Самойлович Янина Андреевна (размещена 04.12.2015).
advertisement
ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ НАУЧНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ «НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ АКУШЕРСТВА, ГИНЕКОЛОГИИ И РЕПРОДУКТОЛОГИИ ИМЕНИ Д.О.ОТТА» На правах рукописи Самойлович Янина Андреевна ДЕФИЦИТ АРОМАТАЗЫ Р450 ОВАРИАЛЬНЫХ ФОЛЛИКУЛОВ ПРИ НОРМОГОНАДОТРОПНОЙ АНОВУЛЯЦИИ 14.01.01 – акушерство и гинекология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание учёной степени кандидата медицинских наук Научные руководители: з.д.н. РФ д.м.н. профессор Тарасова М.А. з.д.н. РФ д.м.н. профессор Потин В.В. Санкт-Петербург – 2015 2 ОГЛАВЛЕНИЕ Оглавление…………………………………………………………… 2 Список сокращений………………………………………………….. 3 Введение……………………………………………………………… 5 Глава 1. Обзор литературы………………………………………….. 13 1.1. Патогенез различных форм нормогонадотропной 13 недостаточности яичников…………………………………………... 1.2. Структура и свойства ароматазы р450 ........................................ 31 1.3. Дефекты и полиморфные варианты гена СУР19 .…………….. 39 Глава 2. Материалы и методы исследования.………………………. 44 2.1. Общая характеристика обследованных женщин………………. 44 2.2. Методы исследования…………………………………................ 46 Глава 3. Результаты собственных исследований…………………… 54 3.1. Клиническая характеристика обследованных женщин ………. 54 3.2. Результаты ультразвукового обследования…………………… 58 3.3. Результаты гормонального обследования…. ..…...……………. 60 3.4. Результаты пробы с ингибитором ароматазы летрозолом ….... 67 3.5. Сопоставление клинических, эхографических и гормональных данных у больных с частичным дефицитом ароматазы овариальных фолликулов ……………………………… 79 3.6. Результаты генетического исследования ……………………… 86 3.7. Характеристика женщин с полиморфизмом 7..11(А1А6)(А2А6) по гену СУР19 …………………………………. 89 Глава 4. Обсуждение полученных результатов…………………….. 92 Выводы……………………………………………………………….... 105 Практические рекомендации…………………………………...……. 107 Список литературы………………………………………………….... 108 3 Список сокращений 17-ОНР – 17-гидроксипрогестерон А4 – андростендион АКТГ – адренокортикотропный гормон АМГ - антимюллеров гормон ВГКН - врожденная гиперплазия коры надпочечников ВОЗ- всемирная организация здравоохранения ГРГ - гонадотропин-рилизинг гормон ГСПС - глобулин, связывающий половые стероиды ДЭА- сульфат - дегидроэпиандростерон-сульфат ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота ИМТ – индекс массы тела ИР - инсулинрезистентность ИФР-1- инсулиноподобный фактор роста-1 ЛГ - лютеинизирующий гормон МПКТ – минеральная плотность костной ткани мРНК - матричная рибонуклеиновая кислота НАДФ-Н - никотинамидадениннуклеотидфосфат в восстановленной форме НГЭ - наружный генитальный эндометриоз ПДРФ - полиморфизм длин рестрикционных фрагментов ПКА – протеинкиназа А ПТГ – проба на толерантность к глюкозе ПЦР – полимеразная цепная реакция СД - сахарный диабет СПЯ - синдром поликистозных яичников ТТГ – тиреотропный гормон ФСГ - фолликулостимулирующий гормон цАМФ - циклический аденозинмонофосфат Э1- эстрон 4 Э2 – эстадиол 3ƁHSD – 3-бета-гидроксистероиддегидрогеназа BMP15- морфогенетический белок -15 СУР11А1- ген, кодирующий фермент р450scc СУР19А1 – ген ароматазы р450 CYP 21 – ген, кодирующий 21-гидроксилазу ERKs- внеклеточные регуляторные киназы GDF9 – фактор роста и дифференцировки 9 GLUT4 – транспортер глюкозы 4 типа IGFBP-4 – ИФР- связывающий белок -4 INSR – ген рецептора инсулина МАРК – митоген – активированная протеинкиназа P450c11 - 11β-гидроксилаза P450c17α - 17а-гидроксилаза/ С20-22-лиаза P450c21 – 21-гидроксилаза P450scc- фермент, расщепляющий боковую цепь холестерина PI3K – фосфатидилинозитол-3-киназа SNP - одиночные нуклеотидные полиморфизмы SRD5A1 – ген, кодирующий фермент 5-альфа-редуктазу типа 1 SRD5A2 - ген, кодирующий фермент 5-альфа-редуктазу типа 2 StAR - острофазный стероидогенный регуляторный белок TGF-β - трансформирующий ростовой фактор-β 5 Введение Сохранение и укрепление репродуктивного здоровья является приоритетной задачей не только системы здравоохранения, но и государства в целом. В последние годы наблюдается тенденция к прогрессивному ухудшению здоровья женщин репродуктивного возраста, что обусловлено комплексным влиянием на организм как эндогенных, так и неблагоприятных факторов внешней среды [150,250]. Согласно официальной статистике, распространенность бесплодия составляет от 8% до 19% и имеет тенденцию к постоянному росту [35]. В настоящее время наиболее распространенной формой нарушения репродуктивной функции женщины является нормогонадотропная недостаточность яичников, которая характеризуется неизмененным базальным уровнем ФСГ в крови и может быть обусловлена экстрагонадными и овариальными факторами [17, 18, 179]. По данным ВОЗ [174], распространенность этой патологии составляет до 85% от всех нарушений функции яичников. К заболеваниям, наиболее часто приводящим к развитию нормогонадотропной недостаточности яичников, относят синдром поликистозных яичников (СПЯ), эндометриоз, врожденную гиперплазию коры надпочечников (ВГКН), аутоиммунный оофорит, гиперпролактинемию и гипотиреоз [10, 22, 110, 250]. Кроме того, нормогонадотропная ановуляция может быть обусловлена наличием у женщины дефицита массы тела, ожирения, сахарного диабета I или II типа и хронического сальпингоофорита [16,19,22]. Нормогонадотропная овариальная недостаточность является гетерогенным по механизмам развития состоянием и нередко обусловлена центральными регуляторными нарушениями [22]. К настоящему времени установлено, что приблизительно у 35 % больных с нормогонадотропной недостаточностью яичников механизм положительной обратной связи в гипоталамо-гипофизарноовариальной системе интактен. Овариальная недостаточность у этих больных, следовательно, связана с первично-яичниковыми факторами. Если при гипергонадотропной аменорее примордиальные и полостные фолликулы, как правило, полностью отсутствуют или число их резко снижено, у женщин с 6 нормогонадотропной сохранен и недостаточностью способен поддерживать яичников продукцию фолликулярный аппарат эстрадиола уровне, на превышающем пороговый для запуска механизма отрицательной обратной связи между яичниками и гипофизом. Овариальная недостаточность при этом может быть связана с несостоятельностью доминантного фолликула, уровень секреции эстрадиола которым недостаточен для реализации интактного механизма положительной обратной связи между яичниками и гипофизом [17,18,22]. Недостаточная продукция эстрогенов доминантным фолликулом может быть обусловлена хроническим сальпигоофоритом или аутоиммунным оофоритом [16,17,18]. Другой возможной причиной первично-овариальных нарушений может быть дефект ферментов, ответственных за стероидогенез в яичниках. Можно предположить, что повреждения в гене ароматазы р450, отвечающей за конверсию андрогенов в эстрогены, могут играть определенную роль в патогенезе данной патологии. Энзимный комплекс ароматазы катализирует превращение С- 19андрогенных стероидов в эстрогены, то есть реализует биосинтез эстрона из андростендиона и эстрадиола из тестостерона. Ген, кодирующий ароматазу (CYP19A1), находится на длинном плече 15-ой хромосомы (15q21.2) с направлением транскрипции, ориентированным от теломеры к центромере [137,231]. Неоднократно были описаны случаи снижения активности ароматазы, связанные с наличием мутаций в гене CYP19, что клинически выражается развитием внутриутробной вирилизации, а в последующем-гипергонадотопной недостаточностью яичников, аменореей, бесплодием, нарушением толерантности к глюкозе, жировым гепатозом, остеопенией [221]. Помимо генных мутаций CYP19A1, которые встречаются крайне редко, в литературе описаны также полиморфизмы данного гена. Это изменения в последовательности ДНК, которые происходят более чем у 1% населения и вызывают возникновение различных аллельных форм данного гена [6]. Данные генетические изменения наследуются и их конфигурация уникальна для каждого человека. К настоящему времени описано более 1080 различных генетических полиморфизмов гена CYP19A1. 7 Наиболее хорошо микросателлитных исследованы (TTTA)n полиморфизмы повторов, а в также интроне IV в виде полиморфизма ТСТ, обуловленного делецией 3-х нуклеотидов в этом же интроне. Опубликовано множество данных о влиянии этих полиморфизмов на секрецию половых гормонов [194], и, соответственно, на развитие эстроген - зависимых заболеваний, таких как рак молочной железы [122,193], остеопороз [195], рак эндометрия [100], эндометриоз [99], рак предстательной железы и гинекомастия [60]. Имеются работы [101], в которых показано, что больные СПЯ, гомозиготные по коротким аллелям, имеют более высокий коэффициент тестостерон/эстрадиол, более высокий уровень тестостерона в крови и более высокое соотношение ЛГ/ФСГ по сравнению с гомозиготами по длинным аллелям. Определена взаимосвязь полиморфизма гена СУР19 ((ТТТА)n повторы) с минеральной плотностью костной ткани у женщин в пери- и постменопаузальном возрасте. Так, женщины, имеющие в генотипе аллель (TTTA)11 и/или (ТТТА)12, имеют значительно большую минеральную плотность костной ткани и не страдают остеопорозом в отличие от женщин, в генотипе которых имеется меньшее количество (ТТТА) повторов [195]. Результаты этого исследования косвенно свидетельствуют о более высоком уровне эстрогенов в крови женщин, несущих аллель (ТТТА)11 и/или (ТТТА)12. Эстрогены играют существенную роль в развитии синдрома преждевременного полового созревания. При исследовании количества (ТТТА) повторов в группе девочек с данной патологией было выявлено, что аллель (ТТТА)13 встречается только в основной группе и не встречается у здоровых девочек контрольной группы. Носители аллеля (ТТТА)13 имели значительно более высокий уровень эстрогенов в крови. Эти результаты также могут свидетельствовать об ассоциации ароматазной активности с числом повторов (ТТТА) [152]. Аллель (ТТТА)7 гена CYP19 встречается в двух вариантах: стандартном – с наличием тринуклеотида ТСТ на 5'-конце (insertion (Ins)) и в «укороченном» - с отсутствием TCT (deletion (Del)) [26]. Более низкое количество повторов (ТТТА)n генаCYP19, в частности del-(ТТТА)7, ассоциируется с увеличением 8 уровня андрогенов и уменьшением эстрогенов в крови и, возможно, снижением ферментативной активности ароматазы [67]. В 2012 г. Савиной В.А. и соавт. [27] не было выявлено ассоциации аллельных вариантов гена ароматазы СУР19 ((ТТТА)nполиморфизм) и (del(TCT)) с развитием СПЯ. Однако в данной работе в группе обследованных женщин с СПЯ учитывалась только общая ароматазная активность яичников, тогда как ароматазная активность отдельных фолликулов не определялась. В недавно проведенных исследованиях [4] было обнаружено, что почти у половины (48,8%) больных СПЯ определяется сниженная ароматазная активность фолликулов, что свидетельствует распространенного заболевания, о неоднородности сопровождающегося патогенеза самого нормогонадотропной ановуляцией. Существует группа женщин, имеющих клинические признаки гиперандрогенемии (гирсутизм, угревая сыпь, нарушение функции яичников), но совокупность симптомов неклассической формы которых не укладывается в картину СПЯ или ВГКН-наиболее распространенных заболеваний, сопровождающихся гиперандрогенемией. По данным литературы [46], на долю гиперандрогенемии «неясного происхождения» приходится 17,4 %. Возможно, частичный дефицит ароматазы р450, ответственной за конверсию андрогенов в эстрогены, также может играть роль в патогенезе «идиопатической» гиперандрогенемии. Представляется перспективным изучение особенностей полиморфизма гена ароматазы CYP19 при нормогонадотропной недостаточности яичников по сравнению с женщинами, имеющими овуляторные циклы. В современной литературе нет описания клинических, гормональных, эхографических и генетических (полиморфизм нормогонадотропной гена ановуляцией, CYP 19) сочетающейся особенностей с низкой больных с ароматазной активностью антральных фолликулов. Цель исследования отражена в названии и состоит в выяснении роли ароматазы р450 в патогенезе нормогонадотропной ановуляции. 9 Задачи исследования: 1. Установить частоту встречаемости дефицита ароматазы овариальных фолликулов среди больных с нормогонадотропной ановуляцией. 2. С помощью пробы с летрозолом выделить группу больных с низкой ароматазной активностью фолликулов и проанализировать ее клинические, эхографические и гормональные особенности. 3. Изучить реакцию гонадотропинов и половых стероидных гормонов на ингибитор ароматазы летрозол у здоровых женщин и больных с нормогонадотропной ановуляцией и низкой активностью ароматазы фолликулов. 4. Изучить связь дефицита овариальной ароматазы фолликулов с числом антральных фолликулов в яичниках и с содержанием половых стероидных гормонов в крови больных с нормогонадотропной ановуляцией. 5. Определить частоту аллелей и генотипов по гену ароматазы CYP19 ((TTTA)n полиморфизм, del(TCT) полиморфизм) в группе больных с низкой ароматазной активностью фолликулов. Научная новизна и теоретическая значимость работы Определена частота встречаемости дефицита ароматазы овариальных фолликулов среди женщин с нормогонадотропной ановуляцией (26,3%). Впервые выделена группа больных с нормогнадотропной недостаточностью яичников и дефицитом ароматазы фолликулов. Получена их клиническая, гормональная и эхографическая характеристика. Определено, что наиболее частыми клиническими проявлениями дефицита ароматазы овариальных фолликулов являются: опсоменорея (70%), андрогензависимая дермопатия в виде акне (60%) и избыточная масса тела (28%). Выявлено, что большинство женщин обследуемой группы (56%) имеют клинические (андрогензависимая дермопатия), 10 эхографические (увеличение объема яичников и количества в них антральных фолликулов) и гормональные (гиперпродукция ЛГ гипофизом, АМГ и андрогенов яичниками) признаки СПЯ. Ароматазная активность фолликулов у больных с нормогонадотропной ановуляцией находится в прямой зависимости от содержания эстрадиола в крови и в обратной зависимости от числа антральных фолликулов. Отрицательная связь ароматазной активности фолликулов с их числом и положительная связь с уровнем эстрадиола в крови позволяют считать, что увеличение когорты антральных фолликулов направлено на поддержание продукции эстрогенов яичниками в количестве, препятствующем «растормаживанию» гонадотропной функции гипофиза и развитию гипергонадотропной овариальной недостаточности. Выявлено, что наиболее частым генотипом по гену CYP19 ((TTTA)n полиморфизм) у больных с низкой ароматазной активностью фолликулов является (TTTA)7(TTTA)11 (42%), который у здоровых женщин встречается лишь в 12,8% случаев. Данное различие между сравниваемыми группами является статистически значимым (р=0,0003). Найденные особенности полиморфизма гена СУР19 позволяют предполагать генетическую обусловленность дефицита овариальной ароматазы. Практическая значимость работы Обнаружена положительная статистически значимая корреляция (у больных с нормогонадотропной ановуляцией r=0,9, у здоровых женщин r=0,7 при р=0,01) между коэффициентами Э2/АМГ и ∆Э2/АМГ. Это позволяет использовать отношение Э2/АМГ (где Э2-уровень эстрадиола в крови в пмоль/л, АМГ- уровень АМГ в крови на 2-й день менструального цикла в нг/мл) как показатель ароматазной активности овариальных фолликулов. 11 Основные положения, выносимые на защиту 1. Дефицит ароматазы антральных фолликулов в начале менструального цикла (до инициации доминантного фолликула) выявляется у 26,3% больных с нормогонадотропной ановуляцией. 2. Наиболее частыми клиническими проявлениями дефицита ароматазы фолликулов являются: опсоменорея (70%), андогензависимая дермопатия (60 %) и избыточная масса тела (28%). 3. Клинические (андрогензависимая дермопатия), эхографические (увеличение объема яичников и количества в них антральных фолликулов) и гормональные (гиперпродукция ЛГ гипофизом, АМГ и андрогенов яичниками) признаки СПЯ имеют в различных сочетаниях большинство больных (56%) с дефицитом ароматазы овариальных фолликулов. 4. Наиболее частым генотипом по гену CYP19 ((TTTA)n полиморфизм) у больных с низкой ароматазной активностью фолликулов является (TTTA)7(TTTA)11 (42%), встречающийся лишь у 12,8% женщин группы сравнения, что позволяет предполагать генетическую обусловленность дефицита ароматазы антральных фолликулов. Апробация работы Материалы диссертации доложены на VIII междисциплинарной конференции по акушерству, перинатологии, неонатологии «Здоровая женщина – здоровый новорожденный», Санкт-Петербург, 2013; V ежегодной научнопрактической конференции молодых ученых и специалистов «Репродуктивная медицина: взгляд молодых – 2014», Санкт- Петербург, 2014; LXXV научнопрактической конференции «Актуальные вопросы экспериментальной и клинической медицины», Санкт-Петербург, 2014; VII региональном научном форуме «Мать и дитя» и Пленума Российского общества акушеров-гинекологов. – Геленджик, 2014; Снегиревских чтениях «Инновационные технологии в 12 акушерстве и гинекологии» в секции молодых иследователей- Москва, 2015. По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ, в том числе 2 статьи – в рецензируемых научных журналах и изданиях. Внедрение результатов исследования в практику Результаты исследования внедрены в работу отделения гинекологической эндокринологии ФГБУ «НИИАГ им. Д.О. Отта» СЗО РАМН, в учебный процесс на кафедре акушерства и гинекологии СПбГМУ имени И.П. Павлова. 13 ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1 Патогенез различных форм нормогонадотропной недостаточности яичников Нормогонадотропная ановуляция - форма овариальной недостаточности, характеризующаяся неизмененным базальным уровнем ФСГ в крови, может быть обусловлена экстрагонадными и овариальными факторами [17,18,179]. Данная патология является частой причиной нарушения менструального цикла и бесплодия и составляет, по данным ВОЗ [174], 85% от всех нарушений функции яичников. Нормогонадотропную недостаточность яичников принято считать результатом центральных регуляторных нарушений [18,22]. К заболеваниям, наиболее часто приводящим к развитию нормогонадотропной недостаточности яичников, относят синдром поликистозных яичников (СПЯ), эндометриоз, врожденную гиперплазию коры надпочечников (ВГКН), аутоиммунный оофорит, гиперпролактинемию и гипотиреоз [10,18,22,24,41,110,250]. Кроме того, нормогонадотропная ановуляция может быть обусловлена наличием у женщины дефицита массы тела, ожирения, сахарного диабета 1 или 2 типа хронического сальпингоофорита [5,16,19,30]. 1.1.1 Синдром поликистозных яичников СПЯ является наиболее распространенным эндокринным заболеванием среди женщин репродуктивного возраста, которое характеризуется хронической ановуляцией и избытком андрогенов. Частота его встречаемости, по данным разных авторов, составляет 5-10% [110,192]. Первые описания клинической картины СПЯ были сделаны итальянцем Валлиснери в 1721 году, много позже A. Chereau были выявлены морфологические изменения склерокистозных яичников и опубликованы в 1844 году. Российским исследователем С.К. Лесным в 1928 году были сделаны первые сообщения об успешном лечении пациенток с 14 клинической картиной СПЯ путем клиновидной резекции яичников. Однако лишь в 1935 году Штейном и Левенталем была выявлена связь между поликистозом яичников и аменореей, олигоменореей, бесплодием, гирсутизмом и ожирением, что позволило авторам выделить заболевание в отдельную нозологическую форму [228]. Разнообразие клинической картины заболевания привело к необходимости выработки критериев диагностики СПЯ. Впервые эти критерии были опубликованы Национальным институтом здоровья США в 1990 году. В соответствии с данными рекомендациями диагноз СПЯ мог быть установлен при обязательном наличии у пациентки ановуляции и гиперандрогенемии, но не учитывал присутствие сопутствующих метаболических нарушений или нарушений репродуктивной функции [191]. В последующие годы стало очевидно, что клиническая картина СПЯ более разнообразна, и критерии диагностики требуют пересмотра, что привело к принятию Роттердамского консенсуса в 2003 году. В соответствии с Роттердамскими критериями, диагноз СПЯ может быть установлен на основании выявления у пациентки 2-х из 3-х ключевых признаков: ановуляции, гиперандрогенемии и эхографических признаков поликистозных яичников при условии исключения других причин гиперандрогенемии [210]. Ановуляция является наиболее распространенным клиническим признаком и выявляется практически у 95% женщин с СПЯ, частым клиническим проявлением ановуляции является опсо- или аменорея [50,54]. СПЯ является гетерогенным заболеванием. Спектр клинических проявлений варьирует в зависимости от возраста, наличия ожирения и метаболических нарушений [50]. Манифестация СПЯ чаще всего происходит в подростковом или раннем репродуктивном возрасте, когда после своевременного менархе не устанавливается регулярный менструальный цикл и формируется опсоменорея [33,86]. Тем не менее, нарушения менструального цикла не являются облигатным признаком СПЯ, поскольку даже при регулярных менструациях возможна ановуляция, что является причиной бесплодия [155]. Клинические признаки гиперандрогенемии (гирсутизм, акне, себорея и алопеция) наблюдаются примерно 15 у 60% пациенток с СПЯ [238]. Наличие гиперандрогенемии выявляется посредством измерения уровня циркулирующих андрогенов, однако тяжесть симптомов андрогензависимой дермопатии не всегда коррелирует со степенью гиперандрогенеми [31,88,103]. Наличие эхографических признаков поликистозных яичников является важным, но не облигатным диагностическим критерием СПЯ. Распространенность поликистозных яичников у пациенток с СПЯ, по данным разных авторов, колеблется от 17% до 33% [71,105]. Ожирение не является важным диагностическим критерием СПЯ, тем не менее, доля таких больных достигает 42%, что значительно превышает общепопуляционные значения (менее 30%) [85]. Метаболические нарушения, индуцированные ожирением, приводят к формированию инсулинорезистентности (ИР), нарушению толерантности к глюкозе и сахарному диабету (СД) 2 типа [144]. Таким образом, облигатных признаков СПЯ не существует, что обусловливает необходимость комплексного подхода к обследованию таких пациенток. До настоящего времени многие вопросы этиологии и патогенеза СПЯ остаются окончательно неизученными. Согласно современным представлениям, СПЯ является мультифакториальным заболеванием, многообразие клинических и биохимических проявлений которого обусловлено воздействием различных экзои эндогенных факторов [110,216]. В процессе изучения механизмов развития заболевания было предложено множество теорий возникновения СПЯ, среди них наиболее известными являются яичниковая, центральная, надпочечниковая теории СПЯ, а также теория о первичной роли гиперинсулинемиии [29,189]. Во время фолликулярной фазы происходит селекция когорты растущих фолликулов, из которых в последующем овулирует один фолликул, а остальные подвергаются атрезии [71]. При СПЯ яичниковая гиперандрогенемия, ИР и гиперинсулинемия приводят к нарушению паракринных взаимодействий и препятствуют росту фолликулов [184,189]. В последующем эти изменения приводят к нарушению менструального цикла, ановуляторным кровотечениям и накоплению малых антральных фолликулов по периферии яичников, придавая им поликистозную морфологию [173]. Существует предположение, что нарушение 16 роста фолликула при СПЯ обусловлено дефицитом ароматазы в клетках гранулезы, возникающего из-за избытка 5-альфа редуктазы в тканях яичника [127]. Важным механизмом нарушения дифференцировки клеток гранулезы антральных фолликулов и ее низкой ароматазной активности при СПЯ является гиперпродукция лютеинизирующего гормона (ЛГ) гипофизом, что приводит к нарушению роста и созревания доминантного фолликула, кистозной атрезии антральных фолликулов, а также повышению выработки андрогенов клетками теки, которые также потенцируют кистозные изменения в яичниках [29]. Повышение продукции ЛГ и инсулиноподобного фактора роста-1 (ИФР-1) под влиянием гиперинсулинемии приводит к увеличению пролиферативной активности клеток внутренней теки фолликула и усилению синтеза андрогенов [72]. Избыток инсулина способствует преждевременной лютеинизации фолликулов посредством снижения ФСГ-индуцированной дифференциации клеток гранулезы [239]. Кроме того, гиперпродукция антимюллерового гормона (АМГ) клетками гранулезы фолликулов при СПЯ противодействует эффектам ФСГ в малых антральных фолликулах, что приводит к дефициту эстрогенов, несмотря на достаточную биодоступность ФСГ [8,96,185]. Результаты проведенных Николаенковым И.П. и соавт. исследований [4] указывают на патогенетическую гетерогенность СПЯ. Почти у половины больных СПЯ определялась сниженная ароматазная активность фолликулов. По мнению авторов, это может служить пусковым моментом для увеличения числа антральных фолликулов, направленное на поддержание уровня эстрадиола в крови, препятствующего «растормаживанию» гонадотропной функции гипофиза. Увеличение числа антральных фолликулов сопровождается усилением секреции яичниками АМГ, который способен тормозить овариальную ароматазу и тем самым в еще большей степени нарушать фолликулогенгез и стероидогенез в яичниках. У больных с неизмененной и повышенной ароматазной активностью фолликулов существенную роль в развитии СПЯ могут играть гиперпродукция ЛГ и повышенная чувствительностью к нему яичников, например, под влиянием гиперинсулинемии [4]. 