экспрессия некоторых генов энергетического метаболизма в

стоверно чаще предъявляли диспепсические жалобы, в
частности на изжогу и боли в эпигастрии, чем во 2 группе
(70 и 41,4% соответственно, р<0,05). В 1 группе с большей частотой при эндоскопическом и гистологическом
исследовании выявляли эзофагит А-В степени, чем во 2
группе (35 и 16,7% соответственно, р<0,05), и реже эндоскопически негативную ГЭРБ (28,9 и 42,7% соответственно, р<0,05).
Данный феномен требует дальнейшего анализа, но
уже сейчас можно предположить, что назначение больным СД 2 типа инсулина приводит к более частому формированию и неблагоприятному течению ГЭРБ у данных
пациентов.
В заключение можно отметить, что поражение пищевода в виде ГЭРБ у больных СД 1 и 2 типа является
распространенным явлением. Данная патология часто
служит причиной абдоминального болевого и диспепсического синдромов, но у ряда пациентов, особенно с СД
2 типа, она может протекать и бессимптомно. Назначаемая сахароснижающая терапия СД способна влиять на
возникновение и течение ГЭРБ при СД. Помнить об этом
должны врачи-эндокринологи, гастроэнтерологи, терапевты, работающие с больными СД.
4. Григорьев П.Я., Яковенко Э.П. Недостаточность
кардии и рефлюкс-эзофагит // Российский медицинский
журнал. - 1996. - №5. - С. 11-14.
5. Казей Н.А. Диабетическая вегетопатия // Диабет.
Образ жизни. - 1997. - № 4. - С. 12-14.
6. Кирилов Д.А. Клинические и функционально-морфологические особенности гастроэзофагеальной рефлюксной болезни при сахарной диабете: автореф. дис. …
канд. мед. наук. - М., 2002.
7. Лазебник Л.Б., Бордин Д.С., Машарова А.А. Современное понимание гастроэзофагеальной рефлюксной
болезни: от Генваля к Монреалю // Экспериментальная и
клиническая гастроэнтерология. - 2007. - №5. - С. 4-11.
8. Федорченко Ю.Л. Хронические гастродуоденальные язвы у больных сахарным диабетом // Проблемы эндокринологии. - 2003. - №1. - С. 7-12.
9. Чернобровый В.Н. Модификация внутрижелудочной рН-метрии у больных язвенной болезнью // Врачебное дело. - 1990. - №1. - С. 17-19.
10. Perdichimi G. Chronic gastritis and ulcer risk in
patients with diabetes mellitus // Scand. J. Gastroenterol. 1996. - Vol. 27. - №3. - P. 233-237.
11. Yki-Jarvinen H. Comparison of insulin regimens in
patients with non insulin-dependent diabetes mellitus // N.
Engl J. Med. - 1999. - Vol. 327. - №10. - P. 1426-1433.
Ли те ра тура
1. Баранская Е.К. Болезни органов пищеварения при
эндокринной патологии - М.: Медицина, 1989.- С. 88.
2. Балаболкин М.И. Сахарный диабет. - М.: Медицина, 1994. - С. 54-76.
3. Вержбицкий Ф.Р., Циммерман Я.С. Интрагастральная рН-метрия и пути повышения ее информативности //
Клин. медицина. - 1991. - №10. - С. 100-102.
Координаты для связи с авторами: Корнеева Наталья Вячеславовна — очный аспирант 1 года обучения
кафедры факультетской терапии ДВГМУ; Федорченко
Юрий Леонидович — профессор кафедры факультетской
терапии ДВГМУ, тел.: 8-(4212)-22-13-08, e-mail: ufedor@
mail.fesmu.ru.
УДК 576.535 : 575.117.2 : 577.121
В.В. Шаройко, Б.М. Кершенгольц
ЭКСПРЕССИЯ НЕКОТОРЫХ ГЕНОВ ЭНЕРГЕТИЧЕСКОГО
МЕТАБОЛИЗМА В ПАНКРЕАТИЧЕСКИХ ОСТРОВКАХ
ЧЕЛОВЕКА КОРРЕЛИРУЕТ С УРОВНЕМ
ГЛИКОЗИЛИРОВАННОГО ГЕМОГЛОБИНА
Институт биологических проблем криолитозоны СО РАН,
677891, пр. Ленина, 41, тел.: 8-(4112)-33-58-12, г. Якутск
Молекулярные механизмы, лежащие в основе глюкозостимулированной секреции инсулина в панкреатических
β-клетках, до конца не выяснены. Для исследования метаболических нарушений в β-клетках, которые ослабляют
глюкозостимулированную секрецию инсулина, мы сравнили две клональные линии β-клеток INS-1: глюкозочувствительные (832/13) и глюкозонечувствительные (832/2).
