Определение гормонов и антител в слюне в клинической

ШКОЛА КЛІНІЦИСТА
И.В. Евстигнеев, к.м.н.
кафедра госпитальной терапии № 2 с курсом клинической иммунологии и аллергологии
ГУ «Днепропетровская медицинская академия МЗ Украины»
К.м.н.
И.В. Евстигнеев
Определение гормонов и антител в слюне
в клинической лабораторной практике
И
сследование слюны имеет ряд преимуществ
по сравнению с методами лабораторной диагностики крови из пальца или из вены.
Подготовка проб слюны отличается простотой и удобством сбора, безболезненностью, неинвазивностью.
Имеется возможность многократного получения
проб в нестрессогенной для пациента обстановке, что
важно при биоритмологических и гормональных исследованиях. Состав смешанной слюны определяется
соотношением между серозной секрецией околоушных желез и муцинозной секрецией двух других пар
желез, а также состоянием слизистой оболочки (СО)
рта, зубов, пародонта, микрофлоры и характером питания [7].
В слюне содержатся биологически активные вещества, регуляторные пептиды: интерлейкин-1α
(ИЛ-1α), ИЛ-6, ИЛ-8, ростковый фактор, синтезируемый тромбоцитами (PDGF-AB), фактор роста эпителия
(EGF), основной фактор роста фибробластов (bFGF).
Содержание цитокинов в слюне отражает активность
макрофагов и моноцитов в СО полости рта и десневой
жидкости [8]. Протеолитическая система слюны влияет
на лизис и рост бактерий в полости рта. По принципу
обратной связи микрофлора полости рта может вызвать
гипосаливацию [11].
Нарушение функции слюнных желез –
важный фактор риска возникновения
орофарингеального кандидоза.
Слюна содержит лизоцим, лактоферрин, сиалопероксидазу, специфические антитела, препятствующие
росту Candida spp. [9, 10]. Гипосаливация может быть
следствием синдрома Шегрена, применения некоторых лекарственных веществ, облучения головы и шеи.
В исследовании [12] у 90% здоровых пациентов число
Candida spp. в слюне не превышало 10 КОЕ/мл, в то
время как у 29 и 22% пациентов с первичным и вторичным синдромом Шегрена, соответственно, оно составляло 103–104 КОЕ/мл, а у 36 и 39% – >104 КОЕ/мл.
Большой интерес исследователей привлекло параллельное определение в плазме крови и слюне таких
гормонов, как кортизол и кортизон, эстриол и прогестерон, альдостерон, тестостерон и др. Различные модификации стандартных методик определения концентрации стероидов в слюне должны иметь высокую
чувствительность для выявления корреляции при сопоставлении результатов исследования гормонов в слюне
и плазме крови.
Определение стероидных гормонов в слюне
За последние годы в клинической практике шире
стали использоваться методы исследования стероидных гормонов (тестостерона, андростендиона, дегидроэпиандростерона сульфата, прогестерона, эстрадиола, кортизола) в слюне. В клинико-лабораторной
диагностике важным вопросом является соотношение концентрации стероидных гормонов в крови
и слюне. При исследовании уровня стероидных гормонов в плазме крови и слюне установлено, что их определение в слюне может иметь диагностическое значение, учитывая тесную корреляционную взаимосвязь
содержания гормонов в крови и в слюне как у здоровых лиц, так и у больных [7].
© Клінічна імунологія. Алергологія. Інфектологія. № 4 (73) 2014
www.kiai.com.ua
55
ШКОЛА КЛІНІЦИСТА
Исследование содержания свободного биологически
активного тестостерона в слюне у мужчин
Только 1–2% тестостерона циркулирует в крови в свободном виде, остальное количество гормона связано со
специфическим транспортным глобулином, а также с альбумином. Свободный тестостерон (сТ) и тестостерон, связанный с альбумином, составляют в сумме биологически
активную форму гормона. Объективными критериями андрогенного дефицита, включая возрастной гипогонадизм,
считаются снижение уровня в крови циркулирующего общего тестостерона (оТ) <11–12 нмоль/л и гипопродукция
сперматозоидов.
При сравнении результатов определения тестостерона в сыворотке крови с использованием автоматизированных систем и референсного метода (массспектро­мет­рии), а также стандартизированного
радио­­им­мунологического анализа (РИА) установлено неприемлемое завышение результатов при определении концентрации оТ <10 нмоль/л. При этом существенное количество пациентов с истинным дефицитом андрогенов,
которым необходима заместительная терапия препаратами тестостерона, получают завышенные результаты [2].