17 Ожирение и ИР выявляются у многих пациенток с СПЯ. ИР приводит к возникновению компенсаторной гиперинсулинемии, которая обусловливает развитие многих фенотипических признаков СПЯ. Тем не менее, не у всех женщин с гиперинсулинемией развивается гиперандрогенемия и СПЯ, что объясняется наличием генетической предрасположенности к стимулирующему действию инсулина на синтез андрогенов в яичниках. Несмотря на то, что распространенность ожирения у женщин увеличилась за последние два десятилетия, ожирение само по себе не является обязательным признаком СПЯ [256]. Важно отметить, что ИР выявляется у пациенток с СПЯ даже при нормальной массе тела. Молекулярные механизмы, лежащие в основе развития резистентности к инсулину при СПЯ, остаются неизвестными; однако в разных исследованиях была продемонстрирована роль первичных дефектов инсулинопосредованного транспорта глюкозы [149], синтеза рецепторов GLUT4 [93], несмотря на отсутствие дефектов связывания с инсулином [90,125,191]. Таким образом, генетически обусловленная ИР и гиперинсулинемия у пациенток с СПЯ приводят к стимуляции инсулином через рецепторы ИФР-1 продукции андрогенов яичниками. Инсулин повышает чувствительность яичников к ЛГ, что приводит к усилению синтеза андрогенов. Возросшие концентрации андрогенов в крови вызывают атрезию фолликулов, что приводит к дегенерации клеток гранулезы и гиперплазии тека-клеток [29, 65,79]. Однако, проведенные исследования об эффективности стимуляции овуляции ингибиторами ароматазы у больных СПЯ [25], дают основание считать, что гиперандрогенемия не является ведущей причиной нарушения фолликулогенеза при данном заболевании. Авторами [25] выявлено, что применение летрозола приводило к повышению содержания андрогенов в крови и одновременно стимулировало рост доминантного фолликула. Фактором, нарушающим развитие доминантного фолликула при СПЯ, может являться повышенная чувствительность гипофиза к стимулирующему действию эстрогенов [25]. Согласно центральной теории, пусковым механизмом развития СПЯ, является нарушение регуляции функции яичников - повышение импульсной секреции ГРГ и, как следствие, повышение 18 частоты и амплитуды импульсов ЛГ [29,33]. Усиление позитивной обратной связи между яичником и гипофизом приводит к преждевременным выбросам ЛГ гипофизом, лютеинизации и атрезии доминантного фолликула. Сниженная под влиянием летрозола конверсия андрогенов в эстрогены в доминантном фолликуле может предупредить появление преждевременных пиков ЛГ и обеспечить дальнейшее развитие фолликула до предовуляторной стадии. Уменьшение уровня эстрадиола в крови под влиянием летрозола «включает» механизм негативной обратной связи, что сопровождается усилением продукции гонадотропинов гипофизом. Усиление секреции ФСГ, вероятно, определяет рост и развитие доминантного фолликула под воздействием летрозола [25]. Относительная недостаточность ФСГ, возникающая вследствие нарушения соотношения ЛГ/ФСГ при СПЯ, является причиной снижения активности ароматазы, и в клетках гранулезы нарушается ароматизация андрогенов в эстрогены [190]. Семейное накопление случаев СПЯ привело к активному поиску генетических маркеров заболевания. Показано, что заболевание наблюдается у 2040% родственниц первой степени женщин с СПЯ, что гораздо больше, чем в общей популяции (4-6%) [251]. В исследованиях близнецов, конкордантных по СПЯ, была выявлена взаимосвязь клинических проявлений заболевания с генетическими факторами, что указывает на генетическую природу некоторых проявлений заболевания со значительным влиянием факторов окружающей среды [145]. Считается, что воздействие неблагоприятных факторов на плод в период внутриутробного развития может приводить к формированию фенотипа СПЯ. В экспериментах беременным обезьянам [51] и овцам [252] вводили высокие дозы тестостерона, и у рожденных самок до достижения репродуктивного возраста отмечалась гиперсекреция ЛГ, яичниковая гиперандрогенемия, ановуляция, а также ИР и абдоминальное ожирение. При гистологическом исследовании биоптатов яичников наблюдалась морфологическая картина, сходная с таковой при СПЯ. Тем не менее, до настоящего времени клинические исследования не подтверждают роли избытка тестостерона в период внутриутробного развития человека в развитии СПЯ [69,91]. 19 Первыми попытками объяснить случаи семейного накопления СПЯ были цитогенетические исследования. A. Netter в 1961 году и N. Bishum в 1964 году впервые обнаружили высокую распространенность анэуплоидии Х-хромосомы у женщин с СПЯ, однако в дальнейших исследованиях было выявлено, что эти аномалии не влияют на частоту развития СПЯ [251]. Длительное время обсуждалась роль генных мутаций в патогенезе СПЯ. H.E. Cooper (1968) и J.R. Givens (1988) предположили аутосомно-доминантный тип наследования СПЯ на основании обследования семей с клиническими и биохимическими признаками заболевания. Авторы предполагали наследование заболевания как по материнской, так и отцовской линии с высокой степенью пенетрантности, однако в дальнейших исследованиях тип наследования определить не удалось [69]. По современным представлениям, СПЯ является полигенным заболеванием, в связи с чем перспективным направлением является изучение роли геновкандидатов. В настоящее время активно изучается участие генов, вовлеченных в стероидогенез в яичниках, генов, ответственных за действие гормонов гипофиза, синтез и действие инсулина, метаболизм углеводов, а также медиаторов воспаления [33,111,180,251]. Ген CYP11A кодирует ферменты Р450scc и катализирует превращение холестерина в прогестерон, рассматривается как ген-кандидат гиперандрогенемии при СПЯ. Доказательства ассоциации локуса CYP11A с СПЯ противоречивы, и результаты варьируют в различных популяциях женщин [141]. В одном из крупнейших исследований, посвященных изучению роли полиморфизмов этого гена в патогенезе СПЯ, было проведено в Великобритании с участием 370 женщин с СПЯ. По результатам проведенной работы авторами не было обнаружено связи между VNTR-полиморфизмом этого гена и повышенной частотой развития СПЯ [63]. Литературные данные убедительно демонстрируют важную роль 5αредуктазы в патогенезе СПЯ. Данный фермент катализирует превращение тестостерона в дигидротестостерон. В исследовании, проведенном с участием 287 женщин с СПЯ, была продемонстрирована связь между полиморфизмом генов, 20 кодирующих изоформы 5α-редуктазы (SRD5A1 и SRD5A2) и восприимчивостью к развитию СПЯ [126,127]. Тем не менее, все работы, посвященные роли полиморфизмов 5α-редуктазы в патогенезе СПЯ, были выполнены на небольших выборках пациенток, что обусловливает необходимость проведения дальнейших исследований [162]. Роль гена, кодирующего рецепторы андрогенов, также изучается в патогенезе СПЯ. Выявлено, что уменьшение числа CAG повторов в экзоне этого гена приводит к увеличению активности андрогенов в периферических тканях, что клинически выражается в развитии у женщины синдрома андрогензависимой дермопатии. В одном из исследований, включившего 330 женщин с СПЯ, было выявлено значительное андрогенового снижение рецептора [219]. (13%) числа Полученные CAG повторов результаты также в гене были подтверждены и в других исследованиях [150]. Полиморфизм в гене рецептора инсулина (INSR) предполагается в качестве маркера, обусловливающего развитие СПЯ и ИР. Полиморфизм в области тирозинкиназы INSR (экзон 17-21) представляет особый интерес, так как мутации в этой области связаны с умеренной гиперинсулинемией и ИР [123]. Ранее было показано, что замена С/Т в положении 1058 связана с СПЯ. Тем не менее, в нескольких других исследованиях такой связи выявлено не было, хотя следует отметить, что все эти исследования проводились на малых выборках пациенток [68,149]. Глобулин, связывающий половые стероиды (ГСПС) представляет собой гликопротеин, который регулирует биодоступность андрогенов путем связывания половых стероидов [89]. Исследования показали, что снижение уровня сывороточного ГСПС ассоциировано с риском развития СПЯ у женщин, а также СД 2 типа у мужчин и женщин [186,218]. Было показано, что наличие (TAAAA) полиморфизма пентануклиотидного повтора в промоторной области влияет на эффективность транскрипции ГСПС, что приводит к снижению уровней сывороточного ГСПС [53]. В двух небольших когортных исследованиях случайконтроль в Греции была продемонстрирована ассоциация между наличием 21 больших повторов в гене (TAAAA) и СПЯ [240,254]. Однако в других исследованиях такой связи обнаружено не было [197]. Калпаин-10 является триггерной цистеин-протеазой инсулина. Выявлено, что комбинация гаплотипов (112 и 121), состоящих из трех полиморфизмов (UCSNP-43, -19 и -63 ), увеличивает риск развития СД 2 типа у гетерозиготных носителей [207]. В 2003 году A. Gonzalez и E. Abril [226] первыми выявили наличие связи между UCSNP-44 и СПЯ, а также гаплотипами калпаина-10 и другими фенотипическими характеристиками СПЯ (в том числе гиперхолестеринемия и гирсутизм) у испанских женщин. В исследовании, проведенном в Турции, также обнаружена значимая корреляционная связь между UCSNP-44 и СПЯ [84]. Тем не менее, следует отметить, что некоторые из этих исследований имеют относительно небольшие размеры выборки. Продуктом гена CYP19 является ароматаза, с помощью которой происходит конверсия андрогенов в эстрогены. В течение многих лет изучается возможная роль полиморфизмов этого гена в патогенезе СПЯ. N. Gharani et al. [63,132] на основании данных, полученных в более ранних исследованиях о развитии гиперандрогенемии у пациенток с дефицитом ароматазы, предложили гипотезу, согласно которой полиморфизмы гена ароматазы приводят к снижению ароматазной активности клеток гранулезы, и формируется относительный избыток андрогенов, нарушающий развитие фолликулов. Авторами был описан клинический случай мутации CYP19, ассоциированной с СПЯ, однако позже был сделан вывод, что для мутаций гена CYP19 более характерна клиническая картина гипергонадотропного гипогонадизма [143]. Несмотря на то, что в ранних исследованиях не удалось найти связь между CYP19 и СПЯ, что, вероятно, обусловлено низкой статистической мощностью, в работе, проведенной C.J. Petry и K.K. Ong [61] показана сильная связь между наличием однонуклеотидного полиморфизма (SNP50) в гене CYP19 и гиперандрогенемией у девушек с преждевременным пубархе. Кроме того, недавнее исследование показало, что наличие коротких микросателлитных (TTTA)n повторов в четвертом интроне гена CYP19 связано с повышением уровня 22 андрогенов и абдоминальным ожирением среди женщин [67]. Роль данного полиморфизма в формировании фенотипа СПЯ была продемонстрирована также в исследовании, проведенном N. Xita и L. Lazaros [101]. Авторами выявлено, что женщины с СПЯ, как правило, имеют более короткие (TTTA)n повторы (9 или меньшее количество повторов), чем здоровые женщины контрольной группы (33,1% против 29,5%) несмотря на отсутствие статистической значимости. Тем не менее, пациентки с более высоким уровнем тестостерона в крови чаще были гомозиготными по данному полиморфизму по сравнению с контрольной группой (59,1% против 42,1%). Кроме того, пациентки, гомозиготные по коротким аллелям данного гена, имели более высокие соотношения тестостерон/эстрадиол, более высокий уровень тестостерона в крови и соотношение ЛГ/ФСГ [101,151]. Тем не менее, в работе, выполненной В.А. Савиной [27], не было выявлено статистически значимых различий в частоте аллелей и генотипов по гену ароматазы CYP19 ((TTTA)n полиморфизм, del(TCT) полиморфизм и SNP50 (rs2414096)) у пациенток с СПЯ по сравнению с показателями в контрольной группе. 1.1.2 Врожденная гиперплазия коры надпочечников ВГКН – группа врожденных нарушений стероидогенеза, наследуемых по аутосомно-рецессивному типу, обусловленных дефицитом одного из ферментов системы, участвующих в синтезе кортизола и минералкортикоидов [32, 212]. Дефект любого из 5-ти ферментов стероидогенеза (Р450c17α, StAR, 3β-HSD, P450c21 или P450c11) обусловлен мутациями соответствующего гена и заключается в частичной или полной потере активности фермента [163]. Распространенность классических форм ВГКН составляет от 1:9800 до 1:13000 новорожденных, неклассические формы заболевания встречаются значительно чаще и составляют примерно 0,2% среди европейского населения (этот показатель широко колеблется в разных этнических группах) [177,250]. 23 Недостаточность 21-гидроксилазы (недостаточность P450c21) встречается наиболее часто из всех ферментных нарушений коры надпочечников, составляя до 95% в структуре ВГКН [10,176]. Ген, кодирующий 21-гидроксилазу (P450c21), локализуется на коротком плече 6-ой хромосомы (6p) и представлен в виде активного гена CYP21 или неактивной копии CYP21P [177,212]. Вследствие недостаточности 21-гидроксилазы блокируется превращение 17- гидроксипрогестерона в 11-дезоксикортизол, что приводит к нарушению синтеза кортизола и накоплению его предшественников: 17-гидроксипрогестерона, прегненолона, 17-гидроксипрегненолона и прогестерона, которые в сетчатом слое коры надпочечников дегидроэпиандростерон, недостаточность конвертируются андростендион 21-гидроксилазы в надпочечниковые андрогены: тестостерон. Клинически и протекает в двух основных формах: классической (вирильной и сольтеряющей) и неклассической (более «мягкой») [94]. Нередко ранняя диагностика неклассических форм ВГКН крайне затруднена. Клиническая картина заболевания зачастую представлена легкими формами гирсутизма и опсоменореи, а также бесплодием или привычным невынашиванием беременности [32,177]. Вирилизации наружных половых органов, как при классических формах ВГКН, обычно не наблюдается [94]. Однако при неклассической форме заболевания отмечается ускоренный рост или быстрое увеличение костного возраста, а также картина преждевременного пубархе. Доминирующими симптомами, как правило, является гирсутизм (у 60% пациенток), опсоменорея (54%), угревая сыпь (33%) и бесплодие (13%) [212,250]. По данным исследования, проведенного Е.Л. Соболевой [32], развитие нормогонадотропной недостаточности яичников у пациенток с неклассической формой ВГКН наблюдалось в 77% случаев. Из них у 89% женщин отмечалась хроническая ановуляция и у 11% - лютеиновая недостаточность. Нарушения менструального цикла были отмечены у 81% пациенток, из них у большинства (80%) диагностирована опсоменорея, значительно реже – вторичная аменорея (16%), а также у 3% женщин – первичная аменорея и у 1% - меноррагии. Кроме 24 того, результаты проведенной работы демонстрируют статистически значимое увеличение уровня андрогенов в крови пациенток с неклассической формой ВГКН по сравнению с аналогичным показателем как у здоровых женщин, так и у больных СПЯ [32]. Существует группа женщин, имеющих клинические признаки гиперандрогенемии (гирсутизм, угревая сыпь, нарушение функции яичников), но совокупность симптомов неклассической которых не укладывается в картину СПЯ или формы ВГКН-наиболее распространенных заболеваний, сопровождающихся гиперандрогенемией. По данным литературы [46], на долю гиперандрогенемии «неясного происхождения» приходится 17,4 %. Некоторые авторы считают, что идиопатический гирсутизм в этом случае связан или с повышенным содержанием дигидротестостерона или с повышенной чувствительностью рецепторов клеток волосяных фолликулов к воздействию андрогенов [11]. Клиническая картина при «идиопатической» гиперандрогенемии сходна с таковой при неклассической форме недостаточности 21- гидроксилазы, исключая значительное повышение уровня 17-ОНР после пробы с АКТГ у больных с неклассической формой ВГКН [15]. Возможно, частичный дефицит ароматазы р450, ответственной за конверсию андрогенов в эстрогены, играет роль в патогенезе «идиопатической» гиперандрогенемии. 1.1.3 Наружный генитальный эндометриоз Нередко яичников причиной является развития наружный нормогонадотропной генитальный недостаточности эндометриоз (НГЭ). Распространенность эндометриоза среди женщин репродуктивного возраста, по данным разных авторов [3,43,203], варьирует от 12 до 80%. Согласно современным данным, эндометриоз – это патологический процесс, при котором за пределами полости матки происходит доброкачественное разрастание ткани, по морфологическим и функциональным свойствам подобной эндометрию [34,44,78]. Несмотря на значительное количество исследований, посвященных 25 проблеме эндометриоза, на сегодняшний день вопросы этиологии и патогенеза этого заболевания остаются окончательно неизученными. Активно исследуется роль генетических факторов, иммунных и гормональных нарушений, а также особенности эндометрия при эндометриозе [42,135]. К настоящему времени было сформулировано множество теорий патогенеза эндометриоза, среди которых наибольшее распространение получила имплантационная теория, предложенная J.A. Sampson в 1920 году. Согласно этой теории, формирование очагов эндометриоза происходит вследствие ретроградного заброса менструальной крови по маточным трубам в брюшную полость [45,155,243]. Однако, несмотря на то, что данная теория объясняет, каким образом фрагменты эндометрия попадают в брюшную полость, необходимо присутствие факторов, способствующих росту имплантатов, обеспечивающих защиту от иммунной системы, способность к инвазии и стимулирующих ангиогенез. Таким образом, были выявлены специфические молекулярные особенности эндометриоза: генетическая предрасположенность, эстрогензависимость, резистентность к действию прогестерона и воспаление [82,146]. По данным В.М. Денисовой [3], при НГЭ у 64,7% женщин развивается нормогонадотропная недостаточность яичников, что в большинстве случаев (55,9%) характеризуется ановуляцией, в 8,8% - недостаточностью лютеиновой фазы. Развитие происходящими нормогонадотропной нарушениями ановуляции фолликулогенеза при - НГЭ снижается обусловлено количество преовуляторных фолликулов, их рост, размеры доминантного фолликула, снижается количество эстрадиола, андрогенов и прогестерона и повышается концентрация активина в фолликулярной жидкости [45,157]. В различных исследованиях было показано, что у пациенток с эндометриозом снижается экспрессия рецепторов к ЛГ, а также не происходит необходимых для нормальной овуляции изменений в содержании протеолитических ферментов, цитокинов и стероидных гормонов в фолликулярной жидкости [55,56,87]. 26 Важно отметить, что у пациенток с эндометриозом овулирует меньшее количество ооцитов, чем у здоровых женщин. Недавнее исследование показало, что при НГЭ отмечается увеличение апоптоза клеток кумулюса, окружающих ооцит [106]. Апоптоз в клетках яичников отражает низкое качество ооцитов. Гибель клеток кумулюса, вероятно, приводит к снижению созревания и качества ооцитов вследствие нарушения нутритивной поддержки, которая осуществляется этими клетками [70]. Считается, что генетические изменения клеток эндометрия, влияющие на их склонность к имплантации, могут быть наследственными. Так, было показано, что риск развития заболевания у родственников первой степени пациенток с тяжелым эндометриозом в шесть раз выше, чем у родственников здоровых женщин [64]. В крупном исследовании, проведенном J.N. Painter, C.A. Anderson в 2011 году [183] с участием более чем 1100 семей с двумя или более родственниками, больными эндометриозом, были идентифицированы локусы хромосом 10q26 и 7p15, ассоциированные с эндометриозом. В настоящее время получено большое количество доказательств эпигенетической регуляции действия стероидных гормонов в эндометрии [258] и нарушения этой регуляции у женщин с эндометриозом [52]. В частности, нарушения метилирования ДНК промоутеров генов, продукты которых имеют решающее значение для нормального ответа эндометрия на действие прогестерона, были обнаружены у пациенток с эндометриозом [130]. Кроме того, в исследовании T. Toloubeydokhti и Q. Pan [236] было обнаружено снижение активности микроРНК в эктопическом эндометрии, экспрессия которой регулируется гормонами яичников. В связи с этим, интерес представляет изучение распространенности полиморфизмов генов, ответственных за стероидогенез в яичниках у пациенток с НГЭ. N. Kado и J. Kitawaki [62] было выявлено, что наличие (ТТТА)n полиморфизма в интроне 4 гена CYP19 ассоциировано с повышенным риском развития НГЭ, аденомиоза и миомы матки. Повышенная экспрессия мРНК ароматазы цитохрома Р450 в эутопическом эндометрии при эндометриозе была 27 впервые обнаружена L.S. Noble в 1996 году [59]. Ароматаза стимулирует локальное увеличение продукции эстрогенов, которые в дальнейшем индуцируют синтез простагландинов путем активации циклооксигеназы-2. Чрезмерное увеличение уровня эстрогенов и простагландинов препятствует фагоцитозу макрофагов и NK-клеток, что облегчает имплантацию клеток эндометрия в брюшину [42]. Статистически значимое повышение активности ароматазы в антральных фолликулах у пациенток с НГЭ было продемонстрировано в исследовании, проведенном В.М. Денисовой [3]. Автором также показано, что ароматазная активность антральных фолликулов напрямую зависит от степени распространенности НГЭ [3]. Кроме того, M.L. Macer и H.S. Taylor [157] выявлено, что обнаружение ароматазы P450 в биоптатах эндометрия коррелирует с наличием эндометриоза или аденомиоза, и этот подход был предложен в качестве скринингового теста для амбулаторной диагностики эндометриоза с чувствительностью и специфичностью 91% и 100%, соответственно [157]. 1.1.4 Аутоиммунный оофорит В некоторых случаях развитие нормогонадотропной недостаточности яичников может быть обусловлено аутоиммунным поражением яичников. Аутоиммунный оофорит является заболеванием, возникающим при поражении специфическими антителами стероидпродуцирующих клеток яичников, что приводит к их гормональной недостаточности и нарушению фолликулогенеза [2,5,112]. В исследовании, проведенном А.М. Гзгзяном [5], аутоиммунное поражение яичников выявлено у 27,9% женщин репродуктивного возраста с нормогонадотропной первично-яичниковой недостаточностью, что проявляется хронической ановуляцией у 91,6% больных и лютеиновой недостаточностью у 8,4% пациенток [5]. Этиология и патогенетические механизмы развития данного состояния остаются окончательно неизученными, однако предполагается роль генетических факторов, врожденных или приобретенных дефектов рецепторов гонадотропинов и факторов окружающей среды [2,5,24,38,39]. Кроме того, А.М. 28 Гзгзяном [5] отмечена высокая частота сочетания аутоиммунного оофорита (19,4%) с другими системными аутоиммунными заболеваниями. В настоящее время для диагностики аутоиммунного оофорита используется определение антиовариальных антител, однако «золотым стандартом» является биопсия яичников [148]. При гистологическом исследовании биоптатов обнаруживается мононуклеарная воспалительная инфильтрация клеток теки растущих фолликулов с преобладанием плазматических, В- и Т-клеток [142,222]. В настоящее время большое значение уделяется роли антиовариальных антител в патогенезе нормогонадотропной ановуляции при СД. Нарушения менструального цикла выявляются у трети пациенток с СД 1 типа [241]. По данным И.П. Мешковой и О.Р. Григоряна [14], высокие титры аутоантител к ткани яичников у девушек с СД 1 типа наблюдаются значительно чаще, чем у здоровых сверстниц (14,1% и 2,5%, соответственно). Кроме того, важным фактором развития нарушения функции яичников при СД является снижение уровней инсулина и инсулиноподобного фактора роста-1 в крови [9]. 1.1.5 Гипотиреоз Заболевания щитовидной железы – самая частая эндокринная патология среди женщин репродуктивного возраста. Гипотиреоз - это синдром, обусловленный дефицитом тиреоидных гормонов в организме. Различают гипотиреоз первичный, развившийся в результате поражения самой щитовидной железы, и вторичный, возникающий в результате дефицита ТТГ гипофиза или тиреотропин-рилизинг гормона гипоталамуса [41]. Распространенность первичного манифестного гипотиреоза составляет 0,2-2%, субклинического – до 10% [35]. Влияние гормонов щитовидной железы на репродуктивную функцию осуществляется как напрямую – через рецепторы тиреоидных гормонов в яичниках, так и путем влияния на секрецию ГСПС, пролактина и ГРГ. Снижение уровня ГСПС при гипотиреозе приводит к уменьшению общего и связанного тестостерона и эстрадиола в крови, в то время как свободные фракции этих 29 гормонов увеличиваются [128]. Кроме того, гипофункция щитовидной железы приводит к нарушению синтеза и периферического метаболизма эстрогенов и образованию их неактивных фракций, не способных обеспечить нормального механизма обратной связи. Моделирование предовуляторного подъема эстрогенов с помощью экзогенного эстрадиола выявило у женщин с гипотиреозом повреждени механизма положительной обратной связи между яичниками и гипофизом, обеспечивающего созревание доминантного фолликула и овуляцию в физиологических условиях, что связано, вероятно, с нарушением моноаминергического и опиоидного контроля секреции ГРГ гипоталамусом [21]. Необходимо отметить, что уровень гонадотропинов при гипотиреозе не изменяется [35,41]. 1.1.7 Дефицит массы тела и ожирение Ановуляция, обусловленная дефицитом массы тела, составляет до 25% от всех форм вторичной аменореи, а среди женщин до 20-ти лет около 40% [13]. К наиболее частым причинам развития дефицита массы тела относят нарушения психоэмоционального состояния, чрезмерную приверженность к диете, физические нагрузки, а также наличие заболеваний желудочно-кишечного тракта [115]. Механизм возникновения нормогонадотропной недостаточности яичников при дефиците массы тела обусловлен снижением периферической конверсии андрогенов в эстрогены в жировой ткани под влиянием фермента ароматазы р450, что приводит к развитию у пациентки гипоэстрогенемии [204]. Кроме того, наблюдается торможение секреции ГРГ опиодной и дофаминергической системами, что, в конечном счете, приводит к снижению уровней гонадотропинов в крови и аменорее [37,73]. В настоящее время убедительно показано, что увеличение индекса массы тела (ИМТ) и ожирение ассоциировано с развитием нарушений репродуктивного здоровья, которые включают нарушения менструального цикла, как правило, вследствие ановуляции [19,90]. В развитии нормогонадотропной овариальной 30 недостаточности при инсулинорезистентность, ожирении связанная гиперинсулинемия. Повышенный существенную с гиперлипидемией, роль играет и ответная уровнь инсулина в крови увеличивает чувствительность яичников к гонадотропной стимуляции. Другим фактором, нарушающим процессы фолликулогенеза и стероидогенеза в яичниках, является усиленная конверсия андрогенов в эстрогены в жировой ткани под влиянием фермента ароматазы. Гиперэстрогенемия сенсибилизирует гонадотрофы гипофиза к гонадотропин-рилизинг гормону гипоталамуса и снижает пороговый уровень овариального эстрадиола, необходимый для начала овуляторного подъема ЛГ. Гиперстимуляция незрелых фолликулов, вероятно, лежит в основе их кистозного перерождения репродуктивной [20]. Роль системы ожирения в подтверждается патогенезе нарушений восстановлением функции овуляторного менструального цикла после нормализации массы тела [19,20,85]. Абдоминальное ожирение связано с повышенным содержанием инсулина в крови, которое приводит к подавлению печеночного синтеза ГСПC и увеличению синтеза андрогенов в яичниках [256]. В международном когортном исследовании, проведенном B.O. Yildiz и E.S. Knochenhauer [256], показано, что у женщин с избыточным весом статистически значимо чаще наблюдаются нерегулярные менструации, в связи с чем авторы сделали вывод, что ожирение негативно влияет на функцию желтого тела. В другом перекрестном исследовании из 266 женщин с ожирением и нормальной фертильностью у 64,3% отмечался регулярный менструальный цикл, у 21,4% олигоменорея и у 14,3% - гиперменорея и/или полименорея. Выявлено, что пациентки с олигоменореей имели наибольшую окружность талии, ИМТ и содержание инсулина в крови по сравнению с этими показателями у женщин с нормальным менструальным циклом [256]. Кроме того, наличие метаболического синдрома у женщины может оказывать прямое влияние на качество ооцитов. У женщин с ожирением наблюдается увеличение уровня С-реактивного белка в фолликулярной жидкости [255]. Увеличение концентрации С-реактивного белка в фолликулярной жидкости у женщин с ожирением являются маркером воспаления 31 и оксидативного стресса, которые статистически значимо связаны с качеством ооцитов [90,255]. 1.2 Структура и свойства ароматазы р450 1.2.1 Структура ароматазы р450 Превращение андрогенов в эстрогены происходит под воздействием ферментного комплекса ароматазы, состоящего из гемопротеина цитохрома Р450 и флавопротеина никотинамидадениннуклеотидфосфата в восстановленной форме (НАДФ-Н) редуктазы, который является белком эндоплазматического ретикулума и отвечает за передачу восстановительных эквивалентов от НАДФ-Н к любой форме микросомального цитохрома Р450 с которой он вступает в контакт [213]. В отличие от редуктазы, которая может быть продуктом всего одного гена, цитохром P450arоm является членом надсемейства генов, которое в настоящее время содержит более 220 членов, принадлежащих к 36 семействам [175]. Ароматаза является одноцепочечным протеином, состоящим из 419 аминокислот и катализирует 3 различные реакции в одном активном центре [97, 213]. Физиологическим субстратом ароматазы являются андростендион, тестостерон, и 16α-гидрокситестостерон, которые превращаются в эстрон, 17β-эстрадиол, и 17β, 16α-эстриол, соответственно. Данная реакция называется ароматизацией, так как идет присоединение кислорода с образованием фенольного кольца, характерного для эстрогенов (Рисунок 1). В недавних исследованиях было показано, что фермент также способен превращать дигидротестостерон в 19-гидрокси- и 19оксо производные, а также в нестероидные продукты, в результате потери 19метил группы [92]. 