автореферат - институт биологии развития
реклама
На правах рукописи Никишина Юлия Олеговна РОЛЬ ДОФАМИНА МОЗГОВОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ В ЭНДОКРИННОЙ РЕГУЛЯЦИИ ФУНКЦИЙ ГИПОФИЗА В РАЗВИВАЮЩЕМСЯ ОРГАНИЗМЕ 03.03.01 – физиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва 2015 Работа выполнена в лаборатории нервных и нейроэндокринных регуляций федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор, академик РАН Угрюмов Михаил Вениаминович Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Раевский Владимир Вячеславович, заведующий лабораторией нейроонтогенеза федерального государственного бюджетного учреждения науки Института высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН доктор биологических наук, профессор Смирнова Ольга Вячеславовна, заведующий лабораторией эндокринологии кафедры физиологии человека и животных Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова Ведущая организация: федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт физиологии им. И.П. Павлова РАН Защита состоится «____» _______________2015 г. в _____ часов на заседании диссертационного совета Д 002.238.01 в Институте биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН по адресу: 119334, Москва, ул. Вавилова, д. 26. С диссертацией и авторефератом можно ознакомиться в библиотеке и на сайте Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН: http://idbras.ru/. Автореферат разослан «___»_____________ 2015 г. Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук Бойко О.В. 3 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность и современное состояние проблемы Мозг, и в первую очередь гипоталамус, у взрослых животных является центральным звеном системы нейроэндокринной регуляции важнейших функций и поддержания постоянства внутренней среды организма. Особое внимание в литературе уделяется формированию и функционированию нейроэндокринной системы регуляции в онтогенезе, поскольку в процессе развития гипоталамические нейрогормоны и гормоны эндокринных желез контролируют не столько функциональную активность органов-мишеней, сколько их развитие. В последнем случае действие упомянутых сигнальных молекул носит необратимый (импринтинговый, морфогенетический) характер [Gorski, 1988; Lauder, 1993; Ugrumov, 1997]. Согласно сложившейся к концу 80х годов концепции мозг до своего полного созревания, т.е. до формирования межнейрональных синаптических связей и гематоэнцефалического барьера (ГЭБ), не участвует в нейроэндокринной регуляции периферических органов и только после окончательной дифференцировки нейронов и установления синаптической нейротрансмиссии берет под свой контроль гипофиз, а опосредованно через него и все остальные эндокринные железы [Мицкевич, 1978; Dörner, 1981; Fuse, 1996; O'Shaughnessy et al., 1998]. В последние годы представления о роли мозга в нейроэндокринной регуляции в онтогенезе претерпели существенные изменения. Так в нашей лаборатории при анализе данных литературы и результатов собственных исследований было замечено, что нейроны начинают синтезировать и выделять сигнальные молекулы задолго до формирования межнейрональных синаптических связей и ГЭБ [Ugrumov et al., 1989a; Borisova et al., 1991; Ugrumov et al., 1994; Ugrumov, 2010]. Это наблюдение послужило триггером для формулирования гипотезы, согласно которой мозг в онтогенезе до формирования ГЭБ функционирует как эндокринный орган, выделяя в общую систему циркуляции физиологически активные вещества и оказывая, таким образом, влияние на развитие и функционирование периферических и клеток- и органов-мишеней [Угрюмов, 2004, Ugrumov, 2010]. В данной гипотезе можно выделить два основных положения: 1. Мозг является источником сигнальных молекул, содержащихся в общей системе циркуляции, с момента образования нейронов и до окончательного формирования синаптических связей и закрытия ГЭБ. 2. Сигнальные молекулы, секретируемые мозгом в общую систему циркуляции в данный период онтогенеза, способны оказывать прямое парааденогипофизарное эндокринное влияние на периферические органы-мишени. Первое положение гипотезы нашло подтверждение в предыдущих исследованиях нашей лаборатории. На модели обратимого специфического ингибирования синтеза катехоламинов в мозге неонатальных животных 4 [Сайфетярова и др., 2011] были получены прямые доказательства того, что мозг в раннем постнатальном периоде развития до формирования ГЭБ, является источником дофамина, содержащегося в общей системе циркуляции. В ходе проверки справедливости второго положения гипотезы в нашей лаборатории в экспериментах in vitro были получены данные, согласно которым дофамин, поступающий из мозга в общую систему циркуляции, оказывает ингибиторное влияние на выделение ПРЛ лактотрофами гипофиза [Сайфетярова и др. 2012]. В то же время, данные о влиянии сигнальных молекул мозга, в частности, дофамина, поступающих непосредственно из мозга в общую систему циркуляции до закрытия ГЭБ, на длительно протекающие процессы, опосредованные через геном (такие как синтез), до сих пор не были получены. Однако данный вопрос является очень важным на пути доказательства гипотезы авторов. У взрослых животных нейроэндокринная регуляция осуществляется в основном через гипоталамо-гипофизарную портальную систему циркуляции. В перинатальном периоде развития у крыс в отсутствие ГЭБ теоретически регуляция возможна как через портальную, так и через общую систему циркуляции. Однако до сих пор не было получено данных о том, каков вклад в нейроэндокринную регуляцию функционирования и развития периферических органов каждого из путей. Ответ на данный вопрос является принципиально важным не только для доказательства эндокринной функции мозга, но и для понимания развития и функционирования системы нейроэндокринной регуляции в онтогенезе вообще. Цель и задачи исследования Целью данной работы является изучение роли дофамина мозгового происхождения в эндокринной регуляции функций гипофиза в развивающемся организме. Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи: 1. Оценка на модели in vitro (в культуре аденогипофиза) влияния дофамина в концентрации, в которой он содержится в общей системе циркуляции, на синтез пролактина гипофизом у крыс в раннем постнатальном периоде (до формирования ГЭБ). 2. Создание модели хронического специфического выключения синтеза дофамина в мозге у крыс в раннем постнатальном периоде до формирования ГЭБ. 3. Оценка на разработанной модели морфофункционального состояния дофаминергических нейронов тубероинфундибулярной системы мозга. 4. Оценка на разработанной модели эндокринного влияния дофамина мозгового происхождения через общую систему циркуляции на синтез и выделение пролактина лактотрофами гипофиза. 5 Научная новизна полученных результатов Впервые на модели in vitro получено прямое доказательство ингибиторного влияния дофамина в той концентрации, в которой он содержится в общей системе циркуляции неонатальных животных, на синтез пролактина у крыс в неонатальном периоде онтогенеза. Впервые при помощи нейротоксина дофаминергических нейронов 6гидроксидофамина была разработана модель хронического выключения синтеза дофамина в мозге неонатальных крыс. На данной модели впервые удалось ингибировать синтез дофамина во всех основных популяциях дофаминергических нейронов за исключением нейронов медиобазального гипоталамуса. Впервые на разработанной модели получены доказательства того, что в раннем постнатальном периоде дофаминовая регуляция секреции пролактина осуществляется мозгом через общую систему циркуляции. Научная и практическая значимость работы В данной работе впервые получены доказательства прямого эндокринного влияния мозга на функционирование лактотрофов гипофиза в раннем постнатальном периоде онтогенеза до формирования ГЭБ. Полученные результаты опровергают существующую концепцию формирования нейроэндокринной регуляции в онтогенезе и создают основу для принципиального нового понимания роли мозга в нейроэндокринной регуляции развития и функционирования периферических органов-мишеней, в данном исследовании – гипофиза. Они могут быть использованы в курсах и учебниках по физиологии и фундаментальной медицине для студентов. Кроме того, на основе самой концепции о мозге как эндокринном органе и на основе полученных в данной работе результатах, в частности, возможен пересмотр сложившихся представлений о патогенезе различных врожденных заболеваний. Изучение механизмов эндокринного влияния мозга на развитие периферических органов-мишеней до формирования ГЭБ в будущем приведет к качественному изменению подхода к диагностике и лечению различных врожденных заболеваний. 6 Основные положения, выносимые на защиту 1. 2. 3. Разработана экспериментальная модель хронического специфического выключения синтеза дофамина в мозге неонатальных крыс. Синтез дофамина на данной модели был выключен во всех основных популяциях дофаминергических нейронов мозга, за исключением нейронов медиобазального гипоталамуса. Синтез дофамина в периферических органах при этом оставался неизменным. На разработанной модели показано, что в раннем постнатальном периоде до формирования ГЭБ регуляция лактотрофов гипофиза дофамином осуществляется через общую систему циркуляции. На моделях in vivo и in vitro получены доказательства эндокринного влияния мозга на мишени через общую систему циркуляции до закрытия ГЭБ. Личный вклад автора Все эксперименты, описанные в диссертационной работе, были спланированы и выполнены и проанализированы автором. Автор лично участвовал в апробации результатов исследования и подготовке основных публикаций по выполненной работе. Степень достоверности и апробация результатов Основные материалы диссертации были представлены и обсуждены на российских и международных симпозиумах: II Международной междисциплинарной конференции «Современные проблемы системной регуляции физиологических функций» (г. Бодрум, Турция, 22-29 июня 2012 г.); конференциях молодых ученых ИБР РАН (Москва, 29-30 ноября 2012 г., 8-9 декабря 2014 г.); III конференции молодых ученых и студентов «Экспериментальная и прикладная физиология» ФГБУ НИИНФ им. П.