В слюну проникает только сТ как жирорастворимый свободный стероид с низкой молекулярной
массой и не может попасть тестостерон, связанный со специфическим глобулином и альбумином.
Концентрация сТ не зависит от скорости выделения слюны, хорошо коррелирует с концентрацией
сТ в крови, а также является дополнительным информативным диагностическим критерием для определения андрогенного статуса мужчин.
Использование современного иммуноанализа, основанного на усиленной хемилюминесценции, высокочувствительного и специфичного метода, дает возможность определить сТ в очень малых объемах слюны
прямым методом. Для получения точных результатов
измерения уровня сТ важен правильный сбор слюны.
Образцы слюны удобно собирать в специальные контейнеры (SaliCaps, IBL – Гамбург, Германия); специальная трубочка, соединенная с контейнером, изготовлена из материала, который не сорбирует стероиды.
В методе люминесцентного иммуноанализа (ЛИА) используется принцип конкурентного связывания, регистрация люминесцентного сигнала проводится на мультианализаторе. ЛИА позволяет с высокой точностью
и специфичностью определять уровень сТ в слюне, являющийся адекватным маркером для оценки андрогенного статуса у мужчин. Исследование сТ в слюне
методом ЛИА наиболее приемлемо для мониторинга
заместительной терапии андрогенами, позволяет подбирать оптимальные дозы препарата и пути его введения [2]. Концентрация сТ в слюне – маркер наличия андрогенного дефицита. Целесообразность использования
этого показателя в клинической практике определяется
сочетанием адекватного ЛИА-метода, простоты получения материала и удобства определения сТ в слюне в качестве критерия различных форм гипогонадизма у мужчин.
протоколу и оценить уровень сК в слюне, собранной
в промежуток времени от 23:00 до 24:00 [1]. Основное преимущество определения сК в слюне по сравнению с исследованием его уровня в крови заключается в оценке
уровня сК, являющегося биологически активным.
Содержание данного гормона в крови отражает концентрацию общего кортизола, связанного с транскортином
и альбумином. Уровень кортизола в крови зависит от способности транскортина связывать этот гормон, которая
меняется при заболеваниях почек, щитовидной железы,
сахарном диабете и других состояниях [4].
Точность определения сК в слюне подтверждена
масс-спектрометрией. Концентрация кортизола
в слюне отражает уровень свободной физиологически активной фракции гормона в крови.
Определение кортизола в слюне используется как
альтернативный метод при проведении функциональных тестов с дексаметазоном, адренокортикотропным
гормоном (АКТГ), инсулином, при этом снижается
стрессовое влияние многократного забора крови на гипоталамо-гипофизарно-адреналовую систему (ГГАС).
Исследование концентрации сК в слюне более приемлемо для оценки физиологических колебаний активности ГГАС на протяжении определенного времени по
сравнению с определением уровня кортизола в крови.
Определение уровня кортизола в слюне является надежным методом для выявления пациентов с эндогенным гиперкортицизмом в амбулаторных условиях.
Диагностика эндогенного гиперкортицизма
у пациентов с ожирением с определением уровня
кортизола в слюне
В исследовании [1] изучены возможности определения уровня кортизола в слюне методом электрохемилюминесцентного анализа (ЭХЛА) с использованием автоматического иммунохимического анализатора Соваs
E601 (Roche) для диагностики эндогенного гиперкортицизма у пациентов с ожирением. Сбор слюны проводился в 23:00 в течение двух дней с помощью специальной системы сбора слюны Salivette (Sarstedt).
Полученный образец слюны исследован методом ЭХЛА
на автоматическом анализаторе. После анализа образцы
слюны замораживались при температуре –70 °С для
проведения ИФА на диагностических наборах Salivary
Cortisol ELISA Kit SLV-2930 (DRG).
МПД проводилась в 23:00 (после последнего сбора
слюны пациент принимал 1 мг дексаметазона). В исследовании установлено, что диагностическая ценность
определения сК в слюне методами ЭХЛА и ИФА статистически не различается. Проведение МПД с точкой
разделения (cut-оff) 50 нмоль/л оправдано для повышения чувствительности диагностики.
Определение сК в слюне – надежный метод в качестве скрининга или первого исследования у пациентов с различными заболеваниями гипофиза
и надпочечников с определением базального уровня
кортизола и на фоне функциональных тестов.
