Диссертация - Медико-генетический научный центр
advertisement
Федеральное государственное бюджетное учреждение «Московский научно-исследовательский онкологический институт им. П. А. Герцена» Министерства здравоохранения Российской Федерации На правах рукописи Шикеева Амуланг Алексеевна «Молекулярно-генетические изменения при немелкоклеточном раке легкого. 03.02.07 – генетика 14.01.12 – онкология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научные руководители: доктор биологических наук Завалишина Л.Э. кандидат медицинских наук Кекеева Т.В. Москва - 2014 2 ОГЛАВЛЕНИЕ. СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ. ........................................................................................ 4 ВВЕДЕНИЕ. ................................................................................................................... 5 Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. ............................................................................... 9 1.1. Этиология, классификация, диагностика и лечение НМРЛ. ............................ 9 1.2. Молекулярно-генетические изменения при НМРЛ. ....................................... 16 1.2.1 Структурные изменения. .............................................................................. 16 1.2.2 Эпигенетические изменения. ....................................................................... 23 1.2.2.1 Аномальное метилирование промоторов генов................................... 25 1.2.2.2 МикроРНК. .............................................................................................. 27 Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ. .................................................................... 29 2.1. Клинический материал. ...................................................................................... 30 2.2. Выделение геномной ДНК. ................................................................................ 31 2.3. Выделение микроРНК из парафиновых блоков. ............................................. 31 2.4. Бисульфитная модификация ДНК. ................................................................... 31 2.5. Микросателлитный анализ. ............................................................................... 33 2.6. Фрагментный анализ. ......................................................................................... 34 2.7. Рестрикционный анализ. .................................................................................... 34 2.8. Метил-чувствительная полимеразная цепная реакция (МЧ-ПЦР). .............. 35 2.9. Метил-специфическая ПЦР ( МС-ПЦР). .......................................................... 36 2.10. Полимеразная цепная реакция (ПЦР). ............................................................ 37 2.11. Обратная транскрипция. .................................................................................. 38 2.12. ПЦР в режиме реального времени (Real time-ПЦР)...................................... 39 2.12.1 Real time-ПЦР для определения мутаций гена EGFR. ................................ 39 2.12.2 Real time-ПЦР для определения уровня экспрессии микроРНК................ 40 2.13. Секвенирование. ............................................................................................... 40 2.14. Электрофорез в ПААГ. .................................................................................... 40 2.15. Ультратонкое окрашивание нитратом серебра.............................................. 41 2.16. Флуоресцентная гибридизация in situ (FISH). ............................................... 41 3 2.17. Программное обеспечение. .............................................................................. 42 2.18. Статистическая обработка данных. ................................................................ 42 3.1. Аллельные нарушения при НМРЛ. ................................................................... 43 Аллельные нарушения в смежной с опухолью условно нормальной ткани на различном расстоянии. .......................................................................................... 50 3.2. Результаты анализа мутации генов EGFR, KRAS и транслокации гена ALK при НМРЛ................................................................................................................... 51 3.3. Результаты аномального метилирования промоторов генов у пациентов с НМРЛ. ......................................................................................................................... 58 Эпигенетические изменения в смежной с опухолью условно нормальной ткани на различном расстоянии. ........................................................................... 63 3.4. Результаты экспрессии зрелых микроРНК в НМРЛ. ...................................... 65 Определение уровня экспрессии микроРНК let-7a, miR-155, miR-205 в смежной условно нормальной ткани на различном расстоянии. ...................... 73 3.5. Анализ генетических и эпигенетических изменений в опухолевом окружении. ................................................................................................................. 78 ЗАКЛЮЧЕНИЕ. .......................................................................................................... 81 ВЫВОДЫ. ..................................................................................................................... 84 ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ. ................................................................. 85 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ. ........................................................................................ 86 4 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ. FISH – флуоресцентная гибридизация in situ Real time-ПЦР - полимеразная цепная реакция в режиме реального времени АК – аденокарцинома АПКРЛ - аденоплоскоклеточный рак легкого ИФР – интерферон КРЛ - крупноклеточный рак легкого КТ – компьютерная томография МН – микросателлитная нестабильность МРТ – магнитно-резонансная томография МС-ПЦР – метил-специфическая полимеразная цепная реакция МЧ-ПЦР – метил-чувствительная полимеразная цепная реакция МЭ - мукоэпидермоидный рак НМРЛ – немелкоклеточный рак легкого НХЗЛ – неспецифические хронические заболевания легких ОТ-ПЦР – полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией ПААГ – полиакриламидный гель ПГ – потеря гетерозиготности ПКРЛ - плоскоклеточный рак легкого ПЦР – полимеразная цепная реакция ПЭТ – позитронно-эмиссионная томография УФ излучение – ультрафиолетовой излучение 5 ВВЕДЕНИЕ. Рак легкого является одним из самых распространенных злокачественных новообразований и одной из основных причин летального исхода у онкологических больных. По данным ВОЗ на 2008 год рак легких стал причиной смерти 1,3 миллиона человек (World health statistics, 2013). В 2011 в России зарегистрировано более 50 тысяч новых случаев рака легкого, при этом 36% случаев выявлено на 4 стадии заболевания (Чиссов В.