К. Анохина РАМН (Москва, 29 ноября 2012 г.); Federation of European Biochemical Societies Congress 2013 “Mechanism in Biology” (Санкт-Петербург, 6-11 июля 2013 г.); XXII Съезде Физиологического общества им. Н.П. Павлова (Волгоград, 16-20 сентября 2013 г.); XXII Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов – 2015» (Москва, 13-17 апреля 2015 г.). 7 Работа была выполнена при поддержке грантов: Российский фонд фундаментальных исследований № 11-04-01840-а (2011-2013гг.); Российский фонд фундаментальных исследований № 14-04-01732-a (2014-2016 гг.); Грант Президента РФ по поддержке ведущих научных школ НШ91.2014.4 (2014-2015гг.); Российский научный фонд № 14-15-01122 (2014-2016гг.); Федеральная целевая программа “Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2014–2020 годы” (уникальный идентификатор проекта RFMEFI60414X0073). Публикации По теме диссертации опубликовано 12 печатных работ, из них статей в журналах, соответствующих перечню ВАК – 4, статей в иностранных рецензируемых журналах – 1, тезисов и материалов конференций – 7 Структура и объем диссертации Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, описания результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов, списка наиболее часто встречающихся сокращений и литературы. Текст диссертации изложен на 104 страницах, содержит 4 таблицы и иллюстрирован 26 рисунками. Список литературы содержит 286 источников. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Животные Работа проводилась на самцах крыс линии Вистар на второй день постнатального периода развития (П2). День рождения крысят считали первым днем постнатального периода развития. Все манипуляции с животными были проведены в соответствии с протоколом, утвержденным комиссией по биоэтике Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН, и находящимся в соответствии с национальными и международными требованиями. 8 Разработка модели хронического выключения синтеза дофамина в мозге неонатальных крыс Системное введение нейротоксина В опыте животным подкожно вводили 100 мкг 6-гидроксидофамина (6ГДА) (Sigma, США) – специфического нейротоксина катехоламинергических нейронов. Для того чтобы вызвать избирательную гибель только ДАергических нейронов и сохранить норадренергические, за 30 минут до введения 6-ГДА подкожно вводили 25 мг/кг десметилимипромина (ДМИ) (Sigma, США) – ингибитора обратного захвата норадреналина, а, следовательно, и 6-ГДА в норадренергические нейроны. Контрольным животным вместо 6-ГДА вводили 0,9% NaCl (Sigma, США). Сбор материала осуществляли через 72 часа после инъекции. Стереотаксическое введение нейротоксина в боковые желудочки мозга Животным в боковые желудочки мозга однократно вводили 100 мкг 6ГДА в 2 мкл 0,9% NaCl с 0,1% аскорбиновой кислотой по координатам 1.2 мм латерально от брегмы, 2.0-2.5 мм вглубь мозга; контрольным животным вводили 2 мкл 0.9% NaCl с 0,1% аскорбиновой кислотой. За 30 минут до стереотаксических инъекций всем животным подкожно вводили 25 мг/кг ДМИ. Сбор материала осуществляли через 72 часа после инъекции. Определение активности тирозигидроксилазы Для определения активности тирозингидроксилазы (ТГ), первого скорость лимитирующего фермента синтеза ДА, через 72 часа после стереотаксической инъекции 6-ГДА и за 30 минут до начала сбора всем животным в опыте и контроле внутрибрюшинно вводили ингибитор декарбоксилазы ароматических аминокислот (ДАА) – 3дигидроксибензилгидразин (NSD-1015, Sigma, США) в концентрации 100 мг/кг веса тела. В собранных образцах активность ТГ оценивали по накоплению дигидроксифенилаланина (L-ДОФА), измеренного с помощью ВЭЖХ. Влияние дофамина на синтез пролактина in vitro Крыс на П2 декапитировали выделяли переднюю долю гипофиза и помещали в лунки 24 луночного планшета со средой (1 мл) DMEM F12 (Sigma, США) - по 3 половинки от двух животных в одну лунку. Ткань культивировали в течение 18-20 часов в СО2 –инкубаторе (5% СО2) при 37 ºС. Все манипуляции проводили в стерильных условиях. Ткань гипофиза инкубировали в течение 8 часов. В опыте каждые 2 часа заменяли среду на свежеприготовленную, содержащую ДА (Sigma, США) в 9 концентрации 1,5 нг/мл. В контроле среду заменяли на свежую без ДА. Для доказательства специфичности действия ДА на гипофиз в среду наряду с ДА добавляли галоперидол, ингибитор рецепторов к ДА (0,1 нМ) (Sigma, США). Взятие и обработка материала При разработке модели хронического выключения синтеза ДА в мозге у крыс после подкожных и стереотаксических инъекций 6-ГДА под наркозом (хлоралгидрат, 400мг/кг) (Sigma, США) собирали кровь из сердца, выделяли мозг (стриатум, медиобазальный гипоталамус, средний