Федеральное государственное бюджетное учреждение науки
реклама
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова Российской академии наук На правах рукописи БОГУШ Ирина Викторовна НАРУШЕНИЯ В ТИРЕОИДНОЙ И РЕПРОДУКТИВНОЙ СИСТЕМАХ КРЫС С ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫМ САХАРНЫМ ДИАБЕТОМ И ИХ КОРРЕКЦИЯ ИНТРАНАЗАЛЬНО ВВОДИМЫМ ИНСУЛИНОМ 03.01.04 – биохимия Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук А.О. Шпаков Санкт-Петербург – 2014 2 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ GppNHp – гуанилилимидодифосфат PACAP-38 – pituitary adenylyl cyclase-activating polypeptide-38, питуитарный АЦактивирующий полипептид длиной 38 аминокислотных остатков АЦ – аденилатциклаза АЦСС – аденилатциклазная сигнальная система БСА – бычий сывороточный альбумин ГГГ ось/система – гипоталамо-гипофизарно-гонадная ось/система ГГТ ось – гипоталамо-гипофизарно-тиреоидная ось ИИ – интраназальный инсулин ЛГ – лютеинизирующий гормон ПКА – протеинкиназа А СГСГ – секс-гормон-связывающий глобулина СД – сахарный диабет СД1, СД 1-го типа – сахарный диабет 1-го типа СД2, СД 2-го типа – сахарный диабет 2-го типа СТЗ – стрептозотоцин Т3 – трийодтиронин Т4 – тироксин ТРГ – тиролиберин, тиреотропин-рилизинг-гормон ТТГ – тиреотропный гормон ФСГ – фолликулостимулирующий гормон ХГЧ – хорионический гонадотропин человека ЩЖ – щитовидная железа 3 ВВЕДЕНИЕ....................................................................................................... 7-13 ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ............................................................... 14-39 1.1. Сахарный диабет ................................................................................... 14 1.2. Гипоталамо-гипофизарная система эндокринной регуляции ..... 14-34 1.2.1. Гипоталамо-гипофизарно-тиреоидная ось. Общие закономерности............................................................................. 16-19 1.2.2. ГГТ ось при сахарном диабете....................................................... 19-23 1.2.3. Функциональное состояние ГГТ оси в условиях экспериментального сахарного диабета.................................................. 23-27 1.2.4. Гипоталамо-гипофизарно-гонадная ось. Общие закономерности............................................................................. 27-29 1.2.5. ГГГ ось при сахарном диабете....................................................... 29-31 1.2.6. Функциональное состояние ГГГ оси в условиях экспериментального сахарного диабета.................................................. 31-34 1.3. Интраназальный способ введения инсулина................................... 34-36 1.4. Аденилатциклазная сигнальная система ......................................... 36-39 ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ...................................................... 40-55 2.1. Экспериментальные модели диабета ................................................ 40-43 2.1.1. Краткосрочная стрептозотоциновая модель острого СД1 на самцах крыс продолжительностью 30 суток ..................................... 40-41 2.1.2. Долговременная модель «мягкого» стрептозотоцинового СД1 на самцах крыс продолжительностью 7 месяцев........................... 41-42 2.1.3. Неонатальная модель СД2 на самцах крыс продолжительностью 3, 8 и 18 месяцев .................................................. 43 2.2. Оценка развития диабета..................................................................... 44 2.2.1. Определение содержания глюкозы в крови ..................................44 2.2.2. Определение сахара в моче .............................................................44 2.2.3. Тест на толерантность к глюкозе....................................................44 2.3. Определение содержания гормонов в сыворотке крови крыс..... 44-50 2.3.1. Определение уровня инсулина....................................................... 47 4 2.3.2. Определение уровня ТТГ................................................................ 48 2.3.3. Определение уровня тиреоидных гормонов................................. 48-49 2.3.4. Определение уровня общего тестостерона................................... 49-50 2.4. Тест с нагрузкой тиролиберином ....................................................... 50 2.5. Тест с нагрузкой люлиберином .......................................................... 50-51 2.6. Химические реактивы .......................................................................... 51 2.7. Выделение фракций частично очищенных плазматических мембран............................................................................ 51-52 2.8. Определение содержания белка.......................................................... 52-53 2.9. Определение активности аденилатциклазы.................................... 54 2.10. Определение ГТФ-связывания G-белков....................................... 54-55 2.11. Cтатистическая обработка полученных результатов.................. 55 ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ .............................................................................. 56-106 3.1. Характеристика моделей сахарного диабета ................................... 56-61 3.1.1. Краткосрочная стрептозотоциновая модель острого СД1 на самцах крыс продолжительностью 30 суток ..................................... 56-57 3.1.2. Пролонгированная стрептозотоциновая модель «мягкого» СД1 на самцах крыс продолжительностью 7 месяцев........................... 58-59 3.1.3. Неонатальная модель СД2 на самцах крыс продолжительностью 18 месяцев ............................................................ 59-61 3.2. Нарушения в гипоталамо-гипофизарно-тиреоидной оси.............. 62-76 3.2.1. Сравнительное изучение функционального состояния ГГТ оси у крыс с острым и «мягким» СД1 .......................... 62-64 3.2.2. Изучение ответа щитовидной железы крыс с острым и «мягким» СД1 на нагрузку тиролиберином ............................................................. 64-66 3.2.3. Функциональное состояние АЦСС в щитовидной железе крыс с острым и «мягким» СД1 ............................................................... 66-68 3.2.4. Чувствительность АЦСС в щитовидной железе крыс с острым и «мягким» СД1 к гормональным воздействиям................... 68-72 3.2.5. Функциональная активность АЦСС в щитовидной железе 5 самцов крыс с неонатальным диабетом 2-го типа ................................. 72-75 3.3. Влияние интраназального введения инсулина на функциональное состояние щитовидной железы у крыс с острым и «мягким» СД1.... 76-84 3.3.1. Влияние обработки различными дозами ИИ на массу тела и уровень глюкозы у крыс с острой и пролонгированной моделями СД1........................................................... 76-78 3.3.2. Влияние введения ИИ на уровень тиреоидных гормонов у крыс с острой моделью СД1.................................................................. 79-82 3.3.3. Влияние введения ИИ на уровень тиреоидных гормонов у крыс с пролонгированной моделью СД1 ................................................ 82-84 3.4. Нарушения в гипоталамо-гипофизарно-гонадной оси .................. 85-106 3.4.1. Суточная динамика изменения уровня тестостерона у здоровых животных и его регуляция люлиберином .......................... 85-86 3.4.2. Уровень тестостерона и регуляция ГГГ системы люлиберином у крыс с 30-ти суточной моделью острого СД1 ............ 87-89 3.4.3. Активность АЦСС в семенниках крыс с моделью острого СД1 ............................................................................... 89-93 3.4.4. Функциональная активность АЦСС в семенниках крыс с «мягким» пролонгированным СД1............................................................................ 93-94 3.4.5. Влияние обработки ИИ на функциональную активность АЦСС в семенниках крыс с пролонгированным 210-суточным «мягким» СД1 ............................................................................................ 94-97 3.4.6. Исследование суточной динамики уровня тестостерона у самцов крыс с неонатальным СД и оценка функциональной активности ГГГ оси с помощью нагрузки люлиберином ..................... 98-100 3.4.7. Изучение изменений функциональной активности АЦСС в семенниках самцов крыс с различной продолжительностью неонатальной модели СД2.................................. 101-103 3.4.8. Гормональная чувствительность АЦСС в семенниках самцов крыс с различной продолжительностью 6 неонатальной модели СД2........................................................................ 103-106 ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ ............................................................................ 107-125 4.1. Изменение тиреоидного статуса и функциональной активности АЦСС в щитовидной железе крыс с острым и пролонгированным («мягким») СД1, а также с неонатальным СД2 ..................................... 107-114 4.2. Влияние интраназального инсулина на функциональную активность щитовидной железы в условиях диабетической патологии ................ 114-119 4.3. Влияние экспериментального СД на функциональный статус гипоталамо-гипофизарно-гонадной системы и активность чувствительной к гонадотропинам АЦСС в тестикулярной ткани .. 119-125 ВЫВОДЫ .......................................................................................................... 126-127 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ ............................................................................. 128-151 ПРИЛОЖЕНИЕ............................................................................................... 152-154 7 ВВЕДЕНИЕ Актуальность проблемы. Одной из актуальных проблем современной медицины является разработка новых подходов для диагностики, лечения и мониторинга сахарного диабета (СД) и его осложнений. В мире СД болеют более 360 миллионов человек (в Российской Федерации – более 12 миллионов), из них около 10 % страдают инсулинозависимым СД 1-го типа (СД1), остальные 90 % – инсулиннезависимым СД 2-го типа (СД2). Более чем у 40 % больных СД выявлены тяжелые осложнения со стороны сердечно-сосудистой, нервной, выделительной и других систем организма, что приводит к временной или полной их нетрудоспособности, инвалидизации и, при неблагоприятном течении заболевания, к преждевременной смерти. В настоящее время все больше внимания уделяется нарушениям, которые возникают в тиреоидной и репродуктивной системах у больных СД, что ведет к развитию гипотиреоидных состояний, андрогенной недостаточности, синдрома поликистоза яичников, усугубляет дисфункции со стороны сердечно-сосудистой системы. Несмотря на значительные успехи, достигнутые в изучении осложнений со стороны эндокринной системы при СД, этиология, патогенез и молекулярные механизмы развития заболеваний репродуктивной системы и щитовидной железы (ЩЖ) в условиях СД до сих пор изучены недостаточно. В частности не выяснено, какие из звеньев гипоталамо-гипофизарно-тиреоидной (ГГТ) и гипоталамо- гипофизарно-гонадной (ГГГ) осей подвергаются наибольшим функциональным изменениям при СД и каковы молекулярные механизмы, лежащие в основе этих изменений. Ключевую роль в реализации эффектов гипофизарных гликопротеиновых гормонов играет аденилатциклазная сигнальная система (АЦСС), однако данные о взаимосвязи между функциональным состоянием АЦСС в ЩЖ и органах репродуктивной системы при СД, с одной стороны, и уровнем гипофизарных гликопротеиновых гормонов, тиреоидных и половых стероидных гормонов в условиях СД1 и СД2 отсутствуют. Важнейшим подходом для поиска эффективных путей лечения, прогнозирования и профилактики осложнений СД является разработка 8 адекватных моделей СД1 и СД2 с применением экспериментальных животных. В экспериментальной эндокринологии для моделирования СД1 широко используются краткосрочная стрептозотоциновая модель заболевания, вызываемая одноразовой обработкой высокой дозой стрептозотоцина (СТЗ), для которой характерна абсолютная инсулиновая недостаточность и выраженная гипергликемия, а также модели СД2 на мутантных линиях грызунов, которые характеризуются ожирением и резистентностью тканей к инсулину. Однако эти модели имеют лишь отдаленное сходство с соответствующими заболеваниями человека. Так у животных с острой моделью СД1 в полной мере не успевают развиться осложнения этого заболевания, а спектр и степень выраженности функциональных изменений в эндокринной системе заметно отличаются от таковых при СД1 человека. Для увеличения продолжительности заболевания необходимо лечение инъекционным инсулином, что приводит к гипогликемическим эпизодам, которые сами вызывают нарушения со стороны ЦНС и функционально связанных с ней ГГТ и ГГГ осей. Исходя из этого, необходимы длительные модели СД1, лишенные указанных недостатков. Среди моделей СД2 наибольший интерес представляет неонатальная модель, которую вызывают инъекцией СТЗ новорожденным крысятам [1, 2]. Она характеризуется сильно выраженной инсулиновой резистентностью и дислипидемией, характерными признаками СД2 человека, и большой длительностью, что позволяет проследить развитие осложнений со стороны эндокринной и других систем организма. Для лечения СД традиционно используют инъекционный инсулин, применение которого приводит к снижению гипергликемии, но не в полной мере устраняет дефицит инсулина в мозге, одну из первопричин развития нейродегенеративных экспериментальные заболеваний. доказательства В того, последние что годы повышение получены концентрации инсулина в мозге путем его интраназального введения положительно влияет на функционирование ЦНС, устраняет развивающийся в условиях СД когнитивный дефицит, повышает чувствительность периферических тканей к инсулину [2, 3]. 9 Это позволяет рекомендовать интраназальный инсулин (ИИ) для лечения СД и его осложнений, в том числе со стороны эндокринной системы, поскольку повышение уровня инсулина в мозге может восстановить функции ГГТ и ГГГ осей, нарушенные вследствие инсулиновой недостаточности (СД1) или инсулиновой резистентности (СД2). Однако исследования влияния длительного воздействия ИИ на функции тиреоидной и репродуктивной систем в условиях СД не проводились. Следует подчеркнуть, что актуальность и необходимость таких исследований связана еще и с тем, что в последние годы ИИ стали широко применять в клинике для лечения пациентов с болезнью Альцгеймера и неврологическими расстройствами недиабетической этиологии. Все это требует комплексного изучения влияния длительной терапии ИИ на эндокринную и другие системы организма как в условиях СД, так и в отсутствие диабетической патологии. Цели и задачи исследования. Цель работы состояла в изучении нарушений гипоталамо-гипофизарнотиреоидной и гипоталамо-гипофизарно-гонадной осей у самцов крыс с пролонгированными моделями сахарного диабета 1-го и 2-го типов и в исследовании влияния на них длительной обработки с помощью интраназально вводимого инсулина. В соответствии с этим в конкретные задачи исследования входило: 1. Получить пролонгированную модель мягкого СД 1-го типа и неонатальную модель СД 2-го типа на самцах крыс, охарактеризовать их по метаболическим показателям, сравнить модель мягкого СД 1-го типа с наиболее часто используемой краткосрочной моделью острого СД 1-го типа. 2. Изучить функциональное состояние гипоталамо-гипофизарно- тиреоидной оси у крыс с пролонгированным мягким СД 1-го типа по содержанию у них тиреоидных гормонов и тиреотропного гормона (ТТГ), теста с нагрузкой тиролиберином, и сравнить полученные результаты с аналогичными показателями у крыс с краткосрочным острым СД 1-го типа. 10 3. Провести сравнительное исследование функциональной активности гормоночувствительной аденилатциклазной сигнальной системы (АЦСС), ответственной за продукцию тиреоидных гормонов, в щитовидной железе крыс с моделями мягкого и острого СД 1-го типа. 4. Исследовать влияние длительной обработки крыс с моделями острого и мягкого СД 1-го типа различными дозами интраназально вводимого инсулина (ИИ) на содержание у них тиреоидных гормонов и ТТГ, чувствительность ГГТ оси к тиролиберину, а также на функциональную активность гормоночувствительной АЦСС в щитовидной железе. 5. Изучить функциональное состояние гипоталамо-гипофизарно-гонадной оси у самцов крыс с моделями СД 1-го и 2-го типов с помощью мониторинга содержания уровня тестостерона и теста с нагрузкой люлиберином. 6. Исследовать функциональную активность гормоночувствительной АЦСС в семенниках диабетических крыс, и изучить влияние на нее длительной обработки животных с помощью ИИ. Основные положения, выносимые на защиту 1. У крыс с пролонгированной моделью мягкого СД 1-го типа снижены уровни тиреоидных гормонов на фоне повышенного уровня ТТГ, что характерно для СД 1-го типа человека. 2. Одной из причин снижения уровня тиреоидных гормонов у крыс при СД 1-го типа является ослабление чувствительности АЦСС к регуляторному действию ТТГ в щитовидной железе. 3. Длительная обработка крыс с СД 1-го типа с помощью ИИ частично восстанавливает уровень тиреоидных гормонов и активность АЦСС в щитовидной железе, но при этом значительно повышает у них уровень ТТГ. Повышение ТТГ отмечено также при обработке ИИ здоровых животных. 4. При СД 1-го и 2-го типа у крыс снижен уровень тестостерона, ослаблен ответ гипоталамо-гипофизарно-гонадной оси на люлиберин и снижена чувствительность АЦСС семенников к гонадотропину и пептидным гормонам. 11 Длительная обработка ИИ частично восстанавливает чувствительность АЦСС семенников к гонадотропину. Научная новизна Разработана модель мягкого СД1 продолжительностью семь месяцев, которая характеризуется относительной инсулиновой недостаточностью и умеренной гипергликемией, более близкая по ряду характеристик СД1 человека в сравнении с острой СТЗ моделью заболевания. Впервые показано, что у крыс с пролонгированной моделью СД1 снижается уровень тиреоидных гормонов при повышении содержания ТТГ, что указывает на развитие у них гипотиреоидного состояния. Эти изменения существенно отличаются от таковых при остром СД1, и сходны с изменениями тиреоидного статуса у пациентов с СД1, что свидетельствует об адекватности использования пролонгированной модели для изучения функций ГГТ оси при СД1 человека. Впервые показано, что чувствительность АЦСС к ТТГ в ЩЖ крыс с пролонгированными моделями СД1 и СД2 снижена, что свидетельствует о развитии резистентности ЩЖ к регуляторному действию ТТГ и является одной из ключевых причин снижения уровня тиреоидных гормонов при СД. Впервые изучено влияние длительной обработки ИИ на тиреоидный статус и показано, что ИИ в дозах 0.5–0.6 МЕ/крысу в значительной степени восстанавливает уровень тиреоидных гормонов у крыс с СД1, но при этом повышает уровень ТТГ, причем это повышение обнаружено и при обработке ИИ здоровых животных. Впервые показано, что у крыс с СД1 и СД2 снижается уровень тестостерона и ослабляется ответ семенников нарушениях в на ГГГ обработку оси и люлиберином, развитии что андрогенной свидетельствует о недостаточности у диабетических животных. Впервые установлено, что одной из причин снижения продукции андрогенов при СД является ослабление функциональной активности АЦСС в семенниках диабетических крыс и снижение ее чувствительности к регуляторному действию гонадотропина, причем эти нарушения в значительной степени восстанавливались при длительной обработке ИИ. 12 Теоретическое и практическое значение работы. Разработанная и охарактеризованная в работе пролонгированная модель мягкого СД1 может быть использована для изучения нарушений ГГТ оси в условиях СД1, поскольку по изменению гормональных показателей тиреоидной системы она сходна с СД1 человека. Установлен один из ключевых молекулярных механизмов, лежащих в основе развития резистентности ЩЖ и семенников к гипофизарным гликопротеиновым гормонам в условиях СД, в основе которого лежит снижение чувствительности АЦСС в этих тканях к регуляторному действию функционирования ТТГ тиреоидной и гонадотропинов. системы при Восстановление длительной обработке диабетических крыс с помощью ИИ указывает на его терапевтический потенциал для коррекции нарушений со стороны ГГТ оси при СД. При этом выявлено повышение уровня ТТГ, которое наблюдается при длительной обработке ИИ как диабетических, так и здоровых крыс, что необходимо учитывать при использовании ИИ для лечения СД, болезни Альцгеймера и нейрологических расстройствах. Идентификация гормональных нарушений в ГГТ и ГГГ осях при СД и их коррекция с помощью ИИ открывают новые перспективы для диагностики, лечения и профилактики дисфункций ЩЖ и репродуктивной системы в условиях СД1 и СД2. Результаты работы могут быть использованы в курсах лекций для студентов биологического и медицинского факультетов Санкт-Петербургского государственного университета, СанктПетербургской государственной химико-фармацевтической академии, Первого Санкт-Петербургского государственного медицинского университета им. акад. И. П. Павлова и других биологических и медицинских вузов. Апробация работы. Результаты исследования представлены на Международной молодежной конференции «Биология – наука XXI века» (Москва, 2012), Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Инновационные технологии в гематологии и диабетологии» (Санкт-Петербург, 2012), III Конференции Молодых ученых Института цитологии РАН (Санкт- 13 Петербург, 2012), Международной конференции «Рецепторы и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2013), XXII съезде Физиологического общества им. И.П. Павлова (Волгоград, 2013), Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Инновационные технологии в нейроэндокринологии, нейронауках и гематологии» (Санкт-Петербург, 2013), III Российском конгрессе проблемы» (Санкт-Петербург, синдром: «Метаболический 2013), междисциплинарные Всероссийской конференции с международным участием «Трансляционные исследования в инновационном развитии здравоохранения» (Санкт-Петербург, 2014), IV Съезде физиологов стран СНГ (Сочи–Дагомыс, 2014). Публикации По материалам диссертации опубликовано 16 печатных работ, в том числе 6 статей в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК РФ. Личный вклад автора Все экспериментальные данные, приведенные в диссертационной работе, получены лично автором или при его непосредственном участии. Автор проводил статистическую обработку полученных данных, осуществлял их анализ и обобщение, принимал участие в подготовке публикаций по материалам работы. Структура и объем диссертации Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов исследования, их обсуждения и выводов. Работа изложена на 154 страницах, включая 29 рисунков, 19 таблиц и приложение. Список цитируемой литературы содержит 189 ссылок. Благодарности. Работа выполнялась при финансовой поддержке Программы Российского Научного Фонда № 14-15-00413, Молодежного гранта РФФИ № 12-04-32034 (руководитель Мойсеюк (Богуш) И.В.), Федеральной целевой программы министерства образования и науки РФ (соглашение № 8486), гранта Правительства Санкт-Петербурга для студентов, аспирантов, молодых ученых, молодых кандидатов наук 2012 года. 14 ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Сахарный диабет Сахарный диабет — одно из самых распространенных заболеваний, которым в мире страдают более 365 миллионов человек. Несмотря на большой прогресс, достигнутый в последние годы в изучении СД, этиология и патофизиология этого заболевания по-прежнему изучены недостаточно. Как при СД1, для которого характерны инсулиновая недостаточность и выраженная гипергликемия, так и при СД2, который развивается вследствие резистентности тканей к инсулину и характеризуется гиперинсулинемией, в наибольшей степени поражаются сердечно-сосудистая, выделительная и нервная системы [46]. Однако в настоящее время все больше внимания уделяется нарушениям, возникающим в эндокринной системе, которые во многих случаях являются пусковым механизмом, приводящим к многочисленным осложнениям СД. Важнейшими компонентами эндокринной системы являются ГГГ и ГГТ оси, основные функции которых состоят в контроле репродуктивной системы, ЩЖ и других жизненно важных систем организма человека и животных [7, 8]. 1.2. Гипоталамо-гипофизарная система эндокринной регуляции Одной из важнейших функций мозга является поддержание организмом гомеостаза. Ключевую роль в этом процессе играет гипоталамус, который представляет собой часть ЦНС. Он участвует в управлении и контроле функций эндокринных желез. В гипоталамусе расположены нейросекреторные ядра и центры, принимающие участие в регуляции синтеза и секреции гормонов аденогипофиза [9]. Гипоталамусом секретируются как собственно гипоталамические гормоны (вазопрессин, окситоцин, нейротензин), так и биологически активные вещества (рилизинг-факторы), угнетающие или усиливающие секреторную функцию гипофиза (соматостатин, тиролиберин (ТРГ), люлиберин, кортиколиберин, соматолиберин и др.) (рис. 1.1). 15 Рис. 1.1. Гипоталамо-гипофизарная система эндокринной регуляции. ТТГ - тиреотропный гормон, АКТГ - адренокортикотропный гормон, СТГ соматотропный гормон, ФСГ - фолликулостимулирующий гормон, ЛГ - лютеинизирующий гормон, ЛТГ - лактотропный гормон, АДГ - антидиуретический гормон Гипофизотропные гормоны гипоталамуса, высвобождаясь в портальную систему гипофиза, достигают клеток передней доли гипофиза, непосредственно влияя на их секреторную активность, угнетая или стимулируя секрецию тропных гормонов гипофиза, которые в свою очередь стимулируют работу периферических желез внутренней секреции. 16 Передняя доля гипофиза — это важнейший орган регуляции основных функций организма. Здесь вырабатываются шесть тропных гормонов, регулирующих секреторную активность периферических эндокринных желез — тиреотропный гормон (ТТГ), адренокортикотропный гормон, соматотропный гормон, лактотропный гормон (пролактин) и два гонадотропных гормона, регулирующих функции периферических половых желез – фолликулостимулирующий (ФСГ) и лютеинизирующий (ЛГ). ТТГ контролирует функционирование ЩЖ, адренокортикотропный гормон регулирует работу коркового вещества надпочечников, соматотропный гормон опосредованно (через соматомедины или инсулиноподобные факторы роста) контролирует процессы роста и развития костной системы, хрящей и мышц. Гипофиз тесно связан с гипоталамусом, вместе с которым является связующим звеном между мозгом, периферической нервной системой и системой кровообращения (рис. 1.1) [10]. 1.2.1. Гипоталамо-гипофизарно-тиреоидная ось. Общие закономерности ТРГ, секретируемый гипоталамусом, проходит в аденогипофиз через портальную систему гипофиза, где он активирует клетки – тиротрофы, ответственные за выработку ТТГ. Секреция ТТГ тормозится с помощью ТРГ по механизму обратной связи, а также под действием других гормонов (в том числе соматостатина и дофамина) и цитокинов, в том числе интерлейкина-1β, интерлейкина-6 и фактора-α некроза опухолей [11]. Действие ТТГ на ткани ЩЖ происходит вследствие активации рецепторов ТТГ, расположенных на поверхности клеток ЩЖ – тироцитов. Рецепторы ТТГ являются трансмембранными рецепторами, семь раз пронизывающими плазматическую мембрану [12]. Через посредство гетеротримерных Gs- и Gqбелков они функционально сопряжены с ферментами, генераторами вторичных посредников – аденилатциклазой (АЦ), катализирующей образование цАМФ, и фосфолипазой С, которая ответственна за синтез 1,4,5-трифосфоинозитола и диацилглицерина, повышающих концентрацию внутриклеточного кальция [13]. Хотя основной путь передачи генерируемого ТТГ сигнала реализуется через 17 АЦСС с участием Gs-белков [14], передача сигнала через Gq-белки к фосфолипазе С также играет важную роль в процессах роста ЩЖ и синтеза тиреоидных гормонов [15, 16] (рис. 1.2). Рис. 1.2. Передача гуанозинтрифосфат, сигнала ГДФ фосфатидилинозитолдифосфат, ИФ3 через рецептор гуанозиндифосфат, - ТТГ. ГТФ ФИФ2 инозитолтрифосфат, ДАГ - диацилглицерин, ПКС - протеинкиназа С, АТФ - аденозинтрифосфат, цАМФ циклический аденозинмонофосфат, ПКА - протеинкиназа А 18 Клетки ЩЖ вырабатывают весь пул тироксина (Т4) и 20 % трийодтиронина (T3). Остальные 80 % T3 образуются вследствие конверсии Т4 в Т3, осуществляемой с помощью дейодиназ в ЦНС и периферических тканях. Т4 и Т3 транспортируются в кровь в связанном с белками состоянии. Тиреоидные гормоны, не связанные с белками-переносчиками представляют собой лишь незначительную часть общего пула тиреоидных гормонов, циркулирующих в крови (0.03 % для T4; 0.3 % для T3). Свободный Т3 проникает через плазматическую и ядерную мембраны клеток и специфически взаимодействует с локализованным в ядре Т3-рецептором, функционирующим как транскрипционный фактор. Это взаимодействие приводит к изменению экспрессии генов, кодирующих белки, ответственные за ростовые и метаболические процессы, находящиеся под контролем гормонов ЩЖ. Циркулирующие в крови Т4 и Т3 по механизму обратной связи влияют на способность гипофиза и гипоталамуса контролировать синтез и секрецию ТРГ и ТТГ, что позволяет поддерживать уровень тиреоидных гормонов в крови в пределах нормы (рис. 1.3) [17]. 