Исследование уровня свободного кортизола в слюне
При диагностике эндогенного гиперкортицизма необходимо определить уровень свободного кортизола
(сК) в суточной моче (два измерения), провести малую
пробу с дексаметазоном (МПД) согласно стандартному
56
На начальном этапе диагностики эндогенного гиперкортицизма, в том числе у пациентов с нечеткими
симптомами гиперсекреции глюкокортикоидов, опре­
деление сК в слюне – доступный метод обследования
© Клінічна імунологія. Алергологія. Інфектологія. № 4 (73) 2014
www.kiai.com.ua
ШКОЛА КЛІНІЦИСТА
в амбулаторных условиях. Исследование уровня кортизола в слюне является оптимальным тестом для оценки
эмоционального стресса. Например, уровень кортизола
в слюне используется для изучения стрессогенности рабочей нагрузки у летчиков и космонавтов.
Иммуноферментный метод определения
противодифтерийных sIgA-антител в слюне
для оценки местного противодифтерийного
иммунитета
Дифтерийный анатоксин, используемый для спе­
цифической профилактики дифтерии в составе АКДСи АДС-М-препаратов, способствует формированию
антитоксического иммунитета. Он защищает от возникновения тяжелых форм заболевания, однако при наличии дефицита антибактериального иммунитета среди
привитых лиц персистенция и распространение возбудителя дифтерии продолжается.
Кроме системного иммунитета важное значение имеет
мукозный иммунитет, определяемый уровнем противодифтерийных антибактериальных sIgA в слюне, защищающий СО полости рта от колонизации возбудителем
дифтерии после передачи воздушно-капельным путем.
Противодифтерийные антибактериальные sIgA связывают Corynebacterium diphtheriae как на поверхности эпителия СО полости рта, так и внутри эпителиальных клеток.
Метод ИФА для определения противодифтерийных антибактериальных sIgA в слюне является информативным не только для оценки местного противодифтерийного иммунитета, но и возможности
прогнозирования развития тяжелых форм дифтерии.
А.В. Лабушкина и соавт. [3] обследовали практически здоровых детей в возрасте от 2 до 16 лет, посещающих дошкольные и школьные учреждения, привитых по календарю АКДС- и АДС-М-препаратами.
Нестимулированную слюну собирали утром натощак
после ополаскивания ротовой полости водой в стерильную центрифужную пробирку. Центрифугирование
образцов слюны проводили при 3 000/мин в течение
30 мин, надосадочную жидкость сохраняли при температуре –20 °С до момента исследования.
Результаты ИФА выражали в условных единицах
(ед/мл) относительно стандарта (положительного контроля). В качестве стандарта использовали 30 проб сывороток крови пациентов с дифтерией, подтвержденной бактериологически. В соответствии с результатами
РПГА, титр противодифтерийных антител в этих сыворотках крови составил >1/40.
Содержание антител в стандарте принято за 100 ед/мл.
Проведено сопоставление уровня заболеваемости дифтерией и бактерионосительства токсигенных штаммов С. diphtheriae у детей различного возраста с относительной частотой выявления противодифтерийных
антибактериальных sIgA в слюне.
Достоверное повышение среднего содержания противодифтерийных sIgA у детей наблюдалось только
к 7–9 годам (51,6±3,9 ед/мл) по сравнению с аналогичными показателями у детей более раннего возраста.
Вероятно, повышение уровня противодифтерийных
sIgA в слюне у детей в возрасте 7–9 лет объясняется расширением окружения после поступления в школьные
учреждения.
При более выраженной циркуляции в популяции
штаммов токсигенных С. diphtheriae происходит контакт
возбудителя со СО полости рта. В иммунном организме
антибактериальные sIgA-антитела участвуют в элиминации возбудителя, нарушая адгезию С. diphtheriae на
эпителиальных клетках СО.
Выявление контингента детей с низким уровнем
противодифтерийного иммунитета дает возможность
определить группы риска по развитию дифтерии. Дети
раннего возраста (2–6 лет) представляют группу риска
по развитию дифтерии. Данная категория нуждается
в проведении мер как специфической, так и неспеци­
фической профилактики этой инфекции, учитывая
вероятность развития токсической и субтоксической
форм дифтерии [3].
Определение sIgA в слюне методом ИФА
у пациентов с поллинозом для диагностики
заболевания и оценки эффективности
аллерген-специфической иммунотерапии
(АСИТ)
Методы, основанные на определении аллерген-спе­
цифических антител, в аллергодиагностике являются
широко используемыми, учитывая их высокую чувствительность, специфичность, безопасность для пациентов. В последнее время для проведения АСИТ используют пероральные препараты аллергенов, имеющие
высокую степень специфичности и являющиеся удобными в применении. ИФА является одним из удобных
и информативных методов диагностики и контроля эффективности лечения больных респираторными аллергозами.
