки жировой ткани активно синтезируют ряд хемокинов, цитокинов и адипокинов. Адипокины представляют собой гормоноподобные биологически активные молекулы, 70 обладающие широким спектром метаболических и нейроэндокринных эффектов. Дисбаланс адипокинов является одним из звеньев патогенеза нарушений углеводного и липидного обменов при ожирении, которые лежат в основе развития кардиоваскулярных заболеваний и диабета 2 типа и других осложнений [14, 15, 36, 40]. Принципиально важными следует считать данные, полученные при изучение метаболических эффектов адипокинов. Показано, что адипокины влияют на каскад биохимических превращений в мембранах и внутри клеток, липопротеиновый метаболизм, гомеостаз глюкозы, процессы воспаления, свертывания, иммунного ответа, оказывая воздействие паракринным, аутокринным и эндокринным путем [98, 108, 161]. Кроме этого, адипокины участвуют в регуляции аппетита и насыщения, функционировании эндотелия, поддержании артериального давления, чувствительности к инсулину, энергетическом метаболизме, адипогенезе и секреции инсулина β-клетками поджелудочной железы[126, 146, 149]. Однако в современной литературе представлены данные исследований отдельных адипокинов при ожирении, что не дает представления об их взаимоопосредующем влиянии на энергетический метаболизм. Адипонектин является одним из наиболее значимых адипокинов, специфическим для жировой ткани. Этот гликопротеид (первоначально известный как Acrp30) с молекулярным весом 30кДа структурно подобен компоненту комплимента C1q и образует большие гомо-олигомеры, которые претерпевают ряд пост-трансляционных модификаций. Секреция Acrp30 повышается за счет инсулина, поэтому этот адипокин может являться фактором инсулин-регулируемого секреторного пути в адипоцитах. Уровень адипонектина в крови составляет в среднем 12-30 μг/мл, мужчин – 8-30 μг/мл и обратно пропорционален массе жировой ткани и индексу массы тела [59, 82]. В экспериментальных исследованиях было показано, что гормоноподобный пептид грелин, стимулирует секрецию соматотропина. Рецепторы к грелину связанны с G-белком (GPCR) и локализованы в нейронах 71 дугообразном и вентромедиальном ядре гипоталамуса, что обеспечивает регуляцию энергетического метаболизма и стимуляции чувства голода. Его уровень увеличивается при наборе массе тела[114, 135, 170]. Клинические наблюдения свидетельствуют о том, что резистентность к инсулину в большей степени влияет на развитие сахарного диабета 2-го типа и играет важную роль во многих метаболических нарушений таких, как гипертония, дислипидемия и атеросклероз [87, 94]. При ожирении, в частности висцерального типа, развивается резистентностью к инсулину, одним из механизмов которой является липотоксичность биологически активных пептидов, продуцируемых адипоцитами [41]. Исследованиями, проведенными в последние годы, было установлено, что предикторами инсулинорезистентности являются резистин, висфатин и апелин [96, 105, 111, 139, 158, 174]. Однако изучение концентрации апелина и его рецепторов имеет в основном описательный характер и в настоящее время представляет интерес для исследования его метаболических эффектов в норме и патологии, особенно при избыточной массе тела и ожирении. Таким образом, изучение адипокинового статуса у больных с ожирением является актуальной и клинически значимой задачей. Был проведен анализ содержания адипонектина, грелина, резистина, апелина и висфатина в группах пациентов с ожирением I, II и III степени и в контрольной группе. Данные представлены в таблице 4.6. 72 Таблица 4.6 Содержание адипокинов у больных с ожирением (Me (Q1, Q3)) Группа Адипонектин Грелин Резистин Апелин Висфатин мкг/мл пг/мл нг/мл нг/мл нг/мл 3,63 (2,39;4,88) 50,15(21,40;170,2) 6,32(3,06;9,81) 2,28(0,85;3,47) 7,01(3,05;19,42) 2,52 (1,52;4,48) 19,20 (0,09;95,70) 4,89(2,61;10,21) 1,97(1,15;3,61) 9,85(2,91;26,96) 2,58 (1,68;3,70) 38,80 (8,64;97,60) 5,66(2,09;10,93) 2,09(0,89;3,96) 7,62(2,38;28,25) n=25 16,68 (3,46;16,9) 42,19(23,48;60,90) 1,68(1,20;2,15) 1,34(0,76;1,92) 8,15(7,40;10,76) U, Z, Рк-1 25,00;1,76;0,08 35,00;-0,21;0,83 14,00;-1,59;0,11 29,00;-0,66;0,51 53,00;0,43;0,67 U,Z,Рк-2 28,00;2,02;0,04 46,00;0,54;0,59 23,00;-1,49;0,14 37,50;-0,82;0,41 83,00;-0,25;0,80 U,Z, Рк-3 27,00;2,25;0,02 69,50;0,10;0,92 34,00;-1,35;0,18 47,00;-0,79;0,43 112,50;0,10;0,92 U, Z, Р1-2 1032;2,13;0,03 793,5;2,69;0,007 1291;0,46;0,64 1108;-0,57;0,57 1119;-1,08;0,28 U, Z,Р1-3 1160,5;3,04;0,002 1095;3,04;0,04 1711,5;-0,13;0,89 1303,5;0,91;0,36 1505;-0,73;0,47 U, Z, Р2-3 2346;0,43;0,67 1893;-1,34;0,18 2293;-0,65;0,52 1965;-0,44;0,66 2282;0,41;0,68 Адипокин 1. I степень ожирения n=55 2. II степень ожирения n=70 3. III степень ожирения n=92 Контрольная группа 73 Установлено, что больные с ожирением имеют дискоординационные изменения в содержании адипокинов. Так, было установлено достоверное снижение концентрации адипонектина у больных со II и III степенями ожирения по сравнению с контрольной группой (р<0,05). Исходя из полученных данных, можно сделать вывод, что адипонектин является одним из ранних маркеров ожирения. Сравнительный анализ между группами больных с различной степенью ожирения обнаружил достоверные отличия концентрации адипонетина у больных с I и II, а также I и III степенями ожирения (p<0,05). Корреляционный анализ выявил отрицательную взаимосвязь уровня адипонектина и ИМТ (r= 0,71; p=0,003). Известно, что адипоциты висцеральной жировой ткани обладают выраженной способностью подавлять синтез адипонектина [80]. Вероятно, при развитии морбидного ожирения существенно увеличивается доля висцеральных адипоцитов, что обуславливает снижение адипонектина. Принципиально важным следует считать данные, полученные при исследовании содержания грелина. Анализ изученных показателей свидетельствует о том, что при увеличении ИМТ уровни грелина снижались по сравнению с группой больных, имеющих I степень ожирения (p<0,05). Установленный факт может быть объяснен комплексными эффектами, оказываемыми грелином на регуляцию потребления пищи, направленными на снижение аппетита при положительном энергетическом балансе. При исследовании уровня резистина у больных с ожирением была установлена тенденция к увеличению его содержания по мере возрастания ИМТ, не достигшая уровня статистической значимости (р<0,05). Содержание апелина и висфатина у больных с ожирением было выше аналогичных показателей в контрольной группе, однако достоверных отличий не было выявлено. Вероятно, влияние этих адипокинов на развитие ожирения не ограничивает прямой зависимостью от количества жировой ткани, а 74 основывается на более сложном комплексном процессе, в который вовлекаются многочисленные биологически активные молекулы. На основании изучения уровней адипокинов установлена зависимость концентрации адипонектина от индекса массы тела (r= -0,71), что позволяет рассматривать адипонектин в качестве одного из ранних маркеров развития ожирения. Поскольку реализация биохимических процессов при регуляции энергетического метаболизма происходит при участии различных адипокинов, то представляется целесообразным исследовать их в комплексе. 4.5 Изучение содержания цитокинов у больных с ожирением Согласно современным требованиям, для адекватной оценки многофакторных изменений метаболического статуса у больных с ожирением необходимо использовать данные иммунологических исследований. Успехи иммунологии позволили расширить спектр диагностических тестов, применяемых в клинической практике, на основании которых сформировалось представление о жировой ткани, как об активном эндокринном и иммунном органе [38, 80, 90]. Были получены данные, свидетельствующие о том, что при ожирении возникает дисбаланс в синтезе отдельных провоспалительных и противовоспалительных цитокинов, инициирующий развитие субклинического воспалительного процесса и дисфункции жировой ткани как эндокринного и иммунного органа [39, 83,86, 80, 90, 122]. В основе метаболических нарушений при ожирении является развитие хронического воспаления жировой ткани, характеризующегося дсбалансом адипокинов, инфильтрацией жировой ткани иммунокомпетентными клетками, выявлением неспецифических маркеров воспаления как С-реактивный белок, фибриноген, лейкоциты, молекулы адгезии [83, 84]. 75 Доказано, что воспаление жировой ткани представляет собой компенсаторную реакцию, направленную на снижение усвоения и накопления энергетических субстратов [91]. Результаты экспериментальных и клинических исследований показали, что воспаление жировой ткани лежит в основе патогенеза многих алиментарнозависимых заболеваний, таких как сахарный диабет 2 типа, атеросклероз, неалкогольная жировая болезнь печени, метаболический синдром, артериальная гипертензия, аллергические состояния и др. [29, 86, 90, 118, 148]. Известно, что адипоциты продуцируют широкий спектр биологически активных молекул в тот числе провоспалительных цитокинов: адгезивные молекулы sICAM, фактора некроза опухоли-α (ФНО-α), интерлейкины-6 (ИЛ-6) и -1 (ИЛ-1), гормоноподобные субстанции – адипокины, а также хемокины (МСР-1 и RANTES) [84,85,87]. Так, ИЛ-6 индуцирует активацию иммунной защиты (дифференцировка Т-клеток, вызревание В-клеток, усиление гемопоэза). Важным достижением науки стало открытие способности адипоцитов в большом количестве синтезировать ИЛ-6, обосновывающим его регуляторную функцию при ожирении. На фоне заболеваний, сопровождающихся хроническим воспалительным процессом, к которым относится и ожирение, секреция ИЛ-6 существенно возрастает. [83, 84,85, 86, 89, 91, 93]. Несмотря значительный прогресс в исследовании эндокринной функции жировой ткани, роль гуморального звена иммунной системы у больных с метаболическими нарушениями недостаточно изучена, что обуславливает актуальность изучения ожирения с позиции расширения и углубления представлений о его патогенезе, в которой существенную роль играют иммуноопосредующие механизмы [6, 21,38, 68,80, 83,86,]. В связи с этим, изучение механизмов участия иммунной системы в метаболических нарушениях у больных с ожирением и особенностей их генотипа остается актуальной задачей. Результаты этих исследований могут быть использованы в диагностике сопутствующих поражений внутренних 76 органов, иметь важное прогностическое значение и позволить раскрыть некоторые звенья патогенеза ожирения. Проведенное исследование цитокинового статуса показало, что у больных с ожирением имеют место дискоординационные изменения провоспалительных цитокинов и молекул адгезии (Таблица 4.7). Сравнительный анализ содержания sICAM и CRP выявил достоверное увеличение этих показателей у больных со II и III степенями ожирения по сравнению с контрольной группой (p<0,05). Было установлено, что содержание CRP достоверно выше у больных с II и III степенями по сравнению с пациентами с I степенью ожирения (p<0,05). Корреляционный анализ выявил положительную взаимосвязь индекса массы тела с концентрациями CRP (r= 0,62; p=0,04) и адгезивных молекул sICAM (r= 0,56; p= 0,03). Известно, что CRP представляет собой неспецифический маркер развития воспаления. Достоверное увеличение его концентрации при ожирении подтверждает гипотезу о связи дисбаланса иммунологических механизмов и нарушений энергетического метаболизма [77, 84]. 