мозг и ствол) и периферические органы (почки, ростральную часть двенадцатиперстной кишки и желудок). Плазму крови отделяли от форменных элементов и высокомолекулярных белков и добавляли 250 пмоль/мл внутреннего стандарта 3,4дигидроксибензиламин гидробромида. Перед определением ДА и его метаболитов проводили твердофазную экстракцию на оксиде алюминия. Для определения активности ТГ у крыс после стереотаксической инъекции выделяли медиобазальный гипоталамус и остальную часть мозга. Для оценки количества моно- и биферментных нейронов в аркуатном ядре методом иммуногистохимии мозг фиксировали в 4% параформальдегиде, промывали в фосфатно-солевом буфере, инкубировали в 20%-й сахарозе и замораживали в гексане (Lecbiopharm, Россия). Для определения ПРЛ в плазме крови у животных под наркозом (хлоралгидрат, 400 мг/кг) собирали кровь из сердца, а затем центрифугировали при скорости 7000 об/мин в течение 20 минут при температуре +4°С. В полученном супернатанте определяли ПРЛ методом иммуноферментного анализа. Для определения ПРЛ в ткани гипофизов проводили предварительную экстракцию гормона в 0.05 M карбонатно-бикарбонатном буфере (рН 10.0). Для определения содержания мРНК ПРЛ у крыс после стереотаксических инъекций выделяли переднюю долю гипофиза. На пробу приходился материал от трех животных. Высокоэффективная жидкостная хроматография Измерение катехоламинов проводили при помощи обратно-фазной высокоэффективной жидкостной хроматографии с электрохимической детекцией (Amperometric detector LC 4B, Bioanalytical Systems, США) при потенциале 850 мВ. Разделение производили на 10-ти сантиметровой колонке с внутренним диаметром 4 мм и наполнителем С-18, 3.3 мкм (Dr. Maisch GmbH, Германия). Содержание рассчитывали методом внутреннего стандарта с помощью программы “Мультихром” (Россия). 10 Иммуногистохимия ТГ и ДАА выявляли на срезах медиобазального гипоталамуса толщиной 20 мкм, приготовленных на криостате и монтированных на стекла. В работе использовали овечьи поликлональные антитела к ТГ (1:700) (Chemicon, США), поликлональные антитела к ДАА (1:300) (Abcam, США), вторые антитела, меченные флуоресцеинизотиоционатом (FITC) (1:40) (Sigma, США) и вторые антитела, меченные цианином (Су3) (1:500) (Sigma, США). Препараты просматривали на флуоресцентном микроскопе Zeiss Observer Z1. Иммуноферментный анализ Измерение ПРЛ в ткани передней доли гипофиза, образцах плазмы и инкубационной среды проводили с помощью метода иммуноферментного анализа, c использованием коммерческих наборов SPIbio-Rat Prolactin EIA Kit (Bertin Pharma, France). Выделение РНК и обратная транскрипция Выделение тотальной РНК проводили с применением TRI Reagent (Sigma, США). Для удаления примеси геномной ДНК выделенную РНК обрабатывали ДНКазой (Fermentas, США). РНК переосаждали в 4М LiCl, концентрацию обработанной РНК измеряли на спектрофотометре Nanodrop 8000 (Thermo Scientific, США). Синтез кДНК проводили с использованием обратной транскриптазы M-MLV и рандомных гексануклеотидов (Fermentas, США). ПЦР в реальном времени ПЦР в реальном времени проводили на автоматическом амплификаторе 7500 Real-Time PCR System (Applied Biosystems, США) с использованием смеси qPCRmix-HS SYBR+ROX (Fermentas, США) и специфических олигонуклеотидов (Литех, Россия). Расчет относительной экспрессии гена проводили методом ΔΔCt с учетом эффективности ПЦР [Bookout et al., 2005]. Эффективность ПЦР определяли методом построения стандартных кривых [Bookout et al., 2005]. 11 Статистическая обработка результатов Статистическую обработку данных выполняли в среде интегрированных программ GraphPad Prism Version 6.0 для Windows (GraphPad Software, США). Данные представлены в виде: среднее арифметическое ± средняя ошибка среднего арифметического (M±m). Для определения статистической значимости полученных результатов были использованы параметрический tкритерий Стьюдента (t-тест) и непараметрический U-критерий Манна-Уитни (U- тест). РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Влияние дофамина на синтез пролактина гипофизом неонатальных крыс in vitro При решении первой задачи для нас принципиально важно было определить, обладает ли ДА именно в той физиологически активной концентрации, в которой он содержится в периферической крови у неонатальных крыс, ингибирующим влиянием на синтез ПРЛ. Для того чтобы ответить на этот вопрос, были проведены эксперименты in vitro на органотипической культуре передней доли гипофиза неонатальных крыс. В проведенных нами ранее экспериментах было показано, что концентрация ДА, поступающего из мозга в общую систему циркуляции, в плазме крови 3-дневных крыс составляет 1,5 нг/мл (Сайфетярова и др. 2011). Именно в этой концентрации добавляли ДА в культуру передней доли гипофиза в данной работе. Через два часа после начала инкубации органотипической культуры гипофизов с ДА в концентрации 1,5 нг/мл наблюдалось достоверное снижение концентрации ПРЛ в инкубационной среде (рисунок 1А). Полученные на новой модели данные подтверждают, что ДА в той концентрации, в которой он содержится в периферической крови неонатальных крыс, оказывает влияние на выделение ПРЛ лактотрофами гипофиза. Через восемь часов после начала инкубации гипофизов двухдневных крыс в культуральной среде, содержащей ДА, суммарное содержание ПРЛ в ткани гипофиза и в среде достоверно уменьшалось по сравнению с контролем, что является доказательством ингибирующего влияния ДА на синтез ПРЛ (рисунок 1Б). Для оценки специфичности действия ДА на секрецию ПРЛ, т.