российская академия медицинских наук северо
advertisement
РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК СЕВЕРО-ЗАПАДНОЕ ОТДЕЛЕНИЕ ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ «НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ АКУШЕРСТВА И ГИНЕКОЛОГИИ ИМ. Д. О. ОТТА» На правах рукописи Кореневский Андрей Валентинович НАРУШЕНИЕ ГИПОТАЛАМИЧЕСКОЙ РЕГУЛЯЦИИ РЕПРОДУКТИВНЫХ ЦИКЛОВ ПРИ ВОЗДЕЙСТВИИ НЕБЛАГОПРИЯТНЫХ ЭКОЛОГИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ 03.03.01 («Физиология») 03.01.04 («Биохимия») Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук Научный консультант: з.д.н. РФ, д.б.н., проф. Арутюнян А. В. Санкт-Петербург 2015 2 ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ………………………………………………………………………………….............. ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. 5 16 Гипоталамо-гипофизарная регуляция репродуктивной функции женского организма…………………………………………………………………………. 16 1.2. Роль пинеальной железы в регуляции репродуктивной функции…………...... 40 1.3. Возрастные нарушения гипоталамической регуляции репродуктивной функции…………………………………………………………………………… 50 1.4. Изменение содержания пинеального мелатонина при старении……………… 57 1.5. Влияние пептидных биорегуляторов на репродуктивную функцию…………. 61 1.6. Воздействие экзогенных нейротоксических ксенобиотиков толуола и 1,2-диметилгидразина на гипоталамо-гипофизарное звено регуляции репродуктивной системы………………………………………………………… 1.7. Воздействие эндогенного L-гомоцистеина на нейротоксического гипоталамо-гипофизарное 66 ксенобиотика звено регуляции репродуктивной функции………………………………………………………... 82 ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ………………………………...... 92 2.1. Животные………………………………………………………………………..... 92 2.2. Реактивы и препараты……………………………………………………………. 92 2.3. Общая схема эксперимента……………………………………………………… 94 2.4. Выделение и препарирование структур мозга, осуществляющих регуляцию эстральных циклов……………………………………………………………….. 2.5. Определение уровня гонадолиберина в структурах мозга иммуноферментным методом………………………………………………….... 2.6. Определение уровня половых гормонов в сыворотке Определение в структурах содержания мозга биогенных методом аминов и их метаболитов высокоэффективной жидкостной хроматографии с электрохимическим детектированием…………………...…. 2.8. Определение уровня общего L-гомоцистеина в плазме 101 102 крови иммуноферментным методом………………………………...…………………. 2.9. 100 крови радиоиммунологическим методом…………………………………………...…. 2.7. 98 103 Определение уровня генерации активных форм кислорода в структурах мозга методом люминолзависимой хемилюминесценции…...………………... 103 3 2.10. Определение содержания продуктов перекисного окисления липидов в сыворотке крови по тесту с 2-тиобарбитуровой кислотой спектрофотометрическим методом…………………...………………………… 2.11. Определение содержания нитритов в сыворотке крови спектрофотометрическим методом………………………………………...…… 2.12. Определение моноаминооксидазной активности в структурах 104 105 мозга спектрофотометрическим методом…………………………...………………… 105 2.13. Определение содержания общего белка в структурах мозга и в реакционной смеси турбидиметрическим методом…………………………………………… 106 2.14. Статистическая обработка результатов…………………………...……………. 107 ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ………... 108 3.1. Содержание и гонадолиберина срединном возвышении в медиальной с аркуатными преоптической ядрами области гипоталамуса и уровень половых гормонов в крови на различных стадиях эстрального цикла……………………………………………………………………………..... 3.2. 108 Суточная динамика и среднесуточное содержание биогенных аминов в медиальной преоптической области и срединном возвышении с аркуатными ядрами гипоталамуса на различных стадиях эстрального цикла……………………………………………………………………...……….. 3.3. Циркадианный в характер медиальной динамики преоптической содержания области и биогенных срединном аминов возвышении с аркуатными ядрами гипоталамуса……………………………………...……... 3.4. Влияние содержание ксенобиотика 1,2-диметилгидразина гонадолиберина в медиальной на преоптической области 133 Влияние ксенобиотиков 1,2-диметилгидразина и толуола на суточную динамику в и среднесуточное медиальной преоптической содержание области и биогенных срединном аминов возвышении с аркуатными ядрами гипоталамуса…………………………………………...... 3.6. 128 среднесуточное и срединном возвышении с аркуатными ядрами гипоталамуса………...…….. 3.5. 111 Влияние метиониновой нагрузки 135 (гипергомоцистеинемии) на суточную динамику и среднесуточное содержание биогенных аминов в медиальной преоптической области и срединном возвышении с аркуатными ядрами гипоталамуса…………………………………………..… 3.7. Влияние ксенобиотиков 1,2-диметилгидразина, толуола и метиониновой нагрузки на образование активных форм кислорода в медиальной 147 4 преоптической области и срединном возвышении с аркуатными ядрами гипоталамуса и продуктов перекисного окисления липидов в сыворотке крови………………………………………………………………………………. 3.8. Коррекция с помощью мелатонина и пептидных биорегуляторов нарушения катехоламинергической нейротоксическим регуляции воздействием эстральных циклов, (1,2-диметилгидразин, вызванного метиониновая нагрузка)…………………………………………………………………………... 3.9. 152 Изменение катехоламинергической регуляции эстральных 157 циклов у животных различных возрастных групп……………………………………… 169 3.10. Влияние мелатонина и эпиталона на динамику эстральных циклов у молодых и старых животных при различных световых режимах…………... 175 ЗАКЛЮЧЕНИЕ…………………………………………………………………………………... 181 ВЫВОДЫ…………………………………………………………………………………………. 192 ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ…………………………………………………………. 194 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ………………………………………………………………………. 194 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ………………………………………………………………………... 196 5 ВВЕДЕНИЕ Актуальность темы исследования Современный этап развития цивилизации характеризуется все большим вмешательством человека в состояние биосферы. В ней появляются и накапливаются несвойственные природе соединения, называемые ксенобиотиками. Их присутствие даже в относительно небольших количествах при длительном воздействии способно вызывать нарушения различных функций живого организма. Репродуктивная к неблагоприятным система является экологическим одной факторам систем из наиболее женского чувствительных организма. Имеются многочисленные клинические наблюдения, свидетельствующие о нарушении менструального цикла, секреции гонадотропных гормонов, пролактина, половых стероидов у женщин, работающих в присутствии паров таких широко распространенных на промышленных предприятиях органических веществ, как бензол, формальдегид, метилметакрилат, стирол, диоксан и др. [Баласанян И. Г., 1991; Лыткин В. В., Антипова В. Г., 1991; Айламазян Э. К. и соавт., 1997]. Важнейшая роль в координации репродуктивной функции млекопитающих принадлежит процессам центральной регуляции, которые осуществляет единая нейроэндокринная система, использующая в качестве химических посредников половые гормоны [Шаляпина В. Г., 1991]. Процессу овуляции, характерному для женского организма, предшествует ряд гормональных изменений в организме, среди которых важнейшим является резкое повышение в крови уровня гонадотропных гормонов гипофиза, вызываемое у самок крыс гиперсекрецией гонадолиберина. Для осуществления преовуляторного пика секреции этого нейрогормона необходимо взаимодействие двух сигналов – гормонального, заключающегося в повышении в крови уровня синтезируемых яичниками стероидов в период, предшествующий овуляции, и циркадианного сигнала, ежедневно поступающего из супрахиазматических ядер гипоталамуса к нейрональным структурам, ответственным за синтез и секрецию гонадолиберина [Palm I. F. et al., 1999; 2001]. Оба эти сигнала передаются к гонадолиберинергическим нейронам опосредованно, через нейромедиаторные системы. Активность этих систем регулируется как эндокринным путем, в первую очередь половыми гормонами яичников, так и посредством нейрональных связей с различными функциональными отделами мозга. Несмотря на то что роль главного циркадианного осциллятора, супрахиазматических ядер гипоталамуса, в протекании эстрального цикла в настоящее время считается доказанной, многие вопросы, связанные с молекулярной организацией этого процесса у животных с сезонным и несезонным размножением и особенно у человека остаются невыясненными. 6 Имеются данные, свидетельствующие о важной роли катехоламинергических и пептидергических систем в нейроэндокринной регуляции репродуктивной функции [Chappell P. E., 2005]. Однако по-прежнему малоизученными остаются вопросы, связанные с изменением в течение суток содержания нейромедиаторов в гипоталамических структурах, ответственных за синтез и секрецию гонадолиберина. Недостаточно изучена роль пинеальной железы и продуцируемого ею мелатонина в регуляции репродуктивных циклов и их возрастных нарушениях. В последние десятилетия были получены данные о том, что процесс передачи циркадианного сигнала к нейромедиаторным системам, участвующим в гипоталамической регуляции репродуктивной функции, отличается особой чувствительностью к различным естественным и техногенным воздействиям. Так, у самок крыс наиболее ранним маркером возрастных нарушений эстральных циклов служит исчезновение околосуточных ритмов активности моноаминергических и опиоидергических систем гипоталамуса [Wise P. M. et al., 1997; Арутюнян А. В., Степанов М. Г., Кореневский А. В., 1998; Goldman J. M. et al., 2008]. Экспериментальные исследования показали, что нейротоксические соединения вызывают в первую очередь нарушения центрального, гипоталамо-гипофизарного, звена регуляции репродуктивной системы [Савченко О. Н., Арутюнян Н. А., Степанов М. Г., 1992; Степанов М. Г., 1994; Арутюнян А. В. и соавт., 1997]. Поэтому исключительно актуальной представляется задача исследования содержания и суточной динамики биогенных аминов в гипоталамических структурах как индикатора ранних нарушений репродуктивной функции при воздействии нейротоксикантов. Вследствие увеличения средней продолжительности жизни человека женский организм в течение более 20 лет пребывает в условиях возрастных изменений гормонального гомеостазиса, обусловленных прекращением циклических процессов в женской репродуктивной системе. В связи с этим актуальным является изучение механизмов регуляции репродуктивной функции, ее возрастных изменений с целью разработки мер, направленных на осуществление контроля и возможное продление репродуктивного периода. Исследования, проведенные в последние десятилетия, были посвящены раскрытию сложных механизмов развития нормального функционирования репродуктивной системы и ее естественного угасания с возрастом. Несмотря на то, что она является одной из наиболее чувствительных к изменению окружающей среды систем живого организма, отмечается неспецифический характер ее реакции на воздействие различных химических и физических факторов. Это свидетельствует об определенных нарушениях центральных механизмов регуляции репродуктивной функции под действием неблагоприятных экологических факторов вне зависимости от их природы [Arutjunyan A. V. et al., 2001; Арутюнян А. В. и соавт., 2003]. 7 К числу эндогенных неблагоприятных факторов, способствующих развитию системного окислительного стресса в тканях, в том числе и в головном мозге, следует отнести цитотоксичную аминокислоту L-гомоцистеин гомоцистеиновую кислоту, уровень и которых продукт в его кровяном спонтанного окисления русле резко возрастает при нарушениях мозгового кровообращения [Yap S., 2003; Зорилова И. В. и соавт., 2005], а также при недостаточности в организме витаминов группы В, и прежде всего фолиевой кислоты [Miller J. W., 2013]. Гипергомоцистеинемия, вызываемая нарушением метаболизма L-гомоцистеина, представляет реальную угрозу для здоровья человека в современном урбанистическом обществе. В последние годы появились данные о важной роли нарушений обмена фолатов и L-гомоцистеина в патогенезе микроциркуляторных и тромботических осложнений в акушерской практике [Ефимов В. С., Цакалов А. К., 1999; Аржанова О. Н., Алябьева Е. А., Шляхтенко Т. Н., 2010]. До настоящего времени влияние гипергомоцистеинемии на гипоталамо-гипофизарное звено регуляции репродуктивной функции было изучено недостаточно. Ответ на вопрос о том, каковы могут быть механизмы воздействия L-гомоцистеина на преовуляторную секрецию лютеинизирующего гормона, по-видимому, могут дать исследования, направленные на изучение влияния экспериментальной гипергомоцистеинемии на нейромедиаторные системы гипоталамуса, ответственные за регуляцию репродуктивных циклов. Многочисленными исследованиями было показано, что, помимо химических факторов, световое излучение, как естественное, так и искусственное, его продолжительность и интенсивность также влияют на различные биологические объекты [Bullough J. D., Rea M. S., Figueiro M. G., 2006; Анисимов В. Н., Виноградова И. А., 2008]. Основную роль в поддержании физиологических функций организма играет пинеальная железа, активность которой изменяется в зависимости от времени суток и уровня освещенности. Вместе с супрахиазматическими ядрами гипоталамуса пинеальная железа относится к биологическим часам, которые регулируют физиологические ритмы и функции живого организма [Arendt J., 2005; Call C. et al., 2005]. Известно, что избыточный световой фон (световое загрязнение) подавляет, а световая депривация, напротив, активирует пинеальную железу [Анисимов В. Н., Виноградова И. А., 2008]. Условия освещенности приполярных широт, в которых проживает значительная часть населения Земного шара, характеризуются наличием колебаний в продолжительности светового дня в течение года. Такое изменение продолжительности светлого периода суток приводит к естественному нарушению циркадианных ритмов. При этом нельзя забывать и об искусственном изменении продолжительности светового дня, связанном с экономической деятельностью человека (сменный график работы на промышленных предприятиях, уличное 8 ночное освещение и пр.) и также приводящем к сбою биологических часов. Нарушение функционирования пинеальной железы сказывается на цикличности продукции мелатонина, что приводит к гормонально-метаболическим сдвигам, способствующим преждевременному старению организма [Анисимов В. Н., 2008; Виноградова И. А. и соавт., 2008]. Сегодня воздействие повышенного светового фона на организм человека и животных по-прежнему остается малоизученным, отсутствуют данные о влиянии этого неблагоприятного фактора внешней среды на гипоталамо-гипофизарное звено регуляции репродуктивной системы. Актуальной также является задача поиска соединений, способных предохранить моноаминергические системы гипоталамуса от различных неблагоприятных химических и физических факторов, а также нормализовать нарушенные процессы передачи информации о суточном периодизме к этим нейромедиаторным системам. В этой связи представляется перспективным использование гормона пинеальной железы мелатонина, а также препаратов пинеальной железы либо синтетических пептидных аналогов, изготовленных на основе анализа их аминокислотной последовательности. Введение этих соединений способно устранять ряд нарушений гипоталамо-гипофизарного звена репродуктивной системы, наблюдаемых в процессе старения [Trentini G. P. et al., 1992; Li S., Givalois L., Pelletier G., 1997; Meredith S. et al., 1998; Анисимов В. Н., 2003, 2005; Гончарова Н. Д. и соавт., 2003; Долгов Г. В., Цвелев Ю. В., Малинин В. В., 2004; Коркушко О. В. и соавт., 2006; Гончарова Н. Д., Хавинсон В. Х., Лапин Б. А., 2007; Козина Л. С., 2009; Хавинсон В. Х., 2009]. Известно, что мелатонин может оказывать защитное действие вследствие наличия у него антиоксидантных свойств, поскольку нейротоксическое действие многих ксенобиотиков связано с образованием активных форм кислорода [Mattia C. J., Adams J. D. Jr., Bondy S. C., 1993; Singh M. P. et al., 2010; Kodavanti P. R. S. et al., 2011]. Нами была выдвинута гипотеза о том, что хроническое введение мелатонина или пептидных биорегуляторов (препаратов пинеальной железы) самкам крыс способно предохранить их репродуктивную систему от преждевременного старения, вызванного окислительным стрессом, индуцированным внешним (нейротоксические ксенобиотики, избыточный световой фон) или внутренним (пренатальная, возрастная или алиментарная гипергомоцистеинемия) негативными факторами. Цель и задачи исследования Цель настоящего исследования – изучить влияние различных неблагоприятных экзогенных (1,2-диметилгидразин, толуол, постоянное освещение) и эндогенных (гипергомоцистеинемия) факторов, а также возраста на моноаминергические структуры гипоталамуса самок крыс, ответственные за регуляцию репродуктивной функции, и оценить 9 возможность коррекции выявленных нарушений с помощью мелатонина и пептидных биорегуляторов. Для достижения указанной цели были поставлены и последовательно решены следующие задачи: 1. Изучить суточную динамику и среднесуточное содержание биогенных аминов в структурах гипоталамуса, ответственных за регуляцию репродуктивной функции, на различных стадиях эстрального цикла. 2. Выяснить, имеют ли суточные изменения содержания биогенных аминов в структурах гипоталамуса, ответственных за регуляцию репродуктивной функции, циркадианную природу. 3. Оценить влияние экзогенных и эндогенных нейротоксических факторов на суточную динамику и среднесуточное содержание гонадолиберина и биогенных аминов в структурах гипоталамуса, ответственных за регуляцию репродуктивной функции. 4. Выяснить, существует ли взаимосвязь между содержанием биогенных аминов и показателями окислительного стресса в структурах гипоталамуса, ответственных за регуляцию репродуктивной функции, в норме, а также после нейротоксического воздействия. 5. Изучить воздействие мелатонина и пептидных биорегуляторов пинеалона, эпиталамина и эпиталона на суточную динамику и среднесуточное содержание биогенных аминов в структурах гипоталамуса, ответственных за регуляцию репродуктивной функции, в экспериментальных моделях преждевременного старения репродуктивной системы и гипергомоцистеинемии. 6. Изучить возрастные изменения суточной динамики и среднесуточного содержания биогенных аминов в структурах гипоталамуса, ответственных за регуляцию репродуктивной функции. 7. Оценить влияние мелатонина и пептидного препарата пинеальной железы эпиталона на динамику эстральных циклов самок крыс разного возраста при различных световых режимах. Научная новизна работы Проведено гипоталамической детальное регуляции исследование нарушения репродуктивных циклов моноаминергического самок крыс под звена влиянием нейротоксических факторов экзогенной и эндогенной природы, а также при различных световых режимах и старении. 10 Впервые особое внимание уделено регистрации времени изменения содержания биогенных аминов в гипоталамусе, имеющего важное значение для формирования преовуляторного пика секреции гонадолиберина, обусловливающего нормальное течение репродуктивных циклов. Установлено, что снижение уровня норадреналина в медиальной преоптической области гипоталамуса и повышение уровня дофамина в срединном возвышении с аркуатными ядрами гипоталамуса происходит на стадии проэструса в узком временном интервале между 9:30 ч и 11 ч циркадианного времени. Впервые проведена оценка зависимости изменений содержания биогенных аминов в гипоталамических структурах, участвующих в регуляции синтеза и секреции гонадолиберина, от циркадианного и овариального сигналов, оказывающих специфическое действие на моноаминергические системы гипоталамуса. Показано, что обнаруженная суточная динамика содержания норадреналина в медиальной преоптической области и дофамина в срединном возвышении с аркуатными ядрами не зависит от уровня половых стероидов в крови. Отмечено сохранение нормальной суточной динамики содержания норадреналина в медиальной преоптической области в условиях световой депривации, что доказывает ее зависимость от центрального осциллятора циркадианных ритмов. Получены новые данные о роли биогенных аминов в процессах возрастного изменения и выключения циклических процессов в репродуктивной системе самок крыс. Впервые показано, что с возрастом начальные этапы угасания репродуктивной функции сопровождаются изменением нормальной суточной динамики содержания норадреналина и дофамина в гипоталамических структурах, участвующих в регуляции синтеза и секреции гонадолиберина; обнаруженное изменение связано с предполагаемым нарушением функционирования центрального осциллятора циркадианных ритмов. Впервые установлено, что однократное введение обладающего нейротоксическими свойствами энтеротропного канцерогена 1,2-диметилгидразина снижает среднесуточное содержание гонадолиберина в срединном возвышении с аркуатными ядрами гипоталамуса, принимающем участие в регуляции секреции нейрогормона. Впервые изучено воздействие 1,2-диметилгидразина и нейротоксического ксенобиотика толуола на суточные ритмы и среднесуточное содержание биогенных аминов в гипоталамических структурах, участвующих в регуляции репродуктивной функции. Установлено, что однократное введение 1,2-диметилгидразина, подобно двухмесячной ингаляции толуола, воздействует на суточную динамику и среднесуточное содержание биогенных аминов в исследованных структурах гипоталамуса, приводя к полному исчезновению нормальных суточных изменений, а также значительно изменяя среднесуточные показатели. 11 Впервые в установлено, гипоталамусе эффекты, ксенобиотиками, что что экспериментальная схожие представляет с эффектами, дополнительное гипергомоцистеинемия вызываемыми вызывает нейротоксическими подтверждение неспецифического характера реакции центрального звена регуляции репродуктивной функции на различные неблагоприятные факторы внешней среды и ставит эндогенно образующийся в организме L-гомоцистеин в один ряд с экзогенными ксенобиотиками. Получены новые данные о влиянии ксенобиотиков 1,2-диметилгидразина и толуола, а также экспериментальной гипергомоцистеинемии на показатели окислительного стресса. Показано, что суточная динамика образования активных форм кислорода в структурах гипоталамуса, ответственных за регуляцию эстральных циклов, может служить маркером нормального функционирования механизмов передачи к этим структурам информации о суточном периодизме, а также нарушения таких механизмов при различных неблагоприятных воздействиях на организм. Впервые обнаружен нейропротекторный эффект эпиталамина на суточную динамику содержания норадреналина в медиальной преоптической области гипоталамуса и эпиталона на суточную динамику содержания дофамина в срединном возвышении с аркуатными ядрами гипоталамуса, нарушенную при воздействии 1,2-диметилгидразина. Показано, что введение мелатонина на фоне нарушения в гипоталамусе суточных ритмов содержания норадреналина и дофамина приводит к нормализации их суточной динамики. Также впервые установлено, что пинеалон, подобно эпиталамину, восстанавливает суточную динамику содержания норадреналина в медиальной преоптической области, нарушенную под влиянием экспериментальной гипергомоцистеинемии. Впервые уделено особое внимание изучению влияния различных световых режимов на такие показатели репродуктивной функции молодых, зрелых и стареющих животных, как средняя продолжительность эстрального цикла, количество эстральных циклов разной продолжительности и их процентное соотношение, процентное соотношение фаз эстрального цикла, относительное число животных с иррегулярными циклами. Показано, что постоянное освещение способствует изменению гипоталамической регуляции репродуктивной системы, что может быть одной из причин того, что нарушения эстрального цикла наступают в более раннем возрасте по сравнению с животными, находившимися в условиях стандартного фиксированного освещения. Впервые установлено, что мелатонин и эпиталон как при постоянном освещении, так и при стандартном фиксированном освещении замедляют развитие возрастных изменений эстрального цикла. Показано, что короткие эстральные циклы сохраняются до более зрелого возраста, а длинные эстральные циклы и иррегулярные циклы появляются позже, чем в контрольных группах животных, причем наибольшее влияние 12 на эстральный цикл препараты оказывают при постоянном освещении, что, возможно, связано с моноаминергическим звеном регуляции эстральных циклов. Теоретическая и практическая значимость работы Экспериментальное исследование роли биогенных аминов в процессах центральной регуляции репродуктивных циклов и изучение молекулярной организации этого процесса способствует пониманию сложных механизмов выключения репродуктивной функции в процессе старения женского организма и ее нарушений при действии неблагоприятных факторов внешней среды. Проведенные исследования расширяют представления о роли циркадианной системы организма в процессах гипоталамической регуляции репродуктивной функции. Установлено, что нарушение суточной динамики содержания норадреналина и дофамина и генерации активных форм кислорода в структурах гипоталамуса, участвующих в регуляции эстральных циклов, служит одним из наиболее ранних и чувствительных маркеров нарушений гипоталамического звена регуляции репродуктивной функции под воздействием таких нейротоксикантов, как 1,2-диметилгидразин и толуол. Измерение этих показателей может применяться для оценки нарушений гипоталамических механизмов регуляции репродуктивной функции после воздействия других нейротоксических соединений. Также показано, что гипергомоцистеинемия, вызванная метиониновой нагрузкой, приводит к результатам, схожим с полученными после воздействия на организм экзогенных ксенобиотиков, а постоянное освещение вызывает нарушение регуляции эстральных циклов. Выявление ранних функциональных нарушений центральной регуляции репродуктивной функции, которое удается обнаружить лишь экспериментальным путем, имеет важное практическое значение при разработке профилактических мер, способствующих устранению или ослаблению действия повреждающих факторов на организм в неблагоприятных экологических условиях. Полученные результаты о защитном действии мелатонина и пептидных биорегуляторов при нарушении гипоталамической регуляции репродуктивных циклов под влиянием ксенобиотиков 1,2-диметилгидразина и толуола, в условиях гипергомоцистеинемии, а также при постоянном освещении являются перспективными в практическом отношении с точки зрения использования этих нейропротекторных соединений для коррекции нарушений гипоталамической регуляции репродуктивной функции. 13 Основные положения, выносимые на защиту 1. Моноаминергические системы гипоталамуса участвуют в формировании неспецифической реакции организма самок крыс на воздействие неблагоприятных экологических факторов. 2. Воздействие неблагоприятных экзогенных (ксенобиотики) и эндогенных (гипергомоцистеинемия) факторов выражается в изменении суточной динамики содержания норадреналина в медиальной преоптической области гипоталамуса и дофамина в срединном возвышении с аркуатными ядрами гипоталамуса. 3. Неблагоприятные факторы нарушают механизм передачи информации о суточном периодизме, поступающей от супрахиазматических ядер гипоталамуса к медиальной преоптической области и срединному возвышению с аркуатными ядрами. 4. Нарушение суточной динамики содержания норадреналина в медиальной преоптической области и дофамина в срединном возвышении с аркуатными ядрами является одним из наиболее ранних признаков возрастного угасания репродуктивной функции. 5. В регуляции репродуктивных циклов, наряду с супрахиазматическими ядрами, принимает участие пинеальная железа. Эпифизарный гормон мелатонин и пептидные препараты, способствующие его синтезу и секреции, устраняют нарушения репродуктивной функции, вызванные неблагоприятными экологическими факторами. Апробация работы Результаты исследования представлены на X Международном симпозиуме «Экологофизиологические проблемы адаптации» (г. Москва, 2001 г.), IX Международном катехоламиновом симпозиуме (г. Киото, Япония, 2001 г.), Всероссийской научной конференции «Биохимия – медицине» (Санкт-Петербург, 2002 г.), 4-й Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные вопросы эндокринологии» (г. Пермь, 2002 г.), XI Международном симпозиуме «Эколого-физиологические проблемы адаптации» (г. Москва, 2003 г.), LIV Мосбаховском коллоквиуме «Ритм жизни: молекулярные механизмы циркадианных часов» (г. Мосбах, ФРГ, 2003 г.), научной конференции «Нейрохимия: фундаментальные и прикладные аспекты» (г. Москва, 2005 г.), I съезде физиологов СНГ (г. Москва, 2005 г.), международном симпозиуме «Молекулярные механизмы регуляции функции клетки» (г. Тюмень, 2005 г.), VI Европейском конгрессе международной ассоциации геронтологов и гериатров (СанктПетербург, 2007 г.), VIII Международном симпозиуме «Биологические механизмы старения» 14 (г. Харьков, Украина, 2008 г.), конгрессе «Экотоксины и здоровье» (Санкт-Петербург, 2008 г.), научно-практической конференции с международным участием «Нейрохимические подходы к исследованию мозга» (г. Ростов-на-Дону, 2011 г.), VIII Всероссийской конференции с международным участием, посвященной 220-летию со дня рождения акад. К. М. Бэра, «Механизмы функционирования висцеральных систем» (Санкт-Петербург, 2012 г.), XXXVIII Конгрессе Федерации Европейских биохимических обществ (Санкт-Петербург, 2013 г.), ХХII Съезде Физиологического общества им. И. П. Павлова (г. Волгоград, 2013 г.), II Российском симпозиуме с международным участием «Световой режим, старение и рак» (г. Петрозаводск, 2013 г.), научной конференции с международным участием, посвященной 20-летию со дня основания Геронтологического общества при РАН, «Фундаментальные проблемы геронтологии и гериатрии» (Санкт-Петербург, 2014 г.), Всероссийской конференции с международным участием «Нейрохимические механизмы формирования адаптивных и патологических состояний мозга» (Санкт-Петербург, 2014 г.), IV съезде физиологов СНГ «Физиология и здоровье человека» (г. Сочи, 2014 г.). Публикации по теме диссертационной работы По материалам исследования опубликована 51 печатная работа, в том числе 19 статей в научных журналах и сборниках научных трудов (из них 13 – статьи в журналах, включенных в Перечень ВАК Министерства образования и науки РФ) и 32 тезисов докладов. Все результаты и положения диссертационного исследования полностью отражены в публикациях. Связь исследований с планом НИР Диссертационное исследование проведено в соответствии с планом НИР ФГБУ «Научноисследовательский институт акушерства и гинекологии им. Д. О. Отта СЗО РАМН» по теме: «Нарушения нейрохимических механизмов центральной регуляции репродуктивных циклов и их коррекция (экспериментальное исследование)». Работа выполнена при поддержке грантов: РФФИ 2000-2002 №00-04-48967-а «Роль мелатонина при нарушениях центральной регуляции репродуктивной функции под влиянием неблагоприятных экологических факторов нейротоксической природы»; РФФИ 2004-2006 №04-04-49204-а «Изучение механизмов нарушения суточных ритмов биогенных аминов, участвующих в гипоталамической регуляции репродуктивной функции, под влиянием нейротоксических ксенобиотиков»; РФФИ 2010-2012 №10-04-00749-а «Механизмы нарушения регуляции репродуктивной функции женского организма при гипергомоцистеинемии». 15 Структура и объем диссертации Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, описания результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов, практических рекомендаций, списков наиболее часто встречающихся сокращений и литературы. Текст диссертации изложен на 253 страницах, содержит 11 таблиц и иллюстрирован 53 рисунками. Список литературы содержит 657 источников, из которых отечественных – 126, зарубежных – 531. 16 ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Гипоталамо-гипофизарная регуляция репродуктивной функции женского организма Известно, что репродуктивная функция регулируется сложными нейроэндокринными механизмами. До середины прошлого века нервная и эндокринная системы воспринимались и изучались как совершенно изолированные в функциональном отношении, при этом каждой системе отводилась особая роль в поддержании гомеостазиса и адаптации организма к различным условиям среды обитания. Впервые на возможную связь этих систем указал Дж. Харрис в 1948 г., когда им была выдвинута гипотеза, согласно которой нормальное функционирование репродуктивной системы возможно лишь при условии интегрированного контроля нервных и гуморальных сигналов [цит. по: Агаджанян Н. А., Радыш И. В., Краюшкин С. И., 1998]. Им же несколько ранее было выдвинуто предположение о том, что овуляторные отклики на электрическую стимуляцию гипоталамуса обязательно должны проходить через гипофиз. Собственные наблюдения Дж. Харриса и исследования других ученых позволили установить, что гипоталамический контроль репродуктивной функции осуществляется нейрогуморальным образом. Следующим этапом исследований было изучение химической природы молекул физиологически активных веществ, синтезируемых нейронами гипоталамуса и секретируемых в специфическую портальную систему кровотока аденогипофиза. В 1962 г. С. Макканн предположил, а почти десять лет спустя, в 1971 г., Р. Скалли доказал существование декапептида гонадотропин-рилизинг гормона (ГнРГ), или гонадолиберина. В дальнейшем это позволило внедрить методы определения его локализации в гипоталамусе. Правильное понимание работы контролирующих систем репродуктивной эндокринологии в первую очередь определяется точным знанием локализации гонадолиберин-синтезирующих нейронов в мозге, а также анатомического расположения нейросекреторных путей его выведения [Вихляева Е. М., 2006]. Отличительной чертой женского организма является наличие половой цикличности, которая в мужском гипоталамических организме ядер. Началу утрачивается каждого во время репродуктивного половой цикла дифференцировки предшествует ряд гормональных изменений в организме, важнейшим из которых является резкое повышение в крови уровня гонадотропных гормонов гипофиза, вызванное гиперсекрецией ГнРГ [Kriegsfeld L. J., Silver R., 2006]. Продолжительность репродуктивных циклов сильно различается у человека и разных видов животных. У женщин овариально-менструальный цикл имеет продолжительность около 28 дней, у крупного рогатого скота, свиней и овец эстральный цикл длится около 21 дня. Эстральный цикл у крыс и мышей ввиду отсутствия активной фазы желтого тела, которое 17 образуется, но в отсутствие оплодотворения, по-видимому, не имеет особого функционального значения, является самым коротким из репродуктивных циклов млекопитающих и составляет 4-5 дней. У животных, не относящихся к приматам (коровы, свиньи, кролики, крысы и т.д.), используется следующая классификация фаз репродуктивного цикла (в скобках указана продолжительность фаз эстрального цикла у крыс), не соответствующая классификации фаз менструального цикла у женщин, общепринятой в акушерстве и гинекологии [Агаджанян Н. А., Радыш И. В., Краюшкин С. И., 1998]: 1) фаза проэструса – период созревания фолликула и подготовки к овуляции (12-14 ч); 2) фаза эструса – период овуляции, который сопровождается влагалищным кровотечением и повышением половой активности (25-27 ч); 3) фаза метаэструса (диэструс-1) – период, когда исчезают изменения репродуктивного тракта, наблюдаемые на стадии эструса (6-8 ч); 4) фаза диэструса (диэструс-2) – период покоя, в ходе которого репродуктивный тракт готовится к приему яйцеклетки, спариванию и возможному оплодотворению (55-57 ч). Для ГнРГ характерен определенный фоновый уровень секреции, носящей импульсный характер [Matagne V. et al., 2004]. Частота пульсов фоновой секреции in vivo у овариэктомированных обезьян, овец и крыс равна одному пульсу в 40-60 мин., длительность пульса составляет около 5 мин.; для интактных животных характерны более длинные межпульсовые интервалы. Имеются данные, указывающие на то, что у приматов во время преовуляторного повышения уровня ГнРГ его секреция носит характер сплошного излияния в сочетании с присутствием импульсов секреции [Herbison A. E., 2006]. Не последнюю роль в генерации этих импульсов играют clock-гены. Однако каким именно образом функционирование этих генов в гонадолиберинергических нейронах на протяжении цикла связано с ритмами импульсной секреции, длительность фазы которых составляет менее 1 ч, к настоящему времени не установлено. Более ясным на сегодняшний день является то, каким образом в строго определенное время в ходе репродуктивного цикла (а у грызунов, в силу более короткого эстрального цикла в сравнении с менструальным циклом у женщин, еще и в определенное время суток) осуществляется преовуляторная гиперсекреция нейрогормона. Импульсная фоновая секреция ГнРГ осуществляется за счет процессов, просходящих в самих ГнРГ-синтезирующих клетках. Преовуляторная же гиперсекреция ГнРГ обусловлена главным образом взаимодействием двух внешних по отношению к гонадолиберинергическим нейронам сигналов – гуморального (овариального) и нейронального (циркадианного) [Chappell P. E., 2005; Разыграев А. В., Керкешко Г. О., Арутюнян А. В., 2011]. Один из двух внешних по отношению к нейронам, продуцирующим ГнРГ, сигналов имеет гуморальную природу и поступает от яичников с периодичностью, равной продолжительности 18 репродуктивного цикла. Механизм данного сигнала достаточно хорошо изучен и заключается в последовательном чередовании положительных и отрицательных обратных связей между гипоталамусом и яичниками. Положительная обратная связь характеризуется усилением синтеза и секреции ГнРГ в отделах гипоталамуса, ответственных за регуляцию репродуктивной функции, в ответ на увеличение выработки половых гормонов созревающими фолликулами. Гиперсекреция ГнРГ на стадии цикла, предшествующей овуляции, приводит к повышению синтеза фолликулостимулирующего (ФСГ) и лютеинизирующего (ЛГ) гормонов гипофиза, что вызывает еще большее усиление выработки половых гормонов, приводящее к овуляции [Hernández G. et al., 2003; Micevych P. et al., 2003; Levine J. E., 2003; Miller B. H., Takahashi J. S., 2014] (рисунок 1.1). Данный механизм характерен только для особей женского пола, тогда как у особей мужского пола он утрачивается в процессе онтогенеза [van der Beek E. M., 1996; Horvath T. L., Cela V., van der Beek E. M., 1998; Ojeda S. R., Skinner M. K., 2006]. Отрицательная обратная связь, сохранившаяся у обоих полов, заключается в снижении уровня ГнРГ и, как следствие, гонадотропинов повышающимся уровнем половых гормонов в крови. Уровень прогестерона, растущий вплоть до наступления овуляции, по механизму отрицательной обратной связи препятствует возникновению новых преовуляторных пиков секреции ГнРГ на последующих стадиях эстрального или менструального цикла. Рисунок 1.1 – Изменение втечение эстрального цикла содержания гонадолиберина в гипоталамусе и уровня гонадотропных (лютеинизирующий и фолликулостимулирующий гормоны) и половых (эстрадиол, прогестерон) гормонов в крови. Воспроизводится по [Miller B. H., Takahashi J. S., 2014] 19 Основными гипоталамическими структурами, ответственными за регуляцию репродуктивной функции у грызунов, являются медиальная преоптическая область (МПО) и срединное возвышение (СВ) с аркуатными ядрами (Арк) (рисунок 1.2). Известно, что тела нейронов, продуцирующих ГнРГ, не образуют крупных скоплений. Помимо МПО гипоталамуса и входящего в нее сосудистого органа концевой пластинки (СОКП), где находится наибольшее их количество [Barraclough C. A., Wise P. M., 1982; Kiss J., Halasz B., 1985], гонадолиберинергические нейроны также присутствуют в вентральном переднем гипоталамусе и в области срединной перегородки [Charlton H. M., 1992). Однако у грызунов именно МПО гипоталамуса является основным местом сосредоточения тел гонадолиберинергических нейронов, посылающих свои проекции в СВ гипоталамуса [Rivest S., Rivier C., 1995]. Эта гипоталамическая зона, скорее всего, является местом аксон-аксональных взаимодействий, что видно на примере тесного расположения дофаминергических и гонадолиберинергических окончаний, особенно во внешнем слое, и выступает как основная структура, ответственная за секрецию ГнРГ, транспортируемого в эту область по аксонам из МПО гипоталамуса. Помимо СВ гипоталамуса секреция ГнРГ также осуществляется и непосредственно из СОКП. Критически необходимой зоной для формирования преовуляторного пика секреции ГнРГ является антеровентральная перивентрикулярная зона МПО гипоталамуса, так называемое антеровентральное перивентрикулярное ядро, или медиальное преоптическое ядро (МПЯ), которое содержит нейроны с рецепторами к половым гормонам [Simerly R. B. et al., 1990; Watson R. E. et al., 1995; Gu G. B., Simerly R. B., 1997; Scott C. J. et al., 2000; Wintermantel T. M. et al., 2006] (рисунок 1.2). Несмотря на наличие отдельных исследований in vivo и in vitro, доказывающих прямое действие эстрадиола на гонадолиберинергические нейроны [Roy D., Angelini N. L., Belsham D. D., 1999; Herbison A. E., Pape J. R., 2001; Navarro C. E. et al., 2003; Petersen S. L., Ottem E. N., Carpenter C. D., 2003; Temple J. L. et al., 2004], в настоящее время считается, что эстрадиол и прогестерон преимущественно опосредуют свое влияние на синтез и секрецию ГнРГ через нейромедиаторные системы нейронов, содержащих рецепторы к половым гормонам [Mahesh V. B., Brann D. W., 1998; Warembourg M. et al., 1998; Herbison A. E., 1998; Chappell P. E., Levine J. E., 2000; Kelly M. J., Rønnekleiv O. K., 2008]. Нейромедиаторы, обладающие как активирующим, так и тормозным действием на продукцию ГнРГ, можно в настоящее время условно разделить на четыре класса: 1) моноамины: серотонин (5-ОТ), норадреналин (НА) и дофамин (ДА); 2) аминокислоты: -аминомасляная (ГАМК), аспарагиновая (аспартат) и глутаминовая (глутамат) кислоты; 3) пептиды: нейропептид Y, 20 опиоиды, нейротензин, кисспептин (метастин), гонадотропин-ингибирующий гормон, галанин и др.; 4) оксид азота (II) [Ojeda S. R., Skinner M. K., 2006]. 1 – гонадолиберинергические нейроны; 2 – аргинин-вазопрессинергические нейроны СХЯ (контакты с кисспептинергическими и другими эстрогенчувствительными нейронами АВПЯ); 3 – ВИП-ергические нейроны СХЯ (прямые контакты с гонадолиберинергическими нейронами МПО); 4 – нейроны СХЯ, образующие контакты с нейроэндокринными нейронами АРК; 5 – тубероинфундибулярные дофаминергические нейроны АРК; 6 – кисспептинергические нейроны АРК; 7 – норадренергические нейроны продолговатого мозга (голубое пятно); 8 – серотонинергические нейроны продолговатого мозга (ядра шва) (МПО – медиальная преоптическая область; АВПЯ – антеровентральное перивентрикулярное ядро; СХЯ – супрахиазматические ядра; АРК – аркуатные ядра; СВ – срединное возвышение) Рисунок 1.2 – Основные структуры мозга, участвующие в регуляции репродуктивной функции у грызунов и нейрональные связи между ними 21 Между различными нейромедиаторными системами происходят многочисленные взаимодействия, благодаря которым и осуществляется регуляция синтеза и секреции ГнРГ [Kalra S. P., 1993; Kalra S. P. et al., 1997; Gore A. C., Terasawa E., 2001; Selvage D. J., Johnston C. A., 2004] (рисунок 1.2). Полагают, что катехоламины НА и ДА, глутаминовая кислота, кисспептин, нейропептид Y, оксид азота (II) стимулируют секрецию ГнРГ, а индоламин 5-ОТ, ГАМК, гонадотропин-ингибирующий гормон и опиоидные пептиды – ингибируют ее [Sizonenko P. C., Aubert M. L., 1986; Freeman M. E., 2006] (рисунок 1.3). Рисунок 1.3 – Изменение в течение для проэструса секреции гонадолиберина и контролирующих его секрецию нейромедиаторов в гипоталамусе В литературе имеются данные о том, что глутаминовая кислота активирует норадренергические нейроны медиобазального гипоталамуса, что приводит к активации нейрональной NO-синтазы с образованием оксида азота (II). Последний, выделяясь из клетки диффузно и взаимодействуя с гонадолиберинергическими нейронами, стимулирует секрецию ГнРГ посредством активации гуанилатциклазы и циклооксигеназы [Całka J., 2006]. По мнению других авторов, хотя гонадолиберинергические нейроны и иннервируются напрямую глутаматергическими процессами [Goldsmith P. C. et al., 1994; Hrabovszky E. et al., 2012], N-метил-D-аспарагиновая кислота (NMDA) едва ли напрямую воздействует 22 на гонадолиберинергические нейроны с целью высвобождения ГнРГ, поскольку лишь очень незначительная субпопуляция этих клеток продуцирует соответствующие рецепторы на протяжении всего препубертатного развития [Gore A. C. et al., 1996; Iremonger K. J. et al., 2010]. Вместо этого глутаматергические нейроны, по-видимому, используют каинатные рецепторы для прямой регуляции секреции ГнРГ, как это происходит в случае активации многих других нейросекреторных нейронов гипоталамуса [van den Pol A. N., Wuarin J.-P., Dudek F. E., 1990; Christian C. A., Pielecka-Fortuna J., Moenter S. M., 2009]. Стимуляция этих рецепторов усиливает секрецию ГнРГ из СВ гипоталамуса in vitro [Donoso A. O., López F. J., Negro-Vilar A., 1990]. Образующийся в мозге из холестерина и других предшественников дигидроэпиандростерон (конвертируемый в тестостерон, который затем, как известно, под влиянием ароматазы Р450 преращается в эстрадиол) способен стимулировать NMDA-глутаматные рецепторы и модулировать другие нейромедиаторные системы (НА, ДА, 5-ОТ, вазопрессин, окситоцин и т.д.), связываясь с внутриклеточными цитоплазматическими и ядерными рецепторами и воздействуя на генную экспрессию рецепторов нейромедиаторов и нейропептидов, что в результате также может приводить к стимуляции синтеза и секреции ГнРГ [Моренков Э. Д., Петрова Л. П., 2009]. Дигидроэпиандростерон также является антагонистом ГАМК-рецепторов типа А, а синтез ароматазы, активность которой коррелирует с содержанием ГнРГ в медиобазальном гипоталамусе [Roselli C. E., Liu M., Hurn P. D., 2009], контролируется гонадотропными гормонами аденогипофиза и глутаминовой кислотой. При этом эстрадиол и глутаминовая кислота выступают в гипоталамусе антагонистами: глутаминовая кислота через NMDA-рецепторы активирует Ca2+-зависимый экзоцитоз вазопрессина и окситоцина, а эстрадиол через свои β-рецепторы подавляет эффект глутаминовой кислоты [Somponpun S., Sladek C. D., 2002; Чернышева М. П., Коваленко Р. И., 2009]. Нейропептид Y также активно вовлечен в процесс транссинаптического контроля полового созревания у крыс [Ojeda S. R., Terasawa E., 2002]. Так, содержание нейропептида Y в целом гипоталамусе увеличивается у крыс после рождения и достигает максимальных значений к моменту наступления половой зрелости [Sutton S. W. et al., 1988]. Однократное интравентрикулярное введение нейропептида Y ускоряет открытие влагалища у молодых крыс и наступление первой овуляции у этих животных [Minami S. et al., 1990; Roa J., 2013]. Недавние исследования показали, что другой пептид, кисспептин (метастин), продуцируемый геном kiss-1 в антеровентральных перивентрикулярных и аркуатных адрах гипоталамуса [Ohtaki T. et al., 2001; Kotani M. et al., 2001; Clarkson J., Herbison A. E., 2011] и являющийся лигандом рецептора GPR-54 [Muir A. I. et al., 2001; Kauffman A. S., Clifton D. K., Steiner R. A., 2007; Hanchate N. K. et al., 2012], активно стимулирует секрецию ГнРГ 23 как у грызунов [Navarro V. M. et al., 2009], так и у обезьян [Ramaswamy S., Gibbs R. B., Plant T. M., 2009; Smith J. T. et al., 2010] и овец [Smith J. T. et al., 2011]. Противоречивой на сегодняшний день остается гипотеза о прямом действии на гонадолиберинергические нейроны синтезируемого в жировой ткани и секретируемого в общий кровоток еще одного пептида – лептина. Лептин может стимулировать секрецию ГнРГ посредством возбуждающих и тормозных нейрональных субпопуляций, синаптически связанных с гонадолиберинергическими нейронами [Watanobe H., 2002; Reynoso R. et al., 2003; Seth A. et al., 2004; Louis G. W. et al., 2011; Roa J., 2013]. Поскольку лептин может синтезироваться в нейронах гипоталамуса крысы [Morash B. et al., 1999], вполне возможно допустить его участие в процессах, регулирующих секрецию ГнРГ посредством транссинаптических механизмов. Норадренергические нейроны также играют важную роль в контроле импульсной секреции ГнРГ в качестве посредников стимулируемого половыми гормонами преовуляторного выброса ЛГ и ФСГ у грызунов [Barraclough C. A., Wise P. M., 1982; Ramirez V. D., Feder H. H., Sawyer C. H, 1984; Kalra S. P., 1986]. Не исключено, что НА в преовуляторный период эстрального цикла может изменять активность дофаминсодержащих нейронов, локализованных в области СВ-Арк гипоталамуса. Есть данные о том, что ДА участвует в контроле циклической секреции ЛГ, активируя процесс секреции ГнРГ из нервных окончаний на уровне СВ гипоталамуса [Бабичев В. Н., 2005]. С другой стороны, были получены убедительные доказательства того, что наступлению полового созревания у самок крыс предшествует постепенное снижение тормозного влияния ГАМК, секретируемой из МПО гипоталамуса [Goroll D., Arias P., Wuttke W., 1993; Moguilevsky J. A., Wuttke W., 2001], а гонадотропин-ингибирующий гормон быстро подавляет секрецию ЛГ у крыс, мышей и хомяков [Butler M. P., Kriegsfeld L. J., Silver R., 2009]. Опиоидные пептиды также подавляют импульсную секрецию ЛГ, а антагонист опиоидных рецепторов налоксон препятствует возникновению эффекта отрицательной обратной связи, вызываемого влиянием эстрадиола на высвобождение ЛГ и ФСГ у взрослых особей [DevorshakHarvey E., Bona-Gallo A., Gallo R. V, 1987; Evans W. S. et al., 1992]. Глиальные клетки также регулируют секрецию ГнРГ, посредством двух связанных друг с другом механизмов, требующих участия факторов роста [Ojeda S. R. et al., 2000; Prevot V. et al., 2007]. Другой сигнал, критически необходимый для осуществления преовуляторной секреции ГнРГ, имеет нейрональную природу и ежедневно поступает от центрального циркадианного осциллятора, супрахиазматических ядер (СХЯ) гипоталамуса, к нейрональным структурам, ответственным за синтез и секрецию этого нейрогормона [de la Iglesia H. O., Schwartz W. J., 2006; Tonsfeldt K. J., Chappell P. E., 2012], (рисунок 1.2). Исследование данного вопроса 24 в прошлом столетии проводилось многими учеными в разных странах мира. Одними из первых, кому удалось найти экспериментальные доказательства существования данного механизма, были Дж. Эверетт и Ч. Сойер. В 1950 г. ими были опубликованы данные об открытии довольно непродолжительного периода времени, являющегося критическим для осуществления преовуляторного пика секреции ГнРГ у крыс. Блокируя секрецию нейрогормона барбитуратами в первую половину дня проэструса (в 14 ч), они наблюдали его выброс лишь с 24-часовым опозданием [Everett J. W., Sawyer C. H., 1950], причем применение барбитуратов спустя всего два часа (в 16 ч) оказывалось уже неэффективным. Позднее, в 1970-х гг., были проведены исследования, которые подтвердили вовлеченность циркадианной системы в регуляцию репродуктивной функции. Данные исследования проводились на овариэктомированных животных, у которых искусственно поддерживался постоянно высокий уровень половых гормонов. В этих условиях пики секреции ГнРГ возникали также с опозданием ровно в 24 ч [Legan S. J., Coon G. A., Karsch F. J., 1975; Legan S. J., Karsch F. J., 1975; Plas-Roser S., Hassani M., Aran C., 1977]. Ряд исследований того же периода связан с изучением влияния изменяющегося светового режима на секрецию ЛГ [Colombo J. A., Baldwin D. M., Sawyer C. H., 1974; McCormack C. E., Sridaran R., 1978]. Работы в этом направлении продолжаются и по сей день. Накоплен большой экспериментальный материал о синхронизации репродуктивных циклов с уровнем освещенности. Так, было установлено, что в условиях световой депривации нормальная эстральная функция сохраняется, тогда как при удлинении светового режима или в условиях постоянного освещения происходят различные нарушения в реализации репродуктивной функции, а именно: увеличение продолжительности эстрального цикла и даже развитие персистирующего эструса у мышей и крыс, снижение содержания ЛГ и увеличение содержания ФСГ в гипофизе крыс, повышение порога чувствительности гипоталамуса к действию половых гормонов по механизму отрицательной обратной связи у самок крыс, у женщин – укорочение продолжительности менструального цикла, появление на протяжении суток двух укороченных пиков секреции ЛГ вместо одного [Swann J. M., Turek F. W., 1985; Анисимов В. Н., Виноградова И. А., 2008]. При этом репродуктивная функция в условиях постоянного освещения оказывалась более уязвимой по сравнению с локомоторной яктивностью и температурой тела экспериментальных животных. Так, в ранних работах было показано, что нормальная эстральная функция самок крыс нарушалась при помещении животных в условия постоянного освещения всего на три дня, тогда как циркадианный ритм локомоторной активности сохранялся в течение двух месяцев и окончательно пропадал спустя лишь три месяца содержания животных в условиях постоянного освещения [Honma K. I., Hiroshige T., 1978; Campbell C. S., Schwartz N. B., 1980; Watts A. G., Fink G., 1981]. 25 Последующие исследования расширили и уточнили имеющиеся представления о сложной организации взаимодействия света, центрального осциллятора циркадианных ритмов СХЯ гипоталамуса и желез внутренней секреции, лежащего в основе выявленных различий, при этом длительное постоянное освешение «выключало» СХЯ гипоталамуса, вызывая эффекты, схожие с таковыми при повреждении центрального осциллятора циркадианных ритмов или его генетических компонентов [Sterner M. R., Cohen I. R., 1995; Edelstein K., Amir S., 1999; Chiesa J. J. et al., 2010; Ono D., Honma S., Honma K., 2013]. Главными генами, образующими основу молекулярного осциллятора у млекопитающих, являются гены группы рer (англ. Рeriod), а именно рer1, рer2 и рer3, и группы cry (англ. Cryptochrome), а именно cry1 и cry2 [Butler M. P., Kriegsfeld L. J., Silver R., 2009; Разыграев А. В., Керкешко Г. О., Арутюнян А. В., 2011]. Транскрипционными факторами по отношению к рer1 и рer2 являются гетеродимеры, сформированные белками CLOCK и BMAL1. Гетеродимеры CLOCK/BMAL1 связываются с нуклеотидной последовательностью CACGTG (Е-бокс) промоторов генов рer1 и рer2 (а также рer3), что инициирует транскрипцию этих рer-генов [Panda S., Hogenesch J. B., Kay S. A., 2002; Reppert S. M., Weaver D. R., 2002]. В результате формируются соответствующие мРНК, которые в цитоплазме транслируются в белки PER1 и PER2. Данные белки транслоцируются в клеточное ядро и образуют стабильные комплексы (включающие в себя также белки CRY1 и CRY2), подавляющие транскрипцию генов рer1 и рer2 посредством связывания с позитивными факторами CLOCK/BMAL1 [Ko C. H., Takahashi J. S., 2006]. В результате формируется чередование подъемов и спадов содержания мРНК, а затем и самих белков PER1 и PER2 с фазой, приблизительно равной 24 ч [Hastings M., O’Neill J. S., Maywood E. S., 2007]. Содержание мРНК реr2 минимально при переходе от ночной фазы к дневной, при этом максимум приходится на время перехода к ночной фазе, тогда как содержание мРНК рer1 (и рer3), напротив, оказывается при данном переходе максимальным [Okamura H., 2003; Kennaway D. J., 2005]. Существует несколько дополнительных молекулярных циклов, регулирующих циклическую экспрессию генов рer1 и рer2. Один из этих циклов включает в себя циклическую продукцию позитивного фактора BMAL1 [Guillaumond F. et al., 2005], которая находится в противофазе с ритмом экспрессии генов рer1 и рer2. Транскрипция гена bmal1 индуцируется белком RORα и тормозится фактором REV-ERBα [Kennaway D. J., 2005; Butler M. P., Kriegsfeld L. J., Silver R., 2009; Чернышева М. П., 2013]. Другой тип регуляции – антагонистическая регуляция со стороны РPAR-белков (HLF, TEF, DBP) и белка E4BP4 [Ueda H. R. et al., 2005; Ripperger J. A., Schibler U., 2006]. В промоторе гена per1 имеется специфическая последовательность, с которой эти белки способны связываться. При этом DBP усиливает, а E4BP4 снижает CLOCK/BMAL1-индуцируемую транскрипцию гена per1. Вместе 26 с тем комплекс CLOCK/BMAL1 способен связываться с его Е-боксом и инициировать транскрипцию гена dbp. Поэтому РPAR-белки, такие, как DBP, экспрессируются в большом количестве в начале дневной фазы и содействуют повышению уровня транскрипции per1. E4BP4 в обилии продуцируется в начале ночи и содействует супрессии транскрипции per1 [Okamura H., 2003]. Уровень белков PER, сформировавшихся в результате экспрессии генов per, также регулируется несколькими факторами, обеспечивающими их стабильность и, по всей видимости, способность проникать в клеточное ядро. Фосфорилирование PER казеинкиназой-Iε обеспечивает цитоплазматическую деградацию PER, не связанного с CRY, и предотвращает преждевременное накопление PER в цитоплазме. Белок PER менее стабилен в отсутствие CRY и может легко деградировать посредством убиквитинирования. Существует предположение, что именно белок CRY опосредует подстройку биологических часов под внешний ритм освещенности, являясь ингибитором транскрипции per и регулируя уровень PER [Young M. W., Kay S. A., 2001; Okamura H., 2003]. Следует отметить, что в промоторах генов cry1 и cry2 также содержится Е-бокс, вследствие чего транскрипция генов cry позитивно регулируется комплексом CLOCK/BMAL1 [Kennaway D. J., 2005; Butler M. P., Kriegsfeld L. J., Silver R., 2009]. То же справедливо и в отношении транскрипции гена rev-erbα [Maywood E. S., O'Brien A. O., Hastings M. H., 2003]. Относительно недавно были обнаружены гены dec1 и dec2, вносящие вклад в ритмичность молекулярного осциллятора. Для этих генов тоже характерно наличие Е-бокса в их промоторных последовательностях. Ингибируя транскрипцию собственных генов путем взаимодействия с CLOCK/BMAL1, белки DEC1 и DEC2 наряду с белками PER и CRY репрессируют транскрипцию генов per и cry [Kennaway D. J., 2005; Boden M. J., Kennaway D. J., 2006] (рисунок 1.4). Все белки так называемых часовых генов (clock-белки) относятся к семейству транскрипционных факторов, содержащих домен basic-helix-loop-helix (bHLH), связывающий белок с ДНК, и PAS-домен, который активируется светом и может связывать железосодержащий гем, кислород, оксид углерода (II) или азота (II) [Чернышева М. П., 2014]. По этой причине PAS-содержащие белки могут реагировать не только на изменение уровня освещенности и параметров магнитного поля, но и газового состава внешней и внутренней сред, что важно для процессов окисления. Информационно значимыми сигналами для фоточувствительных PAS-доменов часовых генов являются также и эндогенные факторы, такие, как, например, изменения мембранного потенциала и воздействия стероидных и пептидных гормонов [Gilles-Gonzalez M. A., Gonzalez G., 2004; Чернышева М. П., 2013]. 27 Рисунок 1.4 – Упрощенная схема взаимодействий молекулярных компонентов центрального осциллятора циркадианных ритмов. Прямая регуляция синтеза нейромедиатора (на примере вазопрессина). Адатаптировано из [Kennaway D. J., 2005]; воспроизводится по [Разыграев А. В., Керкешко Г. О., Арутюнян А. В., 2011] 28 Нейроны СХЯ гипоталамуса, то есть доминирующие клеточные структуры циркадианной системы, получают информацию об уровне освещенности от сетчатки глаза через ретиногипоталамический тракт, содержащий коллатерали клеток сетчатки, которые на уровне зрительного перекреста отходят от зрительного тракта и направляются к вентролатеральной зоне СХЯ гипоталамуса. Данные пути опосредуют ежедневную подстройку молекулярного таймера в соответствии с продолжительностью светового дня [Reuss S., 1996]. Регистрацию и передачу информации о фотоцикле связывают с меланопсинсодержащими ганглиозными нейронами сетчатки [Provencio I. et al., 2000; Devlin P. F., 2002; Simonneaux V., Ribelayga C., 2003; Guler A. D. et al., 2008]. Преимущественными нейромедиаторами ретиногипоталамического тракта, служащими для передачи данной информации, являются глутаминовая кислота и пептид, активирующий гипофизарную аденилатциклазу (РАСАР) [Чернышева М. П., 2013]. Нейрональные пути, проходящие через промежуточный листок латерального коленчатого тела (геникулогипоталамический тракт), где медиаторами служат нейропептид Y, энкефалин и ГАМК, и через ядра шва, содержащие 5-ОТ, также передают СХЯ гипоталамуса информацию об уровне освещенности [Simonneaux V., Ribelayga C., 2003; Morin L. P., 2013]. Очевидно, что осцилляции, генерируемые на уровне генов и их белковых продуктов, амплифицируются и распространяются за пределы центрального циркадианного осциллятора. Существует представление о наличии двух способов передачи ритмического сигнала от основного осциллирующего механизма на молекулярном уровне. Первый подразумевает прямой контроль посредством CLOCK/BMAL1-гетеродимера, который, будучи негативно регулируемым PER/CRY-комплексами, контролирует экспрессию вазопрессина, одного из медиаторов нейронов СХЯ гипоталамуса, ген которого имеет промотор, содержащий Е-бокс (рисунок 1.4). Второй путь, непрямой, состоит в регуляции посредством PPAR-белков, RORα и E4BP4. В данном механизме PPAR-белки действуют на гены-мишени как позитивные, а E4BP4 – как негативный регуляторы [Okamura H., 2003]. Таким образом, возможно формирование ритмов экспрессии нейромедиаторов в нейронах СХЯ гипоталамуса и, как следствие, ритмов активности данных нейронов. К настоящему времени накоплены данные о нейрональных путях, указывающие на возможность как прямого контроля над активностью гонадолиберинергических нейронов со стороны СХЯ гипоталамуса, так и контроля, опосредованного различными нейротрансмиттерными системами, медиаторами в которых служат глутаминовая кислота, ГАМК, пептиды и моноамины. Более того, циркадианный контроль над процессами синтеза и секреции ГнРГ осуществляется нейрогуморальным путем, а именно с вовлечением пинеального гормона мелатонина. 29 На возможность прямого контроля со стороны СХЯ гипоталамуса указывают данные анатомических исследований 1980-1990-х гг., которые подтвердили наличие тесных нейрональных контактов между СХЯ и отделами гипоталамуса, ответственными за регуляцию репродуктивной функции. Так, у крыс были обнаружены прямые моносинаптические пути, связывающие нейроны СХЯ гипоталамуса с гонадолиберинергическими нейронами МПО гипоталамуса и СОКП [van der Beek E. M., 1996; van der Beek E. M. et al., 1997], что в дальнейшем получило оригинальное дополнительное подтверждение [de la Iglesia H. O., Meyer J., Schwartz W. J., 2003]. Также были описаны синаптические контакты между нейронами СХЯ гипоталамуса и дофаминергическими нейронами, посылающими свои проекции в СВ гипоталамуса [Horvath T. L., 1997]. Значительная роль в механизме передачи циркадианного сигнала, поступающего от СХЯ гипоталамуса преовуляторного к гипоталамическим пика секреции структурам, ГнРГ у самок контролирующим крыс, формирование принадлежит различным нейромедиаторным системам. Одним из нейромедиаторов в нейронах СХЯ гипоталамуса, иннервирующих гонадолиберинергические нейроны, является вазоактивный интестинальный пептид (ВИП) [van der Beek E. M. et al., 1993] (рисунок 1.2). Физиологические эксперименты подтверждают роль ВИП в регуляции пика секреции ЛГ [Reppert S. M., Uhl G. R., 1987; van der Beek E. M. et al., 1994; van der Beek E. M., 1996; Palm I. F. et al., 1999; Christian C. A., Moenter S. M., 2008]. Нейроны СХЯ гипоталамуса, содержащие этот нейромедиатор, иннервируют гонадолиберинергические нейроны МПО гипоталамуса [Ward D. R. et al., 2009]. Имеются также данные, указывающие на аргинин-вазопрессин как на медиатор, опосредующий передачу циркадианного сигнала, поступающего от СХЯ гипоталамуса к гонадолиберинергическим нейронам [Palm I. F. et al., 1999; Funabashi T. et al., 2000; Palm I. F. et al., 2001; Kalsbeek A. et al., 2010] (рисунок 1.2). Вазопрессинергические нейроны являются одними из наиболее распространенных нейронов, входящих в состав СХЯ гипоталамуса. Они посылают свои проекции к нейронам МПЯ гипоталамуса, содержащему, как уже было сказано выше, рецепторы к половым гормонам [Watson R. E. et al., 1995]. Так как экспрессия гена вазопрессина регулируется CLOCK/BMAL1-гетеродимером, вазопрессинергические моносинаптические пути от нейронов СХЯ гипоталамуса к гонадолиберинергическим нейронам могут считаться наиболее простой системой регуляции продукции ГнРГ со стороны молекулярного осциллятора [Miller B. H. et al., 2006]. Содержание вазопрессина в СХЯ гипоталамуса претерпевает суточные изменения, сохраняющиеся в условиях световой депривации, с максимумом во время так называемого «критического периода», когда, как предполагается, и поступает циркадианный к гонадолиберинергическим нейронам [Inouye S. T., 1996]. сигнал от СХЯ гипоталамуса 30 Известно, что среди систем, контролирующих продукцию ГнРГ, ведущая роль принадлежит глутамат- и ГАМК-ергической системам. Электрофизиологические эксперименты на мышах позволили установить, что подавляющее большинство постсинаптических потенциалов глутаминовой гонадолиберинергических кислоты и ГАМК. нейронов Более генерируются того, в установлено, ответ что на действие абсолютно все гонадолиберинергические нейроны реагируют на эти две аминокислоты [Herbison A. E., 2003]. Накопленные к настоящему времени сведения о ритмической активности глутамати ГАМК-ергической систем гипоталамуса позволяют рассматривать их как вставочные системы, участвующие в передаче циркадианного сигнала от СХЯ гипоталамуса к нейронам, продуцирующим ГнРГ. Показано, что гонадолиберинергические нейроны экспрессируют субъединицы ГАМК-рецептора типа А и получают синаптические входы от ГАМК-ергических нейронов. В опытах на овариэктомированных крысах с имплантированными капсулами с эстрадиолом было показано, что в присутствии высокого уровня эстрогена уровень секреции ГАМК в МПО гипоталамуса снижается перед наступлением эстрогениндуцированного пика секреции ЛГ [Jarry H., Perschl A., Wuttke W., 1988; Jarry H. et al., 1992]. В опытах на нормально циклирующих самках крыс [Mitsushima D. et al., 2002] было продемонстрировано повышение секреции ГАМК в МПО гипоталамуса в день проэструса, предшествующее по времени формированию пика секреции ЛГ. При этом существенным обстоятельством является то, что в день, предшествующий дню проэструса, то есть когда нормально циклирующее животное находится на стадии диэструса-2 и уже имеется тенденция к повышению уровня эстрадиола в крови [Smith M. S., Freeman M. E., Neill J. D., 1975], наблюдаются менее выраженный подъем и, в дальнейшем, снижение секреции ГАМК. Такие данные указывают на то, что повышенный уровень половых гормонов позволяет реализоваться сигналу (скорее всего, ингибирующему), ежедневно поступающему к гонадолиберин-ергическим нейронам со стороны ГАМКергических систем. Зависимость данного сигнала от центрального осциллятора циркадианных ритмов весьма вероятна, но пока однозначные свидетельства в пользу этого предположения получены не были. Выявленный суточный ритм может быть навязан циклическими условиями освещения [Butler M. P., Kriegsfeld L. J., Silver R., 2009]. В гистологических исследованиях было выявлено, что к антеровентральному перивентрикулярному ядру гипоталамуса крыс поступает массивная афферентная связь от СХЯ гипоталамуса, причем нейроны этой гипоталамической структуры и прилежащей к ней области контактируют со многими перикарионами антеровентрального перивентрикулярного ядра гипоталамуса, содержащими рецепторы к эстрогенам [Watson R. E. et al., 1995]. Имеются данные о том, что большинство нейронов МПЯ гипоталамуса являются одновременно глутамат- и ГАМК-ергическими. Глутамат/ГАМК-ергические нейроны контактируют 31 с нейронами, продуцирующими ГнРГ. Окончания этих «двойных» нейронов содержат два типа везикул, один из которых характеризуется наличием везикулярного транспортера-2 для глутаминовой кислоты, а другой – наличием транспортера для ГАМК. Во время гиперсекреции ЛГ количество везикул с транспортером для глутаминовой кислоты растет, тогда как количество ГАМК-транспортер-позитивных везикул уменьшается. Полагают, что осуществляется противоположно направленная реакция данных нейронов в отношении секреции глутаминовой кислоты и ГАМК в ответ на изменяющийся уровень эстрадиола [Ottem E. N. et al., 2004]. Таким образом, по-видимому, одни и те же нейроны стимулируют продукцию ГнРГ через секрецию глутаминовой кислоты и ингибируют ее посредством секреции ГАМК с чередованием данных активностей. Исследованиями последнего десятилетия было дополнительно показано, что ГАМК, модулируя экспрессию или активность селективных каналов хлорид-анионов, которыми бедны нейроны МПО гипоталамуса, продуцирующие ГнРГ, и нейроны СХЯ гипоталамуса, продуцирующие аргинин-вазопрессин [Kanaka C. et al., 2001; Leupen S. M. et al., 2003], может синхронизировать процесс взаимодействия СХЯ гипоталамуса и гонадолиберинергических нейронов. Другой системой, имеющей, как представляется, большое значение для передачи циркадианного сигнала от СХЯ гипоталамуса гонадолиберинпродуцирующим клеткам, является система нейронов, синтезирующих уже упомянутый выше кисспептин (метастин) (рисунок 1.2). Недавно было установлено, что нейроны антеровентрального перивентрикулярного ядра, экспрессирующие белок KISS-1, испытывают на себе влияние половых гормонов и вовлечены в механизм индукции преовуляторного пика секреции ЛГ на гипоталамическом уровне [Dungan H. M., Clifton D. K., Steiner R. A., 2006]. В опытах на овариэктомированных мышах, которым были имплантированы капсулы с эстрадиолом, было показано наличие циркадианных паттернов экспрессии kiss-1 в антеровентральном перивентрикулярном ядре и сопряженной экспрессии с-fos в кисспептинергических нейронах, причем пики экспрессии совпадали с увеличением секреции ЛГ. Изменения, наблюдаемые в отношении кисспептинергических нейронов при постоянно высоком уровне эстрадиола, дают основание считать, что активность данных нейронов регулируется посредством циркадианных сигналов. В отсутствие эстрадиола для животных не было характерно наличие циркадианных ритмов секреции ЛГ или экспрессии kiss-1. Таким образом, полученные сведения подтверждают развиваемое в настоящее время представление о том, что система кисспептинергических нейронов антеровентрального перивентрикулярного ядра является эстрадиолзависимым посредником в трансдукции сигнала, поступающего от СХЯ гипоталамуса и обусловливающего временнýю зависимость продукции ГнРГ [Robertson J. L. et al., 2009]. 32 В литературе имеются сведения, позволяющие предполагать наличие зависимости работы опиоидергической системы, вовлеченной в контроль синтеза и секреции ГнРГ, от центрального циркадианного осциллятора. У взрослых самок крыс содержание β-эндорфина в медиобазальном гипоталамусе претерпевает суточные изменения, сохраняющиеся на всех стадиях эстрального цикла [Jamali K. A., Tramu G., 1999]. Уже упомянутые выше белки CRY1 и CRY2, обнаруженные в СХЯ гипоталамуса, а также в других тканях, и требующиеся для поддержания циркадианной ритмичности [van der Horst G. T. et al., 1999], как полагают, действуют как циркадианные фоторецепторы, способные обнаруживать прямое действие светового излучения и таким образом подстраивать биологические ритмы различных тканей к 24-часовой периодичности [Reppert S. M., Weaver D. R., 2002; Ko C. H., Takahashi J. S., 2006]. Поскольку отсутствие этих белковых комплексов ведет к полной потере свободнотекущей локомоторной ритмичности [van der Horst G. T. et al., 1999], они, по-видимому, являются чрезвычайно важными компонентами циркадианного механизма, заключенного в СХЯ гипоталамуса. Мутации clock-генов (сlock, bmal1, per1, per2 и per3, cry1 и cry2) также могут изменять нормальное функционирование центрального циркадианного осциллятора, вследствие чего нарушаются репродуктивные циклы, скоординированная секреция ЛГ в день проэструса и нормальное течение беременности [van der Horst G. T. et al., 1999; Vitaterma M. H. et al., 1999; Bunger M. K. et al., 2000; Zheng B. et al., 2001; Bae K. et al., 2001; Okamura H., 2003; Miller B. H. et al., 2004; Sellix M. T., Menaker M., 2010]. Оксид азота (II), который, как уже отмечалось выше, играет определенную роль в стимулировании секреции ГнРГ, является еще одной сигнальной молекулой, способной выступать в качестве синхронизирующего агента, согласуя поступающие световые стимулы с циркадианным механизмом [Reuss S. et al., 1995; Ferreyra G. A., Cammarota M. P., Golombek D. A., 1998; Mitome M. et al., 2001] и быстро стимулируя транскрицию гена per1 в СХЯ гипоталамуса [Tischkau S. A. et al., 2003]. Пептид, активирующий гипофизарную аденилатциклазу [Ha C. M. et al., 2000; Minami Y. et al., 2002; Apostolakis E. M., Lanz R., O'Malley B. W., 2004], также может синхронизировать процесс взаимодействия СХЯ гипоталамуса и гонадолиберинергических нейронов. Нельзя исключать и роль в вышеописанных процессах глиальных клеток, так как было обнаружено, что в СХЯ гипоталамуса клетки астроглии показывают самый согласованный осцилляторный отклик на действие глутаминовой кислоты [van den Pol A. N., Finkbeiner S. M., Cornell-Bell A. H., 1992; Haak L. L., Heller H. C., van den Pol A. N., 1997; Burkeen J. F. et al., 2011], важного нейромедиатора, опосредующего нейрональное взаимодействие между ретиногипоталамическим трактом и СХЯ гипоталамуса [Shibata S., Liou S. Y., Ueki S., 1986; Nisikawa Y. et al., 2002; van der Leest H. T. et al., 2009]. 33 Предположительно, сигнал от СХЯ гипоталамуса поступает к нейромедиаторным системам, принимающим участие в секреции ГнРГ, не только в день проэструса. На всех стадиях эстрального цикла отмечается ежедневное, происходящее с наименьшей амплитудой в одно и то же время, повышение секреции нейрогормона в СВ гипоталамуса [Sarkar D. K., Minami S., 1995]. Суточные изменения содержания ГнРГ наблюдаются также в СОКП [Степанов М. Г., 1994]. Однако связанное с этим повышение секреции ГнРГ, происходящее не на стадии, предшествующей овуляции, вероятнее всего, не влияет на изменение уровня ЛГ и ФСГ в крови [Sarkar D. K., Minami S., 1995]. Известно, что СХЯ гипоталамуса не содержат рецепторов к половым гормонам [Gundlah C. et al., 2000; Butler M. P., Kriegsfeld L. J., Silver R., 2009], однако тот факт, что циркадианный сигнал, ежедневно поступающий от этих ядер, лишь однажды на протяжении эстрального цикла вызывает высокоамплитудный пик секреции ГнРГ и последующий выброс гонадотропинов, свидетельствует о контроле со стороны гонад за осуществлением самого циркадианного сигнала. Ингибирование половыми гормонами поступающего от СХЯ гипоталамуса циркадианного сигнала во все остальные дни, вероятнее всего, происходит при участии различных нейромедиаторных систем. Таким образом, помимо сигнала, поступающего от СХЯ к отделам гипоталамуса, участвующим в регуляции репродуктивной функции, к ним поступают также сигналы, необходимые для формирования периода чувствительности, в течение которого гонадолиберинергические нейроны могут повысить секрецию нейрогормона [Kennaway D. J., 2005]. Суточные изменения активности этих систем могут являться механизмом, с помощью которого происходит формирование интервала чувствительности гонадолиберинергических нейронов к стимулирующему сигналу, поступающему от СХЯ гипоталамуса [Palm I. F. et al., 2001]. Среди нейромедиаторных систем, принимающих участие в синтезе и секреции ГнРГ, довольно значительная роль принадлежит биогенным аминам. В исследованиях, проведенных с применением биохимических методов в отделах гипоталамуса самок крыс, содержащих тела и окончания гонадолиберинергических нейронов, были выявлены суточные изменения содержания и секреции моноаминов. При этом часть данных указывает на сохранность выявляемых суточных ритмов содержания моноаминов на протяжении нескольких стадий эстрального цикла; по другим сведениям, выраженные изменения в секреции моноаминов наблюдаются лишь на стадии, предшествующей овуляции, что связывают с моноаминергической регуляцией синтеза и секреции ГнРГ [ThyagaRajan S., MohanKumar P. S., Quadri S. K., 1995; MohanKumar S. M. J., MohanKumar P. S., 2004; Кореневский А. В. и соавт., 2007]. На рисунке 1.5 представлены основные пути синтеза и деградации биогенных аминов. 