77 Таблица 4.7 Содержание цитокинов и молекул адгезии у больных с ожирением (Me (Q1, Q3)) Группа sICAM CRP ИЛ-6 ИЛ-1α ФНОα нг/мл нг/мл пг/мл пг/мл пг/мл 1. I степень ожирения 67,82 4671 3,48 15,09 5,86 (n=55) (46,06;146,9) (2865;7866) (2,64;5,01) (7,63;21,22) (2,39;9,26) 2. II степень ожирения 86,67 8300 3,68 12,91 5,40 (n=70) (56,90;183,2) (6201;12650) (2,64;6,52) (8,47;20,02) (2,77;8,63) 3. III степень ожирения 91,54 9087 3,92 8,83 4,54 (n=92) (57,91;209,6) (8875;9973) (2,76;6,94) (7,40;16,12) (1,98;6,75) Контрольная группа 49,38 4150 3,09 10,44 5,70 (n=25) (30,41;80,65) 2(3134;5170) (2,72;4,59) (7,16;14,21) (3,57;8,97) U, Z,Рк-1 82,5; -1,34;0,18 12,00; -0,37;0,71 193,00;0,11;0,91 49,50;-1,42;0,16 191,00;-0,05;0,96 U,Z,Рк-2 87,00; -1,91;0,05 1,00;-2,13;0,03 244,50;-0,58;0,56 73,50;-1,34;0,18 261,50;0,29;0,77 U,Z,Рк-3 109,00; -2,03; 0,04 0,00;-2,00;0,04 287,00;-0,89;0,38 118,50;-0,83;0,41 276,00;1,09;0,28 U,Z,Р1-2 647,00; -1,29;0,19 26,00;-2,44;0,01 1200;-1,05;0,29 1349;-0,09;0,93 1259;0,48;0,63 U,Z,Р1-3 787,00;-1,78;0,07 71,00;-2,76;0,005 1232,5;-0,71;0,48 1107;1,64;0,10 1147;1,21;0,23 U, Z,Р2-3 1901,50;-0,67;0,50 91,00;0,14;0,89 2315;-0,42;0,67 1894,5;2,30;0,02 2099,5;1,45;0,15 Цитокин 78 Обращает на себя внимание тенденция к снижению содержания ИЛ-1 и ФНОα по мере увеличения ИМТ. Уровень ИЛ-6 статистически не отличался во всех трех группах больных с ожирением по сравнению с группой контроля (p>0,05). Таким образом, развитие ожирения сопровождается выраженной иммунологической перестройкой и развитием воспалительного процесса, о чем свидетельствует изменения содержания в сыворотке цитокинов и адгезивных молекул. Анализируя полученные данные можно заключить, что прогрессирующее формирование метаболических осложнений при ожирении сочетается с развитием субклинического воспалительного процесса, активации иммунной системы и дисфункции жировой ткани как эндокринного и иммунного органа [39,83, 84, 86]. Таким образом, при изучение цитокинового статуса у больных с ожирением с индексом массы тела свыше 35 выявлено достоверное увеличение концентраций таких неспецифических маркеров воспаления, как адгезивные молекулы sICAM и С-реактивный белок. Учитывая этот факт, представляется перспективным использовать их в качестве маркеров в оценке иммунологических изменений у больных с ожирением. 4.6 Изучение содержания маркеров углеводного и липидного обменов у больных с ожирением Согласно современным представлениям в основе патогенеза ожирения лежит нарушение липидного обмена, в механизме которого задействована эндокринная регуляции, система про- и противовоспалительных цитокинов, адипокины и др. [17, 36,44, 60, 83, 84, 86, 91,158]. Доказано, что при увеличении массы тела, усиливается высвобождение свободных жирных кислот из адипоцитов в портальный кровоток, что 79 сопровождается повышением синтеза ЛПОНП в печени. Этот процесс поддерживается низкой активностью периферической липопротеинлипазы, не способной полноценно расщеплять липопротеиды, богатые триглицеридами [12]. Кроме этого, ожирение сопровождается изменениями углеводного обмена, в частности развитием толерантности к глюкозе и инсулинорезистеностью [22, 40, 44, 54]. Исследования, проводимые в последние годы, показали большую роль нарушений обмена липидов и углеводов в развитии сопутствующих ожирению заболеваний. Необходимость исследований гиперлипидемии и гипергликемии определяется в установленной корреляции между этими патологическими состояниями и атеросклеротическими поражениями сосудов, ишемической болезнью сердца, инсультами, атеросклерозом сосудов, диабетом 2-го типа и др.[6, 15, 32, 77, 132]. Особый интерес представляет тот факт, что модифицированные формы липидов, образующиеся в процессе перекисного окисления, участвуют в патогенезе многих заболеваний, таких как гипертоническая болезнь, атеросклероз, нарушении мозгового и коронарного кровообращения. Полученные факты позволяют представить механизмов развития ожирения как комплекс дискоординционных изменений в метаболизме ключевых нутриентов. Проведенное биохимическое исследование крови больных с ожирением позволило установить, что концентрации глюкозы была статистически достоверно выше только в группе больных с III степенью ожирения по сравнению с контрольной группой (таблица 4.8), т.е. концентрация глюкозы достоверно возрастала по мере увеличения ИМТ (p<0,05). 80 Таблица 4.8 Метаболомные показатели у больных с ожирением (М±м; Me (Q1, Q3)) Глюкоза Общий ХС ТГ ЛПВП ЛПНП oxLDL АЛТ АСТ (ммоль/л) (ммоль/л) (ммоль/л) (ммоль/л) (ммоль/л) (нг/мл) (ммоль/л) (ммоль/л) 4,93±0,08 5,35±0,17 1,49±0,14 1,39±0,05 3,36±0,13 28,08±3,58 25,66±1,91 5,29±0,11 5,28±0,14 1,73±0,13 1,27±0,04 3,30±0,12 31,97±3,61 27,56±2,65 5,72±0,14 5,06±0,12 2,05±0,24 1,16±0,03 3,19±0,10 41,61±3,90 31,52±2,17 5,15±0,17 5,14±0,14 1,12±0,15 1,88±0,13 3,14±0,21 Р1-к >0,05 <0,01 <0,05 >0,05 <0,05 <0,05 >0,05 <0,05 Р2-к >0,05 <0,05 <0,05 >0,05 <0,05 <0,05 <0,05 <0,001 Р3-к <0,005 <0,05 <0,005 >0,05 >0,05 <0,001 <0,005 <0,05 Р1-2 <0,005 >0,05 <0,05 >0,05 >0,05 <0,05 >0,05 <0,05 Р1-3 <0,001 >0,05 <0,05 >0,05 >0,05 >0,05 <0,001 <0,05 Р2-3 <0,005 >0,05 <0,05 >0,05 >0,05 <0,05 <0,005 >0,05 1. Больные с I степенью ожирени (n=55) 2. Больные со II степенью ожирени (n=70) 3. Больные с III степенью ожирени (n=92) Контрольная группа (n=25) 27,57 (8,16;86,15) 78,85 (6,46;193,8) 30,14 (18,16;94,02) 0,50 (0,17;0,50) 20,50±4,65 21,97±1,73 81 Выявлено достоверное увеличение содержания холестерина (ХС) в группах больных с II и III степенями ожирения по сравнению с контрольной группой (p<0,05). Обращает на себя внимание тот факт, что при III степени ожирения уровень общего холестерина был ниже, чем в контрольной группе, что может быть обусловлено существенным снижением уровня холестерина в составе ЛПВП. У больных ожирением установлено существенное снижение содержания триглицеридов (ТГ), как по сравнению с контрольной группой, так между группами больных с различными степенями ожирения. Отличий в содержании ЛПВП выявлено между группами с I-III степенями ожирения не было выявлено (p>0,05). При исследовании содержания ЛПНП выявлены достоверные отличия у больных со Iи с II степенями ожирения по сравнению с контрольной группой, в то время как линейная прогрессия концентрации ЛПНП по мере увеличения ИМТ не была установлена. Принципиально важными следует считать данные, полученные при оценке уровня биохимических показателей состояния печени. Так, при II и III степени ожирения достоверно увеличивался уровень АЛТ и АСТ (p<0,05). Поскольку в клетках печени сосредоточены ключевые ферменты метаболизма липидов (печеночная липопротеинлипаза, глицеролкиназа и др.), то нарушения энергетического обмена могут опосредовать функциональные изменения гепатоцитов, отражающиеся в изменении печеночных трансаминаз. На основании полученных данных можно сделать вывод, что при ожирении в первую очередь увеличивается концентрации глюкозы, триглицеридов и печеночных трансаминаз, то есть возникает дисбаланс энергетического метаболизма, выражающийся изменениями показателей липидного и углеводного обмена. При изучении содержания модифицированных липидов выявлено, что концентрация окисленных липопротеидов низкой плотности была достоверно выше во всех трех группах по сравнению с группой контроля. На регуляцию 82 интенсивности перекисного окисления липидов влияют система антиоксидантной защиты, воспаление, характер питания, гипоксия, токсины и другие факторы, что объясняет отсутствие линейной зависимости уровня oxLDL от ИМТ. Таким образом, дискоординационные изменения липидного спектра крови является одним из ранних маркеров, характеризующих степень нарушений энергетического метаболизма. Выявление дислипидемии на ранних стадиях ожирения позволит своевременно диагностировать и снизить риск развития сопутствующих ожирению заболеваний, вызванных липотоксичностью. Метаболомные исследования больных с ожирением позволяют идентифицировать клинически не проявляющиеся нарушения энергетического обмена и своевременно, с учетом особенностей метаболизма пищевых и биологически активных веществ конкретного человека, персонализировать диетотерапию. 4.7 Характеристика геномномных, протеомных и метаболомных маркеров и оценка их диагностического значения у больных с ожирением Несмотря на существенный прогресс экспериментальной биологии, проблема поиска путей повышения эффективности диетотерапии больных с ожирением, по-прежнему остается актуальной в связи с неоднозначностью трактовки тех или иных патологических изменений метаболизма [10, 13]. Обращает на себя внимание тот факт, что у ряда больных с ожирением наряду с нарушениями углеводного и липидного обмена выявляются и другие сопутствующие заболевания. В настоящее время не разработаны стандартизованные подходы к диетотерапии с учетом индивидуальных метаболических и генетических особенностей [78]. Поэтому, принципиально важными являются исследования, направленные на повышение эффективности лечебных мероприятий с применением 83 персонализированного подхода к диетотерапии. Особый интерес представляют геномные, протеомные и метаболомные методы, позволяющие выявить гены, белки и ферменты, задействованные на ключевых этапах метаболизма. Таким образом, поиск клинически значимых маркеров ожирения может привести к интенсификации коррекции избыточной массы тела и метаболических нарушений. Исследование геномных, протеомных и метаболомных маркеров у больных с ожирением представлено в таблице 4.9. 