32 Рисунок 1- Синтез стероидных гормонов (по W.B. Nothnick, 2011) 1.2.2 История открытия ароматазы Выделение и биохимическая характеристика андрогенов и эстрогенов в 1930-х годах позволили продемонстрировать сходство между этими двумя классами соединений и высказать предположение о том, что C19-стероиды могут быть непосредственно преобразованы в С18 эстрогены [83,248,260]. Zondek в 1934 году [260] впервые предположил, что «женские половые гормоны, которые постоянно присутствуют в мужском организме, представляют нормальный физиологический продукт метаболизма мужских половых гормонов». Позже, Steinach и Kun в 1937 году [229] представили первые экспериментальные доказательства этого утверждения путем введения тестостерона пропионата мужчинам и демонстрируя усиление эстрогенной активности в моче. Открытие оральных контрацептивов G. Pincus и M.C. Chang способствовало интенсивному изучению синтеза и метаболизма эстрогенов. Основной интерес исследователей 33 был сосредоточен на процессах биосинтеза и метаболизма стероидов, вырабатываемых в надпочечниках, яичках и яичниках. Швейцарским ученым Andre Meyer под руководством главы Фонда экспериментальной биологии R. Dorfman были впервые выявлены метаболиты 4-андростен-3,17-диона (А) в культуре клеток бычьих надпочечников. В 1955 году A. Meyer было установлено, что андростендион гидроксилируется в 19-гидрокси-A (19-ОН-а) [164,165] и отмечено, что «удаление угловой метильной группы в положении C19, шаг, требующий замены молекулы водорода на кислород, способствует ароматизации А или В кольца». Он первым признал ферментативную природу 19гидроксилирования и предположил, что это является первым шагом в биосинтезе эстрогенов из неароматических стероидов. Однако A. Meyer считал, что ароматизация протекает в несколько этапов и назвал это «процессом ароматизации» [164,165]. Окончательные доказательства того, что только один фермент участвует в этом процессе, были получены только после выделения и очистки ароматазы в 1980 году. Тем не менее, R. Dorfman внес ясность в «процесс ароматизации», - он продемонстрировал конверсию меченого тестостерона в эстрадиол в тканях яичника человека [66]. Применение меченых молекул имело решающее значение для изучения биосинтеза и метаболизма стероидов [131]. Исследовательской группой было показано образование эстрогенов из 19-гидроксиандростендиона в различных тканях, в том числе яичниках и надпочечниках [165]. В последующем Ryan и Engel из Гарварда использовали препараты, содержащие микросомы плаценты человека, для преобразования андрогенов в эстрогены [211]. Эта система стала основой для изучения механизмов ароматизации андрогенов в эстрогены [214]. По результатам проведенных исследований ученые предположили, что 19-оксо-андростендион является промежуточным продуктом между 19-гидрокси-4-андростен-3,17-дионом и эстрогенами [168]. Авторы также отметили необходимость присутствия NADPH и кислорода для преобразования С19-соединений в эстрогены. К началу 1970-х годов уже были согласованы основные факты, касающиеся механизма действия ароматазы: 19- 34 гидроксиандростендион превращается в 19-оксоандростендион, который, в свою очередь, образует тестостерон, подвергающийся ароматизации с образованием эстрогенов, при этом на 1 моль преобразованных андрогенов затрачивается 3 моль кислорода и NADPH [76,77]. 1.2.3 Экспрессия гена ароматазы CYP19 В организме человека экспрессия ароматазы и, следовательно, синтез эстрогенов, выявлены во многих тканях и органах. К ним относятся яичники и яички, плацента, печень, жировая ткань, хондроциты и остеобласты кости, гладкая мускулатура сосудов, а также многочисленные области головного мозга, в том числе некоторые участки гипоталамуса, лимбической системы и коры больших полушарий [159,215]. Ген, кодирующий ароматазу (CYP19A1) находится на длинном плече 15-ой хромосомы (15q21.2) с направлением транскрипции, ориентированным от теломеры к центромере. Белок-кодирующая область гена включает экзоны со 2 по 10 (Рисунок 2). Рисунок 2 - Структура гена СУР19А1 (по Artigalás O., 2015) К настоящему времени описано по меньшей мере девять вариантов первого экзона [133,137,231]. Эти альтернативные варианты первого экзона транскрибируются тканеспецичными промоторами, а сплайсинг РНК происходит на случайном акцепторном сайте 2-ого экзона. Таким образом, мРНК содержит 35 тканеспецифичный 5'-конец, но кодируемая область гена (и, следовательно, белок из 503 аминокислот) не изменяется. 3'-нетранслируемая область гена содержит поли(А) участок и последовательность переменной длины. Таким образом, было описано два основных вида мРНК размером 2,9 и 3,4 кб [242]. Некоторые описаны в потенциальные 5'-конце гена. регуляторные Они последовательности включают сайты были связывания нейтрофил/интерлейкин-6 активирующего белка-1, стероидогенного фактора-1, трансформирующего ростового фактора-β (TGF-β) в промоторе (Р) II и некоторые другие [161,223]. Большое количество отрицательных регуляторных областей также были описаны в 5'-конце, в особенности между экзонами I.6 и I.3. Они оказывают тормозящее влияние на транскрипцию гена, но их фактическое значение в естественных условиях до настоящего времени не выяснено [47]. Таким образом, транскрипция CYP19A1 регулируется комплексным воздействием тканеспецифических факторов. В различных тканях, как правило, транскрипция гена происходит с использованием разных промоторов. Наиболее активный промотор PII в основном обнаруживается в яичниках. В костной и в жировой ткани транскрипция гена осуществляется чаще всего I.4 вариантом первого экзона [81,137]. Тем не менее, вид промотора может варьировать в зависимости от экспериментальных условий и, в частности, из-за присутствия различных гуморальных факторов, оказывающих модулирующее воздействие на транскрипцию гена [201,249]. 1.2.4 Экспрессия ароматазы в яичниках В яичниках ароматаза экспрессируется клетками гранулезы преовуляторных фолликулов и клетками желтого тела. Интересен тот факт, что эти клетки представляют собой две различные стадии дифференцировки одного вида клеток. Недифференцированные клетки гранулезы преантральных фолликулов не экспрессируют ароматазу [231]. Рост и созревание фолликулов от преантральной к преовуляторной стадии сопровождается дифференциацией зернистых клеток и 36 индукцией экспрессии ароматазы, что стимулируется ФСГ [225]. После овуляции происходит быстрое подавление экспрессии ароматазы, по мере того, как зернистые клетки дифференцируются в лютеиновые. Тем не менее, у некоторых видов млекопитающих, в частности, у приматов и грызунов, наблюдается сохранение экспрессии ароматазы в клетках желтого тела [80,224]. В преовуляторных фолликулах градиент экспрессии ароматазы наиболее высок в клетках наружной оболочки фолликула, но полностью отсутствует в клетках кумулюса [129,244]. В настоящее время физиологический смысл такой дифференцированной экспрессии остается неясным. Выявлено, что в клетках кумулюса экспрессия ароматазы подавляется специфическими факторами, такими как костный морфогенетический белок-15 (BMP 15) [181] и фактор роста и дифференцировки-9 (GDF9) [227]. Роль ингибирующего влияния этих факторов была продемонстрирована на моделях GDF9-дефицитных мышей, у которых наблюдалась преждевременная индукция ароматазы в преантральных фолликулах [114]. Таким образом, негативное влияние ростовых факторов и стимулирующий эффект ФСГ определяют градиент экспрессии ароматазы в клетках гранулезы преовуляторных фолликулов [231]. Локальный синтез эстрогенов стимулирует пролиферацию клеток гранулезы и способствует действию ФСГ и ЛГ [206]. Одним из основных эффектов эстрадиола является повышение ФСГ-индуцированной экспрессии ароматазы [167]. Этот эффект эстрадиола был убедительно продемонстрирован на моделях мышей с нокаутом гена ароматазы и рецептора эстрогена-β. У мышей с нокаутом гена ароматазы наблюдалась остановка роста фолликулов на раннем этапе, вследствие чего не происходила овуляция и образование желтого тела [118]. Кроме того, несмотря на то, что в яичниках таких мышей содержались фолликулы на всех стадиях развития, все антральные фолликулы были с кровоизлияниями и высоким уровнем апоптоза в клетках гранулезы [237]. У мышей с нокаутом гена рецептора эстрогена-β, напротив, антральные фолликулы были совершенно нормальными, однако наблюдалось значительное снижение экспрессии ароматазы [98]. Кроме того, своевременная экспрессия ароматазы в фолликулах опосредует 37 циклические изменения в сывороточных уровнях эстрадиола. Эти изменения модулируют структурные и функциональные изменения, происходящие циклически в женской репродуктивной системе. Происходящие гормональные изменения необходимы для выживания ооцитов, оплодотворения и имплантации [246]. Колебания уровня эстрадиола в крови устанавливают необходимый ритм секреции гонадотропинов. Что еще более важно, экспрессия ароматазы в преовуляторных фолликулах приводит к пику ЛГ, который вызывает овуляцию [172]. Таким образом, своевременная и тканеспецифическая экспрессия ароматазы в яичниках имеет решающее значение для аутокринной регуляции фолликулогенеза, эндокринного контроля циклических процессов, происходящих в женской репродуктивной системе и координации секреции гонадотропинов [160,221]. В яичниках субстратом для ароматазы являются андрогены клеток теки фолликула. Андрогены, вырабатываемые клетками теки, также участвуют в регуляции этого фермента. В недавних исследованиях продемонстрировано, что тестостерон стимулирует экспрессию ароматазы в отсутствие ФСГ [253]. Андрогены также усиливают эффект ФСГ на экспрессию ароматазы. Так, было показано, что тестостерон является более сильным, чем эстрадиол, индуктором экспрессии ароматазы в клетках гранулезы фолликулов крыс, в то время как дигидротестостерон так же эффективен, как эстрадиол [234]. Эти данные показывают, что андрогены, синтезируемые клетками теки, действуют не только в качестве субстрата для синтеза эстрогенов, но и модулируют эффекты ФСГ путем активации андрогеновых рецепторов [234]. В исследованиях in vitro было выявлено, что андрогены увеличивают ФСГ-зависимый синтез стероидов за счет повышения уровня циклического аденозинмонофосфата (цАМФ) [113]. У крыс экспрессия рецепторов андрогенов наиболее высока в преантральных и антральных фолликулах и постепенно снижается по мере их созревания и возрастания экспрессии ароматазы [233]. Эти данные позволяют предположить, что андрогены усиливают эффекты ФСГ на ранней стадии развития фолликулов, но на заключительных этапах развития фолликулов они в основном служат в 38 качестве субстрата для синтеза эстрогенов [234]. Вместе с тем показано, что уровни экспрессии ароматазы и эстрадиола у мышей с нокаутом гена рецептора андрогенов остаются в пределах нормы [220], вследствие чего авторы предположили, что андрогены не оказывают решающего влияния на экспрессию ароматазы в естественных условиях. В исследованиях клеток гранулезы мышей было выявлено, что эффекты ФСГ значительно усиливаются под влиянием ИФР-1, который действует на свои рецепторы в зернистых клетках и увеличивает ФСГ-индуцированную стимуляцию активности ароматазы [104,230]. Было также показано, что мРНК ароматазы присутствует только в фолликулах, в которых определяются рецепторы к ФСГ и ИФР-1 [259]. Еще одним доказательством функциональной связи между системой ИФР, ароматазой и ФСГ является наличие ИФРсвязывающего белка (IGFBP-4), который является мощным ингибитором ФСГиндуцированной продукции эстрадиола клетками гранулезы как у мышей [154], так у человека [158]. В клетках гранулезы человека ИФР-1 сам по себе увеличивает синтез эстрадиола до уровней, сопоставимых с индуцированными ФСГ. Таким образом, эти гормоны действуют синергично [221]. В ранее проведенных исследованиях установлено, что цАМФ является основным внутриклеточным медиатором ФСГ-зависимой экспрессии ароматазы [135,188]. Увеличение внутриклеточной концентрации цАМФ, индуцированной ФСГ, приводит к активации цАМФ-зависимой протеинкиназы A. Кроме того, ФСГ активирует некоторые другие внутриклеточные сигнальные пути, в том числе внеклеточные регуляторые киназы (ERKs), p38 митоген-активированные протеин киназы (МАРК) и фосфатидилинозитол-3-киназы (PI3K) [138]. Экспрессия ароматазы достигает максимума в преовуляторных фолликулах. Выброс ЛГ и лютеинизация фолликулов приводит к быстрому уменьшение уровня мРНК ароматазы [135]. Ингибирующий эффект ЛГ контрастирует со стимулирующим действием ФСГ в виду того, что оба гормона действуют с участием аденилатциклазы / цАМФ в качестве основного сигнального пути. Было высказано предположение, что различия в величине и длительности сигнала 39 цАМФ, который производит каждый рецептор [120,121] и генерация специфических внутриклеточных сигналов [257] обусловливают различные эффекты ФСГ и ЛГ на экспрессию ароматазы. F.X. Donadeu и M. Ascoli [108] предположили, что различные эффекты ФСГ и ЛГ могут зависеть от плотности их рецепторов. В экспериментах на культуре клеток гранулезы крыс авторы показали, что только клетки с высокой плотностью рецепторов реагируют на ЛГ путем активации инозитол фосфата в дополнение к цАМФ. При низкой плотности рецепторов ЛГ стимулирует экспрессию ароматазы. Подобно ароматазе, экспрессия рецепторов ЛГ увеличивается в преовуляторных фолликулах [169], что, по-видимому, обусловлено стимуляцией синтеза инозитол фосфата и внутриклеточным высвобождением кальция. Рост внутриклеточной концентрации этих вторичных мессенджеров приводит к активации протеинкиназы C, которая ингибирует ФСГ-зависимую экспрессию ароматазы [119]. 1.3 Дефекты и полиморфные варианты гена CYP19 Современные достижения молекулярной генетики позволили уточнить функциональную роль ароматазы путем изучения полиморфных вариантов и мутаций гена CYP19A1. Дефицит ароматазы является очень редким аутосомнорецессивным заболеванием и к настоящему времени было описано менее 20 случаев [48,49,166,247]. Заболевание развивается в результате различных мутаций в кодирующей области гена, что приводит к снижению или потере ферментативной функции, и, как следствие, дефициту эстрогенов. Большинство описанных мутаций включают изменения в экзонах IX и X, играющих важную роль в связывании субстрата [57]. Такие мутации приводят к изменениям кодонов и замене единичных аминокислотных последовательностей, что приводит к синтезу поврежденного белка. На животных моделях дефицита ароматазы с мутацией экзона IX было выявлено развитие у мышей ожирения с чрезмерным накоплением внутрибрюшного жира. Возникновение ожирения связано с увеличением уровня циркулирующих липидов, развитием гиперинсулинемии и 40 резистентности к инсулину [199]. Кроме того, у животных наблюдалась потеря минеральной плотности костной ткани [74]. Со стороны органов репродуктивной системы отмечалось изменение формы и размеров внутренних половых органов, наличие дегенеративных процессов в яичниках, а также нарушение сексуального поведения [75,134]. У человека первый случай дефицита ароматазы был описан в 1991 году [221]. Первые симптомы заболевания появляются еще до рождения ребенка развитием прогрессирующей вирилизации матери из-за неспособности ароматизации андрогенов в плаценте, такие как угревая сыпь, снижение тембра голоса, гипертрофия клитора. Данные симптомы постепенно исчезают после родов. При нулевой активности ароматазы в плодово-плацентарном комплексе начало маскулинизации матери отмечено на 12 неделе беременности, в случае сохранения около 1% ароматазной активности подобные проявления не наблюдаются. Клиническая картина у больных женского пола (кариотип 46, ХХ) зависит от активности данного фермента и выражается внутриутробной вирилизацией различной степени тяжести, гипергонадотропным гипогонадизмом, недоразвитием вторичных половых признаков, первичной аменореей, бесплодием [221]. Таким образом, во всех случаях женского псевдогермафродитизма с кариотипом 46ХХ и наличия внутренних женских половых органов необходимо исключать дефицит ароматазы [139,247]. У больных с дефицитом ароматазы определяется повышенный уровень гонадотропинов и андрогенов при минимальных значениях эстрогенов в крови. В дальнейшем выявляются кистозные изменения в яичниках, прогрессирующая потеря костной массы, а также признаки метаболического синдрома [221]. Помимо дефицита ароматазы в литературе описано несколько семейных случаев синдрома избытка эстрогенов вследствие повышенной экспрессии ароматазы [107,116,200]. препубертатной Данный гинекомастией у синдром мужчин, характеризуется тяжелой преждевременным половым созреванием, у женщин увеличением матки и нарушениями менструального цикла. Чрезмерная ароматизация андрогенов приводит к повышению уровня 41 эстрадиола и эстрона, а также снижению уровня тестостерона и андростендиона в крови и подавлению секреции гонадотропинов. В исследовании, проведенном G. Binder и D.I. Iliev [107], была изучена семья с синдромом избытка ароматазы, наследуемого по аутосомно-доминантному типу в 3-х поколениях. Авторы выявили сильную связь с наличием у больных TTTA повторного полиморфизма в гене CYP19A1. Сходные данные были получены и в других работах [235]. Помимо генных мутаций CYP19A1, которые встречаются крайне редко, в литературе описаны также его полиморфизмы. Это изменения в последовательности ДНК, которые происходят более чем у 1% населения и вызывают возникновение различных аллельных форм данного гена [6]. Данные генетические изменения наследуются, и их конфигурация уникальна для каждого человека. К настоящему времени описано более 1080 различных генетических полиморфизмов гена CYP19A1. Большинство из них являются одиночными нуклеотидными полиморфизмами (SNP), которые присутствуют в некодирующей области гена. Есть только 4 вида SNP, которые не влияют на активность ароматазы: Trp39Arg и Thr201Met, а также SNP, которые уменьшают ее активность - Arg264Cys и Met364Thr [6,102]. Наиболее хорошо исследованы полиморфизмы в интроне IV в виде микросателлитных (TTTA)n повторов, а также полиморфизма ТСТ, обуcловленного делецией 3-х нуклеотидов в этом же интроне. К настоящему времени опубликовано множество данных о влиянии этих полиморфизмов на уровень половых гормонов в крови [194], развитие эстрогензависимых заболеваний, таких как рак молочной железы [122,193], остеопороз [58,195], рак эндометрия [100], эндометриоз [99], рак предстательной железы и гинекомастия [60]. В крупном исследовании, проведенном в 2005 году [61], впервые была выявлена связь между наличием SNPs в кодирующей области гена CYP19A1 (SNP 44,50,60,64) и гиперандрогенемией у молодых женщин, проживающих в Испании, и молодых женщин с признаками СПЯ из Оксфорда. В обеих группах авторы обнаружили статистически значимую корреляцию между наличием SNP50 (rs2414096) и избытком андрогенов. Они предположили, что полиморфные 42 варианты гена CYP19A1, а не только спорадические мутации, приводящие к снижению активности белка, связаны с избытком андрогенов в крови молодых женщин [61]. Необходимо отметить, что в более ранних исследованиях связи между наличием SNP50 (rs2414096) и СПЯ выявлено не было, что возможно обусловлено низкой статистической мощностью этих исследований [63,246]. Известно, что эстрогены играют важную роль в поддержании гомеостаза кости [124,208]. Рецепторы эстрогенов экспрессируются в 2-х основных типах костных клеток, остеокластах и остеобластах, но также и в других типах клеток, присутствующих в костной ткани, таких как эндотелиальные клетки, клетки иммунной и кроветворной системы [205]. Эстрогены способствуют уменьшению резорбции костной ткани путем ингибирования синтеза факторов, стимулирующих остеокласты, такие как интерлейкин-1, 6, 7, TGF-α и рецептора активатора ядерного фактора, а также стимулируя синтез остеопротегерина [232]. Эстрогены также имеют важное значение для поддержания костной массы в период активного роста и во взрослом возрасте, что обусловливает быструю потерю костной массы у женщин в постменопаузальном возрасте [124]. Роль ароматазы в костном гомеостазе была показана на моделях мышей с нокаутом гена CYP19A1 [217], а также при описании случаев мутаций гена ароматазы у людей [58,247]. Ассоциация некоторых полиморфизмов гена CYP19A1 со снижением минеральной плотности костной ткани и переломами костей была проанализирована в ряде исследований. К настоящему времени наиболее широко изученным полиморфизмом является наличие микросателлитных (TTTA)n повторов в интроне 4, а также ассоциированного с ним полиморфизма ТСТ, обусловленного делецией трех нуклеотидов. Большинство авторов обнаружило связь между наличием коротких TTTA аллелей и снижением минеральной плотности костной ткани у женщин в постменопаузальном возрасте. Однако в нескольких исследованиях связи между наличием полиморфизма в гене ароматазы и развитием остеопороза выявлено не было [170,196], что может быть обусловлено недостаточной статистической мощностью этих работ. В исследовании, проведенном J.A. Riancho и M.T. Zarrabeitia [205], выявлена связь 43 между наличием полиморфизма гена ароматазы и снижением минеральной плотности костной ткани только у женщин в возрасте старше 60 лет. По мнению авторов, полученные результаты обусловлены возрастными различиями в активности фермента в связи с прогрессирующим снижением доступности субстрата [205]. В исследовании, проведенном В.А. Савиной [27], при обследовании 92 пациенток с СПЯ и 55 женщин из группы сравнения не было выявлено статистически значимых различий в частоте аллелей и генотипов по гену ароматазы CYP19 ((TTTA)n полиморфизм, del(TCT) полиморфизм и SNP50 (rs2414096). По мнению автора, дефицит ароматазы в яичниках больных СПЯ носит вторичный характер и обусловлен малыми размерами антральных фолликулов. Также относительный дефицит овариальной ароматазы может быть связан с гиперпродукцией ЛГ. Кроме того, относительный дефицит ФСГ, отвечающего за активность ароматазы в клетках гранулезы и конверсию андрогенов в эстрогены, приводит к гиперандрогенемии и клиническим проявлениям заболевания [27]. Таким образом, перспективным представляется дальнейшее изучение особенностей гена ароматазы СУР19 при нормогонадотропной недостаточности яичников по сравнению с женщинами, имеющими овуляторные циклы. В современной литературе отсутствуют описания клинических, гормональных, эхографических и генетических (полиморфизмы гена СУР19) особенностей больных с частичным дефицитом ароматазы антральных фолликулов. 44 ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Общая характеристика обследованных женщин Для решения поставленных задач в период с 2012 по 2015 гг. обследовали 190 больных с нормогонадотропной недостаточностью яичников и 15 женщин с полноценным овуляторным циклом, включенных в группу контроля. Из 190 больных с нормогонадотропной недостаточностью яичников у 50 женщин (26,3%) имелась низкая ароматазная активность фолликулов (коэффициент ∆Э2/АМГ<8,4). Группу сравнения для генетического исследования составили 70 женщин. На момент исследования 64 женщины группы сравнения имели регулярный менструальный цикл. У 6 женщин наступила своевременная менопауза, продолжительность постменопаузального периода колебалась от 1 года до 6 лет и в среднем составила 3,5±0,8 года. У 45 женщин группы сравнения в анамнезе были беременности, которые закончились срочными родами, 9 женщин имели в прошлом невынашивание беременности. У всех женщин репродуктивного возраста группы сравнения зарегистрирована овуляция с полноценной лютеиновой фазой. Обследование женщин проводили в отделении гинекологической эндокринологии ФГБНУ «НИИАГиР им. Д.О. Отта» (заведующая отделением д.м.н., профессор М.А. Тарасова). Группа больных с нормогонадотропной недостаточностью яичников Критерии включения: 1. Возраст от 18 до 39 лет; 2. Наличие нормогонадотропной недостаточности яичников, установленной на основании: характерных клинических проявлений (нарушение менструального цикла по типу опсоменореи или аменореи), 45 данных гормонального обследования (уровень прогестерона менее 20нмоль/л в крови во вторую фазу менструального цикла, на 19-22 день), эхографических критериев (отсутствие «желтого тела» в яичниках во вторую фазу менструального цикла). Группа больных с низкой активностью ароматазы овариальных фолликулов Критерии включения: 1. Возраст от 18 до 39 лет 2. Наличие нормогонадотропной недостаточности яичников (по перечисленным ранее признакам) 3. Коэффициент ∆Э2/АМГ, вычисленный по результатам пробы с ингибитором ароматазы летрозолом, меньше 8,4. Группа контроля для гормонального обследования Критерии включения: 1. Возраст от 19 до 36 лет 2. Наличие полноценного овуляторного цикла. Группа сравнения для генетического исследования Критерии включения: 1. Возраст от 19 до 56 лет 2. Наличие полноценного овуляторного цикла на момент иследования или в репродуктивном возрасте (для женщин, находящихся на момент исследования в пери- и постменопаузе). Критерии исключения для всех групп обследованных женщин: 1. Гиперпролактинемия (уровень пролактина более 600МЕ/л в крови) 2. Сахарный диабет 1 типа и другая тяжелая сопутствующая соматическая патология (онкологические заболевания, тромботические осложнения в анамнезе) 3. Наличие беременности на момент исследования системные заболевания, 46 4. Прием антиандрогенов, гормональных контрацептивных препаратов, агонистов ГРГ в течение двух месяцев до обследования. 2.2. Методы исследования Сбор анамнеза, общеклиническое и гинекологическое обследование были выполнены всем женщинам основной и контрольной группы. Общеклиническое исследование включало в себя антропометрию, объективный осмотр; по показаниям - пробу на толерантность к глюкозе (ПТГ) и остеоденситометрию. Индекс массы тела (ИМТ) рассчитывали по формуле: масса тела больной (в килограммах), деленная на величину роста (в метрах), возведенную в квадрат. Масса тела оценивалась как нормальная при ИМТ не превышающем 25 кг/м², избыток массы тела при ИМТ 25-30 кг/м², ожирение I степени при ИМТ 31-35 кг/м², ожирение II степени при ИМТ 36-40 кг/м², ожирение III степни при ИМТ>40 кг/м², дефицит массы тела при ИМТ<18,5 кг/м². Оценку степени гирсутизма осуществляли по шкале Ферримана-Голлвея в 11 областях тела (Таблица 1) [117]. Гирсутизм констатировали при значении гирсутного числа более 12. Распространенность угревой сыпи оценивали по классификации угревой болезни Американской академии дерматологии [202]. Нарушение менструального цикла по типу продолжительности опсоменореи менструального устанавливали цикла свыше в случае 35 дней. увеличения Аменорею диагностировали в случае отсутствия менструаций в течение 6 месяцев и более. Диагноз бесплодия устанавливался в случае отсутствия беременности в течение года и более при регулярной половой жизни без применения контрацептивных средств. 