34 А. Б. А. Б. В. А. Схема биосинтеза и метаболизма серотонина (Trp – триптофан, 5HTrp – 5-окситриптофан, 5HT – 5-окситриптамин, 5HIA – 5-оксииндолилуксусная кислота). Б. Схема биосинтеза дофамина и норадреналина. В. Пути деградации катехоламинов (АДГ – алкогольдегидрогеназа, МАО – моноаминоксидаза, КОМТ – катехол-О-метилтрансфераза). Рисунок 1.5 – Схемы биосинтеза и метаболизма биогенных аминов. Адаптировано из [Lenders J. W. et al., 1996; Flatmark T., 2000] 35 Катехоламины были первыми нейромедиаторами, участие которых в регуляции этого процесса и функционировании эстрального цикла было доказано еще в середине прошлого века в классических опытах Дж. Эверетта и Ч. Сойера [Everett J. W., Sawyer C. H., 1950]. В настоящее время наличие синаптических контактов между аксонами катехоламинергических нейронов и телами гонадолиберинергических нейронов в МПО гипоталамуса считается уже общеизвестным фактом [Chen W. P., Witkin J. W., Silverman A. J., 1989; Horvath T. L., Naftolin F., Leranth C., 1993; Clarke I. J. et al., 2006]. В иннервации МПО и СВ гипоталамуса принимают участие дофаминергические нейроны, формирующие так называемые инсертогипоталамическую и мезенцефалическую дофаминергические системы. Кроме того, к этим структурам подходят аксоны норадренергических нейронов, тела которых расположены в продолговатом мозге, а также аксоны серотонинергических нейронов, идущие от ядер шва. Иннервация СВ гипоталамуса осуществляется, помимо этого, нейронами, тела которых располагаются в аркуатных ядрах медиобазального гипоталамуса и формируют тубероинфундибулярную дофаминергическую систему. В этих моноаминергических системах были обнаружены нейроны, чувствительные к половым гормонам; таким образом, активность этих нейронов зависит от уровня половых гормонов в крови и, следовательно, от стадии эстрального цикла [Wise P. M., Rance N., Barraclough C. A., 1981; Kalra S. P., 1993; Бабичев B. H., 2005]. Этот факт наряду с экспериментальными данными, полученными после дополнительного введения моноаминов, позволили выдвинуть предположение об участии этих нейромедиаторных систем в регуляции синтеза и секреции ГнРГ и гонадотропных гормонов. Принято считать, предшествующей что усиление овуляции, связано гонадолиберинергических нейронов синтеза с ГнРГ на иннервацией гипоталамуса стадии в то эстрального цикла, же время самое посредством активации эстрогенчувствительных норадренергических нейронов продолговатого мозга и голубого пятна [Barraclough C. A., Wise P. M., 1982; Kalra S. P., Kalra P. S., 1983; Martins-Afférri M. P. et al., 2003]. Это действие реализуется через α-адренорецепторы [Науменко E. B. и соавт., 1983; Herbison A. E., 1997]. Показано, что агонисты α1-адренорецепторов стимулируют секрецию ГнРГ [Terasawa E. et al., 1988], тогда как введение в СВ гипоталамуса их антагонистов ингибирует секрецию ЛГ на стадии проэструса [Le W. W. et al., 1997]. Однако есть также данные и о том, что НА способен тормозить секрецию ГнРГ, действуя на β-адренорецепторы [Li P. H., 1989; Siawrys G. et al., 2002]. При этом именно уровень половых гормонов в крови регулирует соотношение плотности тех и других рецепторов [Weiland N. G., Wise P. M., 1989]. Для ДА также отмечено как стимулирующее, происходящее при участии инсертогипоталамической дофаминергической системы, так и тормозное влияние, 36 реализуемое через тубероинфундибулярную систему [Gunnet J. W., Lookingland K. J., Moor K. E., 1986; Thayananuphat A. et al., 2007; Rollo C. D., 2009]. Что касается индоламина 5-ОТ, то его влияние на МПО гипоталамуса опосредовано через СХЯ гипоталамуса [Lenahan S. E., Siebel H. R., Johnson J. H., 1986; Deurveilher S., Semba K., 2005]. На уровне же СВ гипоталамуса этот нейромедиатор обеспечивает колебания секреции ЛГ путем периодического торможения секреции ГнРГ [Бабичев В. Н. 2005]. Спектр действия индоламина достаточно широк: он реализует свое влияние на уровне как циклического, так и тонического центров контроля гонадотропной функции, и его роль в этом процессе – синхронизирующая, в комплексе с действием других моноаминов – НА и ДА. Циклическое изменение уровня половых гормонов на протяжении репродуктивного цикла влияет на серотонинергическую нейронную передачу и модулирует распределение и плотность рецепторов к 5-ОТ в различных отделах гипоталамуса [Krajnak K. et al., 2003]. Овариэктомия вызывает снижение активности триптофан-5-гидроксилазы в гипоталамусе морских свинок, которая восстанавливается введением половых гормонов [Lu N. Z. et al., 1999]. Участие моноаминов в регуляции синтеза гипоталамического ГнРГ и их участие в регуляции секреции этого нейрогормона, как уже было указано выше, осуществляется в тесной взаимосвязи друг с другом. Если участие биогенных аминов в формировании гормонального сигнала запуска преовуляторной гиперсекреции ГнРГ не вызывает сомнений, то их роль в формировании циркадианного сигнала остается до сих пор недостаточно изученной и в литературе имеется лишь незначительное количество публикаций, посвященных данному вопросу. Поскольку циркадианный сигнал поступает от СХЯ гипоталамуса, где тела моноаминергических нейронов отсутствуют, исследования последних двух десятилетий в основном были посвящены изучению тех нейромедиаторных систем, которые в этих гипоталамических ядрах присутствуют и которые связывают их с отделами гипоталамуса, ответственными за синтез и секрецию ГнРГ. Рядом исследователей было выдвинуто предположение о том, что основным нейромедиатором, регулирующим скорость синхронизации эндогенных ритмов в СХЯ гипоталамуса с изменяющимся световым режимом, является 5-ОТ [Cagampang F. R., Inouye S. T., 1994; Mrosovsky N., 1996; Slotten H. A., Pitrovsky B., Pévet P., 2000]. Наибольшее скопление серотонинергических окончаний было обнаружено именно в этой гипоталамической структуре [Morin L. P., 1999; 2013], в которой также было зарегистрировано достаточно высокое содержание других моноаминов – НА и ДА. Если предположить, что биогенные амины участвуют в осуществлении ежедневного сигнала, то, вероятнее всего следует ожидать наличия суточной периодичности их активности как в СХЯ гипоталамуса, так и в тех его структурах, которые отвечают за синтез и секрецию ГнРГ. Суточные ритмы этих нейромедиаторов в СХЯ 37 гипоталамуса ранее изучались преимущественно у самцов, так как такой методологический подход позволяет исключить вероятность воздействия на этот процесс овариального сигнала, который наблюдается у самок. Поскольку наличие половой цикличности у самок затрудняет изучение на циркадианного овариэктомированных сигнала, животных, исследования которым зачастую вводятся капсулы выполняются с эстрогенами, поддерживающие их постоянно высокий уровень в организме. Результаты проведенных исследований свидетельствуют о том, что повреждение продолговатого мозга у овариэктомированных крыс вызывает снижение секреции гонадотропных гормонов и повышение содержания ГнРГ в МПО и СВ гипоталамуса на стадии, предшествующей овуляции [Martins-Afférri M. P. et al., 2003]. У самцов и молодых овариэктомированных самок были обнаружены суточные ритмы содержания 5-ОТ в СХЯ, МПО и СВ гипоталамуса. В исследованиях, проведенных на самцах крыс и хомяков описано сохранение суточных ритмов содержания 5-ОТ [Cagampang F. R., Inouye S. T., 1994] и НА [Cagampang F. R., Okamura H., Inouye S., 1994] в СХЯ гипоталамуса (с повышением содержания нейромедиатора в дневные часы и снижением – в ночные) в условиях световой депривации, что указывает на их истинную циркадианную природу. Однако было отмечено, что суточные ритмы содержания 5-ОТ в других отделах гипоталамуса зависели от меняющихся световых условий [Cagampang F. R., Inouye S. T., 1994]. В ряде исследований наблюдались суточные ритмы содержания НА и ДА в МПО и СВ-Арк гипоталамуса [Koulu M. et al., 1989; Арутюнян A. B. и соавт., 2004]. Кроме того, в литературе имеются данные о наличии у самцов и самок крыс суточных изменений активности ферментов синтеза и деградации НА, ДА и 5-ОТ в МПО, СВ и СХЯ гипоталамуса [Daiguji M. et al., 1978; Ishida Y. et al., 2002]. Таким образом, биогенным аминам принадлежит важная роль в регуляции репродуктивной функции, однако ее изучение в женском организме связано с определенными сложностями, поскольку в этом случае имеет место взаимодействие двух сигналов и каждый из них – как повышение уровня в крови половых гормонов, так и циркадианный сигнал, поступающий из СХЯ гипоталамуса, – оказывает свое специфическое действие на моноаминергические системы гипоталамуса. Как уже было отмечено выше, циркадианный контроль над процессами синтеза и секреции ГнРГ осуществляется также и нейрогуморальным путем, а именно с вовлечением пинеального гормона мелатонина. Мелатонин действует непосредственно на гонадолиберинергические нейроны, на нейромедиаторные системы, регулирующие активность этих нейронов, и на центральный осциллятор циркадианных ритмов, СХЯ гипоталамуса, модулируя его работу по принципу обратной связи (см. следующий подраздел). В то время как вентролатеральные части СХЯ гипоталамуса считаются областями, принимающими входящие синхронизирующие сигналы от сетчатки и ствола, его 38 дорсомедиальные части представляют собой сайт выхода регуляторных сигналов. Один из нейрональных путей, по которым эти сигналы передаются, – гипоталамо-пинеальный путь – обеспечивает ритмическую секрецию мелатонина. СХЯ гипоталамуса образуют нейрональные связи с паравентрикулярными ядрами гипоталамуса, нейромедиаторами в которых служат ВИП, вазопрессин, глутаминовая кислота и ГАМК [Perreau-Lenz S. et al., 2004; Butler M. P., Kriegsfeld L. J., Silver R., 2009]. Последний из упомянутых нейромедиаторов опосредует дневное ингибирование стимулирующей активности нейронов паравентрикулярных ядер гипоталамуса в отношении выработки мелатонина пинеальной железой [Kalsbeek A. et al., 2000]. Дорсальные и медиаторами к в латеральные нейроны которых служат интермедиолатеральным вазопрессин нейронам Интермедиолатеральные нейроны паравентрикулярных ядер гипоталамуса, верхних и трех (преимущественно окситоцин, сегментов проецируются спинного холинергические) мозга. посылают свои проекции к верхнему шейному симпатическому ганглию, нейроны которого иннервируют пинеальную железу. К медиаторам нейронов верхнего шейного ганглия относят НА и нейропептид Y [Simonneaux V., Ribelayga C., 2003]. Мелатонин, находясь под контролем со стороны СХЯ гипоталамуса, выполняет функцию гуморального водителя циркадианных ритмов, вызывая через свои рецепторы ритмические процессы в органах-мишенях (рисунок 1.6). Поскольку уровень мелатонина в крови изменяется в соответствии с фазой центрального циркадианного осциллятора, вызываемые мелатонином физиологические процессы также изменяются циклично. Таким образом, органам-мишеням доставляется информация о текущей фазе центрального осциллятора циркадианных ритмов [Cassone V. M. et al., 1993; Cassone V. M., 1998]. Поскольку наиболее критическим фактором, необходимым для формирования преовуляторного пика секреции ГнРГ, является повышение в крови уровня эстрадиола, причем овариальный сигнал должен вступить во взаимодействие с сигналом нейрональной природы, ежедневно поступающим эстрогенчувствительного от СХЯ звена гипоталамуса, на пути возникает передачи вопрос о локализации циркадианного сигнала гонадолиберинергическим нейронам. Проекции нейронов СХЯ гипоталамуса были обнаружены на эстроген-рецепторэкспрессирующих клетках в МПО гипоталамуса грызунов, включая антеровентральную перивентрикулярную область (антеровентральное перивентрикулярное ядро), участвующую в эстрогензависимой регуляции активности гонадолиберинергических нейронов. Наиболее вероятно, что антеровентральная перивентрикулярная область является основной структурой, интегрирующей овариальный и циркадианный сигналы, входящие в гонадолиберинергическую 39 Рисунок 1.6 – Роль пинеальной железы и ее гормона мелатонина в организации биологических ритмов. Адаптировано из [Cassone V. M. et al., 1993] нейрональную сеть [Herbison A. E., 2006]. Это означает, что именно непрямые нейрональные пути (то есть имеющие в своем составе вставочные регулируемые элементы), проходящие от СХЯ гипоталамуса к клеткам, продуцирующим ГнРГ, должны быть способны принимать овариальный сигнал. Не исключена также возможность конвергенции сигналов, поступающих от эстрогенрецептирующих структур и от центрального циркадианного осциллятора, непосредственно на телах гонадолиберинергических нейронов. Более того, было показано, что гонадолиберинергические нейроны способны экспрессировать β-рецептор эстрогенов, 40 что может обеспечивать наличие прямого пути эстрогензависимой регуляции экспрессии генов в данных клетках [Herbison A. E., 2003]. В целом имеющиеся на настоящий момент сведения позволяют утверждать, что циклическая продукция ГнРГ обусловлена регуляторным воздействием со стороны центрального циркадианного осциллятора, СХЯ гипоталамуса, осуществляемым посредством нейрональных связей с гонадолиберинергическими нейронами, а также гуморальным путем посредством гормонов яичников. В случае нейромедиаторов СХЯ гипоталамуса может осуществляться прямой контроль транскрипции их генов посредством позитивных регуляторных CLOCK/BMAL1-комплексов и негативных регуляторов PER/CRY, которые в совокупности являются ядром молекулярного осциллятора. Нейрональные связи СХЯ гипоталамуса с гонадолиберинпродуцирующими клетками могут быть как прямыми, так и опосредованными, а именно c участием медиаторных систем, нейротрансмиттерами в которых являются моноамины, пептиды и аминокислоты. Вовлечение данных вставочных систем обусловливает скоординированную положительную и отрицательную регуляцию продукции ГнРГ. Вставочные системы вовлечены в рецепцию овариального сигнала, критически необходимого для формирования преовуляторного пика секреции ГнРГ. Нейрональные связи осуществляют свое регуляторное влияние на уровне тел и окончаний гонадолиберинергических нейронов. Нейрогуморальный контроль с вовлечением мелатонина обеспечивает синхронизацию продукции ГнРГ с продолжительностью светового дня, а также с сезонными изменениями параметров циркадианного ритма двигательной и пищевой активности. Соответствующие перестройки метаболизма через обратные связи с clockосцилляторами печени и СХЯ гипоталамуса могут способствовать «измерению» продолжительности светового дня в сезон размножения [Ikegami K., Yoshimura T., 2013; Чернышева М. П., 2014]. 1.2. Роль пинеальной железы в регуляции репродуктивной функции Пинеальная железа (эпифиз) – нейроэндокринный орган, тесно связанный с гипоталамусом и периферическими эндокринными железами и играющий значимую роль в регуляции биологических ритмов организма. Функциональная активность пинеальной железы зависит от уровня внешней освещенности. Будучи одним из основных регуляторов жизненных функций организма, свет определяет через гипоталамо-гипофизарно-пинеальную систему биоритмы репродуктивной функции [Агаджанян Н. А., Радыш И. В., Краюшкин С. И., 1998]. 41 При изучении влияния пинеальной железы на репродуктивную систему прежде всего исследуют роль в этом процессе продуцируемого железой гормона мелатонина. К настоящему времени накоплен достаточно большой массив данных, указывающих на роль пинеального мелатонина в процессах полового созревания, а также сведений о том, что именно снижение уровня мелатонина, по мере полового созревания, ведет к растормаживанию центра циклической секреции ГнРГ и, соответственно, гонадотропных гормонов. Однако данные не всех экспериментальных исследований согласуются с этим выводом, и ряд авторов высказывает предположение, что пубертатное снижение содержания мелатонина отнюдь не индуцирует начало биохимических процессов, лежащих в основе полового созревания. С другой стороны, повышение уровня мелатонина в период пубертата не может являться причиной ановуляторных циклов у взрослых животных. Хорошо известно, что свет в видимом диапазоне длин волн тормозит превращение 5-ОТ в мелатонин, что приводит к активации гонадотропной деятельности гипоталамо-гипофизарного нейросекреторного аппарата [Зайчик А. Ш., Чурилов Л. П., 2000]. В то же время имеются сведения о том, что продолжительное, 3-6-месячное, введение мелатонина при нарушении менструальных циклов перименопаузальным женщинам нормализует уровень гонадотропных гормонов гипофиза [Rohr U. D., Herold J., 2002; Bellimanni G. et al., 2006]. Возможно, действие мелатонина на репродуктивную систему можно охарактеризовать, скорее, не как ингибиторное, а как модуляторное. Подобный эффект мелатонина был также отмечен и у средневозрастных самок крыс с нерегулярными эстральными циклами, у которых введение мелатонина в значительной степени повышало секрецию ЛГ и ФСГ на стадии, предшествующей овуляции [Diaz E. et al., 1999]. Помимо этого было показано, что, благодаря своим геропротекторным свойствам, мелатонин замедлял процесс возрастного выключения репродуктивной функции и увеличивал среднюю продолжительность жизни самок мышей и крыс [Meredith S. et al., 2000; Anisimov V. N., 2003; Анисимов В. Н., 2014]. Бóльшая часть экспериментальных работ, посвященных изучению эффектов мелатонина на репродуктивную систему, проведена на хомяках и овцах, то есть на сезонно размножающихся животных. У этих животных мелатонину отводится ключевая роль в регуляции сезонных ритмов репродуктивной активности [Vanecek J., 1998]. Обнаружено, что эффект мелатонина на репродуктивную функцию находится в зависимости от времени года, а также от вида сезонно размножающихся животных. Например, у хомяков, которые размножаются на протяжении длительного светового дня, увеличение продолжительности темного времени суток в осенне-зимний период и, следовательно, более продолжительное повышение уровня мелатонина в крови обусловливают антигонадотропный эффект гормона. В условиях же увеличения продолжительности светового дня даже незначительное повышение 42 уровня мелатонина в ночное время оказывает прогонадотропное действие. Обратная картина наблюдается у овец, которые размножаются осенью и зимой: длительное повышение в крови уровня гормона пинеальной железы вызывает у этих животных прогонадотропный эффект, а снижение продолжительности темного времени суток – напротив, антигонадотропный эффект. Кроме того, в туберальной части гипофиза позвоночных с разными сроками размножения (в сезоны с коротким или длинным световым днем), в том числе птиц, сибирских и сирийских хомячков, коз, овец и мышей, мелатонин подавляет транскрипционный фактор Еуа3, активирующий транскрипцию β-субъединицы тиреотропного гормона [Unfried С. et al., 2009; Чернышева М. П., 2014]. Поэтому при возрастании длительности светового дня, сопровождаемом снижением синтеза и секреции мелатонина, синтез β-субъединицы тиреотропного гормона усиливается, а ночью и в осеннее-зимний период уменьшается [Wyse C., Hazlerigg D., 2009; Dardente H., 2012]. Вспышка света (белого и голубого) ночью вызывает не только резкое снижение уровня мелатонина, но и активацию фактора Еуа3 и экспрессию β-субъединицы тиреотропного гормона. Действуя на соседние клетки эпендимы дна третьего желудочка мозга, тиреотропный гормон способствует экспрессии в них дейодиназы 2 или 3 [Yasuo S. et al., 2009; Dardente H., 2012]. Прогормон Т4 (тироксин), поступающий в танициты из кровеносного русла [Visser W. E. et al., 2010], под действием дейодиназы 2 превращается в активный Т3 (трийодтиронин), а дейодиназа 3 приводит к образованию неактивного rT3. На соотношение дейодиназ влияет продолжительность светового дня: при коротком (высокое содержание мелатонина и низкое – тиреотропного гормона) преобладает синтез дейодиназы 3, а при длинном световом дне (низкое содержание мелатонина и высокое – тиреотропного гормона) наблюдается доминирование дейодиназы 2 [Prendergast B. J. et al., 2013]. В медиобазальном гипоталамусе трийодтиронин активирует пищевое и репродуктивное поведение, стимулируя секрецию кисспептинов (семейство пептидов гена kiss-1) в нейронах, локализованных у самок и самцов мышей в дорсомедиальной зоне задней части аркуатных ядер гипоталамуса, а у самок также и в передневентральной зоне перивентрикулярных ядер гипоталамуса [Gottsch M. L. et al., 2011]. Аксоны, содержащие кисспептины, образуют, как было показано выше, синаптические связи с СХЯ и МПО гипоталамуса, со структурами медиобазального гипоталамуса, участвующими в контроле репродуктивной функции. Таким образом, мелатонин/трийодтиронин-зависимая регуляция кисспептинергической системы гипоталамуса, а также включение гена per1 в петлю регуляции ГнРГ-зависимого синтеза ЛГ и затем половых стероидов дают дополнительное объяснение механизмов взаимосвязи процессов размножения и беременности с продолжительностью светового дня [Чернышева М. П., 2014]. 43 Роль мелатонина в регуляции репродуктивных циклов у крыс, которые размножаются независимо от времени года, в настоящее время остается не до конца выясненной. Во многих работах был показан ингибирующий эффект мелатонина на вызванную ГнРГ секрецию гонадотропных гормонов гипофизом новорожденных крысят [Vanecek J., 1998]. Этот эффект гормона пинеальной железы начинал ослабевать на десятый день постнатального развития и к пятнадцатому дню практически исчезал. Предполагают, что таким образом фотопериод способен влиять на сроки полового созревания, что в полной мере проявляется у диких крыс, но в меньшей степени наблюдается также и у животных в условиях эксперимента [Vanecek J., 1998]. Наряду с этим, хроническое введение гормона пинеальной железы неполовозрелым самкам и самцам крыс вызывало у них более выраженный антигонадотропный эффект и, как следствие, задержку полового созревания, по сравнению с антигонадотропным эффектом, вызываемым снижением длительности фотопериода [Lang U. et al., 1984; Rivest R. W. et al., 1985; Vanecek J., Illnerova H., 1985]. Наблюдаемый эффект введения экзогенного мелатонина на сроки полового созревания зависел от времени суток и был максимальным при введении гормона в поздние вечерние и ранние ночные часы [Lang U. et al., 1984; Rivest R. W. et al., 1985]. Гормон пинеальной железы предположительно оказывает вышеописанные эффекты, непосредственно воздействуя на гипоталамус, где присутствуют рецепторы мелатонина [Lerner A. B. et al., 1958; Fraschini F. et al., 1968; Weaver D. R. et al., 1993; Reppert S. M., Weaver D. R., Ebisawa T., 1994; Liu C. et al., 1997], развивающиеся еще до рождения [Williams L. M. et al., 1991]. Результаты некоторых исследований дополнительно указывают на то, что мелатонин может также напрямую действовать на гипофиз [Martin J. E. et al., 1980; Martin J. E., Sattler C., 1982; Yilmaz B. et al., 2000] и даже на половые железы [Ellis L. C., 1969; Ellis L. C., 1972; Frungieri M. B. et al., 2005; Carnevali O. et al., 2011]. В предыдущем разделе было отмечено, что для реализации репродуктивной функции у самок грызунов необходимо наличие циркадианного сигнала. В настоящее время накапливается все больше данных о важной роли пинеальной железы и ее гормона мелатонина в организации биологических, и прежде всего циркадианных ритмов [Arendt J., 2003; Borjigin J., Zhang L. S., Calinescu A. A., 2012]. Имеются достаточные основания полагать, что пинеальная железа, продуцируя и секретируя мелатонин, регулирует биологические ритмы функционирования различных тканей, органов и физиологических систем в организме, приспосабливая их к смене дня и ночи, светлого и темного периода суток [Arendt J., Skene D. J., 2005] (рисунок 1.6). Ночью, в темноте, нервные окончания, достигающие пинеальной железы, выделяют НА, активирующий в пинеалоцитах синтез ферментов, образующих мелатонин, – арилалкиламин-N-ацетилтрансферазы и оксииндолил-О-метилтрансферазы [Анисимов В. Н., 44 2014]. Яркий свет мгновенно блокирует синтез мелатонина, в то время как в постоянной темноте суточный ритм его секреции, поддерживаемый периодической активностью СХЯ гипоталамуса, сохраняется. Поэтому максимальный уровень содержания мелатонина в пинеальной железе и в крови наблюдается в ночные часы, а минимальный – в утренние и дневные [Мендель В. Э., Мендель О. И., 2010]. Необходимо отметить, что существуют мембранные и ядерные рецепторы к мелатонину [Menendez-Pelaez A., Reiter R. J., 1993; Арушанян Э. Б., 2006]. К мембранным относятся рецепторы следующих трех типов: Mel1a, Mel1b и Mel1c. У человека обнаружены только следующие типы: Mel1a (MT1) – в гипоталамусе, почках, кишечнике; и Mel1b (MT2) – в сетчатке глаза и различных отделах мозга [von Gall C., Stehle J. H., Weaver D. R., 2002]. Рецептор Mel1c обнаружен в клетках амфибий, птиц и рыб, но не представлен у млекопитающих. В мозге крыс наибольшая плотность рецепторов и участков связывания мелатонина отмечается в бугорной части аденогипофиза и СХЯ гипоталамуса [Weaver D. R., Rivkees S. A., Reppert S. M., 1989]. В СХЯ гипоталамуса выявлены как МТ1-, так и МТ2-рецепторы, однако, по имеющимся в настоящее время данным, активация этих рецепторов приводит к различным эффектам в фотопериодическом регулировании гипоталамо-гипофизарной системы [Liu C. et al., 1997; von Gall C., Stehle J. H., Weaver D. R., 2002]. MT1-рецепторы опосредуют активацию генов в медиобазальном гипоталамусе, что вызывает регуляцию фотопериодических гонадальных ответов. Активация же MT2-рецепторов ведет к снижению экспрессии этих генов [Yasuo S. et al., 2009]. Данные типы рецепторов принадлежат к семейству метаботропных рецепторов, сопряженных с G-белками [Анисимов B. H., 1998; von Gall C., Stehle J. H., Weaver D. R., 2002]. Активация этих рецепторов приводит к угнетению аденилатциклазы, вероятно, связанной с активацией Gi-белка [Reppert S. M., Weaver D. R., Ebisawa T., 1994; Dupré S. M. et al., 2011]. Кроме того, показано, что в клетках СХЯ гипоталамуса мелатонин изменяет активность протеинкиназы С [Rivera-Bermudez M. A. et al., 2003; Pandi-Perumal S. R. et al., 2008], а это может быть связано с сопряженностью мембранных рецепторов к мелатонину с фосфолипазой С. Достаточно хорошо изучены механизмы, лежащие в основе биологических ритмов продукции пролактина у грызунов. В частности, установлено, что циклическая экспрессия в клетках гипофиза гена суточного периодизма рer1 и связанное с этим торможение экспрессии гена пролактина осуществляется через активацию МТ1-рецепторов в ночные часы. Устранение влияния мелатонина одновременно тормозит экспрессию гена рer1 и вызывает увеличение секреции пролактина [Jilg A., Moek J., Korf H., 2005]. Следует отметить, что одной из важнейших тканей-мишеней для мелатонина у грызунов является туберальная область аденогипофиза, где высока плотность участков связывания гормона. Предполагается, 45 что изменения секреции пролактина у сезонно размножающихся грызунов (в частности, у хомяков) связаны со значительным снижением плотности МТ1-рецепторов в клетках бугорной части аденогипофиза в условиях короткого светового дня [Dardente H. et al., 2003]. Результаты относительно недавнего исследования испанских ученых [González S. et al., 2012] показали, что известный ингибитор секреции пролактина ДА [Freeman M. E. et al., 2000] задает суточный ритм продукции мелатонина в организме самцов крыс и контролирует в нем ряд биологических процессов, адаптируя мозговую активность ко времени суток. Так, было показано, что рецепторы НА взаимодействуют с рецепторами ДА, образуя «гетеромеры» типа α1B-D4 и β1-D4. В ходе такого взаимодействия ДА ослабляет действие НА, что в свою очередь приводит к снижению продукции и секреции мелатонина. Это ингибирование не наблюдалось в период времени суток, когда не экспрессировался рецептор D4. Рецепторы ДА, как удалось установить, появляются в пинеальной железе ближе к концу ночи. Таким образом, гетеромеризация рецепторов НА и ДА обеспечивает механизм отрицательной обратной связи в системе НА-мелатонин, останавливающий продукцию мелатонина с началом светового дня. Кроме того, в настоящее время можно считать доказанным, что гормон пинеальной железы влияет на биологические ритмы, связываясь со специфическими рецепторами в СХЯ гипоталамуса, активность которых на поверхности мембран имеет собственный суточный ритм [Gauer F. et al., 1994; Gillette M. U., McArthur A. J., 1996; Zitouni M., Pévet P., Masson-Pévet M. 1996; von Gall C., Stehle J. H., Weaver D. R., 2002; Hardeland R., Pandi-Perumal S. R., Cardinali D. P., 2006; Pandi-Perumal S. R. et al., 2008]. Воздействие мелатонина на эндогенные ритмы в СХЯ гиппоталамуса у взрослых животных лучше всего проявляется при помещении их в условия световой депривации. В этих условиях ритмы активности животных контролируются циркадианным осциллятором и поэтому протекают с периодом, равным эндогенному периоду циркадианных ритмов в СХЯ гипоталамуса, несколько отличающемуся от 24 ч в бόльшую сторону [Slotten H. A., Pitrovsky B., Pévet P., 1999]. Такое состояние циркадианного ритма, когда в нем проявляется собственный эндогенный период, не испытывающий влияния извне, принято называть «свободным бегом» ритма, а сам ритм – «свободнотекущим». Обнаружено, что введение мелатонина интактным или пинеалэктомированным крысам через каждые 24 ч в течение нескольких недель синхронизирует свободнотекущие ритмы их активности с 24-часовым циклом введения мелатонина [Warren W. S., Hodges D. B., Cassone V. M., 1993]. При этом синхронизирующий эффект гормона пинеальной железы наблюдался только тогда, когда его вводили в строго определенное время, соответствующее поздним вечерним часам в условиях нормального цикла «свет-темнота». Этот феномен, как было показано в дальнейших исследованиях in vitro, объясняется способностью мелатонина быстро смещать фазу циркадианных ритмов 46 электрической активности в нейронах СХЯ гипоталамуса [Gillette M. U., McArthur A. J., 1996]. Нейроны этой гипоталамической структуры чувствительны к воздействию гормона пинеальной железы только в определенные часы, граничащие с моментом смены дня и ночи, при этом максимальную чувствительность эти нейроны проявляют за два часа до наступления темноты [Gillette M. U., McArthur A. J., 1996; Hunt A. E. et al., 2001]. Благодаря этому мелатонин корректирует период эндогенных ритмов, генерируемых СХЯ гипоталамуса, приводя его в соответствие с ритмами освещенности, существующими во внешней среде. Возможно, данный феномен связан с обнаруженными в СХЯ гипоталамуса циркадианными ритмами изменения плотности мелатониновых рецепторов с максимальными значениями этого показателя на границе смены дня и ночи [Gauer F. et al., 1994]. Тонкий механизм регулирующего влияния гормона пинеальной железы состоит в изменении экспрессии clock-генов в клетках СХЯ гипоталамуса [Roca A. L. et al., 1996; Yasuo S. et al., 2002]. Отмечено, что у пинеалэктомированных животных изменение светового режима быстрее вызывает сдвиг фазы локомоторной активности [Арушанян Э. Б., Батурин В. А., Попов А. В., 1993]. Вышеизложенные факты дают основание полагать, что у взрослых животных воздействие мелатонина на СХЯ гипоталамуса играет стабилизирующую роль, не позволяя этим гипоталамическим структурам слишком быстро и резко отвечать на случайные изменения светового режима и других внешних факторов [Арушанян Э. Б., 1996]. Среди ядерных рецепторов к гормону пинеальной железы в настоящее время различают RORα, имеющий, по меньшей мере, четыре разновидности, и RZRβ, регуляторная активность которого охватывает широкий спектр физиологических процессов [Carlberg C., 2000]. Представители подсемейства этих рецепторов обладают конститутивной транскрипционной активностью (позитивной или негативной в зависимости от промотора и типа клеток), которая может усиливаться лигандом – мелатонином. Таким образом, гормон пинеальной железы способен самостоятельно влиять на процессы транскрипции. Известно, что активация ядерных рецепторов к мелатонину вызывает, например, усиление синтеза γ-глутамилцистеинсинтетазы – основного фермента синтеза в организме глутатиона, что повышает антиоксидантную защиту клетки [Urata Y. et al., 1999; Reiter R. J. et al., 2001]. Наиболее высокая плотность ядерных рецепторов к мелатонину отмечается именно в СХЯ гипоталамуса, однако эти рецепторы были обнаружены и в других гипоталамических ядрах [Анисимов В. Н., 1998; Weaver D. R., Rivkees S. A., Reppert S. M., 1989]. Специфические места связывания гормона пинеальной железы у крыс обнаружены также в МПО гипоталамуса, переднем гипоталамусе [Vanecek J., 1998] и особенно в СВ гипоталамуса [Weaver D. R., Rivkees S. A., Reppert S. M., 1989; Lopez-Gonzalez M. A. et al., 1991], то есть в тех структурах мозга, которые отвечают за синтез и секрецию ГнРГ. 47 Принято считать, что изменение внешней освещенности является первичным экзогенным медиатором, а нарушение секреции мелатонина – основным эндогенным фактором хронофизиологических расстройств. Необходимо отметить, что у млекопитающих пинеальная железа не является осциллятором в отличие от СХЯ гипоталамуса, поэтому ритм мелатонинпродуцирующей функции пинеальной железы всецело задается ритмом активности СХЯ [Cassone V. M., 1990; Reppert S. M., Weaver D. R., 2002; Kalsbeek A. et al., 2006]. Вследствие того что пинеальная железа млекопитающих неспособна непосредственно реагировать на свет (что характерно, например, для амфибий), у высших позвоночных она получает информацию об уровне освещенности особым образом [Kalsbeek A. et al., 2000]. Воспринимаемая глазами световая информация передается в пинеальную железу сначала по нейронам СХЯ базального гипоталамуса и затем по нейронам интермедиолатерального клеточного ствола верхней грудной части спинного мозга и верхнего шейного ганглия. У млекопитающих НА, высвобождаясь из симпатических терминалей преимущественно в условиях световой депривации [Анисимов В. Н., 1997], связывается с β1-адренорецепторами на наружной мембране пинеалоцитов. Поскольку эти рецепторы являются типичными метаботропными рецепторами, происходит активация Gs-белка и сопряженной с ним аденилатциклазы. Это в свою очередь приводит к увеличению образования цАМФ, активации протеинкиназы А и CREB-белка и инициации транскрипции специфической мРНК, кодирующей арилалкиламин-N-ацетилтрансферазу, а также к индукции этого фермента и, как следствие, образованию пинеальных гормонов индольной (в первую очередь мелатонина) и, возможно, пептидной природы. Одновременно с повышением образования цАМФ активация Gs-белка вызывает стимуляцию гуанилатциклазы, что увеличивает уровень пинеального цГМФ. Повышение уровня цГМФ в пинеальной железе крыс, независимо от изменяющегося уровня цАМФ и при участии протеинкиназы С [Ho A. K., Chik C. L., 1995], способствует продукции индольных гормонов, хотя и не вызывает непосредственной индукции арилалкиламин-Nацетилтрансферазы. Некоторые авторы допускают существование в пинеальной железе особого механизма, который усиливает синтез мелатонина без непосредственного повышения активности арилалкиламин-N-ацетилтрансферазы [Ebadi M., Govitrapong P., 1986; Ho A. K., Chik C. L., 1995]. В целом роль цГМФ в образовании гормонов пинеальной железы остается в настоящее время недостаточно понятной и требует дальнейшего изучения. Кроме адренергической иннервации пинеальная железа млекопитающих получает также сигналы от разнообразных неадренергических нервных волокон, имеющих как периферическое, так и центральное происхождение [Коваленко Р. И., 2005]. Отходящие от верхнего шейного ганглия симпатические нервы помимо адренергических включают в себя и нейропептид 48 Y-содержащие волокна. Периферические парасимпатические волокна, отходящие от крылонебного и ушного ганглиев тройничного нерва, являются холинергическими и ВИПергическими, а также содержащими гистидинизолейцин [Moller M., 1992]. Центральные волокна поступают от гипоталамуса и лимбических структур переднего и среднего мозга, в частности от структур, задействованных в реакции нервной системы на воздействия различных стрессоров: от паравентрикулярных ядер – волокна, продуцирующие ГАМК, вазопрессин и окситоцин [Kalsbeek А. et al., 2000]; от СХЯ гипоталамуса – вазопрессинергические волокна; от ядер шва – серотонинергические волокна; от таламуса – разнообразные пептидергические, а также волокна, содержащие другие нейромедиаторы, в частности нейропептид Y и ацетилхолин. Значительно менее изучена роль в функциональной регуляции пинеалоцитов неадренергической иннервации. Сведения о сравнительном участии центральной и периферической иннервации в фоторегуляции пинеальной железы остаются достаточно скудными [Martin C., Meissl H., 1990]. В условиях пониженной секреции НА из симпатических нервов [Анисимов В. Н., Рейтер Р. Д., 1990] синтез мелатонина возрастает, что указывает на потенциальную роль неадренергической иннервации без непосредственного участия адренергических волокон в регуляции реакции пинеальной железы на воздействия стрессоров. Рядом авторов высказывается предположение, что эстрадиол, но не прогестерон, способен влиять на ночную секрецию мелатонина [Hayashi K., Okatani Y., 1990; Okatani Y. et al., 1997]. Известно, что ЛГ и тестостерон, блокируя трансляцию м-РНК арилалкиламин-Nацетилтрансферазы, угнетают продукцию гормона пинеальной железы [Lewin D. L., 1996], причем плотность рецепторов к ЛГ на поверхности цитоплазматических мембран пинеалоцитов у самок крыс изменяется в зависимости от стадии эстрального цикла [Itoh M. T., Hosaka T., Takahashi N., 2006]. Одновременно с этим мелатонин способен по механизму отрицательной обратной связи блокировать секрецию ЛГ. Этот эффект, который отмечается у новорожденных крысят, практически полностью исчезает к пятнадцатому дню постнатального развития экспериментальных животных. У половозрелых же самок усиление синтеза и секреции мелатонина в вечерние часы ускоряет снижение уровня ЛГ в крови после дневного преовуляторного пика секреции гонадотропного гормона в день проэструса, то есть синхронизирует с циклом «свет-темнота». Экспериментальное же введение мелатонина перед наступлением времени ожидаемого пика гиперсекреции гонадотропинов блокирует секрецию ЛГ и, таким образом, овуляцию [Vanecek J., Watanabe K., 1999]. В настоящее время механизм подобного действия гормона пинеальной железы на гипоталамо-гипофизарное звено регуляции репродуктивной функции остается еще до конца не выясненным. Поскольку 49 мелатонин не влияет на чувствительность гипофиза к действию ГнРГ, можно выдвинуть предположение, что он действует непосредственно на синтез и секрецию самого нейропептида. Действительно, в культуре клеток гормон пинеальной железы вызывает репрессию гена, контролирующего синтез ГнРГ [Roy D. et al., 2001; Gillespie J. M. et al., 2004], причем действие мелатонина опосредуется связыванием его с соответствующими рецепторами на мембранах гонадолиберинергических нейронов. Данный эффект зависит от времени суток и приводит к циклическим изменениям уровня мРНК ГнРГ с периодом, равным 24 ч. Кроме того, не исключено и влияние гормона пинеальной железы, опосредованное нейромедиаторными системами, контролирующими синтез и секрецию ГнРГ [Alexiuk N. A., Vriend J. P., 1993; Vriend J., Dreger L., 2006]. В опытах in vitro наблюдалось снижение под влиянием мелатонина секреции ГнРГ из СВ гипоталамуса самцов крыс [Rasmussen D. D., 1993]. Вместе с тем мелатонин повышал секрецию ГнРГ из препаратов, содержащих СВ-Арк гипоталамуса. Причину подобных различий автор данного исследования объясняет тем, что препараты СВ гипоталамуса содержат лишь аксоны пептидергических и моноаминергических нейронов, в то время как в препаратах, в которые содержались также и аркуатные ядра гипоталамуса, заключены целостные тубероинфундибулярная дофаминергическая и β-эндорфинергическая нейромедиаторные системы. Было показано, что ДА в опытах in vitro стимулирует секрецию ГнРГ из изолированного СВ гипоталамуса [Negro-Vilar A., Ojeda S. R., McCann S. M., 1979], однако ингибирует ее из препарата СВ-Арк гипоталамуса и это ингибирование, по-видимому, обусловлено повышением активности опиоидергической системы под воздействием ДА [Rasmussen D. D., 1991]. Это позволяет сделать заключение о том, что в препаратах СВ гипоталамуса гормон пинеальной железы, снижая секрецию ДА, вызывает ингибирование дофаминергической стимуляции окончаний гонадолиберинергических нейронов, что в результате приводит к последующему снижению секреции ГнРГ. В препаратах же, содержащих СВ-Арк гипоталамуса, снижение секреции ДА под воздействием мелатонина приводит к снижению активности целостной опиоидергической системы, тонически ингибирующей секрецию ГнРГ. Воздействие гормона пинеальной железы на секрецию ГнРГ наблюдалось только в утренние, но не в вечерние часы. Этот факт может указывать на наличие у нейромедиаторных систем, контролирующих секрецию нейропептида, суточных ритмов чувствительности к мелатонину. Действительно, было получено экспериментальное доказательство наличия суточного ритма ингибирования гормоном пинеальной железы высвобождения ДА в гипоталамусе самцов крыс под действием электрической стимуляции: максимальное ингибирование наблюдалось в утренние часы, минимальное – в ранние ночные часы [Zisapel N., Egozi Y., Laudon M., 1985]. Предположение о непрямом влиянии мелатонина на гонадолиберинергические нейроны, опосредованном 50 нейромедиаторными системами, контролирующие синтез и секрецию ГнРГ, подтверждается также и тем экспериментальным наблюдением, что под действием гормона пинеальной железы увеличивается активность серотонинергической системы в различных структурах гипоталамуса и, кроме того, повышается содержание НА и ДА в целом гипоталамусе [Zisapel N., Egozi Y., Laudon M., 1985; Zisapel N., 2001], тогда как при пинеалэктомии у животных содержание НА, ДА и 5-ОТ в гипоталамусе снижается [Niles L. P., Brown G. M., Mishra R. K., 1983; Míguez J. et al., 1991]. Отдельные исследователи высказывают предположение о том, что ночное повышение уровня гормона пинеальной железы приводит к снижению содержания ДА также и в гипоталамусе человека [Rao M. L., Mager T., 1987]. Другие авторы отмечают, что введение мелатонина снижает содержание НА в гипоталамусе хомяков, а содержание ДА остается при этом неизменным [Juszczak M. et al., 1996]. Таким образом, за последние десятилетия были получены интересные данные, убедительно доказывающие и по-новому освещающие роль гормона пинеальной железы мелатонина в регуляции репродуктивной функции женского организма. 1.3. Возрастные нарушения гипоталамической регуляции репродуктивной функции В настоящее время общепризнанным является представление о ведущей роли гипоталамуса в механизме «включения» репродуктивной функции, однако до сих пор не существует единого мнения по поводу ее «выключения». Согласно предложенной В. М. Дильманом еще во второй половине прошлого века и активно развиваемой с тех пор онтогенетической модели старения [Дильман B. M., 1983; Ebbiary N. A. A., Lenton E. A., Cooke I. D., 1994], представляющей старение как трансформацию генетической программы развития в живого организма гипоталамических в физиологический центрах репродуктивной, механизм, элевационный метаболической процесс (энергетической) и адаптационной гомеостатических систем является ключевым вектором отклонения гомеостазиса, задающим направление и стратегию постнатального развития, равно как и скорость физиологического старения. Причем в качестве основной выступает именно репродуктивная гомеостатическая система. Элевационный процесс постепенно разворачивается у обоих полов еще до периода полового созревания в тоническом репродуктивном центре гипоталамуса, а у девочек, начиная с препубертатного периода, также и в циклическом гипоталамическом центре репродуктивной гомеостатической системы [Жуковский M. A., 1995]. 51 Согласно нейроэндокринологической (элевационной) теории старения и формирования возрастной патологии В. М. Дильмана, возрастное выключение функций репродуктивной системы женского организма вызывается повышением порога чувствительности гипоталамических центров к тормозному действию половых гормонов яичников по механизму отрицательной обратной связи [Анисимов В. Н., 2008]. В рамках данной модели механизм выключения репродуктивной функции осуществляется за счет того же самого процесса, что и ее включение. Непосредственно после рождения гипоталамус чувствительность к тормозящему действию эстрогенов, проявляет которые в максимальную это время уже вырабатываются главным образом гонадами. В соответствии с механизмом отрицательной обратной связи, существующей между половыми гормонами и гипоталамусом, активность тонического центра последнего подавляется. В конце 1950-х гг. была выдвинута концепция, согласно которой включение репродуктивной функции обусловлено развитием в процессе онтогенеза резистентности гипоталамуса к ингибирующему действию эстрогенов [Donovan B. T., van der Werff Ten Bosch J. J., 1959]. Следует отметить, что стимуляция циклического центра гипоталамуса, который контролирует процесс овуляции, является фактором, критически необходимым для включения репродуктивной функции женского организма. Изменения, происходящие в тоническом центре, приводят к увеличению продукции половых гормонов. Когда их содержание в крови достигает определенной величины, они, действуя на циклический центр по механизму положительной обратной связи, индуцируют преовуляторную гиперсекрецию ГнРГ и гонадотропных гормонов, приводящую к овуляции [Дильман B. M., 1983]. Было получено экспериментальное подтверждение того, что в дальнейшем, с возрастом, происходит постепенное повышение порога чувствительности гипоталамуса к действию половых стероидов в циклическом центре [Бабичев B. H., 1981]. Таким образом, для осуществления овариального сигнала запуска гиперсекреции ГнРГ необходимо соблюдение условия постоянно увеличивающегося содержания эстрогенов в крови, что обеспечивается нарастающим порогом чувствительности к ингибирующему действию половых стероидов тонического центра гипоталамуса и, как следствие, повышению в крови базального уровня гонадотропных гормонов [Дильман B. M., 1983; Ebbiary N. A. A., Lenton E. A., Cooke I. D., 1994]. Необходимо отметить, что увеличение секреции ФСГ и ЛГ с возрастом у женщин начинается достаточно рано, по некоторым данным еще до тридцати лет. В. М. Дильманом было выдвинуто предположение о том, что связанное с возрастом повышение содержания ФСГ в крови вызывает повреждение гранулезной ткани, тогда как увеличение уровня ЛГ приводит 52 к гиперплазии интерстициальной ткани яичников [Дильман B. M., 1987]. Однако отчасти благодаря этому повышению секреция половых гормонов яичниками непосредственно в кровеносное русло с возрастом до наступления менопаузы не снижается, несмотря на структурные и функциональные изменения в яичниках, а, напротив, даже возрастает [Вундер П. А., 1980]. По мере старения организма наблюдается компенсаторное усиление функциональной активности яичников, которое происходит, однако, за счет синтеза в них вместо эстрадиола различных эстрогенподобных стероидов, относящихся к группе так называемых неклассических эстрогенов (фенолстероидов). При этом свойства отдельных фенолстероидов могут отличаться от свойств эстрадиола и даже вызывать антагонистический эффект. Так, например, 2-метоксиэстрон играет немаловажную роль в механизме инактивации НА и ДА в гипоталамусе [Fishman J., Norton B., 1975]. Выключение репродуктивной функции происходит в том случае, когда содержание эстрогенов в крови становится недостаточным для индуцирования овуляции в условиях постоянно повышающегося гипоталамического порога [Дильман В. М., 1983]. Таким образом, после наступления менопаузы содержание половых гормонов в крови быстро снижается, что приводит к значительным сдвигам во всей эндокринной системе и резким изменениям гомеостазиса [Берштейн Л. М., 1998]. Состояние, связанное с дефицитом эстрогенов, может сопровождаться развитием таких нейроэндокринных изменений, как, например, изменение функции гипоталамической и лимбической систем и секреции нейрогормонов. Состояние постменопаузы оказывает свое влияние на синтез, секрецию и активность нейромедиаторов, а также сказывается на пластичности и синаптических связях нейронов. Поэтому изучение возрастных изменений, происходящих в гипоталамо-гипофизарной системе, является чрезвычайно важной задачей. У самок крыс также было обнаружено, что уровень половых гормонов, необходимый для формирования преовуляторного пика секреции ЛГ в молодом возрасте, оказывается недостаточным для его выброса у стареющих животных [Mann D. R., Barraclough C. A., 1973; Lu J. K. et al., 1981]. С возрастом у крыс происходит двух-трехкратное ослабление чувствительности нейронов преоптической и аркуатной областей гипоталамуса к половым гормонам [Wise P. M. et al., 2002], что становится заметно уже в среднем возрасте, еще до появления иррегулярных эстральных циклов [Downs J. L., Wise P. M., 2009]. При этом нейроны вышеупомянутых гипоталамических областей не обнаруживали различий в чувствительности, что свидетельствует об отсутствии периодического включения этих областей на протяжении эстрального цикла; следовательно, нормальный ход цикла у стареющих крыс отсутствует. У средневозрастных (8-12 мес.) самок крыс наблюдается задержка и снижение амплитуды пика секреции ЛГ в ответ на введение эстрадиола [Wise P. M. et al., 2002], причем количество гонадолиберинергических нейронов не уменьшается вплоть 53 до стареющего возраста [Downs J. L., Wise P. M., 2009]. Ряд исследователей обращает внимание на тот факт, что у молодых животных в день проэструса за несколько часов до преовуляторного выброса ЛГ наблюдается уменьшение площади поверхности астроцитов МПО гипоталамуса. Авторы этих исследований полагают, что данные изменения площади поверхности астроцитов, которые находятся в непосредственной близости от гонадолиберинергических нейронов, приводят к различным взаимодействиям между нейронами и, как следствие, влияют на время и амплитуду пика гиперсекреции ГнРГ в день проэструса. У крыс же среднего возраста суточная пластичность поверхности этих астроцитов утрачивается [Cashion A. B., Smith M. J., Wise P. M., 2003]. Как правило, при старении у крыс нормальная продолжительность эстрального цикла нарушается, при этом сначала происходит удлинение стадий эструса или диэструса, которое затем сменяется полным прекращением циклирования в конечном состоянии постоянного эструса либо диэструса, продолжающегося 20-25 дней [Вундер П. А., 1980]. Это явление представляет собой биологический эквивалент климактерического периода у женщин. У стареющих нормально циклирующих крыс содержание ГнРГ в гипоталамусе увеличивается, а уровень ЛГ в крови, напротив, снижается. У старых же животных с нерегулярным циклом происходит еще большее увеличение содержания ГнРГ в гипоталамусе (в 2-3 раза по сравнению с молодыми самками), при этом уровень ЛГ в крови продолжает снижаться. Следовательно, процесс старения первично затрагивает механизмы секреции ГнРГ, что приводит к накоплению нейрогормона в гипоталамусе. Наступающее вследствие этого длительное снижение уровня ЛГ в крови и нарушение циклического выделения гормона гипофизом приводит к развитию кист, прекращению овуляции, увеличению массы матки. Таким образом, начальные этапы старения сопровождаются снижением секреции ГнРГ, а последующие этапы – и снижением его синтеза. Старение также является причиной структурных и функциональных изменений в самих гонадолиберинергических нейронах [Yin W., Gore A. C., 2006]. Следует отметить, что, в отличие от человека, у крыс уровень гонадотропных гормонов с возрастом не изменяется. У средневозрастных животных начало преовуляторного подъема уровня ЛГ происходит с задержкой во времени, при этом амплитуда пика секреции этого гонадотропного гормона достоверно снижается [Wise P. M. et al., 2002]. Базальный уровень ЛГ в этом возрасте еще остается неизменным, и только спустя время, с возрастом, происходит его постепенное снижение, приводящее к иррегулярной цикличности и в итоге к ановуляции [Cooper R. L., Conn P. M., Walker R. F., 1980; Nass T. E. et al., 1984; ThyagaRajan S., MohanKumar P. S., Quadri S. K., 1995]. Кроме того, с возрастом у крыс чувствительность яичников к стимуляции гонадотропными гормонами остается на прежнем уровне, 54 тогда как у женщин эта чувствительность постепенно снижается [Meites J., Donovan B. T., McCann S. M., 1978]. Существует предположение, что у крыс ДА стимулирует секрецию ГнРГ [Kamberi I. A., Mical R. S., Porter J. C., 1970], а следовательно, и ЛГ, а у женщин – напротив, ингибирует [Judd S. J., Rakoff J. S., Yen S. S. C., 1978]. Большинство исследователей отмечают постепенное снижение с возрастом содержания ДА в среднем мозге как у крыс, так и у человека, что ведет к противоположно направленным изменениям в секреции гонадотропных гормонов [Morgan D. G., 1987; Бабичев В. Н., 2005], и клинические наблюдения показывают антидофаминергические эффекты высоких доз эстрогенов, в том числе и оральных контрацептивов; кроме этого, было показано, что заместительная гормональная терапия обостряет симптомы болезни Паркинсона, что также указывает на антидофаминергическое действие высоких доз эстрогенов, противоположное действию физиологическего уровня эстрадиола. Значительное число исследований свидетельствует о существенных возрастных изменениях в содержании и (или) метаболизме нейромедиаторов в гипоталамусе [Wise P. M., 1994; Gore A. C., Oung T., Woller M. J., 2002; Cashion A. B., Smith M. J., Wise P. M., 2004; MohanKumar S. M. J., MohanKumar P. S., 2004; Yin W., Gore A. C., 2006], в том числе и в СВ [Esquifino A. I. et al., 2004]. Изменяется активность норадренергических, дофаминергических, серотонинергических и пептидергических нейронов у стареющих животных и человека [Simpkins J. W. et al., 1977; Bhaskaran D., Radha E., 1983; Carfagna N., Trunzo F., Moretti A., 1985; Steger R. W., De Paolo L. V., Shepherd A. M., 1985; Rollo C. D., 2009]. Данные нарушения могут быть вызваны в некоторых случаях полной утратой соответствующих рецепторов [Roth G. S., 1988]. Прекращение половой цикличности также может выступать в качестве одной из основных причин вышеназванных нарушений [Meites J., 1995]. Так, L-3,4-диоксифенилаланин (3,4-ДОФА) восстанавливал эстральные циклы и зависимую от эстрадиола секрецию ЛГ у старых нециклирующих крыс [Forman L. J. et al., 1980]. Агонист α-адренорецепторов клонидин также восстанавливал секрецию ЛГ у нециклирующих крыс [Yin W., Gore A. C., 2006]. Пониженная секреция гонадотропных гормонов и повышенная секреция пролактина у стареющих особей птиц связаны со снижением скорости метаболизма катехоламинов НА и ДА и повышением скорости деградации 5-ОТ, который в регуляции репродуктивной функции может выступать в качестве антагониста ДА [Prasad S. K. et al., 2007]. Старение организма также является причиной десинхронизации нейрональных процессов, которые связывают СХЯ гипоталамуса и гонадолиберинергические нейроны, нарушая при этом суточные ритмы содержания ВИП в СХЯ гипоталамуса и цАМФ в СХЯ гипоталамуса и ростральном преоптическом ядре гипоталамуса [Gerhold L. M., Rosewell K. L., Wise P. M., 55 2005]. Следует отметить, что возрастная динамика состояния нейромедиаторов характеризуется скорее «десинхронизацией», чем одинаковым снижением уровня конкретных нейромедиаторов. Имеющиеся в настоящее время данные литературы о вызываемом старением изменении уровня нейромедиаторов в различных гипоталамических структурах, довольно противоречивы. По мнению некоторых исследователей, механизм нейроэндокринных изменений на уровне гипоталамической системы, которые развиваются на фоне возрастного снижения функции яичников, характерного для женщин в постменопаузе, заключается в снижении дофаминергического и увеличении норадренергического тонуса, что определенным образом связано со снижением активности опиоидергической системы. Кроме того, было доказано, что овариэктомия вызывает повышение активности тирозингидроксилазы, а следовательно, и интенсивности обмена НА в ЦНС [Goldzieher J. W., Green J. A., 1962; Rosenfield R. L., Ehrlich E. N., Cleary N. E., 1972]. Однако другими исследователями было показано, что в процессе старения содержание НА и ДА в гипоталамусе падает, а уровень 5-ОТ и активность тирозингидроксилазы изменяются незначительно [Анисимов В. И., 1979]. С возрастом отмечено уменьшение количества рецепторов к 5-ОТ в СХЯ гипоталамуса [Krajnak K. et al., 2003]. В литературе имеются также данные о том, что в МПО и аркуатных ядрах гипоталамуса у крыс после прекращения половой цикличности снижается содержание НА [MohanКumar P. S., ThyagaRajan S., Quadri S. K., 1995]. При исследовании овариэктомированных крыс, которым вводили половые гормоны, было обнаружено, что содержание ДА в МПО гипоталамуса у 8-11-месячных животных выше, чем у 4-5-месячных [MohanKumar S. M. J., MohanKumar P. S., 2004]. Отмечено повышение с возрастом активности моноаминоксидазы (МАО) и катехол-О-метилтрансферазы (КОМТ) и снижение активности ДОФА-декарбоксилазы и содержания ГАМК в гипоталамусе крыс и человека [Анисимов В. И., 1979]. Отмечается также снижение содержания НА и ВИП, которые предположительно опосредуют воздействие эстрадиола на гонадолиберинергические нейроны. Вместе с тем, уровень ГАМК и опиоидных пептидов оставался неизменным или повышался во второй половине дня проэструса [Downs J. L., Wise P. M., 2009]. В настоящее время ключевое значение в механизмах, определяющих возрастные изменения в нейроэндокринной системе и ведущих в конечном итоге к старению организма, придается некоторыми исследователями изменению в процессе старения уровня различных биогенных аминов [Anisimov V. N., 1987; Анисимов В. Н., 2000]. В дальнейших исследованиях все больше внимания стали уделять изучению возрастных изменений суточных ритмов содержания различных нейромедиаторов в гипоталамических структурах, участвующих в регуляции репродуктивной функции. Так, рядом исследователей было показано нарушение суточных ритмов содержания в гипоталамусе ГАМК. По мнению 56 авторов, уровень этого нейромедиатора в структурах гипоталамуса у молодых животных должен уменьшаться для реализации пика секреции ГнРГ на стадии проэструса [Cashion A. B., Smith M. J., Wise P. M., 2004]. Отмечено также, что в процессе старения изменяется количество глутаматных рецепторов на гонадолиберинергических нейронах [Gore A. C., Oung T., Woller M. J., 2002; Maffucci J. A. et al., 2009]. В некоторых работах было показано, что суточная динамика активности серотонинергической и норадренергической систем, которая первоначально была обнаружена в различных ядрах гипоталамуса молодых самок крыс, в процессе старения исчезает. Особо следует обратить внимание на тот факт, что данные нарушения не связаны с возрастным изменением нейромедиаторных систем или изменением стероидного фона, так как среднесуточный уровень нейромедиаторов в этих структурах и половых гормонов в крови существенным образом не изменяется [Wise P. M., 1994]. Также было обнаружено нарушение суточной динамики содержания НА в МПО гипоталамуса и медиобазальном гипоталамусе у средневозрастных крыс, смещение пика секреции этого нейромедиатора в сторону более поздних часов, а также достоверное снижение амплитуды пика по сравнению с данным показателем у молодых животных [ThyagaRajan S., MohanKumar P. S., Quadri S. K., 1995; MohanKumar S. M. J., MohanKumar P. S., 2004]. В других работах было показано, что происходящие в процессе старения изменения преовуляторного пика секреции ГнРГ и гонадотропных гормонов могут являться следствием снижения активности нейромедиаторных систем, контролирующих эти процессы, в частности, следствием ослабления циркадианного сигнала, поступающего от СХЯ гипоталамуса [Harney J. P. et al., 1996; Davidson A. J. et al., 2008]. Поэтому отдельные исследователи в настоящее время связывают исчезновение суточных ритмов содержания некоторых нейромедиаторов в отделах гипоталамуса, ответственных за синтез и секрецию ГнРГ, и, следовательно, снижение амплитуды пика секреции ЛГ с ослаблением влияния суточного периодизма на моноаминергические системы, которое в свою очередь вызывается снижением функциональной активности СХЯ гипоталамуса в процессе старения [Wise P. M. et al., 1997; Wise P. M., 1999]. Одновременно с исчезновением суточной динамики содержания катехоламинов при старении происходит нарушение циркадианных ритмов содержания опиоидных пептидов в тех же самых отделах гипоталамуса. Так, было показано, что пересадка старым крысам эмбриональной ткани, содержащей СХЯ гипоталамуса, восстанавливает суточные ритмы активности опиоидергической системы [Cai A. et al., 1997]. Кроме того, в той же самой гипоталамической структуре при старении нарушается нормальная суточная динамика содержания вазопрессина [Hofman M. A., Swaab D. F., 1994] и ВИП [Gerhold L. M., 57 Rosewell K. L., Wise P. M., 2005]. Нарушение суточных изменений уровня различных нейромедиаторов, и в частности биогенных аминов, при старении крыс позволяет использовать эти ритмы в качестве маркера целостности связи между циркадианной системой и гипоталамическим звеном регуляции репродуктивной функции [Cohen I. R., Wise P. M., 1988]. В настоящее время все большее число исследований посвящается изучению влияния старения как на циркадианную систему в целом [Gibson E. M., Williams W. P. 3rd, Kriegsfeld L. J. 2009], так и на отдельные ее компоненты, и прежде всего на clock-гены [Bunger M. K. et al., 2000; Asai M. et al., 2001; Kolker D. E. et al., 2003; Kondratov R. V. et al., 2006]. Следствием этих возрастных нарушений для репродуктивной функции становится разбалансировка практически всех нейроэндокринных механизмов, опосредующих процесс овуляции [Gerhold L. M., Rosewell K. L., Wise P. M., 2005]. В последнее десятилетие исследования в этом направлении сосредоточены на поиске соединений, вызывающих синхронизацию утраченных в результате старения организма циркадианных ритмов, участвующих в регуляции репродуктивной функции. 1.4. Изменение содержания пинеального мелатонина при старении В эмбриональном периоде млекопитающие не продуцируют собственный мелатонин, а пользуются материнским, поступающим к ним через плаценту. Имеются данные о том, что материнский мелатонин необходим для установления и поддержания циркадианных ритмов в эмбриональном периферийном генераторе [Ansari N. et al., 2009]. У человека секреция собственного мелатонина начинается на третьем месяце постнатального развития с достижением максимального содержания к первому году жизни. Далее, в течение всего пубертатного периода, уровень мелатонина остается неизменным, а затем, в течение приблизительно пяти лет его количество несколько снижается. После этого уровень гормона не изменяется до достижения человеком возраста сорока-сорока пяти лет, а затем, в период менопаузы и до конца жизни, его количество снижается [Zhao Z. Y. et al., 2002; Коркушко О. В., Хавинсон В. Х., Шатило В. Б., 2006]. Здоровые пожилые люди, у которых сохраняется мелатонинобразующая функция пинеальной железы, обладают более высокими функциональными возможностями организма и более низкими показателями биологического возраста [Коркушко О. В., Хавинсон В. Х., Шатило В. Б., 2006]. У столетних людей, у которых еще сохраняется суточный ритм продукции мелатонина, обнаружено превышение ночной 58 экскреции 6-сульфатоксимелатонина над той, которая обычно характерна для пожилых людей [Magri F. et al., 2004]. Снижение активности пинеальной железы выявлено у различных животных, в том числе у крыс, песчанок и хомяков. У самок крыс, начиная с четырехмесячного возраста, ночная продукция мелатонина пинеальной железой снижается, однако в возрасте 12-16 мес. происходит ее незначительное увеличение, что связывают со снижением продукции половых гормонов, а затем вновь наблюдается снижение ночной продукции гормона, продолжающееся до конца жизни [Okatani Y., Morioka N., Hayashi K., 1999]. В данном исследовании не было отмечено возрастного изменения содержания триптофана и НА в пинеальной железе, однако было обнаружено постепенное снижение с возрастом активности гидроксииндол-О- метилтрансферазы. Снижение активности этого фермента на 17-55% у 18-месячных крыс было показано и в ряде других работ [Dax E. M., Sugden D., 1988; Sanchez-Hidalgo M. et al., 2009]. С возрастом у самок крыс активность арилалкиламин-N-ацетилтрансферазы в пинеальной железе в ночные часы снижается, что сопровождается нарушением циркадианного ритма мелатонина [Reiter R. J., 1991]. Уменьшение содержания гормона в пинеальной железе этих животных наблюдается уже в 12-месячном возрасте, что связано со снижением активности арилалкиламин-N-ацетилтрансферазы и оксииндолил-О-метилтрансферазы и, следовательно, со снижением образования мелатонина из его предшественников [Бондаренко Л. А., 1991]. У 24-месячных животных наблюдается компенсаторное повышение содержания 5-ОТ. Однако уровень мелатонина продолжает стремительно уменьшаться, и уже к 36 мес. обнаруживается минимальное содержание как мелатонина, так и 5-ОТ. Большинство исследователей рассматривают арилалкиламин-N-ацетилтрансферазу в качестве основного фермента, лимитирующего биосинтез мелатонина, и сводят все регуляторные механизмы к контролю его ферментативной активности [Klein D. C. et al., 1997; Zawilska J. B. et al., 2002; Schomerus C., Korf H. W., 2005]. Однако ряд исследователей придерживается той точки зрения, что ночной подъем уровня мелатонина не связан с усилением активности арилалкиламин-N- ацетилтрансферазы, ссылаясь на сохранение нормальной суточной динамики содержания мелатонина в пинеальной железе животных с мутантным геном арилалкиламин-Nацетилтрансферазы [Liu T., Borjigin J., 2005]. К настоящему времени накопилось уже достаточно большое количество данных, свидетельствующих о возрастном снижении функциональной активности пинеальной железы, причем в качестве существенного результата исследователи отмечали снижение в ночное время суток амплитуды пика мелатонина [Reiter R. J. et al., 1980; Бондаренко Л. А., 1991; Míguez J. M. et al., 1996, 1998; Zhao Z. Y. et al., 2002; Magri F. et al., 2004; Гончарова Н. Д., Хавинсон В. Х., Лапин Б. А., 2007]. Согласно результатам одного исследования [Бондаренко Л. А., 1991], 59 ночной уровень мелатонина у 24-месячных крыс оказался в 4 раза, а у 36-месячных в 12 раз ниже, чем у молодых шестимесячных животных. При этом у 12-месячных крыс отмечался нормальный уровень 5-ОТ и его основного метаболита 5-оксииндолилуксусной кислоты (5-ОИУК) в пинеальной железе в дневное время суток, а у 24-месячных животных наблюдалось снижение содержания этих соединений днем, а также ночного содержания 5-ОТ, N-ацетилсеротонина и мелатонина. У хомяков спад дневного уровня 5-ОТ происходит в 12-месячном возрасте, а 5-ОИУК – в 18-месячном. В 18-месячном возрасте наблюдается также снижение содержания нейромедиатора и его метаболита в ночное время суток. С 12-месячного возраста у хомяков отмечается снижение ночного уровня N-ацетилсеротонина, а в возрасте 18 мес. содержание мелатонина в пинеальной железе в ночные часы снижается более чем на 70% по сравнению с молодыми животными. В пинеальной железе старых животных также отмечалось снижение ночного содержания других биогенных аминов – НА и ДА [Míguez J. M. et al., 1998]. До сих пор не существует целостного представления о механизмах возрастного нарушения синтеза и секреции мелатонина пинеальной железой. До 1980-х гг. снижение мелатонинобразующей функции пинеальной железы при старении связывали с различными структурными изменениями железы. В тот же период времени было обнаружено, что с возрастом у животных утолщается соединительнотканная капсула пинеальной железы и увеличивается количество вакуолей в пинеалоцитах, плотных телец, липофусцина. В 1990-е гг. рядом ученых было установлено, что при старении на 30% уменьшается число «светлых» функционирующих пинеалоцитов и примерно на 12-18% снижается общее их количество, что, по мнению исследователей, и приводит к нарушению нормальной мелатонинобразующей функции пинеальной железы [Reuss S. et al., 1990; Humbert W., Pévet P., 1995]. Дополнительно были обнаружены изменения ядерного аппарата, такие как уменьшение объема ядер и появление компактных ядрышек. Было установлено, что с возрастом усиливаются процессы минерализации пинеальной железы, распространяющиеся преимущественно по краям железы и редко затрагивающие паренхиматозные клетки средней части [Humbert W., Pévet P., 1995; Majeed S. K., 1997]. Минерализация обусловлена отложением солей кальция и нейтральных мукополисахаридов. Однако ряд исследователей придерживается той точки зрения, что подобные структурные изменения железы не являются первопричиной возрастного снижения ее функциональной активности [Gusek W., 1983; Golan J. et al., 2002]. Некоторые авторы вообще не отмечают достоверных признаков атрофии пинеальной железы у пожилых и старых людей [Hasegawa A. et al., 1990], а образование кальциевых отложений в пинеалоцитах, при котором не обнаруживается корреляции между их количеством и возрастом [Mori R., Kodaka T., Sano T., 2003], связывают скорее с функциональной 60 активностью клеток, нежели с их атрофическими изменениями. Кроме того, имеются данные, свидетельствующие о том, что, несмотря на наличие структурных изменений в пинеальной железе, метаболизм индолов в ней нарушается только у очень старых животных [Бондаренко Л. А., 1991]. Следует также отметить, что пинеальная железа является одним из важных звеньев циркадианной системы организма. Изменения в этой системе, которая включает в себя также сетчатку, ретиногипоталамический тракт, СХЯ гипоталамуса, верхние шейные симпатические ганглии, могут привести к снижению продукцию мелатонина. В нейронах СХЯ гипоталамуса млекопитающих локализован центральный циркадианный осциллятор, который осуществляет контроль над большинством биоритмов организма. Среди его функций, контролирующих деятельность СХЯ гипоталамуса, наиболее важное значение имеет регуляция суточного ритма синтеза и секреции мелатонина пинеальной железой с повышением содержания этого гормона в крови в темное время суток [Foulkes N. S., Whitmore D., Sassone-Corsi P., 1997]. При разрушении СХЯ гипоталамуса большинство суточных ритмов организма, в том числе и суточный ритм образования гормона пинеальной железы, полностью нарушаются. Известно, что с возрастом развивается возрастная деструкция нейронов СХЯ гипоталамуса [Hofman M. A., Swaab D. F. 1994] и уменьшается количество рецепторов к мелатонину [Benloucif S., Masana M. I., Dubocovich M. L., 1997]. При старении в этой гипоталамической структуре уменьшается также и количество нейронов, при этом в них обнаруживаются различные дистрофические изменения, происходит избыточное накопление липидов и липофусцина [Chee C. A. et al., 1988]. К снижению функциональной активности пинеальной железы может привести также и нарушение поступления в СХЯ гипоталамуса информации об уровне освещенности, которое в свою очередь может являться следствием возрастного изменения хрусталика и сетчатки глаза [Коркушко О. В., Хавинсон В. Х., Шатило В. Б., 2006]. Другой причиной снижения синтеза гормона пинеальной железы при старении может служить уменьшение плотности и реакционной способности β-адренорецепторов на мембранах пинеалоцитов, которые взаимодействуют с НА [Henden T. et al., 1992], а также возрастное нарушение синтеза и секреции этого нейромедиатора из терминалей нейронов верхнего шейного симпатического ганглия [Reiter R. J. et al., 1980; Jengeleski C. A. et al., 1989]. Как уже было отмечено выше, в некоторых исследованиях было показано, что ослабление поступающего от СХЯ гипоталамуса сигнала к структурам гипоталамуса, отвечающим за реализацию репродуктивной функции, также может быть причиной возрастного изменения преовуляторной секреции ГнРГ и гонадотропных гормонов [Harney J. P. et al., 1996]. Известно, что экзогенный мелатонин способен устранять ряд возрастных нарушений гипоталамического звена репродуктивной системы [Trentini G. P. et al., 1992; Li S., Givalois L., Pelletier G., 1997; 61 Forcada F. et al., 2007], задерживая, например, наступление наблюдаемых в процессе старения изменений нейрональных структур, осуществляющих контроль репродуктивной функции [Pierpaoli W. et al., 1997; Pierpaoli W., 2007]. Данные же о том, что мелатонин воздействует на активность моноаминергических систем гипоталамуса, позволяют выдвинуть предположение, что суточные ритмы содержания биогенных аминов в отделах гипоталамуса, ответственных за регуляцию репродуктивной функции, могут быть в той или иной мере обусловлены ритмами секреции гормона пинеальной железы. Обнаружено, что введение мелатонина самкам мышей замедляет возрастное выключение эстральной функции и увеличивает среднюю продолжительность жизни [Anisimov V. N., 2003]. Имеются данные о том, что у крыс, кормящих потомство, а также у самих крысят, получавших мелатонин в вечернее время суток, реже нарушалась продолжительность эстрального цикла по сравнению с животными, получавшими мелатонин круглосуточно, что позволяет сделать вывод о том, что ночное введение мелатонина способно замедлить процесс возрастного выключения репродуктивной функции [Meredith S. et al., 2000]. Вместе с тем было показано, что эффекты экзогенно вводимого мелатонина сильно зависят от амплитуды ночного пика секреции эндогенного гормона, а также от продолжительности его повышенного уровня в крови на протяжении суток [Комаров Ф. И., Малиновская Н. К., Рапопорт С. И., 2000]. Любое отклонение от нормальных физиологических значений этих показателей может привести к нежелательным последствиям. В условиях недостаточной функции пинеальной железы, которая наблюдается при старении, воздействии ряда ксенобиотиков, а также при различных заболеваниях введение мелатонина приводит к положительным результатам за счет восстановления нормального содержания гормона в крови [Pierpaoli W. et al., 1997; Pierpaoli W., 2007]. Однако применение экзогенного мелатонина на фоне нормального его синтеза в организме может привести к ряду негативных последствий в связи с превышением нормальных физиологических значений содержания гормона в крови [Guardiola-Lemaitre B., 1997; Арутюнян A. B. и соавт., 2003]. 