И., 2011). Курение является одним из главных факторов риска развития рака легкого (курильщиками являются 87% пациентов с этой нозологией). Летальность на первом году с момента установления диагноза составляет 53%. Пятилетняя выживаемость пациентов с раком легкого очень мала и составляет в разных странах от 5 до 18%, несмотря на высокий уровень развития современных методов диагностики и лечения. Все раки легкого можно разделить на 2 большие группы: мелкоклеточный и немелкоклеточный раки легкого. Группа немелкоклеточного рака легкого (НМРЛ) включает примерно 85% всех раков. Среди гистологических типов НМРЛ – аденокарцинома, плоскоклеточный рак легкого, аденоплоскоклеточный, крупноклеточный рак. Первые два типа составляют 80-90% всех НМРЛ. Показано, что для каждого гистологического типа существует свой профиль генетический изменений, так, например, мутации генов EGFR, KRAS, транслокация EML4/ALK характерны для аденокарцином легкого. Для плоскоклеточного рака легкого показана амплификация генов FGFR1 и SOX2. Характерной особенностью нашей страны является преобладание плоскоклеточного рака, что обусловлено большим количеством курящего населения. В ряде работ показано, что молекулярно-генетические изменения характерны не только для опухолевой ткани, но часто выявляются в смежных с опухолью условно нормальных тканях. Недавние исследования показали, что опухолевое окружение НМРЛ имеет гетерогенную структуру и играет важную роль в прогрессировании опухоли и эффективности лечения. 6 В последнее время в связи с развитием персонализированного подхода к выбору тактики лечения онкологических больных большое значение имеют не только клинические характеристики пациента, а также гистологический тип опухоли, но и молекулярно-генетические особенности опухоли и их применение для диагностики, прогноза заболевания и определения чувствительности к таргетной терапии. Настоящее исследование посвящено изучению генетических и эпигенетических нарушений в опухоли и смежных с опухолью условно нормальных тканях, а также оценке практической (диагностической и прогностической) значимости этих нарушений. Цель работы – комплексное изучение молекулярно-генетических изменений в немелкоклеточном раке легкого и смежных с опухолью условно нормальных тканях. Задачи исследования. 1. Изучить аллельный дисбаланс локусов D2S405, D2S164, D3S1300, D3S1768, D3S1539, D9S925, D17S938 в НМРЛ и смежных с опухолью условно нормальных тканях на различном расстоянии от опухоли. 2. Изучить аномальное метилирование промоторов генов FHIT, TIMP3, CDH1, MGMT, RASSF1A, DAPK1, CD44 в НМРЛ и смежных с опухолью условно нормальных тканях на различном расстоянии от опухоли. 3. Определить частоты мутаций генов EGFR и KRAS и транслокацию гена ALK в не плоскоклеточном НМРЛ для определения чувствительности к таргетным препаратам. 4. Определить уровни экспрессии микроРНК: let-7a, miR-155, miR-205 – в опухолевой ткани и смежных с опухолью условно нормальных тканях на различном расстоянии от опухоли. 7 5. Провести сравнительный анализ выявленных молекулярно- генетических нарушений для различных гистологических типов НМРЛ и других клинических параметров. Научная новизна. Впервые на российской выборке проведено комплексное исследование молекулярно-генетических изменений НМРЛ: потери гетерозиготности, микросателлитной нестабильности, эпигенетических изменений на материале опухолевой ткани, смежной условно нормальной ткани на различном расстоянии. Впервые на российской выборке проведено исследование уровней экспрессии ряда микроРНК в опухолевой ткани, смежных с опухолью нормальных тканях пациентов с НМРЛ. Впервые изучено состояние опухолевого окружения на различных расстояниях от опухолевого очага. Практическая значимость. C развитием таргетной терапии, направленной против специфических молекулярных мишеней, точная гистологическая верификация опухолей легкого стала еще более необходимой. Выявленные в нашей работе молекулярногенетические изменения локусов D9S925, D17S928, а также гиперметилирование промоторов генов CDH1 и CD44 могут рассматриваться в качестве маркеров плоскоклеточного рака легкого в сложных диагностических случаях в дополнение к данным иммуноморфологического исследования. Выявленные в нашей работе аллельные нарушения микросателлитов D2S405, D3S1300, гиперметилирование промоторов генов RASSF1A, FHIT, DAPK1, а также снижение экспрессии микроРНК let-7a и miR-155 могут рассматриваться в качестве маркеров прогноза. Апробация работы. Материалы диссертации доложены: на десятой конференции «Нанотехнологии в онкологии», 15 декабря 2012г., Москва, на конференции «European Conference of Human Genetics», 8-11 июня, 2013г., Париж, Франция. 8 Положения, выносимые на защиту. 1. Для НМРЛ характерны высокие частоты потери гетерозиготности/микросателлитной нестабильности локусов D2S405, D2S164, D3S1300, D3S1768, D3S1539, D9S925, D17S938, гиперметилирование промоторов генов RASSF1A, FHIT, DAPK1, CDH1, CD44, TIMP3, MGMT и снижение экспрессии микроРНК let-7a. 2. В смежных с опухолью условно нормальных тканях на расстоянии 2 и 5 см от опухоли выявлены эпигенетические изменения и отсутствуют аллельные нарушения. В ряду: опухоль – смежная условно нормальная ткань на расстоянии 2 см – смежная условно нормальная ткань на расстоянии 5 см – происходит уменьшение частоты эпигенетических изменений. 3. Выявленные молекулярные повреждения: потеря гетерозиготности/микросателлитная нестабильность локусов D9S925, D17S928 и метилирования генов CDH1 и CD44 – ассоциированы с плоскоклеточным раком легкого и могут использоваться в качестве маркеров для гистологической верификации опухоли; аллельные нарушения регионов D2S405, D3S1300, метилирование промоторов генов RASSF1A и FHIT, снижение уровня экспрессии микроРНК let-7a и miR-155 ассоциированы со стадией заболевания, степенью дифференцировки опухоли и метастазированием и могут рассматриваться в качестве маркеров прогноза. 4. ткани, Смежные с опухолью морфологически не измененные нормальные содержащие молекулярно-генетические изменения, формируют «опухолевое окружение» выявленное на расстоянии 5 см от опухолевого очага. 9 Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. 1.1. Этиология, классификация, диагностика и лечение НМРЛ. Рак лёгкого — обобщенное понятие, включающее разные по происхождению, клиническому течению, гистологической структуре и прогнозу злокачественные эпителиальные новообразования. В 2011 в России зарегистрировано более 50 тысяч новых случаев рака легкого, при этом 36% случаев выявлено на 4 стадии заболевания (Чиссов В.И., 2011). Летальность на первом году с момента установления диагноза составляет 53%. Пятилетняя выживаемость пациентов с раком легкого очень мала и составляет в разных странах от 5 до 18%. Курение является одним из главных факторов риска развития рака легкого. Курильщиками являются 87% пациентов с этой нозологией. Также, в группу риска развития рака легкого могут попасть люди, имеющие: профессиональные вредности (асбест, уголь, хром и т.д.), хронические заболевания легких (туберкулез, НХЗЛ и т.д.), генетическую предрасположенность (зачастую прослеживаются семейные случаи рака легких), воздействия различных канцерогенов, встречающихся в повседневной жизни (УФ излучение, выхлопные газы и пр.), онкологические заболевания в анамнезе. Однако наличие этих факторов не всегда ведет к развитию рака легкого, что скорее говорит о мультифакториальной природе данного заболевания. В зависимости от места возникновения новообразования выделяют (Чиссов В.