19 Рис.1.3. ГГТ ось и ее основные функции 1.2.2. ГГТ ось при сахарном диабете Заболевания ЩЖ, так же как и СД, являются наиболее распространенными эндокринными заболеваниями. Как показали исследования последних лет, между заболеваниями ЩЖ и СД существует тесная взаимосвязь. Еще в 1980-е годы появились первые данные о том, что у пациентов с СД1 значительно чаще встречается субклинический гипотиреоз с повышенным уровнем ТТГ и нормальным содержанием тиреоидных гормонов [18]. В дальнейшем было показано, что среди дисфункций ЩЖ, ассоциированных с СД1, на первом месте стоит аутоиммунный тиреодит (20-30 %), на втором субклинический гипотиреоз (5-8.6 %) и клинический гипотиреоз (5.7 %), для 20 которых характерны повышенный уровень ТТГ, на фоне сниженного или нормального уровня свободного Т4, в то время как гипертиреоз встречается не так часто (1 %) [19]. Другие авторы отмечали клинический и субклинический гипотиреоз у 38 % больных СД1, основной причиной возникновения которого является аутоиммунный тиреоидит [8]. У пациентов с СД2 встречаемость заболеваний ЩЖ также достоверно выше, чем в остальной популяции, но различия в этом случае не столь значительны, как при СД1 [20, 21]. В основе высокой встречаемости заболеваний ЩЖ у пациентов с СД1 и СД2 лежат многие факторы, в том числе генетические. Так некоторые генные мутации, которые ассоциированы с развитием СД, с высокой частотой выявляются и у пациентов с аутоиммунным тиреоидитом [22-25]. Установлено, что СД и заболевания ЩЖ влияют друг друга. С одной стороны, гормоны ЩЖ регулируют метаболизм углеводов и функции поджелудочной железы, и с другой стороны, гипергликемия и нарушения инсулиновой сигнализации влияют на функции ЩЖ и всей ГГТ оси [26, 27]. Тиреоидные гормоны влияют на метаболизм глюкозы посредством нескольких механизмов. Имеются данные о том, что гипертиреоз приводит к усилению гипергликемии [28]. При гипертиреозе время полураспада инсулина уменьшается вследствие увеличения скорости его деградации и возрастания содержания биологически неактивных прекурсоров инсулина [29, 30]. При болезни Грейвса (диффузный токсический зоб), для которой характерен повышенный уровень тиреоидных гормонов, наблюдали увеличенные уровни проинсулина в ответ на прием пищи [31]. Кроме того, нелеченный гипертиреоз связан с уменьшением соотношения C-пептид/проинсулин, что, по-видимому, вызвано нарушениями синтеза инсулина [32]. Другим механизмом, связывающим гипертиреоз и гипергликемию, является увеличение поглощения кишечником глюкозы, вызванное избыточным содержанием тиреоидных гормонов [33, 34]. При гипертиреозе увеличивается эндогенная продукция глюкозы. Тиреоидные гормоны вызывают повышение экспрессии и содержания GLUT2 на поверхности мембран гепатоцитов, что приводит к изменению 21 транспорта глюкозы и вносит вклад в нарушение углеводного метаболизма [35, 36]. При гипертиреозе наблюдается усиление липолиза, что ведет к увеличению продукции свободных жирных кислот, которые стимулируют глюконеогенез в печени. Этот процесс также можно объяснить усилением липолиза, вызванного стимуляцией катехоламинами, уровень которых возрастает при повышении концентрации тиреоидных гормонов [37]. Более того, неокислительный путь утилизации глюкозы связан с гиперпродукцией лактата, который затем поступает в цикл Кори и усиливает глюконеогенез в печени. Увеличение уровней гормона роста, глюкагона и катехоламинов в условиях гипертиреоза вносит вклад в ослабление толерантности к глюкозе (рис. 1.4) [38-40]. Установлено, что у больных СД с гипертиреозом наблюдается ухудшение гликемического контроля, причем тиреотоксикоз ускорял развитие кетоацидоза. А. Б. Рис. 1.4. А. Взаимосвязь гипертиреоза с гипергликемией; Б. Взаимосвязь гипотиреоза с гипогликемией 22 При гипотиреозе метаболизм глюкозы также регулируется по нескольким путям (рис. 1.4). Так у диабетических пациентов с гипотиреозом снижаются скорость продукции глюкозы в печени и потребность в инсулине [41]. У больных СД1 с гипотиреозом наблюдались более частые эпизоды гипогликемии по сравнению с эутиреоидными больными СД, и при заместительной терапии тиреоидными гормонами эти эпизоды становятся более редкими и менее выраженными [42]. Имеются доказательства того, что как клинический, так и субклинический гипотиреоз являются инсулинрезистентными состояниями [4345]. Исследования in vivo и in vitro показали, что это результат ухудшения стимулируемой инсулином утилизации глюкозы в периферических тканях [43, 44, 46, 47]. Показано, что гипотиреоз является фактором риска при метаболическом синдроме [26]. Более того у больных СД2 с субклиническим гипотиреозом увеличен риск развития нефропатии [20]. Это можно объяснить уменьшением минутного периферического сердечного сопротивления выброса сосудов, и которые увеличением общего наблюдаются при гипотиреозе, что ведет к уменьшению почечного кровообращения и скорости клубочковой фильтрации [48]. Лечение гипотиреоза у диабетических больных восстанавливает почечную функцию [49]. При изучении случаев ретинопатии у пациентов с СД1 было показано, что при наличии субклинического гипотиреоза ретинопатия встречается чаще, чем у эутироидных диабетических больных [50]. Следует отметить тесную взаимосвязь между нефропатией, ретинопатией, нейропатией, сердечно-сосудистыми заболеваниями и состоянием тиреоидной системы у диабетических пациентов. Вследствие этого выявление заболеваний ЩЖ у больных СД является одной из актуальных задач клинической эндокринологии, и предусматривает скрининг диабетических пациентов на скрытый гипотиреоз и его своевременную коррекцию. Эутиреоидных пациентов с СД1 без дисфункций со стороны ЩЖ, рекомендуется ежегодно обследовать на содержание ТТГ, эутиреоидных пациентов с СД2 — ежегодно в том случае, когда уровень ТТГ выше 2 мкЕд/мл или отмечается положительная реакция на анти-ТПО, или каждые 3–5 лет, если уровень ТТГ ниже 2 мкЕд/мл и 23 отсутствуют антитела к тиреопероксидазе [19]. Наряду с этим, для изучения взаимосвязи между СД и дисфункциями ЩЖ и поиска эффективных путей для их коррекции необходимы модели СД на животных, соответствующие по гормональным показателям СД человека. 1.2.3. Функциональное состояние ГГТ оси в условиях экспериментального сахарного диабета Основные результаты о функционировании ГГТ оси при СД1 были получены на животных с моделями аллоксанового и стрептозотоцинового (СТЗ) СД, для которых характерны ярко выраженная гипергликемия и острый дефицит инсулина [51-55]. У животных с СД1 отмечали широкий спектр нарушений функций ЩЖ и ГГТ оси, но механизмы этих нарушений и их соответствие таковым при СД1 человека до сих пор не выяснены. Показано, что при СД1 ослабляется функциональная активность гипоталамуса, что ведет к снижению секреции ТТГ гипофизом и приводит к гипофункции ЩЖ. Так через 72 ч после инъекции СТЗ у крыс Sprague-Dawley в сравнении с контролем значительно снижался уровень Т4, Т3 и ТТГ [56]. Снижение уровня ТТГ было вызвано снижением на 46 % уровня циркулирующего в крови ТРГ. У крыс линии Wistar с СД1, наряду со снижением уровней Т3, Т4 и ТТГ, было значительно снижено содержание иммунореактивного ТРГ в гипоталамусе (прогормона ТРГ) спустя 2 и 4 недели после инъекции СТЗ. Снижен был и ответ ГГТ оси на стимуляцию холодом (4 °С), что приводило к снижению концентрации иммунореактивного ТРГ и ТТГ в плазме крови диабетических крыс [53]. Ряд ученых показали, что уменьшение уровня ТРГ у крыс с СД1 связано со снижением секреции ТРГ, а не с уменьшением его абсолютного содержания [57, 58]. В условиях in vitro было показано, что базальная секреция иммунореактивного ТРГ в медио-базальном гипоталамусе значительно снижена у крыс Sprague-Dawley через месяц после индукции СД1 [55, 57]. Другими исследователями было показано, что, несмотря на нормальное содержание ТРГ в 24 гипоталамусе диабетических крыс линии Wistar, секреция ТРГ у них была значительно снижена [58]. Некоторые исследователи устанавливают связи между морфологическими изменениями в гипоталамусе крыс с СД1 и снижением секреции ТРГ гипоталамусом [58, 59]. Используя световую и электронную микроскопию, они показали, что у крыс с СД1 значительно увеличивается накопление гликогена в телах (перикарионах) нейронов, таницитах и глиальных клетках вокруг аркуатных ядер гипоталамуса, в особенности в его базальной области. Нейроны в аркуатных ядрах диабетических крыс имели фрагментированный эндоплазматический ретикулум, в них отсутствовали некоторые органеллы, очертания ядер и клеток были неравномерны, что указывает на повреждение клеток. Танициты были гипертрофированы. Ультраструктурные исследования показали, что танициты утрачивали апикальные процессы, имели уменьшенное число органелл, и увеличенное отношение ядер к цитоплазме [55]. Согласно исследованиям, ТРГ высвобождается нейронами из области срединного дугообразного возвышения. Активность этих нейронов зависит от интактных взаимодействий с передним гипоталамусом. Следовательно, ультраструктурные изменения вокруг аркуатных ядер в мозге диабетических крыс могут быть ответственны за уменьшение секреции ТРГ [60]. Нейрохимические основы изменений секреции ТРГ у диабетических крыс изучены недостаточно. Эксперименты на контрольных крысах указывают на то, что активация серотонинергической системы может приводить к ингибированию секреции ТТГ, преимущественно за счет центрального ингибирования высвобождения ТРГ. В пользу этого свидетельствует обнаружение обратной зависимости между уровнем серотонина и содержанием ТРГ в гипоталамусе [61]. Ряд авторов указывают на ослабление функции гипофиза в условиях диабетической патологии, что приводит к уменьшению секреции ТТГ. Методом обратного локального гемолиза in vitro было показано, что секреция ТТГ в тиротрофах диабетических крыс существенно снижается по сравнению со 25 здоровыми животными [62]. В условиях in vitro было показано, что в тиротрофах гипофиза крыс Sprague-Dawley с СД1 базальная секреция ТТГ была значительно снижена по сравнению с тиротрофами, изолированными из гипофиза контрольных крыс [63]. Внутриклеточное содержание ТТГ в тиротрофах крыс с СД1 было снижено на 45 % по сравнению с контролем, и индуцированная ТРГ секреция ТТГ в тиротрофах диабетических крыс была на 30 % ниже по сравнению с тиротрофами контрольных животных. У крыс со стрептозотоциновой моделью острого СД1, уровни ТТГ, Т4 и Т3 в плазме были снижены. Гипофиз у диабетических животных был значительно легче по сравнению со здоровыми животными. Более того, количество тиротрофов II типа, которые в наибольшей степени связывают ТТГ, превышало таковое тиротрофов I типа, а соотношение тиротрофов было противоположным их соотношению в контроле [57]. Другие исследователи выявили нарушения непосредственно в ЩЖ животных с моделью острого СД1, приводящие к гипотиреозу. Как in vitro, так и in vivo было показано, что у крыс Wistar при СД1, индуцированном высокими дозами СТЗ, ослаблен захват йода, снижено соотношение количества йода в ЩЖ к количеству йода в сыворотке крови, снижена продукция ЩЖ органического йода. Это указывает на то, что ослабление функций ЩЖ в этом случае может не зависеть от содержания ТТГ в плазме [51]. У диабетических крыс была значительно снижена скорость метаболического (общего) клиренса Т4 и Т3. Скорости образования Т4 и Т3 у крыс с острым СД1 также были значительно снижены [64]. В работе [52] показано, что через одну неделю после введения крысам СТЗ снижалось монодейодирование внешнего кольца Т4 и Т3, конверсия 3’,5’дийодтирозина в 3’-монойодтирозин и монодейодирование внешнего кольца Т3 и 3,5-дийодтирозина как в присутствии донора тиольной группы (дитиотреитола), так и в его отсутствие. Эти данные позволяют предположить, что в условиях экспериментального СД активность монодейодиназ снижена [52]. Исследователи предположили, что это может быть причиной синдрома низкого 26 Т3, отмеченного у пациентов с инсулинозависимым СД [65], а также в опытах in vitro на срезах печени диабетических крыс [66]. Ответ ЩЖ на введение ТТГ у диабетических мышей был снижен вследствие ультраструктурных нарушений в ткани ЩЖ, следствием чего являются снижение образования связанных с белками меченых [127I]– и [131I]– йодтиронинов и скорости гидролиза меченного тиреоглобулина [67]. Другие авторы показали, что эпителиальные клетки ЩЖ у диабетических крыс имели грубо расплющенный эндоплазматический ретикулум, пониженное содержание коллоида, а в фолликулярных клетках ЩЖ наблюдали дефицит экзоцитолитических вершинных и эндоцитолитических везикул и сниженное количество иммунореактивного тиреоглобулина [55]. Таким образом, СД1 влияет на все три уровня метаболической регуляции ГГТ оси [68]. В то же время пациенты с СД1 редко страдают гипотиреозом в условиях адекватной терапии инсулином [65, 67]. На животных моделях было показано, что лечение инсулином приводит к коррекции гипотиреоидного состояния. При введении мышам инсулина в дозе 6 ЕД/100 г в течение 12 дней приводило к восстановлению секреции ТТГ, сниженной у животных с СД1 [67]. Инсулиновая терапия также восстанавливала метаболический клиренс и скорость превращения Т4 в Т3 [64], и нормализовала захват йода ЩЖ диабетических крыс [51]. До конца не ясно как инсулиновая терапия улучшает функцию ГГТ оси при СД, тем более, что некоторые исследователи показали, что гипергликемия непосредственно не отвечает за снижение тиреоидных гормонов в условиях СД1 [69]. У крыс при системном ацидозе, вызванном хлоридом аммония, значительно снижалось содержание ТТГ в гипофизе. Тем не менее, уровни тиреоидных гормонов у них были сходными с таковыми у контрольных животных. Секреция гипофизом ТТГ в ответ на введение ТРГ у крыс с краткосрочным СД1 и у крыс с системным ацидозом различалась несущественно. Показано, что преинкубация тиротрофов с 25 мМ глюкозой слабо влияла на секрецию ими ТТГ при стимуляции ТРГ [63]. У здоровых крыс 27 увеличение концентрации глюкозы от 10 до 30 мМ в условиях in vitro не влияло на секрецию ТРГ гипоталамусом [58]. С другой стороны известно, что тиреоидные гормоны непосредственно влияют на метаболизм глюкозы [70]. Кроме того, как показано на животных моделях, ТРГ локализуется в β-клетках поджелудочной железы вместе с инсулином и может оказывать защитное антидиабетическое действие [71]. 1.2.4. Гипоталамо-гипофизарно-гонадная ось. Общие закономерности Гипоталамус высвобождает люлиберин, который действует на G-белоксопряженные рецепторы серпантинного типа, специфичные к этому рилизингфактору, которые локализованы в гонадотрофах аденогипофиза, что вызывает секрецию ими ЛГ и ФСГ. Различное влияние люлиберина на секрецию гонадотропинов (ЛГ, ФСГ) связано с пульсирующей секрецией этого рилизинггормона. Быстрочастотная секреция люлиберина снижает секрецию обоих гонадотропинов; медленночастотная пульсация секреции люлиберина повышает уровень ФСГ относительно ЛГ, а инфузия люлиберина с постоянной скоростью ингибирует секрецию как ФСГ, так и ЛГ [10]. Гонадотропины являются ключевыми регуляторами синтеза стероидов в гонадах и, как и в случае люлиберина, их рецепторы также являются рецепторами серпантинного типа, функционально сопряженными с G-белком. Активация рецептора гонадотропином приводит к активации сопряженного с ним Gs-белка, стимуляции активности внутриклеточного фермента уровня АЦ, цАМФ и что вызывает запускает повышение цАМФ-зависимые внутриклеточные сигнальные каскады, ответственные за регуляцию синтеза стероидных гормонов. Наряду с АЦ, активация рецептора ЛГ или рецептора ФСГ может приводить к активации фосфолипазы С и гидролизу фосфоинозитидов, что, в конечном итоге, вызывает повышение концентрации внутриклеточного кальция и запуску кальций-зависимых сигнальных каскадов (рис. 1.5) [11]: 28 Рис. 1.5. Гипоталамо-гипофизарно-гонадная ось. цАМФ - циклический аденозинмонофосфат, ПКА - протеинкиназа А, ДАГ - диацилглицерин, ПКС протеинкиназа С, ИФ3 - инозитолтрифосфат Механизмы активации рецепторов ЛГ и ФСГ являются общими для мужчин и женщин, а различия возникают на уровне клеток – мишеней действия гонадотропных гормонов в половых железах. ФСГ стимулирует процесс сперматогенеза, который осуществляется в извитых канальцах, выстланных клетками Сертоли. ЛГ стимулирует выработку тестостерона в клетках Лейдига. Уровень тестостерона в сыворотке крови, как и глюкокортикоидов, существенно меняется на протяжении суток. Так, например, у человека наибольшее повышение уровня тестостерона отмечается утром, в 7.00–9.00, а самый низкий уровень отмечен ночью, с 24.00 до 3.00. Тестостерон и другие андрогены отвечают за формирование вторичных мужских половых признаков (оволосение 29 на лице, в подмышечных впадинах, рост гениталий и т.д.), обеспечивают либидо и потенцию, обладают анаболической активностью, стимулируют рост скелета и всех тканей организма, что проявляется увеличением массы тела и объема мышц [17]. 1.2.5. ГГГ ось при сахарном диабете У пациентов с СД1 и СД2 при неадекватном гликемическом контроле наблюдаются нарушения функций репродуктивной системы. У мужчин с СД часто выявляют импотенцию, сниженное либидо, ослабленный сперматогенез [72, 73]. Причиной этого являются нарушения в периферической автономной нервной системе и циркуляторные изменения, которые часто возникают при СД и являются основными причинами импотенции [72]. Можно полагать, что важную роль в развитии дисфункций репродуктивной системы играют возникающие при СД изменения в эндокринной системе, а также в центральной нервной системах, контролирующей сексуальное возбуждение [74]. Нарушения в функционировании ГГГ оси у мужчин могут реализовываться через гормональные взаимодействия или напрямую через посредство действия инсулина на семенники и сперматозоиды. В этой связи необходимо отметить, что тестикулярные клетки и сперматозоиды в небольших количествах продуцируют собственный инсулин [75]. Как отмечалось выше, в нормально функционирующей ГГГ оси люлиберин выделяется пульсациями, стимулируя как ЛГ, так и ФСГ, которые действуют на клетки Сертоли и клетки Лейдига, соответственно, стимулируя процессы сперматогенеза. Нарушения на любом этапе функционирования ГГГ оси приводят к ослаблению фертильности. Показано, что у мужчин с СД1 снижается секреция ЛГ и ФСГ в ответ на введение люлиберина, что приводит к снижению содержания гонадотропинов в крови [76, 77]. В пользу влияния инсулина на секрецию гонадотропинов гипофизом свидетельствуют данные о тесной взаимосвязи между экспрессией и активностью рецепторов инсулина в мозге и функциональным состоянием репродуктивной системы [78]. 30 Данные о содержании гонадотропинов у мужчин, страдающих СД, противоречивы. У мужчин с СД2, для которых характерно снижение андрогенов и нарушение репродуктивных функций, уровень гонадотропинов может быть снижен [79], близок к норме или даже повышен [80]. При СД1 чаще наблюдается повышение уровня гонадотропинов при нормальном или сниженном уровне андрогенов [81]. Отсутствие положительной корреляции между уровнем гонадотропинов и уровнем андрогенов является типичным для различным форм гипогонадизма, который с высокой частотой диагностируется у мужчин с СД1 и СД2 [82-84]. С возрастом уровень гонадотропинов у мужчин повышается, что по принципу отрицательной обратной связи вызывает ослабление чувствительности к ним тестикулярной ткани и ведет к снижению содержания общего, свободного и связанного тестостерона и нарушению репродуктивных функций [85]. Вероятно, сходная ситуация наблюдается в случае СД, который часто сопровождается повышением уровня гонадотропинов и снижением уровня стероидных гормонов, что ведет к развитию первичного гипогонадизма [86]. У мужчин с СД1 содержание свободного тестостерона было снижено в сравнении со здоровыми мужчинами в среднем на 10 % [81]. Это связано с тем, что у больных СД1 заметно повышался уровень секс-гормон-связывающего глобулина (СГСГ), который в норме связывает около 45 % общего тестостерона и, таким образом, определяет его доступность для тестикулярных клеток. У мужчин с СД1 также значительно повышался уровень общего эстрона. При этом концентрация свободного эстрона, даже с учетом повышенного уровня СГСГ, который связывает эстрон с меньшей эффективностью в сравнении с тестостероном, была существенно выше таковой у здоровых мужчин [81]. Необходимо отметить, что повышение уровня эстрогенов вносит существенный вклад в развитие гипогонадизма. 31 У мужчин с СД2 наблюдается значительное снижение содержания общего тестостерона в плазме крови в сравнении со здоровыми мужчинами того же возраста – оно составляет от 14 до 33 % [80, 87-89]. Снижение уровня общего тестостерона в наибольшей степени выражено у пациентов, страдающих тяжелыми формами заболевания. В отличие от больных СД1, у больных СД2 наблюдается некоторое снижение уровня СГСГ [88, 89], которое наиболее заметно у больных СД2 с высокой степенью резистентности к инсулину [87]. Однако относительное снижение содержания СГСГ при СД2 не столь выражено, как в случае тестостерона. Снижение уровня СГСГ обнаружено не только у мужчин с СД2, но и у мужчин, страдающих ожирением. Предполагается, что первопричиной снижения продукции СГСГ может быть отрицательное влияние инсулина на синтез этого белка в печени. В пользу этого свидетельствует то, что инсулин ингибирует синтез и секрецию СГСГ в клеточной культуре гепатоцитов HepG2 [90], в то время как снижение уровня инсулина у здоровых мужчин диазоксидом, напротив, повышает уровень СГСГ. Несмотря на сниженный уровень СГСГ, связывающего тестостерон, содержание свободного тестостерона у больных СД2 также снижено, хотя и не в такой степени как содержание общего тестостерона [87], в наибольшей степени у молодых мужчин [80]. Таким образом, несмотря на различия в содержании общего тестостерона и СГСГ при СД1 и СД2, в обоих случаях наблюдается снижение свободного тестостерона, что ведет к выраженной клинической картине андрогенной недостаточности. 1.2.6. Функциональное состояние ГГГ оси в условиях экспериментального сахарного диабета У самцов крыс с СД1, вызванным высокими дозами СТЗ, отмечено уменьшение веса гонад, снижение уровня гонадотропинов, низкий уровень тестостерона в плазме, ослабленный ответ на кастрацию [91-94]. У крыс с СД1 32 выявлены отклонения в копулятивном поведении [91-96]. Все эти эффекты, повидимому, вызваны именно метаболическим состоянием, которое вызвано отсутствием инсулина или резистентностью к нему, а не непосредственным действием СТЗ. Так крысы Zucker (даже на рационе с пониженным количеством калорий для предотвращения набора веса) и диабетические мыши также демонстрировали сниженное сексуальное поведение и аномалии в функционировании репродуктивной системы [97-100]. Лечение тестостероном животных c острым СД1 полностью восстанавливала недостаток гормона, массу семенников, хотя сравнительно слабо влияла на массу тела, сильно сниженную в условиях СД1 [101]. В более ранних работах говорилось о том, что терапия тестостероном диабетических животных в полной мере не восстанавливает их сексуальное поведение, несмотря на нормализацию уровня тестостерона в крови [95]. Установлено, что инсулиновая недостаточность при СД1 вызывает снижение чувствительности гонадотрофов гипофиза к регуляторному влиянию люлиберина, что, в свою очередь, приводит к снижению секреции гонадотропинов [102]. В основе этого, как полагают, лежит нарушение функциональной активности рецептора люлиберина и ослабление его сопряжения с гетеротримерными Gq-белками, через которые осуществляется стимуляция активности фосфолипазы С, контролируется внутриклеточный уровень кальция и, в конечном итоге, регулируется секреторная активность гонадотрофов. Получены данные о том, что не только недостаток, но и избыток инсулина может приводить к нарушениям функционирования гипоталамических нейронов, высвобождающих люлиберин, и к снижению чувствительности к нему гонадотрофов [103]. Изменение уровня люлиберина может быть ответственно за нарушения копулятивного поведения. На это указывает тот факт, что люлиберин влияет на сексуальное поведение самцов независимо от его способности стимулировать секрецию гонадотропинов [104]. Подавление секреции люлиберина в условиях СД1, по-видимому, связано с нарушением центрального метаболизма 33 нейротрансмиттеров – дофамина и норадреналина, уровни которых в мозге диабетических крыс меняются [105, 106]. Уменьшение высвобождения ЛГ, наблюдаемое у самцов крыс с СД1, вторично по отношению к ослаблению метаболизма норадреналина в гипоталамических областях, ответственных за синтез люлиберина [91]. Терапия инсулином восстанавливала как уровень ЛГ, так и метаболизм норадреналина до их уровня у здоровых животных [95]. Контроль уровня ЛГ может осуществляться и через посредство сигнальных каскадов мозга, регулируемых нейропептидом Y, внутримозговая концентрация и сигнальные пути которого претерпевают значительные изменения при СД. Известно, что нейропептид Y усиливает действие как люлиберина, так и норадреналина [107]. В механизмы нарушений репродуктивной функции при диабете вовлечена и серотонинергическая система мозга, которая вовлечена в регуляцию сексуального поведения и высвобождения гормонов гипофиза [108]. Данные, полученные на моделях СД2 в отношении функционирования репродуктивной системы очень противоречивы и зависят от выбранной модели заболевания. На крысах линии OLETF (Otsuka Long Evans Tokushima Fatty), генетической модели СД2, показано, что уровни ЛГ, свободного тестостерона и СГСГ у диабетических животных не отличаются от контроля. Однако масса семенников у диабетических крыс была существенно ниже, и по результатам гистологического анализа в них наблюдались выраженные изменения, возникающие вследствие гипергликемии и резистентности тканей к инсулину [109]. На модели СД2, вызванной высокожировой диетой, были получены другие результаты [110]. У диабетических животных уровни тестостерона и ЛГ были значительно снижены. Как и у мутантных животных, у крыс с ожирением были выявлены гистологические изменения в ткани семенников. Причиной этого, как полагают, являются нарушения липидного обмена и развивающийся в условиях СД окислительный стресс. 34 Обобщая имеющиеся в литературе данные, можно сделать вывод о том, что изменения функциональной активности тиреоидной и репродуктивной систем при СД1 и СД2, а также лежащие в основе этого механизмы в настоящее время изучены недостаточно, а данные, полученные на различных моделях заболеваний противоречивы. В этой связи следует отметить необходимость разработки экспериментальных моделей СД1 и СД2, которые приводят к нарушениям в тиреоидной системе и ГГГ оси, сходным с теми, которые выявляются при СД человека. 1.3. Интраназальный способ введения инсулина В последние годы для профилактики и коррекции заболеваний широко используется интраназальный способ доставки лекарственных препаратов [3, 111, 112]. Важную роль в механизмах, лежащих в основе интраназального транспорта молекул, играют пути, включающие обонятельный и тройничный нервы, соединяющие носовые ходы с головным и спинным мозгом. Кроме того, в транспорте молекул из носовой полости в ЦНС участвуют пути, связанные с сосудистой сетью, спинномозговой жидкостью и лимфатической системой. Полагают, что транспорт осуществляется сочетанием этих путей, хотя один из них может преобладать, в зависимости от свойств препарата. Обонятельные нервные пути являются одним из основных компонентов интраназальной доставки [111]. Дендриты обонятельных сенсорных нейронов располагаются в слизистой оболочке обонятельного эпителия, в то время как их аксоны проходят через отверстия в решетчатой кости, пронизывают субарахноидальное пространство, содержащее спиномозговую жидкость, и заканчиваются на митральных клетках обонятельных луковиц. Оттуда нейронные проекции распространяются в множественные области мозга, включая обонятельный тракт, переднее обонятельное ядро, грушевидную кору, миндалевидное тело и гипоталамус. В свою очередь, тройничный нерв, иннервирующий дыхательный и обонятельный эпителий носа, проникает в ЦНС из респираторной области 35 носа через два различных сайта: через переднее рваное отверстие, рядом с Варолиевым мостом, и через отверстия горизонтальной пластинки решетчатой кости [3]. Таким образом, интраназальная доставка препаратов может обеспечиваться в различные области головного мозга, достигая своих мишеней. Основным преимуществом интраназального введения являются адресная доставка в ЦНС веществ, не имеющих возможности проникать через гематоэнцефалический барьер вследствие своего размера или заряда. Данный подход обеспечивает более высокую биодоступность препаратов, быстрое достижение терапевтического эффекта, а также неинвазивность и удобство применения. Важной особенностью интраназального введения является отсутствие эффекта первого прохождения через печеночный барьер, что позволяет использовать более низкие дозы препаратов, снижающие побочные эффекты. В настоящее время интраназальное введение используется для широкого спектра веществ – ростовых факторов, гормонов, лекарственных средств, стволовых клеток [3]. Наибольший интерес представляет интраназальный способ доставки инсулина, который в последние годы используют для лечения болезни Альцгеймера и неврологических расстройств [111, 112]. Показано, что интраназальное введение инсулина значительно улучшает вербальную память и избирательное внимание у пациентов с болезнью Альцгеймера, не влияя при этом на эти показатели у здоровых людей [113, 114]. В экспериментальных условиях предпринимаются попытки изучить терапевтический потенциал ИИ для коррекции нарушений, возникающих при СД, в первую очередь для лечения нейродегенеративных заболеваний. Одним из преимуществ ИИ является отсутствие его существенного влияния на уровень сахара в крови, что позволяет избежать гипогликемических эпизодов и очень важно при лечении пациентов с СД [115]. Применение ИИ в условиях СД крайне важно, поскольку позволяет повысить уровень этого гормона в мозге, сниженный в условиях СД, и восстановить функциональную активность инсулиновых сигнальных путей в ЦНС, которые в значительной степени ослаблены при СД1 и СД2. Имеются 36 многочисленные доказательства того, что уровень инсулина в мозге влияет не только на функционирование ЦНС, но и вовлечен в регуляцию энергетического гомеостаза, в контроль функций сердечно-сосудистой, репродуктивной и других систем организма. Концентрация инсулина в мозге намного выше, чем в крови, что отражает решающую функцию инсулин в мозге в качестве сигнального гормона [116]. Предполагается, что инсулин взаимодействует с инсулиновыми рецепторами на гипоталамических нейронах и влияет на высвобождение ими люлиберина и ТРГ. Однако, данные о влиянии инсулина мозга на функционирование как начальных (гипоталамус), так и нижележащих компонентов ГГТ и ГГГ осей отсутствуют. До настоящего времени не изучено влияние ИИ на функции репродуктивной и тиреоидной систем, в том числе и в условиях СД, что является очень актуальной задачей в свете предполагаемого использования ИИ для лечения диабетической патологии. 1.4. Аденилатциклазная сигнальная система Одним из перспективных подходов для изучения начальных этапов развития СД, мониторинга его течения и оценки тяжести заболевания является изучение функционального состояния гормональных сигнальных систем в тканях диабетических животных. Как показано нами и другими авторами, эти системы чутко реагируют на самые ранние метаболические нарушения, возникающие при различных формах СД, и хорошо отражают степень выраженности и тяжесть метаболических и функциональных нарушений, которые имеют место на более поздних стадиях заболевания [117-119]. Управление клеточными процессами и координация действия клетки осуществляется за счет сигнальной трансдукции. Возможность клеток корректно отвечать на изменения окружающей среды играет ключевую роль в регуляции фундаментальных клеточных процессов, таких как рост, дифференцировка, репарация тканей, иммунитет и метаболизм в целом. Нарушения в этих процессах вызывают широкий спектр заболеваний со стороны сердечнососудистой, нервной, репродуктивной, эндокринной и других систем организма. 37 Изучение механизмов передачи сигнала внутри клетки может привести к разработке новых методов лечения этих заболеваний [120]. Наиболее распространенной гормональной сигнальной системой является гормоночувствительная АЦСС, которая представлена во всех типах клеток и тканей эукариот [121, 122]. АЦСС в качестве сигнальных компонентов включает три компонента – сенсор, представленный рецептором серпантинного типа, трансдуктор, представленный гетеротримерным G-белком, и эффектор, каталитический компонент АЦСС, представленный ферментом АЦ. Рецептор серпантинного типа, семь раз пронизывающий плазматическую мембрану, специфически опознает гормональный сигнал и передает его на функционально сопряженный с ним гетеротримерный G-белок стимулирующего или ингибирующего типа, который вовлечен соответственно в стимуляцию или ингибирование АЦ [123, 124]. Рецепторы серпантинного типа подразделяются, по крайней мере, на восемь семейств, не обладающих существенной гомологией первичной структуры и использующих различные домены для связывания очень разнообразных лигандов, таких как аминокислоты, нуклеотиды, пептиды, белки, одоранты и т.