е. через рецепторы к ДА, нами был поставлен дополнительный контроль, когда наряду с инкубацией гипофизов неонатальных и взрослых животных при добавлении ДА в среду также вводили ингибитор ДА рецепторов галоперидол. Как и ожидалось, введение галоперидола снимало ингибирующее влияние ДА на секрецию ПРЛ (рисунок 1). 12 А 250 Пролактин, % # 200 150 * * контроль ДА ДА+галоперидол # # 100 # 50 * * 0 2 часа 4 часа 6 часов 8 часов Б 250 Пролактин, % * 200 150 # контроль ДА ДА+галоперидол 100 50 0 * - достоверные различия между контролем и средой с дофамином (p<0.05; U-тест) # - достоверные различия между средой с дофамином и средой с дофамином и галоперидолом (p<0.05; U-тест) Рисунок 1 - Концентрация пролактина в культуральной среде (А) и суммарное содержание пролактина в ткани гипофиза и среде (Б) через 8 часов инкубации с 1,5 нг/мл дофамина, либо с 1,5 нг/мл дофамина и 0,1 нМ галоперидола; в контроле гипофизы инкубировали в среде без дофамина Несмотря на то, что полученные нами данные о влиянии ДА на синтез ПРЛ являются достаточно убедительными, исследования in vitro, как правило, не дают полной картины физиологических процессов, протекающих в организме. Лактотрофы в условиях in vivo находятся под постоянным тоническим воздействием ДА, при этом в условиях in vitro клетки гипофиза долгое время содержатся в среде без ДА. Поэтому для нас очень важно было получить доказательства влияния ДА, поступающего из мозга в общую систему циркуляции на синтез ПРЛ на модели in vivo. Мы предположили, что данную проблему возможно решить с помощью модели длительного специфического выключения синтеза ДА в мозге крыс до 13 формирования ГЭБ. Поэтому второй задачей данной работы была разработка такой модели. Разработка модели хронического выключения синтеза дофамина в мозге неонатальных крыс При разработке модели хронического специфического выключения синтеза ДА в мозге неонатальных крыс использовали крыс линии Вистар на П2, у которых ГЭБ для ДА еще открыт. Разрабатываемая модель должна была удовлетворять следующим требованиям: синтез ДА должен быть выключен в течение длительного времени (как минимум нескольких суток), причем только в мозге, не затрагивая при этом синтез ДА в периферических органах. Для того чтобы выключить синтез ДА в мозге на длительный промежуток времени, мы использовали нейротоксин катехоламинергических нейронов 6гидроксидофамин. 6-ГДА вызывает гибель не только ДА-ергических, но и норадренергических нейронов, поэтому необходимо было «защитить» норадренергические нейроны от действия токсина. Для этого за 30 минут до введения 6-ГДА подкожно вводили ДМИ – ингибитор обратного захвата норадреналина и 6-ГДА в норадренергические нейроны. Для того, чтобы выключить синтез ДА только в мозге, не затрагивая при этом периферические органы, нейротоксин вводили стереотаксически в боковые желудочки мозга. Однако в отсутствие ГЭБ при внутрижелудочковом введении нельзя было исключить диффузию нейротоксина в кровь, и, как следствие, его действие на дофамин-синтезирующие клетки в периферических органах. Поэтому в первую очередь необходимо было подобрать такую дозу 6ГДА, которая бы максимально снижала содержание ДА в мозге, не влияя при этом на его содержание в периферических ДА-синтезирующих органах. В первой серии экспериментов мы проводили подбор максимальной дозы нейротоксина, которая бы при системном введении и поступлении в кровь не влияла на уровень синтеза ДА ни в мозге, ни в периферических органах. Мы предположили, что в дальнейшем при введении данной дозы токсина в боковые желудочки мозга мы получим эффект в мозге, при отсутствии влияния на периферию. На основании литературных данных на первом этапе для подкожного введения нами была выбрана доза 6-ГДА 100 мкг, которая вызывает значительную гибель ДА-ергических нейронов при введении в мозг [Yokoyama et al., 1992]. Было показано, что при подкожном введении 100 мкг 6-ГДА не происходило изменения концентрации ДА и норадреналина, ни в периферических источниках, ни в одной из изученных областей мозга, ни в плазме крови по сравнению с контролем (рисунок 2). Совокупность этих данных дала возможность использовать данную дозу для дальнейшего введения в мозг. 14 А Дофамин, нг/г 1600 1200 800 400 0 стр. гип. ср. мозг ДМИ+0.9% NaCl ДМИ+6-ГДА Б 60 2 Дофамин, нг/мл Дофамин, нг/г ствол 40 20 В 1,5 1 