Баланс Тh1/Th2-хелперов, уровень апоптоза при болезни Грейвса – Базедова и аутоиммунной офтальмопатии В последние годы в Республике Беларусь, как и во многих странах, отмечается рост случаев болезни Грейвса – Базедова (БГБ). С данным заболеванием наиболее часто ассоциируется аутоиммунная офтальмопатия (АИО), которая представляет собой органоспецифическое аутоиммунное заболевание, проявляющееся клинически примерно в 50–60 % случаев БГБ [11]. Многие аспекты патогенеза аутоиммунных заболеваний щитовидной железы остаются дискутабельными. Неясны причины развития у ряда пациентов АИО, в то время как у других больных с БГБ отсутствуют проявления офтальмопатии. В последнее время большое внимание уделяется изучению апоптоза с точки зрения влияния его на различные патологические процессы. Роль апоптоза значима в уравновешивании эффекта клеточной пролиферации, дифференцировки, а также элиминации функционально неполноценных иммунокомпетентных клеток. Одним из ведущих механизмов развития аутоиммунных заболеваний щитовидной железы считают нарушение функции рецептора гибели клеток Fas (СД95, APO-1) и его лиганда FasL. Известен тот факт, что, несмотря на экспрессию Fas и FasL, апоптоз тироцитов не характерен для БГБ. Возможно, это обусловлено высоким уровнем антител к рецептору тиротропного гормона при данной патологии и повышенной экспрессией ингибитора апоптоза Bcl-2 [2]. В ряде работ показано, что при БГБ повышен уровень растворимой формы рецептора sFas, обладающей антиапоптоген- Гончарова Н. В., Космачева С. М., Шпак И. Р., Данилова Л. И., Романовский А. А. Научно-практический центр гематологии и трансфузиологии, БелМАПО, Минск ным действием за счет нарушения взаимодействия Fas/FasL. Увеличение sFas может блокировать процесс делеции В-лимфоцитов, что способствует продукции антител к рецептору тироторопного гормона [7]. В то же время лимфоциты, инфильтрирующие щитовидную железу больных с БГБ, усиленно подвергаются процессам апоптоза. В научном мире продолжается дискуссии относительно характера нарушений апоптоза лимфоцитов при БГБ. Существуют данные о снижении экспрессии Fas-рецепторов на поверхности периферических лимфоцитов, в то же время при тяжелых формах БГБ отмечено повышение содержания экспрессирующих Fas CD4+ лимфоцитов [4, 8]. Нарушение механизмов апоптоза приводит к изменению субпопуляционных взаимоотношений регуляторных Т-лимфоцитов, что в свою очередь является патогенетическим механизмом прогрессирования органоспецифической аутоиммунной патологии [1]. В литературе активно обсуждается роль различных Т-хелперных субпопуляций в патогенезе БГБ и АИО. Выделяют Th1-хелперы, продуцирующие INF-γ, TNF-α, IL-2 и Th2-хелперы, вырабатывающие IL-4, IL-10, IL-5, IL-13 [9]. Существующие в литературе данные о преимущественно клеточноопосредованном Th1 или гуморальном Th2 характере иммунных реакций при БГБ и АИО противоречивы [10]. При БГБ регистрируют как Th1 либо Th2, так и смешанные варианты ответа, что определило наш интерес к уточнению данного вопроса. 136 КЛИНИКА Научная публикация ЦЕЛЬ РАБОТЫ Целью настоящей работы явилось исследование апоптоза и субпопуляционных изменений в клеточном звене иммунитета у больных с болезнью Грейвса – Базедова и в сочетании аутоиммунной офтальмопатией на фоне тиростатической терапии. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ На базе отделения эндокринологии 10-й городской клинической больницы г. Минска обследовано 28 больных БГБ. Исследование проводилось в динамике: при поступлении в клинику и через 6 недель после поведенного лечения. Больные были разделены на 2 группы в зависимости от наличия АИО: 10 пациентов с болезнью БГБ и 14 больных БГБ в сочетании с АИО. Средний возраст больных с АИО составил (39,05 ± 3,01) (3 мужчин, 11 женщин), с БГБ – (41,7 ± 4,1) лет (4 мужчин, 6 женщин). Все включенные в исследование больные исходно находились в состоянии тиротоксикоза. Пациентам проводилась тиростатическая терапия препаратами метимазола (тирозол, мерказолил) в дозе 15–30 мг/сут. При сочетании тиротоксикоза с активной АИО (9/14) дополнительно назначались глюкокортикоиды (метилпреднизолон, преднизолон) в дозе 1 мг/ кг через день per os по альтернирующей схеме. Контрольную группу составили 27 здоровых, сопоставимых по полу и возрасту первичных доноров. Набор образцов крови для иммунологических исследований осуществлялся в стерильные «вакутайнеры» с гепарином, для гормональных исследований – в пробирки без консерванта для сыворотки крови. Определяли спонтанный и активированный апоптоз в выделенных на градиенте плотности мононуклеарах периферической крови (МПК), которые культивировали в течение 3 суток в присутствии митогена – фитогемаглютинина (ФГА). Апоптотические клетки детектировали на проточном цитофлуориметре «FACScan» (Becton Dickinson, San Jose, США) с 15 мВт 488 нм аргон-ионным лазером и 585/42 (FL2) дискриминационном фильтром. Данные анализировали после выделения логического гейта бластной популяции в dot/plot распределении клеток «Рецепт» № 4 (60), 2008 по их линейному переднему (FSC) и боковому (SSC) светорассеиванию. Минимум 10 000 клеток анализировалось на пробу. Сбор и анализ данных проводили с помощью программы «LYSIS II software» (Becton Dickinson, США). Субпопуляции Т-хелперов определяли с помощью моноклональных антител (anti-human IL-4 FITC конъюгированный и anti-human INF-γ R-PE-конъюгированный, Sigma) по содержанию внутриклеточных цитокинов в цитоплазме лимфоцитов одновременно с фенотипированием этих клеток. Определение внутриклеточных цитокинов проводили в выделенных на градиенте плотности МПК, культивируемых в среде RPMI1640 (Sigma). МПК стимулировали поликлональными активаторами – ФМА и иономицином в присутствии ингибитора аппарата «Гольджи» – монензина, для накопления внутриклеточных цитокинов. Количество Тh1(CD4+/INF-γ) и Тh2-(CD4+/IL-4)-клеток, содержащих внутриклеточные цитокины, оценивали с помощью проточной цитометрии при окрашивании соответственно антиγIFN или анти-IL-4 моноклональных антител среди CD4+ лимфоцитов. Аналитическую цитометрию проводили на проточном цитофлуориметре FACScan (Becton Dickinson, San Jose, США). Для определения уровней тиротропного гормона (ТТГ) и свободного Т3 (св.Т3) использовали высокочувствительные наборы для иммуноферментного анализа (Abbot, США), свободный Т4 (св.Т4) определяли РИА (Roche, Германия), антитела к тироидной пероксидазе (АТПО) также с использованием ИФА (Abbot, США). Cтатистическую обработку полученных результатов осуществляли с помощью пакета компьютерных программ «SPSS for Windows 13.0». Количественные данные представлены в виде М ± σ. Для сравнения показателей в группах и с контролем применялся непараметрический тест Манна – Уитни, при оценке изменения показателей по сравнению с исходными данными – критерий Уилкоксона. Различия оценивали как статистически достоверные при значениях степени вероятности р < 0,05. 