Данные клоны были получены из одного родительского
клона инсулиномы крысы INS-1 путем трансфекции плазмиды, стабильно эспрессирующей мДНК человеческого
инсулина под контролем цитомегаловирусного промотора. Впоследствии были изолированы клоны INS-1 832/13
и INS-1 832/2 с использованием маркера — гена резистентности к неомицину [1]. С этой целью мы провели в этих
клонах сравнительный анализ экспрессии генов, контролирующих энергетический метаболизм клетки. Было обнаружено, что в глюкозонечувствительных клетках 832/2
экспрессия генов гликолитического метаболизма повышена, а митохондриального — снижена, по сравнению с
глюкозочувствительными клетками 832/13. Далее мы ис32
следовали, происходят ли подобные метаболические изменения в панкреатических островках человека, которые
были обнаружены в клональных β-клетках.
Рез ю ме
Молекулярные механизмы, лежащие в основе глюкозостимулированной секреции в панкреатических β-клетках, до
конца не выяснены. С целью обнаружения метаболических
нарушений, ослабляющих глюкозостимулированную секрецию инсулина, мы провели сравнительный анализ клональных β-клеток линии INS-1 — глюкозочувствительных
(832/13) и глюкозонечувствительных (832/2). Мы проанализировали экспрессию мРНК генов, вовлеченных в энергетический метаболизм клетки. Было обнаружено, что в
глюкозонечувствительных клетках 832/2 экспрессия генов
гликолитического метаболизма повышена, а митохондриального — снижена, по сравнению с глюкозочувствительными клетками 832/13. В человеческих островках экспрессия
мРНК генов лактатдегидрогеназы А и гексокиназы I позитивно коррелировала с показателем гомеостаза глюкозы
HbA1с, тогда как экспрессия гена S1c2a2 (транспортер глюкозы) негативно коррелировала с уровнем НbА1с. Таким образом, можно заключить, что сопряженная метаболическая
регуляция, усиливающая митохондриальный метаболизм и
ограничивающая гликолиз в клетках 832/13, требуется для
стабильной глюкозозависимой секреции инсулина. Кроме
того, наблюдалась аналогичная картина экспрессии генов,
контролирующих гликолиз и митохондриальный метаболизм в клональных β-клетках и человеческих островках.
Из этого можно сделать вывод, что аналогичная приоритизация митохондриального метаболизма необходима для
здоровой человеческой β-клетки.
Ключевые слова: β-клетки, островки, метаболизм.
Материалы и методы
Уровень НbА1c определялся mono-S методом [2].
Клетки линии INS-1 (клоны 832/13 и 832/2) культивировались в инкубаторе при 37°С, во влажной атмосфере
воздуха 95% и концентрации СО2 5%, в среде RPMI1640.
Среда RPMI 1640 содержала 11 мМ D-глюкозы, 10% эмбриональной сыворотки теленка, 100 U/мл пенициллина,
100 мкг/мл стрептомицина, 10 мМ L-глутамина, 1 мМ
пирувата натрия, 10 мМ HEPES и 50 мкМ β-меркаптоэтанола [1]. Островки из поджелудочных желез человека
были получены от недиабетических умерших доноров (13
женщин, 10 мужчин; ИМТ 17,6-29,0 кг/м2) в возрасте 2673 лет. Степень чистоты островков варьировала от 13 до
90%. Островки культивировались в среде CMRL 1066 с
добавлением 10 мМ HEPES, 2 мМ L-глутамина, 50 мкг/мл
гентамицина, 0,25 мкг/мл фунгизона, 20 мкг/мл ципрофлоксацина и 10 мМ никотинамида при 37°С, во влажной
атмосфере воздуха 95% и СО2 5%. Затем β-клетки и островки использовали для выделения РНК.
РНК выделяли и очищали, используя набор реактивов
Qiagen RNAeasy RNA purification kit (Hilden, Germany).
Обратная транскрипция проводилась с использованием
набора реактивов от Fermentas RevertAid™ First-Strand
cDNA synthesis kit (Vilnius, Lithuania).