1.5. Влияние пептидных биорегуляторов на репродуктивную функцию Как уже было отмечено в одном из предыдущих разделов, все бóльшую важность и актуальность в настоящее время приобретает задача поиска фармакологических средств коррекции возрастных изменений содержания биогенных аминов и других нейромедиаторов в системе, ответственной за регуляцию репродуктивной функции. Известно, что 62 при содержании крыс на рационе с обедненным содержанием триптофана, приводящем к снижению содержания 5-ОТ в мозге, наблюдается замедление изменений репродуктивной функции, вызываемых старением. Введение мышам противосудорожного препарата дифенина, который увеличивает в ЦНС уровень биогенных аминов, прежде всего ДА, также замедляет процесс старения репродуктивной системы и продлевает циклическую эстральную функцию. Однако, согласно заключению экспертов Международного агентства по изучению рака, дифенин является канцерогенным для человека [Анисимов B. H., 2000]. Изучение влияния полипептидного препарата пинеальной железы эпиталамина на репродуктивную систему выявило его способность продлевать деятельность яичников у самок мышей и крыс, восстанавливать репродуктивную функцию у старых крыс и чувствительность их гипоталамических половых центров к эстрогенам [Слепушкин В. Д., Мордовин В. Ф., Золоев Г. К., 1983; Морозов В. Г., Хавинсон В. Х., 1996; Анисимов В. Н., 1998; Хавинсон В. Х., Морозов В. Г., 2001; Коркушко О. В. и соавт., 2002; Долгов Г. В., Цвелев Ю. В., Малинин В. В., 2004]. Представитель класса цитомединов, эпиталамин представляет собой комплекс водорастворимых пептидов, полученный из пинеальной железы крупного рогатого скота. В эпиталамине содержится большое количество основных аминокислот (Lys, Arg, His). Установлено, что эпиталамин обладает тропным действием в отношении подкорковых образований мозга и позволяет осуществлять регуляцию гормонального баланса опосредованно, через гипоталамо-гипофизарную систему [Khavinson V. Kh. et al., 1997]. При длительном введении эпиталамина наблюдается увеличение средней продолжительности жизни лабораторных животных [Анисимов В. Н., 2008], причем введение препарата 15-месячным крысам приводит к увеличению максимальной продолжительности жизни животных в 3 раза, а 23,4% крыс жили дольше, чем прожившие максимальный срок крысы из группы контроля [Анисимов В. Н., 2008]. Как уже было отмечено выше, с возрастом у самок крыс происходит повышение порога чувствительности гипоталамических структур, ответственных за синтез и секрецию ГнРГ, к гомеостатическому торможению эстрогенами. Эпиталамин вызывал появление нерегулярных эстральных циклов у 24-26-месячных самок крыс, находящихся в состоянии персистирующего эструса. Данный препарат снижал уровень ЛГ и пролактина у старых самок; кроме того, при его введении регистрировались отдельные беременности и рождение здоровых крысят [Морозов В. Г., Хавинсон В. Х., 1996]. Эпиталамин уменьшал пролиферативные изменения влагалищного эпителия и эндометрия в ановулярной фазе [Хавинсон В. Х., Анисимов В. Н., 2003]. Введение препарата также уменьшало число фолликулярных кист [Гаджиева Т. С., Блинова Т. С., 1980]. Было установлено, что эпиталамин стимулирует синтез 5-ОТ, 63 N-ацетилсеротонина, мелатонина и увеличивает секрецию последнего в ночные часы у взрослых и старых крыс. Также было отмечено, что введение данного препарата повышает антиокислительную и антирадикальную активность сыворотки крови при старении, снижает содержание на продуктов перекисного структурные различия, физиологические эффекты. окисления липидов. эпиталамин проявляет Однако исследователи Показано, довольно схожие предполагают, что, с несмотря мелатонином что механизм антиоксидантного действия мелатонина и эпиталамина, скорее всего, различен. У эпиталамина, в отличие от мелатонина, он связан не с собственной антиоксидантной активностью, а с активацией ферментативных антиоксидантных систем организма. Подтверждением данного предположения служат данные о том, что мелатонин обладает сходной антиоксидантной активностью как in vivo, так и in vitro, а эпиталамин in vivo проявляет сравнительно бόльшую активность, чем in vitro [Anisimov V. N., Arutjunyan A. V., Khavinson V. Kh., 2001; Милютина Ю. П. и соавт., 2010]. Антиоксидантное действие эпиталамина может быть опосредовано стимуляцией синтеза и секреции эндогенного мелатонина, который увеличивает активность супероксиддисмутазы и каталазы [Anisimov V. N., Arutjunyan A. V., Khavinson V. Kh., 2001; Khavinson V. Kh., 2002]. В экспериментах, проведенных на крысах и обезьянах, было обнаружено, что эпиталамин при курсовом введении повышает ночную продукцию мелатонина пинеальной железой и восстанавливает суточный ритм содержания гормона в сыворотке крови старых животных [Бондаренко Л. А., Анисимов В. Н., 1992; Гончарова Н. Д. и соавт., 2003]. Показано, что данный полипептидный препарат оказывает модулирующее влияние на мелатонинобразующую функцию пинеальной железы у человека [Коркушко О. В. и соавт., 2004]. В литературе имеются данные о том, что введение эпиталамина пожилым людям с относительно высоким содержанием мелатонина в крови приводило к уменьшению ночного пика секреции гормона пинеальной железы, тогда как у людей с низким содержанием мелатонина данный препарат повышал ночной уровень гормона более чем в два раза [Коркушко О. В. и соавт., 2006]. Приведенные факты свидетельствуют о частичной реализации фармакологических эффектов эпиталамина на уровне самой пинеальной железы [Бондаренко Л. А., 1997]. Были получены данные о том, что интраназальное введение препарата, а также добавление эпиталамина в среду инкубации изолированной пинеальной железы крыс изменяет электрическую активность пинеалоцитов [Khavinson V. Kh., 2002]. Однако конкретные биохимические аспекты взаимоотношения эпиталамина и индолилалкиламинов продолжают оставаться до сих пор не до конца выясненными [Бондаренко Л. А., 1997]. Однократное введение эпиталамина крысам приводило через час 64 к более чем 15-кратному увеличению содержания цГМФ в пинеальной железе по сравнению с показателями у контрольных животных, тогда как содержание цАМФ в железе практически не изменялось. Описанное увеличение содержания цГМФ указывает на гуанилатзависимый путь стимуляции образования пинеальных индолов эпиталамином. При введении полипептидного препарата на фоне использования блокаторов адренорецепторов нормальное содержание цАМФ сохранялось, а содержание цГМФ в пинеалоцитах по-прежнему повышалось [Пишак В. П., Заморский И. И., 2000]. Полученные данные позволяют сделать вывод о том, что стимулирующее воздействие эпиталамина на пинеалоциты не опосредуется адренергической иннервацией железы и адренорецепторами, которые находятся на поверхности пинеалоцитов. Полученные результаты в некоторой степени объясняют причину эффективности применения эпиталамина при старении, когда, согласно отдельным данным, количество функционирующих адренорецепторов на поверхности пинеалоцитов снижается [Анисимов В. Н., 1997]. При этом, как уже было отмечено выше, цГМФ, независимо от цАМФ, активирует протеинкиназу С, участвующую в биосинтезе мелатонина [Ho A. K., Chik C. L., 1995], не вызывая при этом непосредственной индукции арилалкиламин-N-ацетилтрансферазы. В последнее десятилетие представляется достаточно интересным с научной точки зрения и перспективным для дальнейшего использования в клинических целях изучение применения другого геропротекторного препарата – эпиталона, который, как было показано в эксперименте, стимулирует секрецию мелатонина пинеальной железой, более чем троекратно повышая вечерний уровень гормона у старых макак [Гончарова Н. Д., Хавинсон В. Х., Лапин Б. А., 2007]. Эпиталон относится к классу цитогенов, обладающих высокой биологической активностью в сверхмалых дозах. Препарат разработан Санкт-Петербургским институтом биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН на основе анализа аминокислотного состава эпиталамина и представляет собой синтетический тетрапептид с химической формулой Ala-Glu-Asp-Gly. Было получено экспериментальное подтверждение гипотезы о том, что эпиталон способен комплементарно взаимодействовать на промоторном участке генов со специфическими сайтами связывания ДНК, вызывая разделение цепей двойной спирали и активацию РНК-полимеразы [Хавинсон В. Х., Шатаева Л. К., Бондарев И. Э., 2003]. Данные наблюдения представляют особый интерес с позиции активно развиваемой в настоящее время А. М. Оловниковым и В. Х. Хавинсоном концепции старения как эволюционно детерминированного биологического процесса возрастного изменения структуры хроматина и экспрессии генов [Оловников А. М., 2003; Хавинсон В. Х., Шатаева Л. К., Бондарев И. Э. 2003; Хавинсон В. Х., 2009]. 65 Кроме того, было обнаружено, что эпиталон замедляет старение репродуктивной функции [Анисимов В. Н., 2005], то есть проявляет физиологические свойства, сходные со свойствами природного прототипа этого синтетического пептидного биорегулятора – эпиталамина. Еще один геропротекторный препарат, синтетический трипептид пинеалон с химической формулой Glu-Asp-Arg, также разработанный Санкт-Петербургским институтом биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН, как и два предыдущих препарата, обладает ярко выраженными антиоксидантными, антигипоксическими и нейропротекторными свойствами [Козина Л. С., 2009]. Так, было показано, что пинеалон существенно снижал скорость Fe2+-индуцированного окисления липопротеиновых комплексов плазмы крови человека, повышал устойчивость экспериментальных животных к гипоксии, активируя антиоксидантные ферменты (супероксиддисмутазу и глутатиопероксидазу) в мозге чувствительных к гипоксии крыс. Нейропротекторные свойства данного препарата также проявлялись в защите нервных клеток от окислительного стресса, развивающегося в результате гипоксического воздействия, как в экспериментах in vivo [Козина Л. С. и соавт., 2008], так и в опытах in vitro [Козина Л. С. и соавт., 2008а]. Пинеалон повышал выживаемость клеток мозжечка 10-12-дневных крыс, подавляя образование активных форм кислорода (АФК) и активируя пролиферативные процессы [Khavinson V. et al., 2011], и защищал потомство крыс от пренатальной гипергомоцистеинемии (ГГЦ), улучшая показатели поведения крысят в тесте «открытое поле», а также увеличивая устойчивость выделенных из их мозжечка нейронов к окислительному стрессу, индуцируемому пероксидом водорода или NMDA [Arutjunyan A. et al., 2012]. При окклюзии сонных артерий у старых крыс введение пинеалона способствовало повышению содержания моноаминов: в коре больших полушарий – 3,4-ДОФА и ДА, в стволовых структурах – адреналина [Карантыш Г. В., 2013]. Подробное изучение нейропротекторной роли пептидных биорегуляторов создает предпосылки для разработки на их основе лекарственных препаратов для профилактики и терапии различных нейроэндокринных нарушений, ассоциированных как с естественным, так и с вызываемым различными неблагоприятными факторами преждевременным старением организма в целом и репродуктивной системы в частности. В то же время по-прежнему остается еще немало неразрешенных вопросов относительно роли каждой из структур, участвующих в регуляции репродуктивной функции (гипоталамус, гипофиз, пинеальная железа, половые железы), процессов, протекающих в этих структурах, а также сложных механизмов взаимодействия их между собой. Понимание этих сложных процессов позволит более аргументированно подойти к разрешению проблемы изучения возрастных изменений, а следовательно, и поиска соединений, способных корректировать нарушения репродуктивной 66 функции при старении, а также при различных токсических воздействиях, данные о возможных механизмах которых представлены ниже. 1.6. Воздействие экзогенных нейротоксических ксенобиотиков толуола и 1,2-диметилгидразина на гипоталамо-гипофизарное звено регуляции репродуктивной системы Из всех веществ, загрязняющих окружающую среду, самым опасным классом соединений, влияющих на репродуктивную систему как мужского, так и женского организма, являются так называемые эндокринные дезинтеграторы. Эти токсины дезинтегрируют нормальные эндокринные механизмы, воздействуя на рецепторы специфических гормонов (например, половых) и таким образом изменяя протекающие в клетках процессы. Было показано, что широкий спектр соединений, источником которых являются растительные экстракты, пластмассы, пестициды, гербициды, фунгициды и иные минеральные и органические удобрения, нарушают нормальное функционирование эндокринных желез, от которых, в частности, зависят и репродуктивные процессы [Stoker T. E. et al., 2000; Stoker T. E., Goldman J. M., Cooper R. L., 2001]. Так, например, было показано, что натрия диметилдитиокарбамат, являющийся продуктом деградации применяемого в настоящее время и обладающего хелатирующими свойствами фунгицида тирама, снижает у крыс активность дофамин--гидроксилазы, вследствие чего снижается синтез НА и в результате подавляется секреция ЛГ вплоть до полного прекращения овуляции [Goldman J. M. et al., 2008]. Также было отмечено, что воздействие некоторых нейротоксических соединений на репродуктивную систему самок крыс вызывает у них нарушения, сходные с наблюдаемыми в процессе старения [Савченко О. Н., Арутюнян Н. А., Степанов М. Г., 1992; Степанов М. Г., 1994; Арутюнян А. В. и соавт., 1997]. Так, при сравнительно коротком воздействии нейротоксикантов наблюдается снижение преовуляторного пика секреции ГнРГ, не исключающее, впрочем, возможности овуляции. Более длительное воздействие этих веществ приводит к существенным нарушениям эстрального цикла вплоть до наступления стойкой ановуляции. Поэтому ряд ученых предполагает возможным использование модели нарушения центральной регуляции репродуктивной функции с введением отдельных ксенобиотиков. Одним из семейств ксенобиотиков, с которыми в настоящее время приходится контактировать достаточно большому количеству людей, является группа ароматических углеводородов, таких как бензол, стирол, толуол и др. В частности, толуол применяется 67 в электронной промышленности, на кожевенном производстве, в качестве растворителя красок, разбавителя лаков, при производстве взрывчатых веществ, красителей, клейкой ленты, как компонент автомобильного и авиатоплива [Echeverria D. et al., 1991; Lucchini R. et al., 2000; Anderson C. E., Loomis G. A., 2003], причем в автомобильном топливе толуол составляет 5-7% от общего веса входящих в его состав нефтепродуктов. Приблизительно 92% всего получаемого в промышленных масштабах толуола используется при производстве различных марок бензинов. И лишь остальные 8% подвергаются дополнительной очистке и применяются в иных целях, в том числе в фармацевтической и косметической отрасли в качестве экстрагирующего агента [Roberts L. G., Nicolich M. J., Schreiner C. A., 2007]. При остром отравлении толуолом, которое наступает при однократном действии больших концентраций ксенобиотика (10-12 г/м3), наблюдается быстро нарастающая вялость, сменяющаяся клоническими судорогами, смерть наступает от остановки дыхания. При хроническом отравлении, которое вызывается ежедневным вдыханием паров ксенобиотика в больших концентрациях (2,0-2,6 г/м3), наблюдаются изменения со стороны крови, дистрофические изменения печени и почек, а также жалобы на головную боль, тошноту, расстройство координации и памяти [Christakis-Hampsas M. et al., 1998; Bowen S. E. et al., 2006; Wiłkość M. et al., 2010]. При этом токсикант обнаруживается во всех тканях, особенно в надпочечниках, нервной ткани и костном мозге [Вилин Ю. Ю., Артемьев И. Ю., 1991]. Ранее отмечалось неблагоприятное воздействие толуола и на репродуктивную функцию [Карпов А. Б., 1991]. В большинстве случаев, в результате применения гигиенических мероприятий, концентрации паров толуола в воздухе рабочей зоны на производствах, где он используется, относительно невелики. Поэтому в настоящее время внимание ученых привлекает изучение возможных отрицательных эффектов постоянного длительного воздействия низких доз ксенобиотика на организм человека как на производстве, так и вне него [Hsieh G. C. et al., 1990; Moro A. M et al., 2012]. Среднегодовая продукция толуола во всем мире составляет на сегодняшний день около 2,4 млн. тонн в год. По этой причине он является одним из загрязнителей атмосферы не только на производстве, но и в окружающей среде. Так, в частности, его находят в почве, где он оказывает неблагоприятное воздействие на микроорганизмы и растения, попадая с пищей в организм животных [Сафонникова С. М., Магжанова С. А., Кондратьева И. А., 1990; Толочкина С. А., Дворникова Т. П., Вавельский М. М., 1992; Chang H. Y. et al., 2009]. Проникает толуол и в грунтовые воды, которые являются одним из основных источников питьевой воды [Hsieh G. C. et al., 1990; Laaks J. et al., 2010]. Недавние исследования показали, что использование и злоупотребление этим широко применяемым в быту и на производстве растворителем за последние десятилетия в мире резко возросли [Paglia-Boak A. et al., 2009]. Таким образом, даже не имеющие прямого 68 контакта с этим веществом люди подвергаются постоянному воздействию его малых доз через вдыхаемый воздух, пищу и питьевую воду. Обнаружено, что одной из основных мишеней токсического действия толуола является нервная система [Win-Shwe T. T., Fujimaki H., 2010]. По своему химическому строению толуол является сильным липофильным агентом, что позволяет ему в больших количествах проникать в богатые липидами зоны, включая такие, как головной и спинной мозг [Iizumi H. et al., 1995; Calderón-Guzmán D. et al., 2005]. Распределение ксенобиотика в различных отделах мозга крыс положительно коррелирует с общим содержанием липидов в каждом из них [Gospe S. M. Jr., Calaban M. J., 1988]. Наибольшее содержание нейротоксиканта обнаруживалось в стволе мозга, средние значения этого показателя наблюдались в среднем мозге и мозжечке, покрышке, таламусе и гипоталамусе, наименьшие – в коре мозга, гиппокампе и обонятельной луковице [Gospe S. M. Jr., Calaban, M. J., 1988; Kiriu T. et al., 1990; Perit K. E et al., 2012]. Недавно проведенные исследования показали, что толуол изменяет в ЦНС экспрессию генов, связанных с нейрональными процессами, участвующими в синаптической передаче [Hester S. D. et al., 2011], и нарушает процесс ацетилирования гистонов в различных отделах мозга крыс [SanchezSerrano S. L., Cruz S. L., Lamas M., 2010]. Ранее было показано, что толуол нарушает работу различных ионных каналов мембран – потенциалнезависимых каналов, активируемых АТФ, ацетихолхолином, ГАМК, глутаминовой кислотой и 5-ОТ, а также потенциал-зависимых натриевых и калиевых каналов [Bale A. S. et al., 2005; Williams J. M., Stanfford D., Steketee J. D., 2005; Liu C. L. et al., 2007]. Нейротоксический эффект ксенобиотика выражается прежде всего в его воздействии на различные нейромедиаторные системы. Так, было обнаружено воздействие толуола на ГАМК-ергическую [Stengård K., O’Konnor W. T., 1994; Beckstead M. J. et al., 2000; Perrine S. A. et al., 2011], глутаматергическую [Lo P. S. et al., 2009], ацетилхолинергическую [Stengård K., 1994; Tsuga H., Honma T., 2000; Chan M. H. et al., 2008], опиоидную [Saracibar G. et al., 2001; Páez-Martínez N. et al., 2008], а также катехоламинергические и серотонинергическую системы [Rea T. M. et al., 1984; Calderón-Guzmán D. et al., 2005, 2005a; Alfaro-Rodríguez A. et al., 2011]. В работах, посвященных изучению влияния толуола на нейромедиаторную передачу, исследуется два возможных варианта его воздействия: пресинаптическое и постсинаптическое. Пресинаптическое воздействие оценивается по изменению под влиянием ксенобиотика содержания в различных отделах мозга нейромедиаторов, уровень которых зависит от скорости их синтеза, секреции, обратного захвата и (или) метаболизма. О постсинаптическом воздействии судят по изменению количества, а также фармакологических характеристик постсинаптических рецепторов нейромедиаторов [Win-Shwe T.-T., Fujimaki H., 2010]. 69 В ряде исследований, которые проводились в основном на самцах крыс, было обнаружено изменение содержания биогенных аминов и их метаболитов в различных отделах мозга после острого и хронического воздействия толуола. Полученные данные трудно сопоставимы из-за разницы в применявшихся дозах и способах введения ксенобиотика (внутрибрюшинно, с питьевой водой, методом ингаляции), а также из-за различного выбора исследуемых структур мозга. Однако большинство авторов отмечали общую тенденцию к повышению уровня нейромедиаторов под влиянием нейротоксиканта. Так, однократное внутрибрюшинное введение толуола самцам крыс вызывало у подопытных животных изменения в цикле «сон-бодрствование», которые сопровождались повышением содержания НА и 5-ОТ в коре мозга в темное время суток [Arito H., Tsuruta H., Nakagaki K. 1984], а кратковременные (15 мин./день) ингаляции ксенобиотика в течение 1 мес. в дозе 55 г/м3 вызывали у самцов крыс значительное увеличение по сравнению с контрольными значениями содержания НА и ДА в среднем мозге, а также НА, ДА и его основного метаболита 3,4-дигидроксифенилуксусной кислоты (3,4-ДОФУК) в стриатуме, тогда как содержание 5-ОТ в гипоталамусе и стриатуме, напротив, снижалось, а содержание метаболита 5-ОИУК возрастало во всех исследованных отделах мозга, за исключением гипоталамуса [AlfaroRodríguez A. et al., 2011]. Другими исследователями было показано, что после 8-часовой ингаляции ксенобиотика в дозе 0,41 г/м3 содержание ДА в целом мозге у крыс повышалось [Rea T. M. et al., 1984]. В том же самом эксперименте при изучении уровня нейромедиаторов в различных отделах мозга было обнаружено повышение содержания ДА в стриатуме, НА в cреднем и продолговатом мозге, а также 5-ОТ в стриатуме, мозжечке и продолговатом мозге при воздействии 4,10 г/м3 толуола. В исследованиях, проведенных методом микродиализа, было обнаружено повышение внеклеточного уровня ДА в стриатуме крыс после 2-часовой ингаляции ксенобиотика в дозах 4,10 и 8,20 г/м3, но не 2,05 г/м3 [Stengård K., Höglund G., Ungerstedt U., 1994]. На основании полученных данных авторами было высказано предположение о том, что повышение уровня нейромедиатора происходит не за счет усиления его синтеза, а по причине снижения его обратного захвата пресинаптическими терминалями. В исследованиях in vitro и in vivo, проведенных относительно недавно методами электрофизиологии и микродиализа, было показано, что толуол повышает секрецию ДА в прилегающем ядре и вентральной области покрышки мозга самцов крыс, тем самым усиливая привыкание к другим нейротоксикантам [Gerasimov M. R. et al., 2002; Riegel A. C. et al., 2007]. После подострой ингаляции толуола (2,05-4,10 г/м3, 3 дня, 6 ч/день) у экспериментальных животных наблюдалось повышение содержания и интенсивности обмена НА и ДА в некоторых зонах СВ гипоталамуса, а также НА в паравентрикулярных и передних перивентрикулярных ядрах гипоталамуса [Andersson K. et al., 1980; Andersson K. et al., 1983]. 70 Хроническое внутрибрюшинное введение крысам ксенобиотика (100 и 200 мг/кг, 14 дней) приводило к повышению содержания ДА в целом гипоталамусе, а также метаболитов нейромедиатора 3,4-ДОФУК и гомованилиновой кислоты (ГВК) в стриатуме в ночные часы. При этом в дневные часы наблюдалось снижение содержания 5-ОТ в среднем мозге, гиппокампе и коре мозга, а также метаболита нейромедиатора 5-ОИУК в среднем мозге и гипоталамусе [Arito H. et al., 1985]. При получении самцами мышей ксенобиотика с питьевой водой в дозах 5, 22 и 105 мг/кг/день в течение 1 мес. было обнаружено значительное повышение содержания НА, ДА и 5-ОТ, а также их метаболитов 3,4-ДОФУК и 5-ОИУК в гипоталамусе [Hsieh G. C. et al., 1990]. Те же самые авторы наблюдали повышение содержания биогенных аминов и их метаболитов и в других отделах мозга: коре, среднем и продолговатом мозге, мозжечке, стриатуме. При этом эффект ксенобиотика наблюдался уже при его концентрации в питьевой воде 20 мг/л (доза 5мг/кг/день), что не намного выше его предельно допустимой концентрации (ПДК) – 14,3 мг/л. Заслуживает внимания тот факт, что во многих случаях воздействие нейротоксиканта в дозе 22 мг/кг/день превышало таковое при более частом и продолжительном употреблении питьевой воды (доза 105 мг/кг/день). Повышение содержания биогенных аминов в различных отделах мозга крыс было также обнаружено и после очень длительной, шестимесячной, ингаляции ксенобиотика в дозах 2,05 и 4,10 г/м3 [Ladefoged O. et al., 1991]. С помощью иммуногистохимического метода анализа было обнаружено влияние хронической ингаляции толуола (12,3 г/м3, 4 ч/день, 3 нед.) на количество волокон, иммунореактивных к тирозингидроксилазе, в различных отделах переднего мозга самцов крыс [Iizumi H. et al., 1995]. В гипоталамусе, гиппокампе и коре мозга ингаляция ксенобиотика приводила к увеличению количества и интенсивности окрашивания волокон, иммунореактивных к тирозингидроксилазе. Методом полуколичественного морфометрического анализа было выявлено значительное повышение суммарной плотности тел нейронов, волокон и терминалей, содержащих тирозингидроксилазу в переднем, латеральном, вентромедиальном и паравентрикулярном ядрах гипоталамуса. Увеличение количества волокон, иммунореактивных к тирозингидроксилазе, возможно, отражает интенсификацию процесса синтеза этого фермента, что в свою очередь приводит к повышению продукции катехоламинов после хронической ингаляции ксенобиотика в высоких дозах. В исследованиях французских ученых была показана чувствительность к 16-недельной подострой ингаляции толуола моноаминергических систем ствола головного мозга и гипоталамуса самцов и самок крыс, причем у самок ксенобиотик вызывал более обширные изменения в активности ключевых ферментов биосинтеза индоламина 5-ОТ и катехоламинов – триптофангидроксилазы и тирозингидроксилазы [Berenguer P. et al., 2003; Soulage C. et al., 2007]. 71 Под влиянием толуола изменяется также количество и аффинность постсинаптических рецепторов биогенных аминов. Наиболее последовательно этой проблемой на протяжении около двадцати лет занималась группа шведских ученых из Королевского Каролинского института под руководством К. Фуксе. Ими было обнаружено снижение аффинности рецепторов 5-ОТ [Celani M. F. et al., 1983], а также дозозависимое снижение аффинности и увеличение плотности β β-адренорецепторов [Fuxe K. et al., 1987] в коре мозга самцов крыс после ингаляции ксенобиотика (330 мг/м3, 9 дней, 6 ч/день). Было обнаружено, что подострая ингаляция нейротоксиканта (330 мг/м3, 3 дня, 6 ч/день) вызывает повышение аффинности рецепторов ДА D2 в стриатуме [von Euler G. et al., 1987]. Изменения фармакологических характеристик рецепторов D2 под влиянием хронической ингаляции этого токсического соединения (330 мг/м3, 4 нед., 6 ч/день) носят, по-видимому, долговременный характер, так как было обнаружено, что они сохраняются спустя 1 мес. после окончания воздействия ксенобиотика [Hillefors-Berglund M., Liu Y., von Euler G., 1995]. Изменяя содержание в гипоталамусе биогенных аминов, которые участвуют в регуляции секреции гонадотропинов гипофизом, толуол предположительно должен оказывать влияние и на их содержание в крови. Действительно, было обнаружено, что повышенные содержание и интенсивность обмена НА и ДА в некоторых гипоталамических ядрах и в зонах СВ гипоталамуса у самцов крыс после подострой ингаляции ксенобиотика (3 дня, 6 ч/день) коррелирует с повышенным уровнем ФСГ в их крови [Andersson K. et al., 1980]. Хроническая ингаляция нейротоксиканта в продолжение как четырех, так и двенадцати недель вызывала значительное повышение содержания в крови пролактина [von Euler G. et al., 1988, 1994], на секрецию которого ДА оказывает ингибирующее действие [Hillefors-Berglund M., Liu Y., von Euler G., 1995]. Повышенное содержание пролактина в крови сохранялось спустя 17 дней после хронической ингаляции ксенобиотика [von Euler G. et al., 1994], но уже через месяц после такого же воздействия приходило в норму [Hillefors-Berglund M., Liu Y., von Euler G., 1995]. Полученные результаты свидетельствуют о том, что изменения уровня этого гормона под воздействием нейротоксиканта носят легкий и обратимый характер. Обследование мужчин, занятых на производстве, где применялся толуол, выявило снижение содержания гонадотропных гормонов в крови по сравнению с группой рабочих, которые не имели контакта с органическими растворителями. При обследовании рабочих других производств, также связанных с применением ксенобиотика, было обнаружено, что снижение содержания ЛГ и ФСГ в крови обратно пропорционально зависит от концентрации паров этого растворителя в воздухе рабочей зоны. Однако, как и в случае пролактина, снижение содержания гонадотропинов в крови, по-видимому, носило обратимый характер, так как у большинства обследованных содержание ФСГ и ЛГ вновь повышалось 72 после четырехнедельного отпуска [Svensson B. G. et al., 1992]. В экспериментальном исследовании группы турецких ученых, проведенном на самцах крыс [Yilmaz B. et al., 2001], было установлено, что хроническая ингаляция (11,25 г/м3 из расчета содержания чистого толуола, 15 и 30 дней, 1 ч/день в утреннее и 1 ч/день в вечернее время) широко используемого в промышленности и быту растворителя лаков и красок с содержанием толуола (66%), ацетона (20%), изобутилацетата (10%), бутилгликоля (3%) и изобутанола (1%) приводила к значительному снижению содержания ЛГ, но не ФСГ, в крови, при этом содержание тестостерона значительно снижалось только в случае 15-дневной ингаляции летучей смеси, а в случае более длительной, 30-дневной, ингаляции содержание тестостерона нормализовалось вплоть до значений в контрольной группе. Содержание же НА и ДА в МПО, СХЯ и СВ гипоталамуса не испытывало существенных изменений ни в одной из опытных групп, тогда как в аркуатных ядрах содержание обоих катехоламинов существенно возрастало. На основании полученных данных авторами был сделан вывод о том, что исследованный растворитель обладает ярко выраженным антигонадотропным эффектом и способен вызывать долгосрочные эндокринные нарушения у самцов крыс, тогда как гипоталамические катехоламинергические системы, по мнению авторов данного исследования, не вызывают прямого торможения секреции ЛГ и, как следствие, тестостерона. Несмотря на достаточно большое количество работ, в которых исследовалось нейротоксическое действие толуола [Win-Shwe T.-T., Fujimaki H., 2010], некоторые аспекты его влияния на ЦНС остаются малоизученными. Во-первых, упомянутые выше экспериментальные работы по изучению воздействия этого ксенобиотика на содержание нейромедиаторов в различных отделах мозга, а также на содержание в крови гормонов гипофиза были проведены на самцах, а не на самках крыс. Во-вторых, в большинстве этих работ не ставилась задача изучения воздействия ксенобиотика на центральные механизмы регуляции репродуктивной функции, поэтому для исследований часто брались отделы мозга, не связанные с осуществлением этой функции. В-третьих, для оценки нейротоксического действия ксенобиотика авторами исследовалась только одна временная точка. В то же самое время содержание нейромедиаторов в различных отделах мозга самцов и самок крыс не является постоянной величиной, а претерпевает различные суточные изменения. Именно эти изменения позволяют нейромедиаторам участвовать в регуляции синтеза и секреции ГнРГ и гонадотропных гормонов гипофиза, уровень которых в крови также не является постоянной величиной. В нашей лаборатории была проведена серия экспериментов, выполненных на самках крыс репродуктивного возраста, по оценке воздействия толуола на суточную динамику содержания ЛГ и ФСГ в крови, а также ГнРГ в СОКП, расположенном в МПО гипоталамуса. Для оценки 73 воздействия ксенобиотика были взяты две временные точки – утренняя (10-12 ч) и вечерняя (17-18 ч). Животные подвергались ингаляции нейротоксиканта в течение одного месяца в двух дозах: в дозе на уровне ПДК (50 мг/м3), установленной гигиенистами для воздуха рабочей зоны предприятий, и на порядок ее превышающей (10 ПДК, 500 мг/м3) – на уровне порога хронического воздействия, установленного по общетоксикологическим показателям. Воздействие ксенобиотика вызывало увеличение содержания ГнРГ в СОКП в утренние часы на стадии диэструса и таким образом нарушало наблюдаемые у контрольных животных суточные изменения уровня нейрогормона в этой микроструктуре [Степанов М. Г., 1994]. Одновременно с этим имела место тенденция к снижению уровня гонадотропных гормонов в крови, особенно при концентрации ксенобиотика 500 мг/м3 (10 ПДК). При этом не было выявлено изменений величины преовуляторного пика секреции этих гормонов, а также нарушения процесса овуляции. Уровень пролактина в крови у экспериментальных животных после аналогичного воздействия ксенобиотика не изменялся как на стадии диэструса, так и на стадии проэструса. Более длительное, 2-4-месячное, воздействие нейротоксиканта, помимо отмеченного повышения утреннего содержания ГнРГ в СОКП на стадии диэструса, вызывало повышение уровня пролактина в крови на той же самой стадии, а также снижение преовуляторного пика секреции ЛГ. Кроме того, длительное воздействие ксенобиотика вызывало полное исчезновение или же извращение реакции гипоталамо-гипофизарного звена на стрессорные факторы и функциональные пробы. На основании полученных данных было высказано предположение о том, что повышение в утренние часы содержания ГнРГ и пролактина связано с ослаблением в это же самое время тормозного влияния нейромедиаторов (в частности, ДА), участвующих в регуляции их синтеза и секреции. Для того чтобы проверить или опровергнуть эту гипотезу, было исследовано влияние одномесячной ингаляции толуола в тех же самых экспериментальных условиях на содержание биогенных аминов (НА, ДА и 5-ОТ) и их основных метаболитов в МПО и СВ-Арк гипоталамуса. Воздействие ингаляции толуола (ПДК, 10 ПДК) приводило главным образом к снижению уровней исследуемых нейромедиаторов [Arutjunyan A. V. et al., 1997]. Так, после ингаляции ксенобиотика в дозе ПДК в утренние часы на стадии диэструса наблюдалось снижение содержания ДА в МПО гипоталамуса, что можно сопоставить с полученными ранее данными о повышении под влиянием нейротоксиканта уровня ГнРГ на этой же самой стадии эстрального цикла [Савченко О. Н., Арутюнян Н. А., Степанов М. Г., 1992; Степанов М. Г., 1994]. Однако наиболее значительное снижение содержания биогенных аминов (НА, ДА и 5-ОТ) и их метаболитов после воздействия ксенобиотика наблюдалось в МПО гипоталамуса в вечернее время суток. На стадии проэструса воздействие нейротоксиканта в меньшей степени влияло на содержание нейромедиаторов, однако снижение утреннего уровня ДА и вечернего уровня 74 5-ОТ в МПО гипоталамуса наблюдалось также и в этом случае. Необходимо отметить, что ингаляция ксенобиотика в высоких дозах (10 ПДК) не вызывала существенных изменений в содержании исследуемых веществ за исключением повышения утреннего содержания НА в МПО гипоталамуса на стадии проэструса. Что касается суточных ритмов содержания нейромедиаторов и их метаболитов в МПО гипоталамуса, то было отмечено исчезновение достоверных различий между утренним и вечерним содержанием ДА и его метаболита 3,4-ДОФУК, а также 5-ОТ под влиянием ингаляции ксенобиотика в высоких дозах [Арутюнян А. В., Степанов М. Г., Кореневский А. В., 1998]. Вместе с тем в некоторых случаях значительное снижение уровня нейромедиаторов в вечернее время под воздействием ксенобиотика вызывало появление суточных изменений содержания биогенных аминов, которые не наблюдались в контрольной группе животных. Полученные неоднозначные результаты указывали на необходимость дальнейшего исследования влияния ксенобиотика на среднесуточный уровень и суточные ритмы содержания биогенных аминов и их метаболитов в МПО и СВ-Арк гипоталамуса. Более того, осталось неизученным воздействие на уровень исследуемых нейромедиаторов более длительной, двухмесячной, ингаляции этого нейротоксиканта, которая, как было показано нами ранее, вызывала изменение в содержании не только ГнРГ в МПО гипоталамуса, но и гипофизарных гормонов в крови. Поэтому одной из задач настоящего исследования стало изучение воздействия двухмесячной ингаляции толуола на содержание НА, ДА и 5-ОТ и их основных метаболитов в МПО и СВ-Арк гипоталамуса. Точные механизмы нейротоксического действия толуола остаются до сих пор не до конца изученными. Однако, исходя из физико-химических свойств этого ксенобиотика, можно предположить два основных механизма его действия. Во-первых, этот широко применяемый в промышленности и в быту органический растворитель, как уже было сказано выше, в силу своих сильно липофильных свойств может свободно встраиваться в липидные мембраны клеток, повышая при этом их текучесть [LeBel C. P., Schatz R. A., 1989; CalderónGuzmán D. et al., 2005]. Внедряясь в мембраны нейронов, ксенобиотик воздействует на активность различных встроенных в мембраны ферментов за счет конформационных изменений в их липидном окружении, а также путем непосредственного связывания с гидрофобными карманами этих белков. Воздействие нейротоксиканта на активность ферментов, ответственных за модификацию фосфолипидов, вызывает изменение соотношения липидных фракций в нейрональной мембране, что также сказывается на ее физико-химических свойствах. Действительно, было обнаружено избирательное снижение под воздействием ксенобиотика содержания в мембранах синаптосом фосфатидилэтаноламина и уровня метилирования фосфолипидов – процесса, в котором фосфатидилэтаноламин выступает 75 в качестве исходного субстрата и который, как предполагают, влияет на передачу биологических сигналов через мембрану [LeBel C. P., Schatz R. A., 1988]. Предполагается, что процесс метилирования фосфолипидов влияет на сопряжение постсинаптических рецепторов с аденилатциклазой [LeBel C. P., Schatz R. A., 1989]. Снижение под воздействием нейротоксиканта уровня фосфатидилэтаноламина обусловлено избирательным повышением активности фосфолипазы С [LeBel C. P., Schatz R. A., 1990]. Толуол влияет и на активность других связанных с мембранами ферментов – Na+/K+-АТФ-азы [LeBel C. P., Schatz R. A., 1990] и Ca2+/Mg2+-АТФ-азы [Edelfors S., Ravn-Jonsen A., 1989], а также фосфолипазы D [Kyrklund T., Kjellstrand P., Haglid K., 1987]. Изменение текучести и липидного состава нейрональных мембран под воздействием этого ксенобиотика, нарушающее нормальное липидное окружение моноаминергических рецепторов, может привести к конформационным изменениям в этих рецепторах и снижению их аффинности к нейромедиаторам [Fuxe K. et al., 1987]. Наблюдаемое после воздействия нейротоксиканта повышение плотности рецепторов в постсинаптической мембране, а также интенсификация процесса синтеза нейромедиаторов в пресинаптическом окончании, возможно, являются компенсаторной реакцией, необходимой для обеспечения нормальной передачи нервного сигнала в условиях снижения аффинности этих рецепторов [Hsieh G. C. et al., 1990]. Воздействие толуола на активность ферментов, участвующих в передаче сигнала от рецепторов к системам вторичных посредников, также может вносить свой вклад в общий нейротоксический эффект этого ксенобиотика. Так, под влиянием его ингаляции (330 мг/м3, 9 дней, 6 ч/день) было обнаружено повышение уровня Ca2+-зависимого фосфорилирования мембранных белков коры мозга и особенно стриатума [von Euler G. et al., 1987]. Нарушение процессов фосфорилирования белков под воздействием ксенобиотика указывает на возможное нарушение процессов трансдукции для нейромедиаторных и гормональных сигналов. Во-вторых, нейротоксическое действие толуола может быть обусловлено также образованием в процессе его метаболизма свободных радикалов. Обнаружено, что воздействие ксенобиотика как in vivo, так и in vitro приводит к обширному системному повышению уровня генерации АФК [Mattia C. J., LeBel C. P., Bondy S. C., 1991; Mattia C. J., Adams J. D. Jr., Bondy S. C., 1993; Mattia C. J., Ali S. F., Bondy S. C., 1993; Singh M. P. et al., 2010]. Так, под влиянием однократного интраперитонеального введения крысам толуола в различных дозах (0,5; 1,0; 1,5 г/кг) уровень образования АФК в легких и почках повышался дозозависимо, в то время как в печени и мозге он достигал максимальных значений при сравнительно низких дозах ксенобиотика. Несмотря на тот факт, что содержание непрометаболизировавшего толуола в организме спустя несколько часов после введения снижалось до незначительных величин, уровень генерации АФК в мозге еще длительное время оставался повышенным. 76 В исследованиях, проведенных в нашей лаборатории, также было отмечено повышенное образование АФК в коре мозга самок крыс после хронической ингаляции ксенобиотика (50 мг/м3 и 500 мг/м3, 1 мес.) [Бурмистров C. O. и соавт., 2001]. В недавнем исследовании группы американских ученых [Kodavanti P. R. S. et al., 2011] было изучено влияние перорально вводимого толуола (0,65 г/кг и 1,00 г/кг) на показатели окислительного стресса в различных отделах мозга молодых и старых самцов крыс (4, 12 и 24 мес.). Было показано, что отдельные показатели окислительного стресса увеличиваются как с возрастом, так и под влиянием интоксикации ксенобиотиком. Так, НАДФН-хинон-оксиредуктазная активность повышалась во фронтальной коре и мозжечке четырех- и 12-месячных крыс и в гиппокампе 24-месячных животных, подвергшихся воздействию ксенобиотика. Значительным изменениям в разных возрастных группах подвергалась общая антиокислительная активность и активность отдельных ферментов γ-глутамилцистеинсинтетаза, антиоксидантной защиты глутатион-S-трансфераза, (супероксиддисмутаза, глутатион-пероксидаза, глутатионредуктаза), а также показатели окислительного стресса (общая аконитазная активность и содержание карбонилпроизводных белков). При этом толуол только усиливал негативные эффекты, вызываемые старением. Эти данные хорошо согласуются с наблюдениями другой группы исследователей, обнаружившей более высокие концентрации нейротоксиканта в мозге старых крыс по сравнению с молодыми животными [Gordon C. J. et al., 2010]. Толуол метаболизируется в организме через окисление метильной группы под действием оксидазы со смешанными функциями (рисунок 1.7). Образовавшийся бензиловый спирт, в свою очередь, окисляется до бензальдегида под действием алкогольдегидрогеназы. Бензальдегид быстро окисляется под действием альдегиддегидрогеназы до бензойной кислоты, бóльшая часть которой конъюгируется с глицином и экскретируется с мочой в виде гиппуровой кислоты [Mattia C. J., Ali S. F., Bondy S. C., 1993]. Поскольку повышение уровня АФК под воздействием ксенобиотика блокировалось при введении ингибитора активности оксидазы со смешанными функциями, было высказано предположение о том, что один из метаболитов толуола катализирует этот процесс [Mattia C. J., LeBel C. P., Bondy S. C., 1991]. В то время как бензиловый спирт и бензойная кислота в опытах in vitro проявляли способность снижать свободнорадикальную активность, бензальдегид оказывался потенциальным источником свободных радикалов. Предполагается, что именно бензальдегид является метаболитом, ответственным за повышение уровня образования АФК под воздействием толуола. Эксперименты, проведенные in vivo и in vitro, позволяют предположить, что повышение уровня генерации АФК под воздействием этого ксенобиотика происходит на стадиях его катаболизма 77 * – этапы метаболизма, на которых предполагается образование активных форм кислорода Рисунок 1.7 – Схема метаболизма толуола в организме животных и человека. Адаптировано из [Mattia C. J., Adams J. D. Jr., Bondy S. C., 1993] при участии оксидазы со смешанными функциями и альдегиддегидрогеназы [Mattia C. J., Adams J. D. Jr., Bondy S. C., 1993; Mattia C. J., Ali S. F., Bondy S. C., 1993]. Обнаружено, что при метаболизме толуола в первую очередь образуются гидроксильный и супероксидный радикалы, причем помимо этого бензальдегид специфически и с достаточно большой эффективностью способен инактивировать глутатион-S-трансферазу – основной фермент, защищающий мозг от АФК [Tabatabaie T., Floyd R. A., 1996]. Возможно, инактивация этого фермента бензальдегидом и является основной причиной повышенного образования АФК после воздействия ксенобиотика. В связи с описанными выше нейротоксическими эффектами ингаляции малых доз толуола возникает вопрос о поиске препаратов, способных защитить ЦНС от его неблагоприятного воздействия. С одной стороны, для достижения этой цели могут быть использованы вещества, 78 оказывающие противоположное действию ксенобиотика влияние на физико-химические и функциональные показатели синаптических мембран. Так, было предложено использование моносиалоганглиозида GM1 – эндогенного компонента синаптических окончаний, участвующего в синаптической передаче. Введение экспериментальным животным GM1 предотвращало изменения характеристик рецепторов ДА стриатума, наблюдаемых при подострой ингаляции нейротоксиканта (330 мг/м3, 3 дня, 6 ч/день) [von Euler G. et al., 1987]. Обработка GM1 в опытах in vitro снижала текучесть мембран и предотвращала противоположный эффект толуола на этот показатель [von Euler G., Fuxe K., Bondy S. C., 1990]. Так как нейротоксическое действие толуола, как предполагается, также связано и с его способностью повышать уровень образования АФК, актуальным на сегодняшний день является поиск природных антиоксидантов, способных предотвратить данный эффект ксенобиотика. С этой целью в прошлом уже применялись такие антиоксиданты, как тиамин и рибофлавин [Бородин К. А., Шептуха Н. В., Толмачев Л. В., 1988]. Однако до сих пор не была широко исследована способность мелатонина, самого сильного из обнаруженных к настоящему времени природных антиоксидантов, служить протектором нейрональных нарушений, вызванных толуолом и другими нейротоксикантами [Reiter R. J., Manchester L. C., Tan D.-X., 2010]. Единичные исследования, посвященные данному вопросу, стали появляться лишь в последние годы. Так, недавно проведенное исследование выявило способность мелатонина, вводимого самцам крыс интраперитонеально в дозе 0,5-10,0 мг/кг, восстанавливать нарушенный парами толуола рост дендритов в различных зонах коры больших полушарий [Pascual R. et al., 2011]. А чуть ранее группа турецких ученых обнаружила способность мелатонина нормализовать процессы перекисного окисления липидов в мозге самцов крыс, подвергшихся 45-дневной ингаляции данного ксенобиотика [Bayadas G. et al., 2003]. Еще одним классом соединений, которые широко используются в современной промышленности, является группа гидразинов. Гидразин и его производные применяются в металлургии, нефтяной промышленности, при производстве красителей и пластмасс, а также как компоненты ракетного и иных видов топлива [Авакян A. K., 1990; Choudhary G., Hansen H, 1998; Toth B., 2000; Kenessov B. et al., 2012]. Кроме того, эти соединения используются в сельском хозяйстве в качестве регуляторов роста растений и гербицидов, а также в медицине в качестве лекарственных препаратов при широком спектре заболеваний [Elsharkawy A. M., 2007; Sterling T. R., 2008; Liu X. H. et al., 2011]. Некоторые представители этого класса соединений образуются естественным путем в почве в процессе жизнедеятельности азотфиксирующих бактерий, они также найдены в составе съедобных грибов, в листьях табака и табачном дыме [Lima C. U. et al., 2011; Pang X., Lewis A. C., 2011]. 79 Все это обусловливает возможность соприкосновения достаточно большого числа людей с этими вредными веществами, находящимися в воздухе, в воде, в продуктах питания. В опытах на животных было установлено, что большинство (84 из 98) изученных производных гидразина обладают канцерогенными свойствами. В дополнение к канцерогенному действию, в опытах на животных, а также в клинических наблюдениях был обнаружен широкий спектр токсических эффектов гидразинов, оказывающих свое негативное влияние практически на все системы организма: нервную, иммунную, лимфоретикулярную, гематопоэтическую, сердечно- сосудистую, дыхательную, пищеварительную, скелетно-мышечную, мочеполовую [Toth B., 1988]. Нейротоксическое действие гидразинов до сих пор остается малоизученным. Было показано, что имеющие свободную аминогруппу производные гидразина могут вступать в реакцию с карбонильной группой пиродоксаля и пиродоксаль-5-фосфата [Moloney S. J., Prough R. A., 1983]. Предполагается, что эта реакция объясняет ингибирующее действие гидразинов на активность различных пиродоксальфосфатзависимых ферментов. Некоторые нейротоксические эффекты гидразинов могут являться следствием ингибирования активности таких ферментов, участвующих в процессах синтеза и метаболизма ряда нейромедиаторов. Так, известно, что введение ряда производных гидразина вызывает у подопытных животных конвульсии. Постулировано, что причиной этих конвульсий является снижение в нервной системе уровня тормозного нейромедиатора ГАМК, которое происходит за счет ингибирования активности пиридоксальфосфатзависимого фермента синтеза этого нейромедиатора – декарбоксилазы глутаминовой кислоты. Другим предполагаемым механизмом конвульсантного действия гидразинов является снижение уровня 5-ОТ, который в нервной системе также обладает преимущественно тормозным действием. Показано, что, по меньшей мере, два производных гидразина ингибируют активность 5-окситриптофанкарбоксилазы – фермента, ответственного за превращение 5-окситриптофана в 5-ОТ. Предполагается также ингибирующее действие гидразинов на активность пиридоксальфосфатзависимых ферментов синтеза катехоламинов – ДОФА-декарбоксилазы и дофамин--гидроксилазы [Анисимов B. H. и соавт., 1976a]. Кроме того, токсическое действие гидразинов также, как и в случае толуола, связано с повышением уровня образования АФК и снижением активности антиоксидантных систем после их введения. После попадания в организм производные гидразина окисляются в печени под действием различных ферментативных систем (цитохром P-450, митохондриальная МАО, простагландинсинтетаза и др.) до соответствующих азоинтермедиатов (рисунок 1.8). В свою очередь азосоединения ферментативно восстанавливаются до азоанион-радикалов, которые 80 * – этапы метаболизма, на которых предполагается образование активных форм кислорода Рисунок 1.8 – Возможные пути метаболизма 1,2-диметилгидразина в организме животных. Воспроизводится по [Лихачев А. Я., 1980] затем могут реагировать с молекулярным кислородом с образованием супероксидного радикала. Это обстоятельство позволяет считать, что супероксидный радикал является одним из общих интермедиатов, образующихся при метаболизме многих производных гидразина [Авакян А. К., 1990]. Кроме того, производные гидразина в различной степени способны ингибировать активность супероксиддисмутазы микросом – фермента, ответственного за инактивацию супероксидного радикала. Воздействие же гидразинов на центральное звено регуляции репродуктивной функции к настоящему времени исследовано еще недостаточно. Одним из производных гидразина является симметричный 1,2-диметилгидразин (ДМГ), который избирательно и с высокой частотой вызывает опухоли кишечника у крыс (модель, наиболее адекватная раку толстой кишки у людей) [Лихачев А. Я., 1980]. Канцерогенное действие ДМГ в кишечнике обусловлено специфическим метилированием ДНК энтероцитов высокоактивными продуктами радикальной природы (в частности, карбониевым ионом СН3+), 81 образующимися в процессе метаболизма данного ксенобиотика (рисунок 1.8). Повреждение под действием его метаболитов макромолекул ДНК, РНК и различных белков в других органах и тканях также имеет место, однако носит неспецифический характер, вследствие чего не вызывает индукции канцерогенеза. Так, через сутки после введения ДМГ мышам было отмечено значительное повреждение ДНК в клетках различных тканей, в том числе головного и спинного мозга [Sasaki Y. F. et al., 1998]. Недавние исследования, проведенные группой отечественных ученых, показали, что антиоксиданты, в частности мелатонин, тормозят канцерогенез, индуцированный ДМГ [Анисимов B. H. и соавт., 2000; Anisimov V. N., 2001; Anisimov V. N. et al., 2006]. Способность мелатонина инактивировать свободные радикалы, образующиеся при метаболизме гидразинов, подтверждается и в экспериментах, в которых исследовалось воздействие другого соединения этого же класса – фенилгидразина [Karbownik M. et al., 2000]. Ранее в нескольких работах было отмечено воздействие ДМГ на нервную систему крыс. Показано, что токсикант уже через полчаса после его введения блокирует синаптическую передачу возбуждения в симпатических ганглиях у крыс [Клименко Е. М., Шевелева В. С., 1985]. По мнению авторов, такой эффект ДМГ может быть либо связан с непосредственным угнетением холинергической передачи возбуждения, либо опосредован возбуждающим действием ксенобиотика на α-адренорецепторы. Было обнаружено, что ДМГ обладает антигонадотропным эффектом, который может быть обусловлен воздействием ксенобиотика как непосредственно на половые железы [Анисимов B. H. и соавт., 1976], так и на гипоталамогипофизарное звено регуляции репродуктивной функции [Анисимов B. H. и соавт., 1976a; Анисимов B. H. и соавт., 2000; Arutjunyan A.V. et al., 2001; Korenevsky A. V. et al., 2012]. Установлено, что спустя 3 ч после введения [3Н]-ДМГ самцам крыс уровень удельной радиоактивности в семенниках и гипофизе значительно превосходил наблюдаемый в печени – органе, метаболизирующем канцероген, что позволяет предполагать непосредственное влияние ксенобиотика на эти эндокринные железы [Анисимов B. H. и соавт., 1976]. Включение радиоактивной метки в ткань гипоталамуса было значительно выше, чем в ткань ствола мозга и коры больших полушарий, что указывает на избирательное воздействие ДМГ на эту структуру. В этом же эксперименте у самцов крыс под влиянием ДМГ наблюдалось снижение более чем на 60% содержания ФСГ в гипофизе. Особо интересными представляются данные о влиянии ДМГ на содержание биогенных аминов в целом гипоталамусе [Анисимов B. H. и соавт., 1976a]. Так, было установлено, что уже через полчаса после введения ксенобиотика самцам крыс уровень НА в гипоталамусе снизился почти на 40% и оставался таковым в течение суток. Уровень другого нейромедиатора, ДА, значительно понижался (почти на 70%) только через сутки после введения ксенобиотика. 82 Было высказано предположение, что ДМГ селективно ингибирует активность ферментов биосинтеза катехоламинов – ДОФА-декарбоксилазы и дофамин-β-оксидазы, препятствуя образованию ДА из 3,4-ДОФА и далее НА из ДА. Необходимо отметить, что в вышеупомянутых работах не рассматривалось воздействие на клетки нервной системы свободных радикалов, образующихся при метаболизме ДМГ, в качестве одного из механизмов возможного нейротоксического действия этого соединения; не проводилось также изучение воздействия данного ксенобиотика на суточную динамику содержания биогенных аминов в основном водителе циркадианных ритмов организма – СХЯ гипоталамуса, а также в связанных с этими ядрами гипофизотропных гипоталамических областях, таких как МПО и СВ гипоталамуса. 1.7. Воздействие эндогенного нейротоксического ксенобиотика L-гомоцистеина на гипоталамо-гипофизарное звено регуляции репродуктивной функции К числу химических факторов, способствующих развитию системного окислительного стресса в тканях, в том числе и в головном мозге, относятся L-гомоцистеин (ГЦ) и продукты его спонтанного окисления (главным образом, гомоцистеиновая кислота), уровень которых в кровяном русле резко возрастает при нарушениях мозгового кровообращения [Yap S., 2003; Зорилова И. В. и соавт., 2005]. Как правило, при хронических сосудистых заболеваниях головного мозга наблюдается ГГЦ различной степени выраженности, вызванная нарушениями метаболизма, происходящими под влиянием разнообразных экзо- и эндогенных факторов. ГЦ образуется вследствие метаболизма незаменимой аминокислоты L-метионина, являющейся основным источником метильных групп в организме. Обмен L-метионина в нормальных условиях обеспечивает процессы метилирования ряда важных молекул клетки – нуклеиновых кислот, белков (в том числе гистонов) и мембранных липидов, – происходящего при участии производного L-метионина – S-аденозилгомоцистеина. При недостатке витаминов группы В или избыточном образовании ГЦ в организме происходит его спонтанное окисление в более стабильные сульфосоединения (в основном в гомоцистеиновую кислоту), которые в силу стерической аналогии с глутаминовой кислотой проявляют сильное токсическое действие на ионотропные и метаботропные рецепторы глутамата [Ziemińska E., Stafiej A., Łazarewicz J. W., 2003; Болдырев А. А., 2009]. ГЦ также реметилируется с образованием L-метионина или вступает в реакции транссульфирования с превращением в L-цистеин (рисунок 1.9). 83 Рисунок 1.9 – Цикл трансформаций фолатов, L-метионина и L-гомоцистеина Другим механизмом токсичности ГЦ является генерация АФК, инициируемая его аутоокислением в присутствии кислорода и ионов металлов с переменной валентностью [Perna A. F. et al., 2003]. Образующиеся пероксид водорода и супероксиданион-радикал стимулируют процессы перекисного окисления липидов и снижают биодоступность оксида азота [Upchurch G. R. Jr. et al., 1997]. Последнее обусловлено, в первую очередь, образованием пероксинитрита вследствие ингибирования активности супероксиддисмутазы и образования при взаимодействии оксида азота и супероксида высокотоксичного продукта – пероксинитрита [Upchurch G. R. Jr. et al., 1997; Hooijmans C. R., Blom H. J., 2009]. При повышении содержания ГЦ некоторые исследователи отмечают подавление экспрессии глутатионпероксидазы и супероксиддисмутазы, что может усиливать токсический эффект свободных радикалов в структурах мозга [Bayadas G. et al., 2006]. Известно, что ГЦ обладает способностью эффективнее других аминотиолов, при переходе в форму дисульфида или связываясь с эндогенными тиолами, отдавать электроны кислороду, превращая последний в супероксиданион. Супероксиданион уже непосредственно участвует в процессах перекисного окисления липидов. В результате происходит усиленное образование продуктов свободнорадикального метаболизма [Жлоба А. А., Никитина В. В., 2004]. Ряд исследователей отмечает, что при возрастании уровня ГЦ наблюдается увеличение содержание малонового 84 диальдегида, карбонильных производных и диеновых коньюгатов в плазме крови крыс и кроликов [Yalçinkaya-Demirsöz S. et al., 2009; Vanzin C. S. et al., 2011], повышение уровня малонового диальдегида и супероксиданиона в гиппокампе крыс [Ataie A. et al., 2010]. В других работах было показано, что после хронического 22-дневного введения ГЦ через час после последней инъекции происходит повышение уровня перекисного окисления липидов и снижение общей антиокислительной активности в сердце крыс. Однако данный эффект исчезает через 12 ч [Kolling J. et al., 2011]. Исследования, проведенные на культурах клеток печени и микроглии, показали, что как ГЦ, так и S-аденозилметионин вызывают повреждения ДНК. Установлены различия в механизмах повреждающего действия этих соединений на нуклеиновые кислоты, а также показано, что S-аденозилметионин непосредственно действует на ДНК, тогда как действие ГЦ происходит опосредованно с участием продуктов, образующихся при активации перекисного окисления липидов [Liu C. C. et al., 2009]. ГЦ и гомоцистеновая кислота относятся к известным факторам риска развития сердечнососудистых и нейродегенеративных заболеваний, и высокий уровень содержания этих соединений в периферической крови (ГГЦ) является опасным проявлением дизрегуляции метаболизма, оказывающим особо разрушительное действие на развивающийся организм [Bayadas G. et al., 2007; Махро А. В. и соавт., 2008]. Однако механизм повышения содержания этих опасных эндогенных ксенобиотиков в крови пока остается недостаточно изученным, в связи с чем исследователи используют различные экспериментальные модели для изучения влияния ГГЦ на физиологические и биохимические показатели структур мозга. Экспериментальная ГГЦ является наиболее распространенным инструментом исследования механизмов нейротоксичности ГЦ. В ранних работах ГГЦ индуцировали путем введения животным производных ГЦ, в частности S–аденозил–L–гомоцистеина [Fonlupt P., 1979]. Впоследствии было установлено, что ГЦ, образуемый в процессе метаболизма L-метионина, может достигать высокого уровня в компартментах клетки, недоступных для экзогенного ГЦ [Sauls D. L. et al., 2007]. Поэтому внутриклеточный уровень метаболически генерируемого ГЦ в различных органах, в том числе и в нервной системе, может значительно превышать его содержание при экзогенном введении ГЦ, даже несмотря на повышенный уровень ГЦ в крови. По этой причине в последующем стали широко применяться экспериментальные модели ГГЦ, основанные на хроническом введении животным L-метионина (метиониновая нагрузка). Наиболее распространенным способом метиониновой нагрузки является потребление животными в хроническом эксперименте L-метионина с питьевой водой. При использовании этой модели ГГЦ был получен ряд интересных данных, раскрывающих молекулярные механизмы нейротоксичности ГЦ. Так, было установлено, что ГГЦ вызывает повышение 85 чувствительности нервных клеток к эксайттоксическому окислительному повреждению in vivo и in vitro [Streck E. L. et al., 2003; Bayadas G. et al., 2006; Boldyrev A., 2010]. По другим данным, у крыс, находящихся на диете с высоким потреблением L-метионина, снижено содержание 5-ОТ и ДА в коре головного мозга [Gao L. et al., 2012]. После интраперитонеального введения самцам мышей ГЦ в дозе 0,5-1.0 г/кг (1 раз/день, 36 дней) наблюдалось повышение в стриатуме в среднем на 30% уровня ГЦ, а также достоверное снижение уровня 3,4-ДОФУК и ГВК в этой структуре (но не в коре и гиппокампе), а также снижение уровня иммунореактивности к тирозингидроксилазе в черной субстанции [Lee E.-S. Y. et al., 2005]. Через 19 дней после однократного интранигрального введения ГЦ (0,25-1,00 мкМ) самцам крыс в стриатуме наблюдалось снижение уровня ДА, 3,4-ДОФУК и ГВК, которое при введении ГЦ в дозе 1 мкМ сопровождалось уменьшением числа иммуноположительных к тирозингидроксилазе нейронов в стриатуме и черной субстанции [Chandra G. et al., 2006]. При этом уровень 5-ОТ и 5-ОИУК в стриатуме не претерпевал значительных изменений. Введение ГЦ (1 мкМ) в дорсальное ядро также не приводило к изменению содержания 5-ОТ, НА и ДА в стриатуме, черной субстанции, гипоталамусе, мозжечке, коре мозга и спинном мозге. Продолжительное потребление L-метионина с пищей (стандартное питание с добавлением 1,7% L-метионина в течение шести недель) вызывыло у крыс повышение уровня ГЦ в крови (около 5,0 мкМ) по сравнению с контролем (около 3,2 мкМ), сопровождающееся снижением уровня ДА и 3,4-ДОФУК, 5-ОТ и 5-ОИУК в медиальной зоне префронтальной коры, а также уровня 3,4-ДОФУК и 5-ОИУК в гиппокампе [Gao L. et al., 2012]. Другие исследователи, используя модель ГГЦ, вызванную диетой с дефицитом фолиевой кислоты, также отмечали изменения метаболизма моноаминов и снижение содержания глутатиона в мозге животных [Kronenberg G. et al., 2008]. У больных, страдающих нейропсихическими заболеваниями, обнаружено снижение уровней 5-ОИУК, ГВК и 3-метокси4-гидроксифенилгликоля в спинномозговой жидкости [Bottiglieri T. et al., 2000]. У самок крыс, находившихся в течение 38 дней на диете с отсутствием фолиевой кислоты, наблюдалось значительное повышение уровня ГЦ в крови (125 мкМ) по сравнению с контролем (9 мкМ). Изучение уровней биогенных аминов (НА, ДА и 5-ОТ) и их метаболитов (ванилилминдальная кислота и 3-метокси-4-гидроксифенилгликоль, 3,4-ДОФУК и ГВК, 5-ОИУК) в гипоталамусе и хвостатых ядрах стриатума (каудатных ядрах) таких животных выявило только снижение содержания ДА и его метаболитов 3,4-ДОФУК и ГВК в каудатных ядрах и снижение отношения 5-ОИУК/5-ОТ в гипоталамусе [Gospe S. M. Jr. et al., 1995]. Изменение содержания биогенных аминов и их метаболитов в структурах мозга под влиянием повышенного уровня ГЦ в крови может объясняться тремя возможными механизмами нейротоксического действия ГГЦ: окислительным стрессом, гиперстимуляцией 86 NMDA-рецепторов глутаминовой кислоты и апоптозом. В настоящее время еще не найден ответ на вопрос, каким из этих механизмов в большей степени осуществляется воздействие ГЦ на моноаминергические системы мозга. Открытым также остается вопрос и о том, какая степень повышения уровня ГЦ в мозге обусловливает проявление его нейротоксических свойств [Troen A. M., 2005]. В норме уровень ГЦ в цереброспинальной жидкости человека (0,28-0,66 мкМ) [Hyland K., Bottiglieri T., 1992] и в ткани мозга крыс (0,76 мкМ/кг) [Ueland P. M. et al., 1984] на порядок ниже, чем в плазме крови (6,04-16,20 мкМ) [Troen A. M., 2005]. Четкие же нейротоксические эффекты ГЦ in vitro и ex vivo проявляются только в концентрациях около 100 мкМ, что гораздо выше, чем повышение ГЦ в плазме крови на уровне десятков микромоль, достаточное для развития ГГЦ [Troen A. M., 2005]. Тем более повышение уровня ГЦ в цереброспинальной жидкости и ткани мозга при ГГЦ в среднем не может достигать таких величин. Вместе с тем не может быть исключено локальное повышение уровня ГЦ в синапсах или внеклеточном пространстве в условиях метаболического стресса вплоть до нейротоксических концентраций. Умеренное повышение уровня ГЦ, возможно, не является токсичным для дофаминергических нейронов, однако ксенобиотик может снижать порог чувствительности этих нейронов к другим токсическим агентам или оказывать токсическое действие на уже поврежденные нейроны [Kruman I. I. et al., 2000; Lee E.-S. Y. et al., 2005]. В таких нейронах синтез ДА может повышаться, что, возможно, является компенсаторным эффектом для восстановления нормального уровня нейромедиатора в ткани [McCormack A. L. et al., 2002]. Имеются также данные о том, что введение ГЦ увеличивает содержание X-бокссвязывающего белка-1 в нескольких отделах мозга мышей, таких как гиппокамп, гипоталамус и кора. Известно, что X-бокс-связывающий белок вовлечен в патогенез болезней центральной нервной системы [Hosoi T., Ogawa K., Ozawa K., 2010]. Пренатальная ГГЦ, моделируемая посредством метиониновой нагрузки при беременности, вызывает снижение когнитивных функций у потомства [Bayadas G. et al., 2008; Арутюнян А. В., Козина Л. С., Арутюнов В. А., 2010]. Показано, что токсический эффект ГЦ и гомоцистеиновой кислоты на процессы созревания мозга в условиях ГГЦ реализуется путем воздействия на метаботропные глутаматные рецепторы [Арутюнян А. В., Козина Л. С., Арутюнов В. А., 2010; Arutjunyan A. et al., 2012], а также путем изменения экспрессии нейроспецифических белков, принимающих участие в дифференциации нейронов и синаптогенезе [Bayadas G. et al., 2008]. Тест с нагрузкой L-метионином используется также в клинике для оценки состояния метаболизма ГЦ, особенно при диагностике умеренной ГГЦ, протекающей бессимптомно [Refsum H. et al., 1998; Хубутия М. Ш., 2004]. 87 По результатам ряда исследований ГЦ запускает в нейроне ряд процессов, приводящих клетку к апоптозу [Жиляева Т. В., 2012]. Величина и скорость эффекта в эксперименте зависела от концентрации ГЦ: при концентрации 250 мкМ ксенобиотик вызывал апоптоз почти всех нейронов гиппокампа в культуре клеток in vitro в течение 28 ч, а при концентрации 0,5 мкМ (что является нормой in vivo) в том же эксперименте происходил отставленный апоптоз около 40% нейронов в течение четырех-шести суток [Kruman I. I. et al., 2000]. В исследовании группы немецких ученых было обнаружено, что ГЦ связывает ионы Cu2+, которые являются кофактором цитохром-С-оксидазы в митохондриях, что приводит к инактивации этого фермента, окислительному стрессу и апоптотической гибели нейронов [Linnebank M. et al., 2006]. В культуре гранулярных нейронов мозжечка ГЦ в дозе более 300 мкМ в течение 16-22 ч также вызывал гибель нейронов, опосредованную воздействием на NMDA-рецепторы и продукцией свободных радикалов [Kim W. K., Pae Y. S., 1996]. В работе японских ученых [Imamura K. et al., 2007] была продемонстрирована дозозависимая токсичность ГЦ в дозах 0–50 мМ в отношении мезенцефальных дофаминергических нейронов в культуре клеток. Причем внутриклеточный ДА усиливал цитотоксичность ГЦ. В этом же эксперименте было показано, что изучаемые эффекты ассоциированы с окислительным стрессом. Эти результаты, безусловно, нельзя переносить на ситуацию in vivo хотя бы потому, что вряд ли могут нормальные концентрации ГЦ вызывать гибель нейронов. Так, существуют данные о наличии in vivo протекторных веществ, таких как карнозин, параоксоназа-1, нейтрализующих действие ГЦ на нервную ткань [Linnebank M. et al., 2006; Borowczyk K., Shih D. M., Jakubowski H., 2012]. Тем не менее, они демонстрируют наличие токсичности ГЦ в отношении нервной ткани. И если ГЦ в концентрациях более 100 мкМ вызывает гибель нейрона через воздействие на NMDA-рецепторы, то в дозах менее 100 мкМ воздействие на NMDA-рецепторы, возможно, имеет другие последствия, что требует дальнейшего изучения. Еще одна группа ученых из ФРГ продемонстрировала в эксперименте, что ГЦ и его окисленные производные оказывают сильное ингибирующее влияние на активность нейрональных сетей. Так, если ГЦ ингибирует спонтанную активность нейросети в достаточно больших концентрациях, то его окисленные производные, в частности гомоцистеиновая кислота, оказывают этот эффект даже в малых концентрациях [Görtz P. et al., 2004; Арзуманян Е. С., Степанова М. С., 2010]. Причем это влияние опосредуется также через воздействие на NMDA-рецепторы нейронов [Kruman I. I. et al., 2000; Linnebank M. et al., 2006; Boldyrev A. A., 2009]. Гомоцистеиновая кислота инициирует вход Ca2+ в клетки и накопление свободных радикалов, способных приводить к апоптозу, а при более длительном воздействии и к некрозу клеток [Linnebank M. et al., 2006]. Cущественным недостатком применяемой в подавляющем большинстве исследований модели ГГЦ является неконтролируемое потребление животными L-метионина при его приеме 88 с питьевой водой. По данным [Bayadas G. et al., 2007], белые крысы при приеме L-метионина с питьевой водой в дозе 1 г/кг массы, которая обычно применяется в большинстве исследований, начиная со второго дня приема, потребляли столько же воды, что и контрольные животные. Однако в недавно проведенных в нашей лаборатории экспериментах было установлено, что в этих условиях у значительной части подопытных крыс наблюдались признаки обезвоживания (потеря веса, вялость и т.п.) и сифункулятоз, обусловленные, по-видимому, ослаблением иммунитета [Арутюнян А. В. и соавт., 2012]. В связи с этим нами в дальнейшем была предложена модель контролируемого принудительного перорального введения животным L-метионина. В специально поставленных экспериментах было показано, что при этом можно достичь путем укорочения интервала времени, прошедшего после введения раствора L-метионина до забоя животного, более высокого уровня ГГЦ, чем в описанных выше исследованиях. До настоящего времени влияние ГГЦ на гипоталамо-гипофизарное звено регуляции репродуктивной функции было представлено, к сожалению, лишь единичными работами. Так, было установлено, что введение ГЦ в концентрации 10-7 М в третий желудочек мозга самок крыс в утренние часы дня проэструса вызывает более чем двукратное увеличение преовуляторного пика секреции ЛГ. Интравентрикулярное введение ингибитора синтеза катехоламинов α-метилтирозина блокировало это увеличение, а также и появление самого проэстрального пика [Ladosky W., Azambuja H. M., Schneider H. T., 1983]. Каковы могут быть механизмы воздействия ГЦ на проэстральную секрецию ЛГ? По-видимому, ответ на этот вопрос могут дать исследования, направленные на изучение влияния экспериментальной ГГЦ на нейромедиаторные системы гипоталамуса, ответственные за регуляцию репродуктивных циклов. При этом следует иметь в виду, что ГЦ в малых дозах в силу его способности стимулировать NMDA-рецепторы глутаминовой кислоты, может сам выступать в качестве стимулирующего нейромедиатора. В качестве возможных механизмов токсического воздействия этого эндогенного ксенобиотика на секрецию ЛГ в день проэструса следует рассматривать уже описанное выше нейротоксическое (эксайтотоксическое) действие высоких концентраций ГЦ (к сожалению, его нейротоксический эффект на нейроны гипоталамуса в настоящее время остается практически неизученным) и физиологическое действие ксенобиотика, включающее ингибирование активности фермента деградации катехоламинов КОМТ и фермента фенилэтаноламин-Nметилтрансферазы, катализирующего превращение НА в адреналин. Так, было обнаружено, что ГЦ [Ladosky W., Azambuja H. M., Schneider H. T., 1983] и особенно его предшественник S-аденозил-L-гомоцистеин [Deguchi T. et al., 1971; Zhu B. T. et al., 2000; Zhu B. T., 2002] являются сильными ингибиторами активности КОМТ (ингибирование смешанного типа 89 продуктом по принципу обратой связи). После интраперитонеального введения мышам аденозина и ГЦ уровень S-аденозил-L-гомоцистеина в крови, печени и мозге значительно повышался, в то же время активность метилтрансфераз, в том числе КОМТ, снижалась [Schatz R. A., Wilens T. E., Sellinger O. Z., 1981]. Двукратное интравентрикулярное введение ГЦ самцам крыс в дозе 1 мкМ (1 раз/день, 2 дня) вызывало повышение содержания ДА, а также снижение уровня его метаболитов 3,4-ДОФУК и ГВК в стриатуме, что можно объяснить ингибированием активности ферментов деградации ДА [Lee E.-S. Y. et al., 2005]. Однако при более длительном (5 дней) введении ГЦ в той же дозе, а также в более высокой (2 мкМ) те же авторы наблюдали совместное снижение содержания ДА и его метаболитов. При этом ГЦ не влиял на уровень ДА, 3,4-ДОФУК и ГВК в других отделах мозга (кора и гиппокамп). Интраперитонеальное введение крысам S-аденозил-L-гомоцистеина в дозе 0,1-30,0 мг/кг приводило к увеличению активности синтеза НА из тирозина в стволе мозга и среднем мозге [Fonlupt P. et al., 1979], но не влияло на содержание НА и норметанефрина в ткани гипоталамуса и таламуса [Bidard J. N. et al., 1979]. Под действием S-аденозил-Lгомоцистеина наблюдалось снижение уровня 5-ОТ и активности его синтеза из триптофана, а также повышение образования 5-ОИУК [Fonlupt P. et al., 1979]. Введение S-аденозил-Lгомоцистеина не влияло на содержание и метаболизм ДА в стриатуме [Bidard J. N. et al., 1979]. Фермент биосинтеза адреналина фенилэтаноламин-N-метилтрансфераза встречается в различных отделах мозга, в том числе в гипоталамусе [Fuller R. W., Hemrick-Luecke S. K., Perry K. W., 1982; Palkovits M. et al., 1992; Moreno M. L., Villanua M. A., Esquifino A. I., 1992; Ko L. et al., 2011]. В опытах in vitro было показано, что S-аденозил-L-гомоцистеин является конкурентным ингибитором активности фенилэтаноламин-N-метилтрансферазы [Fuller R. W., Hemrick-Luecke S. K., Perry K. W., 1982]. Кроме того, представляется возможным, что в умеренных концентрациях ГЦ и его метаболит гомоцистеиновая кислота, являясь агонистами глутаминовой кислоты, через глутаматные рецепторы могут непосредственно активировать гонадолиберинергические нейроны. Несмотря на то что нейротоксическое действие ГЦ и его метаболита гомоцистеиновой кислоты, обусловленное связыванием с NMDA-рецепторами глутамата и их гиперактивацией, в настоящее время не вызывает сомнений [Shi Q. et al., 2003; Болдырев А. А., 2009], многие вопросы, касающиеся нейрохимических механизмов нарушения центральной регуляции репродуктивной функции женского организма при ГГЦ, остаются невыясненными. В связи с этим представляется целесообразным дальнейшее экспериментальное изучение влияния эндогенного ксенобиотика ГЦ на среднесуточное содержание и суточные ритмы биогенных аминов в гипоталамических структурах, ответственных за синтез и секрецию ГнРГ. Эти 90 исследования могли бы способствовать пониманию общих механизмов повреждающего воздействия ГЦ на репродуктивную функцию женского организма и могли бы оказаться полезными в поиске нейропротекторных соединений, способных предотвратить или ослабить это воздействие. *** Изложенные в обзоре литературе сведения можно подытожить следующим образом. Установлено, что циркадианная система играет важную роль в формировании репродуктивных циклов женского организма. В исследованиях на самках крыс было показано, что нейрональный сигнал, исходящий из СХЯ гипоталамуса, ежедневно поступает к МПО гипоталамуса, где находятся тела нейронов, продуцирующих ГнРГ, а также к СВ гипоталамуса – основному нейрогемальному органу, ответственному за секрецию этого нейропептида. Предполагается, что поступающий от СХЯ гипоталамуса циркадианный сигнал обусловливает в этих отделах гипоталамуса суточные изменения активности моноаминергических и опиоидных систем, которые играют ключевую роль в регуляции синтеза и секреции ГнРГ. Отмечено, что нейротоксические соединения вызывают у самок крыс нарушения суточных ритмов содержания биогенных аминов в отделах гипоталамуса, ответственных за регуляцию репродуктивных циклов. Поэтому первостепенной задачей настоящего исследования явилось изучение хронического либо острого воздействия неблагоприятных экологических факторов, имеющих химическую природу, – обладающих нейротоксическими свойствами экзогенных (толуол, ДМГ) и эндогенных (ГЦ) соединений на суточные ритмы и среднесуточное содержания НА и ДА в МПО и СВ-Арк гипоталамуса самок крыс. Вместе с тем взаимосвязь между содержанием биогенных аминов и уровнем генерации АФК (источником которых эти соединения являются) в отделах гипоталамуса, ответственных за регуляцию репродуктивной функции, по-прежнему остается малоизученной. Наличие такой взаимосвязи позволило бы использовать показатель генерации АФК в качестве дополнительного маркера активности моноаминергических систем гипоталамуса. Кроме того, изучение уровня образования АФК в гипоталамических структурах могло бы служить критерием для оценки возможного нейропротекторного эффекта различных антиоксидантов, в частности мелатонина или пептидных биорегуляторов. Поэтому еще одной задачей данного исследования стало выявление возможной взаимосвязи между уровнем генерации АФК и содержанием биогенных аминов в гипоталамусе в норме, а также после воздействия нейротоксических соединений и мелатонина. По-прежнему остаются малоизученными вопросы, связанные с участием пинеальной железы в регуляции репродуктивных циклов и, как следствие, с нарушениями этой регуляции, 91 которые могут быть вызваны снижением синтеза продуцируемого железой мелатонина как в процессе старения организма, так и в изменяющихся световых условиях. В настоящее время мелатонину отводится роль водителя циркадианных ритмов организма млекопитающих. Поэтому следующей задачей данной работы стало изучение роли биогенных аминов в изменении процессов гипоталамической регуляции репродуктивной функции с возрастом, а также в модели преждевременного старения репродуктивной системы, вызываемого не только упомянутым выше химическим воздействием (экзогенные и эндогенные ксенобиотики), но и воздействием, имеющим исключительно физическую природу (избыточный световой фон), а также изучение возможности коррекции выявленных нарушений с помощью мелатонина и пептидных биорегуляторов. Собранные за последние три десятилетия экспериментальные данные создали предпосылки для терапевтического применения мелатонина при лечении расстройств, связанных с десинхронизацией суточных ритмов организма человека. Полученные нами результаты позволили выдвинуть гипотезу о том, что мелатонин, обладающий синхронизирующими и антиоксидантными свойствами, а также использованные в данном исследовании пептидные биорегуляторы (пинеалон, эпиталамин, эпиталон) могут служить протекторами вызванных неблагоприятным экологическим воздействием нарушений центральных механизмов регуляции репродуктивной функции, в частности суточных ритмов активности моноаминергических систем гипоталамуса. 