исследование природы взаимодействий инсулина с

Экология человека и социальная экология
4. Кошелев, Д.И. Параметры зрительных вызванных потенциалов и характеристики движений глаза при фиксации у испы
туемых с нормальным зрением / Д.И. Кошелев, А.В. Пономарев, И.В. Сироткина // Физиология адаптации: Материалы
1й Всероссийской науч.практ. конф. – Волгоград, 2008. – С.2326.
5. Кошелев, Д.И. Особенности движений глаза при фиксации неподвижного объекта учащихся первых и четвертых классов
в норме и при миопии / Д.И. Кошелев, Р.А. Мухамадеев, И.В. Сироткина // Оздоровление средствами образования и
экологии: Материалы V Междунар. науч.практ. конф. – Челябинск, 2008. – С. 146148.
6. Филин, В.А. Автоматия саккад / В.А. Филин. – М.: Издво МГУ, 2002. – 240с.
7. Шагас, Ч. Вызванные потенциалы мозга в норме и патологии / Ч.Шагас. – М., Мир, 1975. С.315.
8. Ярбус, А.Л. Роль движений глаз в процессе зрения / А.Л. Ярбус. – М.: Наука, 1965. – 166с.
УДК 612.018
Елисеева О.С, Киреева Н.А., Першина А.С.,
Буторина О.Л., Бикбулатова С.М., Гарипова М.И.
Башкирский государственный университет
ИССЛЕДОВАНИЕ ПРИРОДЫ ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ ИНСУЛИНА
С ПОВЕРХНОСТЬЮ ЭРИТРОЦИТОВ И СОСТАВА
ГОРМОНТРАНСПОРТИРУЮЩЕГО КОМПЛЕКСА
ПЛАЗМЫ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА
Показано, что в обеспечении инсулиндепонирующей функции эритрона принимают участие
специфические и гидрофобные взаимодействия. Установлено, что транспортирующий гормоны
комплекс плазмы крови является общим для гидрофильных и гидрофобных гормонов. Наряду с
инсулином в него включаются гидрофобные (тироксин, трийодтиронин, тестостерон) и гидро?
фильные (тиреотропный гормон, пролактин, лютеинизирующий гормон) гормоны, а также триг?
лицериды и холестерол. Ядро комплекса формируют альбумин, a?фетопротеин и трансферин.
Ключевые слова: инсулин, эритроциты, гормоны, плазма крови, гидрофобные взаимодействия.
Впервые предположение об участии эрит
роцитов в транспорте инсулина в крови челове
ка сформулировано в работах Л.И. Сандуляк и
соавторов [1,2]. В работах этих авторов сформу
лирована гипотеза о инсулиндепонирующей
функции эритроцитов. Показано [3,4], что коэф
фициент распределения инсулина между эрит
роном и плазмой крови в крови здоровых доно
ров составляет 0,52. Известно, что несмотря на
то, что эритроциты не относятся к классическим
чувствительным к инсулину клеткам, на их плаз
матической мембране присутствуют рецепторы
к этому гормону [1]. Одна из функций рецепто
ров к инсулину, локализованных на поверхнос
ти эритроцитов, вероятно, заключается в достав
ке гормона к периферическим тканям. Однако,
существует возможность того, что в формирова
нии фракции связанного с эритроцитами инсу
лина, принимают также гидрофобные взаимо
действия. Цель данного исследования – оценить
роль гидрофобных взаимодействий во взаимо
действии инсулина с эритроцитами, определить
состав белков транспортирующего гормоны ком
плекса плазмы крови человека, а также состава
транспортируемых им гормонов.
476
ВЕСТНИК ОГУ №6/ИЮНЬ`2009
Объекты и методы исследования
Коэффициент распределение инсулина
между поверхностью эритроцитов и плазмой
крови оценивали с использованием ранее опи
санного метода. Для оценки распределения ин
сулина между поверхностью эритроцитов и плаз
мой крови получен инсулин, меченный перокси
дазой, по методу Fare и Nakane с использовани
ем человеческого генноинженерного инсулина
хумулин Р производства фирмы Lilly France S.A.
Предложенный метод определения коэффици
ента распределения инсулина между рецептора
ми поверхности эритроцитов и транспортными
белками сыворотки крови заключается в опре
делении соотношения пероксидазной активнос
ти, связанной с поверхностью эритроцитов, к
активности пероксидазы в плазме крови после
инкубации с исследуемой пробой крови рабоче
го разведения коньюгата инсулина с пероксида
зой, выполняющей роль маркерного фермента
[4]. В контроле определялось распределение не
связанной с инсулином пероксидазы в пробах
крови с использованием как физиологических
условий, так и 1,М хлорида натрия рН 4,0. Оп
ределение коэффициентов распределения меж
Елисеева О.С. и др.