д. Внутри семейств имеются многочисленные группы рецепторов, сходных по своей специфичности к лигандам. Среди них следует выделить адренергические, серотониновые, дофаминовые и мускариновые холинергические рецепторы. Важность этих рецепторов определяется тем, что около 30–50 % всех лекарств, используемых человеком в медицине, являются мишенями для этих рецепторов [125]. Значительная часть рецепторов серпантинного типа через Gs- и Gi-белки сопряжены с ферментом АЦ. Трансдукторный компонент АЦСС, гетеротримерный G-белок, состоит из трех типов субъединиц – α, β и γ, две последние из которых образуют прочный βγ-димерный комплекс [121, 126-129]. В неактивном состоянии, когда Gα связана с ГДФ, она образует с Gβγ-димером αβγ-гетеротримерный комплекс, прочно заякоренный в мембране. Активация рецептора лигандом вызывает замену ГДФ на ГТФ и последующую диссоциацию ГТФ-связанной формы Gαсубъединицы от Gβγ-димера [130]. Активированная Gα-ГТФ специфически 38 взаимодействует с молекулой АЦ. Вследствие присущей Gα-субъединице ГТФазной активности ГТФ гидролизуется до ГДФ. Gα в ГДФ-связанной форме снова ассоциирует с Gβγ-димером, и G-белок возвращается в исходное состояние. Фермент АЦ, каталитический компонент АЦСС – значительный по размеру белок, который многократно усиливает первоначальный сигнал через посредство синтеза и перераспределения внутри клетки универсального вторичного посредника цАМФ и формирует адекватный ответ клетки на действие гормона. Повышение уровня цАМФ внутри клетки приводит к стимуляции активности цАМФ-зависимой протеинкиназы А (ПКА), которая относится к семейству Ser/Thr протеинкиназ. ПКА в неактивном состоянии представляет собой гетеротетрамерный комплекс, который состоит из двух регуляторных и двух каталитических субъединиц. Каждая регуляторная субъединица содержит два цАМФ-связывающих сайта. Регуляторная субъединица, находясь в связанном с каталитической субъединицей состоянии, делает ПКА неактивной, вследствие чего регуляторную субъединицу называют ингибирующей. При взаимодействии четырех молекул цАМФ с регуляторными субъединицами, их аффинность к каталитическим субъединицам снижается, и гетеротетрамерный комплекс диссоциирует. Открытые активные центры каталитических субъединиц переносят концевой фосфат молекулы АТФ на остатки серина или треонина. ПКА представлена во многих типах клеток, и проявляет каталитическую активность в отношении различных субстратов, поэтому, ПКА и концентрация цАМФ играют важную роль в различных биохимических путях. Активность ПКА регулируется и по механизму отрицательной обратной связи. Одним из субстратов, активируемых ПКА, является фосфодиэстераза, которая превращает цАМФ в АМФ, и таким образом, снижает концентрацию цАМФ и ингибирует ПКА (рис. 1.6). 39 Рис. 1.6. Гормоночувствительная аденилатциклазная сигнальная система. ГТФ - гуанозинтрифосфат, ГДФ - гуанозиндифосфат, АТФ - аденозинтрифосфат, цАМФ - циклический аденозинмонофосфат Разнообразие гормонов и других факторов, действующих через АЦСС, и спектр реализуемых ими регуляторных эффектов являются весьма значительными. Через АЦСС свои регуляторные эффекты оказывают и гликопротеиновые гипофизарные гормоны – ТТГ и ЛГ, а также целый ряд других гормонов, играющих ключевую роль в функционировании ЩЖ и репродуктивных тканей. Имеются многочисленные свидетельства, что в условиях СД1 и СД2 функциональная активность АЦСС в мозге и периферических тканях претерпевает существенные, а порой и драматические изменения, что лежит в основе этиологии и патогенеза как самого СД, так и его многочисленных осложнений. Вследствие этого изучение функционирования АЦСС в ЩЖ и семенниках, ключевых звеньев ГГТ и ГГГ осей, в условиях экспериментального СД1 и СД2 является одним из перспективных путей для понимания осложнений СД со стороны тиреоидной и репродуктивной систем. 40 ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 2.1. Экспериментальные модели диабета 2.1.1. Краткосрочная стрептозотоциновая модель острого СД1 на самцах крыс продолжительностью 30 суток Для экспериментов были взяты самцы крыс линии Wistar в возрасте 6-7 месяцев, которые содержались в стандартных условиях и на стандартном рационе. Острый СД1 вызывали внутрибрюшинным введением крысам СТЗ («Sigma», США), растворенного в 0.1 М цитратном буфере (10 мл 0.1 М цитрата натрия доводили до pH 4.5 0.1 М лимонной кислотой), в дозе 65 мг на кг веса животного. Животные контрольной группы получали цитратный буфер в том же объеме, но без СТЗ. Были сформированы две группы самцов крыс: контрольные (группа оК30, n = 8) и условно диабетические животные (оД, n = 11). Вес тела и биохимические показатели (содержание глюкозы и инсулина) у этих групп животных были измерены перед началом эксперимента, через 10 дней после обработки СТЗ и перед декапитацией (30-й день после обработки СТЗ). Три животных из диабетической группы умерли в первые пять дней опыта, вследствие чего число животных к 10-му и 30-му дням эксперимента составило 8 (оД30, n = 8). Перед началом эксперимента и перед декапитацией у животных была взята кровь для оценки уровня тиреоидных гормонов и тестостерона в сыворотке крови. Тест с нагрузкой люлиберином проводили через 25 дней после введения СТЗ. Тест с нагрузкой ТРГ проводили через 28 суток после введения СТЗ. Кровь у крыс забирали из хвостовой вены, с предварительным обезболиванием подкожным уколом в кончик хвоста 2% раствора лидокаина. Животных декапитировали на 30-й день после инъекции СТЗ под наркозом и забирали ткани ЩЖ и семенников в жидкий азот для последующего выделения фракций плазматических мембран. Для исследования действия интраназального введения различных доз инсулина на функциональные показатели и статус ЩЖ у контрольных и диабетических крыс были сформированы 8 групп. Четыре группы контрольных самцов крыс: группа оК (n = 8) получала интраназально 0,1 М цитратный буфер, 41 pH 4.5; группам оКИ0.3 (n = 6), оКИ0.6, (n = 6). оКИ1.5, (n = 6), интраназально вводили инсулин в дозах 0.3, 0.6 и 1.5МЕ на крысу в сутки соответственно. Крысы с краткосрочной моделью острого СД1, вызванного внутрибрюшинным введением стрептозотоцина в дозе 65 мг/кг также были разделены на четыре группы. Группа оД (n = 8) получала интраназально 0.1 М цитратный буфер, pH 4.5; группы оДИ0.3 (n = 6), оДИ0.6, (n = 6). оДИ1.5, (n = 6), обрабатывали интраназально вводимым инсулином в дозах 0.3, 0.6 и 1.5 МЕ на крысу в сутки соответственно. Интраназальное введение инсулина проводили ежедневно в течение 28 дней, начиная с третьего дня после инъекции СТЗ. Перед началом обработки у диабетических крыс был измерен уровень глюкозы и для дальнейших экспериментов были отобраны только те из них, у которых уровень сахара был выше 25 мМ. Для обработки животных был использован кристаллический инсулин (человеческий рекомбинантный, «Lilly», США) растворенный в 0.1 М цитратном буфере (pH 4.5), который вводили интраназально один раз в день. Крысу переворачивали на спину и вводили в каждую ноздрю по 10 мкл раствора гормона (по две капли объемом 5 мкл) [131]. Содержание тиреоидных гормонов и ТТГ определяли в сыворотке крови через 28 дней после введения СТЗ. 2.1.2. Долговременная модель «мягкого» стрептозотоцинового СД1 на самцах крыс продолжительностью 7 месяцев Для экспериментов были взяты самцы крыс линии Wistar в возрасте 5 месяцев, которые содержались в стандартных условиях и на стандартном рационе. Долговременная модель «мягкого» СД1 была инициирована тремя последовательными интраперитонеальными инъекциями СТЗ, растворенного в 0.1 М цитратном буфере (pH 4.5), в нисходящих дозах – 40 мг (первый день), 35 мг (10-й день) и 30 мг (80-й день) на кг веса тела крысы. Животные были разделены на шесть групп: три группы диабетических животных с продолжительностью «мягкого» СД1 в 30, 150 и 210 дней, которые обрабатывались СТЗ (мД30, n = 6, мД150, n = 8, мД210, n = 8) и три 42 соответствующих группы контрольных крыс, которые получали вместо раствора СТЗ цитратный буфер (мК30, n = 6, мК150, n = 8, мК210, n = 8). Для изучения действия интраназального введения инсулина кристаллический инсулин (человеческий рекомбинантный, «Lilly», США) в количестве 25 ЕД растворяли в 0.1 М цитратном буфере (pH 4.5) и вводили интраназально один раз в день. Крысу переворачивали на спину и вводили в каждую ноздрю по 10 мкл раствора гормона (по две капли объемом 5 мкл). [131]. Были сформированы еще 4 группы крыс: мКИ150, n = 6; мКИ210, n = 6; мДИ150, n = 6 и мДИ210, n = 6, которые получали ИИ в суточной дозе 0.5 ЕД на крысу, другие четыре группы (мК150, n = 8, мК210, n = 8, мД150, n = 8 и мД210, n = 8) вместо ИИ получали цитратный буфер pH 4.5 в течение 75 и 135 дней соответственно. Обработку инсулином проводили ежедневно в течение 75 и 135 дней. Каждые три дня проводили взвешивание животных, а также оценивали объем выпиваемой ими жидкости. У животных из хвостовой вены, с предварительным обезболиванием подкожным уколом в кончик хвоста 2 %-ного раствора лидокаина, брали образцы крови для оценки уровня тощаковой глюкозы и инсулина через 9 дней после первой и второй инъекций СТЗ (на 9-й и 19-й дни, соответственно), на 74й день – за день до начала обработки ИИ (или за пять дней до третьей, последней, обработки СТЗ), а также перед декапитацией. В образцах крови, полученных до начала эксперимента, на 74-й день после первой обработки СТЗ и в конце эксперимента (на 210 день после первой инъекции СТЗ) были измерены уровни тиреоидных гормонов (свободного Т4, общего Т4 и общего Т3) и ТТГ. Тест с нагрузкой ТРГ проводили на 190 день после первой инъекции стрептозотоцина. На 210-й день после первой инъекции СТЗ животных декапитировали под наркозом и забирали ткани ЩЖ и семенников в жидкий азот для последующего выделения фракций плазматических мембран. 43 2.1.3. Неонатальная модель СД2 на самцах крыс продолжительностью 3, 8 и 18 месяцев Для экспериментов были взяты самцы крыс породы Wistar, которые содержались в стандартных условиях и на стандартном рационе. Неонатальный СД вызывали внутрибрюшинным введением пятидневным крысятам СТЗ, растворенного в 0.1 М цитратном буфере, pH 4.5, в дозе 80 мг на кг веса животного, как описано в работе [1] и воспроизводилось ранее нами. Животные контрольной группы того же возраста получали цитратный буфер, pH 4.5, в том же объеме. После введения СТЗ крысам в раннем постнатальном периоде (первая неделя после рождения) инсулин - продуцирующая функция поджелудочной железы частично восстанавливается за счет механизмов регенерации β-клеток, формируя хронический дефицит инсулина – 50 % от контрольного уровня [132]. Через 2.5–3 месяца примерно у 70 % крыс развивались признаки СД2. Развитие толерантности к глюкозе оценивали по сахарной кривой, определяя уровень гликемии в крови натощак и через 15, 30, 60 и 120 мин после введения глюкозы (2 г/кг веса). Были отобраны диабетические животные с нарушенной толерантностью к глюкозе. Для исследования были взяты шесть групп самцов крыс: контрольные животные возраста 3 месяца (группа нК3, n = 8), 8 месяцев (нК8, n = 10) и 18 месяцев (нК18, n = 7), диабетические животные возраста 3 месяца (нД3, n = 8), 8 месяцев (нД8, n = 10) и 18 месяцев (нД18, n = 7). Животных декапитировали под наркозом в возрасте 3, 8 и 18-ти месяцев и забирали ткани для последующего выделения фракций плазматических мембран из ЩЖ и семенников. Перед забоем измеряли вес, брали кровь из хвостовой вены для оценки уровня инсулина, проводили тест на толерантность к глюкозе. У животных в возрасте 8ми месяцев проводили тест с нагрузкой люлиберином для оценки нарушений в репродуктивной системе. 44 2.2. Оценка развития диабета 2.2.1. Определение содержания глюкозы в крови Содержание глюкозы в крови определяли глюкозооксидазным методом с помощью глюкометра One Touch Ultra («Life Scan Johnson & Johnson», Дания) и тест-полосок «One Touch Ultra» (США). Уровень глюкозы рассчитывается по энзиматическому окислению в присутствии глюкозоксидазы. Образовавшаяся перекись водорода взаимодействует с фенолом и 4-аминофеназоном под каталитическим воздействием пероксидазы и образует красно-фиолетовый хинонимин. Глюкоза + О2 + Н2О ------> глюконовая кислота + H2O2 2H2O2 + 4-аминофеназон + фенол -------> хинонимин + 4 H2O 2.2.2. Определение сахара в моче Сахар в моче определяли с помощью тест-полосок Combi-screen («Analyticon», Германия). Тест также основан на специфической глюкозоксидазно-пероксидазной реакции. 2.2.3. Тест на толерантность к глюкозе Развитие толерантности к глюкозе оценивали по сахарной кривой. Определяли уровень гликемии в крови у крыс натощак (18-ти часовое голодание), затем интраперитонеально вводили 20 % раствор глюкозы из расчета 2 г на кг веса тела животного, и с помощью глюкометра и тест-полосок проводили измерения уровня глюкозы в крови животных через 15, 30, 60 и 120 мин после введения глюкозы. 2.3. Определение содержания гормонов в сыворотке крови крыс Для определения уровней инсулина, ТТГ, тиреоидных гормонов и тестостерона в сыворотке крови крыс нами были применены широко используемые в клинической биохимической практике иммуноферментные методы, которые позволяют быстро и с достаточной точностью определить содержание гормонов в большом числе образцов. 45 Инсулин и ТТГ крысы определяли на основе «сэндвич»-метода иммуноферментного анализа (ИФА) (рис. 2.1). Рис. 2.1. Схема «сэндвич»-метода иммуноферментного анализа. «Сэндвич» метод ИФА используется для определения крупных антигенов, содержащих, по крайней мере, две антигенных детерминанаты (эпитопа). В наборах, принцип работы которых основан на этой методике, используют два моноклональных антитела с различной эпитопной специфичностью к исследуемому гормону. В лунках полистиролового планшета с пришитыми специфичными антителами, при добавлении исследуемого образца и конъюгата анти-гормон-пероксидаза, во время инкубации одновременно происходит иммобилизация исследуемого гормона, содержащегося в опытном образце, и связывание его с конъюгатом. При удалении содержимого из лунок и промывке происходит удаление избытка конъюгата анти-гормон-пероксидаза, не связавшегося с иммобилизованным в ходе инкубации гормоном. Количество связавшегося конъюгата прямо пропорционально количеству гормона в исследуемом образце. Во время инкубации с раствором тетраметилбензидина происходит окрашивание раствора в лунках. Степень окраски прямо пропорциональна концентрации гормона в анализируемых пробах. После измерения оптической плотности раствора в лунках на основании 46 калибровочного графика рассчитывается концентрация исследуемого гормона в определяемых образцах. Тестостерон, общий Т4, свободный Т4, общий Т3 определяли с помощью конкурентного инммуноферментного анализа. При помощи этого метода определяют антигены небольшой молекулярной массы с единственным эпитопом. Принцип работы набора для конкурентного твердофазного иммуноферментного анализа (рис. 2.2) состоит в следующем: в лунках, при добавлении исследуемого образца и конъюгата гормон-пероксидаза, во время инкубации устанавливается равновесие между конъюгатом и эндогенным гормоном сыворотки крови в процессе связывания с антителами, иммобилизованными на внутренней поверхности лунок полистиролового планшета. При удалении содержимого из лунок происходит разделение свободного и связанного антителами гормона и конъюгата гормон-пероксидаза, причем количество связанного антителами конъюгата обратно пропорционально количеству исследуемого гормона в образце сыворотки крови. Рис. 2.2. Схема конкурентного метода иммуноферментного анализа. Во время инкубации с раствором субстрата на основе 3,3’,5,5’тетраметилбензидина с добавлением перекиси водорода происходит окрашивание раствора в лунках. Степень окраски прямо пропорциональна 47 количеству связанного антителами конъюгата гормон-пероксидаза и обратно пропорциональна концентрации исследуемого гормона, содержащегося в анализируемом образце. После измерения оптической плотности раствора в лунках с помощью планшетного спектрофотометра при длине волны 450 нм на основании калибровочного графика рассчитывается концентрация гормона в определяемых образцах. 2.3.1. Определение уровня инсулина Определение уровня инсулина у крыс проводили с помощью набора для иммуноферментного анализа Rat Insulin ELISA («Mercodia AB», Швеция) в соответствии с протоколом исследования. Калибровочные пробы и исследуемые сыворотки крови вносились в дубликатах. Оптическую плотность в лунках планшета измеряли с помощью планшетного спектрофотометра Anthos 2020 («Biochrom», Великобритания) на длине волны 450 нм. Расчет концетраций инсулина в пробах (нг/мл) проводили по калибровочной кривой, которую строили в логарифмических координатах (рис. 2.3). Данные представлены в виде среднего значения для каждой пробы. 0,6 LOG10ОП450=0,91959LOG10Cинсулина-0,18259 0,4 LOG10ОП450 0,2 0,0 -0,2 -0,4 -0,6 -0,8 -1,0 -1,0 -0,8 -0,6 -0,4 -0,2 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 LOG10Cинсулина Рис. 2.3. Типичная калибровочная кривая для расчета концетрации инсулина. По вертикали: десятичный логарифм оптической плотности, по горизонтали: десятичный логарифм концентрации инсулина (нг/мл), проведена линейная аппроксимация. 48 2.3.2. Определение уровня ТТГ Определение уровня ТТГ у крыс проводили с помощью набора для иммуноферментного анализа Rat Thyroid Stimulating Hormone , TSH ELISA Kit («Cusabio Biotech. Co.», Ltd, Wuhan, Китай) в соответствии с протоколом исследования. Калибровочные пробы и исследуемые сыворотки крови вносились в дубликатах. Оптическую плотность в лунках планшета измеряли с помощью планшетного спектрофотометра Anthos 2020 («Biochrom», Великобритания) на длине волны 450 нм. Калибровочная кривая состояла из 6 проб с концентрациями крысиного ТТГ соответственно: 0.6, 1.2, 3, 6, 12, 24 мкЕд/мл. Расчет концетраций ТТГ в пробах (мкМЕ/мл) проводили с помощью программы «Curve Expert 1.3», согласно рекомендации производителя набора (http://www.cusabio.com). Данные представлены в виде среднего значения для каждой пробы. 2.3.3. Определение уровня тиреоидных гормонов Определение уровня тиреоидных гормонов (общего Т3, общего Т4, свободного Т4) проводили с помощью наборов «ИФА-ТТ3-1», «ИФА-ТТ4-1», «ИФА-СвТ4-1» ЗАО «НВО Иммунотех» (Россия) в соответствии с протоколами исследования. Калибровочные пробы, контрольная сыворотка и исследуемые пробы вносились в дубликатах. Оптическую плотность в лунках планшета измеряли с помощью планшетного спектрофотометра Anthos 2020 («Biochrom», Великобритания) на длине волны 450 нм. Для наборов фирмы ЗАО «НВО Иммунотех» (Россия) расчет исследуемого гормона в пробах проводили с помощью кусочно-линейного метода аппроксимации. Данные для каждой пробы представлены в виде среднего значения. Типичные калибровочные кривые, полученные нами, представлены на рис. 2.5. 49 3,0 А Оптическая плотность, 450 нм Оптическая плотность, 450 нм 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0 0 50 100 150 200 250 Б 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0 0 300 Оптическая плотность, 450 нм Оптическая плотность, 450 нм 3,0 В 3,5 20 40 60 80 100 Концентрация свободного Т4, пМ Концентрация общего Т4, нМ 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 Г 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0 0,5 0 2 4 6 8 10 Концентрация общего Т3, нМ 12 0 10 20 30 40 50 Концентрация свободного Т3, пМ Рис. 2.5. Типичные калибровочные кривые для расчета концентраций: (А) Общего Т4, нМ; (Б) Свободного Т4, пМ; (В) Общего Т3, нМ; (Г) Свободного Т3, пМ. 2.3.4. Определение уровня общего тестостерона Исследование уровня общего тестостерона проводили с помощью набора для иммуноферментного анализа «Тестостерон-ИФА» фирмы ООО «Алкор Био» (Россия) в соответствии с протоколом исследования. Калибровочные пробы, контрольная сыворотка и исследуемые пробы вносились в дубликатах. Оптическую плотность в лунках планшета измеряли с помощью планшетного спектрофотометра Anthos 2020 («Biochrom», Великобритания) на длине волны 450 нм. Расчет концентрации исследуемого гормона (нмоль/л) в пробах 50 производили по калибровочной кривой после преобразования logit-log (рис. 2.6) Данные для каждой пробы представлены в виде среднего значения. LOGIT ОП=1,63966-2,14909LOG10Стестостерона 3 LOGIT ОП450 2 1 0 -1 -2 -0,5 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 LOG10Cтестостерона Рис. 2.6. концетрации Типичная калибровочная тестостерона, нМ. кривая для Проведено расчета логит- преобразование, сделана линейная аппроксимация. 2.4. Тест с нагрузкой тиролиберином ТРГ разводили в физиологическом растворе (5 мг в 1мл). ТРГ в дозе 100 мкг на крысу (20 мкл раствора) вводили инраназально: крысу переворачивали на спину и вводили в каждую ноздрю 2 раза по 5 мкл раствора гормона. Контрольным животным интраназально вводили физиологический раствор в том же объеме. Образцы крови для исследования в сыворотке уровня ТТГ, общего Т3, общего Т4 и свободного Т4 забирали до введения гормона и через 2 часа после введения. 2.5. Тест с нагрузкой люлиберином Люлиберин разводили в 0.2 М ацетатном буфере, pH 5.2 (1 мг в 1мл). Путем последовательных разбавлений добивались концентрации 25 пг на мл. Люлиберин в дозе 0.25 пг на крысу (10 мкл раствора) вводили инраназально четыре раза в день (в 10.30, 12.00, 13.30 и 15.00): крысу переворачивали на спину и вводили в каждую ноздрю по 5 мкл раствора гормона (контрольные 51 животные получали интраназально ацетатный буфер, pH 5.2, в том же объеме). Суммарная суточная доза гормона составила 1пг на крысу. Кровь на исследование уровня тестостерона забирали через 30 минут, 2, 3.5 и 5.5 часов (11.00, 12.30, 14.00 и 16.00) после введения первой дозы люлиберина. 2.6. Химические реактивы Для проведения физиологических тестов и биохимических исследований использовали СТЗ, ТРГ, люлиберин, инсулин, изопротеренол, ТТГ, хорионический гонадотропин человека (ХГЧ), соматостатин, питуитарный АЦактивирующий полипептид-38 (PACAP-38, pituitary adenylyl cyclase-activating polypeptide-38), форсколин, Lubrol-PX, ГТФ, АТФ, цАМФ, креатинфосфат, креатин фосфокиназа из мышц кролика, гуанилилимидодифосфат (GppNHp), ингибиторы протеаз: O-фенантролин, пепстатин, фенилметилсульфонилфторид, Tris-HCl, имидазол, дитиотреитол, 2.5-дифенилоксазол, 1-4бис2-5- фенилоксазолилбензол, ЭДТА, полученные из фирмы «Sigma-Aldrich» (США), сахарозу, хлорид магния, сульфат меди (II), хлорид натрия, цитрат натрия, карбонат натрия, ацетат натрия, гидрофосфат натрия, дигидрофосфат калия, едкий натр, соляную кислоту, лимонную кислоту, уксусную кислоту, полученные из фирмы ЗАО «Вектон» (Россия), реактив Фолина-Чокальтеу (2N) – ООО «Фирма Синтакон» (Россия). Меченые [α-32P]-АТФ (4 Ки/ммоль) и [83H]GppNHp были получены из ОАО «Всерегиональное объединение «Изотоп» (Россия). 2.7. Выделение фракций частично очищенных плазматических мембран По окончании эксперимента животных наркотизировали и декапитировали, извлекая ткани для дальнейших исследований. Взятие тканей осуществляли через 24 ч после последнего интраназального введения инсулина или цитратного буфера (pH 4.5) соответствующим группам диабетических и контрольных крыс. Фракцию плазматических мембран из ЩЖ выделяли, как описано [133, 134]. Щитовидные железы были промыты охлажденным физиологическим раствором, измельчены и гомогенизированы с помощью Polytron в 20 объемах 52 охлажденного до 4°С 40 мМ Tris-HCl буфера (pH 7.4), содержащего 5 мМ MgCl2, 320 мМ сахарозу и коктейль ингибиторов протеаз (500 мкМ O-фенантролина, 2 мкМ пепстатина и 1 мМ фенилметилсульфонилфторида) (буфер А). Гомогенат подвергали центрифугированию при 480 g в течение 10 мин, осадок отбрасывали, супернатант центрифугировали при 27 500 g в течение 20 мин, полученный осадок ресуспендировали в буфере А без сахарозы и повторно центрифугировали при 27 500 g в течение 20 мин (все процедуры проводили при 4°C). Выделение фракций плазматических мембран из тестикул проводили, как описано [135]. Промытые охлажденным буфером А измельченные ткани тестикул гомогенизировали с помощью Polytron в 20 объемах того же буфера. Гомогенат центрифугировали при 1500 g в течение 10 мин, осадок отбрасывали, супернатант центрифугировали при 20 000 g в течение 30 мин, полученный осадок ресуспендировали в 10 объемах буфера А без сахарозы и повторно центрифугировали при 20 000 g в течение 30 мин (4°C). Полученные из ЩЖ и семенников фракции плазматических мембран ресуспендировали в 50 мМ Tris-HCl буфере (pH 7.4), так чтобы содержание белка в них составило 1–3 мг/мл, и хранили при -70°C. 2.8. Определение содержания белка Определение содержания белка в пробах проводили по методу Лоури [136]. Реактив А: цитрат натрия количественно растворяли в 15 мл дистиллированной воды, к полученному раствору добавляли 0.1 г сульфата меди (II) и общий объем раствора доводили дистиллированной водой до 20 мл. Реактив Б: 10 г карбоната натрия количественно растворяли в приблизительно 100 мл дистиллированной воды, затем полученный раствор смешивали с предварительно разведенным в 200 мл воды 25 мл раствора едкого натра (2N) и доводили полученный раствор до 500мл. 53 Реактив Фолина-Чокальтеу 1N: реактив Фолина-Чокальтеу (2N) (ООО «Фирма Синтакон», Россия) разводили дистиллированной водой в соотношении 1:1. Реактив В: к 50мл реактива Б прибавляли 1 мл реактива А непосредственно перед анализом. В качестве стандарта использовали бычий сывороточный альбумин (БСА) с концентрацией 1 мг/мл, общий объем пробы составил 200 мкл. Калибровочный график был построен для концентраций БСА в пробе: 0, 10, 20, 40, 50, 70, 85, 100 мкг. Типичный калибровочный график представлен на рис. 2.7. В каждую пробирку, содержавшую разведения белка для калибровочной кривой вносили по 1 мл реактива В. Перемешивали и оставляли на 10 мин при комнатной температуре для образования биуретовых комплексов. Затем добавляли по 0.1 мл 1N реактива Фолина-Чокальтеу, перемешивали и оставляли на 30-40 мин для развития окраски. Затем из каждой пробирки отбирали по 300 мкл раствора и помещали в лунки полистиролового планшета, измерение оптической плотности проводили с помощью планшетного спектрофотометра Anthos 2020 («Biochrom», Великобритания) на длине волны 620 нм. Определение белка в исследуемых образцах проводили по той же схеме, фракции плазматических Оптическая плотность, 620 нм мембран разводили в 20 раз. 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 0 20 40 60 80 100 БСА, мкг Рис. 2.7. Калибровочная кривая по БСА. 54 2.9. Определение активности аденилатциклазы Активность аденилатциклазы (EC 4.6.1.1) определяли, как описано в работе [137]. Реакционная смесь (общий объем 50 мкл) содержала 50 мМ TrisHCl (pH 7.5), 5 мМ MgCl2, 0.1 мМ цАМФ, 1 мМ АТФ, 1 мкКи [α-32P]-АТФ, 20 мМ креатинфосфата, 0.2 мг/мл креатинфосфокиназы и 25–50 мкг мембранного белка. Реакцию проводили в течение 10 минут при 37°C, начинали добавлением фракции плазматических мембран и останавливали добавлением 100 мкл 0.5 M HCl. Пробы кипятили в течение 6 мин для разрушения комплексов между меченым цАМФ и белками и нейтрализовали кислоту с помощью 100 мкл 1.5 M имидазола. Образовавшийся в результате ферментативной реакции [32P]-цАМФ отделяли на колонках с оксидом алюминия, используя в качестве элюента 8 мл 10 мМ имидазол-HCl буфера (pH 7.4). Элюат собирали в сцинтилляционные флаконы и считали радиоактивность на сцинтилляционном счетчике 1209/1215 RackBeta («LKB», Швеция). Каждое измерение было проведено в трех независимых экспериментах в трех или четырех параллельных пробах. Результаты представлены в пмоль цАМФ/мин на мг мембранного белка. Базальная активность АЦ была измерена в отсутствие гормональных и негормональных агентов, ингибирующий эффект гормонов был изучен по их влиянию на активность АЦ, стимулированную форсколином (10-5 M). 2.10. Определение ГТФ-связывания G-белков Определение ГТФ-связывания G-белков проводили по модифицированному методу [138, 139] во фракциях плазматических мембран тканей крыс. Стандартная реакционная смесь содержала (конечные концентрации): 50 мM Трис-HCl буфер, pH 8.0, 1 мМ ЭДТА, 50 мМ MgCl2, 100 мМ NaCl, 1 мМ дитиотреитола, 1 мкМ GppNHp, 0.5–1 мкКи [8-3H]GppNHp. Реакцию начинали внесением в каждую пробу 50–80 мкг белка. Общий объем каждой пробы составлял 50 мкл. После инкубации в течение 45 мин при 37 °C ферментативную реакцию останавливали добавлением к реакционной смеси 100 мкл 0.1 %-ного раствора Lubrol-PX в 20 мМ K/Na-фосфатном буфере, pH 8.0. Пробы фильтровали через фильтры нитроцеллюлозные фильтры тип HA, 0.45 мкм 55 («Millipore», США) с использованием водоструйного насоса, фильтры дважды промывали 4 мл 20 мМ K/Na-фосфатного буфера, pH 8.0, помещали в виалы со сцинтилляционной смесью, содержащей 0.4 % 2.5-дифенилоксазола и 0.02 % 14бис2-5-фенилоксазолилбензола. 1209/1215 RackBeta («LKB», Радиоактивность Швеция). измеряли Специфическое на счетчике ГТФ-связывание определяли как разность между связыванием радиоактивного Gpp[NH]p в пробе в отсутствие ГТФ и таковым в присутствии 10 мМ ГТФ. 2.11. Cтатистическая обработка полученных результатов Статистическую обработку экспериментальных данных проводили в программе «Microsoft Office Excel 2007» с помощью надстроек «AtteStat 12.5» и «Daniel’s XL Toolbox 6.52». Все данные представлены в виде M ± SD (как среднее ± стандартное отклонение). Нормальность распределения проверяли с помощью критерия Шапиро-Уилка. Для сравнения двух зависимых/независимых выборок с нормальным распределением использовали парный/двухвыборочный t-критерий Стьюдента, для сравнения трех и более групп - дисперсионный анализ: вводили поправку Бонферрони. Данные, не удовлетворяющие критериям нормального распределения и не прошедшие тест на равенство дисперсий, обрабатывали с применением непараметрических методов: для сравнения двух независимых групп использовали U-критерий Манна-Уитни, для сравнения зависимых выборок - критерий Уилкоксона, для сравнения трех и более групп тест - Крускалла-Уоллиса с последующим попарным сравнением с применением критерия Данна. Статистически значимыми считались отличия при уровне значимости p<0.05. 56 ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ 3.1. Характеристика моделей сахарного диабета В работе были использованы три СД на самцах крыс линии Wistar – (2) пролонгированная стрептозотоциновая модель «мягкого» СД 1-го типа, (1) взятая для сравнения стрептозотоциновая модель острого СД1, а также (3) неонатальная модель СД 2-го типа. Все модели были охарактеризованы по массе тела животных, уровню глюкозы, инсулина, в случае СД2 – по толерантности к глюкозе с помощью теста с глюкозной нагрузкой. 3.1.1. Краткосрочная стрептозотоциновая модель острого СД1 на самцах крыс продолжительностью 30 суток Были сформированы две группы самцов крыс: контрольные животные (группа оК30, n = 8) и диабетические животные с острой моделью СД1 (группа оД30, n = 11). Вес тела и биохимические показатели (содержание глюкозы и инсулина) у этих групп животных были измерены перед началом эксперимента, через 10 дней после обработки СТЗ, который вводили внутрибрюшинно в дозе 65 мг/кг веса, и непосредственно перед декапитацией (на 30-й день после обработки СТЗ) (табл. 3.1). Следует отметить, что вследствие сильно выраженной гипергликемии три животных из диабетической группы умерли уже в первые пять дней эксперимента, вследствие чего число животных к 10-му и 30му дням составило 8 (оД30, n = 8). Показано, что уже через 10 дней после начала эксперимента вес тела животных с острой моделью СД1 был достоверно ниже в сравнении с таковым в контрольной группе и со значениями этого параметра в диабетической группе перед началом эксперимента. К 30-му дню вес тела диабетических крыс с острой моделью СД1 был на 23 % ниже, чем в контроле. У диабетических животных был снижен аппетит, в три-четыре раза повышено потребление воды. 57 Таблица 3.1 Вес тела, уровни глюкозы и инсулина в плазме крови контрольных крыс и животных с острым стрептозотоциновым СД1, вызванным инъекцией СТЗ в дозе 65 мг на кг веса, возраста 6-7 месяцев (M ± SD) Показатели 1-й день 10-й день 30-й день Контрольные крысы (n = 8) Вес тела, г 304 ± 18 316 ± 15 334 ± 20 Глюкоза, мМ 4.4 ± 0.4 4.6 ± 0.5 4.7 ± 0.7 Инсулин, нг/мл 2.2 ± 0.3 2.1 ± 0.2 2.0 ± 0.2 Диабетические крысы (n = 8, n = 11) Вес тела, г 313 ± 12@ 273 ± 18* 257 ± 17* Глюкоза, мМ 4.5 ± 0.4@ 28.4 ± 3.4* 27.5± 4.1* Инсулин, нг/мл 2.3 ± 0.3@ 0.2 ± 0.2* 0.1 ± 0.1* Примечание: * – различия между контрольными и диабетическими крысами одного возраста статистически достоверны при p < 0.05 Уровень глюкозы через два дня после инъекции СТЗ повышался в 6.5 раз в сравнении с контролем и составил 29.5 ± 4.1 мМ, что свидетельствует о сильно выраженной гипергликемии. Также у самцов крыс с острым СД1 наблюдалась выраженная глюкозурия (≥28 ммоль/л). В дальнейшем повышенное содержание глюкозы в крови сохранялось (в среднем в 5-6 раз выше нормы). Наряду с этим наблюдался острый дефицит инсулина (его концентрация не превышала 0.2 нг/мл), что указывает на сильное повреждение β-клеток поджелудочной железы высокими дозами СТЗ, вызвавшее нарушение синтеза и секреции ими инсулина. Таким образом, модель острого СД1 характеризуется абсолютным дефицитом инсулина, сильно выраженной гипергликемией, которая приводит к сильной интоксикации и окислительному стрессу, следствием чего является снижение выживаемости животных. Необходимо отметить, что, согласно нашим предыдущим экспериментам, через полтора-два месяца после индукции острого СД1 наблюдается массовая гибель животных. 