92 ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Животные Экспериментальная работа была проведена на 1080 половозрелых самках крыс линии Wistar с массой тела 180-220 г и четырехдневным эстральным циклом (питомник «Рапполово» РАМН, Санкт-Петербург, Россия). Использование белых крыс связано с тем, что этот вид позвоночных широко используется в общебиологических и медицинских исследованиях [Ноздрачев А. Д., Поляков Е. Л., 2001; Каркищенко Н. Н., 2004]. Лабораторные животные содержались в стандартных помещениях вивария с искусственной вентиляцией, оборудованного в соответствии с санитарными требованиями №1045-73 от 06.04.73 [Белоусов Ю. Б., 2005], в клетках размером 62х44х25 см по 5 животных в каждой клетке при температуре окружающего воздуха в зависимости от времени года 22±2 0С [Душкин В. А., Кривов Л. И., 1971]. Крысы получали стандартный готовый лабораторный корм с содержанием протеина более 25%, жиров 6-12%, кальция и фосфора 1,0-1,4%, лизина и метионина 0,7-1,5%, микроэлементов и витаминов 3-4% (ЗАО «Волосовский комбикормовый завод», г. Волосово, Ленинградская обл., Россия) и имели неограниченный доступ к пище и отстоянной водопроводной воде в соответствии с правилами, принятыми Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и иных научных целей (г. Страсбург, 1986 г.). Все опыты на лабораторных животных выполнялись в соответствии с положениями Хельсинкской декларации Всемирной Медицинской Ассоциации о гуманном отношении к животным (ред. 2000 г.), принципами гуманности, изложенными в директиве Европейского Сообщества №86/609 ЕС, «Биоэтическими правилами проведения исследований на человеке и животных» и «Руководством по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ» (2005 г.). 2.2. Реактивы и препараты В работе были использованы следующие реактивы и препараты. Для ингаляции летучих органических веществ: толуол («ч», ОАО «Реактив», Россия). Для введения животным: 1,2-диметилгидразина гидрохлорид (Sigma, США); мелатонин (Sigma, США); L-метионин («хч», ЗАО «Вектон», Россия); пинеалон (Санкт-Петербургский институт биорегуляции 93 и геронтологии СЗО РАМН, Россия); физиологический раствор (0,9% раствор натрия хлорида; ОАО «Биохимик», Россия); эпиталамин (Санкт-Петербургский институт биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН, Россия); эпиталон (Санкт-Петербургский институт биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН, Россия); этанол («хч», ОАО «Реактив», Россия). Для выделения структур мозга: азот жидкий. Для определения содержания гонадолиберина в структурах мозга: натрия гидроксид («хч», ЗАО «Вектон», Россия); тест-система для стандартизованного иммуноферментного определения содержания гонадолиберина в биологических образцах (Peninsula Laboratories, LLC, США); уксусная кислота («хч», ОАО «Реактив», Россия). Для определения уровня половых стероидов в сыворотке крови: антисыворотки к эстрадиолу и прогестерону (Институт физиологии им. И. П. Павлова РАН, Санкт-Петербург, Россия); декстран (Serva, ФРГ); дифенилоксазол («хч», ОАО «Реактив», Россия); 1,4-ди-(5-фенил-2-оксазолилбензол) («хч», ОАО «Реактив», Россия); меченные тритием препараты эстрадиола и прогестерона (Государственный институт прикладной химии, Санкт-Петербург, Россия); натрия ацетат («хч», ОАО «Реактив», Россия); толуол («ч», ОАО «Реактив», Россия); уголь активированный («ч», ОАО «Реактив», Россия); уксусная кислота («хч», ОАО «Реактив», Россия); фосфатный буфер, рН 7,4 (Sigma, Великобритания); эфир диэтиловый («ч», ОАО «Реактив», Россия). Для определения содержания биогенных аминов и их метаболитов в структурах мозга: ацетонитрил («чистый для хроматографии», ЗАО «Вектон», Россия); 3,4-диоксибензиламина гидрохлорид (Sigma, США); 3,4-диоксифенилуксусная кислота (Sigma, США); дофамина гидрохлорид (Sigma, США); калия метабисульфит («хч», ЗАО «Вектон», Россия); лимонная кислота (Sigma, США); натрия октилсульфонат (Sigma, США); натрия цитрат, трехзамещенный, пятиводный («чда», ЗАО «Вектон», Россия); натрия этилендиаминтетраацетат, двузамещенный («хч», ЗАО «Вектон», Россия); норадреналина гидротартрат (Sigma, США); 5-оксииндолилуксусная кислота (Sigma, США); серотонина креатинсульфат гидрат (Serva, ФРГ); хлорная кислота («хч», ЗАО «Вектон», Россия). Для определения уровня общего L-гомоцистеина в плазме крови: тест-система для стандартизованного иммуноферментного определения уровня общего L-гомоцистеина в плазме крови (Axis-Shield Diagnostics Limited, Великобритания). Для определения уровня генерации активных форм кислорода в структурах мозга: водорода пероксид («хч», ОАО «Реактив», Россия); калия фосфат, однозамещенный («хч», ЗАО «Вектон», Россия); калия хлорид («хч», ЗАО «Вектон», Россия); люминол (Sigma, США); фосфатный буфер, рН 7,4 (Sigma, Великобритания). 94 Для определения содержания продуктов перекисного окисления липидов в сыворотке крови: бутанол-1 («ч», ОАО «Вектон», Россия); ортофосфорная кислота («чда», ОАО «Вектон», Россия), 2-тиобарбитуровая кислота («чда», ОАО «Реактив», Россия). Для определения содержания нитритов в сыворотке крови: натрия нитрит («чда», ОАО «Реактив», Россия), 1-нафтилэтилендиамина гидрохлорид (Sigma, США), соляная кислота («осч», ООО «Сигма Тек», Россия), сульфаниловая кислота («чда», ОАО «Реактив», Россия), цинка сульфат, семиводный («осч», ОАО «Вектон», Россия). Для определения общей моноаминооксидазной активности в структурах мозга: R-депренил (Sigma, США); калия фосфат, однозамещенный («хч», ЗАО «Вектон», Россия); кинурамина дигидробромид (Sigma, США); натрия фосфат, двузамещенный («хч», ЗАО «Вектон», Россия); натрия этилендиаминтетраацетат, двузамещенный («хч», ЗАО «Вектон», Россия); сахароза («хч», ЗАО «Вектон», Россия). Для определения содержания общего белка в структурах мозга и в реакционной смеси: меди сульфат (II), пятиводный («хч», ЗАО «Вектон», Россия); натрия гидроксид («хч», ЗАО «Вектон», Россия); натрия карбонат («хч», ЗАО «Вектон», Россия); реактив ФолинаЧокалтеу (Sigma, США); трихлоруксусная кислота («хч», ЗАО «Вектон», Россия). 2.3. Общая схема эксперимента В различных сериях экспериментов в виварии поддерживались следующие световые режимы: стандартное фиксированное освещение (12 ч – день, 12 ч – ночь), световая депривация (24 ч – ночь) и постоянное освещение (24 ч – день). Для измерения освещенности помещений, в которых содержались животные, использовали люксметр «Ф-107» (Россия). Помещения вивария освещали люминесцентные лампы (освещенность 750 лк на уровне клеток на 1 м2 площади). Окна в помещениях отсутствовали. Решение задач, поставленных в диссертации, осуществлялось в семь последовательных этапов: 1) исследование суточной динамики и среднесуточного содержания биогенных аминов в структурах гипоталамуса, ответственных за синтез и секрецию ГнРГ (МПО и СВ-Арк) на различных стадиях эстрального цикла и в условиях световой депривации; 95 2) исследование суточной динамики и среднесуточного содержания биогенных аминов в МПО и СВ-Арк гипоталамуса при хроническом и остром воздействии нейротоксических ксенобиотиков (ДМГ, толуол); 3) исследование суточной динамики и среднесуточного содержания биогенных аминов в МПО и СВ-Арк гипоталамуса в условиях экспериментальной ГГЦ (метиониновая нагрузка); 4) исследование нейротоксических воздействий (ДМГ, толуол, метиониновая нагрузка) на уровень ГнРГ в МПО и СВ-Арк гипоталамуса и показатели окислительного стресса в сыворотке крови; 5) исследование влияния мелатонина и пептидных биорегуляторов (пинеалон, эпиталамин, эпиталон) на суточную динамику и среднесуточное содержание биогенных аминов в МПО и СВ-Арк гипоталамуса при нейротоксических воздействиях (ДМГ, метиониновая нагрузка); 6) исследование возрастных изменений суточной динамики и среднесуточного содержания биогенных аминов в МПО и СВ-Арк гипоталамуса; 7) исследование влияния мелатонина и пептидного препарата пинеальной железы эпиталона на динамику эстральных циклов у молодых и старых животных при различных световых режимах (стандартное фиксированное освещение, постоянное освещение). На отдельных этапах работы дополнительно определяли уровень половых стероидов (эстрадиол, прогестерон) и общего ГЦ в сыворотке и плазме крови, соответственно, а также моноаминооксидазную активность в вышеупомянутых гипоталамических структурах (МПО и СВ-Арк). В некоторых случаях содержание биогенных аминов определяли также и в других гипоталамических структурах, а именно в СХЯ и сером бугре (СБ). Декапитацию животных производили на стадии проэструса или диэструса с началом в 5 ч, 9:30 ч и 11 ч циркадианного времени (ЦВ) или, в зависимости от условий эксперимента, в другое время (конкретные временные точки в каждой из экспериментальных серий указаны в гл. 3). ЦВ отсчитывали от начала дневной фазы экспериментальных суток, искусственно поддерживаемых в виварии; под временными точками здесь и далее понимали временные промежутки с началом декапитации в указанное время, при этом общее время декапитации животных, ограниченное одним временным промежутком, не превышало 40 мин. Стадии эстрального цикла животных в день декапитации определяли по соотношению клеток трех типов, присутствующих во влагалищных мазках [Marcondes F. K., Bianchi F. J., Tanno A. P., 2002]. Правильность определения стадий эстрального цикла подтверждали post mortem, измеряя массу яичникови визуально оценивая степень обводненности матки. 96 Нелетучий ксенобиотик ДМГ вводили внутрибрюшинно, однократно, утром (в 3 ч ЦВ), накануне дня проэструса, в дозе 21 мг/кг массы (в расчете на основание), растворенный ex tempore в физиологическом растворе. Для проведения ингаляции толуола животных помещали в специальные затравочные камеры, сконструированные на базе блоков типа 1КА-НЖ. Схема затравочных камер представлена на рисунке 2.1. Емкость камер – 400 л. Скорость подачи воздуха в камеры – 30 л/мин. Животные подвергались воздействию паров ксенобиотика на заданном уровне 1 – камера; 2 – вентилятор; 3 – вакуумный насос; 4 – реометр выходной; 5 – барботажный сосуд; 6 – реометр дозирующий; 7 – реометр шунтирующий Рисунок 2.1 – Схема работы затравочной камеры в течение 4 ч в день по 5 дней в неделю на протяжении 2 мес. Концентрацию толуола в камерах поддерживали на уровне предельно допустимой концентрации (ПДК), установленной гигиенистами для воздуха рабочей зоны промышленных предприятий (50 мг/м3). Дозировку ксенобиотика осуществляли весовым методом. Расчет концентрации паров проводили по формуле: А/(ВС), где: А – масса испарившегося вещества, мг; В – продув воздуха, м3/ч; С – время испарения, ч. Во время ингаляции было обеспечено продувание камер, достаточное для поддержания концентрации кислорода и углекислого газа на физиологическом уровне. При проведении экспериментов фиксировалась температура, влажность и давление воздуха 97 внутри камер. Животных контрольной группы помещали в такие же камеры, но без подачи в них ксенобиотика. После каждого сеанса ингаляции животных возвращали в виварий. Мелатонин вводили вечером (в 10 ч ЦВ) в дозе 1 мг/кг массы. Пептидные биорегуляторы эпиталамин, эпиталон и пинеалон [Хавинсон В. Х., 2001] вводили днем (в 6 ч ЦВ) в дозе 1 мг/кг массы, 2 мкг/кг массы и 10 мкг/кг массы, соответственно. Все препараты растворяли в физиологическом растворе и вводили внутрибрюшинно, ежедневно в течение 4 дней, предшествовавших дню декапитации, в объеме 0,25 мл. Дозы и режим введения пептидных препаратов были разработаны и изучены в работах [Морозов В. Г., Хавинсон В. Х., 1996; Хавинсон В. Х., Морозов В. Г., 2001; Хавинсон В. Х., Анисимов В. Н., 2003]. Водный раствор L-метионина вводили перорально, ежедневно в течение 30 дней, в количествах, необходимых для получения животными суточной дозы 0,12-0,15 г в расчете на животное. Исходя из полученных нами ранее данных о том, что принудительное пероральное введение L-метионина самкам крыс приводит к более выраженному повышению уровня общего ГЦ в сыворотке крови, чем потребление L-метионина с питьевой водой [Арутюнян А. В. и соавт., 2012], в настоящем исследовании была выбрана экспериментальная модель ГГЦ с пероральным введением L-метионина. Для определения уровня общего ГЦ в крови забор материала осуществляли в вакуумные пробирки Vacuette® с антикоагулянтом калия этилендиаминтетраацетатом (К3EDTA, Greiner Bio-One GmbH, Австрия). Так как ГЦ продолжает синтезироваться в эритроцитах и после забора крови, забранный материал центрифугировали настолько быстро, насколько это было возможно, после чего оставляли на льду до начала анализа. Исследование влияния на экспериментальных животных световой депривации проводили, как описано ниже. Животные, первоначально содержавшиеся достаточно длительное время (2-3 нед.) в условиях стандартного фиксированного освещения, помещались на трое суток в условия световой депривации. Длительность пребывания животных в этих условиях была выбрана в соответствии с описанными в литературе подходами к изучению циркадианной природы суточных ритмов [Cagampang F. R., Okamura H., Inouye S., 1994; Jamali K. A., Tramu G., 1999]. Считается, что в течение трех суток в условиях световой депривации суточные ритмы, связанные с изменением освещенности, полностью исчезают, но при этом еще не происходит сдвига фазы эндогенных циркадианных ритмов, что наблюдается при помещении животных в темноту на более длительный срок. Для описания времени декапитации животных, находившихся в условиях световой депривации, использовали понятия «условный день» и «условная ночь», соответствующие светлому и темному времени астрономических суток, в условиях циклической смены которых животные содержались до помещения их в условия световой депривации. 98 Исследование влияния на экспериментальных животных постоянного освещения в сочетании с применением мелатонина и эпиталона проводили следующим образом. В эксперименте использовали животных в возрасте 3, 5, 8, 11, 14, 17, 20 и 23 мес. Исследование проводили до естественной гибели животных. В данной экспериментальной серии изучали следующие показатели: средняя продолжительность эстрального цикла, количество эстральных циклов разной продолжительности и их процентное соотношение, процентное соотношение фаз эстрального цикла, относительное число животных с иррегулярными циклами. Стадии эстрального цикла в этих исследованиях определяли, начиная с трехмесячного возраста, каждые три месяца ежедневно в течение двух недель. В 25-дневном возрасте все животные данной серии были рандомизированно разделены на две группы. Первая группа находилась в условиях стандартного фиксированного освещения. Вторая группа животных содержалась при круглосуточном постоянном освещении. В возрасте 4 мес. животных каждой из двух групп рандомизированно делили на три равные подгруппы. Животные первой подгруппы получали на протяжении всей последующей жизни в течение пять дней в неделю в ночное время суток (с 19.00 ч до 07.00 ч) вместе с питьевой водой мелатонин в дозе 10 мг/л [Pierpaoli W., Maestroni G. J., 1987]. Животным второй подгруппы ежемесячно курсами по пять дней в неделю подкожно утром (в 3 ч ЦВ) вводили эпиталон в количестве 0,1 мкг на животное в 0,1 мл физиологического раствора. Животные третьей подгруппы являлись контрольными. В этой подгруппе выделялись две части: одни контрольные животные получали инъекцию физиологического раствора в те же часы, когда производилась инъекция эпиталона, другие – питьевую воду в ночное время суток. Поскольку изучаемые показатели у интактных животных, содержавшихся в условиях вивария, и у контрольных животных, которым вводили физиологический раствор, не имели статистически достоверных отличий, данные по ним были объединены и представлены как данные одной контрольной группы. Исследование влияния возраста экспериментальных животных на содержание биогенных аминов в структурах гипоталамуса, ответственных за синтез и секрецию ГнРГ, включало в себя четыре возрастные группы. Первую группу составили животные в возрасте 1,5 мес. Данный возраст характеризуется открытием влагалища и формированием эстральных циклов. Вторая группа животных состояла из половозрелых, регулярно циклирующих самок в возрасте 7-8 мес. В третьей группе животных находились самки в возрасте 13-14 мес., при котором еще встречаются отдельные эстральные циклы, но уже наблюдается удлинение стадий диэструса и (или) эструса. Четвертую группу животных составили самки в возрасте 24 мес. и старше, в котором половая цикличность полностью прекращается и животные находятся в состоянии персистирующего эструса или диэструса. 99 Количество животных в контрольной и опытных группах в каждой из экспериментальных серий указано в гл. 3. 2.4. Выделение и препарирование структур мозга, осуществляющих регуляцию эстральных циклов Из мозга декапитированных животных выделяли гипоталамические структуры (МПО, СВ-Арк, СХЯ, СБ). Топографическая идентификация анатомических образований осуществлялась с использованием атласов анатомии головного мозга крыс [Paxinos G., Watson C., 2007] или как описано ранее [Савченко О. Н., Данилова О. А., 1979]. Ориентируясь на оптическую хиазму, делали фронтальный срез мозга до и после нее толщиной около 1 мм. Из него извлекали МПО гипоталамуса – участок треугольной формы массой 2-3 мг, а из следующего среза толщиной 0,8 мм выделяли фрагмент, содержащий СХЯ гипоталамуса. Фрагмент, содержащий СВ-Арк гипоталамуса, массой около 1 мг, выделяли из СБ гипоталамуса. После выделения структуры замораживали в жидком азоте и хранили при температуре –70 0С до начала анализа. После размораживания исследуемые структуры мозга гомогенизировали в 0,5 мл 0,1 М хлорной кислоты, содержащей 0,05% калия метабисульфита, после чего отбирали 0,1 мл пробы для определения содержания общего белка по методу Лоури [Lowry O. H. et al., 1951]. Оставшийся гомогенат центрифугировали (10 000 g, 15 мин., +4 0С), осадок отбрасывали, а от супернатанта отбирали 0,05 мл для измерения интенсивности хемилюминесценции. Супернатант переносили в прибор для микрофильтрации и фильтровали через капроновый фильтр с диаметром пор 0,2 мкм; фильтрат подвергали хроматографическому анализу в тот же день. В отдельных сериях исследований исследуемые структуры мозга после размораживания гомогенизировали в меньшем объеме (0,3 мл) 0,1 М хлорной кислоты, содержащей 0,05% калия метабисульфита, и центрифугировали (10 000 g, 15 мин., +4 0С). Осадок растворяли в 0,2 мл 1 М натрия гидроксида для определения содержания общего белка по методу Вера [Vera J. C., 1988], а супернатант переносили в прибор для микрофильтрации и фильтровали через капроновый фильтр с диаметром пор 0,2 мкм; фильтрат подвергали хроматографическому анализу в тот же день. Для определения моноаминооксидазной активности ткань гомогенизировали в 0,32 М растворе сахарозы, приготовленном в 0,05 М фосфатном буфере (рН 7,4), и центрифугировали 100 (1 000 g, 10 мин., +4 0С). Осадок отбрасывали, а супернатант использовали для проведения моноаминоксидазной реакции. Для определения содержания ГнРГ гипоталамические структуры гомогенизировали в 0,3 мл 0,1 М уксусной кислоты при температуре, близкой к 0 0С, после чего подвергали термической обработке (10 мин., +100 0С) и центрифугировали (13 000 g, 15 мин., +4 0С). Осадок растворяли в 0,2 мл 1 М натрия гидроксида для определения содержания общего белка по методу Вера [Vera J. C., 1988], а из супернатанта отбирали 90 мкл (в случае МПО, без последующего разведения) либо 20 мкл (в случае СВ-Арк, с последующим разведением 0,1 М раствором уксусной кислоты в соотношении 1:10, v/v). Полученные аликвоты осторожно нейтрализовали 1 М раствором натрия гидроксида (в соотношении 10:1, v/v) и разбавляли буфером из тест-системы для стандартизованного иммуноферментного определения содержания ГнРГ в биологических образцах (в соотношении 1:5, v/v). Из полученных растворов отбирали 50 мкл, которые использовали непосредственно для иммуноферментного определения содержания нейропептида в гипоталамических структурах. 2.5. Определение уровня гонадолиберина в структурах мозга иммуноферментным методом Тест-система Peninsula Laboratories, LLC предназначена для определения содержания ГнРГ в биологических образцах (ткань, плазма и сыворотка крови) методом иммуноферментного анализа. Твердофазный иммуноферментный анализ основан на конкуренции за сайты связывания с моноклональными антигонадолибериновыми антителами между ГнРГ в образце и биотинилированным ГнРГ. После удаления ГнРГ, не связавшегося с планшетом, в ячейки добавляется стрептавидин, меченный пероксидазой хрена. Активность пероксидазы измеряется спектрофотометрическим методом после добавления субстрата. Полученная абсорбция обратно пропорциональна концентрации ГнРГ в пробе. Измерение оптической плотности осуществляли при 450 нм, используя автоматический фотометр для микропланшетов и стрипов ELx800 (BioTek Instruments, США). 101 2.6. Определение уровня половых гормонов в сыворотке крови радиоиммунологическим методом Уровень половых стероидов (эстрадиол, прогестерон) в сыворотке крови определяли радиоиммунологическим методом. Характеристики антисывороток к эстрадиолу и прогестерону (их специфичность, рабочие титры) приведены в работе [Морозов В. И. и соавт., 1988]. В качестве радиоактивных лигандов использовали препараты гормонов, меченные тритием по четырем положениям стероидного кольца (1, 2, 6, 7) с удельной активностью 3,2-3,5 ТБк/моль. Рабочие титры антисывороток подгоняли таким образом, чтобы в холостой пробе связывалось 30-50% активности. Неспецифическое связывание в пробе без антисыворотки составляло 2-4% от общей активности. Диапазоны концентраций для калибровочных кривых составляли: для эстрадиола – от 5 до 250 пг на пробу, для прогестерона – от 25 до 800 пг на пробу. Уровень эстрадиола в сыворотке крови определяли после предварительной экстракции диэтиловым эфиром, при этом 0,1-0,2 мл сыворотки экстрагировали с помощью 1-2 мл эфира. Водную часть замораживали, эфир сливали в пробирку для тестирования и выпаривали. К сухому остатку добавляли 0,1 мл 10 мМ фосфатного буфера (рН 7,4) и использовали в радиоиммунологической реакции. Уровень прогестерона в сыворотке крови определяли безэкстракционным методом. Для этого в радиоиммунологическом методе использовали кислый ацетатный буфер (pH 4,0), который инактивирует кортикостеронсвязывающий белок. Ввиду высокого содержания прогестерона в сыворотке в анализ брали 5 мкл биологического образца, добавляли 0,1 мл ацетатного буфера и проводили радиоиммунологическую реакцию. К 0,1 мл испытуемой пробы (а также к 0,1 мл холостой пробы и 0,1 мл стандарта) добавляли 0,1 мл антисыворотки в рабочем титре и 0,1 мл раствора меченого гормона с общей активностью 8 000-10 000 имп./мин. на пробу. Содержимое пробирок тщательно перемешивали и инкубировали в течение 45 мин. при +37 0С. Адсорбцию меченого гормона, не связавшегося с антисывороткой, проводили декстран-угольной смесью (0,25% активированного угля и 0,025% декстрана с молекулярной массой 110 кДа), добавляя ее в количестве 0,5 мл. После инкубации уголь осаждали центрифугированием (3 500 g, 10 мин.), для подсчета радиоактивности надосадочную жидкость сливали в виалы со сцинтилляционной жидкостью, приготовленной на толуоле (0,4 г дифенилоксазола и 0,04 г 1,4-ди-(5-фенил-2- оксазолилбензола) на 1 л толуола). Подсчет радиоактивности проводили на следующий день на жидкостном сцинтилляционном счетчике LKB 1215 RackBeta (Wallac, Финляндия). 102 2.7. Определение содержания биогенных аминов и их метаболитов в структурах мозга методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с электрохимическим детектированием Для анализа биогенных аминов и их метаболитов в различных биологических объектах в настоящее время используется метод высокоэффективной жидкостной хроматографии с электрохимическим детектированием, обеспечивающий высокую чувствительность, селективность и скорость анализа [Зех К., 1988]. Количественное определение НА, ДА и его метаболита 3,4-ДОФУК, 5-ОТ и его метаболита 5-ОИУК в экстрактах структур мозга проводили методом обращеннофазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии с электрохимическим детектированием [Кудрин В. С. и соавт., 1995]. Хроматографическая система состояла из изократического насоса модели Maraphone-2 (SSI, США), инжектора петлевого ввода типа Rheodyne (НПП «Биохром», Россия), дегазатора подвижной фазы SDU 2006 (Швеция) и устройства для термостатирования хроматографических колонок (ООО «Элсико», Россия). Хроматографическое разделение биогенных аминов и их метаболитов осуществляли на металлической колонке Reprosil 80 ODS-2 (1004 мм, 3 мкм; Dr. Maisch GmbH, ФРГ). Детектирование проводили на аналитической ячейке модели 5100А Coulochem II (ESA, США) при потенциале +0,65 В. Подвижная фаза содержала 6 мМ цитратного буфера, 2 мМ натрия этилендиаминтетраацетата, 1,1 мМ натрия октилсульфоната и 7% ацетонитрила (v/v), рН 5,1. Расход элюента – 0,75 мл/мин, температура колонки – +30 0С. Стандартные растворы НА, ДА, 3,4-ДОФУК, 5-ОТ, 5-ОИУК и 3,4-диоксибензиламина (внутренний стандарт) в 0,1 М хлорной кислоты, содержащей 0,05% калия метабисульфита, готовили методом последовательных разбавлений. Концентрации компонентов стандартной смеси находились в пределах величин, наблюдаемых в реальных образцах. Соотношение между вводимым количеством стандарта и откликом детектора было линейным для всех исследуемых веществ в диапазоне 0-500 нМ. Предел детектирования составил 0,05 нг. Количественные характеристики хроматографических пиков измерялись автоматически системой регистрации и обработки спектрометрической информации UniChrom 4.4 (ООО «Новые Аналитические Системы», Беларусь). Содержание определяемых веществ рассчитывали в нанограммах на миллиграмм общего белка, который определяли по методу Лоури [Lowry O. H. et al., 1951] или Вера [Vera J. C., 1988]. 103 Для оценки состояния и функциональной активности моноаминергических систем мозга в исследуемых структурах мозга определяли изменение содержания соответствующих нейромедиаторов и их главных метаболитов, а также соотношение между ними. 2.8. Определение уровня общего L-гомоцистеина в плазме крови иммуноферментным методом Тест-система Axis Homocysteine EIA предназначена для определения концентрации общего ГЦ в крови методом иммуноферментного анализа. Связанный с белком ГЦ восстанавливается до свободного и превращается в S-аденозил-L-гомоцистеин ферментативным путем в специальной процедуре, предшествующей иммуноанализу. Фермент специфичен для L-формы ГЦ, в которой последний и присутствует в крови. Смесь дисульфида ГЦ и белок-связанной формы аминокислоты в образце восстанавливается до свободного ГЦ при использовании дитиотреитола. Высвободившийся ГЦ образца далее превращается в S-аденозил-L-гомоцистеин при участии S-аденозил-Lгомоцистеингидролазы в присутствии избытка аденозина. Следующий за этим твердофазный иммуноферментный анализ основан на конкуренции за сайты связывания с моноклональными анти-S-аденозил-L-гомоцистеиновыми в образце и антителами S-аденозил-L-гомоцистеином, между S-аденозил-L-гомоцистеином иммобилизованным в ячейках планшета. После удаления анти-S-аденозил-L-гомоцистеиновых антител, не связавшихся с планшетом, в ячейки добавляются вторые кроличьи антимышиные антитела, меченные пероксидазой хрена. Активность пероксидазы измеряется спектрофотометрическим методом после добавления субстрата. Полученная абсорбция обратно пропорциональна концентрации общего ГЦ в пробе. Измерение оптической плотности осуществляли при 450 нм, используя автоматический фотометр для микропланшетов и стрипов ELx800 (BioTek Instruments, США). 2.9. Определение уровня генерации активных форм кислорода в структурах мозга методом люминолзависимой хемилюминесценции Об уровне генерации АФК судили по уровню люминолзависимой перекисной хемилюминесценции [Арутюнян А. В., Дубинина Е. Е., Зыбина Н. Н., 2000]. 104 Супернатант, отобранный после гомогенизирования исследуемых микроструктур мозга, разводили фосфатным буфером (1:9, v/v; рН 7,4), содержащим 60 мМ калия фосфата однозамещенного и 105 мМ калия хлорида, и хранили до начала анализа при –20 0С. После размораживания к 100 мкл разведенного супернатанта добавляли 650 мкл фосфатного буфера и 50 мкл 10 мМ люминола. Приготовленную реакционную смесь помещали в кювету люминометра Emilite-1105 (ООО «БиоХимМак», Россия). Для инициации свечения в пробу с помощью шприца вносили 0,2 мл раствора водорода пероксида (Е230=2,33). Свечение измеряли в течение 2 мин. при +37 0С и определяли светосумму в относительных единицах (1 отн. е. эквивалентна 1 мВ). В качестве контроля использовали смесь фосфатного буфера и люминола (15:1, v/v). Уровень хемилюминесценции рассчитывали в относительных единицах на миллиграмм общего белка, который определяли по методу Лоури [Lowry O. H. et al., 1951]. 2.10. Определение содержания продуктов перекисного окисления липидов в сыворотке крови по тесту с 2-тиобарбитуровой кислотой спектрофотометрическим методом Принцип метода основан на определении интенсивности окраски, образующейся в ходе реакции между малоновым диальдегидом и 2-тиобарбитуровой кислотой, протекающей в кислой среде и при высокой температуре. Образующийся в результате реакции триметиновый комплекс, содержащий одну молекулу малонового диальдегида и две молекулы 2-тиобарбитуровой кислоты, имеет характерный спектр поглощения с максимумом при 535 нм [Арутюнян А. В., Дубинина Е. Е., Зыбина Н. Н., 2000]. К 0,2 мл сыворотки крови прибавляли 3 мл 2% раствора ортофосфорной кислоты (рН 1,3) и 1 мл 0,8% раствора 2-тиобарбитуровой кислоты. Пробы выдерживали в течение 45 мин. при +100 0С. Затем смесь охлаждали и экстрагировали окрашенный продукт 3 мл бутанола-1. Разделения водной и органической фаз достигали центрифугированием (1 000 g, 10 мин.). Затем, чтобы избежать мутности образцов, измеряли оптическую плотность бутанольных экстрактов при двух длинах волн (535 нм и 580 нм) на спектрофотометре DU-65 (Beckman, США). Бутанольный экстракт контрольной пробы готовили аналогично опытным пробам, используя вместо сыворотки крови 0,2 мл дистиллированной воды. Для расчета содержания продуктов перекисного окисления липидов использовали формулу: С=∆Е535-580Кl, где: 105 ∆Е535-580 – разница оптических плотностей бутанольных экстрактов при двух длинах волн; К – 1,88105 М-1см-1; l – длина светового пути, см. 2.11. Определение содержания нитритов в сыворотке крови спектрофотометрическим методом Нитриты – продукты окисления оксида азота молекулярным кислородом или другими окислителями. Широкое распространение получил спектрофотометрический метод определения нитритов в биологических жидкостях с использованием реактива Грисса. Реакцию на нитритные анионы проводят в безбелковом супернатанте сыворотки или плазмы крови [Madueño F., Guerrero M. G., 1991]. Для осаждения белка к образцам сыворотки крови добавляли 30% раствор цинка сульфата (20:1, v/v). После инкубации в течение 30 мин. при комнатной температуре пробы центрифугировали (2 000 g, 15 мин.), в случае необходимости отфильтровывали через фильтр Шотта. С супернатантом проводили реакцию Грисса, для чего к пробам последовательно добавляли сначала 1% раствор сульфаниловой кислоты в 2 М соляной кислоты, а затем, через 10 мин., реактив Грисса – 0,02% водный раствор 1-нафтилэтилендиамина гидрохлорида. Через 30 мин. развивалась розовая окраска. Оптическую плотность окрашенных продуктов измеряли при 540 нм, используя спектрофотометр DU-65 (Beckman, США). Калибровочный график строили по стандартному раствору натрия нитрита. 2.12. Определение моноаминооксидазной активности в структурах мозга спектрофотометрическим методом В основу метода, описанного в работе [Weissbach Н. et al., 1960] и являющегося прототипом использованного в данной работе способа определения моноаминооксидазной активности, положена реакция окислительного дезаминирования кинурамина, катализируемая МАО. Упомянутый выше метод основан на измерении убыли концентрации кинурамина, при окислении которого, вследствие спонтанной внутримолекулярной циклизации 106 промежуточного продукта, формируется 4-гидроксихинолин. В вышеуказанной работе также обращается внимание на возможность определения активности МАО по приросту концентрации 4-гидроксихинолина, на основании чего и проводилась оптимизация способа определения активности фермента. В результате предварительного снятия спектрограмм реакционной смеси было установлено, что 4-гидроксихинолин имеет два максимума поглощения при длинах волн 315 и 327 нм. В настоящем варианте метода прирост концентрации данного продукта регистрируется при 327 нм [Разыграев А. В., Арутюнян А. В., 2006]. Реакционная среда представляла собой раствор кинурамина в 0,05 М фосфатном буфере (рН 7,8). Конечная концентрация кинурамина – 0,19 мМ. Оптическая плотность раствора кинурамина данной концентрации при 327 нм составляет 0,45. В методе-прототипе [Weissbach Н. et al., 1960] используется более низкая концентрация кинурамина – 0,11 мМ, что, согласно литературным данным, не обеспечивает насыщения МАО [Горкин В. З., 1981]. К 0,73-0,75 мл раствора кинурамина (0,192-0,198 мМ) добавляли супернатант гомогената ткани до получения общего объема 0,76 мл с конечной концентрацией белка 0,016-0,375 мг/мл и тщательно перемешивали. В холостую пробу вместо биологического материала вносили раствор сахарозы в фосфатном буфере, использовавшийся для приготовления гомогенатов. Инкубацию проводили при +37 0С, периодически измеряя оптическую плотность при 327 нм. Для исследования вклада изоферментов МАО в общую кинураминоксидазную активность проводили подбор оптимальной концентрации ингибитора МАО R-депренила для специфического ингибирования изоформы типа В с тем, чтобы по разнице между общей (МАО А + МАО В) и остаточной активностями (МАО А) судить о работе ингибируемого изофермента. Для этого использовали следующие конечные концентрации R-депренила в реакционной смеси: 8,0; 4,0; 2,0; 1,0 и 0,5 мкМ. Содержание общего белка в реакционной смеси определяли после окончания инкубации по методу Вера [Vera J. C., 1988]. 2.13. Определение содержания общего белка в структурах мозга и в реакционной смеси турбидиметрическим методом Использование турбидиметрического метода определения содержания общего белка в биологических материалах, известного как метод Вера [Vera J. C., 1988], вызвано необходимостью концентрирования анализируемой пробы и внесения практически всего 107 супернатанта, полученного при предварительной обработке гомогенатов микроструктур мозга, в хроматографическую колонку (с учетом хроматографирования параллельных образцов) или в реакционную среду для определения ферментативной активности. В основу данного метода положено измерение при 340 нм оптической плотности, развивающейся в результате добавления к щелочному раствору белка равного объема 30% раствора трихлоруксусной кислоты. Пригодность этого метода для использования в настоящем исследовании была подтверждена нами посредством изучения его точности и чувствительности. Показатель точности опыта Р при четырех параллельных определениях составил 0,49%. Поскольку эмпирическое значение Р значительно меньше 2%, определения выполняются при помощи данного метода с высокой точностью [Матюшичев В. Б., 1990]. Содержание общего белка в реакционной смеси, в которой оценивали моноаминооксидазную активность, определяли после окончания инкубации, регистрируя оптическую плотность при 500 нм вместо 340 нм во избежание влияния присутствия кинурамина при более коротких длинах волн. При этом широко используемый метод Лоури [Lowry O. H. et al., 1951] не позволяет исследовать содержание белка в реакционной смеси по причине взаимодействия кинурамина с реактивами, применяемыми в вышеупомянутом методе, с развитием синего окрашивания. 2.14. Статистическая обработка результатов Статистическую обработку данных выполняли в среде интегрированных пакетов статистических программ STATISTICA 5.0 и EXCEL общепринятыми методами вариационной статистики [Лапач С. Н., Чубенко А. В., Бабич П. Н., 2001; Зайцев В. М., Лифляндский В. Г., Маринкин В. И., 2006]. Данные представлены в следующем виде: среднее арифметическое средняя ошибка среднего арифметического (Мm). Для определения статистической значимости полученных результатов были использованы: параметрический t-критерий Стьюдента (t-тест), непараметрический U-критерий Манна-Уитни (U-тест), критерий согласия Пирсона (2-тест). Достоверно различающимися признавали значения при р<0,05; при 0,05<р<0,10 говорили о тенденции к изменению; при p>0,1 различия считали недостоверными. Наличие суточных ритмов исследуемых показателей оценивали при помощи непараметрического Н-критерия Крускала-Уоллиса (Н-тест). 108 ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 3.1. Содержание гонадолиберина в медиальной преоптической области и срединном возвышении с аркуатными ядрами гипоталамуса и уровень половых гормонов в крови на различных стадиях эстрального цикла Анализ содержания ГнРГ в областях гипоталамуса, ответственных за синтез и секрецию этого нейрогормона, не показал достоверных различий между его уровнями в утреннее и дневное время. Так, в МПО гипоталамуса содержание ГнРГ на стадии проэструса составило: 0,570,09 нг/мг белка в 3 ч ЦВ и 0,520,07 нг/мл белка в 9:30 ч ЦВ. Похожая картина наблюдалась и в СВ-Арк гипоталамуса, где содержание нейрогормона составило: 41,35,1 нг/мг белка в 3 ч ЦВ и 57,612,5 нг/мг белка в 9:30 ч ЦВ. Однако важно отметить, что в случае СВ-Арк была заметна тенденция роста содержания нейрогормона ко времени его преовуляторной секреции. Можно предположить, что отсутствие при этом достоверных изменений обусловлено значительным разбросом данных в период формирования преовуляторного пика секреции ГнРГ (9:30 ч ЦВ). Полученные нами результаты о содержании ГнРГ в гипоталамусе согласуются с данными исследования, проведенного в нашей лаборатории ранее. В предварительных экспериментах, посвященных изучению нейропротекторных эффектов экзогенного мелатонина [Керкешко Г. О., 2002], было показано отсутствие достоверных различий между показателями содержания ГнРГ как в МПО, так и в СВ-Арк гипоталамуса самок крыс в контрольной группе в зависимости от времени суток (3 ч и 9:30 ч ЦВ). Недостатком этого исследования явилось то, что в процессе работы в день декапитации у экспериментальных животных не определялись стадии эстрального цикла; таким образом, предварительные данные представляли усредненную картину возможных суточных изменений в содержании нейрогормона. В более ранних исследованиях, также проведенных в нашей лаборатории [Степанов М. Г., 1994], было показано, что в МПО гипоталамуса, из которой был изъят СОКП, на стадии проэструса отмечалась лишь тенденция к повышению содержания ГнРГ в дневное время (9-10 ч ЦВ) по сравнению с утренним (3-4 ч ЦВ) значением. В то же время в СОКП величины утреннего и дневного содержания ГнРГ различались на порядок (p<0,001; t-тест), что позволило автору вышеупомянутого исследования сделать предположение о том, что отмеченная в классической работе С. Карла [Kalra S. P., 1976] циркадианная ритмика содержания ГнРГ в МПО гипоталамуса самок крыс на стадии проэструса, с относительно более низким значением данного показателя в утренние часы в сравнении с таковым в послеполуденное время, была обусловлена именно включением в нее СОКП. Дополнительно, в исследованиях, проведенных 109 в нашей лаборатории [Степанов М. Г., 1994], не было обнаружено достоверных суточных колебаний содержания ГнРГ в СВ-Арк гипоталамуса на стадии проэструса. Отдельные различия в данных, представленных в этом исследовании и полученных в нашей лаборатории ранее, а также приведенных в литературе, могут быть обусловлены рядом факторов. В данном исследовании изучали содержание нейрогормона в целой МПО гипоталамуса (с находящимся в ней СОКП) и только на стадии проэструса и выражали полученные результаты в пересчете на содержание в ткани общего белка, а не на объем супернатанта [Керкешко Г. О., 2002] или на фрагмент [Степанов М. Г., 1994]. Отличие же от данных литературы [Kalra S. P., 1976] могут быть обусловлены различным способом выделения гипоталамических структур, а также сезонными и иными факторами. Выявленная в результате проведенных исследований неоднозначность в отношении самого факта циркадианной природы изменений уровня ГнРГ в гипоталамусе, а также различие в методологических подходах к исследованию этого явления побудили нас к изучению регуляции содержания ГнРГ со стороны нейромедиаторных систем на различных стадиях эстрального цикла. Несмотря на то, что на всех этапах данного исследования стадия эстрального цикла экспериментальных животных определялась по влагалищному мазку и после декапитации по состоянию маточных труб, нами также проводилась оценка фона половых гормонов в крови. Полученные данные, подтверждая результаты других исследований, указывают на достоверно (U=13,5; p<0,01) повышенный фон эстрадиола на стадии проэструса с максимальным пиком в 9:30 ч ЦВ. Так, на стадии проэструса уровень гормона составил: 0,27±0,01 нМ –в 5 ч ЦВ; 0,41±0,03 нМ – в 9:30 ч ЦВ и 0,35±0,04 нМ – в 11 ч ЦВ. На стадии диэструса концентрация эстрадиола достоверно отличалась от таковой на стадии проэструса в дневной (U=4; p<0,001) и вечерней (U=35,5; p<0,05) временных точках и составила: 0,20±0,03 нМ – в 5 ч ЦВ; 0,16±0,03 нМ – в 9:30 ч ЦВ и 0,24±0,02 нМ – в 11 ч ЦВ. На стадии диэструса к вечеру уровень эстрадиола в крови повышался и становился сходным с таковым в 5 ч ЦВ на стадии проэструса (рисунок 3.1). Уровень же прогестерона на обеих стадиях эстрального цикла, по нашим данным, достоверно не отличался в 5 ч ЦВ (21,2±3,0 нМ – на стадии проэструса; 30,5±5,6 нМ – на стадии диэструса) и не изменялся на протяжении всего дня на стадии диэструса (23,7±3,1 нМ – в 9:30 ч ЦВ; 29,5±3,3 нМ – в 11 ч ЦВ), но начинал достаточно резко возрастать и достигал своего максимума к 11 ч ЦВ на стадии проэструса (53,2±5,0 нМ – в 9:30 ч ЦВ; 82,9±14,8 нМ – в 11 ч ЦВ) (рисунок 3.2). 110 0,5 0,45 0,4 0,35 нМ 0,3 Проэструс 0,25 Диэструс 0,2 * 0,15 ** 0,1 0,05 0 5 9:30 11 циркадианное время, ч # – различие с показателем в 5 ч циркадианного времени на той же стадии эстрального цикла достоверно (p<0,01; U-тест); *, ** – различия с показателем на стадии проэструса в то же время достоверно (*р<0,05; **р<0,001; U-тест) Рисунок 3.1 – Содержание эстрадиола в сыворотке крови самок крыс на различных стадиях эстрального цикла (M±m, n=9-13) 12 0 # 10 0 нМ 80 # Проэструс 60 Ди эстр ус 40 20 * * 0 5 9:30 11 циркадианное время, ч # – различия с показателем в 5 ч циркадианного времени на той же стадии эстрального цикла достоверны (p<0,001; U-тест); * – различия с показателем на стадии проэструса в то же время достоверны (р<0,001; U-тест) Рисунок 3.2 – Содержание прогестерона в сыворотке крови самок крыс на различных стадиях эстрального цикла (M±m, n=7-12) 111 Таким образом, у животных, использованных в настоящем исследовании, наблюдалась характерная для стадий диэструса и проэструса картина изменений уровня половых стероидов в крови. 3.2. Суточная динамика и среднесуточное содержание биогенных аминов в медиальной преоптической области и срединном возвышении с аркуатными ядрами гипоталамуса на различных стадиях эстрального цикла Данные литературы о роли биогенных аминов в процессах синтеза и секреции ГнРГ были и остаются до сих пор достаточно противоречивыми [Kalra S. P., Kalra P. S., 1983; Бабичев В. Н., 1995, 2005; Chappel P. E., 2005]. Предполагается, что для осуществления преовуляторного пика секреции ГнРГ необходимо взаимодействие двух сигналов – гормонального, заключающегося в повышении уровня в крови синтезируемых яичниками половых стероидов в период, предшествующий овуляции, и циркадианного сигнала, ежедневно поступающего из СХЯ гипоталамуса к нейрональным структурам, ответственным за синтез и секрецию этого нейрогормона. Несмотря на наличие отдельных исследований in vivo и in vitro, доказывающих прямое действие эстрадиола на гонадолиберинергические нейроны [Roy D., Angelini N. L., Belsham D. D., 1999; Herbison A. E., Pape J. R., 2001; Navarro C. E. et al., 2003; Petersen S. L., Ottem E. N., Carpenter C. D., 2003; Temple J. L. et al., 2004], в настоящее время считается, что эстрадиол и прогестерон преимущественно опосредуют свое влияние на синтез и секрецию ГнРГ через эстрогенчувствительные нейроны, входящие в состав различных нейромедиаторных систем [Mahesh V. B., Brann D. W., 1998; Warembourg M. et al., 1998; Herbison A. E., 1998; Chappell P. E., Levine J. E., 2000; Kelly M. J., Rønnekleiv O. K., 2008]. Нейромедиаторы, и особенно биогенные амины, принимают активное участие в осуществлении контроля над регуляцией овариального цикла [Бабичев В. Н., 1995]. По этой причине оценить зависимость изменений в содержании различных нейромедиаторов в структурах гипоталамуса, ответственных за синтез и секрецию ГнРГ, от овариального и циркадианного сигналов, специфически действующих на моноаминергические системы гипоталамуса, оказывается для исследователей довольно непростой задачей. Ранее в нашей лаборатории уже проводились исследования по изучению суточных ритмов содержания биогенных аминов в различных гипоталамических структурах, однако в них не всегда учитывалась стадия эстрального цикла. Между тем для более полного понимания процессов взаимодействия различных моноаминергических систем гипоталамуса и их участия в центральной регуляции овариальных 112 циклов необходимо учитывать влияние на эти механизмы уровня половых гормонов в крови. Изменение через этого уровня специфические на рецепторы различных стадиях активацию или эстрального торможение цикла различных вызывает тормозных и стимулирующих нейромедиаторных систем, которые в результате осуществляют контроль над синтезом ГнРГ, его продвижение по аксонам и выделение в кровь в нейрогемальных областях [Kalra S. P. et al., 1997]. В проведенном нами исследовании суточной динамики содержания биогенных аминов в структурах гипоталамуса, в которых происходят синтез и секреция ГнРГ, было обнаружено, что на стадии проэструса содержание НА в МПО гипоталамуса в период времени с 9 ч до 11 ч ЦВ имеет место достоверное (U=11; р<0,05) снижение содержания этого нейромедиатора, а к 14 ч ЦВ уже отмечается тенденция к его повышению (рисунок 3.3). Содержание же ДА в той же гипоталамической структуре в указанном временном интервале изменялось без достоверно значимых различий, что носило характер тенденций: к снижению в период с 9 ч до 11 ч ЦВ и к повышению в период с 11 ч до 14 ч ЦВ (рисунок 3.4). В СВ-Арк гипоталамуса достоверной суточной динамики содержания НА выявлено не было (рисунок 3.5). Однако уровень ДА в этой структуре достоверно (U=2; р<0,05) повышался в период времени с 9 ч до 11 ч ЦВ и имел тенденцию к снижению в следующем временном интервале, с 11 ч до 14 ч ЦВ (рисунок 3.6). Выяснение природы суточных изменений содержания биогенных аминов в гипоталамических областях, участвующих в синтезе и секреции ГнРГ, может стать ключом к пониманию роли этих нейромедиаторов в регуляции эстральных циклов в норме, что в дальнейшем поможет установить причины нарушений центральной регуляции репродуктивной функции при различных патологических состояниях и воздействии неблагоприятных факторов внешней среды, а также в процессе старения. Ранее нами уже проводился анализ суточной динамики содержания биогенных аминов в структурах гипоталамуса. Проведенные в нашей лаборатории исследования обнаружили различное содержание биогенных аминов в утреннее и позднее вечернее время суток [Керкешко Г. О., 2002], что послужило основанием для более детального исследования нами суточной динамики содержания НА и ДА в структурах гипоталамуса, ответственных за синтез и секрецию ГнРГ. Данное исследование проводилось только на стадии проэструса. Ранее нами объединялись данные по стадиям диэструса и проэструса, что не давало возможности получить представления о зависимости содержания вышеупомянутых нейромедиаторов от изменяющегося фона половых гормонов в крови. Другие исследователи в своих работах также отмечали наличие суточных ритмов содержания различных нейромедиаторов в гипоталамических областях, 113 3 25 2,5 20 нг/мг белка нг/мг белка 2 15 10 * 1,5 1 5 0,5 0 0 8 10 12 8 14 10 12 14 циркадианное в ремя, ч циркадианное время, ч * – различие с показателем в 9 ч циркадианного Рисунок 3.4 – Суточная динамика времени достоверно (p<0,05; U-тест) содержания дофамина в медиальной Рисунок 3.3 – Суточная динамика преоптической области гипоталамуса содержания норадреналина самок крыс на стадии проэструса в медиальной преоптической области (M±m, n=6-9) гипоталамуса самок крыс на стадии проэструса (M±m, n=7-9). связанных с реализацией репродуктивной функции. Так, в некоторых работах, проведенных на интактных животных на стадии диэструса, характеризующейся относительным постоянством уровня половых гормонов в крови, были обнаружены суточные изменения содержания ДА в МПО гипоталамуса с характерным снижением уровня нейромедиатора в дневные часы по сравнению с ночным значением данного показателя, а также изменения содержания НА в той же гипоталамической структуре, которые носили противоположный характер [Reuss S. et al., 1999]. В других же исследованиях, проведенных на овариэктомированных животных при введения капсулы с эстрадиолом, суточной динамики содержания ДА в МПО гипоталамуса выявлено не было [MohanKumar S. M. J., MohanKumar P. S., 2004]. В исследованиях, проведенных на самцах, были обнаружены достоверные изменения в суточной динамике содержания НА в СВ гипоталамуса с пиковым значением в середине светлого времени суток [Koulu M. et al., 1989], однако ни в данном исследовании, ни в исследованиях, проведенных нами ранее [Керкешко Г. О., 2002], подобных изменений в организме самок крыс обнаружено не было. 21 7 18 6 15 5 нг/мг белка нг/мг белка 114 12 9 4 3 6 2 3 1 0 * 0 8 10 12 14 циркадианное время, ч 8 10 12 14 циркадианное время, ч Рисунок 3.5 – Суточная динамика * – различие с показателем в 9 ч циркадианного содержания норадреналина времени достоверно (p<0,05; U-тест) в срединном возвышении с аркуатными ядрами гипоталамуса самок крыс на стадии проэструса (M±m, n=6-8). Рисунок 3.6 – Суточная динамика содержания дофамина в срединном возвышении с аркуатными ядрами гипоталамуса самок крыс на стадии проэструса (M±m, n=5-7) Достаточно трудно сопоставить полученные нами результаты по суточной динамике содержания НА и ДА в исследованных структурах гипоталамуса с данными литературы, так как сведения о характере этих изменений носят противоречивый характер, что может быть обусловлено рядом факторов, таких как: возраст животного, пол, стадия эстрального цикла, сезонные различия, изменяющийся световой режим, различие в методах определения биогенных аминов. Кроме того, характер суточной динамики содержания биогенных аминов сильно зависит от того, какие конкретно структуры гипоталамуса были подвергнуты исследованию. Так, в различных ядрах, входящих в состав МПО гипоталамуса, активность моноаминергических систем может быть различной, а исследование СВ гипоталамуса может проводиться с анализом прилегающих к нему аркуатных ядер гипоталамуса, как в нашем эксперименте, или же без них. Необходимо также отметить, что изменения в содержании нейромедиаторов могут осуществляться не постепенно, в течение нескольких часов, а за достаточно короткий промежуток времени, что, вероятнее всего, связано с реализацией определенной функции и относительно быстрым восстановлением их базального уровня. 115 Подобный характер изменений подразумевает необходимость достаточно частых измерений (некоторые исследователи регистрируют данные с 10-20-минутными интервалами, что представляет собой довольно трудоемкий и времязатратный процесс), а включение в эксперимент небольшого числа временных точек может недостаточно точно отражать картину суточных изменений уровня нейромедиаторов. Обнаруженные нами резкое снижение содержание НА в МПО гипоталамуса и достоверный подъем содержания ДА в СВ-Арк гипоталамуса совпадают по времени с завершением преовуляторного пика секреции ГнРГ. Кроме того, в эти же часы происходит подъем уровня прогестерона и содержания опиоидных пептидов, а также снижение уровня вазопрессина [Fox S. R. et al., 1990]. Известно, что увеличение секреции прогестерона на стадии проэструса, на фоне повышенного уровня эстрадиола, происходит за несколько минут до преовуляторного пика секреции ЛГ [Fink G., Rosie R., Thomson E., 1991], что характеризует механизм положительной обратной связи овариального сигнала активации гипоталамогипофизарного звена регуляции репродуктивной функции. Вазопрессин же является одним из основных нейромедиаторов, участвующих в передаче циркадианного сигнала запуска процесса гиперсекреции ГнРГ от СХЯ к МПО гипоталамуса [Kalra S. P., 1993; Inouye S. T., 1996; Palm I. F. et al., 1999, 2001]. Подобное изменение содержания НА в МПО и ДА в СВ-Арк гипоталамуса именно в этом, достаточно узком, временном интервале может формировать тот самый нейромедиаторный фон, который необходим для реализации пика секреции ГнРГ на стадии проэструса. В результате проведенного исследования возникает вопрос о том, зависят ли обнаруженные суточные изменения содержания НА и ДА в МПО и СВ-Арк гипоталамуса исключительно от работы центрального циркадианного осциллятора, СХЯ гипоталамуса, или же на эти ритмы влияет изменение уровня освещенности. До сих пор в литературе нет однозначных данных, проливающих свет на природу суточной динамики содержания биогенных аминов в каких-либо отделах гипоталамуса самок крыс, прежде всего в МПО и СВ. Подавляющее большинство исследований в этом направлении выполнено на самцах. Обусловлено это, по-видимому, тем, что самки представляют собой довольно сложный объект исследования по причине наличия у них половой цикличности, которая связана с изменениями на разных стадиях эстрального цикла уровня в крови половых гормонов, способных влиять на активность нейромедиаторных систем. Значительная роль в формировании преовуляторного пика секреции ГнРГ отводится именно влиянию на активность моноаминергических нейронов повышенного уровня в крови половых стероидов в день проэструса. Некоторые авторы рассматривают изменения содержания НА и ДА в МПО и СВ гипоталамуса только как следствие повышения в крови уровня половых гормонов, не связанное напрямую 116 с суточными ритмами организма [MohanКumar P. S., ThyagaRajan S., Quadri S. K., 1995], однако наличие сходных суточных изменений содержания биогенных аминов в условиях искусственно созданного постоянного уровня в крови половых гормонов, пониженного в результате овариэктомии и повышенного при введении овариэктомированным животным эстрогенов [Wise P. M. et al., 1997], позволяет предположить, что обнаруженные изменения связаны с системой суточного периодизма. Поэтому в следующей серии экспериментов нами была изучена зависимость суточных изменений содержания исследуемых нейромедиаторов в структурах гипоталамуса, ответственных за синтез и секрецию ГнРГ, от стадии эстрального цикла и уровня половых гормонов в крови, для чего были выбраны три временные точки, достаточно хорошо отражающие основные изменения в стероидном фоне и секреции ГнРГ на стадии проэструса. Кроме того, было проведено исследование суточных ритмов содержания биогенных аминов в вышеупомянутых гипоталамических структурах в условиях световой депривации для уточнения вопроса об их циркадианной природе. Было обнаружено, что в исследованных областях гипоталамуса наблюдается различная суточная динамика содержания биогенных аминов в зависимости от стадии эстрального цикла. Так, было установлено, что в МПО гипоталамуса как на стадии проэструса, так и на стадии диэструса, при котором уровень половых гормонов в крови остается относительно стабильным, наблюдаются сходные суточные изменения содержания НА (рисунок 3.7). Содержание нейромедиатора в исследуемой области гипоталамуса составило на стадии проэструса: 11,00,6 нг/мг белка (5 ч ЦВ), 9,70,8 нг/мг белка (9:30 ч ЦВ) и 5,90,4 нг/мг белка (11 ч ЦВ); на стадии диэструса: 10,12,3 нг/мг белка (5 ч ЦВ), 11,00,4 нг/мг белка (9:30 ч ЦВ) и 7,70,5 нг/мг белка (11 ч ЦВ). Как будет показано ниже (таблица 3.1, рисунок 3.15), среднесуточное содержание НА в МПО гипоталамуса не зависит от стадии эстрального цикла; следовательно, независимо от уровня половых стероидов в крови, этот нейромедиатор подвержен постоянным ежедневным изменениям с характерным снижением его уровня в узком временном интервале с 9:30 ч до 11 ч ЦВ (р<0,01). В то же самое время с помощью Н-теста Крускала-Уоллиса была подтверждена зависимость содержания НА в данной гипоталамической области от временного показателя (Н=14,247; p<0,001). Так, содержание нейромедиатора при объединении данных по стадиям цикла (диэструс и проэструс) составило: 10,01,3 нг/мг белка (5 ч ЦВ), 10,30,5 нг/мг белка (9:30 ч ЦВ) и 6,80,4 нг/мг белка (11 ч ЦВ) (рисунок 3.8). При этом важно отметить, что максимальной величины уровень содержания НА в этой гипоталамической структуре достигает в интервале времени с 5 ч до 9:30 ч ЦВ, что соответствует, как показали наши дальнейшие эксперименты, времени оптимального проявления преовуляторного пика секреции ГнРГ. 117 12 14 12 * ** 5 9:30 циркадианное время, ч 10 * 8 6 * 4 8 нг/мг белка нг/мг белка 10 6 4 2 2 0 5 9:30 11 0 циркадианное время, ч Проэструс Диэструс 11 * – различия с показа-телем в 9:30 ч *, ** – различия с показателем в 11 ч циркадианного времени в той же группе циркадианного времени достоверны достоверны (p<0,01; U-тест) (*p<0,05; **p<0,001; U-тест) Рисунок 3.7 – Суточная динамика Рисунок 3.8 – Суточная динамика содержания норадреналина содержания норадреналина в медиальной преоптической области в медиальной преоптической области гипоталамуса самок крыс на различных гипоталамуса самок крыс стадиях эстрального цикла (объединенные данные по стадиям (M±m, n=6-7) диэструса и проэструса; M±m, n=13-14) Другой нейромедиатор, ДА, не претерпевал достоверных суточных изменений в этой гипоталамической структуре. Отмечена лишь тенденция к снижению его уровня в период с 5 ч до 11 ч ЦВ на стадии диэструса и к повышению его содержания в 9:30 ч ЦВ на стадии проэструса (рисунок 3.9). В СВ-Арк гипоталамуса также наблюдались изменения в содержании биогенных аминов, отличные от динамики их уровня в МПО гипоталамуса. Так, в этой гипоталамической структуре не было обнаружено суточных ритмов содержания НА. На обеих стадиях эстрального цикла фиксировался практически постоянный уровень нейромедиатора на протяжении всего дня (рисунок 3.10). Содержание же ДА в СВ-Арк гипоталамуса, напротив, имело выраженную суточную динамику, с повышением уровня биогенного амина в вечерние часы (рисунок 3.11). Уровень нейромедиатора составил на стадии проэструса: 7,01,3 нг/мг 118 9 12 8 10 7 8 нг/мг белка нг/мг белка 6 5 4 6 4 3 2 2 1 0 0 5 9:30 циркадианное время, ч Проэструс 11 Диэструс 5 9:30 циркадианное время, ч Проэструс 11 Диэструс Рисунок 3.9 – Суточная динамика Рисунок 3.10 – Суточная динамика содержания дофамина в медиальной содержания норадреналина преоптической области гипоталамуса в срединном возвышении с аркуатными самок крыс на различных стадиях ядрами гипоталамуса самок крыс эстрального цикла (M±m, n=5-8) на различных стадиях эстрального цикла (M±m, n=6-8) белка (5 ч ЦВ), 9,42,0 нг/мг белка (9:30 ч ЦВ) и 10,91,0 нг/мг белка (11 ч ЦВ); на стадии диэструса: 6,90,8 нг/мг белка (5 ч ЦВ), 6,41,0 нг/мг белка (9:30 ч ЦВ) и 13,21,8 нг/мг белка (11 ч ЦВ). С помощью Н-теста Крускала-Уоллиса была подтверждена зависимость содержания ДА в данной гипоталамической области от временного показателя (Н=11,910; p<0,01). Так, при объединении данных по стадиям цикла (диэструс и проэструс) содержание нейромедиатора в исследуемой области гипоталамуса составило: 6,90,7 нг/мг белка (5 ч ЦВ), 8,11,3 нг/мг белка (9:30 ч ЦВ) и 12,01,0 нг/мг белка (11 ч ЦВ) (рисунок 3.12). Можно полагать, что именно суточная динамика содержания НА в МПО и ДА в СВ-Арк гипоталамуса играет важную роль в формировании преовуляторного пика секреции ГнРГ. Суточное изменение активности норадренергической и дофаминергической нейромедиаторных систем может быть тем самым механизмом, благодаря которому создается «интервал чувствительности» гонадолиберинергических нейронов к стимулирующему циркадианному сигналу, поступающему из СХЯ гипоталамуса. Ранее был обнаружен моносинаптический путь, 119 16 14 14 12 * 8 6 ** 4 * 10 * 10 нг/мг белка нг/мг белка 12 ** 8 6 4 2 2 0 5 9:30 циркадианное время, ч Проэструс 11 0 5 Диэструс 9:30 циркадианное время, ч 11 * – различия с показателем в 5 ч циркадианного *, ** – различия с показателем в 11 ч времени в той же группе достоверны (p<0,05; циркадианного времени достоверны U-тест); ** – различие с показателем в 11 ч (*p<0,01; **p<0,001; U-тест) циркадианного времени в той же группе Рисунок 3.12 – Суточная динамика достоверно (p<0,05; U-тест) содержания дофамина в срединном Рисунок 3.11 – Суточная динамика возвышении с аркуатными ядрами содержания дофамина в срединном возвышении с аркуатными ядрами гипоталамуса самок крыс на различных гипоталамуса самок крыс (объединенные данные по стадиям диэструса и проэструса; M±m, n=12-14) стадиях эстрального цикла (M±m, n=6-8) связывающий нейроны СХЯ с гонадолиберинергическими нейронами МПО гипоталамуса [van der Beek E. M., 1996; Palm I. F. et al., 1999]. Предполагается также наличие мультисинаптического пути, связывающего СХЯ с СВ гипоталамуса, основным нейрогемальным органом, выделяющим ГнРГ в портальную кровеносную систему гипофиза [Horvath T. L., 1997]. Известно, что СХЯ гипоталамуса имеют эфферентные пути, идущие к аркуатным ядрам гипоталамуса, где располагается большоеколичество дофаминергических нейронов [Horvath T. L., 1997], а также пути, идущие к зонам продолговатого мозга, каудальная вентролатеральная часть которого содержит норадренергические нейроны, проецирующие свои волокна через вентральный пучок в МПО гипоталамуса [Бабичев В. Н., 1995; Saeb-Parsy K. et al., 2000]. Несмотря на то, что роль СХЯ гипоталамуса в протекании эстрального цикла в настоящее время ни у кого не вызывает сомнений, и за последние десятилетия накопился 120 значительный массив данных, позволяющих предположить, что суточные изменения содержания биогенных аминов в гипоталамических структурах, участвующих в регуляции репродуктивной функции, обусловлены функционированием этого циркадианного осциллятора [Wise P. M., 1994; Wise P. M. et al., 1997; Reuss S. et al., 1999; Sellix M. T., Freeman M. E., 2003], многие вопросы, связанные с молекулярной организацией этого явления у животных с сезонным и несезонным размножением, а также у человека, по-прежнему остаются невыясненными. Полученные нами ранее данные о суточной динамике содержания ДА в МПО гипоталамуса не выявили достоверных различий в уровне нейромедиатора, однако варьирующиеся тенденции его суточных изменений на стадиях диэструса и проэструса, обнаруженные в этом эксперименте, снижение его среднесуточного содержания на стадии проэструса, а также противоречивые данные литературы о роли этого катехоламина в процессе синтеза ГнРГ позволили выдвинуть предположение о том, что ДА в МПО гипоталамуса, возможно, играет роль не столько активного нейромедиатора, сколько предшественника НА в норадрененергических нейронах. В результате исследований, проведенных в нашей лаборатории, было установлено, что суточная динамика содержания НА в МПО гипоталамуса не связана с соответствующим изменением активности МАО [Разыграев А. В., 2007], поэтому можно предположить, что она опосредована либо активностью КОМТ, либо снижением активности дофамин--гидроксилазы. Для оценки участия дофамин--гидроксилазы в наблюдаемых изменениях суточной динамики содержания катехоламинов был использован коэффициент соотношения уровней НА/ДА. В МПО гипоталамуса было выявлено достоверное (U=5; p<0,05) снижение данного показателя на стадии проэструса в период с 5 ч до 11 ч ЦВ (рисунок 3.13), что вероятно, характеризует уменьшение активности дофамин--гидроксилазы, которое в свою очередь может обеспечивать резкое снижение уровня НА в вечерние часы, при этом изменения коэффициента НА/ДА, наблюдаемого на стадии проэструса, на стадии диэструса выявлено не было. Это наблюдение позволяет предположить, что изменение содержания НА в МПО гипоталамуса контролируется как сигналами, поступающими из СХЯ гипоталамуса, так и уровнем половых гормонов в крови. Можно предположить, что МПО гипоталамуса выполняет релейную функцию, передавая гонадолиберинергическим нейронам от СХЯ гипоталамуса циркадианный сигнал, который может либо ингибироваться, либо активироваться в зависимости от уровня половых гормонов в крови. Эта гипотеза подтверждается данными литературы о том, что антеровентральная перивентрикулярная зона МПО гипоталамуса богата нейронами, которые содержат рецепторы к эстрогенам [Simerly R. B. et al., 1990] и к которым направляются проекции вазопрессинергических нейронов СХЯ гипоталамуса [Kalra S. P., 1993]. 121 В другой структуре гипоталамуса, СВ-Арк, характер суточных изменений коэффициента НА/ДА сходен на стадиях диэструса и проэструса, но наиболее выражен на стадии проэструса и также снижается в интервале времени с 5 ч до 11 ч ЦВ (рисунок 3.14), что подтверждает 9 2 8 1,8 7 1,6 ** 1,4 6 1,2 5 ед. ед. * 4 * 3 1 0,8 0,6 2 0,4 1 0,2 0 0 5 9:30 циркадианное время, ч Проэструс 11 Диэструс 5 9:30 циркадианное время, ч Проэструс 11 Диэструс * – различие с показателем в 5 ч циркадианного * – различие с показателем в 11 ч времени на той же стадии эстрального цикла циркадианного времени на той же стадии (проэструс) достоверно (p<0,05; U-тест) эстрального цикла (проэструс) достоверно Рисунок 3.13 – Суточная динамика (p<0,05; U-тест); ** – различие с показателем коэффициента норадреналин/дофамин в 11 ч циркадианного времени на той же стадии в медиальной преоптической области гипоталамуса самок крыс на различных стадиях эстрального цикла (M±m, n=5-8) эстрального цикла (диэструс) достоверно (p<0,05; U-тест) Рисунок 3.14 – Суточная динамика коэффициента норадреналин/дофамин в срединном возвышении с аркуатными ядрами гипоталамуса самок крыс на различных стадиях эстрального цикла (M±m, n=6-8) активное участие ДА в регуляторных процессах на уровне СВ-Арк гипоталамуса, которое реализуется за счет вечернего повышения содержания нейромедиатора в этой структуре. Относительное постоянство уровня НА в этой области гипоталамуса в течение дня, при снижении коэффициента НА/ДА, вероятнее всего, связано с изменением активности ферментов метаболизма НА. 122 В дополнение к исследованию суточной динамики содержания биогенных аминов в структурах гипоталамуса, ответственных за синтез и секрецию ГнРГ, и влияния на нее уровня половых стероидов в крови, нами также было изучено их воздействие на среднесуточное содержание исследуемых нейромедиаторов в гипоталамусе. U-тест Манна-Уитни не выявил влияния стадии эстрального цикла на среднесуточное содержание НА в МПО гипоталамуса. Однако в СВ-Арк гипоталамуса на стадии проэструса среднесуточный уровень нейромедиатора оказался достоверно (U=109; р<0,01) выше такового на стадии диэструса: 8,20,6 нг/мг белка и 6,00,5 нг/мг белка, соответственно (таблица 3.1). Таблица 3.1 – Среднесуточное содержание норадреналина, дофамина и 5-оксииндолилуксусной кислоты в супрахиазматических ядрах, медиальной преоптической области, срединном возвышении с аркуатными ядрами и сером бугре гипоталамуса самок крыс на различных стадиях эстрального цикла (M±m, нг/мг белка; n=18-22) НА ДА 5-ОИУК Структуры диэструс проэструс диэструс проэструс диэструс проэструс СХЯ 5,4±0,6 4,7±0,5 1,1±0,5 1,2±0,4 6,1±0,4 7,7±0,5* МПО 9,3±0,9 8,7±0,6 5,3±0,8 3,3±0,5* 9,3±0,9 9,1±1,1 СВ-Арк 6,0±0,5 8,2±0,6** 8,7±1,0 9,2±1,0 7,7±0,8 7,6±0,6 СБ 3,8±0,3 3,4±0,2 1,4±0,2 2,0±0,4 12,0±0,7 12,7±0,7 Примечание: * – различия с показателем на стадии диэструса в той же гипоталамической структуре достоверны (*p<0,05; **p<0,01; U-тест). Подобным же образом (U-тест Манна-Уитни) была подтверждена независимость от половой цикличности изменения среднесуточного содержания ДА в СВ-Арк гипоталамуса. Однако в МПО гипоталамуса содержание нейромедиатора подчинялось зависимости иного рода и определялось стадией эстрального цикла экспериментальных животных. Среднесуточное содержание этого моноамина на стадии проэструса было достоверно (U=109; р<0,05) ниже его среднесуточного уровня на стадии диэструса: 3,30,5 нг/мг белка и 5,40,8 нг/мг белка, соответственно (таблица 3.1). 123 В СХЯ гипоталамуса среднесуточное содержание НА и ДА не претерпевало статистически достоверных изменений в зависимости от стадии эстрального цикла. Интересным представлялось оценить, наряду со среднесуточным содержанием НА и ДА, и среднесуточный уровень 5-ОИУК, как основного метаболита 5-ОТ, в СХЯ, МПО и СВ-Арк гипоталамуса на различных стадиях эстрального цикла. Так, было показано, что на стадии проэструса среднесуточное содержание метаболита 5-ОТ – 5-ОИУК, в СХЯ гипоталамуса было достоверно (U=101; р<0,05) выше его среднесуточного содержания в той же гипоталамической структуре на стадии диэструса: 7,70,5 нг/мг белка и 6,10,4 нг/мг белка, соответственно (таблица 3.1). Кроме того, для сравнения полученных данных также было проанализировано влияние меняющегося фона половых стероидов на среднесуточное содержание вышеупомянутых нейромедиаторов в структуре гипоталамуса, не связанной с регуляцией репродуктивной функции, а именно в СБ. Обнаружено, что в СХЯ, МПО и СБ гипоталамуса среднесуточное содержание НА на обеих стадиях эстрального цикла не различается или наблюдается небольшая тенденция к снижению среднесуточного содержания нейромедиатора на стадии проэструса; в СВ-Арк гипоталамуса же отмечается совершенно отличная динамика, с достоверным (U=109; р<0,01) повышением среднесуточного содержания этого нейромедиатора на предовуляторной стадии (рисунок 3.15). Это указывает на зависимость норадренергической системы от изменяющегося 12 10 нг/мг белка * 8 6 4 2 0 СХЯ МПО СВ-Арк гипоталамические структуры Диэструс СБ Проэструс * – различие с показателем на стадии диэструса в той же гипоталамической структуре достоверно (p<0,01; U-тест) Рисунок 3.15 – Среднесуточное содержание норадреналина в структурах гипоталамуса на различных стадиях эстрального цикла (M±m, n=18-22) 124 фона половых гормонов в крови и возможной вовлеченности ее в механизмы реализации овариального сигнала на уровне секреции ГнРГ. Также было обнаружено, что среднесуточное содержание НА в СВ-Арк гипоталамуса на стадии проэструса становится приблизительно равным его среднесуточному содержанию в МПО гипоталамуса, где оно значительно превосходит среднесуточное содержание нейромедиатора в СХЯ и особенно в СБ гипоталамуса. Известно, что дофаминергические нейроны аркуатной области направляют свои аксоны в область наружного слоя СВ гипоталамуса, оканчиваются аксо-аксональными синапсами на аксонах гонадолиберинергических нейронов и одновременно принимают на себя норадренергические терминали. В одном из исследований было показано, что реакция гонадолиберинергических нейронов в аркуатных ядрах гипоталамуса на введение НА определяется стадией эстрального цикла, то есть зависит от уровня половых гормонов в крови [Herbison A. E., 1997]. Отмечено, что при повышенном фоне половых гормонов в крови, например, в первой половине дня проэструса, действие НА на активность гонадолиберинергических нейронов аркуатных ядер гипоталамуса преимущественно тормозное, а по мере снижения уровня половых стероидов наблюдается активация большинства нейронов [Бабичев В. Н., 1995]. Отдельные исследователи также высказывали предположение, что изменение среднесуточного содержания НА в СВ гипоталамуса обусловлено исключительно повышением уровня половых гормонов, ими даже были обнаружены суточные изменения содержания этого нейромедиатора на стадии проэструса, которые на стадии диэструса отсутствовали [Rance N. et al., 1981; MohanКumar P. S., ThyagaRajan S., Quadri S. K., 1995]. При анализе данных по среднесуточному содержанию в этих гипоталамических структурах другого нейромедиатора, ДА, был выявлен характер изменений, отличный от такового в случае НА (рисунок 3.16). Так, при достаточно высоком среднесуточном содержании этого нейромедиатора в СВ-Арк гипоталамуса по сравнению с другими гипоталамическими структурами, разницы в его уровне на обеих стадиях эстрального цикла выявлено не было, а среднесуточное содержание того же нейромедиатора в МПО гипоталамуса зависело от уровня половых стероидов в крови и было достоверно (U=109; р<0,05) ниже на стадии проэструса. Согласно данным литературы, в результате изучения влияния введения ДА в МПО и аркуатные ядра гипоталамуса был сделан вывод о том, что характер реакции нейронов аркуатных ядер на введение этого нейромедиатора был аналогичен ответу нейронов МПО гипоталамуса на введение НА. В этих же исследованиях не было выявлено характерного 125 12 10 8 а к л е б6 г м /г н4 * 2 0 СХЯ МПО СВ-Арк СБ гипоталамические структуры Диэструс Проэструс * – различие с показателем на стадии диэструса в той же гипоталамической структуре достоверно (p<0,05; U-тест) Рисунок 3.16 – Среднесуточное содержание дофамина в структурах гипоталамуса на различных стадиях эстрального цикла (M±m, n=18-22) для СВ гипоталамуса действия ДА на функциональную активность нейронов МПО гипоталамуса [Бабичев В. Н., 1995; Terasawa Е., 2001]. Вышеупомянутые данные не противоречат нашим представлениям о том, что в процессах активации норадренергических и дофаминергических систем в МПО и СВ-Арк гипоталамуса лежат различные механизмы, зависящие от разных факторов, участвующих в процессе реализации репродуктивной функции. Таким образом, можно предположить, что изменение среднесуточного содержания НА в СВ-Арк и ДА в МПО гипоталамуса, которое, как было показано в настоящем исследовании, зависит от уровня половых гормонов в крови, связано с реализацией овариального сигнала, необходимого для инициации процесса формирования преовуляторного пика секреции ГнРГ. Вместе с тем, повышенный фон половых стероидов в крови не может сам по себе инициировать процесс формирования пика гиперсекреции ГнРГ в день проэструса, и непосредственным триггером этого процесса является сигнал нейрональной природы, ежедневно поступающий от СХЯ гипоталамуса [Palm I. F. et al., 2001]. Это подтверждается наличием «критического периода», времени во второй половине дня проэструса, в продолжение которого обработка животных барбитуратами приводила в классических экспериментах Дж. Эверетта и Ч. Сойера к блокаде пика секреции ЛГ, задержке овуляции и к смещению этих процессов ровно на 24 ч 126 [Everett J. W., Sawyer C. H., 1950]. Дальнейшие исследования подтвердили вовлеченность циркадианной системы организма в формирование эстральных циклов у самок крыс. Известно, что СХЯ гипоталамуса не содержат рецепторов эстрогенов, однако было показано, что метаболическая активность этих ядер может изменяться в зависимости от уровня половых стероидов в крови [Simerly R. B. et al., 1990]. Поэтому воздействие стероидов на нейроны СХЯ гипоталамуса осуществляется, вероятнее всего, опосредованно, через те нейромедиаторные системы, которые содержат рецепторы к эстрогенам. В дополнение к вышесказанному нами было отмечено, что в МПО, СВ-Арк и СБ гипоталамуса среднесуточное содержание 5-ОИУК не зависит от фона половых стероидов в крови, тогда как в СХЯ гипоталамуса отмечается иная динамика изменений, с достоверным (U=101; р<0,05) повышением среднесуточного содержания этого метаболита на стадии, предшествующей овуляции (рисунок 3.17). На основании данных об изменении среднесуточного содержания 16 14 нг/мг белка 12 10 8 * 6 4 2 0 СХЯ МПО СВ-Арк СБ гипоталамические структуры Диэструс Проэструс * – различие с показателем на стадии диэструса в той же гипоталамической структуре достоверно (p<0,05; U-тест) Рисунок 3.17 – Среднесуточное содержание 5-оксииндолилуксусной кислоты в структурах гипоталамуса на различных стадиях эстрального цикла (M±m, n=18-22) метаболита 5-ОТ 5-ОИУК в гипоталамических структурах в зависимости от стадии эстрального цикла, можно с известной степенью достоверности судить о повышении активности серотонинергической системы в СХЯ гипоталамуса при изменении уровня половых гормонов в крови. 