ÑÅËÜÑÊÎÕÎÇßÉÑÒÂÅÍÍÀß ÁÈÎËÎÃÈß, 2013, ¹ 2 Èññëåäîâàíèÿ ó÷åíûõ Âñåðîññèéñêîãî ÍÈÈ æèâîòíîâîäñòâà∗ Ñâåòëîé ïàìÿòè Ó÷èòåëÿ — àêàäåìèêà Ë.Ê. Ýðíñòà ïîñâÿùàåòñÿ Áèîëîãèÿ òðàíñãåííûõ æèâîòíûõ ÓÄÊ 636.4:636.064:[573.6.086.83+577.21]:577.175.322 ÁÈÎËÎÃÈ×ÅÑÊÈÅ ÎÑÎÁÅÍÍÎÑÒÈ ÑÂÈÍÅÉ, ÒÐÀÍÑÃÅÍÍÛÕ ÏÎ ÃÅÍÓ ÃÎÐÌÎÍÀ ÐÎÑÒÀ ×ÅËÎÂÅÊÀ∗∗ Ë.Ê. ÝÐÍÑÒ 1, Í.À. ÇÈÍÎÂÜÅÂÀ1, Í.À. ÂÎËÊÎÂÀ1, À.Þ. ÔÈËÈÌÎÍÎÂ2, È.À. ÐÀËÊÎÂ1, È.Â. ÃÓÑÅÂ1, Ã. ÁÐÅÌ3 Ïîêàçàíî ïîâûøåíèå ýêñïðåññèè ãîðìîíà ðîñòà ó ñâèíåé, òðàíñãåííûõ ïî ãåííîé êîíñòðóêöèè WAP-hGH ãåíåðàöèé F3 (õîëîñòûå è ëàêòèðóþùèå ñâèíîìàòêè) è F5 (ìîëîäíÿê â âîçðàñòå 5 è 9 ìåñ). Óñòàíîâëåíû èçìåíåíèÿ â íåêîòîðûõ áèîõèìè÷åñêèõ ïîêàçàòåëÿõ ñûâîðîòêè êðîâè òðàíñãåííûõ ñâèíåé. Îáíàðóæåíî èçìåíåíèå êîððåëÿöèîííûõ çàâèñèìîñòåé ìåæäó áèîõèìè÷åñêèìè ïîêàçàòåëÿìè êðîâè òðàíñãåííûõ è êîíòðîëüíûõ ñâèíåé. Êëþ÷åâûå ñëîâà: òðàíñãåííûå ñâèíüè, ñîìàòîòðîïèí, áèîõèìè÷åñêèå ïîêàçàòåëè, êîððåëÿöèè. Keywords: transgenic pigs, growth hormone, biochemical characteristics, correlation. Ê ïðèîðèòåòíûì îáëàñòÿì ðàçâèòèÿ áèîòåõíîëîãèé â æèâîòíîâîäñòâå îòíîñèòñÿ ñîçäàíèå òðàíñãåííûõ ôîðì æèâîòíûõ, îáëàäàþùèõ çàäàííûìè ïðîäóêòèâíûìè è áèîëîãè÷åñêèìè ñâîéñòâàìè èëè ïðîäóöèðóþùèõ áèîëîãè÷åñêè àêòèâíûå âåùåñòâà (1, 2). Äëÿ îáåñïå÷åíèÿ íàïðàâëåííîãî ñèíòåçà ðåêîìáèíàíòíûõ áåëêîâ â ìîëî÷íîé æåëåçå â ãåííî-èíæåíåðíûå êîíñòðóêöèè âêëþ÷àþò ðåãóëÿòîðíûå ýëåìåíòû ãåíîâ áåëêîâ ìîëîêà — κ-êàçåèíà, β-ëàêòîãëîáóëèíà, α-ëàêòàëüáóìèíà, êèñëîãî ñûâîðîòî÷íîãî áåëêà (WAP) (3), ïðè ýòîì â ðÿäå èññëåäîâàíèé ïîêàçàíà íåñïåöèôè÷åñêàÿ ýêñïðåññèÿ ãåííûõ êîíñòðóêöèé, îáóñëîâëåííàÿ ïðîìîòîðîì WAP. Òàê, C.W. Pittius ñ ñîàâò. (4) îáíàðóæèëè ìÐÍÊ òêàíåâîãî ïëàçìèíîãåííîãî àêòèâàòîðà ÷åëîâåêà â ÿçûêå, ïî÷êàõ è ñëþííûõ æåëåçàõ òðàíñãåííûõ ìûøåé. Ýêñïðåññèÿ ñîìàòîòðîïèíà (ÑÒÃ) ÷åëîâåêà, êîíòðîëèðóåìàÿ ïðîìîòîðîì WAP ìûøè äëèíîé 2,6 kb, âûÿâëÿëàñü â ñûâîðîòêå êðîâè ìûøåé â ïåðèîä ëàêòàöèè (5). Ïî äàííûì W.H. Güenzburg ñ ñîàâò. (6), ó 40 % òðàíñãåííûõ ìûøåé, èíòåãðèðîâàâøèõ ãåííóþ êîíñòðóêöèþ ÑÒà ÷åëîâåêà ïîä êîíòðîëåì ïðîìîòîðà WAP äëèíîé 2,4 kb, ñïåöèôè÷åñêóþ ìÐÍÊ íàõîäèëè â ñëþííûõ æåëåçàõ è ñåìåííèêàõ. Ó âñåõ òðàíñãåííûõ ìûøåé òðàíñãåííûé áåëîê ñèíòåçèðîâàëñÿ â êëåòêàõ ãîëîâíîãî ìîçãà. Ïðè÷èíà íåñïåöèôè÷åñêîé ýêñïðåññèè ãåíîâ, ââåäåííûõ â ãåíîì ïîä êîíòðîëåì ýòîãî ðåãóëÿòîðíîãî ýëåìåíòà, çàêëþ÷àåòñÿ â íåñïåöèôè÷íîñòè ýêñïðåññèè ýíäîãåííîãî WAP. Íåñìîòðÿ íà ìíîãî÷èñëåííîñòü è ìíîãîîáðàçèå èññëåäîâàíèé â îáëàñòè