И., 2007): - центральный (новообразование возникает из эпителия главных, долевых, сегментарных бронхов) - периферический (опухоль возникает из эпителия мелких бронхов и альвеол) поражение медиастинальный лимфатических первичного очага в легком) (множественное узлов средостения, метастатическое без выявления 10 - диссеминированный (множественное поражение легких, без выявления первичной опухоли в других органах) В зависимости от гистологического строения выделяют (ВОЗ, 2001): - плоскоклеточный (происходит из покровного эпителия бронхов) - аденокарциному (происходит из железистого эпителия бронхов) - мелкоклеточный - крупноклеточный - аденоплоскоклеточный - карциномы с плеоморфными, саркоматиодными и саркоматозными компонентами. С целью унификации подходов в лечении и прогнозе выживаемости пациентов в онкологии выделяют мелкоклеточный и немелкоклеточный раки легкого. Немелкоклеточный рак легкого (НМРЛ) составляет 85% всех раков легкого. Группа немелкоклеточного рака легкого довольно многочисленна и включает в себя аденокарциному, плоскоклеточный, крупноклеточный, аденоплоскоклеточный раки легкого. При этом первые два подтипа составляют 80-90% всех НМРЛ (Рис 1, 2). Первоначальное состояние, так же как и прогрессирование заболевания любого онкологического больного, описывается с помощью TMN классификации. В табл. 1 приведена TNM классификация для пациентов с НМРЛ. Для определения общей характеристики степени развития заболевания разные сочетания показателей TNM классификации объединены в группы – стадии (табл. 2). 11 Таблица 1. Современная TNM классификация рака легкого (Mirsadraee S., 2012). T (tumor) – размер опухоли Первичная опухоль не может быть определена или опухоль при TX наличии злокачественных клеток в мокроте или бронхиальном смыве не наблюдается при рентгенографии или бронхоскопии T0 Нет признаков первичной опухоли Tis Карцинома in situ Опухоль менее 3 см в наибольшем направлении, окружена легочной или висцеральной плеврой, без бронхоскопических T1 признаков инвазии проксимальнее, чем дольковый бронх (например, нет в главном бронхе) T1a Опухоль менее 2 см в наибольшем направлении T1b Опухоль более 2 см, но менее 3 см в наибольшем направлении Опухоль более 3 см, но менее 7 см, или опухоль с каким-либо из признаков: Вовлечен главный бронх, более чем на 2 см дистальнее киля трахеи T2 Инвазия в висцеральную плевру Ассоциирована с аталектазом или обструктивным пневмонитом, который распространяется на прикорневую область, но не на целое легкое T2a Опухоль более 3 см, но менее 5 см в наибольшем направлении T2b Опухоль более 5 см, но менее 7 см в наибольшем направлении Опухоль более 7 см или при инвазии в одно из следующего: Грудная стенка (включая опухоль Панкоста), диафрагма, диафрагмальный нерв, медиастинальная плевра, париетальный перикард T3 Опухоль в главном бронхе менее чем 2 см дистальнее киля трахеи, но без его вовлечения Ассоциированный аталектаз или обструктивный пневмонит целого легкого Наличие других опухолевых очагов в этой доле легкого Опухоль любого размера при инвазии в одно из следующего: Средостение, сердце, большие сосуды, трахея, возвратный T4 гортанный нерв, пищевод, тело позвонка, киль трахеи Наличие других опухолевых очагов в других ипсилатеральных долях легкого N (nodes) – лимфатические узлы Метастазы в региональные лимфатические узлы не могут быть NX определены N0 Нет метастазов в региональные лимфатические узлы 12 Метастазы в ипсилатеральные перибронхиальные лимфатические узлы и/или ипсилатеральные прикорневые N1 лимфатические узлы и внутрилегочные лимфатические узлы, включая их вовлечение непосредственным увеличением размеров Метастазы в ипсилатеральные медиастинальные лимфатические N2 узлы и/или трахеобронхиальные лимфатические узлы Метастазы в контралатеральные медиастинальные, контралатеральные прикорневые, ипсилатеральные или N3 контралатеральные лестничные, или супрклавикулярные лимфатические узлы M (metastases) – метастазы MX Отдаленные метастазы не могут быть определены M0 Нет отдаленных метастазов M1 Отдаленные метастазы Отдельные опухолевые узлы в контралатеральной доле M1a Опухоль с плевральными опухолевыми узлами или злокачественным плевральным/ перикардиальным экссудатом M1b Отдаленные метастазы Таблица 2. Стадии рака легкого (Mirsadraee S, 2012). Стадия по TNM T1a T1b T2a T2b T3 T4 M1a M1b N0 IA IA IB II A II B III A IV IV N1 II A II A II A II B III A III A IV IV N2 III A III A III A III A III A III B IV IV N3 III B III B III B III B III B III B IV IV 13 Рис 1. Аденокарцинома легкого. Окр. г/э. Ув. 200. Рис 2. Плоскоклеточный рак легкого. Окр. г/э. Ув. 200. Клинические проявления НМРЛ различны и зависят от локализации первичного очага. Так, к примеру, центральный рак легкого, особенно если он возник из эпителия слизистой крупного бронха, проявляет себя рано. В отличие от периферического рака легкого, который на начальных этапах в виду возникновения в паренхиме легкого, где отсутствует чувствительная иннервация, протекает практически бессимптомно. Этот факт в большинстве случаев НМРЛ объясняет выявление заболевания на поздних этапах. Однако, несмотря на различные типы течения, НМРЛ имеет общие симптомы, которые свойственны практически всем пациентам и которые могут позволить заподозрить наличие новообразования: - кашель (длительный, не проходящий, в ряде случаев с кровавой мокротой) 14 - боли в груди (особенно если возникают при глубоком вдохе/выдохе, кашле) - повышенная температура (продолжительное время, при отсутствии других очагов воспаления) - частые и продолжительные воспалительные заболевания легких - одышка - охриплость - недомогание (общая вялость, отсутствие аппетита) - похудание (значительная потеря веса за короткий срок) Зачастую трудности с диагностикой рака легких заключаются в отсутствии специфических симптомов, характерных именно для этого заболевания. НМРЛ довольно быстро метастазирует, что может добавлять дополнительные клинические симптомы. Считается, что НМРЛ имеет 3 основных пути метастазирования: - лимфогенный - гематогенный - аэрогенный/имплантационный (попадая в центральные или периферические ходы бронхиального древа во время дыхания или кашля) Для диагностики НМРЛ и оценки состояния заболевания применяют следующие инструментальные методы: - рентгенологическое исследование органов грудной клетки (зачастую заподозрить наличие рака лёгкого помогает флюорография) - КТ, МРТ, ПЭТ органов грудной клетки - бронхоскопическое исследование - ультразвуковая диагностика - торакоцентез - диагностическая торакоскопия - медиастиноскопия, медиастинотомия 15 - тонко- и толстоигольные трансторакальные биопсии Симптоматическая картина и инструментальные методы исследования могут только подтвердить или опровергнуть наличие новообразования. Однако точный диагноз немелкоклеточного рака легкого ставится только после гистологического исследования биоптата или операционного материала. В некоторых случаях оказывается полезным цитологические исследования (мазок мокроты, плеврального выпота), особенно в случаях, когда опухоль прорастает в просвет крупных бронхов. В зависимости от стадии заболевания, состояния пациента и наличия/отсутствия отягощающих факторов тактика лечения пациентов с НМРЛ включает: - оперативное лечение - лучевую терапию - химиотерапию - таргетную терапию В каждом случае подбор тактики лечения пациента с НМРЛ строго индивидуален и может сочетать в себе несколько видов лечения. Однако, несмотря на постоянно усовершенствующиеся подходы к диагностике и лечению пациентов с НМРЛ, существует ряд проблем, решение которых в настоящее время является актуальным. Так, летальность на первом году с момента установления диагноза НМРЛ составляет 53%, а пятилетняя выживаемость пациентов с раком легкого очень мала и составляет в разных странах от 5 до 18%. Лечение пациентов с НМРЛ зачастую не приводит к ожидаемым эффектам, что обуславливает высокий процент рецидивов и прогрессирования заболевания. В этом аспекте изучение молекулярно- биологических свойств