Для скрининга изменений экспрессии генов энергетического метаболизма в β-клетках использовали ДНКмикрочип от Applied Biosystems (TaqMan LDAs; Foster
City, USA), а для панкреатических островков человека
использовался ДНК-микрочип от Affymetrix (Inc, Santa
Clara, CA, USA).
Секреция инсулина в β-клетках 832/13 и 832/2, достигших плотности ≥90%, измерялась в 24-луночных
планшетах. Для измерения секреции инсулина клетки в
течение 2 ч инкубировались в буфере, содержащем 114
мМ NaCl; 4,7 мМ КСl; 1,2 мМ КН2РО4; 1,16 мМ MgSO4;
20 мМ HEPES; 2,5 мМ СаСl2; 25,5 мМ NaHCO3; 0,2%
БСА; рН 7,2 и 2,8 мМ глюкозы. Затем добавлялся буфер
того же состава, содержащий 2,8 или 16,7 мМ глюкозы для
V.V. Sharoyko, B.M. Kershengoltz
EXPRESSION OF SOME GENES OF ENERGETIC
METABOLISM IN HUMAN PANCREATIC
ISLETS CORRELATE WITH
GLYCOSILATED HAEMOGLOBIN LEVEL
The Institute of Biological Problems of Cryolithozone, Yakutsk
Summar y
The molecular mechanisms underlying glucose-stimulated
insulin secretion from pancreatic β-cells are not completely
understood. To identify metabolic disturbances in β-cells that
impair glucose-stimulated insulin secretion, we compared two
INS-1-derived clonal β-cell lines, which are glucose-responsive
(832/13) or glucose-unresponsive (832/2). We analyzed mRNA
expression of genes involved in cellular energy metabolism. In
832/2 cells mRNA expression of genes for glycolytic enzymes
were up-regulated, whereas mitochondria-related genes were
down-regulated. In human islets, mRNA expression of genes
such as lactate dehydrogenase A and hexokinase I correlated
positively with long-term glucose homeostasis reflected by
HbA1c levels, while that of S1c2a2 (GLUT) correlated negatively with Hb1Ac. We conclude that tight metabolic regulation
enhancing mitochondrial metabolism and restricting glycolysis
in 832/13 cells is required for clonal β-cells to secrete insulin
robustly in response to glucose. Moreover, a similar expression pattern of genes controlling glycolytic and mitochondrial
metabolism in clonal β-cells and human islets was observed,
suggesting that a similar prioritization of mitochondrial metabolism is required in healthy human β-cells.
Key words: β-cells, islets, metabolism.
секреция инсулина, нг/ч/мг белка
*
Рис. 1. Глюкозостимулированная секреция инсулина в
глюкозочувствительных (832/13) и глюкозонечувствительных (832/2)
β-клетках. Результаты представлены как среднее±стандартная
ошибка для трех независимых экспериментов (* — p<0,01
относительно 2,8 мМ глюкозы для клеток 832/13)
33
Разница в экспрессии генов между глюкозочувствительными 832/13 и глюкозонечувствительными 832/2 клетками
Символ
Название гена
Разница
в экспрессии
Ct
Номер
в генобанке
Tagman
Р
832/2 кл.
832/13 кл./
832/2 кл.
22,82
31,08
309
<0,01
832/13 кл.