47 Таблица 1- Оценка степени оволосения по шкале Ферримана-Голлвея ОБЛАСТЬ ТЕЛА Верхняя губа Подбородок Грудь Верхняя половина спины Нижняя половина спины Верхняя половина живота Нижняя половина живота Плечо Предплечье СТЕПЕНЬ ОВОЛОСЕНИЯ Единичные волоски по наружному краю. Маленькие усики по наружному краю. Усы, занимающие половину наружной области. Усы, распространяющиеся до средней линии. Единичные рассеянные волосы. Обильный рост рассеянных волос. Незначительное сплошное оволосение. Обильное сплошное оволосение. Волосы вокруг сосков. Волосы вокруг сосков и по средней линии. Дугообразное оволосение трех четвертей груди. Сплошное оволосение. Отдельные рассеянные волосы. Значительное количество волос, но они рассеянные. Незначительное сплошное оволосение. Обильное сплошное оволосение. Сакральный пучок. Сакральный пучок и небольшое оволосение на латеральной поверхности. Оволосение нижней половины спины. Сплошное оволосение. Отдельные волосы по белой линии. Обильное оволосение по белой линии. Оволосение половины верхнего отдела живота. Сплошное оволосение. Отдельные волосы по белой линии. Полоски волос по белой линии. Широкая полоска волос по белой линии. Рост волос в виде треугольника. Рассеянные волосы, покрывающие не более четверти поверхности плеча. Обильное, но не полное оволосение. Незначительное сплошное оволосение. Обильное сплошное оволосение. Незначительное оволосение тыльной поверхности. Умеренное оволосение тыльной поверхности. Обильное оволосение тыльной поверхности. Сплошное оволосение тыльной поверхности. БАЛЛЫ 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 48 Продолжение таблицы 1 ОБЛАСТЬ ТЕЛА Бедро Голень СТЕПЕНЬ ОВОЛОСЕНИЯ БАЛЛЫ тыльной 1 Незначительное оволосение поверхности. Умеренное оволосение тыльной поверхности. Обильное оволосение тыльной поверхности. Сплошное оволосение тыльной поверхности. Незначительное оволосение тыльной поверхности. Умеренное оволосение тыльной поверхности. Обильное оволосение тыльной поверхности. Сплошное оволосение тыльной поверхности. Ультразвуковое исследование проводили 2 3 4 1 2 3 4 с использованием трансвагинального датчика (частота 4-9 мГц, (аппарат «SonoAce» X4 (Корея)). При ультразвуковом исследовании оценивали размеры яичников, количество антральных фолликулов, их размеры и локализацию, наличие доминантного фолликула, его размер, структуру яичников (выраженность стромы, состояние капсулы), на 19-22 день менструального цикла- наличие/отсутствие «желтого тела». Определяли размеры матки, толщину и структуру эндометрия. Измерение тела матки проводили при продольном и поперечном сканировании. При измерении длины тела матки за дистальную точку отсчета принимали середину перпендикуляра, опущенного от вершины угла между телом и шейкой к задней стенки матки. Толщину эндометрия определяли по расстоянию от срединного Мэха до границы с миометрием. Биометрию яичников проводили в трех взаимно перпендикулярных плоскостях, после чего объем яичников рассчитывали по стандартной формуле: V=L×W×T×0,5236, где L – продольный, W – переднее-задний (саггитальный), T – поперечный размер яичника (см), 0,5236 – постоянный коэффициент. Гормональное обследование включало в себя определение иммуноферментным методом в сыворотке крови уровня эстрадиола (Э2), эстрона 49 (Э1), тестостерона, свободного гидроксипрогестерона (17-OHP), тестостерона, андростендиона (А4), дегидроэпиандростерон-сульфата 17- (ДЭА- сульфата), ФСГ, ЛГ, пролактина, антимюллерова гормона (АМГ) на 2 день менструального цикла, а также определение уровня прогестерона на 19 – 22 день менструального цикла. Пролактин, ФСГ, ЛГ, общий тестостерон, ДЭА-сульфат определяли при помощи тест - систем Алкор-био (Россия); эстрадиол, андростендион, свободный тестостерон, эстрон, 17-OHP определяли при помощи тест - систем DRG Diagnostics (Германия); АМГ – при помощи тест - системы Beckman Coulter (США). Уровень прогестерона определяли иммуноферментным методом с помощью тест – систем Алкор-био (Россия). Менструальный цикл считали ановуляторным при уровне прогестерона менее 10 нмоль/л, с недостаточностью лютеиновой фазы – от 10 до 20 нмоль/л. Проба с ингибитором ароматазы летрозолом заключалась в определении иммуноферментным методом в сыворотке крови уровня половых стероидных гормонов и гонадотропинов дважды: исходно на 2 день менструального цикла и повторно через 48 часов после перорального приема 10 мг летрозола. Результаты пробы с летрозолом оценивали по изменению уровня эстрогенов, андрогенов и гонадотропинов в крови после перорального приема летрозола в абсолютных значениях и в процентах от исходного уровня. Для оценки ароматазной активности фолликулов использовали следующий коэффициент: ароматазная активность фолликула = ∆Э2 АМГ где: ∆Э2 – снижение эстрадиола в пмоль/л в сыворотке крови через 48 часов после приема 10 мг летрозола, АМГ – содержание в крови антимюллерова гормона в нг/мл (патент № 2013147216 от 5.12.2014 г.). Гормональные исследования проводили в гормональной лаборатории отдела эндокринологии репродукции ФГБУ «НИИАГиР им. Д.О. Отта» СЗО РАМН (руководитель лаборатории – к.б.н. Н.Н. Ткаченко). 50 Генетическое обследование проводили совместно пренатальной диагностики наследственных «НИИАГиР им. Д.О. Отта» СЗО РАМН - заболеваний с лабораторией человека ФГБУ руководитель лаборатории член- корреспондент РАМН з.д.н. РФ профессор В.С. Баранов, под непосредственным руководством в.н.с. профессора Т.Э. Иващенко. Изучали особенности генетического полиморфизма гена ароматазы р450. Исследовали следующие полиморфные варианты: (ТТТА)n повтор в интроне 4 и (del(TCT)) (таблица 2). Таблица 2 - Характеристика исследованного гена и его полиморфизма Полиморфизм Ген и функциональная Структура олигопраймеров характеристика (ТТТА)n повтор интроне 4, CYP19 в del(TCT) изменение уровня F: 5'< GGTACTTAGTTAGCTACAATC >3'; R: 5'< GTTACAGTGAGCCAAGGTCGTGAG >3'. экспрессии гена Генетическое исследование проводили на образцах ДНК, полученных стандартным способом из ядер лимфоцитов периферической крови в соответствии с методикой приведенной в руководстве Сэмбрука с некоторыми модификациями. Идентификацию полиморфного микросателлита (ТТТА)n гена CYP19, проводили методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) со специфическими олигопраймерами (табл.2). Определение делеции трех нуклеотидов (ТСТ) в интроне 4 гена CYP19 проводили методом ПЦР со специфическими олигопраймерами (табл.2) с последующим рестрикционным анализом. Смесь для амплификации, объемом 25 мкл включала 15 нМ каждого праймера, 67 мМ трисHCl, рН 8.8, 16,6 мМ сульфата аммония, 6,7 мМ MgCl2, 6,7 мкМ ЭДТА, 10 мМ меркаптоэтанола, 170 мкг BSA, 1,0 мМ каждого dNTP и 2U ДНК-полимеразы 51 (производства "СибЭнзим", Новосибирск). Условия проведения ПЦР представлены в таблице 3. Таблица 3 -Условия проведения ПЦР Ген Денатурация Денатурация Отжиг Синтез Синтез 35 циклов CYP19 (ТТТА)n и 95°C-10 мин 95°C-45 c 54°C - 45 c 95°C-40 c del(TCT) Количество ТТТА-повторов 95°C-40 c в гене 72°C- 72°C-45 c 5мин 50°C- 40 c определяли CYP19 на электрофореграммах по наличию продуктов амплификации определенного размера. Размеры ПЦР продукта соответствующие определенным повторам были следующие: (ТСТ)del(TTTA) - 166 п.о., (ТТТА)7 - 169 п.о., (ТТТА)8 - 173 п.о., (ТТТА)9 -177п.о., (ТТТА)10-181 п.о., (ТТТА)11 - 185п.о., (ТТТА)12 - 189 п.о., (ТТТА)13 - 193 п.о. Гидролиз ДНК ферментами рестрикции – рестрикцию амплифицированных ДНК-фрагментов проводили согласно рекомендации фирмы-изготовителя (Сибэнзим) (таблица 4). Таблица 4 - Рестриктазы и анализ полиморфных вариантов гена CYP19 Ген Полиморфизм CYP19 del(TCT) Размер ПЦР продукта 166 п.н. Аллель Эндонуклеаза и размер фрагментов рестрикции Dra I I –107 + 59 п.н. D – 65 + п.н. Полноту гидролиза оценивали по результатам электрофореза в 7,5 % полиакриламидном геле. Гель окрашивали водным раствором бромистого этидия (0,5 мкг/мл), просматривали в ультрафиолетовом свете на трансиллюминаторе 52 «Macrovue» («Pharmacia LKB», Великобритания) и фотографировали системе видео-гель-документации («Vilber Lourmat»). Всем женщинам в группе с низкой ароматазной активностью фолликулов проводили молекулярно-генетическое исследования гена 21-гидроксилазы (CYP21) методом ПЦР, ПДРФ-анализа на наличие мутаций: делеция гена CYP21A2, P30L (экзон 1), i2splice (интрон 2), del8bp (экзон 3), I172N (экзон 4), V237E (экзон 6), V281L (экзон 7), Q318X (экзон 8), R356W (экзон8), и P453S (экзон 10). Молекулярно- генетическое исследование гена 21-гидроксилазы проводилось также женщинам в группе с нормогонадотропной ановуляцией, у которых уровень 17-ОНР в крови на 2-й день менструального цикла был выше 4 нмоль/л и/или было диагностировано привычное невынашивание беременности. Диагноз наружный генитальный эндометриоз, имевшийся у десяти больных в группе с низкой ароматазной активностью фолликулов, установлен с помощью лапароскопии. Статистическую обработку полученных результатов проводили с применением стандартных пакетов программ прикладного статистического анализа (SAS v. 9.0, Microsoft Excel, Microsoft Word и др.) с использованием методов параметрической и непараметрической статистики. Параметры распределения признаков в выборке оценивали при помощи критериев ШапироУилка и Лиллиефорса. Методы описательной (дескриптивной) статистики для количественных признаков с нормальным распределением включали в себя оценку среднего арифметического (М), среднего квадратичного отклонения (s) в формате М (s), средней ошибки среднего (±m) и 95% ДИ. Для качественных признаков приводили таблицы частот. Для оценки межгрупповых различий значений признаков, имеющих непрерывное распределение, применяли t-критерий Стьюдента, при сравнении частотных величин - точный метод Фишера. Выявленные отклонения от нормального распределения обуславливали необходимость использования непараметрических методов статистики. Для определения различий в группе 53 использовали ранговый критерий Вилкоксона, для оценки межгрупповых различий значений признаков - ранговый U–критерий МаннаУитни. Анализ связи (ассоциации, корреляции) проводили с использованием коэффициента Спирмена (R) при оценке нормально распределенных количественных признаков. Для качественной оценки силы корреляции и ассоциации руководствовались шкалой Чеддока: коэффициент 0,1-0,3 – слабая, 0,3-0,5 – умеренная, 0,5-0,7 – заметная, 0,7-0,9 – высокая, 0,9-1,0 – весьма высокая зависимость. Для анализа динамики нормально распределенных количественных признаков применялся дисперсионный анализ для зависимых выборок (ANOVA Repeated). Критический уровень достоверности нулевой статистической гипотезы (об отсутствии значимых различий или факторных влияний) принимали равным 0,05. 54 ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ 3.1 Клиническая характеристика обследованных женщин 3.1.1 Клиническая характеристика больных с нормогонадотропой недостаточностью яичников Обследовано 190 женщин с нормогонадотропной недостаточностью яичников. У большинства (97 женщин) недостаточность яичников была обусловлена СПЯ. У 47 женщин установлен диагноз НГЭ. У 6 пациенток имелось сочетание НГЭ и СПЯ. С помощью анализа гена 21-гидроксилазы у 5 пациенток обнаружена неклассическая нормогонадотропной форма ановуляции не ВГКН. У 35 верифицирована. женщин причина Возраст больных варьировал от 18 до 39 лет и в среднем составил 27,5±0,3 года. Индекс массы тела находился в пределах от 14,9 кг/м² до 42,7 кг/м² и в среднем составил 23,7±0,3 кг/м². Дефицит массы тела диагностирован у 6 больных (3,3%), избыток массы тела был выявлен у 27 (14,2%) больных, ожирение I степени- у 22 (11,6%) больной, ожирение II степени наблюдалось у 2 (1,05%) больных, ожирение III степени имела 1 больная (0,52%). 3.1.2 Клиническая характеристика больных с низкой ароматазной активностью фолликулов и здоровых женщин Группу пациенток с низкой активностью ароматазы овариальных фолликулов составили 50 женщин в возрасте от 18 до 34 лет. Контрольную группу составили 15 здоровых женщин в возрасте от 23 лет до 31 года с полноценным овуляторным менструальным циклом. Средний возраст в группе женщин с низкой активностью овариальной ароматазы фолликулов составил 25,7±0,6 лет. Индекс массы тела колебался от 14,9 до 42,7 кг/м², составив в среднем 23,7±0,7 кг/м². Избыток массы тела выявлен у 8 больных, ожирение I степени у 5 пациенток, ожирение III степени - у одной 55 больной. Дефицит массы тела был определен у трех больных. ИМТ в контрольной группе находился в пределах от 17,6 кг/м2 до 24,2 кг/м2, в среднем составил 21,3±0,5 кг/м2, у одной женщины имелся дефицит массы тела, у 14 женщин масса тела была в пределах нормы. Таким образом, ИМТ в обеих группах статистически не различался (p=0,08). Признаки андрогензависимой дермопатии проявлялись у 30 (60%) больных основной группы в виде вульгарных угрей. Угревая сыпь I степени тяжести отмечалась у 19 больных, II степени тяжести у 11 больных. Гирсутное число у женщин с нормогонадотропной ановуляций и низкой активностью овариальной аромтазы фолликулов в среднем составило 8,8±0,5 и колебалось от 4 до 18. У здоровых женщин среднее значение гирсутного числа составило 5,4±0,3. Гирсутизм (гирсутное число >12) наблюдался у 12 (24%) больных. Ни у одной женщины контрольной группы не было отмечено гирсутизма и угревой болезни. Возраст менархе в основной группе варьировал от 11 до 17 лет и в среднем составил 13,1±0,2 года, что не отличалось от показателя в группе контроля (13,0±0,2 года). Позднее менархе (в возрасте старше 15 лет) отмечено у 5 (10%) больных. Нарушения менструального цикла в виде опсоменореи наблюдалось у 35 женщин (70%). У 15 женщин менструальный цикл был регулярным. У восьми женщин с диагнозом НГЭ имелись перименструальные кровянистые выделения и альгоменорея. У всех женщин основной группы менструальный цикл носил регулярный характер. На момент обследования диагноз первичного бесплодия (отсутствие беременности в течение года и более, при регулярной половой жизни без применения контрацептивных средств) имелся у 16 женщин основной группы: 7 женщин с СПЯ, 5 женщин с НГЭ, одна больная с сочетанием НГЭ и СПЯ и у трех больных с неверифицированным диагнозом. Вторичное бесплодие наблюдалось у пяти больных: у одной больной с диагнозом СПЯ спонтанно наступившая беременность закончилась срочными родами, у одной пациентки с диагнозом НГЭ в анамнезе была внематочная беременность, 3 пациентки имели в анамнезе искусственные аборты. 29 женщин на момент обследования беременность не планировали. У одной из женщин, не заинтересованных в 56 беременности на момент исследования, в анамнезе было двое срочных родов. У всех женщин контрольной группы в анамнезе были беременности, которые закончились срочными родами, у одной (6,7%) женщины контрольной группы в анамнезе был самопроизвольный выкидыш. Углеводный обмен с помощью пробы на толерантность к глюкозе был исследован у девяти женщин основной группы. У троих выявлено нарушение толерантности к глюкозе, из них 2 пациентки с избытком массы тела, у одной из женщин - ожирение 3 степени. Минеральная плотность костной ткани исследована с помощью рентгенологической остеоденситометрии позвоночника и проксимальных отделов бедренной кости у 15 женщин с низкой ароматазной активностью фолликулов. У большинства (10 пациенток) – не было выявлено снижения костной плотности, у двоих- диагностирована начальная остеопения позвоночника (при нормальном ИМТ), у трех пациенток- умеренная остеопения бедра и позвоночника (ИМТ<18,5). Из анамнеза известно, что железистую гиперплазию эндометрия имели 2 женщины основной группы, у одной пациентки имели место ювенильные маточные кровотечения, у одной пациентки - лапароскопическое удаление серозной кисты яичника, 3 женщины указывали на консервативную терапию по поводу обострения хронического сальпингоофорита. У трех женщин в анамнезе была хламидийная инфекция, у 14 и 9 - уреаплазменая и микоплазменная инфекции соответственно. С помощью лабораторного обследования было выявлено, что 4 женщины являлись носителями вирусов папилломы человека онкогенных типов. Диффузный фиброаденоматоз молочных желез по объективным и ультразвуковым данным был диагностирован у 24% больных. Гинекологические заболевания в анамнезе были у двух (13,3%) женщин контрольной группы: у одной (6,7%) женщины - полип эндометрия, по поводу которого ей была выполнена гистероскопия, у одной (6,7%) женщины – хронический сальпингоофорит. 57 Из сопутствующей экстрагенитальной патологии у троих женщин основной группы было выявлено нарушение толерантности к глюкозе. Аутоиммунный тиреоидит наблюдался у 8 больных. Из заболеваний сердечно-сосудистой системы у девяти женщин диагностирована варикозная болезнь. Заболевания почек и мочевыводящих путей (хронический пиелонефрит и хронический цистит) были у 12 женщин. Болезни желудочно-кишечного тракта (хронический гастрит и гастродуоденит, язвенная болезнь желудка и двенадцатиперстной кишки) выявлялись у 7 женщин. У 2 пациенток отмечался жировой гепатоз, у 3- дискинезия желчевыводящих путей. Хронический тонзиллит имелся у 14 женщин. Аллергический анамнез у всех женщин основной группы был не отягощен. Сопутствующей соматической патологии не было у 10 (66,7%) женщин из контрольной группы, хронические заболевания органов дыхания были у 5 (3,3%) женщин, у 1 (6,7%) женщины в анамнезе отмечен хронический гастрит, у одной (6,7%) женщины – хронический пиелонефрит. Аллергические реакции в анамнезе были только у одной (6,7%) женщины контрольной группы. Таблица 5 -Клиническая характеристика обследованных женщин Больные Показатель с низкой активностью ароматазы фолликулов Группа контроля (n=15) (n=50) Возраст, годы 25,7±0,6 26,9±0,7 Возраст менархе, лет 13,1±0,2 13,0±0,2 Опсоменорея 35 (70%) 0 ИМТ, кг/м² 23,7±0,7 21,4±0,5 Ожирение 6 (12%) 0 Гирсутизм 12 (24%) 0 Гирсутное число 8,8±0,5 5,4±0,3 Угревая сыпь 30 (60%) 0 58 В результате общеклинического исследования было определено, что у большинства женщин обследуемой группы имелись клинические, гормональные и эхографические признаки СПЯ (28 женщин), у девяти- лапароскопически диагностирован НГЭ, у одной пациентки-сочетание НГЭ и СПЯ, у 12 больных диагноз не был верифицирован (Рисунок 3). Не верифициров ан-24% СПЯ- 56% НГЭ-18% НГЭ+СПЯ-2% Рисунок 3 - Частота встречаемости СПЯ и НГЭ у больных с низкой активностью ароматазы овариальных фолликулов 3.2 Результаты ультразвукового обследования Ультразвуковое сканирование проведено на 5-6 день менструального цикла всем больным в группе с низкой активностью ароматазы фолликулов и всем женщинам группы контроля. Результаты эхографии приведены в таблице 6. 59 Таблица 6 - Данные ультразвукового исследования органов малого таза (M±m) у обследованных женщин на 5-6 день менструального цикла Ультразвуковые показатели Продольный размер матки, см Сагиттальный размер матки, см Поперечный размер матки, см Толщина эндометрия, мм Объем правого яичника, см ³ Объем левого яичника, см ³ Количество антральных фолликулов в обоих яичниках Средний размер фолликула, мм Максимальный размер фолликула, мм Больные с низкой активностью ароматазы фолликулов (n=50) 4,6±0,1 Группа контроля (n=15) р для t-критерия 5,0±0,1 p<0,005 3,6±0,02 3,9±0,02 p<0,001 3,8±0,02 4,6±0,1 14,7±0,8 13,7±0,8 4,5±0,04 6,1±0,2 8,5±0,9 8,4±0,6 p<0,001 p<0,001 p<0,001 p<0,005 20,5±0,7 13,6±0,5 p<0,001 3,9±0,01 5,3±0,1 p<0,001 5,2±0,1 7,6±0,1 p<0,001 Данные ультразвукового исследования органов малого таза женщин основной группы косвенно отражают низкую активность овариальной ароматазы и, соответственно, недостаточную продукцию эстрадиола яичниками. Все размеры матки больных с низкой ароматазной активностью фолликулов были достоверно (p<0,001 и р<0,005) меньше, чем в группе сравнения. Пролиферация эндометрия в основной группе была замедлена и величина М-эхо в начале цикла была достоверно (р<0,001) ниже, чем у женщин с овуляторным циклом. Объем яичников больных основной группы был больше (p<0,001 и p<0,005), чем у женщин группы сравнения и превышал 12 см³. Увеличение объема яичников происходило за счет увеличения числа фолликулов в них, количество которых в основной группе также было статистически значимо выше (р<0,001), чем в группе контроля. При этом средний размер фолликулов в яичниках больных с низкой ароматазной активностью фолликулов (3,9±0,01мм) был статистически значимо (p<0,001) меньше, чем в яичниках здоровых женщин (5,3±0,1мм). Максимальный 60 размер фолликула в яичниках женщин основной группы (5,2±0,1мм) был значимо меньше в сравнении с аналогичным показателем у здоровых женщин (7,6±0,1мм), р<0,001. Как правило, в яичниках больных СПЯ фолликулы располагались по периферии; капсула была утолщена, строма избыточна. 3.3 Результаты гормонального обследования Всем больным в группе с нормогонадотропной недостаточностью яичников и низкой ароматазной активностью овариальных фолликулов (50 человек) и женщинам контрольной группы (15 человек) проведено гормональное обследование. Проба с летрозолом (Femara, Novartis – Швейцария, таблетки по 2,5мг) заключалась в определении иммуноферментным методом в сыворотке крови уровня половых стероидных гормонов и гонадотропинов дважды: исходно на 2й день менструального цикла и повторно через 48 часов после перорального приема 10 мг ингибитора ароматазы летрозола. Определяли уровень следующих гормонов в сыворотке крови: тестостерона, эстрадиола, эстрона, тестостерона, свободного андростендиона, дегидроэпиандростерона-сульфата, ФСГ, 17-гидроксипрогестерона, ЛГ, пролактина, антимюллерова гормона. Результаты пробы с летрозолом оценивали по изменению уровня эстрогенов, андрогенов и гонадотропинов в крови после перорального приема летрозола в абсолютных значениях и в процентах от исходного уровня. Исходные уровни гонадотропинов, пролактина, андрогенов и эстрадиола в крови здоровых женщин и больных с низкой ароматазной активностью фолликулов на второй день менструального цикла приведены в таблице 7. 61 Таблица 7 - Исходный уровень гонадотропинов, пролактина, половых стероидных гормонов, АМГ в периферической крови здоровых женщин и больных с низкой ароматазной активностью фолликулов Исследуемая группа Гормон ФСГ, МЕ/л ЛГ, МЕ/л Больные с низкой ароматазной активностью фолликулов (n=50) M±m 5,3±0,3 Здоровые женщины (n=15) M±m 5,9±0,3 5,9±0,6* 3,3±0,5 316,3±19,9 369,3±36,6 Тестостерон, нмоль/л 1,6±0,1 1,7±0,2 Свободный тестостерон, пмоль/л 17-OHP, нмоль/л 7,0±0,8 7,1±1,0 2,8±0,2* 1,7±0,1 6,7±0,5 6,0±0,6 Пролактин, мМЕ/л ДЭА-сульфат, мкмоль/л Андростендион, нмоль/л Эстрадиол, пмоль/л 8,3±0,5 6,9±0,8 141,9±5,1 144,9±7,9 Эстрон, пмоль/л 333,8±24,5 253,6±21,1 АМГ, нг/мл 8,3±0,7* 3,8±1,1 Соотношение ЛГ/ФСГ 1,2±0,1* 0,6±0,1 Прогестерон, нмоль/л 6,2±0,7* 48,3±3,3 Примечание: * - значимость различий (p<0,05) при сравнении с контрольной группой Анализируя данные таблицы 7, выявлено, что в сыворотке крови больных с недостаточностью яичников и низкой ароматазной активностью фолликулов наблюдалось статистически значимое (p=0,04) повышение уровня ЛГ (5,9±0,6) и более высокий уровень АМГ (8,3±0,7 нг/мл, р=0,0002). Необходимо отметить, что 62 уровень АМГ положительно коррелировал с числом антральных фолликулов (коэффициент корреляции r=0,46) (рисунок 4). 32 30 число фолликулов в обоих яичниках 28 26 24 22 20 18 16 14 12 10 8 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 АМГ Рисунок 4 - Зависимость нормогонадотропной содержания недостаточностью АМГ в крови яичников и низкой больных с активностью ароматазы фолликулов от общего количества фолликулов в обоих яичниках по данным ультразвукового сканирования на 5-6 день менструального цикла. Известно, что ФСГ стимулирует экспрессию овариальной ароматазы [117,118, 222, 228, 240]. Однако в содержании ФСГ в крови женщин сравниваемых групп статистически значимых различий не выявлено (p=0,09). Однако, в группе женщин с дефицитом ароматазы фолликулов имелась тенденция к снижению ФСГ в крови по сравнению со здоровыми женщинами (5,3±0,3 МЕ/л и 5,9 ±0,3 МЕ/л соответственно). Соотношение ЛГ/ФСГ у больных основной 63 группы (1,2±0,1) было статистически значимо (p=0,004) выше, чем в группе контроля (0,6±0,1). Повышение уровня общего тестостерона выявлено у 10 больных с дефицитом ароматазы овариальных фолликулов, свободного тестостерона - у 12 больных, А4- у 16 больных, 17-ОНР- у 34 больных, ДЭА-S- у 16 больных. Гиперандрогенемия (повышение А4 и/или свободного тестостерона и/или общего тестостерона в сыворотке крови на 2-й день менструального цикла) выявлено у 23 больных с низкой активностью ароматазы фолликулов (46%). За верхнюю границу нормы принималась верхняя граница доверительного интервала соответствующего значения у здоровых женщин при р=0,05. Уровень 17-гидроксипрогестерона был выше в крови больных с нормогонадотропной недостаточностью яичников (2,8±0,2 нмоль/л, р=0,002). Содержание в крови женщин сравниваемых групп свободного и общего тестостерона, андростендиона, ДЭА-сульфата не имело статистически значимых различий (p=0,4; р=0,4; р=0,1 и p=0,9 соответственно). 4,5 4 Тестостерон, нмоль/л 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 Рисунок 5 - Содержание общего тестостерона в крови больных с дефицитом ароматазы; горизонтальными линиями обозначены границы доверительного интервала (р=0,05) уровня общего тестостерона в крови здоровых женщин. 64 Андростендион, нмоль/л 25 20 15 10 5 0 Рисунок 6 - Содержание андростендиона в крови больных с дефицитом ароматазы; горизонтальными линиями обозначены границы доверительного интервала (р=0,05) уровня андростендиона в крови здоровых женщин. Свободный тестостерон,пмоль/л 35 30 25 20 15 10 5 0 Рисунок 7 - Содержание свободного тестостерона в крови больных с дефицитом ароматазы, горизонтальными линиями обозначены границы доверительного интервала (р=0,05) уровня свободного тестостерона в крови здоровых женщин. 65 8 7 17-ОНР, нмоль/л 6 5 4 3 2 1 0 Рисунок 8 - Содержание 17-ОНР в крови больных с дефицитом ароматазы, горизонтальными линиями обозначены границы доверительного интервала (р=0,05) уровня 17-ОНР в крови здоровых женщин. Исследуя зависимость гирсутного числа от уровней андрогенов в сыворотке крови у женщин с дефицитом ароматазы овариальных фолликулов, получены следующие данные: гирсутное число положительно коррелировало с уровнем А4 (r=0,36) и уровнем 17-ОНР (r=0,3) в крови на 2-ой день менструального цикла. Не было выявлено значимой ассоциации между степенью акне и уровнем андрогенов в крови на 2-ой день менструального цикла (r<0,3). Как уровень эстрадиола (141,9±5,1 пмоль/л), так и уровень эстрона (333,8±24,8 пмоль/л) в крови женщин основной группы статистически значимо не отличался (p=0,6 и р=0,1 соответственно) от аналогичных показателей у женщин группы контроля (144,8±7,9 пмоль/л и 253,6±21,1 пмоль/л соответственно). На 20-21 день менструального цикла в крови женщин с низкой активностью ароматазы фолликулов уровень прогестерона был значительно (p<0,0001) ниже аналогичного показателя у женщин группы контроля, что свидетельствовало об ановуляции. Содержание в крови пролактина не имело статистически значимых различий у женщин обеих групп (р=0,1). 66 Не выявлено значимой взаимосвязи между уровнями гормонов в сыворотке крови на 2-й день менструального цикла и толщиной эндометрия на 5-6 день цикла, максимальным размером фолликула и средним размером фолликула у женщин с дефицитом ароматазы овариальных фолликулов. Коэффициент Э2/Свободный тестостерон (где Э2 – уровень эстрадиола в крови в пмоль/л, свободный тестостерон – уровень свободного тестостерона в крови в пмоль/л) у больных с низкой ароматазной активностью фолликулов и здоровых женщин статистически не отличался (р=0,9). У здоровых женщин данное соотношение находилось в пределах от 7 до 71,6 (в среднем 28,7±5,1), у больных основной группы варьировало в пределах от 4,0 до 123,6 (в среднем составило 33,2±3,9) (таблица 8). Соотношение Э2/Тестостерон (где Э2 – уровень эстрадиола в крови в пмоль/л, тестостерон – уровень тестостерона в крови в нмоль/л) также не отличалось в обеих группах. Коэффициент варьировал в широких пределах в контрольной группе (от 37,8 до 219,0, в среднем составил 97,5±13,3) и также широко колебался у женщин основной группы (от 32,2 до 1048,0 в среднем 166,3±29,0) (таблица 8). Соотношение Э1/А4 (где Э1 – уровень эстрона в крови в пмоль/л, А4 – уровень андростендиона в крови в нмоль/л) у больных обеих групп не имело статистически значимых различий. В контрольной группе значение коэффициента находилось в пределах от 12,9 до 102,1 и в среднем составило 45,5±6,7. В основной группе – варьировало от 13,9 до 165,1, составив в среднем 46,8±4,4 (таблица 8). 