84 Таблица 4.9 Протеомные и метаболомные маркеры у больных с ожирением при различных полиморфных вариантах генов ApoE и LPL (Me (Q1, Q3); М±м) Ген A p o E L P L Генотип Адипонектин (мкг/мл) Апелин (пг/мл) sICAM (нг/мл) CRP (нг/мл) ИЛ-6 (пг/мл) MDA-oxLDL (мкг/мл) L-FABP (пг/мл) 1. ε3/ε3/ε3 (n=92) 2. ε2/ε3/ε3 (n=31) 3.ε2/ε2/ε3 (n=30) 4. ε4/ε3/ε3 (n=43) 5.ε2/ε3/ε4 (n=12) 6. ε2/ε2/ε4 (n=9) Р1-2 Р1-3 3,35 (2,01; 4,73) 3,79 (1,87; 5,71) 2,72 (1,31; 4,35) 2,68 (1,66; 3,57) 2,20 (1,26; 4,39) 2,41 (1,48; 3,18) 0,85 0,11 1,76 (0,93; 3,40) 1,59 (0,47; 3,25) 1,59 (0,87; 2,99) 3,03 (1,13; 4,09) 2,64 (1,68; 4,04) 3,40 (1,35; 5,05) 0,21 0,99 75,28 (32,75; 203,5) 90,61 (53,94; 207) 69,94 (57,71; 126,0) 78,37 (37,95; 118,2) 96,27 (10,74; 318,5) 144,0 (73,80; 293) 0,31 0,93 9929 (5277; 13000) 6204 (4272; 9394) 4727 (3494; 5947) 7122 (3497; 10131) 8962 (4906; 10171) 4779 (2865; 66920 0,26 0,01 3,60 (2,64; 6,39) 4,20 (2,73; 5,70) 4,10 (2,47; 7,32) 3,60 (2,78; 6,84) 4,35 (2,62; 5,55) 2,58 (2,42; 2,64) 0,71 0,58 2,27 (1,13; 3,51) 3,32 (1,67; 6,73) 2,50 (1,55; 4,31) 2,87 (1,60; 4,06) 5,09 (2,30; 8,53) 2,71 (1,21; 13,37) 0,09 0,52 8,99 (3,36; 12,58) 8,82 (3,87; 11,23) 11,63 (4,69; 24,88) 10,73 (5,27; 19,56) 8,71 (3,23; 10,32) 12,89 (3,35; 17,01) 0,98 0,05 Р1-4 Р1-5 Р1-6 1.Ser/Ser (n=191) 2.Ser/Ter (n=26) Р1-2 0,03 0,18 0,13 2,91 (1,68; 4,42) 3,54 (1,71; 4,46) 0,47 0,03 0,14 0,16 2,05 (0,94; 3,54) 2,68 (1,02; 4,20) 0,30 0,70 0,97 0,16 71,67 (42,18; 171,6) 122,7 (76,50; 221,7) 0,03 0,27 0,47 0,25 7772 (5174; 10900) 4709 (1861; 7176) 0,03 0,59 0,91 0,01 3,68 (2,64; 5,98) 3,05 (2,45; 8,97) 0,52 0,21 0,03 0,55 2,68 (1,49; 4,83) 3,05 (0,84; 5,52) 0,96 0,04 0,56 0,48 9,65 (3,64; 13,83) 9,50 (5,07; 13,25) 0,98 85 Продолжение таблицы 4.9 Ген A p o E L P L Генотип 1. ε3/ε3/ε3 (n=92) 2. ε2/ε3/ε3 (n=31) 3.ε2/ε2/ε3 (n=30) 4. ε4/ε3/ε3 (n=43) 5.ε2/ε3/ε4 (n=12) 6. ε2/ε2/ε4 (n=9) Р1-2 Р1-3 Р1-4 Р1-5 Р1-6 1.Ser/Ser (n=191) 2.Ser/Ter (n=26) Р1-2 Глюкоза (моль/мл) ХС (моль/мл) ТГ (моль/мл) ЛПВП (моль/мл) ЛПНП (моль/мл) АпоВ (г/л) АЛТ (Ед/л) АCТ (Ед/л) 5,35±0,13 5,29±0,13 1,76±0,23 1,25±0,03 3,42±0,11 0,93±0,05 35,65±3,00 30,70±2,61 5,28±0,16 5,11±0,22 1,75±0,19 1,39±0,08 3,14±0,18 0,98±0,09 38,93±4,07 30,30±3,43 5,28±0,16 5,05±0,22 1,74±0,18 1,37±0,07 3,09±0,18 0,94±0,09 38,52±3,74 30,12±3,24 5,44±0,14 5,08±0,16 1,53±0,10 1,28±0,06 3,17±0,12 1,09±0,11 27,08±2,420 24,04±1,39 5,42±0,27 5,53±0,34 1,82±0,29 1,14±0,08 3,66±0,27 1,33±0,24 43,40±1,44 31,91±4,30 4,76±0,18 4,78±0,20 1,94±0,30 1,12±0,08 2,81±0,16 0,95±0,06 28,67±2,28 24,48±2,68 0,02 0,03 0,02 0,19 0,01 0,99 0,91 0,14 0,79 0,01 0,001 0,001 0,001 0,007 0,01 0,04 0,04 0,27 0,37 0,36 0,95 0,99 0,04 0,65 0,02 0,93 0,80 0,47 0,01 0,12 0,39 0,31 0,001 0,97 0,38 0,09 0,06 0,001 0,06 0,002 5,35±0,08 5,14±0,08 1,83±0,12 1,26±0,03 3,20±0,07 1,02±0,04 33,33±2,23 28,02±1,38 5,33±0,24 5,35±0,25 1,42±0,13 1,34±0,07 3,46±0,21 0,96±0,13 36,83±3,64 29,86±3,74 0,42 0,42 0,001 0,99 0,34 0,98 0,29 0,69 86 Выявлена прямая корреляционная связь уровней холестерина, триглицеридов, ЛПНП содержания с концентрацией аполипопротеина В, что объясняется участием аполипопротеина В в транспорте этих липидных фракций у больных с генотипом ε3/ε3/ε3. Исследование уровня адипокинов, цитокинового статуса, показателей углеводного и липидного обменов у больных с ожирением с различными вариациями полиморфных аллелей генов ApoE и LPLпоказало, что у носителей генотипа ε2/ε3/ε3 гена ApoE содержание глюкозы, триглицеридов было статистически достоверно ниже, а ЛПВП - выше, чем у носителей ε3/ε3/ε3 (p<0,05). Аналогичные изменения биохимических показателей крови наблюдались у пациентов с гомозиготным генотипом ε2/ε2/ε3. Кроме этого, полиморфный генотип ε2/ε2/ε3 был сопряжен с более низким уровнем CRP. Как известно, аллель ε2 обуславливает синтез аполипопротеина Е с высокой афинностью к рецептору ЛПНП, что способствует быстрой элиминации липидных частиц из крови [123]. Таким образом, идентификация одного или двух аллелей ε2 можно рассматривать как благоприятный прогностический фактор у больных с ожирением. Липидный обмен носителей генотипа ε4/ε3/ε3 гена ApoE характеризовался пониженным уровнем адипонектина, триглицеридов, АЛТ и АСТ, а концентрации глюкозы и транспортного белка L-FABP были повышены по сравнению с носителями генотипа ε3/ε3/ε3. Многочисленными исследованиями доказано, что уровень L-FABP пропорционален содержанию свободных жирных кислот в крови, транспортируемых в гепатоциты [115, 162]. Избыточное поступление жирных кислот в печеночную ткань является ведущим фактором стеатоза гепатоцитов, который часто вызывает повышение уровня трансминаз. Кроме того установлена способность адипонектина модулировать активность инсулина [172]. Снижение концентрации адипонектина у носителей генотипа ε3/ε4/ε3 гена ApoE, по-видимому, объясняет статистически достоверное повышение уровня глюкозы в крови. 87 У больных с ожирением – носителей генотипа ε2/ε3/ε4 были выявлены достоверно повышенные концентрации триглицеридов, апоВ и МДА- модифицированных АпоВ (MDA-oxLDL), чем в группе больных с генотипом ε3/ε3. Таким образом, при одновременном носительстве аллелей ε2 и ε4 гена ApoE выявляются наиболее выраженные изменения липидного обмена. В тоже время, у носителей генотипа ε2/ε2/ε4 отмечались сниженные уровни глюкозы, общего холестерина, ЛПНП, АСТ и ИЛ-6 и повышенный уровень триглицеридов по сравнению с носителями генотипа ε3/ε3/ε3. При изучении полиморфизма гена LPL у больных с ожирением было установлено, что концентрациями носители CRP и аллеля отличались Ser447Ter триглицеридов и повышенным низкими содержанием адгезивных молекул sICAM, чем в группе больных с генотипом Ser447Ser. Как показывают полученные результаты, полиморфизм гена LPL обуславливает иммунологические изменения при ожирении. Таким образом, при генотипе Ser447Ter гена LPL необходимо проводить мониторинг и коррекцию дисбаланса провоспалительных цитокинов и молекул адгезии. В настоящее время не вызывает сомнения, что использование диагностических методов, основанных на анализе геномных маркеров позволяет осуществлять раннюю диагностику с учетом фенотипических особенностей при развитии ожирения и своевременно назначать адекватную персонализированную диетотерапию. Это приобретает особую значимость, так как благодаря генетической диагностике в несколько раз сокращается время подбора нужного рациона, появляется возможность назначить более эффективные схемы диетотерапии, а также снизить количество осложнений, связанных как с самим заболеванием, так и с неблагоприятными реакциями на фармакологические препараты [55, 73, 122, 129]. Анализ геномных, протеомных и метаболомных изменений при различных полиморфных вариантах генов ApoE иLPL показал неоднозначную диагностическую значимость отдельных показателей. Тем не менее, в результате проведенной работы удалось выявить некоторые закономерности. 88 Наиболее выраженные изменения показателей липидного и углеводного обменов выявлены при генотипах, ассоциированных с одновременным носительством аллелей ε2 и ε4 гена ApoE (ε2/ε3/ε4 и ε2/ε2/ε4). В основном, они выражались в увеличении концентрации триглицеридов, аполипопротеина В и МДА-модифицированных АпоВ (MDA-oxLDL). Напротив, выявление аллеля ε2 гена ApoE в гомозиготной форме или в ассоциации с аллелем дикого типа ε3 сопровождалось более позитивными изменениями липидного и углеводного обменов, а также уменьшением выраженности воспалительной реакции. Принципиально важными следует считать данные, полученные проведении корреляционного анализа протеомных и метаболомных маркеров у больных с ожирением с различными полиморфными вариантами гена ApoE. Данный статистический метод позволяет определить характер реализации метаболических изменений у больных с ожирением. Как следует из данных рисунка 3, у больных с ожирением с генотипом ε3/ε3/ε3 развитие дислипидемии сопровождается инициацией неспецифической воспалительной реакции за счет прямой корреляционной зависимости содержания CRPи концентрации триглицеридов (r=0,77; p<0,05) и обратной корреляции с уровнем ЛПВП (r=-0,70; p<0,05). Рисунок 3. Результаты корреляционного анализа геномных, протеомных и метаболомных маркеров у больных с ожирением при генотипе ε3/ε3/ε3 гена ApoE. 89 Корреляционный анализ протеомных и метаболомных маркеров у больных с генотипом ε2/ε3/ε3 установил прямую зависимость уровня АпоВ от содержания холестерина (r=0,76; p<0,001), триглицеридов (r=0,83; p<0,001) и ЛПНП (r=0,92; p<0,001), что объясняется способностью АпоВ транспортировать липиды низкой плотности. Особый интерес представляет обратная зависимость уровня АпоВ и висфатина (r=-0,69; p<0,05), а также ИЛ-6 (r=-0,59; что p<0,05), указывает на вовлеченность адипокинов и провоспалительных цитокинов в развитие дисбаланса липидного обмена (Рисунок 4). Рисунок 4. Результаты корреляционного анализа геномных, протеомных и метаболомных маркеров у больных с ожирением при генотипе ε2/ε3/ε3 гена ApoE У носителей гомозиготного генотипа ε2/ε2/ε3 гена ApoE были выявленные изменения протеомных и метаболомных маркеров, аналогичные изменениям при генотипе ε2/ε3/ε3, за исключением выявленной обратной корреляционной взаимосвязи содержания аполипопротеина В с концентрацией адипонектина (r=-0,55; p<0,05) (Рисунок противоатерогенным, действием[100, 172]. 5). Как известно, противовоспалительным адипонектин и обладает гипогликемическим 90 Рисунок 5. Результаты корреляционного анализа геномных, протеомных и метаболомных маркеров у больных с ожирением при генотипе ε2/ε2/ε3 гена ApoE Возможно, адипонектин реализует свои функции посредством воздействия на липидный состав крови, воздействуя на ключевые транспортные молекулы, такие как аполипопротеины. При изучении больных с ожирением с генотипом ε4/ε3 изменения липидного обмена характеризовались наличием прямой зависимости содержания аполипопротеина В (r=0,71; p<0,05; r=0,92; p<0,001; r=0,71; p<0,05 соответственно) и аполипопротеина А от концентраций холестеина, триглицеридов и ЛПНП (r=0,70; p<0,05; r=0,56; p<0,05; r=0,58; p<0,05 соответственно). Не вызывает сомнения, что уровни липидных фракций и транспортных молекул находятся в тесной взаимосвязи (Рисунок 6). Известно, что при аллельном варианте ε4 синтезируется аполипопротеин Е со сниженным сродством к рецепторам, что приводит к нарушению энергетического обмена, отражающегося изменениями липидного профиля крови у больных с ожирением[177].