58 3.1.2. Пролонгированная стрептозотоциновая модель «мягкого» СД1 на самцах крыс продолжительностью 7 месяцев Для исследования были сформированы шесть групп самцов крыс линии Wistar. Две группы для 30-ти суточного «мягкого» СД1 контрольная (группа мК30, n = 6) и диабетическая (мД30, n = 6), и еще четыре группы для пролонгированного «мягкого» СД1, длительностью 150 и 210 суток – две контрольные группы (мК150, n = 8, мК210, n = 8) и две диабетические группы (мД150, n = 8, мД210, n = 8). СТЗ вводили в нисходящих дозах – 40 (первый день), 35 (10-й день) и 30 мг (80-й день) на кг веса тела крысы. Вес тела, содержание глюкозы и инсулина у животных были измерены перед началом эксперимента, а также через 30 суток после первой обработки СТЗ крыс с краткосрочным «мягким» СД1, а также через 150 и 210 дней после первой обработки СТЗ крыс с пролонгированным «мягким» СД1. (табл. 3.2). Таблица 3.2 Вес тела, уровень глюкозы и инсулина в крови контрольных и диабетических крыс (M ± SD) Группа животных Вес тела, г Глюкоза, мМ Инсулин, нг/мл «Мягкий» СД1, через 30 суток после первой обработки СТЗ мК30 (n = 6) 351 ± 15 4.3 ± 0.1 1.82 ± 0.27 мД30 (n = 6) 316 ± 19 17.1± 2.4* 0.30 ± 0.16* «Мягкий» СД1, через 150 суток после первой обработки СТЗ мК150 (n = 8) 379 ± 16 5.1 ± 0.2 ND мД150 (n = 8) 315 ± 19* 15.2 ± 3.7* ND «Мягкий» СД1, через 210 суток после первой обработки СТЗ мК210 (n = 8) 412±27 4.9±0.5 2.19 ± 0.19 мД210 (n = 8) 354±32* 16.7±5.0* 0.33 ± 0.14* Примечание: * – различия между контрольными и диабетическими крысами одного возраста статистически достоверны при p < 0.05. ND – концентрацию инсулина не определяли. 59 У крыс с «мягким» СД1 продолжительностью 30 суток изменения были выражены намного слабее, чем при остром СД1. У животных с 30-ти суточным «мягким» СД1 вес тела был снижен на 10 %, уровень глюкозы был повышен до 17 мМ, но существенно уступал таковому при остром СД1, имеющим ту же продолжительность заболевания. У крыс со 150-ти суточным и 210-ти суточным «мягким» СД1 вес тела был снижен в сравнении с контролем на 16–17 %, концентрация глюкозы в среднем не превышала 17 мМ. Концентрация инсулина у крыс с краткосрочной и пролонгированной моделями «мягкого» СД1 была снижена до 0.3 нг/мл (табл. 3.2). Этой концентрации гормона достаточно для частичного поддержания глюкозного гомеостаза и функциональной активности инсулиновых сигнальных каскадов в тканях [141]. 3.1.3. Неонатальная модель СД2 на самцах крыс продолжительностью 18 месяцев Для исследования были взяты шесть групп самцов крыс линии Wistar. Первую группу составили трехмесячные контрольные животные (нК3, n = 8), вторую группу – восьмимесячные контрольные крысы (нК8, n = 10), и третью группу – восемнадцатимесячные контрольные крысы (нК18, n = 7). Четвертую группу составили трехмесячные крысы с неонатальным стрептозотоциновым СД (нД3, n = 8), пятую группу - восьмимесячные (нД8, n = 10) и шестую группу – восемнадцатимесячные диабетические животные (нД18, n = 7). Вес тела и биохимические показатели (содержание глюкозы и инсулина) у этих групп животных были измерены через три, восемь и восемнадцать месяцев после обработки СТЗ, который вводили внутрибрюшинно новорожденным 5-ти суточным крысятам в дозе 80 мг на 1 кг массы животного (контрольные животные получали внутрибрюшинно 0.1 М цитратный буфер (pH 4.5)) (табл. 3.3). 60 Таблица 3.3 Вес тела, уровни глюкозы и инсулина в плазме крови контрольных крыс и животных с неонатальным СД2 (M ± SD) Показатели 3 месяца 8 месяцев 18 месяцев (n = 8) (n = 10) (n = 7) Контрольные крысы Вес тела, г 206±17 266±15 326±17 Глюкоза, мМ 4.4±0.4 4.7±0.5 4.4±0.4 ND ND 1.8±0.3 Инсулин, нг/мл Диабетические крысы Вес тела, г 214±17* 338±25* 398±22* Глюкоза, мМ 5.2±0.5 6.9±0.7* 6.5±0.6* ND ND 2.1±0.4 Инсулин, нг/мл Примечание: * – различия между контрольными и диабетическими крысами сходного возраста статистически достоверны при p < 0.05. ND – концентрацию инсулина не определяли Введение высокой дозы СТЗ взрослым животным приводит к полной деструкции β-клеток и прекращению секреции инсулина. После введения СТЗ новорожденным крысятам (в первую неделю после рождения) происходит частичное восстановление инсулинпродуцирующей функции поджелудочной железы вследствие ее регенерации [1]. Как правило у 50-70% животных, обработанных СТЗ, развиваются признаки СД2 по достижении возраста 2.5-3 месяцев [132]. В нашем эксперименте у 70 % животных к третьему месяцу после обработки СТЗ нарушалась толерантность к глюкозе, что было показано в тесте с нагрузкой глюкозой. Через 2 часа после внутрибрюшинного введения глюкозы (2 г на кг веса животного) уровень глюкозы в группах нД3, нД8 и нД18 составил 10.7±1.5 мМ, 11.6±1.9 мМ и 10.5±1.9 мМ соответственно, что было значительно выше по сравнению с контролем (рис. 3.1) 61 Рис. 3.1. Зависимость концентрации глюкозы в крови контрольных и диабетических животных от времени в тесте на толерантность к глюкозе. (А) – через 3 месяца после введения СТЗ, (Б) – через 8 месяцев, (В) – через 18 месяцев (M ± SD). *, ** - различия между концентрацией глюкозы в крови контрольных и диабетических крыс достоверны при p < 0.05 и 0.01, соответственно. 62 3.2. Нарушения в гипоталамо-гипофизарно-тиреоидной оси 3.2.1. Сравнительное изучение функционального состояния ГГТ оси у крыс с острым и «мягким» СД1 Для оценки функционального состояния ГГТ оси у крыс с краткосрочным (30-ти суточным) острым СД1 и пролонгированной (7-ми месячной) моделью «мягкого» СД1 исследовали гормональный статус диабетических животных по содержанию ТТГ и тиреоидных гормонов (свободного Т4, общего Т4, общего Т3), а также проводили тест с нагрузкой интраназальным ТРГ. Уровень гормонов в сыворотке крыс измеряли на 30-й день развития острого СД1, а также на 30-й, 150-й и 210-й дни после индукции пролонгированной модели «мягкого» СД1. Показано, что у крыс с острым СД1 наблюдается значительное снижение уровня свободного Т4 (на 44 % в сравнении с контролем), в то время как уровень обеих форм T3, свободного и общего, снижался в меньшей степени – на 23 и 19 %, соответственно (табл. 3.4). Эти данные указывают на то, что существенного снижения активности дейодиназ при этой форме заболевания не наблюдается, поскольку конверсия Т4 в T3 не нарушена. На фоне достоверного снижения уровня тиреоидных гормонов уровень ТТГ менялся в незначительной степени, что свидетельствует об ослаблении ответа ЩЖ на ее регуляцию ТТГ у крыс с острым СД1. Таблица 3.4 Содержание тиреоидных гормонов и ТТГ в крови крыс с 30-ти суточным острым сахарным диабетом 1-го типа в сравнении с контрольными животными (M±SD) Группа крыс Свободный Свободный Общий Т3, ТТГ, мкЕд/мл Т4, пМ Т3, пМ нМ оК30 (n = 8) 21.4 ± 1.8 5.61 ± 0.66 2.43 ± 0.25 0.42 ± 0.22 оД30 (n = 8) 11.9± 2.5** 4.30 ± 0.87* 1.52 ± 0.24* 0.29 ± 0.20 Примечание: *, ** – различия группами оК30 и оД30 достоверны при p < 0.05 и p < 0.005, соответственно. 63 У крыс с 30-ти суточным «мягким» СД1 (спустя три недели после второй инъекции СТЗ) наблюдали отчетливо выраженное снижение концентрации свободного Т4 (на 32 % в сравнении с контрольной группой). Концентрация общего T4, общего Т3 и ТТГ при этом существенно не менялась и была близкой к таковой у контрольных животных (табл. 3.5). У крыс с «мягким» СД1 продолжительностью 150 и 210 суток концентрация свободного Т4, общего Т4, и общего Т3 была достоверно ниже, чем в контрольной группе животных того же возраста. Наряду с этим, у крыс с «мягким» СД1 продолжительностью 210 суток уровень ТТГ был повышен на 119 % в сравнении с контролем (табл. 3.5). Таблица 3.5 Содержание тиреоидных гормонов и ТТГ в крови крыс с моделью «мягкого» СД1 в сравнении с контрольными животными того же возраста (M±SD) Группа крыс Свободный Общий T4, Общий Т3, ТТГ, Т4, пМ нМ нМ мкЕд/мл 30-ти суточный «мягкий» СД1 мК30 (n = 6) 24.2 ± 1.2 79.3 ± 1.6 2.16 ± 0.25 0.38 ± 0.19 мД30 (n = 6) 16.4 ± 2.8* 75.6 ± 4.2 1.94 ± 0.18 0.43 ± 0.23 «Мягкий» СД1, через 150 суток после первой обработки СТЗ мК150 (n = 8) 20.7 ± 1.3 71.9 ± 2.4 2.08 ± 0.11 ND мД150 (n = 8) 13.8 ± 1.4** 60.8 ± 4.5* 1.69 ± 0.16* ND «Мягкий» СД1, через 210 суток после первой обработки СТЗ мК210 (n = 8) 23.0 ± 1.6 74.9 ± 3.1 2.24 ± 0.15 0.31 ± 0.16 мД210 (n = 8) 16.0 ± 1.7** 58.8 ± 4.4** 1.57 ± 0.13** 0.68 ± 0.24* Примечание: *, ** – различия между соответствующими контрольными и диабетическими группами достоверны при p < 0.05 и p < 0.005, соответственно. Снижение уровня тиреоидных гормонов при сильно повышенной концентрации ТТГ указывает на развитие у крыс с «мягким» СД1 гипотиреоидного состояния, одной из причин которого, как мы предположили, 64 является ослабление чувствительности ЩЖ к регуляторному действию ТТГ, что в дальнейшем было проверено при изучении АЦСС в тканях ЩЖ диабетических животных. 3.2.2. Изучение ответа щитовидной железы крыс с острым и «мягким» СД1 на нагрузку тиролиберином Для оценки функциональной активности ГГТ оси использовали ТРГ, который животным вводили интраназально в дозе 100 мкг на крысу. Это приводило к повышению уровня тиреоидных гормонов и ТТГ как у диабетических, так и у контрольных животных, но различия между этими группами были значительными (табл. 3.6, 3.7). В условиях острого 30-ти суточного СД1 наблюдали прирост концентрации общего Т4, свободного Т4 и общего Т3 на 21.1 нМ, 6.5 пМ и 0.70 нМ, в то время как в контроле эти значения составили 27.6 нМ, 10.7 пМ и 1.27 нМ, соответственно, что на 24, 39 и 45 % выше, чем в диабетической группе (табл. 3.6). Уровень ТТГ у диабетических животных повысился на 1.72 мкЕд/мл, что на 36 % ниже, чем прирост в контроле (2.68 мкЕд/мл). Эти данные указывают на снижение ответа гипофиза на введение ТРГ у крыс с острой моделью СД1, а также на снижение уровня тиреоидных гормонов, которое может быть вызвано как ослаблением секреции тиротрофами гипофиза ТТГ, так и нарушением синтеза Т4 в ЩЖ и Т3 в экстратиреоидных тканях, в первую очередь в печени и почках. При изучении диабетических крыс с «мягкой» моделью СД1 продолжительностью 210 суток также было выявлено снижение ответа гипофиза и ЩЖ на обработку интраназальным ТРГ (табл. 3.7). 65 Таблица 3.6 Влияние обработки крыс с острой моделью СД1 интраназальным ТРГ на содержание у них общего Т4, свободного Т4, общего Т3 и ТТГ в сравнении с контролем (M±SD) Группа крыс Свободный Общий Т4, Общий Т3, ТТГ, Т4, пМ нМ нМ мкЕд/мл За 10 минут до обработки ТРГ оК30 (n = 6) 21.4 ± 1.9 74.9 ± 3.2 2.40 ± 0.07 0.42 ± 0.18 оД30 (n = 6) 11.9 ± 3.0 60.6 ± 5.4 1.79 ± 0.17 0.31 ± 0.15 Через два часа после обработки ТРГ оК30 (n = 6) 32.1 ± 3.3* 102.5 ± 9.4* 3.67 ± 0.28* 3.10 ± 0.70* оД30 (n = 6) 18.4 ± 2.8* 81.7 ± 1.8* 2.49 ± 0.25* 2.03 ± 0.69* Примечание: * – различия между значениями концентраций гормонов у крыс одной группы до и после обработки ТРГ достоверны при p<0.05. Таблица 3.7 Влияние обработки контрольных и диабетических крыс интраназальным ТРГ на содержание у них общего Т4, свободного Т4, общего Т3 и ТТГ (M±SD) Свободный Т4, Общий Т4, Общий Т3, ТТГ, пМ нМ нМ мкЕд/мл мК210 (n = 5) 23.4±1.3 75.5±2.9 2.23±0.14 0.33±0.07 мД210 (n = 5) 15.8±0.8 58.1±4.9 1.58±0.15 0.80±0.12 Группа крыс До обработки ТРГ Через два часа после обработки ТРГ мК210 (n = 5) 35.8±3.1* 103.1±6.2* 3.52±0.28* 1.14±0.12* мД210 (n = 5) 21.2±2.0* 73.5±3.5* 2.98±0.25* 1.53±0.23* Примечание: * – различия между значениями концентраций гормонов у крыс одной группы до и после обработки ТРГ достоверны при p<0.05. Прирост концентрации общего и свободного Т4 при пролонгированном «мягком» СД1 составил 56 и 44% от такового в контроле. Однако прирост 66 концентрации общего Т3 у диабетических крыс с пролонгированным «мягким» СД1 и контрольных животных существенно не различался, что может свидетельствовать о компенсаторном повышении синтеза и секреции этого гормона тканями, в которых он синтезируется (почки, печень, мозг и др.). Это может быть связано с повышением активности 2-дейодиназ, которые превращают свободный Т4 в Т3. В пользу этого свидетельствует тот факт, что прирост концентрации свободного Т4 при действии ТРГ в процентном выражении был ниже, чем прирост концентрации общего Т4. Не было выявлено заметных различий и в приросте концентрации ТТГ, что указывает на сохранение реактивности гипофиза к действию ТРГ и способности тиротрофов секретировать ТТГ. Таким образом, в условиях пролонгированной модели «мягкого» СД1 ослабляются функции ЩЖ, ответственной за синтез и секрецию Т4, в то время как чувствительность гипофиза к действию ТРГ и активность ферментов иодтиронин-деиодиназ, ответственных за синтез Т3 из Т4, при этом сохраняется. 3.2.3. Функциональное состояние АЦСС в щитовидной железе крыс с острым и «мягким» СД1 На первом этапе исследовали функциональное состояние АЦСС во фракциях плазматических мембран, выделенных из тканей ЩЖ крыс с 30-ти дневными моделями острого и «мягкого» СД1, для чего изучали базальную активность АЦ (в отсутствие каких-либо воздействий), а также ее стимуляцию гуаниновыми нуклеотидами (активаторами гетеротримерных G-белков) и дитерпеном форсколином, который действует непосредственно на каталитический компонент АЦСС – собственно фермент АЦ. Показано, что базальная активность АЦ практически не отличалась от таковой в мембранах ЩЖ контрольных животных. У крыс с пролонгированной моделью «мягкого» СД1 длительностью 210 дней она была выше на 21 %, чем в контроле (рис. 3.2, А). Эти данные указывают на то, что базальная активность АЦ даже в условиях сильно выраженной гипергликемии у крыс с острым СД1 сохраняется, 67 а при длительном развитии заболевания имеет тенденцию к повышению. В этой связи следует отметить, что и в ряде других тканей (миокард, ткани мозга, скелетные мышцы) при СД1 базальная активность фермента не претерпевает существенных изменений или даже немного повышается, что свидетельствует о сохранении конститутивной активности АЦСС в условиях дефицита инсулина и гипергликемии. Основной вклад в эту активность в тканях ЩЖ вносит конститутивная активность рецептора ТТГ, который в отсутствие гормона способен через посредство Gs-белка стимулировать активность АЦ [142]. В пользу сохранения каталитической активности АЦ в ЩЖ диабетических крыс свидетельствует и тот факт, что стимулирующие АЦ эффекты форсколина, который непосредственно взаимодействует с каталитическим сайтом фермента, у крыс со всеми изученными моделями СД1 не отличались от таковых в контрольных группах (рис. 3.2, В). Далее изучали функциональное взаимодействие между гетеротримерными Gs-белками и ферментом АЦ, для чего использовали негидролизуемый аналог гуаниновых нуклеотидов –GppNHp. Показано, что у крыс со всеми изученными моделями СД1 стимулирующий АЦ эффект GppNHp был снижен (рис. 3.2, Б). Так, в ЩЖ крыс с острым СД1 и пролонгированным «мягким» СД1 прирост над базальной активностью АЦ при стимуляции гуаниновым нуклеотидом был снижен почти в два раза. Эти данные иллюстрируют снижение функциональной активности Gs-белков, стимулирующим способом сопряженных с АЦ, что может быть следствием как снижения их числа, так и нарушения сопряжения с другими компонентами АЦСС в тканях ЩЖ диабетических животных. 68 оК30 оД30 мК30 мД30 мК210 мД210 Активность АЦ, пмоль цАМФ за мин на мг белка 70 60 50 40 * * 30 * 20 10 0 А В Б Рис. 3.2. Активность АЦ в тироидальных мембранах диабетических и контрольных крыс, пмоль цАМФ за 1 мин на 1 мг мембранного белка: (А) – базальная; (Б) – стимулированная GppNHp, 10-5М; (В) – стимулированная форсколином, 10-5М. (M ± SD). * - различия между активностью АЦ соответствующих контрольных и диабетических групп достоверны при p < 0.05 Таким образом, основываясь на изучении базальной и стимулированной GppNHp и форсколином активности АЦ в тканях ЩЖ крыс с моделями острого и «мягкого» СД1 можно сделать вывод, что каталитические потенции этой системы в условиях СД1 сохраняются, но ее регуляция гуаниновыми нуклеотидами ослабляется. 3.2.4. Чувствительность АЦСС в щитовидной железе крыс с острым и «мягким» СД1 к гормональным воздействиям Для исследования чувствительности АЦ к гормонам, которые действуют на фермент стимулирующим способом через Gs-белки, были выбраны гипофизарный гликопротеиновый гормон – ТТГ, питуитарный аденилатциклазу активирующий полипептид PACAP-38 и β-агонист изопротеренол. Выбор ТТГ был обусловлен тем, что он играет ключевую роль в регуляции синтеза Т4 фолликулярными клетками ЩЖ, причем его регуляторные эффекты 69 реализуются в основном через чувствительную к этому гормону АЦСС, которая включает рецептор ТТГ, Gs-белок и фермент АЦ [142]. Выбор PACAP-38 связан с его важной ролью в контроле процессов роста и дифференцирования клеток ЩЖ, ответственных за синтез и секрецию Т4. Действие PACAP-38 на различные типы клеток реализуется через специфичные к нему рецепторы VIP/PACAPсемейства, которые функционально сопряжены с АЦ и опосредуют активацию цАМФ-зависимых внутриклеточных каскадов [143, 144]. В свою очередь, агонист β-адренергических рецепторов изопротеренол через посредство регуляции АЦСС в стенках сосудов контролирует микроциркуляцию в тканях ЩЖ, что влияет на ее кровоснабжение, метаболический статус, секрецию тиреоидных гормонов [145]. В результате проведенного исследования было показано, что в плазматических мембранах, выделенных из тканей ЩЖ контрольных крыс различного возраста, ТТГ (10-8 M) повышал базальную активность АЦ на 239– 311 %. В ЩЖ диабетических крыс эффекты гормона были снижены – в наибольшей степени в случае острого СД1. Так у крыс с острым СД1 прирост активности фермента, вызванный ТТГ, был снижен на 46 % в сравнении с контролем, у крыс с 30-ти и 210-ти суточным «мягким» СД1 – только на 18 и 34 % (рис. 3.3, А). Впервые выявленное нами снижение стимулирующего эффекта ТТГ (10-8 M) на активность АЦ в ЩЖ крыс с СД1 положительно коррелирует со снижением уровня тиреоидных гормонов у диабетических животных. Мы полагаем, что нарушение цАМФ-зависимой сигнализации в условиях СД1 является одной из ключевых причин развития резистентности ЩЖ к действию ТТГ. Наряду с ТТГ, в ЩЖ диабетических животных ослабляются стимулирующие АЦ эффекты и некоторых других гормонов – PACAP-38 и βагониста изопротеренола, которые хотя непосредственно и не вовлечены в синтез и секрецию Т4, но играют важную роль в жизнедеятельности ЩЖ, в формировании фолликулярных тиреоидных гормонов. клеток, ответственных за продукцию 70 Показано, что стимулирующий АЦ эффект PACAP-38 (10-6 M) достоверно снижался в ЩЖ крыс с 210-ти суточным «мягким» СД1 (на 42 %), но практически не менялся у диабетических животных с краткосрочными моделями заболевания (рис. 3.3, Б). Это указывает на то, что только длительная гипергликемия и инсулиновый дефицит существенно влияют на функциональную активность АЦСС, чувствительной к PACAP-38. Необходимо отметить, что при остром СД1 стимулирующий АЦ эффект PACAP-38 даже несколько повышался. И это несмотря на то, что стимулирующий АЦ эффект GppNHp, активатора Gs-белка, функционально сопряженного с рецептором для PACAP-38, снижался почти вдвое. Не исключено, что в этом случае уменьшение функциональной активности Gs-белков компенсируется усилением экспрессии рецепторов, связывающих PACAP-38, что позволяет сохранить регуляторное влияние PACAP-38 на рост и регенерацию клеток ЩЖ в условиях деструктивных процессов, вызванных острым СД1, как это происходит в мозге в случае стимуляции АЦ агонистами дофаминовых рецепторов [2]. Стимулирующий АЦ эффект изопротеренола (10-5 M), неселективного агониста β-адренергических рецепторов, достоверно снижался только в ЩЖ крыс с острым СД1 (рис. 3.3, В). Это во многом определяется снижением функций Gs-белков в условиях сильно выраженной гипергликемии с уровнем глюкозы выше 25 мМ, которая сопровождается окислительным стрессом и гипергомоцистеинемией, вызывающими нарушение трансдукторной функций α-субъединиц G-белков. ГТФ-связывающей и 71 Прирост активности АЦ, пмоль цАМФ за мин на мг белка 50 оК30 оД30 мК30 мД30 мК210 мД210 * 40 * 30 * 20 10 * * 0 А Б В Рис. 3.3. Стимулирующие эффекты гормонов на активность АЦ в тироидальных мембранах диабетических и контрольных крыс (А) – ТТГ, 10-8 M, (Б) – PACAP-38, 10-6 M, (В) – изопротеренол, 10-5 M. Приведен прирост активности АЦ над базальной активностью фермента при обработке тироидальных мембран гормонами, пмоль цАМФ за 1 мин на 1 мг мембранного белка. (M±SD) * – различия между соответствующими контрольными и диабетическими группами достоверны при p < 0.05. Таким образом, в ЩЖ крыс с острым и «мягким» СД1 выявлены изменения чувствительности АЦ к регуляторному действию различных классов гормонов, активаторов АЦ, причем у крыс с острым СД1 в значительной степени ослаблялись АЦ эффекты ТТГ и изопротеренола, у крыс с пролонгированной моделью «мягкого» СД1 – АЦ эффекты ТТГ и PACAP-38, в то время как у крыс с 30-ти суточным «мягким» СД1 изменения гормональной чувствительности АЦ были выражены слабо – отмечалось только сравнительно небольшое снижение АЦ эффекта ТТГ. Сделан вывод о том, что одной из ключевых причин развития резистентности тканей ЩЖ к ТТГ при СД1 является ослабление передачи генерируемого этим гормоном сигнала через АЦСС, на что 72 указывает снижение стимулирующего эффекта ТТГ на активность АЦ в тироидальных мембранах диабетических крыс. 3.2.5. Функциональная активность АЦСС в щитовидной железе самцов крыс с неонатальным диабетом 2-го типа В рамках этого этапа исследования изучали изменения функциональной активности АЦСС в ЩЖ крыс с неонатальной моделью СД 2-го типа на протяжении длительного периода времени – с момента развития заболевания (3 месяца) до возраста 18 месяцев. Для сравнения изучали здоровых животных того же возраста, оценивая также возможное влияние возраста на функции ЩЖ. Показано, что как у контрольных, так и у диабетических животных с неонатальной моделью СД2 с увеличением возраста с трех до 18 месяцев базальная активность АЦ в ЩЖ имела тенденцию к повышению, причем у диабетических крыс в возрасте 8 и 18 месяцев значения базальной активности АЦ были достоверно выше, чем у трехмесячных диабетических животных (табл. 3.8). При сравнении значений базальной активности АЦ у диабетических и контрольных крыс одного возраста достоверные различия были выявлены в ЩЖ восьми- и 18-тимесячных животных (при СД она была выше). 73 Таблица 3.8 Базальная активность АЦ (пмоль цАМФ/мин на мг мембранного белка) во фракциях плазматических мембран, выделенных из ЩЖ диабетических крыс с трех-, восьми- и 18-тимесячным неонатальным СД и контрольных крыс того же возраста (M±SD) Группы Базальная Прирост активности АЦ, пмоль активность, цАМФ за мин на мг белка пмоль цАМФ за GppNHp, 10-5 М мин на мг белка Форсколин, 10-5 М нК3 (n = 8) 16.4 ± 1.3 26 ± 3 56 ± 2 нК8 (n = 10) 17.0 ± 1.1 24 ± 2 59 ± 1 нК18 (n = 7) 18.8 ± 0.7 17 ± 1#, ## 68 ± 2#, ## нД3 (n = 8) 18.2 ± 0.9 19 ± 2* 55 ± 3 нД8 (n = 10) 22.5 ± 1.0*,& 16 ± 1* 58 ± 2 нД18 (n = 7) 24.3 ± 0.7*,& 19 ± 3 57 ± 2* Примечание: различия между контрольными и диабетическими крысами одного возраста (*), между группами нК3 и нК8 или нК3 и нК18 (#), между группами нК8 и нК18 (##), между группами нД3 и нД8 или нД3 и нД18 (&),достоверны при p < 0.05. Стимулирующие АЦ эффекты GppNHp (10-5 М), негидролизуемого аналога ГТФ, были отчетливо снижены в ЩЖ 18-тимесячных контрольных крыс в сравнении с животными групп нК3 и нК8. В ЩЖ крыс с неонатальной моделью СД2 стимулирующий АЦ эффект GppNHp был снижен уже на ранних сроках СД и далее менялся слабо. При этом различия в АЦ эффекте GppNHp между трех- и 8-ми месячными контрольными крысами и животными с неонатальной моделью СД2 того же возраста были достоверными. Полученные 74 нами данные указывают на влияние возраста крыс и неонатального СД2 на функциональную активность Gs-белков в ЩЖ крыс и на их сопряжение с ферментом АЦ. Стимулирующие АЦ эффекты форсколина (10-5 М), в отличие от таковых GppNHp, менялись слабо. Исключение составил АЦ эффект форсколина у 18-ти месячных контрольных животных, который был достоверно выше как его значений у трех- и восьмимесячных контрольных животных, так и у животных с неонатальной моделью СД2 всех возрастов. Можно предположить, что с возрастом в ЩЖ здоровых животных начинает усиливаться каталитическая активность АЦ, на что указывает повышение, пусть и небольшое, базальной активности фермента, а также усиление его стимуляции форсколином, который непосредственно взаимодействует с каталитическим сайтом фермента. В условиях модели неонатального СД2 уровень базальной активности АЦ повышается в еще большей степени, что, вероятно, и снижает ресурс активации фермента форсколином. Действительно, суммарная активность АЦ при действии форсколина на мембраны ЩЖ 18-тимесячных диабетических крыс составляет 81.6 пмоль цАМФ за мин на мг белка, в то время в контроле это значение составляет 87.0 пмоль цАМФ за мин на мг белка. Далее исследовали эффекты ТТГ, ключевого регулятора АЦСС в тироцитах ЩЖ, у контрольных крыс и крыс с неонатальной моделью СД2. Обнаружено, что в ЩЖ контрольных крыс при повышении возраста чувствительность АЦ к регуляторному действию ТТГ ослабляется, в то время как при неонатальном СД2 стимулирующий АЦ эффект ТТГ был изначально снижен и с возрастом менялся (рис. 3.4). 75 Прирост активности АЦ над уровнем базальной активности фермента, пмоль цАМФ за 1 мин на 1 мг белка 30 25 # ## 20 * нК3 нК8 нК18 нД3 нД8 нД18 15 10 5 0 Рис. 3.4. Стимуляция ТТГ (10-8 М) АЦ в ЩЖ диабетических и контрольных крыс разного возраста. Прирост активности АЦ над уровнем базальной активности фермента, пмоль цАМФ за 1 мин на 1 мг белка. (M±SD) Статистически значимые различия между контрольными и диабетическими крысами одного возраста (*, p < 0.05), между группами нК3 и нК8 или нК3 и нК18 (#, p < 0.05), между группами нК8 и нК18 ( ##, p < 0.05). Достоверные различия были обнаружены только между группами нД8 и нК8. Это свидетельствует о том, что с повышением возраста у контрольных крыс развивается слабо выраженная резистентность ЩЖ к действию ТТГ, в то время как при СД чувствительность АЦ к гормону снижена изначально. Снижение реактивности ЩЖ к ТТГ в условиях неонатальной модели СД2 должно приводить к нарушению ее секреторной функции, снижению уровня тиреоидных гормонов и нарушению активности всей ГГТ оси. 76 3.3. Влияние интраназального введения инсулина на функциональное состояние щитовидной железы у крыс с острым и «мягким» СД1 3.3.1. Влияние обработки различными дозами ИИ на массу тела и уровень глюкозы у крыс с острой и пролонгированной моделями СД1 Для изучения влияния интраназального введения инсулина на функциональные показатели и статус ЩЖ у крыс с острой 30-ти суточной моделью СД1 использовали три дозы гормона (0.3, 0.6 или 1.5 МЕ на крысу), который вводили ежедневно в течение 28 дней, начиная с третьего дня после обработки животных СТЗ (доза 65 мг/кг веса). Перед началом обработки у животных измеряли уровень глюкозы и для дальнейших экспериментов отбирали только тех, у которых уровень сахара был выше 25 мМ. Были сформированы три диабетических (оДИ0.3, оДИ0.6 и оДИ1.5) и соответствующие им три контрольные группы крыс (оКИ0.3, оКИ0.6 и оКИ1.5). Масса тела у крыс с острым СД1, как не обработанных, так обработанных ИИ, была достоверно ниже, чем в соответствующих группах контрольных животных. При этом введение различных доз ИИ существенно не влияло на массу тела, исключая наиболее высокую дозу 1.5 МЕ на крысу, при которой масса тела несколько снижалась (но не достоверно) в сравнении как с не обработанными крысами, так и с диабетическими животными, получавшими ИИ в дозах 0.3 и 0.6 МЕ на крысу (табл. 3.9). Уровень глюкозы у диабетических крыс был в шесть раз выше, чем в соответствующем контроле, и обработка ИИ слабо на него влияла. Исключение составила доза 0.6 МЕ на крысу, при которой наблюдали достоверное снижение уровня глюкозы в сравнении с группой оД (p < 0.05). 77 Таблица 3.9 Масса тела и уровень глюкозы у крыс с острой 30-ти суточной моделью СД1 в сравнении с контрольными животными и влияние на них длительной (28 дней) терапии различными дозами ИИ (M±SD) Группа животных Масса тела, г Уровень глюкозы в крови, мМ оК (n = 8) 327 ± 11 4.8 ± 0.4 оКИ0.3 (n = 6) 312 ± 15 4.5 ± 0.3 оКИ0.6 (n = 6) 324 ± 19 5.3 ± 0.5 оКИ1.5 (n = 6) 304 ± 14 5.0 ± 0.6 оД (n = 8) 249 ± 14* 28.7 ± 2.3* оДИ0.3 (n = 6) 232 ± 11* 27.3 ± 2.6* оДИ0.6 (n = 6) 257 ± 17* 19.4 ± 4.3* оДИ1.5 (n = 6) 221 ± 14* 26.7 ± 3.0* Примечание: * - статистически значимые различия между группами оК и оД, и соответствующими группами оКИ и оДИ p < 0.05. Для изучения влияния ИИ на функциональные параметры ЩЖ и активность ГГТ оси у крыс с пролонгированной, 210-ти суточной моделью «мягкого» СД1, использовали дозу инсулина 0.5 МЕ на крысу, которую вводили ежедневно в течение 135 дней, начиная с 75-го дня после первой обработки животных стрептозотоцином. Перед началом обработки у животных был измерен уровень глюкозы и для дальнейших экспериментов были отобраны те из них, у которых уровень сахара был выше 15 мМ. Были сформированы две диабетические (мДИ150 и мДИ210) и соответствующие две контрольные группы крыс (мКИ150 и мКИ210). Масса тела у крыс с пролонгированным мягким СД1 как через 150, так и через 210 дней после индукции диабета, была достоверно ниже таковой в контроле. Введение ИИ приводило к небольшому повышению массы тела в группах мДИ150 и мДИ210. Однако это повышение не было достоверным, что 78 свидетельствует диабетических о сравнительно животных. При слабом этом влиянии необходимо ИИ на массу отметить тела отчетливо выраженную тенденцию к повышению массы тела при обработке ИИ контрольных животных, как в группе мКИ150, так и в группе мКИ210 (табл. 3.10). Таблица 3.10 Масса тела и уровень глюкозы у крыс с пролонгированным СД1 продолжительностью 150 и 210 дней в сравнении с контрольными животными и влияние на них длительной терапии ИИ (M±SD) Группа животных Масса тела, г Уровень глюкозы в крови, мМ 150 дней после СТЗ обработки (75 дней введения ИИ) мК150 (n=8) 379 ± 16 5.1 ± 0.2 мКИ150 (n=6) 398 ± 11 5.0 ± 0.2 мД150 (n=8) 315 ± 19* 15.2 ± 3.7* мДИ150 (n=6) 339 ± 23 11.0 ± 1.8* 210 дней после СТЗ обработки (135 дней введения ИИ) мК210 (n=8) 412±27 4.9±0.5 мКИ210 (n=6) 441 ± 18 5.1 ± 0.2 мД210 (n=8) 354±32* 16.7±5.0* мДИ210 (n=6) 374 ± 15* 10.1 ± 2.3* Примечание: * - статистически значимые различия между соответствующими группами мК и мД, мКИ и мДИ при p < 0.05. Уровень глюкозы у диабетических крыс был в три раза выше, чем в соответствующем контроле. Введение ИИ существенно снижало уровень сахара как на 150-й день развития СД1 (на 43 %), так и на 210-й день развития заболевания (на 62 %). 