0,5 0 почки желудок 12пк 0 плазма ДМИ – десметилимипромин; 6-ГДА – 6-гидроксидофамин; стр. – стриатум; гип. – гипоталамус; ср. мозг – средний мозг; 12пк – двенадцатиперстная кишка Рисунок 2 - Концентрация дофамина в различных областях мозга (А), периферических органах (Б) и плазме крови (В) через 72 часа после подкожного введения 25 мг/кг ДМИ и 100 мкг 6-ГДА; в контроле вводили 25 мг/кг ДМИ и 0,9% NaCl При стереотаксическом введении 100 мкг 6-ГДА в боковые желудочки концентрацию ДА определяли в целом мозге, чтобы сопоставить изменения концентраций ДА в мозге и плазме крови. Через 72 часа после введения 6-ГДА было показано снижение концентрации ДА в мозге на 54 %. При этом в плазме крови наблюдалось резкое (на 73%) снижение уровня ДА. При этом в почках, желудке, двенадцатиперстной кишке и надпочечниках после введения нейротоксина не произошло достоверных изменений концентрации ДА (рисунок 3). 15 А 400 300 Б 2 Дофамин, нг/мл Дофамин, нг/г 500 * 200 100 1,5 1 * 0,5 0 0 плазма ДМИ+6-ГДА ДМИ+0.9% NaCl В 70 60 50 40 30 20 10 0 Дофамин, мкг/г Дофамин, нг/г мозг почки желудок 12пк 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 Г надпочечники ДМИ – десметилимипромин; 6-ГДА – 6-гидроксидофамин; 12пк – двенадцатиперстная кишка * - Достоверные различия между контролем и опытом (p<0.05, Т-тест) Рисунок 3 - Концентрация дофамина в мозге (А), плазме крови (Б) и периферических органах (В, Г) через 72 часа после стереотаксического введения 100 мкг 6-ГДА в боковые желудочки мозга на фоне подкожного введения 25 мг/кг ДМИ; в контроле вводили 25 мг/кг ДМИ и 0,9% NaCl Оценка морфофункционального состояния тубероинфундибулярной системы гипоталамуса при моделировании хронического выключения синтеза дофамина в мозге неонатальных крыс В отличие от взрослых животных, у которых ДА, поступающий из гипоталамуса к гипофизу, регулирует функционирование периферических мишеней только через портальную систему циркуляции, у неонатальных животных, согласно нашей гипотезе, ДА в отсутствие ГЭБ может так же поступать из всех популяций нейронов непосредственно в общую систему циркуляции. Ранее нам не удавалось разобщить эти два пути эндокринной регуляции у неонатальных животных. В ряде исследований было показано, что ДА-ергические нейроны тубероинфундибулярной системы, которые осуществляют нейроэндокринный контроль секреции пролактина у взрослых животных, имеют низкую 16 чувствительность к различным нейротоксинам, в том числе и к 6-ГДА, по сравнению с другими ДА-ергическими нейронами мозга. Это связано с тем, что в нейронах данной области очень низкий уровень экспрессии мембранного транспортера дофамина, с помощью которого нейротоксин попадает в клетку. Поэтому можно ожидать, что при введении в мозг он вызовет дегенерацию ДАергических нейронов, расположенных в основном за пределами тубероинфундибулярной системы. В связи с этим данную модель, вероятно, можно использовать для дифференциальной оценки влияния ДА, поступающего к гипофизу через общую и портальную системы циркуляции, на секрецию ПРЛ лактотрофами у неонатальных животных. Для того чтобы оценить, влияет ли нейротоксин на ДА-синтезирующие нейроны аркуатного ядра, мы в первую очередь оценили содержание ДА и его метаболитов в данной области после внутрижелудочкового введения 6-ГДА. Было показано, что на разработанной модели уровень ДА в медиабазальном гипоталамусе не меняется по сравнению с контролем, в то время как в стриатуме, среднем мозге и стволе наблюдается его значительное снижение (рисунок 4). Эти данные можно рассматривать как интегральный показатель того, что секреторная активность гипоталамуса не меняется под действием токсина. ДМИ+0.9% NaCl 1600 ДМИ+6-ГДА Дофамин, нг/г 1200 800 * 400 * * * 0 Стриатум Средний мозг Гипоталамус ствол ост. часть мозга ДМИ – десметилимипромин; 6-ГДА – 6-гидроксидофамин * - Достоверные различия между контролем и опытом (p<0.05, Т-тест) Рисунок 4 - Концентрация дофамина в различных областях мозга через 72 часа после стереотаксического введения 100 мкг 6-ГДА в боковые желудочки мозга на фоне подкожного введения 25 мг/кг ДМИ; в контроле вводили 25 мг/кг ДМИ и 0.9% NaCl В качестве прямого показателя синтеза ДА на разработанной модели мы оценивали активность тирозингидроксилазы, скорость лимитирующего 17 фермента синтеза ДА, путем определения накопления L-ДОФА в медиобазальном гипоталамусе после ингибирования второго фермента синтеза ДА – ДАА. Оказалось, что уровень L-ДОФА в данной области не менялся по сравнению с контролем, то есть активность ТГ не меняется под действием нейротоксина. В то же время, в остальной части мозга концентрация L-ДОФА, а, следовательно, суммарная активность ТГ, снижалась в 2 раза по сравнению с контролем (рисунок 5). ДМИ+0.9% NaCl ДМИ+6-ГДА 300 L-ДОФА, нг/г 250 200 150 100 50 ** 0 гипоталамус ост. часть мозга ДМИ – десметилимипромин; 6-ГДА – 6-гидроксидофамин * - Достоверные различия между контролем и