òðàíñãåíåçà, ìíîãèå ôàêòîðû, îïðåäåëÿþùèå ýôôåêòèâíîñòü ýêñïðåññèè ÷óæåðîäíûõ ãåíîâ â êëåòêàõ îðãàíèçìà, îñòàþòñÿ íåäîñòàòî÷íî èçó÷åííûìè. Óæå íà ðàííèõ ýòàïàõ èññëåäîâàíèé ñòàëî ÿñíî, ÷òî âçàèìîäåéñòâèå èíòðîäóöèðîâàííîé êîíñòðóêöèè è ãåíîìà-õîçÿèíà íå ìîæåò áûòü ñâåäåíî ê ïðîñòîìó ñóììèðîâàíèþ ðàçëè÷íûõ ãåíåòè÷åñêèõ çàäàòêîâ. ∗ ∗∗ Íà÷àëî ñì. â æóðíàëå «Ñåëüñêîõîçÿéñòâåííàÿ áèîëîãèÿ» ¹ 6 çà 2012 ãîä. Ðàáîòà âûïîëíåíà ïðè ôèíàíñîâîé ïîääåðæêå Ìèíèñòåðñòâà îáðàçîâàíèÿ è íàóêè ÐÔ, øèôð 2012-1.412-000-2021-009.  ïðîâåäåíèè èññëåäîâàíèé èñïîëüçîâàíî îáîðóäîâàíèå ÖÊÏ «Áèîðåñóðñû è áèîèíæåíåðèÿ ñåëüñêîõîçÿéñòâåííûõ æèâîòíûõ» ÃÍÓ ÂÈÆ Ðîññåëüõîçàêàäåìèè. 40 Ïîñêîëüêó èíòåãðàöèÿ ÷óæåðîäíûõ ãåíîâ ïî ñâîåé ïðèðîäå ñõîäíà ìóòàöèè (èíñåðöèè), ñëåäóåò îæèäàòü ïðîÿâëåíèÿ â îðãàíèçìå òðàíñãåííûõ æèâîòíûõ öåëîãî ñïåêòðà íåïðåäñêàçóåìûõ ñîáûòèé ìîäèôèêàöèîííîé è ìóòàöèîííîé ïðèðîäû, òàê êàê êàæäàÿ ìóòàöèÿ çàõâàòûâàåò íå èçîëèðîâàííûé ïðîöåññ äëÿ îòäåëüíîãî ïðèçíàêà, à èçâåñòíóþ îáëàñòü ïðîöåññîâ èíäèâèäóàëüíîãî ðàçâèòèÿ (7). Ïîäîáíîå ïðåäïîëîæåíèå áûëî ïîäòâåðæäåíî â ðàáîòàõ, âûïîëíåííûõ íà ðàçíûõ òðàíñãåííûõ æèâîòíûõ (8-11). Ñëåäîâàòåëüíî, îöåíêà âëèÿíèÿ òðàíñãåíà íà îðãàíèçì èñêëþ÷èòåëüíî àêòóàëüíà êàê äëÿ áèîòåõíîëîãèè, òàê è äëÿ ñåëåêöèè. Ìû èçó÷èëè ýêñïðåññèþ ââåäåííûõ ãåíîâ è åå âçàèìîñâÿçè ñ ôèçèîëîãî-ìîðôîëîãè÷åñêèìè ïðèçíàêàìè ó òðàíñãåííûõ ñâèíåé 3-й è 5-é ãåíåðàöèé. Ìåòîäèêà. Îáúåêòîì èññëåäîâàíèé áûëè ñâèíüè, òðàíñãåííûå ïî ãåííîé êîíñòðóêöèè ÑÒà ÷åëîâåêà ïîä êîíòðîëåì ïðîìîòîðà WAP ìûøè (WAP-hGH). Äëÿ èçó÷åíèÿ èõ áèîëîãè÷åñêèõ è õîçÿéñòâåííî ïîëåçíûõ ïðèçíàêîâ â óñëîâèÿõ ôèçèîëîãè÷åñêîãî äâîðà Âñåðîññèéñêîãî ÍÈÈ æèâîòíîâîäñòâà ôîðìèðîâàëè ãðóïïû ïî ïðèíöèïó îäíîãíåçäîâûõ àíàëîãîâ. Ñîäåðæàíèå ÑÒà â ñûâîðîòêå êðîâè îïðåäåëÿëè ó ñâèíåé ãåíåðàöèé F3 (õîëîñòûå è ëàêòèðóþùèå ñâèíîìàòêè) è F5 (ìîëîäíÿê â âîçðàñòå 5 è 9 ìåñ) èììóíîôåðìåíòíûì ìåòîäîì íà èììóíîðèäåðå Dinatech («Dynex Technologies», ÑØÀ), èñïîëüçóÿ íàáîð Ñ-kit («Sigma-Aldrich», ÑØÀ) ñîãëàñíî ðåêîìåíäàöèÿì ïðîèçâîäèòåëÿ. Ýêñïðåññèþ ÑÒà â îðãàíàõ è òêàíÿõ îöåíèâàëè ìåòîäîì èììóíîãèñòîõèìèè ñ ïîìîùüþ íàáîðà ABC-kit («VectorLabs», Âåëèêîáðèòàíèÿ) â ñîîòâåòñòâèè ñ ðåêîìåíäàöèÿìè ïðîèçâîäèòåëÿ.  êà÷åñòâå ïåðâûõ àíòèòåë ïðèìåíÿëè àíòèòåëà, ñïåöèôè÷íûå ê ÑÒà ÷åëîâåêà («Sigma-Aldrich», ÑØÀ). Ïðîäóêò èììóíîãèñòîõèìè÷åñêîé ðåàêöèè äåòåêòèðîâàëè ñ èñïîëüçîâàíèåì 3,3-äèàìèíîáåíçèäèíà òåòðàõëîðàòà (ÄÀÁ) («VectorLabs», Âåëèêîáðèòàíèÿ). Áèîõèìè÷åñêèå ïîêàçàòåëè êðîâè èññëåäîâàëè ó ñâèíåé ãåíåðàöèè F5 â âîçðàñòå 7 ìåñ, ïðèìåíÿÿ îáùåïðèíÿòûå ìåòîäèêè (12, 13). Ïîëó÷åííûå ïîêàçàòåëè îáðàáàòûâàëè áèîìåòðè÷åñêèìè ìåòîäàìè äëÿ ìàëûõ âûáîðîê (14). Ðåçóëüòàòû.  