79 3.3.2. Влияние введения ИИ на уровень тиреоидных гормонов у крыс с острой моделью СД1 Обработка крыс с острым СД1 на протяжении 28 дней с помощью ИИ в дозе 0.6 МЕ на крысу приводила к частичному восстановлению уровней тиреоидных гормонов, сниженных в условиях диабетической патологии. На 30ый день уровни свободного T4, общего T4 и общего T3 в группе оДИ0.6 были повышены на 38, 17 и 26 % в сравнении с уровнем этих гормонов у диабетических крыс, которых не подвергали обработке ИИ (табл. 3.11–3.13). Таблица 3.11 Уровни свободного T4 у крыс с острым 30-ти суточным СД1 в условиях введения ИИ и без такового (M±SD) Группа животных Концентрация свободного T4, пМ До начала 15-ый день 30-ый день эксперимента, 1-й день оК (n=8) 20.2 ± 1.4 19.5 ± 2.0 21.4 ± 1.8 оКИ0.3 (n=6) 20.9 ± 1.9 23.4 ± 2.3& 25.8± 3.1& оКИ0.6 (n=6) 21.5 ± 1.4 24.1 ± 2.1& 24.3 ± 1.8& оКИ1.5 (n=6) 19.8 ± 1.5 21.5 ± 1.2 19.2 ± 1.5 оД (n=8) 21.2 ± 1.6 13.6 ± 2.7* 11.9 ± 2.5* оДИ0.3 (n=6) 19.5 ± 1.7 12.6 ± 2.0 12.5 ± 1.0 оДИ0.6 (n=6) 19.7 ± 2.0 15.1 ± 3.2 16.4 ± 3.0& оДИ1.5 (n=6) 20.7 ± 0.9 15.6 ± 2.2 14.0 ± 1.5 Примечание: * - статистически значимые различия между группами оК и оД, и соответствующими группами оКИ и оДИ при p < 0.05; &- между группой оК и группами оКИ0.3, оКИ0.6, оКИ1.5; между группой оД и группами оДИ0.3 , оДИ0.6, оДИ1.5 при p < 0.05. 80 Таблица 3.12 Уровни общего T4 у крыс с острым 30-ти суточным СД1 в условиях введения ИИ и без такового (M±SD) Группа животных Концентрация общего T4, нМ До начала 15-ый день 30-ый день эксперимента, 1-й день оК (n=8) 70.9 ± 3.4 73.0 ± 2.8 74.9 ± 4.3 оКИ0.3 (n=6) 69.6 ± 3.9 81.8 ± 4.4& 84.3 ± 3.9& оКИ0.6 (n=6) 69.1 ± 3.7 83.3 ± 4.5& 86.9 ± 3.5& оКИ1.5 (n=6) 68.0 ± 3.6 78.2 ± 4.0& 72.1± 3.6 оД (n=8) 72.3 ± 4.2 62.1 ± 4.1* 58.2 ± 4.6* оДИ0.3 (n=6) 68.4 ± 4.2 59.8 ± 5.2 63.6 ± 3.0& оДИ0.6 (n=6) 68.7 ± 5.1 63.2 ± 9.2 71.1 ± 5.6& оДИ1.5 (n=6) 69.6 ± 2.1 64.5 ± 4.1 62.7 ± 3.1 Примечание: * - статистически значимые различия между группами оК и оД при p < 0.05; &- между группой оК и группами оКИ0.3, оКИ0.6, оКИ1.5; между группой оД и группами оДИ0.3 , оДИ0.6, оДИ1.5 при p < 0.05. 81 Таблица 3.13 Уровни общего T3 у крыс с острым 30-ти суточным СД1 в условиях введения ИИ и без такового (M±SD) Группа животных Концентрация общего T3, нМ До начала 15-ый день 30-ый день эксперимента, 1-й день оК (n=8) 2.23 ± 0.23 2.27 ± 0.21 2.43 ± 0.25 оКИ0.3 (n=6) 2.27 ± 0.31 2.62 ± 0.24& 2.73 ± 0.23 оКИ0.6 (n=6) 2.13 ± 0.27 2.60 ± 0.30& 2.43 ± 0.34 оКИ1.5 (n=6) 2.20 ± 0.25 2.47 ± 0.34 2.23 ± 0.23 оД (n=8) 2.26 ± 0.26 1.79 ± 0.27* 1.52 ± 0.24* оДИ0.3 (n=6) 2.17 ± 0.21 1.90 ± 0.29 1.77 ± 0.20 оДИ0.6 (n=6) 2.22 ± 0.19 2.15 ± 0.27& 2.05 ± 0.30& оДИ1.5 (n=6) 2.27 ± 0.31 2.36 ± 0.34& 2.08 ± 0.19& Примечание: * - статистически значимые различия между группами оК и оД при p < 0.05; &- статистически значимые различия между группой оК и группами оКИ0.3, оКИ0.6, оКИ1.5; между группой оД и группами оДИ0.3 , оДИ0.6, оДИ1.5 при p < 0.05. На 15-ый день обработки ИИ в суточной дозе 1.5 МЕ на крысу предотвращал снижение общего Т4 и вызывал повышение уровней свободного T4 и общего T3 на 15 и 28 % в сравнении с не обработанной ИИ диабетической группой (оД). Однако на 30-ый день восстанавливающее действие ИИ было ослаблено. ИИ в дозе 0.3 МЕ на крысу заметно не влиял на уровень тиреоидных гормонов у крыс с острой моделью СД1. 82 В отношении влияния ИИ на уровень ТТГ у диабетических животных нами были получены следующие результаты (табл. 3.14). Таблица 3.14 Уровни ТТГ в крови крыс с острым 30-ти суточным СД1 в условиях введения ИИ и без такового (M±SD) Группа животных Концентрация ТТГ, мкМЕ/мл До начала 15-ый день 30-ый день эксперимента, 1-й день оК (n=8) 0.39 ± 0.15 0.40 ± 0.12 0.42 ± 0.22 оКИ0.3 (n=6) 0.43 ± 0.18 0.78 ± 0.32& 0.67 ± 0.29 оКИ0.6 (n=6) 0.37 ± 0.19 0.72 ± 0.33 0.58 ± 0.36 оКИ1.5 (n=6) 0.47 ± 0.25 0.49 ± 0.33 0.34 ± 0.17 оД (n=8) 0.44 ± 0.22 0.35 ± 0.15 0.29 ± 0.20 оДИ0.3 (n=6) 0.37 ± 0.12 0.47 ± 0.16 0.35 ± 0.17 оДИ0.6 (n=6) 0.45 ± 0.21 0.57 ± 0.18& 0.51 ± 0.28 оДИ1.5 (n=6) 0.41 ± 0.09 0.60 ± 0.26& 0.52 ± 0.24 Примечание: &- статистически значимые различия между группой оК и группами оКИ0.3, оКИ0.6, оКИ1.5; между группой оД и группами оДИ0.3 , оДИ0.6, оДИ1.5 при p < 0.05. На 15-ый день ИИ в дозах 0.6 и 1.5 МЕ на крысу повышал концентрацию ТТГ на 58 и 67 %, и на 30-ый день – на 48 и 74 % в сравнении с диабетической группой, не получавшей ИИ. В группе оДИ0.3 уровень ТТГ в плазме крови животных практически не менялся и был сходным с таковым в группе оД30. 3.3.3. Влияние введения ИИ на уровень тиреоидных гормонов у крыс с пролонгированной моделью СД1 На 150-ый день после первой обработки крыс СТЗ уровни тиреоидных гормонов свободного T4, общего T4 и общего T3 были снижены на 33, 15 и 19 %, на 210-й день – на 27, 21 и 30 %, соответственно, причем изменения в случае 83 свободного T4 были достоверными (p < 0.05) (табл. 3.15). В конце эксперимента, на 210-й день, уровень ТТГ был вдвое выше, чем в соответствующем контроле. Введение ИИ в дозе 0.5 ЕД на крысу в течение 75 и 135 дней (начиная с 75-го дня после первой обработки СТЗ) приводило к частичному восстановлению уровня тиреоидных гормонов, хотя различия между группами мДИ150 и мД150, мДИ210 и мД210 были не достоверными. В наибольшей степени менялась концентрация свободного T4, которая через 75 и 135 дней после начала обработки ИИ повышалась в сравнении с таковой у необработанных крыс с моделью «мягкого» СД1 на 17 и 20 %. В то же время концентрация ТТГ при обработке ИИ менялась в значительной степени. Так, обработка диабетических животных с моделью «мягкого» СД1 ИИ вызывала повышение уровня ТТГ в полтора раза в сравнении с диабетическими крысами без обработки ИИ и с контрольными животными, получавшими ИИ. На 150-ый и 210-ый дни эксперимента уровень ТТГ в группах мДИ150 и мДИ210 был на 122 и 229 % выше, чем у контрольных животных, необработанных инсулином (табл. 3.15). Следует также отметить, что 135-ти дневная обработка ИИ контрольных крыс в суточной дозе 0.5 МЕ на крысу вызывала снижение уровня общего T3 на 22 % и повышение концентрации ТТГ на 123 %, в то время как уровень Т4 при этом не менялся. На 150-ый день эксперимента, когда контрольные крысы обрабатывались ИИ только 75 дней, изменений в уровне тиреоидных гормонов зафиксировано не было, в то время как концентрация ТТГ повышалась, но не достоверно (табл. 3.15). 84 Таблица 3.15 Концентрация тиреоидных гормонов и ТТГ у крыс с пролонгированной, 210дневной, моделью СД1 и влияние на них длительной обработки ИИ (M±SD) Группа Свободный Общий T4, Общий Т3, ТТГ, животных Т4, пМ нМ нМ мкЕД/мл 150 дней после первой СТЗ обработки (75-ый день введения ИИ) мК150 (n = 8) 20.7 ± 1.3 71.9 ± 2.4 2.08 ± 0.11 0.36 ± 0.15 мКИ150 (n = 6) 18.7 ± 2.5 68.8 ± 2.7 2.13 ± 0.15 0.50 ± 0.24 13.8 ± 1.4** 60.8 ± 4.5** 1.69 ± 0.16* 0.52 ± 0.30 16.1 ± 2.1 62.7 ± 3.8 1.87 ± 0.12 0.80 ± 0.35 мД150 (n = 8) мДИ150 (n = 6) 210 дней после первой СТЗ обработки (135-ый день введения ИИ) мК210 (n = 8) 23.0 ± 1.6 74.9 ± 3.1 2.24 ± 0.15 0.35 ± 0.13 мКИ210 (n = 6) 20.8 ± 1.5 69.5 ± 2.7 1.75 ± 0.25 0.69 ± 0.28& мД210 (n = 8) 16.8 ± 1.7** 58.8 ± 4.4** 1.57 ± 0.13** 0.71 ± 0.23* мДИ210 (n = 6) 20.1 ± 3.2& 68.0 ± 4.8 1.74 ± 0.14 1.04 ± 0.29 Примечание: *, ** - статистически значимые различия между соответствующими группами мК и мД, мКИ и мДИ, при p < 0.05 и p < 0.01, соответственно, &- статистически значимые различия между группами мК и мКИ или мД и мДИ при p < 0.05. 85 3.4. Нарушения в гипоталамо-гипофизарно-гонадной оси Для оценки функций репродуктивной системы и идентификации нарушений в ГГГ оси у самцов крыс с острым, 30-ти суточным, и мягким, пролонгированным, СД1, а также с моделью неонатального СД2 определяли уровень тестостерона в крови диабетических животных, исследовали функциональный ответ ГГГ оси на обработку люлиберином, а также изучали функциональную активность АЦСС во фракциях плазматических мембран, выделенных из семенников диабетических крыс. Полученные результаты сравнивали с данными по функциональной активности репродуктивной системы у самцов крыс контрольных групп того же возраста. 3.4.1. Суточная динамика изменения уровня тестостерона у здоровых животных и его регуляция люлиберином Исследование динамики изменений уровня тестостерона в плазме крови различных групп контрольных крыс с 10.00 до 18.00 показало, что концентрация гормона сильно варьирует и у большинства животных достигает максимальных значений в 12.00. В качестве примера приведем результаты исследования суточной динамики уровня тестостерона у 8-ми месячных самцов крыс (n = 10). Максимальная концентрация тестостерона составила 37.5 ± 3.8 нМ (12.00), минимальная – 13.8 ± 2.9 нМ (18.00), в то время как среднесуточная концентрация гормона – 27.0 нМ. Полученные данные указывают на необходимость учета суточных колебаний уровня гормона при изучении тестостеронпродуцирующей функции семенников, а также на важность суточной динамики изменений концентрации тестостерона, как одного из параметров функционирования ГГГ оси в условиях СД. Для оценки функциональной активности ГГГ оси животных обрабатывали люлиберином, рилизинг-фактором ЛГ. Среди различных способов введения люлиберина был выбран интраназальный способ его доставки, который обеспечивает непосредственное воздействие люлиберина на гипофиз, а также исключает быструю деградацию этого рилизинг-фактора в кровяном русле. На 86 начальном этапе подбирали дозу интраназально вводимого люлиберина и схему обработки с учетом того, что при его низких концентрациях стимулирующий эффект на продукцию тестостерона выражен слабо, а при очень высоких концентрациях, вследствие десенситизации рецепторов, начинает выявляться его ингибирующий эффект на продукцию ЛГ и тестостерона. В итоге была выбрана суммарная доза люлиберина 1 пг на крысу, и схема обработки, которая включала четыре введения по 0.25 пг в 10.30, 12.00, 13.30 и 15.00. В этом случае достигали длительного повышения уровня тестостерона, которое было отчетливо выражено уже через два часа после введения рилизинг-фактора. Значение AUC (11.00-16.00) для кривой концентрации тестостерона у контрольных крыс, обработанных люлиберином в суммарной дозе 1 пг на животное, составило 123±16, что на 46 % выше, чем у крыс контрольной группы без обработки люлиберином (рис. 3.5). оК30 оК30+Л 70 Тестостерон, нмоль/л 60 50 * * 40 30 20 10 0 11 12 13 14 15 16 В р е м я, ча с ы Рис. 3.5. Влияние интраназального введения люлиберина (1 пг/крысу) на суточную динамику концентрации тестостерона в контрольной группе крыс. * - различия между концентрацией тестостерона в плазме крови контрольных крыс без обработки и с обработкой интраназальным люлиберином достоверны при p < 0.05. 87 3.4.2. Уровень тестостерона и регуляция ГГГ системы люлиберином у крыс с 30-ти суточной моделью острого СД1 Изучение уровня тестостерона у диабетических крыс с моделью острого СД1 (n=8) проводили в укороченный период, с 11.00 до 16.00. Показано, что как стартовая концентрация тестостерона (в 11.00), так и его среднесуточная концентрация (в период до 16.00) у самцов с острым СД1 были достоверно ниже, чем у контрольных животных (рис. 3.6). Эти данные свидетельствует о развитии у животных с острым СД1 выраженного андрогенного дефицита. оК30 оД30/1 оД30/2 35 Тестостерон, нмоль/л 30 25 20 15 10 # 5 * * # * ** ** 0 11 12 13 14 15 16 Время, часы Рис. 3.6. Динамика изменения концентрации тестостерона в сыворотке крови контрольных и диабетических крыс в течение 5 дневных часов (с 11.00 до 16.00). * - различия между концентрацией тестостерона в плазме крови контрольных и диабетических крыс достоверны при p < 0.05; # - различия между концентрациями гормона в плазме крови двух групп диабетических крыс достоверны при p < 0.05. Изучение суточной динамики изменения тестостерона у диабетических животных позволяет разбить их на две группы – оД/1 и оД/2. В первой группе 88 крыс (оД/1, n = 3) сохранялась нормальная суточная динамика изменения уровня тестостерона (нисходящая кривая с утренним максимумом), в то время как во второй группе (оД/2, n = 5) концентрация тестостерона изначально была очень низкой (5–7 нмоль/л), а утренний максимум отсутствовал (рис. 3.6). При этом положительной корреляции между суточной динамикой изменения концентрации тестостерона и уровнем глюкозы в крови диабетических животных выявлено не было. При этом в группе оД/1 значение AUC(11.0016.00) было равно 44±10, что достоверно ниже, чем в контроле, где это значение составило 84±13. В то же время значение AUC(11.00-16.00) для группы оД/1 достоверно превышало таковое в группе оД/2, где AUC(11.00-16.00) для кривой концентрации тестостерона составил 20±1. Значение AUC(11.00-16.00) для объединенной диабетической группы (оД/1+оД/2, n=8) составило 32±15, что на 62 % меньше, чем в контроле. Для изучения чувствительности ГГГ оси крыс с острым СД1 к люлиберину изучали влияние интраназально введенного рилизинг-фактора ЛГ на уровень тестостерона, и сравнивали с соответствующими показателями в контрольной группе (рис. 3.7). Было показано, что повышение уровня тестостерона в ответ на люлиберин у крыс с моделью острого СД1 существенно слабее, чем в контроле. Здесь также можно было наблюдать два сценария влияния люлиберина на уровень тестостерона. В первой группе животных наблюдали типичный, хотя и менее выраженный пик гормона после обработки животных люлиберином, в то время как во второй группе первоначальный пик полностью отсутствовал и лишь в 16.00 наблюдали повышение уровня тестостерона (рис.3.7). 89 Тестостерон, нмоль/л 50 оК30+Л оД30-1+Л оД30-2+Л 40 30 20 10 # # # * * * 0 11 12 13 14 15 16 Время, часы Рис. 3.7. Динамика изменения концентрации тестостерона в сыворотке крови контрольных и диабетических крыс при интраназальном введении люлиберина в течение 5 дневных часов (с 11.00 до 16.00). * - различия между концентрацией тестостерона в плазме крови контрольных и диабетических крыс достоверны при p < 0.05; # - различия между концентрациями гормона в плазме крови двух групп диабетических крыс достоверны при p < 0.05. Полученные данные свидетельствуют о снижении уровня тестостерона и ослаблении ответа ГГГ оси на введение люлиберина у крыс с 30-ти суточным острым СД1, и, вместе с тем указывают на то, что нарушения в ГГГ оси в условиях острого СД1 очень индивидуальны и определяются тонкими компенсаторными механизмами, направленными на восстановление функций репродуктивной системы в условиях диабетической патологии. 3.4.3. Активность АЦСС в семенниках крыс с моделью острого СД1 Исследования проводили на группе самцов с 30-ти суточным острым СД1, показавшей в тесте в нагрузкой люлиберином наличие выраженной гипоандрогенемии. Показано, что базальная активность АЦ в семенниках крыс с острым СД1 снижается на 44 % в сравнении с контрольной группой. В семенниках диабетических крыс ослаблялся стимулирующий АЦ эффект GppNHp, негидролизуемого аналога ГТФ, который непосредственно 90 взаимодействует с Gs-белком, и отчетливо снижался базальный уровень ГТФсвязывания, что указывает на ослабление функциональной активности G-белков и их частичном выключении из сигнальной трансдукции. Наблюдали также снижение АЦ эффекта дитерпена форсколина, который является аллостерическим регулятором каталитического сайта АЦ (табл. 3.16). Важно отметить, что в большинстве тканей в условиях острого СД1 базальная активность АЦ и ее стимуляция форсколином практически не меняются, что свидетельствует об устойчивости каталитического компонента АЦСС, фермента АЦ, к негативному влиянию диабетической патологии. Выявленное нами ослабление функций АЦСС в семенниках крыс с СД1 свидетельствует о высокой лабильности репродуктивной системы в условиях метаболических нарушений, характерных для СД1. Таблица 3.16 Базальная и стимулированная GppNHp и форсколином активность АЦ и базальный уровень ГТФ-связывания в семенниках крыс с 30-ти суточным острым СД1 (M ± SD) Группа Активность АЦ, пмоль цАМФ/мин на мг белка крыс ГТФсвязывание, пмоль [8-3H]GppNHp/мг белка Базальная GppNHp, Форсколин, Базальный активность 10-5 М 10-5 М уровень оК30 (n = 8) 20.2 ± 2.4 42 ± 3 (100) 106 ± 7 (100) 2.7 ± 0.5 оД30 (n = 8) 11.4 ± 1.3 *(↓) 23 ± 3 (53) *(↓) 78 ± 5 (78) *(↓) 1.8 ± 0.4 *(↓) Примечание: в скобках приведены стимулирующие АЦ эффекты негормональных агентов, в процентах. Стимулирующие АЦ эффекты GppNHp и форсколина (оба – 10-5 М) в контроле приняты за 100%. * - различия между контрольными и диабетическими крысами достоверны при p < 0.05. 91 Таким образом, полученные нами данные указывают на то, что в семенниках крыс с моделью острого СД1 нарушаются как функции Gs-белков, через которые гормональные рецепторы стимулирующим способом сопряжены с АЦ, так и каталитические функции АЦ. Далее изучали стимулирующие АЦСС эффекты гормонов, являющихся ключевыми регуляторами функций мужской репродуктивной системы, которые оказывают на АЦ как стимулирующее (ХГЧ, PACAP-38), так и ингибирующее (соматостатин) влияние. Показано, что в тестикулярных мембранах, выделенных из семенников крыс с острым СД1, были в значительной степени снижены стимулирующие эффекты ХГЧ (10-8 M), структурного и функционального гомолога ЛГ, и полипептидного гормона PACAP-38 (10-7 M) на активность АЦ и ГТФсвязывание. Так, у животных с острым СД1 АЦ эффекты ХГЧ и PACAP-38 составили лишь 38 и 67 % от таковых величин в семенниках контрольных крыс (рис. 3.8 А). ГТФ-связывающая способность G-белков при стимуляции ХГЧ (108 M) в тестикулярных мембранах диабетических крыс была снижена в 4 раза по сравнению с контрольными животными (рис. 3.8 Б). 3 ,0 оК30 оД30 140 120 100 80 60 * * 40 20 0 Х ГЧ Б уровнем, пмоль [8-3H]-GppNHp/мг белка А Повышение ГТФ-связывания над базальным Прирост активности АЦ над уровнем базальной ее активности, пмоль цАМФ за мин на мг белка 160 оК30 оД30 2 ,5 2 ,0 1 ,5 * 1 ,0 * 0 ,5 0 ,0 P A C A P -38 ХГЧ P A C A P -3 8 Рис. 3.8. Стимуляция гормонами (ХГЧ, 10-8 M, PACAP-38, 10-7 M) активности АЦ (А) и ГТФ-связывания (Б) в семенниках диабетических и контрольных крыс. (M ± SD) * - различия между контрольными и диабетическими крысами достоверны при p < 0.05. 92 При изучении ингибирующих АЦ эффектов в семенниках крыс с острым СД1 было выявлено ослабление ингибирующего АЦ эффекта пептидного гормона соматостатина. В еще большей степени при СД1 снижалась стимуляция соматостатином базального уровня ГТФ-связывания, что связано с понижением его способности активировать Gi-белки в условиях острого СД1. Ингибирующий АЦ эффект соматостатина в семенниках диабетических крыс, который оценивали по влиянию гормона на предварительно стимулированную форсколином активность АЦ, был снижен в сравнении с контролем на 57 %, а стимуляция соматостатином ГТФ-связывающей активности Gi-белков была 100 80 эффекта форсколина, % Ингибирование стимулирующего АЦ 90 70 60 50 40 30 20 10 * оК30 оД30 Повышение ГТФ-связывания над базальным уровнем, пмоль [8-3H]-GppNHp/мг белка снижена на 68 % (рис. 3.9, рис. 3.10). оК30 оД 30 1,0 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 * 0,4 0,3 0,2 0,1 0,0 0 Рис. 3.9. Ингибирующие АЦ эффекты Рис. 3.10. Стимуляция соматостатина (10-6 M) в семенниках крыс соматостатином (10-6 M) ГТФс острым СД1 и контрольных крыс. (M ± связывания в семенниках крыс с SD) Процент от стимулирующего АЦ острым СД1 и контрольных крыс, эффекта форсколина (10-5 M), который в пмоль [8-3H]-GppNHp/мг отсутствие соматостатина принят за мембранного белка. (M ± SD)* 100 %. - различия между контрольными и различия между контрольными и диабетическими крысами достоверны при диабетическими p < 0.05. достоверны при p < 0.05. крысами 93 Таким образом, при остром 30-ти суточном СД1 значительно снижалась функциональная активность АЦСС в семенниках, о чем свидетельствует снижение базальной активности АЦ и базального уровня ГТФ-связывания, значительное ослабление стимулирующих АЦ эффектов гуаниновых нуклеотидов и форсколина, а также регуляторных эффектов полипептидных гормонов – ХГЧ, PACAP-38 и соматостатина, играющих ключевую роль в функционировании репродуктивной системы. При этом в значительной степени нарушались как стимулирующие, так и ингибирующие АЦ сигнальные каскады, что указывает на подавление активности обоих типов G-белков, Gs и Gi. Наши данные о системном ослаблении функций АЦСС в тканях и органах репродуктивной системы диабетических животных согласуются с результатами других авторов том, что в предстательной железе и семенных пузырьках крыс с СД1 снижены экспрессия и функциональная активность Gs- и Gi-белков, а также регуляция АЦ адренергическими агонистами и вазоактивным пептидом, функциональным и структурным гомологом PACAP-38 [146]. 3.4.4. Функциональная активность АЦСС в семенниках крыс с «мягким» пролонгированным СД1 У крыс с мягким СД1 (n = 8) суточная динамика тестостерона сохранялась только у одного животного из 8. В группе мД210 отмечали сильно выраженное снижение уровня тестостерона: 6.1±4.4 нМ в сравнении с 28.7±10.9 нМ в группе мК210 (p<0.01). Эти данные указывают на то, что длительное течение СД1, даже в условиях умеренной гипергликемии и относительной инсулиновой недостаточности, характерных для мягкого СД1, приводит к более выраженным нарушениям в функционировании ГГГ оси, чем при краткосрочном остром СД1. Изучали функциональное состояние АЦСС в семенниках крыс с 210-ти суточным «мягким» СД1, который вызывали многократной обработкой крыс низкими дозами СТЗ. Показано, что базальная активность АЦ в семенниках диабетических крыс была значительно снижена по сравнению с контролем (табл. 3.17). 94 Таблица 3.17 Базальная и стимулированная GppNHp и форсколином активность АЦ (пмоль цАМФ/мин на мг белка) в семенниках крыс с пролонгированной моделью СД1 (M ± SD) Группа крыс Базальная GppNHp, 10-5 М активность Форсколин, 10-5 М мК210 (n = 8) 20.0 ± 0.2 41.4 ± 4.8 (100) 95 ± 5 (100) мД210 (n = 8) 11.1 ± 0.3 * 19.4 ± 1.6 (39) * 54 ± 2 (57) * Примечание: в скобках приведены стимулирующие АЦ эффекты негормональных агентов, в процентах от таковых в контроле. Стимулирующие АЦ эффекты GppNHp и форсколина (оба – 10-5 М) в контроле приняты за 100%. * - различия между группами мК210 и мД210 достоверны при p < 0.05. У животных с пролонгированным «мягким» СД1 стимулирующий АЦ эффект GppNHp, негидролизуемого аналога ГТФ, был достоверно снижен по сравнению с контролем. В меньшей степени снижался стимулирующий АЦ эффект форсколина, который через 210 дней составил 57 % от эффекта этого активатора в контроле. Эти данные указывают на ослабление каталитических функций мембранносвязанной АЦ в тестикулах диабетических крыс с пролонгированным «мягким» СД1. 3.4.5. Влияние обработки ИИ на функциональную активность АЦСС в семенниках крыс с пролонгированным 210-суточным «мягким» СД1 Обработка крыс ИИ с пролонгированным 210-ти суточным СД1, которую проводили на протяжении 135 дней, слабо влияло на базальный уровень АЦ в семенниках диабетических животных. Так, в группе мДИ210 базальная активность АЦ составила 12.4±0.2 пмоль цАМФ/мин на мг мембранного белка, практически не отличаясь от этого параметра у диабетических животных, не обработанных ИИ (11.1±0.3 пмоль цАМФ/мин на мг мембранного белка). ИИ практически не влиял на базальную активность АЦ при обработке им 95 контрольных животных. В группе мКИ210 базальная активность составила 18.2 ± 0.2, в группе мК210 – 20.0±0.2 пмоль цАМФ/мин на мг мембранного белка. Введение ИИ также не влияло на стимулирующие АЦ эффекты GppNHp и форсколина у диабетических и контрольных крыс (рис. 3.11) мК210 мКИ210 мД210 мДИ210 Прирост активности АЦ, пмоль цАМФ за мин на мг белка 50 40 30 &&& *** 20 10 *** &&& 0 Б А Рис. 3.11. Влияние длительной обработки ИИ крыс с «мягким» СД1 на: (А) – стимулирующие АЦ эффекты GppNHp (10-5 М); (Б) – форсколина (10-5 М). (M±SD) *** - различия между группами мК210 и мД210 статистически достоверны при p<0.001; &&& - различия между группами мКИ210 и мДИ210, p<0.001. Далее были изучены регуляторные эффекты гормонов, действующих на АЦСС в семенниках диабетических крыс, и влияние на них введения ИИ. Исследовали стимулирующие эффекты ХГЧ и PACAP-38, а также ингибирующий АЦ эффект соматостатина, который оценивали по влиянию гормона на стимулированную форсколином активность фермента. В семенниках крыс с пролонгированным «мягким» СД1 стимулирующие АЦ эффекты ХГЧ (10-8 М) и PACAP-38 (10-7 М) были в значительной степени снижены (табл. 3.18). В отличие от стимулирующих АЦ эффектов GppNHp и форсколина, АЦ эффект ХГЧ в значительной степени восстанавливался при 96 обработке крыс ИИ. В то же время стимулирующий АЦ эффект PACAP-38 в условиях введения ИИ практически не менялся. Следует отметить, что снижение эффектов ХГЧ и PACAP-38 у крыс с пролонгированной моделью СД1 более ярко выражено в сравнении с острой моделью СД1. Таблица 3.18 Стимулирующие АЦ эффекты гормонов в тестикулах и влияние на них ИИ (M±SD) Группа ХГЧ, 10-8 М животных PACAP-38, 10-7 М Прирост активности АЦ в присутствии гормонов, пмоль цАМФ/мин на мг белка мК210 (n = 8) 105±4 53±3 мКИ210 (n = 6) 89±5 50±2 мД210 (n = 8) 40±3* 29±2* 67±2#,& 34±2& мДИ210 (n = 6) Примечание: * - различия между группами мК210 и мД210 статистически достоверны при p<0.001; # - между группами мД210 и мДИ210 при p<0.001; & - различия между группами мКИ210 и мДИ210 при p<0.001. Полученные результаты свидетельствуют о том, что в основе изменений функциональной активности семенников при различных экспериментальных моделях СД1 лежит нарушение чувствительности АЦ к гонадотропинам и пептидным гормонам VIP/PACAP-семейства. Одной из причин этого может быть снижение экспрессии αs-субъединицы Gs-белка, играющего ключевую роль в передаче стимулирующего сигнала с рецепторов к АЦ [147, 148]. Однако значительные изменения были связаны и с Gi-белок- сопряженными сигнальными путями, которые активируются пептидным гормоном соматостатином (рис. 3.12). 97 Ингибирование стимулирующего АЦ эффекта форсколина, % 100 * мК210 мКИ210 мД210 мДИ210 & 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 Рис. 3.12. Ингибирующий АЦ эффект соматостатина (10-6 М) в тестикулярных мембранах, выделенных из семенников крыс с пролонгированным СД1. Стимулирующий АЦ эффект форсколина (10-5М) принят за 100 %. (M ± SD) * - различия между группами мК210 и мД210 статистически достоверны при p<0.001; & - различия между группами мКИ210 и мДИ210 статистически достоверны при p<0.001. Показано, что ингибирующий АЦ эффект соматостатина (10-6 М) был почти полностью подавлен в семенниках крыс с пролонгированным «мягким» СД1, причем, как и в случае регуляторных эффектов ХГЧ и PACAP-38, ослабление АЦ эффекта соматостатина было более выражено, чем в случае острого СД1. Обработка ИИ не оказывало влияния на ингибирующий АЦ эффект соматостатина. 98 3.4.6. Исследование суточной динамики уровня тестостерона у самцов крыс с неонатальным СД и оценка функциональной активности ГГГ оси с помощью нагрузки люлиберином На начальном этапе изучали суточную динамику изменения концентрации тестостерона у самцов крыс с неонатальной моделью 8-ми месячного СД2. Показано, что суточная динамика у диабетических крыс была сходной с таковой у контрольных животных того же возраста, но утренний пик (12.00) был выражен слабо, а концентрация гормона с 14.00 до 18.00 практически не менялась. Значение AUC(10.00-18.00) для концентрации тестостерона у крыс с неонатальной моделью СД2 составило 106±27, что на 53 % меньше, чем в контроле – 224±33 (рис. 3.13). нК8 нД8 40 Тестостерон, НМ 35 30 25 20 * ** 15 ** *** 14 16 10 5 10 12 18 Время суток, ч Рис. 3.13. Динамика изменения концентрации тестостерона в плазме крови контрольных и диабетических крыс. (M ± SD) *, **, *** - различия между концентрацией гормона в плазме крови контрольных и диабетических крыс достоверны при p < 0.05, 0.01 и 0.001, соответственно. Максимальная концентрация тестостерона в этом случае составила 19.8 ± 3.1 нМ (12.00), минимальная – 8.2 ± 1.7 нМ (18.00), среднесуточная концентрация гормона была 13.2 нМ (n = 10). Таким образом, максимальная концентрация гормона и его среднесуточная концентрация у диабетических 99 крыс были на 47 и 51 % ниже таковых в контроле, что указывает на выраженную андрогенную недостаточность у самцов крыс с неонатальным СД2. Для изучения чувствительности ГГГ оси крыс с неонатальной моделью СД2 к люлиберину, рилизинг-фактору ЛГ, изучали его влияние на уровень тестостерона. В предварительных экспериментах было показано, что при интраназальном способе введения суточная доза люлиберина, вызывающая длительное повышение уровня тестостерона, составляет 1 пг на крысу (четыре введения по 0.25 пг в 10.30, 12.00, 13.30 и 15.00). Более высокие дозы люлиберина (от 100 пг до 10 мкг на крысу) приводили к устойчивому снижению уровня тестостерона уже через два часа после введения рилизинг-фактора (данные не представлены). При использовании люлиберина в суточной дозе 1 пг на крысу обнаружено, что уже через 30 мин после его первого введения контрольным животным (0.25 пг) наблюдается значительное повышение уровня тестостерона (+90 %) с последующим его понижением до значений, которые на 17–34 % превышали таковые у физиологический раствор (рис. 3.15). контрольных животных, получавших 100 70 нК8 нК8+Л нД8 нД8+Л # Тестостерон, нМ 60 50 40 & 30 * & # ** 20 & * & ** 10 0 11-00 12-30 14-00 16-00 Рис. 3.14. Влияние интраназального введения люлиберина на уровень тестостерона у контрольных и диабетических крыс. (M ± SD) *, ** - различия в уровне тестостерона между группами нК8 и нД8 достоверны при p < 0.05 и 0.01, # - между группами нК8 и нК8+Л и между группами нД8 и нД8+Л, p < 0.05, & - между группами нК8+Л и нД8+Л, p < 0.05. У животных с 8-ми месячным неонатальным СД2 прирост концентрации тестостерона, наблюдаемый через 30 мин после первого введения люлиберина, составил 8.5 нМ, что существенно ниже такового в контроле (27.6 нМ). В то же время, в отличие от контрольных животных, через два и четыре часа после начала введения люлиберина прирост концентрации тестостерона у крыс с 8-ми месячным неонатальным СД2 сохранялся на том же уровне, что и через 30 мин (рис. 3.14). Таким образом, при неонатальном СД2, несмотря на снижение максимального ответа, чувствительность ГГГ оси к люлиберину сохраняется, что может быть использовано для лечения андрогенной недостаточности в условиях СД 2-го типа люлиберином и его аналогами. 101 3.4.7. Изучение изменений функциональной активности АЦСС в семенниках самцов крыс с различной продолжительностью неонатальной модели СД2 На первом этапе изучали базальную активность АЦ в семенниках контрольных и крыс с неонатальной моделью СД2 в возрасте 3, 8 и 18 месяцев. Показано, что у 18-ти месячных контрольных самцов крыс базальная активность АЦ снижена в сравнении с 3-х и 8-ми месячными контрольными животными. Для групп нД8 и нД18 базальная активность фермента в семенниках составила 70 и 45% от таковой в семенниках 3-х месячных крыс с неонатальной моделью СД2. Это, как мы полагаем, связано с тем, что в возрасте трех месяцев у крыс с неонатальной моделью СД2 еще нет значительных проявлений заболевания. При сравнении базальной активности АЦ в семенниках у контрольных и диабетических крыс одного и того же возраста значительные различия наблюдали у 8-ми и 18-ти месячных животных (табл. 3.19). Полученные данные указывают на выраженную тенденцию к снижению базальной активности фермента с увеличением возраста как в контрольной, так и в диабетической группой животных. 