Таким целесообразность образом, применения при полученные генотипе данные ε4/ε3 обосновывают методов контроля гипергликемии и индивидуального подхода к диетотерапии, направленной на снижение свободных жирных кислот в крови. 91 Рисунок 6. Результаты корреляционного анализа геномных, протеомных и метаболомных маркеров у больных с ожирением при генотипе ε3/ε3/ε4 гена ApoE Особый интерес представляют результаты корреляционного анализа у больных с генотипом ε2/ε3/ε4, в частности взаимозависимость провоспалительных цитокинов ИЛ-1α и ФНОα (r=0,70; p<0,05) и L-FABP (r=0,66; p<0,05), что свидетельствует об активации иммунной системы и развитии воспалительной реакции при избыточном поступлении свободных жирных кислот в гепатоциты (Рисунок 7). Рисунок 7. Результаты корреляционного анализа геномных, протеомных и метаболомных маркеров у больных с ожирением при генотипе ε2/ε3/ε4 гена ApoE Результаты исследования протеомных и метаболомных маркеров у носителей генотипа ε2/ε2/ε4 демонстрировали прямую зависимость уровня висфатина от уровня глюкозы (r=0,83; p<0,05) и обратную связь с содержанием аполипопротеина В (r=-0,95; p<0,05). Также выявлена прямая зависимости 92 содержания резистина от концентрации аннексина V (r=0,68; p<0,05). Таким образом, можно заключить, что при генотипе ε2/ε2/ε4 гена ApoE дисбаланс регуляторных механизмов углеводного обмена тесно связан с адипокиновым статусом больных с ожирением (Рисунок 8). Рисунок 8. Результаты корреляционного анализа геномных, протеомных и метаболомных маркеров у больных с ожирением при генотипе ε2/ε2/ε4 гена ApoE Принципиальную важность играют данные, полученные при изучении полиморфных вариантов гена LPL. Так, у носителей генотипа Ser447Ser гена LPL была выявлена достоверная взаимосвязь содержания холестерина, триглицеридов, ЛПНП и аполипопротеина В (r=0,79; p<0,001; r=0,75; p<0,001; r=0,66; p<0,001 соответственно) (Рисунок 9), а у больных с генотипом Ser447Ter гена LPL выявлена обратная корреляционная зависимость уровней АЛТ, MDAмодифицированных ЛПНП, sICAM и адипонектина (r=-0,58; p<0,05; r=-0,51; p<0,05; r= -0,50; p<0,05 соответственно) (Рисунок 10). Рисунок 9. Результаты корреляционного анализа геномных, протеомных и метаболомных маркеров у больных с ожирением при генотипе Ser447Ser гена LPL 93 Рисунок 10. Результаты корреляционного анализа геномных, протеомных и метаболомных маркеров у больных с ожирением при генотипе Ser447Ter гена LPL Можно заключить, что концентрация адипонектина у носителей генотипа аллеля Ser447Ter гена LPL является критически значимым факторов нарушения липидного обмена, развития воспалительной реакции и окислительного стресса. Исходя из особенностей распределения частот генотипов у пациентов с различной степенью ожирения, исследованные полиморфные генотипы могут рассматриваться в комплексе с индивидуальными особенностями энергетического метаболизма, гормонального и иммунного статуса больного. 4.8 Оценка эффективности диетотерапии при различных полиморфных вариациях генов ApoE и LPL у больных с ожирением На сегодняшний день основным общепризнанным методом лечения ожирения является диетотерапия, направленная на создание отрицательного энергетического баланса [10]. Однако стандартизированный подход к диетотерапии не учитывает индивидуальных особенностей генома, протеома и метаболома каждого конкретного больного, что существенно снижает эффективность проводимых лечебных мероприятий. Так как ожирения, являясь хроническим заболеванием, то требуется комплексный подход к лечению, постоянного контроля факторов риска 94 развития сопутствующих заболеваний. Изучение эффективности проводимой диетотерапии при различных полиморфных вариациях ключевых генов энергетического метаболизма позволит оптимизировать проводимые лечебные мероприятия и улучшить их долгосрочный эффект. После использования стандартного варианта гипокалорийной диеты больным с ожирением была проведена оценка динамики биохимических показателей крови, результаты которого представлены в таблице 4.10 и 4.11. 94 Таблица 4.10 Динамика биохимических показателей метаболизма у носителей полиморфных вариантов гена ApoE, больных ожирением в процессе диетотерапии (М±м) Общий Генотип холестерин (ммоль/л) Триглицериды ЛПВП ЛПНП Глюкоза (ммоль/л) (ммоль/л) (ммоль/л) (ммоль/л) 1. ε3/ε3 До 5,89±0,25 1,69±0,14 1,37±0,07 3,85±0,23 5,89±0,32 (n=32) После 4,75±0,22 1,38±0,11 1,14±0,07 3,08±0,18 5,46±0,20 2. ε2/ε2 До 4,79±0,30 1,64±0,20 1,37±0,15 2,77±0,27 5,85±0,27 (n=9) После 4,40±0,24 1,30±0,16 1,16±0,11 2,73±0,20 5,36±0,21 3. ε2/ε3 До 6,10±0,41 1,91±0,35 1,49±0,15 3,86±0,37 5,55±0,21 (n=9) После 4,86±0,47 1,47±0,14 1,27±0,15 3,02±0,41 4,94±0,17 4. ε4/ε3 До 5,22±1,22 1,45±0,29 1,20±0,12 3,47±0,92 5,74±0,21 (n=5) После 3,11±0,54 1,17±0,23 0,97±0,09 1,62±0,36 5,67±0,15 Р1 <0,001 <0,001 <0,0001 <0,001 <0,0001 Р2 >0,05 >0,05 <0,05 >0,05 >0,05 Р3 <0,01 <0,01 <0,005 >0,05 >0,05 Р4 >0,05 <0,005 >0,05 >0,05 >0,05 95 Таблица 4.11 Динамика показатели липидного и углеводного обмена у носителей полиморфных вариантов генов LPL и ApoE, больных ожирением в процессе диетотерапии (М±м) Общий холестерин Генотип (ммоль/л) Триглицериды ЛПВП ЛПНП Глюкоза (ммоль/л) (ммоль/л) (ммоль/л) (ммоль/л) 1. Ser/Ser До 5,67±0,19 1,79±0,13 1,32±0,05 3,58±0,16 5,85±0,22 (n=49) После 4,69±0,20 1,41±0,08 1,13±0,05 2,99±0,18 5,39±0,14 2. SerTer До 5,86±0,57 1,81±0,24 1,33±0,15 3,77±0,50 5,64±0,30 (n=9) После 4,77±0,39 1,21±0,16 1,26±0,17 3,14±0,30 5,15±0,16 Р1 <0,0001 <0,0001 <0,0001 <0,0001 <0,0001 Р2 >0,05 >0,05 <0,005 >0,05 <0,05 96 Полученные данные указывают на существенные отличия в эффективности проведенной диетотерапии в зависимости от генотипа. Установлено, что при генотипах ε3/ε3и ε2/ε3гена ApoE содержание липидов и глюкозы у больных с ожирением статистически значимо снижалось, что указывало на высокую эффективность проводимой диетотерапии. У больных с генотипами ε2/ε2 и ε4/ε3такой закономерности выявлено не было. При изучении динамики биохимических показателей крови носителей различных полиморфных маркеров гена LPL было выявлено, что максимальный выраженный положительный эффект от диетотерапии у больных с ожирением был выявлен при полиморфном варианте Ser/Ser гена липопротеинлипазы. На основании полученных данных можно заключить, что эффективность диетотерапии при нарушении липидного и углеводного обменов у больных с ожирением значительно выше у носителей генотипов ε3/ε3/ε3 (на 19% снижается уровень общего холестерина, на 18% - триглицеридов, на 17% липопротеидов низкой плотности, на 20% - липопротеидов высокой плотности, на 7% - глюкозы), ε2/ε3/ε3 гена ApoE (на 29% снижается содержание общего холестерина, на 23% - триглицеридов и на 15% - липопротеидов высокой плотности) и Ser447Ser гена LPL (на 17% снижается концентрация общего холестерина, на 21% - триглицеридов, на 14% - липопротеидов высокой плотности, на 16% - липопротеидов низкой плотности, на 8% - глюкозы). 97 5 ЗАКЛЮЧЕНИЕ Определение полиморфизмов Ser447Ter гена LPL, Arg158Cys (ε2) и Cys112Arg158 (ε4) гена ApoE, уровней адипокинов и цитокинов в крови рекомендовано в качестве диагностического и прогностического тестов у лиц с избыточной массой тела и больных с ожирением Представляется перспективным направлением при выполнении дальнейших исследований создание персонализированных подходов к диетотерапии и фармакотерапии, основанных на выявлении генетических маркеров, изменений протеомных и метаболомных показателей у больных с ожирением (таблица 5.1). 98 Таблица 5.1 Геномные, протеомные и метаболомные технологии в персонализированной диагностике и терапии ожирения Проведение стандартного варианта гипокалорийной диетотерапии для больных с ожирением: Белки- 95г, Жиры - 63, Углеводы - 172, Энергетическая ценность - 1640 ккал В отсутствии редукции массы тела и положительной динамики липидного спектра крови – назначение молекулярногенетического анализа полиморфизмов Ser447Ter гена LPL, Arg158Cys и Cys112Arg гена ApoE. Полиморфный маркер ε4/ε3 гена ApoE Полиморфный маркер ε2/ε3 гена Полиморфный маркер ε2/ε2 гена ApoE ApoE Полиморфный маркер Ser/Ter гена LPL гена ApoE Риск развития перекисного окисления липидов; Риск развития дислипидемии; В 5,69 раза выше риск развития ожирения; * В 1,53 раза выше риск развития НАЖБП; * Резистентность к диетотерапии; * - по сравнению с больными с ожирением – носителями генотипа «дикого типа В 11,22 раза выше риск развития ожирения; * В 2,77 раза выше риск развития НАЖБП; * В 3,16 раза выше риск развития атеросклероза при ожирении; * Риск развития дислипидемии; Резистентность к диетотерапии; При ожирении, осложненном атеросклерозом, высокий риск дислипидемии, развития воспалительной реакции и перекисного окисления липидов; Резистентность к диетотерапии; 99 ПЕРСОНАЛИЗИРОВАННАЯ ДИАГНОСТИКА Определение содержания: Липидограмма (общий ХС, ТГ, ЛПВП, ЛПНП); Определение содержания: АЛТ; АСТ; Окисленные липопротеины низкой плотности (oxLDL); ЩФ; ɣ-ГТ; МДА-модифицированныt ЛПНП (MDA-oxLDL); Билирубин (связанный и свободный); Определение содержания: Определение содержания: Липидограмма (общий ХС, ТГ, ЛПВП, ЛПНП); Индекс атерогенности ((ХСобщий-ЛПВП)/ЛПВП); Липидограмма (общий ХС, ТГ, ЛПВП, ЛПНП); Окисленные липопротеины низкой плотности (oxLDL); МДА-модифицированныt ЛПНП (MDA-oxLDL); АЛТ; АСТ; ЩФ; ɣ-ГТ; Билирубин (связанный и свободный); sICAM; С-реактивный белок; Индекс атерогенности ((ХСобщийЛПВП)/ЛПВП); 100 ПЕРСОНАЛИЗИРОВАННАЯ ДИЕТОТЕРАПИЯ Белки – 70-80г (животные 50% г) Белки –100-120г (в т.ч. животные 45-50 г) Белки –100-120г (в т.ч. животные 45-50 г) Белки – 70-80г (в т.