опухолевых клеток может оказать существенную помощь в решении проблем ранней диагностики, эффективности лечения и прогноза течения НМРЛ. 16 1.2. Молекулярно-генетические изменения при НМРЛ. 1.2.1 Структурные изменения. К структурным нарушениям генома относятся любые изменения вызывающие нарушение нуклеотидной последовательности ДНК: делеции, дупликации, инсерции, инверсии, транслокации и др. Структурные изменения в генах часто приводят к грубому нарушению функции этого гена, что в свою очередь обуславливает изменение механизмов жизнедеятельности клетки в целом. Инактивация генов-супрессоров в клетках опухоли часто является результатом делеции участка хромосомы, где локализован этот ген. Подобные изменения можно идентифицировать либо с помощью прямого исследования нуклеотидной последовательности гена, либо, в случаях, когда это по какой либо причине невозможно, с помощью генетического анализа состояния микросателлитных маркёров, локализованных внутри генов-супрессоров или тесно сцепленных с ними. Микросателлиты представляют собой высокополиморфные, тандемно-организованные, ди-, три-, тетрануклеотидные последовательности, повторяющиеся в геноме от нескольких десятков до нескольких сотен раз и представленные большим количеством различных аллелей (Залетаев Д.В., 2009; Горбунова В.Н., 1997). Высокая полиморфность обусловливает наличие у большинства индивидов двух аллелей в исследуемом микросателлитном локусе. Делеция одного аллеля в опухолевой ДНК обозначается термином «потеря гетерозиготности» (ПГ) (Залетаев Д.В., 2009; Горбунова В.Н., 1997). В ряде случаев признаком инициации опухолевого процесса, наряду с ПГ, может служить «микросателлитная нестабильность» (МН) - изменение длины микросателлитных последовательностей в результате делеции или вставки нескольких нуклеотидов. МН выражается в появлении в опухолевых клетках дополнительных аллелей микросателлитов, которые отличаются по длине от аллелей в нормальных тканях того же пациента (Залетаев Д.В., 2009; Горбунова В.Н., 1997). 17 Аллельные нарушения могут быть чувствительным маркёром опухолевых клеток и/или внешним проявлением дестабилизации генома в целом (Залетаев Д.В., 2009; Горбунова В.Н., 1997). НМРЛ характеризуется многочисленными генетическими изменениями, затрагивающими гены-супрессоры опухолевого роста и онкогены, такие как: HLJ1 (1p31), FHIT (3p14), p16INK4a (9p21), RASSF1A, FUS1, LIMD1, SEMA3B, SEMA3F (3p21) и p53 (17p13) (Zochbauer-Muller S., 2002; Sekido Y., 2003; Mitsuuchi Y., 2002; Chmara M., 2004; Zienolddiny S., 2001, Шикеева А.А., 2013). Согласно литературным данным, частыми молекулярно-генетическими изменениями при НМРЛ считаются аллельные нарушения (ПГ и МН) в хромосомных регионах 2p23~p24 и 2q35; 3p14 и 3p21~p26 (50 - 80% всех НМРЛ); 9p21~p22; 17p13 (40% всех НМРЛ); 13q; 18q и 9q (Woenckhaus M., 2005; Tseng R.C., 2005; Chmara M., 2004; Girard L., 2000). Другие исследования также показывают частые аллельные нарушения в районах 1p, 2p, 2q, 3p, 6q, 7p, 9p, 12p, 16p, 17p, 17q, 19p и 21q, которые чаще встречаются в опухоли, чем в нормальных тканях (Sanchez-Cespedes M., 2001; Marsit C.J., 2005; Pan H., 2005 Hirao T., 2001; Grepmeier U., 2005). Показано, что для каждого гистологического подтипа тоже существует свой профиль генетический изменений, так, например, мутации генов EGFR, KRAS, транслокация EML4/ALK, хромосомные перестройки в регионах 2p, 9p, 14q, 20p характерны для аденокарцином легкого (Grepmeier U., 2005; Tseng R.C., 2005); для плоскоклеточного рака легкого показана амплификация генов FGFR1 и SOX2 (Sos M.L., 2012), а также хромосомные перестройки в районах 3p и 17p (Chmara M., 2004). Хотя в большинстве случаев проблемы дифференциальной диагностики между различными гистологическими подтипами НМРЛ не стоит, использование генетических маркеров в дополнение к данным формальной морфологии и иммуногистохимии в сложных диагностических случаях может быть полезно. Несмотря на большое число исследований, данные об ассоциации генетических изменений и клинико-морфологических параметров НМРЛ не 18 многочисленны. Так, Tseng и соавторы показали, что ПГ локуса 1p36.23 ассоциирована с курением, плоскоклеточным раком и поздней стадией опухолевого процесса (Tseng R.C., 2005). В исследовании Wrage и соавторов потеря гетерозиготности в районе 4q, в частности 4q12–q23, в НМРЛ статистически достоверно ассоциирована с метастазами в кости (Wrage M., 2009). В этой же работе показано, что аналогичные молекулярно-генетические изменения обнаружены в метастазах НМРЛ в головной мозг. Исходя из результатов исследования, авторы предположили, что аллельные делеции в районе 4q могут запускать механизм ранней гематогенной диссеминации опухолевых клеток. Рассмотрим подробнее данные по отдельным генам, нарушения которых характерны для НМРЛ. Рецептор эпидермального фактора роста (EGFR), так же известный, как HER1 или ErbB1, относится к семейству рецепторов ErbB, в частности к подсемейству тирозинкиназных рецепторов (обладающих внутренней тирозинкиназной активностью): EGFR (Her1/ErbB1), HER2/c-neu (Her2/ErbB2), Her3 (ErbB3) и Her4 (ErbB-4) (http://en.wikipedia.org). EGFR играет важную роль в канцерогенезе и прогрессировании опухоли посредством различных механизмов активации: гиперэкспрессии белка, соматических мутаций в гене EGFR и аутокринной продукции лиганда рецептора. Нарушения в гене EGFR вызывают активацию Ras/Raf/Mek/Mapk и PI3K/Akt/mTOR сигнальных путей, что приводит к активному клеточному росту, пролиферации опухолевых клеток, инвазивному росту опухоли, метастазированию и стимуляции опухолевого ангиогенеза (Salomon D.S., 1995). Мутации в гене EGFR встречаются в 15-40% случаев НМРЛ. 18-21 экзоны гена EGFR кодируют тирозинкиназный домен рецептора, и мутации в любом из этих низкомолекулярными регионов определяют ингибиторами EGFR. чувствительность Наиболее к терапии распространенными мутациями являются делеции в 19 экзоне и мутация p.L858R в 21 экзоне гена EGFR, реже встречаются мутации в 18 и 20 экзонах этого гена (Lynch T.J., 2004; Paez J.G., 2004; Sharma S.V., 2007). По данным различных исследований, мутации 19 в гене EGFR характерны для аденокарцином, чаще встречаются в азиатской популяции, у женщин, некурящих (Bell D.W., 2008; Cappuzzo F., 2010; Lee D., 2011). Как уже отмечалось, активирующие мутации в гене EGFR определяют чувствительность пациентов с НМРЛ к терапии гефитинибом и эрлотинибом – низкомолекулярным ингибиторам EGFR первого поколения, которые блокируют внутриклеточный тирозинкиназный домен рецептора, затрудняя дальнейшую передачу сигнала по сигнальному пути (Reungwetwattana T., 2012). Клинические исследования: IPASS, NEJSG 002, WJTOG3405, OPTIMAL, EURTAC – показали, что пациенты с поздней стадией НМРЛ, имеющие активирующие мутации в гене EGFR и получавшие гефитиниб/эрлотиниб в первой линии терапии, имеют лучшие показатели выживаемости, времени без прогрессирования заболевания и ответа на терапию по сравнению с пациентами, получавшими стандартную химиотерапию. Эти исследования позволили авторам рекомендовать селективный отбор пациентов, основанный на статусе мутаций гена EGFR, для назначения препаратов гефитиниб и эрлотиниб (Maemondo M., 2010; Mok T.S., 2009; Zhou C., 2011; Rosell R., 2011; Mitsudomi T., 2010). Ген KRAS — протоонкоген, кодирующий одноименный белок, который является представителем белков семейства Ras. Белок KRAS представляет собой ГТФазу и является компонентом многих сигнальных путей. Мутации в гене KRAS встречаются у 15–35% пациентов с НМРЛ (Roberts P.J., 2010). Наиболее частыми являются мутации в 12 и 13 кодонах гена KRAS (90%); мутации в 10 и 61 кодонах встречаются редко (Ihle N.T., 2012). Мутации гена KRAS характерны для аденокарцином легкого, чаще встречаются у европеоидов, чем азиатов (30% и 5%), и ассоциированы с курением (Herbst R.S., 2010; Li M., 2009; Riely G.J., 2008). Согласно литературным данным, наличие мутации в гене KRAS считается неблагоприятным фактором прогноза. Мета-анализ данных показал, что мутации в этом гене ассоциированы со снижением выживаемости пациентов, а также неэффективностью терапии ингибиторами EGFR первого поколения (Li M., 2009). 