êðîâè õîëîñòûõ è ëàêòèðóþùèõ òðàíñãåííûõ ñâèíîìàòîê â F3 ñîäåðæàíèå ÑÒà ïîâûøàëîñü â 3,30-3,50 ðàçà ïî ñðàâíåíèþ ñ ïîêàçàòåëÿìè ó êîíòðîëüíûõ æèâîòíûõ. Ó ìîëîäíÿêà F5 â âîçðàñòå 5 ìåñ êîëè÷åñòâî ÑÒà óâåëè÷èâàëîñü â 2,25 ðàçà, â âîçðàñòå 9 ìåñ — â 3,77 ðàçà îòíîñèòåëüíî êîíòðîëÿ. Ñëåäóåò îòìåòèòü, ÷òî åñëè ó ìîëîäíÿêà èç êîíòðîëüíîé ãðóïïû ðàçëè÷èé â êîíöåíòðàöèè ÑÒà â ðàçíûå âîçðàñòíûå ïåðèîäû âûÿâëåíî íå áûëî, òî â ãðóïïå òðàíñãåííûõ ñâèíåé ïðîèñõîäèë ðîñò êîíöåíòðàöèè ÑÒà â 2,0 ðàçà (òàáë. 1). 1. Ñîäåðæàíèå ñîìàòîòðîïèíà (ÑÒÃ, íã/ìë) â êðîâè òðàíñãåííûõ (îïûò) è íåòðàíñãåííûõ (êîíòðîëü) ñâèíîìàòîê (F3) è ìîëîäíÿêà (F5) ðàçíîãî âîçðàñòà (X±x) Ãðóïïà Îïûò Êîíòðîëü Ëàêòèðóþùèå ñâèíîìàòêè n = 10 29,00±1,7à, á n = 10 8,30±1,9á Õîëîñòûå ñâèíîìàòêè n = 10 24,00±1,2à, â n = 10 7,30±0,8â Ìîëîäíÿê íà îòêîðìå: â âîçðàñòå 5 ìåñ n=3 1,53±0,2 n=3 0,68±0,3 â âîçðàñòå 9 ìåñ n=3 3,10±0,9 n=3 0,65±0,3 Ï ð è ì å ÷ à í è å. Èñïîëüçîâàííàÿ ãåííàÿ êîíñòðóêöèÿ — WAP-hGH (ãåí ñîìàòîòðîïíîãî ãîðìîíà ÷åëîâåêà ïîä êîíòðîëåì WAP-ïðîìîòîðà ìûøè). à p < 0,05, á, â p < 0,01 (ðàçëè÷èÿ äîñòîâåðíû). Èññëåäîâàíèå ñèíòåçà ãîðìîíà ðîñòà â îðãàíàõ è òêàíÿõ ó ëàêòèðóþùèõ òðàíñãåííûõ ñâèíåé â F3 ïîêàçàëî íàëè÷èå ýêñïðåññèè ÑÒà â ìîëî÷íîé æåëåçå, ïîäæåëóäî÷íîé æåëåçå, ñëþííîé æåëåçå è â ãèïîôèçå.  41 ñåðäöå, ïå÷åíè, ïî÷êàõ, ëåãêèõ è ìûøöàõ ó ýòèõ æèâîòíûõ ýêñïðåññèþ ÑÒà íå íàáëþäàëè. Òàêèì îáðàçîì, òðàíñãåííûå æèâîòíûå õàðàêòåðèçîâàëèñü áîëåå âûñîêèì ñîäåðæàíèåì ÑÒà â îðãàíàõ è òêàíÿõ, ïðè ýòîì íàèáîëåå àêòèâíîå ïðîäóöèðîâàíèå ÑÒà ïðîèñõîäèëî ó òðàíñãåííûõ ëàêòèðóþùèõ ñâèíîìàòîê. Íàëè÷èå ÑÒà â ñëþííîé è ïîäæåëóäî÷íîé æåëåçàõ è ãèïîôèçå ñâèäåòåëüñòâóåò î íåñïåöèôè÷åñêîé ýêñïðåññèè, îáóñëîâëåííîé ïðîìîòîðîì WAP.  öåëîì ïîëó÷åííûå äàííûå ìîæíî ðàññìàòðèâàòü êàê óêàçàíèå íà ïðåèìóùåñòâî òðàíñãåííûõ ñâèíåé íàä êîíòðîëüíûìè ïî àêòèâíîñòè àíàáîëè÷åñêèõ ïðîöåññîâ. Ó ìîëîäíÿêà ñâèíåé â F5 ñîäåðæàíèå ïðîäóêòîâ ìåòàáîëèçìà â ñûâîðîòêå êðîâè ó òðàíñãåííûõ è êîíòðîëüíûõ îñîáåé íàõîäèëîñü â ïðåäåëàõ ôèçèîëîãè÷åñêîé íîðìû. Ñðåäè íàèáîëåå çàìåòíûõ ñëåäóåò îòìåòèòü íàáëþäàåìûå èçìåíåíèÿ â àêòèâíîñòè àìèíîòðàíñôåðàç — àëàíèíàìèíîòðàíñôåðàçû è àñïàðòàòàìèíîòðàíñôåðàçû (ÀëÀÒ è ÀñÀÒ). Ó òðàíñãåííûõ îñîáåé êîíöåíòðàöèÿ ÀëÀÒ áûëà íà 37,2 % âûøå, ÷åì ó àíàëîãîâ èç êîíòðîëüíîé ãðóïïû. Àêòèâíîñòü ÀëÀÒ ïîëîæèòåëüíî êîððåëèðîâàëà ñ êîíöåíòðàöèåé ãëþêîçû â Ðèñ. 1. Àêòèâíîñòü àëàíèíàìèíîòðàíôåðàçû (à) ñûâîðîòêå êðîâè, êîòîðàÿ ó òðàíñè àñïàðòàòàìèíîòðàíñôåðàçû (á) â êðîâè ó êîí- ãåííûõ ñâèíåé áûëà íà 8,8 % âûøå, òðîëüíûõ è òðàíñãåííûõ ñâèíåé ãåíåðàöèè F5 . ÷åì ó àíàëîãîâ èç êîíòðîëüíîé ãðóïÈñïîëüçîâàííàÿ ãåííàÿ êîíñòðóêöèÿ — WAPïû. Àêòèâíîñòü ÀñÀÒ â ñûâîðîòêå hGH (ãåí ñîìàòîòðîïíîãî ãîðìîíà ÷åëîâåêà êðîâè òàêæå èìåëà áîëåå âûñîêîå ïîä êîíòðîëåì WAP-ïðîìîòîðà ìûøè). çíà÷åíèå (íà 16,7 %) ó îñîáåé èç îïûòíîé ãðóïïû ïî ñðàâíåíèþ ñ êîíòðîëüíûìè (ðèñ. 1). Òåíäåíöèþ ê ðîñòó àêòèâíîñòè ÀñÀÒ ó òðàíñãåííûõ ñâèíåé ìîæíî ðàññìàòðèâàòü êàê óêàçàíèå íà èíòåíñèôèêàöèþ áåëêîâîãî è ýíåðãåòè÷åñêîãî îáìåíà â ïå÷åíè è ìûøå÷íîé òêàíè ýòèõ æèâîòíûõ. ÑÒà — îäèí èç ðåãóëÿòîðîâ ëèïèäíîãî îáìåíà, è åãî ïîâûøåííàÿ ïðîäóêöèÿ óñèëèâàåò ïåðåìåùåíèå æèðà ñ ïåðèôåðèè â ïå÷åíü. Ó÷èòûâàÿ ðàçëè÷èÿ â ñîäåðæàíèè ÑÒà â êðîâè ó êîíòðîëüíûõ è òðàíñãåííûõ ñâèíåé, ó ïîñëåäíèõ ìîæíî îæèäàòü èçìåíåíèé â ëèïèäíîì îáìåíå. Ðåçóëüòàòû àíàëèçà ñîäåðæàíèÿ îáùèõ ëèïèäîâ è èõ êëàññîâ â ñûâîðîòêå êðîâè ó òðàíñãåííûõ è êîíòðîëüíûõ îñîáåé â F5 ïîêàçàëè (òàáë. 2), ÷òî â îáåèõ ãðóïïàõ îíî íàõîäèëîñü â ïðåäåëàõ ôèçèîëîãè÷åñêîé íîðìû. Ïðè ýòîì â ãðóïïå òðàíñãåííûõ îñîáåé ïî îáùèì ëèïèäàì ïîêàçàòåëè áûëè íà 5,6 % âûøå, ÷åì â êîíòðîëå, çà ñ÷åò ïîâûøåíèÿ êîíöåíòðàöèè ýôèðíîãî õîëåñòåðîëà. 2. Ñîäåðæàíèå îáùèõ ëèïèäîâ è êëàññîâ ëèïèäîâ â ñûâîðîòêå êðîâè ó òðàíñãåííîãî (îïûò) è íåòðàíñãåííîãî (êîíòðîëü) ìîëîäíÿêà ñâèíåé íà îòêîðìå â F5 (X±x) Ïîêàçàòåëü Êîíòðîëü (n = 6) Îïûò (n = 3) Ðàçíèöà «îïûò — êîíòðîëü» Îïûò ê êîíòðîëþ, % Îáùèå ëèïèäû, ã% 0,40±0,01 0,38±0,02 0,02 5,6  òîì ÷èñëå ïî êëàññàì, %: ôîñôîëèïèäû 11,9±0,2 10,5±0,2 −1,50 −12,5 ìîáèëüíûå + äåïîíèðîâàííûå ãëèöåðîëû 2,2±0,2 1,5±0,1 −0,70 −30,9 õîëåñòåðîë 3,6±0,3 2,4±0,1 −1,20 −32,0 ñâîáîäíûé õîëåñòåðîë 37,7±0,3 44,4±0,3 6,80 17,9 òðèãëèöåðîëû 38,3±0,2 35,6±0,0 −2,70 −6,9 ÍÝÆÊ 5,9±0,2 5,4±0,1 −0,50 −8,5 Ï ð è ì å ÷ à í è å. ÍÝÆÊ — íåýòåðèôèöèðîâàííûå æèðíûå êèñëîòû. Èñïîëüçîâàííàÿ ãåííàÿ êîíñòðóêöèÿ — WAP-hGH (ãåí ñîìàòîòðîïíîãî ãîðìîíà ÷åëîâåêà ïîä êîíòðîëåì WAP-ïðîìîòîðà ìûøè). 