67 Таблица 8 - Соотношение эстрогенов и андрогенов в крови здоровых женщин и в группе больных с нормогонадотропной недостаточностью яичников и низкой ароматазной активностью фолликулов на второй день менструльного цикла Исследуемая группа Контрольная группа (n=15) M±m Показатель Больные с нормогонадотропной недостаточностью яичников и низкой ароматазной активностью фолликулов (n=50) M±m Э1/А4 45,5±6,7 46,8±4,4 Э2/Свободный тестостерон Э2/Тестостерон 28,7±5,1 33,2±3,8 97,5±13,3 166,3±29,0 Примечание: * - значимость отличий (p˂0,05) по сравнению с контрольной группой. 3.4 Результаты пробы с ингибитором ароматазы летрозолом Прием 10 мг ингибитора ароматазы летрозола на второй день менструального цикла вызывал достоверное снижение уровня эстрогенов и адекватное повышение гонадотропинов в крови здоровых женщин (таблица 9) через 48 часов (на 4-ый день менструального цикла). Исходный уровень эстрадиола в крови здоровых женщин составил 144,9±7,9 пмоль/л, через 48 часов после перорального приема летрозола снизился до 102,3±4,2 пмоль/л (p<0,01), на 42,6±8,0 пмоль/л (на 27,2±4,3% от исходного уровня) (таблица 9); в пределах 95% доверительного интервала снижение уровня эстрадиола происходило от 25,5 пмоль/л до 59,6 пмоль/л или от 17,9% до 36,5%. Исходный уровень эстрона в крови здоровых женщин составил 253,6±21,1 пмоль/л, через 48 часов после приема летрозола снизился до 220,4±19,3 пмоль/л (p=0,007) (таблица 9). Снижение эстрона (ΔЭ1) в крови в среднем составило 33,2±9,4 пмоль/л (12,1±3,9% 68 от исходного уровня). После перорального приема 10 мг летрозола уровень ФСГ повышался с 5,9±0,3 МЕ/л до 10,3±0,5 МЕ/л, в среднем на 4,4±0,5 МЕ/л, то есть 78,4±9,3% от исходного уровня (p˂0,001). Уровень ЛГ повышался с 3,3±0,5 МЕ/л до 7,2±0,5 МЕ/л, в среднем на 3,9±0,5 МЕ/л, 152,9±26,3% от исходного уровня (p˂0,001). Отмечалось достоверое (р<0,01) повышение уровня 17-ОНР с 1,7±0,1 нмоль/л до 2,3±0,2нмоль/л. Повышение уровня остальных андрогенов не было статистически значимым (таблица 9). Таблица 9 - Уровень гонадотропинов, эстрогенов и андрогенов в крови здоровых женщин исходно и после приема летрозола (10мг) День пробы 1й день (M±m) 3й день (M±m) Эстрадиол, пмоль/л 144,9±7,9 102,3±4,2* Эстрон, пмоль/л 253,6±21,1 220,4±19,3* ФСГ, МЕ/л 5,9±0,3 10,3±0,5** ЛГ, МЕ/л 3,3±0,5 7,2±0,5** Свободный тестостерон, пмоль/л 17-OHP, нмоль/л 7,2±1,1 7,4±1,3 1,7±0,1 2,3±0,2* ДЭА-сульфат, мкмоль/л 6,0±0,6 5,8±0,5 Андростендион, нмоль/л 6,9±0,8 8,0±0,9 Показатель Примечание: * - значимость различий (p<0,01) при сравнении с показателями в 1й день пробы с летрозолом, ** - значимость различий (p<0,001) при сравнении с показателями в 1й день пробы с летрозолом. Для определения ароматазной активности антрального фолликула использовался коэффициент ΔЭ2/АМГ (патент № 2013147216 от 5.12.2014 г.), где ΔЭ2 – снижение уровня эстрадиола в крови в пмоль/л через 48 часов после приема летрозола, АМГ – уровень АМГ в крови в нг/мл. У здоровых женщин значение 69 коэффициента ∆Э2/АМГ колебалось от -2,6 до 46,0 и в среднем составляло 18,3±4,3. Границы доверительного интервала коэффициента ∆Э2/АМГ при p=0,05 у здоровых женщин составили: нижний предел – 8,4, верхний предел – 27,2. Реакция на летрозол у женщин в группе с нормогонадотропной ановуляцией и низкой ароматазной активностью фолликулов была сходной с таковой у здоровых женщин (таблица 10). Однако, отмечалось не только статистически значимое снижение уровня эстрогенов, повышение уровня гонадотропинов и 17ОНР в крови, но и статистически значимое повышение уровня свободного тестостерона (р<0,001) (таблица 10). После перорального приема летрозола у больных с нормогонадотропной ановуляцией и низкой активностью ароматазы фолликулов происходило снижение уровня эстрадиола в крови от 141,9±5,1 пмоль/л до 108,5±3,8 пмоль/л, в среднем на 33,4±3,2 пмоль/л (22,5±1,6%) от исходного (таблица 10). Как и у здоровых женщин, снижение уровня эстрона в крови больных основной группы было менее выраженным: с 333,8±24,8 пмоль/л до 270,4±24,5 пмоль/л, в среднем на 63,4±12,7 пмоль/л, на 18,4±2,8% от исходного значения. Через 48 часов после перорального приема 10 мг летрозола уровень ФСГ повышался с 5,3±0,3 МЕ/л до 9,8±0,5 МЕ/л, в среднем на 4,5±0,4 МЕ/л, то есть 105,4±13,3% от исходного уровня (p˂0,001). Уровень ЛГ повышался с 5,9±0,6 МЕ/л до 10,8±1,0 МЕ/л, в среднем на 4,9±0,6 МЕ/л, 132,8±25,5% от исходного уровня (p˂0,001). Повышение уровня свободного тестостерона в крови женщин в группе с нормогонадотропной ановуляцией и низкой активностью ароматазы фолликулов было более выраженным, чем у здоровых женщин: от 7,0±0,8 пмоль/л до 8,4±1,0 пмоль/л, в среднем на 1,4±0,5 пмоль/л, то есть на 33,7±8,0% от исходного значения (у здоровых женщин – на 0,2±0,4 пмоль/л, на 2,7±8,6%). Уровень 17ОНР в группе женщин с нормогонадотропной ановуляцией также имел статистически значимое (p<0,001) повышение: от 2,8±0,2 нмоль/л до 4,5±0,4нмоль/л (таблица 10), в среднем на 1,7±0,3нмоль/л, на 69,4±10,1% от 70 исходного уровня (у здоровых женщин уровень 17-ОНР повышался в среднем на 0,7±0,2 нмоль/л, на 39,2±9,5%). Таблица 10 - Уровень гонадотропинов, эстрогенов и андрогенов в крови больных с нормогонадотропной ановуляцией и низкой ароматазной ативностью фолликулов исходно и после приема летрозола(10мг) День пробы Показатель 1й день (M±m) Эстрадиол, пмоль/л 141,9±5,1 108,5±3,8 * Эстрон, пмоль/л 333,8±24,8 270,4±24,5* ФСГ, МЕ/л 5,3±0,3 9,8±0,5* ЛГ, МЕ/л 5,9±0,6 10,8±1,0* Свободный тестостерон, пмоль/л 17-OHP, нмоль/л 7,0±0,8 8,4±1,0* 2,8±0,2 4,5±0,4* ДЭА-сульфат, мкмоль/л 6,7±0,5 6,8±0,5 Андростендион, нмоль/л 8,3±0,5 8,8±0,6 Примечание. * 3й день (M±m) - Значимость различий (p<0,001) по сравнению с показателями в 1й день пробы с летрозолом. Для анализа изменения уровня гормонов в сыворотке крови женщин обеих групп после приема 10 мг летрозола использовался также дискриминантный анализ для зависимых выборок (ANOVA Repeated). Данный анализ также показал наличие статистически значимого (р<0,0001) снижения уровня эстрадиола и повышения уровня гонадотропинов в сыворотке крови здоровых женщин и женщин с низкой ароматазной активностью фолликулов после приема летрозола. Кроме того, с помощью данного анализа не выявлено статистически значимой разницы в динамике этих гормонов между группами (Рисунки 8,9,10). 71 11 10 ФСГ, МЕ/л 9 8 7 6 5 4 ФСГ-3 ФСГ-1 день пробы повышение уровня ФСГ в крови женщин с низкой ароматазной активностью фолликулов повышение уровня ФСГ в крови здоровых женщин Рисунок 8 - Динамика ФСГ через 48 часов после приема 10 мг летрозола у здоровых женщин и женщин с нормогонадотропной ановуляцией и низкой активностью ароматазы фолликулов (дискриминантный анализ для зависимых выборок ANOVA Repeated). 72 12 11 10 9 ЛГ, МЕ/л 8 7 6 5 4 3 2 ЛГ-3 ЛГ-1 день пробы повшение уровня ЛГ в крови женщин с низкой ароматазной активнос тью фолликулов повышение уровня ЛГ в крови здоровых женщин Рисунок 9 - Динамика ЛГ через 48 часов после приема 10 мг летрозола у здоровых женщин и женщин с нормогонадотропной ановуляцией и низкой активностью ароматазы фолликулов (дискриминантный анализ для зависимых выборок ANOVA Repeated). 73 150 145 140 уровень эстрадиола, пмоль/л 135 130 125 120 115 110 105 100 95 E2-3 E2 -1 день пробы с нижение уровня эс традиола в крови женщин с низкой активнос тью ароматазы фолликулов с нижение уровня эс традиола в крови доровых женщин Рисунок 10 - Динамика эстрадиола через 48 часов после приема 10 мг летрозола у здоровых женщин и женщин с нормогонадотропной ановуляцией и низкой активностью ароматазы фолликулов (дискриминантный анализ для зависимых выборок ANOVA Repeated). 74 152,9 160 132,8 140 % от исходного значения 120 100 105,4 78,4 69,4 80 60 36,4 33,7 40 20 2,7 0 -20 -22,5 -27,2 -40 здоровые женщины -12,1 -18,4 женщины с низкой активностью ароматазы фолликулов Рисунок 11 - Изменение уровня гонадотропинов, эстрогенов и андрогенов в крови здоровых женщин и женщин с низкой ароматазной активностью фолликулов после приема летрозола (в процентах от исходного уровня). Известно [36], что проба с летрозолом позволяет определять общую овариальную ароматазную активность по снижению эстрадиола в сыворотке крови (ΔЭ2). Как было отмечено выше, в пределах 95% доверительного интервала снижение уровня эстрадиола у здоровых женщин вследствие приема летрозола происходило от 25,5 пмоль/л до 59,6 пмоль/л. Соответственно данным значениям было определено, что общая активность овариальной ароматазы в группе женщин с низкой активностью ароматазы фолликулов варьировала в широких пределах: у 44% больных находилась в пределах нормальных величин, у 12% больных была повышена, у 44% больных – снижена (Рисунок 12). 75 Общая ароматазная активность 120 100 80 60 40 20 0 Рисунок 12 - Распределение женщин с нормогонадотропной ановуляцией и низкой активностью ароматазы фолликулов в зависимости от общей ароматазной активности; горизонтальными линиями обозначены границы доверительного интервала (р=0,05) общей ароматазной активности (ΔЭ2) в крови здоровых женщин. Ароматазная активность фолликулов у больных обследуемой группы положительно коррелировала с базальным уровнем эстрадиола (r=0,3) и отрицательно коррелировала с числом антральных фолликулов (r=-0,35) (рисунок 13). Выявлена положительная корреляция между размерами матки и активностью ароматазы овариальных фолликулов (r=0,35, r=0,3, r=0,43). 76 32 Число фолликулов в обоих яичниках 30 28 26 24 22 20 18 16 14 12 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Ароматазная активнос ть фолликулов Рисунок 13 - Соотношение ароматазной активности и общего количества антральных фолликулов в яичниках больных с нормогонадотропной ановуляцией и низкой активностью ароматазы фолликулов. Иногда в клинической практике выбор препарата для стимуляции овуляции вызывает затруднения. Можно предположить, что в группе женщин с дефицитом ароматазы фолликулов применение ингибиторов ароматазы по схеме стимуляции овуляции не вызовет достаточного падения уровня эстрогенов и не произойдет достаточной стимуляции гонадотрофов гипофиза к образованию ФСГ в количестве, способном обеспечить нормальный фолликулогенез, а также не обеспечит достаточного повышения внутрифолликулярного уровня андрогенов и, соответственно, не произойдет достаточного усиления сенситизирующего действия андрогенов на ФСГ- рецепторы клеток, то есть не будет достаточного роста фолликулов и созревания ооцита. Учитывая относительно низкое содержание андрогенов в крови больных с низкой ароматазной активностью фолликулов, можно предположить сниженную чувствительность яичников как к ФСГ, так и к ЛГ. Соответственно, вопрос эффективности применения гонадотропинов для стимуляции овуляции у этих больных является открытым и требует дополнительных исследований. Очевидно, что для выбора препарата для 77 стимуляции овуляции, знание о том, какова активность овариальной ароматазы фолликулов, может играть решающую роль. У всех здоровых женщин (n=15) и женщин с нормогонадотропной ановуляцией (n=190) было рассчитано отношение Э2/АМГ (коэффициент Ка), где Э2- уровень эстрадиола в крови на 2-й день менстуального цикла, пмоль/л; АМГуровень АМГ в крови на 2-й день менструального цикла, нг/мл. Среднее значение коэффициента Ка (M±m) и границы доверительного интервала (при р=0,01) у здоровых женщин (n=15) представлены в таблице 11. Таблица 11 - Среднее значение и границы доверительного интервала коэффициента Ка у здоровых женщин Э2/АМГ (Ка) Среднее значение (M±m) 64,3±8,9 Границы доверительного интервала (при р=0,01) 37,8-90,7 С помощью корреляционного анализа выявлена высокая сила ассоциации (r=0,7) между коэффициентами ΔЭ2/АМГ (К) и Э2/АМГ (Ка) при р=0,01 в группе здоровых женщин. Таким образом, наличие низкой ароматазной активности овариальных фолликулов можно предполагать при показателе Ка менее 37,8, нормальной ароматазной активности овариальных фолликулов - при показателе Ка от 37,8 до 90,7, высокой ароматазной активности овариальных фолликулов - при значении Ка более 90,7. Соответственно значениям Ка все женщины в группе с нормогонадотропной ановуляцией (n=190) были разделены на три группы: с низкой, нормальной и высокой активностью ароматазы овариальных фолликулов. В каждой группе определены средние значения (M±m) коэффициента К= ΔЭ2/АМГ (таблица 12). 78 Таблица 12 - Ароматазная активность овариальных фолликулов у женщин с нормогонадотропной ановуляцией соответственно коэффициену Ка Ароматазная ативность овариальных фолликулов у женщин с нормогонадотропной ановуляцией (n=190) Низкая, Ка<37,8 Нормальная, Высокая, Kа>90,7 (n=75) (n=45) 37,8<Kа<90,7 (n=70) ΔЭ2/АМГ (К) 7,3±0,4 17,4±1,0 69,9±11,7 В группе женщин с нормогонадотропной ановуляцией коэффициент корреляции Спирмена (r) между коэфициентами Э2/АМГ (Ка) и ΔЭ2/АМГ (К) составил 0,9. Анализируя данные таблиц 11 и 12 очевидно, что группу с низкой активностью ароматазы овариальных фолликулов составило 50 женщин соответственно коэффициенту ∆Э2/АМГ (К) и 75 женщин соответственно коэффициенту Э2/АМГ (Ка). Определено, что среднее значение коэффициента К у 75 женщин с предполагаемой низкой активностью ароматазы фолликулов (Ка<37,8) составило 7,3±0,4, а границы доверительного интервала коэффициента ∆Э2/АМГ (К) при p=0,05 у этих женщин составили: нижний предел: 6,4, верхний предел: 8,2. Соответственно, с помощью коэффициента Э2/АМГ (Ка) могут быть выявлены пациенты, чья ароматазная активность овариальных фолликулов низкая или приближается к нижней границе нормы (за нижнюю границу нормы принимается значение коэффициента К=8,4; где 8,4- нижняя граница доверительного интервала коэффициента К у здоровых женщин при р=0,05). Коэффициент корреляции Спирмена между К и Ка в данной подгруппе составил r=0,7 при р=0,01. 79 3.5 Сопоставление клинических, эхографических и гормональных данных у больных с частичным дефицитом ароматазы овариальных фолликулов На основании характерных клинических проявлений (нарушение менструального цикла, гирсутизм, угревая сыпь), данных гормонального обследования (повышенный уровень ЛГ, свободного тестостерона в крови на 2-й день менструального цикла, увеличение соотношения ЛГ/ФСГ), эхографических критериев (увеличение объема яичников более 12 см³, наличие более 10 антральных фолликулов в каждом яичнике) у 56% женщин в группе с низкой активностью ароматазы овариальных фолликулов установлен диагноз СПЯ. У 44% женщин проявления частичного дефицита ароматазы фолликулов не укладывались в картину СПЯ: с помощью лапароскопии у десяти пациенток диагностирован НГЭ, у 12 больных диагноз не был верифицирован. Для выявления симптомов, характерных для низкой активности ароматазы овариальных фолликулов, были сопоставлены клинические, эхографические и гормональные признаки больных с СПЯ и больных, не имеющих всех характерных для СПЯ проявлений (таблица 13) 80 Таблица13 - Клиническая характеристика обследованных женщин Больные с низкой Больные с низкой активностью ароматазы активностью ароматазы Группа Показатель Возраст фолликулов с фолликулов диагнозом СПЯ проявлений СПЯ (n=28) (n=22) 13,4±0,3 12,7±0,2 ˟ без контроля (n=15) 13,0±0,2 менархе, лет Опсоменорея 23 (82%)* 12 (54,5%)* ИМТ, кг/м² 23,5±0,8 24,0±1,3 Гирсутизм 10 (35,7%)* 2 (9%)* ˟ Гирсутное число Угревая сыпь 9,6±0,7* 19 (67,8%)* 7,8±0,7* 11 (50%)* 0 21,4±0,5 0 5,4±0,3 0 Примечание: * - значимость различий (p<0,05) при сравнении с контрольной группой; ˟ - значимость различий (р<0,05) между группами больных с СПЯ и больных без проявлений СПЯ Анализируя данные таблицы 13, необходимо отметить, что нарушения менструального цикла по типу опсоменореи встречались чаще в группе женщин с СПЯ, чем в группе женщин без проявлений СПЯ, однако, различия не были статистически значимыми (в 82% случаев и в 54,5% случаев соответственно, р>0,05). У всех здоровых женщин менструальный цикл был регулярным. Возраст наступления менархе оказался ниже в группе женщин без проявлений СПЯ по сравнению с женщинами, имеющими СПЯ (12,7±0,2 лет и 13,4±0,3 лет соответственно, р<0,05). Гирсутизм и вульгарные угри встречались в обеих 81 подгруппах женщин с частичным дефицитом ароматазы фолликулов. У женщин с диагнозом СПЯ эти клинические проявления встречались чаще, чем у женщин без СПЯ (гирсутизм в 35,7% и 9% случаев соответственно, p=0,04; угревая сыпь в 67,8 и 50% случаев соответственно, p=0,2). Ни у одной здоровой женщины гирсутизма и угревой сыпи отмечено не было. ИМТ не различался у всех обследуемых женщин. В таблице 14 представлены результаты эхографического обследования органов млого таза на 5-6 день менструального цикла здоровых женщин и женщин с низкой акивностью аромтазы овариальных фолликулов. 82 Таблица 14 - Данные ультразвукового исследования органов малого таза (M±m) у обследованных женщин на 5-6 день менструального цикла Больные с низкой активностью Ультразвуковые показатели ароматазы фолликулов c диагнозом СПЯ (n=28) Продольный размер матки, см Сагиттальный размер матки, см 4,6±0,08* 3,6±0,03* Больные с низкой активностью ароматазы фолликулов без Группа контроля (n=15) проявлений СПЯ (n=22) 4,6±0,1* 3,7±0,04* 3,9±0,02 Поперечный размер матки, см 3,8±0,02* Толщина эндометрия, мм 4,5±0,2* Объем правого яичника, см ³ 17,9±1,0* ˟ 10,6±0,7* 8,5±0,9 Объем левого яичника, см ³ 15,6±0,8* ˟ 11,2±1,3* 8,4±0,6 Количество антральных фолликулов в обоих яичниках Средний размер фолликула, мм Максимальный размер фолликула, мм 23,2±0,8* ˟ 3,9±0,02* 5,1±0,2* 3,9±0,04* 5,0±0,1 4,8±0,1* 17,1±0,5* 3,9±0,03* 5,2±0,1* 4,5±0,04 6,1±0,2 13,6±0,5 5,3±0,1 7,6±0,1 Примечание: * - значимость различий (p<0,05) при сравнении с контрольной группой; ˟ - значимость различий (р<0,05) между группами больных с СПЯ и больных без проявлений СПЯ. 83 Все женщины с низкой активностью ароматазы овариальных фолликулов имели статистически значимое (p<0,05) уменьшение размеров матки, уменьшение толщины эндометрия, уменьшенный средний и максимальный размер фолликула по сравнению с соответствующими показателями у здоровых женщин. Объем яичников больных СПЯ превышал 12 см³ и был значимо больше, чем у здоровых женщин (p<0,005) и женщин без проявлений СПЯ (p<0,05). Количество антральных фолликулов в группе женщин с диагнозом СПЯ также было статистически значимо выше, чем в группе здоровых женщин (23,2±0,8 и 13,6±0,5 соответственно, р<0,005) и в группе женщин без проявлений СПЯ (23,2±0,8 и 17,1±0,5 соответственно, p<0,05) . Данные ультразвукового исследования органов малого таза женщин с низкой активностью овариальной ароматазы фолликулов позволяют предполагать недостаточную продукцию эстрадиола яичниками на 5-6 день менструального цикла. В таблице 15 приведены данные гормонального обследования женщин с частичным дефицитом ароматазы овариальных фолликулов и здоровых женщин. 84 Таблица 15 - Исходный уровень гонадотропинов, пролактина, половых стероидных гормонов, АМГ в периферической крови здоровых женщин и больных с низкой ароматазной активностью фолликулов Исследуемая Больные с низкой группа Больные с низкой ароматазной активностью ароматазной фолликулов с диагнозом активностью СПЯ (n=15) фолликулов без (n=28) M±m проявлений СПЯ M±m Здоровые женщины Гормон (n=22) M±m ФСГ, МЕ/л 5,9±0,3 5,8±0,6 4,8±0,3* ЛГ, МЕ/л 3,3±0,5 5,0±0,7* 6,6±0,8* Пролактин, мМЕ/л 369,3±36,6 Тестостерон, нмоль/л 1,7±0,2 1,4±0,2 1,8±0,2 Свободный 7,1±1,0 6,6±1,4 7,3±1,0 17-OHP, нмоль/л 1,7±0,1 2,6±0,2* 2,9±0,3* ДЭА-сульфат, мкмоль/л 6,0±0,6 6,5±0,7 6,9±0,6 Андростендион, 6,9±0,8 7,5±0,7 8,9±0,7 Эстрадиол, пмоль/л 144,9±7,9 131,2±4,9 150,2±7,9 Эстрон, пмоль/л 253,6±21,1 324,1±44,9 341,4±27,5* АМГ, нг/мл 3,8±1,1 5,3±0,6 ˟ 10,8±1,0* Соотношение ЛГ/ФСГ 0,6±0,1 0,9±0,1* 1,3±0,1* 294,8±21,9 333,2±31,2 тестостерон, пмоль/л нмоль/л Примечание: * - значимость различий (p<0,05) при сравнении с контрольной группой; ˟ - значимость различий (р<0,05) между группами больных с СПЯ и больных без проявлений СПЯ. 85 В обеих подгруппах больных с частичным дефицитом ароматазы овариальных фолликулов базальный уровень ЛГ в крови и соотношение ЛГ/ФСГ были статистически значимо (p<0,05) выше, чем у женщин контрольной группы. Наиболее высокое содержание эстрадиола и эстрона наблюдалось в группе больных с СПЯ. Содержание эстрона при этом оказалось статистически значимо (р=0,03) выше, чем у здоровых женщин (341,4±27,5 пмоль/л и 253,6±21,1пмоль/л соответственно). Самые высокие значения общего, свободного тестостерона и андростендиона были найдены в группе больных СПЯ. Гиперандрогенемия выявлена у 57,1% женщин этой подгруппы. В подгруппе пациенток, не имеющих проявлений СПЯ, гиперандрогенемия встречалась у 40,9% женщин. Повышение 17-ОНР было статистически значимым (p<0,003) у всех женщин с частичным дефицитом ароматазы фолликулов по сравнению с этим показателем у женщин контрольной группы (2,9±0,3 нмоль/л у пациенток с СПЯ; 2,6±0,2нмоль/л у женщин, не имеющих проявлений СПЯ и 1,7±0,1нмоль/л у здоровых женщин). Необходимо отметить, что значимых различий в содержании гонадотропинов, эстрогенов и андрогенов между больными с диагнозом СПЯ и больными без проявлений СПЯ выявлено не было (p>0,05). Самое высокое содержание АМГ оказалось у женщин с диагнозом СПЯ (10,8±1,0 нг/мл), данное значение статистически значимо превышало значение АМГ в подгруппе женщин с низкой активностью ароматазы фолликулов без проявлений СПЯ (5,3±0,6 нг/мл, р<0,001) и среднее значение АМГ у здоровых женщин (3,8±1,1нг/мл, p<0,001). Таким образом, гормональные проанализировав проявления частичного клинические, дефицита ультразвуковые ароматазы и овариальных фолликулов, можно выделить следующие признаки, характеризующие данное состояние: ановуляция и нарушение менстуального цикла по типу опсоменореи, увеличение объема яичников и числа антральных фолликулов в них, уменьшение размеров матки, толщины эндометрия и размеров фолликулов на 5-6 день менструального цикла, повышение уровня ЛГ в крови на 2-й день менструального цикла и соотношения ЛГ/ФСГ, умеренное повышение 17-ОНР в крови на 2-й день менструального цикла и увеличение продукции АМГ яичниками. 86 Гиперандрогенемия и андрогензависимая дермопатия являются частыми (46% и 60% соответственно), но не облигатными проявлениями частичного дефицита ароматазы овариальных фолликулов. 3.6 Результаты генетического исследования Всем больным в группе с низкой ароматазной активностью фолликулов (n=50) было проведено генетическое исследование, включающее в себя анализ аллелей и генотипов по гену CYP19 ((TTTA)n полиморфизм и del(TCT) полиморфизм. Аналогичное генетическое исследование проведено всем (n=70) женщинам группы сравнения. На момент исследования 64 женщины группы сравнения имели регулярный менструальный цикл. У 6 женщин наступила своевременная менопауза, продолжительность постменопаузального периода колебалась от 1 года до 6 лет и в среднем составила 3,5±0,8 года. У 45 женщин группы сравнения в анамнезе были беременности, которые закончились срочными родами, 9 женщин имели в прошлом невынашивание беременности. У всех женщин репродуктивного возраста группы сравнения зарегистрирована овуляция с полноценной лютеиновой фазой. В таблице 16 представлено распределение частот генотипов по гену CYP19 ((TTTA)n полиморфизм) у обследованных женщин. 87 Таблица 16- Распределение частот генотипов по гену CYP19 ((TTTA)n полиморфизм) у больных с недостаточностью яичников и низкой ароматазной активностью фолликулов и в группе сравнения Дефицит Группа сравнения ароматазы (n=50) (n=70) Р (TTTA)n полиморфизм Абс. (n) Отн. (%) Абс. (n) Отн. (%) 7..7 (А1A2)(A1A1) 9 18 20 28,575 0,1 7..8(A1A3)(A2A3) 7 14 17 24,3 0,1 7..9(A1A5)(A2A5) 1 2 2 2,85 0,6 7..11(A1A6)(A2A6) 21 42* 9 12,85 0,0003 7..12(A1A7)(A2A7) 1 2 1 1,425 0,7 8..8(A3A3) 1 2 2 2,85 0,6 8..11(A3A6) 2 4 2 2,85 0,5 8..12(A3A7) 0 0 1 1,425 0,6 10..12(А5А7) 0 0 2 2,85 0,3 11..11(A6A6) 7 14 13 18,6 0,3 11..12(A6A7) 1 2 1 1,425 0,7 Всего 50 100 70 100 - Примечание: *- достоверное (р<0,05) отличие между группами соответственно точному критерию Фишера Самым частым генотипом по гену CYP19 ((TTTA)n полиморфизм) у больных с низкой ароматазной активностью фолликулов явился: (TTTA)7(TTTA)11 (42%), который встречался лишь у 12,8% женщин группы сравнения. Данное различие между сравниваемыми группами было статистически значимым (р=0,0003). Ранее в работе Савиной В.А. с соавт. [26], где проводился сравнительный анализ данного полиморфизма больных СПЯ и здоровых женщин, статистически значимого различия в частоте встречаемости данного генотипа 88 обнаружено не было. Однако в этом исследовании ароматазная активность отдельных фолликулов при СПЯ не учитывалась. Остальные генотипы встречались реже в обеих группах, и при их анализе не было выявлено статистически значимых различий между сравниваемыми группами. Анализ распределения частот генотипов гена СУР19 (del(TCT)) у больных с нормогонадотропной ановуляцией и низкой ароматазной активностью фолликулов и у здоровых женщин представлен в таблице 17. Таблица 17 - Распределение частот генотипов гена CYP19 (del(TCT)) у больных с недостаточностью яичников и низкой ароматазной активностью фолликулов и в группе сравнения Недостаточность яичников (n=50) Генотипы гена CYP19 (del(TCT)) Абс. (N) Группа сравнения (n=70) P Отн.(%) Абс. (n) Отн. (%) I/I 21 42 31 44,28 0,5 D/D 4 8 13 18,58 0,08 D/I 25 50 26 37,14 0,1 Всего 50 100 15 100 - Сравнительный анализ частот генотипов и аллелей одного из двух полиморфных вариантов гена CYP19 (del(TCT)) между выборками больных с нормогонадотропной недостаточностью яичников и низкой ароматазной активностью фолликулов и женщин группы сравнения не выявил значимых различий. 89 3.7 Характеристика женщин с полиморфизмом 7..11(А1А6)(А2А6) по гену СУР19 Учитывая данные литературы о том, что более низкое количество повторов (ТТТА)n гена CYP19 ассоциируется с увеличением уровня андрогенов и уменьшением эстрогенов в крови и, возможно, снижением ферментативной активности ароматазы [67], были полиморфизмом встречающимся отдельно проанализированы 7..11(A1A6)(A2A6) в группе больных по с гену СУР19, дефицитом женщины с наиболее ароматазы часто (42%) и встречающимся у здоровых женщин лишь в 12,8% случаев. В данную группу вошла 21 пациентка из группы женщин с нормогонадотропной ановуляцией и дефицитом ароматазы фолликулов. Большинство женщин в данной группе имели диагноз СПЯ (13 женщин), у пяти – лапароскопически подтвержденный НГЭ, у троих женщин диагноз не верифицирован. Возраст пациенток в данной группе варьировал от 18 до 33 лет и в среднем составил 26,02±0,9 года. Индекс массы тела варьировал от 22 кг/м² до 42,7 кг/м² и в среднем составил 24,4±1,2 кг/м². Симптомы андрогензависимой дермопатии проявлялись в виде вульгарных угрей у 12 женщин, в виде гирсутизма у 4 женщин. Возраст менархе колебался от 11 до 17 лет и в среднем составил 12,7±0,3 года. У 10 женщин обследованной группы имелось первичное бесплодие. При проведении остеоденситометрии восьмерым женщинам в группе получены результаты: у 6 женщин МПКТ в пределах нормы, у двоих- выявлена умеренная остеопения позвоночника. Данные гормонального обследования женщин, имеющими полиморфизм гена СУР19 гормонального 7..11(A1A6)(A2A6) (21 человек) мы сравнили с данными обследования остальных женщин из группы с нормогонадотропной недостаточностью яичников и дефицитом ароматазы фолликулов, имеющими в генотипе реже встречающиеся полиморфизмы гена СУР19 (29 человек) (Таблица18). 