20 Сигнальный путь Ras/Raf/Mek/Mapk является одним из ключевых механизмов, участвующих в патогенезе рака легкого. Активация Ras с последующим вовлечением Raf запускает ряд сигнальных каскадов, приводящих к фосфорилированию Mek1/Mek2- и MAP-киназ (Miller V.A., 2010). KRAS является ключевым белком семейства Ras. Различные этапы этого пути являются перспективными мишенями для блокады. Молекулу белка KRAS заблокировать практически невозможно, однако его партнеры по сигнальному пути являются многообещающими мишенями для блокады. Основной из таких мишеней является белок Mek, который функционирует ниже в сигнальном пути Ras. Так как Mek является непосредственным эффектором сигналов с KRAS, то его блокада может оказаться эффективной у пациентов с резистентностью к антагонистам EGFR. В настоящее время проводится ряд клинических исследований различных ингибиторов MEK как в качестве монотерапии, так и в сочетании с другими препаратами. Ген BRAF кодирует одноименную серин/треониновую протеинкиназу. Киназа BRAF является членом семейства киназ Raf. BRAF функционирует в сигнальном каскаде ниже Ras, от которого он передает сигналы на Map-киназу (Linardou H., 2008). Мутации гена BRAF изначально исследовались только в контексте злокачественных меланом. Однако около 3% случаев НМРЛ также несут мутации BRAF (Paik P.K., 2011). При этом в отличие от меланом, при которых в подавляющем большинстве случаев выявляется мутация p.V600E, при НМРЛ встречаются различные мутации BRAF, например, p.G468A и p.L596V (Paik P.K., 2011; Marchetti A., 2011). В настоящее время проводится несколько клинических испытаний по применению ингибиторов BRAF для НМРЛ. Ген PIK3CA кодирует каталитическую субъединицу, которая участвует в процессах фосфорилирования АТФ и является участником сигнального пути PI3K/Akt/mTOR. Мутации в гене PIK3CA встречаются примерно в 5% плоскоклеточных раков легкого и в настоящее время являются объектом активных клинических исследований (Kawano O., 2006). Сигнальный путь PI3K/Akt/mTOR играет важную роль в пролиферации клеток, синтезе белков и 21 ангиогенезе (Steele N.L., 2008). Основным фактором, лимитирующим активность данного пути, является ген PTEN, ключевой ген супрессор опухолевого роста. Делеции или инактивирующие мутации в гене PTEN приводят к усилению экспрессии гена PI3KCA, что активирует сигнальный путь PI3K/Akt/mTOR. Инактивация гена PTEN является маркером неблагоприятного прогноза для пациентов с НМРЛ (Carnero A., 2008). В настоящее время проходят несколько клинических испытаний препаратов, ингибирующих сигнальный путь PI3K/Akt/mTOR. Эверолимус, представлющий собой ингибитор mTOR, показал высокую активность при метастатическом НМРЛ. В последнее время все больше внимания уделяется гену ALK, кодирующему одноименную тирозиновую киназу, экспрессия которой в норме характерна для клеток центральной нервной системы, тонкого кишечника и яичек (Pulford K., 2004). Активирующие мутации или транслокации/химерные гены гена ALK определены в нескольких онкологических нозологиях, включая анапластическую крупноклеточную лимфому, нейроблатому, воспалительные миофибробластические опухоли, НМРЛ (George R.E., 2008; Mossé Y.P.,2008). Этот ген может образовывать химерные гены с: EML4, RANPB2, ATIC, TFG, NPM1, SQSTM1, KIF5B, CLTC, TPM4, MSN (Husain H., 2011). 5-13% случаев аденокарцином легкого имеют транслокацию и/или химерный ген EML4-ALK. Данный химерный ген образуется при инверсии в коротком плече 2 хромосомы, которая соединяет экзоны 1-14 гена EML4 с экзонами 20-29 гена ALK (Kim L.C., 2009). Это приводит к постоянной активации сигнального пути ALK, который в итоге активирует ключевые регуляторы клеточного деления, такие как MAPкиназу и PI3K. Несмотря на то, что описанные эффекты являются фенотипически сходными с мутациями EGFR, мутации ALK практически никогда не сочетаются с мутациями EGFR и KRAS и характерны для пациентов молодого возраста и для некурящих. Доклинические исследования показали, что клетки, дефектные по гену ALK, являются очень чувствительными ингибиторами ALK (Soda M., 2007). к блокаде данного гена 22 Первым описанным ингибитором ALK является кризотиниб. Этот препарат показал крайне высокую эффективность на первой фазе клинических испытаний. Положительный ответ на лечение кризотинибом составил 57%, а 6-месячная выживаемость без прогрессирования заболевания – 72%. Полученные результаты позволили сразу перейти к третьей фазе клинических испытаний (McDermott U., 2008). В настоящее время пациентам с НМРЛ, имеющим транслокацию гена ALK, показана терапия ингибиторами ALK (FDA, 2011). ROS1 – интегральный мембранный белок I типа, кодируемый геном ROS1, обладающий тирозинкиназной активностью. Недавние исследования выявили наличие транслокации гена ROS1, а также некоторые химерные варианты этого гена в НМРЛ. Частота этих изменений невелика и составляет 1,5-2%, однако, показано, что данные изменения характерны для аденокарцином, относительно молодых пациентов и некурящих (Bergethon K., 2012; Davies K.D., 2012; Rimkunas V.M., 2012). Опухоли, имеющие транслокации и/или химерные варианты гена ROS1, хорошо реагируют на применение ингибиторов ALK (кризотиниб) (Aisner D.L., 2012). c-Met – протоонкоген, который кодирует белок MET, также известный как рецептор фактора роста гепатоцитов (HGFR), обладающий тирозинкиназной активностью. Активация MET при НМРЛ коррелирует с неблагоприятным прогнозом: активным опухолевым ростом и ангиогенезом, метастазированием. Амплификация c-MET встречается у 20–22% пациентов, получавших таргетную терапию, и всего лишь у 3% пациентов, не получавших лечение. Амплификация и экспрессия этого гена вызывает резистентность к низкомолекулярным ингибиторам EGFR. Резистентность развивается с помощью Her3-опосредованной активации сигнального пути PI3K-Akt (Engelman J.A.,2007; Bean J., 2007). FGFR1 – тирозинкиназный рецептор, лиганды которого являются членами семейства факторов роста фибробластов. Согласно исследованию Weiss J. и соавт., амплификация гена FGFR1 обнаружена примерно в 20% плоскоклеточных раков легкого и не характерна для других гистологических типов НМРЛ (Weiss J., 2010). 23 HER2 (ErbB-2) — мембранный белок, тирозиновая протеинкиназа семейства рецепторов ErbB. Известно, что амплификация гена Her2 (ERBB2) характерна для инвазивного рака молочной железы. Однако, рядом исследований показано, что амплификация этого гена также встречается в небольшом проценте НМРЛ (4%) (Ramieri M.T., 2010; Junker K., 2005). Согласно данным других исследований, примерно в 3% НМРЛ обнаружены мутации в 18-21 экзонах гена HER2, характерные для женщин, некурящих и аденокарцином легкого (Li C., 2012; Tomizawa K., 2011; Shigematsu H., 2005). При проведении исследования мутаций гена HER2 на специальной выборке (некурящие пациенты с аденокарциномой и аденоплоскоклеточным раком легкого, диким типом гена EGFR) количество пациентов с мутациями возрастало до 14% (Tomizawa K., 2011). В настоящее время активно изучается применение анти-HER2-терапии для пациентов с НМРЛ. Представленные структурные изменения позволяют понять, что в НМРЛ происходят многочисленные мутационные события, затрагивающие различные участки генома, и оценить возможность использования молекулярно- генетических изменений в НМРЛ для назначения соответствующей таргетной терапии и определения прогноза заболевания. Так, к примеру, определение мутаций в гене EGFR показано при назначении таргетной терапии ингибиторами EGFR, наличие транслокации EML4-ALK ассоциировано с чувствительностью к терапии кризотинибом (табл. 3). 