42 Íåîáõîäèìî îòìåòèòü òåíäåíöèþ ê ñíèæåíèþ ïðîöåíòíîãî ñîäåðæàíèÿ âñåõ êëàññîâ ëèïèäîâ (çà èñêëþ÷åíèåì ýôèðíîãî õîëåñòåðîëà) ó òðàíñãåííûõ æèâîòíûõ ïî ñðàâíåíèþ ñ êîíòðîëåì, ÷òî, âîçìîæíî, ñâÿçàíî ó íèõ ñ ïîâûøåííîé ôóíêöèîíàëüíîé àêòèâíîñòüþ ÑÒÃ, êîòîðûé ñïîñîáñòâóåò ïåðåìåùåíèþ ëèïèäîâ ñ ïåðèôåðèè â ïå÷åíü, ãäå ïðîèñõîäèò àêòèâíûé ãèäðîëèòè÷åñêèé ðàñïàä ñ îáðàçîâàíèåì ãëèöåðèíà è æèðíûõ êèñëîò è èñïîëüçîâàíèå èõ â êà÷åñòâå ýíåðãåòè÷åñêîãî ìàòåðèàëà. Ñëåäóåò òàêæå îáðàòèòü âíèìàíèå íà óâåëè÷åíèå êîëè÷åñòâà ïîëèíåíàñûùåííûõ æèðíûõ êèñëîò — ëèíîëåâîé, ëèíîëåíîâîé è àðàõèäîíîâîé â êðîâè òðàíñãåííûõ ñâèíåé.  ÷àñòíîñòè, íà äîëþ ýòèõ æèðíûõ êèñëîò ó êîíòðîëüíûõ îñîáåé ñóììàðíî ïðèõîäèëîñü 7,90 %, â òî âðåìÿ êàê ó òðàíñãåííûõ ïîêàçàòåëü áûë íà 1,96 % âûøå. Ñóììàðíîå óâåëè÷åíèå ïðîèñõîäèëî â ðåçóëüòàòå ïîâûøåíèÿ ñîäåðæàíèÿ êàæäîé èç âûøåíàçâàííûõ æèðíûõ êèñëîò (ðèñ. 2). Ïðîòèâîðå÷èâîñòü äàííûõ ïî ôåíîòèïó òðàíñãåííûõ æèâîòíûõ ïîäòâåðæäàåò, ÷òî ïðîáëåìà ðåãóëÿöèè ôóíêöèé îðãàíèçìà ïîñðåäñòâîì òðàíñãåíåçà î÷åíü ñëîæíà, òàê êàê çàòðàãèâàåò ìíîãèå ðåãóëèðóþùèå îáìåí âåùåñòâ ìåõàíèçìû, âîçäåéñòâèå êîòîðûõ ïðè òðàíñãåíåçå â êîíå÷íîì èòîãå îïðåäåëÿåò èçìåíåíèÿ â ôåíîòèïå.  ýòîì àñïåêòå ñëåäóåò îáðàòèòüñÿ ê òðóäàì âûäàþùåãîñÿ èñÐèñ. 2. Ñîäåðæàíèå ïîëèíåíàñûùåííûõ æèð- ñëåäîâàòåëÿ È.È. Øìàëüãàóçåíà, êîíûõ êèñëîò â ñûâîðîòêå êðîâè ó êîíòðîëüíûõ è òðàíñãåííûõ ñâèíåé ãåíåðàöèè F5. Ñ18:2 — òîðûé óòâåðæäàë: «Íàñëåäñòâåííàÿ ëèíîëåâàÿ, Ñ18:3 — ëèíîëåíîâàÿ, Ñ20:4 — àðà- ñòîéêîñòü îðãàíèçìà îáúÿñíÿåòñÿ õèäîíîâàÿ. Èñïîëüçîâàííàÿ ãåííàÿ êîíñò- ñëîæíîñòüþ ñèñòåìû ìîðôîëîãè÷åðóêöèÿ — WAP-hGH (ãåí ñîìàòîòðîïíîãî ãîð- ñêèõ ñâÿçåé, îáúåäèíÿþùèõ âñå ÷àñìîíà ÷åëîâåêà ïîä êîíòðîëåì WAP-ïðîìîòîðà òè ðàçâèâàþùåãîñÿ îðãàíèçìà â îäìûøè). íî öåëîå, à íå ñòîéêîñòüþ íàñëåäñòâåííîãî âåùåñòâà, òî åñòü ãåíîâ». Êàê óæå îòìå÷àëîñü âûøå, èíòåãðàöèþ ãåíîâ â ãåíîì ìîæíî ðàññìàòðèâàòü êàê ðàçíîâèäíîñòü ìóòàöèè (èíñåðöèè). Ïî ïðåäñòàâëåíèþ àêàäåìèêà È.È. Øìàëüãàóçåíà, ëþáûå èçìåíåíèÿ â ãåíîìå (ìóòàöèè) è èõ âîçäåéñòâèå íà ôåíîòèï ñãëàæèâàþòñÿ íàëè÷èåì õîðîøî ðàçâèòûõ ó âûñøèõ æèâîòíûõ ìîðôîëîãè÷åñêèõ êîððåëÿöèé. È.È. Øìàëüãàóçåí ïèñàë: «Â ïðîöåññå ýâîëþöèè îðãàíèçì èçìåíÿåòñÿ è ýâîëþöèîíèðóåò êàê åäèíîå öåëîå. Óæå îòäåëüíûå ìóòàöèè èìåþò, áëàãîäàðÿ ñâÿçàííîñòè ïðîöåññîâ èíäèâèäóàëüíîãî ðàçâèòèÿ, õàðàêòåð èçìåíåíèé âñåãî îðãàíèçìà â öåëîì». Ïî ìíåíèþ È.