опытом (p<0.05, Т-тест) Рисунок 5 - Активность тирозингидроксилазы, оцениваемая по накоплению дигидроксифенилаланина (L-ДОФА) через 30 минут после введения м-гидроксибензилгидразина –ингибитора декарбоксилазы ароматических аминокислот, в гипоталамусе и остальной части мозга на модели хронического ингибирования синтеза дофамина в мозге с помощью 6-ГДА При оценке степени деградации нейронов мозга под действием 6-ГДА в основном используют метод иммуномечения по ТГ. Однако известно, что помимо истинно ДА-ергических нейронов, экспрессирующих оба фермента синтеза ДА, существуют также нейроны, содержащие по одному из ферментов. В нашей лаборатории ранее было показано, что в аркуатном ядре у крыс в перинатальном периоде развития число моноферментных нейронов значительно превышает число биферментных. При этом моноферментные нейроны способны осуществлять совместный синтез ДА [Ershov et al., 2002; Ugrumov et al., 2004]. В связи с этим в данной работе на модели дефицита ДА мы оценивали количество нейронов в аркуатном ядре с помощью двойного иммуномечения по ТГ и ДАА. Было показано, что на разработанной модели количество биферментных, моноферментных ТГ-содержащих и моноферментных ДАА-содержащих нейронов не менялось по сравнению с контролем (рисунок 6, 7). 18 А 20 µm А' 20 µm А'' Б 20 µm Б' 20 µm Б'' 20 µm 20 µm Рисунок 6 - Флуоресцентная микроскопия. Изображения нейронов аркуатного ядра, меченных по тирозингидроксилазе (А,Б), декарбоксилазе ароматических аминокислот (А', Б') и совмещенное изображение (А'', Б'') в контроле (А, А', А'') и после стереотаксического введения 6-ГДА (Б, Б', Б''). Стрелками отмечены нейроны разного фенотипа Таким образом, на разработанной модели мы получили доказательство того, что специфическое выключение синтеза ДА в мозге с помощью нейротоксина 6-ГДА не меняет морфофункциональное состояние тубероинфундибулярной системы гипоталамуса. Это означает, что если на данной модели будут наблюдаться изменения в синтезе ПРЛ, то они будут обусловлены влиянием ДА исключительно через общую систему циркуляции. . 19 ДМИ+0.9% NaCl ДМИ+6-ГДА 1200 Число нейронов на аркуатное ядро 1000 800 600 400 200 0 ТГ+ДАА- ТГ-ДАА+ ТГ+ДАА+ ДМИ – десметилимипромин; 6-ГДА – 6-гидроксидофамин Рисунок 7 - Количество моноферментных ТГ+ДАА-, моноферментных ТГ-ДАА+ и биферментных ТГ+ДАА+ нейронов в аркуатном ядре через 72 часа после введения 100 мкг 6-ГДА в боковые желудочки мозга на фоне системного введения 25 мг/кг ДМИ; в контроле вводили 25 мг/кг ДМИ и 0,9% NaCl Определение влияния дофамина, поступающего из мозга в общую систему циркуляции, на синтез пролактина in vivo Считается, что для характеристики процесса синтеза белковой молекулы необходимой и достаточной является оценка двух показателей: мРНК, как показатель, характеризующий транскрипцию, и сам белок, как показатель, характеризующий трансляцию. Было показано, что при снижении уровня ДА в общей системе циркуляции на 73% концентрация ПРЛ в плазме увеличилась на 70%. Столь значительное увеличение концентрации ПРЛ в плазме в ответ на снижение концентрации ДА говорит о том, что в данный период онтогенеза (первая неделя постнатального развития) лактотрофы гипофиза уже находятся под стойким ингибиторным контролем ДА, причем скорее всего данное влияние оказывается именно через общую, а не через портальную систему циркуляции. В гипофизе концентрация ПРЛ увеличилась на 48%, при этом уровень экспрессии мРНК ПРЛ возрастал в гипофизе в 2,5 раза у опытных животных по сравнению с контрольными (рисунок 7). 20 ДМИ+0.9% NaCl ДМИ+6-ГДА А 300 * * 160 120 80 40 мРНК пролактина, % от контроля Концентрация пролактина, % от контроля 200 Б 0 * 250 200 150 100 50 0 плазма гипофиз гипофиз ДМИ – десметилимипромин; 6-ГДА – 6-гидроксидофамин * - Достоверные различия между контролем и опытом (p<0.05, U-тест) Рисунок 8 - Концентрация пролактина в плазме крови и гипофизе (А) и содержание мРНК пролактина в гипофизе (Б) через 72 часа после введения 100 мкг 6-ГДА в боковые желудочки мозга на фоне системного введения 25 мг/кг ДМИ; в контроле вводили 25 мг/кг ДМИ и 0,9% NaCl ЗАКЛЮЧЕНИЕ Таким образом, в данной работе нам удалось показать, что в раннем постнатальном периоде до закрытия ГЭБ ДА, выделяемый мозгом в общую систему циркуляции, оказывает прямое эндокринное ингибирующее влияние на синтез и выделение ПРЛ лактотрофами гипофиза. Согласно нашей концепции об эндокринной функции мозга до формирования ГЭБ, в раннем постнатальном периоде могут быть возможны два пути дофаминовой регуляции секреции ПРЛ гипофизом: сначала всеми популяциями ДА-ергических нейронов мозга через общую систему циркуляции, а затем нейронами тубероинфундибулярной системы через портальную систему циркуляции. На основании полученных данных можно предположить, что на протяжении всего периода функционирования мозга как эндокринного органа (с момента образования нейронов и до закрытия ГЭБ) регуляция функционирования