1.2.2 Эпигенетические изменения. Опухоли традиционно рассматриваются как заболевания, в основе которых лежит нарушение генетического аппарата. Однако в последнее время все более очевидным становится то, что в процессе канцерогенеза важную роль также играют эпигенетические изменения (Van Den Broeck A., 2009). К эпигенетическим изменениям относят все нарушения, которые не связаны с изменениями структуры ДНК, но приводят к изменениям уровня экспрессии генов. Эти изменения включают метилирование регуляторных районов генов (промоторов), изменения в структуре хроматина, РНК-интерференцию, варианты 24 альтернативного сплайсинга, изменение уровня экспрессии микроРНК (Залетаев Д.В., 2009). Таблица 3. Мутации в генах при НМРЛ, обуславливающие чувствительность к таргетным препаратам (Black A., 2012; Vadakara J., 2012). Генетическая характеристика опухоли Механизм действия Название препарата Гефитиниб Эрлотиниб Мутации в гене EGFR Ингибиторы EGFR Ингибиторы MEK Мутации в гене KRAS Мутации в гене BRAF Мутации в генах KRAS, NRAS, BRAF, MEK1 Транслокация/ химерный ген EML4/ALK Афатиниб PF 0299804 (дакомитиниб) СО-1686 AZD6244/ Селуметиниб GSK 1120212 Ингибиторы c-MET ARQ 197 Ингибиторы m-TOR IPI-504 + эверолимус Ридафоролимус Ингибиторы Bcr/Abl/ Src Ингибиторы MEK Ингибиторы MEK m-TOR+ PI3K ингибиторы Ингибиторы PI3K Ингибиторы ALK Метилирование ДНК Клиническое исследование IPASS, NEJSG 002, WJTOG3405, NCT01203917, NCT01530334. OPTIMAL, EURTAC, NCT01487265 (+BKM120), NCT01221077 (+ OSI-906), NCT00977470. NCT00525148, NCT0071159, NCT00993499 (+ сиролимус) NCT01000025 NCT01526928 NCT01229150, NCT00890825, NCT01239290 NCT01362296, NCT00687622 NCT01395758 NCT01427946 NCT00818675 Дасатиниб NCT00888134 AZD6244/ Селуметиниб NCT01514864 MEK162 NCT01337765, NCT01449058, NCT01363232, NCT00959127 GSK 2118436 NCT01362296 BEZ235 NCT01337765 BYL719 BKM120 LDK378 IPI-504 HSP 90 AP26113 Кризотиниб NCT01449058 представляет NCT01363232 NCT01283516 NCT01228435 NCT01449461 NCT00932893 собой процесс присоединения метильной группы к кольцу цитозина, предшествующего гуанину (CpG- 25 динуклеотид), чтобы сформировать 5ʹ′-метилцитозин. Большое количество CpGдинуклетидов содержится в промоторах многих генов, и увеличение метилирования в этих регионах часто связывают с подавлением активности гена (Leonhardt H., 2000). Однако вклад метилирования ДНК в канцерогенез не только эпигенетический, 5ʹ′-метилцитозин нестабилен и может подвергаться спонтанному дезаминированию, в результате чего образуется тимин (около 30% точковых мутаций), который не распознается системами репарации, что приводит к транзиции и последующему изменению строения и функции белка (Singal et al., 1999; Кекеева Т.В., 2008). Эти нарушения, по-видимому, вносят существенный вклад в создание генетической нестабильности генома опухолевой клетки. 1.2.2.1 Аномальное метилирование промоторов генов. Наиболее изученным из эпигенетических изменений в контексте онкологических заболеваний является гиперметилирование промоторов геновсупрессоров опухолевого роста. Нарушения метилирования являются ключевым механизмом увеличения или уменьшения экспрессии генов при НМРЛ. Аномальное метилирование промоторов генов-супрессоров опухолевого роста можно рассматривать как один из функциональных маркёров канцерогенеза или как проявление процесса злокачественного перерождения опухоли (Залетаев Д.В., 2009). Для анализа аномального метилирования промоторов генов применяют метил-чувствительную ПЦР (МЧ-ПЦР) или метил-специфическую ПЦР (МСПЦР). Для подтверждения метилирования, проводят бисульфитное секвенирование (Залетаев Д.В., 2009). Многочисленными исследованиями показано, что аберрантное метилирование генов, участвующих в основных молекулярно-биологических клеточных процессах, таких как регуляция клеточного цикла, пролиферация, апоптоз, адгезия, подвижность и репарация ДНК. Примерами генов, метилирование которых характерно для НМРЛ, являются p16, RASSF1A, APC, RARb-2, CDH1, CDH13, DAPK, MGMT, ASC/TMS1, FHIT, hSRBC, TSLC1, DAL-1 и 26 PTEN (Heller G., 2010; Leonhardt H., 2000; Baylin S.B., 2000; Wen J., 2011). Наряду с генетическими механизмами, аномальное метилирование ДНК обеспечивает ещё один механизм инактивации генов-супрессоров опухолевого роста, что приводит к возникновению и прогрессированию рака легкого. В работе исследователей из Китая по анализу эпигенетических нарушений в НМРЛ выявлено гиперметилирование промоторов генов CALCA, CDH1, DAPK1, IRX2, TIMP3, PAX6. Изменения в каждом из этих генов ассоциированы с такими клинико-морфологическими параметрами как: гистологический тип опухоли, стадия заболевания, наличие метастазов, инвазивный рост опухоли и курение (Ji M., 2011). Показано, что в НМРЛ (аденокарциномах и плоскоклеточных раках) частота метилирования промоторов генов p16, MGMT, RASSF1, MTHFR и FHIT выше у курильщиков (Buckingham L., 2010; Vaissiere T., 2009), а метилирование промоторов генов RASSF2, TNFRSF10C, BHLHB5 и BOLL чаще встречается у некурящих пациентов (Tessema M., 2009). Метилирование генов RASSF1A, APC, ESR1, ABCB1, MT1G и HOXC9 ассоциировано с I стадией опухолевого процесса, а эпигенетические изменения генов hDAB2IP, H-cadherin, DAL-1 и FBN2 характерны для III-IV стадии рака легкого (Lin Q., 2009; Chen H., 2005). В другой работе (Begum S., 2011) проводился сравнительный анализ частоты эпигенетических изменений панели генов: APC, CDH1, MGMT, DCC, RASSF1A, AIM в сыворотке крови 76 пациентов с НМРЛ и контрольной группе из 30 здоровых (без онкологии) доноров. В результате проведенной работы американские ученые показали, что метилирование промотора хотя бы одного из 6 генов в панели выявлено в 84% случаев НМРЛ. Ген DCC имел 100%-ную чувствительность для НМРЛ (Begum S., 2011). Данное исследование показывает, что большое количество генов характеризуется аномальным метилированием в НМРЛ и ассоциировано с клиническими параметрами пациентов. 