È. Øìàëüãàóçåíà, ìóòàöèè íèêîãäà íå ïðîÿâëÿþòñÿ â èçìåíåíèÿõ îòäåëüíûõ ïðèçíàêîâ, à âñåãäà ïðîÿâëÿþòñÿ â âèäå èçìåíåíèÿ êîððåëÿöèîííûõ îòíîøåíèé, ïðè÷åì ñóùåñòâóþùèå êîððåëÿöèè ÷àñòî òåðÿþòñÿ, à âçàìåí ýòîãî óñòàíàâëèâàþòñÿ ñîâåðøåííî íîâûå. Ïðîâåäåííûå íàìè èññëåäîâàíèÿ âçàèìîçàâèñèìîñòåé ìåæäó íåêîòîðûìè áèîõèìè÷åñêèìè ïîêàçàòåëÿìè â îïûòíûõ è êîíòðîëüíûõ ãðóïïàõ ñâèíåé ïîêàçàëè, ÷òî â îðãàíèçìå â ðåçóëüòàòå èíòåãðàöèè ãåííîé êîíñòðóêöèè ñóùåñòâåííî èçìåíèëàñü íå òîëüêî ïðîäóêöèÿ ÑÒÃ, íî è ñëîæèâøèåñÿ êîððåëÿöèè (òàáë. 3). Êàê ñëåäóåò èç ïðåäñòàâëåííûõ â ýòîé òàáëèöå äàííûõ, èç 13 ïàð ïðèçíàêîâ â øåñòè ñëó÷àÿõ êîýôôèöèåíò êîððåëÿöèè äëÿ òðàíñãåííûõ è êîíòðîëüíûõ îñîáåé èìåë îòðèöàòåëüíîå çíà÷åíèå. 43 Íàïðèìåð, åñëè êîýôôèöèåíò êîððåëÿöèè ìåæäó ñîäåðæàíèåì êðåàòèíèíà è êðåàòèíêèíàçû ó òðàíñãåííûõ ñâèíåé ðàâíÿëñÿ −0,64, òî ó êîíòðîëüíûõ — +0,58. Êîððåëÿöèÿ ìåæäó ñîäåðæàíèåì ãëþêîçû è èíñóëèíà ñîñòàâëÿëà ñîîòâåòñòâåííî +0,49 è −0,13. Äàæå åñëè çíàê êîýôôèöèåíòà êîððåëÿöèè áûë îäèíàêîâûì ó æèâîòíûõ îáåèõ ãðóïï, â áîëüøèíñòâå ñëó÷àåâ âåëè÷èíà ïîñëåäíåãî îêàçàëàñü ñóùåñòâåííî ìåíüøåé ó òðàíñãåííûõ æèâîòíûõ ïî ñðàâíåíèþ ñ êîíòðîëüíûìè àíàëîãàìè. Òàê, ïî ñîäåðæàíèþ îáùåãî áåëêà è ìî÷åâèíû â êðîâè êîýôôèöèåíò êîððåëÿöèè ó òðàíñãåííûõ ñâèíåé ñîñòàâëÿë −0,46, ó êîíòðîëüíûõ — −0,83, ïî êîíöåíòðàöèè ãëþêîçû è òðèãëèöåðèäîâ — ñîîòâåòñòâåííî −0,66 è −0,99, àìèëàçû è ãëþêîçû — ñîîòâåòñòâåííî +0,03 è +0,52. 3. Êîððåëÿöèîííûå çàâèñèìîñòè ìåæäó áèîõèìè÷åñêèìè ïîêàçàòåëÿìè êðîâè ó òðàíãñåííûõ (îïûò) è íåòðàíñãåííûõ (êîíòðîëü) ñâèíåé (ãåíåðàöèè F3 è F5) Ïàðà ñðàâíèâàåìûõ ïîêàçàòåëåé Êîýôôèöèåíò êîððåëÿöèè r îïûò êîíòðîëü Êðåàòèíèí—êðåàòèíêèíàçà −0,64 Îáùèé áåëîê—ìî÷åâèíà −0,46 Ãëþêîçà—èíñóëèí +0,43 Ãëþêîçà—òðèãëèöåðèäû −0,66 ÀñÀÒ—îáùèé áåëîê +0,50 ÀëÀÒ—îáùèé áåëîê +0,51 Òèðîêñèí—ìî÷åâèíà −0,66 Òèðîêñèí—èíñóëèí −0,39 Àìèëàçà—ãëþêîçà +0,03 Òðèéîäòèðîíèí—òèðîêñèí +0,10 Ëàêòàòäåãèäðîêèíàçà—õîëåñòåðèí −0,87 Êîðòèçîë—ìî÷åâèíà +0,01 Ëàêòàòäåãèäðîêèíàçà—ìîëî÷íàÿ êèñëîòà +0,39 Ï ð è ì å ÷ à í è å. ÀñÀÒ — àñïàðòàòàìèíîòðàíñôåðàçà, ÀëÀÒ — àëàíèíàìèíîòðàíñôåðàçà. +0,58 −0,83 −0,13 −0,99 +0,50 +0,21 −0,78 +0,02 +0,52 −0,76 +0,33 +0,88 −0,07  öåëîì ìîæíî îòìåòèòü, ÷òî èíòåãðàöèÿ ãåííîé êîíñòðóêöèè WAPhGH ïðèâîäèò íå òîëüêî ê ìîäèôèêàöèè ðÿäà ôåíîòèïè÷åñêèõ ïðèçíàêîâ, íî îäíîâðåìåííî ñóùåñòâåííî èçìåíÿåò íàïðàâëåíèå è âåëè÷èíó ìíîãèõ êîððåëÿöèé â îðãàíèçìå æèâîòíûõ. Ýòî ñëóæèò îïðåäåëåííûì ïðåèìóùåñòâîì äëÿ ñåëåêöèè, òàê êàê ñëîæèâøèåñÿ ñâÿçè ñïîñîáñòâóþò ñòàáèëèçàöèè îðãàíèçìà è ïðåïÿòñòâóþò åãî èçìåíåíèþ. Èç ïîëó÷åííûõ íàìè ðåçóëüòàòîâ ñòàíîâèòñÿ î÷åâèäíûì, ÷òî âûñîêèé óðîâåíü ÑÒà â êðîâè òðàíñãåííûõ ñâèíåé íå ìîæåò áûòü ïîëíîñòüþ ðåàëèçîâàí â íîðìàëüíîì îðãàíèçìå, òàê êàê âñå äðóãèå ìåõàíèçìû ó÷àñòèÿ ÑÒà â ìåòàáîëèçìå îêàçûâàþòñÿ íåèçìåííûìè. Òàê, âîçìîæíî ïðîòèâîðå÷èå ìåæäó âûñîêèì ñîäåðæàíèåì ÑÒà è êîëè÷åñòâîì ðåöåïòîðîâ ýòîãî ãîðìîíà. Ïðåäñòàâëåííûå äàííûå ïîäòâåðæäàþò ðàçðàáîòàííóþ È.