137 Баланс Тh1/Th2-хелперов, уровень апоптоза при болезни Грейвса – Базедова и аутоиммунной офтальмопатии Таблица 1 Показатели тироидного статуса наблюдаемых больных и группы контроля БГБ, n = 10 БГБ+АИО, n = 14 через 6 недель через 6 недель до лечения до лечения лечения лечения 5,6 ± 0,9** 10,3 ± 3,1♦ 5,7 ± 1,2 22,67 ± 4,02♦♦ сТ3 пмоль/л (9,81–36,01) (4,1–11,3) (5,8–34,1) (3,8–14,5) 66,87 ± 11,5♦♦ 26,3 ± 5,2*♦♦ 39,3 ± 8,2♦♦ 22,4 ± 4,6*♦ сТ4 пмоль/л (36,5–100) (18,4–34,6) (13,4–99) (17–36,2) 0,24 ± 0,1♦♦ 0,52 ± 0,21♦♦ 0,79 ± 0,3♦♦ 0,23 ± 0,08♦♦ TТГ мМЕ/л (0–0,618) (0,016–0,71) (0,005–0,88) (0,01–2,2) АТПО 325,49 ± 111,9♦♦ 568,2 ± 46,0♦♦ 950,56 ± 255,6♦♦ 624,1 ± 112,0♦♦ (9–680) (11,2–635) (4,3–2043) (89–1080) мМЕ/мл Показатели Контроль, n = 27 4,6 ± 0,2 14,7 ± 0,34 2,2 ± 0,18 15,2 ± 4,8 П р и м е ч а н и е . * р < 0,05, ** р < 0,001 достоверность различий до и после лечения; ♦ р < 0,05, ♦♦ р < 0,001 достоверность различий с группой контроля. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Данные о состоянии функции ЩЖ и уровнях органоспецифических аутоантител у больных до и после проведенного курса лечения представлены в таблице 1. Пациенты обеих групп не различались статистически значимо по уровню св. Т4, ТТГ, АТПО, хотя при АИО наблюдались более высокие титры антител к ТПО (p > 0,05), св.Т3 был достоверно выше в группе пациентов с БГБ (р < 0,05). Значения тироидных гормонов, органоспецифических антител у наблюдаемых больных с высокой достоверностью превышали контрольные значения (р < 0,001). В динамике отмечено значимое снижение свободных фракций тироидных гормонов в обеих анализируемых группах (р < 0,05, р < 0,001). Дальнейшее исследование включало оценку спонтанного и активированного апоптоза МПК, субпопуляций Т-хелперов, на проточном цитофлуориметре. В таблице 2 приведены показатели спонтанного и активированного апоптоза через 24 и 72 часа культивирования МПК. При исследовании 1-суточного апоптоза выявлено повышение спонтанного апоптоза МПК у больных БГБ (p < 0,05) и низкие значения активированного (p < 0,05) после проведенного курса тиростатической терапии в сравнении с контрольной группой. У больных с АИО наблюдались низкие значения спонтанного апоптоза как исходно, так и после проведенного лечения (p < 0,01). Не выявлено статистически значимых различий исследуемых показателей между анализи- Таблица 2 Показатели апоптоза у больных с БГБ и АИО до и через 6 недель медикаментозной терапии Исследуемые группы БГБ, n = 10 до лечения после лечения БГБ+АИО, до лечения n = 14 после лечения Контроль n=27 1-суточный активированспонтанный ный 4,93 ± 5,67 2,25 ± 3,29♦ 3,03 ± 5,79 0,95 ± 0,09♦ ♦♦ 0,41 ± 0,75 8,07 ± 11,6 1,44 ± 2,85♦♦ 13,8 ± 15,87 1,78 ± 2,11 5,3 ± 3,95 3-суточный активированспонтанный ный 3,5 ± 2,34♦♦ 6,61 ± 4,25♦♦ 1,98 ± 2,11♦♦ 7,04 ± 7,1♦♦ ♦ 3,2 ± 4,28 2,3 ± 2,7♦♦ 8,05 ± 7,37 16,4 ± 14,5*^ 4,8 ± 4,39 14,74 ± 9,33 П р и м е ч а н и е . В сравнении с контролем – ♦p < 0,05; ♦♦p < 0,01; при сравнении БГБ+АИО и БГБ ^ – < 0,05; * – p < 0,05 до и после лечения. 138 КЛИНИКА Научная публикация Таблица 3 Изменение в динамике Т-хелперных субпопуляций в периферической крови у больных БГБ и АИО (в %) Показатели Тh1 (IFN-γ) Th2 (IL-4) Th1/ Th2 До лечения После лечения До лечения После лечения До лечения После лечения БГБ, n = 10 8,54 ± 3,12 10,02 ± 3,1 1,45 ± 0,69♦♦ 5,28 ± 1,5 6,56 ± 1,34♦ 2,63 ± 0,76* БГБ+АИО, n = 14 9,66 ± 3,24 6,12 ± 2,6 4,86 ± 1,93 ^ 1,16 ± 0,36♦ 2,84 ± 0,6♦ 6,71 ± 1,9* Контроль, n = 27 7,61 ± 2,48 2,7 ± 0,83 4,62 ± 1,49 П р и м е ч а н и е . В сравнении с контролем – ♦p < 0,05; ♦♦p < 0,05; при сравнении БГБ+АИО и БГБ ^ – p < 0,05; * – p < 0,05 до и после лечения. руемыми группами, а также после проведенного лечения (p > 0,05). Значительно более информативным является исследование 3-суточного апоптоза. Показатели спонтанного апоптоза у больных с БГБ ((3,5 ± 2,34) %, p < 0,01) и с АИО ((3,2 ± 4,28) %, p < 0,05) достоверно снижены в сравнении с контрольной группой ((4,8 ± 4,39) %). Значения индуцированного ФГА апоптоза МПК в сравнении с контролем также были статистически значимо снижены в обеих исследуемых группах (p < 0,01). После проведенной тиростатической терапии у больных с БГБ показатели апоптоза остались низкими по сравнению с контрольной группой (p < 0,05). В то время как у больных с сочетанной аутоиммунной патологией выявлено усиление спонтанного и статистически значимое повышение активированного апоптоза в сравнении с исходными показателями (p < 0,05). После курса патогенетической терапии показатели активированного апоптоза не отличались от контрольных значений у больных с АИО ((16,4 ± 14,5) %, у доноров (14,74 ± 9,33) %, p > 0,05). Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о снижении апоптоза МПК у больных с БГБ и при ее сочетании с аутоиммунной офтальмопатией. Известно, что наиболее значимой является оценка активированного апоптоза, которому подвергаются лимфоциты при их стимуляции митогенами. Согласно мнению ряда авторов ослабление апоптоза способствует формированию аутоиммунных заболеваний вследствие наруше«Рецепт» № 4 (60), 2008 ния процесса выбраковки клонов лимфоцитов. Снижение апоптоза мононуклеарных клеток способствует персистенции аутореактивных лимфоцитов, что ведет к прогрессированию аутоиммунного процесса. Отсутствие нормализации показателей апоптоза у пациентов с БГБ в нашем исследовании может быть связано с короткой продолжительностью тиростатической терапии. Усиление активированного апоптоза в группе больных с аутоиммунной офтальмопатией вероятно отражает снижение активности процессов аутоагрессии в результате проводимой иммуносупрессорной терапии глкокортикостероидами. Известно, что глюкокортикоиды обладают апоптогенным действием, приводя к индукции клеточной гибели. Следующим этапом нашей работы было исследование субпопуляций Т-хелперов. Динамика Т-хелперов 1 и 2 типа в обеих группах в сравнении с контролем представлена в таблице 3. У больных с БГБ наблюдалось статистически значимое снижение CD4+/IL-4 клеток ((1,45 ± 0,69) %) в сравнении с контрольными значениями ((2,7 ± 0,83) %, p < 0,01). После проведенной тиростатической терапии в течение 6 недель увеличилось содержание CD4+/ INF-γ (p > 0,05), что привело к достоверному снижению соотношения Th1/Th2 (p < 0,05). На момент обследования у больных с АИО отмечено недостоверное увеличение CD4+/IL-4 клеток ((4,86 ± 1,93) %) в сравнении со значениями у доноров ((2,7 ± 0,83) %), в результате 139 Баланс Тh1/Th2-хелперов, уровень апоптоза при болезни Грейвса – Базедова и аутоиммунной офтальмопатии проведенного лечения баланс Th1/Th2 сдвигается в сторону Th1 за счет подавления Th2 ((1,16 ± 0,36) %, p < 0,05 в сравнении с группой контроля). Полученные нами данные свидетельствуют о субпопуляционных сдвигах Т-клеток, нарушении баланса Т-хелперов у больных с БГБ и АИО. При БГБ до лечения баланс Th1/ Th2 смещен в сторону Th1 за счет снижения Th2. Назначение тиростатических препаратов приводит к увеличению Th2 и достоверному снижению Th1/Th2. У больных с АИО в результате лечения наблюдается сдвиг баланса Th1/Th2 в сторону Th1 за счет подавления Th2. Изменения соотношения Т-хелперов, представленные в нашей работе, отмечают и другие исследователи [6]. Antonelli et al. обнаружили смещение баланса Т-хелперов от Th1 к Th2 у гипертироидных больных с БГБ в процессе лечения препаратами метимазола [3]. Согласно данным ряда исследований, Th1 тип иммунных реакций преимущественно встречается на начальных стадиях БГБ и АИО, в то время