hCalcitonin IRMA kit

RK-83CT_CE150201
125
НАБОР чКальцитонин [
IRMA
I]
(Номер по каталогу: RK-83CT)
125
I-чКальцитонин
IRMA
Система
позволяет
проводить
прямое
количественное
определение
человеческого
кальцитонина
(чКальцитонин) in vitro в сыворотке крови
человека. Количественное определение
кальцитонина может проводиться в
диапазоне 0-2000 пг/мл, при этом
используются образцы сыворотки объемом
100 мкл. Содержимого каждого набора
достаточно для проведения 100 процедур
количественного
определения,
что
позволяет построить одну стандартную
кривую и провести анализ 42 неизвестных
и 2 контрольных образцов дважды.
Введение
Кальцитонин (молекулярная масса 3,4 кДа)
секретируется парафолликулярными Склетками щитовидной железы. Гормон
состоит из 32 аминокислотных остатков.
Кальцитонин
оказывает
свое
биологическое
действие
за
счет
воздействия на органы-мишени: кости,
почки и желудочно-кишечный тракт.
Физиологическая роль кальцитонина в
костном метаболизме не до конца известна
и
является
предметом
изучения.
Установлено, что значительное повышение
уровня кальцитонина характерно для Склеточной
гиперплазии
щитовидной
железы и медуллярного рака щитовидной
железы (МРЩЖ). МРЩЖ составляет
5-10% от всех случаев рака щитовидной
железы. Существует две формы МРЩЖ:
наследственная и спорадическая. Набор
Кальцитонин IRMA рекомендуется для
диагностики и мониторинга МРЩЖ, а
также для диагностики доклинических
случаев наследственной формы МРЩЖ.
Концентрация кальцитонина в крови очень
низкая, нормальные значения для мужчин
составляют 15 пг/мл, для женщин –
10 пг/мл.
Возможна ложная кальцитонино-подобная
иммунореактивность,
обусловленная
различными
кальцитонин-связанными
веществами,
включая
мономерные,
димерные и полимерные формы, а также
фрагменты и предшественники самого
гормона.
Принцип метода
Технология, применяемая в системе
иммуно-радиометрического
количественного определения (IRMA),
предполагает
использование
двух
высокоафинных моноклональных антител.
Сигнальное антитело, меченое 125I,
связывается
с
эпитопом
молекулы
кальцитонина, которая отличается от
молекулы, которая распознается биотинзахватывающим антителом. Два антитела
одновременно реагируют с антигеном,
который присутствует в стандарте или в
образце, что приводит к образованию
комплекса иммобилизированное антитело
– антиген – сигнальное антитело, также
известного как «сэндвич».
В
течение
периода
инкубации
продолжительностью более 12 часов
иммуно-комплекс иммобилизируется на
реактивной
поверхности
пробирок,
покрытых
стрептавидином.
Затем
реакционную смесь извлекают, пробирки
тщательно промывают и производят замер
их радиоактивности в гамма-счетчике.
Концентрация
антигена
прямо
пропорциональна
радиоактивности,
измеренной в пробирках.
Путем
построения калибровочной кривой, в
которой отражаются полученные значения
в сравнении с серией калибраторов,
содержащих
известное
количество
чКальцитонина, может быть определена
искомая концентрация чКальцитонина в
образцах пациента.
Содержание набора
1. 1 флакон МЕТКИ, готовой к
использованию,
флакон
11
мл,
содержащий <740 кБк 125I-сигнальное и
биотин-связанное антитело в буфере с
красным красителем 0.1 % NaN3.
2. 6 флаконов СТАНДАРТОВ, (6 x 1ml)
лиофилизированных в сыворотке лошадей
с 0.1% NaN3. Точная концентрация указана
на каждом флаконе (откалиброваны в
соответствии со 2 Международным
стандартом, код 89/620.). См.
Приготовление реактивов.
3. 2 флакона
КОНТРОЛЬНОЙ
СЫВОРОТКИ, низкой (CI) и высокой
(CII).
Лиофилизированная
сыворотка
крови
человека
с
0,1%
NaN3.
Концентрация контрольной сыворотки
указана в прилагаемом сертификате
качества. См. Приготовление реактивов.
4. 1 флакон РАСТВОРА ДЛЯ
РАЗВЕДЕНИЯ СЫВОРОТКИ, готовый к
использованию 2.0 мл на флакон,
содержит сыворотку лошадей с 0,1% NaN3.