È. Øìàëüãàóçåíîì òåîðèþ îðãàíèçìà êàê öåëîñòíîé ñèñòåìû â èíäèâèäóàëüíîì è èñòîðè÷åñêîì ðàçâèòèè. «Òàê êàê âñå îðãàíû æèâîòíîãî îáðàçóþò åäèíóþ ñèñòåìó, ÷àñòè êîòîðîé çàâèñÿò äðóã îò äðóãà è äåéñòâóþò è ïðîòèâîäåéñòâóþò îäíà ïî îòíîøåíèþ ê äðóãîé, íèêàêîå èçìåíåíèå íå ìîæåò îáíàðóæèòüñÿ â îäíîé ÷àñòè áåç òîãî, ÷òîáû íå âûçâàòü ñîîòâåòñòâóþùèå èçìåíåíèÿ âî âñåõ îñòàëüíûõ ÷àñòÿõ». Èòàê, òðàíñãåííûå æèâîòíûå õàðàêòåðèçóþòñÿ ïåðåñòðîéêîé ñëîæèâøèõñÿ êîððåëÿòèâíûõ ñâÿçåé, êîòîðûå, íåñîìíåííî, îêàçûâàþò âëèÿíèå íà ïðîöåññû ðàçâèòèÿ îñîáåé. Âñå ýòî ñâèäåòåëüñòâóåò î òîì, ÷òî èíòåãðàöèÿ è ïîñëåäóþùàÿ ýêñïðåññèÿ ãåíîâ ñóùåñòâåííûì îáðàçîì ìåíÿåò õàðàêòåð îáìåíà âåùåñòâ, çàòðàãèâàåò âåëè÷èíó âàæíåéøèõ áèîõèìè÷åñêèõ ïîêàçàòåëåé. Ðàçóìååòñÿ, ñåé÷àñ åùå òðóäíî îïðåäåëèòü çíà÷åíèå êàæäîãî èç ýòèõ ôàêòîðîâ äëÿ ðàçâèòèÿ õîçÿéñòâåííî öåííûõ ïðèçíàêîâ, ýòî áóäåò ïðåäìåòîì äàëüíåéøèõ èññëåäîâàíèé. 44 ËÈÒÅÐÀÒÓÐÀ 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. Á ð å ì Ã., Ç è í î â ü å â à Í.À., Ý ð í ñ ò Ë.Ê. Ãåííûå ôåðìû — íîâûé ïóòü ïðîèçâîäñòâà áèîëîãè÷åñêè àêòèâíûõ ïðîòåèíîâ òðàíñãåííûìè æèâîòíûìè. Ñåëüñêîõîçÿéñòâåííàÿ áèîëîãèÿ, 1993, 6: 3-27. Ý ð í ñ ò Ë.Ê., Á ð å ì Ã., Ç è í î â ü å â à Í. Ãåííî-èíæåíåðíûå òåõíîëîãèè — íîâûé ïóòü ðàçâèòèÿ æèâîòíîâîäñòâà. Çîîòåõíèÿ, 1994, 5: 2-4. Ý ð í ñ ò Ë.Ê., Ç è í î â ü å â à Í.À., Á ð å ì Ã. Ñîâðåìåííîå ñîñòîÿíèå è ïåðñïåêòèâû èñïîëüçîâàíèÿ òðàíñãåííûõ òåõíîëîãèé â æèâîòíîâîäñòâå. Ì., 2002. P i t t i u s C.W., H e n n i g h a u s e n L., L e e E., W e s t p h a l H., N i c o l s E., V i t a l e J. A milk protein gene promoter directs the expression of human tissue plasminogen activator cDNA to the mammary gland in transgenic mice. PNAS USA, 1988, 85: 5874-5878. R e d d y V.B., V i t a l e J.A., W e i C., M o n t o y a - Z a v a l a M., S t i c e S.L., B a l i s e J., R o b i J.M. Expression of human growth hormone in the milk of transgenic mice. Anim. Biotechnol., 1991, 2: 15-29. G ü n z b u r g W.H., S a l m o n s B., Z i m m e r m a n n B., M ü l l e r M., E r f l e V., B r e m G. A mammary specific promoter directs expression of growth hormone not only to the mammary gland, but also to Bergman Glia cells in transgenic mice. Mol Endocrinol., 1991, 5: 123-133. Ø ì à ë ü ã à ó ç å í È.