102 Таблица 3.19 Базальная активность АЦ во фракциях плазматических мембран, выделенных из тестикул контрольных и диабетических крыс разного возраста Группа животных Семенники Базальная активность АЦ, пмоль цАМФ/мин на мг мембранного белка нК3 (n = 8) 19.0±2.5 нК8 (n = 8) 18.5±2.1 нК18 (n = 10) нД3 (n = 10) нД8 (n = 7) нД18 (n = 7) 15.6±2.2 #,## 19.5±2.5 13.6±1.2* 8.8±1.0* ,& ,&,&& Примечание: * - различие между группами контрольных и диабетических крыс одного возраста при p < 0.05; # - между группами нК3 и нК8 и между группами нК3 и нК18 при p < 0.05; ## - между группами нК8 и нК18 при p < 0.05.; & - между группами нД3 и нД8 и между группами нД3 и нД18 при p < 0.05; и && - между группами нД8 и нД18 при p < 0.05. При изучении влияния негормональных активаторов АЦ – форсколина и GppNHp, были получены следующие результаты. Стимулирующий АЦ эффект форсколина (10-5 М) в семенниках был снижен у 18-ти месячных крыс в сравнении с трех- и восьмимесячными животными (рис. 3.15, Б). Таким образом, с увеличением возраста и срока развития неонатального СД2 каталитическая активность АЦ в семенниках меняется в значительной степени. Стимулирующий АЦ эффект GppNHp (10-5 M) был значительно снижен у 18-ти месячных контрольных и крыс с неонатальной моделью СД2 в сравнении с более молодыми животными, что указывает на ослабление стимуляции Gsбелков гуаниновыми нуклеотидами с повышением возраста животных. В возрасте 8 и 18 месяцев стимулирующий АЦ эффект GppNHp у крыс с 103 неонатальной моделью СД2 был достоверно снижен в сравнении с таковым в соответствующих контрольных группах (p < 0.001). Так, в группе нД18 он Прирост активности АЦ над базальной активностью фермента, пмольцАМФ/мин на мг мембранного белка составил только 59 % от АЦ эффекта GppNHp в группе нК18 (рис. 3.15, А). 100 80 нК3 нК8 нК18 нД3 нД8 нД18 # ## & * & && * 60 40 20 # ## & & * && * 0 А Б Рис. 3.15. Активность АЦ, (А) стимулированная GppNHp (10-5 М) и (Б) форсколином (10-5 М) во фракциях тестикулярных мембран, выделенных из семенников 3-х, 8-ми и 18-ти месячных контрольных крыс и животных с неонатальным СД2. (M±SD). * - различие между группами контрольных и диабетических крыс одного возраста при p < 0.05; # - между группами нК3 и нК8 и между группами нК3 и нК18 при p < 0.05; ## - между группами нК8 и нК18 при p < 0.05; & - между группами нД3 ин Д8 и между группами нД3 и нД18 при p < 0.05; и && - между группами нД8 и нД18 при p < 0.05. Полученные нами данные свидетельствуют о значительном влиянии возраста и срока развития СД2 на функциональную активность Gs-белков в семенниках. 3.4.8. Гормональная чувствительность АЦСС в семенниках самцов крыс с различной продолжительностью неонатальной модели СД2 Далее в семенниках крыс с неонатальным СД2 различной продолжительности были изучены стимулирующие АЦ эффекты гормонов, 104 действующих через Gs-белки (ХГЧ, PACAP-38) или Gi-белки (соматостатин). Показано, что в семенниках 18-ти месячных контрольных самцов и крыс с неонатальной моделью СД2 в сравнении с трех и 8-ми месячными животными был значительно ослаблен стимулирующий АЦ эффект ХГЧ (10-8 М), что было наиболее выражено в группе нД18. АЦ эффект PACAP-38 (10-6 М) был сильно снижен в семенниках крыс группы нД18, в то время как в других группах животных снижение было не столь выражено, либо эффект сохранялся (рис. 3.16). У 8-ми месячных самцов крыс было также изучено влияние ХГЧ на ГТФсвязывающую способность Gs-белков. Показано, что при обработке тестикулярных мембран ХГЧ повышение базального уровня ГТФ-связывания в тестикулярных мембранах диабетических крыс составило 93 %, что существенно ниже, чем в мембранах животных группы нК8 (+142 %) (данные не Прирост активности АЦ над базальной активностью фермента, пмольцАМФ/мин на мг мембранного белка представлены). 100 нК3 нК8 нК18 нД3 нД8 нД18 # 90 80 70 * ## # 60 & * 50 * && & 40 ## # * & * 30 * && & 20 10 0 ХГЧ PAC AP-38 Рис. 3.16. Стимулирующие АЦ эффекты в тестикулах контрольных и диабетических крыс. (M± SD) Концентрация ХГЧ – 10-8 М, PACAP-38 – 10-6 М. * - различие между группами контрольных и диабетических крыс одного возраста при p < 0.05; # - между группами нК3 и нК8 и между группами нК3 и нК18, p < 0.05; ## - между группами нК8 и нК18, p < 0.05; группами нД3 и нД8 и между группами нД3 и нД18, p < 0.05; и группами нД8 и нД18, p < 0.05. & - между && - между 105 Ингибирующий АЦ эффект соматостатина (10-8 М) был значительно ослаблен в семенниках крыс групп нД8 и нД18 по сравнению с соответствующими контролями (рис. 3.17). В семенниках группы нД18 ингибирующий АЦ эффект составил 36 % от такового в группе нК18. Это позволяет сделать заключение, что в семенниках крыс с длительным неонатальным СД2 Gi-белок-сопряженные сигнальные пути, регулируемые соматостатином, значительно ослаблены. 100 *& АЦ эффект форсколина, % 90 ## # 80 70 * # 60 * && & нК3 нК8 нК18 нД3 нД8 нД18 50 40 30 20 10 0 Соматостатин Рис. 3.17. Ингибирующий эффект соматостатина на стимулированную форсколином АЦ в тестикулах контрольных и диабетических крыс. (M± SD) Концентрация соматостатина – 10-8 М, * - различие между группами контрольных и диабетических крыс одного возраста при p<0.05; # - между группами нК3 и нК8 и между группами нК3 и нК18, p<0.05; ## - между группами нК8 и нК18, p<0.05; между группами нД3 и нД18, p<0.05; и & - между группами нД3 и нД8 и && - между группами нД8 и нД18, p<0.05. Полученные данные свидетельствуют о том, что в семенниках крыс с неонатальным СД ослабляются стимулирующие эффекты ХГЧ на активность АЦ и ГТФ-связывающую способность Gs-белков. Это свидетельствует о 106 снижении чувствительности цАМФ-зависимых каскадов в этой ткани к регуляторному действию гонадотропинов. Эти изменения могут быть одной из причин выявленного нами снижения стимулирующего эффекта люлиберина на секрецию тестостерона у крыс с неонатальным СД и развития у них выраженной гипоандрогенемии. Обнаруженное нами снижение чувствительности АЦСС семенников к ХГЧ в условиях СД2 указывает на сходство молекулярных механизмов, ведущих к нарушению функций репродуктивной системы при различных формах СД. Необходимо подчеркнуть, что нами также выявлено ослабление регуляции АЦСС пептидными гормонами – PACAP-38 и соматостатином, играющими важную роль в контроле роста, дифференцировки и регенерации тестикулярных клеток. Эти изменения могут вносить существенный вклад в нарушения сперматогенеза, которые характерны для пациентов с СД1 и СД2, а также в возникновение изменений морфологии и ультраструктуры тестикулярных клеток. 107 ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ 4.1. Изменение тиреоидного статуса и функциональной активности АЦСС в щитовидной железе крыс с острым и пролонгированным («мягким») СД1, а также с неонатальным СД2 Проведенный нами комплекс исследований по изучению функций ГГТ оси в условиях краткосрочного острого СД1, вызванного однократной обработкой крыс СТЗ в дозе 65 мг/кг, «мягкого» СД1 различной продолжительности, вызванного последовательными инъекциями средних доз СТЗ, а также самцов крыс с неонатальной моделью СД2 продолжительностью до 18 месяцев позволил выявить значительные изменения в тиреоидном статусе диабетических животных, а также в функционировании гормональных сигнальных систем в ЩЖ на примере АЦСС, играющей ключевую роль в регуляции синтеза и секреции Т4. В крови крыс с СД1 нами было выявлено значительное снижение концентрации свободного Т4, свидетельствующее об ослаблении синтеза и секреции T4 фолликулярными клетками ЩЖ. Уровни общего Т4, а также T3 (свободного и общего) снижались только у крыс с острым СД1 и с пролонгированным 210-суточным «мягким» СД1, хотя и в меньшей степени в сравнении со свободным Т4. Другие авторы также сообщали о снижении уровня свободного Т4 и других тиреоидных гормонов у крыс со стрептозотоциновым СД1 [55, 56, 58, 149-151]. Следует, однако, отметить, что большинство исследований проводили на экспериментальных животных с острым СД1, который инициировали высокими дозами СТЗ (55–75 мг/кг) и которые характеризовались абсолютным дефицитом инсулина, сильно выраженной гипергликемией, окислительным стрессом и сильной интоксикацией организма уже на ранних стадиях инициирования диабетических моделей. Не вызывает сомнений тот факт, что при острой форме СД1 в значительной степени нарушается функционирование всей эндокринной системы, включая ГГТ ось, что приводит к резкому снижению синтеза и секреции тиреоидных гормонов и является причиной гипотиреоидного состояния. По своему негативному 108 влиянию на функции ЩЖ модель острого СД1 у крыс лишь отдаленно напоминает типичные формы СД1, возникающие у человека [68]. В первую очередь это связано с быстрым и значительным по величине снижением уровня тиреоидных гормонов, что, как правило, не наблюдается у диабетических пациентов. Так уже через трое суток после инъекции высокой дозы СТЗ крысам породы Sprague-Dawley у них сильно снижается уровень Т4 и T3, что сопровождается снижением на 46 % концентрации циркулирующего в крови ТРГ. Эти данные указывают на сочетанное ослабление функций фолликулярных клеток ЩЖ и секретирующих ТРГ гипоталамических нейронов [56]. Через 6 и 15 дней после инъекции СТЗ уровень свободного Т4 у трехмесячных самок крыс породы Dutch-Miranda снижался на 39 и 32 % соответственно [150]. Через две недели после обработки СТЗ у крыс породы Wistar на фоне отчетливо выраженных признаков острого СД1 в значительной степени снижался уровень всех форм тиреоидных гормонов и подавлялась секреция ТРГ гипоталамусом [58]. У людей быстрые изменения функций ЩЖ наблюдаются только в случае агрессивного развития сопровождается нарушением сильно СД1 в детском выраженной возрасте, когда гипергликемией, окислительно-восстановительного заболевание кетоацидозом, баланса. Концентрация свободного Т4, общего T4 и общего Т3, а также индекс свободного Т4, представляющей отношение свободного Т4 к общему T4, у таких пациентов снижаются уже в первые три дня после постановки диагноза СД1 [152]. В то же время при использовании моделей более длительного стрептозотоцинового «мягкого» СД1 снижение концентрации свободного и общего Т4 было выражено слабее, что, как показано нами и другими авторами, в большей степени соответствует клинической картине клинического и субклинического гипотиреоза у пациентов с СД1 [19, 22]. Так у крыс породы Dutch-Miranda с шестимесячным СД1, вызванным обработкой животных средними дозами СТЗ (45 мг/кг), концентрация Т4 в плазме крови лишь незначительно отличалась от таковой в контрольной группе [150]. 109 На ранних сроках, в первые недели, острого СД1 одной из основных причин снижения концентрации тиреоидных гормонов, в первую очередь свободного Т4, считают снижение уровня ТТГ вследствие ослабления его секреции тиротрофами гипофиза [58, 153]. Причинами этого могут быть ослабление функциональной секретирующих ТРГ, активности снижение гипоталамических чувствительности нейронов, секретирующих ТТГ тиротрофов гипофиза к регуляторному действию ТРГ [55, 58, 154]. Однако основной причиной принято считать нарушение секреторной функции гипофиза, что может быть связано с ослаблением как контролируемой ТРГ, так и независимой от ТРГ конститутивной секреции гормона [153]. Одним из факторов, вызывающих снижение секреции ТТГ, является значительное повышение в гипофизе диабетических животных концентрации нейромедина B, эндогенного ингибитора секреции ТТГ. Это было продемонстрировано для крыс с 20-ти дневным СД1, который вызывали обработкой животных СТЗ в субмаксимальной дозе 55 мг/кг [155]. Другим фактором может быть снижение в гипофизе и гипоталамусе активности фермента 5’-дейодиназы 2-го типа, который осуществляет конверсию Т4 в T3, В условиях ослабления превращения Т4 в T3 по механизму обратной связи меняется синтез и секреция ТТГ [156]. В условиях острого СД1 в гипофизе диабетических крыс существенно снижена экспрессия гена, кодирующего ТТГ, что приводит к дефициту его накопления в тиротрофах и не позволяет даже при значительной стимуляции гипофиза ТРГ, добиться адекватного повышения секреции этого гипофизарного гормона [157]. В пользу значительного снижения уровня ТТГ на ранних стадиях острого СД1 свидетельствуют данные, полученные при изучении крыс Sprague-Dawley через три дня после индукции СД1, а также у крыс Wistar через две недели после обработки СТЗ [56, 58]. В дальнейшем уровень ТТГ постепенно восстанавливается до его значений, близких к таковым у контрольных животных [52, 158]. При этом уровень тиреоидных гормонов по-прежнему был снижен, что указывает на развитие резистентности фолликулярных клеток ЩЖ к регуляторному действию ТТГ, причинами чего могут быть как деструктивные 110 процессы в ЩЖ, так и нарушения в зависимых от ТТГ сигнальных каскадах [55, 150, 159]. При снижении дозы СТЗ, используемой для инициирования СД1, несмотря на снижение уровня тиреоидных гормонов, как на ранних, так и на поздних стадиях заболевания концентрация ТТГ в плазме крови диабетических животных существенно не менялась. На это указывают данные бразильских исследователей, полученные при изучении ими самок крыс Dutch-Miranda с краткосрочным (6 и 15 суток) и с пролонгированным СД1 (шесть месяцев), который вызывали инъекцией СТЗ в дозе 45 мг/кг [150]. Это подтверждают и наши данные, полученные при изучении «мягкого» СД1, вызванного последовательными инъекциями средних доз СТЗ (30–40 мг/кг). Более того, в случае пролонгированной модели (7 месяцев) «мягкого» СД1 концентрация ТТГ в крови диабетических крыс была в два раза выше, чем концентрация этого гормона в контрольной группе животных. Это может быть связано с компенсаторной реакцией организма на длительное снижение тиреоидных гормонов. Выраженный дефицит тиреоидных гормонов на фоне нормального или повышенного уровня ТТГ свидетельствует о развитии у крыс гипотиреоидного состояния, что, вероятно, связано со снижением чувствительности тироцитов ЩЖ к регуляторному действию ТТГ. Полученные нами данные о повышении уровня ТТГ в условиях пролонгированного, 210-ти суточного, «мягкого» СД1 хорошо согласуются с клинической картиной гипотиреоидных состояний у пациентов с СД1. У значительной их части развиваются аутоиммунный тиреоидит и гипотиреоз с повышенным уровнем ТТГ, причем во многих случаях это повышение является значительным и рассматривается как фактор риска для развития рака ЩЖ [19, 160]. Таким образом, по ключевому параметру – уровню ТТГ, используемая нами пролонгированная модель более пригодна для изучения патологии ЩЖ в условиях СД1, в сравнении с традиционно используемыми краткосрочными моделями острого СД1. Выявленное нами и другими авторами снижение уровня свободного и общего T3, который регулирует метаболические и ростовые процессы в тканях- 111 мишенях, определяется подавлением синтеза и секреции Т3 в печени, почках, гипофизе, мозге, мышцах и других тканях. Синтез функционально активного T3 осуществляется ферментами дейодиназами, которые отщепляют атом йода от молекулы Т4. В дальнейшем Т3 проникает в ядро клетки и связывается там со специфичным к нему ядерным T3-рецептором [161, 162]. Имеются данные об ослаблении функциональной активности 5’-дейодиназы 2-го типа в гипофизе и гипоталамусе крыс с экспериментальным СД1, что самым непосредственным образом влияет на синтез и секрецию ТТГ [156]. В условиях краткосрочного СД1 отмечено снижение каталитической активности дейодиназы 1-го типа в печени и почках [52, 163]. Показано, что динамика снижения активности дейодиназы 1-го типа положительно коррелирует со снижением уровня Т3 в крови диабетических животных. Это указывает на то, причинами снижения уровня Т3 при экспериментальном СД1 являются как сниженный уровень субстрата реакции – свободного Т4, так и снижение каталитической активности и(или) экспрессии фермента дейодиназы, а также нарушение его позитивной регуляции кофакторами [163]. Нами в случае острого СД1 достоверное снижение уровня Т3 выявлено через 30 суток после индукции заболевания, в то время как при «мягком» СД1 наблюдается плавное снижение концентрации Т3 при повышении срока заболевания – через 30, 150 и 210 дней после его индукции СТЗ уровень свободного Т3 снижался на 10, 16 и 24 % соответственно (табл. 3.5). Основной сигнальной системой, которая в ЩЖ связывает рецептор ТТГ с внутриклеточными эффекторными белками, ответственными за синтез и секрецию Т4, является чувствительная к гормонам АЦСС. Вследствие этого от функциональной активности АЦСС в ЩЖ, в первую очередь от ее сенсорного компонента – рецептора ТТГ, зависит синтез и секреция Т4 и ответ ЩЖ на действие ТТГ [20]. Нами впервые установлено, что стимулирующий эффект ТТГ на активность АЦ в ЩЖ диабетических крыс в значительной степени ослаблен. Снижение стимулирующего АЦ эффекта ТТГ, которое в наибольшей степени 112 выражено при остром СД1, положительно коррелирует со снижением уровня тиреоидных гормонов у диабетических животных. Мы полагаем, что нарушение цАМФ-зависимой сигнализации в тироцитах в условиях СД1 является одной из ключевых причин развития резистентности ЩЖ к действию ТТГ. Следует отметить, что наряду с ТТГ, в ЩЖ диабетических животных ослабляются стимулирующие АЦ эффекты и некоторых других гормонов, функции которых напрямую не связаны с контролем синтеза и секреции тиреоидных гормонов. Так нами показано, что при остром СД1 снижается АЦ эффект β-агониста изопротеренола, который участвует в регуляции микроциркуляции крови в ЩЖ, а в условиях пролонгированной модели «мягкого» СД1 ослабляется АЦ эффект пептидного гормона PACAP-38, который вовлечен в контроль ростовой активности клеток ЩЖ, их регенерации и дифференцирования [143, 144, 164]. Изменения чувствительности АЦ к гормонам, активаторам фермента, в том числе к ТТГ, могут быть связаны с ослаблением функциональной сопрягающих компонентов активности между гетеротримерных рецепторами серпантинного Gs-белков, типа и ферментом АЦ. В пользу этого свидетельствует тот факт, что стимулирующий АЦ эффект GppNHp, действующего непосредственно на гуаниннуклеотидсвязывающий сайт Gs-белка, в значительной степени снижен в ЩЖ всех исследованных нами групп диабетических животных. В то же время, например при остром СД1, когда стимулирующий АЦ эффект GppNHp снижен почти вдвое, АЦ эффект PACAP-38, действие которого реализуется через сопряженный с Gs-белком рецептор VIP/PACAP-семейства, даже несколько повышается. Не исключено, что в этом случае уменьшение функциональной активности Gs-белков компенсируется усилением экспрессии рецепторов, связывающих PACAP-38, что позволяет сохранить регуляторное влияние PACAP-38 на рост и регенерацию клеток ЩЖ в условиях деструктивных процессов, вызванных острым СД1, как это происходит в мозге в случае стимуляции АЦ агонистами дофаминовых рецепторов [2]. 113 При изучении самцов крыс с длительно текущим неонатальным СД, который по ряду характеристик близок СД2 человека, вызванным инъекциями высокой дозы СТЗ 5-ти дневным крысятам, было выявлено ослабление функциональной активности АЦСС в ЩЖ и ее чувствительности к ТТГ и другим гормонам, регуляторам АЦ. Изменения усиливались с повышением возраста животных и в наибольшей степени проявлялись в группе крыс с продолжительностью заболевания 18 месяцев. Следует отметить, что ослабление функциональной активности АЦСС, хотя и менее выраженное, в возрасте 18 месяцев наблюдали и у контрольных животных. Выявленное нами снижение чувствительности АЦ к регуляторному действию ТТГ, как и при СД1, может вызывать ослабление ответа ЩЖ на ТТГ. Имеются данные литературы о том, что у пациентов с СД2 наблюдается повышение уровня ТТГ, которое сопровождается нормальным или сниженным уровнем тиреоидных гормонов, что свидетельствует о развитии ассоциированного с СД2 гипотиреоидного состояния [165, 166]. Таким образом, нами показано, что у крыс с краткосрочными и пролонгированными моделями стрептозотоцинового СД1 развивается гипотиреоидное состояние, которое характеризуется снижением содержания тиреоидных гормонов на фоне нормального или повышенного уровня ТТГ, что указывает на снижение чувствительности ЩЖ к действию ТТГ. Нами впервые установлено, что изменения концентрации тиреоидных гормонов и ТТГ у крыс с пролонгированной, 210-ти суточной, моделью «мягкого» СД1 сходны с теми, которые наблюдаются у пациентов с СД1, в то время как в случае острого СД1, который характеризуется сильно выраженной гипергликемией, абсолютным дефицитом инсулина и общей интоксикацией организма, изменения в содержании этих гормонов существенно отличаются от таковых при СД1 человека. На основании полученных данных сделан вывод о том, что одной из ключевых причин развития резистентности тканей ЩЖ к ТТГ при СД1 является ослабление передачи генерируемого этим гормоном сигнала через АЦСС, на что указывает снижение стимулирующего эффекта ТТГ на активность АЦ в 114 тироидальных мембранах диабетических крыс. Сходные, хотя и менее выраженные изменения, связанные со снижением чувствительности АЦСС к ТТГ выявлены и в ЩЖ самцов крыс с длительно текущей неонатальной моделью СД, близкой СД2 человека, что говорит об универсальности нарушений в гормональных сигнальных каскадах в ЩЖ при различных формах диабетической патологии. Изучение молекулярных механизмов, лежащих в основе ослабления функций ЩЖ в условиях различных моделей СД1 и СД2, необходимо для разработки новых стратегий для эффективного мониторинга и лечения заболеваний ЩЖ, как осложнений СД, а также для оптимизации применения тиреоидных препаратов для терапии ассоциированных с СД1 и СД2 гипотиреоидных состояний. 4.2. Влияние интраназального инсулина на функциональную активность щитовидной железы в условиях диабетической патологии Традиционно внутримышечные для лечения инъекции СД1 инсулина, используют которые подкожные позволяют не и только нормализовать уровень глюкозы, но и восстановить нарушенные в условиях гипергликемии и гипоинсулинемии эндокринные функции. Это в полной мере относится и к функционированию ГГТ оси. Показано, что обработка крыс с СД1 инъекционным инсулином частично восстанавливает у них функции ГГТ оси и приводит к повышению уровня тиреоидных гормонов [167-169]. Так семидневное введение крысам с острым СД1 инсулина дважды в день в дозе 1.2 МЕ на 100 г веса тела животного, приводило к полному восстановлению уровня тиреоидных гормонов и ТТГ, сильно сниженных в условиях СД1 [170]. Обработка инсулином крыс со стрептозотоциновым СД1 в течение 10 дней восстанавливала уровень сказывалось функционировании на тиреоидных гормонов, что сердечно-сосудистой также позитивно системы [168]. Использование даже сравнительно низких доз инсулина в суточной дозе 1 МЕ на крысу приводило к частичному восстановлению уровня общего и свободного Т4 115 и общего Т3 у СТЗ крыс, несмотря на то, что в этой дозе инсулин не вызывал нормализации уровня глюкозы [169]. Эффективность низких доз инсулина для восстановлении функций ГГТ оси в условиях острого СД1, на фоне продолжающейся гипергликемии, свидетельствует о высокой чувствительности компонентов этой оси, в первую очередь секретирующих ТРГ гипоталамических нейронов, к действию инсулина. В пользу этого свидетельствуют данные о том, что обработка низкими дозами инсулина в условиях in vitro гипоталамических нейронов, полученных от диабетических животных, приводила к значительному усилению секреции ими ТРГ, хотя заметно не влияла на синтез этого рилизинг-фактора [171]. В этой связи представляют интерес данные о том, что в условиях острого дефицита инсулина в мозге крыс R-Amsterdam со стрептозотоциновым СД1 нарушается высвобождение ТРГ из срединного возвышения гипоталамуса, что приводит к снижению уровня циркулирующего ТРГ через 1, 2 и 3 недели после индукции заболевания, но синтез этого нейрогормона в нейронах меняется незначительно. Еще в 1995 году была выдвинута гипотеза о том, что инсулин мозга усиливает секрецию ТРГ, подавляя высвобождение нейропептида Y паравентрикулярными ядрами гипоталамуса [172]. Известно, что нейропептид Y подавляют секрецию ТРГ, что обусловлено его специфическим связыванием с рецепторами на ТРГ-продуцирующих нейронах [173]. В 1997 году экспериментально было доказано, что при интрацеребровентрикулярном введении инсулин подавляет экспрессию гена, кодирующего нейропептид Y, и снижает секрецию этого нейропептида гипоталамическими нейронами, причем действие инсулина реализуется только в гипоталамусе, не затрагивая другие области мозга [174]. Имеются данные о том, что секреция ТРГ стимулируется лептином, который может действовать либо непосредственно через рецепторы, расположенные на различных типах ТРГ-продуцирующих нейронов, что ведет к активации ТРГ-промотора, либо опосредованно через активацию меланокортиновой сигнальной системы. В этом случае лептин усиливает высвобождение α-меланоцитстимулирующего гормона из 116 проопиомеланокортиновых нейронов [175]. В этой связи необходимо отметить, что инсулиновая сигнальная система мозга вовлечена во взаимодействие с лептиновой и меланокортиновой сигнальными системами, вследствие чего инсулин в ЦНС может непосредственно влиять на их функциональную активность. В пользу влияния инсулина на секретирующие ТРГ нейроны свидетельствуют данные экспериментов in vitro об усилении вызываемой ТРГ секреции пролактина в культуре клеток гипофиза крыс при их обработке физиологическими концентрациями инсулина [176]. Однако исследований по влиянию введенного в мозг инсулина на тиреоидный статус у контрольных крыс и животных с экспериментальными моделями СД1 до настоящего времени не проводилось. В этой связи можно только упомянуть работу, в которой изучали влияние введенного в мозг инсулина на тиреоидный статус у голодающих крыс, но у этих животных на фоне голодания были значительно снижены уровни инсулина, лептина и глюкозы, что существенно влияет на регуляцию активности ТРГ- продуцирующих гипоталамических нейронов инсулином мозга [173]. В то же время выяснение того, как повышение уровня инсулина в мозге влияет на функции ГГТ оси и тиреоидный статус, является одной из актуальных задач современной эндокринологии и нейрологии, поскольку вот уже на протяжении двадцати лет интенсивно изучаются новые подходы для лечения нейродегенеративных заболеваний, а также диабетической патологии, основанные на использовании интраназального способа введения инсулина. В этом случае инсулин поступает непосредственно в мозг, что позволяет повысить концентрацию гормона в мозге и восстановить функциональную активность инсулиновой сигнальной системы в условиях инсулинового дефицита (СД1) или инсулиновой резистентности (болезнь Альцгеймера, метаболический синдром, СД2) [177-179]. Проведенное нами исследование показало, что ИИ при длительном применении в значительной степени восстанавливает сниженную в условиях СД1 концентрацию тиреоидных гормонов, причем его эффект выявляется как в 117 случае модели острого СД1, вызванного обработкой высокой дозой СТЗ, так и при пролонгированном «мягком» СД1. Обработка ИИ также приводила к повышению чувствительности ГГТ оси к действию ТРГ, которая была снижена у диабетических животных. В случае острого СД1 из трех изученных доз ИИ наиболее эффективной была суточная доза, равная 0.6 МЕ на крысу, доза 1.5 МЕ на крысу немного ей уступала, в то время как низкая доза, 0.3 МЕ на крысу, была мало эффективной. При обработке пролонгированного «мягкого» СД1 использовали дозу 0.5 МЕ на крысу, которая с высокой эффективностью влияла на функциональное состояние тиреоидной оси. Полученные данные указывают на то, что в условиях абсолютного (острый СД1) или относительного («мягкий» СД1) дефицита инсулина повышение его уровня исключительно в ЦНС позволяет предотвратить или в значительной степени сгладить снижение уровня тиреоидных гормонов, характерное для СД1. При этом у обработанных ИИ диабетических крыс сохранялась гипергликемия, что позволяет сделать вывод о том, что гипергликемия не является ключевым фактором, определяющим активность ГГТ оси в условиях СД1. У контрольных животных ИИ заметного влияния на уровень тиреоидных гормонов не оказывал, что свидетельствует о слабой взаимосвязи между активностью инсулиновой сигнальной системы мозга и синтезом и секрецией тиреоидных гормонов у здоровых животных, не имеющих дефицита тиреоидных гормонов. В то же время при изучении влияния ИИ на уровень ТТГ картина была другой. При введении ИИ в течение 28 дней он повышал уровень ТТГ как у диабетических, так и у здоровых крыс, хотя в случае крыс с СД1 эффективными были дозы 0.6 и 1.5 МЕ, у здоровых животных – 0.3 МЕ на крысу. Различия в эффективных дозах, вероятно, связаны с тем, что в мозге диабетических крыс наблюдается острый дефицит инсулина, что требует введения более высоких доз гормона для его компенсации. Мы полагаем, что введение высоких доз (0.6 и 1.5 МЕ) ИИ контрольным животным приводит к десенситизации инсулиновых рецепторов в мозге и развитию инсулиновой резистентности, с чем и связано 118 отсутствие стимулирующего влияния ИИ на выработку ТТГ в этих дозах. Возможно, этим объясняется и некоторое снижение положительного влияния ИИ в дозе 1.5 МЕ на ГГТ ось у крыс с СД1 в сравнении с дозой 0.6 МЕ. Следует отметить, что обработка диабетических крыс ИИ в суточной дозе 0.6 МЕ на крысу вызывала не только восстановление тиреоидной оси, но и заметно снижала гипергликемию. Еще более отчетливое влияние ИИ оказывал на уровень ТТГ при его длительном использовании у крыс с «мягким» СД1 и при обработке соответствующей им контрольной группы, причем влияние на уровень ТТГ усиливалось при увеличении продолжительности обработки ИИ. Так уровень ТТГ в группе мКИ210, обработанных ИИ в суточной дозе 0.5 МЕ в течение 135 суток, превышал таковой у необработанных животных более чем в два раза. У диабетических животных концентрация ТТГ в группе мДИ в полтора раза превышала таковую в группе мД и в три раза концентрацию гормона в группе мК. Ранее нами было показано, что длительное введение крысам ИИ в суточной дозе 0.45-0.6 МЕ/крысу приводит к частичному восстановлению активности АЦСС, чувствительной к моноаминам (серотонину, дофамину) и пептидным гормонам (соматостатину, PACAP-38), в мозге крыс с пролонгированной моделью СД1 и неонатальной моделью СД2 [2, 180]. Мы полагаем, что вызываемое ИИ восстановление функциональной активности интегративной сети нейромедиаторных систем мозга у диабетических животных является одним из ключевых факторов, ответственных за повышение чувствительности гипофиза к ТРГ, повышение синтеза и секреции ТТГ и восстановление функций ГГТ оси. Важно отметить, что восстанавливающий эффект ИИ на функционирование нейромедиаторных систем мозга выявлялся при использовании тех же доз и той же продолжительности обработки, что и в случае позитивного влияния ИИ на ГГТ ось. Таким образом, нами впервые показано, что длительная обработка ИИ крыс с моделями острого и «мягкого» стрептозотоцинового СД1 приводит к частичному улучшению их тиреоидного статуса, что выражается в повышении 119 уровня тиреоидных гормонов и в восстановлении чувствительности ГГТ оси к регуляторному действию ТРГ, сниженных в условиях СД1. В случае острого СД1 изучены различные дозы ИИ (от 0.3 до 1.5 МЕ на крысу) и установлено, что наиболее эффективной среди них является суточная доза 0.6 МЕ, которая близка к дозе, оказывающей выраженный позитивный эффект на тиреоидную ось при обработке длительного «мягкого» СД1 (0.5 МЕ на крысу). Впервые обнаружено, что введение в течение месяца сравнительно низких доз ИИ (0.3 МЕ на крысу) здоровым крысам приводит к значительному повышению у них уровня ТТГ, не влияя при этом на тиреоидный статус. Повышение уровня ТТГ было выявлено и при длительной, 135-дневной, обработке ИИ крыс с «мягким» СД1, у которых уровень гормона и так был повышен в сравнении с контролем, а также здоровым животным. Это необходимо учитывать при длительной терапии ИИ диабетических больных и пациентов с недиабетической патологией, в частности с болезнью Альцгеймера. Последнее особенно важно, поскольку лечение ИИ сейчас рассматривается, как одно из магистральных направлений терапии болезни Альцгеймера и других нейродегенеративных состояний [178, 181]. 