ч. животные 40 г) Жиры – 45-60г (из них 25г растительные) Жиры – 50-60г (из них 30г растительные) Жиры – 45-60г (из них 25-30г - растительные) Жиры – 60-70г (из них 25г - растительные) Углеводы – 130-150г (пищевые волокна 30-40г) Углеводы – 120-150г (пищевые волокна 20-25г) Углеводы – 120-150г (пищевые волокна 30-40г) Углеводы – 130-150г (пищевые волокна 60-70г) Энергетическая ценность – 1340-1500 ккал Энергетическая ценность – 1350-1500 ккал Экзогенный холестерин – до 200-300 мг/сут Энергетическая ценность – 1350-1500 ккал Экзогенный холестерин – до 200-300 мг/сут Режим питания – 4-6 раз/день Энергетическая ценность – 1350-1500 ккал Режим питания – 4-6 раз/день Режим питания – 4-6 раз/день Поваренная соль – до 2г/день Режим питания – 4-6 раз/день Поваренная соль – 3-5 г/день Поваренная соль – 3-5 г/день Свободная жидкость–0,81,5л Поваренная соль – до 2г/день Свободная жидкость – 0,81,0л Свободная жидкость – 0,81,0л Свободная жидкость – 0,81,5л 101 ПЕРСОНАЛИЗИРОВАННАЯ ФАРМАКОТЕРАПИЯ Дополнительный прием антиоксидатнов: тиоктовая кислота (берлитион, эспа-липон, тиогамма) 600мг на 200мл физ.раствора; Прием статинов и др.гиполипидемических лекарственных средств: диротон 5-10мг в сутки, эналаприл 5-10мг в сутки, лозап 25-50мг в сути; крестор/ липримар/ аторис/ симвастатин - 10мг Дополнительный прием полиненасыщенных жирных кислот: Омега-3-ПНЖК — 2–4 г/сутки Дополнительный прием полиненасыщенных жирных кислот: Омега-3-ПНЖК — 2–4 г/сутки; Антигипертензивная терапия: диротон 5-10мг в сутки, эналаприл 5-10мг в сутки, лозап 25-50мг в сутки; Антигипертензивная терапия: диротон 5-10мг в сутки, эналаприл 5-10мг в сутки, лозап 25-50мг в сутки; Антикоагуляционная терапия: прадакса (110 или 150мг 1 или 2 раза в день); Антикоагуляционная терапия: прадакса (110 или 150мг 1 или 2 раза в день); Дополнительный прием антиоксидатнов: тиоктовая кислота (берлитион, эспа-липон, тиогамма) 600мг на 200мл физ.раствора; Дополнительный прием антиоксидатнов: тиоктовая кислота (берлитион, эспа-липон, тиогамма) 600мг на 200мл физ.раствора; Прием статинов и др.гиполипидемических лекарственных средств: диротон 5-10мг в сутки, эналаприл 5-10мг в сутки, лозап 25-50мг в сути; крестор/ липримар/ аторис/ симвастатин - 10мг 102 6 ВЫВОДЫ 1. Впервые получены новые данные, свидетельствующие о том, что риск развития ожирения в российской популяции ассоциирован с носительством полиморфизма Arg158Cys (ε2) гена ApoE (OR=18,68; 95% CI [2,56 – 137,13]). 2. На основании исследования 217 больных с различной степенью ожирения доказано, что носительство гетерозиготного генотипа ε2/ε3 гена ApoE увеличивает риск развития ожирения в ~6 раз (95% CI [0,76 – 43,79]), а гомозиготный генотип ε2/ε2 гена ApoE увеличивает риск развития ожирения в ~11 раз (95% CI [0,67 – 189,35]) по сравнению с генотипом ε3/ε3 (95% CI [0,01 – 0,53]). 3. Сравнительный анализ проатерогенных биомаркеров у больных с ожирением и атеросклерозом выявил, что у носителей гомозиготного генотипа ε2/ε2/ε3 гена ApoE достоверно увеличивается содержание триглицеридов (на 47%), окисленных липопротеидов низкой плотности oxLDL (на 390%), ИЛ-6 (на 51%), sICAM (на 201%), L-FABP (на 177%) и снижается уровень адипонектина (на 51%), что позволяет отнести их к клинически значимым предикторам атеросклероза. 4. Впервые показано, что наличие генотипа ε4/ε3/ε3 гена ApoE, увеличение содержания глюкозы (5,55-6,19 ммоль/л), триглицеридов (2,09-3,89 ммоль/л), L-FABP (11,62-23,76 пг/мл), ФНОα (14,88-30,11 пг/мл) и снижение концентрации адипонектина (0,89-3,21 мкг/мл) являются предикторами развития неалкогольной жировой болезни печени у больных с ожирением. 5. На основании изучения уровней адипокинов установлена зависимость концентрации адипонектина от индекса массы тела (r= -0,71), что позволяет 103 рассматривать адипонектин в качестве одного из ранних маркеров развития ожирения. 6. При изучении цитокинового статуса у больных с ожирением с индексом массы тела свыше 35 выявлено достоверное увеличение концентраций таких неспецифических маркеров воспаления, как адгезивные молекулы sICAM (56,90-209,6 нг/мл; r= 0,62) и С-реактивный белок (887512650 нг/мл; r= 0,56). 7. Эффективность диетотерапии при нарушении липидного и углеводного обменов у больных с ожирением значительно выше у носителей генотипов ε3/ε3/ε3 (на 19% снижается уровень общего холестерина, на 18% триглицеридов, на 17% - липопротеидов низкой плотности, на 20% - липопротеидов высокой плотности, на 7% - глюкозы), ε2/ε3/ε3 гена ApoE (на 29% снижается содержание общего холестерина, на 23% - триглицеридов и на 15% - липопротеидов высокой плотности) и Ser447Ser гена LPL (на 17% снижается концентрация общего холестерина, на 21% - триглицеридов, на 14% - липопротеидов высокой плотности, на 16% - липопротеидов низкой плотности, на 8% - глюкозы). 8. Определение полиморфизмов Ser447Ter гена LPL, Arg158Cys (ε2) и Cys112Arg158 (ε4) гена ApoE, уровней адипокинов и цитокинов в крови рекомендовано в качестве диагностического и прогностического тестов у лиц с избыточной массой тела и для разработки персонализированной диетотерапии у больных с ожирением. 104 7 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ELISA(enzim-linkedimmunosorbentassay) – иммуно-ферментный анализ HRP (horseradish peroxidase) – пероксидаза хрена L-FABP (liver-typefatty acid-binding protein)– печеночная форма белка, связывающего жирные кислоты MDA - малоновый диальдегид NAD - никотинамидадениндинуклеотид NADH – никотинамидадениндинуклеотид (восстановленная форма) oxLDL(oxidizedlow-densitylipoprotein)– окисленные липопротеины низкой плотности PCR (ПЦР) – полимеразная цепная реакция (polymerase chain reaction) SNP(single nucleotide polymorphism) – единичный нуклеотидный полиморфизм ɣ -ГТ - гамма-глутамилтранспептидаза АГ – артериальная гипертензия АДФ - аденозиндифосфат АКТГ – адренокортикотропный гормон АЛТ- аланинаминотрансфераза АпоC – аполипопротеин С АпоE – аполипопротеин Е АСТ - аспартатаминотрансфераза ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота АТФ - аденозинтрифосфат ВОЗ – всемирная организация здравоохранения ГЛЮТ-4 - Глюкозный транспортѐр -4 ИЛ-1 – интерлейкин -1 ИЛ-6 – интерлейсин-6 ИМТ - индекс массы тела ЛПВП - липопротеины высокой плотности ЛПНП - липопротеины низкой плотности ЛПОНП - липопротеины очень низкой плотности 105 ЛППП - липопротеины промежуточной плотности ЛХАТ - лецитинхолестеринацилтрансфераза мРНК – матричная рибонуклеиновая кислота НАЖБП – неалкогольная жировая болезнь печени НАСГ – неалкогольный стеатогепатит ОТ/ОБ – индекс отношения окружности талии к окружности бедер ПЭГ - полиэтиленгликоль ФНОα – фактор некроза опухоли альфа ХС – холестерин ЩФ- щелочная фосфотаза ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота ЭХПБ - эфиры холестерина-переносящий белок 106 8 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Алексеева, Н.С. Факторы риска развития метаболического синдрома и психологическая готовность больных к проведению профилактики / Н.С. Алексеева, О.И. Салмина-Хвостова // Профилактическая медицина . - 2011. №2. – С.53-56. 2. Бабак, О. Я.. Гипоадипонектинемия — ключевой фактор риска неалкогольной жировой болезни печени / О. Я. Бабак, Н. А. Кравченко, Е. В. Колесникова // Журнал НАМН України . - 2012 .- Т.18, № 2 .- С.199–204. 3. Бабак, О.Я. Влияние генетического полиморфизма на формирование неалкогольной жировой болезни печени / О.Я. Бабак, Е.В. Колесникова, И.В. Шуть и др. // Гастроентерологiя. - 2013. - № 1. - С. 54-59. 4. Баранов, В.С. Генетика и эпигенетика дисплазий соединительной ткани / В.С. Баранов // Педиатрия. - 2013. - Т.92, №4, - С.19-26. 5. Баранов, В.С. Экологическая генетика, репродуктивное здоровье и предиктивная медицина / В.С. Баранов // Журнал акушерства и женских болезней. - 2005. - №1, - С.14-19. 6. Беляева, И.Г. Субклиническое воспаление и цитокиновый статус у больных артериальной гипертонией с метаболическими факторами риска / И.Г. Беляева, Г.А. Грицаенко, А.М. Терегулова и др. // Современные наукоемкие технологии. - 2012.- №6. - C.10-13. 7. Борзенко, Б.Г. Общие закономерности обмена веществ. Метаболизм углеводов, липидов, белков и его регуляция / Е.В. Богатырева, Ю.Д. Турсунова, Л.Ф. Землякова, Е.В. Хомутов. - Донецк, 2012. - 106с. 8. Буеверова, Е.Л. Атерогенная дислипидемия и печень / Е.Л. Буеверова, О.М. Драпкина, В.Т. Ивашкин // Российские медицинские вести. — 2008. — Том 13, №1. — С. 17-23. 9. Бутрова, С.А. Висцеральное ожирение - ключевое звено метаболического синдрома / С.А. Бутрова, Ф.Х. Дзгоева // Ожирение и метаболизм. – 2004. - №1. – С.10-16. 107 10. Бутрова, С.А. Современная терапия ожирения / С.А. Бутрова, Ф.Х. Дзгоева // Российский Медицинский Журнал. - 2005. - Т.13. № 2. – С.96–99. 11. Бутрова, С.А. Адипоцитокины: резистин и фактор некроза опухолей-α у мужчин с абдоминальным ожирением / С.А. Бутрова, Е.В. Ершова, А.В. Ильин // Ожирение и метаболизм. - 2007. - № 4. – С.30-33. 12. Бутрова, С.А. Метаболический синдром: патогенез, клиника, диагностика, подходы к лечению / С.А. Бутрова // Российский Медицинский Журнал. - 2001. – Том 9, № 2, - С.56–60. 13. Бутрова, С. А. Ожирение. Современная тактика ведения больных / С.А. Бутрова // Лечащий врач. - 2000.- № 5.-С.30-33 14. Вербовой, А.Ф. Адипокины, инсулинорезистентность и активность симпато-адреналовой системы у юношей с ожирением, манифестировавшим в пубертатный период / А.Ф. Вербовой, Е.В. Митрошина, Ю.А. Долгих // Ожирение и метаболизм. -2012. -№ 2. - С.49-52. 15. Веселовская, Н.Г. Адипокины как корригируемые факторы риска сердечно-сосудистых заболеваний / Н.Г. Веселовская, Г.А. Чумакова, А.А. Козаренко и др. // Российский кардиологический журнал. -2010.- №6. – С.88-93. 16. Вовк, Е.И. Лечение неалкогольной жировой болезни печени в практике терапевта: что? где? когда? / Е.И.Вовк // Российский Медицинский Журнал. 2011.- №17. – С.1038-1046. 17. Гинзбург, М.М. Ожирение. Влияние на развитие метаболического синдрома / М.М. Гинзбург, Н.Н. Крюков // Профилактика и лечение. – М.: Медпрофилактика-М, 2002. - 127с. 18. Гинтер, Е.К. Наследственные болезни в российских популяциях / Е.К. Гинтер, Р.А. Зинченко // Вестник ВОГиС . – 2006 .- Том 10, № 1 . – С.206-125. 19. Гуревич, В.С. Современные представления о патогенезе атеросклероза / В.С. Гуревич // Болезни сердца и сосудов. - 2006. – №4. – С. 4–7. 20. Гусова, З.Р. Сравнительный анализ клинико-иммунологических особенностей больных с избыточной массой тела и морбидным ожирением / 108 З.Р. Гусова, Л.П. Сизякина, С.В. Воробьев // Цитокины и воспаление. - 2012. № 4(11), - С. 56–61. 21. Дедов, И.И. Жировая ткань как эндокринный орган / И.И. Дедов, Г.А. Мельниченко, С.А. Бутрова // Ожирение и метаболизм. – 2006. - №1. - С.6-13. 22. Дедов, И.