27 1.2.2.2 МикроРНК. МикроРНК (miRNA) — класс не кодирующих одноцепочечных РНК, имеющих длину около 22 нуклеотидов. Эти РНК играют важную роль в регуляции трансляции и деградации матричной РНК (мРНК). Регуляция осуществляется путем комплементарного связывания микроРНК с частично комплементарными сайтами в нетранслируемых участках мРНК («мишенями»). МикроРНК тканеспецифичны и играют важную роль в процессах развития и дифференцировки тканей и органов. Показано, что при различных заболеваниях, в том числе онкологических, происходят изменения уровня экспрессии микроРНК (Bartel D.P., 2004). Из-за их фундаментальной роли в развитии и дифференцировке клеток, их причастности к биологическим механизмам, лежащим в основе канцерогенеза, а также их простого строения, стабильности и доступности обнаружения, они представляют собой многообещающий класс биомаркеров рака [Lin P-Y., 2010]. Различные предиктивными уровни и экспрессии прогностическими микроРНК маркерами в и НМРЛ могут специфичными быть для определенного гистологического типа НМРЛ. Например, такие микроРНК, как miR-126, miR-31, miR-519c, Let-7a, miR-133B, miR-15a, miR-16 и miR-183, участвуют с регуляции пролиферации, миграции и инвазии клеток при НМРЛ, воздействуя на специфические «мишени»: Crk, EGFL7, VEGF, LATS2, PPP2R2A, HIF-1a, NIRF, MCL-1, BCL2L2, циклины D1, D2, E1 и Ezrin (Wen J., 2010; Liu B., 2009; Liu X., 2010; Cha S.T., 2010; He X., 2009; Crawford M., 2009; Sun Y., 2010; Bandi N., 2009). Выявлено, что экспрессия микроРНК Has-miR-205 является специфическим маркером плоскоклеточного рака легкого (Bishop J.A., 2010; Lebanony D., 2009). Считается, что гиперэкспрессия miR-21, miR-146b, miR-155 в опухоли является неблагоприятным прогностическим маркером, ассоциированным с низкой выживаемостью пациентов с НМРЛ (Markou A., 2008; Raponi M., 2009; Yanaihara N., 2006). Другие исследования показали, что снижение уровня экспрессии let-7 и miR-34 и гиперэкспрессия miR-221, miR-137, 28 miR-372 и miR-182* ассоциированы с рецидивом заболевания у пациентов с НМРЛ (Takamizawa J., 2004; Gallardo E., 2009; Yu S.L., 2008). В 2008 году Mitchell P.S. и соавт. показали, что циркулирующие в крови микроРНК являются стабильными маркерами рака (Mitchell P.S., 2008). Выявлено наличие микроРНК в образцах плазмы и сыворотки крови и показано, что эти молекулы довольно стабильны, даже при многократном замораживании и размораживании. Циркулирующие микроРНК могут быть перспективными маркерами рака, что подтверждается большим количеством исследований в этом направлении. В процессе формирования опухоли происходит отклонение клетки от обычного пути морфофункционального развития. В ходе канцерогенеза, клетки приобретают новые морфологические и биологические свойства, не присущие им при нормальном развитии. Для определения степени злокачественности опухоли и прогноза течения заболевания важное значение имеют не только признаки клеточной патологии (катаплазии), но и состояние клеточных и внеклеточных компонентов стромы, лимфоидная инфильтрация и многие другие морфологические характеристики, дающие оценку не только непосредственно опухолевой ткани, но и окружающим её тканям. Все эти патоморфологические изменения, как правило, располагающиеся вокруг опухоли, объединяют термином «опухолевое поле». Существуют различные теории «опухолевого поля» (Slaughter D., 1953; Willis R.A., 1953, 1967). Точное знание границ морфологических и молекулярно-генетических изменений в смежной с опухолью условно нормальной ткани позволит правильно определить истинные размеры «опухолевого поля» в каждом конкретном случае. В настоящее время, исследования в области молекулярной биологии НМРЛ позволяют понять и оценить возможности применения существующих генетических нарушений в клинической практике. К примеру, разработка тестсистем на основе молекулярно-генетических маркеров позволит улучшить раннюю диагностику и обеспечить более точный прогноз заболевания у пациентов с НМРЛ. 29 Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ. Данная работа включала в себя анализ аллельного дисбаланса, структурных нарушений генов (мутации, транслокации) и эпигенетических нарушений (аномальное метилирование промоторов генов, изменение уровней экспрессии микроРНК), которые проводились по следующим схемам. Рисунок 3. Анализ аллельного дисбаланса исследуемых локусов. Рисунок 4. Анализ аберрантного метилирования промоторов генов. Рисунок 5. Анализ экспрессии микроРНК. 30 Рисунок 6. Анализ мутаций гена EGFR. Рисунок 7. Анализ мутаций гена KRAS. Рисунок 8. Определение транслокации гена ALK. 2.1. Клинический материал. Материалом для исследования послужили образцы опухоли и образцы смежной условно нормальной ткани (парафиновые блоки) 216 пациентов с диагнозом немелкоклеточный рак легкого, прооперированных в ФГБУ «МНИОИ им. П.А. Герцена» в период с 2011 по 2013 годы. Гистологическую идентификацию тканей проводили в патологоанатомическом отделении «Московского научно-исследовательского онкологического института им. П.А. 31 Герцена». Из 216 наблюдений основными гистологическими типами оказались аденокарцинома – 147 больных, плоскоклеточный рак – 48 пациентов. Из 216 пациентов у 108 получено по 3 образца ткани: опухолевая, смежная с опухолью условно нормальная ткань на расстоянии 2 см от опухоли, смежная с опухолью условно нормальная ткань на расстоянии 5 см от опухоли. У двух пациентов получены образцы опухолевой ткани и смежной с опухолью условно нормальной ткани на расстоянии 2 см. Из 216 наблюдений у 106 пациентов получены только образцы опухолевой ткани. Всего проанализировано 434 образца ДНК. Средний возраст пациентов составил 61 год. Клинические характеристики пациентов приведены в табл. 4. 2.2. Выделение геномной ДНК. Выделение ДНК проводили из операционного материала, фиксированного в формалине с последующей парафинизацией (парафиновые блоки), путем абсорбции на сорбенте по протоколам коммерческого набора «ДНК-сорб-В», РФ. Выделения ДНК из малых количеств операционного и биопсийного материала, фиксированного в формалине с последующей парафинизацией, проводили с помощью колонок с абсорбирующей мембраной по протоколам коммерческого набора «QIAamp DNA FFPE Tissue Kit» («QIAGEN», Германия). 2.3. Выделение микроРНК из парафиновых блоков. Выделение микроРНК проводили из операционного материала (парафиновых блоков) с помощью колонок с абсорбирующей мембраной по протоколам коммерческого набора «miRNeasy FFPE Kit » фирмы «QIAGEN», Германия. Особенность колонок для выделения микроРНК состоит в диаметре пор абсорбирующей мембраны, которые задерживают на своей поверхности молекулы размером от 18 нуклеотидов, что позволяет выделить тотальную РНК, включая микроРНК. 2.4. Бисульфитная модификация ДНК. Бисульфитная модификация ДНК (с помощью бисульфита Na) – химический процесс превращения неметилированных остатков цитозина в урацил 32 (при этом не происходит превращения метилированных цитозинов), позволяющий анализировать аберрантное метилирование CpG-динуклеотидов. Таблица 4. Клинико-морфологические характеристики пациентов исследования. Клиническо-морфологические характеристики пациентов Критерии Nобщ = 216 < 61 лет 102 По возрасту ≥ 61 лет 114 Средний возраст 61 мужчины женщины Центральный По локализации Периферический не известно I II По стадии III IV не установлена АК ПКРЛ По гистологии АПКРЛ Другие(КРЛ, МЭ) высокодифференцированный умереннодифференцированный По степени дифференцировки низкодифференцированный не установлена Да Нет Курение не известно По полу % 47 53 181 35 86 123 6 45 67 63 16 25 147 48 17 4 26 89 86 15 127 67 22 84 16 40 57 3 21 31 29 7 12 68 22 8 2 12 41 40 7 59 31 10 АК - аденокарцинома; ПКРЛ - плоскоклеточный рак; АПКРЛ аденоплоскоклеточный рак; КРЛ - крупноклеточный рак легкого ( нейроэндокринный вариант исключен); МЭ - мукоэпидермоидный рак; I, II, III, IV - стадии по TNM. ДНК, полученная из парафиновых блоков, сильно фрагментирована и ее концентрация меньше концентрации ДНК, полученной из нефиксированных тканей или периферической венозной крови. Бисульфитная модификация ДНК 33 (бисульфитом Na) – процесс, во время которого происходят потери большого количества генетического материала. Бисульфитную модификацию ДНК проводили по протоколам набора «EpiTect Bisulfite FFPE Kit» фирмы «QIAGEN», Германия, предназначенного для бисульфитной модификации ДНК, полученной из парафиновых блоков. 