Исследование природы взаимодействий инсулина с поверхностью...
ду эритроцитами и плазмой крови в пробах кро
ви здоровых доноров проводили в физиологи
ческих условиях (0,14М хлорид натрия, забуфе
ренный 0,01М фосфатным буфером рН 7,2).
Вклад гидрофобных взаимодействий во взаимо
действии инсулина с поверхностью эритроци
тов оценивали при торможении специфическо
го связывания меченного пероксидазой инсули
на в присутствии немеченого гормона. Для ис
следования отобраны пробы крови 30 здоровых
добровольцев 2025 лет.
Выделение транспортирующего гормоны
комплекса плазмы крови человека проводили
методом аффинной хроматографии на сорбен
те с иммобилизованным инсулином по ранее
описанному методу [5]. Концентрацию гормо
нов в пробах определяли на автоматическом
анализаторе Amerham с использованием набо
ров Amerlite (Амерлайт) конкурентным мето
дом по инструкции, прилагаемой к набору ре
активов. Определение содержания в пробах a1
кислого гликопротеина и трансферина прово
дили методом иммунонефелометрии при помо
щи диагностических наборов фирмы Иммуно
тех (Россия) по прилагаемой инструкции. Им
муноферментное определение человеческого
альбумина и aфетопротеина в выделенных
аффинно пробах проволили с использованием
диагностических наборов фирмы Иммунотех
(г.Москва) по прилагаемой инструкции. Гельх
роматографию на Сефадексе G75 проводили
по стандартной методике [6].
Результаты и обсуждение
Установлено, что при конкурентном тормо
жении связывания меченного пероксидазой ин
сулина со специфическими рецепторами плаз
матической мембраны эритроцитов свободным
гормоном, с поверхностью эритроцитов связы
вается 14±1,32% меченного пероксидазой инсу
лина, соответственно коэффициент распреде
ления инсулина в этих условиях составил 0,16.
Вероятно, уровень связывания инсулина эрит
роцитами в этих условиях отражает вклад гид
рофобных взаимодействий в формировании
фракции инсулина, связанной с плазматичес
кой мембраной эритроцитов. Таким образом,
установлено, что в формировании инсулинде
понирующей емкости эритрона принимают уча
стие гидрофобные взаимодействия.
Ранее показано, что в крови человека инсу
лин транспортируется в составе комплекса,
ядро которого формируют белки крови [3]. Ме
тодом иммуноферментного анализа установле
но, что в состав белков, формирующих транс
портирующий гормоны комплекс в крови здо
ровых доноров входит 0,015±0,0007 мг/мл аль
бумина. Методом иммунонефелометрии в про
бах обнаружен трансферин – транспортный
белок крови с подвижностью bглобулинов, что
согласуется с результатами Н.К. Грачевой и со
авторов [7]. Трансферин, согласно современным
представлениям, относится к классу липокали
нов и принимает участие в транспорте широко
го спектра биологически активных соединений
[8]. По данным иммуноферментного анализа, в
состав транспортного комплекса также входят
гликопротеин с доказанной транспортной, им
муномодулирующей и детоксицирующей фун
кцией aфетопротеин (6,7±0,3 нг/мл).
Полученные экспериментальные данные
позволяют сделать вывод о том, что в крови здо
ровых доноров в состав связывающего инсулин
комплекса входят транспортные белки, в том
числе, альбумин, aфетопротеин и трансферин.
Наличие в составе гормонтранспортиру
ющего комплекса трансферина, относящего
ся к липокалинам, послужило основанием для
изучения содержания в полученных фракци
ях липидов. В полученных аффинно гормон
транспортирующих фракциях проведено оп
ределение холестерола и триглицеридов. В
пробах здоровых доноров содержание холес
терола составило 0,07±0,0004 ммоль/л, содер
жание триглицеридов – 0,1010±0,003 ммоль/
л. Вероятно, полученные данные свидетель
ствуют о том, что изучаемый комплекс транс
портирует широкий спектр гидрофобных био
логически активных соединений.