90 Таблица 18 - Уровень гонадотропинов, половых стероидных гормонов, пролактина соотношение эстрогенов и андрогенов в периферической крови женщин с полиморфизмом 7..11(A1A6)(A2A6) гена СУР19 и женщин с полиморфизмами 7..7 (А1A2)(A1A1), 7..8(A1A3)(A2A3), 7..9(A1A5)(A2A5), 7..12(A1A7)(A2A7), 11..11(А6А6), 8..11(А3А6), 8..8(А3А3), 11..12(А6А7) Исследуемая группа ФСГ, МЕ/л 5,6±0,5 Женщины с полиморфизмами 7..7(А1A2)(A1A1), 7..8(A1A3)(A2A3), 7..9(A1A5)(A2A5), 7..12(A1A7)(A2A), 11..11(А6А6), 8..11(А3А6), 8..8(А3А3), 11..12(А6А7) (n=29) M±m 5,2±0,3 ЛГ, МЕ/л 5,8±0,8 5,9±0,6 322,9±33,5 316,3±24,9 Тестостерон, нмоль/л 1,5±0,2 1,6±0,2 Свободный тестостерон, пмоль/л 17-OHP, нмоль/л 6,0±1,5 7,7±1,2 2,8±0,2 2,7±0,3 ДЭА-сульфат, мкмоль/л Андростендион, нмоль/л Эстрадиол, пмоль/л 6,0±0,6 6,8±0,7 6,6±0,9 7,8±0,5 134,5±8,6 147,2±7,1 Эстрон, пмоль/л 324,3±46,2 346,8±34,5 1,1±0,1 0,9±0,2 Прогестерон, нмоль/л 6,1±0,9 6,5±0,4 Э1/А4 42,7±6,3 49,8±9,4 Э2/Свободный 39±6,4 29±5,9 161,2±34,6 170,1±36,2 Женщины с полиморфизмом 7..11(A1A6)(A2A6) (n=21) M±m Гормон Пролактин, мМЕ/л Соотношение ЛГ/ФСГ тестостерон Э2/тестостерон Примечание. * - значимость различий (p<0,05) при сравнении с контрольной группой. 91 Анализируя данные таблицы 18, необходимо отметить, что уровень эстрогенов в группе женщин с полиморфизмом 7..11(A1A6)(A2A6) гена СУР19 ниже, чем в группе женщин с полиморфизмами, наиболее редко встречающимися в обследуемой группе пациенток с дефицитом ароматазы фолликулов: эстрадиол 134,5±8,6 пмоль/л и 147,2±7,1 пмоль/л, эстрон 324,3±46,2 пмоль/л и 346,8±34,5 пмоль/л соответственно. Однако, различия не были статистически значимыми (р=0,2 и р=0,2 соответственно). Вопреки ожиданиям, уровень андрогенов статистически значимо не отличались в обеих группах и даже были несколько выше в группе 7..8(A1A3)(A2A3), женщин, имеющих 7..9(A1A5)(A2A5), полиморфизмы 7..7(А1A2)(A1A1), 7..12(A1A7)(A2A), 11..11(А6А6), 8..11(А3А6), 8..8(А3А3) или 11..12(А6А7) (таблица 13). Соотношение Э1/А4 и Э2/тестостерон ниже в группе женщин с полиморфизмом 7..11(A1A6)(A2A6) гена СУР19: 42,7±6,3 и 161,2±34,6 соответственно, в группе женщин с другими полиморфизмами значения составили: Э1/А4 - 49,8±9,4; Э2/тестостерон - 170,1±36,2. Различия оказались статистически не значимы (р=0,4 и р=0,9). Статистически значимых различий в содержании пролактина, гонадотропинов также не было между женщинами обеих групп. 92 ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ Наиболее распространенной формой нарушения репродуктивной функции женщины является нормогонадотропная недостаточность яичников, которая характеризуется неизмененным базальным уровнем ФСГ в крови и может быть обусловлена экстрагонадными и овариальными факторами [17,18,179]. По данным ВОЗ [174], распространенность этой патологии составляет до 85% от всех нарушений функции яичников. Установлено, что приблизительно у 35 % больных с нормогонадотропной недостаточностью яичников механизм положительной обратной связи в гипоталамо-гипофизарно-овариальной системе интактен. Овариальная недостаточность у этих больных, следовательно, связана с первичнояичниковыми факторами, а именно с несостоятельностью доминантного фолликула, уровень секреции эстрадиола которым недостаточен для реализации интактного механизма положительной обратной связи между яичниками и гипофизом [17,18,22]. Возможной причиной первично-овариальных нарушений может быть дефект ферментов, ответственных за стероидогенез в яичниках. Можно предположить, что повреждения в гене ароматазы р450, отвечающей за конверсию андрогенов в эстрогены, могут играть определенную роль в патогенезе данной патологии. Для определения ароматазной активности были обследованы 190 женнщин с нормогонадотропной недостаточностью яичников. Наличие нормогонадотропной недостаточности яичников устанавливалось на основании: характерных клинических проявлений (нарушение менструального цикла по типу опсоменореи или аменореи), данных гормонального обследования (уровень прогестерона в крови менее 20 нмоль/л во вторую фазу менструального цикла, на 19-22 день), эхографических критериев (отсутствие «желтого тела» в яичниках во вторую фазу менструального цикла). С помощью пробы с летрозолом у 50 из обследованных (26,3%) была выявлена низкая ароматазная активность фолликулов ∆Э2/АМГ<8,4, патент № 2013147216 от 5.12.2014 г.). (коэффициент 93 Средний возраст женщин с низкой активностью овариальной ароматазы фолликулов составил 25,7±0,6 лет. Индекс массы тела колебался от 14,9 до 42,7 кг/м², составив в среднем 23,7±0,7 кг/м². Избыточная масса тела выявлена у 28% женщин. Признаки андрогензависимой дермопатии проявлялись у 30 (60%) больных основной группы в виде вульгарных угрей. Угревая сыпь I степени тяжести отмечалась у 19 больных, II степени тяжести у 11 больных. Не было выявлено значимой ассоциации между степенью акне и уровнем андрогенов в крови на 2-ой день менструального цикла (r<0,3). Согласно ранее проведенным исследованиям [4] и данным литературы [95], распространенность гирсутизма среди больных СПЯ достигает 70-76,3%. Гирсутное число у женщин с нормогонадотропной ановуляцией и низкой активностью овариальной ароматазы фолликулов в среднем составило 8,8±0,5 и колебалось от 4 до 18. Гирсутизм (гирсутное число >12) наблюдался у 12 (24%) больных. Исследуя зависимость гирсутного числа от уровня андрогенов в сыворотке крови у женщин с дефицитом ароматазы овариальных фолликулов, получены следующие данные: гирсутное число положительно коррелировало с уровнем А4 (r=0,36) и уровнем 17-ОНР (r=0,3) в крови на 2-ой день менструального цикла. Согласно данным литературы [1,3,4,27,136], возраст наступления менархе у больных как НГЭ, так и СПЯ не отличается от данного показателя у здоровых женщин. Возраст менархе в группе женщин с дефицитом ароматазы фолликулов варьировал от 11 до 17 лет и в среднем составил 13,1±0,2 года, что не отличалось от показателя в группе контроля (13,0±0,2 года). Частота альгоменореи у женщин с НГЭ колеблется от 18% до 90% [44, 147,198,209], нарушения менструального цикла в виде перименструальных кровянистых выделений наблюдаются у 27% - 52% больных с эндометриозом яичников [23, 209]. У всех женщин обследуемой нами группы с диагнозом НГЭ (8 женщин) имелись перименструальные кровянистые выделения и альгоменорея. Нарушение менструального цикла по типу опсоменореи наблюдалось у 35 женщин (70%). У 15 женщин менструальный цикл был регулярным. Полученные данные соответствуют данным литературы [28], которые указывают, что 94 нарушение менструального цикла по типу опсоменореи у женщин с нормогонадотропной ановуляцией встречается в 65,8%. Эхографические нормогонадотропной показатели органов недостаточностью малого яичников и таза низкой больных с активностью ароматазы фолликулов также отражали нарушение фолликулогенеза и снижение продукции эстрадиола яичниками. Размеры матки больных основной группы были достоверно (р<0,005) меньше, чем в группе контроля. Пролиферация эндометрия у больных с дефицитом ароматазы фолликулов была замедлена и величина М-эхо в начале цикла была достоверно (р<0,001) ниже, чем у женщин с сохраненным овуляторным циклом. Средний размер фолликулов в яичниках женщин с нормогонадотропной недостаточностью яинчников (3,9±0,01мм) достоверно (p<0,001) меньше, чем в яичниках здоровых женщин (5,3±0,1 мм), кроме того, значимо (p<0,001) меньше максимальный размер фолликула (5,2±0,1 мм) в сравнении с аналогичным показателем у здоровых женщин (7,6±0,1мм). Объем яичников пациенток обследуемой группы был достоверно (p<0,001) больше, чем у женщин группы сравнения и превышал 12 см³. Яичники больных основной группы значимо (p<0,001) отличались наличием множества мелких антральных фолликулов. Не выявлено значимой взаимосвязи между уровнями гормонов в сыворотке крови на 2-й день менструального цикла и толщиной эндометрия на 5-6 день цикла, максимальным размером фолликула и средним размером фолликулов у женщин с дефицитом ароматазы овариальных фолликулов. В результате гормонального обследования больных с нормогонадотропной ановуляций и дефицитом ароматазы фолликулов и женщин контрольной группы отмечено статистически значимое (p<0,05) повышение в сыворотке крови уровня ЛГ, более высокое (p=0,004) соотношение содержания ЛГ/ФСГ (1,2±0,1), чем в группе контроля (0,6±0,1). Эти данные соответствуют данным, полученным ранее в работе, изучающей группу больных с СПЯ, сочетающегося с низкой активностью ароматазы фолликулов [4]. Известно, что ФСГ стимулирует экспрессию овариальной ароматазы [120,121,225,231,257]. В 95 содержании ФСГ в крови женщин сравниваемых групп статистически значимых различий не выявлено (p=0,09). Однако, в группе женщин с дефицитом ароматазы фолликулов имелась тенденция к снижению ФСГ в крови по сравнению со здоровыми женщинами (5,3±0,3 МЕ/л и 5,9 ±0,3 МЕ/л соответственно). Гиперпродукция ЛГ гипофизом при дефиците ароматазы овариальных фолликулов не сопровождалась достоверным повышением среднего уровня андрогенов в крови. Содержание в крови женщин сравниваемых групп свободного и общего тестостерона, андростендиона, ДЭА-сульфата не имело статистически значимых различий (p=0,4; р=0,4; р=0,1 и p=0,9 соответственно). Гиперандрогенемия (повышение А4 и/или свободного тестостерона и/или общего тестостерона в сыворотке крови на 2-й день менструального цикла) выявлена у 23 больных с низкой активностью ароматазы фолликулов (46%). За верхнюю границу нормы принималась верхняя граница доверительного интервала соответствующего значения у здоровых женщин при р=0,05. Уровень 17-гидроксипрогестерона был выше в крови больных с нормогонадотропной недостаточностью яичников по сравнению с аналогичным показателем у здоровых женщин (2,8±0,2 нмоль/л и 1,7±0,1 нмоль/л соответственно, р=0,002). Как уровень эстрадиола (141,9±5,1 пмоль/л), так и уровень эстрона (333,8±24,8 пмоль/л) в крови женщин основной группы статистически значимо не отличался (p=0,6 и р=0,1 соответственно) от аналогичных показателей у женщин группы контроля (144,8±7,9 пмоль/л и 253,6±21,1 пмоль/л соответственно). Некоторыми недостаточной исследователями продукции [18] эстрогенов получены доминантным данные в пользу фолликулом с нормогонадотропной ановуляцией при сохраненном механизме положительной обратной связи между яичниками и гипофизом. Снижение ароматазной активности фолликулов может служить пусковым моментом для увеличения числа антральных фолликулов, направленное на поддержание уровня эстрадиола в крови, препятствующего «растормаживанию» гонадотропной функции 96 гипофиза. Увеличение числа антральных фолликулов сопровождается усилением секреции яичниками АМГ, который способен тормозить овариальную ароматазу [171] и тем самым в еще большей степени нарушать фолликулогенгез и стероидогенез в яичниках. Уровень АМГ в крови больных с нормогонадотропной недостаточностью яичников был повышен и в среднем составил 8,3±0,7 нг/мл (у здоровых женщин – 3,8±0,1 нг/мл, р<0,05). Увеличение содержания в крови АМГ обусловлено усиленной его секрецией гранулезными клетками и увеличением количества антральных фолликулов, что доказывает положительная корреляция между уровнем АМГ в крови и числом антральных фолликулов в яичнике (r=0,46). Согласно данным ранее проведенных исследований [4], повышение содержания в крови АМГ имеется у 85,6% больных СПЯ. Известно, что СПЯ - наиболее распространенное эндокринное заболевание, приводящее к нормогонадотропной недостаточности яичников [110,192]. На основании характерных клинических проявлений (нарушение менструального цикла, гирсутизм, угревая сыпь), данных гормонального обследования (повышенный уровень ЛГ, свободного тестостерона в крови на 2-й день менструального цикла, увеличение соотношения ЛГ/ФСГ), эхографических критериев (увеличение объема яичников более 12 см³, наличие более 10 антральных фолликулов в каждом яичнике) у 56% женщин в группе с низкой активностью ароматазы овариальных фолликулов установлен диагноз СПЯ. У 44% женщин проявления частичного дефицита ароматазы фолликулов не укладывались в диагноз СПЯ: с помощью лапароскопии у десяти пациенток диагностирован НГЭ, у 12 больных диагноз не был верифицирован. Для выявления симптомов, характерных для низкой активности ароматазы овариальных фолликулов, были сопоставлены клинические, эхографические и гормональные признаки больных с СПЯ и больных, не имеющих всех характерных для СПЯ проявлений. Нарушения менструального цикла по типу опсоменореи встречались чаще в группе женщин с СПЯ, чем в группе женщин без проявлений СПЯ, однако, различия не были статистически значимыми (в 82% случаев и в 54,5% случаев соответственно, р>0,05). Гирсутизм и вульгарные угри 97 встречались в обеих подгруппах женщин с частичным дефицитом ароматазы фолликулов. У женщин с диагнозом СПЯ эти клинические проявления встречались чаще, чем у женщин без СПЯ (гирсутизм в 35,7% и 9% случаев соответственно, p=0,04; угревая сыпь в 67,8 и 50% случаев соответственно, p=0,2). В обеих подгруппах больных с частичным дефицитом ароматазы овариальных фолликулов базальный уровень ЛГ в крови и соотношение ЛГ/ФСГ были статистически значимо (p<0,05) выше, чем у женщин контрольной группы. Наиболее высокое содержание эстрадиола и эстрона наблюдалось в группе больных с СПЯ. Содержание эстрона при этом оказалось статистически значимо (р=0,03) выше, чем у здоровых женщин (341,4±27,5 пмоль/л и 253,6±21,1пмоль/л соответственно). Самые высокие значения общего, свободного тестостерона и андростендиона были найдены в группе больных СПЯ. Гиперандрогенемия выявлена у 57,1% женщин этой подгруппы. В подгруппе пациенток, не имеющих проявлений СПЯ, гиперандрогенемия встречалась у 40,9% женщин. Повышение 17-ОНР было статистически значимым (p<0,003) у всех женщин с частичным дефицитом ароматазы фолликулов по сравнению с женщинами контрольной группы (2,9±0,3 нмоль/л у пациенток с СПЯ, 2,6±0,2нмоль/л у женщин, не имеющих проявлений СПЯ и 1,7±0,1нмоль/л у здоровых женщин). Необходимо отметить, что значимых различий в содержании гонадотропинов, эстрогенов и андрогенов между женщинами с диагнозом СПЯ и женщинами без проявлений СПЯ выявлено не было (p>0,05). Самое высокое содержание АМГ оказалось у женщин с диагнозом СПЯ (10,8±1,0 нг/мл), данное значение статистически значимо превышало значение АМГ в подгруппе женщин с низкой активностью ароматазы фолликулов без проявлений СПЯ (5,3±0,6 нг/мл, р<0,001) и среднее значение АМГ у здоровых женщин (3,8±1,1нг/мл, p<0,001). Все женщины с низкой активностью ароматазы овариальных фолликулов имели статистически замедленную значимое пролиферацию (p<0,05) эндометрия, уменьшение уменьшенный максимальный размер фолликула по сравнению со размеров средний матки, и здоровыми женщинами. Объем яичников больных СПЯ превышал 12 см³ и был значимо больше, чем у 98 здоровых женщин (p<0,005) и женщин без проявлений СПЯ (p<0,05). Количество антральных фолликулов в группе женщин с диагнозом СПЯ также было статистически значимо выше, чем в группе здоровых женщин (23,2±0,8 и 13,6±0,5 соответственно, р<0,005) и в группе женщин без проявлений СПЯ (23,2±0,8 и 17,1±0,5 соответственно, p<0,05). Данные ультразвукового исследования органов малого таза женщин с низкой активностью овариальной ароматазы фолликулов позволяют предполагать недостаточную продукцию эстрадиола яичниками. Таким образом, гормональные проанализировав проявления частичного клинические, дефицита ультразвуковые ароматазы и овариальных фолликулов, можно выделить следующие признаки, характеризующие данное состояние: ановуляция и нарушение менстуального цикла по типу опсоменореи, увеличение объема яичников и числа антральных фолликулов в них, уменьшение размеров матки, толщины эндометрия и размеров фолликулов на 5-6 день менструального цикла, повышение уровня ЛГ в крови на 2-й день менструального цикла и соотношения ЛГ/ФСГ, умеренное повышение 17-ОНР в крови на 2-й день менструального цикла и увеличение продукции АМГ яичниками. Гиперандрогенемия и андрогензависимая дермопатия являются частыми (46% и 60% соответственно), но не облигатными проявлениями частичного дефицита ароматазы овариальных фолликулов. Прием 10 мг ингибитора ароматазы летрозола на второй день менструального цикла через 48 часов (на 4-ый день менструального цикла) вызывал статистически значимое снижение уровня эстрогенов и адекватное повышение гонадотропинов в крови как здоровых женщин, так и в группе женщин с нормогонадотропной ановуляцией и низкой активностью ароматазы фолликулов, что соответствует результатам пробы с летрозолом в исследованиях, проведенных разными авторами ранее [3,4,27,36]. Через 48 часов после перорального приема 10 мг летрозола наблюдалось статистически значимое (р<0,01) снижение уровня эстрадиола (на 27,2±4,3% от исходного уровня у здоровых женщин, на 22,5±1,6% от исходного уровня у больных с нормогонадотропной ановуляцией и низкой активностью ароматазы фолликулов ) 99 и повышение гонадотропинов: ФСГ (на 78,4±9,3% здоровых женщин, на 105,4±13,3% от исходного уровня у от исходного уровня у больных с нормогонадотропной ановуляцией и низкой активностью ароматазы фолликулов) и ЛГ (на 152,9±26,3% от исходного уровня у здоровых женщин, на 132,8±25,5% от исходного уровня у больных с нормогонадотропной ановуляцией и низкой активностью ароматазы фолликулов). Повышение уровня свободного тестостерона на фоне приема летрозола в крови женщин в группе с нормогонадотропной ановуляцией и низкой активностью ароматазы фолликулов было более выраженным, чем у здоровых женщин: от 7,0±0,8 пмоль/л до 8,4±1,0 пмоль/л, в среднем на 1,4±0,5 пмоль/л, то есть на 33,7±8,0% от исходного значения (у здоровых женщин – на 0,2±0,4 пмоль/л, на 2,7±8,6%). Уровень 17-ОНР в обеих группах имел статистически значимое (р<0,05) повышение: от 2,8±0,2 нмоль/л до 4,5±0,4нмоль/л, в среднем на 1,7±0,3нмоль/л, на 69,4±10,1% от исходного уровня в группе женщин с частичным дефицитом ароматазы фоликулов; у здоровых женщин уровень 17ОНР повышался в среднем на 0,7±0,2 нмоль/л, на 39,2±9,5%. Cтатистически значимого повышения андростендиона и ДЭА- сульфата на фоне приема 10 мг летрозола отмечено не было (р>0,05). Полученные данные о динамике андрогенов в сыворотке крови на фоне приема летрозола, демонстрирующие их незначительное повышение, не противоречат данным литературы об отсутствии значимого повышения уровня андрогенов на фоне терапии ингибиторами ароматазы [36,109, 187]. Однако, рядом авторов [12,40] при нарушении ароматизации андрогенов в эстрогены наблюдалась гиперандрогенемия. По данным литературы [156,182], продукция андрогенов яичниками зависит от фазы менструального цикла. В ранней фолликулярной фазе продукция андростендиона и тестостерона надпочечниками превышает таковую яичниками, по мере созревания фолликулов андрогены в большем количестве секретируются яичниками [156, 182]. Поскольку проба с летрозолом проводилась со 2 по 4 день менструального цикла, т.е. в фолликулярную фазу, можно предположить, что отсутствие значимого 100 повышения андрогенов обусловлено преимущественно их внегонадным синтезом. Полученное статистически значимое повышение уровня 17-ОНР через 48 часов после приема летрозола соответствует данным ранее проведенных исследований [36]. Известно, что 17-ОНР синтезируется в яичниках и надпочечниках [7]. Нельзя исключить, что при кратковременном блокировании яичников включается компенсаторный механизм синтеза 17-ОНР в надпочечниках. Для определения ароматазной активности антрального фолликула использовался коэффициент ΔЭ2/АМГ (патент № 2013147216 от 5.12.2014 г.), где ΔЭ2 – снижение уровня эстрадиола в крови в пмоль/л через 48 часов после приема летрозола, АМГ – уровень АМГ в крови в нг/мл. Ароматазная активность фолликулов у больных обследуемой группы отрицательно коррелировала с числом антральных фолликулов (r=-0,35). Как уже было сказано, снижение ароматазной активности фолликулов может являться пусковым моментом для увеличения числа антральных фолликулов, направленное на поддержание уровня эстрадиола в крови, препятствующего «растормаживанию» гонадотропной функции гипофиза. Можно предположить, что в группе женщин с дефицитом ароматазы фолликулов, применение ингибиторов ароматазы по схеме стимуляции овуляции не вызовет достаточного повышения внутрифолликулярного уровня андрогенов и, соответственно, не произойдет достаточного усиления сенситизирующего действия андрогенов на ФСГ- рецепторы клеток, то есть не будет достаточного роста фолликулов и созревания ооцита. Учитывая относительно низкое содержание андрогенов в крови больных с низкой ароматазной активностью фолликулов, можно предположить сниженную чувствительность яичников как к ФСГ, так и к ЛГ. Соответственно, вопрос эффективности применения гонадотропинов для стимуляции овуляции у этих больных является открытым и требует дополнительных исследований. Очевидно, что для выбора препарата для стимуляции овуляции, знание о том, какова активность овариальной ароматазы фолликулов, может играть решающую роль. 101 У всех здоровых женщин (n=15) и женщин с нормогонадотропной ановуляцией (n=190) было рассчитано отношение Э2/АМГ (Ка), где Э2- уровень эстрадиола в крови на 2-й день менстуального цикла, пмоль/л; АМГ- уровень АМГ в крови на 2-й день менструального цикла, нг/мл. Определены границы доверительного интервала коэффициента Ка (при р=0,01) у здоровых женщин (n=15): нижний предел-37,8, верхний-90,7. С помощью корреляционного анализа выявлена высокая сила ассоциации (r=0,7) между коэффициентами ΔЭ2/АМГ (К) и Э2/АМГ (Ка) при р=0,01 в группе здоровых женщин. Таким образом, наличие низкой ароматазной активности овариальных фолликулов можно предполагать при показателе коэффициента Ка менее 37,8, нормальной ароматазной активности овариальных фолликулов - при показателе Ка от 37,8 до 90,7, высокой ароматазной активности овариальных фолликулов при значении Ка более 90,7 (заявка на патент №2015145080 от 22.10.15). Соответственно значениям коэффициента Ка, все женщины в группе с нормогонадотропной ановуляцией (n=190) были разделены на три группы: с низкой (75 женщин), нормальной (70 женщин) и высокой (45 женщин) активностью ароматазы овариальных фолликулов. В группе женщин с нормогонадотропной ановуляцией коэффициент корреляции Спирмена (r) между коэфициентами Э2/АМГ и ΔЭ2/АМГ составил 0,9. Учитывая высокую силу ассоциации между коэффициентами ΔЭ2/АМГ и Э2/АМГ у здоровых женщин и женщин с нормогонадотропной ановуляцией (r=0,7 и r=0,9 соответственно), коэффициент Э2/АМГ может быть использован для вычисления ативности ароматазы овариальных фолликулов. Современные достижения молекулярной генетики позволили уточнить функциональную роль ароматазы путем изучения полиморфных вариантов и мутаций гена CYP19A1. Выраженный дефицит ароматазы является очень редким аутосомно-рецессивным заболеванием и к настоящему времени описано менее 20 случаев [48,49,166,247]. Заболевание развивается в результате различных мутаций в кодирующей области гена, что приводит к снижению или потере ферментативной функции, и, как следствие, дефициту эстрогенов. У человека, 102 первый случай дефицита ароматазы был описан в 1991 году [221]. Клиническая картина у больных женского пола (кариотип 46, ХХ) зависит от активности данного фермента и выражается внутриутробной вирилизацией степени тяжести, гипергонадотропным гипогонадизмом, различной недоразвитием вторичных половых признаков, первичной аменореей, бесплодием [221]. У больных с дефицитом ароматазы определяется повышенный уровень гонадотропинов и андрогенов при минимальных значениях эстрогенов в крови, выявляются кистозные изменения в яичниках, прогрессирующая потеря костной массы, а также признаки метаболического синдрома [221]. Помимо генных мутаций CYP19A1, которые встречаются крайне редко, в литературе описаны также его полиморфизмы. Это изменения в последовательности ДНК, которые происходят более чем у 1% населения и вызывают возникновение различных аллельных форм данного гена [6]. Наиболее хорошо исследованы полиморфизмы в интроне IV в виде микросателлитных (TTTA)n повторов, а также полиморфизма ТСТ, обуловленного делецией 3-х нуклеотидов в этом же интроне. К настоящему времени опубликовано множество данных о влиянии этих полиморфизмов на секрецию половых гормонов [194], и, соответственно, на развитие эстроген - зависимых заболеваний, таких как рак молочной железы [122,193], остеопороз [195], рак эндометрия [100], эндометриоз [99], рак предстательной железы и гинекомастия [60]. Имеются работы [101], в которых показано, что больные СПЯ, гомозиготные по коротким аллелям, имеют более высокий коэффициент тестостерон/эстрадиол, более высокий уровень тестостерона в крови и более высокое соотношение ЛГ/ФСГ по сравнению с гомозиготами по длинным аллелям. Определена взаимосвязь полиморфизма гена СУР19 ((ТТТА)n повторы) с минеральной плотностью костной ткани у женщин в пери- и постменопаузальном возрасте. Так, женщины, имеющие в генотипе аллель (TTTA)11 и/или (ТТТА)12, имеют значительно большую минеральную плотность костной ткани и не страдают остеопорозом в отличие от женщин, в генотипе которых имеется меньшее количество (ТТТА) повторов [195]. Результаты этого исследования косвенно свидетельствуют о более высоком 103 уровне эстрогенов в крови женщин, несущих аллель (ТТТА)11 и/или (ТТТА)12. Эстрогены играют существенную роль в развитии синдрома преждевременного полового созревания. При исследовании количества (ТТТА) повторов в группе девочек с данной патологией было выявлено, что аллель (ТТТА)13 встречается только в основной группе и не встречается у здоровых девочек контрольной группы. Носители аллеля (ТТТА)13 имели значительно более высокий уровень эстрогенов в крови. Эти результаты также могут свидетельствовать об ассоциации ароматазной активности с числом повторов (ТТТА) [152]. Аллель (ТТТА)7 гена CYP19 встречается в двух вариантах: стандартном – с наличием тринуклеотида ТСТ на 5'-конце (insertion (Ins)) и в «укороченном» - с отсутствием TCT (deletion (Del)) [26]. Более низкое количество повторов (ТТТА)n генаCYP19, в частности del-(ТТТА)7, ассоциируется с увеличением уровня андрогенов и уменьшением эстрогенов в крови и, возможно, снижением ферментативной активности ароматазы [67]. В нашем исследовании сравнительный анализ частот генотипов и аллелей одного из двух полиморфных вариантов гена CYP19 (del(TCT)) нормогонадотропной между недостаточностью выборками яичников и низкой больных с ароматазной активностью фолликулов и здоровых женщин не выявил достоверных различий. В 2012 г. Савиной В.А. и соавт. [27] не было выявлено ассоциации аллельных вариантов гена ароматазы СУР19 ((ТТТА)nполиморфизм) и (del(TCT)) с развитием СПЯ. Однако в данной работе в группе обследованных женщин с СПЯ учитывалась только общая ароматазная активность яичников, тогда как ароматазная активность отдельных фолликулов не определялась. В нашем исследовании самым частым генотипом по гену CYP19 ((TTTA)n полиморфизм) у больных с низкой ароматазной активностью фолликулов явился: (TTTA)7(TTTA)11 (42%), который у здоровых женщин встречался лишь в 12,8% случаев. Данное различие между сравниваемыми группами было статистически значимым (р=0,0003). Таким образом, в процессе исследования была выделена гуппа больных с нормогонадотропной ановуляцией, сопровождающейся низкой активностью 104 ароматазы фолликулов; определены характерные клинические, гормональные и эхографические признаки полиморфизма гена данного СУР19 состояния. позволяют Найденные предполагать обусловленность частичного дефицита овариальной ароматазы. особенности генетическую 105 ВЫВОДЫ: 1. Дефицит ароматазы антральных фолликулов в начале менструального цикла (до инициации доминантного фолликула) выявляется у 26,3% больных с нормогонадотропной ановуляцией. 