127 В СХЯ гипоталамуса отмечена исключительно высокая плотность серотонинергических окончаний, превосходящая таковую в других отделах мозга [Morin L. P., 2013]. Предполагается, что действие 5-ОТ на уровне СХЯ гипоталамуса выявляется только при высоком уровне половых стероидов в крови, что имеет место в преовуляторный период [Lenahan S. E., Siebel H. R., Johnson J. H., 1986; Deurveilher S., Semba K., 2005] и подтверждается полученными нами результатами. Согласно данным литературы, у самцов крыс в СХЯ гипоталамуса наблюдаются суточные ритмы содержания 5-ОТ, с повышением уровня нейромедиатора в дневные часы и снижением этого показателя в темное время суток [Cagampang F. R., Okamura H., Inouye S., 1994]. В предыдущих исследованиях, проведенных в нашей лаборатории, были обнаружены суточные изменения содержания 5-ОИУК с достоверно более низким содержанием этого метаболита в дневные часы по сравнению с ночными, то есть наблюдалась отрицательная корреляция между уровнем метаболита и содержанием самого нейромедиатора. Так как в данном эксперименте уровень нейромедиаторов фиксировался только в светлое время суток и во всех трех исследованных временных точках отмечался постоянный уровень 5-ОИУК, низкое содержание этого метаболита в СХЯ гипоталамуса по сравнению с другими гипоталамическими структурами может косвенно указывать на повышенный уровень в этой структуре самого 5-ОТ. Таким образом, полученные нами данные свидетельствуют об избирательном характере изменений среднесуточного содержания исследуемых биогенных аминов в различных структурах мозга, участвующих в регуляции овариальных циклов, в зависимости от стадии цикла. На стадии проэструса, по сравнению со стадией диэструса, было выявлено снижение уровня ДА в МПО гипоталамуса и повышение уровня НА в СВ-Арк и 5-ОИУК в СХЯ гипоталамуса. Однако различий в среднесуточном содержании НА в МПО и ДА в СВ-Арк гипоталамуса на стадиях диэструса и проэструса нами обнаружено не было. Дополнительно нами было обнаружено неравномерное распределение среднесуточного содержания исследуемых биогенных аминов (объединенные данные по стадиям диэструса и проэструса) в самих микроструктурах гипоталамуса. Наши результаты полностью согласуются с данными некоторых исследователей [Бабичев В. Н., 1995], из которых следует, что максимальное среднесуточное содержание НА отмечается именно в МПО гипоталамуса, а ДА – в СВ гипоталамуса. Высокий уровень этих нейромедиаторов в структурах, ответственных за синтез и секрецию ГнРГ, подтверждает представление о вовлеченности этих нейромедиаторов в процесс регуляции овариальных циклов. Несмотря на то, что для большинства процессов в организме млекопитающих характерно наличие суточного периодизма, не для всех из них была доказана зависимость 128 от циркадианного осциллятора. Имеются убедительные доказательства того, что СХЯ гипоталамуса осуществляют контроль над продукцией мелатонина пинеальной железой и кортикостерона надпочечниками [van Esseveldt K. E., Lehman M. N., Boer G. J., 2000], а также участвуют в регуляции эстральных циклов самок крыс [van der Beek E. M., 1996]. В механизме передачи ежедневного ритмического сигнала, генерируемого в СХЯ гипоталамуса, к другим гипоталамическим структурам, ответственным за регуляцию репродуктивной функции, важная роль принадлежит суточным ритмам секреции нейромедиаторов нейронами СХЯ гипоталамуса. На данный момент самым объективным критерием, подтверждающим, что те или иные ритмы имеют циркадианную природу, является сохранение их в условиях световой депривации. Так, установлено, что суточные изменения содержания 5-ОТ [Cagampang F. R., Inouye S. T., 1994] и вазопрессина [Inouye S. T., 1996] в СХЯ гипоталамуса, а также активность опиоидных систем в медиобазальном гипоталамусе [Jamali A. K., Tramu G., 1997] зависят от работы этого циркадианного осциллятора. Однако в настоящее время остается неисследованным вопрос о наличии контактов между вазопрессинергическими нейронами СХЯ гипоталамуса, которые непосредственно не взаимодействуют с телами гонадолиберинергическимих нейронов, и моноаминергическими нейронами МПО и СВ гипоталамуса. Поэтому нами было проведено отдельное исследование, целью которого явилось выяснение вопроса о том, какие из обнаруженных суточных ритмов содержания биогенных аминов, участвующих в регуляции репродуктивной функции самок крыс и сохраняющихся при изменяющемся фоне половых гормонов в крови, зависят от работы центрального осциллятора циркадианных ритмов. 3.3. Циркадианный характер динамики содержания биогенных аминов в медиальной преоптической области и срединном возвышении с аркуатными ядрами гипоталамуса При исследовании изменения в течение суток содержания биогенных аминов в структурах гипоталамуса, ответственных за синтез и секрецию ГнРГ, были получены данные о том, что наблюдаемая у самок крыс на стадии диэструса суточная динамика содержания НА в МПО гипоталамуса сохраняется в условиях световой депривации (таблица 3.2, рисунок 3.18). Отмечено, что содержание этого нейромедиатора достоверно (U=21; p<0,05) снижается в период с 5 ч до 11 ч ЦВ, сохраняясь на низком уровне до 18 ч ЦВ и, возможно, даже до более позднего времени, а уже к 23 ч ЦВ наблюдается резкий подъем содержания нейромедиатора 129 до уровня, приблизительно равного тому, который регистрировался в утренней временной точке. Подобный характер изменений свидетельствует о том, что суточный ритм содержания НА в МПО гипоталамуса носит циркадианный характер. Н-тест Крускала-Уоллиса подтвердил зависимость содержания нейромедиатора в данной гипоталамической области от временного показателя (Н=10,023; p<0,05). Между тем, суточный ритм содержания ДА в СВ-Арк гипоталамуса в условиях световой депривации нами обнаружен не был (таблица 3.2, рисунок 3.19), что позволяет предположить отличие механизмов гипоталамической регуляции при участии этих нейромедиаторов в зависимости от уровня освещенности. Таблица 3.2 – Суточная динамика содержания норадреналина в медиальной преоптической области и дофамина в срединном возвышении с аркуатными ядрами гипоталамуса самок крыс на стадии диэструса в условиях световой депривации (M±m, нг/мг белка; n=9-11) циркадианное время, ч Показатель 5 11 18 23 НА в МПО 27,6±1,5* 23,1±1,4 21,3±1,8 28,1±1,6* ДА в СВ-Арк 17,0±2,8 15,2±2,5 13,0±2,1 16,6±3,2 Примечание: * – различие с соответствующим показателем в 11 ч и 18 ч циркадианного времени достоверно (p<0,05; U-тест). Некоторые исследователи связывают суточные ритмы содержания биогенных аминов в гипоталамических структурах, ответственных за регуляцию эстральных циклов, с работой центрального осциллятора циркадианных ритмов [Wise P. M., 1994; Бабичев В. Н., 1995; Reuss S. et al., 1999]. Это предположение подтверждается, прежде всего, результатами изучения нейрональных связей между СХЯ гипоталамуса и исследуемыми областями мозга. Ранее были обнаружены тесные нейрональные связи между СХЯ и МПО гипоталамуса, доказано также наличие синаптических контактов между нейронами СХЯ гипоталамуса и дофаминергическими нейронами, расположенными в МПО гипоталамуса [Horvath T. L., 1997]. Можно предположить, что СХЯ гипоталамуса вызывают суточные изменения синтеза НА в продолговатом мозге и 5-ОТ в ядрах шва, содержащих нейроны, аксоны которых иннервируют гипоталамус. Действительно, в этих отделах мозга самцов крыс были обнаружены суточные ритмы содержания НА и 5-ОТ. Однако, поскольку аксоны норадренергических 130 32 30 25 * * 28 20 нг/мг белка нг/мг белка 26 24 22 15 10 20 18 5 16 14 0 5 11 18 23 циркадианное время, ч 5 11 18 23 циркадианное время, ч * – различие с показателем в 11 ч и 18 ч Рисунок 3.19 – Суточная динамика циркадианного времени достоверно содержания дофамина в срединном (p<0,05; U-тест) Рисунок 3.18 – Суточная динамика содержания норадреналина в медиальной преоптической области гипоталамуса самок крыс на стадии возвышении с аркуатными ядрами гипоталамуса самок крыс на стадии диэструса в условиях световой депривации (M±m, n=9-11) диэструса в условиях световой депривации (M±m, n=9-10) нейронов в продолговатом мозге и серотонинергических нейронов в ядрах шва иннервируют, помимо гипоталамуса, многие отделы ЦНС, специфическая функция этих изменений в отношении регуляции овариальных циклов остается под вопросом. Вместе с тем наличие в самих СХЯ гипоталамуса самцов крыс циркадианных ритмов содержания НА и 5-ОТ указывает на то, что эти изменения отражают воздействие СХЯ гипоталамуса именно на те области мозга, в которых располагаются тела нейронов, иннервирующих гипоталамус по механизму обратной связи [Cagampang F. R., Okamura H., Inouye S., 1994; Morin L. P., 2013]. Даже если суточные изменения содержания биогенных аминов и не зависят напрямую от нейрональных связей между СХЯ и моноаминергическими системами в МПО гипоталамуса, они могут быть обусловлены воздействием СХЯ на опиоидные системы в медиобазальном гипоталамусе, для которых доказана зависимость суточных изменений от центрального осциллятора циркадианных ритмов [Jamali K. A., Tramu G., 1999]. 131 Зависимость суточных ритмов содержания биогенных аминов в гипоталамических областях, ответственных за регуляцию эстральных циклов, от работы циркадианного осциллятора подтверждается также и геронтологическими исследованиями [Wise P. M., 1994]. Было показано, что с возрастом у самок крыс исчезают суточные ритмы активности норадренергической и серотонинергической систем, регистрируемые в различных ядрах гипоталамуса молодых животных. Обнаруженные нарушения не являлись следствием возрастных изменений в самих исследованных нейромедиаторных системах, так как среднесуточный уровень их активности оставался прежним. Исчезновение суточных ритмов не являлось также и следствием изменения стероидного фона, поскольку уровень половых гормонов в крови таких крыс не претерпевал существенных изменений. Поэтому было высказано предположение о том, что снижение преовуляторного пика секреции ЛГ происходит вследствие старения циркадианного осциллятора, запускающего этот процесс [Wise P. M. et al., 1997]. Параллельно с исчезновением суточных ритмов активности моноаминергических систем, при старении происходят сходные нарушения циркадианных ритмов активности опиоидной системы, однако пересадка старым крысам эмбриональной ткани, содержащей СХЯ гипоталамуса, приводит к их восстановлению [Cai А. et al., 1997]. У животных, которые были помещены в условия световой депривации, эстральные циклы не нарушаются, но становятся свободнотекущими, синхронизируясь с фазой эндогенного циркадианного осциллятора [Morin L. P. et al., 1977]. Наличие эстральных циклов в этих условиях подразумевает сохранность всех нейрональных механизмов, необходимых для формирования проэстрального пика секреции гонадотропных гормонов, то есть механизмов, к которым относятся и суточные изменения содержания биогенных аминов в гипоталамических структурах, ответственных за синтез и секрецию ГнРГ. К сожалению, пока не проведено исследования изменений содержания биогенных аминов в гипоталамусе интактных самок крыс на различных стадиях эстрального цикла, а также овариэктомированных животных с введением им эстрадиола или же без него, в условиях постоянного освещения. Поэтому зависимость этих изменений от работы центрального осциллятора циркадианных ритмов можно лишь предполагать с различной степенью достоверности. Вместе с тем было отмечено, что постоянное освещение вызывает через достаточно короткое время нарушения эстральных циклов вплоть до наступления ановуляторного состояния [McCormack C. E., Sridaran R., 1978]. Эти нарушения рядом ученых связываются с нарушением ритмов синтеза гормона пинеальной железы мелатонина [Анисимов В. Н., 1997]. Участие мелатонина в регуляции эстральных циклов подтверждается и геронтологическими исследованиями, в которых было показано, что хроническое введение этого гормона старым 132 крысам, у которых нарушается ритм его синтеза, отодвигало у них сроки завершения половой цикличности [Trentini G. P. et al., 1992]. Хроническое введение мелатонина старым самкам крыс, характеризующимся иррегулярной продолжительностью эстрального цикла, вызывало значительное повышение преовуляторных пиков секреции ЛГ и ФСГ [Diaz E. et al., 1999]. Эти данные указывают на значительную роль гормона пинеальной железы в гипоталамогипофизарной регуляции овариальных циклов, которая, скорее всего, заключается в точной синхронизации преовуляторного пика секреции ГнРГ и гонадотропных гормонов с 24-часовым околосуточным циклом [Walker R. F., 1982; Rasmussen D. D., 1993; Chiba A., Akema T., Toyoda J. 1994]. Синхронизирующий эффект мелатонина, скорее всего, опосредован его воздействием на СХЯ гипоталамуса и через эти структуры на нейромедиаторные системы, участвующие в регуляции преовуляторной секреции ГнРГ. Отмечено, что мелатонин оказывает значительный эффект на активность моноаминергических систем гипоталамуса, причем как in vivo, так и in vitro [Zisapel N., Egozi Y., Laudon M., 1985; Rasmussen D. D., 1993; Alexiuk N. A, Vriend J. P., 1993; Míguez J. M. et al., 1996]. Поэтому не исключено, что обнаруженные нами суточные изменения содержания биогенных аминов в МПО и СВ-Арк гипоталамуса самок крыс находятся в зависимости от суточных ритмов содержания мелатонина в пинеальной железе. Обнаруженная нами тенденция к снижению содержания ДА в СВ-Арк гипоталамуса к 18 ч ЦВ, повторяющая характер изменений содержания НА в МПО гипоталамуса, подтверждается более поздними исследованиями американских ученых, в которых было показано, что в СВ гипоталамуса овариэктомированных самок крыс коэффициент 3,4-ДОФУК/ДА, служащий показателем активности дофаминергических нейронов, обладает циркадианной природой, то есть характеризуется собственным 24-часовым околосуточным ритмом, который сохраняется в условиях световой депривации [Sellix M. T., Freeman M. E., 2003], что должно косвенно подтверждать циркадианный характер изменений содержания самого ДА в данной гипоталамической структуре. Вышеупомянутые исследования проводились в течение суток с четырехчасовыми интервалами, при этом максимальные значения данного показателя в условиях стандартного фиксированного освещения наблюдались в период с 11 ч до 13 ч ЦВ, а минимальные – в период с 14 ч до 22 ч ЦВ. При помещении экспериментальных животных в условия световой депривации происходил сдвиг фазы ритма, наблюдавшегося в условиях стандартного фиксированного освещения, при этом максимальные значения данного показателя наблюдались в период с 17 ч до 19 ч ЦВ, а минимальные – в период с 2 ч до 6 ч ЦВ и с 11 ч до 13 ч ЦВ. Дальнейшие исследования показали, что введение в СХЯ гипоталамуса овариэктомированных самок крыс антисывороточной смеси дезоксиолигонуклеотидов, блокирующей экспрессию циркадианных генов сlock, рer1 и рer2, 133 приводило в условиях стандартного фиксированного освещения к полному исчезновению суточного ритма коэффициента 3,4-ДОФУК/ДА в СВ гипоталамуса в период с 12 ч до 17 ч ЦВ, что дало дополнительное подтверждение зависимости активности дофаминергических нейронов СВ гипоталамуса от активности центрального осциллятора цирадианных ритмов [Poletini M. O. et al., 2010]. Однако авторы этих исследований, к сожалению, не приводят данных о характере ритма содержания самого ДА в СВ гипоталамуса как в условиях стандартного фиксированного освещения, так и в условиях световой депривации. Полученные нами данные, не подтверждающие циркадианного характера суточных изменений содержания этого нейромедиатора в данной структуре гипоталамуса, не противоречат результатам вышеупомянутых, более поздних, исследований американских авторов и могут быть объяснены как недостаточные для установления факта циркадианности выявленных нами изменений. Среди возможных причин отсутствия в нашем исследовании доказательств циркадианного характера динамики содержания ДА в СВ-Арк гипоталамуса можно назвать неисключенное влияние половых стероидов и использование достаточно ограниченного количества временных точек (данное исследование проводились на стадии диэструса в период с 5 ч до 23 ч ЦВ с пяти-, шести- и семичасовым интервалами), а также неполное совпадение объектов исследования (группа американских ученых использовала СВ без прилежащих к нему аркуатных ядер гипоталамуса). Таким образом, на основании результатов собственных исследований и данных литературы можно заключить, что суточные изменения содержания НА в МПО гипоталамуса обладают циркадианной природой и регулируются СХЯ гипоталамуса. 3.4. Влияние ксенобиотика 1,2-диметилгидразина на среднесуточное содержание гонадолиберина в медиальной преоптической области и срединном возвышении с аркуатными ядрами гипоталамуса Исследование влияния острого воздействия ДМГ, известного своими канцерогенными свойствами [Анисимов В. Н., Забежинский М. А., Попович И. Г., 2000], на среднесуточное содержание ГнРГ в исследуемых гипоталамических областях показало, что однократное введение ксенобиотика накануне дня проэструса оказывало значительный ингибирующий эффект на среднесуточное содержание нейрогормона в СВ-Арк гипоталамуса (U=37; p<0,01). Так, среднесуточный уровень ГнРГ в контрольной и опытной группе составил: 47,164,48 нг/мг белка и 27,862,48 нг/мг белка, соответственно (рисунок 3.20). 134 6 0 5 0 4 0 а к л е б 3 0 г /м г н * 2 0 1 0 0 ф и з . р -р ф и з . р -р Д М Г + * – различие достоверно (p<0,01; U-тест) Рисунок 3.20 – Влияние однократного введения 1,2-диметилгидразина на среднесуточное содержание гонадолиберина в срединном возвышении с аркуатными ядрами гипоталамуса самок крыс на стадии проэструса на фоне введения физиологического раствора (M±m, n=15) Вместе с тем однократное введение ДМГ оказывало сходное влияние и на среднесуточный уровень ГнРГ в МПО гипоталамуса, однако различие между опытной (0,410,04 нг/мг белка) и контрольной (0,540,05 нг/мг белка) группами отмечалось лишь на уровне тенденции. Полученные данные свидетельствуют о токсическом действии ДМГ, которое выражается в снижении под влиянием ксенобиотика среднесуточного содержания ГнРГ в обеих гипоталамических структурах, ответственных за синтез и секрецию нейрогормона, при этом наиболее выраженный эффект нейротоксиканта наблюдался именно в структуре, отвечающей за секрецию ГнРГ. Учитывая тот факт, что гипоталамус является одной из мишеней воздействия ДМГ [Анисимов В. Н. и соавт., 1976; Лихачев А. Я., 1980], можно предположить, что нейротоксическое действие ксенобиотика на гипоталамо-гипофизарное звено регуляции репродуктивной функции может осуществляться посредством его влияния на нейромедиаторные системы гипоталамуса. Как показали наши дальнейшие исследования (см. подраздел 3.5), нейротоксический эффект ДМГ, который по-прежнему еще остается малоизученным, проявлялся также и в снижении среднесуточного содержания НА в МПО гипоталамуса при сохранении в данной структуре прежнего среднесуточного уровня его предшественника, ДА, и в то же самое время в увеличении среднесуточного содержания ДА в СВ-Арк гипоталамуса при неизменном уровне 135 в нем НА. Данные наблюдения подтверждают предположение о том, что ДМГ нарушает процессы синтеза и секреции ГнРГ, которые находятся под стимулирующим (НА) и ингибирующим (ДА) контролем нейромедиаторов в соответствующих структурах гипоталамуса. Снижение среднесуточного содержания НА в МПО гипоталамуса под влиянием ксенобиотика, по-видимому, и объясняет наблюдаемую нами тенденцию к снижению среднесуточного уровня нейрогормона в этой структуре, тогда как индуцированное ДМГ достоверное снижение среднесуточного уровня ГнРГ в СВ-Арк, скорее всего, является результатом ослабления как процесса синтеза нейрогормона, так и процесса его секреции, а также действия иных, не изученных в рамках данного исследования, факторов, причем снижение синтеза ГнРГ, по-видимому, является определяющим в этом процессе. Наблюдавшееся нами снижение среднесуточного содержания ГнРГ в обеих гипоталамических структурах, особенно в СВ-Арк, а также разнонаправленные изменения в этих структурах среднесуточного содержания исследуемых нейромедиаторов после однократного введения ДМГ ставит вопрос о необходимости более подробного изучения реакции гипоталамо-гипофизарного звена регуляции репродуктивной функции на негативные внешние факторы. Результаты данного исследования приведены ниже. 3.5. Влияние ксенобиотиков 1,2-диметилгидразина и толуола на суточную динамику и среднесуточное содержание биогенных аминов в медиальной преоптической области и срединном возвышении с аркуатными ядрами гипоталамуса Как показали наши последующие эксперименты, выбранные для настоящего исследования ксенобиотики оказывали значительное влияние на суточную динамику и среднесуточное содержание биогенных аминов в структурах гипоталамуса, ответственных за синтез и секрецию ГнРГ. Так, однократное введение экспериментальным животным ДМГ на фоне введения физиологического раствора приводило к нарушению на стадии проэструса нормальных суточных изменений содержания НА в МПО гипоталамуса, причем уровень нейромедиатора сохранялся практически постоянным во всех трех исследованных временных точках (таблица 3.3). Установлено, что при введении ксенобиотика содержание нейромедиатора в утреннее и вечернее время было сходным с его содержанием в соответствующих временных точках в контроле, однако присущего контрольной группе достоверного снижения содержания нейромедиатора во временном интервале с 9:30 ч до 11 ч ЦВ не наблюдалось в группе, 136 получившей однократную инъекцию ДМГ. При введении ксенобиотика также отмечалось исчезновение нормальных суточных изменений содержания ДА в СВ-Арк гипоталамуса, наблюдаемого у контрольных животных (таблица 3.3). Таблица 3.3 – Содержание норадреналина в медиальной преоптической области и дофамина в срединном возвышении с аркуатными ялрами гипоталамуса самок крыс на стадии проэструса после однократного введения 1,2-диметилгидразина на фоне введения физиологического раствора (M±m, нг/мг белка; n=9-16) Циркадианное НА в МПО ДА в СВ-Арк время, ч физ. р-р физ. р-р + ДМГ физ. р-р физ. р-р + ДМГ 5 20,3±1,4 18,7±1,2 5,2±0,4 13,8±1,1 9:30 24,3±1,5 18,4±2,1 8,4±0,8** 13,2±1,5 11 20,9±0,9 20,3±1,6 8,2±1,1* 14,0±1,6 Примечание: – различие с показателем в 11 ч циркадианного времени в той же группе достоверно (p<0,05; U-тест); *, ** – различия с показателем в 5 ч циркадианного времени в той же группе достоверны (*p<0,05; **p<0,01; U-тест). В ходе дальнейшего исследования было обнаружено, что введение ДМГ в утренние часы (3 ч ЦВ) на фоне введения физиологического раствора достоверно (U=217; р<0,01) снижало среднесуточный уровень НА в МПО гипоталамуса на 12,1% относительно группы животных, получавших только физиологический раствор (19,10,9 нг/мг белка и 21,80,7 нг/мг белка, соответственно) (рисунок 3.21). Анализ данных о среднесуточном содержании ДА в СВ-Арк гипоталамуса показал, что его уровень значительно, на 86,7%, возрастал при введении ксенобиотика на фоне введения физиологического раствора (13,70,8 нг/мг белка и 7,30,6 нг/мг белка, соответственно). Сочетанное введение ДМГ и физиологического раствора не приводило к достоверному изменению среднесуточного содержания НА в СВ-Арк и ДА в МПО гипоталамуса (рисунок 3.21). Полученные данные подтверждают имеющиеся в литературе сведения о том, что гипоталамус является одной из мишеней воздействия ДМГ. В то время как избирательное канцерогенное воздействие ДМГ на энтероциты толстого кишечника является хорошо изученным феноменом [Анисимов В. Н., Забежинский М. А., Попович И. Г., 2000], нейротоксический эффект данного соединения изучен еще достаточно слабо. Ранее было 137 30 25 а к л е б г м /г н * 20 ** 15 10 5 0 НА в МПО НА в СВ-Арк физ. р-р ДА в М ПО ДА в СВ-Арк физ. р-р + ДМГ *, ** – различия с соответствующим показателем в группе животных, получавших только инъекции физиологического раствора, достоверны (*p<0,01; **p<0,001; U-тест) Рисунок 3.21 – Влияние однократного введения 1,2-диметилгидразина на среднесуточное содержание норадреналина и дофамина в медиальной преоптической области и срединном возвышении с аркуатными ядрами гипоталамуса самок крыс на фоне введения физиологического раствора (M±m, n=31-40) установлено, что уже спустя 3 ч после введения [3Н]-ДМГ самцам крыс в их гипоталамусе и гипофизе наблюдался высокий уровень удельной радиоактивности, который превосходил значения этого показателя в коре больших полушарий и стволе мозга [Анисимов В. Н. и соавт., 1976]. Более того, удельная радиоактивность ткани гипоталамуса и гипофиза была выше, чем таковая печени, основного органа, который метаболизирует ксенобиотик [Лихачев А. Я., 1980]. Воздействие ДМГ на гипоталамус и гипофиз определенно затрагивает механизмы нейроэндокринной регуляции репродуктивной функции, так как через неделю после однократного введения ксенобиотика самцам крыс наблюдалось значительное снижение содержания ФСГ в гипофизе [Анисимов В. Н. и соавт., 1976]. Воздействие ДМГ на гипоталамо-гипофизарное звено регуляции репродуктивной функции может осуществляться посредством его влияния на нейромедиаторные системы гипоталамуса. Ранее было установлено, что через сутки после однократного введения ДМГ наблюдается снижение среднесуточного содержания НА и ДА в целом гипоталамусе самцов крыс [Анисимов В. Н. и соавт., 1976а]. Предполагалось, что ксенобиотик способен ингибировать активность пиридоксальзависимых ферментов синтеза катехоламинов, 138 что характерно и для других представителей семейства гидразинов [Moloney S. J., Prough R. A., 1983]. В нашем эксперименте через сутки после введения ДМГ также было зафиксировано снижение содержания НА в МПО гипоталамуса по сравнению с контрольной группой животных при сохранении прежнего уровня его предшественника, ДА. Вместе с тем уровень НА, измеренный через сутки после введения ксенобиотика в другой гипоталамической структуре, в СВ-Арк, как показывают наши эксперименты, не отличался от такового в контрольной группе, однако было обнаружено существенное увеличение содержания предшественника данного нейромедиатора. Такое различие в эффекте введения ДМГ не может быть объяснено только ингибированием через определенное время процессов биосинтеза ДА и НА в исследованных структурах гипоталамуса, как это представлялось ранее. Скорее, можно предположить воздействие ксенобиотика на механизмы, обеспечивающие обратный захват и (или) процессы деградации исследуемых нейромедиаторов (опосредуемые соответствующим изменением активности МАО и КОМТ), а также суточные ритмы содержания этих нейромедиаторов (см. подраздел 3.2) и суточные изменения чувствительности организма в целом и гипоталамуса в частности. Нельзя исключить и разнонаправленного действия ДМГ на ферментные системы гипоталамуса: снижение активности дофамин--гидроксилазы в МПО гипоталамуса (и, по-видимому, также в СВ-Арк) может в то же самое время сопровождаться компенсаторным повышением активности ДОФА-декарбоксилазы в СВ-Арк гипоталамуса, где исследуемые нейромедиаторы играют различную функциональную роль. Однако тот факт, что различие в уровне НА между группой животных, получивших инъекцию ДМГ на фоне физиологического раствора, и группой животных, не получивших ее, обусловлено только разницей в содержании нейромедиатора в 9:30 ч ЦВ, позволяет предположить, что в данном случае ксенобиотик не оказывает непосредственного влияния на активность дофамин--гидроксилазы, а изменяет суточную активность различных взаимно влияющих друг на друга нейромедиаторных систем гипоталамуса, совокупно участвующих в осуществлении циркадианного сигнала запуска преовуляторного пика секреции ГнРГ в достаточно узких границах критического для этого физиологического явления временного интервала. Вопрос об особенностях воздействия данного ксенобиотика на вышеупомянутые ферменты метаболизма исследуемых нейромедиаторов в гипоталамических структурах, участвующих в регуляции овариальных циклов, несмотря на потенциальную ценность таких данных, к сожалению, не мог быть изучен в рамках данного исследования. Как уже было показано выше, инъекции ДМГ на фоне введения физиологического раствора вызывали достоверное снижение среднесуточного содержания НА в МПО гипоталамуса и выраженное повышение среднесуточного уровня ДА в другой 139 гипоталамической структуре – в СВ-Арк. В литературе имеются данные о том, что однократное введение крысам другого нейротоксиканта, диметилтиокарбоната, приводило к снижению среднесуточного уровня НА и значительному повышению среднесуточного содержания ДА в переднем и заднем гипоталамусе [Goldman J. M. et al., 2008]. При этом наблюдалось подавление преовуляторного пика секреции ЛГ, сопровождавшееся нарушением эстрального цикла. Авторы данного исследования полагают, что обнаруженный ими феномен обусловлен снижением количества c-fos-позитивных нейронов, продуцирующих ГнРГ в СОКП, который располагается в МПО гипоталамуса. В подразделе 3.2 было показано, что моноаминергические системы, участвующие в регуляции синтеза и секреции ГнРГ, сильно зависят от уровня половых стероидов в крови. Поэтому если предположить наличие отрицательного воздействия ДМГ на механизмы, осуществляющие овариальный сигнал запуска секреции ГнРГ, то вполне следует ожидать изменений среднесуточного содержания этих нейромедиаторов в исследуемых гипоталамических структурах под действием ксенобиотика на фоне введения физиологического раствора. Тем не менее, достоверных изменений в среднесуточном содержании НА в СВ-Арк и ДА в МПО гипоталамуса нами обнаружено не было, а наблюдаемое достоверное снижение НА в МПО и повышение ДА в СВ-Арк гипоталамуса еще раз доказывает правильность предположения о том, что ксенобиотик воздействует именно на те нейромедиаторные системы, которые участвуют в осуществлении циркадианного сигнала запуска преовуляторного пика секреции ГнРГ. В следующей серии экспериментов была поставлена задача изучить влияние на те же самые показатели (суточная динамика и среднесуточное содержание биогенных аминов) воздействия другого токсического соединения – толуола, известного своими нейротоксическими свойствами, и сопоставить эффекты двух различных по своей химической природе ксенобиотиков – острого воздействия ДМГ и хронического воздействия толуола – на гипоталамо-гипофизарное звено регуляции репродуктивной функции. Как показали дальнейшие исследования, ингаляция толуола в дозах на уровне ПДК вызывала достоверное (U=7; p<0,01) повышение уровня НА в МПО гипоталамуса в дневное время (9 ч ЦВ) по сравнению с контролем (таблица 3.4), что приводило к исчезновению характерной для контрольной группы суточной динамики содержания этого нейромедиатора (рисунок 3.22). В отношении содержания НА в СВ-Арк гипоталамуса было обнаружено достоверное (U=12; p<0,05) повышение утреннего (3 ч ЦВ) уровня этого нейромедиатора (таблица 3.5). Как и в контрольной группе, после воздействия ксенобиотика содержание НА в этой гипоталамической структуре не претерпевало достоверных суточных изменений (рисунок 3.22). 140 Таблица 3.4 – Влияние хронической ингаляции толуола в дозах на уровне предельно допустимой концентрации на суточную динамику содержания норадреналина, дофамина, серотонина и его метаболита 5-оксииндолилуксусной кислоты в медиальной преоптической области гипоталамуса самок крыс (M±m, нг/мг белка; n=6-10) Группа НА Контроль 3 ч ЦВ 31,32,1 Толуол 30,61,4 ДА 9 ч ЦВ 11,22,6 *** 27,63,2 3 ч ЦВ 7,31,6 8,21,4 5-ОТ 9 ч ЦВ 2,81,1 * 7,21,8 3 ч ЦВ 17,41,9 11,31,7 5-ОИУК 9 ч ЦВ 8,41,7 * 10,31,3 3 ч ЦВ 5,70,6 9 ч ЦВ 3,80,9 5,10,3 5,10,3 Примечание: *, *** – различия с показателем в 3 ч циркадианного времени в той же группе достоверны (*p<0,05; ***p<0,001; U-тест); , – различия с показателем в контрольной группе в то же время достоверны ( p<0,05; p<0,01; U-тест). Таблица 3.5 – Влияние хронической ингаляции толуола в дозах на уровне предельно допустимой концентрации на суточную динамику содержания норадреналина, дофамина и метаболита серотонина 5-оксииндолилуксусной кислоты в срединном возвышении с аркуатными ядрами гипоталамуса самок крыс (M±m, нг/мг белка; n=7-10) Группа НА ДА Контроль 3 ч ЦВ 17,91,8 9 ч ЦВ 14,91,9 3 ч ЦВ 16,71,6 Толуол 23,51,2 21,52,8 21,13,7 5-ОИУК 9 ч ЦВ 11,81,3 * 23,82,5 3 ч ЦВ 2,40,5 9 ч ЦВ 2,00,6 2,50,2 3,80,5 Примечание: * – различие с показателем в 3 ч циркадианного времени в той же группе достоверно (p<0,05; U-тест); , – различия с показателем в контрольной группе в то же время достоверны (p<0,05; p<0,01; U-тест). При воздействии толуола в дозах на уровне ПДК происходило достоверное (U=2; p<0,01) повышение уровня ДА в СВ-Арк гипоталамуса в дневное время (таблица 3.5), что сопровождалось исчезновением характерной для контрольной группы животных суточной динамики содержания этого нейромедиатора (рисунок 3.22). В МПО гипоталамуса воздействие ксенобиотика также вызывало достоверное (U=13; p<0,05) повышение дневного уровня нейромедиатора по сравнению с соответствующим контрольным значением. 40 35 30 25 20 15 10 5 0 НА в МПО 10 8 Контроль Толуол *** 6 4 2 0 * 3 9 циркадианное время, ч 3 9 циркадианное время, ч НА в СВ-Арк ДА в СВ-Арк 30 30 25 20 15 10 нг/мг белка нг/мг белка ДА в МПО 12 нг/мг белка нг/мг белка 141 25 20 15 * 10 5 5 0 0 3 9 циркадианное время, ч 3 9 циркадианное время, ч 25 5-ОТ в МПО нг/мг белка 20 15 10 * 5 0 3 9 циркадианное время, ч *, *** – различия с показателем в 3 ч циркадианного времени в той же группе достоверны (*p<0,05; ***p<0,001; U-тест) Рисунок 3.22 – Влияние хронической ингаляции толуола в дозах на уровне предельно допустимой концентрации на суточную динамику содержания норадреналина, дофамина и серотонина в медиальной преоптической области и срединном возвышении с аркуатными ядрами гипоталамуса самок крыс (M±m; n=6-10) 142 Содержание 5-ОТ в МПО гипоталамуса в утренние часы достоверно (U=8; p<0,05) снижалось при ингаляции толуола (таблица 3.4), что приводило к исчезновению нормальной суточной динамики уровня этого нейромедиатора (рисунок 3.22). Содержание же метаболита 5-ОТ, 5-ОИУК, в обеих гипоталамических структурах в утренние и дневные часы не отличалось от соответствующих контрольных значений после воздействия ксенобиотика. Обнаруженное в контрольной группе животных достоверное снижение по сравнению с утренними значениями дневных уровней НА, ДА и 5-ОТ в МПО, а также ДА в СВ-Арк гипоталамуса, не наблюдалось в группах, подвергшихся ингаляции толуола. Подобное нарушение суточной динамики содержания биогенных аминов под влиянием ксенобиотика может свидетельствовать о его нейротоксическом воздействии на процессы синаптической передачи в тех нейрональных структурах, которые передают в МПО и СВ-Арк гипоталамуса информацию о суточном периодизме. Если вопросы, связанные с общим нейротоксическим действием толуола на процессы нейрональной передачи и содержание нейромедиаторов в различных отделах мозга, достаточно хорошо освещены в литературе, то хронобиологические аспекты этого действия до сих пор остаются малоизученными. В одной из работ были исследованы вызываемые толуолом изменения дневного и ночного содержания биогенных аминов в различных областях мозга самцов крыс [Arito H. et al., 1985]. Было установлено, что хроническое введение ксенобиотика значительно повышает ночной уровень НА в целом гипоталамусе и не оказывает существенного воздействия на содержание нейромедиатора в дневное время. Эти сведения согласуются с полученными нами данными о характере воздействия толуола на содержание НА в МПО гипоталамуса, где ксенобиотик повышал уровень нейромедиатора в дневные, но не в утренние часы. Предыдущие исследования, проведенные в нашей лаборатории, показали неоднозначность эффектов одномесячной ингаляции этого ксенобиотика на содержание биогенных аминов в тех же гипоталамических структурах. В ряде случаев, как и в нашем эксперименте, под воздействием толуола происходило исчезновение наблюдаемых в контроле достоверных различий между утренним и дневным содержанием нейромедиаторов [Арутюнян А. В., Степанов М. Г., Кореневский А. В., 1998]. В других же случаях в группах животных, подвергшихся воздействию ксенобиотика, обнаруживались суточные изменения уровня биогенных аминов, не наблюдавшиеся в контроле. Характерно, что как в настоящем исследовании, так и в предыдущих экспериментах значительные сдвиги в содержании моноаминов были зафиксированы в основном в дневное время. Этот факт служит еще одним свидетельством, дополняющим уже имеющиеся в литературе сведения о характере суточных изменений чувствительности нейромедиаторных систем гипоталамуса к различным негативным воздействиям [Gillette M. U., McArthur A. J., 1996; Almeida O. F. X. et al., 1997]. 143 Независимо от конкретной точки приложения воздействия толуола на механизмы, обусловливающие суточные изменения содержания биогенных аминов в гипоталамусе, нарушение суточной динамики уровня этих нейромедиаторов свидетельствует о повреждении под действием ксенобиотика нейрональных путей, по которым к гипоталамическим структурам, ответственным за регуляцию эстральных циклов, поступает информация о суточном фотопериодизме. Немногочисленные данные литературы свидетельствуют о нарушении циркадианной системы под воздействием различных ксенобиотиков, что выражается в снижении амплитуды суточных ритмов содержания в крови мелатонина и различных гипофизарных гормонов [Baccarelli A., Pesatori A. C., Bertazzi P. A., 2000]. В исследованиях, проведенных ранее в нашей лаборатории, было зафиксировано нарушение суточных ритмов содержания ГнРГ в СОКП под действием толуола [Степанов М. Г., Арутюнян А. В., Айламазян Э. К., 1995]. Ксенобиотик может вызывать нарушения синаптической передачи в нейрональных путях, связывающих МПО и СВ гипоталамуса с сетчаткой глаза и СХЯ гипоталамуса. Как следствие, ежедневный сигнал, приводящий к изменениям содержания биогенных аминов в МПО и СВ гипоталамуса, либо не достигает моноаминергических нейронов, либо достигает их уже в ослабленном виде. Толуол также может воздействовать и на нейрональные пути, связывающие СХЯ гипоталамуса с пинеальной железой, что в свою очередь может приводить к нарушению суточных ритмов секреции мелатонина. Результаты наших экспериментов по изучению влияния хронической ингаляции толуола на содержание биогенных аминов в гипоталамических областях, ответственных за синтез и секрецию ГнРГ, подтвердили и дополнили полученные ранее в нашей лаборатории данные о нарушении под воздействием данного ксенобиотика суточных ритмов содержания некоторых из исследуемых нейромедиаторов в МПО и СВ-Арк гипоталамуса самок крыс [Арутюнян А. В., Степанов М. Г., Кореневский А. В., 1998]. Данные, полученные в настоящем исследовании, позволяют предположить, что суточные ритмы содержания биогенных аминов в МПО и СВАрк гипоталамуса являются чувствительным маркером нарушений механизмов, обеспечивающих связь циркадианной системы организма с катехоламинергическим звеном регуляции репродуктивной функции, как при остром, так и при хроническом воздействии на организм нейротоксических ксенобиотиков. Помимо воздействия на суточную динамику содержания нейромедиаторов, толуол изменял также и среднесуточный уровень биогенных аминов в исследуемых структурах гипоталамуса. Так, ингаляция ксенобиотика в дозах на уровне ПДК оказывала значительный эффект на среднесуточное содержание НА и ДА в СВ-Арк гипоталамуса, при этом на уровне тенденции также отмечалось влияние нейротоксиканта на среднесуточный уровень НА в МПО 144 гипоталамуса. Значительный эффект толуола обнаруживался и в случае показателя активности серотонинергической системы 5-ОИУК/5-ОТ в МПО гипоталамуса. В отношении же среднесуточного содержания ДА в МПО гипоталамуса значительного эффекта ксенобиотика не наблюдалось (рисунок 3.23). 35 30 нг/мг белка 25 Контроль ** Толуол ** 20 15 10 5 0 НА в СВ-Арк ДА в СВ-Арк НА в МПО 0,6 10 * 0,5 8 6 ед. нг/мг белка 0,4 4 0,3 0,2 0,1 2 0 0 5-ОИУК/5-ОТ в МПО ДА в МПО *, ** – различия с соответствующим показателем в контрольной группе достоверны (*p<0,05; **p<0,01; U-тест) Рисунок 3.23 – Влияние хронической ингаляции толуола в дозах на уровне предельно допустимой концентрации на среднесуточное содержание норадреналина и дофамина в медиальной преоптической области и срединном возвышении с аркуатными ядрами гипоталамуса самок крыс, а также на показатель 5-оксииндолилуксусная кислота/серотонин в медиальной преоптической области гипоталамуса самок крыс (M±m, n=12-19) 145 Как видно из полученных данных, хроническая ингаляция толуола вызывала повышение среднесуточного содержания биогенных аминов в МПО и СВ-Арк гипоталамуса экспериментальных животных. Повышение уровня НА и ДА в различных отделах мозга под воздействием острого и хронического воздействия толуола было неоднократно описано в литературе [Andersson K. et al., 1980; Andersson K. et al., 1983; Rea T. M. et al., 1984; Arito Н. et al., 1985; Hsieh G. C. et al., 1990; Ladefoged О. et al., 1991; Stengård K., Höglund G., Ungerstedt U., 1994; Gerasimov M. R. et al., 2002; Riegel A. C. et al., 2007]. Обозначить конкретные механизмы воздействия толуола на суточную динамику содержания нейромедиаторов в гипоталамических областях, ответственных за синтез и секрецию ГнРГ, в настоящее время не представляется возможным из-за недостаточности наших сведений о биохимических процессах, обусловливающих наблюдаемые суточные изменения. Однако основная гипотеза, объясняющая причину изменения среднесуточного уровня исследуемых нейромедиаторов под действием толуола, заключается в том, что для обеспечения нормальной нейрональной передачи происходит компенсаторное увеличение и, У как количества следствие, овариэктомированных постсинаптических повышение самок рецепторов среднесуточного крыс был [von Euler содержания обнаружен суточный G. et al., 1987] нейромедиаторов. ритм плотности α1-адренорецепторов в МПЯ гипоталамуса с минимумом в середине дня и пиком в 18 ч [Weiland N. G., Wise P. M., 1987]. Этот ритм находится в противофазе с наблюдаемыми нами изменениями содержания НА в МПО гипоталамуса. Если суточные ритмы уровня биогенных аминов зависят от суточных ритмов активности их постсинаптических рецепторов, то следует предположить, что воздействие ксенобиотика на моноаминергические рецепторы вызывает нарушения механизмов, обеспечивающих суточные изменения их плотности и аффинности, что в свою очередь приводит к исчезновению этих эффектов. Нельзя исключить и того, что толуол ингибирует секрецию моноаминов, а не только воздействует на их рецепторы. Помимо этого, нарушения нейрональной передачи под воздействием толуола могут быть связаны с тем, что в процессе его метаболизма образуется большое количество свободных радикалов, способных вызывать множественные нарушения липидных и белковых компонентов мембран [Mattia C. J., Adams J. D. Jr., Bondy S. C., 1993]. Однако изучение нами свободнорадикальной активности в МПО гипоталамуса не выявило значительных изменений ее среднесуточного уровня под действием ксенобиотика (см. подраздел 3.7). Экспериментальных данных о влиянии толуола на содержание 5-ОТ в различных отделах мозга до сих пор было получено сравнительно мало. В основном в отношении этого индоламина была обнаружена та же тенденция, что и для катехоламинов, – повышение среднесуточного содержания под действием ксенобиотика, которое сопровождается снижением 146 аффинности серотонинергических постсинаптических рецепторов [Celani M. F. et al., 1983]. Сходство в эффектах толуола на среднесуточное содержание НА, ДА и 5-ОТ, зафиксированное в наших исследованиях, по-видимому, объясняется схожими адаптивными возможностями катехоламинергических и серотонинергических систем к воздействию данного ксенобиотика. В экспериментах, проведенных нами ранее [Кореневский А. В., 1998], данные дисперсионного анализа не подтвердили наличия значительного эффекта одномесячной ингаляции толуола на среднесуточное содержание биогенных аминов в структурах гипоталамуса, участвующих в регуляции эстральных циклов у самок крыс. Наличие более сильного воздействия ксенобиотика, которое было обнаружено в настоящем эксперименте, возможно, объясняется повышением срока ингаляции с одного до двух месяцев. Кроме того, в предыдущих экспериментах в ряде случаев, несмотря на достаточно сильные изменения среднесуточного содержания катехоламинов под влиянием толуола, эти сдвиги были статистически недостоверными из-за высокого разброса данных. Полученные в этом исследовании результаты дают более четкую картину хронического воздействия ксенобиотика на среднесуточное содержание биогенных аминов в исследованных структурах гипоталамуса, возможно, благодаря усовершенствованию методики определения этих нейромедиаторов. Наблюдавшееся нами повышение среднесуточного содержания ДА в СВ-Арк гипоталамуса после однократного введения ДМГ и после хронической ингаляции толуола, а также разнонаправленные изменения уровня НА в МПО гипоталамуса после применения указанных воздействий могут свидетельствовать о сложной реакции гипоталамо-гипофизарного звена регуляции репродуктивной функции на экзогенно вводимые ксенобиотики. При этом отличие в эффектах введения ДМГ на уровне МПО и СВ-Арк гипоталамуса может быть обусловлено различным воздействием ксенобиотика на околосуточные ритмы содержания биогенных аминов и других нейромедиаторов в областях гипоталамуса, ответственных за синтез и секрецию ГнРГ. Для дальнейшего выяснения вопроса о наличии или отсутствии специфичности воздействия ксенобиотиков на катехоламинергическое звено регуляции эстральных циклов нами было предложено исследовать влияние на изучаемые показатели хронического потребления аминокислоты L-метионина, которая сама по себе не является ксенобиотиком, но образует в процессе своей деградации цитотоксичную аминокислоту ГЦ и еще более токсичную L-гомоцистеиновую кислоту, а также АФК и таким образом может выступать в качестве источника эндогенных ксенобиотиков. 147 3.6. Влияние метиониновой нагрузки (гипергомоцистеинемии) на суточную динамику и среднесуточное содержание биогенных аминов в медиальной преоптической области и срединном возвышении с аркуатными ядрами гипоталамуса Наличие ГГЦ при хроническом принудительном потреблении экспериментальными животными L-метионина было во всех случаях подтверждено путем прямого измерения содержания общего ГЦ в сыворотке крови. Как видно из данных, представленных на рисунке 3.24, отмечалось достоверное (p<0,01) повышение содержания общего ГЦ в период формирования и терминации преовуляторного пика секреции ГнРГ (9:30 ч и 11 ч ЦВ, соответственно). 25 # 20 мкмоль/л # 15 10 5 0 5 9:30 циркадианное время, ч контроль 11 L-метионин – различие с показателем в то же время в контрольной группе достоверно (p<0,01; U-тест) Рисунок 3.24 – Влияние хронического воздействия L-метионина на суточную динамику уровня общего L-гомоцистеина в сыворотке крови самок крыс на стадии проэструса (M±m, n=8-13) В результате проведенных исследований было обнаружено влияние алиментарной ГГЦ на суточную динамику и среднесуточное содержание биогенных аминов в структурах гипоталамуса, ответственных за синтез и секрецию ГнРГ. Так, при исследовании содержания НА в МПО гипоталамуса в контроле была обнаружена сходная с описанной выше динамика изменений уровня этого нейромедиатора с характерным достоверным (U=22; p<0,05) повышением его содержания в дневное время (9:30 ч ЦВ) и снижением в вечерние часы 148 (11 ч ЦВ). Обнаруженная динамика исчезала на фоне одномесячного курса перорального введения L-метионина. В этих условиях уровень НА сохранялся практически одинаковым во всех трех временных точках (рисунок 3.25). 35 20 # * 30 16 * нг/мг белка нг/мг белка 25 20 15 12 8 10 4 5 0 0 5 9: 30 циркадианное время, ч контроль 11 5 9:30 циркадианное время, ч контроль L-метионин 11 L-метионин * – различие с показателем в 11 ч циркадианного * – различие с показателем в 9:30 ч времени в той же группе (контроль) достоверно циркадианного времени в той же группе (p<0,05; U-тест) Рисунок 3.25 – Влияние хронического воздействия L-метионина на суточную (контроль) достоверно (p<0,05; U-тест); – различие с показателем в то же время в контрольной группе достоверно (p<0,05; U-тест) динамику содержания норадреналина в медиальной преоптической области гипоталамуса самок крыс на стадии проэструса (M±m, n=9-12) Рисунок 3.26 – Влияние хронического воздействия L-метионина на суточную динамику содержания дофамина в срединном возвышении с аркуатными ядрами гипоталамуса самок крыс на стадии проэструса (M±m, нг/мг белка; n=9-13) При исследовании суточной динамики содержания ДА в СВ-Арк гипоталамуса было установлено, что в контроле наблюдается суточное изменение уровня нейромедиатора с характерным повышением в вечерней временной точке (U=25; p<0,05). При введении L-метионина наблюдалось исчезновение нормальной суточной динамики содержания нейромедиатора, при этом имели место достоверное (U=39; p<0,05) по сравнению с контролем 149 повышение уровня этого моноамина в 9:30 ч ЦВ и тенденция к снижению этого показателя к 11 ч ЦВ (рисунок 3.26, таблица 3.6). Дополнительно к этому в той же самой гипоталамической структуре была обнаружена тенденция к повышению содержания другого моноамина, НА, и также в 9:30 ч ЦВ, при этом не отмечалось достоверных изменений данных показателей в другой гипоталамической структуре – в МПО (таблица 3.6). Таблица 3.6 – Влияние алиментарной гипергомоцистеинемии на содержание норадреналина и дофамина в медиальной преоптической области и срединном возвышении с аркуатными ядрами гипоталамуса самок крыс на стадии проэструса в 9:30 ч циркадианного времени (M±m, нг/мг белка; n=12-13) Показатель Контроль L-метионин НА в МПО 27,2±1,7 26,2± 1,7 ДА в МПО 6,0±0,3 6,4±0,4 НА в СВ-Арк 23,1±1,4 26,9±1,3 ДА в СВ-Арк 13,5±0,7 16,1± 0,7 Примечание: – различие с соответствующим показателем в контрольной группе достоверно (p<0,05; U-тест). Исследование уровня ДА в МПО и НА в СВ-Арк гипоталамуса не выявило суточной динамики содержания этих нейромедиаторов ни в группе контроля, ни в группе животных, подвергшихся метиониновой нагрузке. Определение же среднесуточного содержания НА в МПО гипоталамуса при объединении данных, полученных во всех трех временных точках (5 ч, 9:30 ч и 11 ч ЦВ), показало, что после принудительного перорального введения L-метионина в течение месяца происходит достоверное (U=409; p<0,05) повышение содержания нейромедиатора по сравнению с контролем. В группе животных, получавших L-метионин, оно составило 27,2±1,0 нг/мг белка, а в контрольной группе – 23,7±0,9 нг/мг белка. В результате изучения среднесуточных уровней ДА и 5-ОИУК в МПО гипоталамуса статистически значимые различия при сравнении контрольных и опытных животных выявлены не были. Так, среднесуточное содержание ДА в этой гипоталамической структуре в группе животных, потреблявших L-метионин, достоверно не отличалось от содержания нейромедиатора в группе контроля и составило: 27,0±0,9 нг/мг белка и 24,9±1,1 нг/мг белка, 150 соответственно. Имела место лишь тенденция к повышению содержания среднесуточного уровня этого биогенного амина при введении L-метионина. В литературе имеются данные о повышении содержания НА в данной структуре гипоталамуса при метиониновой нагрузке. По мнению авторов, ГЦ индуцирует увеличение секреции ЛГ гипофизом. Это происходит вследствие ингибирования активности КОМТ в СВ-Арк гипоталамуса, в результате чего и происходит накопление НА в МПО гипоталамуса [Ladosky W., Azambuja H. M., Schneider H. T., 1983]. Также при объединении данных, полученных во всех трех временных точках (5 ч, 9:30 ч и 11 ч ЦВ), нами не было выявлено статистически значимых различий в среднесуточном содержании НА, ДА и 5-ОИУК в СВ-Арк гипоталамуса между контрольной и опытной группами животных. Так, например, среднесуточное содержание НА в этой гипоталамической структуре в группе животных, потреблявших L-метионин, достоверно не отличалось от уровня нейромедиатора в группе контроля (27,0±0,9 нг/мг белка и 24,9±1,1 нг/мг белка, соответственно). Имела место лишь тенденция к повышению содержания данного биогенного амина при введении L-метионина. Согласно современным представлениям, ДА и особенно НА считаются позитивными регуляторами синтеза ГнРГ в МПО гипоталамуса самок крыс. Активация норадренергических нейронов, иннервирующих данную гипоталамическую структуру, в дневные часы на стадии проэструса играет важную роль в формировании преовуляторного пика секреции ГнРГ [Herbison A. E., 1997]. Что же касается секреции ГнРГ из СВ гипоталамуса, то ДА, в противоположность НА, рассматривается как негативный регулятор. В отношении 5-ОТ известно его ингибирующее влияние на продукцию ГнРГ. Как было показано выше, для исследованных нами биогенных аминов на стадии проэструса характерна суточная динамика их содержания в МПО и СВ-Арк гипоталамуса, связанная с регуляторной ролью этих нейромедиаторов в формировании преовуляторного пика секреции ГнРГ. Отмеченное в данном исследовании изменение суточной динамики и среднесуточного содержания катехоламинов при метиониновой нагрузке в структурах гипоталамуса, ответственных за синтез и секрецию ГнРГ, подтверждает адекватность использования для создания ГГЦ модели принудительного кормления животных L-метионином. Можно предположить, что исчезновение суточных ритмов содержания НА и ДА в данной модели ГГЦ связано с изменениями в работе центрального осциллятора циркадианных ритмов и является характерным начальным репродуктивной функции. признаком нарушений нормального функционирования 151 Приведенные результаты указывают на то, что повышенное содержание общего ГЦ вызывает нарушение катехоламинергической регуляции эстральных циклов у самок крыс, оказывая влияние на норадренергическую систему в МПО гипоталамуса и дофаминергическую систему в СВ-Арк гипоталамуса, что свидетельствует о негативном действии ГГЦ на процессы синтеза и секреции ГнРГ, находящиеся под контролем этих нейромедиаторных систем. Полученные данные дают основание рассматривать повышенное содержание общего ГЦ в качестве фактора, одним из проявлений нейротоксичности которого является нарушение гипоталамической регуляции овариальных циклов, что ставит его в один ряд с другими ранее изученными в нашей лаборатории ксенобиотиками. Обнаруженные нами изменения в содержании отдельных нейромедиаторов в структурах гипоталамуса самок крыс при ГГЦ требуют дальнейшего исследования. В последнее время интерес к ГГЦ в основном связывают с изучением дегенеративных заболеваний нервной системы, при которых все больше исследователей отмечают повышенный уровень общего ГЦ в сыворотке крови. Однако механизм этого повышения пока еще остается недостаточно изученным, поэтому исследователи используют различные экспериментальные модели для изучения влияния ГГЦ на физиологические и биохимические показатели структур мозга. Так, рядом ученых было обнаружено, что у крыс, находящихся на диете с высоким потреблением L-метионина, снижено содержание 5-ОТ и ДА в коре головного мозга [Gao L. et al.,. 2012]. Другие исследователи, используя модель ГГЦ, вызванную диетой с дефицитом фолиевой кислоты, также отмечали изменения метаболизма биогенных аминов и снижение глутатиона в мозге животных [Kronenberg G. et al., 2008]. Имеются сведения о том, что введение ГЦ увеличивает содержание X-бокс-связывающего белка-1 в таких отделах мозга мышей, как гиппокамп, гипоталамус и кора. Известно, что X-бокс-связывающий белок-1 вовлечен в патогенез заболеваний ЦНС [Hosoi T., Ogawa K., Ozawa K., 2010]. Таким образом, можно предположить, что искажение нормальной суточной динамики и среднесуточного содержания катехоламинов в МПО и СВ-Арк гипоталамуса в рассмотренной нами модели ГГЦ, вызванной введением L-метионина, может обусловливать нарушения в центральной регуляции эстральных циклов. Однако механизмы этого явления нуждаются в дальнейшем изучении. Полученные нами данные позволяют рассматривать ГЦ, концентрация которого в организме самок крыс возрастает при метиониновой нагрузке, в качестве эндогенного ксенобиотика, вызывающего нарушение центральной регуляции репродуктивных циклов. 152 3.7. Влияние ксенобиотиков 1,2-диметилгидразина, толуола и метиониновой нагрузки на образование активных форм кислорода в медиальной преоптической области и срединном возвышении с аркуатными ядрами гипоталамуса и продуктов перекисного окисления липидов в сыворотке крови Помимо суточных изменений содержания биогенных аминов в структурах гипоталамуса, ответственных за синтез и секрецию ГнРГ, в МПО гипоталамуса также были обнаружены суточные изменения генерации АФК. Образование АФК в этой структуре в дневное время существенно (U=4; p<0,05) превосходило значения данного показателя в утренние и ранние ночные часы (рисунок 3.27). С помощью Н-теста Крускала-Уоллиса была подтверждена зависимость уровня люминолзависимой хемилюминесценции в этой гипоталамической области от временного показателя (Н=9,156; p<0,05). Необходимо отметить, что суточная динамика генерации АФК в МПО гипоталамуса имела характер, противоположный соответствующим изменениям содержания биогенных аминов в той же структуре (рисунок 3.22). 18000 * отн. ед./мг белка 16000 * 14000 12000 10000 8000 # 6000 4000 2000 0 3 9 17 3 9 17 3 ц иркад ианное вр ем я, ч ф и з . р -р ф и з . р -р + Д М Г * – различие с показателями в 3 ч и 17 ч циркадианного времени в той же группе достоверно (р<0,05; U-тест); – различие с показателем в группе животных, получивших инъекцию физиологического раствора, в то же время достоверно (р<0,05; U-тест) Рисунок 3.27 – Влияние однократного введения 1,2-диметилгидразина на генерацию активных форм кислорода (уровень люминолзависимой хемилюминесценции) в медиальной преоптической области гипоталамуса самок крыс на фоне введения физиологического раствора (M±m; n=5-6) 153 Введение ДМГ достоверно (U=1; p<0,05) снижало дневной уровень образования АФК до значений, характерных для утреннего и раннего ночного времени, что приводило к исчезновению наблюдаемой в контрольной группе суточной динамики генерации АФК (рисунок 3.27). Хроническая ингаляция толуола в дозах на уровне ПДК вызывала достоверное (U=5; p<0,05) повышение утреннего уровня генерации АФК в МПО гипоталамуса по сравнению с контролем, что приводило к исчезновению наблюдаемых в норме суточных изменений интенсивности свободнорадикального окисления (рисунок 3.28). 1 8 00 0 1 6 00 0 * отн. ед./мг белка 1 4 00 0 1 2 00 0 # 1 0 00 0 8 00 0 6 00 0 4 00 0 2 00 0 0 К о нт ро л ь 3 ч ЦВ Т о л у ол 9 ч ЦВ * – различие с показателем в 3 ч циркадианного времени в той же группе достоверно (р<0,05; U-тест); – различие с показателем в то же время в контрольной группе достоверно (р<0,05; U-тест) Рисунок 3.28. Влияние хронического воздействия толуола на генерацию активных форм кислорода (уровень люминолзависимой хемилюминесценции) в медиальной преоптической области гипоталамуса самок крыс (M±m; n=6-10) Нарушение суточной динамики содержания биогенных аминов в МПО гипоталамуса под воздействием хронической ингаляции толуола сопровождалось исчезновением суточной динамики образования АФК в этой гипоталамической структуре. В то же время однократное введение ДМГ вызывало исчезновение в этой области гипоталамуса нормальной суточной динамики содержания ДА и образования АФК. Таким образом, в МПО гипоталамуса при различных воздействиях, также как и в нормальных физиологических условиях, наблюдалась взаимосвязь между уровнем биогенных аминов и свободнорадикальными 154 процессами. Несмотря на то, что механизм нейротоксического действия толуола и ДМГ связан с образованием свободных радикалов, ни ингаляция ксенобиотика, ни введение канцерогена не вызывали значительного повышения образования АФК в МПО гипоталамуса. Этот факт, по-видимому, дает дополнительное подтверждение того, что обнаруженные при различных воздействиях изменения в образовании АФК в МПО гипоталамуса отражают изменения в содержании биогенных аминов, а не обусловлены индукцией свободных радикалов при метаболизме ксенобиотиков. Если суточная динамика образования АФК в МПО гипоталамуса обусловлена суточными изменениями активности метаболизирующей катехоламины МАО-А, то в таком случае следует предполагать, что нарушение суточных ритмов генерации АФК под воздействием ксенобиотиков представляет собой следствие нарушения суточных ритмов активности этой формы моноаминоксидазы самого изофермента. Суточные изменения активности МАО-А в переднем гипоталамусе самцов крыс исчезали при помещении экспериментальных животных в условия световой депривации [Kamase Н., 1980], поэтому исчезновение суточных ритмов образования АФК при различных воздействиях могло явиться следствием нарушения механизмов передачи фотопериодической информации от сетчатки глаза к моноаминергическим системам гипоталамуса. Полученные нами данные позволяют предположить, что суточные ритмы генерации АФК в МПО гипоталамуса связаны с суточными изменениями в содержании биогенных аминов в этой богатой моноаминергическими окончаниями гипоталамической структуре. Вместе с тем уровень генерации АФК может рассматриваться как интегральный показатель, не только свидетельствующий об изменении активности моноаминергических систем, но и дающий представление об интенсивности множества различных биохимических процессов, связанных с образованием АФК. Таким образом, изучение суточной динамики образования АФК в структурах гипоталамуса, ответственных за регуляцию эстральных циклов, может служить маркером нормального функционирования механизмов передачи к этим структурам информации о суточном периодизме, а также нарушения таких механизмов при различных неблагоприятных воздействиях на организм. Как уже было указано в главе 1, одним из основных механизмов токсичности ГЦ является его аутоокисление в присутствии кислорода и ионов металлов с переходной валентностью и инициируемая этим генерация АФК [Perna A. F. et al., 2003]. Образующиеся пероксид водорода и супероксиданион-радикал стимулируют процессы перекисного окисления липидов и снижают биодоступность оксида азота [Upchurch G. R. Jr. et al., 1997]. Последнее обусловлено, в первую очередь, образованием при взаимодействии оксида азота и супероксиданион-радикала высокотоксичного продукта – пероксинитрита [Hooijmans C. R., Blom H. J., 2009; Upchurch G. R. Jr. et al., 1997]. При повышении содержания общего ГЦ 155 некоторые исследователи отмечают подавление экспрессии глутатионпероксидазы и супероксид-дисмутазы, что может усиливать токсический эффект свободных радикалов в структурах мозга [Bayadas G. et al., 2006]. Данные об увеличении уровня общего ГЦ в плазме крови при пероральном введении L-метионина согласуются с полученными нами результатами о содержании продуктов перекисного окисления липидов (ТБК-реактивных продуктов), а также нитритов в сыворотке крови, при этом влияние потребления L-метионина на уровень Fe2+/H2O2-индуцированной хемилюминесценции в сыворотке крови в ходе экспериментов нами обнаружено не было. Так, при исследовании в сыворотке крови уровня вторичного продукта перекисного окисления липидов малонового диальдегида было обнаружено его достоверное (U=502,5; p<0,01) повышение при метиониновой нагрузке, указывающее на активацию перекисных процессов в крови (рисунок 3.29). Аналогичные данные были описаны нами ранее, причем было показано, 16 * 14 мкмоль/л 12 10 8 6 4 2 0 контроль L-метионин * – различие с показателем в контрольной группе достоверно (p<0,01; U-тест) Рисунок 3.29 – Влияние хронического воздействия L-метионина на содержание малонового диальдегида в сыворотке крови самок крыс на стадии проэструса (M±m, n=36-46) что наиболее заметное повышение уровня малонового диальдегида наблюдалось во временном интервале с 9:30 ч до 10:10 ч ЦВ [Арутюнян А. В. и соавт., 2012]. Известно, что ГЦ обладает способностью эффективнее других аминотиолов, при переходе в форму дисульфида или связываясь с эндогенными тиолами, отдавать электроны кислороду, превращая последний в супероксид-анион. Супероксид-анион уже непосредственно участвует 156 в процессах перекисного окисления липидов. В результате происходит усиленное образование продуктов свободнорадикального метаболизма [Жлоба А. А., Никитина В. В., 2004]. Полученные нами результаты согласуются с данными других исследователей, которые указывают на то, что при возрастании уровня общего ГЦ наблюдается увеличение содержания малонового диальдегида, карбонильных производных и диеновых конъюгатов в плазме крови крыс и кроликов [Yalçinkaya-Demirsöz S. et al., 2009; Vanzin C. S. et al., 2011], а также повышение уровня малонового диальдегида и супероксид-аниона в гиппокампе крыс [Ataie A. et al., 2010]. В других исследованиях было показано, что после хронического 22-дневного введения ГЦ спустя час после последней инъекции происходит повышение уровня перекисного окисления липидов и снижение общей антиокислительной активности в сердце крыс. Однако через 12 ч данный эффект исчезал [Kolling J. et al., 2011]. Исследования, проведенные на культурах клеток печени и микроглии, показали, что как ГЦ, так и S-аденозилL-метионин вызывают повреждения ДНК клеток. Были установлены различия в механизмах повреждающего действия этих соединений на нуклеиновые кислоты, а также показано, что S-аденозил-L-метионин непосредственно воздействует на ДНК, тогда как воздействие ГЦ осуществляется опосредованно с участием продуктов, образующихся при активации перекисного окисления липидов [Liu C. C. et al., 2009]. 10 * мкмоль/л 8 6 4 2 0 контроль 5 ч ЦВ L-метионин 9:30 ч ЦВ 11 ч ЦВ * – различие с показателями в 5 ч и 9:30 ч циркадианного времени в той же группе достоверно (p<0,05; U-тест) Рисунок 3.30 – Влияние хронического воздействия L-метионина на cодержание нитритов в сыворотке крови самок крыс на стадии проэструса (M±m, n=10-13) 157 В настоящем исследовании нами также была выявлена суточная динамика содержания нитритов в сыворотке крови контрольных животных, с достоверным (p<0,05) повышением уровня этого показателя к 11 ч ЦВ (рисунок 3.30). Н-тест Крускала-Уоллиса подтвердил зависимость содержания нитритов от временного показателя (Н=7,489; p<0,05). Пероральное введение L-метионина приводило к достоверному (U=28; p<0,05) снижению содержания нитритов в вечернее время с нарушением их нормальной суточной динамики. Снижение уровня нитритов может быть обусловлено усилением взаимодействия с супероксидным радикалом и косвенно свидетельствовать об интенсификации процесса образования пероксинитрита в этих условиях. Вследствие значительной схожести данных о воздействии экзогенных ксенобиотиков ДМГ и толуола на суточную динамику и среднесуточное содержание биогенных аминов, что указывает на неспецифичность реакции гипоталамического звена регуляции репродуктивной функции на неблагоприятные внешние факторы, в дальнейшем для сравнения были использованы только два соединения – ДМГ (модель преждевременного старения репродуктивной функции, см. также подраздел 3.9) и L-метионин (модель экспериментальной гипергомоцистеинемии). 3.8. Коррекция с помощью мелатонина и пептидных биорегуляторов нарушения катехоламинергической регуляции эстральных циклов, вызванного нейротоксическим воздействием (1,2-диметилгидразин, метиониновая нагрузка) Последующие эксперименты показали, что при введении ДМГ на фоне инъекций мелатонина, эпиталамина и эпиталона наблюдается реакция гипоталамических структур, ответственных за синтез и секрецию ГнРГ, проявляющаяся в изменении содержания в них катехоламинов (таблица. 3.7). Так, среднесуточное содержание НА в МПО гипоталамуса в группе животных, получавших ДМГ на фоне введения мелатонина, достоверно не отличалось от соответствующего контрольного значения, то есть от среднесуточного содержания нейромедиатора в группе животных, получавших только мелатонин. У животных же, получивших инъекцию ДМГ на фоне введения эпиталамина, отмечалось достоверное (U=259; р<0,01) увеличение на 17,9% уровня НА по сравнению с группой животных, получавших только эпиталамин. При введении ДМГ на фоне инъекций эпиталона была отмечена лишь тенденция к повышению среднесуточного содержания этого нейромедиатора (рисунок 3.31). 158 159 % 25 ** 20 15 10 5 физ. р-р мелатонин 0 эпиталамин -5 эпиталон -10 -15 * -20 * – различие между показателями в группе животных, получивших инъекцию 1,2-диметилгидразина на фоне введения физиологического раствора, и в группе животных, получавших только физиологический раствор, достоверно (p<0,01; U-тест); ** – различие между показателями в группе животных, получивших инъекцию 1,2-диметилгидразина на фоне введения эпиталамина, и в группе животных, получавших только эпиталамин, достоверно (р<0,01; U-тест) Рисунок 3.31 – Влияние однократного введения 1,2-диметилгидразина на среднесуточное содержание норадреналина в медиальной преоптической области гипоталамуса самок крыс на стадии проэструса на фоне введения различных соединений относительно соответствующего контроля (за нулевую линию принято среднесуточное содержание нейромедиатора в группах животных, не получавших инъекции ксенобиотика; n=30-40) Анализ полученных данных по среднесуточному содержанию ДА в МПО гипоталамуса позволил установить, что однократное введение ДМГ при фоновом введении всех трех исследованных соединений достоверно (р<0,01; р<0,001) повышает уровень ДА на 64,7% (мелатонин), 131,9% (эпиталамин) и 76,7% (эпиталон) (рисунок 3.32). В СВ-Арк гипоталамуса достоверное (U=166; р<0,001) увеличение среднесуточного содержания НА (на 46,4%) наблюдалось только при введении ДМГ на фоне четырехдневного курса введения эпиталона (рисунок 3.33). Анализ данных о среднесуточном содержании ДА в СВ-Арк гипоталамуса показал, что его уровень значительно (на 71,3%) возрастал при введении ксенобиотика на фоне введения 160 % 160 ** 140 120 100 * 80 * 60 40 20 0 физ. р-р мелатонин эпиталамин эпиталон -20 -40 * – различие между показателями в группе животных, получивших инъекцию 1,2-диметилгидразина на фоне введения мелатонина или эпиталона, и в группах животных, получавших только мелатонин или эпиталон, достоверно (p<0,01; U-тест); ** – различие между показателями в группе животных, получивших инъекцию 1,2-диметилгидразина на фоне введения эпиталамина, и в группе животных, получавших только эпиталамин, достоверно (р<0,001; U-тест) Рисунок 3.32 – Влияние однократного введения 1,2-диметилгидразина на среднесуточное содержание дофамина в медиальной преоптической области гипоталамуса самок крыс на стадии проэструса на фоне введения различных соединений относительно соответствующего контроля (за нулевую линию принято среднесуточное содержание нейромедиатора в группах животных, не получавших инъекции ксенобиотика; n=27-39) эпиталона, тогда как при сочетанном введении ДМГ и эпиталамина изменения были недостоверными, а на фоне введения мелатонина наблюдалось даже достоверное (U=268; р<0,01) снижение среднесуточного содержания нейромедиатора на 19,8% (рисунок 3.34). В группе животных, которые получали курс введения гормона пинеальной железы мелатонина, наблюдается нормальная суточная динамика содержания НА в МПО гипоталамуса, характерная для контрольных животных (таблица 3.8). Установлено, что при введении ДМГ на фоне инъекций мелатонина нормальные суточные изменения содержания НА в МПО гипоталамуса сохранялись, при этом наблюдалось достоверное (U=25; р<0,05) снижение уровня данного нейромедиатора во временном интервале с 9:30 ч до 11 ч ЦВ; подобный же положительный эффект отмечался и при сочетанном введении ДМГ и эпиталамина, который в МПО гипоталамуса оказался более эффективным по сравнению с эпиталоном (таблица 3.8). 