4.3. Влияние экспериментального СД на функциональный статус гипоталамо-гипофизарно-гонадной системы и активность чувствительной к гонадотропинам АЦСС в тестикулярной ткани Одними из осложнений СД1 и СД2 являются нарушения репродуктивной системы, что ведет к гипогонадотропным состояниям и андрогенному дефициту у мужчин и синдрому поликистоза яичников у женщин [72, 182]. В конечном итоге, это вызывает нарушения репродуктивных функций и бесплодие, что является одной из важнейших социальных проблем в диабетологии. В то же время данные о нарушениях репродуктивных функций при СД, их динамика и выраженность, молекулярные механизмы этих нарушений и функционирование гормональных систем в органах и тканях репродуктивной системы до сих пор изучены недостаточно. В частности практически не исследовано, как в условиях СД меняется функциональная активность гормональных сигнальных систем в 120 семенниках, в том числе АЦСС, играющей ключевую роль в регуляции роста и дифференцировки генеративных клеток, а также в контроле синтеза и секреции стероидных гормонов. Вследствие этого, проведенное нами комплексное исследование, в котором исследованы уровень тестостерона, чувствительность ГГГ оси к люлиберину и регуляторные свойства АЦСС в семенниках крыс с различными моделями СД1 и СД2 является по своему уникальным. Исследование динамики изменений уровня тестостерона в плазме крови контрольных крыс в течение трех дней показало, что он сильно варьирует и у большинства животных достигает максимальных значений в 11.00-12.00. У диабетических животных с неонатальной моделью СД2 динамика изменений уровня тестостерона была сходной, но утренний пик был выражен слабо. Среднесуточная концентрация тестостерона у крыс с неонатальной моделью СД2 была ниже, чем в контроле, что указывает на выраженную андрогенную недостаточность. Следует отметить, что у пациентов с СД2 также наблюдается, хотя и не столь выраженное, снижение уровня тестостерона [80, 87, 88]. Полученные данные свидетельствуют о том, что инсулиновая резистентность и умеренная гипергликемия, характерные для неонатального СД2 у крыс и СД2 человека, являются основными факторами, ведущими к гипоандрогенемии при СД2. В то же время гиперинсулинемия, как мы полагаем, не играет определяющей роли, поскольку неонатальная модель не сопровождается гиперинсулинемией, типичной для СД2 человека, а, напротив, характеризуется небольшим снижением уровня инсулина [1, 2]. Еще одним фактором может быть гиперхолестеринемия, типичная для СД2, в том числе для его неонатальной модели [2]. Косвенно на это указывают данные о том, что обогащенная холестерином диета в два раза снижает концентрацию тестостерона в крови самцов крыс с СД1, у которых уровень андрогенов изначально снижен [183]. При использовании теста с нагрузкой люлиберином было обнаружено, что у животных с неонатальным СД2 после интраназального введения люлиберина наблюдается прирост концентрации тестостерона, но он существенно ниже прироста в контроле. Таким образом, при неонатальном СД, несмотря на 121 снижение максимального ответа, чувствительность ГГГ оси к люлиберину сохраняется, что может быть использовано для лечения андрогенной недостаточности в условиях СД2 люлиберином и его аналогами. В большинстве исследований на острой модели СД1 уровень тестостерона измеряли в конечной точке эксперимента – при забое животных. В результате этих исследований было показано, что у диабетических животных с острой моделью СД1 уровень тестостерона снижен по сравнению с контрольными животными [184-186]. Поэтому при изучении острой модели СД1 особый интерес представляло изучение суточной динамики изменения уровня тестостерона. Нами было показано, что диабетические животные с острой моделью СД1 разделились на 2 группы: в одной группе у диабетических самцов сохранялась суточная динамика уровня тестостерона, но при этом начальная точка и максимум были значительно ниже, чем в контрольной группе животных; во второй группе крыс концентрация тестостерона изначально была очень низкой и максимум в течение дня отсутствовал. В тесте с нагрузкой люлиберином разделение диабетических животных с острой моделью СД1 сохранялось: в одной группе наблюдался прирост концентрации тестостерона, хотя и ниже, чем в контроле, в другой группе – прирост концентрации гормона практически отсутствовал. Неоднородность такого распределения, по-видимому, можно объяснить сильным токсическим эффектом СТЗ [186], развитием окислительного стресса [187] и короткой продолжительностью диабета – за это время не успевают полностью проявиться компенсаторные механизмы, так как прямой корреляции с уровнем глюкозы в крови диабетических животных, суточной динамикой уровня тестостерона и ответом на интраназальное введение люлиберина выявлено не было. Ряд авторов показали, что у самцов крыс с СТЗ-индуцированным СД1, наблюдается снижение пика выброса ЛГ в ответ на введение люлиберина в сравнении с контрольными животными [92, 102]. Предполагается, что в условиях СД1 снижение уровня ЛГ может быть связано с целым рядом факторов, среди которых ослабление чувствительности лютеотрофов гипофиза к 122 люлиберину и снижение высвобождения люлиберина гипоталамическими нейронами [55, 57, 185]. Полученные нами данные подтверждают эту гипотезу. С другой стороны мы показали, что еще одним звеном, которое подвергается значительным изменениям в условиях диабетической патологии, является регуляция гонадотропинами (ЛГ или ХГЧ) функциональной активности АЦСС в клетках Лейдига семенников. Изучение нами активности АЦСС в различных тканях животных с экспериментальными моделями СД1 и СД2 показало, что изменения функциональной активности и чувствительности к гормонам этой системы в наибольшей степени выражены в семенниках. Мы полагаем, что это связано с запуском программы ослабления или даже полного выключения репродуктивной функции в условиях острой гипергликемии, окислительного стресса, метаболических нарушений, которые характерны для обоих типов СД. В семенниках крыс с острой 30-ти суточной стрептозотоциновой моделью СД1 и с пролонгированной, моделью «мягкой», заболевания продолжительностью 210 суток, ослаблялись не только регуляторные эффекты гуаниновых нуклеотидов и гормонов, что характерно для миокарда и мозга диабетических животных, но и в значительной степени снижались базальная и стимулированная форсколином активность фермента, что свидетельствует о нарушении функций каталитического компонента АЦСС. Это должно быть связано со снижением экспрессии и функциональной активностью мембранносвязанных форм АЦ в тестикулярных клетках диабетических крыс. Ключевую роль в этих процессах, как мы полагаем, играет длительное влияние инсулиновой недостаточности и вызываемых СД1 метаболических и гормональных нарушений, а не уровень гипергликемии. В пользу этого свидетельствуют следующие факты. В семенниках крыс с 10-ти суточной острой моделью базальная активность АЦ снижалась на 17 %, в то время как при 30-ти суточной острой модели и при 75-ти и 210-ти суточной пролонгированной модели – на 38–44 %. Стимулирующие АЦ эффекты форсколина, изопротеренола и PACAP-38 и ингибирующий эффект соматостатина у крыс с 123 острой моделью продолжительностью 10 суток достоверно не отличались от таковых в контроле, а стимулирующий АЦ эффект ХГЧ снижался только на 33 %, в то время как в остальных случаях – на 58–62 %. Таким образом, АЦСС в семенниках на ранних стадиях острого СД1 не подвергается значительным изменениям, в то время как в дальнейшем эти изменения становятся отчетливо выраженными и приводят к дисфункциям репродуктивной системы. Более значительные изменения функциональной активности АЦСС семенников наблюдали и в случае крыс с длительной неонатальной моделью СД2, причем здесь также наблюдали изменения не только регуляции АЦ гормонами и GppNHp, но также и значительное снижение базальной и стимулированной форсколином активности фермента. Снижение стимулирующего АЦ эффекта ХГЧ в семенниках диабетических животных является одним из важнейших факторов, который приводит к ослаблению регуляторного действия гонадотропинов на синтез и секрецию тестостерона клетками Лейдига, но и по механизму обратной связи вызывает повышение уровня ЛГ в крови, что является основным фактором, «разгоняющим» резистентность репродуктивных тканей к гонадотропинам. Так при СД1 обычно наблюдается значительное повышение уровня гонадотропинов при нормальном или сниженном уровне андрогенов [81]. У мужчин с СД2, для которых характерно снижение андрогенов и нарушение репродуктивных функций, уровень гонадотропинов обычно близок к норме или повышен [80]. Отсутствие положительной корреляции между уровнем гонадотропинов и уровнем андрогенов является типичным для различным форм гипогонадизма, который с высокой частотой диагностируется у мужчин с СД1 и СД2 [82-84]. Причинами снижения функций АЦСС могут быть как изменения функций Gs-белков, которые опосредуют сопряжение рецептора ЛГ с АЦ [148], так и изменение функциональной активности самого рецептора. В пользу снижения функции рецепторов гонадотропинов свидетельствует обнаружение дефектов в гликозилировании рецептора ЛГ при СД первопричиной этого является инсулиновая [95]. Предполагается, что недостаточность, поскольку 124 обработка диабетических животных инсулином полностью восстанавливает функции рецепторов. Однако не исключено, что определенную роль в развитии резистентности рецепторов гонадотропинов к гормонам могут играть и значительные колебания уровня глюкозы, характерные для различных форм СД и возникающие при его лечении дозами инсулина, существенно превышающими физиологические. В случае изучения неонатальной модели СД2 с различной продолжительностью было отмечено снижение чувствительности семенников к ХГЧ с повышением возраста экспериментальных животных. При этом уровень нарушений при СД2 был намного более выражен. Сходная картина наблюдается и у пациентов с длительно текущим СД, у которых повышение уровня гонадотропинов сопровождается снижением уровня стероидных гормонов, что ведет к развитию первичного гипогонадизма [86]. Это связано с тем, что у мужчин с возрастом уровень гонадотропинов повышается, что по принципу отрицательной обратной связи вызывает ослабление чувствительности к ним тестикулярной ткани и ведет к снижению содержания общего, свободного и связанного тестостерона и нарушению репродуктивных функций [85]. Необходимо подчеркнуть, что в семенниках крыс с пролонгированным СД1 продолжительностью 210 суток и с длительно текущим неонатальным СД2 подавлены ингибирующие АЦ эффекты пептидного гормона соматостатина. Это может быть связано со значительным снижением экспрессии и функциональной активности соматостатиновых рецепторов и сопряженных с ними Gi-белков. Данные по экспрессии соматостатиновых рецепторов в репродуктивных тканях в условиях СД1 и СД2 отсутствуют. В отношении Gi-белков имеется информация о том, что в мембранах, выделенных из предстательной железы крыс со стрептозотоциновым СД1, снижена экспрессия Gsα-, Gi1α-, Gi2α-, Gi3α- и Goα-субъединиц, что указывает на ослабление как цАМФ-зависимых, так и ряда других внутриклеточных сигнальных каскадов [188]. Наряду с этим снижена стимулированная форсколином и изопротеренолом активность АЦ, а также плотность β-адренергических рецепторов, мишеней изопротеренола. 125 Следовательно, при СД1 в предстательной железе нарушены все три основных звена АЦСС – рецептор, G-белок и фермент АЦ. Имеются данные о том, что в семенных пузырьках диабетических крыс ослаблены функции Gs- и Gi-белков, а также стимулирующий АЦ эффект вазоактивного кишечного пептида, который функционально и структурно близок PACAP-38 [148]. Таким образом, полученные нами и другими авторами данные указывают на то, что патологические изменения, возникающие при различных моделях СД1 и СД2, оказывают значительное репродуктивных органах влияние и тканях, на что функционирование необходимо АЦСС учитывать в при прогнозировании, мониторинге и лечении заболеваний репродуктивной системы при СД. Нами впервые показано, что длительная, 15-недельная терапия крыс с пролонгированным «мягким» СД1 с помощью ИИ (в суточной дозе 0.5 ЕД на крысу) приводит к восстановлению чувствительности АЦСС семенников к ХГЧ. Повышение чувствительности АЦCC семенников к гонадотропинам при лечении диабетических животных ИИ, указывает на то, что нарушения в периферических компонентах ГГГ оси, являются результатом нарушения центральных механизмов регуляции, которые находятся под контролем инсулиновой сигнальной системы, функции которой нарушаются в условиях характерного для СД1 инсулинового дефицита. На тесную взаимосвязь между инсулиновой сигнальной системой мозга и функциональным состоянием репродуктивной системы указывают данные о влиянии экспрессии и активности рецепторов инсулина в мозге на секрецию гонадотропинов гипофизом и чувствительность к ним генеративных тканей [78]. У трансгенных мышей, лишенных функционально активного инсулинового рецептора в ЦНС, заметно снижен уровень ЛГ и число клеток Лейдига, являющихся мишенями его действия. Следует также отметить, что подкожное введение инсулина (инъекционная форма) приводит к значительному восстановлению уровня гонадотропинов у диабетических животных и их репродуктивных функций [189]. 126 ВЫВОДЫ 1. Установлено, что у крыс с разработанной нами пролонгированной, 7-ми месячной, моделью мягкого сахарного диабета 1-го типа (СД1), для которой характерны относительный инсулиновый дефицит и умеренная гипергликемия, снижен уровень тиреоидных гормонов, повышен уровень тиреотропного гормона (ТТГ), ослаблен функциональный ответ тиреоидной системы на обработку тиролиберином, что свидетельствует о развитии у них гипотиреоидного состояния, сходного с таковым у человека. Это отличает пролонгированную модель мягкого СД1 от изученной нами, широко используемой, краткосрочной модели острого СД1, при которой в значительной степени снижаются уровни как тиреоидных гормонов, так и ТТГ. 2. Обнаружено, что в тканях щитовидной железы крыс с острым и мягким СД1 меняется функциональная активность аденилатциклазной сигнальной системы (АЦСС) и снижается ее чувствительность к ТТГ, основному регулятору синтеза и секреции тиреоидных гормонов, что является одной из ключевых причин развития гипотиреоидного состояния в условиях диабетической патологии. 3. Показано, что длительная обработка крыс с экспериментальным СД1 с помощью интраназально вводимого инсулина (ИИ) в дозах 0.5–0.6 МЕ/крысу приводит к восстановлению функционального ответа у них уровня тиреоидных гиполатамо-гипофизарно-тиреоидной гормонов, оси на тиролиберин, а также активности гормоночувствительной АЦСС в тканях щитовидной железы. Длительная обработка ИИ (135 суток) крыс с мягким СД1, а также здоровых животных приводила к значительному повышению у них уровня ТТГ, что свидетельствует о стимуляции продукции ТТГ при повышении концентрации инсулина в мозге и должно учитываться при практическом применении ИИ. 4. Установлено, что у самцов крыс с экспериментальными моделями СД1 и СД2 снижается уровень тестостерона, нарушается его суточный ритм, 127 ослабляется функциональный ответ гипоталамо-гипофизарно-гонадной оси на обработку люлиберином. 5. Показано, что в семенниках диабетических животных снижена функциональная активность АЦСС и ее чувствительность к действию гормональных и негормональных регуляторов, в том числе гонадотропина, основного регулятора продукции тестостерона, что является одной из основных причин развития андрогенной недостаточности при СД. При этом длительная, 135-ти суточная, обработка крыс с мягким СД1 с помощью ИИ (0.5 МЕ инсулина/крысу) чувствительности гонадотропина. приводила АЦСС к частичному семенников к восстановлению стимулирующему у них влиянию 128 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Hemmings, S. J. Neonatal STZ model of type II diabetes mellitus in the Fischer 344 rat: characteristics and assessment of the status of the hepatic adrenergic receptors / S. J. Hemmings, D. Spafford // International Journal of Biochemistry & Cell Biology. – 2000. – Vol. 32, Issue 8. – P. 905-919. 2. Intranasal insulin affects adenylyl cyclase system in rat tissues in neonatal diabetes / A. O. Shpakov [et al.] // Central European Journal of Biology – 2012. – Vol. 7. – P. 33-47. 3. Intranasal treatment of central nervous system dysfunction in humans / C. D. Chapman [et al.] // Pharmaceutical Research. – 2013. – Vol. 30, Issue 10. – P. 2475-2484. 4. Sowers, J. R. Diabetes, hypertension, and cardiovascular disease: an update / J. R. Sowers, M. Epstein, E. D. Frohlich // Hypertension. – 2001. –Vol. 37 – P. 1053-1059. 5. Badal, S. S. New insights into molecular mechanisms of diabetic kidney disease / S. S. Badal, F. R. Danesh // American journal of kidney diseases : the official journal of the National Kidney Foundation. – 2014. – Vol. 63, Issue 2, Suppl. 2. – P. S63-S83. 6. Диабетическая нейропатия. Эпидемиологические и клинические аспекты / Г. Р. Галстян [и др.] // Сахарный диабет. – 2000. – № 1. – С. 19-21. 7. Роживанов, Р. В. Состояние мужской репродуктивной функции при сахарном диабете / Р. В. Роживанов, Н. С. Парфенова, Д. Г. Курбатов // Сахарный диабет. – 2009. – № 4. – С. 21-22. 8. Hage, M. Thyroid disorders and diabetes mellitus [Электронный ресурс] / M. Hage, M. S. Zantout, S. T. Azar // Journal of Thyroid Research. – 2011. – Vol. 2011. Режим доступа: http://www.hindawi.com/journals/jtr/2011/439463, свободный. – Загл. с экрана. 129 9. Bouret, S. G. Organizational actions of metabolic hormones / S. G. Bouret // Frontiers in Neuroendocrinology. – 2013. – Vol. 34, Issue 1. – P. 18-26. 10.Балаболкин, М. И. Эндокринология / М. И. Балаболкин. – М.: Универсум наблишинг, 1998. – 416 c. 11.Nussey, S. Endocrinology: An Integrated Approach / S. Nussey, S. Whitehead – Oxford: BIOS Scientific Publishers, 2001. – 358 p. 12.Шпаков, А. О. Структурно-функциональная организация рецепторов полипептидных гормонов, содержащих LRR-повторы, и их взаимодействие с гетеротримерными G-белками / А. О. Шпаков // Цитология. – 2009. – Т. 51, № 8. – С. 637–649. 13.Ткачук, В. А. Молекулярные механизмы сопряжения G-белков с мембранными рецепторами и системами вторичных посредников / В. А. Ткачук, А. Э. Авакян // Российский физиологический журнал им. И.М. Сеченова. – 2003. – Т. 89, № 12. – С.1478-1490. 14.Vassart, G. The thyrotropin receptor and the regulation of thyrocyte function and growth / G. Vassart, J. E. Dumont // Endocrine Reviews. – 1992. – Vol. 13, Issue 3. – P. 596-611. 15.A familial thyrotropin (TSH) receptor mutation provides in vivo evidence that the inositol phosphates/Ca2+ cascade mediates TSH action on thyroid hormone synthesis / H. Grasberger [et al.] // The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. – 2007. – Vol. 92, Issue 7. – P.2816-2820. 16.Thyrocyte-specific Gq/G11 deficiency impairs thyroid function and prevents goiter development / J. Kero [et al.] // The Journal for Clinical Investigation. – 2007. – Vol. 117, Issue 9. – P. 2399-2407. 17.Brent, G. A. Mechanisms of thyroid hormone action / G. A. Brent // The Journal of clinical investigation. – 2012. – Vol. 122, Issue 9. – P.3035-3043. 130 18.Prevalence of subclinical thyroid failure in insulin-dependent diabetes / R. S. Gray [et al.] // The Journal of clinical endocrinology and metabolism. – 1980. – Vol. 50, Issue 6. – P. 1034-1037. 19.Kadiyala, R. Thyroid dysfunction in patients with diabetes: clinical implications and screening strategies / R. Kadiyala, R. Peter, O. E. Okosieme // International Journal of Clinical Practice. – 2010. – Vol. 64, Issue 8. – P. 1130-1139. 20.Шпаков, А. О. Заболевания щитовидной железы у больных сахарным диабетом / А. О. Шпаков, П. А. Карпова, М. Ф. Баллюзек // Бюллетень ФЦСКЭ им. В.А. Алмазова. – 2013. – № 6. – С. 34-41. 21.Díez, J. J. An analysis of the relative risk for hypothyroidism in patients with Type 2 diabetes / J. J. Díez, P. Iglesias // Diabetic medicine : a journal of the British Diabetic Association. – 2012. – Vol. 29, Issue 12. – P. 1510-1514. 22. Duntas, L. H. The Interface between thyroid and diabetes mellitus / L. H. Duntas, J. Orgiazzi, G. Brabant // Clinical endocrinology. – 2011. – Vol. 75, Issue 1. – P. 1-9. 23.Potenza, M. Excess thyroid hormone and carbohydrate metabolism / M. Potenza, M. A.Via, R. T. Yanagisawa // Endocrine Practice. – 2009. – Vol. 15, № 3. – P. 254-262. 24.Bhattacharyya, A. Diabetic ketoacidosis precipitated by thyrotoxicosis / A. Bhattacharyya, P. G. Wiles // Postgraduate medical journal. – 1999. – Vol. 75, Issue 883. – P. 291-292. 25.Subclinical hyperthyroidism and the risk of coronary heart disease and mortality / T. H. Collet [et al.] // Archives of internal medicine. – 2012. – Vol. 172, № 10. – P. 799-809. 131 26.Wang C. The Relationship between Type 2 Diabetes Mellitus and Related Thyroid Diseases [Электронный ресурс] / C. Wang // J Diabetes Res. – 2013. – Vol. 2013. Режим доступа: http://www.hindawi.com/journals/jdr/2013/390534, свободный. – Загл. с экрана. 27.Brenta, G. Diabetes and thyroid disorders /G. Brenta // British Journal of Diabetes and Vascular Disease. – 2010. – Vol. 10, № 4. – P. 195-208. 28.Long-term observations of glucose tolerance in thyrotoxic patients / H. R. Maxon [et al.] // Archives of internal medicine. – 1975. – Vol. 135, № 11. – P. 1477-1480. 29.Lack of control by glucose of ultradian insulin secretory oscillations in impaired glucose tolerance and in non-insulin-dependent diabetes mellitus / N. M. O'Meara [et al.] // The Journal of clinical investigation. – 1993. – Vol. 92, Issue 1. – P. 262-271. 30.Effect of thyroid hormone excess on action, secretion, and metabolism of insulin in humans / G. Dimitriadis [et al.] // The American journal of physiology. – 1985. – Vol. 248, № 5. – P. 593-601. 31.Beta-cell function and glucose and lipid oxidation in Graves' disease / K. Bech [et al.] // Clinical endocrinology. – 1996. – Vol. 44, № 1. – P. 59-66. 32.The effect of thyroid disease on proinsulin and C-peptide levels / S. F. Beer [et al.] // Clinical endocrinology. – 1989. – Vol. 30, № 4. – P. 379-383. 33.Levin, R. J. The effect of the thyroid gland on intestinal absorption of hexoses / R. J. Levin, D. H. Smyth // The Journal of physiology. – 1963. – Vol. 169. – P. 755-769. 34.Matty, A. J. Effect of thyroxine on the isolated rat intestine / A. J. Matty, B. Seshadri // Gut. – 1965. – Vol. 6. – P. 200-202. 132 35.Kemp, H. F. Glucose transport correlates with GLUT2 abundance in rat liver during altered thyroid status / H. F. Kemp, H. S. Hundal, P. M. Taylor // Molecular and cellular endocrinology – 1997. – Vol. 128, Issues 1-2. – P. 97102. 36.Glucose transporter 2 concentrations in hyper- and hypothyroid rat livers / T. Mokuno [et al.] // The Journal of endocrinology – 1999. – Vol. 160. – P. 285289. 37.Vaughan, M. An in vitro effect of triiodothyronine on rat adipose tissue / M. Vaughan // The Journal of clinical investigation. – 1967. – Vol. 46, Issue 9. – P. 1482-1491. 38.Thyroid hormone modulation of the hypothalamic growth hormone (GH)releasing factor-pituitary GH axis in the rat / N. Miki [et al.] // The Journal of clinical investigation. – 1992. – Vol. 90, Issue 1. – P. 113-120. 39.Early changes in plasma glucagon and growth hormone response to oral glucose in experimental hyperthyroidism / F. Tosi [et al.] // Metabolism. – 1996. – Vol. 45. – P. 1029-1033. 40.Sestoft, L. Responses of glucose and glucoregulatory hormones to exercise in thyrotoxic and myxoedematous patients before and after 3 months of treatment / L. Sestoft, N. J. Christensen, B. Saltin // Clinical science (London, England : 1979). – 1991. – Vol. 81. – P. 91-99. 41.Okajima, F. Metabolism of glucose in hyper- and hypo-thyroid rats in vivo. Minor role of endogenous insulin inthyroid-dependent changes in glucose turnover / F. Okajima, M. Ui // The Biochemical journal. – 1979. – Vol. 182. – P. 577-584. 42.Clinical presentation of thyroid dysfunction and Addison's disease in young adults with Type 1 diabetes / K.S. Leong [et al.] // Postgraduate medical journal – 1999. – Vol. 75, Issue 886. – P. 467-70. 133 43.Insulin action in adipose tissue and muscle in hypothyroidism / G. Dimitriadis [et al.] // The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. – 2006. – Vol. 91, Issue 12. – P. 4930-4937. 44.Hypothyroidism in rats decreases peripheral glucose utilisation, a defect partially corrected by central leptin infusion / P. Cettour-Rose [et al.] // Diabetologia. – 2005. – Vol. 48, Issue 4. – P. 624-633. 45.Studies of insulin resistance in patients with clinical and subclinical hypothyroidism / E. Maratou [et al.] // European journal of endocrinology / European Federation of Endocrine Societies. – 2009. – Vol. 160. – P 785-790. 46.Response of glucose disposal to hyperinsulinaemia in human hypothyroidism and hyperthyroidism / C. Rochon [et al.] // Clinical science (London, England : 1979). – 2003. – Vol. 104. – P 7-15. 47.The effects of insulin on transport and metabolism of glucose in skeletal muscle from hyperthyroid and hypothyroid rats / G. Dimitriadis [et al.] // European journal of clinical investigation. – 1997. – Vol. 27. – P 475-483. 48.Singer, A. J. Simple renal cysts causing loss of kidney function and hypertension / A. J. Singer, S. K. Lee // Urology. – 2001. – Vol. 57, Issue 2. – P. 363-364. 49.Correlation between severity of thyroid dysfunction and renal function / J.G. den Hollander [et al.] // Clinical endocrinology. – 2005. – Vol. 62, Issue 4. – P. 423-427. 50.Association between subclinical hypothyroidism and proliferative diabetic retinopathy in type 2 diabetic patients: a case-control study / G. R. Yang [et al.] // The Tohoku journal of experimental medicine. – 2010. – Vol. 222, № 4. – P. 303-310. 51.Jolin, T. Thyroid iodine metabolism in streptozotocin diabetic rats / T. Jolin, C. Gonzales, M. Gonzales // Acta endocrinologica. – 1978. – Vol. 88. – P 506-515. 134 52.Chopra, I. J. Alterations in hepatic monodeiodination of iodothyronines in the diabetic rats / I. J. Chopra, W. Wiersinga, H. Frank // Life Sciences. – 1981. – V. 28. – P. 1765-1776. 53.Mitsuma, T. Effects of streptozotocin-induced diabetes mellitus on hypothalamic-pituitary thyroid axis in rats / T. Mitsuma, T. Nogimori // Endocrinologia japonica. – 1982. – Vol. 29, № 6. – P. 695-700. 54.Gonzales, C. Effect of streptozotocin diabetes on the hypothalamic-pituitarythyroid axis in the rat / C. Gonzales, E. Montoya, T. Jolin // Endocrinology. – 1980. – Vol. 107, Issue 6. – P. 2099-2103. 55.Thyroid and pituitary secretory disorders in streptozotocin-induced rats are associated with severe structural changes of these glands / G. E. Bestetti [et al.] // Virchows Archiv. B, Cell pathology including molecular pathology. – 1987. – Vol. 53. – P. 69-78. 56.Alterations in hypothalamic pituitary-thyroid regulation produced by diabetes mellitus / J. F. Wilber [et al.] // Life sciences. – 1981. – Vol. 28. – P. 17571763. 57.Functional and morphological aspects of impaired TRH release by medial basal hypothalamus of STZ-induced diabetic rats / G. E. Bestetti [et al.] // Diabetes. – 1989. – Vol. 38, № 11. – P. 1351-1356. 58.Hypothalamo-hypophysial-thyroid axis in streptozotocin-induced diabetes / J. M. M. Rondeel [et al.] // Endocrinology. – 1992. – Vol. 130, Issue 1. – P. 216220. 59.Bestetti, G. E. Hypothalamic lesions in rats with long-term streptozotocininduced diabetes mellitus / G. E. Bestetti, G. L. Rossi // Acta neuropathologica. – 1980. – Vol. 52. – P. 119-127. 135 60.Hefco, E. Effect of hypothalamic deafferentation on the secretion of thyrotropin during thyroid blockade and exposure to cold in the rat / E. Hefco, L. Krulich, J. E. Aschenbrenner // Endocrinology. – 1975. – Vol. 97, Issue 5. – P 1185-1195. 61.Neurotransmitter control of hypothalamic-pituitary-thyroid function in rats / J. E. Morley [et al.] // European journal of pharmacology. – 1981. – Vol. 70. – P. 263-271. 62.Reverse hemolytic plaque assay study of luteinizing and follicle-stimulating hormone and thyrotropin secretion in diabetic rat pituitary glands / G. L. Rossi [et al.] // Diabetes. – 1989. – Vol. 38. – P. 1301-1306. 63.Chamras, H. Effect of diabetes mellitus on thyrotropin release from isolated rat thyrotrophs / H. Chamras, J. M. Hershman // The American journal of the medical sciences. – 1990. – Vol. 300. – P. 16-21. 64.Ortiz-Caro, J. Diurnal variations of plasma growth hormone, thyrotropin, thyroxine, and triiodothyronine in streptoLotocin-diabetic and food-restricted rats / J. Ortiz-Caro, C. Gonzalez, T. Jolin // Endocrinology. – 1984. – Vol. 115, Issue 6. – P. 2227-2232. 65.Impaired 3,5,3'-triiodothyronine (T3) production in diabetic patients / C. S. Pittman [et al.] // Metabolism. – 1979. – Vol. 28, Issue 4. – P. 333-338. 66.Balsam, A. The influence of fasting, diabetes and several pharmacological agents on the pathways of thyroxine metabolism in rat liver / A. Balsam, S. H. Inbar, F. C. Sexton // The Journal of clinical investigation. – 1978. – Vol. 62, Issue 2. – P. 415-424. 67.Decreased thyroidal response to thyrotropin in diabetic mice / N. Bagchi [et al.] // Endocrinology. – 1981. – Vol. 109, Issue 5. – P. 1428-1432. 136 68.Steger, R. W. The effect of diabetes mellitus on endocrine and reproductive function / R. W. Steger, M. B. Rabe // Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. Society for Experimental Biology and Medicine (New York, N.Y.). – 1997. – Vol. 214. – P. 1-11. 69.Boado, R. Effects of diabetes, beta hydroxybutyric acid and metabolic on pituitary-thyroid axis in the rat / R. Boado, O. Colombo, A. A. Zavinovich // Journal of endocrinological investigation. – 1985. – Vol. 8. – P. 107-111. 70.Thyroid hormone effects on whole-body energy homeostasis and tissue-specific fatty acid uptake in vivo / L. P. Klieverik [et al.] // Endocrinology. – 2009. – Vol. 150, Issue 12. – P. 5639-5648. 71.Luo, L. G.Thyrotropin releasing hormone (TRH) may preserve pancreatic islet cell function: potential role in the treatment of diabetes mellitus / L. G. Luo, I. Jackson // Acta bio-medica : Atenei Parmensis. – 2007. – Vol. 78, Suppl. 1. – P. 216-221. 72.Gaunay, G. Reproductive sequelae of diabetes in male patients / G. Gaunay, H. M. Nagler, D. S. Stember // Endocrinology and metabolism clinics of North America. – 2013. – Vol. 42, Issue 4. – P. 899-914. 73.Dinulovic, D. Diabetes mellitus/male infertility / D. Dinulovic, G. Radonjic // Archives of andrology. – 1990. – Vol. 25. – P. 277-293. 74.Neurogenic ejaculatory disorders: focus on current and future treatments / R. S. Calabrò [et al.] // Recent patents on CNS drug discovery. – 2011. – Vol. 6, Issue 3. – P. 205-221. 75.Autocrine regulation of insulin secretion in human ejaculated spermatozoa / S. Aquila [et al.] // Endocrinology. – 2005. – Vol. 146, № 2. – P 552-557. 