И. Ожирение: этиология, патогенез, клинические аспекты. Руководство для врачей / И.И. Дедов, Г.А. Мельниченко. - Москва: Медицинское информационное агентство, 2004. - 456 с. 23. Дедов, И.И. Персонализированная медицина: современное состояние и перспективы / И.И. Дедов, А.Н. Тюльпаков, В.П. Чехонин и др. // Вестник РАМН. – 2012. - №12, - С.4-12. 24. Демидова, Т.Ю. Ожирение, как ключевая и модифицируемая причина развития сахарного диабета 2 типа / Т.Ю. Демидова, Е.Л. Круглова // Русский Медицинский Журнал. - 2009 .- Т. 17, № 7. – С.450-453. 25. Диабет. Информационный бюллетень ВОЗ №°312. – 2013. - октябрь 26. Дмитриев, А.Н. Критерий диагностики досимптоматической (преморбидной) стадии метаболического синдрома / А.Н. Дмитриев, Л.Р. Перминова // Ожирение и метаболизм. – 2014. - №4, - С.24-28. 27. Драпкина, О. М. Неалкогольная жировая болезнь печени — современный взгляд на проблему / О. М. Драпкина, В. И. Смирин, В. Т. Ивашкин // Российские медицинские вести. – 2010. - №2. - С. 72–78. 28. Евтушенко, С.К. Церебротендинальный ксантоматоз у детей / С.К. Евтушенко, Т.М. Морозова, И.Н. Голубева // Международный неврологический журнал. – 2007. - №6(16). - С. 67-74 . 29. Журавель, В.А. Эффективность определения SICAM для оценки и прогноза иммуномодулирующей терапии циклоферном при лечении женщин с хламидийным эндоцервицитом / В.А. Журавель, М.С. Семененко, Н.Ю. Стукова и др. // Успехи современного естествознания. – 2003 .-№6. – С.55-57. 30. Зиновьева, Е.Н. Эндотелиальная дисфункция как фактор прогрессирования неалкогольного стеатогепатита. Терапевтические подходы / 109 Е.Н. Зиновьева, С.Н. Мехтиев, С.В. Соколовский // Гастроэнтерология . – 2011. №1. – С.3-9. 31. Ивашкин, В.Т. Неалкогольный стеатогепатит / В.Т. Ивашкин, Ю.О. Шульпекова // Российский Медицинский Журнал Болезни органов пищеварения. - 2000.- Т.2. - С.41–45. 32. Измайлова, О.В. Алиментарно-зависимые факторы риска развития артериальной гипертонии и технологии их коррекции / О.В. Измайлова, А.М. Калинина, Р.А. Еганян // Профилактическая медицина. - 2011.- №1. – С.19-28. 33. Кардиология: Учебн. пособие / И.А.Латфуллин, А.А.Подольская, Р.И. Ахмерова. – М. :МЕДпресс-информ, 2006. –224с. 34. Карпов, Р.С. Атеросклероз: патогенез,клиника, функциональная диагностика, лечение / Р.С. Карпов, В.А. Дудко. – Томск:STT, 1998. –672 с. 35. Кишкун, А.А. Биологический возраст и старение: возможности определения и пути коррекции: Руководство для врачей / А.А. Кишкун. – М.: Геотар-Медиа, 2008. - 973 с. 36. Ковалева, О.Н. Адипокины: биологические, патофизиологические и метаболические эффекты / О.Н. Ковалева, Т.Н. Амбросова, Т.В. Ащеулова, Е.А. Гетман // Внутренняя медицина. -2009. -№3. –С.18-26. 37. Ковалева, О.Н. Особенности антигипертензивной терапии у пациентов с ожирением / О.Н. Ковалева, С.А. Шаповалова, И.В. Шоп // Артериальная гипертензия. - 2008. - №1. - С. 63-70. 38. Колберг, Б. Жировая ткань как эндокринный орган / Б. Колберг // Проблемы ендокринноїпатології. - 2009.- № 1. – С.38–44. 39. Колчанов, Н.А. Генные сети липидного метаболизма / Н.А. Колчанов, М.И. Воевода, Т.Н.Кузнецова и др. // Бюллетень Сибирского отделения РАМН. 2006.- №2 (120). – С.29-42. 40. Кравчун, П.Г. Роль адипоцитокинов в формировании нарушений липидного и углеводного обменов у кардиологических больных / П.Г. Кравчун, О.И. Кадыкова, Т.Н. Габисония // Медицинские новости Грузии. – 2012. - №12 (213). - С.26-30. 110 41. Леженко, Г.А. Факторы формирования артериальной гипертензии у детей с ожирением / Г.А. Леженко, К.В. Гладун, Е.Е. Пашкова // Дитячий лікар. – 2011. – №3. – С. 23–34. 42. Мазурина, Н.В.17-ый европейский конгресс по ожирению / Н.В. Мазурина // Ожирение и метаболизм. – 2009. - №4. - С.64-67. 43. Марри Р. Биохимия человека: В 2-х томах. Т. 1. Пер. с англ. / Р. Марри, Д. Греннер ,П. Мейес, В.Родуэлл. — М.: Мир, 1993. - 384 с. 44. Мельниченко, Г.А. Ожирение / Г.А. Мельниченко, Т.Е. Романцова. Под ред. И.И. Дедова, Г.А. Мельниченко. — Медицинское информационное агентство, 2006. — 456с. 45. Метаболический синдром / Под ред. Г. Е. Ройтберга. —М.: Медпресс- информ., 2007. — 224 с. 46. Мешков, А. Н. Мутации гена рецептора липопротеинов низкой плотности у пациентов с клиническим диагнозом семейной гиперхолестеринемии / А. Н. Мешков, Д. В. Стамбольский, С. Р. Крапивнер и др. // Кардиология. - 2004. Т.44, №9. - С.58-61. 47. Мкртумян, А.М. Актуальные проблемы консервативного лечения ожирения / А.М. Мкртумян // Медицинский совет. – 2010. - №7-8, - С. 21-27. 48. Наследственная патология человека. Руководство для врачей. В 2 х томах / Под ред. Ю.Е. Вельтищева, Н.П. Бочкова. – М., 1992.– 134 с. 49. Невзорова В. А. Роль эндотелиальной дисфункции в прогрессировании метабо-лического синдрома от факторов риска до сосудистых ката строф / В. А. Невзорова, О. Г. Помогалова, О. В. Настрадин // Тихоокеанский медицинский журнал. -2008.- № 3, - С.69–74. 50. Неврология: нац. рук-во / Е. И. Гусев, А. Н. Коновалов, В. И. Скворцова, А. Б. Гехт. М.: ГЭОТАР, 2009. – 1040с. 51. Новиков, А.А. Протеомные исследования в ревматологии / А.А. Новиков, Е.Н. Александрова, Е.Л. Насонов // Научно-практическая ревматология. – 2012. - №6 (50), - С. 56-62 . 111 52. Нурбеков, М.К. Экология человека в аспекте новых данных о механизмах обеспечения тканевого и клеточного гомеостаза и контроля развития распространенных патологий / М.К. Нурбеков, О.А. Сперанская, М.И. Сусова и др. // Актуальные вопросы антропологических исследований. - 2012. - №1. – С.107-116. 53. Ожирение и избыточный вес. Информационный бюллетень ВОЗ №311, - 2014. - май 54. Ожирение: этиология, патогенез, клинические аспекты / Под ред. Дедова И.И. М.: Изд-во «МИА», 2006:104. 55. Олейник, О.А. Клинико-метаболические и молекулярно-генетические механизмы формирования кардиоваскулярных осложнений при ожирении / О.А. Олейник, Ю.Г. Самойлова, И.Н. Ворожцова и др. // Сибирский медицинский журнал. – 2011. - № 4-2, Т.26, - С. 16-21. 56. Орлова, Е. Г.. Регуляция лептином и грелиномапоптоза CD4+-лимфоцитов invitro / Е. Г. Орлова, С. В. Ширшев // Вестник Пермского университета. Сер.: Биология. - 2012. - №3. - С.81-84. 57. Пальцева, Е.М. Новые биомаркеры: адипонектин в современной диагностике сердечно-сосудистых заболеваний / Е.М. Пальцева, С.В. Константинова, С.Е. Северин // Кардиологический науч-практический журнал - 2009. - №10. – С.65-74. 58. Патрушев, Л. И. Экспрессия генов. / Л. И. Патрушев— М.: Наука, 2000. - 830 с. 59. Розенсон, P.C. Влияние фенофибрата на адипонектин и воспалительные биомаркеры у пациентов с метаболическим синдромом / P.C. Розенсон // Обзоры клинической кардиологии. - 2009. - №19. - С. 2 - 11. 60. Родионова, Т.И. Ожирение – глобальная проблема современного общества / Т.И. Родионова, А.И. Тепаева // Фундаментальные исследования. -2012.- Том 1, №12. – С.132-136. 112 61. Романцова, Т.И. Эндоканнабиноидная система: структура и потенциальные возможности в регуляции массы тела / Т.И. Романцова, И.И. Дедов, И.С. Кузнецов // Ожирение и метаболизм. – 2006. - №4. – С.2-11. 62. Романцова, Т.И. Патогенетический подход к лечению ожирения и сахарного диабета 2 типа / Т.И. Романцова // Ожирение и метаболизм. – 2008. №4, - С.2-10. 63. Романцова, Т.И. Эпидемия ожирения: очевидные и вероятные причины / Т.И. Романцова // Ожирение и метаболизм. - 2011.- №1, - С. 5-19. 64. Руяткина, Л.А. Глимепирид в современной гипогликемизирующей терапии: безопасность и эффективность / Л.А. Руяткина, М.Ю. Сорокин // Сахарный диабет. – 2012. - №2.-С.89-97. 65. Сидорова, М. В. Синтез и изучение кардиопротекторных свойств апелина-12 и его структурных аналогов / Сидорова М. В., Азьмуко А. А., Палькеева М. Еи др. // Биоорганическая Химия. – 2012. - Том 38, № 1. – С. 40– 51. 66. Силивончик, Н.Н. Неалкогольная жировая болезнь печени: возможности лечения / Н.Н. Силивончик // Медицинские новости. - 2008.- №8. – С.8-12. 67. Солнцева, А.В. Ожирение у детей. Вопросы этиологии и патогенеза / А.В. Солнцева, А.В. Сукало // Медицинские новости. – 2008. -№3. – С.7-13. 68. Солнцева, А.В.. Эндокринные эффекты жировой ткани / А.В. Солнцева //Медицинские новости. – 2009. – №3. – С. 711 69. Солошенкова, О.О. Дислипидемии в клинической практике. Часть 1 / О.О. Солошенкова, И.И. Чукаева, Н.В. Орлова // Лечебное дело. – 2009. - №3. - С.1217. 70. Степанов, В.А. Геномы, популяции, болезни: этническая геномика и персонифицированная медицина / В.А. Степанов // Acta Naturae (русскоязычная версия). – 2010. - №4, Т.2., - С.18-34. 71. Старовойтова, С. А. Обзор международных проектов в области микробной экологии человека и создания пробиотиков / С.А. Старовойтова // BiotechnologiaActa. – 2013. - № 3, Т.6., - С. 121-131. 113 72. Строев, Ю.И. Эндокринология подростков / Ю.И. Строев, Л.П. Чурилов. Под ред. А.Ш.Зайчика. - ЭЛБИ-СПб, 2004. - 384с. 73. Сычев, Д.А.Клиническая фармакогенетика системы биотрансформации и транспортеров лекарственных средств: дань моде или прикладное направление? / Д.А. Сычев, И.В. Игнатьев, Н.А. Гасанов и др. // Pacific Medical Journal. 2006.- №4. – С.21-26. 74. Танянский ,Д.А. Адипокины в патогенезе атерогенной дислипидемии при метаболическом синдроме / Д.А. Танянский, Э.М. Фирова, Л.В. Шатилина и др. // Медицинский академический журнал. - 2011. - №2. - С.78-85. 75. Творогова, М.Г. Аполипопротеины – свойства, методы определения, клиническая значимость / М.Г. Творогова // Лабораторная медицина. – 2005. №7. – С.29-37. 76. Титов, В.Н., Амелюшкина В. А., Яровая Е.Б и др. Оценка комплекса генетически зависимых показателей аполипопротеинов А-I, В, С-III, Е и липопротеина (А) у пациентов с гипертриглицеридемией / В.Н. Титов, В. А. Амелюшкина, Е.Б. Яровая и др // Атеросклероз и дислипидемии. – 2013. –Том 11, № 2. - С. 40-45. 77. Титов, В.Н. С-реактивный белок – вектор переноса жирных кислот, тест эндогенного воспаления при артериальной гипертонии / В.Н. Титов // Системные гипертензии . - 2007.- №2. - С.44-47. 78. Тутельян, В.А. От генома – к нутриому. От оптимального питания для всех – к персонализированной диетологии / В.А. Тутельян // Здравоохранение России. -2013.- Т.13 – С.253-256. 79. Фадеенко, Г.Д. Активность адипокинов и воспаления в развитии эзофагита у больных гастроэзофагеальнойрефлюксной болезнью с избыточной массой тела / Г.Д. Фадеенко, Т.А. Соломенцева, И.Э. Кушнир, В.М. Чернова // Гастроэнтерология. – 2013 .