161 % * 45 30 15 физ. р-р эпиталамин 0 мелатонин эпиталон -15 * – различие между показателями в группе животных, получивших инъекцию 1,2-диметилгидразина на фоне введения эпиталона, и в группе животных, получавших только эпиталон, достоверно (p<0,001; U-тест) Рисунок 3.33 – Влияние однократного введения 1,2-диметилгидразина на среднесуточное содержание норадреналина в срединном возвышении с аркуатными ядрами гипоталамуса самок крыс на стадии проэструса на фоне введения различных соединений относительно соответствующего контроля (за нулевую линию принято среднесуточное содержание нейромедиатора в группах животных, не получавших инъекции ксенобиотика; n=28-36) При сочетанном введении ДМГ и мелатонина была обнаружена суточная динамика содержания ДА в СВ-Арк гипоталамуса, сходная с ритмом уровня нейромедиатора, наблюдаемым в контрольной группе, а также в группе животных, получавших только инъекции мелатонина (достоверное повышение уровня нейромедиатора в дневные и вечерние часы по сравнению с его уровнем в утренней временной точке) (таблица 3.9). Кроме того, в СВ-Арк гипоталамуса достаточно эффективным оказался эпиталон, который предотвращал нарушение суточной динамики содержания ДА, вызываемое воздействием ксенобиотика, сохраняя при этом низкий уровень катехоламина в 5 ч ЦВ с достоверным (р<0,05) повышением его содержания к 9:30 ч и 11 ч ЦВ (таблица 3.9). Тот факт, что суточные ритмы содержания НА в МПО и ДА в СВ-Арк гипоталамуса претерпевают изменения под действием ДМГ, указывает на нарушение связи 162 % 100 ** 80 ** 60 40 20 мелатонин 0 эпиталамин физ. р-р эпиталон -20 * -40 * – различие между показателями в группе животных, получивших инъекцию 1,2-диметилгидразина на фоне введения мелатонина, и в группе животных, получавших только мелатонин, достоверно (p<0,01; U-тест); ** – различие между показателями в группе животных, получивших инъекцию 1,2-диметилгидразина на фоне введения физиологического раствора или эпиталона, и в группах животных, получавших только физиологический раствор или эпиталон, достоверно (р<0,001; U-тест) Рисунок 3.34 – Влияние однократного введения 1,2-диметилгидразина на среднесуточное содержание дофамина в срединном возвышении с аркуатными ядрами гипоталамуса самок крыс на стадии проэструса на фоне введения различных соединений относительно соответствующего контроля (за нулевую линию принято среднесуточное содержание нейромедиатора в группах животных, не получавших инъекции ксенобиотика; n=28-36) между циркадианной системой организма и гипоталамическим звеном регуляции эстральных циклов, так как установлено, что суточная динамика содержания НА в МПО и ДА в СВ-Арк связана с работой центрального осциллятора циркадианных ритмов, СХЯ гипоталамуса [Cai А. et al., 1997; Sellix M. T. et al., 2004; Арутюнян А. В. и соавт., 2005], и, вероятнее всего, участвует в реализации «циркадианного сигнала» запуска пика секреции ГнРГ на стадии проэструса. Также велика вероятность того, что суточный ритм содержания ДА в СВ-Арк гипоталамуса зависит от изменений в течение суток уровня мелатонина в крови, одной из мишеней прямого действия которого является собственно СВ гипоталамуса [Weaver D. R., Rivkees S. A., Reppert S. M., 1989; Коркушко О. В., Хавинсон В. Х., Шатило В. Б., 2006]. Таким образом, можно 163 Таблица 3.8 – Суточная динамика содержания норадреналина в медиальной преоптической области гипоталамуса самок крыс на стадии проэструса после однократного введения 1,2-диметилгидразина на фоне введения физиологического раствора, мелатонина, эпиталамина и эпиталона (M±m, нг/мг белка; n=6-16) Циркадианное время, ч физ. р-р физ. р-р + ДМГ мелатонин мелатонин эпиталамин эпиталон + ДМГ + ДМГ + ДМГ 5 20,3±1,4 18,7±1,2 19,1±1,8** 19,1±1,9* 20,3±1,2 21,1±2,4 9:30 24,3±1,5 18,4±2,1 25,8±1,7 24,6±2,0 23,4±1,0 17,2±1,1 11 20,9±0,9* 20,3±1,6 20,0±1,4* 18,7±1,9* 19,5±1,1* 19,2±1,8 Примечание: *, ** – различия с показателем в 9:30 ч циркадианного времени в той же группе достоверны (*p<0,05; ** p<0,01; U-тест). Таблица 3.9 – Суточная динамика содержания дофамина в срединном возвышении с аркуатными ядрами гипоталамуса самок крыс на стадии проэструса после однократного введения 1,2-диметилгидразина на фоне введения физиологического раствора, мелатонина, эпиталамина и эпиталона (M±m, нг/мг белка; n=8-13) Циркадианное время, ч физ. р-р физ. р-р + ДМГ мелатонин 7,7±0,5 мелатонин эпиталамин эпиталон + ДМГ + ДМГ + ДМГ 6,5±0,4 16,4±2,3 12,4±0,6 5 5,2±0,4 13,8±1,1 9:30 8,4±0,8** 13,2±1,5 12,3±0,8** 9,5±0,4*** 13,0±2,5 16,5±1,3* 11 8,2±1,1* 14,0±1,6 11,5±1,0* 10,0±0,2*** 8,2±0,9** 17,7±2,0* Примечание: *, **, *** – различия с показателем в 5 ч циркадианного времени в той же группе достоверны (*p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001; U-тест). предположить, что восстанавливающий нарушенные под воздействием ксенобиотика суточные изменения содержания нейромедиаторов эффект мелатонина и пептидных препаратов реализуется через способность этих соединений предотвращать нарушение процессов передачи информации о суточном периодизме от СХЯ гипоталамуса к нейромедиаторным системам МПО и СВ гипоталамуса, участвующим в регуляции эстральных циклов. Однако достаточно сложно судить о механизмах, вызывающих этот эффект, поскольку сначала необходимо 164 проанализировать возможные механизмы, посредством которых однократное введение экспериментальным животным ДМГ приводит к нарушению суточных ритмов содержания НА в МПО и ДА в СВ-Арк гипоталамуса. Согласно данным литературы, ДМГ проявляет антигонадотропный эффект, который может являться результатом как непосредственного воздействия ксенобиотика на половые железы, так и его влияния на гипоталамическое звено регуляции овариальных циклов [Анисимов В. Н., 1976; Анисимов В. Н., Забежинский М. А., Попович И. Г., 2000]. В то же время было показано, что уровень мелатонина в пинеальной железе в ночные часы снижался под влиянием утреннего введения ДМГ [Арутюнян А. В. и соавт., 2001]. Можно предположить, что в пинеальной железе ДМГ влияет не на активность N-ацетилтрансферазы, поскольку среднесуточное содержание 5-ОТ в ней под воздействием ксенобиотика не изменялось, а на активность конечного фермента биосинтеза мелатонина – гидроксииндол-О-метилтрансферазы. Существует мнение, что синтез мелатонина в пинеальной железе и суточные изменения его содержания напрямую зависят от уровня НА, синтезируемого не только в продолговатом мозгу, но и в СХЯ гипоталамуса [Cassone V. M., 1990; Lewin D. L., 1996]. Мелатонин, в свою очередь, через свои рецепторы в СХЯ гипоталамуса, где была обнаружена наиболее высокая их плотность [Анисимов В. Н., 1998], способен оказывать модулирующее влияние на нейромедиаторные системы, участвующие в формировании преовуляторного пика секреции ГнРГ [Gillette M. U., McArthur A. J., 1996]. Есть предположение, что воздействие мелатонина на СХЯ гипоталамуса играет стабилизирующую роль, предотвращая возможность нежелательного и быстрого ответа осциллятора на случайные изменения окружающей среды и воздействия неблагоприятных внешних факторов [Арушанян Э. Б., 1996]. Снижение уровня мелатонина в пинеальной железе в ночные часы может быть обусловлено либо связыванием ДМГ с α-адренорецепторами и, как следствие этого, нарушением симпатической иннервации пинеальной железы, либо непосредственным воздействием ксенобиотика на СХЯ гипоталамуса. Нельзя исключить и увеличение выброса под влиянием ДМГ мелатонина в кровь. Исходя из этого, можно предположить, что при утреннем введении ДМГ происходят серьезные нарушения, затрагивающие СХЯ гипоталамуса и пинеальную железу – основные центры, обусловливающие реализацию циркадианного сигнала, необходимого для запуска преовуляторного пика секреции ГнРГ. Наблюдаемое в нашей работе нарушение суточных ритмов содержания НА в МПО гипоталамуса, а также данные о том, что экзогенно введенные мелатонин и пептидные препараты, способные стимулировать синтез и (или) синхронизировать секрецию эндогенного мелатонина, восстанавливают эти ритмы или, возможно, предотвращают их нарушение, полностью подтверждают высказанные предположения. Необходимо отметить, что данный эффект мелатонина реализуется именно при вечернем его введении, 165 что обусловлено, вероятно, активацией мелатониновых МТ1-рецепторов в СХЯ гипоталамуса исключительно в ночное время суток [Gauer F. et al., 1994; Poirel V. J. et al., 2002]. Нарушения суточных ритмов содержания ДА в СВ-Арк гипоталамуса, которые, как было показано в нашем исследовании, зависят от освещенности, могут быть обусловлены также влиянием ДМГ на пути передачи сигнала о суточном периодизме от сетчатки глаза к дофаминергической системе СВ гипоталамуса. Тогда можно предположить, что сохранение нормальных ритмов содержания ДА в этой структуре вместе с аркуатными ядрами гипоталамуса при введении ксенобиотика на фоне инъекций мелатонина связано с воздействием пинеального гормона на сетчатку глаза. Известно, что рецепторы к мелатонину обнаружены не только в СХЯ и других ядрах гипоталамуса, но и в сетчатке глаза [Reppert S. M. et al., 1995; Levoye А. et al., 2006]. Следует также иметь в виду, что механизм действия ДМГ связан с образованием АФК и снижением активности антиоксидантных систем, а также учитывать тот факт, что гидразины способны ингибировать супероксиддисмутазу [Авакян А. К., 1990]. Образующиеся в процессе метаболизма ДМГ свободные радикалы способны повреждать ДНК, РНК и белки в различных органах и тканях, в том числе и в клетках головного и спинного мозга [Sasaki Y. F et al., 1998]. Поэтому нельзя исключить из рассмотрения и непосредственного воздействия ксенобиотика на экспрессию clock-генов, а также на различные белки и ферменты, участвующие в этом процессе. В этой связи представляется вполне закономерным восстанавливающий эффект мелатонина, который, как известно из данных литературы, способен инактивировать свободные радикалы, образующиеся в больших количествах при метаболизме гидразинов [Karbownik M. et al., 2000]. Однако помимо вышеописанных эффектов, связанных с нарушением функционирования нейромедиаторных систем и характеризующих воздействие ксенобиотика на циркадианный сигнал реализации репродуктивной функции, ДМГ способен оказывать и другие эффекты. Согласно данным литературы, некоторые нейротоксические эффекты гидразинов могут явиться следствием ингибирования пиридоксальзависимых ферментов, участвующих в метаболизме ряда нейромедиаторов [Moloney S. J., Prough R. A., 1983]. Так, например, известно, что гидразины ингибируют активность фермента синтеза ГАМК – декарбоксилазы глутаминовой кислоты. Предполагается, что ДМГ селективно ингибирует активность ферментов синтеза катехоламинов – ДОФА-декарбоксилазы и дофамин--гидроксилазы [Анисимов В. Н. и соавт., 1976]. Другой предполагаемый механизм заключается в снижении уровня 5-ОТ. Показано, что как минимум два производных гидразина ингибируют активность 5-окситриптофан-карбоксилазы, фермента, ответственного за превращение 5-окситриптофана в 5-ОТ [Анисимов В. Н. и соавт., 1976]. Доказано, что введение ДМГ не влияет на содержание 5-ОТ в пинеальной железе [Арутюнян А. В. и соавт., 2001], однако ранее в нашей лаборатории 166 было показано (см. подраздел 3.2), что серотонинергическая система СХЯ гипоталамуса в физиологических условиях реагирует на изменение фона половых стероидов, что в свою очередь, возможно, служит определенным сигналом для других нейромедиаторных систем различных гипоталамических структур, ответственных за реализацию репродуктивной функции. Следовательно, ослабление синтеза 5-ОТ в СХЯ гипоталамуса на стадии проэструса может привести к нарушению взаимодействия циркадианного и овариального сигналов, необходимых для формирования преовуляторного пика секреции ГнРГ. Также достаточно интересным представляется тот факт, что свой негативный эффект гидразины реализуют за достаточно короткий промежуток времени. Показано, что ДМГ уже через полчаса после введения блокирует синаптическую передачу возбуждения в симпатических ганглиях у крыс [Клименко Е. М., Шевелева В. С., 1985]. Следует также отметить, что помимо гормональных, мелатонин, как и другие биогенные амины, обладает также и нейротрансмиттерными функциями. Он обеспечивает возбудимость постсинаптических мембран и участвует в проведении нервного импульса [Осиповский С. А., Полесская М. М., 1982]. Для более полного понимания влияния ДМГ на нейромедиаторные системы в норме, а также на фоне введения мелатонина и пептидных биорегуляторов нами были рассмотрены изменения в среднесуточном содержании НА и ДА в МПО и СВ-Арк гипоталамуса (таблица 3.7). Ранее уже указывалось, что различие в среднесуточном содержании НА в МПО гипоталамуса между группой животных, получивших инъекцию ДМГ на фоне введения физиологического раствора, и группой животных, не получивших ее, обусловлено только разницей в уровне нейромедиатора в 9:30 ч ЦВ (см. подраздел 3.5), вследствие чего было высказано предположение о том, что в данном случае ксенобиотик не оказывает непосредственного влияния на активность дофамин--гидроксилазы, а отсутствие достоверных различий в среднесуточном содержании ДА в этой гипоталамической структуре между вышеупомянутыми группами доказывает отсутствие ингибирования под воздействием ДМГ другого фермента – ДОФА-декарбоксилазы. Мелатонин, эпиталамин и эпиталон, вероятнее всего, вызывают усиление реакции катехоламинергических систем на введение ксенобиотика путем компенсаторного повышения среднесуточного содержания нейромедиаторов в МПО гипоталамуса, что, возможно, обусловлено снижением активности МАО под действием ксенобиотика [Разыграев А. В., 2007]. Достаточно сложно судить о причинах подобных изменений, однако тот факт, что на фоне действия эпиталона при введении ДМГ происходит активация как норадрененергических, так и дофаминергических систем в СВ-Арк гипоталамуса, а также сохраняется нормальная суточная динамика содержания ДА при действии ксенобиотика, позволяет выдвинуть 167 предположение о том, что эпиталон оказывается достаточно эффективным при контроле механизмов, обусловливающих секрецию ГнРГ. Сильно же выраженная активация моноаминергических систем в МПО гипоталамуса при инъекции ДМГ на фоне введения эпиталамина, а также то, что последний при введении ксенобиотика способствует сохранению нормальной суточной динамики содержания в этой гипоталамической структуре НА, свидетельствует о том, что данный полипептидный препарат влияет преимущественно на процессы, связанные с синтезом ГнРГ. Последующие эксперименты показали, что введение пинеалона, но не мелатонина на фоне метиониновой нагрузки восстанавливает нарушенный суточный ритм содержания НА в МПО гипоталамуса. Так, уровень нейромедиатора в опытной группе достоверно (U=2; p<0,05) повышался и затем резко снижался во второй половине дня проэструса и составил: 29,32,0 нг/мг белка – в 5 ч ЦВ, 36,51,9 нг/мг белка – в 9:30 ч ЦВ и 24,81,7 нг/мг белка – в 11 ч ЦВ (рисунок 3.35). 45 40 нг/мг белка 35 * 30 25 ** * 20 15 10 5 0 ко нтроль L-метионин 5 ч ЦВ L-метионин + мелатонин 9:30 ч ЦВ L-метионин + пинеалон 11 ч ЦВ *, ** – различия с показателем в 9:30 ч циркадианного времени в той же группе достоверны (*p<0,05; **p<0,01; U-тест) Рисунок 3.35 – Суточная динамика содержания норадреналина в медиальной преоптической области гипоталамуса самок крыс на стадии проэструса после введения мелатонина и пинеалона на фоне перорального введения L-метионина (M±m, n=7-12) 168 Полученные нами данные о положительном влиянии пинеалона на суточную динамику содержания НА в МПО гипоталамуса в условиях экспериментальной ГГЦ подтверждают имеющиеся в литературе сведения о том, что данный биорегулятор обладает выраженными нейропротекторными свойствами, что проявляется в защите нервных клеток от воздействия окислительного стресса, развивающегося в результате метиониновой нагрузки [Arutjunyan A. et al., 2012]. Так, авторами данного исследования было показано, что пинеалон способен на разных уровнях защищать потомство крыс от токсического действия пренатальной ГГЦ. Обнаружено, что при введении пинеалона беременным самкам наблюдалось увеличение среднего веса потомства, выращенного в условиях пренатальной ГГЦ до контрольного уровня (22-25 г). Оценка пространственной ориентации крысят, то есть способности к обучению в тесте Морриса (поиск платформы при передвижении в бассейне с водой) выявила значительное улучшение под влиянием пинеалона возможностей их обучения и запоминания, нарушенных в результате перенесенной пренатальной ГГЦ. В экспериментах с нейронами, выделенными из мозжечка животных, рожденных от крыс, получавших пинеалон, установлены нейропротекторные свойства данного биорегулятора, обуславливающие устойчивость клеток к окислительному стрессу, индуцируемому перекисью водорода. Поскольку не было обнаружено соответствия между изменением количества мертвых клеток и повышением уровня АФК при индукции окислительного стресса, теми же авторами был сделан вывод о том, что защита клеток от гибели осуществляется пинеалоном не путем прямого ограничения продукции АФК. Возможно, нейропротекторный эффект пинеалона обусловлен механизмом, связанным с повышением устойчивости мембран, как это наблюдалось ранее в модельных экспериментах с осмотическим гемолизом эритроцитов крысы и человека, индуцируемым в присутствии пинеалона [Козина Л. С. и соавт., 2008б]. Нельзя исключить и того, что эффект пинеалона реализуется через увеличение устойчивости системы ферментов антиоксидантной защиты, как это было установлено в отношении беременных самок крыс [Козина Л. С., 2008]. Выявление антиоксидантной активности пинеалона указывает на вероятную роль данного препарата в механизмах его геро- и нейропротекторного действия, поскольку ослабление мощности антиоксидантных систем организма является одной из ведущих причин развития возрастной патологии и преждевременного старения, вызываемого различными неблагоприятными факторами внешней среды. В ряде работ было установлено, что возрастные изменения в формировании преовуляторного пика секреции ГнРГ и содержании гонадотропинов связаны со снижением активности нейромедиаторных систем, которые контролируют эти процессы, в частности ослаблением сигнала, поступающего от центрального циркадианного осциллятора, СХЯ гипоталамуса [Harney J. P. et al., 1996; Wise P. M. et al., 1997]. Обусловленные возрастом 169 изменения в содержании биогенных аминов в гипоталамических структурах, ответственных за синтез и секрецию ГнРГ, будет рассмотрен в следующем разделе. 3.9. Изменение катехоламинергической регуляции эстральных циклов у животных различных возрастных групп В результате исследования, проведенного на 1,5-месячных и 24-месячных животных, было установлено, что с возрастом, к 24 мес., когда половая цикличность полностью прекращается и животные находятся в состоянии персистирующего эструса или диэструса, содержание НА в МПО гипоталамуса достоверно (U=0; p<0,01) снижается (рисунок 3.36). 28 26 нг/мг белка 24 22 * 20 18 16 14 1,5-месячные 24-месячные * – различие между показателями достоверно (p<0,01; U-тест) Рисунок 3.36 – Возрастное изменение среднесуточного содержания норадреналина в медиальной преоптической области гипоталамуса самок крыс (M±m, n=6) Так, среднесуточное содержание нейромедиатора составило: 25,90,7 нг/мг белка – у 1,5-месячных животных и 19,71,0 нг/мг белка – у 24-месячных. В последующих экспериментах было установлено, что у 13-14-месячных животных, у которых еще встречались отдельные эстральные циклы, но при этом уже наблюдалось удлинение стадии диэструса и (или) эструса, нарушается нормальная суточная динамика 170 содержания НА в МПО гипоталамуса, характерная для нормально циклирующих 7-8-месячных самок с повышением содержания нейромедиатора к 9:30 ч ЦВ и снижением этого показателя к 11 ч ЦВ (рисунок 3.37). Так, содержание этого биогенного амина в МПО гипоталамуса у 13-14-месячных животных в трех исследованных временных точках составило: 23,3±0,8 нг/мг белка – в 5 ч ЦВ; 21,6±1,8 нг/мг белка – в 9:30 ч ЦВ и 21,3±1,6 нг/мг белка – в 11 ч ЦВ. Однако, несмотря на исчезновение суточного ритма содержания нейромедиатора в этой гипоталамической структуре у средневозрастных животных, его среднесуточное содержание достоверно не отличалось от такового у молодых животных: 21,8±0,8 нг/мг белка – у 7-8-месячных и 22,0±0,8 нг/мг белка – у 13-14-месячных (рисунок 3.38). 25 28 * 26 20 22 нг/мг белка нг/мг белка 24 20 18 15 10 16 5 14 5 9:30 11 циркадианное время, ч 7-8-мес. 13-14-мес. 0 7-8-месячные 13-14-месячные * – различие с показателем в 11 ч Рисунок 3.38 – Среднесуточное циркадианного времени в той же группе содержание норадреналина (7-8 мес.) достоверно (p<0,05; U-тест) Рисунок 3.37 – Суточная динамика содержания норадреналина в медиальной преоптической области гипоталамуса самок крыс различных в медиальной преоптической области гипоталамуса самок крыс различных возрастных групп на стадии проэструса (M±m, n=29-40) возрастных групп на стадии проэструса (M±m, n=9-16) Анализ данных о содержании ДА в СВ-Арк гипоталамуса у животных разного возраста показал, что суточный ритм содержания этого биогенного амина с повышением его уровня 171 в вечернее время, характерный для 7-8-месячных животных, у 13-14-месячных самок отсутствует (рисунок 3.39). Содержание нейромедиатора в этой гипоталамической структуре у средневозрастных животных составило: 4,4±0,4 нг/мг белка – в 5 ч ЦВ; 4,4±0,5 нг/мг белка – в 9:30 ч ЦВ и 3,9±0,4 нг/мг белка – в 11 ч ЦВ. Кроме того, согласно полученным нами данным, среднесуточное содержание этого биогенного амина у животных данной возрастной группы снижается. Так, уровень ДА в СВ-Арк гипоталамуса у 7-8-месячных животных составил: 7,3±0,6 нг/мг белка, а у 13-14-месячных – 4,3±0,3 нг/мг белка (U=116; p<0,001) (рисунок 3.40). 9 10 8 9 8 7 ** * 6 6 нг/мг белка нг/мг белка 7 5 4 3 * 5 4 3 2 1 2 0 5 9:30 11 циркадианное время, ч 7-8 мес 13-14 мес 1 0 7-8-месячные 13-14-месячные *, ** – различия с показателем в 5 ч * – различие между показателями достоверно циркадианного времени в той же группе (p<0,001; U-тест) достоверны (*p<0,05; **p<0,01; U-тест) Рисунок 3.40 – Среднесуточное Рисунок 3.39 – Суточная динамика содержание дофамина в срединном содержания дофамина в срединном возвышении с аркуатными ядрами возвышении с аркуатными ядрами гипоталамуса самок крыс различных гипоталамуса самок крыс различных возрастных групп на стадии проэструса возрастных групп на стадии проэструса (M±m, n=27-32) (M±m, n=8-13) Таким образом, естественное старение организма животного сопровождается нарушением характерной суточной динамики содержания НА и ДА, а также снижением среднесуточного содержания этих нейромедиаторов в областях гипоталамуса, ответственных за синтез и секрецию ГнРГ. 172 Данные литературы свидетельствуют о том, что в МПО, как и в других гипоталамических структурах, с возрастом происходит снижение уровня НА. Так, было показано, что у 8-10-месячных крыс среднесуточное содержание НА в этой структуре достоверно выше, чем у 4-5-месячных, а к 22-24 мес., когда половая цикличность полностью прекращается и животные находятся в состоянии персистирующего диэструса, среднесуточное содержание нейромедиатора в той же самой структуре мозга значительно снижается и становится даже ниже, чем у молодых животных [MohanКumar P. S., ThyagaRajan S., Quadri S. K., 1994; ThyagaRajan S., MohanKumar P. S., Quadri S. K., 1995]. Тем не менее, авторами этих исследований было отмечено, что, несмотря на высокий среднесуточный уровень НА у средневозрастных животных, у них уже прослеживаются нарушения в суточной динамике содержания этого нейромедиатора по сравнению с молодыми животными: пик содержания нейромедиатора сдвигается в сторону более поздних часов, а его амплитуда уменьшается. Помимо этого, известно, что именно в возрасте 8-12 мес. у крыс начинают происходить изменения в эстральном цикле и секреции ЛГ; так, наблюдается задержка во времени начала преовуляторного подъема уровня гормона в крови, сопровождающаяся достоверным уменьшением его амплитуды [MohanКumar P. S., ThyagaRajan S., Quadri S. K., 1994; Wise P. M., 1982; Wise P. M. et al., 2002]. Базальный уровень ЛГ у крыс в этом возрасте еще остается неизменным, и только затем, с возрастом, он постепенно снижается: наступает период, характеризующийся иррегулярной цикличностью, приводящей в итоге к ановуляции. Отмечено, что именно у старых (22-24 мес.) нециклирующих крыс наблюдается снижение среднесуточного содержания НА в МПО гипоталамуса, связанное, как предполагается, с изменением фона половых стероидов. Однако исчезновение суточных ритмов содержания некоторых нейромедиаторов в МПО и СВ гипоталамуса, согласно современным представлениям, следует в первую очередь связывать с ослаблением влияния суточного периодизма на моноаминергические системы, которое вызывается снижением в процессе старения функциональной активности СХЯ гипоталамуса [Wise P. M., 1999]. В нашем исследовании одним из объектов изучения стали 13-14-месячные крысы, у которых еще встречались отдельные эстральные циклы, но уже наблюдалось удлинение стадии диэструса и (или) эструса. На основании полученных нами данных, а также анализируя результаты исследований других авторов, можно предположить, что начальные этапы угасания репродуктивной функции самок стареющих крыс сопровождаются постепенным исчезновением характерной суточной динамики содержания НА в МПО гипоталамуса на стадии проэструса при сохранении в то же время нормального среднесуточного содержания этого нейромедиатора, что, вероятно, связано с нарушениями работы циркадианных центров в СХЯ гипоталамуса. Лишь в более позднем возрасте у крыс происходит возрастное изменение порога 173 чувствительности гипоталамуса к половым гормонам, ведущее затем к еще более выраженным изменениям в норадренергической системе, участвующей в регуляции процессов синтеза и секреции ГнРГ, а именно к значительному снижению среднесуточного содержания НА в МПО гипоталамуса, прекращению нормальной реализации репродуктивной функции и, как следствие, ановуляции и персистирующему диэструсу. В связи с полученными нами данными, не подтверждающими циркадианного характера суточного ритма содержания ДА в СВ-Арк гипоталамуса, можно выдвинуть предположение о том, что возрастные нарушения суточной динамики содержания ДА в этой структуре являются следствием ослабления передачи информации об уровне освещенности от сетчатки глаза. Однако, как уже было указано выше (см. подраздел 3.3), сравнительно недавно в литературе появились данные о циркадианном характере суточных изменений коэффициента 3,4-ДОФУК/ДА в СВ гипоталамуса овариэктомированных самок крыс [Sellix M. T., Freeman M. E., 2003], что, тем не менее, не является прямым подтвержением циркадианного характера суточных изменений содержания самого ДА в СВ гипоталамуса. Если все же суточный ритм содержания ДА в СВ с прилежащими к нему аркуатными ядрами гипоталамуса зависит от освещенности, то в таком случае нельзя исключить того, что ослабление в процессе старения передачи информации об уровне освещенности от сетчатки глаза к этой гипоталамической структуре, возможно, предшествует снижению функциональной активности СХЯ гипоталамуса, так как к 13-14 мес. у самок крыс среднесуточное содержание ДА в СВ-Арк гипоталамуса уже в значительной степени снижено по сравнению с 7-8-месячными животными. Исходя из того, что снижение среднесуточного содержания катехоламинов в СВ-Арк гипоталамуса происходит еще при сохранении нормального среднесуточного уровня нейромедиаторов в МПО гипоталамуса, можно предположить, что с возрастом нарушения процессов, связанных с секрецией ГнРГ, предшествуют процессам, уменьшающим его синтез. Предположение о том, что на начальных этапах старения снижается секреция ГнРГ, а по мере дальнейших возрастных изменений уменьшается и его синтез, высказывается также и некоторыми другими исследователями. Так, в частности, отмечается, что у старых животных с нерегулярными эстральными циклами содержание ГнРГ в гипоталамусе в 2,5 раза выше, а уровень ЛГ в крови значительно ниже, чем у молодых самок [Бабичев В. Н., 1981]. Рассматривая зависимость суточной динамики и среднесуточного содержания биогенных аминов, участвующих в процессах синтеза и секреции ГнРГ, от различных факторов, таких как фон половых стероидов в крови, работа циркадианного осциллятора и уровень освещенности, необходимо отметить, что в настоящее время значительная роль в гипоталамо-гипофизарной регуляции репродуктивной функции отводится пинеальному гормону мелатонину. Так, например, он влияет на порог чувствительности гипоталамических структур к эстрогенам. 174 Кроме того, общеизвестно, что мелатонин играет важную роль в формировании суточных и сезонных биоритмов [Pandi-Perumal S. R. et al., 2005]. Необходимо также отметить, что, в отличие от СХЯ гипоталамуса, пинеальная железа млекопитающих не является осциллятором, поэтому собственный ритм синтеза мелатонина в железе задается ритмом активности СХЯ гипоталамуса [Cassone V. M., 1990; Cassone V. M. et al., 1993; Korf H. W., Schomerus C., Stehle J. H., 1998]. Однако в этой цепи существует и обратная связь, осуществляемая посредством связывания мелатонина с его рецепторами в СХЯ гипоталамуса [Zitouni M., Pévet P., Masson-Pévet M. 1996; Poirel V. J. et al., 2002; Dardente H. et al., 2003]. Таким образом мелатонин способен корректировать эндогенные ритмы, генерируемые СХЯ гипоталамуса, в соответствии с ритмами освещенности. Имеются данные о влиянии мелатонина на различные звенья метаболизма в клетках СХЯ гипоталамуса [Rivera-Bermudez M. A. et al., 2003]. Воздействуя на СХЯ гипоталамуса и через них на нейромедиаторные системы, участвующие в процессах синтеза и секреции ГнРГ, мелатонин, вероятно, участвует в синхронизации преовуляторного пика секреции ГнРГ и гонадотропинов с 24-часовым околосуточным циклом [Rasmussen D. D., 1993; Chiba A., Akema T., Toyoda J. 1994]. Было показано, что in vitro мелатонин влияет на активность моноаминергических систем [Rasmussen D. D., 1993]. Также были получены данные о том, что пинеалэктомия у животных приводит к снижению среднесуточного содержания НА, ДА и 5-ОТ в гипоталамусе [Niles L. P., Brown G. M., Mishra R. K., 1983]. В настоящем исследовании не ставилась задача изучения конкретных механизмов, посредством которых пинеальная железа в норме влияет на моноаминергические системы гипоталамуса, принимающие участие в реализации преовуляторного пика секреции ГнРГ, так как для этого более правильным методическим подходом было бы проведение исследования с использованием пинеалэктомированных животных, однако достаточно интересным представлялось изучение влияния экзогенно введенного мелатонина, а также соединений, способных стимулировать синтез и (или) синхронизировать секрецию эндогенного мелатонина при предполагаемом снижении функциональной активности пинеальной железы, что наблюдается, например, при старении или при воздействии различных неблагоприятных экологических факторов, имеющих как химическую (ксенобиотики), так и физическую (световое загрязнение) природу. 175 3.10. Влияние мелатонина и эпиталона на динамику эстральных циклов у молодых и старых животных при различных световых режимах В проведенном нами исследовании впервые было уделено особое внимание изучению влияния различных световых режимов, в частности постоянного освещения, на такие показатели репродуктивной функции молодых, зрелых и стареющих животных, как средняя продолжительность эстрального цикла, количество эстральных циклов разной продолжительности и их процентное соотношение, процентное соотношение фаз эстрального цикла, относительное число животных с иррегулярными циклами. В группе крыс, находившихся в условиях стандартного фиксированного освещения и получавших мелатонин, существенных возрастных изменений в соотношении фаз эстрального цикла зафиксировано не было: соотношение стадий эструсы/диэструсы колебалось в пределах от 1/1,04 до 1/1,08 (таблица 3.10). Длинные эстральные циклы появлялись только в возрасте 11 мес. Короткие циклы сохранялись до 14-месячного возраста включительно. Возрастные изменения эстрального цикла у крыс, получавших мелатонин, появлялись, начиная с 17-месячного возраста, при этом достоверных изменений в продолжительности эстральных циклов на протяжении первых 14 мес. жизни не наблюдалось. В контрольной же группе животных достоверное (p<0,05) увеличение данного параметра было установлено на 3 мес. раньше. У самок, получавших эпиталон, соотношение фаз эстрального цикла изменялось в течение жизни от 1/1,17 до 1/0,80 (таблица 3.10). Достоверное увеличение продолжительности цикла наблюдалось, также как и в случае с мелатонином, в возрасте 17 мес., что на 3 мес. позже, чем в контрольной группе. Короткие эстральные циклы исчезали у экспериментальных животных только в 20-месячном возрасте, а длинные эстральные циклы появлялись в возрасте 14 мес. У всех животных до 11-месячного возраста сохранялись регулярные циклы (рисунок 3.41), а в возрасте 11 мес. во всех экспериментальных группах появлялись иррегулярные циклы, причем достоверных различий между группами не наблюдалось: иррегулярные циклы составляли: 19% в контрольной группе, 21% в группе животных, получавших мелатонин, и 17% в группе животных, получавших эпиталон. В дальнейшем, в 20-месячном возрасте, у крыс, получавших препараты, иррегулярные циклы встречались реже, чем в контрольной группе, однако достоверные различия отсутствовали. У животных контрольной группы, находившихся в условиях постоянного освещения, соотношение стадий эструсы/диэструсы менялось с возрастом от 1/1,6 до 1/0,7 в сторону 176 Таблица 3.10 – Возрастная динамика показателей эстральной функции у крыс, получавших мелатонин и эпиталон, при стандартном фиксированном освещении (n=6) Возраст (мес.) средняя продолжительность цикла (дни) 3 5 8 11 14 17 20 23 5,6±0,2 5,2±0,3 6,1±0,5 6,6±1,3 7,9±0,9 8,9±1,0 8,2±0,8 9,7±0,9 3 5 8 11 14 17 20 23 5,6±0,2 5,4±0,4 5,6±0,3 5,6±1,4 6,1±0,9 8,7±1,1 8,7±1,1 9,7±0,6 3 5 8 11 14 17 20 23 5,6±0,2 5,0±0,4 5,6±0,5 6,1±0,9 6,7±0,9 8,6±0,9 9,5±1,1 10,2±1,4 количество эстральных циклов разной продолжительности (%) короткие средние длинные Контроль 28 72 47* 53* 34* 53* 28* 67* 0* 67* 0 57* 0 40* 0 25* Мелатонин 28 72 45* 55* 40^ 60^ 31 64 30*^ 55*^ 0* 77*^ 0* 55*^^ 0* 34* Эпиталон 28 72 48* 52* 42^ 58^ 38^ 62^ 35*^ 37*^ 32*^ 49*^ 0* 74*^ 0* 56*^ соотношение фаз эстрального цикла (%) эструсы диэструсы 0 0 13* 13* 33* 43* 60* 75* 38 31 42 49 40 46 40 46 62 69 58 51 60 54 60 54 0 0 0^ 5 15*^ 23*^ 45*^^ 66* 38 49^^ 47 45 46 50 48 48 62 51^^ 53 55 54 50 52 52 0 0 0^ 0^ 8*^ 19*^ 26*^ 44*^ 38 46^^ 48 50 52 52 54** 55** 62 54^^ 52 50 48 48 46** 45** Примечание: – различия с соответствующим показателем в 3-месячном возрасте в той же группе достоверны (p<0,05; t-тест); *, ** – различия с соответствующим показателем в 3-месячном возрасте в той же группе достоверны (*p<0,01; **p<0,05; 2-тест); ^, ^^ – различия с соответствующим показателем в контрольной группе в том же возрасте достоверны (^p<0,01; ^^p<0,05; 2-тест). преобладания стадии эструса (таблица 3.11). В группе животных, получавших мелатонин, соотношение стадий эструсы/диэструсы менялось с возрастом от 1/1,6 до 1/1,3. Таким образом, колебания соотношения фаз эстрального цикла у разновозрастных крыс становились менее выраженными под воздействием мелатонина. Применение гормона пинеальной железы 177 35 29 30 25 25 % 19 20 21 20 17 контроль мелатонин 15 эпиталон 10 5 0 0 0 0 5 11 20 возраст, мес. Рисунок 3.41 – Количество иррегулярных циклов у самок крыс, получавших мелатонин и эпиталон, при стандартном фиксированном освещении (%, n=6) у животных, находившихся в условиях постоянного освещения, улучшало все исследуемые показатели эстрального цикла, замедляя тем самым развитие возрастных изменений. Достоверное (p<0,05) увеличение продолжительности эстрального цикла у животных, получавших мелатонин, наблюдалось лишь в 20-месячном возрасте, при этом длинные эстральные циклы появлялись, а короткие исчезали, когда животные достигали возраста 14 мес. У крыс, получавших эпиталон в условиях постоянного освещения, соотношение фаз эстрального цикла подвергалось наименьшему колебанию – от 1/1,6 у молодых животных до 1/1,4 у старых (таблица 3.11). Короткие циклы сохранялись до 14-месячного возраста, в этом же возрасте появлялись длинные эстральные циклы. Продолжительность эстрального цикла достоверно (p<0,05) увеличивалась только к 17-месячному возрасту. В отличие от контрольной группы, у крыс, получавших препараты, эстральные циклы средней продолжительности сохранялись даже в 23-месячном возрасте, тогда как в контрольной группе к 2-летнему возрасту у всех самок наблюдались только длинные эстральные циклы. Иррегулярные циклы в контрольной группе животных появлялись уже в возрасте 5 мес., тогда как иррегулярные циклы в экспериментальных группах появлялись намного позднее – в возрасте 11 мес. (рисунок 3.42). В этом возрасте иррегулярные циклы встречались с частотой всего 20% и 10% в экспериментальных группах против 42% в контрольной группе. В 20-месячном возрасте различия между группами становились все более значимыми, и значения, полученные в группах животных, получавших препараты, достоверно (p<0,01) отличались от таковых в контрольной группе. 178 Таблица 3.11 – Возрастная динамика показателей эстральной функции у крыс, получавших мелатонин и эпиталон, при постоянном освещении (n=6) Возраст (мес.) средняя продолжительность цикла (дни) 3 5 8 11 14 17 20 23 5,50,4 8,00,9 8,90,7 8,30,9 9,5±0,7 9,8±0,8 9,0±0,5 11,5±0,3 3 5 8 11 14 17 20 23 5,50,4 6,7±0,9 7,3±0,8 7,4±0,8 7,6±0,9 7,6±0,5 8,3±1,4 11,0±0,8 3 5 8 11 14 17 20 23 5,50,4 6,5±0,6 6,9±1,0 7,3±1,1 7,7±0,6 8,0±0,5 9,2±1,1 12,0±0,6 количество эстральных циклов разной продолжительности (%) короткие средние длинные Контроль 48 48 30* 55* 0* 61* 0* 50* 0* 29* 0* 25* 0* 16* 0* 0* Мелатонин 48 48 50^ 50^ 44^ 54^ 36^ 55^ 0* 48*^ 0* 44*^ 0* 32*^^ 0* 14*^ Эпиталон 48 48 61^ 49^ 57^ 43^ 40^ 60^ 0 83^ 0 64^ 0 42^ 0 26^ соотношение фаз эстрального цикла (%) эструсы диэструсы 4 20* 39* 50* 71* 75* 84* 100* 38 31 58 51 52 49 58* 57** 62 69 42 49 48 51 42* 43** 4 0^ 2^ 9^ 52*^ 56*^ 68*^^ 86*^ 38 41 43^^ 44 44 46 43^^ 43 62 59 57^^ 56 56 54 57^^ 57 4 0^ 0^ 0^ 17^ 36^ 58^ 74^ 38 50^ 49 50 47 42 46 42^^ 62 50^ 51 50 53 58 54 58^^ Примечание: – различия с соответствующим показателем в 3-месячном возрасте в той же группе достоверны (p<0,05; t-тест); *, ** – различия с соответствующим показателем в 3-месячном возрасте в той же группе достоверны (*p<0,01; **p<0,05; 2-тест); ^, ^^ – различия с соответствующим показателем в контрольной группе в том же возрасте достоверны (^p<0,01; ^^p<0,05; 2-тест). Согласно полученным нами данным, постоянное освещение способствует ускоренному старению репродуктивной системы, о чем свидетельствует тот факт, что нарушения эстрального цикла у крыс в условиях постоянного освещения наступают в более раннем возрасте по сравнению с животными, находившимися в условиях стандартного фиксированного освещения. 179 80 70 70 * 60 50 * 42 50 40 % 40 контроль мелатонин * 30 20 20 8 10 эпиталон * 10 * * 0 0 * 0 5 11 20 возраст, мес. * – различия с показателем в контрольной группе в том же возрасте достоверны (p<0,01; 2-тест) Рисунок 3.42 – Количество иррегулярных циклов у самок крыс, получавших мелатонин и эпиталон, при постоянном освещении (%, n=6) Как показывают результаты данного исследования, применение мелатонина и эпиталона при любом световом режиме замедляло в той или иной степени развитие возрастных изменений эстрального цикла. Короткие эстральные циклы сохранялись до более зрелого возраста, а длинные эстральные циклы и иррегулярные циклы появлялись позже, чем в контрольных группах животных, причем наибольшее влияние на эстральный цикл препараты оказывали в условиях постоянного освещения, то есть при световом режиме с нарушенным фотопериодизмом, что, возможно, связано с катехоламинергическим звеном регуляции эстральных циклов. Хорошо известно, что мелатонин способен корректировать эндогенные ритмы, генерируемые СХЯ гипоталамуса, в соответствии с ритмами, существующими во внешней среде. Воздействуя на СХЯ гипоталамуса и через них на нейромедиаторные системы, участвующие в процессах синтеза и секреции ГнРГ, мелатонин, вероятно, участвует в синхронизации преовуляторного пика секреции ГнРГ и гонадотропинов с 24-часовым околосуточным циклом [Rasmussen D. D., 1993; Chiba A., Akema T., Toyoda J. 1994]. Можно полагать, что подобным действием обладает также и эпиталон, способный стимулировать синтез и (или) синронизировать секрецию эндогенного мелатонина [Арутюнян А. В. и соавт., 2003]. Несмотря на то, что репродуктивная система является одной из систем организма, наиболее чутко реагирующих на изменение окружающей среды [Айламазян Э. К. и соавт., 180 1997], отмечается неспецифический характер ее реакции на воздействие различных химических и физических факторов. Это свидетельствует об определенных нарушениях центральных механизмов регуляции репродуктивной функции под действием неблагоприятных факторов внешней среды, причем наблюдаемые нарушения не зависят от природы этих факторов, что находит подтверждение в данной работе. Полученные нами результаты представляют еще одно доказательство важной роли пинеальной железы в формировании циркадианного сигнала, необходимого для реализации преовуляторного пика секреции ГнРГ, и указывают на защитное действие мелатонина и эпиталона, проявляющееся в способности сглаживать неблагоприятные экологические воздействия на репродуктивную функцию молодого, зрелого и стареющего женского организма. Исследование влияния нейротоксикантов на гипоталамическую регуляцию репродуктивной системы и изучение роли пептидных биорегуляторов и мелатонина в коррекции нарушений гипоталамической регуляции репродуктивной функции, вызванных воздействием ДМГ, выполнены автором совместно с Керкешко Г. О., Милютиной Ю. П. и др., что нашло отражение в совместных публикациях [Керкешко Г. О. и соавт., 2001; Arutjunyan A. V. et al., 2001; Арутюнян А. В. и соавт., 2001а; Арутюнян А. В. и соавт., 2005; Милютина Ю. П. и соавт., 2010; Арутюнян А. В. и соавт., 2012; Arutjunyan A. et al., 2012a; Korenevsky A. V. et al., 2012; Кореневский А. В. и соавт., 2013; Арутюнян А. В., Кореневский А. В., 2014; и др.]. 181 ЗАКЛЮЧЕНИЕ В последние десятилетия особо важное место в биологии занимает изучение влияния различных биоритмов на физиологические функции организма, в том числе и на репродуктивную функцию. У женщин процесс постепенного исчезновения ритма, который характерен для репродуктивной функции любого стареющего организма, проявляется как пременопаузальные нарушения регулярности, выраженности (снижение амплитуды) и длительности овариально-менструального цикла, тогда как у самок крыс при старении наблюдается рост частоты встречаемости пролонгированных и иррегулярных эстральных циклов, а также персистирующий эструс или диэструс. Результатом в том и ином случае является исчезновение ритма – либо менопауза у женщин, либо анэструс и исчезновение фертильности у самок крыс. Возможность коррекции процесса старения на уровне гипоталамуса, выражающейся в снижении порога чувствительности гипоталамических структур к тормозному действию эстрогенов, проводимых в настоящее время на животных, и рассматривается осуществляется преимущественно двумя путями: в исследованиях, а) посредством фармакологического воздействия на регуляторные нейромедиаторные (главным образом, моноаминергические и опиатные) проекции к гипоталамическим структурам, участвующим в регуляции овариальных циклов (МПО и СВ); б) посредством стимуляции функциональной активности пинеальной железы, которая достигается введением в организм продуцируемого ею гормона или препаратов, синтезированных на основе экстракта, полученного из пинеальной железы животных, а также благодаря воздействию на организм дозированной фотодепривации [Reiter R. J. et al., 1980; van der Beek E. M., 1996; Wise P. M. et al., 2002; Анисимов В. Н., 2003; Prata Lima M. F., Baracat E. C., Simões M. J., 2004; Иванов С. В. и соавт., 2004]. Не менее остро стоит и вопрос коррекции тех нарушений репродуктивной функции, которые вызываются различными неблагоприятными экологическими воздействиями, гелиогеофизическими и социальными факторами и которые в конечном итоге приводят к преждевременному старению женской репродуктивной системы. В настоящее время в передовых научных кругах развивается представление о том, что ГнРГ является своеобразной «молекулой антистарения», а гипоталамус – структурой, состояние которой определяет биологический возраст живого организма. Так, недавно группой американских ученых было показано, что введение нейрогормона в третий желудочек мозга старых мышей стимулировало нейрогенез и тормозило процессы, ассоциированные со старением [Zhang G. et al., 2013]. Однако причины изменений в нейрогуморальной системе, ведущих к прекращению циклических процессов в репродуктивной системе женского 182 организма в процессе ее естественного или преждевременного старения, до сих пор остаются малоизученными. Для всестороннего раскрытия этих причин необходимо изучение сложных, взаимодействующих между собой механизмов передачи информации через нервные стимулы, опосредованные нейромедиаторами скоординированный контроль различной над нормальной природы, реализацией которые осуществляют репродуктивной функции в онтогенезе. Известно, что для формирования преовуляторного пика секреции ГнРГ необходимо взаимодействие двух основных сигналов – гормонального, заключающегося в повышении в крови уровня половых гормонов в период, предшествующий овуляции, и циркадианного, ежедневно поступающего от СХЯ к МПО гипоталамуса и СВ. Оба этих сигнала передаются гонадолиберинергическим среди которых важная нейронам опосредованно роль принадлежит через нейромедиаторные катехоламинергическим и системы, опиодным нейромедиаторам. У молодых нормально циклирующих самок крыс гиперсекреция ГнРГ наблюдается во второй половине дня проэструса. Непосредственно перед этим происходит повышение стимулирующей активности указанных нейромедиаторных систем с одновременным снижением ингибирующих влияний, в вечерние же часы действие стимулирующих эффектов снижается, а ингибирующих – вновь возрастает [Gerhold L. M., Rosewell K. L., Wise P. M., 2005; Kriegsfeld L. J., Silver R., 2006; Kelly M. J., Rønnekleiv O. K., 2008; Разыграев А. В. и соавт., 2010]. Подобные изменения содержания нейромедиаторов необходимы для формирования преовуляторного пика секреции ГнРГ [Yin W., Gore A. C., 2006]. Известно, что вазопрессин [Palm I. F. et al., 1999; 2001] наряду с ВИП [Gerhold L. M., Rosewell K. L., Wise P. M., 2005] являются ключевыми нейромедиаторами, посредством которых осуществляется контроль процесса запуска преовуляторной гиперсекреции ГнРГ со стороны центрального осциллятора циркадианных ритмов СХЯ гипоталамуса. Проекции этих нейронов, тела которых расположены в СХЯ, направляются к кисспептинергическим и другим эстрогенчувствительным нейронам МПО гипоталамуса. В настоящем исследовании особое внимание было уделено выяснению роли моноаминергических систем в процессе формирования преовуляторного пика секреции ГнРГ. Нами было обнаружено, что в узком временном интервале, совпадающем по времени с завершением преовуляторной секреции этого нейрогормона, происходит снижение содержания НА в МПО гипоталамуса и повышение содержания ДА в СВ-Арк гипоталамуса. Предположение о стимулирующем действии НА на процесс формирования пика секреции ГнРГ уже высказывалось рядом других исследователей [MohanКumar P. S., ThyagaRajan S., Quadri S. K., 1994; ThyagaRajan S., MohanKumar P. S., Quadri S. K., 1995; Temel S. et al., 2002], которые склонны связывать суточный ритм секреции нейрогормона исключительно 183 с изменением уровня половых стероидов в крови. Однако в специально проведенном эксперименте, учитывающем различные стадии эстрального цикла экспериментальных животных, нами было установлено, что обнаруженные суточные изменения содержания НА в МПО гипоталамуса и ДА в СВ-Арк гипоталамуса не зависят от уровня половых стероидов; кроме того, в условиях световой депривации нами наблюдалось сохранение суточной динамики содержания НА в МПО гипоталамуса, что доказывает участие в ее формировании центрального осциллятора циркадианных ритмов, СХЯ гипоталамуса. Вместе с тем суточный ритм содержания ДА в СВ-Арк гипоталамуса при помещении животных в условия световой депривации исчезал, что указывает на возможную зависимость суточной динамики содержания этого нейромедиатора в рассматриваемой гипоталамической структуре от уровня освещенности. Вопрос о неодинаковом влиянии СХЯ гипоталамуса на суточную динамику содержания катехоламинов в различных структурах гипоталамуса на сегодняшний день не представляется достаточно ясным и нуждается в дальнейшем изучении. Кроме того, несмотря на то, что во второй половине дня проэструса нами не было обнаружено суточных ритмов содержания НА в СВ-Арк гипоталамуса и ДА в МПО гипоталамуса, изменение уровней этих нейромедиаторов в гипоталамических структурах подчинялось иной характерной зависимости и определялось стадией эстрального цикла, что, вероятно, связано с реализацией овариального сигнала запуска преовуляторного пика секреции ГнРГ. Совпадающее по времени с завершением пика секреции этого нейрогормона снижение содержания НА в МПО гипоталамуса, а также повышение его среднесуточного содержания в СВ-Арк гипоталамуса на стадии проэструса подтверждает высказываемые рядом исследователей предположения о том, что данный нейромедиатор стимулирует преовуляторную секрецию ГнРГ. Повышение же содержания ДА в СВ-Арк гипоталамуса в вечерние часы и снижение его среднесуточного содержания в МПО гипоталамуса на фоне повышенного уровня эстрадиола и прогестерона в крови указывает на ингибирующее действие этого нейромедиатора на процессы, связанные с синтезом и секрецией ГнРГ. Однако при этом необходимо учитывать, что, помимо выполнения собственно нейромедиаторной функции, ДА является также предшественником НА. Данное обстоятельство в известной степени осложняет интерпретацию полученных нами данных. Поэтому при изучении участия катехоламинов в центральной регуляции репродуктивной функции целесообразным представляется исследование активности дофамин--гидроксилазы. Установив механизмы гипоталамической регуляции репродукции, в частности определив роль в этом процессе катехоламинергических систем (что возможно выполнить только в эксперименте, причем исключительно на молодых половозрелых самках с нормально протекающим эстральным циклом), можно оценить причины нарушений половой цикличности как в процессе физиологического старения, так и в модели 184 преждевременного старения репродуктивной функции, вызванного воздействием нейротоксических соединений. В настоящем исследовании было установлено, что с возрастом начальные этапы угасания репродуктивной функции сопровождаются нарушением нормальной суточной динамики содержания НА в МПО гипоталамуса и ДА в СВ-Арк гипоталамуса. Ввиду того, что, как было показано, суточная динамика содержания НА в МПО гипоталамуса является следствием реализации циркадианного сигнала запуска преовуляторного пика секреции ГнРГ, ее изменение в процессе естественного старения, вероятно, связано с нарушением работы центрального осциллятора циркадианных ритмов, СХЯ гипоталамуса. Эти данные подтверждают предположение некоторых других исследователей о том, что в основе обусловленного возрастом нарушения суточной динамики содержания отдельных нейромедиаторов в гипоталамических структурах, участвующих в регуляции репродуктивной функции, лежит ослабление сигнала, поступающего от СХЯ гипоталамуса [Harney J. P. et al., 1996; Wise P. M. et al., 1997; Yin W., Gore A. C., 2006]. Это, в свою очередь, вызывает изменение амплитуды преовуляторного пика секреции ГнРГ и, следовательно, снижение секреции ЛГ. Помимо этого, при старении репродуктивной системы, в СХЯ гипоталамуса нарушается характерная суточная динамика содержания аргинина-вазопрессина [Hofman M. A., Swaab D. F. 1994], связанного с синтезом ВИП и цАМФ [Gerhold L. M., Rosewell K. L., Wise P. M., 2005], вследствие чего в этой структуре гипоталамуса нарушается образование самого нейромедиатора. По данным литературы, пересадка старым крысам эмбриональной ткани, содержащей СХЯ гипоталамуса, восстанавливает характерные для молодых животных суточные ритмы содержания катехоламинов [Cai А. et al., 1997]. В представленном нами экспериментальном исследовании показано, что нарушение суточной динамики содержания НА в МПО гипоталамуса самок крыс происходит еще при сохранении его нормального среднесуточного уровня, снижение которого отмечается в более позднем возрасте, когда половая цикличность полностью прекращается. Анализ содержания НА и ДА в исследованных структурах гипоталамуса подтверждает предположение о том, что с возрастом снижение секреции ГнРГ предшествует нарушению синтеза этого нейрогормона. Известно, что возрастное ослабление функциональной активности центрального циркадианного осциллятора сопровождается нарушением суточных ритмов активности моноаминергических и опиоидергических систем гипоталамуса [Wise P. M. et al., 1997]. Эти две нейромедиаторные системы выступают антагонистами друг друга и при этом тесно взаимодействуют: повышение активности одной из них приводит к снижению активности другой, и наоборот [Przekop F., Tomaszewska D., 1996]. Также была доказана зависимость от центрального осциллятора циркадианных ритмов активности опиоидной 185 β-эндорфинергической системы медиобазального гипоталамуса [Jamali K. A., Tramu G., 1999]. Данные, полученные в нашем исследовании, позволяют предположить вовлеченность центрального циркадианного осциллятора в процесс формирования суточных ритмов активности моноаминергических систем в гипоталамических структурах, участвующих в регуляции овариальных циклов. Однако для более убедительного подтверждения этой гипотезы необходимо проведение дальнейших исследований, проводимых на экспериментальных моделях, позволяющих изучать суточные изменения содержания этих нейромедиаторов при неизменном уровне половых стероидов в крови, поскольку изменение их уровня может оказывать модулирующее воздействие на исследуемые суточные ритмы содержания моноаминов в гипоталамических структурах [Бабичев В. Н., 1995; 2005]. В качестве таких моделей можно использовать овариэктомированных животных (постоянный низкий уровень половых стероидов в крови), а также овариэктомированных животных, обработанных эстрогеном (постоянное содержание половых стероидов в крови). Кроме того, определенный интерес представляет исследование суточной динамики содержания катехоламинов в гипоталамусе на разных стадиях эстрального цикла у интактных животных, находящихся в условиях постоянного освещения и световой депривации. Известно, что с возрастом мелатонинобразующая функция пинеальной железы ослабевает. В последние десятилетия подобное снижение функциональной активности исследователи все реже ассоциируют со структурными изменениями, происходящими в железе. Исследования, проведенные в 90-х годах прошлого столетия, свидетельствуют о том, что снижение продукции мелатонина может являться следствием нарушения связи пинеальной железы с СХЯ гипоталамуса [Henden Т. et al., 1992; Dawson D., Armstrong S. M., 1996]. Известно, что пинеальная железа играет модулирующую роль в регуляции репродуктивной функции женского организма. Снижение функциональной активности пинеальной железы как гуморального эффектора циркадианной системы может в свою очередь вызывать рассогласование основных сигналов, необходимых для реализации репродуктивной функции [Rohr U. D., Herold J. 2002]. Введение мелатонина экспериментальным животным, по некоторым данным, способно устранять нарушения гипоталамо-гипофизарного звена регуляции репродуктивной функции, наблюдаемые в процессе старения [Li S., Givalois L., Pelletier G., 1997]. Данные литературы свидетельствуют о том, что потребление мелатонина в вечерние и ночные часы синхронизирует циркадианные ритмы в СХЯ гипоталамуса [Slotten H. A., Pitrovsky B., Pévet P., 1999]. Нами было установлено, что вечернее введение экспериментальным животным мелатонина восстанавливает суточную динамику содержания НА в МПО и ДА в СВ-Арк гипоталамуса, нарушение которой происходит на фоне введения 186 инициирующего первые признаки угасания репродуктивной функции энтеротропного канцерогена и нейротоксического ксенобиотика ДМГ. В последние три-четыре десятилетия научное сообщество проявляет большой интерес к мелатонину, появилось множество работ, посвященных его антиоксидантным [Reiter R. J., Manchester L. C., Tan D.-X., 2010], антиканцерогенным и геропротекторным свойствам [Анисимов В. Н., Забежинский М. А., Попович И. Г., 2000; Anisimov V. N., 2001], а также его участию в формировании циркадианных ритмов [Sletten T. L. et al., 2010]. Было установлено, что эффекты мелатонина, опосредуемые через его рецепторы, сильно зависят от амплитуды ночного пика его секреции, а также от продолжительности его повышенного уровня в крови на протяжении суток [Комаров Ф. И., Малиновская Н. К., Рапопорт С. И., 2000]. Любое отклонение от нормальных физиологических значений вышеуказанных показателей может привести к нежелательным последствиям. Экзогенное введение гормона пинеальной железы в условиях, когда ее функция снижена, что наблюдается при старении, а также при различных заболеваниях, приводит к положительным результатам благодаря восстановлению нормального уровня гормона в крови [Pierpaoli W. et al., 1997; Pierpaoli W., 2007]. Однако применение мелатонина на фоне его нормального синтеза в организме может повлечь ряд негативных последствий по причине превышения его уровня над физиологическим уровнем в крови [Guardiola-Lemaitre В., 1997]. Так, ранее в нашей лаборатории было показано, что экзогенно введенный мелатонин проявлял антигонадотропный эффект у здоровых нормально циклирующих крыс, вызывая снижение содержания и десинхронизацию суточных ритмов содержания НА и ДА в гипоталамических структурах, участвующих в реализации репродуктивной функции [Арутюнян А. В. и соавт., 2003]. Поэтому в настоящем исследовании помимо собственно мелатонина также были использованы соединения, способные стимулировать его синтез и (или) синхронизировать его секрецию в организме, не оказывая при этом побочных эффектов. Изучение воздействия пептидных биорегуляторов, препаратов пинеальной железы эпиталамина и эпиталона, на суточные ритмы, нарушенные под воздействием однократной инъекции нейротоксического ксенобиотика ДМГ, показало восстановление характерной суточной динамики содержания НА и ДА в гипоталамусе. Полученные результаты свидетельствуют о важной роли пинеальной железы в формировании циркадианного сигнала, необходимого для реализации преовуляторного пика секреции ГнРГ. Исследование воздействия двухмесячной ингаляции толуола на моноаминергические системы гипоталамуса подтвердило результаты наших предыдущих исследований, обнаруживших нейротоксический эффект этого ксенобиотика на нейромедиаторные системы, ответственные за процессы синтеза и секреции ГнРГ [Арутюнян А. В., Степанов М. Г., Кореневский А. В., 1998]. Наблюдаемое нами повышение содержания биогенных аминов 187 в гипоталамусе после воздействия толуола, по-видимому, свидетельствует о защитной реакции нейронов, позволяющей поддерживать нормальную моноаминергическую передачу в условиях снижения под влиянием ксенобиотика функциональной способности постсинаптических нейронов [Iizumi Н. et al., 1995]. Эксперимент по изучению воздействия другого ксенобиотика, ДМГ, показал, что моноаминергические системы гипоталамуса, принимающие участие в регуляции овариальных циклов, являются чувствительными даже к однократному введению данного нейротоксиканта. Как показали наши исследования, хроническая ингаляция толуола и острое воздействие ДМГ также приводили к исчезновению обнаруженной в контрольных группах животных суточной динамики содержания биогенных аминов в исследованных гипоталамических структурах. Нарушение суточных ритмов содержания НА и ДА происходило даже тогда, когда под влиянием ксенобиотиков не наблюдалось значительного изменения среднесуточного содержания этих нейромедиаторов. Полученные нами результаты в совокупности с данными литературы свидетельствуют о том, что характер суточной динамики содержания биогенных аминов в структурах гипоталамуса, участвующих в регуляции овариальных циклов, является более чувствительным маркером ранних нарушений гипоталамической регуляции репродуктивной функции, вызванных острым или хроническим воздействием различных нейротоксикантов (собственные данные), а также процессами старения [Wise P. M. et al., 1997], чем показатель среднесуточного содержания тех же нейромедиаторов в гипоталамусе. Воздействие нейротоксических ксенобиотиков на моноаминергическое звено регуляции репродуктивной функции, приводящее к нарушению характерной суточной динамики и к изменению среднесуточного содержания биогенных аминов, оказалось для нас ожидаемым результатом. Вместе с тем несколько неожиданным явился тот факт, что потребление L-метионина, также как и воздействие обладающих нейротоксическими свойствами толуола и ДМГ, вызывало схожее нарушение наблюдаемых в контроле суточных изменений содержания катехоламинов в структурах гипоталамуса, ответственных за синтез и секрецию ГнРГ. Можно предположить, что, как и в случае с экзогенными ксенобиотиками, исчезновение суточной динамики содержания НА и ДА в использованной нами модели ГГЦ связано с изменениями в работе центрального осциллятора циркадианных ритмов и является характерным начальным признаком нарушений нормального функционирования репродуктивной функции. Полученные данные указывают на то, что повышенный уровень ГЦ в крови вызывает нарушение катехоламинергической регуляции репродуктивной функции, влияя на норадренергическую систему в МПО гипоталамуса и дофаминергическую систему в СВ-Арк 188 гипоталамуса, что свидетельствует о негативном воздействии ГГЦ на процессы синтеза и секреции ГнРГ, находящиеся под контролем этих нейромедиаторных систем. Характерно, что при ГГЦ защитным эффектом при наблюдаемых нарушениях обладает пинеалон, также как и пептидные биорегуляторы эпиталамин и эпиталон относящийся к числу геропротекторов. Результаты настоящего исследования дают основание рассматривать ГГЦ в качестве фактора, одним из проявлений нейротоксичности которого является нарушение гипоталамической регуляции репродуктивной функции, что ставит ГЦ в один ряд с ранее изученными в нашей лаборатории нейротоксическими ксенобиотиками. Введение пинеалона в условиях экспериментальной ГГЦ, а также мелатонина и эпиталона в условиях постоянного освещения позволило получить дополнительное подтверждение наличия реципрокных взаимоотношений между пинеальной железой и СХЯ гипоталамуса, способных частично компенсировать нарушения центрального звена регуляции репродуктивной функции, вызываемые как экзогенными, так и эндогенными неблагоприятными факторами (рисунок 4.1). МПО – медиальная преоптическая область гипоталамуса; СХЯ – супрахиазматические ядра гипоталамуса; СВ-Арк – срединное возвышение с аркуатными ядрами гипоталамуса Рисунок 4.1 – Возможные механизмы нарушений гипоталамической регуляции репродуктивной функции под воздействием нейротоксикантов и их коррекция с помощью мелатонина 189 Как показали наши исследования, в основе повреждающего действия как экзогенных (ксенобиотики), так и эндогенных (гипергомоцистеинемия) неблагоприятных факторов, вызывающих преждевременное старение репродуктивной функции, лежит взаимосвязь между содержанием в гипоталамусе биогенных аминов, вовлеченных в регуляцию синтеза и секреции ГнРГ, и избыточным образованием в процессе метаболизма выбранных для настоящего исследования нейротоксикантов высокотоксичных свободных радикалов (азоанион-радикалы, карбониевый ион СН3+, гидроксиланион-радикал, супероксиданионрадикал) [Авакян А. К., 1990; Mattia C. J., Adams J. D. Jr., Bondy S. C., 1993; Mattia C. J., Ali S. F., Bondy S. C., 1993; Perna A. F. et al., 2003; Liu C. C. et al., 2009], воздействующих на нейромедиаторные системы и снижающих активность антиоксидантных систем [Tabatabaie T., Floyd R. A., 1996; Upchurch G. R. Jr. et al., 1997; Bayadas G. et al., 2006; Hooijmans C. R., Blom H. J., 2009]. Так, нарушение суточной динамики содержания биогенных аминов в МПО гипоталамуса под воздействием хронической ингаляции толуола сопровождалось исчезновением суточной динамики образования АФК в этой гипоталамической структуре. В то же время однократное введение ДМГ вызывало исчезновение в этой области гипоталамуса нормальной суточной динамики содержания ДА и образования АФК. Таким образом, в МПО гипоталамуса при различных воздействиях, также как и в нормальных физиологических условиях, наблюдалась взаимосвязь между содержанием биогенных аминов и свободнорадикальными процессами. Несмотря на то, что механизм нейротоксического действия толуола и ДМГ связан с образованием свободных радикалов, ни ингаляция ксенобиотика, ни введение канцерогена не вызывали значительного повышения образования АФК в МПО гипоталамуса. Этот факт, по-видимому, дает дополнительное подтверждение того, что обнаруженные при различных воздействиях изменения в образовании АФК в МПО гипоталамуса отражают изменения в содержании биогенных аминов, а не обусловлены индукцией свободных радикалов при метаболизме ксенобиотиков. Если суточная динамика образования АФК в МПО гипоталамуса обусловлена суточными изменениями активности метаболизирующей катехоламины МАО-А, то в таком случае следует предполагать, что нарушение суточных ритмов генерации АФК под воздействием ксенобиотиков представляет собой следствие нарушения суточных ритмов активности этой формы моноаминоксидазы. Суточные изменения активности МАО-А в переднем гипоталамусе самцов крыс исчезали при помещении экспериментальных животных в условия световой депривации [Kamase Н., 1980], поэтому исчезновение суточных ритмов образования АФК при различных воздействиях могло явиться следствием нарушения механизмов передачи фотопериодической информации от сетчатки глаза к моноаминергическим системам гипоталамуса. 190 Полученные нами данные позволяют предположить, что суточные ритмы генерации АФК в МПО гипоталамуса связаны с суточными изменениями в содержании биогенных аминов в этой богатой моноаминергическими окончаниями гипоталамической структуре. Вместе с тем уровень генерации АФК может рассматриваться как интегральный показатель, не только свидетельствующий об изменении активности моноаминергических систем, но и дающий представление об интенсивности множества различных биохимических процессов, связанных с образованием АФК. Таким образом, изучение суточной динамики образования АФК в структурах гипоталамуса, ответственных за регуляцию эстральных циклов, может служить маркером нормального функционирования механизмов передачи к этим структурам информации о суточном периодизме, а также нарушения таких механизмов при различных неблагоприятных воздействиях на организм. Данные об увеличении уровня общего ГЦ в плазме крови при пероральном введении L-метионина согласуются с полученными нами результатами о содержании продуктов перекисного окисления липидов (ТБК-реактивных продуктов), а также нитритов в сыворотке крови, при этом влияние потребления L-метионина на уровень Fe2+/H2O2-индуцированной хемилюминесценции в сыворотке крови в ходе экспериментов нами обнаружено не было. Так, при исследовании в сыворотке крови уровня вторичного продукта перекисного окисления липидов малонового диальдегида было обнаружено его достоверное повышение при метиониновой нагрузке, указывающее на активацию перекисных процессов в крови. Аналогичные данные были описаны нами ранее, причем было показано, что наиболее заметное повышение уровня малонового диальдегида наблюдалось во временном интервале с 9:30 ч до 10:10 ч ЦВ [Арутюнян А. В. и соавт., 2012]. В настоящем исследовании нами также была выявлена суточная динамика содержания нитритов в сыворотке крови контрольных животных, с достоверным повышением уровня этого показателя к 11 ч ЦВ. Пероральное введение L-метионина приводило к достоверному снижению содержания нитритов в вечернее время с нарушением их нормальной суточной динамики. Снижение уровня нитритов может быть обусловлено усилением взаимодействия с супероксиданион-радикалом и косвенно свидетельствовать об интенсификации процесса образования пероксинитрита в этих условиях. В основе же нейропротекторного действия исследованных нами пептидных биорегуляторов может лежать их способность стимулировать синтез и (или) синхронизировать секрецию эндогенного мелатонина [Анисимов В. Н., 2003, 2005; Гончарова Н. Д. и соавт., 2003; Долгов Г. В., Цвелев Ю. В., Малинин В. В., 2004; Коркушко О. В. и соавт., 2006; Гончарова Н. Д., Хавинсон В. Х., Лапин Б. А., 2007; Козина Л. С., 2009; Хавинсон В. Х., 2009], который, как известно, является самым эффективным природным антиоксидантом. 191 Полученные данные гипоталамического свидетельствуют звена регуляции о характерной овариальных неспецифической циклов, которая реакции выражается в преждевременном старении репродуктивной функции, вызываемом различными негативными воздействиями на организм, и ставят вопрос о поиске эффективных комбинированных фармакологических препаратов, способных в условиях различных патологий компенсировать нарушение не только овариального, но и циркадианного сигнала, участвующего в реализации репродуктивной функции. Таким образом, в настоящем диссертационном исследовании было, во-первых, доказано участие моноаминергическим систем гипоталамуса в формировании неспецифической реакции организма самок крыс на воздействие неблагоприятных экологических факторов; во-вторых, выявлены наиболее ранние признаки возрастного и преждевременного угасания репродуктивной функции и механизмы, лежащие в его основе; и, в-третьих, обнаружена способность гормона пинеальной железы мелатонина и пептидных биорегуляторов, способствующих его синтезу и (или) секреции, сглаживать неблагоприятные экологические воздействия на организм посредством восстановления нарушенных механизмов передачи информации о суточном периодизме нейрональным структурам, участвующим в реализации репродуктивной функции. 192 ВЫВОДЫ 1. У самок крыс в структурах гипоталамуса, ответственных за регуляцию синтеза и секреции гонадолиберина, обнаружены суточные ритмы содержания биогенных аминов. В медиальной преоптической области наблюдается не зависящий от стадии эстрального цикла суточный ритм содержания норадреналина с выраженным снижением его уровня в узком временном интервале с 9:30 часов до 11 часов циркадианного времени. Суточный ритм содержания дофамина характерен для срединного возвышения с аркуатными ядрами, причем он не зависит от стадии эстрального цикла и характеризуется повышением уровня содержания нейромедиатора. Содержание норадреналина в срединном возвышении с аркуатными ядрами и дофамина в медиальной преоптической области зависит от стадии эстрального цикла, определяемой уровнем половых гормонов в крови. 2. Суточный ритм содержания норадреналина в медиальной преоптической области, в отличие от суточного ритма содержания дофамина в срединном возвышении с аркуатными ядрами, сохраняется при световой депривации самок крыс и имеет циркадианную природу. 3. При остром и хроническом воздействии на самок крыс нейротоксических ксенобиотиков (1,2-диметилгидразин, толуол) происходит нарушение суточных ритмов содержания норадреналина в медиальной преоптической области и дофамина в срединном возвышении с аркуатными ядрами. Введение животным 1,2-диметилгидразина вызывает снижение среднесуточного содержания гонадолиберина в медиальной преоптической области и, особенно, в срединном возвышении с аркуатными ядрами, сопровождающееся снижением среднесуточного содержания норадреналина в медиальной преоптической области и увеличением среднесуточного содержания дофамина в срединном возвышении с аркуатными ядрами. 4. Ежедневное одномесячное пероральное введение самкам крыс L-метионина вызывает нарушение суточной динамики содержания норадреналина в медиальной преоптической области и дофамина в срединном возвышении с аркуатными ядрами. Метиониновая нагрузка также вызывает увеличение среднесуточного содержания норадреналина в медиальной преоптической области. 5. В медиальной преоптической области обнаружены суточные изменения уровня генерации активных форм кислорода, противоположные по направленности суточным ритмам содержания биогенных аминов в той же структуре. Нарушение суточных ритмов содержания биогенных аминов под воздействием нейротоксических ксенобиотиков 193 (1,2-диметилгидразин, толуол) сопровождается исчезновением суточной динамики генерации активных форм кислорода. Метиониновая нагрузка вызывает повышение уровня малонового диальдегида в крови и нарушает обнаруженную в ней суточную динамику содержания нитритов. 6. При использовании пептидных биорегуляторов с целью коррекции нарушенных под влиянием нейротоксических воздействий (1,2-диметилгидразин, метиониновая нагрузка) суточных ритмов содержания биогенных аминов в гипоталамусе самок крыс пинеалон и эпиталамин, восстанавливая нормальную суточную динамику содержания норадреналина, наиболее эффективно действуют на уровне медиальной преоптической области. Эпиталон оказывает протекторное действие в срединном возвышении с аркуатными ядрами, сохраняя суточный ритм содержания дофамина. Мелатонин восстанавливает нормальную суточную динамику содержания норадреналина и дофамина в обеих гипоталамических структурах при воздействии 1,2-диметилгидразина, но оказывается не столь эффективным при метиониновой нагрузке. 7. Начальные этапы сопровождаются угасания с возрастом репродуктивной функции самок крыс постепенным исчезновением нормальной суточной динамики содержания норадреналина в медиальной преоптической области на фоне сохранения среднесуточного уровня этого нейромедиатора, снижение которого отмечается позднее, к 22-24 месяцам. Снижение среднесуточного содержания дофамина в срединном возвышении с аркуатными ядрами происходит раньше, уже в 13-14-месячном возрасте, одновременно с нарушением суточного ритма содержания этого нейромедиатора. 8. Постоянное освещение способствует ускоренному старению репродуктивной системы самок крыс: нарушения эстрального цикла у исследуемых животных в этих условиях наступают в более раннем возрасте по сравнению с животными, находившимися в условиях стандартного фиксированного освещения. Применение мелатонина и эпиталона при любом световом режиме замедляет в той или иной степени развитие возрастных изменений эстрального цикла, причем наибольшее влияние на эстральный цикл препараты оказывают в условиях постоянного освещения. 194 ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ Полученные результаты о протекторном действии мелатонина и пептидных биорегуляторов (пинеалон, эпиталамин, эпиталон) при нарушении регуляции репродуктивных циклов создают предпосылки использования данных соединений для коррекции возрастных изменений репродуктивной функции, а также нарушений тонких механизмов регуляции репродукции, вызванных различными нейротоксическими факторами освещением. СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ Арк – аркуатные ядра АФК – активные формы кислорода ВИП – вазоактивный интестинальный пептид ГАМК – -аминомасляная кислота ГГЦ – гипергомоцистеинемия ГВК – гомованилиновая кислота ГнРГ – гонадотропин-рилизинг-гормон, гонадолиберин ГЦ – L-гомоцистеин ДА – дофамин ДМГ – 1,2-диметилгидразин ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота 3,4-ДОФА – L-3,4-диоксифенилаланин 3,4-ДОФУК – 3,4-диоксифенилуксусная кислота КОМТ – катехол-О-метилтрансфераза ЛГ – лютеинизирующий гормон МАО – моноаминооксидаза МПО – медиальная преоптическая область МПЯ – медиальное преоптическое ядро НА – норадреналин 5-ОИУК – 5-оксииндолилуксусная кислота 5-ОТ – 5-окситриптамин (серотонин) РНК – рибонуклеиновая кислота и избыточным 195 СБ – серый бугор СВ – срединное возвышение СВ-Арк – срединное возвышение с аркуатными ядрами СОКП – сосудистый орган концевой пластинки СХЯ – супрахиазматические ядра ПДК – предельно допустимая концентрация ФСГ – фолликулостимулирующий гормон цАМФ – циклоаденозинмонофосфат цГМФ – циклогуанозинмонофосфат ЦВ – циркадианное время ЦНС – центральная нервная система NMDA – N-метил-D-аспарагиновая кислота 196 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Авакян, А.К. Новые молекулярные критерии оценки токсического действия производных гидразина. Активные формы кислорода как ключевые соединения в механизме токсичности / А.К.Авакян // Фармакол. и токсикол. – 1990. – Т. 53, №1. – С. 70-73. 2. Агаджанян, Н.А. Хроноструктура репродуктивной функции / Н.А.Агаджанян., И.В.Радыш, С.И.Краюшкин. – М.: КРУК, 1998. – 248 с. 3. Айламазян, Э.К. Репродуктивное здоровье женщины как критерий биоэкологической оценки окружающей среды / Э.К.Айламазян, Т.В.Беляева, Е.Г.Виноградова, И.А.Шутова // Вестн. Росс. асс. акушеров-гинекологов. – 1997. – №3. – С. 72-78. 4. Анисимов, В.Н. Изменения уровня биогенных аминов в головном мозге лабораторных животных и человека в процессе развития и старения / В.Н.Анисимов // Успехи физиол. наук. – 1979. – Т. 10, №1. – С. 54-75. 5. Анисимов, В.Н. Физиологические функции эпифиза / В.Н.Анисимов // Росс. физиол. журн. им. И.М. Сеченова. – 1997. – Т. 83, №8. – С. 1-13. 6. Анисимов, В.Н. Роль эпифиза (шишковидной железы) в механизмах старения / В.Н.Анисимов // Успехи геронтол. – 1998. – №2. – С. 74-81. 7. Анисимов, В.Н. Средства профилактики преждевременного старения (геропротекторы) / В.Н.