как гуморальный Th2 тип характерен для более поздних стадий заболевания [5, 12]. ЗАКЛЮЧЕНИЕ У больных с БГБ и при сочетании АИО отмечается снижение как спонтанного, так и индуцированного ФГА апоптоза. После проведенного курса тиростатической терапии при БГБ показатели спонтанного и индуцированного апоптоза остаются достоверно низкими по сравнению с контрольной группой, что свидетельствует о сохраняющемся дисбалансе иммунной системы после кратковременного курса терапии, направленной на нормализацию тироидного статуса. Медикаментозное лечение приводит к статистически значимому усилению индуцированного апоптоза у больных с АИО, что вероятно обусловлено действием глюкокортикостероидных препаратов. При БГБ отмечается сдвиг хелперных субпопуляций в сторону Th1, у больных с аутоиммунной офтальмопатией – сдвиг в сторону Th2. После курса тиростатической у больных БГБ происходит сдвиг баланса Т-хелперов в сторону Th2 за счет увеличения Th2. У больных с АИО сочетанная тиростатическая и глюкокортикостероидная приводит к сдвигу баланса в сторону Th1 за счет подавления Th2. ЛИТЕРАТУРА 1. Кандрор В. И. Аутоиммунные заболевания щитовидной железы и апоптоз / Проблемы эндокринологии. – 2002. – Т. 48, № 1. – С. 45–48. 2. Andrikoula M., Tsatsoulis A. The role of Fas-mediated apoptosis in thyroid disease / Eur.J. Endocrinol. – 2001. – Vol. 144. – P. 561–568. 3. Antonelli A., Rotondi M., Fallahi P. et al. Increase of interferon-γ-inducible CXC chemokine CXCL10 serum levels in patients with active Graves’ disease, and modulation by methimazole therapy / Clin. Endocrinol. – 2006. – Vol. 64. – P. 189–195. 4. Fountoulakis S., Vartholomatos G., Kolaitis N. et al. Differential expression of Fas system apoptotic molecules in peripheral lymphocytes from patients with Graves’ disease and Hashimoto’s thyroiditis / Eur. J. Endocrinol. – 2008. – Vol. 158, № 6. – P. 853–859. 5. Han R., Smith T.J. T helper type 1 and type 2 cytokines exert divergent influence on the induction of prostaglandin E2 and hyaluronan synthesis by interleukin-1beta in orbital fibroblasts: implications for the pathogenesis of thyroid-associated ophthalmopathy / Endocrinology. – 2006. – Vol. 147, № 1. – P. 13–19. 140 КЛИНИКА Научная публикация 6. Inukai Y., Momobayashi A., Sugawara N. et al. Changes in expression of T-helper (Th) 1- and Th2-associated chemokine receptors on peripheral blood lymphocytes and plasma concentrations of their ligands, interferon-inducible protein-10 and thymus and activation-regulated chemokine, after antithyroid drug administration in hyperthyroid patients with Graves’ disease / Eur. J. Endocrinol. – 2007. – Vol. 156. – P. 623–630. 7. Lin J.D. The role of apoptosis in autoimmune thyroid disorders and thyroid cancer / BMJ. – 2001. – Vol. 322. – P. 1525–1527. 8. Maruoka H., Watanabe M., Matsuzuka F. et al. Increased intensities of Fas expression on peripheral T-cell subsets in severe autoimmune thyroid disease / Thyroid. – 2004. – Vol. 14, № 6. – P. 417– 423. 9. Prabhakar B. S. et al. Graves’ disease and Ophthalmopathy // Endocrine Rev. – 2003. – Vol. 24, № 6. – P. 802–835. 10. Weetman A. P. Cellular immune responses in autoimmune thyroid disease // Clin. Endocrinol. (Oxf). – 2004. – Vol. 61, № 4. – P. 405–413. 11. Wiersinda W.M., Bartalena L. Epidemiology and prevention of Graves’ ophthalmopathy // Thyroid. – 2002. – Vol. 12. – P. 855–860. 12. Xia N. et al. CD4+ T cells and the Th1/Th2 imbalance are implicated in the pathogenesis of Graves’ ophthalmopathy / Int. J. Mol. Med. – 2006. – Vol. 17, № 5. – P. 911–916. «Рецепт» № 4 (60), 2008 141