È. Ôàêòîðû ýâîëþöèè (òåîðèÿ ñòàáèëèçèðóþùåãî îòáîðà). Ì.Ë., 1946. M e h t a l i N., L e M e u r V., L a t h e R. The methylation-free status of a houskeeping transgene is lost at high copy number. Gene, 1990, 91: 179-184. B r e m G., B r e n n i n g B., S a l a m o n s B. et al. Unerwartets transgene Expression eines gesaengespezifischen Wachstumshormon Genkonstruktes in den Bergmann-Gliazellen der Maus. Tiwrarztl. Prax., 1991, 19: 1-6. Ê ë å í î â è ö ê è é Ï.Ì., Í å ê ð à ñ î â À.À. Ìóòàöèîííûå èçìåíåíèÿ ó òðàíñãåííûõ æèâîòíûõ.  ñá.: Àêòóàëüíûå ïðîáëåìû ðàçâèòèÿ æèâîòíîâîäñòâà. Äóáðîâèöû, 1998: 184-191. Ê à ë à ø í è ê î â à Ë.À. Èñïîëüçîâàíèå ÄÍÊ-òåõíîëîãèé äëÿ îöåíêè è èçìåíåíèÿ ãåíîìà ñåëüñêîõîçÿéñòâåííûõ æèâîòíûõ. Àâòîðåô. äîêò. äèñ. Ëåñíûå Ïîëÿíû, 1998. Ê ó ä ð ÿ â ö å â À.À., Ê ó ä ð ÿ â ö å â à Ë.À. Êëèíè÷åñêàÿ ãåìàòîëîãèÿ æèâîòíûõ. Ì., 1974. Ê î í ä ð à õ è í È.Ï., À ð õ è ï î â À.Â., Ë å â ÷ å í ê î Â.È., Ò à ë à í î â Ã.À., Ô ð î ë î â à Ë.À., Í î â è ê î â Â.Ý. Ìåòîäû âåòåðèíàðíîé êëèíè÷åñêîé ëàáîðàòîðíîé äèàãíîñòèêè: Ñïðàâî÷íèê /Ïîä ðåä. È.Ï. Êîíäðàõèíà. Ì., 2004. Ì å ð ê ó ð ü å â à Å.Ê. Áèîìåòðèÿ â ñåëåêöèè è ãåíåòèêå ñåëüñêîõîçÿéñòâåííûé æèâîòíûõ. Ì., 1970. 1ÃÍÓ Âñåðîññèéñêèé ÍÈÈ æèâîòíîâîäñòâà Ðîññåëüõîçàêàäåìèè, Ïîñòóïèëà â ðåäàêöèþ 15 ÿíâàðÿ 2013 ãîäà 142132 Ìîñêîâñêàÿ îáë., Ïîäîëüñêèé ð-í, ïîñ. Äóáðîâèöû, e-mail: [email protected]; 2ÃÁÎÓ ÂÏÎ Ðîññèéñêèé íàöèîíàëüíûé èññëåäîâàòåëüñêèé ìåäèöèíñêèé óíèâåðñèòåò èì. Í.È. Ïèðîãîâà Ìèíçäðàâñîöðàçâèòèÿ Ðîññèè, 117997 ã. Ìîñêâà, óë. Îñòðîâèòÿíîâà, 1, e-mail: [email protected]; 3Veterinärmedizinische Universität (Èíñòèòóò æèâîòíîâîäñòâà è ãåíåòèêè Âåòåðèíàðíî-ìåäèöèíñêîãî óíèâåðñèòåòà), Veterinaerplatz, 1, A-1210 Vienna, Austria, e-mail: [email protected] BIOLOGICAL CHARACTERISTICS OF PIGS TRANSGENIC FOR HUMAN GROWTH HORMONE L.K. Ernst 1, N.A. Zinovieva1, N.A. Volkova1, A.Yu. Filimonov2, I.A. Ralkov1, I.V. Gusev1, G. Brem3 Summary The increase of growth hormone expression in pigs transgenic for WAP-hGH gene construct of F3 (non-pregnant and lactating sows) and F5 generations (young gilts in age of 5 and 9 months) was observed. The alteration of some biochemical characteristics of blood serum in transgenic pigs comparing to control animals was detected. The differences in correlation relationships between some biochemical characteristics of transgenic and control pigs were established. 45