5. 2 упаковки ПРОБИРОК С
ПОКРЫТИЕМ, готовые к использованию.
2x50 пробирки, 12 x 75 мм, упакованные в
пластиковые коробки.
6. 1 флакон КОНЦЕНТРАТА
ПРОМЫВОЧНОГО БУФЕРА (20 мл),
содержащего 0,2% NaN3. Смотрите
«Приготовление реактивов».
Сертификат качества
Листок-вкладыш.
Необходимые материалы,
инструменты и оборудование
общее лабораторное оборудование
высокоточные пипетки 100 мкл
многоразовые пипетки 100 мкл
многоразовые пипетки 2000 мкл или
лиспенсер
полимерная
пленка
для
покрытия
пробирок
абсорбирующая ткань
гамма-счетчик
Сбор и хранение образцов
Образцы
сыворотки
могут
быть
подготовлены в соответствии с общей
процедурой, которая обычно используется
в клинической лабораторной практике.
Образцы могут храниться при температуре
2-8°C, если исследование проводится в
течение 24 часов, иначе аликвоты следует
готовить и хранить в условиях глубокой
заморозки (-20°C). Перед анализом
замороженные
образцы
следует
разморозить и тщательно перемешать.
Приготовление реактивов,
хранение
Для получения 720 мл промывочного
раствора добавьте 20 мл концентрата
промывочного
буфера
к
700
мл
дистиллированной воды. Приготовленный
раствор хранить при температуре 2-8°C до
окончания срока годности набора.
Добавьте
к
лиофилизированным
стандартам и контрольной сыворотке
1000
мкл
дистиллированной
воды
Аккуратно перемешайте встряхиванием
или взбалтыванием (следует избегать
образования пены).
Убедитесь,
что
достигнуто
полное
растворение
и
дайте
раствору
уравновеситься
при
комнатной
температуре в течение 20 минут. Хранить
компоненты при температуре -20°C до
окончания срока годности набора.
Открытые образцы следует хранить при
температуре
2-8°C.
При
данной
температуре все реактивы стабильны до
истечения срока годности набора.
Процедура
определения
количественного
(Краткое описание см. в Таблице 1.)
1.
Перед использованием уравновесьте
реактивы и образцы до комнатной
температуры.
2. Промаркируйте
два
экземпляра
пробирок с покрытием для каждого из
стандартов
(S0-S5),
контрольной
сыворотки (CI, CII) и образцов.
3. Гомогенизируйте все реактивы и
образцы, аккуратно перемешав их,
избегая вспенивания.
4.
Внесите пипеткой по 100 мкл
стандартов, контроля и образцов в
соответствующим
образом
промаркированные пробирки. Для
фиксации пробирок используйте
штатив. Не дотрагивайтесь или не
царапайте внутреннюю поверхность
пробирок наконечником пипетки.
5.
С помощью пипетки поместите в
каждую из пробирок 100 мкл метки.
6.
Аккуратно
перемешайте
все
пробирки. Закройте все пробирки
полимерной пленкой.
7.
Инкубируйте пробирки в течение 1624 часов в комнатной температуре.
8.
Добавьте в каждую пробирку по 2.0
мл разбавленного промывочного
буфера. Слейте супернатант из всех
пробирок путем переворачивания
штатива. Поместите штатив в
10.
11.
Таблица 1. Протокол количественного
определения, методика введения (все объемы
указаны в микролитрах)
Пробирки
всего
Стандарт
100
Образец
Контроль
Стандарт
Образец
100
Контроль
100
Метка
100
100
100
100
Перемешивать в течение 16-24 часов при
комнатной температуре.
Промывоч2000
2000
2000
ный буфер
Удалить жидкость и поставить перевернутую
пробирку на фильтровальную бумагу
Промывоч2000
2000
2000
ный буфер
Удалить жидкость и поставить перевернутую
пробирку на фильтровальную бумагу
Промывоч2000
2000
2000
ный буфер
Удалить жидкость и поставить перевернутую
пробирку на фильтровальную бумагу
Измерьте уровень радиоактивности (60
сек/пробирка).
Рассчитайте результаты
Расчет результатов
Расчет представлен с использованием
репрезентативных данных. Полученные
данные должны быть схожими с данными,
представленными в Таблице 2.
Рассчитайте среднее значение в минуту
(CPM) для каждой пары исследуемых
пробирок.