Установлено, что в состав изучаемого ком
плекса входят следующие гидрофобные гормо
ны: тироксин (11,0±0,5 нмоль/л), трийодтиро
нин (1,3 ±0,06 нмоль/л), тестостерон (7,0±0,03
нмоль/л). Достоверного различия в содержа
нии липидов и гидрофобных гормонов во фрак
циях здоровых доноров и больных сахарным
диабетом не выявлено. В то же время, в составе
связывающих инсулин фракций выявлены не
значительные количества белковых гормонов:
1МЕ/мл лютеинизирующего гормона, 0,03
ВЕСТНИК ОГУ №6/ИЮНЬ`2009
477
Экология человека и социальная экология
мкМЕ/мл тиреотропного гормона, 0,5 МЕ/мл
пролактина. Полученные экспериментальные
данные свидетельствуют о том, что изучаемый
комплекс транспортирует не только гидрофоб
ные соединения, но и белковые гормоны.
Проведено разделение белков, принима
ющих участие в транспорте гормонов, мето
дом гельхроматографии при рН 2,8 и физио
логическом значении рН. При рН 2,8 иссле
дуемые белки разделились на два пика, соот
ветствующие молекулярному весу более 100
тысяч Д и около 50 тысяч Д. После плавного
доведения рН до физиологических значений
при гельхроматографии исследуемого комп
лекса белков получен один пик, соответству
ющий молекулярному весу более 100 тысяч Д.
Вероятно, это свидетельствует о том, что при
физиологических условиях исследуемые бел
ки ассоциируют, формируя ядро гормонтран
спортирующего комплекса.
Таким образом, установлено, что транспор
тирующие инсулин белки плазмы крови при
физиологических значениях рН формируют
транспортный комплекс, ядро которого в нор
ме формируют альбумин, a– фетопротеин и
трансферин. Выявленный транспортный ком
плекс является общим для ряда гидрофильных
и гидрофобных гормонов. Комплекс, наряду с
инсулином, включает примерно 50% всего со
держащегося в сыворотке трийодтиронина, зна
чительный процент тестостерона и других гид
рофобных гормонов, а также некоторое количе
ство белковых (пролактина) и гликопротеид
ных (лютеинизирующего и тиреотропного)
гормонов. Можно предположить, что транспор
тный комплекс содержит оптимальное для кле
ток соотношение гормонов и его биологическое
значение заключается в обеспечении дублиру
ющего механизма доставки гормонов за счет
клеточных рецепторов к транспортным белкам.
Показано, что в крови здоровых доноров
при физиологических условиях инсулин рас
пределяется между поверхностью эритроци
тов и плазмой крови с коэффициентом рас
пределения 0,52. В среднем с эритроцитами в
крови обследованных здоровых доноров свя
зано 33,03±2,66%.
Показано, что у лиц, занятых на нефтепере
рабатывающих производствах, происходит дос
товерное изменение состава белков ядра транс
портирующего гормоны комплекса: в гормонт
ранспортирующих комплексах, выделенных из
крови 35 лиц, работающих на предприятиях неф
теперерабатывающей промышленности, обна
ружено присутствие 2,6±0,036 нг/мл a1кислого
гликопротеина – белка острой фазы воспали
тельной реакции. Возможно, изменение состава
белков транспортирующего гормоны комплек
са может служить причиной нарушений транс
порта гормонов в крови обследованных.
Список использованной литературы:
1. Сандуляк Л.И. Эритроциты как депо и система транспорта инсулина // Доклады Академии наук С С С Р.1974.т. 219.
№4.с. 1020 – 1021;
2. Сандуляк Л.И, Ковалев В.П. – Иммунофлуоресцентный метод выявления инсулина в эритроцитах.Проблемы эндокри
нологии.1978.т. 24.№5.с. 77 – 78.
3. Гарипова М.И. Транспорт инсулина в крови человека. – Уфа.– РИЦ БашГУ.2007.127 С.(б);
4. Першина А.С., Киреева Н.А., Елисеева О.С, Гарипова М.И. Изучение эритроцитарного транспорта инсулина в норме и
при сахарном диабете первого типа.– Вестник Оренбургского государственного университета.В печати.
5. Гарипова М.И.. В.Ю., Умнова, Л.И Штыкова, Пиндюрина Т.Е. Инсулинсвязывающий компонент сыворотки человека в
норме и при заболевании сахарным диабетом первого типа.//Вестник Баш.гос.унта.2005.№4.– с.4446.
6. Остерман Л.А. Хроматография белков и нуклеиновых кислот. М.: Наука.1985.536 С.
7. Грачева Н.К., Харитоненков И.Г. Изучение «связанного инсулина» сывороток крови доноров и больных сахарным
диабетом методом кругового дихроизма. // Лабораторное дело.1977.стр.813.
8. Flower, D.R. the Lipocalin Protein Family: Structure and Function.// Biochem. J. 1996.– v. 318.– p. 114.
478
ВЕСТНИК ОГУ №6/ИЮНЬ`2009