лактотрофов гипофиза через общую систему циркуляции вносит существенный вклад в регуляцию секреции ПРЛ. В связи с этим мы можем предполагать, что, скорее всего, в процессе онтогенетического развития организма происходит постепенная качественная смена механизмов нейроэндокринной регуляции. Кроме того, так как рецепторы к ДА в онтогенезе появляются достаточно рано не только в гипофизе, но в других периферических органах (например, в почках и мезентерических органах), можно ожидать, что эндокринное влияние ДА 21 распространяется и на другие периферические органы. Однако все высказанные предположения требуют дальнейшего изучения. ВЫВОДЫ 1. Впервые разработана экспериментальная модель хронического выключения синтеза дофамина в мозге неонатальных крыс до формирования гематоэнцефалического барьера. На данной модели впервые удалось ингибировать синтез дофамина во всех основных популяциях дофаминергических нейронов за исключением нейронов медиобазального гипоталамуса. 2. На разработанной модели были получены доказательства того, что в раннем постнатальном периоде нейроэндокринная регуляция функционирования лактотрофов гипофиза через общую систему циркуляции вносит существенный вклад в регуляцию секреции пролактина. 3. На примере лактротрофов гипофиза в экспериментах in vivo и in vitro получены прямые доказательства эндокринного влияния мозга до закрытия гематоэнцефалического барьера на функционирование периферических органов-мишеней. 4. Полученные данные подтверждают гипотезу о том, что мозг в онтогенезе до формирования гематоэнцефалического барьера играет роль эндокринного органа и оказывает, таким образом, влияние на развитие и функционирование периферических органов-мишеней. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи в рецензируемых научных журналах 1. Зубова Ю.О. Хроническое выключение синтеза дофамина в мозге у неонатальных крыс как доказательство эндокринной функции мозга в онтогенезе / Ю.О. Зубова, Ю.Ю. Сайфетярова, А.Я. Сапронова, М.В. Угрюмов // ДАН – 2014. - Т. 454 - № 4. - С. 481-484. 2. Zubova Yu. Brain as an endocrine source of circulating 5-hydroxytryptamine in ontogenesis in rats / Yu. Zubova, D. Nasyrova, A. Sapronova, M. Ugrumov // Mol. Cell. Endocrinol. – 2014. - V. 393. - P. 92-98. 3. Зубова Ю.О. Моделирование хронического избирательного выключения синтеза норадреналина в головном мозге неонатальных крыс / Ю.О. Зубова, Н.С. Бондаренко, А.Я. Сапронова, М.В. Угрюмов. // Доклады Академии Наук – 2015. - Т. 461 - № 5. - С. 608-611. 4. Зубова Ю.О. Секреция норадреналина из мозга в общую систему циркуляции в онтогенезе у крыс / Ю.О. Зубова, Н.С. Бондаренко, А.Я. Сапронова, М.В. Угрюмов. // Нейрохимия – 2015. - Т. 32. - № 2. - С. 116122. 22 5. Бондаренко Н.С. Роль аденогипофизотропных нейрогормонов в эндокринной парааденогипофизарной регуляции периферических органов-мишеней в онтогенезе у крыс / Н.С. Бондаренко, Ю.О. Зубова, А.Я. Сапронова, Е.В. Волина, М.В. Угрюмов.// Бюл. эксп. биол. мед. – 2015. - Т. 159 № 3. - С. 268-272. Публикации в материалах научных мероприятий 1. Зубова Ю.О., Сайфетярова Ю.Ю. «Влияние дофамина мозгового происхождения, содержащегося в периферической крови у неонатальных крыс, на секрецию пролактина лактотрофами гипофиза» Вторая Международная междисциплинарная конференция «Современные проблемы системной регуляции физиологических функций» г. Бодрум (Турция), 22-29 июня 2012 года. 2. Зубова Ю.О., Угрюмов М.В., Сапронова А.Я.Создание хронической модели выключения синтеза дофамина вмозгу у крыс в перинатальном периоде развитияю. Тезисы доклада на III конференции молодых ученых и студентов «Экспериментальная и прикладная физиология» ФГБУ НИИНФ им. П.К. Анохина РАМН. г. Москва. 2012. с. 17. 3. Ю.О. Зубова. Влияние длительного фармакологического выключения синтеза дофамина в мозгу неонатальных крыс на уровень дофамина в плазме крови и секрецию пролактина гипофизом. Тезисы докладов конференции молодых ученых института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН (29-30 ноября 2012г.). Онтогенез. т. 44(4). с. 226. 2013 4. Yu.Zubova, A. Sapronova and M. Ugrumov. Developing brain as an endocrine organ: secretion and endocrine action of dopamine. 38th Congress FEBS. The Journal FEBS. St. Petersburg. July 6-11, 2013. P. 194. 5. Ю.О. Зубова, Ю.Ю. Сайфетярова, А.Я. Сапронова, М.В. Угрюмов. Развивающийся мозг как источник катехоламинов, участвующих в эндокринной регуляции целостного организма. Тезисы доклада на XXII Съезде Физиологического общества им. И.П. Павлова. Волгоград. 16-20 сентября 2013. С. 190-191. СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 6-ГДА – 6-гидроксидофамин; L-ДОФА – L-диоксифенилаланин; ВЭЖХ – высокоэффективная жидкостная хроматография; ГЭБ – гематоэнцефалический барьер; ДА – дофамин; ДАА-декарбоксилаза ароматических аминокислот; ДМИ-десметилимипромин; П – постнатальный день развития; ПРЛ – пролактин; ТГ- тирозингидроксилаза.