76.Insulin-dependent diabetes in men is associated with hypothalamo-pituitary derangement and with impairment in semen quality / B. Baccetti [et al.] // Human reproduction. – 2002. – Vol 17, Issue 10. – P. 2673-2677. 137 77.Poorly controlled type I diabetes mellitus in young men selectively suppresses luteinizing hormone secretory burst mass / J. C. López-Alvarenga [et al.] // The Journal of clinical endocrinology and metabolism. – 2002. – Vol. 87, Issue 12. – P. 5507-5515. 78.Role of brain insulin receptor in control of body weight and reproduction // J. C. Bruning [et al.] // Science. – 2000. – Vol. 289, № 5487. – P. 2122–2125. 79.Low testosterone and high C-reactive protein concentrations predict low hematocrit in type 2 diabetes / V. Bhatia [et al.] // Diabetes Care. – 2006. – Vol. 29, № 10. – P. 2289–2294. 80.Testosterone concentration in young patients with diabetes / A. Chandel [et al.] // Diabetes Care. – 2008. – Vol. 31, № 10. – P. 2013–2017. 81.Steroids in adult men with type 1 diabetes / E. W. Van Dam [et al.] // Diabetes Care. – 2003. – Vol. 26, № 6. – P. 1812–1818. 82.Erectile dysfunction and lower androgenicity in type 1 diabetic patients / O. Alexopoulou [et al.] // Diabetes & metabolism. – 2001. – Vol. 27, № 3. – P. 329–336. 83.Hypogonadotrophic hypogonadism in type 2 diabetes, obesity and the metabolic syndrome / P. Dandona [et al.] // Current molecular medicine. – 2008. – Vol. 8, Issue 8. – P. 816–828. 84.Clinical and biochemical assessment of hypogonadism in men with type 2 diabetes: correlations with bioavailable testosterone and visceral adiposity / D. Kapoor [et al.] // Diabetes Care. – 2007. – Vol. 30, № 4. – P. 911–917. 85.Age trends in the level of serum testosterone and other hormones in middleaged men: longitudinal results from the Massachusetts Male Aging Study / H. A. Feldman [et al.] // The Journal of clinical endocrinology and metabolism.. – 2002. – Vol. 87, Issue 2. – P. 589–598. 138 86.Betancourt-Albrecht, M. Hypogonadism and diabetes / M. Betancourt-Albrecht, G. R. Cunningham // International journal of impotence research. – 2003. – Vol. 15, Suppl. 4. – P. S14–S20. 87.Ding, E. L. Sex differences of endogenous sex hormones and risk of type 2 diabetes: a systematic review and meta-analysis / E. L. Ding, Y. Song, V. S. Malik, S. Liu // JAMA. – 2006. – Vol. 295, № 11. – P. 1288–1299. 88.Sex hormone-binding globulin and insulin-like growth factor-binding protein-1 as indicators of metabolic syndrome, cardiovascular risk, and mortality in elderly men / T. Kalme [et al.] // The Journal of clinical endocrinology and metabolism. – 2005. – Vol. 90, Issue 3. – P. 1550–1556. 89.Relationship between testosterone levels, insulin sensitivity, and mitochondrial function in men / N. Pitteloud [et al.] // Diabetes Care. – 2005. – Vol. 28, № 7. – P. 1636–1642. 90.Inhibition of sex hormone-binding globulin production in the human hepatoma (Hep G2) cell line by insulin and prolactin / S. R. Plymate [et al.] // The Journal of clinical endocrinology and metabolism. – 1988. – Vol. 67, Issue 3. – P. 460– 464. 91.Streptozotocin-induced deficits in sex behavior and neuroendocrine function in male rats / R. W. Steger [et al.] // Endocrinology. – 1989. – Vol 124, Issue 4. – P 1737-1743. 92.Hypothalamic-hypophyseal-gonadal axis in the streptozotocin-induced diabetic male rat / J. C. Calvo [et al.] // Journal of steroid biochemistry. – 1984. – Vol. 20, Issue 3. – P. 769-772. 93.Influence of diabetes on the gonadotropin response to the negative feedback effect of testosterone and hypothalamic neurotransmitter turnover in adult male rats / V. Chandrashekar [et al.] // Neuroendocrinology. – 1991. – Vol. 54, № 1. – P. 30-35. 139 94.Шпаков, А. О. Функциональное состояние гипоталамо-гипофизарногонадной системы при сахарном диабете / А. О. Шпаков // Проблемы эндокринологии. – 2010. – Т. 56, № 5. – С. 23-29. 95.Steger, R. W. Testosterone replacement fails to reverse the adverse effects of streptozotocin-induced diabetes on sexual behavior in the male rat / R.W. Steger // Pharmacology, biochemistry, and behavior. – 1990. – Vol. 35, Issue 3. – P. 577-582. 96.Hails, R. Diabetes disrupts copulatory behavior and neuroendocrine responses of male rats to female conspecifics / R. Hails, C. Fadden, R. W. Steger // Pharmacology, biochemistry, and behavior. – 1993. – Vol. 44, Issue 4. – P. 837-842. 97.Johnson, L. M. A reproductive endocrine profile in the diabetes (db) mutant mouse / L. M. Johnson, R. L. Sidman // Biology of reproduction. – 1979. – Vol. 20, № 3. – P. 552-559. 98.King, T. S. Reduced aminergic synthesis in the hypothalamus of the infertile, genetically diabetic (C57BL/KsJ-db/db) male mouse / T. S. King, D. H. Rohrbach // Experimental brain research. – 1990. – Vol. 81, № 3. – P. 619-625. 99.Hormonal regulation of testicular human chorionic gonadotropin binding and steroidogenesis in adult mice with different forms of hereditary diabetes and obesity / A. G. Amador [et al.] // Hormone research.. – 1986. – Vol. 23, № 4. – P. 215. 100. Edmonds, E. S. Reproductive system of the obese male Zucker rat. Reproductive capacity, artificial insemination and plasma testosterone levels / E. S. Edmonds, S. K. Dallie, B. Withyachumnarnkul // Biology of reproduction. – 1982. – Vol. 27, № 4. – P. 891-897. 140 101. The characterization of high-fat diet and multiple low-dose streptozotocin induced type 2 diabetes rat model [Электронный ресурс] / M. Zhang [et al.] // Exp. Diabetes Res. – 2008. – Vol. 2008. – Режим доступа: http://www.hindawi.com/journals/jdr/2008/704045, свободный. – Загл. с экрана. 102. Pulsatile LH secretion in streptozotocin-induced diabetes in the rat / Q. Dong [et al.] // The Journal of endocrinology. – 1991. – Vol. 131, № 1. – P. 49– 55. 103. Hypoglycemia, but not insulin, acutely decreases LH and T secretion in men / K. M. Oltmanns [ et al.] // The Journal of clinical endocrinology and metabolism. – 2001. – Vol. 86, Issue 10. – P. 4913–4919. 104. Bain, P. A. The effect of luteinizing hormone releasing hormone on the copulatory behavior of hyperprolactinemic male rats / P. A. Bain, P. Shrenker, A. Bartke // Hormones and behavior. – 1987. – Vol. 21, Issue 4. – P. 430-439. 105. Шпаков, А. О. Пептидергические сигнальные системы мозга при сахарном диабете / А. О. Шпаков, К. В. Деркач // Цитология. – 2012. – Т. 54, № 10. – С. 733-741. 106. Kolta, M. G. Role of S-hydroxytryptamine in the regulation of brain peptides in normal and diabetic rats / M. G. Kolta, K. F. Soliman, B. B. Williams // Hormone research. – 1986. – Vol. 23, № 2. – P. 112-121. 107. Sahu, A. An opioid-neuropeptide-Y transmission line to luteinizing hormone (LH)-releasing hormone neurons: a role in the induction of LH surge / A. Sahu, W. R. Crowley, S. P. Kalra // Endocrinology. – 1990. – Vol. 126, Issue 2. – P. 876-883. 141 108. Bradshaw, W. G. Dissociation of the effects of gonadal steroids on brain serotonin metabolism and sexual behavior in the male rat / W. G. Bradshaw, M. S. lrskine, M. J. Baum // Neuroendocrinology. – 1982. – Vol. 34, № 1. – P. 3845. 109. Komaki, K. Gonadal hormones and gonadal function in type 2 diabetes model OLETF (Otsuka Long Evans Tokushima Fatty) rats / K. Komaki, Y. Ohno, N. Aoki // Endocrine journal. – 2005. – Vol. 52, № 3. – P. 345-51. 110. Male hypogonadism induced by high fat diet and low dose streptozotocin is mediated by activated endoplasmic reticulum stress and IκBβ and attenuated by argirein and valsartan / G. L. Liu [et al.] // European journal of pharmacology. – 2013. – Vol. 713, Issues 1-3. – P. 78-88. 111. Dhuria, S. V. Intranasal delivery to the central nervous system: mechanisms and experimental considerations / S. V. Dhuria, L. R. Hanson, W. H. 2nd Frey // Journal of pharmaceutical sciences. – 2010. – Vol. 99, Issue 4. – P. 1654-1673. 112. Lochhead, J. J. Intranasal delivery of biologics to the central nervous system / J. J. Lochhead, R. G. Thorne // Advanced drug delivery reviews. – 2012. – Vol. 64, Issue 7. – P. 614-628. 113. Intranasal insulin improves memory in humans / C. Benedict [et al.] // Psychoneuroendocrinology. – 2004. – Vol. 29, Issue 10. – P. 1326-1334. 114. Effects of intranasal insulin on cognition in memory-impaired older adults: modulation by APOE genotype / M. A. Reger [et al.] // Neurobiology of aging. – 2006. – Vol. 27, Issue 3. – P. 451-458. 115. Шпаков, А. О. Сигнальные системы мозга, регулируемые инсулином, ИФР-1 и лептином, в условиях предиабета и сахарного диабета 2-го типа / А. О. Шпаков // Цитология. – 2014. – Т. 56, № 11. – C. 789-799. 142 116. Non-insulin-dependent diabetes in obesity (type IIB): study of insulin secretion, insulin receptors and response to low-calorie diet / J. Havrankova [et al.] // L'unión médicale du Canada. – 1987. Vol. 116, № 6. – P. 337-341. 117. Идентификация нарушений в гормоночувствительной АЦ-системе в тканях крыс с диабетом 1-го и 2-го типов с использованием функциональных зондов и синтетических наноразмерных пептидов / А. О. Шпаков [и др.] // Технологии живых систем. – 2007. – Т. 4, № 5-6. – С. 96108. 118. Hashim, S. G protein-linked cell signaling and cardiovascular functions in diabetes/hyperglycemia / S. Hashim, Y. Li, M. B. Anand-Srivastava // Cell biochemistry and biophysics. – 2006. – Vol. 44, № 1. – P. 51-64. 119. Перцева, М. Н. Новый концептуальный подход для поиска молекулярных причин сахарного диабета, основанный на изучении функционирования гормональных сигнальных систем / М. Н. Перцева, Л. А. Кузнецова, А. О. Шпаков // Журнал эволюционной биохимии и физиологии. – 2013. – T. 49, № 5. – С. 313-322. 120. Zalewska, M. G protein-coupled receptors: abnormalities in signal transmission, disease states and pharmacotherapy / M. Zalewska, M. Siara, W. Sajewicz // Acta poloniae pharmaceutica. – 2014. – Vol. 71, № 2. – P. 229-43. 121. Шпаков, А. О. Структурно-функциональная характеристика β- и γ- субъединиц G-белков и молекулярные механизмы их сопряжения с другими компонентами систем сигнальной трансдукции/ A. O. Шпаков, М. Н. Перцева // Журнал эволюционной биохимии и физиологии. – 1997. – № 6. – С. 669-688. 122. Sunahara, R. K. Isoforms of mammalian adenylyl cyclase: multiplicities of signaling /R. K. Sunahara, R. Taussig // Molecular interventions. – 2002. – Vol. 2, Issue 3. – P. 168-184. 143 123. G-protein signaling: back to the future / C. R. McCudden [et al.] // Cellular and molecular life sciences : CMLS. –2005. – Vol. 62, Issue 5. – P. 551-577. 124. Billington, C. K. Novel cAMP signalling paradigms: therapeutic implications for airway disease / C. K. Billington, I. P. Hall // British journal of pharmacology. – 2012. – Vol. 166, Issue 2. – P. 401-410. 125. Davey, J. G-protein-coupled receptors: new approaches to maximise the impact of GPCRS in drug discovery / J. Davey // Expert opinion on therapeutic targets. – 2004. – Vol. 8, № 2. – P. 165-170. 126. Chidiac, P. Rethinking receptor-G protein-effector interactions / P. Chidiac // Biochemical pharmacology. – 1998. – Vol. 55, Issue 5. – P. 549-556. 127. Hamm, H. E. The many faces of G protein signaling / H. E. Hamm // The Journal of biological chemistry. – 1998. – Vol. 273, № 2. – P. 669-672. 128. Крутецкая, З. И. Структурно-функциональная организация сигнальных систем в клетках / З. И. Крутецкая, О. Е. Лебедев // Цитология . – 2000. – Т. 42, № 9. – С. 844-874. 129. Wettschureck, N. Mammalian G proteins and their cell type specific functions / N. Wettschureck, S. Offermanns // Physiological reviews. – 2005. – Vol. 85, № 4. – P. 1159-1204. 130. Sequence of interactions in receptor-G protein coupling / R. Herrmann [et al.] // The Journal of biological chemistry. – 2004. – Vol. 279, № 23. – P. 24283-24290. 131. Delivery of insulin-like growth factor-I to the rat brain and spinal cord along olfactory and trigeminal pathways following intranasal administration / R. G. Thorne [et al.] // Neuroscience. – 2004. – Vol. 127, Issue 2. – P. 481-496. 144 132. Blondel, O. Relation of insulin deficiency to impaired insulin action in NIDDM adult rats given streptozocin as neonates / O. Blondel, D. Bailbé, B. Portha // Diabetes. – 1989. – Vol. 38, № 5. – P. 610-617. 133. Shpakov, A. O. The sensitivity of the adenylyl cyclase system in rat thyroidal and extrathyroidal tissues to peptides corresponding to the third intracellular loop of thyroid-stimulating hormone receptor / A. O. Shpakov, E. A. Shpakova, K. V. Derkach // Current Topics in Peptide & Protein Research. – 2012. – Vol. 13. – P. 61–73. 134. Биологическая соответствующих активность третьей in и vitro цитоплазматической in vivo петле пептидов, рецептора тиреотропина / Е. А. Шпакова [и др.] // Доклады Академии наук. – 2012. – Т. 443, № 1. – С. 123–126. 135. The influence of peptides corresponding to the third intracellular loop of luteinizing hormone receptor on basal and hormone-stimulated activity of the adenylyl cyclase signaling system / A. O. Shpakov [et al.] // Global Journal of Biochemistry. – 2011. – Vol. 2, Issue 1. – P. 59–73. 136. Protein measurement with Folin phenol reagent / O. H. Lowry [et al.] // The Journal of biological chemistry. – 1951. – Vol. 193. – P. 265-275. 137. The peptides mimicking the third intracellular loop of 5- hydroxytryptamine receptors of the types 1B and 6 selectively activate G proteins and receptor-specifically inhibit serotonin signaling via the adenylyl cyclase system / A. O Shpakov [et al.] // International Journal of Peptide Research and Therapeutics. – 2010. – Vol. 16, № 2. – P. 95–105. 138. Panchenko, M. P. Purification and some properties of GTP-binding proteins from pig heart plasma membranes / M. P. Panchenko, S. I. Hoffenberg, V. A. Tkachuk VA.// Biomedica biochimica acta. – 1987. – Vol. 46, № 8-9. – P. 452-455. 145 139. McIntire, W. E. The G protein beta subunit is a determinant in the coupling of Gs to the beta 1-adrenergic and A2a adenosine receptors / W. E. McIntire, G. MacCleery, J. C. Garrison // The Journal of biological chemistry. – 2001. – Vol. 276, № 19. – P. 15801-15809. 140. Гланц, С. Медико-биологическая статистика / С. Гланц. – М.: Практика, 1998. – 459 с. 141. Romanovsky, D. Pressure-induced pain: early sign of diabetes-associated impairment of insulin production in rats / D. Romanovsky, M. Dobretsov //. Neuroscience letters. – 2010. – Vol. 483, Issue 2. – P. 110-113. 142. Kleinau, G. Constitutive activities in the thyrotropin receptor: regulation and significance / G. Kleinau, H. Biebermann // Advances in pharmacology. – 2014. – Vol. 70. – P. 81-119. 143. Fahrenkrug, J. Localisation of the neuropeptide PACAP and its receptors in the rat parathyroid and thyroid glands / J. Fahrenkrug, J. Hannibal // General and comparative endocrinology. – 2011. – Vol. 171, Issue 1. – P. 105-113. 144. Stimulatory action of pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide (PACAP) on thyroid gland / W. Chen [et al.] // Biochemical and biophysical research communications. – 1993. – Vol. 194, Issue 2. – P. 923-929. 145. Marshall, N. J. Studies on isoproterenol stimulation of adenyl cyclase in membrane preparations from the bovine thyroid / N. J. Marshall, S. von Borcke, P. G. Malan // Endocrinology. – 1975. – Vol. 96, Issue 6. – P. 1520-1524. 146. G-proteins and beta-adrenergic stimulation of adenylate cyclase activity in the diabetic rat prostate / M. J. Carmena [et al.] // The Prostate. – 1997. –Vol. 33, Issue 1. –P.46-54. 147. The effect of streptozotocin diabetes on the vasoactive intestinal peptide receptor/effector system in membranes from rat ventral prostate / M. J. Carmena [et al.] // Endocrinology. – 1992. – Vol. 131, Issue 4. – P. 1993-1998. 146 148. Analysis of vasoactive intestinal peptide receptors and the G protein regulation of adenylyl cyclase in seminal vesicle membranes from streptozotocin-diabetic rats / M. S. Rodriguez-Pena [et al.] // Cellular signalling. – 1994. – Vol. 6, Issue 2. – P. 147–156. 149. Schröder-van der Elst, J. P. Effects of streptozotocin-induced diabetes and food restriction on quantities and source of T4 and T3 in rat tissues / J. P. van Schröder-van der Elst, D. van der Heide // Diabetes. – 1992. – Vol. 41, № 2. – P. 147-152. 150. Autoradiographic thyroid evaluation in short-term experimental diabetes mellitus / C. C. Nascimento-Saba [et al.] // Brazilian journal of medical and biological research. – 1998. – Vol. 31, № 2. – P. 299-302. 151. Saravanan, G. Antidiabetic effect of S-allylcysteine: effect on thyroid hormone and circulatory antioxidant system in experimental diabetic rats / G. Saravanan., P. Ponmurugan // Journal of diabetes and its complications. – 2012. – Vol. 26, Issue 4. – P. 280-285. 152. Thyroid function in children with newly diagnosed type 1 diabetes mellitus / C. H. Lin [et al.] // Acta paediatrica Taiwanica. – 2003. – Vol. 44, № 3. – P. 145–149. 153. Bestetti, G. E. Secretory disorders in pituitary thyrotropes of streptozocin- diabetic male rats / G. E. Bestetti, P. Brändli, G. L. Rossi // Acta anatomica. – 1994. – Vol. 149, № 3. – P. 215-220. 154. Pastor, R. M. Peripheral metabolism and secretion rate of thyrotropin in streptozotocin-diabetic rats / R. M. Pastor, T. Jolin // Endocrinology. – 1983. – Vol. 112, Issue 4. – P. 1454-1459. 147 155. Pituitary neuromedin B content in experimental fasting and diabetes mellitus and correlation with thyrotropin secretion / T. M. Ortiga-Carvalho [et al.] // Metabolism: clinical and experimental. – 1997. – Vol. 46, Issue 2. – P. 149-153. 156. Influence of type II 5' deiodinase on TSH content in diabetic rats / C. Aláez [et al.] // Journal of physiology and biochemistry. – 2001. – Vol. 57, Issue 3. – P. 221-230. 157. Rodriguez, F. The role of somatostatin and/or dopamine in basal and TRH-stimulated TSH release in food-restricted rats / F. Rodriguez, T. Jolin // Acta endocrinologica. – 1991. – Vol. 125, Issue 2. – P. 186-191. 158. Moura, E. G. Insulin deficiency impairs thyroid peroxidase activity. A study in experimental diabetes mellitus / E. G. Moura, C. C. Pazos, D. Rosenthal // In: Frontiers in Endocrinology / ed. by G. Medeiros-Neto, E. Gaitan. – New York, 1986. – P. 627-630. 159. Liu, C. Morphological studies of the adrenal zona glomerulosa cells and the thyroid and pituitary glands in streptozocin-induced experimental diabetic rats / C. Liu, C. Shu // Zhonghua bing li xue za zhi Chinese journal of pathology. – 1996. – Vol. 25, № 6. – P. 358-360. 160. Thyroid hormone replacement and growth of children with subclinical hypothyroidism and diabetes / H. P.Chase [et al.] // Diabetic Medicine. – 1990. – Vol. 7, Issue 4. – P. 299–303. 161. Aranda, A. Receptors of thyroid hormones / A. Aranda, E. Alonso- Merino, A. Zambrano // Pediatric endocrinology reviews : PER. – 2013. – Vol. 11, № 1. – P. 2-13. 162. Tata, J. R. The road to nuclear receptors of thyroid hormone/ J. R. Tata // Biochimica et biophysica acta. – 2013. – Vol. 1830, Issue 7. – P. 3860-3866. 148 163. Effect of streptozotocin-induced diabetes mellitus on type 1 deiodinase (D1) in inherited D1-deficient mice / S. Tabata [et al.] // Endocrine journal. – 1999. – Vol. 46, № 4. – P. 497-504. 164. The PACAP-regulated gene selenoprotein T is highly induced in nervous, endocrine, and metabolic tissues during ontogenetic and regenerative processes / Y. Tanguy [et al.] // Endocrinology. – 2011. – Vol. 152, Issue 11. – P. 43224335. 165. Thyroid Function In Type 2 Diabetes Mellitus and in Diabetic Nephropathy / S. Rai [et al.] // Journal of clinical and diagnostic research : JCDR. – 2013. – Vol. 7, Issue 8. – P. 1583-1585. 166. Celani, M. F. Prevalence of abnormal thyrotropin concentrations measured by a sensitive assay in patients with type 2 diabetes mellitus / M. F. Celani, M. E. Bonati, N. Stucci // Diabetes research. – 1994. – Vol. 27, № 1. – P. 15-25. 167. Ortiz-Caro, J. Diurnal variations of plasma growth hormone, thyrotropin, thyroxine, and triiodothyronine in streptozotocin-diabetic and food-restricted rats / J. Ortiz-Caro, C. Gonzalez, T. Jolin // Endocrinology. – 1984. – Vol. 115, Issue 6. – P. 2227-2232. 168. Thyroid hormones mediated effect of insulin on alloxan diabetic rat atria / C. Karasu [et al.] // General pharmacology. – 1990. – Vol. 21, Issue 5. – P. 735740. 169. Katovich, M. J. Effect of insulin on the altered thyroid function and adrenergic responsiveness in the diabetic rat / M. J. Katovich, K. S. Marks, C. A. Sninsky // Canadian journal of physiology and pharmacology. – 1993. – Vol. 71, Issue 8. – P. 568-575. 149 170. Diabetes mellitus increases reactive oxygen species production in the thyroid of male rats / M. C. Santos [et al.] // Endocrinology. – 2013. –Vol.154, Issue 3. – P. 1361-1372. 171. Possible role of corticosterone in the down-regulation of the hypothalamo-hypophysial-thyroid axis in streptozotocin-induced diabetes mellitus in rats / G. A. van Haasteren [et al.] // The Journal of endocrinology. – 1997. – Vol. 153, № 2. – P. 259-67. 172. McCarty, M. F. Central insulin may up-regulate thyroid activity by suppressing neuropeptide Y release in the paraventricular nucleus / M. F. McCarty // Medical hypotheses. –1995. –Vol. 45, Issue 2. – P. 193-199. 173. Neuropeptide Y has a central inhibitory action on the hypothalamic- pituitary-thyroid axis / C. Fekete [et al.] // Endocrinology. – 2001. – Vol. 142, Issue 6. – P. 2606–2613. 174. Wang, J. Central insulin inhibits hypothalamic galanin and neuropeptide Y gene expression and peptide release in intact rats / J. Wang, K. L. Leibowitz // Brain research. – 1997. – Vol. 777, Issues 1-2. – P.231-6. 175. Nillni, E. A. Regulation of the hypothalamic thyrotropin releasing hormone (TRH) neuron by neuronal and peripheral inputs / E.A. Nillni // Frontiers in neuroendocrinology. – 2010. – Vol. 31, Issue 2. – P. 134-156. 176. Effects of insulin on luteinizing hormone and prolactin secretion and calcium signaling in female rat pituitary cells / J. M. Weiss [et al.] // Archives of gynecology and obstetrics. – 2003. – Vol. 269, Issue 1. – P. 45-50. 177. A randomized, double-blind, controlled trial evaluating the effect of intranasal insulin on neurocognitive function in euthymic patients with bipolar disorder / R. S. McIntyre [et al.] // Bipolar disorders. – 2012. – Vol. 14, Issue 7. – P. 697-706. 150 178. Intranasal insulin as a treatment for Alzheimer's disease: a review of basic research and clinical evidence / J. Freiherr [et al.] // CNS Drugs. – 2013. – Vol. 27, Issue 7. – P. 505-514. 179. Enhancement of vasoreactivity and cognition by intranasal insulin in type 2 diabetes / V. Novak [et al.] // Diabetes Care. – 2014. – Vol. 37, № 3. – P. 751759. 180. Активность аденилатциклазной системы в миокарде и семенниках крыс с острой и пролонгированной стрептозотоциновыми моделями сахарного диабета / К. В. Деркач [и др.] // Технологии живых систем. – 2013. – Т. 10, № 9. – C. 3-12. 181. Antidiabetic drugs and their potential role in treating mild cognitive impairment and Alzheimer's disease / K. Alagiakrishnan [et al.] // Discovery medicine. – 2013. – Vol. 16, № 90 – P. 277-286. 182. Nandi, A. Diabetes and the female reproductive system / A. Nandi, L. Poretsky // Endocrinology and metabolism clinics of North America. – 2013. – Vol. 42, Issue 4. – P. 915-946. 183. Impaired testicular function in rats with diet-induced hypercholesterolemia and/or streptozotocin-induced diabetes mellitus / M. Tanaka [et al.] // Endocrine research. – 2001. – Vol. 27, Issues 1-2. – P. 109– 117. 184. Jackson, F. L. Altered responses to androgen in diabetic male rats / F. L. Jackson, J. C. Hutson // Diabetes. – 1984. – Vol. 33, № 9. – P. 819-824. 185. One month of streptozotocin-diabetes induces different neuroendocrine and morphological alterations in the hypothalamo-pituitary axis of male and female rats / G. Bestetti [et al.] // Endocrinology. – 1985. – Vol. 117, Issue 1. – P. 208-216. 151 186. Studies on the mechanism of testicular dysfunction in the early stage of a streptozotocin induced diabetic rat model / Y. Xu [et al.] // Biochemical and biophysical research communications. – 2014. – Vol. 450, Issue 1. – P. 87-92. 187. Experimental diabetes-induced testicular damage in prepubertal rats / C. Kyathanahalli [et al.] // Journal of diabetes. – 2014. – Vol. 6, Issue 1. – P. 4859. 188. Pituitary and hypothalamic somatostatin receptor subtype messenger ribonucleic acid expression in the food-deprived and diabetic rat / J. Bruno [et al.] // Endocrinology. – 1994. –Vol. 135, Issue 5. – P. 1787–1792. 189. Insulin-Dependent Diabetes Affects Testicular Function by FSH- and LH- Linked Mechanisms / J. Ballester [et al.] // Journal of andrology. – 2004. – Vol. 25, Issue 5. – P. 706–719. 152 ПРИЛОЖЕНИЕ Группы животных, использовавшиеся в работе Группа животных Описание Модель острого сахарного диабета 1-го типа Через 30 дней после введения стрептозотоцина (СТЗ) (65 мг/кг) оК30 (n=8) оД30 (n=8) Контрольные самцы крыс через 30 дней после внутрибрюшинного введения 0.1 М цитратного буфера (pH 4.5) Диабетические самцы крыс через 30 дней после внутрибрюшинного введения СТЗ в дозе 65мг/кг, растворенного в цитратном буфере (pH 4.5) Модель острого сахарного диабета 1-го типа c длительным интраназальным введением инсулина (28 дней) в разных дозах (0.3, 0.6, 1.5 ME/крысу) оК (n=6) оКИ0.3 (n=6) оКИ0.6 (n=6) оКИ1.5 (n=6) оД (n=6) оДИ0.3 (n=6) оДИ0.6 (n=6) оДИ1.5 (n=6) Контрольные самцы крыс линии Wistar возраста 6-7 месяцев, которым ежедневно в течение 28 дней интраназально вводили цитратный буфер (pH 4.5). Контрольные самцы крыс линии Wistar возраста 6-7 месяцев, которым ежедневно в течение 28 дней интраназально вводили кристаллический инсулин, растворенный в цитратном буфере(pH 4.5), в дозе 0.3 МЕ/крысу Контрольные самцы крыс линии Wistar возраста 6-7 месяцев, которым ежедневно в течение 28 дней интраназально вводили кристаллический инсулин, растворенный в цитратном буфере, в дозе 0.6 МЕ/крысу Контрольные самцы крыс линии Wistar возраста 6-7 месяцев, которым ежедневно в течение 28 дней интраназально вводили кристаллический инсулин, растворенный в цитратном буфере(pH 4.5), в дозе 1.5 МЕ/крысу Диабетические самцы крыс линии Wistar возраста 6-7 месяцев, которым интраназально вводили цитратный буфер (pH 4.5), начиная с третьего дня после инъекции СТЗ и в течение 28 дней Диабетические самцы крыс линии Wistar возраста 6-7 месяцев, которых ежедневно обрабатывали интраназальным инсулином, растворенным в цитратном буфере (pH 4.5), в дозе 0.3 МЕ/крысу, начиная с третьего дня после инъекции СТЗ и в течение 28 дней Диабетические самцы крыс линии Wistar возраста 6-7 месяцев, которых ежедневно обрабатывали интраназальным инсулином, растворенным в цитратном буфере (pH 4.5), в дозе 0.6 МЕ/крысу, начиная с третьего дня после инъекции СТЗ и в течение 28 дней Диабетические самцы крыс линии Wistar возраста 6-7 месяцев, которых ежедневно обрабатывали интраназальным инсулином, растворенным в цитратном буфере (pH 4.5), в дозе 1.5 МЕ/крысу, начиная с третьего дня после инъекции СТЗ и в течение 28 дней 153 Пролонгированная модель «мягкого» сахарного диабета 1-го типа на самцах крыс продолжительностью 7 месяцев Через 30 дней после первой инъекции СТЗ мК30 (n=6) мД30 (n=6) Контрольные самцы крыс возраста 5-ти месяцев через 30 дней после первого внутрибрюшинного введения цитратного буфера (pH 4.5) (2 введения буфера) Диабетические самцы крыс через 30 дней после первого внутрибрюшинного введения СТЗ в дозе 40 мг/кг, растворенного в цитратном буфере (pH 4.5) (2 введения СТЗ) Через 150 дней после первой инъекции СТЗ мК150 (n=8) мД150 (n=8) Контрольные самцы крыс возраста 5-ти месяцев через 150 дней после первого внутрибрюшинного введения цитратного буфера (pH 4.5) (3 введения СТЗ) Диабетические самцы крыс через 150 дней после первого внутрибрюшинного введения СТЗ в дозе 40 мг/кг, растворенного в цитратном буфере (pH 4.5) (3 введения СТЗ) Через 210 дней после первой инъекции СТЗ мК210 (n=8) мД210 (n=8) Контрольные самцы крыс возраста 5-ти месяцев через 210 дней после первого внутрибрюшинного введения цитратного буфера (pH 4.5) (3 введения буфера) Диабетические самцы крыс через 210 дней после первого внутрибрюшинного введения СТЗ в дозе 40 мг/кг, растворенного в цитратном буфере (pH 4.5) (3 введения СТЗ) Модель «мягкого» сахарного диабета 1-го типа на самцах крыс c длительным интраназальным введением инсулина (135 дней, обработку начинали на 75 день после первой инъекции СТЗ) в дозе 0.5 МЕ на животное Через 150 дней после первой инъекции СТЗ Контрольные самцы крыс, которым интраназально вводили мК150 (n=8) мКИ150 (n=6) мД150 (n=8) мДИ150 (n=6) цитратный буфер (pH 4.5), начиная с 75 дня после первого внутрибрюшинного введения цитратного буфера (pH 4.5) и в течение 75 дней Контрольные самцы крыс, которым интраназально вводили кристаллический инсулин, растворенный в цитратном буфере (pH 4.5), в дозе 0.5 МЕ/крысу, начиная с 75 дня после первого интраперитонеального введения цитратного буфера (pH 4.5) и в течение 75 дней Диабетические самцы, которым интраназально вводили цитратный буфер (pH 4.5), начиная с 75 дня после первой инъекции СТЗ (40 мг/кг) и в течение 75 дней Диабетические самцы, которым ежедневно интраназально вводили инсулин, растворенный в цитратном буфере (pH 4.5), в дозе 0.5 МЕ/крысу, начиная с 75 дня после первой инъекции СТЗ (40 мг/кг) и в течение 75 дней Через 210 дней после первой инъекции СТЗ мК210 (n=8) Контрольные самцы крыс, которым интраназально вводили цитратный буфер (pH 4.5), начиная с 75 дня после первого внутрибрюшинного введения цитратного буфера (pH 4.5) и в течение 135 дней 154 мКИ210 (n=6) мД210 (n=8) мДИ210 (n=6) Контрольные самцы крыс, которым интраназально вводили инсулин, растворенный в цитратном буфере (pH 4.5), в дозе 0.5 МЕ/крысу, начиная с 75 дня после первого внутрибрюшинного введения цитратного буфера (pH 4.5) и в течение 135 дней Диабетические самцы, которым интраназально вводили цитратный буфер (pH 4.5), начиная с 75 дня после первой инъекции СТЗ (40 мг/кг) и в течение 135 дней Диабетические самцы, которым ежедневно интраназально вводили инсулин, растворенный в цитратном буфере (pH 4.5), в дозе 0.5 МЕ/крысу, начиная с 75 дня после первой инъекции СТЗ (40 мг/кг) и в течение 135 дней Неонатальная модель сахарного диабета 2-го типа на самцах крыс продолжительностью 3, 8 и 18 месяцев Через 3 месяца после инъекции СТЗ нК3 (n=8) нД3 (n=8) Контрольные самцы крыс возраста 3 месяцев, которым внутрибрюшино вводили цитратный буфер (pH 4.5) на 5-е сутки после рождения Диабетические самцы крыс возраста 3 месяцев, которым внутрибрюшино вводили СТЗ (80мг/кг), растворенный в цитратном буфере (pH 4.5) на 5-е сутки после рождения Через 8 месяцев после инъекции СТЗ нК8 (n=10) нД8 (n=10) Контрольные самцы крыс возраста 8 месяцев, которым внутрибрюшино вводили цитратный буфер (pH 4.5) на 5-е сутки после рождения Диабетические самцы крыс возраста 8 месяцев, которым внутрибрюшино вводили СТЗ (80мг/кг), растворенный в цитратном буфере (pH 4.5) на 5-е сутки после рождения Через 18 месяцев после инъекции СТЗ нК18 (n=7) НД18 (n=7) Контрольные самцы крыс возраста 18 месяцев, которым внутрибрюшино вводили цитратный буфер (pH 4.5) на 5-е сутки после рождения Диабетические самцы крыс возраста 18 месяцев, которым внутрибрюшино вводили СТЗ (80мг/кг), растворенный в цитратном буфере (pH 4.5) на 5-е сутки после рождения