Рассчитать нормализованное процентное
связывание для каждого стандарта,
контрольной
сыворотки
и
образца
соответственно, используя следующую
формулу:
S1-5 / C / Mx (cpm) – S0 (cpm)
B/T(%) = _______________________ x 100
T(cpm)
Используя
полулогарифмическую
миллиметровую бумагу, постройте график
B/B0 (%) для каждого стандарта в
соответствии
с
соответствующей
концентрации кальцитонина.
Определите концентрацию кальцитонина в
неизвестных
образцах
методом
интерполяции данных калибровочной
кривой. Не экстраполируйте значения,
находящиеся за пределами диапазона
калибровочной кривой.
Из доступных прикладных программ
автоматической обработки данных, в
данном случае можно использовать логитпреобразование
или
аппроксимацию
данных с помощью сплайн-функций.
Так же доступна автоматизированная
система обработки данных.
Таблица 2. Типичные данные количественного
определения
Пробирки Количество Среднее B/T
cpm
значение %
cpm
301645
300521
T
299398
196.5
195
0.06
S0
193.6
713.6
720
0.24
S1
726.1
2547
2571
0.86
S2
2594
11021
11034 3.67
S3
11047
40670
40692 13.54
S4
40713
141750
142621 47.46
S5
143492
1350
1351
0.45
CI
1352
8437
8538
2.84
CII
8640
100 0000
Точность
Для определения точности результатов в
ходе количественного определения было
проанализировано
7
образцов
по
15
повторов.
Ниже
представлены
полученные значения.
Образец Количество Среднее
повторов
значение
1
15
6.2
2
15
31.5
3
15
65.0
4
15
107.5
5
15
347.8
6
15
1009.4
7
15
1529.7
1 0000
1000
100
1
10
100
100 0
CV %
8.1
2.5
3.0
3.8
2.7
4.4
5.9
Воспроизводимость
Для определения точности результатов
между количественными определениями
было проанализировано 7 образцов
(каждый из них протестирован дважды) в
ходе
15
независимых
анализов,
проведенных 3 разными исполнителями с
помощью наборов из разных партий. Ниже
представлены полученные значения.
Образец Количество Среднее
повторов
значение
1
15
4.8
2
15
27.7
3
15
61.7
4
15
104.2
5
15
327.0
6
15
995.3
7
15
1544.2
10 0000
cpm
9.
перевернутом состоянии на 2 минуты
на фильтровальную бумагу.
Верните штатив с пробирками в
прежнее положение и повторите шаг
8 еще два раза.
Определите радиоактивность каждой
пробирки, поместив ее в гаммасчетчик как минимум на 60 секунд.
Рассчитайте
концентрацию
кальцитонина в образцах, как это
описано
в
разделе
«расчет
результатов» или используйте для
этого специальное программное
обеспечение.
CV %
15.0
5.4
4.8
4.8
4.3
5.0
6.8
1 000 0
концентр ация чКальцитонина
(пг/ мл)
Рисунок 1: Типичная калибровочная кривая
(Не использовать для подсчета значений
образцов)
Характеристика количественного
определения
Типичные
параметры
количественного определения
NSB/T
< 0,1 %
Bmax/B0
> 700
Чувствительность
Значение предела обнаружения, которое
составило 1.5 пг/мл, было получено в
результате
тестирования
20
копий
нулевого стандарта. Чувствительность
была определена как концентрация,
соответствующая сумме среднего значения
cpm и его двух стандартных отклонений.
Функциональная чувствительность – это
значение концентрации чКальцитонина,
которое статистически значимо отличается
от нуля при определении точности
результатов
между количественными
определениями
(22%
CV).
Функциональная
чувствительность
количественного определения составляет 3
пг/мл.
Восстановление
Под
восстановлением
понималось
зафиксированное увеличение, выраженное
в процентах от ожидаемого роста пиков в
образцах сыворотки крови с известным
количеством
чКальцитонина.
Для
5
образцов
сыворотки
крови
с
чКальцитонином на 3 уровнях было
получено
следующее
значение:
92.4 - 111.3.
Специфичность
Моноклональные
антитела,
которые
используются в данном наборе IRMA
являются
специфичными
для
человеческого Кальцитонина.