- №1. - С. 43-47. 80. Чубриева, С. Ю. Жировая ткань как эндокринный регулятор (обзор литературы) / С. Ю. Чубриева, Н. В. Глухов, А. М. Петербургского университета. -2008.- № 1. – С.32–43. Зайчик // Вестник Санкт- 114 81. Чураев, Р.Н. Генные и эпигенные сети: два уровня организации наследственной системы / Р.Н. Чураев //Вестник ВОГиС. -2005.–Том 9, № 2.С.199-208. 82. Шварц, В. Адипонектин: патофизиологические аспекты / В. Шварц // Патологическая физиология и экспериментальная терапия. – 2009. – №3. – С.3438. 83. Шварц, В. Воспаление жировой ткани (часть 1). Морфологические и функциональные проявления / В. Шварц // Проблемы эндокринологии . -2009.Т.55, №4. – С.44-49. 84. Шварц, В.Я. Воспаление жировой ткани (часть 4). Ожирение — новое инфекционное заболевание? (обзор литературы) / В.Я. Шварц // Проблемы эндокринологии. - 2011 .- № 5. – С.63—71. 85. Шварц, В.Я. Воспаление жировой ткани (часть 5). Взаимосвязь с физиологической инсулинрезистентностью / В.Я. Шварц // Проблемы эндокринологии. - 2011.- № 6 . – С.64—70. 86. Шварц, В. Воспаление жировой ткани: враг или друг? / В. Шварц // Цитокины и воспаление . -2013.- Т. 12. № 1–2. - С.13–21. 87. Шварц, В. Я. Воспаление как фактор патогенеза инсулинрезистентности и сахарного диабета 2-го типа / В.Я. Шварц // Терапевтический архив. - 2009 .№ 10. – С.74-80. 88. Шварц, В. Грелин – гормон желудка, регулирующий энергетический баланс / В. Шварц // Актуальные вопросы гастроэнтерологии в терапии и хирургии. Сборник научных трудов. - 2008. - Выпуск 5. - С. 18-23. 89. Шварц, В.Я. Двойственная инсулинрезистентности / В.Я. роль Шварц интерлейкина-6 в развитии // Патологическая физиология и экспериментальная терапия. - 2010.- № 1. – С.40-47. 90. Шварц, В. Жировая ткань как орган иммунной системы / В. Шварц // Цитокины и воспаление . - 2009.- Т.8, №4 . – С.3-10. 91. Шварц, В. Жировая ткань как эндокринный орган / В. Проблемы эндокринологии. - 2009. - Т. 55, № 1.- С. 38-44. Шварц // 115 92. Шварц, В.Я. Значение постпрандиальной гипергликемии в развитии сердечно-сосудистых заболеваний при сахарном диабете 2-го типа / В.Я. Шварц // Клиническая медицина. - 2009. - Том 88, № 11. - С. 12-17. 93. Шварц, В. Регуляция метаболических процессов интерлейкином 6 / В. Шварц // Цитокины и воспаление. - 2009. - Т. 8, № 3. - С. 3-10. 94. Шварц, В.Я. Жировой гепатоз и неалкогольный стеатогепатит / В.Я. Шварц, А.М. Ногаллер // Сибирский вестник гепатологии и гастроэнтерологии. -2011. - № 25. - С.5 – 9. 95. Шварц, В.. Неалкогольный стеатогепатит: патогенез, диагностика, лечение / В.Я. Шварц, А.М. Ногаллер // Врач . – 2011 .- №10. - С.31-36. 96. Школьник, В.В. Взаимоотношение грелина и Фно-α у пациентов с различными компонентами метаболического синдрома / В.В. Школьник, Ю.Н. Шапошникова, В.Д. Немцова // Запорожский медицинский журнал. - 2012. Том 71,№2. – С. 78-84. 97. Шульпекова, Ю.О. Патогенетическое значение липидов при неалкогольной жировой болезни печени / Ю.О. Шульпекова // Российском журнале гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. - 2012.-Т.22, №1. С.45-56. 98. Abella, V. Adipokines, metabolic syndrome and rheumatic diseases / V. Abella, M. Scotece, J. Conde et al. // Journal of Immunology Research. - 2014. – Режим доступа: doi: 10.1155/2014/343746. 99. Agarwal, C. Obesity, hyperglycemia and endothelial function in inner city Bronx adolescents: a cross-sectional study / C. Agarwal, H.W. Cohen, R.H. Muzumdar et al. // International Journal of Pediatric Endocrinology. – 2013. - №1. – P.18. 100. Ahsan, S. Status of serum adiponectin related to insulin resistance in prediabetics / S. Ahsan, S .Ahmed, S.D. Ahmed et al. // Journal of the Pakistan Medical Association. - 2014. – Vol.64, №2. – P.184-188. 116 101. Alvim, R.O. APOE polymorphism is associated with lipid profile, but not with arterial stiffness in the general population / R.O. Alvim, S.R.S Freitas, N.E. Ferreira et al. // Lipids in Health and Diseas. - 2010. - №9. - P.128. 102. Appachi, S. Adiposopathy and cardiovascular disease: the benefits of bariatric surgery / S. Appachi, S.R. Kashyap // Current Opinion in Cardiology. - 2013. – Vol.28, №5. - P.540-546. 103. Arai, H. Oxidative modification of lipoproteins / H.Arai // Subcellular Biochemistry. –2014.- №77. –P.103-114. 104. Assar, M. E. Preserved endothelial function in human obesity in the absence of insulin resistance / M. E. Assar, J. C. Ruiz de Adana, J. Angulo //Journal of Translational Medicine.- 2013.-№11. – P.263. 105. Aydin, S. The role of apelins in the physiology of the heart / S. Aydin, M.N. Eren, I. Sahin et al. // Protein and Peptide Letters. – 2014 .- №1. - P.2- 9. 106. Ba, H.J. Associations between serum apelin-12 levels and obesity-related markers in Chinese children / H.J. Ba, H.S. Su, Z. Chen et al. // PLoS One. -2014.№1. – Режим доступа: doi: 10.1371/journal.pone.0086577. 107. Bellentani, S. Epidemiology of non-alcoholic fatty liver disease / S. Bellentani, F. Scaglioni, M. Marino et al. // Digestive Diseases and Sciences. - 2010.-№ 28. – P.155–161. 108. Blüher, M. Adipokines - removing road blocks to obesity and diabetes therapy / M. Blüher // Molecular Metabolism. - 2014.- Vol.3, №3. – P.230-240. 109. Bragazzi, N.L. Situating nutri-ethics at the junction of nutrigenomics and nutriproteomics in postgenomics medicine / N.L. Bragazzi // Current Pharmacogenomics and Personalized Medicine. – 2013. - №11(2), - P.162-166. 110. Camp, K.M. Position of the Academy of Nutrition and Dietetics: nutritional genomics / K.M. Camp, Trujillo E. // Journal of the Academy of Nutrition and Dietetics. - 2014.- Vol.114, №2. – P.299-312. 111. Castan-Laurell, I. Apelin, a promising target for type 2 diabetes treatment? / I. Castan-Laurell, C. Dray, C. Knauf et al. // Trends in Endocrinology & Metabolism. 2012. - Vol.23, №5. - P.234-241. 117 112. Chan, I.S.Personalized medicine: progress and promise / I.S. Chan, G.S. Ginsburg //Annual Review of Genomics and Human Genetics. - 2011.-№12 , -P. 217244. 113. Chen, M.M. Novel Role for the Potent Endogenous Inotrope Apelin in Human Cardiac Dysfunction / M.M. Chen, E.A. Ashley, D.X. Deng // Circulation. - 2003 .№108. – P.65–72. 114. Chollet, C. Ghrelin – an ovel generation of antiobesity drug: design, pharmacomodulation and biological activity of ghrelin analogues / C., Chollet, K. Meyer, A.G. Beck-Sickinger // Journal of Peptide Science. – 2009. – Vol.15, №11. – P.711-730. 115. Choromańska, B.The clinical significance of fatty acid binding proteins / B. Choromańska, P. Myśliwiec, J. Dadan et al. // Postepy Hig Med Dosw. - 2011 .№65. – P.759-763. 116. Choquette, A.C. Evidence of aquantitative trait locus for energy and macronutrient intakes on chromosome 3q27.3: the Quebec Family Study / A.C. Choquette, S. Lemieux, A. Tremblay et al. // The American Journal of Clinical Nutrition. - 2008.-№4. -P. 1142-1148. 117. Conlon, A. Nutritional Management of Insulin Resistance in Nonalcoholic Fatty Liver Disease (NAFLD) / A. Conlon, J.M. Beasley, K. Aebersold al. // Nutrients. – 2013. – Vol.5, №10. – P. 4093–4114. 118. Da Costa, L.A. The association between obesity, cardiometabolic disease biomarkers, and innate immunity-related inflammation in Canadian adults / L.A. Da Costa, P. Arora, B. García-Bailo et al. // Journal of Diabetes, Metabolic Syndrome and Obesity. – 2012 .- №5. – P. 347–355. 119. Davies, B.S.J. New wrinkles in lipoprotein lipase biology / B.S.J. Davies, A.P. Beigneux, L.G. Fong et al. //Current Opinion in Lipidology. -2012.- Vol.23, №1.- P. 35–42. 120. Dichek, H.L. Functional characterization of a chimeric lipase genetically engineered from human lipoprotein lipase and human hepatic lipase / H.L. Dichek, C. 118 Parrott, R. Ronan et al. // The Journal of Lipid Research. – 1993. – Vol.34, №8. – P.1393-1340. 121. Duarte, N.C. Global reconstruction of the human metabolic network based on genomic and bibliomic data / N.C. Duarte, S.A. Becker, N. Jamshidi et al. // Proceedings of the National Academy of Sciences . - 2007. – Vol.104. – P.1777–1782. 122. El-Sayed, M.J.S. From obesity genetics to the future of personalized obesity therapy / M.J.S. El-Sayed, P. Froguel // Nature Reviews Endocrinology. - 2013.– Vol.9, №7.-P. 402-413. 123. Eto, M. Familial type III hyperlipoproteinemia / M. Eto, M. Saito // Nihon Rinsho. -2013. - №71(9). – P.1590-1594. 124. Europe’s visible epidemic //Bull World Health Organ. -2013.- №91. -549–550. 125. Farrell, G.C. Nash is an inflammatory disorder: Pathogenic, prognostic and therapeutic implications / G.C. Farrell, D. van Rooyen, L. Gan et al. // Gut and Liver Journal. -2012.- №6. – P.149–171. 126. Fasshauer, M. Adipokines in gestational diabetes / M. Fasshauer, M. Blüher, M. Stumvoll // The Lancet Diabetes & Endocrinology. – 2013. – Режим доступа: doi:10.1016/S2213-8587(13)70176-1. 127. Fried, M. Interdisciplinary european guidelines on metabolic and bariatric surgery / M. Fried, V. J.-M. Yumuk Oppert et al. // Obesity Facts. -2013.-Vol. 6, № 5. – Режим доступа: doi:10.1159/000355480 128. Gaggin,i M. Non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) and its connection with insulin resistance, dyslipidemia, atherosclerosis and coronary heart disease / M. Gaggini, M. Morelli, E. Buzzigoli et al. // Nutrients. – 2013 .- №5. – P.1544–1560. 129. Garver, W.S.The genetics of childhood obesity and interaction with dietary macronutrients / W.S. Garver, S.B. Newman, D.M. Gonzales-Pacheco et al. // Genes & Nutrition. -2013.- Vol.8, №3.P. - 271-287. 130. Geach T. Genetics: APOC3 mutations lower CVD risk / T.Geach // Nature Reviews Cardiology. – 2014. – Режим доступа: doi: 10.1038/nrcardio.2014.99. 119 131. Gholam, P.M. Nonalcoholic fatty liver disease in severely obese subjects / P.M. Gholam, L. Flancbaum, J.T. Machan et al. // The American Journal of Gastroenterology. -2007.- №102. – P.399–408. 132. Ginter, E. Type 2 diabetes mellitus, pandemicin 21 stcentury / E. Ginter, V.Simko // Advances in Experimental Medicine and Biology. - 2012.- №771. – P.4250. 133. Global health risks: mortality and burden of disease attributable to selected major risks// Geneva,World Health Organization. -2009 134. González-Jiménez, E. Monogenic human obesity: role of the leptinmelanocortin system in the regulation of food intake and body weight in humans / E. González-Jiménez, M.J. Aguilar Cordero, C.A. Padilla López et al // An Sist Sanit Navar. -2012.