Ген, ответственный за транспорт глюкозы
S1c2a2
Транспортер глюкозы 2 (GLUT)
NM_012879
Rn00563565_m1
Гены гликолитического метаболизма
Gck
Глюкокиназа
NM_012565
Rn00561265 m1
26,41
29,03
5,56
<0,001
Hk1
Гексокиназа 1
NM_012734
Rn00562436 m1
not detected
29,81
∞
-
Ldha
Лактатдегидрогеназа А
NM_017025
Rn00820751 g1
not detected
21,28
∞
-
Me1
Декарбоксилирующая
малатдегидрогеназа 1
NM_012600
Rn00561502_m1
25,49
25,97
1,33
<0,05
Pk1r
Пируваткиназа
NM_012624
Rn00561764_m1
25,00
26,35
2,35
0,001
Pfkm
Фосфофруктокиназа
NM_053291
Rn00581848_m1
24,78
25,18
1,27
<0,05
Tri1
Триозофосфат изомераза 1
NM_022922
Rn00821155_g1
23,03
21,79
0,42
<0,01
Aco2
Аконитаза 2, митохондриальная
NM_024398
Rn00577876_m1
23,44
23,92
1,30
<0,05
Cs
Цитрат-синтаза
NM_130755
Rn00756225_m1
24,83
24,53
0,77
<0,05
Gpd2
Глицерол-3-фосфат дегидрогеназа 2, митохондриальная
NM_012736
Rn00562472_m1
27,17
28,17
2,00
<0,05
Mor1
Малатдегидрогеназа,
митохондриальная
NM_031151
Rn00579848_m1
23,59
24,09
1,34
<0,01
РС
Пируваткарбоксилаза
NM_012744
Rn00562534_m1
26,70
28,58
3,45
<0,001
ATP5e
АТФ-синтаза, Н+-транспортирующая ε субъединица, митохондриальный F1 комплекс
NM_019383
Rn00820986_g1
23,05
23,96
1,79
<0,001
Cox4i1
Цитохром с оксидаза
субъединица IV, изоформа 1
NM_017202
Rn00567950_m1
26,88
26,22
0,59
<0,05
Ndufa5
NАДН дегидрогеназа 1 α,
субкомплекс 5
NM_012985
Rn00820691_g1
25,99
27,75
0,81
<0,05
Nqo1
NАД(Р)Н хинондегидрогеназа 1
NM_017000
Rn00566528_m1
29,43
30,93
2,65
<0,001
Гены митохондриального метаболизма
Смешанные гены
Acaca
Ацетил-КоА карбоксилаза а
NM_016987
Rn00672936_g1
26,95
28,55
2,90
<0,05
A1cy
АТФ цитратлиаза
NM_016987
Rn00566411_m1
22,27
23,93
3,03
<0,001
Cpt1a
Карнитин пальмитоилтрансфераза 1
NM_031559
Rn00580702_m1
26,56
26,00
0,65
<0,05
Fasn
Синтаза жирных кислот
NМ_017332
Rn00569117_m1
25,39
26,16
1,60
<0,05
<0,05
Glud1
Глутаматдегидрогеназа
NM_012570
Rn00561306_m1
24,43
25,20
1,60
Mlycd
Малонил-КоА декарбоксилаза
NM_053477
Rn00585056_m1
28,18
29,47
2,20
<0,01
Pdk2
Киназа пируватдегидрогеназы 2
NM_030872
Rn00578427_m1
27,85
27,04
0,55
<0,01
Примечание. Клетки культивировались 48 ч в присутствии 11 мМ глюкозы, экспрессия генов определялась ДНК-микрочипом методом количественного ПЦР в режиме реального времени. Разница в экспрессии генов рассчитывалась по формуле 2∆∆Ct. Данные получены в четырех независимых
экспериментах.
измерения глюкозостимулированной секреции инсулина в
течение 1 ч. Концентрация инсулина в супернатантах измерялась радиоиммунным методом с использованием набора реактивов Coat-a-Count (DPC, Los Angeles, USA) (3).
Статистическая обработка данных проводилась с вычислением t-критерия Стьюдента и использованием пакета программ Sigma Plot для Windows (версия 7.101б SPSS,
INC), Statistica (версия 5.0, Statsoft, Inc). Корреляционный
анализ осуществлялся с использованием непараметрического теста Спирмена. Результаты представлены как
среднее ± SЕ для указанного числа экспериментов. Разницу между средними считали достоверной при р<0,05.