Линейность
3 индивидуальных образца сыворотки
были серийно разведены с нулевым
стандартом
и
измерены
согласно
протоколу набора. Среднее значение после
разведения составило 101,9%. Следующее
уравнение, полученное для фактической
(Y)
относительно
ожидаемой
(X)
концентрации демонстрирует хорошую
линейность:
Y = 1.085X – 6.6353
R2 = 0.9964 n = 12
Ожидаемые значения
< 15 пг/мл (мужчины)
< 10 пг/мл (женщины)
Рекомендуется, чтобы каждая лаборатория
устанавливала собственные интервалы
эталонных значений для своей популяции
пациентов.
Ограничения
Реагенты,
поставляемые
с
данным
набором, предназначены для определения
уровней кальцитонина в сыворотке.
Следует
предотвращать
возможность
размораживания-повторного
замораживания реактивов и образцов.
Не
следует
использовать
гемолизированные
и
липемические
образцы, так как они могут дать ложные
значения.
При концентрациях кальцитонина до
200000 пг/мл высокодозный «эффект
крючка»
отсутствует.
Образцы
с
концентрацией,
превышающей
максимальную концентрацию стандарта,
необходимо
разбавить
нулевым
стандартом и провести количественное
определение повторно.
Полученные
результаты
следует
интерпретировать только в контексте
общей клинической картины.
Примечания к методике
Несоблюдение инструкций по применению
может оказать значительное влияние на
результаты исследования.
Не следует смешивать или заменять
компоненты из различных партий набора
или наборов, выпускаемых разными
производителями.
Добавление промывочного буфера. Для
добавления
промывочного
буфера
рекомендуется использовать стандартный
лабораторный диспенсер со стеклянной
флаконом объемом 1л и наконечником с
гибкой соединительной трубкой. Если
такого прибора нет в наличии, то можно
использовать шприц большого объема,
присоединенную
к
автоматической
пипетке.
Дополнительная информация
Не следует смешивать или заменять
компоненты из различных партий или
наборов разных производителей.
Источник
ошибки!
Пробирки,
упакованные в пластиковые коробки,
индивидуально не промаркированы. Для
минимизации риска никогда не берите из
пластиковой коробки больше пробирок,
чем необходимо, и после работы положите
их обратно в коробку. Рекомендуется
помечать пробирки для анализа маркером.
Меры предосторожности
Радиоактивность
Данный продукт содержит радиоактивный
материал.
Пользователь
несет
ответственность за соблюдение местных
законов или правил, касающихся порядка
использования радиоактивных материалов.
Биологическая опасность
Продукты
человеческой
крови,
использованные в наборе, были получены
у
здоровых
доноров.
Они
были
протестированы
индивидуально
с
использованием утвержденных методов
(иммуноферментный анализ). В результате
проверки были получены отрицательные
результаты на наличие антител к вирусу
иммунодефицита человека (анти-ВИЧ-1/2),
антител к вирусу гепатита С (anti-HCV),
антитрепонемных
антител
и
поверхностных антигенов вируса гепатита
В (HBsAg).
Следует всегда соблюдать осторожность
при работе с человеческими образцами,
предназначенными
для
тестирования
диагностическими наборами. Даже если
образец был протестирован, ни один метод
не
может
гарантировать
полного
отсутствия
инфекционных
агентов.
Следовательно,
с образцами крови
человека следует обращаться как с
потенциально
инфекционно
опасным
материалом.
Все продукты животного происхождения и
их производные были получены у
здоровых животных. Тем не менее, части
набора,
содержащие
компоненты
животного
происхождения,
должны
рассматриваться
как
потенциально
инфекционно опасный материал.
Химическая опасность
В качестве антибактериального агента
компоненты содержат азид натрия. При
утилизации отходы следует смывать
большим количеством воды, чтобы
предотвратить накопление взрывоопасных
азидов металлов в системе водопровода,
который может содержать части из меди и
свинца. Содержание азидов в каждой
упаковке составляет 61 мг.
Использовано
Контроль
Номер партии
Стандарт
Внимание,
обратитесь к
сопроводительным
документам
Пробирка с
покрытием
Биологическая опасность
Метка
Обратитесь к
инструкции по
использованию
Промывочны
й буфер
Устройство
для
проведения
диагностики in
vitro
Раствор для
разведения
сыворотки
Производитель
Температурный предел
Хранить при
темперетуре
2-8oC
Номер по
каталогу
Радиоактивный материал
Вебсайт: <http://www.izotop.hu>
Технический e-mail: immuno@izotop.hu
Коммерческий e-mail: commerce@izotop.hu
ООО «Институт изотопов»
1535 Будапешт. P.O.B. 851.
Тел.: (36-1) 392-2577,
Факс: (36-1) 395-9247