- Vol.35 №2. - P.285-293. 135. Gueorguiev, M. Association studies on ghrelin and ghrelin receptor gene polymorphisms with obesity / M. Gueorguiev, C. Lecoeur, D. Meyre et al. // Obesity (Silver Spring). – 2009. – Vol.17№4. – P.745-754. 136. Hall, J.Energy Homoeostasis: The Roles of Adipose Tissue-Derived Hormones, Peptide YY and Ghrelin / J. Hall, R. Roberts, N.Vora // Obesity Facts. – 2009. – Vol.2, №2. – P.117-125. 137. Harima, Y. Apolipoprotein C-II is a potential serum biomarker as a prognostic factor of locally advanced cervical cancer after chemoradiation therapy / Y. Harima, K. Ikeda, K. Utsunomiya et al. // International Journal of radiation oncology, biology, physics. – 2013. – Vol.87, №5. – P.1155-1161. 138. Hashm, S. AC. elegans model to study human metabolic regulation / S.Hashmi, Y. Wang, R.S. Parhar et al. // Nutrition & Metabolism. -2013.–Vol.10, №1. -P.31. 139. Heppner, K.M. Regulation of glucose metabolism by the ghrelin system: multiple players and multiple actions / K.M. Heppner, Tong J. // European Journal of Endocrinology. – 2014. – Vol.171№1. - R21-32. 140. Hu, P.F. Increased apelin serum levels and expression in human chondrocytes in osteoarthritic patients / P.F. Hu, J.L. Tang, W.P Chen // International Orthopaedics. -2011.- Vol.35, №9. – P.1421–1426. 120 141. Huang, H.L. Metabolic syndrome is related to nonalcoholic steatohepatitis in severely obese subjects / H.L. Huang, W.Y. Lin, L.T. Lee et al. // Obesity Surgery. 2007. - №17. – P.1457–1463. 142. Huang, X.Effects of lipoprotein lipase gene variations, a high-carbohydrate low-fat diet, and gender on serum lipid profiles in healthy Chinese Han youth / X. Huang, R. Gong, J. Lin et al. // BioScience Trends. -2011.-Vol.5, №5. - P. 198-204. 143. Imes, C.C. The Obesity Epidemic: The United States as a Cautionary Tale for the Rest of the World / C.C. Imes, Burke L.E. // Current Epidemiology Reports. – 2014. - №1(2), - P. 82-88. 144. Interventions on diet and physical activity: what works: summary report // Geneva, World Health Organization. – 2009 145. Johnson, A.M. The origins and drivers of insulin resistance / Johnson A.M., Olefsky J.M. // Cell. - 2013.- №152. - P.673–684. 146. Jung, U.J. Obesity and its metabolic complications: the role of adipokines and the relationship between obesity, inflammation, insulin resistance, dyslipidemia and nonalcoholic fatty liver disease / U.J. Jung, M.S. Choi // International Journal of Molecular Sciences. –2014.-Vol.15№4. - P.6184-6223. 147. Kang, H. Metabolic syndrome is associated with greater histologic severity, higher carbohydrate, and lower fat diet in patients with NAFLD / H. Kang, J.K. Greenson, J.T. Omo et al. // The American Journal of Gastroenterology. - 2006.№101. – P.2247–2253. 148. Kawasaki, N. Obesity-induced endoplasmic reticulum stress causes chronic inflammation in adipose tissue / N. Kawasaki, R. Asada, A. Saito et al. // Surface Science Reports. - 2012. – Режим доступа: doi: 10.1038/srep00799. 149. Knights, A.J. Adipokines and insulin action: A sensitive issue / Knights A.J., Funnell A.P., Pearson R.C., et al. // Adipocyte. – 2014.- Vol.3,№2 . – P.88-96. 150. Kojima, M. Ghrelin is a growth hormone releasing acylated peptide from stomach / M. Kojima, H. Nosoda, Y. Date// Nature. - 1999. –Vol.402. – P.656–660. 151. Lee, D.J. ApoE polymorphism may determine low-density lipoprotein cholesterol level in association with obesity and metabolic syndrome in 121 postmenopausal korean women / D.J. Lee, K.M. Kim, B.T. Kim et al. // Yonsei Medical Journal. -2011.-Vol.52, №3. –P.429–434. 152. Lee, M.J. Overweight modulates APOE and APOA5 alleles on the risk of severe hypertriglyceridemia / M.J. Lee, K.L. Chien, M.F. Chen et al. // Clinica Chimica Acta. -2013.- №416. - P.31-35. 153. Leite, N.C. Prevalence and associated factors of non-alcoholic fatty liver disease in patients with type-2 diabetes mellitus / N.C. Leite, G.F. Salles, A.L. Araujo et al. // Liver International. - 2009.-№ 29. – P.113–119. 154. Lima, M.M. Visceral fat resection in humans: effect on insulin sensitivity, beta-cell function, adipokines and inflammatory markers / M.M. Lima, J.C. Pareja, S.M. Alegre // Obesity. -2012.- Vol.3, №21. – P.182-189. 155. Liu, Y.H. Characteristic, polymorphism and expression distribution of LCAT gene in a Mongolian gerbil model for hyperlipidemia / Y.H. Liu, J.S. Wu, Z.Y. Wang et al. // Experimental and Molecular Pathology. – 2014. – Режим доступа: doi: 10.1016/j.yexmp.2014.07.011 156. Lopez, M.F. The role of apolipoprotein E in neurodegeneration and cardiovascular disease / M.F. Lopez, B. Krastins, M.Ning // Expert Review of Proteomics. -2014. – Vol.11, №3. – P.371-381. 157. Lund, A.-S.Q.N-3 Polyunsaturated fatty acids, body fat and inflammation / A.S.Q. Lund, A.L. Hasselbalch, M. Gamborg et al. // Obesity Facts . -2013.-Vol. 6, № 4. – Режим доступа: doi:10.1159/000354663 158. Makni, E. Correlation of resistin with inflammatory and cardiometabolic markers in obese adolescents with and without metabolic syndrome / E. Makni, W. Moalla, L. Benezzeddine-Boussaidi et al. // Obesity Facts. -2013.-Vol.6, №4. – Режим доступа: doi:10.1159/000354574 159. Matsunaga, A. Apolipoprotein E mutations: a comparison between lipoprotein glomerulopathy and type III hyperlipoproteinemia / A. Matsunaga, T.Saito // Clinical and Experimental Nephrology. – 2014. – Vol.8, №2. – P.220-224. 160. Natale, R.A. Role modeling as an early childhood obesity prevention strategy: effect of parents and teachers on preschool children's healthy lifestyle habits / R.A. 122 Natale, S.E. Messiah, L. Asfour et al. // Journal of Developmental & Behavioral Pediatrics. – 2014. - №35(6), - P. 378-387. 161. Ohashi, K. Role of anti-inflammatory adipokines in obesity-related diseases / K. Ohashi, R. Shibata, T. Murohara et al. // Trends in Endocrinology & Metabolism. – 2014 . – Режим доступа: doi: 10.1016/j.tem.2014.03.009 162. Özenirler, S. Serum liver fatty acid binding protein shows good correlation with liver histology in NASH / S. Özenirler, C.K. Degertekin, G. Erkan et al. // Hepatogastroenterology. -2013.- Vol.60, №125. – P.1095-1100. 163. Pérez Rodrigo, C. Current mapping of obesity / C.Pérez Rodrigo // Nutrición Hospitalaria. – 2013. - Suppl 5, - P.21-31. 164. Pitocco, D. Oxidative stress in diabetes: implications for vascular and other complications / D. Pitocco, M. Tesauro, R. Alessandro et al. // International Journal of Molecular Sciences. - 2013.- Vol.14, №11. - P.21525-21550. 165. Ranganathan, G. The lipoprotein lipase (LPL) S447X gain of function variant involves increased mRNA translation // Atherosclerosis. – 2012. – Vol.221, №1. – P.143-147. 166. Reed, J.L. Towards multidimensional genome annotation / J.L. Reed, I. Famili, I. Thiele et al. // Nature Reviews Genetics.- 2006. – Vol.7, №2. –P.130-141. 167. Ridker, P.M. Elevation of tumor necrosis factor-alpha and increased risk of recurrent coronary events after myocardial infarction / P.M. Ridker, N. Rifai, M. Pfeffer et al. //Circulation . - 2000.- №101. -P. 2149-2153. 168. Ridker, P.M. Plasma concentration of interleukin-6 and the risk of future myocardial infarction among apparently healthy men / P.M. Ridker, N. Rifai, M.J. Stampfer et al. // Circulation. - 2000. -№101, -P. 1767-1772. 169. Savva , S.C. Predicting cardiometabolic risk: waist-to-height ratio or BMI.A meta-analysis / S.C. Savva, D. Lamnisos, A.G. Kafatos // Journal of Diabetes, Metabolic Syndrome and Obesity. - 2013.- №6. – P.403-419. 170. Schellekens, H. Lean mean fat reducing "ghrelin" machine: hypothalamic ghrelin and ghrelin receptors as therapeutic targets in obesity / H. Schellekens, T.G. Dinan, J.F. Cryan // Neuropharmacology. – 2010. - Vol.58№1. – P.2-16. 123 171. Schwab, U. Effect of the amount and type of dietary fat on cardiometabolic risk factors and risk of developing type 2 diabetes, cardiovascular diseases, and cancer: a systematic review / U. Schwab, L. Lauritzen, T. Tholstrup et al. // Food & Nutrition Research. – 2014. - Vol 58. – Режим доступа: doi: 10.3402/fnr.v58.25145. 172. Seo, J. B. Adipocyte determination- and differentiation-dependent factor 1 sterol regulatory element-bonding protein 1c regulates mouse adiponectin expression / J. B. Seo, H. M. Moon, M.J. Noh et al. // The Journal of Biological Chemistry. 2004.- Vol. 279 – P.22108–221117. 173. Smith, B.W. Nonalcoholic fatty liver disease and diabetes mellitus: Pathogenesis and treatment / B.W. Smith, L.A. Adams // Nature Reviews Endocrinology.-2011.- №7. – P.456–465. 174. Tastny, J. Visfatin and its role in obesity development / J. Tastny // Diabetes & Metabolic Syndrome: Clinical Research & Reviews -2012.–Vol.6,№2. – P.120–124. 175. Targher, G. Prevalence of nonalcoholic fatty liver disease and its association with cardiovascular disease among type 2 diabetic patients / G. Targher, L. Bertolini, R. Padovani et al. // Diabetes Care. - 2007.- №30. – P.1212–1218. 176. Targher, G. Risk of cardiovascular disease in patients with nonalcoholic fatty liver disease / G. Targher, C.P. Day, E. Bonora // The New England Journal of Medicine. -2010.- №363. – P.1341–1350. 177. Tao, Q.Q. Associations between apolipoprotein E genotypes and serum levels of glucose, cholesterol, and triglycerides in a cognitively normal aging Han Chinese population / Q.Q. Tao, Y. Chen, Z.J. Liu et al. // Journal of Clinical Interventions in Aging. – 2014. - №9. – P.1063-1067. 178. Vajro, P. Diagnosis of nonalcoholic fatty liver disease in children and adolescents: Position paper of the espghanhepatology committee / P. Vajro, S. Lenta, P. Socha et al. // Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. - 2012 .- №54. – P.700–713. 179. Withrow, D. The economic burden of obesity worldwide: a systematic review of the direct costs of obesity / D. Withrow, D.A. Alter // Obesity Reviews. -2011. №12(2), - P. 131-141. 124 180. Wong, V.W. Disease progression of non-alcoholic fatty liver disease: A prospective study with paired liver biopsies at 3 years / V.W. Wong, G.L. Wong, P.C. Choi et al. // Gut. - 2010.- № 59. – P.969–974.