тельно отличается в двух клонах. Глюкозочувствительные
клетки (832/13) в 11,9 раза увеличивают секрецию инсулина при повышении концентрации глюкозы с 2,8 до 16,7
мМ (р<0,01), тогда как глюкозонечувствительные клетки
(832/2) не секретируют инсулин в ответ на повышение
концентрации глюкозы (рис. 1). С целью выяснения причин нарушения секреции инсулина клетками 832/2 мы
провели сравнительный анализ экспрессии мРНК генов,
участвующих в клеточном энергетическом метаболизме
(гликолиз, цикл трикарбоновых кислот, цепь переноса
электронов) в клонах 832/13 и 832/2 соответственно (таблица). Из 46 проанализированных генов 26 экспрессировались различно в клонах 832/13 и 832/2. Уровень мРНК 16
генов был снижен, а 6 генов был повышен в клоне 832/2
по сравнению с клоном 832/13. Следует отметить значительное снижение экспрессии генов S1c2a2, кодирующих
Результаты и обсуждение
Результаты, представленные на рис. 1, показывают,
что глюкозостимулированная секреция инсулина значи34
А
r=-0,63; р<0,01
Д
HbF1c, %
HbF1c, %
Д. log2 [экспрессия Ldha] в человеческих островках
и уровень HbA1c плазмы
A. log2 [экспрессия Slc2a2] в человеческих островках
и уровень HbA1c плазмы
Б
r=-0,40; р=0,059
Е
Б. log2 [экспрессия Hk1] в человеческих
островках и уровень HbA1c плазмы
Е. log2 [экспрессия Cs] в человеческих островках
и уровень HbA1c плазмы
r=-0,59; р<0,01
Ж
r=-0,48; р<0,05
HbF1c, %
HbF1c, %
Ж. log2 [экспрессия Gpd2] в человеческих островках
и уровень HbA1c плазмы
В. log2 [экспрессия Me1] в человеческих островках
и уровень HbA1c плазмы
Г
r=0,47; р<0,05
HbF1c, %
HbF1c, %
В
r=0,64; р<0,01
r=0,43; р<0,05
З
r=-0,47; р<0,05
HbF1c, %
HbF1c, %
Г. log2 [экспрессия Tri1] в человеческих островках
и уровень HbA1c плазмы
З. log2 [экспрессия Acaca] в человеческих островках
и уровень HbA1c плазмы
Рис. 2. Корреляционный анализ значений HbA1c c уровнем экспрессии некоторых генов гликолитического
и митохондриального метаболизма в островках человека (23 донора)
белок транспорта глюкозы и глюкозофосфорилирующего
фермента с высокой константой Михаэлиса-Ментен (Кm)
глюкокиназы (таблица). С другой стороны, ген фермента
с низкой Кm — гексокиназа I — экспрессировался в клоне 832/2 и не детектировался в клоне 832/13. Также ген
фермента лактатдегидрогеназы А экспрессировался в кло35
не 832/2, но не в клоне 832/13 (таблица). Выявлено, что
отсутствие глюкозостимулированной секреции инсулина
в клоне 832/2 коррелировало с увеличением экспрессии
генов гликолиза и со снижением экспрессии генов, участвующих в митохондриальном метаболизме. Далее мы
проанализировали, происходят ли метаболические изменения в панкреатических островках человека, подобные
обнаруженным в клональных β-клетках. Мы провели
корреляционный анализ экспрессии генов энергетического метаболизма, найденных в глюкозонечувствительных
клетках, с уровнем НbА1с. Уровень НbА1c является надежным индикатором средней гликемии в последующие 2-3
мес. и широко используется в клинической практике.
В человеческих панкреатических островках уровень
экспрессии S1c2a2 (транспортер глюкозы) отрицательно
коррелировал с НbАc (рис. 2А), а экспрессия генов, таких
как гексокиназа I (рис. 2Б), триозофосфат изомераза 1
(рис. 2Г) и лактатдегидрогена А (рис. 2Д), коррелировала
положительно с показателем НbА1c (НbА1c отражает содержание глюкозы в крови за последние 1-3 мес.).
Таким образом, можно заключить, что сопряженная
метаболическая регуляция, усиливающая митохондриальный метаболизм и ограничивающая гликолиз в клет-
ках 832/13, требуется для стабильной глюкозозависимой
секреции инсулина. Кроме того, наблюдалась аналогичная картина экспрессии генов, контролирующих гликолиз и митохондриальный метаболизм в клональных
β-клетках и человеческих островках. В связи с этим
можно полагать, что аналогичная характеристика митохондриального метаболизма необходима для здоровой
человеческой β-клетки.
Ли т ер ат у р а
1. Hohmeier H.E., Mulder H., Chen G. et al. // Diabetes.
- 2000. - Vol. 49(3). - P. 424-430.
2. Jeppsson J.O., Kobold U., Barr J. et al. // Clin Chem
Lab Med. - 2002. - Vol. 40(1). - P. 78-89.
3. Kelly R. P., Sutton R., Ashcroft, F.M. The Journal of
physiology. - 1991. - Vol. 443. - P. 175-192.
Координаты для связи с авторами: Шаройко Владимир Владимирович — научный сотрудник Института
биологических проблем криолитозоны СО РАН, тел.:
8-(4112)-33-58-12, e-mail: [email protected]; Кершенгольц Борис Моисеевич — заведующий лабораторией
Института биологических проблем криолитозоны, тел.:
8-(4112)-33-58-12, e-mail: [email protected].
36