2. Наиболее частыми клиническими проявлениями дефицита ароматазы овариальных фолликулов являются: опсоменорея (70%), андогензависимая дермопатия (60 %) и избыточная масса тела (28%). 3. Эхография органов малого таза у больных с дефицитом ароматазы фолликулов на 5-6 день менструального цикла выявляет достоверное увеличение объема яичников, числа в них антральных фолликулов, уменьшение размеров фолликулов, а также достоверное уменьшение толщины эндометрия по сравнению с аналогичными показателями у здоровых женщин. 4. У женщин с нормогонадотропной ановуляцией дефицит ароматазы антральных фолликулов сопровождается повышением ЛГ, АМГ и 17ОНР в сыворотке крови на 2-й день менструального цикла. При этом содержание эстрадиола и ФСГ в сыворотке крови больных с дефицитом ароматазы фолликулов не отличается от соответствующих показателей у здоровых женщин. 5. Гиперандрогенемия и андрогензависимая дермопатия являются частыми (46% и 60% соответственно), но не облигатными проявлениями частичного дефицита ароматазы овариальных фолликулов. 6. Клинические, эхографические и гормональные признаки СПЯ имеются в различных сочетаниях у 56% больных с дефицитом овариальной ароматазы фолликулов. 7. Сохранение физиологического базального уровня эстрогенов в крови больных с дефицитом ароматазы позволяет считать, что увеличение когорты антральных фолликулов направлено на поддержание продукции эстрогенов яичниками в количестве, препятствующем 106 «растормаживанию» гонадотропной функции гипофиза и развитию гипергонадотропной овариальной недостаточности. 8. Снижение эстрадиола в крови больных с дефицитом ароматазы овариальных фолликулов под влиянием ингибитора ароматазы летрозола приводит к усилению гонадотропной функции гипофиза и повышению содержания свободного тестостерона и 17-гидроксипрогестерона в крови. 9. Наиболее частым генотипом по гену CYP19 ((TTTA)n полиморфизм) у больных с низкой ароматазной активностью фолликулов является (TTTA)7(TTTA)11 (42%), встречающийся лишь у 12,8% женщин группы сравнения (р=0,0003), что позволяет предполагать генетическую обусловленность дефицита ароматазы антральных фолликулов. 107 ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ: 1. Основанием фолликулов для оценки является ароматазной ановуляция, активности андрогензависимая овариальных дермопатия, уменьшение размеров матки и уменьшение толщины эндометия (менее 6,1 мм) по данным ультразвукового исследования на 5-6 день менструального цикла. 2. Для оценки ароматазной ативности овариальных фолликулов на 2-ой день менструального цикла целесообразно использовать коэффициент Э2/АМГ, где Э2- уровень эстрадиола в крови в пмоль/л, АМГ-уровень АМГ в крови на 2-й день менструального цикла в нг/мл. У здоровых женщин границы доверительного интервала коэффициента Э2/АМГ при р=0,01 составляют: нижняя-37,8, верхняя-90,7. 108 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Абашова, Е.И. Наружный генитальный эндометриоз и гормональная недостаточность яичников: автореф. дис. … канд. мед. наук / Е.И. Абашова. – СПб., 1999. – 23 с. 2. Айламазян, Э.К. Аутоиммунный оофорит (патогенез, диагностика, перспективы лечения) / Э.К. Айламазян, К.А. Габелова, А.М. Гзгзян // Акушерство и гинекология. – 2002. – № 2. – C. 7-9. 3. Активность овариальной ароматазы при эндометриозе / В.М. Денисова, Потин В.В., Ярмолинская М.И., Тимофеева Е.М.//Журнал акушерства и женских болезней.- 2013.- №2 –С.17- 22. 4. Активность овариальной ароматазы у больных синдромом поликистозных яичников/ И.П. Николаенков, В.В.Потин, М.А.Тарасова [и др.]// Журнал акушерства и женских болезней.-2014.- №1.-С.10-16. 5. Гзгзян, A.M. Аутоиммунный гипогонадизм (патогенез, диагностика, принципы лечения): автореф. дис. … д-ра. мед. наук / А.М. Гзгзян. - СПб., 2007. - 40 с. 6. Генетический паспорт – основа индивидуальной и предиктивной медицины / ред. В.С. Баранов.– СПб.: Н–Л, 2009. – 528 с. 7. Гинекологическая эндокринология / В.Н. Серов [и др.]; ред. Серов В.Н. – М.: Медицина «МЕДпресс-информ», 2004. – 528 с. 8. Гродницкая, Е.Э. Антимюллеров гормон как маркер степени овуляторной дисфункции у женщин с синдромом поликистозных яичников / Е.Э. Гродницкая, М.А. Курцер // Журнал акушерства и женских болезней. - 2012. № 1. - С. 102-105. 9. Дедов, И.И. Сахарный диабет / И.И. Дедов, М.В. Шестакова – М.: Универсум Паблишинг, 2003. – С. 63–772. 10. Диагностика и лечение неклассической формы врожденной гиперплазии коры надпочечников / Э.К. Айламазян, Е.Л. Соболева, В.В. Потин, Н.С. Осиновская // Журнал акушерства и женских болезней. – 2011. – № 1. – С. 8594. 109 11.Долян, Г.Г. Гирсутный синдром у женщин детородного возраста: автореф. дис. … канд.мед.наук /Г. Г. Долян. – СПб., 1981. 12.Зеленина, Н.В. Синдром поликистозных яичников — проявление социальноадаптационного напряжения / Н.В. Зеленина, С.В. Бескровный, О.Л.Молчанов // Российский вестник акушера-гинеколога. – 2012. – № 3. – С. 67–74. 13.Коркина, М.В. Нервная анорекия / М.В. Коркина, И.А. Цивилько, В.А. Марилов. – М.: Медицина, 1986. – 176 с. 14.Мешкова, И.П. Роль аутоантител к ткани яичников и надпочечников в патогенезе нарушений менструального цикла / И.П. Мешкова, О.Р. Григорян, А.В. Зилов // Проблемы репродукции. – 2000. – №5. – С. 34–43. 15.Мутационные нарушения при различных формах ВГКН и особенности молекулярной диагностики дефицита 21-гидроксилазы при стертых формах заболевания / Н.С. Осиновская, Т. Э. Иващенко, Е. Л. Соболева, В. С. Баранов // Медецинская генетика. – 2007. – Т. 6, № 4. – С. 35-41. 16.Ниаури, Д.А. Овариальная недостаточность при хроническом неспецифическом сальпингоофорите /Д.А.Ниаури // Физиология человека.1995.-Т. 21,№3. – С.166. 17.Ниаури, Д.А. Репродуктивное здоровье женщины и недостаточность функции яичников / Д.А. Ниаури, Л.Х. Джемлиханова, А.М. Гзгзян // Журнал акушерства и женских болезней. – 2010. – № 1. – С. 84–90. 18.Нормогонадотропная первично-яичниковая недостаточность / В.В. Потин, В.В. Рулев, Ф.А. Свечникова, Т.Ю. Сиклицкая, Х. Кбейли // Проблемы эндокринологии. – 1990. – Т. 36, №. 4. – С. 83-87. 19.Ожирение и гормональная функция яичников / Е.В. Мишарина, В.В. Потин, А.В. Тиселько, Н.В. Боровик // Эфферентная терапия. - 2007. – Т. 13, №1. - С. 42-45. 20.Ожирение и репродуктивная система женщины: пособие для врачей / Е. В. Мишарина [и др.]; ред. Э. К. Айламазян. — СПб., 2010. — 68 с. 21.Патогенез гормональной недостаточности яичников у женщин с первичным гипотиреозом / Н. Н. Ткаченко, В.В. Потин, С. В. Бескровный [и др.] 110 //Вестник Российской ассоциации акушеров-гинекологов. – 1997. - №3. – С. 37-40. 22. Патогенез нормогонадотропной ановуляции / Э.К. Айламазян, В.В. Потин, Ф.А. Свечникова [и др.] // Вестник Российской ассоциации акушеровгинекологов. – 1994. - № 1. – С. 46-55. 23.Печеникова, В.А. Эндометриоидная болезнь: вопросы патогенеза, клиники, диагностики и лечения: автореф. дис. … д-ра мед. наук / В.А. Печеникова. – СПб., 2011 – 40 с. 24.Потин, В.В. Патогенез и диагностика аутоиммунного оофорита / В.В. Потин, Е.Е. Смагина, А.М. Гзгзян // Журнал акушерства и женских болезней. – 2000. - №2. - С. 59–66. 25.Применение ингибитора ароматазы летрозола для индукции овуляции у женщин с синдромом поликистозных яичников/ А.З. Морчиладзе, В.А. Савина, Н.Н. Ткаченко, М.И. Ярмолинская // Журнал акушерства и женских болезней.-2011.-№2.-С.52-57. 26.Савина, В.А. Аллельные варианты гена СУР19 (ароматазы р450) и активность ароматазы р450 у больных с синдромом поликистозных яичников / В.А. Савина, Н.Ю. Швед, В.В. Потин // Медицинская генетика. – 2012. - № 4. – С. 36-41. 27.Савина, В.А. Роль ароматазы Р450 в патогенезе синдрома поликистозных яичников: автореф. дис. … канд. мед. наук / В.А. Савина. – СПб., 2012. 28. Седнева, С.А. Негормональные методы лечения нарушений менструальной функции у женщин с нормогонадотропной недостаточностью яичников: автореф. дис. … канд.мед.наук / С. А. Седнева. - Волгоград, 2005.-22с. 29.Синдром поликистозных яичников: руководство для врачей / ред. И.И. Дедов, Г.А. Мельниченко. – М.: МИА, 2007. – 368 с. 30.Смагина, Е.Е. Роль аутоиммунных процессов в патогенезе нормогонадотропной недостаточности яичников: автореф. дис... канд. мед. наук. / Е.Е. Смагина. – СПб., 1995. - 19 с. 111 31.Соболева, Е.Л. Гирсутизм: пособие для врачей / Е.Л. Соболева, В.В. Потин, М.А. Тарасова; ред. Э.К. Айламазян. – СПб., 2007. – 50 с. 32.Соболева, Е.Л. Дифференциальная диагностика и патогенетическая терапия врожденной гиперплазии коры надпочечников и синдрома поликистозных яичников: автореф. дис. … д-ра. мед. наук / Е.Л. Соболева. – СПб., 2011. – 41 с. 33.Соболева, Е.Л. Синдром поликистозных яичников / Е.Л. Соболева // Signatura. – 2007. - № 2. – С. 41-45. 34.Современные проблемы наружного генитального эндометриоза / А.И. Ищенко, Е.А. Кудрина, И.В. Станоевич [и др.] // Акушерство и гинекология. 2007. - № 5. - С. 67-73. 35.Сухих, Г.Т. Бесплодный брак. Современные подходы к диагностике и лечению / Г.Т.Сухих, Т.А. Назаренко. - М.: «ГЭОТАР – Медиа», 2010. - 548с. 36.Тимофеева, Е.М. Клинико-лабораторная оценка ароматазной активности яичников женщин репродуктивного возраста: автореф. дис. … канд. мед. наук / Е. М. Тимофеева. - СПб., 2015.- 19с. 37.Тохунц, К.А. Клинико-лабораторные нормогонадотропной яичниковой характеристики недостаточностью, у больных с обусловленной дефицитом массы тела / К.А. Тохунц // Вестник новых медицинских технологий. – 2008. – Т. 15, № 1. – С. 46. 38.Царегородцева, М.В. Патогенетические аспекты формирования аутоиммунного оофорита при хронических воспалительных заболеваниях органов малого таза и его восстановительная терапия / М.В. Царегородцева // АГ-инфо. – 2007. – №1. – С. 32-36. 39.Царегородцева, реабилитационные М.В. аспекты Этиопатогенетические, аутоиммунного оофорита клинические и воспалительного генеза: автореф. дис. … д-ра. мед. наук / М.В. Царегородцева. - М., 2010. - 41 с. 40. Шаргородская, А.В. Синдром овариальной гиперандрогении неопухолевого генеза / А.В. Шаргородская // Эндокринология. – 2006. – № 1. – С.15. 112 41.Щитовидная железа и репродуктивная система женщины: пособие для врачей / В. В. Потин, А. Б. Логинов, И. О. Крихели [и др.]; ред. Э. К. Айламазян. – СПб., 2008.- 44 с. 42.Экспрессия ароматазы цитохрома Р-450 в эктопическом и эутопическом эндометрии при эндометриозе / О.В. Зайратьянц, Л.В. Адамян, М.М. Сонова [и др.] // Архив патологии. — 2008. — Т. 70, №. 5. — С. 16—19. 43.Эпидемиологические аспекты генитального эндометриоза / В.А. Линде, Н.А. Татарова, Н.Е. Лебедева [и др.] // Проблемы репродукции. - 2008. - Т. 14, № 3. - С. 68-72. 44. Ярмолинская, М.И. Генитальный эндометриоз: влияние гормональных, иммунологических и генетических факторов на развитие, особенности течения и выбор терапии: автореф. дис. … д–ра. мед. наук / М.И. Ярмолинская. – СПб., 2009. – 40 с. 45.Ярмолинская, М.И. Наружный генитальный эндометриоз: пособие для врачей / ред. Э.К. Айламазян. – СПб.: Изд-во Н-Л., 2010. – 84 с. 46. A detailed investigation of hirsutism in a Turkish population: idiopathic hyperandrogenemia as a perplexing issue /K. Unluhizarci, C. Gokce H. Atmaca, F. Bayram, F. Kelestimur // Exp. Clin. Endocrinol. Diabetes. – 2004.- Vol.112, N.9. – P.504-509. 47. A new SNP in a negative regulatory region of the CYP19A1 gene is associated with lumbar spine BMD in postmenopausal women / A. Enjuanes, N. Garcia-Giralt, A. Supervia [et al.] // Bone. – 2006. – Vol. 38. – P. 738–743. 48. A novel compound heterozygous mutation of the aromatase gene in an adult man: reinforced evidence on the relationship between congenital oestrogen deficiency, adiposity and the metabolic syndrome / L. Maffei, V. Rochira, L. Zirilli [et al.] // Clin. Endocrinol.– 2007. – Vol. 67. – P. 218–224. 49. A novel mutation in the human aromatase gene: insights on the relationship among serum estradiol, longitudinal growth and bone mineral density in an adult man under estrogen replacement treatment / F. Lanfranco, L. Zirilli, M. Baldi [et al.] // Bone. – 2008. – Vol. 43. – P. 628–635. 113 50. A simple screening approach for assessing community prevalence and phenotype of polycystic ovary syndrome in a semi-urban population in Sri Lanka / V. Kumarapeli, A. Seneviratne Rde, C.N. Wijeyaratne [et al.] // Am. J. Epidemiol. – 2008. – Vol. 168. – P. 321–328. 51.Abbott, D.H. Fetal, infant, adolescent and adult phenotypes of polycystic ovary syndrome in prenatally androgenized female rhesus monkeys / D.H. Abbott, A. F. Tarantal, D. A. Dumesic // Am. J. Primatol. – 2009. – Vol.71. – P. 776–784. 52. Abnormal epigenetic signature in eutopic endometrium of subjects with severe endometriosis / S. Houshdaran, Z. Zelenko, J.S. Tamaresis [et al.] // Reprod. Sci. – 2011. – Vol. 18. – P. 191. 53.Ackerman, C.M. SHBG (TAAAA)n is associated with serum SHBG in a PCOS case-control cohort / C.M. Ackerman, O.A. Garcia, R.S. Legro // Endocr. Rev. – 2011. – Vol.32. – P. 2–66. 54.Amsterdam ESHRE/ASRM-Sponsored 3rd PCOS Consensus Workshop Consensus on women's health aspects of polycystic ovary syndrome (PCOS) // Hum. Reprod. – 2012. – Vol.27. – P. 14–24. 55. Analysis of follicular fluid and serum markers of oxidative stress in women with infertility related to endometriosis / L. Prieto, J.F. Quesada, O. Cambero [et al.] // Fertil. Steril. – 2012. – Vol. 98, N. 1. – P. 126-30. 56. Analysis of follicular fluid retinoids in women undergoing in vitro fertilization: retinoic acid influences embryo quality and is reduced in women with endometriosis / S.A. Pauli, D.R. Session, W. Shang [et al.] // Reprod. Sci. – 2013. – Vol. 20, N. 9. – P. 1116-24. 57.Aromatase-deficient (ArKO) mice accumulate excess adipose tissue / M.E. Jones, A.W. Thorburn, K.L. Britt [et al.] // J. Steroid. Biochem. Mol. Biol. – 2001. – Vol. 79. – P. 3–9. 58. Aromatase gene and osteoporosis: relationship of ten polymorphic loci with bone mineral density / J.A. Riancho, M.T. Zarrabeitia, C. Valero [et al.] // Bone. – 2005. – Vol. 36. – P. 917–925. 114 59. Aromatase expression in endometriosis/ Noble L.S., Simpson E.R., A.Johns, S.E. Bulun // J. Clin. Endocrinol. Metab.-1996.-Vol.81,N.1.-P.174-9. 60. Association between gynecomastia and aromatase (CYP19) polymorphisms / I. Czajka-Oraniec, W. Zgliczynski, A. Kurylowicz [et al.] // Eur. J. Endocrinol. – 2008. – Vol. 158. – P. 721–727. 61. Association of aromatase (CYP19) gene variation with features of hyperandrogenism in two populations of young women / C.J. Petry, K.K. Ong, K.F. Michelmore [et al.] // Hum. Reprod. – 2005. – Vol. 20. – P. 1837–43. 62. Association of the CYP17 gene and CYP19 gene polymorphisms with risk of endometriosis in Japanese women / N. Kado, J. Kitawaki, H. Obayashi [et al.] // Hum. Reprod. – 2002. – Vol. 17, N. 4. – P. 897-902. 63. Association of the steroid synthesis gene CYP11a with polycystic ovary syndrome and hyperandrogenism / N. Gharani, D.M. Waterworth, S. Batty [et al.] // Hum. Mol. Genet. – 1997. – Vol. 6, N. 3. – P. 397-402. 64. Augoulea, A. Pathogenesis of endometriosis: the role of genetics, inflammation and oxidative stress / A. Augoulea, A. Alexandrou, M. Creatsa // Arch. Gynecol. Obstet. – 2012. – Vol.286, N 1. – P. 99-103. 65. Azziz, R. Polycystic ovary syndrome: an ancient disorder? / R. Azziz, D. Dumesic, M. Goodarzi // Fertil. Steril. – 2011. – Vol.95. – P. 1544–1548. 66. Baggett, B. The conversion of testosterone-3-C14 to C14-estradiol-17_ by human ovarian tissue / B. Baggett, R.I. Dorfman, L.L. Engel // J. Biol. Chem. – 1956. – Vol. 221. – P. 931–941. 67. Baghaei, F. The CYP19 gene and associations with androgens and abdominal obesity in premenopausal women / F. Baghaei, R. Rosmond, L. Westberg // Obes. Res. – 2003. – Vol.11. – P. 578–85. 68. Baptiste, C.G. Insulin and hyperandrogenism in women with polycystic ovary syndrome / C.G. Baptiste, M.C. Battista, A. Trottier // J. Steroid. Biochem. Mol. Biol. – 2010. – Vol. 122, N 1-3. – P. 42-52. 69. Barber, T.M. Genetics of polycystic ovary syndrome / T.M. Barber, S. Franks // Front Horm. Res. – 2013. – Vol. 40. – P. 28-39. 115 70. Barbosa, M.A. The impact of endometriosis and its staging on assisted reproduction outcomes: a systematic review and meta-analysis / M.A. Barbosa, D.M. Teixeira, P.A. Navarro // Ultrasound Obstet. Gynecol. – 2014. – Vol. 17. – P. 46-56. 71. Barthelmess, E.K. Polycystic ovary syndrome: current status and future perspective / E.K. Barthelmess, R.K. Naz // Front Biosci. – 2014. – Vol. 1, N. 6. – P. 104-19. 72. Ben-Shlomo, I. Basic research in PCOS: are we reaching new frontiers? / I. Ben-Shlomo, J.S.Younis // Reprod. Biomed. Online. – 2014. – Vol. 28, N. 6. – P. 669-83. 73. Bomba, M. Psychopathological traits of adolescents with functional hypothalamic amenorrhea: a comparison with anorexia nervosa / M. Bomba, F. Corbetta, L. Bonini // Eat. Weight. Disord. – 2014. – Vol. 19, N. 1. – P. 41-8. 74. Bone phenotype of the aromatase deficient mouse / O.K. Oz, G. Hirasawa, J. Lawson [et al.] // J. Steroid. Biochem. Mol. Biol. – 2001. – Vol. 79. – P. 49–59. 75. Britt, K.L. An age-related ovarian phenotype in mice with targeted disruption of the Cyp 19 (aromatase) gene / K.L. Britt, A.E. Drummond, V.A. Cox // Endocrinology. – 2000. – Vol. 141. – P. 2614–23. 76. Brodie, H.J. Studies on the mechanism of estrogen biosynthesis. VI. The stereochemistry of hydrogen elimination at C-2 during aromatization / H.J. Brodie, K.J. Kripalani, G. Possanza // J. Am. Chem. Soc. – 1969. – Vol. 91. – P. 1241– 1242. 77. Brodie, H.J. The stereochemical course of catalytic hydrogenation of ring A unsaturated steroids / H.J. Brodie, M. Hayano, M. Gut // J. Am. Chem. Soc. – 1962. – Vol. 84. – P. 3766–3767. 78. Brosens, I. Endometriosis, a modern syndrome / I. Brosens, G. Benagiano // Indian J. Med. Res. – 2011. – Vol. 133. – P. 581-93. 79. Brown, A.J. Effects of Exercise on Lipoprotein Particles in Women with Polycystic Ovary Syndrome / A.J. Brown, T.L. Setji, L.L. Sanders // Med. Sci. Sports Exerc. – 2009. – Vol. 41. – P. 497-504. 116 80. Bulun, S.E. Organization of the human aromatase p450 (CYP19) gene / S.E. Bulun, K. Takayama, T. Suzuki // Semin. Reprod. Med. – 2004. – Vol. 22, N. 1. – P. 5-9. 81. Bulun, S.E. The human CYP19 (aromatase P450) gene: update on physiologic roles and genomic organization of promoters / S.E. Bulun, S. Sebastian, K.Takayama // J. Steroid Biochem. Mol. Biol. – 2003. – Vol. 86. – P. 219–224. 82. Burney, R.O. Pathogenesis and pathophysiology of endometriosis / R.O. Burney, L.C. Giudice // Fertil. Steril. – 2012. – Vol. 98, N. 3. – P.511-9. 83. Butenandt, A. Uber“Progynon”ein krystallisiertes weibliches sexual hormon / A. Butenandt // Die Naturwissenschaften. – 1929. – Vol. 17. – P. 879. 84. Calpain 10 gene single-nucleotide 44 polymorphism may have an influence on clinical and metabolic features in patients with polycystic ovary syndrome / M. Yilmaz, E. Yurtcu, H. Demirci [et al.] // J. Endocrinol. Invest. – 2009. – Vol. 32. – P. 13–7. 85. Carmina, E. Obesity, adipokines and metabolic syndrome in polycystic ovary syndrome / E. Carmina // Front Horm. Res. – 2013. – Vol. 40. – P. 40-50. 86.Carmina, E. The diagnosis of polycystic ovary syndrome in adolescents / E. Carmina, S.E. Oberfield, R.A. Lobo // Am. J. Obstet. Gynecol. – 2010. – Vol. 203. – P.201. 87.Carvalho, L.F. From conception to birth - how endometriosis affects the development of each stage of reproductive life / L.F. Carvalho, R. Rossener, A. Azeem // Minerva Ginecol. – 2013. – Vol. 65, N. 2. – P.181-98. 88. Catteau-Jonard, S. Pathophysiology of polycystic ovary syndrome: the role of hyperandrogenism / S. Catteau-Jonard, D. Dewailly // Front Horm. Res. – 2013. – Vol. 40. – P. 22-7. 89. Chen, C. Sex hormone-binding globulin genetic variation: associations with type 2 diabetes mellitus and polycystic ovary syndrome / C. Chen, J. Smothers, A. Lange // Minerva Endocrinol. – 2010. – Vol. 35, N. 4. – P. 271-80. 117 90. Chen, J. The correlation of aromatase activity and obesity in women with or without polycystic ovary syndrome / J. Chen, S. Shen, Y. Tan // J. Ovarian Res. – 2015. – Vol. 8, N. 1. – P. 11-21. 91. Chen, Z.J. Polycystic ovary syndrome / Z.J. Chen, Y. Shi // Front Med. China. – 2010. – Vol. 4, N. 3. – P. 280-284. 92. Cheng, Q. Oxidation of dihydrotestosterone by human cytochromes P450 19A1 and 3A4 / Q. Cheng, C.D. Sohl, F.K.Yoshimoto // J. Bio. Chem. – 2012. – Vol. 287, N. 35. – P. 29554-29567. 93. Ciaraldi, T.P. Polycystic ovary syndrome is associated with tissue-specific differences in insulin resistance / T.P. Ciaraldi, V. Aroda, S. Mudaliar // J. Clin. Endocrinol. Metab. – 2009. – Vol. 94. – P. 157–163. 94. Congenital adrenal hyperplasia due to steroid 21-hydroxylase deficiency: an Endocrine Society clinical practice guideline / P.W. Speiser, R. Azziz, L.S. Baskin [et al.] // J. Clin. Endocrinol. Metab. – 2010. – Vol. 95, N. 9. – P. 4133-4160. 95. Consensus on women's health aspects of polycystic ovary syndrome // Hum. Reprod. – 2012. – Vol.27, N 1. – P. 14-24. 96. Corbett, S. The Polycystic Ovary Syndrome and recent human evolution / S. Corbett, L. Morin-Papunen // Mol. Cell Endocrinol. – 2013. – Vol. 373, N. 1-2. – P. 39-50. 97. Corbin, C.J. Isolation of a full length cDNA insert encoding human aromatase system cytochrome P-450 and its expression in non-steroidogenic cells / C.J. Corbin, S. Graham-Lorence, M. McPhaul // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. – 1988. – Vol. 85. – P. 8948–8952. 98. Couse, J.F. Estrogen receptor-β is critical to granulosa cell differentiation and the ovulatory response to gonadotropins / J.F. Couse, M.M. Yates, B.J. Deroo // Endocrinology. – 2005. – Vol. 146. – P. 3247–62. 99. CYP1A1, CYP19, and GSTM1 polymorphisms increase the risk of endometriosis / D.A. Arvanitis, G.E. Koumantakis, A.G. Goumenou [et al.] // Fertil. Steril. – 2003. – Vol. 79. – P. 702–709. 118 100. CYP19 (aromatase) haplotypes and endometrial cancer risk / R.A. Paynter, S.E. Hankinson, G.A. Colditz [et al.] // Int. J. Cancer. – 2005. – Vol. 116. – P. 267– 274. 101. CYP19 gene: a genetic modifier of polycystic ovary syndrome phenotype / N. Xita, L. Lazaros, I. Georgiou [et al.] // Fertil. Steril. – 2010. – Vol. 94, N. 1. – P. 250-254. 102. Czajka-Oraniec, I. Aromatase research and its clinical significance / I. CzajkaOraniec, E.R. Simpson // Endokrynol. Pol. – 2010. – Vol. 61, N. 1. – P. 126-134. 103. Degree of facial and body terminal hair growth in unselected black and white women: toward a populational definition of hirsutism / C.M. DeUgarte, K.S. Woods, A.A. Bartolucci [et al.] // J. Clin. Endocrinol. Metab. – 2006. – Vol. 91. – P. 1345–1350. 104. Di Nardo, G. Human aromatase: perspectives in biochemistry and biotechnology / G. Di Nardo, G. Gilardi // Biotechnol. Appl. Biochem. – 2013. – Vol. 60, N. 1. – P. 92-101. 105. Diamanti-Kandarakis, E. Phenotypes and enviromental factors: their influence in PCOS / E. Diamanti-Kandarakis, C. Christakou, E. Marinakis // Curr. Pharm. Des. – 2012. – Vol. 18, N. 3. – P. 270-282. 106. Díaz-Fontdevila, M. Cumulus cell apoptosis changes with exposure to spermatozoa and pathologies involved in infertility / M. Díaz-Fontdevila, R. Pommer, R.Smith // Fertil, Steril. – 2009. - Vol. 91. – P. 2061–2068. 107. Dominant transmission of prepubertal gynecomastia due to serum estrone excess: hormonal, biochemical, and genetic analysis in a large kindred / G. Binder, D.I. Iliev, A. Dufke [et al.] // J.Clin. Endocrinol. Metab. – 2005. – Vol. 90. – P. 484–92. 108. Donadeu, F.X. The differential effects of the gonadotropin receptors on aromatase expression in primary cultures of immature rat granulosa cells are highly dependent on the density of receptors expressed and the activation of the inositol phosphate cascade / F.X. Donadeu, M. Ascoli // Endocrinology. – 2005. – Vol. 146. – P. 3907–3916. 119 109. Double-blind, randomised, multicentre endocrine trial comparing two letrozole doses, in postmenopausal breast cancer patients / E. Bajetta, N. Zilembo, M. Dowsett [et al.] // Eur. J. Сancer. – 1999. – Vol. 35. – P. 208–213. 110. Dumitrescu, R. The Polycystic Ovary Syndrome: An update on metabolic and hormonal mechanisms / R. Dumitrescu, C. Mehedintu, I. Briceag // J. Med. Life. – 2015. – Vol. 8, N. 2. – P. 142-145. 111. Ebejer K. The role of cytokines in polycystic ovarian syndrome / K. Ebejer, J. Calleja-Agius // Gynecol. Endocrinol.- 2013.-Vol. 29, N.6.-P.536-540. 112. Ebrahimi, M. Pathogenesis and causes of premature ovarian failure: an update / M. Ebrahimi, F. Akbari Asbagh // Int. J. Fertil. Steril. – 2011. – Vol.5, N. 2. – P. 54-65. 113. El-Hefnawy, T. Synergism between FSH and activin in the regulation of proliferating cell nuclear antigen (PCNA) and cyclin D2 expression in rat granulosa cells / T. El-Hefnawy, A.J. Zeleznik // Endocrinology. – 2001. – Vol. 142. – P. 4357–4362. 114. Elvin, J.A. Molecular characterization of the follicle defects in the growth differentiation factor 9-deficient ovary / J.A. Elvin, C. Yan, P. Wang // Mol. Endocrinol. – 1999. – Vol. 13. – P. 1018–1034. 115. ESHRE Capri Workshop Group. Nutrition and reproduction in women /ESHRE Capri Workshop Group // Hum. Reprod. Update. – 2006. – Vol. 12, N. 3. – P. 193-207. 116. Familial hyperestrogenism in both sexes: clinical, hormonal, and molecular studies of two siblings / R.M. Martin, C.J. Lin, M.Y. Nishi [et al.] // J. Clin. Endocrinol. Metab. – 2003. – Vol. 88. – P. 3027–3034. 117. Ferriman, D. Clinical assessment of body hair growth in women / D.Ferriman, J.D. Gallwey // J. Clin. Endocrinol. Metabol. – 1961. — Vol. 21. – P. 1440–1447. 118. Fisher, C.R. Characterization of mice deficient in aromatase (ArKO) because of targeted disruption of the cyp19 gene / C.R. Fisher, K.H. Graves, A.F. Parlow // Proc. Natl. Acad .Sci. U S A. – 1998. – Vol. 95. – P. 6965–6970. 120 119. Fitzpatrick, S.L. Expression of aromatase in the ovary: down-regulation of mRNA by the ovulatory luteinizing hormone surge / S.L. Fitzpatrick, D.L. Carlone, R.L. Robker // Steroids. – 1997. – Vol. 62. – P. 197–206. 120. Fitzpatrick, S.L. Identification of a cyclic adenosine 3′,5′-monophosphate- response element in the rat aromatase promoter that is required for transcriptional activation in rat granulosa cells and R2C leydig cells / S.L. Fitzpatrick, J.S. Richards // Mol. Endocrinol. – 1994. – Vol. 8. – P. 1309–19. 121. Fitzpatrick, S.L. Regulation of cytochrome P450 aromatase messenger ribonucleic acid and activity by steroids and gonadotropins in rat granulosa cells / S.L. Fitzpatrick, J.S. Richards // Endocrinology. – 1991. – Vol. 129. – P. 1452–62. 122. Genetic variants of CYP19 (aromatase) and breast cancer risk / V.N. Kristensen, N. Harada, N. Yoshimura [et al.] // Oncogene. – 2000. – Vol. 19. – P. 1329–1333. 123. Genetic variation in exon 17 of INSR is associated with insulin resistance and hyperandrogenemia among lean Indian women with polycystic ovary syndrome / S. Mukherjee, N. Shaikh, S. Khavale [et al.] // Eur. J. Endocrinol. – 2009. – Vol. 160. – P. 855–62. 124. Gennari, L. Aromatase activity and bone loss / L. Gennari, D. Merlotti, R. Nuti // Adv. Clin. Chem. – 2011. – Vol. 54. – P. 129-64. 