Анисимов // Успехи геронтол. – 2000. – Т. 4. – С. 55-74. 8. Анисимов, В.Н. Молекулярные и физиологические механизмы старения / В.Н.Анисимов. – СПб.: Наука, 2003. – 468 с. 9. Анисимов, В.Н. Некоторые итоги экспериментальных исследований влияния эпиталона на старение, продолжительность жизни и канцерогенез: тез. докл. 2-го рос. симп. по химии и биологии пептидов (Санкт-Петербург, 2005) / В.Н.Анисимов. – СПб., 2005 – 160 с. – С. 10. 10. Анисимов, В.Н. Молекулярные и физиологические механизмы старения: в 2 т. / В.Н.Анисимов. – 2-е изд., перераб. и доп. – СПб.: Наука. – 2008. – 2 т. 11. Анисимов, В.Н. Мелатонин как геропротектор и антиканцероген. Перспективы применения в клинике / В.Н.Анисимов. – СПб.: ЭлПринт, 2014 – 56 с. 12. Анисимов, В.Н. Распределение канцерогенных диалкилгидразинов-3Н в нейроэндокринной системе и их антигонадотропный эффект у крыс / В.Н.Анисимов, М.А.Азарова, А.Ю.Дмитриевская, А.Я.Лихачев, А.С.Петров, Я.Д.Шапошников // Бюлл. экспер. биол. – 1976. – Т. 82, №12. – С. 1473-1475. 13. Анисимов, В.Н. Старение женской репродуктивной системы и мелатонин / В.Н.Анисимов, И.А.Виноградова. – СПб.: Система. – 2008. – 44 с. 197 14. Анисимов, В.Н. Мелатонин угнетает канцерогенез толстой кишки, индуцируемый 1,2-диметилгидразином у крыс: эффекты и возможные механизмы / В.Н.Анисимов, М.А.Забежинский, И.Г.Попович // Вопр. онкол. – 2000. – Т. 46, №2. – С. 136-148. 15. Анисимов, В.Н. Влияние энтеротропного канцерогена 1,2-диметилгидразина на уровень биогенных аминов в гипоталамусе крыс / В.Н. Анисимов, В.К.Поздеев, А.Ю.Дмитриевская, Г.М.Грачева, А.П.Ильин, В.М.Дильман // Бюлл. экспер. биол. – 1976a. – Т. 82, №11. – С. 1359-1361. 16. Анисимов, В.Н. Функция эпифиза при раке и старении / В.Н.Анисимов, Р.Д.Рейтер // Вопр. онкол. – 1990. – Т. 36. – С. 259-268. 17. Аржанова, О.Н. Гипергомоцистеинемия у женщин с привычным невынашиванием / О.Н.Аржанова, Е.А.Алябьева, Т.Н.Шляхтенко // Русский мед. журн. – 2010. – Т. 18, №4. – С. 168–170. 18. Арзуманян, Е.С. Механизмы токсического действия гомоцистеиновой кислоты на нейрональные клетки / Е.С.Арзуманян, М.С.Степанова // Нейрохимия. – 2010. – Т. 27, №3. – С. 251-256. 19. Арутюнян, А.В. Методы оценки свободнорадикального окисления и антиоксидантной системы организма: методические рекомендации / А.В.Арутюнян, Е.Е.Дубинина, Н.Н.Зыбина. – СПб.: Фолиант, 2000. – 104 с. 20. Арутюнян, А.В. Нарушение циркадианных ритмов биогенных аминов в гипоталамусе крыс при введении 1,2-диметилгидразина / А.В.Арутюнян, Г.О.Керкешко, В.Н.Анисимов, М.Г.Степанов, Н.В.Поздеев // Вопр. онкол. – 2001. – Т. 47, №5. – С. 608-615. 21. Арутюнян, А.В. Нейротропные эффекты канцерогена 1,2-диметилгидразина: нарушение суточных ритмов гипоталамической регуляции репродуктивной функции крыс / А.В.Арутюнян, Г.О.Керкешко, В.Н.Анисимов, М.Г.Степанов, В.М.Прокопенко, Н.В.Поздеев, А.В.Кореневский // Нейрохимия. – 2001а. – Т. 18, №3. – С. 234-241. 22. Арутюнян, А.В. Роль биогенных аминов в гипоталамической регуляции репродуктивной функции / А.В.Арутюнян, Г.О.Керкешко, М.Г.Степанов, А.В.Кореневский, Э.К.Айламазян // Журн. акуш. и женск. бол. – 2004. – Т. 53, №1. – С. 98-106. 23. Арутюнян, А.В. Экспериментальное изучение механизмов нарушений гипоталамической регуляции репродуктивной функции / А.В.Арутюнян, Г.О.Керкешко, М.Г.Степанов, А.В.Кореневский, Э.К.Айламазян // Журн. акуш. и женск. бол. – 2005. – Т. 54, №1. – С. 57-63. 24. Арутюнян, А.В. Токсическое влияние пренатальной гипергомоцистеинемии на потомство (экспериментальное исследование) / А.В.Арутюнян, Л.С.Козина, В.А.Арутюнов // Журн. акуш. и женск. бол. – 2010. – Т. 59, №4. – С. 4-21. 198 25. Арутюнян, А.В. Возрастные нарушения гипоталамической регуляции репродуктивных циклов и их коррекция / А.В.Арутюнян, А.В.Кореневский // Успехи геронтол. – 2014. – Т. 27, №2. – С. 275-283. 26. Арутюнян, А.В. гипергомоцистеинемии Ю.П.Милютина, Использование в различных нейрохимических И.В.Залозняя, экспериментальных исследованиях А.В.Пустыгина, Л.С.Козина, / моделей А.В.Арутюнян, А.В.Кореневский // Нейрохимия. – 2012. – Т. 29, №1. – С. 83-88. (Arutyunyan, A.V. The use of different experimental models of hyperhomocysteinemia in neurochemical studies / A.V.Arutyunyan, Yu.P.Milyutina, I.V.Zaloznyaya, A.V.Pustygina, L.S.Kozina, A.V.Korenevskii // Neurochem. J. – 2012. – Vol. 6, No. 1. – P. 71-76.) 27. Арутюнян, А.В. Нарушение гипоталамической регуляции репродуктивной функции при воздействии нейротоксических соединений и мелатонина / А.В.Арутюнян, М.Г.Степанов, Г.О.Керкешко, Э.К.Айламазян // Журн. акуш. и женск. бол. – 2003. – Т. 52, №2. – С. 77-85. 28. Арутюнян, А.В. Нарушение нейромедиаторного звена гипоталамической регуляции репродуктивной функции под влиянием нейротоксических ксенобиотиков / А.В.Арутюнян, М.Г.Степанов, А.В.Кореневский // Нейрохимия. – 1998. – Т. 15, №4. – С. 264–270. 29. Арутюнян, А.В. Влияние экологически неблагоприятных факторов на репродуктивную систему / А.В.Арутюнян, М.Г.Степанов, А.В.Кореневский, В.М.Прокопенко, Т.И.Опарина, С.О.Бурмистров // Вестн. Рос. асс. акушеров-гинекологов. – 1997. – №4. – С. 28–31. 30. Арушанян, Э.Б. Комплексное взаимодействие супрахиазматических ядер гипоталамуса с эпифизом и полосатым телом – функционально единая система регуляции суточных колебаний поведения / Э.Б.Арушанян // Журн. высш. нерв. деят. – 1996. – Т. 46, №1. – С. 15-22. 31. Арушанян, Э.Б. Уникальный мелатонин / Э.Б.Арушанян. – Ставрополь: Изд-во СтГМА, 2006. – 400 с. 32. Арушанян, Э.Б. О реципрокных отношениях между супрахиазматическми ядрами гипоталамуса и эпифизом в процессе перестройки циркадианной подвижности крыс при изменении светового режима / Э.Б.Арушанян, В.А.Батурин, А.В.Попов // Журн. высш. нерв. деят. – 1993. – Т. 43, №1. – С. 69-75. 33. Бабичев, В.Н. Нейроэндокринология пола / В.Н.Бабичев. – М.: Наука, 1981. – 224 с. 34. Бабичев, В.Н. Нейроэндокринная регуляция репродуктивной системы / В.Н.Бабичев. – Пущино: ОНТИ ПНЦ РАН, 1995. – 227 с. 199 35. Бабичев, В.Н. Половые гормоны и центральная нервная система / В.Н.Бабичев // Рос. хим. ж. (Ж. Рос. хим. об-ва им. Д.И. Менделеева). – 2005. – Т. XLIX, №1. – С. 94-103. 36. Баласанян, И.Г. Гипоталамо-гипофизарно-овариальные взаимоотношения у работниц полимерперерабатывающих предприятий / И.Г.Баласанян // Актуальные вопросы физиологии и патологии репродуктивной функции женщины: мат. ХХ науч. сессии НИИАГ им. Д.О. Отта АМН СССР. – Л., 1991. – 180 с. – С.16-18. 37. Белоусов, Ю.Б. Этическая экспертиза биомедицинских исследований: практические рекомендации / Ю.Б.Белоусов. – М., 2005. – 156 с. 38. Берштейн, Л.М. Эстрогены, старение и возрастная патология / Л.М.Берштейн // Успехи геронтол. – 1998. – №2. – С. 90-97. 39. Болдырев, А.А. Молекулярные механизмы токсичности гомоцистеина / А.А.Болдырев // Биохимия. – 2009. – Т. 74, №6. – С. 725-736. 40. Болдырев, А.А. Свободные радикалы в нормальном и ишемическом мозге / А.А.Болдырев, М.Л.Куклей // Нейрохимия. – 1996. – Т. 13, №4. – С. 271-278. 41. Бондаренко, Л.А. Некоторые биохимические аспекты функционирования пинеальной железы крысы в онтогенезе / Л.А.Бондаренко // Онтогенез. – 1991. – Т. 22, №1. – С. 57-62. 42. Бондаренко, Л.А. Современные представления о физиологии эпифиза / Л.А.Бондаренко // Нейрофизиология. – 1997. – Т. 29, №3. – С. 212-237. 43. Бондаренко, Л.А. Возрастные особенности влияния эпиталамина на метаболизм серотонина в шишковидной железе у крыс / Л.А.Бондаренко, В.Н.Анисимов // Бюлл. экспер. биол. и мед. – 1992. – Т. 113, №2. – С. 194-195. 44. Бородин, К.А. Сравнительная характеристика защитного действия тиамина и рибофлавина при хронической интоксикации толуолом / К.А.Бородин, Н.В.Шептуха, Л.В.Толмачев // Охрана окружающей среды и здоровья населения в связи с развитием нефтехимии в Сибири: сб. науч. тр. – Омск, 1988. – 72 с. – C. 26-27. 45. Бурмистров, С.О. Нарушение свободнорадикальных процессов в ткани яичников и мозга крыс при хроническом ингаляционном воздействии толуола и диоксана / С.О.Бурмистров, А.В.Арутюнян, М.Г.Степанов, Т.И.Опарина, В.М.Прокопенко // Бюлл. экспер. биол. и мед. – 2001. – Т. 132, №3. – C. 832-836. 46. Вилин, Ю.Ю. Ионные механизмы нейротоксического действия экологических загрязнителей – бензина и толуола на уровне нервной клетки / Ю.Ю.Вилин, И.Ю.Артемьев // РЖ Охрана природы и воспроизводство природных ресурсов. – 1991. – №6. – С. 527. 47. Виноградова, И.А. Влияние светового режима и мелатонина на гомеостаз, продолжительность жизни и развитие спонтанных опухолей у самцов крыс / 200 И.А.Виноградова, А.В.Букалев, М.А.Забежинский, А.В.Семенченко, В.Н.Анисимов // Вопр. онкол. – 2008. – Т. 54, №1. – С. 70-77. 48. Вихляева, Е.М. Руководство по эндокринной гинекологии / Е.М.Вихляева. – 3-е изд., доп. – М.: ООО «Медицинское информационное агентство», 2006. – 784 с. 49. Вундер, П.А. Эндокринология пола / П.А.Вундер. – М.: Наука, 1980. – 254 с. 50. Гаджиева, Т.С. Влияние эпиталамина на гонадотропную функцию гипофиза и яичники / Т.С.Гаджиева Т.С.Блинова // Акушерство и гинекология. – 1980. – №9. – С. 15-18. 51. Гончарова, Н.Д. Пептидная коррекция возрастных нарушений функции эпифиза у обезьян / Н.Д.Гончарова, А.А.Венгерин, А.В.Шмалий, В.Х.Хавинсон // Успехи геронтол. – 2003. – №12. – С. 121-127. 52. Гончарова, Н.Д. Пинеальная железа и возрастная патология (механизмы и коррекция) / Н.Д.Гончарова, В.Х.Хавинсон, Б.А.Лапин. – СПб.: Наука, 2007. – 168 с. 53. Горкин, В.З. Аминооксидазы и их значение в медицине / В.З.Горкин. – М.: Медицина, 1981. – 335 с. 54. Дильман, В.М. Эндокринологическая онкология / В.М.Дильман. – Л.: Медицина, 1983. – 408 с. 55. Дильман, В.М. Четыре модели медицины / В.М.Дильман. – Л.: Медицина, 1987. – 288 с. 56. Долгов, Г.В. Биорегулирующая терапия в акушерстве и гинекологии / Г.В.Долгов, Ю.В.Цвелев, В.В.Малинин. – СПб.: Фолиант, 2004. – 143 с. 57. Душкин, В.А. Примерные нормы размещения лабораторных мышей и крыс в помещении / В.А.Душкин, Л.И.Кривов // Биология лабораторных животных: вып. 3. – М., 1971. – С. 203-205. 58. Ефимов, В.С. Гомоцистеинемия в патогенезе тромбоваскулярной болезни и атеросклероза / В.С.Ефимов, А.К.Цакалов // Лаб. мед. – 1999. – №2. – C. 44-48. 59. Жиляева, Т.В. Нарушения одноуглеродного метаболизма при шизофрении / Т.В.Жиляева // Психиатрия и психофармакотерапия. – 2012. – Т. 14, №6. – С. 41-46. 60. Жлоба, А.А. Выявление и лечение гипергомоцистеинемии / А.А.Жлоба, В.В.Никитина. – М.: Дружба народов, 2004. – 40 с. 61. Жуковский, М.А. Детская эндокринология / М.А.Жуковский. – 3-е изд. – М.: Медицина, 1995. – 656 с. 62. Зайцев, В.М. Прикладная медицинская статистика / В.М.Зайцев, В.Г.Лифляндский, В.И.Маринкин. – СПб.: Фолиант. – 2006. – 432 с. 63. Зайчик, А.Ш. Основы общей патологии. Часть 2: Основы патохимии / А.Ш.Зайчик, Л.П.Чурилов. – СПб.: ЭЛБИ, 2000. – 688 с. 201 64. Зех, К. Биогенные амины / К.Зех // Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии: под ред. А.Хеншен., К.-П.Хупе, Ф.Лотшпайх, В.Вельтер. – М.: Мир, 1988. – 688 с. – С. 350-377. 65. Зорилова, И.В. Наследственно обусловленная гипергомоцистеинемия в патогенезе ишемического инсульта у лиц молодого возраста / И.В.Зорилова, З.А.Суслина, С.Н.Иллариошкин, Б.А.Кистенев // Неврологический журнал. – 2005. – Т. 10, №2. – С. 1418. 66. Иванов, С.В. Возможности хронотопобиологического анализа общебиологических и популяционных ритмических процессов / С.В.Иванов, Н.Д.Герасимова, В.В.Лукина, Н.К.Минаева, В.А.Мороков, В.А.Попова, К.В.Шумихин // Проблемы ритмов в естествознании: мат. Второго Междунар. симп. (Москва, 1-3 марта 2004 г.). – М., 2004. – 535 с. – С. 190-193. 67. Карантыш, Г.В. Пептидная регуляция поведения и медиаторного баланса у старых крыс в условиях окклюзии сонных артерий / Г.В.Карантыш, В.А.Абрамчук, Г.А.Рыжак, А.М.Менджерицкий // Фундаментальные исследования. – 2013. – №6 (ч. 6). – С. 14061410. 68. Каркищенко, Н.Н. Основы биомоделирования / Н.Н.Каркищенко. – М.: Изд-во ВПК. – 2004. – 608 с. 69. Карпов, А.Б. Влияние неблагоприятных производственных факторов на беременность, роды, новорожденного и гормональную функцию фетоплацентарного комплекса у работниц электронной промышленности / А.Б.Карпов // Актуальные вопросы физиологии и патологии репродуктивной функции женщины: мат. ХХ науч. сессии НИИАГ им. Д.О. Отта АМН СССР. – Л., 1991. – 180 с. – С.59-62. 70. Керкешко, Г.О. Влияние нейротоксических соединений и мелатонина на гипоталамическую регуляцию репродуктивной системы: дисс. ... канд. биол. наук: 03.00.13, 03.00.04 / Керкешко Глеб Олегович. – СПб., 2002. – 160 с. 71. Керкешко, Г.О. Влияние мелатонина на гипоталамическую регуляцию репродуктивной функции крыс при хроническом воздействии ксенобиотиков / Г.О.Керкешко, М.Г.Степанов, А.В.Кореневский, В.М.Прокопенко, А.В.Арутюнян // Нейрохимия. – 2001. – Т. 18, №1. – С. 84-91. 72. Клименко, Е.М. Влияние химических канцерогенов на синаптическую передачу возбуждения в симпатических ганглиях у крыс / Е.М.Клименко, В.С.Шевелева // Бюлл. экспер. биол. и мед. – 1985 – Т. 99, №6 – С. 702-705. 202 73. Коваленко, Р.И. Эпифиз в системе нейроэндокринной регуляции / Р.И.Коваленко // Основы нейроэндокринологии: под ред. Шаляпиной В. Г., Шабанова П. Д. – СПб.: ЭЛБИСПб, 2005. – С. 337-365. 74. Козина, Л.С. Исследование антигипоксических свойств коротких пептидов / Л.С.Козина // Успехи геронтол. – 2008. – Т. 21., №1. – С. 61-67. 75. Козина, Л.С. Антиоксидантное действие геропротекторных пептидных биорегуляторов: автореф. дис. … д-ра биол. наук: 14.00.53 / Козина Людмила Семеновна. – СПб., 2009. – 47 с. 76. Козина, Л.С. Регуляторные пептиды защищают нейроны мозга от гипоксии в экспериментах in vivo / Л.С.Козина, А.В.Арутюнян, С.Л.Стволинский, М.С.Степанова, В.Х.Хавинсон // Докл. акад. наук. – 2008. – Т. 418, №3. – С. 419-422. 77. Козина, Л.С. Оценка биологической активности регуляторных пептидов в модельных экспериментах in vitro / Л.С.Козина, А.В.Арутюнян, С.Л.Стволинский, В.Х.Хавинсон // Успехи геронтол. – 2008а. – Т. 21, №1. – С. 68-73. 78. Козина, Л.С. Изучение антиоксидантных и мембранопротекторных свойств коротких пептидов в модельных экспериментах / Л.С.Козина, С.Л.Стволинский, Т.Н.Федорова, В.А.Арутюнов, Е.Р.Булыгина, Е.С.Арзуманян, А.В.Арутюнян, В.Х.Хавинсон. // Вопр. биол., мед. и фармацевт. химии. – 2008б. – №6. – С. 31-36. 79. Комаров, Ф.И. Мелатонин и биоритмы организма / Ф.И.Комаров, Н.К.Малиновская, С.И.Рапопорт // Хронобиология и хрономедицина: руководство. – М.: Триада-Х, 2000. – 488 с. – С. 82-90. 80. Кореневский, А.В. Влияние ксенобиотиков на содержание биогенных аминов в гипоталамических структурах, участвующих в регуляции репродукции у самок крыс: дисс. ... канд. биол. наук: 03.00.04, 03.00.13 / Кореневский Андрей Валентинович. – СПб., 1998. – 244 с. 81. Кореневский, А.В. Восстановление под влиянием пинеалона суточного ритма содержания норадреналина в гипоталамусе самок крыс, нарушенного при гипергомоцистеинемии / А.В.Кореневский, А.В.Арутюнян, Ю.П.Милютина, И.В.Залозняя, Л.С.Козина // Нейрохимия. – 2014. – Т. 31, №3. – С. 236-239. (Korenevskii, A.V. Pinealon corrects hyperhomocysteinemia induced disturbances of the diurnal dynamics of hypothalamic norepinephrine content in female rats / A.V.Korenevskii, A.V.Arutyunyan, Yu.P.Milyutina, I.V.Zaloznyaya, L.S.Kozina // Neurochem. J. – 2014. – Vol. 8, No. 3. – P. 205-207.) 82. Кореневский, А.В. Защитное влияние мелатонина и эпиталона на гипоталамическую регуляцию репродуктивной функции самок крыс в модели ее преждевременного старения и на эстральные циклы стареющих животных при разных режимах освещения / 203 А.В.Кореневский, Ю.П.Милютина, А.В.Букалев, Ю.П.Баранова, И.А.Виноградова, А.В.Арутюнян // Успехи геронтол. – 2013. – Т. 26, №2. – С. 263-274. (Korenevskii, A.V. The protective effect of melatonin and epithalon on hypothalamic regulation of the reproductive function in female rats in a model of its premature aging and on the estrous cycles of aging animals in different lighting conditions / A.V.Korenevsky, Yu.P.Milyutina, A.V.Bukalyov, Yu.P.Baranova, I.A.Vinogradova, A.V.Arutjunyan // Adv. Gerontol. – 2014. – Vol. 4, No. 1. – P. 67-77.) 83. Кореневский, А.В. О взаимосвязи циркадианных и овариальных циклов в гипоталамической регуляции репродукции (экспериментальное исследование) / А.В.Кореневский, Ю.П.Милютина, М.Г.Степанов, Г.О.Керкешко, А.В.Арутюнян // Журн. акуш. и женск. бол. – 2007. –Т. 56., №4. – С. 24–30. 84. Коркушко, О.В. Пептидные препараты тимуса и эпифиза в профилактике ускоренного старения / О.В.Коркушко, В.Х.Хавинсон, Г.М.Бутенко, В.Б.Шатило. – СПб.: Наука, 2002. – 202 с. 85. Коркушко, О.В. Пинеальная железа: пути коррекции при старении / О.В.Коркушко, В.Х.Хавинсон, В.Б.Шатило. – СПб.: Наука, 2006. – 204 с. 86. Коркушко, О.В. Влияние пептидного препарата эпиталамина на суточный ритм мелатонинобразующей функции эпифиза у людей пожилого возраста / О.В.Коркушко, В.Х.Хавинсон, В.Б.Шатило, Л.В.Магдич // Бюлл. экспер. биол. и мед. – 2004. – Т. 137, №4. – С. 441-443. 87. Коркушко, О.В. Влияние курсового введения пептидных препаратов эпифиза на суточный ритм концентрации мелатонина в плазме крови у людей пожилого возраста / О.В.Коркушко, В.Б.Шатило, И.А.Антонюк-Щеглова, В.Х.Хавинсон, Л.В.Магдич // Буковинский медичний вiсник. – 2006. – Т. 10, №4. – С. 76-79. 88. Кудрин, В.С. Влияние бромантана на дофамин- и серотонинергические системы мозга / В.С.Кудрин, С.А.Сергеева, Л.М.Красных, И.И.Мирошниченко, Т.В.Грехова, Р.Р.Гайнетдинов // Экспер. и клин. фармакол. – 1995. – Т.58, №4. – С.8-11. 89. Лапач, С.Н. Статистические методы в медико-биологических исследованиях с использованием Excel / С.Н.Лапач, А.В.Чубенко, П.Н.Бабич. – К.: Морион. – 2001. – 408 с. 90. Лихачев, А.Я. Молекулярно-биологические основы тканеспецифического канцерогенного действия диметилгидразина / А.Я.Лихачев // Экспер. онкол. – 1980. – Т. 2, №6. – С. 3-7. 91. Лыткин, В.В. Особенности гормональной регуляции репродуктивной системы у работниц промышленного предприятия / В.В.Лыткин, В.Г.Антипова // Эндокринная система 204 организма и вредные факторы окружающей среды: тез. докл. IV всесоюз. конф. – Л., 1991. – 276 с. – С. 143. 92. Матюшичев, В.Б. Элементы статистической обработки результатов биохимического эксперимента / В.Б.Матюшичев. – Л.: Изд-во ЛГУ, 1990. – 130 с. 93. Махро, А.В. Пренатальная гипергомоцистеинемия как модель окислительного стресса мозга / А.В.Махро, А.П.Машкина, О.А.Соленая, О.А.Трунова, Л.С.Козина, А.В.Арутюнян, Е.Р.Булыгина // Бюлл. экспер. биол. и мед. – 2008. – Т. 146, №7. – С. 37-39. 94. Мендель, В.Э. Мелатонин: роль в организме и терапевтические возможности. Опыт применения препарата Мелаксен в российской медицинской практике / В.Э.Мендель, О.И.Мендель // Русс. мед. журн. – 2010. – Т. 18, №6. – С. 336-341. 95. Милютина, Ю.П. Воздействие мелатонина и пептидов эпифиза на катехоламинергическое звено гипоталамической регуляции репродуктивной функции крыс / Ю.П.Милютина, А.В.Кореневский, М.Г.Степанов, А.В.Арутюнян // Нейрохимия. – 2010. – Т. 27, №3. – С. 221-229. (Milyutina, Yu.P. Effects of melatonin and epiphysis peptides on the catecholamine link of hypothalamic regulation of the reproductive function of rats / Yu.P.Milyutina, A.V.Korenevskii, M.G.Stepanov, A.V.Arutyunyan // Neurochem. J. – 2010. – Vol. 4, No. 3. – P. 196-203.) 96. Моренков, Э.Д. Нейроактивные стероиды и формирование полового диморфизма латеральной организации мозга / Э.Д.Моренков, Л.П.Петрова // Руководство по функциональной межполушарной асимметрии: под ред. В.Ф.Фокина, И.Н.Боголеповой, Б.Гутник, В.И.Кобрина, В.В.Шульговского. – М.: Научный мир, 2009. – 836 с. – С. 207253. 97. Морозов, В.Г. Пептидные биорегуляторы (25-летний опыт экспериментального и клинического изучения) / В.Г.Морозов, В.Х.Хавинсон. – СПб.: Наука, 1996. – 74 с. 98. Морозов, В.И. Метод радиоиммунного анализа эстрадиола-17 и влияние физической нагрузки на его содержание в крови людей / В.И.Морозов, С.А.Прияткин, Т.И.Исакова, И.А.Лушицкая, В.А.Рогозкин // Вопр. мед. химии. – 1988. – Т.34, №3. – С. 136-139. 99. Науменко, Е.В. Генетико-физиологические механизмы регуляции функции семенников / Е.В.Науменко, А.В.Осадчук, Л.И.Серова, Г.Т.Шишкина. – Новосибирск: Наука, 1983. – 202 с. 100. Ноздрачев, А.Д. Анатомия крысы (лабораторные животные) / А.Д.Ноздрачев, Е.Л.Поляков. – СПб.: Лань, 2001. – 464 с. 101. Оловников, А.М. Редусомная гипотеза старения и контроля биологического времени в индивидуальном развитии / А.М.Оловников // Биохимия. – 2003. – Т. 68, №1. – С. 7-41. 205 102. Осиповский, С.А. Молекулярные механизмы участия пептидов в функциях нервных клеток / С.А.Осиповский, М.М.Полесская // Успехи физиол. наук. – 1982. – Т. 13, №4. – С. 74-99. 103. Пишак, В.П. Роль неадренергической регуляции в реакции шишковидного тела крыс на острую гипоксию и введение эпиталамина / В.П.Пишак, И.И.Заморский // Вопр. мед. химии. – 2000. – Т. 46, №1. – С. 28-35. 104. Разыграев, А.В. Участие ферментов окислительного метаболизма моноаминов в гипоталамической регуляции репродуктивной функции самок крыс: дисс. ... канд. биол. наук: 03.00.13, 03.00.04 / Разыграев Алексей Вячеславович. – СПб., 2007. – 138 с. 105. Разыграев, А.В. Спектрофотометрический метод определения моноаминоксидазной активности в микроструктурах головного мозга крыс, основанный на реакции окисления кинурамина / А.В.Разыграев, А.В.Арутюнян // Вестн. Санкт-Петербургского унив. Серия 3: Биология. – 2006. – №3. – С. 114-118. 106. Разыграев, А.В. Пути циркадианного контроля продукции гонадотропин-рилизинггормона / А.В.Разыграев, Г.О.Керкешко, А.В.Арутюнян // Журн. акуш. и женск. бол. – 2011. – Т. 60, №2. – С. 88-98. 107. Разыграев, А.В. Динамика содержания катехоламинов в гипоталамических структурах самок крыс в преовуляторный период / А.В.Разыграев, Ю.П.Милютина, А.В.Кореневский, И.В.Залозняя, М.Г.Степанов, А.В.Пустыгина, А.В.Арутюнян // Журн. акуш. и женск. бол. – 2010. – Т. 59. – №4. – С. 76-80. 108. Савченко, О.Н. Экспериментальное бесплодие. Эндокринологические аспекты / О.Н.Савченко, Н.А.Арутюнян, М.Г.Степанов. – СПб.: Наука, 1992. – 152 с. 109. Савченко, О.Н. Гонадотропин-рилизинг активность различных отделов мозга крыс и вероятность наличия ингибирующего ее фактора в супрахиазматической области / О.Н.Савченко, О.А.Данилова // Физиол. журн. СССР. – 1979. – Т. 65, №1. – С. 111-116. 110. Сафонникова, С.М. Гигиеническое нормирование содержания в почве толуола в комбинации с никелем / С.М.Сафонникова, С.А.Магжанова, И.А.Кондратьева // Комплексная гигиеническая оценка условий труда и охрана здоровья промышленных рабочих Сибири: сб. науч. тр. Московского НИИ гигиены им. Ф.Ф.Эрисмана, под ред. Е.М.Горбачева. – М., 1990. –181 с. – С. 92-98. 111. Слепушкин, В.Д. Влияние препарата из эпифиза эпиталамина на гонадотропную функцию гипофиза / В.Д.Слепушкин, В.Ф.Мордовин, Г.К.Золоев // Пробл. эндокринол. – 1983. – Т. 29, №6. – С. 51-56. 206 112. Степанов, М.Г. Циркадианный ритм колебаний уровня гонадолиберина в гипоталамусе крыс и влияние на него различных ксенобиотиков / М.Г.Степанов // Физиол. журн. – 1994. – Т. 80, №4. – С. 12-16. 113. Степанов, М.Г. Нарушение центральной регуляции репродуктивной функции под влиянием неблагоприятных факторов внешней среды / М.Г.Степанов, А.В.Арутюнян, Э.К.Айламазян // Вопр. мед. химии. – 1995. – Т. 41, №5. – С. 33-35. 114. Толочкина, С.А. Влияние агротехногенного загрязнения на почвенную микрофлору / С.А.Толочкина, Т.П.Дворникова, М.М.Вавельский // Микроорганизмы в сельском хозяйстве: тез. докл. IV Всесоюз. науч. конф., под ред. Д.Г.Звягинцева. – Пущино, 1992. – 236 с. – С. 197-198. 115. Угрюмов, М.В. Механизмы нейроэндокринной регуляции / М.В.Угрюмов. – М.: Наука, 1998. – 236 с. 116. Хавинсон, В.Х. Способ получения пептидов, обладающих тканеспецифической активностью, и фармацевтические композиции на их основе / В.Х.Хавинсон // Патент РФ №2161501. – 2001. 117. Хавинсон, В.Х. Пептидная регуляция старения / В.Х.Хавинсон. – СПб.: Наука, 2009. – 50 с. 118. Хавинсон, В.Х. Пептидные биорегуляторы и старение / В.Х.Хавинсон, В.Н.Анисимов. – СПб.: Наука, 2003. – 223 с. 119. Хавинсон, В.Х. Пептиды эпифиза и тимуса в регуляции старения / В.Х.Хавинсон, В.Г.Морозов. – СПб.: Фолиант, 2001. – 160 с. 120. Хавинсон, В.Х. Модель взаимодействия регуляторных пептидов с двойной спиралью ДНК / В.Х.Хавинсон, Л.К.Шатаева, И.Э.Бондарев // Успехи соврем. биол. – 2003. – Т. 123, №1. – С. 467-474. 121. Хубутия, М.Ш. Гомоцистеин при коронарной болезни сердца и сердечного трансплатата / М.Ш.Хубутия. – М.: Изд-во ООО «Реафарм», 2004. – 271 с. 122. Чазов, Е.И. Эпифиз: место и роль в системе нейроэндокринной регуляции / Е.И.Чазов, В.А.Исаченков. – М.: Медицина, 1974. – 238 с. 123. Чернышева, М.П. Циркадианные осцилляторы и гормоны / М.П.Чернышева // Цитология. – 2013. – Т. 55, №11. – С. 761-777. 124. Чернышева, М.П. Временная структура биосистем и биологическое время / М.П.Чернышева. – СПб.: Написано пером, 2014. – 189 с. 125. Чернышева, М.П. Гормоны и динамика функциональной межполушарной ассиметрии / М.П.Чернышева, Р.И.Коваленко // Руководство по функциональной межполушарной 207 асимметрии: под ред. В.Ф.Фокина, И.Н.Боголеповой, Б.Гутник, В.И.Кобрина, В.В.Шульговского. – М.: Научный мир, 2009. – 836 с. 126. Шаляпина, В.Г. Эндокринология репродукции / В.Г.Шаляпина. – СПб.: Наука, 1991. – 192 с. 127. Alexiuk, N.A. Melatonin reduces dopamine content in the neurointermediate lobe of male Syrian hamsters / N.A.Alexiuk, J.P.Vriend // Brain Res. Bull. – 1993. – Vol. 32, No. 4. – P. 433-436. 128. Alfaro-Rodríguez, A. Chronic exposure to toluene changes the sleep-wake pattern and brain monoamine content in rats / A.Alfaro-Rodríguez, A.Bueno-Nava, R.González-Piña., E.ArchTirado, J.Vargas-Sánchez., A.Avila-Luna // Acta Neurobiol. Exp. (Warsz.). – 2011. – Vol. 71, No. 2. – P. 183-192. 129. Almeida, O.F.X. Actional effects of gonadal steroids oh hypothalamo-pituitary-adrenal regulation in the rat disclosed by response to dexamethasone supression / O.F.X.Almeida, V.Canoine, S.Ali, F.Holboer, V.K.Patchev // J. Neuroendocrinol. – 1997. – Vol. 9, No. 2. – P. 129-134. 130. Anderson, C.E. Recognition and prevention of inhalant abuse / C.E.Anderson, G.A.Loomis // Am. Fam. Physician. – 2003. – Vol. 68, No. 5. – P. 869-874. 131. Andersson, K. Toluene-induced activation of certain hypothalamic and median eminence catecholamine nerve terminal systems of the male rat and its effects on anterior pituitary hormone secretion / K.Andersson, K.Fuxe, R.Toftgard, O.G.Nilsen, P.Eneroth, J.A.Gustafsson // Toxicol. Lett. – 1980. – Vol. 5, No. 6. – P. 393-398. 132. Andersson, K. Increased amine turnover in several hypothalamic noradrenaline nerve terminal systems and changes in prolactin secretion in the male rat by exposure to various concentrations of toluene / K.Andersson, O.G.Nilsen, R.Toftgard, P.Eneroth, J.A.Gustafsson, N.Battistini, L.F.Agnati // Neurotoxicology. – 1983. – Vol. 4, No. 4. – P. 43-55. 133. Anisimov, V.N. Carcinogenesis and Aging. Vols. 1 & 2 / V.N.Anisimov. – Boca Raton, FL: CRC Press, Inc., 1987. – Vol. 1. – P. 148. 134. Anisimov, V.N. Melatonin and colon carcinogenesis / V.N.Anisimov // C.Bartsch, H.Bartsch, D.E.Blask et al. (Eds.). The Pineal Gland and Cancer. Neuroimmunoendocrine Mechanisms in Malignancy. – Berlin: Springer, 2001. – 578 p. – P. 240-258. 135. Anisimov, V.N. The role of pineal gland in breast cancer development / V.N.Anisimov // Crit. Rev. Oncol. Hematol. – 2003. – Vol. 46, No. 3. – P. 221-234. 136. Anisimov, V.N. Effects of pineal peptide preparation Epithalamin on free radical processes in humans and animals / V.N.Anisimov, A.V.Arutjunyan, V.Kh.Khavinson // Neuroendocrinol. Lett. – 2001. – Vol. 22, No. 1. – P. 11-20. 208 137. Anisimov, V.N. Melatonin as antioxidant, geroprotector and anticarcinogen / V.N.Anisimov, I.G.Popovich, M.A.Zabezhinski, S.V.Anisimov, G.M.Vesnushkin, I.A.Vinogradova // Biochim. Biophys. Acta. – 2006. – Vol. 1757, No. 5-6. – P. 573-589. 138. Ansari, N. Differential maturation of circadian rhythms in clock gene proteins in the suprachiasmatic nucleus and the pars tuberalis during mouse ontogeny / N.Ansari, M.Agathagelidis, C.Lee, H.W.Korf, C.von Gall // Eur. J. Neurosci. – 2009. – Vol. 29, No. 3. – P. 477-489. 139. Apostolakis, E.M. Pituitary adenylate cyclase-activating peptide: a pivotal modulator of steroidinduced reproductive behavior in female rodents / E.M.Apostolakis, R.Lanz, B.W.O'Malley // Mol. Endocrinol. – 2004. – Vol. 18, No. 1. – P. 173-183. 140. Arendt, J. Importance and relevance of melatonin to human biological rhythms / J.Arendt // J. Neuroendocrinol. – 2003. – Vol. 15, No. 4. – P. 427-431. 141. Arendt, J. Melatonin: characteristics, concerns, and prospects / J.Arendt // J. Biol. Rhythms. – 2005. – Vol. 20, No. 4. – P. 291-303. 142. Arendt, J. Melatonin as a chronobiotic / J.Arendt, D.J.Skene // Sleep Med. Rev. – 2005. – Vol. 9, No. 1. – P. 25-39. 143. Arito, H. Acute effects of toluene on circadian rhythms of sleep-wakefullness and brain monoamine metabolism in the rat / H.Arito, H.Tsuruta, K.Nakagaki // Toxicology. – 1984. – Vol. 33, No. 3-4. – P. 291–301. 144. Arito, H. Partial insomnia, hyperactivity and hyperdipsia induced by repeated administration of toluene in rats: their relation to brain monoamine metabolism / H.Arito, H.Tsuruta, K.Nakagaki, S.Tanaka // Toxicology. – 1985. – Vol. 37, No. 1-2. – P. 99-110. 145. Arutjunyan, A.V. Disturbances of diurnal rhythms of biogenic amines contents in hypothalamic nuclei as an evidence of neurotropic effects of enterotropic carcinogen 1,2-dimethylhydrazine / A.V.Arutjunyan, G.O.Kerkeshko, V.N.Anisimov, M.G.Stepanov, V.M.Prokopenko, N.V.Pozdeyev, A.V.Korenevsky // Neuroendocrinol. Lett. – 2001. – Vol. 22, No. 4. – P. 229237. 146. Arutjunyan, A. Pinealon protects the rat offspring from prenetal hyperhomocysteinemia / A.Arutjunyan, L.Kozina, V.Khavinson, S.Stvolinskiy, Y.Bulygina, A.Mashkina // Int. J. Clin. Exp. Med. – 2012. – Vol. 5, No. 2. – P. 179-185. 147. Arutjunyan, A. Melatonin and pineal gland peptides are able to correct the impairment of reproductive cycles in rats / A.Arutjunyan, L.Kozina, Yu.Milyutina, A.Korenevsky, M.Stepanov, V.Arutyunov // Curr. Aging Sci. – 2012а. – Vol. 5, No. 3. – P. 178-185. 148. Arutjunyan, A.V. The disturbances of circadian rhythms hypothalamic regulation in female rats under the influence of xenobiotics / A.V.Arutjunyan, M.G.Stepanov, A.V.Korenevsky, 209 V.M.Prokopenko, T.I.Oparina // A.W.Teelken, J.Korf (Eds.) Neurochemistry: cellular, molecular and clinical aspects. – N.Y.: Plenum Press, 1997. – 1219 p. – P. 529-534. 149. Asai, M. Circadian profile of Per gene mRNA expression in the suprachiasmatic nucleus, paraventricular nucleus, and pineal body of aged rats / M.Asai, Y.Yoshinobu, S.Kaneko, A.Mori, T.Nikaido, T.Moriya, M.Akiyama, S.Shibata // J. Neurosci. Res. – 2001. – Vol. 66, No. 6. – P. 1133-1139. 150. Ataie, A. Neuroprotective effects of the polyphenolic antioxidant agent, Curcumin, against homocysteine-induced cognitive impairment and oxidative stress in the rat / A.Ataie, M.Sabetkasaei, A.Haghparast, A.H.Moghaddam, B.Kazeminejad // Pharmacol. Biochem. Behav. – 2010. – Vol. 96, No. 4. – P. 378-385. 151. Baccarelli, A. Occupational and environmental agents as endocrine disruptors: experimental and human evidence / A.Baccarelli, A.C.Pesatori, P.A.Bertazzi // J. Endocrinol. Invest. – 2000. Vol. 23, No. 11. – P. 771-81. 152. Bae, K. Differential functions of the mPer1, mPer2, and mPer3 in the SCN circadian clock / K.Bae, J.Xiaowei, E.S.Maywood, M.H.Hastings, S.M.Reppert, D.R.Weaver // Neuron. – 2001. – Vol. 30, No. 2. – P. 525-536. 153. Bale, A.S. Alterations in glutamatergic and gabaergic ion channel activity in hippocampal neurons following exposure to the abused inhalant toluene / A.S.Bale, Y.Tu, E.P.CarpenterHyland, L.J.Chandler, J.J.Woodward // Neuroscience. – 2005. – Vol. 130, No. 1. – P. 197-206. 154. Barraclough, C.A. The role of catecholamines in the regulation of pituitary luteinizing hormone and follicle-stimulating hormone secretion / C.A.Barraclough, P.M.Wise // Endocr Rev. – 1982. – Vol. 3, No. 1. – P. 91-119. 155. Bayadas, G. Melatonin inhibits oxidative stress and apoptosis in fetal brains of hyperhomocysteinemic rat dams / G.Bayadas, S.T.Koz, M.Tuzcu, E.Etem, V.S.Nedzvetsky // J. Pineal Res. – 2007. – Vol. 43, No. 3. – P. 225-231. 156. Bayadas, G. Melatonin prevents gestational hyperhomocysteinemia-associated alterations in neurobehavioral developments in rats / G.Bayadas, S.T.Koz, M.Tuzcu, V.S.Nedzvetsky // J. Pineal Res. – 2008. – Vol. 44, No. 2. – P. 181-188. 157. Bayadas, G. Melatonin prevents oxidative stress and inhibits reactive gliosis induced by hyperhomocysteinemia in rats / G.Bayadas, M.Ozer, A.Yasar, S.T.Koz, M.Tuzcu // Biochemistry (Mosc.). – 2006. – Vol. 71, Suppl. 1. – P. 91-95. 158. Bayadas, G. Melatonin protects the central nervous system of rats against toluene-containing thinner intoxication by reducing reactive gliosis / G.Bayadas, R.J.Reiter, V.S.Nedzvetskii, A.Yasar, M.Tuzcu, F.Ozveren, H.Canatan // Toxicol. Lett. – 2003. – Vol. 137, No. 3. – P. 169174. 210 159. Beckstead, M.J. Glycine and gamma-aminobutyric acid (A) receptor function is enhanced by inhaled drugs of abuse / M.J.Beckstead, J.L.Weiner, E.I.Eger, D.H.Gong, S.J.Mihic // Mol. Pharmacol. – 2000. – Vol. 57, No. 6. – P. 1199-1205. 160. Bellimanni, G. Effects of melatonin in perimenopausal and menopausal woman: our personal experience / G.Bellimanni, F.Di Marzo, F.Blasi, A.Di Marzo // Ann N. Y. Acad. Sci. – 2006. – Vol. 1057. – P. 393-402. 161. Benloucif, S. Responsiveness to melatonin and its receptor expression in the aging circadian clock of mice / S.Benloucif, M.I.Masana, M.L.Dubocovich // Am. J. Physiol. – 1997. – Vol. 273, No. 6 (2). – P. 1855-1860. 162. Berenguer, P. Behavioral and neurochemical effects induced by subchronic exposure to 40 ppm toluene in rats / P.Berenguer, C.Soulage, D.Perrin, J.M.Pequignot, J.H.Abraini // Pharmacol. Biochem. Behav. – 2003. – Vol. 74, No. 4. – P. 997-1003. 163. Bhaskaran, D. Monoamine levels and monoamine oxidase activity in different regions of rat brain as a function of age / D.Bhaskaran, E.Radha // Mech. Ageing Dev. – 1983. – Vol. 23, No. 2. – P. 151-160. 164. Bhaskaran, D. Circadian variations in the monoamine levels and monoamine oxidase activity in different regions of the rat brain as a function of age / D.Bhaskaran, E.Radha // Exp. Gerontol. – 1984. –Vol. 19, No. 3. – P. 153-170. 165. Bidard, J.N. Effect of S-adenosyl-L-homocysteine of dopamine catabolism / J.N.Bidard, P.Sokoloff, L.Cronenberger, H.Pacheco // Arch. Int. Physiol. Biochim. – 1979. – Vol. 87, No. 2. – P. 253-264. 166. Boden, M.J. Circadian rhythms and reproduction / M.J.Boden, D.J.Kennaway // Reproduction. – 2006. – Vol. 132, No. 3. – P. 379-392. 167. Boldyrev, A.A. Molecular mechanisms of homocysteine toxicity / A.A.Boldyrev // Biochemistry (Mosc.). – 2009. – Vol. 74, No. 6. – P. 589-598. 168. Boldyrev, A. Molecular mechanisms of homocysteine toxicity and possible protection against hyperhomocysteinemia / A.Boldyrev // Ch.Ramassamy, S.Bastianetto (Eds.) Recent Advances on Nutrition and Prevention of Alzheimer Disease. – Kerala: Transworld Research Network, 2010. – 209 p. – P. 127-143. 169. Borjigin, J. Circadian regulation of pineal gland rhythmicity / J.Borjigin, L.S.Zhang, A.A.Calinescu // Mol. Cell. Endocrinol. – 2012. – Vol. 349, No. 1. – P. 13-19. 170. Borowczyk, K. Metabolism and neurotoxicity of homocysteine thiolactone in mice: evidence for a protective role of paraoxonase / K.Borowczyk, D.M.Shih, H.Jakubowski // J. Alzheimers Dis. – 2012. – Vol. 30, No. 2. – P. 225-231. 211 171. Bottiglieri, T. Homocysteine, folate, methylation, and monoamine metabolism in depression / T.Bottiglieri, M.Laundy, R.Crellin, B.K.Toone, M.W.Carney, E.H.Reynolds // J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry. – 2000. – Vol. 69, No. 2. – P. 228-232. 172. Bowen, S.E. The last decade of solvent research in animal models of abuse: mechanistic and behavioral studies / S.E.Bowen, J.C.Batis, N.Paez-Martinez., S.L.Cruz // Neurotoxicol. Teratol. – 2006. – Vol. 28, No. 6. – P. 636–647. 173. Bullough, J.D. Of mice and women: light as a circadian stimulus in breast cancer research / J.D.Bullough, M.S.Rea, M.G.Figueiro // Cancer Causes Control. – 2006. – Vol. 17, No. 4. – P. 375-383. 174. Bunger, M.K. Mop3 is an essential component of the master circadian pacemaker in mammals / M.K.Bunger, L.D.Wilsbacher, S.M.Moran, C.Clendenin, L.A.Radcliffe, J.B.Hogenesch, M.C.Simon, J.S.Takahashi, C.A.Bradfield // Cell. – 2000. – Vol. 103, No. 7. – P. 1009-1017. 175. Burkeen, J.F. Mitochondrial calcium signaling mediates rhythmic extracellular ATP accumulation in suprachiasmatic nucleus astrocytes / J.F.Burkeen, A.D.Womac, D.J.Earnest, M.J.Zoran // J. Neurosci. – 2011. – Vol. 31, No. 23. – P. 8432-8440. 176. Butler, M.P. Circadian regulation of endocrine functions / M.P.Butler, L.J.Kriegsfeld, R.Silver // D.W.Pfaff, A.P.Arnold, S.E.Fahrbach, A.M.Etgen, R.T.Rubin (Eds.) Hormones, Brain and Behavior (second edition). – San Diego: Academic Press, 2009. – 4393 p. – P. 473507. 177. Cagampang, F.R. Diurnal and circadian changes of serotonin in the suprachiasmatic nuclei: regulation by light and an endogenous pacemaker / F.R.Cagampang, S.T.Inouye // Brain Res. – 1994. – Vol. 639, No. 1. – P. 175-179. 178. Cagampang, F.R. Circadian rhythms of norepinephrine in the rat suprachiasmatic nucleus / F.R.Cagampang, H.Okamura, S.Inouye // Neurosci. Lett. – 1994. – Vol. 173, No. 1-2. – P. 185188. 179. Cai, A. Fetal grafts containing suprachiasmatic nuclei restore the diurnal rhythm of CRH and POMC mRNA in aging rats / A.Cai, K.Scarbrough, D.A.Hinkle, P.M.Wise // Am. J. Physiol. – 1997. – Vol. 273, No. 5 (2). – R1764-1770. 180. Calderón-Guzmán, D. Effect of toluene and nutritional status on serotonin, lipid peroxidation levels and NA+/K+-ATPase in adult rat brain / D.Calderón-Guzmán, I.Espitia-Vázquez, A.López-Domínguez, E.Hernández-García, B.Huerta-Gertrudis, E.Coballase-Urritia, H.JuárezOlguín, B.García-Fernández // Neurochem. Res. – 2005. – Vol. 30, No. 5. – P. 619-624. 181. Calderón-Guzmán, D. Effect of toluene and cresols on Na+,K+-ATPase, and serotonin in rat brain / D.Calderón-Guzmán, J.L.Hernández-Islas, I.R.Espítia-Vázquez, G.Barragán-Mejía, 212 E.Hernández-García, D.S.Del Angel, H.Juárez-Olguín // Regul. Toxicol. Pharmacol. – 2005a. – Vol. 41, No. 1. – P. 1-5. 182. Całka, J. The role of nitric oxide in the hypothalamic control of LHRH and oxytocin release, sexual behavior and aging of the LHRH and oxytocin neurons / J.Całka // Folia Histochem. Cytobiol. – 2006. – Vol. 44, No. 1. – P. 3-12. 183. Campbell, C.S. The impact of constant light on the estrous cycle of the rat / C.S.Campbell, N.B.Schwartz // Endocrinology. – 1980. – Vol. 106, No. 4. – P. 1230-1238. 184. Carfagna, N. Brain catecholamine content and turnover in aging rats / N.Carfagna, F.Trunzo, A.Moretti // Exp. Gerontol. – 1985. – Vol. 20, No. 5. – P. 265-269. 185. Carlberg, C. Gene regulation by melatonin / C.Carlberg // Ann. N. Y. Acad. Sci. – 2000. – Vol. 917. – P. 387-396. 186. Carnevali, O. Melatonin induces follicle maturation in Danio rerio / O.Carnevali, G.Gioacchini, F.Maradonna, I.Olivotto, B.Migliarini // PLoS One. – 2011. – Vol. 6, No. 5. – e19978. 187. Cashion, A.B. The morphometry of astrocytes in the rostral preoptic area exhibits a diurnal rhythm on proestrus: relationship to the luteinizing hormone surge and effects of age / A.B.Cashion, M.J.Smith, P.M.Wise // Endocrinology. – 2003. – Vol. 144, No. 1. – P. 274-280. 188. Cashion, A.B. Glutamic acid decarboxylase 67 (GAD67) gene expression in discrete regions of the rostral preoptic area change during the oestrous cycle and with age / A.B.Cashion, M.J.Smith, P.M.Wise // J. Neuroendocrinol. – 2004. – Vol. 16, No. 8. – P. 711-716. 189. Cassone, V.M. Melatonin: time in a bottle / V.M.Cassone // Oxf. Rev. Reprod. Biol. – 1990. – Vol. 12. – P. 319-367. 190. Cassone, V.M. Melatonin's role in vertebrate circadian rhythms / V.M.Cassone // Chronobiol. Int. – 1998. – Vol. 15, No. 5. – P. 457-457. 191. Cassone, V.M. Melatonin, the pineal gland, and circadian rhythms / V.M.Cassone, W.S.Warren, D.S.Brooks, J.Lu // J. Biol. Rhythms. – 1993. – Vol. 8, Suppl. – S73-81. 192. Celani, M.F. Effects of subacute treatment with toluene on central monoamine receptors in the rat. Reduced affinity in [3H]5-hydroxytryptamine binding sites and in [3H]spiperone binding sites linked to dopamine receptors / M.F.Celani, K.Fuxe, L.F.Agnati, K.Andersson, T.Hansson, J.-Å.Gustafsson, N.Battistini, P.Eneroth // Toxicol. Lett. – 1983. – Vol. 17, No. 3-4. – P. 275-281. 193. Chan, M.H Toluene exposure during the brain growth spurt reduced behavioral responses to nicotine in young adult rats: a potential role for nicotinic acetylcholine receptors in fetal solvent syndrome / M.H.Chan, Y.C.Tang, T.H.Chien, H.H.Chen // Toxicol. Sci. – 2008. – Vol. 101, No. 2. –P. 286-293. 213 194. Chandra, G. Acute intranigral homocysteine administration produces stereotypic behavioral changes and striatal dopamine depletion in Sprague-Dawley rats / G.Chandra, P.K.Gangopadhyay, K.S.Senthil Kumar, K.P.Mohanakumar // Brain Res. – 2006. – Vol. 1075, No.1. – P. 81-92. 195. Chang, H.Y. Effect of applying biosolids on the biodegradation of toluene and naphthalene contaminated soils / H.Y.Chang, J.M.Hung, Y.S.Wu, Y.R.Lin, H.Y.Lai, C.J.Lu // J. Environ. Biol. – 2009. – Vol. 30, No. 6. – P. 971-975. 196. Chappell, P.E. Clocks and the black box: circadian influences on gonadotropin-releasing hormone secretion / P.E.Chappell // J. Neuroendocrinol. – 2005. – Vol. 17, No. 2. – P. 119-130. 197. Chappell, P.E. Stimulation of gonadotropine-releasing hormone surges by estrogen. I. Role of hypothalamic progesterone receptors / P.E.Chappell, J.E.Levine // Endocrinology. – 2000. – Vol. 141, No. 4. –P. 1477-1485. 198. Charlton, H.M. The Gn-RH neurone / H.M.Charlton // J. Endocrinol. – 1992. – Vol. 135, No. 3, Suppl. – S6. 199. Chee, C.A. Vasoactive intestinal polypeptide neuron changes in the senile rat suprachiasmatic nucleus / C.A.Chee, B.Roozendaal, D.F.Swaab, E.Goudsmit, M.Mirmiran // Neurobiol Aging. – 1988. – Vol. 9, No. 3. – P. 307-312. 200. Chen, W.P. Gonadotropin releasing hormone (GnRH) neurons are directly innervated by catecholamine terminals / W.P.Chen, J.W.Witkin, A.J.Silverman // Synapse. – 1989. – Vol. 3, No. 3. – P. 288-290. 201. Chiba, A. Effects of pinealectomy and melatonin on the timing of the proestrous luteinizing hormone surge in the rat / A.Chiba, T.Akema, J.Toyoda // Neuroendocrinology. – 1994. – Vol. 59, No. 2. – P. 163-168. 202. Chiesa, J.J. Arrhythmic rats after SCN lesions and constant light differ in short time scale regulation of locomotor activity / J.J.Chiesa, T.Cambras, A.R.Carpentieri, A.Díez-Noguera // J. Biol. Rhythms. – 2010. – Vol. 25, No. 1. – P. 37-46. 203. Choudhary, G. Human health perspective on environmental exposure to hydrazines: a review / G.Choudhary, H.Hansen // Chemosphere. – 1998. – Vol.37, No. 5. – P. 801-843. 204. Christakis-Hampsas, M. Acute poisonings and sudden deaths in Crete: a five-year review (19911996) / M.Christakis-Hampsas, M.Tutudakis, A.M.Tsatsakis, P.Assithianakis, A.Alegakis, P.G.Katonis, E.N.Michalodimitrakis // Vet. Hum. Toxicol. – 1998. – Vol. 40, No. 4. – P. 228230. 205. Christian, C.A. Vasoactive intestinal polypeptide can excite gonadotropin-releasing hormone neurons in a manner dependent on estradiol and gated by time of day / C.A.Christian, S.M.Moenter // Endocrinology. – 2008. – Vol. 149, No. 6. – P. 3130-3136. 214 206. Christian, C.A. Estradiol suppresses glutamatergic transmission to gonadotropin-releasing hormone neurons in a model of negative feedback in mice / C.A.Christian, J.Pielecka-Fortuna, S.M.Moenter // Biol Reprod. – 2009. – Vol. 80, No. 6. – P. 1128-1135. 207. Clarke, I.J. The role of noradrenaline in the generation of the preovulatory LH surge in the ewe / I.J.Clarke, C.J.Scott, A.Pereira, S.Pompolo // Domest Anim. Endocrinol. – 2006. – Vol. 30, No. 4. – P. 260-275. 208. Clarkson, J. Dual phenotype kisspeptin-dopamine neurones of the rostral periventricular area of the third ventricle project to gonadotrophin-releasing hormone neurones / J.Clarkson, A.E.Herbison // J. Neuroendocrinol. – 2011. – Vol. 23, No. 4. – P. 293-301. 209. Cohen, I.R. Age-related changes in the diurnal rhythm of serotonin turnover in microdissected brain areas of estradiol-treated ovariectomized rats / I.R.Cohen, P.M.Wise // Endocrinology. – 1988. – Vol. 122, No. 6. – P. 2626-2633. 210. Colombo, J.A. Timing of the estrogen-induced release of LH in ovariectomized rats under an altered lighting schedule / J.A.Colombo, D.M.Baldwin, C.H.Sawyer // Proc. Soc. Exp. Biol. Med. – 1974. – Vol. 145, No. 3. – P. 1125-1127. 211. Cooper, R.L. Characterization of the LH surge in middle-aged female rats / R.L.Cooper, P.M.Conn, R.F.Walker // Biol. Reprod. – 1980. – Vol. 23, No. 3. – P. 611-615. 212. Daiguji, M. The diurnal variations of dopamine-beta-hydroxylase activity in the hypothalamus and locus coeruleus of the rat / M.Daiguji, M.Mikuni, F.Okada, I.Yamashita // Brain Res. – 1978. – Vol. 155, No. 2 – P. 409-412. 213. Dardente, H. Melatonin-dependent timing of seasonal reproduction by the pars tuberalis: pivotal roles for long daylengths and thyroid hormones / H.Dardente // J. Neuroendocrinol. – 2012. – Vol. 24, No. 2. – P. 249-266. 214. Dardente, H. MT1 melatonin receptor mRNA expressing cells in the pars tuberalis of the European hamster: effect of fotoperiod / H.Dardente, P.Klosen, P.Pévet, M.Masson-Pévet // Neuroendocrinology. – 2003. – Vol. 15, No. 8. – P. 778-786. 215. Davidson, A.J. Resetting of central and periferal circadian oscillators in aged rats / A.J.Davidson, S.Yamazaki, D.M.Arble, M.Menaker, G.D.Block // Neurobiol. Aging. – 2008. – Vol. 29, No. 3. – P. 471-477. 216. Dawson, D. Chronobiotics – drugs that shift rhythms / D.Dawson, S.M.Armstrong // Pharmacol. Ther. – 1996. – Vol. 69, No. 1. – P. 15-36. 217. Dax, E.M. Age-associated changes in pineal adrenergic receptors and melatonin synthesizing enzymes in the Wistar rat / E.M.Dax, D.Sugden // J. Neurochem. – 1988. – Vol. 50, No. 2. – P. 468-472. 215 218. Deguchi, T. Inhibition of transmethylations of biogenic amines by S-adenosylhomocysteine. Enhancement of transmethylation by adenosylhomocysteinase / T.Deguchi, J.Barchas // J. Biol. Chem. – 1971. – Vol. 246, No. 10. – P. 3175-3181. 219. de la Iglesia, H.O. Lateralization of circadian pacemaker output: activation of left- and rightsided luteinizing hormone-releasing hormone neurons involves a neural rather than a humoral pathway / H.O.de la Iglesia, J.Meyer, W.J.Schwartz // J. Neurosci. – 2003. – Vol. 23, No. 19. – P. 7412-7414. 220. de la Iglesia, H.O. Minireview: timely ovulation: circadian regulation of the female hypothalamo-pituitary-gonadal axis / H.O.de la Iglesia, W.J.Schwartz // Endocrinology. – 2006. – Vol. 147, No. 3. – P. 1148-1153. 221. Deurveilher, S. Indirect projections from the suprachiasmatic nucleus to major arousalpromoting cell groups in rat: implications for the circadian control of behavioural state / S.Deurveilher, K.Semba // Neuroscience. – 2005. – Vol. 130, No. 1. – P. 165-183. 222. Devlin, P. F. Signs of time: environmental input to the circadian clock / P.F.Devlin // J. Exp. Bot. – 2002. – Vol. 53, No. 374. – Р. 1535-1550. 223. Devorshak-Harvey, E. Endogenous opioid peptide regulation of pulsatile luteinizing hormone secretion during pregnancy in the rat / E.Devorshak-Harvey, A.Bona-Gallo, R.V.Gallo // Neuroendocrinology. – 1987. – Vol. 46, No. 5. – P. 369-378. 224. Díaz, E. Effect of exogenous melatonin on neuroendocrine-reproductive function of middle-aged female rats / E.Díaz, C.Fernández, P.O.Castrillón, A.I.Esquifino, B.Marín, B.Díaz López // J. Reprod. Fertil. – 1999. – Vol. 117, No. 2. – P. 331-337. 225. Donoso, A.O. Glutamate receptors of the non-N-methyl-D-aspartic acid type mediate the increase in luteinizing hormone releasing hormone release by excitatory amino acid in vitro / A.O.Donoso, F.J.López., A.Negro-Vilar // Endocrinology. – 1990. – Vol. 126, No. 1. – P. 414420. 226. Donovan, B.T. The hypothalamus and sexual maturation in the rats / B.T.Donovan, J.J.van der Werff Ten Bosch // J. Physiol. – 1959. – Vol. 147, No. 1. – P. 79-92. 227. Downs, J.L. The role of the brain in female reproductive aging / J.L.Downs, P.M.Wise // Mol. Cell. Endocrinol. – 2009. – Vol. 299, No. 1. – P. 32-38. 228. Dungan, H.M. Minireview: kisspeptin neurons as central processors in the regulation of gonadotropin-releasing hormone secretion / H.M.Dungan, D.K.Clifton, R.A.Steiner // Endocrinology. – 2006. –Vol. 147, No. 3. – P. 1154-1158. 229. Dupré, S.M. Evidence for RGS4 modulation of melatonin and thyrotrophin signalling pathways in the pars tuberalis / S.M.Dupré, H.Dardente, M.J.Birnie, A.S.Loudon, G.A.Lincoln, D.G.Hazlerigg // J. Neuroendocrinol. – 2011. – Vol. 23, No. 8. – P. 725-732. 216 230. Ebadi, M. Neural pathways and neurotransmitters affecting melatonin synthesis / M.Ebadi, P.Govitrapong // J. Neural Trans. – 1986. – Vol. 21, Suppl. – P. 125-155. 231. Ebbiary, N.A.A. Hypothalamic-pituitary ageing: progressive increase in FSH and LH concentrations throughout the reproductive life in regularly menstruating women / N.A.A.Ebbiary, E.A.Lenton, I.D.Cooke // Clin. Endocrinol. (Oxf.) – 1994. – Vol. 41, No. 2. – P. 199-206. 232. Echeverria, D. Acute behavioral comparisons of toluene and ethanol in human subjects / D.Echeverria, L.Fine, G.Langolf, T.Schork, C.Sampaio // Br. J. Ind. Med. – 1991. – Vol. 48, No. 11. – P. 750-761. 233. Edelfors, S. The effect of toluene exposure for up to 18 months (78 weeks) on the (Ca2+/Mg2+)ATPase and fluidity of synaptosomal membranes isolated from rat brain / S.Edelfors, A.Ravn-Jonsen // Pharmacol. Toxicol. – 1989. – Vol. 65, No. 2. – P. 140-142. 234. Edelstein, K. The intergeniculate leaflet does not mediate the disruptive effects of constant light on circadian rhythms in the rat / K.Edelstein, S.Amir // Neuroscience. – 1999. – Vol. 90, No. 3. – P. 1093-1101. 235. Ellis, L.C. The direct action of melatonin and serotonin on testicular androgen production in vitro / L.C.Ellis // J. Reprod. Fertil. – 1969. – Vol. 18, No. 1. – P. 159. 236. Ellis, L.C. Inhibition of rat testicular androgen synthesis in vitro by melatonin and serotonin / L.C.Ellis // Endocrinology. – 1972. – Vol. 90, No. 1. – P. 17-28. 237. Elsharkawy, A.M. Todralazine hepatotoxicity: a sting in the histone tail / A.M.Elsharkawy // J. Hepatol. – 2007. – Vol. 46, No. 2. – P. 189-192. 238. Esquifino, A.I. Changes of prolactin regulatory mechanisms in aging: 24-h rhythms of serum prolactin and median eminence and adenohypophysial concentration of dopamine, serotonin, gamma-aminobutyric acid, taurine and somatostatin in young and aged rats / A.I.Esquifino, P.Cano, V.Jimenez, C.F.Reyes Toso, D.P.Cardinali // Exp. Gerontol. – 2004. – Vol. 39, No. 1. – P. 45-52. 239. Evans, W.S. Effects of opioid receptor blockade on luteinizing hormone (LH) pulses and interpulse LH concentrations in normal women during the early phase of the menstrual cycle / W.S.Evans, M.L.Weltman, M.L.Johnson, A.Weltman, J.D.Veldhuis, A.D.Rogol // J. Endocrinol. Invest. – 1992. – Vol. 15, No. 7. – P. 525-531. 240. Everett, J.W. A 24-hour periodicity in the “LH-release apparatus” of female rat, disclosed by barbiturate sedation / J.W.Everett, C.H.Sawyer // Endocrinology. – 1950. – V. 47, No. 3. – P. 198-218. 217 241. Ferreyra, G.A. Photic control of nitric oxide synthase activity in the hamster suprachiasmatic nuclei / G.A.Ferreyra, M.P.Cammarota, D.A.Golombek // Brain Res. – 1998. – Vol. 797, No. 2. – P. 190-196. 242. Fink, G. Steroid action on hypothalamic neurons with special reference to estrogen control of luteinizing hormone-releasing hormone biosynthesis and release / G.Fink, R.Rosie, E.Thomson // K.Fuxe, L.F.Agnati (Eds.). Volume transmission in the brain: novel mechanisms for neural transmission. – New York: Raven Press, 1991. – 624 p. – P. 195-211. 243. Fishman, J. Catechol estrogen formation in the central nervous system of the rat / J. Fishman, B.Norton // Endocrinology. – 1975. – Vol. 96, No. 4. – P. 1054-1058. 244. Flatmark, T. Catecholamine biosynthesis and physiological regulation in neuroendocrine cells / T.Flatmark // Acta Physiol. Scand. – 2000. – Vol. 168, No. 1. – P. 1-17. 245. Fonlupt, P. Action of S-adenosyl-L-homocysteine on the metabolism of dopamine, norepinephrine and serotonin in rat brain / P.Fonlupt, M.Roche, L.Cronenberger, H.Pacheco // Arch. Int. Pharmacodyn. Ther. – 1979. – Vol. 240, No. 1. – P. 35-44. 246. Forcada, F. Effects of ageing and exogenous melatonin on pituitary responsiveness to GnRH in ewes during anestrus and the reproductive season / F.Forcada, J.A.Abecia, A.Casao, J.A.Cebrián-Pérez, T.Muiño-Blanco, I.Palacín // Theriogenology. – 2007. – Vol. 67, No. 4. – P. 855-862. 247. Forman, L.J. Maintenance by L-DOPA treatment of estrous cycles and LH response to estrogen in aging female rats / L.J.Forman, W.E.Sonntag, N.Miki, J.Meites // Exp. Aging Res. – 1980. – Vol. 6, No. 6. – P. 547-554. 248. Foulkes, N.S. Rhythmic transcription: the molecular basis of circadian melatonin synthesis / N.S.Foulkes, D.Whitmore, P.Sassone-Corsi // Biol. Cell. – 1997. – Vol. 89, No. 8. – P. 487-494. 249. Fox, S.R. Chemical characterization of neuroendocrine targets for progesterone in the female rat brain and pituitary / S.R.Fox, R.E.Harlan, B.D.Shivers, D.W.Pfaff // Neuroendocrinology. – 1990. – Vol. 51, No. 3. – P. 276-283. 250. Fraschini, F. Brain receptors sensitive to indole compounds: function in control of luteinizing hormone secretion / F.Fraschini, B.M.Mess, F.Piva, L.Martini // Science. – 1968. – Vol. 159, No. 3819. – P. 1104-1105. 251. Freeman, M.E. Neuroendocrine control of the ovarian cycle of the rat / M.E.Freeman // J.D.Neill (Ed.) Knobil and Neill’s Physiology of Reproduction (third edition). – New York: Elsevier, 2006. – 3269 p. – P. 2327-2387. 252. Freeman, M.E. Prolactin: structure, function, and regulation of secretion / M.E.Freeman, B.Kanyicska, A.Lerant, G.Nagy // Physiol. Rev. – 2000. – Vol. 80, No. 4. – P. 1523-1631. 218 253. Frungieri, M.B., Direct effect of melatonin on Syrian hamster testes: melatonin subtype 1a receptors, inhibition of androgen production, and interaction with the local corticotropinreleasing hormone system / M.B.Frungieri, A.Mayerhofer, K.Zitta, O.P.Pignataro, R.S.Calandra, S.I.Gonzalez-Calvar // Endocrinology. – 2005. – Vol. 146, No. 3. – P. 1541-1552. 254. Fuller, R.W. Effects of L-dopa on epinephrine concentration in rat brain: possible role of inhibition of norepinephrine N-methyltransferase by S-adenosylhomocysteine / R.W.Fuller, S.K.Hemrick-Luecke, K.W.Perry // J. Pharmacol. Exp. Ther. – 1982. – Vol. 223, No. 1. – P. 8489. 255. Funabashi, T. Gonadotropin-releasing hormone exhibits circadian rhythm in phase with argininevasopressin in co-cultures of the female rat preoptic area and suprachiasmatic nucleus / T.Funabashi, K.Shinohara, D.Mitsushima, F.Kimura // J. Neuroendocrinol. – 2000. – Vol. 12, No. 6. – P. 521-528. 256. Fuxe, K. Effects of subacute treatment with toluene on cerebrocortical alpha- and betaadrenergic receptors in the rat. Evidence for an increased number and a reduced affinity of betaadrenergic receptors / K.Fuxe, M.Martire, G.von Euler, L.F.Agnati, T.Hansson, K.Andersson, J.-Å.Gustafsson, A.Harfstrand // Acta Physiol. Scand. – 1987. – Vol. 130, No. 2. – P. 307-311. 257. Gao, L. Cognitive and neurochemical alterations in hyperhomocysteinemic rat / L.Gao, X.N.Zeng, H.M.Guo, X.M.Wu, H.J.Chen, R.K.Di, Y.Wu // Neurol. Sci. – 2012. – Vol. 33, No. 1. – P. 39-43. 258. Gauer, F. Daily variations in melatonin receptor density of rat pars tuberalis and suprachiasmatic nuclei are distinctly regulated / F.Gauer, M.Masson-Pévet, J.Stehle, P.Pévet // Brain Res. – 1994. – Vol. 641, No. 1. – P. 92-98. 259. Gerasimov, M.R. Toluene inhalation produces regionally specific changes in extracellular dopamine / M.R.Gerasimov, W.K.Schiffer, D.Marstellar, R.Ferrieri, D.Alexoff., S.L.Dewey // Drug Alcohol Depend. – 2002. – Vol. 65, No. 3. – P. 243-251. 260. Gerhold, L. M. Suppression of vasoactive intestinal polypeptide in the suprachismatic nucleus leads to aging-like alterations in cAMP rhythms and activation of gonadotropin-releasing hormone neurons / L.M.Gerhold, K.L.Rosewell, P.M.Wise // J. Neurosci. – 2005. – Vol. 25, No. 1. – P. 62-67. 261. Gibson, E.M. Aging in the circadian system: considerations for health, disease prevention, and longevity / E.M.Gibson, W.P.Williams 3rd, L.J.Kriegsfeld // Exp. Gerontol. – 2009. – Vol. 44, No. 1-2. –P. 51-56. 262. Gilles-Gonzalez, M.A. Signal transduction by heme-containing PAS-domain protein / M.A.Gilles-Gonzalez, G.Gonzalez // J. Appl. PHysiol. – 2004. – Vol. 96, No. 2. – P. 774-783. 219 263. Gillespie, J.M. Repression of gonadotropin-releasing hormone (GnRH) gene expression by melatonin may involve transcription factors COUP-TFI and C/EBP beta binding at the GnRH enhancer / J.M.Gillespie, D.Roy, H.Cui, D.D.Belsham // Neuroendocrinology – 2004. – Vol. 79, No. 2. – P. 63-72. 264. Gillette, M.U. Circadian actions of melatonin at the suprachiasmatic nucleus / M.U.Gillette, A.J.McArthur // Behav. Brain Res. – 1996. – Vol. 73, No. 1-2. – P. 135-139. 265. Golan, J. Morphometric parameters of the human pineal gland in relation to age, body weight and height / J.Golan, K.Torres, G.J.Staśkiewicz, G.Opielak, R.Maciejewski // Folia Morphol. (Warsz.). – 2002. – Vol. 6, No. 1-2. – P. 111-113. 266. Goldman, J.M. Suppression of the steroid-primed luteinizing hormone surge in the female rat by sodium dimethyldithiocarbamate: relationship to hypothalamic catecholamines and GnRH neuronal activation / J.M.Goldman, A.S.Murr, A.R.Buckalew, R.L.Cooper // Toxicol. Sci. – 2008. – Vol. 104, No. 1. – P. 107-112. 267. Goldsmith, P.C. Glutamate-immunoreactive neurons and their gonadotropin-releasing hormoneneuronal interactions in the monkey hypothalamus / P.C.Goldsmith, K.K.Thind, A.D.Perera, T.M.Plant // Endocrinology. – 1994. – Vol. 134, No. 2. – P. 858-868. 268. Goldzieher, J.W. The polycystic ovary. I. Clinical and histologic features / J.W.Goldzieher, J.A.Green // J. Clin. Endocrinol. Metab. – 1962. – Vol. 22. – P. 325-338. 269. González, S. Circadian-related heteromerization of adrenergic and dopamine D4 receptors modulates melatonin synthesis and release in the pineal gland / S.González, D.Moreno-Delgado, E.Moreno, K.Pérez-Capote, R.Franco, J.Mallol, A.Cortés, V.Casadó, C.Lluís, J.Ortiz, S.Ferré, E.Canela, P.J.McCormick // PLoS Biol. – 2012 – Vol. 10, No. 6. – e1001347. 270. Gordon, C.J. Aging and susceptibility to toluene in rats: a pharmacokineticbiomarker, and physiological approach / C.J.Gordon, R.R.Gottipolu, E.M.Kenyon, R.Thomas, M.C.Schladweiler, C.M.Mack, J.H.Shannahan, J.G.Wallenborn, A.Nyska, R.C.MacPhail, J.E.Richards, M.DeVito, U.P.Kodavanti // J. Toxicol. Environ. Health A. – 2010. – Vol. 73, No. 4. – P. 301–318. 271. Gore, A.C. Age-related changes in hypothalamic gonadotropin-releasing hormone and N-methyl-D-aspartate receptor gene expression,and their regulation by oestrogen, in the female rat / A.C.Gore, T.Oung, M.J.Woller // J. Neuroendocrinol. – 2002. – Vol. 14, No. 4. – P. 300-309. 272. Gore, A.C. Neural circuits regulating pulsatile luteinizing hormone release in the female guineapig: opiod, adrenergic and serotoninergic interactions / J. Neuroendocrinol. – 2001. – Vol. 13, No. 3. – P. 239-248. A.C.Gore, E.Terasawa // 220 273. Gore, A.C. Gonadotropin-releasing hormone and NMDA receptor gene expression and colocalization change during puberty in female rats / A.C.Gore, T.J.Wu, J.J.Rosenberg, J.L.Roberts // J. Neurosci. – 1996. – Vol. 16, No. 17. – P. 5281-5289. 274. Goroll, D. Preoptic release of amino acid neuro-transmitters evaluated in peripubertal and young adult female rats by push-pull perfusion / D.Goroll, P.Arias, W.Wuttke // Neuroendocrinology. – 1993. – Vol. 58, No. 1. – P. 11-15. 275. Görtz, P. Implications for hyperhomocysteinemia: not homocysteine but its oxidized forms strongly inhibit neuronal network activity / P.Görtz, A.Hoinkes, W.Fleischer, F.Otto, B.Schwahn, U.Wendel, M.Siebler // J. Neurol. Sci. – 2004. – Vol. 218, No. 1-2. – P. 109-114. 276. Gospe, S.M. Jr. Central nervous system distribution of inhaled toluene / S.M.Gospe Jr., M.J.Calaban // Fundam. Appl. Toxicol. – 1988. – Vol. 11, No. 3. – P. 540-545. 277. Gospe, S.M. Jr. Behavioral and neurochemical changes in folate-deficient mice / S.M.Gospe Jr., D.W.Gietzen, P.J.Summers, J.M.Lunetta, J.W.Miller, J.Selhub, W.G.Ellis, A.J.Clifford // Physiol. Behav. – 1995. – Vol. 58, No. 5. – P. 935-941. 278. Gottsch, M.L. Molecular properties of Kiss1 neurons in the arcuate nucleus of the mouse / M.L.Gottsch, S.M.Popa, O.K.Rønnekleiv, E.Sanz, J.K.Lawhorn, G.S.McKnight, J.Qiu, K.J.Tonsfeldt, D.K.Clifton, M.A.Bosch, R.D.Palmiter, M.J.Kelly, R.A.Steiner // Endocrinology. – 2011. – Vol. 152, No. 11. – P. 4298-4308. 279. Gu, G.B. Projections of the sexually dimorphic anteroventral periventricular nucleus in the female rat / G.B.Gu, R.B.Simerly // J. Comp. Neurol. – 1997. – Vol. 384, No. 1. – P. 142164. 280. Guardiola-Lemaitre, B. Toxicology of melatonin / B.Guardiola-Lemaitre // J. Biol. Rhythms. – 1997. – Vol. 12, No. 6. – P. 697-706. 281. Guillaumond, F. Differential control of Bmail1 circadian transcription by REV-ERB and ROR nuclear receptors / F.Guillaumond, H.Dardente, V.Giguere, N.Cermakian // J. Biol. Rhythms. – 2005. – Vol. 20, No. 5. – P. 391-403. 282. Güler, A.D. Melanopsin cells are the principal conduits for rod-core input to non-image-forming vision / A.D.Güler, J.L.Ecker, G.Lall, S.Haq, C.M.Altimus, H.W.Liao, A.R.Barnard, H.Cahill, T.C.Badea, H.Zhao, M.W.Hankins, D.M.Berson, R.J.Lucas, K.W.Yau, S.Hattar // Nature. – 2008. – Vol. 453, No. 7191. – P. 102-105. 283. Gundlah, C. Distribution of estrogen receptor beta (Erβ) mRNA in hypothalamus, midbrain and temporal lobe of sprayed macaque: continued expression with hormone replacement / C.Gundlah, S.G.Kohama, S.J.Mirkes, V.T.Garyfallou, H.F.Urbanski, C.L.Bethea // Brain Res. Mol. Brain Res. – 2000. – Vol. 76, No. 2. – P. 191-204. 221 284. Gunnet, J.W. Effects of gonadal steroids on tuberoinfundibular and tuberohypophyseal dopaminergic neural activity in male and female rats / J.W.Gunnet, K.J.Lookingland, K.E.Moor // Proc. Soc. Biol. Med. – 1986. – Vol. 183, No. 1. – P. 48-53. 285. Gusek, W. Histology of the pineal gland in the elderly human / W.Gusek // Aktuelle Gerontol. – 1983. – Vol. 13, No. 3. – P. 111-114. 286. Ha, C.M. Progesterone increases mRNA levels of pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide (PACAP) and type I PACAP receptor (PAC) in the rat hypothalamus / C.M.Ha, J.H.Kang, E.J.Choi, M.S.Kim, J.W.Park, Y.Kim, W.S.Choi, S.Y.Chun, H.B.Kwon, B.J.Lee // Brain Res. Mol. Brain Res. – 2000. – Vol. 78, No. 1-2. – P. 59-68. 287. Haak, L.L. Metabotropic glutamate receptor activation modulates kainate and serotonin calcium response in astrocytes / L.L.Haak, H.C.Heller, A.N.van den Pol // J. Neurosci. – 1997. – Vol. 17, No. 5. – P. 1825-1837. 288. Hanchate, N.K. Kisspeptin-GPR54 signaling in mouse NO-synthesizing neurons participates in the hypothalamic control of ovulation / N.K.Hanchate, J.Parkash, N.Bellefontaine, D.Mazur, W.H.Colledge, X.d'Anglemont de Tassigny, V.Prevot // J. Neurosci. – 2012. – Vol. 32, No. 3. – P. 932-945. 289. Hardeland, R. Melatonin / R.Hardeland, S.R.Pandi-Perumal, D.P.Cardinali // Int. J. Biochem. Cell Biol. – 2006. – Vol. 38, No. 3. – P. 313-316. 290. Harney, J.P. In vivo antisense antagonism of vasoactive intestinal peptide in the suprachiasmatic nuclei causes aging-like changes in the estradiol-induced luteinizing hormone and prolactin surges / J.P.Harney, K.Scarbrough, K.L.Rosewell, P.M.Wise // Endocrinology. – 1996. – Vol. 137, No. 9. – P. 3696-3701. 291. Hasegawa, A. Ultrastructural study of the human pineal gland in aged patients including a centenarian / A.Hasegawa, K.Ohtsubo, N.Izumiyama., H.Shimada // Acta Pathol. Jpn. – 1990. – Vol. 40, No. 1. – P. 30-40. 292. Hastings, M. Circadian clocks: regulators of endocrine and metabolic rhythms / M.Hastings, J.S.O’Neill, E.S.Maywood // J. Endocrinol. – 2007. – Vol. 195, No. 2. – P. 187-198. 293. Hayashi, K. Mechanisms underlying the effects of estrogen on nocturnal melatonin synthesis in peripubertal female rats: relation to norepinephrine and adenylate cyclase / K.Hayashi, Y.Okatani // J. Pineal Res. – 1990. – Vol. 26, No. 3. – P. 178-183. 294. Henden, T. Age-associated reduction in pineal beta-adrenergic receptor density is prevented by life-long food restriction in rats / T.Henden, K.A.Stokkan, R.J.Reiter, K.O.Nonaka, A.Lerchl, D.J.Jones // Biol. Signals. – 1992. – Vol. 1, No. 1. – P. 34-39. 295. Herbison, A.E. Noradrenergic regulation of cyclic GnRH secretion / A.E.Herbison // Rev. Reprod. – 1997. – Vol. 2, No. 1. – P. 1-6. 222 296. Herbison, A.E. Multimodal influence of estrogen upon gonadotropine-releasing hormone neurons / A.E.Herbison // Endocr. Rev. – 1998. – Vol. 19, No. 3. – P. 302-330. 297. Herbison, A.E. GnRH neuron / A.E.Herbison // H.Henry, A.Norman (Eds.) Encyclopedia of hormones. – San Diego: Academic Press, 2003. – P. 171-177. 298. Herbison, A.E. Physiology of the gonadotropin-releasing hormone neuronal network / A.E.Herbison // J.D.Neill (Ed.) Knobil and Neill’s Physiology of Reproduction (third edition). – New York: Elsevier, 2006. – 3269 p. – P. 1415-1482. 299. Herbison, A.E. New evidence for estrogen receptors in gonadotropine-releasing hormone neurons / A.E.Herbison, J.R.Pape // Front. Neuroendocrinol. – 2001. – Vol. 22, No. 4. P. 292308. 300. Hernández, G. Effect of treatment with the selective oestrogen receptor modulator LY117018HClon pituitary sensitivity to GnRH and subsequent ovulation / G.Hernández, J.G.HernándezJiménez, P.Guelmes, J.E.Sánchez-Criado, C.Bellido, J.R.Martínez-Morales, L.Prieto, F.Marín, C.Glidewell-Kenney, F.J.López, R.Alonso // Reproduction. – 2003. – Vol. 125, No. 4. – P. 597606. 301. Hester, S.D. Acute toluene exposure alters expression of genes in the central nervous system associated with synaptic structure and function / S.D.Hester, A.F.Johnstone, W.K.Boyes, P.J.Bushnell, T.J.Shafer // Neurotoxicol. Teratol. – 2011. – Vol. 33, No. 5. – P. 521-529. 302. Hillefors-Berglund, M. Persistent, specific and dose-dependent effects of toluene exposure on dopamine D2 agonist binding in the rat caudate-putamen / M.Hillefors-Berglund, Y.Liu, von Euler G. // Toxicology. – 1995. – Vol. 100, No. 1-3. – P. 185-94. 303. Ho. A.K. Phosphatase inhibitors potentiate adrenergic-stimulated cAMP and cGMP production in rat pinealocytes / A.K.Ho, C.L.Chik // Am J. Physiol. – 1995. – Vol. 268, No. 3 (1). – E458466. 304. Hofman, M.A. Alterations in circadian rhythmicity of the vasopressin-producing neurons of the human suprachiasmatic nucleus (SCN) with aging / M.A.Hofman, D.F.Swaab // Brain Res. – 1994. – Vol. 651, No. 1-2. – P. 134-142. 305. Honma, K.I. Endogenous ultradian rhythms in rats exposed to prolonged continuous light / K.I.Honma, T.Hiroshige // Am J. Physiol. – 1978. – Vol. 235, No. 5. – R250-256. 306. Hooijmans, C.R. S-adenosylmethionine and S-adeosylhomocysteine levels in the aging brain of APP/PS1 Alzheimer mice / C.R.Hooijmans, H.J.Blom // Neurol. Sci. – 2009. – Vol. 30, No. 5. – P. 439-445. 307. Horvath, T.L. Suprachiasmatic efferents avoid phenestrated capillaries but innervate neuroendocrine cells, including those producing dopamine / T.L.Horvath // Endocrinology. – 1997. – Vol. 138, No. 3. – P. 1312-1320. 223 308. Horvath, T.L. Gender-specific apposition between vasoactive intestinal peptide-containing axons and gonadotrophin-releasing hormone-producing neurons in the rat / T.L.Horvath, V.Cela, E.M.van der Beek // Brain Res. – 1998. – Vol. 795, No. 1-2. – P. 277-281. 309. Horvath, T.L. Luteinizing hormone-releasing hormone and gamma-aminobutyric acid neurons in the medial preoptic area are synaptic targets of dopamine axons originating in anterior periventricular areas / T.L.Horvath, F.Naftolin, C.Leranth // J. Neuroendocrinol. – 1993. – Vol. 5, No. 1. – P. 71-79. 310. Hosoi, T. Homocysteine induces X-box-binding protein 1 splicing in the mice brain / T.Hosoi, K.Ogawa, K.Ozawa // Neurochem. Int. – 2010. – Vol. 56, No. 2. – P. 216-220. 311. Hrabovszky, E. Glutamatergic and GABAergic innervation of human gonadotropin-releasing hormone-I neurons / E.Hrabovszky, C.S.Molnár, R.Nagy, B.Vida, B.Á.Borsay, K.Rácz, L.Herczeg, M.Watanabe, I.Kalló, Z.Liposits // Endocrinology. – 2012. – Vol. 153, No. 6. – P. 2766-2776. 312. Hsieh, G.C. Evaluation of toluene exposure via drinking water on levels of regional brain biogenic monoamines and their metabolites in CD-1 mice / G.C.Hsieh, R.P.Sharma, R.D.Parker, R.A.Coulombe Jr. // Ecotoxicol. Environ. Saf. – 1990. – Vol. 20, No. 2. – P. 175-184. 313. Humbert, W. The pineal gland of the aging rat: calcium localization and variation in the number of pinealocytes / W.Humbert, P.Pévet // J. Pineal Res. – 1995. – Vol. 18, No. 1. – P. 32-40. 314. Hunt, A.E. Activation of MT(2) melatonin receptors in rat suprachiasmatic nucleus phase advances the circadian clock / A.E.Hunt, W.M.Al-Ghoul, M.U.Gillette, M.L.Dubocovich // Am. J. Physiol. Cell. Physiol. – 2001. – Vol. 280, No. 1. – C110-118. 315. Hyland, K. Measurement of total plasma and cerebrospinal fluid homocysteine by fluorescence following high-performance liquid chromatography and precolumn derivatization with o-phthaldialdehyde / K.Hyland, T.Bottiglieri // J. Chromatogr. – 1992. – Vol. 579, No. 1. – P. 55-62. 316. Iizumi, H. Effect of chronic toluene exposure on tyrosine hydroxylase-positive nerve elements in the rat forebrain: an immunohistochemical study combined with semiquantitative morphometric analysis / H.Iizumi, K.Fukui, H.Utsumi, Y.Kawashima, T.Nakajima // Neuroreport. – 1995. – Vol. 7, No. 1. – P. 81-84. 317. Ikegami, K. Seasonal time measurement during reproduction / K.Ikegami, T.Yoshimura // J. Reprod. Dev. – 2013. – Vol. 59, No. 4. – P. 327-333. 318. Imamura, K. Homocysteine is toxic for dopaminergic neurons in primary mesencephalic culture / K.Imamura, T.Takeshima, K.Nakaso, K.Nakashima // Neuroreport. – 2007. – Vol. 18, No. 13. – P. 1319–1322. 224 319. Inouye, S.T. Circadian rhythms of neuropeptides in the suprachiasmatic nucleus / S.T.Inouye // Prog. Brain Res. – 1996. – Vol. 111. – P. 75-90. 320. Iremonger, K.J. Glutamate regulation of GnRH neuron excitability / K.J.Iremonger, S.Constantin, X.Liu, A.E.Herbison // Brain Res. – 2010. – Vol. 1364. – P. 35-43. 321. Ishida, Y. Circadian rhythm of aromatic L-amino acid decarboxylase in the rat suprachiasmatic nucleus: gene expression and decarboxylating activity in clock oscillating cells / Y.Ishida, C.Yokoyama, T.Inatomi, K.Yagita, X.Dong, L.Yan, S.Yamaguchi, I.Nagatsu, T.Komori, K.Kitahama, H.Okamura // Genes Cells. – 2002. – Vol. 7, No. 5. – P. 447-459. 322. Itoh, M.T. Expression of luteinizing hormone/chorionic gonadotropin receptor in the rat pineal gland / M.T.Itoh, T.Hosaka, N.Takahashi // J. Pineal Res. – 2006. – Vol. 41, No. 1. – P. 35-41. 323. Jamali, A.K. Daily cycle of fos expression within hypothalamic POMC neurons of the male rat / A.K.Jamali, G.Tramu // Brain Res. – 1997. – Vol. 771, No. 1. – P. 45-54. 324. Jamali, A.K. Control of rat hypothalamic pro-opiomelanocortin neurons by a circadian clock that is entrained by the daily light-off signal / A.K.Jamali, G.Tramu // Neuroscience. – 1999. – Vol. 93, No. 3. – P. 1051-1061. 325. Jarry, H. Amino acid neurotransmitter release in the preoptic area of rats during the positive feedback actions of estradiol on LH release / H.Jarry, B.Hirsch, S.Leonhardt, W.Wuttke // Neuroendocrinology. – 1992. – Vol. 56, No. 2. – P. 133-140. 326. Jarry, H. Further evidence that preoptic anterior hypothalamic GABAergic neurons are part of the GnRH pulse and surge generator / H.Jarry, A.Perschl, W.Wuttke // Acta Endocrinol. (Copenh.). – 1988. – Vol. 118, No. 4. – P. 573-579. 327. Jengeleski, C.A. Noradrenergic innervation of human pineal gland: abnormalities in aging and Alzheimer's disease / C.A.Jengeleski, R.E.Powers, D.T.O'Connor, D.L.Price // Brain Res. – 1989. – Vol. 481, No. 2. – P. 378-382. 328. Jilg, A. Rhythms in clock proteins in the mouse pars tuberalis depend on MT1 melatonin receptor signaling / A.Jilg, J.Moek, H.Korf // Eur. J. Neurosci. – 2005. – Vol. 22, No. 11. – P. 2845-2854. 329. Judd, S.J. Inhibition of gonadotropin and prolactin release by dopamine: effect of endogenous estradiol levels / S.J.Judd, J.S.Rakoff, S.S.C.Yen // J. Clin. Endocrinol. Metab. – 1978. – Vol. 47, No. 3. – P. 494-498. 330. Juszczak, M. Oxytocin and prolactin release after hypertonic saline administration in melatonintreated male Syrian hamsters / M.Juszczak, R.W.Steger, C.Fadden, A.Bartke // J. Physiol. Pharmacol. – 1996. – Vol. 47, No. 2. – P. 289-301. 225 331. Kalra, S.P. Circadian rhythm in luteinizing hormone releasing hormone (LH-RH) content of preoptic area during the rat estrous cycle / S.P.Kalra // Brain Res. – 1976. – Vol. 104, No. 2. – P. 354-358. 332. Kalra, S.P. Neural circuitry involved in the control of LHRH secretion: a model for preovulatory LH release / S.P.Kalra // W.F.Ganong, L.Martini (Eds.) Frontiers in Neuroendocrinology. – New York: Raven Press, 1986. – Vol. 9. – P. 31-75. 333. Kalra, S.P. Mandatory neuropeptide-steroid signaling for the preovulatory luteinizing hormonereleasing hormone discharge / S.P.Kalra // Endocr. Rev. – 1993. – Vol. 14, No. 5. – P. 507-538. 334. Kalra, S.P. The interactive language of the hypothalamus for the gonadotropin releasing hormone (GNRH) system / S.P.Kalra, T.Horvath, F.Naftolin, B.Xu, S.Pu, P.S.Kalra // J. Neuroendocrinol. – 1997. – Vol. 9, No. 8. – P. 569-576. 335. Kalra, S.P. Neural regulation of luteinizing hormone secretion in the rat / S.P.Kalra, P.S.Kalra // Endocr. Rev. – 1983. – Vol. 4, No. 4. – P. 311-351. 336. Kalsbeek, A. Vasopressin and the output of the hypothalamic biological clock / A.Kalsbeek, E.Fliers, M.A.Hofman, D.F.Swaab, R.M.Buijs // J. Neuroendocrinol. – 2010. – Vol. 22, No. 5. – P. 362-372. 337. Kalsbeek, A. Melatonin sees the light: Blocking GABA-ergic transmission in the paraventricular nucleus induces daytime secretion of melatonin / A.Kalsbeek, M.L.Garidou, I.F.Palm, J.van der Vliet, V.Simonneaux, P.Pévet, R.M.Buijs // Eur. J. Neurosci. – 2000. – Vol. 12, No. 9. – P. 3146-3154. 338. Kalsbeek, A. SCN outputs and the hypothalamic balance of life / A.Kalsbeek, I.F.Palm, S.E.La Fleur, F.A.Scheer, S.Perreau-Lenz, M.Ruiter F.Kreier, C.Cailotto, R.M.Buijs // J. Biol. Rhythms. – 2006. – Vol. 21, No. 6. – P. 458-469. 339. Kamase, H. The diurnal variations of monoamine oxidase activity in discrete nuclei of rat brain / H.Kamase // Folia Psychiatr. Neurol. Jpn. – 1980. – Vol. 34, No. 4. – P. 481-492. 340. Kamberi, I.A. Effect of anterior pituitary perfusion and intraventricular injection of catecholamines and indoleamines on LH release / I.A.Kamberi, R.S.Mical, J.C.Porter // Endocrinology. – 1970. – Vol. 87, No. 1. – P. 1-12. 341. Kanaka, C. The differential expression patterns of messenger RNAs encoding K-Cl cotransporters (KCC1,2) and Na-K-2Cl cotransporter (NKCCl) in the rat nervous system / C.Kanaka, K.Ohno, A.Okabe, K.Kuriyama, T.Itoh, A.Fukuda, K.Sato // Neuroscience. – 2001. – Vol. 104, No. 4. – P. 933-946. 