М.В. Манжос и соавт. [5] обследовали пациентов с поллинозом, имеющих гиперчувствительность
к пыльце полыни. Клинические проявления чаще всего
характеризовались риноконъюнктивальным синдромом, явления бронхоспазма выявлены у 35% больных.
Слюна собиралась утром натощак, после центрифугирования надосадок хранили при температуре –20 °С.
Использованы конъюгаты антител против IgA человека, меченные пероксидазой хрена. ИФА проводили
на 96-луночных планшетах с учетом результатов ИФА
на спектрофотометре.
Проведен анализ содержания IgA к аллергенам
«Осенняя смесь трав» в индивидуальных образцах
слюны. Планшеты были сенсибилизированы антигеном в концентрации 15 мкг/мл, разведение слюны составило 1:10. АСИТ проводили в предсезонный период аллергеном «Осенняя смесь трав» («Севафарма»,
Чешская республика).
У пациентов с поллинозом на начальном этапе отмечено достоверное снижение уровня секреторных
sIgA-антител в слюне по сравнению со здоровыми
лицами [5]. В процессе АСИТ у пациентов определено повышение уровня специфических секреторных sIgA‑антител в слюне в среднем в 1,6 раза. У 14%
больных уровень sIgA-антител повысился более чем
в 2 раза. Таким образом, вследствие проведения АСИТ
пероральными препаратами-аллергенами активируется местный иммунный ответ с усилением выработки sIgA-антител, защищающих СО. Пероральные
препараты-аллергены стимулируют продукцию sIgA,
IgA и IgG, повышая барьерную функ­цию СО.
© Клінічна імунологія. Алергологія. Інфектологія. № 4 (73) 2014
www.kiai.com.ua
57
ШКОЛА КЛІНІЦИСТА
ИФА для определения специфических sIgAантител у пациентов с поллинозом – простой
и доступный метод диагностики поллиноза
и контроля эффективности использования
пероральных препаратов-аллергенов для АСИТ.
Определение содержания IgA и IgG
к глиадину и тканевой трансглутаминазе
в смешанной слюне при воспалительнодеструктивных процессах СО полости рта
Антитела классов IgA и IgG к глиадину в смешанной
слюне у практически здоровых лиц определяют в низком
титре. При заболеваниях пародонта, по данным исследования В.М. Радомской и соавт. [8], IgA-антитела к глиадину обнаруживаются у всех пациентов в смешанной
слюне в количестве в среднем 4,40±0,82 ед/мл, а антитела
класса IgG к глиадину – в концентрации 4,20±0,18 ед/мл.
Уровень антиглиадиновых антител отражает состояние
локальной иммунной защиты СО полости рта.
Антитела класса IgA к трансглутаминазе выявлены
в смешанной слюне у всех обследованных с заболеваниями пародонта в количестве 1,22±0,05 ед/мл, а антитела класса IgG – 1,88±0,09 ед/мл [8]. Трансглутаминаза
является катализатором образования межмолекулярных
связей между белками. Появление антител к трансглутаминазе в смешанной слюне отражает нарушение процессов формирования нормальной соединительной
ткани, в том числе и пародонта. Уровень антител к глиадину и трансглутаминазе в смешанной слюне характеризует не только тяжесть воспалительно-деструктивных
58
процессов в тканях СО полости рта, но и состояние локальной иммунной защиты.
Выводы
1. Уровень свободного биологически активного тестостерона в слюне выраженно коррелирует с биологически активной формой гормона в крови (сТ плюс связанный с альбумином тестостерон). Уровень тестостерона
в слюне – более адекватный индикатор биологической
активности, чем оТ в сыворотке крови, особенно при
изменении связывающий способности специфического
транспортного глобулина [2].
2. Мониторинг заместительной терапии при андрогенном дефиците можно проводить определением сТ
в слюне методом ЛИА.
3. Исследование уровня кортизола в слюне ЭХЛА на автоматическом анализаторе Соваs E601 (Roche) – удобный
и информативный метод для диагностики эндогенного гиперкортицизма среди пациентов с нормальным индексом
массы тела и пациентов с ожирением, может быть рекомендован в качестве первого исследования скрининга [1].
4. Определение антител в смешанной слюне позволяет оценивать состояние мукозной защиты с учетом
уровня sIgA к возбудителю дифтерии, контролировать эффективность проведения АСИТ пероральными
препаратами-аллергенами, определять тяжесть воспалительно-деструктивных процессов СО полости рта,
включая заболевания пародонта.
Список литературы находится в редакции
© Клінічна імунологія. Алергологія. Інфектологія. № 4 (73) 2014
www.kiai.com.ua