125. Glintborg, D. Impaired insulin activation and dephosphorylation of glycogen synthase in skeletal muscle of women with polycystic ovary syndrome is reversed by pioglitazone treatment / D. Glintborg // J. Clin. Endocrinol. Metab. – 2008. – Vol. 93. – P. 3618–3626. 126. Goodarzi, M.O. DHEA, DHEAS and PCOS / M.O. Goodarzi, E. Carmina, R. Azziz // J. Steroid. Biochem. Mol. Biol. – 2015. – Vol. 145. – P. 213-25. 127. Goodarzi, M.O. Variants in the 5alpha-reductase type 1 and type 2 genes are associated with polycystic ovary syndrome and the severity of hirsutism in affected women / M.O. Goodarzi, N.A. Shah, H.J. Antoine // J. Clin. Endocrinol. Metab. – 2006. – Vol. 91. – P. 4085–4091. 121 128. Gronier, H. Impact of thyroid function on fertility / H. Gronier, C. Sonigo, L. Jacquesson // Gynecol. Obstet. Fertil. – 2015. – Vol. 43, N. 3. – P. 225-233. 129. Guigon, C.J. Unaltered development of the initial follicular waves and normal pubertal onset in female rats after neonatal deletion of the follicular reserve / C.J. Guigon, S. Mazaud, M.G. Forest // Endocrinology. – 2003. – Vol. 144. – P. 3651–3662. 130. Guo, S.W. Epigenetics of endometriosis / S.W. Guo // Mol. Hum. Reprod. – 2009. – Vol. 15. – P. 587–607. 131. Gut, M. Some aspects of stereoselectivity in the introduction of tritium into steroids /M. Gut // The 5th Annual Symposium on Advances in Tracer Methodology. — Washington DC: Plenum Press, 1962. 132. Harada, N. Genetic studies to characterise the origin of the mutation in placental aromatase deficiency / N. Harada, H. Ogawa, M. Shozu // Am. J. Hum. Genet. – 1992. – Vol. 51. – P. 666–667. 133. Harada, N. Tissue specific expression of the human aromatase cytochrome P-450 gene by alternative use of multiple exons 1 and promoters, and switching of tissue-specific exons in carcinogenesis / N. Harada, T. Utsumi, Y. Takagi // Proc. Natl Acad. Sci. USA. – 1993. – Vol. 90. – P. 11312–11316. 134. Hewitt, K.N. Estrogen replacement reverses the hepatic steatosis phenotype in the male aromatase knockout mouse / K.N. Hewitt, K. Pratis, M.E. Jones // Endocrinology. – 2004. – Vol. 145. – P. 1842–184. 135. Hickey, G.J. Aromatase cytochrome P450 in rat ovarian granulosa cells before and after luteinization: adenosine 3′,5′-monophosphate-dependent and independent regulation. Cloning and sequencing of rat aromatase cDNA and 5′ genomic DNA / G.J. Hickey, J.S. Krasnow, W.G. Beattie // Mol. Endocrinol. – 1990. – Vol. 4. – P. 3–12. 136. Hickey, M. Menstrual disorders in adolescence: investigation and management / M. Hickey, A. Balen // Hum. Reprod. Update. – 2003. – Vol. 9, N 5. – P. 493 – 504. 122 137. Human aromatase: gene resequencing and functional genomics / C.X. Ma, A.A. Adjei, O.E. Salavaggione [et al.] // Cancer Res. – 2005. – Vol. 65. – P. 11071–11082. 138. Hunzicker-Dunn, M. FSH signaling pathways in immature granulosa cells that regulate target gene expression: Branching out from protein kinase A / M. Hunzicker-Dunn, E.T. Maizels // Cell Signal. – 2006. – Vol. 18. – P. 1351–1359. 139. Hypothalamic-pituitary-ovarian axis during infancy, early and late prepuberty in an aromatase-deficient girl who is a compound heterocygote for two new point mutations of the CYP19 gene / A. Belgorosky, C. Pepe, R. Marino [et al.] // J. Clin. Endocrinol. Metab. – 2003. – Vol. 88. – P. 5127–5131. 140. Influence of CYP19A1 polymorphisms on the treatment of breast cancer with aromatase inhibitors: a systematic review and meta-analysis/ O. Artigalás, T. Vanni , M. H. Hutz , P. Ashton-Prolla, I. V. Schwartz // BMC Medicine .-2015.-Vol. 13. — P.139. 141. Insenser, M. Proteomics and polycystic ovary syndrome / M. Insenser, H.F. Escobar-Morreale // Expert Rev. Proteomics. – 2013. – Vol. 10, N. 5. – P. 435-447. 142. Jacob, S. Autoimmune oophoritis: A rarely encountered ovarian lesion / S. Jacob, M. Koc // Indian J. Pathol. Microbiol. – 2015. – Vol. 58, N. 2. – P. 249-251. 143. Jin, J.L. Association between CYP19 gene SNP rs2414096 polymorphism and polycystic ovary syndrome in Chinese women / J.L. Jin, J. Sun, H.J. Ge // BMC Med. Genet. – 2009. – Vol. 10. – P. 139. 144. Kim, J.J. Dyslipidemia in women with polycystic ovary syndrome / J.J. Kim, Y.M. Choi // Obstet. Gynecol. Sci. – 2013. – Vol. 56, N. 3. – P. 137-142. 145. Kosova, G. Genetics of the polycystic ovary syndrome / G. Kosova, M. Urbanek // Mol. Cell. Endocrinol. – 2013. – Vol. 373, N. 1-2. – P. 29-38. 146. Krikun, G. Endometriosis, angiogenesis and tissue factor / G. Krikun // Scientifica. – 2012. – Vol. 12. – P. 306-330. 147. Lag time between onset of symptoms and diagnosis of endometriosis / T.M.V. Santos, A.M.G. Pereira, R.G.C. Lopes [et al.] // Einstein. – 2012. – Vol. 10, N 1. – P. 39 – 43. 123 148. La Marca, A. Primary ovarian insufficiency: autoimmune causes / A. La Marca, A. Brozzetti, G. Sighinolfi // Curr. Opin. Obstet. Gynecol. – 2010. – Vol. 22, N. 4. – P. 277-82. 149. Lakkakula, B.V. Genetic variants associated with insulin signaling and glucose homeostasis in the pathogenesis of insulin resistance in polycystic ovary syndrome: a systematic review / B.V. Lakkakula, M. Thangavelu, U.R. Godla // J. Assist. Reprod. Genet. – 2013. – Vol. 30, N. 7. – P. 883-895. 150. Layman, L.C. The genetic basis of female reproductive disorders: etiology and clinical testing / L.C. Layman // Mol. Cell. Endocrinol. – 2013. – Vol. 370, N. 1-2. – P. 138-48. 151. Lazaros, L. CYP19 gene variants affect the assisted reproduction outcome of women with polycystic ovary syndrome / L. Lazaros, N. Xita, E. Hatzi // Gynecol. Endocrinol. – 2013. – Vol. 29, N. 5. – P. 478-482. 152. Lee, H.S. Association of aromatase (TTTA)n repeat polymorphisms with central precocious puberty in girls. / H.S. Lee, K.H. Kim, J.S. Hwang // Clin. Endocrinol. – 2014. – Vol. 81, N. 3. – P. 395-400. 153. Liu, H. Is abnormal eutopic endometrium the cause of endometriosis? The role of eutopic endometrium in pathogenesis of endometriosis / H. Liu, J.H. Lang // Med. Sci. Monit. – 2011. – Vol. 17, N. 4. – P. 92-99. 154. Liu, X.J. Development of specific antibodies to rat insulin-like growth factor-binding proteins (IGFBP-2 to -6): analysis of IGFBP production by rat granulosa cells / X.J. Liu, M. Malkowski, Y. Guo // Endocrinology. – 1993. – Vol. 132. – P. 1176–1183. 155. Livadas, S. Polycystic ovary syndrome: definitions, phenotypes and diagnostic approach / S. Livadas, E. Diamanti-Kandarakis // Front. Horm. Res. – 2013. – Vol. 40. – P. 1-21. 156. Longcope, C. Adrenal and gonadal androgen secretion in normal females /C. Longcope // J. Clin. Endocrinol. Metab. – 1986. – Vol. 15, N. 2. – P. 213–228. 124 157. Macer, M.L. Endometriosis and infertility: a review of the pathogenesis and treatment of endometriosis-associated infertility / M.L. Macer, H.S. Taylor // Obstet. Gynecol. Clin. North Am. – 2012. – Vol. 39, N. 4. – P. 535-49. 158. Mason, H.D. Potent inhibition of human ovarian steroidogenesis by insulin-like growth factor binding protein-4 (IGFBP-4) / H.D. Mason, S. CwyfanHughes, J.M. Holly // J. Clin. Endocrinol. Metab. – 1998. – Vol. 83. – P. 284–287. 159. Meinhardt, U. The essential role of the aromatase/p450arom / U. Meinhardt, P.E. Mullis // Semin. Reprod. Med. – 2002. – Vol. 20, N. 3. – P. 277284. 160. Mendelson, C.R. Mechanisms in the regulation of aromatase in developing ovary and placenta / C.R. Mendelson, A. Kamat // J. Steroid. Biochem. Mol. Biol. – 2007. – Vol. 106, N. 1-5. – P. 62-70. 161. Mendelson, C.R. Transcriptional regulation of aromatase in placenta and ovary / C.R. Mendelson, B. Jiang, J.M. Shelton // J. Steroid. Biochem. Mol. Biol. – 2005. – Vol. 95. – P. 25–33. 162. Mendoza, N. Common genetic aspects between polycystic ovary syndrome and diabetes mellitus / N. Mendoza // Curr. Diabetes Rev. – 2011. – Vol. 7, N. 6. – P. 377-91. 163. Merke, D.P. Management of adolescents with congenital adrenal hyperplasia / D.P. Merke, D.P. Poppas // Lancet Diabetes Endocrinol. – 2013. – Vol. 1, N. 4. – P. 341-352. 164. Meyer, A.S. Conversion of 19-hydroxy-_4-androstene-3,17-dione to estrone by endocrine tissue / A.S. Meyer // Biochim. Biophys. Acta. – 1955. – Vol. 17. – P. 441–442. 165. Meyer, A.S. The conversion of _ 4-androstene-3,17-dione-4-C14 and dehydroepiandrosterone by bovine adrenal homogenate preparations / A.S. Meyer, M. Hayano, M.C. Lindberg // Acta Endocrinol. – 1955. – Vol. 18. – P. 148–168. 166. Mittre-Hervé, M.H. Human gene mutations. Gene symbol: CYP19. Disease: Aromatase deficiency / M.H. Mittre-Hervé, M.L. Kottler, M. Pura // Hum. Genet. – 2004. – Vol. 114. – P. 224. 125 167. Monga, R. Tissue-specific promoter methylation and histone modification regulate CYP19 gene expression during folliculogenesis and luteinization in buffalo ovary / R. Monga, S. Ghai, T.K. Datta // Gen. Comp. Endocrinol. – 2011. – Vol. 173, N. 1. – P. 205-215. 168. Morato, T. The intermediate steps in the biosynthesis of estrogens from androgens / T. Morato, M. Hayano, R.I. Dorfman // Biochem. Biophys. Res. Commun. – 1961. – Vol. 6. – P. 334–338. 169. Mukherjee, A. Gonadotropins regulate inducible cyclic adenosine 3′,5′- monophosphate early repressor in the rat ovary: implications for inhibin α subunit gene expression / A. Mukherjee, J. Urban, P. Sassone-Corsi // Mol. Endocrinol. – 1998. – Vol. 12. – P. 785–800. 170. Multilocus analysis of estrogen-related genes in Spanish postmenopausal women suggests an interactive role of ESR1, ESR2 and NRIP1 genes in the pathogenesis of osteoporosis / F.J. Moron, N. Mendoza, F. Vazquez [et al.] // Bone. – 2006. – Vol. 39. – P. 213–221. 171. Müllerian inhibiting substance inhibits cytochrome P450 aromatase activity in human granulosa lutein cell culture / M. Grossman, S. Nakajima, M. Fallat, Y. Siow // Fertil. Steril. – 2008. – Vol. 89. – P. 1364-1370. 172. Naftolin, F. Estrogen-induced hypothalamic synaptic plasticity and pituitary sensitization in the control of the estrogen-induced gonadotrophin surge / F. Naftolin, L.M. Garcia-Segura, T.L. Horvath // Reprod. Sci. – 2007. – Vol. 14. – P. 101–116. 173. Nandi, A. Polycystic ovary syndrome / A. Nandi, Z. Chen, R. Patel // Endocrinol. Metab. Clin. North Am. – 2014. – Vol. 43, N. 1. P. 123-47. 174. National Collaborating Centre for Women's and Children's Health. Fertility: assessment and treatment for people with fertility problems.- London, 2013. 175. Nelson, D.R. The P450 superfamily: update on new sequences, gene mapping, accession numbers, early trivial names of enzymes, and nomenclature / 126 D.R. Nelson, T. Kamataki, D.J.Waxman // DNA Cell Biol. - 1993. – Vol. 12. – P. 1-51. 176. Nimkarn, S. Congenital adrenal hyperplasia due to 21-hydroxylase deficiency: A paradigm for prenatal diagnosis and treatment / S. Nimkarn, M.I. New // Ann. N. Y. Acad. Sci. – 2010. – Vol. 1192. – P. 5-11. 177. Nonclassical congenital adrenal hyperplasia: targets of treatment and transition / B. McCann-Crosby, M.J. Chen, S.K. Lyons [et al.] // Pediatr. Endocrinol. Rev. – 2014. – Vol. 12, N. 2. – P. 224-238. 178. Nothnick,W.B. The emerging use of aromatase inhibitors for endometriosis treatment/ Nothnick,W.B.// Reprod. Biol. Endocrinol.-2011.-Vol.9. — P.87. 179. O'Flynn, N. Assessment and treatment for people with fertility problems: NICE guideline / O'Flynn N. // Br. J. Gen. Pract. – 2014. – Vol. 64, N. 618. – P. 5051. 180. Ojeda-Ojeda, M. Mediators of low-grade chronic inflammation in polycystic ovary syndrome (PCOS) / M. Ojeda -Ojeda, M. Murri, M. Insenser // Curr. Pharm. Des. – 2013. – Vol. 19, N. 32. – P. 5775-5791. 181. Otsuka, F. Bone morphogenetic protein-15 inhibits follicle-stimulating hormone (FSH) action by suppressing FSH receptor expression / F. Otsuka, S. Yamamoto, G.F. Erickson // J. Biol. Chem. – 2001. – Vol. 276. – P. 11387–11392. 182. Ovarian influence on adrenal androgen secretion in polycystic ovary syndrome / F. Fruzzetti, D. De Lorenzo, C. Ricci [et al.] // Fertil. Steril. – 1995. – Vol. 63, N. 4 – P. 734–741. 183. Painter, J.N. Genome-wide association study identifies a locus at 7p15.2 associated with endometriosis / J.N. Painter, C.A. Anderson, D.R. Nyholt // Nat. Genet. – 2011. – Vol. 43, N.1. – P. 51-54. 184. Panidis, D. Insulin resistance and endocrine characteristics of the different phenotypes of polycystic ovary syndrome: a prospective study / D. Panidis, K. Tziomalos, G. Misichronis // Hum. Reprod. – 2012. – Vol. 27, N. 2. – P. 541-549. 127 185. Pellatt, L. Granulosa cell production of anti-Müllerian hormone is increased in polycystic ovaries / L. Pellatt // J. Clin. Endocrinol. Metab. – 2007. – Vol. 92. – P. 240–245. 186. Perry, J.R. Genetic evidence that raised sex hormone binding globulin (SHBG) levels reduce the risk of type 2 diabetes / J.R. Perry, M.N. Weedon, C. Langenberg // Hum. Mol. Genet. – 2010. – Vol. 19. – P. 535–544. 187. Phase I study of the oral nonsteroidal aromatase inhibitor CGS 20267 in healthy postmenopausal women / T.J. Iveson, I.E. Smith, J. Ahern [et al.] // J. Clin. Endocrinol. Metab. – 1993. – Vol. 77, N 2. – P. 324–331. 188. Picon, R. Conversion of androgen to estrogen by the rat fetal and neonatal female gonad: effects of dcAMP and FSH / R. Picon, M.C. Pelloux, A. Benhaim // J. Steroid Biochem. – 1985. – Vol. 23. – P. 995–1000. 189. Polycystic ovarian syndrome / N. Madnani, K. Khan, P. Chauhan [et al.] // Indian J Dermatol. Venereol. Leprol. – 2013. – Vol. 79, N. 3. – P. 310-321. 190. Polycystic ovaries and obesity / I.E. Messinis, C.I. Messini, G. Anifandis [et al.] // Best. Pract. Res. Clin. Obstet. Gynaecol. – 2015. Vol. 29, N. 4. – P. 479-488. 191. Polycystic Ovary Syndrome: etiology, pathogenesis and diagnosis / M.O. Goodarzi, D.A. Dumesic, Chazenbalk [et al.] // Nature Reviews. – 2011. – Vol. 7. – P. 219-231. 192. Polycystic ovary syndrome / R.J. Norman, D. Dewailly, R.S. Legro [et al.] // Lancet. – 2007. – Vol. 370. – P. 685–697. 193. Polymorphic variation in CYP19 and the risk of breast cancer / S.W. Baxter, D.Y. Choong, D.M. Eccles [et al.] // Carcinogenesis. – 2001. – Vol. 22. – P. 347– 349. 194. Polymorphisms associated with circulating sex hormone levels in postmenopausal women / A.M. Dunning, M. Dowsett, C.S. Healey et al. // J. Natl. Cancer Inst. – 2004. – Vol. 96. – P. 936–945. 195. Polymorphism of the aromatase gene in postmenopausal Italian women: distribution and correlation with bone mass and fracture risk / L. Masi, L. 128 Becherini, L. Gennari [et al.] // J. Clin. Endocrinol. Metab. – 2001. – Vol. 86. – P. 2263–2269. 196. Polymorphisms in the CYP19 and AR genes-relation to bone mass and longitudinal bone changes in postmenopausal women with or without hormone replacement therapy: The Danish Osteoporosis Prevention Study / C.L. Tofteng, A. Kindmark, H. Brandstrom [et al.] // Calcif. Tissue Int. – 2004. – Vol. 74. – P. 25– 34. 197. Polymorphisms in the SHBG gene influence serum SHBG levels in women with polycystic ovary syndrome / E.P. Wickham, K.G. Ewens, R.S. Legro [et al.] // J. Clin. Endocrinol. Metab. – 2011. – Vol. 96. – P. 719–727. 198. Prevalence of endometriosis diagnosed by laparoscopy in adolescents with dysmenorrhea or chronic pelvic pain: a systematic review / E.B. Janssen, A.C.M. Rijkers, K. Hoppenbrouwers [et al.] // Hum. Reprod. Update. – 2013. – Vol. 19, N 5. – P. 570 – 582. 199. Progressive development of insulin resistance phenotype in male mice with complete aromatase (CYP19) deficiency / K. Takeda, K. Toda, T. Saibara [et al.] // J. Endocrinol. – 2003. – Vol. 176. – P. 237–246. 200. Regional rearrangements in chromosome 15q21 cause formation of cryptic promoters for the CYP19 (aromatase) gene / M. Demura, R.M. Martin, M. Shozu [et al.] // Hum. Mol. Genetics. – 2007. – Vol. 16. – P. 2529–2541. 201. Regulation of CYP19 gene expression in primary human osteoblasts: effects of vitamin D and other treatments / A. Enjuanes, N. Garcia-Giralt, M.I. Surks [et al.] // Eur. J. Endocrinol. – 2003. – Vol. 148. – P. 519–526. 202. Report of the Consensus Conference on Acne Classification // J Am Acad Dermatol. – 1991. – Vol. 24, N. 3. – P. 495-500. 203. Reproductive prognosis in endometriosis. A national cohort study / M.V. Hjordt Hansen, T. Dalsgaard, D. Hartwell [et al.] // Acta Obstet. Gynecol. Scand. – 2014. – Vol. 11. – P. 324-356. 129 204. Resch, M. Bulimia from a gynecological view: hormonal changes / M. Resch, G. Szendei, P. Haász // J. Obstet. Gynaecol. – 2004. – Vol. 24, N. 8. – P. 907-910. 205. Riancho, JA. Polymorphisms in the CYP19 gene that influence bone mineral density / J.A. Riancho // Pharmacogenomics. – 2007. – Vol. 8, N. 4. – P. 339-52. 206. Richards, J.S. Novel signaling pathways that control ovarian follicular development, ovulation, and luteinization / J.S. Richards, D.L. Russell, S. Ochsner // Recent Prog. Horm. Res. – 2002. – Vol. 57. – P. 195–220. 207. Ridderstrale, M. Type 2 diabetes candidate gene CAPN10: first, but not last / M. Ridderstrale, E. Nilsson // Curr. Hypertens. Rep. – 2008. – Vol. 10. – P. 19–24 208. Riggs, B.L. Sex steroids and the construction and conservation of adult skeleton / B.L. Riggs, S. Khosla, L.J. Melton // Endocr. Rev. – 2002. – Vol. 23. – P. 279–302. 209. Risk factors associated with endometriosis among infertile Iranian women / A. Moini, F. Malekzadeh, E. Amirchaghmaghi [et al.] // Arch. Med. Sci. – 2013. – Vol. 9, N 3. – P. 506 – 514. 210. Rotterdam ESHRE/ASRM-Sponsored PCOS Consensus Workshop Revised 2003 consensus on diagnostic criteria and long-term health risks related to polycystic ovary syndrome (PCOS) // Hum. Reprod. – 2004. – Vol. 19. – P. 41–47. 211. Ryan, K.J. Biological aromatization of steroids / K.J. Ryan // J. Biol. Chem. – 1959. – Vol. 234. – P. 268–272. 212. Sahakitrungruang, T. Clinical and molecular review of atypical congenital adrenal hyperplasia / T. Sahakitrungruang // Ann. Pediatr. Endocrinol. Metab. – 2015. – Vol. 20, N. 1. - P. 1-7. 213. Santen, R.J. History of aromatase: saga of an important biological mediator and therapeutic target / R.J. Santen, H. Brodie, E.R. Simpson // Endocr. Rev. – 2009. – Vol. 30. – P. 343–375. 214. Schwarzel, W.C. Studies on the mechanism of estrogen biosynthesis. 8. The development of inhibitors of the enzyme system inhumanplacenta / W.C. 130 Schwarzel, W.G. Kruggel, H.J. Brodie // Endocrinology. – 1973. – Vol. 92. – P. 866–880. 215. Senthilkumaran, B. A shift in steroidogenesis occurring in ovarian follicles prior to oocyte maturation / B. Senthilkumaran, M. Yoshikuni // Mol. Cell Endocrinol. – 2004. – Vol. 215, N. 1-2. – P. 11-18. 216. Setji, T.L. Polycystic ovary syndrome: update on diagnosis and treatment / T.L. Setji, A.J. Brown // Am. J. Med. – 2014. – Vol. 127, N. 10. –P. 912-919. 217. Sex- and age-related response to aromatase deficiency in bone / C. Miyaura, K. Toda, M. Inada [et al.] // Biochem. Biophys. Res. Commun. – 2001. – Vol. 280. – P. 1062–1068. 218. Sex hormone-binding globulin and risk of type 2 diabetes in women and men / E.L. Ding, Y. Song, J.E. Manson [et al.] // N. Engl. J. Med. – 2009. – Vol. 361. – P. 1152–1163. 219. Shah, N.A. Association of androgen receptor CAG repeat polymorphism and polycystic ovary syndrome / N.A. Shah, H.J. Antoine, M. Pall // J. Clin. Endocrinol. Metab. – 2008. – Vol. 93. – P. 1939–1945. 220. Shiina, H. Premature ovarian failure in androgen receptor-deficient mice / H. Shiina, T. Matsumoto, T. Sato // Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. – 2006. – Vol. 103. – P. 224–229. 221. Shozu, M. A new cause of female pseudohermaphroditism: placental aromatase deficiency / M. Shozu, K. Akasofu, T. Harada // J. Clin. Endocrinol. Metab. – 1991. – Vol. 72. – P. 560–566. 222. Silva, C.A. Autoimmune primary ovarian insufficiency / C.A. Silva, L.Y. Yamakami, N.E. Aikawa // Autoimmun. Rev. – 2014. – Vol. 13, N. 4-5. – P. 427430. 223. Simpson, E.R. Aromatase: biologic relevance of tissue-specific expression / E.R. Simpson // Semin. Reprod. Med. – 2004. – Vol. 22, N. 1. – P. 11-23. 224. Simpson, E.R. Biology of aromatase in the mammary gland / E.R. Simpson // J. Mammary Gland Biol. Neoplasia. – 2000. – Vol. 5, N3. – P. 251–258. 131 225. Simpson, E.R. Expression of the CYP19 (aromatase) gene: an unusual case of alternative promoter usage / E.R. Simpson, M. Dodson, R. Veena // The FASEB J. – 1997. – Vol. 11. – P. 29–36. 226. Specific CAPN10 gene haplotypes influence the clinical profile of polycystic ovary patients / A. Gonzalez, E. Abril, A. Roca [et al.] // J. Clin. Endocrinol. Metab. – 2003. – Vol. 88. – P. 5529–5536. 227. Spicer, L.J. Growth differentiation factor-9 has divergent effects on proliferation and steroidogenesis of bovine granulosa cells / L.J. Spicer, P.Y. Aad, D. Allen // J. Endocrinol. – 2006. – Vol. 189. – P. 329–339. 228. Stein, I.F. Amenorrhoea associated with bilateral polycystic ovaries / I.F. Stein, M.L. Leventhal // Am. J. Obset. Gynecol. – 1935. – Vol. 29. – P. 181-191. 229. Steinach, E.Transformation of male sex hormones into a substance with the action of a female hormone / Steinach E, Kun H // Lancet. – 1934. – Vol.133. – P. 845. 230. Steinkampf, M.P. Effects of epidermal growth factor and insulin-like growth factor I on the levels of mRNA encoding aromatase cytochrome P-450 of human ovarian granulosa cells / M.P. Steinkampf, C.R. Mendelson, E.R. Simpson // Mol. Cell Endocrinol. – 1988. – Vol. 59. – P. 93–99. 231. Stocco, C. Aromatase expression in the ovary: hormonal and molecular regulation / C. Stocco // Steroids. – 2008. – Vol. 73, N. 5. – P. 473-487. 232. Syed, F.S. Mechanisms of sex steroid effects on bone. Biochem. Biophys / F.S. Syed, S. Khosla // Res. Commun. – 2005. – Vol. 328. – P. 688–696. 233. Tetsuka, M. Androgen receptor gene expression in rat granulosa cells: the role of follicle-stimulating hormone and steroid hormones / M. Tetsuka, S.G. Hillier // Endocrinology. – 1996. – Vol. 137. – P. 4392–4397. 234. Tetsuka, M. Differential regulation of aromatase and androgen receptor in granulosa cells / M. Tetsuka, S.G. Hillier // J. Steroid. Biochem. Mol. Biol. – 1997. – Vol. 61. – P. 233–239. 235. The aromatase excess syndrome is associated with feminization of both sexes and autosomal dominant transmission of aberrant P450 aromatase gene 132 transcription / C.A. Stratakis, A. Vottero, A. Brodie [et al.] // J. Clin. Endocrinol. Metab. – 1998. – Vol. 83. – P. 1348–1357. 236. The expression and ovarian steroid regulation of endometrial micro-RNAs / T. Toloubeydokhti, Q. Pan, X. Luo [et al.] // Reprod. Sci. – 2008. – Vol. 15, N. 10. – P. 993-1001. 237. The ovarian phenotype of the aromatase knockout (ArKO) mouse / K.L. Britt, A.E. Drummond, M. Dyson [et al.] // J. Steroid. Biochem. Mol. Biol. – 2001. – Vol. 79. – P. 181–185. 238. The polycystic ovary syndrome: a position statement from the European Society of Endocrinology / G. Conway, D. Dewailly, E. Diamanti-Kandarakis [et al.] // Eur. J. Endocrinol. – 2014. – Vol. 171, N. 4. – P. 1-29. 239. The relationship of serum anti-Mullerian hormone and polycystic ovarian morphology and polycystic ovary syndrome: a prospective cohort study / R. Homburg, A. Ray, P. Bhide [et al.] // Hum. Reprod. – 2013. – Vol. 28. – P. 10771083. 240. The role of sex hormone-binding globulin and androgen receptor gene variants in the development of polycystic ovary syndrome / N. Xita, I. Georgiou, L. Lazaros [et al.] // Hum. Reprod. – 2008. – Vol. 23. – P. 693–698. 241. Tilman, R. Delayed pubertal onset and development in German children and adolescents with type 1 diabetes: cross-sectional analysis of recent data from the DPV diabetes documentation and quality management system / R. Tilman, E. Stierkorb // Eur. J. Endocrinol. – 2007. - V. 157. – P. 647–653. 242. Toda, K. Alternative usage of different poly(A) addition signals for two major species of mRNA encoding human aromatase P-450 / K. Toda, M. Terashima, Y. Mitsuuchi // FEBS Lett. – 1989. – Vol. 247. – P. 371–376. 243. Transcriptional changes in the expression of chemokines related to natural killer and T-regulatory cells in patients with deep infiltrative endometriosis / P. Bellelis, D.F. Barbeiro, L.V. Rizzo [et al.] // Fertil. Steril. – 2013. – Vol. 99, N. 7. – P. 1987-1993. 133 244. Turner, K.J. Development and validation of a new monoclonal antibody to mammalian aromatase / K.J. Turner, S. Macpherson, M.R. Millar // J. Endocrinol. – 2002. – Vol. 172. – P. 21–30. 245. Update on animal models developed for analyses of estrogen receptor biological activity / K.S. Korach, J.M. Emmen, V.R. Walker [et al.] // J. Steroid Biochem. Mol. Biol. – 2003. – Vol. 86. – P. 387–391. 246. Urbanek, M. Thirty-seven candidate genes for polycystic ovary syndrome: strongest evidence for linkage is with follistatin / M. Urbanek, R.S. Legro, D.A. Driscoll // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 1997. – Vol. 96. – P. 8573–8578. 247. Variable phenotypes associated with aromatase (CYP19) insufficiency in humans / L. Lin, O. Ercan, J. Raza [et al.] // J. Clin. Endocrinol. Metab. – 2007. – Vol. 92. – P. 982–990. 248. Veler, C.D. The preparation of the crystalline follicular ovarian hormone: theelin / Veler CD, Thayer S, Doisy EA // J. BiolChem. – 1930. – Vol. 87. – P. 357–371. 249. Watanabe, M. Aromatase expression in the human fetal osteoblastic cell line SV-HFO / M. Watanabe, E.R. Simpson, N. Pathirage // J. Mol. Endocrinol. – 2004. – Vol. 32. – P. 533–545. 250. Weiss R.V. Female infertility of endocrine origin / R.V. Weiss, R. Clapauch // Arq. Bras. Endocrinol .Metabol. – 2014. – Vol. 58, N. 2. – P. 144-452. 251. Welt, C.K. Genetics of polycystic ovary syndrome / C.K. Welt, J.M. Duran // Semin. Reprod. Med. – 2014. – Vol. 32, N. 3. – P. 177-182. 252. Wood, R.I. Prenatal testosterone differentially masculinizes tonic and surge modes of luteinizing hormone secretion in the developing sheep / R.I. Wood // Neuroendocrinology. – 1995. – Vol. 62, N 3. – P. 238–247. 253. Wu, Y.G. Testosterone, not 5α-dihydrotestosterone, stimulates LRH-1 leading to FSH-independent expression of Cyp19 and P450scc in granulosa cells / Y.G. Wu, J. Bennett, D. Talla // Mol. Endocrinol. – 2011. – Vol. 25. – P. 656–668. 254. Xita, N. Association of the (TAAAA)n repeat polymorphism in the sex hormone-binding globulin (SHBG) gene with polycystic ovary syndrome and 134 relation to SHBG serum levels / N. Xita, A. Tsatsoulis, A. Chatzikyriakidou // J. Clin. Endocrinol. Metab. – 2003. – Vol. 88. – P. 5976–5980. 255. Yildiz, B.O. Androgen Excess and PCOS Society. Ovarian and adipose tissue dysfunction in polycystic ovary syndrome: report of the 4th special scientific meeting of the Androgen Excess and PCOS Society / B.O. Yildiz, R. Azziz // Fertil. Steril. – 2010. – Vol. 94, N. 2. – P. 690-693. 256. Yildiz, B.O. Impact of obesity on the risk for polycystic ovary syndrome / B.O. Yildiz, E.S. Knochenhauer, R. Azziz // J. Clin. Endocrinol. Metab. – 2008. – Vol. 93. – P. 162–168. 257. Zeleznik, A.J. Protein kinase B is obligatory for follicle-stimulating hormone-induced granulosa cell differentiation / A.J. Zeleznik, D. Saxena, L. Little-Ihrig // Endocrinology. – 2003. – Vol. 144. – P. 3985–3994. 258. Zhang, X. Epigenetics meets endocrinology / X. Zhang, S.M. Ho // J. Mol. Endocrinol. – 2011. – Vol. 46, N. 1. – P. 11-32. 259. Zhou, J. Insulin-like growth factor I regulates gonadotropin responsiveness in the murine ovary / J. Zhou, T.R. Kumar, M.M. Matzuk // Mol. Endocrinol. – 1997. – Vol. 11. – P. 1924–1933. 260. Zondek, B. Oestrogenic hormone in the urine of the stallion / B. Zondek // Nature. – 1934. – Vol. 133. – P. 494.