342. Karbownik, M. Melatonin reduces phenylhydrazine-induced oxidative damage to cellular membranes: evidence for the involvement of iron / M.Karbownik, R.J.Reiter, J.J.Garcia, D.-X.Tan // Int. J. Biochem. Cell Biol. – 2000. – Vol. 32, No. 10. – P. 1045-1054. 226 343. Kauffman, A.S. Emerging ideas about kisspeptin-GPR54 signaling in the neuroendocrine regulation of reproduction / A.S.Kauffman, D.K.Clifton, R.A.Steiner // Trends Neurosci. – 2007. – Vol. 30, No. 10. – P. 504-511. 344. Kelly, M.J. Membrane-initiated estrogen signaling in hypothalamic neurons / M.J.Kelly, O.K.Rønnekleiv // Mol. Cell. Endocrinol. – 2008. – Vol. 290, No. 1-2. – P. 14-23. 345. Kenessov, B. Transformation products of 1,1-dimethylhydrazine and their distribution in soils of fall places of rocket carriers in Central Kazakhstan / B.Kenessov, M.Alimzhanova, Y.Sailaukhanuly, N.Baimatova, M.Abilev, S.Batyrbekova, L.Carlsen, A.Tulegenov, M.Nauryzbayev // Sci. Total Environ. – 2012. – Vol. 427-428. – P. 78-85. 346. Kennaway, D.J. The role of circadian rhythmicity in reproduction / D.J.Kennaway // Hum. Reprod. Update. – 2005. – Vol. 11, No. 1. – P. 91-101. 347. Khavinson, V.Kh. Peptides and ageing / V.Kh.Khavinson // Neuroendocrinol. Lett. – 2002. – Vol. 23, Suppl 3. – P. 11-144. 348. Khavinson, V.Kh. The effect of brain peptides on nerve tissue cells in vitro / V.Kh.Khavinson, V.G.Morozov, N.I.Chalisova, V.B.Okulov // Tsitologiia. – 1997. – Vol. 39, No. 7. – P. 571-576. 349. Khavinson, V. Pinealon increases cell viability by suppression of free radical levels and activating proliferative processes / V.Khavinson, Y.Ribakova, K.Kulebiakin, E.Vladychenskaya, L.Kozina, A.Arutjunyan, A.Boldyrev // Rejuvenation Res. – 2011. – Vol. 14, No. 5. – P. 535-541. 350. Kim, W.K. Involvement of N-methyl-d-aspartate receptor and free radical in homocysteinemediated toxicity on rat cerebellar granule cells in culture / W.K.Kim, Y.S.Pae // Neurosci. Lett. – 1996 – Vol. 216, No. 2. – P. 117-120. 351. Kiriu, T. The distribution of toluene in the brain and its effects on the brain catecholamines in acute toluene poisoning / T.Kiriu, K.Ameno, C.Fuke, S.Ameno, I.Ijiri // Nippon Hoigaku Zasshi (Abstract). – 1990. – Vol. 44, No. 1. – P. 25-33. 352. Kiss, J. Demonstration of serotoninergic axons termination on luteinizing hormone-releasing hormone neurones in the preoptic area of the rat using a combination of immunocytochemistry and high resolution autoradiography / J.Kiss, B.Halász // Neuroscience. – 1985. – Vol. 14, No. 1. – P. 69-78. 353. Klein, D.C. The melatonin rhythm-generating enzyme: molecular regulation of serotonin N-acetyltransferase in the pineal gland / D.C.Klein, S.L.Coon, P.H.Roseboom, J.L.Weller, M.Bernard, J.A.Gastel, M.Zatz, P.M.Iuvone, I.R.Rodriguez, V.Bégay, J.Falcón, G.M.Cahill, V.M.Cassone, R.Baler // Recent Prog. Horm. Res. – 1997. – Vol. 52. – P. 307-357. 354. Ko, C.H. Molecular components of the mammalian circadian clock / C.H.Ko, J.S.Takahashi // Hum. Mol. Genetics. – 2006. – Vol. 15, No. 2. – R271-R277. 227 355. Ko, L. A putative morphological substrate of the catecholamine-influenced neuropeptide Y (NPY) release in the human hypothalamus / L.Ko, G.Rotoli, G.Grignol, W.Hu, I.Merchenthaler, B.Dudas // Neuropeptides. – 2011. – Vol. 45, No. 3. – P. 197-203. 356. Kodavanti, P.R.S. Toluene effects on oxidative stress in brain regions of young-adult, middleage, and senescent Brown Norway rats / P.R.S.Kodavanti, J.E.Royland, J.E.Richards, J.Besas, R.C.MacPhail // Toxicol. Appl. Pharmacol. – 2011. – Vol. 256, No. 3. – P. 386-398. 357. Kolker, D.E. Aging alters circadian and light-induced expression of clock genes in golden hamsters / D.E.Kolker, H.Fukuyama, D.S.Huang, J.S.Takahashi, T.H.Horton, F.W.Turek // J. Biol. Rhythms. – 2003. – Vol. 18, No. 2. – P. 159-169. 358. Kolling, J. Homocysteine induces oxidative-nitrative stress in heart of rats: prevention by folic acid / J.Kolling, E.B.Scherer, A.A.da Cunha, M.J.da Cunha, A.T.Wyse // Cardiovasc. Toxicol. – 2011. – Vol. 11, No. 1. – P. 67-73. 359. Kondratov, R.V. Early aging and age related pathologies in mice deficient in BMAIL1, the core component of the circadian clock / R.V.Kondratov, A.A.Kondratova, V.Y.Gorbacheva, O.V.Vykhovanets, M.P.Antoch // Genes Dev. – 2006. – Vol. 20, No. 14. – P. 1868-1873. 360. Korenevsky, A.V. Circadian and diurnal rhythms of catecholamines in hypothalamic areas responsible for regulation of reproduction in female rats are disturbed by neurotoxicants and corrected by melatonin / A.V.Korenevsky, Yu.P.Milyutina, M.G.Stepanov, A.V.Arutjunyan // L.Golovkin, A.Maliszkewicz (Eds.) Circadian Rhythms: Biology, Cognition and Disorders. – New York: Nova Science Publishers, 2012. – 396 p. – P. 187-208. 361. Korf, H.W. The pineal organ, its hormone melatonin, and the photoneuroendocrine system / H.W.Korf, C.Schomerus, J.H.Stehle // Adv Anat. Embryol. Cell Biol. – 1998. – Vol. 146. – P. 1-100. 362. Kotani, M. The metastasis suppressor gene KiSS-1 encodes kisspeptins, the natural ligands of the orphan G protein-coupled receptor GPR54 / M.Kotani, M.Detheux, A.Vandenbogaerde, D.Communi, J.M.Vanderwinden, E.Le Poul, S.Brezillon, R.Tyldesley, N.Suarez-Huerta, F.Vandeput, C.Blanpain, S.N.Schiffmann, G.Vassart, M.Parmentier // J. Biol. Chem. – 2001. – Vol. 276, No. 37. – P. 34631-34636. 363. Koulu, M. Diurnal variation in the concentrations of catecholamines and indoleamines in the median eminence and in the intermediate and posterior lobes of the pituitary gland of the male rat / M.Koulu, N.Bjelogrlic, H.Agren, J.M.Saavedra, W.Z.Potter, M.Linnoila // Brain Res. – 1989. – Vol. 503, No. 2. – P. 246-252. 364. Krajnak, K. Aging, estradiol and time of day differentially affect serotonin transporter binding in the central nervous system of female rats / K.Krajnak, K.L.Rosewell, M.J.Duncan, P.M.Wise // Brain Res. – 2003. – Vol. 990, No. 1-2. – P. 87-94. 228 365. Kriegsfeld, L.J. The regulation of neuroendocrine function: timing is everything / L.J.Kriegsfeld, R.Silver // Horm. Behav. – 2006. – Vol. 49, No. 5. – P. 557-574. 366. Kronenberg, G. Folate deficiency induces neurodegeneration and brain dysfunction in mice lacking uracil DNA glycosylase / G.Kronenberg, C.Harms, R.W.Sobol, F.Cardozo-Pelaez, H.Linhart, B.Winter, M.Balkaya, K.Gertz, S.B.Gay, D.Cox, S.Eckart, M.Ahmadi, G.Juckel, G.Kempermann, R.Hellweg, R.Sohr, H.Hörtnagl, S.H.Wilson, R.Jaenisch, M.Endres // J. Neurosci. – 2008. – Vol. 9, No. 28. – P. 7219-7230. 367. Kruman, I.I. Homocysteine elicits a DNA damage response in neurons that promotes apoptosis and hypersensitivity to excitotoxicity / I.I.Kruman, C.Culmsee, S.L.Chan, Y.Kruman Z.Guo, L.Penix, M.P.Mattson // J. Neurosci. – 2000. – Vol. 20, No. 18. – P. 6920-6926. 368. Kyrklund, T. Brain lipid changes in rats exposed to xylene and toluene / T.Kyrklund, P.Kjellstrand, K.Haglid // Toxicology. – 1987. – Vol. 45, No. 2. – P. 123-133. 369. Laaks, J. In-tube extraction of volatile organic compounds from aqueous samples: an economical alternative to purge and trap enrichment / J.Laaks, M.A.Jochmann, B.Schilling, T.C.Schmidt // Anal. Chem. – 2010. – Vol. 82, No. 18. – P. 7641-7648. 370. Ladefoged, O. Irreversible effects in rats of toluene (inhalation) exposure for six months / O.Ladefoged, P.Strange, A.Moller, H.R.Lam, G.Ostergaard, J.J.Larsen, P.Arlien-Soborg // Pharmacol. Toxicol. – 1991. – Vol. 68, No. 5. – P. 384-390. 371. Ladosky, W. Possible mechanism of action of 2-hydroxylated estradiol on the positive feedback control for LH release in the rat / W.Ladosky, H.M.Azambuja, H.T.Schneider // J. Steroid Biochem. – 1983. – Vol. l9, No. 1 – P. 639-644. 372. Lang, U. Diurnal rhythm of melatonin action on sexual maturation of male rats / U.Lang, R.W.Rivest, L.V.Schlaepfer, J.C.Bradtke, M.L.Aubert, P.C.Sizonenko // Neuroendocrinology. – 1984. – Vol. 38, No. 4. – P.261-268. 373. Le, W.W. Alpha1-adrenergic receptor blockade blocks LH secretion but not LHRH cFos activation / W.W.Le, K.A.Berghorn, M.S.Smith, G.E.Hoffman // Brain Res. – 1997. – Vol. 747, No. 2. – P. 236-245. 374. LeBel, C.P. Toluene-induced alterations in rat synaptosomal membrane composition and function / C.P.LeBel, R.A.Schatz // J. Biochem. Toxicol. – 1988. – Vol. 3. – P. 279-293. 375. LeBel, C.P. Effect of toluene on rat synaptosomal phospholipid methylation and membrane fluidity / C.P.LeBel, R.A.Schatz // Biochem. Pharmacol. – 1989. – Vol. 38, No. 22. – P. 40054011. 376. LeBel, C.P. Altered synaptosomal phospholipid metabolism after toluene: possible relationship with membrane fluidity, Na+,K(+)-adenosine triphosphatase and phospholipid methylation / C.P.LeBel, R.A.Schatz // J. Pharmacol. Exp. Ther. – 1990. – Vol. 253, No. 3. – P. 1189-1197. 229 377. Lee, E.-S.Y. Effects of homocysteine on the dopaminergic system and behavior in rodents / E.-S.Y.Lee, H.Chen, K.F.A.Soliman, C.G.Charlton // Neurotoxicology. – 2005. – Vol. 26, No. 3. – P. 361-371. 378. Legan, S.J. Role of estrogen as initiator of daily LH surges in the ovariectomized rat / S.J.Legan, G.A.Coon, F.J.Karsch // Endocrinology. – 1975. – Vol. 96, No. 1. – P. 50-56. 379. Legan, S.J. A daily signal for the LH surge in the rat / S.J.Legan, F.J.Karsch // Endocrinology. – 1975. – Vol. 96, No. 1. – P. 57-62. 380. Lenahan, S.E. Evidence for multiple serotoninergic influences on LH release in ovariectomized rats and form modulation of their relative effectiveness by estrogen / S.E.Lenahan, H.R.Siebel, J.H.Johnson // J. Neuroendocrinol. – 1986. – Vol. 44, No. 1. – P. 89-94. 381. Lenders, J.W. Specific genetic deficiences of the A and B isoenzymes of monoamine oxidase are characterized by distinct neurochemical and clinical phenotypes / J.W.Lenders, G.Eisenhofer, N.G.Abeling, W.Berger, D.L.Murphy, C.H.Konings, L.M.Wagemakers, I.J.Kopin, F.Karoum, A.H.van Gennip, H.G.Brunner // J. Clin. Invest. – 1996. – Vol. 97, No. 4. – P. 1010-1019. 382. Lerner, A.B. Isolation of melatonin, the pineal gland factor that lightens melanocytes / A.B.Lerner, J.D.Case, Y.Takahashi, T.H.Lee, W.Mori // J. Am. Chem Soc. – 1958. – Vol. 80, No. 10. – P. 2587. 383. Leupen, S.M. Heterogeneous expression of the potassium-chloride cotransporter KCC2 in gonadotropin-releasing hormone neurons of the adult mouse / S.M.Leupen, S.A.Tobet, W.F.Crowley Jr., K.Kaila // Endocrinology. – 2003. – Vol. 144, No. 7. – P. 3031-3036. 384. Levine, J.E. Gonadotropoin-releasing hormone (GnRH) / J.E.Levine // H.Henry, A.Norman (Eds.) Encyclopedia of Hormones. – San Giego: Academic Press, 2003. – P. 157-165. 385. Levoye, A. Are G protein-coupled receptor heterodimers of physiological relevance? – Focus on melatonin receptors / A.Levoye, R.Jockers, M.A.Ayoub, P.Delagrange, E.Savaskan, J.L.Guillaume // Chronobiol. Int. – 2006. – Vol. 23, No. 1-2. – P. 419-426. 386. Lewin, D.L. Researchers cycle down the path to elucidating melatonin’s rhythms / D.L.Lewin // J. NIH Res. – 1996. – Vol. 8. – P. 45-49. 387. Li, P.H. Catecholamine inhibition of luteinizing hormone secretion in isolated pig pituitary cells / P.H.Li // Biol. Reprod. – 1989. – Vol. 40, No. 5. – P. 914-919. 388. Li, S. Effects of aging and melatonin administration on gonadotropin-releasing hormones (GnRH) gene expression in the male and female rat / S.Li, L.Givalois, G.Pelletier // Peptides. – 1997. – Vol. 18, No. 7. – P. 1023-1028. 389. Lima, C.U. Does the Agaricus blazei Murill mushroom have properties that affect the immune system? An integrative review / C.U.Lima, C.O.Cordova, T.Nóbrega Ode, S.S.Funghetto, M.G.Karnikowski // J. Med. Food. – 2011. – Vol. 14, No. 1-2. – P. 2-8. 230 390. Linnebank, M. Binding of copper is a mechanism of homocysteine toxicity leading to COX deficiency and apoptosis in primary neurons, PC12 and SHSY-5Y cells / M.Linnebank M., H.Lutz, E.Jarre, S.Vielhaber, C.Noelker, E.Struys, C.Jacobs, T.Klockqether, B.O.Evert, W.S.Kunz, U.Wüllner // Neurobiol. Dis. – 2006. – Vol. 23, No. 3. – P. 725-730. 391. Liu, C.C. Effects of S-adenosylhomocysteine and homocysteine on DNA damage and cell cytotoxicity in murine hepatic and microglia cell lines / C.C.Liu, W.Y.Ho, K.L.Leu, H.M.Tsai, T.H.Yang // J. Biochem. Mol. Toxicol. – 2009. – Vol. 23, No. 5. – P. 49-56. 392. Liu, C.L. Effects of toluene exposure during brain growth spurt on GABA a receptor-mediated functions in juvenile rats / C.L.Liu, Y.R.Lin, M.H.Chan, H.H.Chen // Toxicol. Sci. – 2007. – Vol. 95, No. 2. – P. 443-451. 393. Liu, C. Molecular dissection of two distinct actions of melatonin on the suprachiasmatic circadian clock / C.Liu, D.R.Weaver, X.Jin, L.P.Shearman, R.L.Pieschi, V.K.Gribkoff, S.M.Reppert // Neuron. – 1997. – Vol. 19, No. 1. – P. 91-102. 394. Liu, T. N-acetyltransferase is not the rate-limiting enzyme of melatonin synthesis at night / T.Liu, J.Borjigin // J. Pineal Res. – 2005. – Vol. 39, No. 1. – P. 91-96. 395. Liu, X.H. Design, synthesis, biological activities, and 3D-QSAR of new N,N'-diacylhydrazines containing 2-(2,4-dichlorophenoxy)propane moiety / X.H.Liu, L.Pan, Y.Ma, J.Q.Weng, C.X.Tan, Y.H.Li, Y.X.Shi, B.J.Li, Z.M.Li, Y.G.Zhang // Chem. Biol. Drug Des. – 2011. – Vol. 78, No. 4. – P. 689-694. 396. Lo, P.S. Acute neurobehavioral effects of toluene: involvement of dopamine and NMDA receptors / P.S.Lo, C.Y.Wu, H.Z.Sue, H.H.Chen // Toxicology. – 2009. – Vol. 265, No. 1-2. – P. 34-40. 397. Lopez-Gonzalez, M.A. Characterization of melatonin binding sites in the harderian gland and median eminence of the rat / M.A.Lopez-Gonzalez, J.R.Calvo, A.Rubio, R.Goberna, J.M.Guerrero // Life Sci. – 1991. – Vol. 48, No. 12. – P. 1165-1171. 398. Louis, G.W. Molecular mapping of the neural pathways linking leptin to the neuroendocrine reproductive axis / G.W.Louis, M.Greenwald-Yarnell, R.Phillips, L.M.Coolen, M.N.Lehman, M.G.Myers Jr. // Endocrinology. – 2011. – Vol. 152, No. 6. – P. 2302-2310. 399. Lowry, O.H. Protein measurement with the Folin phenol reagent / O.H.Lowry, N.J.Rosebrough, A.L.Farr, R.J.Randall // J. Biol. Chem. – 1951. – Vol. 193, No. 2. – P. 265-275. 400. Lu, J.K. Relationship between circulating estrogens and the central mechanisms by which ovarian steroids stimulate luteinizing hormone secretion in aged and young female rats / J.K.Lu, D.P.Gilman, D.R.Meldrum, H.L.Judd, C.H.Sawyer // Endocrinology. – 1981 – Vol. 108, No. 3. – P. 836-841. 231 401. Lu, N.Z. Ovarian steroid action on tryptophan hydroxylase protein and serotonin compared to localization of ovarian steroid receptors in midbrain of guinea pigs / N.Z.Lu, T.A.Shlaes, C.Gundlah, S.E.Dziennis, R.E.Lyle, C.L.Bethea // Endocrine. – 1999. – Vol. 11, No. 3. – P. 257267. 402. Lucchini, R. Mechanism of neurobehavioral alteration / R.Lucchini, E.Albini, D.Placidi, L.Alessio // Toxicol. Lett. – 2000. – Vol. 112-113. – P. 35-39. 403. Madueño, F. Use of a mutant strain of the cyanobacterium Synechococcus R2 for the determination of nitrate / F.Madueño, M.G.Guerrero // Anal. Biochem. – 1991. – Vol. 198, No. 1. – P. 200-202. 404. Maffucci, J.A. Age- and hormone-regulation of N-methyl-D-aspartate receptor subunit NR2b in the anteroventral periventricular nucleus of the female rat: implications for reproductive senescence / J.A.Maffucci, M.L.Noel, R.Gillette, D.Wu, A.C.Gore // J. Neuroendocrinol. – 2009. – Vol. 21, No. 5. – P. 506-517. 405. Magri, F. Qualitative and quantitative changes of melatonin levels in physiological and pathological aging and in centenarians / F.Magri, S.Sarra, W.Cinchetti, V.Guazzoni, M.Fioravanti, L.Cravello, E.Ferrari // J. Pineal Res. – 2004. – Vol. 36, No. 4. – P. 256-261. 406. Mahesh, V.B. Regulation of the preovulatory gonadotropin surge by endogenous steroids / V.B.Mahesh, D.W.Brann // Steroids. – 1998. – Vol. 63, No. 12. – P. 616-629. 407. Mann, D.R. Role of estrogen and progesterone in facilitating LH release in 4-day cyclic rats / D.R. Mann, C.A.Barraclough // Endocrinology. – 1973. – Vol. 93, No. 3. – P. 694-699. 408. Marcondes, F.K. Determination of the estrous cycle phases of rats: some helpful considerations / F.K.Marcondes, F.J.Bianchi, A.P.Tanno // Braz. J. Biol. – 2002. – V. 62, No.4a. – P. 609-614. 409. Martin, C. Characterization of the light response in the pineal gland of intact and sympathectomized rats / C.Martin, H.Meissl // J. Neural Transm. Gen. Sect. – 1990. – Vol. 79, No. 1-2. – P. 81-91. 410. Martin, J.E. Melatonin inhibition of the in vivo pituitary response to luteinizing hormonereleasing hormone in the neonatal rat / J.E.Martin, S.McKellar, D.C.Klein // Neuroendocrinology. – 1980. – Vol. 31, No. 1. – P. 13-17. 411. Martin, J.E. Selectivity of melatonin pituitary inhibition for luteinizing hormone-releasing hormone / J.E.Martin, C.Sattler // Neuroendocrinology. – 1982. – Vol. 34, No. 2. – P. 112-116. 412. Martins-Afférri, M.P. LHRH release depends on Locus Coeruleus noradrenergic inputs to the medial preoptic area and median eminence / M.P.Martins-Afférri, I.A.Ferreira-Silva, C.R.Franci, J.A.Anselmo-Franci // Brain Res. Bull. – 2003. – Vol. 61, No. 5. – P. 521-527. 413. Matagne, V. Estradiol stimulation of pulsatile gonadotropin-releasing hormone secretion in vitro: correlation with prenatal exposure to sex steroids and induction of sexual precocity in vivo / 232 V.Matagne, G.Rasier, M.-C.Lebrethon, A.Gérard, J.-P.Bourguignon // Endocrinology. – 2004. – Vol. 145, No. 6. – P. 2775-2783. 414. Mattia, C.J. Free radical induction in the brain and liver by products of toluene catabolism / C.J.Mattia, J.D.Adams Jr., S.C.Bondy // Biochem. Pharmacol. – 1993. – Vol. 46, No. 1. – P. 103-110. 415. Mattia, C.J. Toluene-induced oxidative stress in several brain regions and other organs / C.J.Mattia, S.F.Ali, S.C.Bondy // Mol. Chem. Neuropathol. – 1993. – Vol. 18, No. 3. – P. 313328. 416. Mattia, C.J. Effects of toluene and its metabolites on cerebral reactive oxygen species generation / C.J.Mattia, C.P.LeBel, S.C.Bondy // Biochem. Pharmacol. – 1991. – Vol. 42, No. 4. – P. 879882. 417. Maywood, E.S. Expression of mCLOCK and other circadian clock-relevant proteins in the mouse suprachiasmatic nuclei / E.S.Maywood, A.O.O'Brien, M.H.Hastings // J. Neuroendocrinol. – 2003. –Vol. 15, No. 4. – P.329-334 418. McCormack, A.L. Environmental risk factors and Parkinson's disease: selective degeneration of nigral dopaminergic neurons caused by the herbicide paraquat / A.L.McCormack, M.Thiruchelvam, A.B.Manning-Bog, C.Thiffault, J.W.Langston, D.A.Cory-Slechta, D.A.Di Monte // Neurobiol. Dis. – 2002. – Vol. 10, No. 2. – P. 119-127. 419. McCormack, C.E. Timing of ovulation in rats during exposure to continuous light: evidence for a circadian rhythm of luteinizing hormone secretion / C.E.McCormack, R.Sridaran // J. Endocrinol. – 1978. –Vol. 76, No. 1. – P. 135-144. 420. Meites, J. Pioneers in Neuroendocrinology: 2 vols. / J.Meites, B.T.Donovan, S.M.McCann (Eds.). – New York/London: Plenum Press, 1978. – Vol. 2. – 422 p. 421. Meites, J. Neuroendocrine control of reproduction in aging rats and humans / J.Meites // D.K.Sarkar, C.D.Barnes (Eds.) The Reproductive Neuroendocrinology of Aging and Drug Abuse. – Boca Raton: CRC Press, 1995. – P. 109-168. 422. Menendez-Pelaez, A. Distribution of melatonin in mammalian tissues: the relative importance of nuclear versus cytosolic localization / A.Menendez-Pelaez, R.J.Reiter // J. Pineal Res. – 1993. – Vol. 15, No. 2. –P. 59-69. 423. Meredith, S. Long-term supplementation with melatonin delays reproductive senescence in rats, without an effect on number of primordial follicles / S.Meredith, K.Jackson, G.Dudenhoeffer, L.Graham, J.Epple // Exp. Gerontol. – 2000. – Vol. 35, No. 3. – P. 343-352. 424. Micevych, P. The luteinizing hormone surge is preceded by an estrogen-induced increase of hypothalamic progesterone in ovariectomized and adrenalectomized rats / P.Micevych, 233 K.Sinchak, R.H.Mills, L.Tao, P.LaPolt, J.K.Lu // J. Neuroendocrinol. – 2003. – Vol. 78, No. 1. – P. 29-35. 425. Míguez, J. Long-term pinealectomy alters hypothalamic serotonin metabolism in the rat / J.Míguez., F.Martín., I.Míguez, M.Aldegunde // J. Pineal Res. – 1991. – Vol. 11, No. 2. – P. 7579. 426. Míguez, J.M. Changes in serotonin level and turnover in discrete hypothalamic nuclei after pinealectomy and melatonin administration to rats / J.M.Míguez, F.J.Martín, M.Lema, M.Aldegunde // Neurochem. Int. – 1996. – Vol. 29, No. 6. – P. 651-658. 427. Míguez, J.M. Changes with age in daytime and nighttime contents of melatonin, indoleamines, and catecholamines in the pineal gland: a comparative study in rat and Syrian hamster / J.M.Míguez, J.Recio, E.Sánchez-Barceló, M.Aldegunde // J. Pineal Res. – 1998. –Vol. 25, No. 2. – P. 106-115. 428. Miller, B.H. Vasopressin regulation of the proestrous luteinizing hormone surge in wild-type and Clock mutant mice / B.H.Miller, S.L.Olson, J.E.Levine, F.W.Turek, T.H.Horton, J.S.Takahashi // Biol. Reprod. – 2006. – Vol. 75, No. 5. – P. 778-784. 429. Miller, B.H. Circadian clock mutation disrupts estrous cyclicity and maintenance of pregnancy / B.H.Miller, S.L.Olson, F.W.Turek, J.E.Levine, T.H.Horton, J.S.Takahashi // Curr. Biol. – 2004. – Vol. 14, No. 15. – P. 1367-1373. 430. Miller, B.H. Central circadian control of female reproductive function / B.H.Miller, J.S.Takahashi // Front. Endocrinol. – 2014. – Режим доступа: doi: 10.3389/fendo.2013.00195. 431. Miller, J.W. Folic Acid / J.W.Miller // B.Caballero (Ed.) Encyclopedia of Human Nutrition (third edition). – Academic Press, 2013. – 2190 p. – P. 262-269. 432. Minami, S. Facilitatory role neuropeptide Y on the onset of puberty: effect of immunoneutralization of neuropeptide Y on the release of luteinizing hormone and luteinizing-hormone-releasing hormone / S.Minami, S.A.Frautschy, P.M.Plotsky, S.W.Sutton, D.K.Sarkar // Neuroendocrinology. – 1990. – Vol. 52, No. 1. – P. 112-115. 433. Minami, Y. Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide produces a phase shift associated with induction of mPer expression in the mouse suprachiasmatic nucleus / Y.Minami, K.Furuno, M.Akiyama, T.Moriya, S.Shibata // Neuroscience. – 2002. – Vol. 113, No. 1. – P. 37-45. 434. Mitome, M. Circadian rhythm of nitric oxide production in the dorsal region of the suprachiasmatic nucleus in rats / M.Mitome, T.Shirakawa, S.Oshima, W.Nakamura, H.Oguchi // Neurosci. Lett. – 2001. – Vol. 303, No. 3. – P. 161-164. 435. Mitsushima, D. GABA release in the medial preoptic area of cycling female rats / D.Mitsushima, T.T.Shwe, T.Funabashi, K.Shinohara, F.Kimura // Neuroscience. – 2002. – Vol. 113, No 1. – P. 109-114. 234 436. Moguilevsky, J.A. Changes in the control of gonadotrophin secretion by neurotransmitters during sexual development in rats / J.A.Moguilevsky, W.Wuttke // Exp. Clin. Endocrinol. Diabetes. – 2001. – Vol. 109, No. 4. – P. 188-195. 437. MohanКumar, P.S., Correlations of catecholamine release in the medial preoptic area with proestrous surges of luteinizing hormone and prolactin: effects of aging / P.S.MohanКumar, S.ThyagaRajan, S.K.Quadri // Endocrinology. – 1994. – Vol. 135, No. 1. – P. 119-126. 438. MohanКumar, P.S. Cyclic and age-related changes in norepinephrine concentrations in the medial preoptic area and arcuate nucleus / P.S.MohanКumar, S.ThyagaRajan, S.K.Quadri // Brain Res. Bull. – 1995. – Vol. 33, No. 6. – P. 561-564. 439. MohanKumar, S.M.J. Aging alters norepinephrine release in the medial preoptic area in response to steroid priming in ovariectomized rats / S.M.J.MohanKumar, P.S.MohanKumar // Brain Res. – 2004. – Vol. 1023, No. 1. – P. 24-30. 440. Moller, M. Fine structure of the pinealopetal innervation of the mammalian pineal gland / M.Moller // Microsc. Research Tech. – 1992. – Vol. 21, No. 3. – P. 188-204. 441. Moloney, S.J. Biochemical toxicology of hydrazines / S.J.Moloney, R.A.Prough // E.Hodgson, J.R.Bend, R.M.Philpot (Eds.). Reviews in Biochemical Toxicology. – New York: Elsevier, 1983. – Vol. 5. – P. 313-346. 442. Morash, B. Leptin gene expression in the brain and pituitary gland / B.Morash, A.Li, P.R.Murphy, M.Wilkinson, E.Ur // Endocrinology. – 1999. – Vol. 140, No. 12. – P. 5995-5997. 443. Moreno, M.L. Serum prolactin and luteinizing hormone levels and the activities of hypothalamic monoamine oxidase A and B and phenylethanolamine-N-methyl transferase are changed during sexual maturation in male rats treated neonatally with melatonin / M.L.Moreno, M.A.Villanua, A.I.Esquifino // J. Pineal Res. – 1992. – Vol. 13, No. 4. – P. 167-173. 444. Morgan, D.G. The dopamine and serotonin systems during aging in human and rodent brain / D.G.Morgan // Prog. Neuropsychopharmacol. Biol. Psychiatry. – 1987. – Vol. 11, No. 2-3. – P. 153-157. 445. Mori, R. Preliminary report on the correlations among pineal concretions, prostatic calculi and age in human adult males / R.Mori, T.Kodaka, T.Sano // Anat Sci. Int. – 2003. – Vol. 78, No. 3. –P. 181-184. 446. Morin, L.P. Serotonin and the regulation of mammalian circadian rhythmicity / L.P.Morin // Ann. Med. – 1999. – Vol. 31, No. 1. – P. 12-33. 447. Morin, L.P. Neuroanatomy of the extended circadian rhythm system / L.P.Morin // Exp. Neurol. – 2013. – Vol. 243. – P. 4-20. 235 448. Morin, L.P. Circadian organization and neural mediation of hamster reproductive rhythms / L.P.Morin, K.M.Fitzgerald, B.Rusak, I.Zucker // Psychoneuroendocrinology. – 1977. – Vol. 2, No. 1. – P. 73-98. 449. Moro, A.M. Evaluation of genotoxicity and oxidative damage in painters exposed to low levels of toluene / A.M.Moro, N.Brucker, M.Charão, R.Bulcão, F.Freitas, M.Baierle, S.Nascimento, J.Valentini, C.Cassini, M.Salvador, R.Linden, F.Thiesen, A.Buffon, R.Moresco, S.C.Garcia // Mutat. Res. – 2012. – Vol. 746, No. 1. – P. 42-48. 450. Mrosovsky, N. Locomotor activity and non-photic influences on circadian clocks / N.Mrosovsky // Biol. Rev. Camb. Philos. Soc. – 1996. – Vol. 71, No. 3. – P. 343-372. 451. Muir, A.I. AXOR12, a novel human G protein-coupled receptor, activated by the peptide KiSS-1 / A.I.Muir, L.Chamberlain, N.A.Elshourbagy, D.Michalovich, D.J.Moore, A.Calamari, P.G.Szekerez, H.M.Sarau, J.K.Chambers, P.Murdock, K.Steplewski, U.Shabon, J.E.Miller, S.E.Middleton, J.G.Darker, C.G.Larminie, S.Wilson, D.J.Bergsma, P.Emson, R.Faull, K.L.Philpott, D.C.Harrison // J. Biol. Chem. – 2001. – Vol. 276, No. 31. – P. 28969-28975. 452. Nass, T.E. Alterations in ovarian steroid and gonadotrophin secretion preceding the cessation of regular oestrous cycles in ageing female rats / T.E.Nass, P.S.LaPolt, H.L.Judd, J.K.Lu // J. Endocrinol. – 1984. – Vol. 100, No. 1. – P. 43-50. 453. Navarro, C.E. Regulation of cyclic adenosine 3’,5’-monophosphate signaling and pulsaltile neurosecretion by Gi-coupled plasma membrane estrogen receptors in immortalized gonadotropine-releasing hormone neurons / C.E.Navarro, S.A.Abdul Saeed, C.Murdock, A.J.Martinez-Fuentes, K.K.Arora, L.Z.Krsmanovic, K.J.Catt // Mol. Endocrinol. – 2003. – Vol. 17, No. 9. – P. 1792-1804. 454. Navarro, V.M. Regulation of gonadotropin-releasing hormone secretion by kisspeptin/dynorphin/neurokinin B neurons in the arcuate nucleus of the mouse / V.M.Navarro, M.L.Gottsch, C.Chavkin, H.Okamura, D.K.Clifton, R.A.Steiner // J Neurosci. – 2009. – Vol. 29, No. 38. – P. 11859-11866. 455. Negro-Vilar. A. Catecholaminergic modulation of luteinizing hormone-releasing hormone release by median eminence terminals in vitro / A.Negro-Vilar, S.R.Ojeda, S.M.McCann // Endocrinology. – 1979. – Vol. 104, No. 6. – P. 1749-1757. 456. Niles, L.P. Effects of blinding and pinealectomy on regional brain monoamine concentrations / L.P.Niles, G.M.Brown, R.K.Mishra // J. Neurosci. Res. – 1983. – Vol. 10, No. 1. – P. 53-60. 457. Nisikawa, Y. Time-dependent effect of glutamate on long-term potentiation in the suprachiasmatic nucleus of rats / Y.Nisikawa, T.Shimazoe, S.Shibata, S.Watanabe // Jpn. J. Pharmacol. – 2002. – Vol. 90, No. 2. – P. 201-204. 236 458. Ohtaki, T. Metastasis suppressor gene KiSS-1 encodes peptide ligand of a G-protein-coupled receptor / T.Ohtaki, Y.Shintani, S.Honda, H.Matsumoto, A.Hori, K.Kanehashi, Y.Terao, S.Kumano, Y.Takatsu, Y.Masuda, Y.Ishibashi, T.Watanabe, M.Asada, T.Yamada, M.Suenaga, C.Kitada, S.Usuki, T.Kurokawa, H.Onda, O.Nishimura, M.Fujino // Nature. – 2001. – Vol. 411, No. 6837. – P. 613-617. 459. Ojeda, S.R. Glia-to-neuron signaling and the neuroendocrine control of female puberty / S.R. Ojeda, Y.L.Ma, B.J.Lee, V.Prevot // Rec. Prog. Horm. Res. – 2000. – Vol. 55, No. – P. 197223. 460. Ojeda, S.R. Puberty in the rat / S.R.Ojeda, M.K.Skinner // J.D.Neill (Ed.) Knobil and Neill’s Physiology of Reproduction (third edition). – New York: Elsevier, 2006. – 3269 p. – P. 20612126. 461. Ojeda, S.R. Neuroendocrine regulation of puberty / S.R.Ojeda, E.Terasawa // D.Pfaff, A.Arnold, A.Etgen, S.Fahrbach, R.Moss, R.Rubin (Eds.) Hormones, Brain and Behavior. – New York: Elsevier, 2002. – Vol. 4. – P. 589-659. 462. Okamura, H. Integration of mammalian circadian clock signals: from molecule to behavior / H.Okamura // J. Endocrinol. – 2003. – Vol. 177, No. 1. – P. 3-6. 463. Okatani, Y. Changes in nocturnal pineal melatonin synthesis during the perimenopausal period: relation to estrogen levels in female rats / Y.Okatani, N.Morioka, K.Hayashi // J. Pineal Res. – 1999. – Vol. 27, No. 2. – P. 65-72. 464. Okatani, Y. Nocturnal changes in pineal melatonin synthesis during puberty: relation to estrogen and progesterone levels in female rats / Y.Okatani, K.Watanabe, N.Morioka, K.Hayashi, Y.Sagara // J. Pineal Res. – 1997. – Vol. 22, No. 1. – P. 33-41. 465. Ono, D. Postnatal constant light compensates Cryptochrome1 and 2 double deficiency for disruption of circadian behavioral rhythms in mice under constant dark / D.Ono, S.Honma, K.Honma // PloS One. – 2013. – Vol. 8, No. 11. – e80615. 466. Ottem, E.N. Dual-phenotype GABA/glutamate neurons in adult preoptic area: sexual dimorphism and function / E.N.Ottem, J.G.Godwin, S.Krishnan, S.L.Petersen // J. Neurosci. – 2004. – Vol. 24, No. 37. – P. 8097-8105. 467. Páez-Martínez, N. Toluene and TCE decrease binding to mu-opioid receptors, but not to benzodiazepine and NMDA receptors in mouse brain / N.Páez-Martínez, E.Ambrosio, C.García-Lecumberri, L.Rocha, G.L.Montoya, S.L.Cruz // Ann. N. Y. Acad. Sci. – 2008. – Vol. 1139. – P. 390-401. 468. Paglia-Boak, A. Drug use among Ontario students 1977–2009: CAMH Research Document Series No. 28 / A.Paglia-Boak, R.E.Mann, E.M.Adlaf, J.Rehm. – Toronto: Centre for Addiction and Mental Health, 2009. 237 469. Palkovits, M. Adrenergic projections from the lower brainstem to the hypothalamic paraventricular nucleus, the lateral hypothalamic area and the central nucleus of the amygdala in rats / M.Palkovits, E.Mezey, L.R.Skirboll, T.Hokfelt // J. Chem. Neuroanat. – 1992. – Vol. 5, No. 5. – P. 407–415. 470. Palm, I.F. Vasopressin induces a luteinizing hormone surge in ovariectomized, estradiol-treated rats with lesions of the suprachiasmatic nucleus / I.F.Palm, E.M.van der Beek, V.M.Wiegant, R.M.Buijs, A.Kalsbeek // Neuroscience. – 1999. – Vol. 93, No. 2. – P. 659-666. 471. Palm, I.F. The stimulatory effect of vasopressin on the luteinizing hormone surge in ovariectomized, estradiol-treated rats is time-dependent / I.F.Palm, E.M.van der Beek, V.M.Wiegant, R.M.Buijs, A.Kalsbeek // Brain Res. – 2001. – Vol. 901, No. 1-2. – P. 109-116. 472. Panda, S. Circadian rhythms from flies to human / S.Panda, J.B.Hogenesch, S.A.Kay // Nature. – 2002. – Vol. 417, No. 6886. – P. 329-335. 473. Pandi-Perumal, S.R. Physiological effects of melatonin: role of melatonin receptors and signal transduction pathways / S.R.Pandi-Perumal, I.Trakht, V.Srinivasan, D.W.Spence, G.J.Maestroni, N.Zisapel, D.P.Cardinali // Prog. Neurobiol. – 2008. – Vol. 85, No. 3. – P. 335-353. 474. Pandi-Perumal, S.R. Melatonin and sleep in aging population / S.R.Pandi-Perumal, N.Zisapel, V.Srinivasan, D.P.Cardinali // Exp. Gerontol. – 2005. – Vol. 40, No. 12. – P. 911-925. 475. Pang, X. Carbonyl compounds in gas and particle phases of mainstream cigarette smoke / X.Pang, A.C.Lewis // Sci. Total Environ. – 2011. – Vol. 409, No. 23. – P. 5000-5009. 476. Pascual, R. Melatonin ameliorates neocortical neuronal dendritic impairment induced by toluene inhalation in the rat / R.Pascual, S.P.Zamora-Leo, N.Perez, T.Rojas, A.Rojo, M.J.Salinas, A.Reyes, C.Bustamante // Exp. Toxicol. Pathol. – 2011. – Vol. 63, No. 5. – P. 467-471. 477. Paxinos, G. The rat brain in stereotaxic coordinates (sixth edition) / G.Paxinos, C.Watson. – San Diego: Academic Press, 2007. – 456 p. 478. Perit, K.E. Distribution of c-Fos immunoreactivity in the rat brain following abuse-like toluene vapor inhalation / K.E.Perit, J.M.Gmaz, J.D.Caleb Browne, B.A.Matthews, M.B.Dunn, L.Yang, T.Raaphorst, P.E.Mallet, B.E.McKay // Neurotoxicol. Teratol. – 2012. – Vol. 34, No. 1. – P. 3746. 479. Perna, A.F. Possible mechanisms of homocysteine toxicity / A.F.Perna, D.Ingrosso, C.Lombardi, F.Acanfora, E.Satta, C.M.Cesare, E.Violetti, M.M.Romano, N.G.De Santo // Kidney Int. Supp. – 2003. – Vol. 84. – S.137-S140. 480. Perreau-Lenz, S. Glutamatergic clock output stimulates melatonin synthesis at night / S.PerreauLenz, A.Kalsbeek, P.Pévet, R.M.Buijs // Eur. J. Neurosci. – 2004. – Vol. 19, No. 2. – P. 318324. 238 481. Perrine, S.A. Binge toluene exposure alters glutamate, glutamine and GABA in the adolescent rat brain as measured by proton magnetic resonance spectroscopy / S.A.Perrine, S.K.O'LearyMoore, M.P.Galloway, J.H.Hannigan, S.E.Bowen // Drug Alcohol Depend. – 2011. – Vol. 115, No. 1-2. – P. 101-106. 482. Petersen, S.L. Direct and indirect regulation of gonadotropine-releasing hormone neurons by estradiol / S.L.Petersen, E.N.Ottem, C.D.Carpenter // Biol. Reprod. – 2003. – Vol. 69, No. 6. – P. 1771-1778. 483. Pierpaoli, W. The key of life: the reversal of aging with melatonin / W.Pierpaoli. – Perugia: Morlacchi Editore, 2007. – 268 p. 484. Pierpaoli, W. Circadian melatonin and young-to-old pineal grafting postpone aging and maintain juvenile conditions of reproductive functions in mice and rats / W.Pierpaoli, D.Bulian, A.Dall'Ara, B.Marchetti, F.Gallo, M.C.Morale, C.Tirolo, N.Testa // Exp. Gerontol. – 1997. – Vol. 32, No. 4-5. – P. 587-602. 485. Pierpaoli, W. Melatonin: a principal neuroimmunoregulatory and anti-stress hormone: its antiaging effects / W.Pierpaoli, G.J.Maestroni // Immunol. Lett. – 1987. – Vol. 16, No. 3-4. – P. 355361. 486. Plas-Roser, S. The role of folliclestimulating hormone (FSH) in combination with luteinizing hormone (LH) in oestrogen-induced ovulation during the oestrous cycle in the rat / S.Plas-Roser, M.Hassani, C.Aran // Acta Endocrinol. – 1977. – Vol. 85, No. 1. – P. 151-157. 487. Poirel, V.J. MT1 melatonin receptor mRNA expression exhibits a circadian variation in the rat suprachiasmatic nuclei / V.J.Poirel, M.Masson-Pévet, P.Pévet, F.Gauer // Brain Res. – 2002. – Vol. 946, No. 1. – P. 64-71. 488. Poletini, M.O. Central clock regulates the cervically stimulated prolactin surges by modulation of dopamine and vasoactive intestinal polypeptide release in ovariectomized rats / M.O.Poletini, J.E.Kennett, D.T.McKee, M.E.Freeman // Neuroendocrinology. – 2010. – Vol. 91, No. 2. – P. 179-188. 489. Prasad, S.K. L-DOPA feeding induces body growth and reproductive conditions in Japanese quail, Coturnix coturnix Japonica / S.K.Prasad, T.N.Qureshi, S.Saxena, S.Qureshi, M.Mehar, S.K.Thakur // Int. J. Poultry Sci. – 2007. – Vol. 6, No. 8. – P. 560-566. 490. Prata Lima, M.F. Effect of melatonin on the ovarian response to pinealectomy or continuous light in female rats: similarity with polycystic ovary syndrome / M.F.Prata Lima, E.C.Baracat, M.J.Simões // Brazil. J. Med. Biol. Res. – 2004. – Vol. 37, No. 7. – P. 987-995. 491. Prendergast, B.J. Rapid induction of hypothalamic iodothyronine deiodinase expression by photoperiod and melatonin in juvenile Siberian hamsters (Phodopus sungorus) / 239 B.J.Prendergast, L.M.Pyter, A.Kampf-Lassin, P.N.Patel, T.J.Stevenson // Endocrinology. – 2013. – Vol. 154, No. 2. – P. 831-841. 492. Prevot, V. euronal-glial-endothelial interactions and cell plasticity in the postnatal hypothalamus: implications for the neuroendocrine control of reproduction / V.Prevot, B.Dehouck, P.Poulain, J.C.Beauvillain, V.Buée-Scherrer, S.Bouret // Psychoneuroendocrinology. – 2007. – Vol. 32, Suppl. 1. – S46-S51. 493. Przekop, F. Responses in the hypothalamic monoaminergic system activity in ewes to betaendorphin, CRF and their antagonists / F.Przekop, D.Tomaszewska // Acta Neurobiol. Exp. (Warsz.) – 1996. – Vol. 56, No. 3. – P. 807-817. 494. Ramaswamy, S. Studies of the localisation of kisspeptin within the pituitary of the rhesus monkey (Macaca mulatta) and the effect of kisspeptin on the release of non-gonadotropic pituitary hormones / S.Ramaswamy, R.B.Gibbs, T.M.Plant // J. Neuroendocrinol. – 2009. – Vol. 21, No. 10. – P. 795-804. 495. Ramirez, V.D. The role of brain catecholamines in the regulation of LH secretion: a critical inquiry / V.D.Ramirez, H.H.Feder, C.H.Sawyer // W.F.Ganong, L.Martini (Eds.) Frontiers in Neuroendocrinology. – New York: Raven Press, 1984. – Vol. 8. – P. 27-84. 496. Rance, N. Catecholamine turnover rates in discrete hypothalamic areas and associated changes in median eminence luteinizing hormone-releasing hormone and serum gonadotropins on proestrus and diestrous day 1 / N.Rance, P.M.Wise, M.K.Selmanoff, C.A.Barraclough // Endocrinology. – 1981. – Vol. 108, No. 5. – P. 1795-1802. 497. Rao, M.L. Influence of the pineal gland on pituitary function in humans / M.L.Rao, T.Mager // Psychoneuroendocrinology. – 1987. – Vol. 12, No. 2. – P.141-147. 498. Rasmussen, D.D. The interaction between mediobasohypothalamic dopaminergic and endorphinergic neuronal systems as a key regulator of reproduction: a hypothesis / D.D.Rasmussen // J. Endocrinol. Invest. – 1991. – Vol. 14, No. 4. – P. 323-352. 499. Rasmussen, D.D. Diurnal modulation of rat hypothalamic gonadotropin-releasing hormone release by melatonin in vitro / D.D.Rasmussen // J. Endocrinol. Invest. – 1993. – Vol. 16, No. 1. – P. 1-7. 500. Rea, T.M. Effects of toluene inhalation on brain biogenic amines in the rat / T.M.Rea, J.F.Nash, J.E.Zabik, G.S.Born, W.V.Kessler // Toxicology. – 1984. – Vol. 31, No. 2. – P.143-150. 501. Refsum, H. Homocysteine and cardiovascular disease / H.Refsum, P.M.Ueland, O.Nygård, S.E.Vollset // Ann. Rev. Med. – 1998. – Vol. 49. – P. 31-62. 502. Reiter, R.J. Pineal melatonin: cell biology of its synthesis and of its physiological interactions / R.J.Reiter // Endocr. Rev. – 1991. – Vol. 12, No. 2. – P. 151-180. 240 503. Reiter, R.J. Free radical-mediated molecular damage. Mechanisms for the protective actions of melatonin in the central nervous system / R.J.Reiter, D.Acuna-Castroviejo, D.X.Tan, S.Burkhardt // Ann. N. Y. Acad. Sci. – 2001. – Vol. 939. – P. 200-215. 504. Reiter, R.J. Neurotoxins: free radical mechanisms and melatonin protection / R.J.Reiter, L.C.Manchester, D.-X.Tan // Curr. Neuropharmacol. – 2010. – Vol. 8, No. 3. – P. 194-210. 505. Reiter, R.J. Pineal melatonin rhythm: reduction in aging Syrian hamsters / R.J.Reiter, B.A.Richardson, L.Y.Johnson, B.N.Ferguson, D.T.Dinh // Science. – 1980. – Vol. 19, No. 210. – P. 1372-1373. 506. Reppert, S.M. Molecular characterization of a second melatonin receptor expressed in human retina and brain: the Mel1b melatonin receptor / S.M.Reppert, C.Godson, C.D.Mahle, D.R.Weaver, S.A.Slaugenhaupt, J.F.Gusella // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 1995. – Vol. 92, No. 19. – P. 8734-8738. 507. Reppert, S.M. Vasopressin messenger ribonucleic acid in the supraoptic and suprachiasmatic nuclei: appearance and circadian regulation during development / S.M.Reppert, G.R.Uhl // Endocrinology. – 1987. – Vol. 120, No. 6. – P. 2483-2487. 508. Reppert, S.M. Coordination of circadian timing in mammals / S.M.Reppert, D.R.Weaver // Nature. – 2002. – Vol. 418, No. 6901. – P. 935-441. 509. Reppert, S.M. Cloning and characterization of a mammalian melatonin receptor that mediates reproductive and circadian responces / S.M.Reppert, D.R.Weaver, T.Ebisawa // Neuron. – 1994. – Vol. 13, No. 5. – P. 1177-1185. 510. Reuss, S. Components and connections of the circadian timing system in animals / S.Reuss // Cell Tissue Res. – 1996. – Vol. 285, No. 3. – P. 353-378. 511. Reuss, S. Nitric oxide synthase in the hypothalamic suprachiasmatic nucleus of rat: evidence from histochemistry, immunohistochemistry and western blot; and colocalization with VIP / S.Reuss, K.Decker, L.Rösseler, E.Layes, A.Schollmayer, R.Spessert // Brain Res. – 1995. – Vol. 695, No. 2. – P. 257-262. 512. Reuss, S. Day- and night-time contents of monoamines and their metabolites in the medial preoptic area of the rat hypothalamus / S.Reuss, B.Hermes, E.Fuchs, C.Hiemke // Neurosci. Lett. – 1999. – Vol. 266, No. 1. – P. 29-32. 513. Reuss, S. The aged pineal gland: reduction in pinealocyte number and adrenergic innervation in male rats / S.Reuss, C.Spies, H.Schröder, L.Vollrath // Exp. Gerontol. – 1990. – Vol. 25, No. 2. – P. 183-188. 514. Reynoso, R. Effect of leptin on hypothalamic release of GnRH and neurotransmitter amino acids during sexual maturation in female rats / R.Reynoso, O.J.Ponzo, B.Szwarcfarb, D.Rondina, 241 S.Carbone, G.Rimoldi, P.Scacchi, J.A.Moguilevsky // Exp. Clin. Endocrinol. Diabetes. – 2003. – Vol. 111, No. 5. – P. 274-277. 515. Riegel, A.C. The abused inhalant toluene increases dopamine release in the nucleus accumbens by directly stimulating ventral tegmental area neurons / A.C.Riegel, A.Zapata, T.S.Shippenberg, E.D.French // Neuropsychopharmacology. – 2007. – Vol. 32, No. 7. – P. 1558-1569. 516. Ripperger, J.A. Rhythmic CLOCK-BMAIL1 binding to multiple E-box motifs drives circadian Dbp transcription and chromatin transitions / J.A.Ripperger, U.Schibler // Nat. Genet. – 2006. – Vol. 38, No. 3. – P. 369-374. 517. Rivera-Bermudez, M.A. Regulation of basal rhythmicity in protein kinase C activity by melatonin in immortalized rat suprachiasmatic nucleus cells / M.A.Rivera-Bermudez, M.J.Gerdin, D.J.Earnest, M.L.Dubocovich // Neurosci. Lett. – 2003. – Vol. 346, No. 1-2. – P. 37-40. 518. Rivest, R.W. Daily administration of melatonin delays rat vaginal opening and disrupts the first estrous cycles: evidence that these effects are synchronized by the onset of light / R.W.Rivest, U.Lang, M.L.Aubert, P.C.Sizonenko // Endocrinology. – 1985. – Vol. 116, No. 2. – P. 779-787. 519. Rivest, S. The role of corticotropin-releasing factor and interleukin-1 in the regulation of neurons controlling reproductive functions / S.Rivest, C.Rivier // Endocr. Rev. – 1995. – Vol. 16, No. 2. – P. 177-199. 520. Roa, J. Role of GnRH neurons and their neuronal afferents as key integrators between food intake regulatory signals and the control of reproduction / J.Roa // Int. J. Endocrinol. – 2013. – Vol. 2013. – 518046. 521. Roberts, L.G. Developmental and reproductive toxicity evaluation of toluene vapor in the rat. II. Developmental toxicity / L.G.Roberts, M.J.Nicolich, C.A.Schreiner // Reprod. Toxicol. – 2007. – Vol. 23, No. 4. – P. 521-531. 522. Robertson, J.L. Circadian regulation of Kiss1 neurons: implications for timing the preovulatory gonadotropin-releasing hormone/luteinizing hormone surge / J.L.Robertson, D.K.Clifton, H.O.de la Iglesia, R.A.Steiner, A.S.Kauffman // Endocrinology. – 2009. – Vol. 150, No. 8. – P. 3664-3671. 523. Roca, A.L. Structure, characterization, and expression of the gene encoding the mouse MEL (1a) melatonin receptor / A.L.Roca, C.Godson, D.R.Weaver, S.Reppert // Endocrinology. – 1996. – Vol. 137, No. 8. – P. 3469-3477. 524. Rohr, U.D. Melatonin deficiencies in women / U.D.Rohr, J.Herold // Maturitas. – 2002. – Vol. 41, Suppl. – S85-S104. 525. Rollo, C.D. Dopamine and aging: intersecting facets / C.D.Rollo // Neurochem. Res. – 2009. – Vol. 34, No. 4. – P. 601-629. 242 526. Roselli, C.E. Brain aromatization: classical roles and new perspectives / C.E.Roselli, M.Liu, P.D.Hurn // Semin. Reprod. Med. – 2009. – Vol. 27, No. 3. – P. 207-217. 527. Rosenfield, R.L. Adrenal and ovarian contributions to the elevated free plasma androgen levels in hirsute women / R.L.Rosenfield, E.N.Ehrlich, N.E.Cleary // J. Clin. Endocrinol. Metab. – 1972. – Vol. 34, No. 1. – P. 92-98. 528. Roth, G.S. Age changes in adrenergic and dopaminergic signal transduction mechanisms: parallels and contrasts / G.S.Roth // Neurobiol. Aging. – 1988. – Vol. 9, No 1. – P. 63-64. 529. Roy, D. Estrogen directly represses gonadotropine-releasing hormone (GnRH) gene expression in estrogen receptor-alpha (ERalpha)- and ERbeta-expressing GT1-7 GnRH neurons / D.Roy, N.L.Angelini, D.D.Belsham // Endocrinology. 1999. – Vol. 140, No. 11. – P. 5045-5053. 530. Roy, D. Cyclical regulation of gnrh gene expression in gt1-7 gnrh-secreting neurons by melatonin / D.Roy, N.L.Angelini, H.Fujieda, G.M.Brown, D.D.Belsham // Endocrinology. – 2001. –Vol. 142, No. 11. – P. 4711-4720. 531. Saeb-Parsy, K. Neural connections of hypothalamic neuroendocrine nuclei in the rat / K.SaebParsy, S.Lombardelli, F.Z.Khan, K.McDowall, I.T.Au-Yong, R.E.Dyball // J. Neuroendocrinol. – 2000. – Vol. 12, No. 7. – P. 635-648. 532. Sanchez-Hidalgo, M. Age-related changes in melatonin synthesis in rat extrapineal tissues / M.Sanchez-Hidalgo, C.A.de la Lastra, M.P.Carrascosa-Salmoral, M.C.Naranjo, A.GomezCorvera, B.Caballero, J.M.Guerrero // Exp. Gerontol. – 2009. – Vol. 44, No. 5. – P. 328-334. 533. Sanchez-Serrano, S.L. Repeated toluene exposure modifies the acetylation pattern of histones H3 and H4 in the rat brain / S.L.Sanchez-Serrano, S.L.Cruz, M.Lamas // Neurosci. Lett. – 2010. – Vol. 489, No. 3. – P. 142-147. 534. Saracibar, G. Toluene alters mu-opioid receptor expression in the rat brainstem / G.Saracibar, M.L.Hernandez, E.Echevarria, I.Barbero, A.Gutierrez, O.Casis // Ind. Health. – 2001. – Vol. 39, No. 3. – P. 231-234. 535. Sarkar, D.K. Diurnal variation in luteinizing hormone-releasing hormone and beta-endorphin release in pituitary portal plasma during the rat estrous cycle / D.K.Sarkar, S.Minami // Biol. Reprod. – 1995. – Vol. 53, No. 1. – P. 38-45. 536. Sasaki, Y.F. Organ-specific genotoxicity of the potent rodent colon carcinogen 1,2-dimethylhydrazine and three hydrazine derivatives: difference between intraperitoneal and oral administration / Y.F.Sasaki, A.Saga, M.Akasaka, S.Ishbashi, K.Yoshida, Y.Q.Su, N.Matsusaka, S.Tsuda // Mutat. Res. – 1998. – Vol. 415, No. 1-2. – P. 1-12. 537. Sauls, D.L. Pro-thrombotic and pro-oxidant effects of diet-induced hyperhomocysteinemia / D.L.Sauls, E.K.Arnold, C.W.Bell, J.C.Allen, M.Hoffman // Thromb. Res. – 2007. – Vol. 120, No. 1. – P. 117-126. 243 538. Schatz, R.A. Decreased transmethylation of biogenic amines after in vivo elevation of brain S-adenosyl-l-homocysteine / Schatz R. A., Wilens T. E., Sellinger O. Z. // J. Neurochem. – 1981. – Vol. 36, No. 5. – P. 1739-1748. 539. Schomerus, C. Mechanisms regulating melatonin synthesis in the mammalian pineal organ / C.Schomerus, H.W.Korf // Ann. N. Y. Acad. Sci. – 2005. – Vol. 1057. – P. 372-383. 540. Schulz, J.B. Glutathione, oxidative stress and neurodegeneration / J.B.Schulz, J.Lindenau, J.Seyfried, J.Dichgans // Eur. J. Biochem. – 2000. – Vol. 267, No. 16. – P. 4904-4911. 541. Scott, C.J. The distribution of cells containing estrogen receptor-alpha (ERalpha) and ERbeta messenger ribonucleic acid in the preoptic area and hypothalamus of the sheep: comparison of males and females / C.J.Scott, A.J.Tilbrook, D.M.Simmons, J.A.Rawson, S.Chu, P.J.Fuller, N.H.Ing, A.J.Clarke // Endocrinology. – 2000. – Vol. 141, No. 8. – P. 2951-2962. 542. Sellix, M.T. Ovarian steroid hormones modulate circadian rhythms of neuroendocrine dopaminergic neuronal activity / M.T.Sellix, M.Egli, R.P.Henderson, M.E.Freeman // Brain Res. – 2004. – Vol. 1005, No. 1-2. – P. 164-168. 543. Sellix, M.T. Circadian rhythms of neuroendocrine dopaminergic neuronal activity in ovariectomized rats / M.T.Sellix, M.E.Freeman // J. Neuroendocrinol. – 2003. – Vol. 77, No. 1. – P. 59-70. 544. Sellix, M.T. Circadian clocks in the ovary / M.T.Sellix, M.Menaker // Trends Endocrinol. Metab. – 2010. – Vol. 21, No. 10. – P. 628-636. 545. Selvage, D.J. Interaction between norepinephrine, oxytocin, and nitric oxide in the stimulation of gonadotropin-releasing hormone release from proestrous rat basal hypothalamus explants / D.J.Selvage, C.A.Johnston // J. Neuroendocrinol. – 2004. – Vol. 16, No. 10. – P. 819-824. 546. Seth, A. Galanin-like peptide stimulates the release of gonadotropin-releasing hormone in vitro and may mediate the effects of leptin on the hypothalamo-pituitary-gonadal axis / A.Seth, S.Stanley, P.Jethwa, J.Gardiner, M.Ghatei, S.Bloom // Endocrinology. – 2004. – Vol. 145, No. 2. – P. 743-750. 547. Shi, Q. L-Homocysteine sulfinic acid and other acidic homocysteine derivatives are potent and selective metabotropic glutamate receptor agonists / Q.Shi, J.E.Savage, S.J.Hufeisen, L.Rauser, E.Grajkowska, P.Ernsberger, J.T.Wroblewski, J.H.Nadeau, B.L.Roth // J. Pharmacol. Exp. Ther. – 2003. – Vol. 305, No. 1. – P. 131-142. 548. Shibata, S. Influence of excitatory amino acid receptor antagonists and of baclofen on synaptic transmission in the optic nerve to the suprachiasmatic nucleus in slices of rat hypothalamus / S.Shibata, S.Y.Liou, S.Ueki // Neuropharmacology. – 1986. – Vol. 25, No. 4. – P. 403-409. 549. Siawrys, G. The effect of stimulators and blockers of adrenergic receptors on LH secretion and cyclic nucleotide (cAMP and cGMP) production by porcine pituitary cells in vitro / 244 G.Siawrys, I.Bogacka, S.Okrasa, T.Kaminski, J.Przala // Anim. Reprod. Sci. – 2002. – Vol. 69, No. 1-2. – P. 73-89. 550. Simerly, R.B. Distribution of androgen and estrogen receptor mRNA-containing cells in the rat brain: an in situ hybridization study / R.B.Simerly, C.Chang, M.Muramatsu, L.W.Swanson // J. Comp. Neurol. – 1990. – Vol. 294, No. 1. – P. 76-95. 551. Simonneaux, V. Generation of the melatonin endocrine message in mammals: a review of the complex regulation of melatonin synthesis by norepinephrine, peptides, and other pineal transmitters / V.Simonneaux, C.Ribelayga // Pharmacol. Rev. – 2003. – Vol. 55, No. 2. – P. 325395. 552. Simpkins, J.W. Evidence for depressed catecholamine and enhanced serotonin metabolism in aging male rats: possible relation to gonadotropin secretion / J.W.Simpkins, G.P.Mueller, H.H.Huang, J.Meites // Endocrinology. – 1977. – Vol. 100, No. 6. – P. 1672-1678. 553. Singh, M.P. Effects of co-exposure of benzene, toluene and xylene to Drosophila melanogaster: alteration in hsp70, hsp60, hsp83, hsp26, ROS generation and oxidative stress markers / M.P.Singh, K.R.Ram, M.Mishra, M.Shrivastava, D.K.Saxena, D.K.Chowdhuri // Chemosphere. – 2010. – Vol. 79, No. 5. – P. 577-587. 554. Sizonenko, P.C. Neuroendocrine changes characteristic of sexual maturation / P.C.Sizonenko, M.L.Aubert // J. Neural. Transm. – 1986. – Vol. 21, Suppl. – P. 159-181. 555. Sletten, T.L. Timing of sleep and its relationship with the endogenous melatonin rhythm / T.L.Sletten, S.Vincenzi, J.R.Redman, S.W.Lockley, S.M.Rajaratnam // Front. Neurol. – 2010. – Vol. 1. – Article 137. – Режим доступа: doi: 10.3389/fneur.2010.00137. 556. Slotten, H.A. Influence of the mode of daily melatonin administration on entrainment of rat circadian rhythms / H.A.Slotten, B.Pitrovsky, P.Pévet // J. Biol. Rhythm. – 1999. – Vol. 14, No. 5. – P. 347-353. 557. Slotten, H.A. Entrainment of rat circadian rhythms by melatonin does not depend on the serotonergic afferents to the suprachiasmatic nuclei / H.A.Slotten, B.Pitrovsky, P.Pévet // Brain Res. – 2000. – Vol. 876, No. 1-2. – P. 10-16. 558. Smith, J.T. Kisspeptin is essential for the full preovulatory LH surge and stimulates GnRH release from the isolated ovine median eminence / J.T.Smith, Q.Li, K.S.Yap, M.Shahab, A.K.Roseweir, R.P.Millar, I.J.Clarke // Endocrinology. – 2011. – Vol. 152, No. 3. – P. 10011012. 559. Smith, J.T. Hypothalamic expression of KISS1 and gonadotropin inhibitory hormone genes during the menstrual cycle of a non-human primate / J.T.Smith, M.Shahab, A.Pereira, K.Y.Pau, I.J.Clarke // Biol Reprod. – 2010. – Vol. 83, No. 4. – P. 568-577. 245 560. Smith, M.S. The control of progesterone secretion during the estrous cycle and early pseudopregnancy in the rat: prolactin, gonadotropin and steroid levels associated with rescue of the corpus luteum of pseudopregnancy / M.S.Smith, M.E.Freeman, J.D.Neill // Endocrinology. – 1975. – Vol. 96, No. 1. – P. 219-226. 561. Somponpun, S. Role of estrogen receptor-beta in regulation of vasopressin and oxytocin release in vitro / S.Somponpun, C.D.Sladek // Endocrinilogy. – 2002. – Vol. 143, No. 8. – P. 2899-2904. 562. Soulage, C. Sub-chronic exposure to toluene at 40 ppm alters the monoamine biosynthesis rate in discrete brain areas / C.Soulage, D.Perrin, P.Berenguer, J.M.Pequignot // Toxicology. – 2007. – Vol. 196, No. 1-2. – P. 21-30. 563. Steger, R.W. Effects of advancing age on hypothalamic neurotransmitter content and on basal and norepinephrine-stimulated LHRH release / R.W.Steger, L.V.De Paolo, A.M.Shepherd // Neurobiol. Aging. – 1985. – Vol. 6, No. 2. – P. 113-116. 564. Stengård, K. Effect of toluene inhalation on extracellular striatal acetylcholine release studied with microdialysis / K.Stengård // Pharmacol. Toxicol. – 1994. – Vol. 75, No. 2. – P. 115-118. 565. Stengård, K. Extracellular dopamine levels within the striatum increase during inhalation exposure to toluene: a microdialysis study in awake, freely moving rats / K.Stengård, G.Höglund, U.Ungerstedt // Toxicol. Lett. – 1994. – Vol. 71, No. 3. – P. 245-255. 566. Stengård, K. Acute toluene exposure decreases extracellular gamma-aminobutyric acid in the globus pallidus but not in striatum: a microdialysis study in awake, freely moving rats / K.Stengård, W.T.O'Connor // Eur. J. Pharmacol. – 1994. – Vol. 292, No. 1. – P. 43-46. 567. Sterling, T.R. New approaches to the treatment of latent tuberculosis / T.R.Sterling // Semin. Respir. Crit. Care Med. – 2008. – Vol. 29, No. 5. – P. 532-541. 568. Sterner, M.R. Steroid treatment fails to induce an afternoon luteinizing hormone or prolactin surge in rats exposed to short-term constant light at the time of ovariectomy / M.R.Sterner, I.R.Cohen // Neuroendocrinology. – 1995. – Vol. 62, No. 3. – P. 231-237. 569. Stoker, T.E. Delayed ovulation and pregnancy outcome: effect of environmental toxicants on the neuroendocrine control of the ovary / T.E.Stoker, J.M.Goldman, R.L.Cooper // Envir. Toxicol. Pharmacol. – 2001. – Vol. 9, No. 3. – P. 117-129. 570. Stoker, T.E. Endocrine-disrupting chemicals: prepubertal exposures and effects on sexual maturation and thyroid function in the male rat. A focus on the EDSTAC recommendations. Endocrine Disrupter Screening and Testing Advisory Committee / T.E.Stoker, L.G.Parks, L.E.Gray, R.L.Cooper // Crit. Rev. Toxicol. – 2000. – Vol. 30, No. 2. – P. 197-252. 571. Streck, E.L. In vitro effect of homocysteine on some parameters of oxidative stress in rat hippocampus / E.L.Streck, P.S.Vieira, C.M.Wannmacher, C.S.Dutra-Filcho, M.Wajner, A.T.Wyse // Metab. Brain Dis. – 2003. – Vol. 18, No. 2. – P. 147-154. 246 572. Sutton, S.W. Neuropeptide Y (NPY): a possible role in the initiation of puberty / S.W.Sutton, N.Mitsugi, P.M.Plotsky, D.K.Sarkar // Endocrinology. – 1988. – Vol 123, No. 4. – P. 2152-2154. 573. Svensson, B.G. Hormone status in occupational toluene exposure / B.G.Svensson, G.Nise, E.M.Erfurth, A.Nilsson, S.Skerfving // Am. J. Ind. Med. – 1992. – Vol. 22, No. 1. – P. 99-107. 574. Swann, J.M. Multiple circadian oscillators regulate the timing of behavioral and endocrine rhythms in female golden hamsters / J.M.Swann, F.W.Turek // Science. – 1985. – Vol. 228, No. 4701. – P. 898-900. 575. Tabatabaie, T. Inactivation of glutathione peroxidase by benzaldehyde / T.Tabatabaie, R.A.Floyd // Toxicol. Appl. Pharmacol. – 1996. – Vol. 141, No.2. – P. 389-393. 576. Temel, S. Expression of estrogen receptor-alpha and cFos in norepinephrine and epinephrine neurons of young and middle-aged rats during the steroid-induced luteinizing hormone surge / S.Temel, W.Lin, S.Lakhlani, L.Jennes // Endocrinology. – 2002. – Vol. 143, No. 10. – P. 39743983. 577. Temple, J.L. Direct action of estradiol on gonadotropine-releasing hormone-1 neuronal activity via a transcription-dependent mechanism / J.L.Temple, E.Laing, A.Sunder, S.Wray // J. Neurosci. – 2004. – Vol. 24, No. 28. – P. 6326-6333. 578. Terasawa, E. Luteinizing hormone-releasing hormone (LHRH) neurons: mechanisms of pulsatile LHRH release / E.Terasawa // Vitam. Horm. – 2001. – Vol. 63. – P. 91-129. 579. Terasawa, E. Norepinephrine is a possible neurotransmitter stimulating pulsatile release of luteinizing hormone-releasing hormone in the rhesus monkey / E.Terasawa, C.Krook, D.L.Hei, M.Gearing, N.J.Schultz, G.A.Davis // Endocrinology. – 1988. – Vol. 123, No. 4. – P. 1808-1816. 580. Thayananuphat, A. Rhythmic dependent light induction of gonadotropinn releasing hormone-I expression and activation of dopaminergic neurons within the premammilary nucleus of the turkey hypothalamus / A.Thayananuphat, S.W.Kang, T.Bakken, J.R.Millam, M.E.El Halawani // J. Neuroendocrinol. – 2007. – Vol. 19, No. 6. – P. 399-406. 581. ThyagaRajan, S. Cyclic changes in the release of norepinephrine and dopamine in the medial basal hypothalamus: effects of aging / S.ThyagaRajan, P.S.MohanKumar, S.K.Quadri // Brain Res. – 1995. – Vol. 689, No. 1. – P. 122-128. 582. Tischkau, S.A. Circadian clock-controlled regulation of cGMP-protein kinase G in the nocturnal domain / S.A.Tischkau, E.T.Weber, S.M.Abbott, J.W.Mitchell, M.U.Gillette // J. Neurosci. – 2003. – Vol. 23, No. 20. – P. 7543-7550. 583. Tonsfeldt, K.J. Clocks on top: the role of the circadian clock in the hypothalamic and pituitary regulation of endocrine physiology / K.J.Tonsfeldt, P.E.Chappell // Mol. Cell. Endocrinol. – 2012. – Vol. 349, No. 1. – P. 3-12. 247 584. Toth, B. Toxicities of hydrazines: a review / B.Toth // In Vivo. – 1988. – Vol. 2, No. 3-4. – P. 209-242. 585. Toth, B. A review of the natural occurrence, synthetic production and use of carcinogenic hydrazines and related chemicals / B.Toth // In Vivo. – 2000. – Vol. 14, No.2. – P. 299-319. 586. Trentini, G.P. Melatonin treatment delays reproductive aging of female rat via the opiatergic system / G.P.Trentini, A.R.Genazzani, M.Criscuolo, F.Petraglia, C.De Gaetani, G.Ficarra, B.Bidzinska, M.Migaldi, A.D.Genazzani // J. Neuroendocrinol. – 1992. – Vol. 56, No. 3. – P. 364-370. 587. Troen, A.M. The central nervous system in animal models of hyperhomocysteinemia / A.M.Troen // Prog. Neuropsychopharmacol. Biol. Psychiatry. – 2005. – Vol. 29, No. 7. – P. 1140-1151. 588. Tsuga, H. Effects of short-term toluene exposure on ligand binding to muscarinic acetylcholine receptors in the rat frontal cortex and hippocampus / H.Tsuga, T.Honma // Neurotoxicol. Teratol. – 2000. – Vol. 22, No. 4. – P. 603-606. 589. Ueda, H.R. System-level identification of transcriptional circuits underlying mammalian circadian clocks / H.R.Ueda, S.Hayashi, W.Chen, M.Sano, M.Machida, Y.Shigeyoshi, M.Iino, S.Hashimoto // Nat. Genet. – 2005. – Vol. 37, No. 2. – P. 187-192. 590. Ueland, P.M. Homocysteine in tissues of the mouse and rat / P.M.Ueland, S.Helland, O.J.Broch, J.S.Schanche // J. Biol. Chem. – 1984. – Vol. 259, No. 4. – P. 2360-2364. 591. Unfried, C. Impact of melatonin and molecular clockwork components on the expression of thyrotropin β-chain (Tshβ and the Tsh receptor) in the mouse pars tuberalis / C.Unfried, N.Ansari, S.Yasuo, H.-W.Korf, C.von Gall // Endocrinology. – 2009. – Vol. 150, No. 10. – P. 4653-4662. 592. Upchurch, G.R. Jr. Homocysteine decreases bioavailable nitric oxide by a mechanism involving glutathione peroxidase / G.R.Upchurch Jr., C.N.Welch, A.J.Fabian, J.E.Freedman, J.L.Johnson, J.F.Keaney Jr., J.Loscalzo // J. Biol. Chem. – 1997. – Vol. 272, No. 27. – P. 17012-17017. 593. Urata, Y. Melatonin induces γ-glutamylcysteine synthetase mediated by activator protein-1 in human vascular endothelial cells / Y.Urata, S.Honma, S.Goto, S.Todoroki, T.Iida, S.Cho, K.Honma, T.Kondo // Free Radic. Biol. Med. – 1999. – Vol. 27, No. 7-8. – P. 838-847. 594. van den Pol, A.N. Calcium excitability and oscillations in suprachiasmatic nucleus neurons and glia in vitro / A.N.van den Pol, S.M.Finkbeiner, A.H.Cornell-Bell // J. Neurosci. – 1992. – Vol. 12, No. 7. – P. 2648-2664. 595. van den Pol, A.N. Glutamate, the dominant excitatory transmitter in neuroendocrine regulation / A.N.van den Pol, J.-P.Wuarin, F.E.Dudek // Science. – 1990. – Vol. 250, No. 4985. – P. 12761278. 248 596. van der Beek, E.M. Circadian control of reproduction in the female rat / E.M.van der Beek // Prog. Brain Res. – 1996. – Vol. 111. – P. 295-320. 597. van der Beek, E.M. Evidence for a direct neuronal pathway from the suprachiasmatic nucleus to the gonadotropin-releasing hormone system: combined tracing and light and electron microscopic immunocytochemical studies / E.M.van der Beek, T.L.Horvath, V.M.Wiegant, R.van den Hurk, R.M.Buijs // J. Comp. Neurol. – 1997. – Vol. 384, No. 4. – P. 569-579. 598. van der Beek, E.M. Preferential induction of c-fos immunoreactivity in vasoactive intestinal polypeptide-innervated gonadotropine-releasing hormone neurons during a steroid-induced luteinizing hormone surge in the female rat / E.M.van der Beek, H.J.van Oudheusden, R.M.Buijs, H.A.van der Donk, R.van den Hurk, V.M.Wiegant // Endocrinology. – 1994. – Vol. 134, No. 6. – P. 2636-2644. 599. van der Beek, E.M. Lesions of the suprachiasmatic nucleus indicate the presence of a direct vasoactive intestinal polypeptide-containing projection to gonadotrophin-releasing hormone neurons in the female rat / E.M.van der Beek, V.M.Wiegant, H.A.van der Donk, R.van den Hurk, R.M.Buijs // J. Neuroendocrinol. – 1993. – Vol. 5, No. 2. – P. 137-144. 600. van der Horst, G.T. Mammalian Cry1 and Cry2 are essential for maintenance of circadian rhythms / G.T.van der Horst, M.Muijtjens, K.Kobayashi, R.Takano, S.Kanno, M.Takao, J.de Wit, A.Verkerk, A.P.Eker, D.van Leenen, R.Buijs, D.Bootsma, J.H.Hoeijmakers, A.Yasui // Nature. – 1999. – Vol. 398, No. 6728. – P. 627-630. 601. van der Leest, H.T. Phase shifting capacity of the circadian pacemaker determined by the SCN neuronal network organization / H.T.van der Leest, J.H.Rohling, S.Michel, J.H.Meijer // PLoS One. – 2009. – Vol. 4, No. 3. – e4976. 602. van Esseveldt, K.E. The suprachiasmatic nucleus and the circadian time-keeping system revisited / K.E.van Esseveldt, M.N.Lehman, G.J.Boer // Brain Res. Rev. – 2000. – Vol. 33, No. 1. – P. 34-77. 603. Vanecek, J. Cellular mechanisms of melatonin action / J.Vanecek // Physiol. Rev. – 1998. – Vol. 78, No. 3. – P. 687-721. 604. Vanecek, J. Effect of short and long photoperiods on pineal N-acetyltransferase rhythm and on growth of testes and brown adipose tissue in developing rats / J.Vanecek, H.Illnerova // Neuroendocrinology. – 1985. – Vol. 41, No. 3. – P. 186-191. 605. Vanecek, J. Mechanisms of melatonin action in the pituitary and SCN / J.Vanecek, K.Watanabe // Adv. Exp. Med. Biol. – 1999. – Vol. 460. – P. 191-198. 606. Vanzin, C.S. Experimental evidence of oxidative stress in plasma of homocystinuric patients: a possible role for homocysteine / C.S.Vanzin, G.B.Biancini, A.Sitta, C.A.Wayhs, I.N.Pereira, 249 F.Rockenbach, S.C.Garcia, A.T.Wyse, I.V.Schwartz, M.Wajner, C.R.Vargas // Mol. Genet. Metab. – 2011. – Vol. 104, No.1-2. – P. 112-117. 607. Vera, J.C. Measurement of microgram quantities of protein by a generally applicable turbidimetric procedure / J.C.Vera // Analyt. Biochem. – 1988. – Vol. 174, No. 1. – P. 187-196. 608. Visser, W.E. Study of the transport of thyroid hormone by transporters of the SLC family / W.E.Visser, W.S.Wong, A.A.van Mullem, E.C.Friesema, J.Geyer, T.J.Visser // Mol. Cell. Endocrinol. – 2010. – Vol. 315, No. 1-2. – P. 138-145. 609. Vitaterma, M.H. Differential regulation of mammalian period genes and circadian rhythmicity by Cryptochromes 1 and 2 / M.H.Vitaterma, C.P.Selby, T.Todo, H.Niwa, C.Thompson, E.M.Fruechte, K.Hitomi, R.J.Thresher, T.Ishikawa, J.Miyazaki, J.S.Takahashi, A.Sankar // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 1999. – Vol. 96, No. 21. – P. 12114-12119. 610. von Euler, G. Ganglioside GM1 treatment prevents the effects of subacute exposure to toluene on N-[3H]propylnorapomorphine binding characteristics in rat striatal membranes / G.von Euler, K.Fuxe, L.F.Agnati, T.Hansson, J.A.Gustafsson // Neurosci. Lett. – 1987. – Vol. 82, No. 2. – P. 181-184. 611. von Euler, G. Ganglioside GM1 prevents and reverses toluene-induced increases in membrane fluidity and calcium levels in rat brain synaptosomes / G.von Euler, K.Fuxe, S.C.Bondy // Brain Res. – 1990. – Vol. 508, No. 2. – P. 210-214. 612. von Euler, G. Effects of acute haloperidol treatment on regional catecholamine levels and utilization in rats exposed to toluene / G.von Euler, K.Fuxe, T.Hansson, P.Eneroth, L.F.Agnati, A.Härfstrand, J.A.Gustafsson // Acta Physiol. Scand. – 1988. – Vol. 132, No. 2. – P. 199-208. 613. von Euler, G. Persistent effects of 80 ppm toluene on dopamine-regulated locomotor activity and prolactin secretion in the male rat / G.von Euler, S.O.Ogren, P.Eneroth, K.Fuxe, J.A.Gustafsson // Neurotoxicology. – 1994. – Vol. 15, No. 3. – P. 621-624. 614. von Gall, C. Mammalian melatonin receptors: molecular biology and signal transduction / C.von Gall, J.H.Stehle, D.R.Weaver // Cell Tissue Res. – 2002. – Vol. 309, No. 1. – P. 151-162. 615. Vriend, J. Effects of haloperidol and melatonin on the in situ activity of nigrostriatal tyrosine hydroxylase in male Syrian hamsters / J.Vriend, L.Dreger // Life Sci. – 2006. – Vol. 78, No. 15. – P. 1707-1712. 616. Walker, R.F. Melatonin:serotonin interaction during termination of the LH surge in rats / R.F.Walker // Prog. Clin. Biol. Res. – 1982. – Vol. 92. – P. 167-176. 617. Ward, D.R. Innervation of gonadotropin-releasing hormone neurons by peptidergic neurons conveying circadian or energy balance information in the mouse / D.R.Ward, F.M.Dear, 250 I.A.Ward, S.I.Anderson, D.J.Spergel, P.A.Smith, F.J.P.Ebling // PLoS ONE. – 2009. – Vol. 4, No. 4. – e5322. 618. Warembourg, M. Estrogen receptor and progesterone receptor-immunoreactive cells are not colocalized with gonadotropin-releasing hormone in the brain of the female mink (Mustela vison) / M.Warembourg, D.Leroy, J.Peytevin, L.Martinet // Cell Tissue Res. – 1998. – Vol. 291, No. 1. – P. 33-41. 619. Warren, W.S. Pinealectomized rat entrain and phase-shift to melatonin injections in dosedependent manner / W.S.Warren, D.B.Hodges, V.M.Cassone // J. Biol. Rhythm. – 1993. – Vol. 8, No. 3. – P. 233-245. 620. Watanobe, H. Leptin directly acts within the hypothalamus to stimulate gonadotropin-releasing hormone secretion in vivo in rats / H.Watanobe // J. Physiol. – 2002. – Vol. 545 (Pt. 1). – P. 255268. 621. Watson, R.E. Estrogen-receptive neurons in the anteroventral periventricular nucleus are synaptic targets of the suprachiasmatic nucleus and peri-suprachiasmatic region / R.E.Watson, M.C.Langub Jr., M.G.Engle, B.E.Maley // Brain Res. – 1995. – Vol. 689, No. 2. – P. 254-264. 622. Watts, A.G. Effects of short-term constant light on the proestrous luteinizing hormone surge and pituitary responsiveness in the female rat / A.G.Watts, G.Fink // Neuroendocrinology. – 1981. – Vol. 33, No. 3. – P. 176-180. 623. Weaver, D.R. Localization and characterization of melatonin receptors in rodent brain by in vitro autoradiography / D.R.Weaver, S.A.Rivkees, S.M.Reppert // J. Neurosci. – 1989. – Vol. 9, No. 7. – P. 2581-2590. 624. Weaver, D.R. Melatonin receptors in human hypothalamus and pituitary: implications for circadian and reproductive responses to melatonin / D.R.Weaver, J.H.Stehle, E.G.Stopa, S.M.Reppert // J. Clin. Endocrinol. Metab. – 1993. – Vol. 76, No. 2. – P. 295-301. 625. Weiland, N.G. Estrogen alters the diurnal rhythm of alpha 1-adrenergic receptor densities in selected brain regions / N.G.Weiland, P.M.Wise // Endocrinology. – 1987. – Vol. 121, No. 5. – P. 1751-1758. 626. Weiland, N.G. Diurnal rhythmicity of beta-1- and beta-2-adrenergic receptors in ovariectomized, ovariectomized estradiol-treated and proestrous rats / N.G.Weiland, P.M.Wise // J. Neuroendocrinol. – 1989. – Vol. 50, No. 6. – P. 655-662. 627. Weissbach, H. A rapid spectrophotometric assay of monoamine oxidase based on the rate of disappearance of kynuramine / H.Weissbach, E.Smith, J.W.Daly, B.Witkop, S.Udenfriend // J. Biol. Сhem. – 1960. – Vol. 235, No.4. – P. 1160-1163. 628. Wiłkość, M. Influence of dopaminergic and serotoninergic genes on working memory in healthy subjects / M.Wiłkość, J.Hauser, M.Tomaszewska, M.Dmitrzak-Węglarz, M.Skibińska, 251 A.Szczepankiewicz, A.Borkowska // Acta Neurobiol. Exp. (Warsz.) – 2010. – Vol. 70, No. 1. – P. 86-94. 629. Williams, J.M. Effects of repeated inhalation of toluene on ionotropic GABAA and glutamate receptor subunit levels in rat brain / J.M.Williams, D.Stanfford, J.D.Steketee // Neurochem. Int. – 2005. – Vol. 46, No. 1. – P. 1-10. 630. Williams, L.M. The ontogeny of central melatonin binding sites in the rat / L.M.Williams, M.G.Martinoli, L.T.Titchener, G.Pelletier // Endocrinology. – 1991. – Vol. 128, No. 4. – P. 2083-2090. 631. Win-Shwe, T.-T Neurotoxicity of toluene / T.-T.Win-Shwe, H.Fujimaki H. // Toxicol. Lett. – 2010. – Vol. 198, No. 2. – P. 93-99. 632. Wintermantel, T.M., Definition of estrogen receptor pathway critical for estrogen positive feedback to gonadotropin-releasing hormone neurons and fertility / T.M.Wintermantel, R.E.Campbell, R.Porteous, D.Bock, H.J.Gröne, M.G.Todman, K.S.Korach, E.Greiner, C.A.Pérez, G.Schütz, A.E.Herbison // Neuron. – 2006. – Vol. 52, No. 2. – P. 271-280. 633. Wise, P.M. Alterations in the proestrous pattern of median eminence LHRH, serum LH, FSH, estradiol and progesterone concentrations in middle-aged rats / P.M.Wise // Life Sci. – 1982. – Vol. 12, No. 2. – P. 165-173. 634. Wise, P.M. Changing neuroendocrine function during aging: impact on diurnal and pulsatile rhythms / P.M.Wise // Exp. Gerontol. – 1994. – Vol. 29, No. 1. – P. 13-19. 635. Wise, P.M. Neuroendocrine modulation of the "menopause": insights into the aging brain / P.M.Wise // Am. J. Physiol. – 1999. – Vol. 277, No. 6 (Pt. 1). – P. E965-E970. 636. Wise, P.M. Aging of the female reproductive system: a window into brain aging / P.M.Wise, M.L.Kashon, K.M.Krajnak, K.L.Rosewell, A.Cai, K.Scarbrough, J.P.Harney, T.McShane, J.M.Lloyd, N.G.Weiland // Recent Prog. Horm. Res. – 1997. – Vol. 52. – P. 279-303. 637. Wise, P.M. Effects of estradiol and progesterone on catecholamine turnover rates in discrete hypothalamic regions in ovariectomized rats / P.M.Wise, N.Rance, C.A.Barraclough // Endocrinology. – 1981. – Vol. 108, No. 6. – P. 2186-2193. 638. Wise, P.M. Neuroendocrine modulation and repercussions of female reproductive aging / P.M.Wise, M.J.Smith, D.B.Dubai, M.E.Wilson, S.W.Rau, A.B.Cashion, M.Böttner, K.L.Rosewell // Recent Prog. Horm. Res. – 2002. – Vol. 57. – P. 235-256. 639. Wyse, C. Seasonal biology: avian photoreception goes deep / C.Wyse, D.Hazlerigg // Curr. Biol. – 2009. – Vol. 19, No. 16. – P. R685-R687. 640. Yalçinkaya-Demirsöz, S. Effects of high methionine diet on oxidative stress in serum, apo-B containing lipoproteins, heart, and aorta in rabbits / S.Yalçinkaya-Demirsöz, B.Depboylu, 252 S.Dogru-Abbasoglu, Y.Unlüçerçi, M.Uysal // Ann. Clin. Lab. Sci. – 2009. – Vol. 39, No. 4. – P. 386-391. 641. Yap, S. Classical homocystinuria: vascular risk and its prevention / S.Yap // J. Inherit. Metab. Dis. – 2003. – Vol. 26, No. 2-3. – P. 259-265. 642. Yasuo, S. Effect of melatonin administration on qPer2, qPer3, and qClock gene expression in the suprachiasmatic nucleus of Japanese quail / S.Yasuo, T.Yoshimura, P.A.Bartell, M.Iigo, E.Makino, N.Okabayashi, S.Ebihara // Eur. J. Neurosci. – 2002. – Vol. 16, No. 8. – P. 15411546. 643. Yasuo, S. Melatonin transmits photoperiodic signals through the MT1 melatonin receptor / S.Yasuo, T.Yoshimura, S.Ebihara, H.W.Korf // J. Neurosci. – 2009. – Vol. 29, No. 9. – P. 28852889. 644. Yilmaz, B. Effects of paint thinner exposure on serum LH, FSH and testosterone levels and hypothalamic catecholamine contents in the male rat / B.Yilmaz, S.Kutlu, S.Canpolat, S.Sandal, A.Ayar, R.Mogulkoc, H.Kelestimur // Biol. Pharm. Bull. – 2001. – Vol. 24, No. 2. – P. 163-166. 645. Yilmaz, B. Melatonin inhibits testosterone secretion by acting at hypothalamo-pituitary-gonadal axis in the rat / B.Yilmaz, S.Kutlu, R.Mogulkoç, S.Canpolat, S.Sandal, B.Tarakçi, H.Kelestimur // Neuroendocrinol. Lett. – 2000. – Vol. 21, No. 4. – P. 301-306. 646. Yin, W. Neuroendocrine control of reproductive aging: roles of GnRH neurons / W.Yin, A.C.Gore // Reproduction. – 2006. – Vol. 131, No. 3. – P. 403-414. 647. Young, M.W. Time zones: a comparative genetics of circadian clocks / M.W.Young, S.A.Kay // Nat. Rev. Genet. – 2001. – Vol. 2, No. 9. – P. 702-715. 648. Zawilska, J.B. Daily variation in the concentration of 5-methoxytryptophol and melatonin in the duck pineal gland and plasma / J.B.Zawilska, J.Rosiak, B.Vivien-Roels, D.J.Skene, P.Pévet, J.Z.Nowak // J. Pineal Res. – 2002. – Vol. 32, No. 4. – P. 214-218. 649. Zhang, G. Hypothalamic programming of systemic ageing involving IKK-β, NF-κB and GnRH / G.Zhang, J.Li, S.Purkayastha, Y.Tang, H.Zhang, Y.Yin, B.Li, G.Liu, D.Cai // Nature. – 2013. – Vol. 497, No. 7448. – P. 211-216. 650. Zhao, Z. Y. Aging and the circadian rhythm of melatonin: a cross-sectional study of Chinese subjects 30-110 yr of age / Z.Y.Zhao, Y.Xie, Y.R.Fu, A.Bogdan, Y.Touitou // Chronobiol. Int. – 2002. – Vol. 19, No. 6. – P. 1171-1182. 651. Zheng, B. Nonredundant roles of the mPer1 and mPer2 genes in the mammalian circadian clock / B.Zheng, U.Albrecht, K.Kaasik, M.Sage, W.Lu, S.Vaishnav, Q.Li, Z.S.Sun, G.Eichele, A.Bradley, C.C.Lee // Cell. – 2001. – Vol. 105, No. 5. – P. 683-694. 253 652. Zhu, B.T. On the mechanism of homocysteine pathophysiology and pathogenesis: a unifying hypothesis / B.T.Zhu // Histol. Histopathol. – 2002. – Vol. 17, No. 4. – P. 1283-1291. 653. Zhu, B.T. O-Methylation of tea polyphenols catalyzed by human placental cytosolic catechol-Omethyltransferase / B.T.Zhu, U.K.Patel, M.X.Cai, A.H.Conney // Drug Metab. Dispos. – 2000. – Vol. 28, No. 9. – P. 1024-1030. 654. Ziemińska, E. Role of group I metabotropic glutamate receptors and NMDA receptors in homocysteine-evoked acute neurodegeneration of cultured cerebellar granule neurones / E.Ziemińska, A.Stafiej, J.W.Łazarewicz // Neurochem. Int. – 2003. – Vol. 43, No. 4-5. – P. 481492. 655. Zisapel, N. Melatonin-dopamine interactions: from basic neurochemistry to a clinical setting / N.Zisapel // Cell. Mol. Neurobiol. – 2001. – Vol. 21, No. 6. – P. 605-616. 656. Zisapel, N. Circadian variations in the inhibition of dopamine release from adult and newborn rat hypothalamus by melatonin / N.Zisapel, Y.Egozi, M.Laudon // Neuroendocrinology. – 1985. – Vol. 40, No. 2. – P. 102-108. 657. Zitouni, M. Brain and pituitary melatonin receptors in male rat during postnatal development and the effect of pinealectomy / M.Zitouni, P.Pévet, M.Masson-Pévet // J. Neuroendocrinol. – 1996. – Vol. 8, No. 8. – P. 571-577.