2.5. Микросателлитный анализ. Для оценки частоты генетических изменений в образцах опухолевой ткани, смежной с ней нормальной ткани на расстоянии 2 см и 5 см и их сравнения выбраны хромосомные районы 2p23.3, 2q35, 3p14.2, 3p22.2, 3p26.3, 9p22.1, 17p13.3, как наиболее часто повреждаемые при НМРЛ. Для идентификации ПГ и МН в исследуемых регионах использованы 7 высокополиморфных микросателлитных маркёров. Нуклеотидные последовательности и условия работы праймеров приведены в табл. 5. В качестве контроля использовали ДНК лейкоцитов периферической крови. ПЦР проводили по следующей схеме: к 0,1 мкг геномной ДНК добавляли 50-100 мкМ каждого олигопраймера, 200 мкМ каждого дезоксинуклеотидтрифосфата, 1-2 ед. Taqполимеразы, 5 мкл однократного буфера для ПЦР следующего состава: 50 мМ KCl, 10 мМ Трис-HCl (pH 8,4), 5 мМ MgCl2. Затем добавляли 40-60 мкл вазелинового масла, прогревали смесь при 94˚С в течение 10 мин и проводили 35 циклов по следующей программе: - денатурация при 94˚С – 40 с - отжиг при 59 - 61˚С – 1 мин - элонгация при 72˚С – 30 с Продукты разделяли в 6%-ном денатурирующем ПААГ и окрашивали нитратом серебра. ПГ оценивали как ослабление или отсутствие полосы одного из аллелей относительно дополнительной полосы. нормальной ткани, на МН указывало появление 34 Таблица 5. Нуклеотидные последовательности праймеров для микроса- теллитного анализа. Маркер Локализация D2S405 2p23.3 D2S164 2q35 D3S1300 3p14.2 D3S1768 3p22.2 D3S1539 3p26.3 D9S925 9p22.1 D17S938 17p13.3 Нуклеотидная последовательность Температура отжига, С Размер продукта, п.н. 61 219 61 173 60 153 60 200 59 188 61 197 61 218 F: atcaatcacagggcagaagc R: atctggtccctcccatgac F: aggtcctaacaggccacaga R: catatccatgtcttcccataggt F: gccctcagagagctcacatt R: aaaattgcacccctaccaca F: tgcatatttgtgctggttgc R: ccactgtgatttgctgttgg F: ttccatctctccctctcttca R: tgaagctgtttaaaactatttctcca F: gtctgggttctccaaagaaa R: tgtgagccaaggccttatag F: taggctgcagtgagctgaga R: ctgaaggatggactggggta 2.6. Фрагментный анализ. Анализ мутаций количественного 19 экзона гена флуоресцентного EGFR проводили капиллярного с помощью денатурирующего электрофореза на генетическом анализаторе Genetic Analyzer 3500xl («Applied Biosystems», США). Продукты идентификацией ПЦР, объём электрофорезом которых в 8% предварительно ПААГ, смешивали установлен с 0,5 мкл флуоресцентного маркёра LIZ-500 и 11 мкл HI-DI формамида («Applied Biosystems», США). Вносили полученную смесь в соответствующие лунки в плашке аппарата. Денатурировали в течение 2 минут при температуре 98˚С с последующим охлаждением до +4 0 С. Плашку помещали в генетический анализатор. Полученные данные анализировали в программе GeneMapper v.4.1. Результаты представлены графиками. 2.7. Рестрикционный анализ. Для выявления метилированных CpG-островков в промоторах исследуемых генов последовательно применяли рестрикционный анализ и метил- 35 чувствительную полимеразную цепную реакцию (МЧ-ПЦР). Рестрикционный анализ проводили следующим образом: ДНК обрабатывали метил- чувствительной рестриктазой HpaII фирмы «Cибэнзим», РФ, по следующей схеме: к 1500 нг (8 мкл) геномной ДНК добавляли 3 е.а. (1 мкл) фермента и 2 мкл соответствующего 10-кратного буфера, доводили до 20 мкл дист. водой и инкубировали в течение 10-12 часов в термостате при температуре 37˚С. Рестриктазу HpaII использовали для анализа метилирования промоторов всех исследуемых генов. 2.8. Метил-чувствительная полимеразная цепная реакция (МЧ-ПЦР). Метод основан на способности метил-чувствительных рестриктаз гидролизовать ДНК, не содержащую модифицированных оснований, и оставлять негидролизованными участки, содержащие метилцитозин. При проведении МЧ-ПЦР учитывалось наличие внутренних сайтов узнавания для используемой рестриктазы в амплифицируемом участке, который содержал не менее 3-4 сайтов узнавания для рестриктазы HpaII. В случае модификации цитозинов в метил-цитозин гидролиз ДНК не происходит и продукт ПЦР может быть выявлен в геле. При отсутствии метилирования ДНК полностью гидролизуется и продукт ПЦР не определяется. Для исключения возможной гомозиготной делеции исследуемых генов МЧ-ПЦР проводилась на парных образцах: гидролизованная и негидролизованная ДНК. ПЦР проводили при помощи программируемого термоциклера «Терцик» фирмы «ДНК-технология», РФ, с использованием термофильной ДНК-полимеразы фирмы «СибЭнзим», РФ, по следующей схеме: к 0,1 мкг геномной ДНК добавляли 20-170 мкМ каждого олигопраймера, 200 мкМ каждого дезоксинуклеотидтрифосфата, 1-2 единицы термофильной ДНК-полимеразы, 5 мкл однократного буфера для ПЦР следующего состава: 50 мМ KCl, 10 мМ трис-HCl pH 8.4. Оптимальное содержание МgСl2 в буфере подбирали экспериментальным путем для каждой пары используемых праймеров. Затем добавляли 40-60 мкл вазелинового масла, прогревали смесь при 94˚С в течение 10 мин. и проводили 35 циклов с параметрами: 36 - денатурация при 94˚С – 40 с - отжиг при 60 - 64˚С – 40 с - элонгация при 72˚С – 30 с Финальную инкубацию проводили при 72˚С в течение 10 мин. Нуклеотидные последовательности и условия работы праймеров указаны в табл. 6. В качестве внутреннего контроля ПЦР выбран фрагмент гена с-KIT, не содержащий сайтов узнавания для используемой рестриктазы. Метилирование оценивалось как наличие полосы на электрофореграмме в образце после рестрикции, соответствующей по длине исследуемому гену в образце без рестрикции. Анализ статуса аномального метилирования промоторов генов RASSF1A и FHIT проводили с помощью мультиплексной МЧ-ПЦР. Таблица 6. Нуклеотидные последовательности праймеров для МЧ-ПЦР. Ген Локализация RASSF1A 3p21.3 FHIT 3p14.2 DAPK1 9q21.33 CDH1 16q22.1 CD44 11p13 TIMP3 22q12.3 MGMT 10q26.3 Нуклеотидная последовательность Размер Температура продукта, отжига, 0С п.н. F: acctcaagatcacggtccag R: ccttccttccctccttcgt F: cacaggactttttgccctct R: cggaagagtactcgggacag F: cgcttgcagggtccccattg R: ttccctccgccttggccttc F: ccctttctgatcccaggtct R: tcacaggtgctttgcagttc F: actgcaagatcacggtccag R: ggccctccgccttggccttc F: agacgagccggggcacgag R: ggcggccgagtgatatag F: tgccggcgtccagcgaggatg R: aggcgacccagacactcacca 60 325 60 273 60 440 64 312 60 240 63 281 60 315 2.9. Метил-специфическая ПЦР ( МС-ПЦР). Для подтверждения метилирования CpG-островков промоторов исследуемых генов (адекватной оценки результатов и условий проведения МЧПЦР) проводили метил-специфическую ПЦР с последующим секвенированием на 37 примере гена CDH1. ПЦР проводили по следующей схеме: к 0,1 мкг геномной ДНК добавляли 70 мкМ каждого олигопраймера, 100 мкМ каждого дезоксинуклеотидтрифосфата, 4 мМ MgCl2, 5 мкл однократного буфера для ПЦР следующего состава: 50 мМ KCl, 10 мМ трис-HCl pH 8,4. Затем добавляли 40-60 мкл вазелинового масла, прогревали смесь при 98˚С в течение 10 мин, затем в каждую пробирку вносили 1-2 единицы термофильной ДНК-полимеразы и проводили 35 циклов с параметрами: - денатурация при 94˚С – 40 с - отжиг при 58˚С – 40 с - элонгация при 72˚С – 40 с Финальную инкубацию проводили при 72˚С в течение 10 мин. Нуклеотидные последовательности и условия работы праймеров указаны в табл. 7. Продукты МС-ПЦР детектировали в 8% ПААГ с последующим окрашиванием нитратом серебра. Таблица 7. Нуклеотидные последовательности праймеров для бисульфитного секвенирования. Ген CDH1 Нуклеотидная последовательность F: tttagtaattttaggttagagggttat R: aaactcacaaatactttacaattcc Температура отжига, 0С 58 Размер продукта, п.н. 221 2.10. Полимеразная цепная реакция (ПЦР). Определение мутаций генов EGFR и KRAS проводили с помощью ПЦР с последующим секвенированием. ПЦР проводили по следующей схеме: к 0,1 мкг геномной ДНК добавляли 65-100 мкМ каждого олигопраймера, 200 мкМ каждого дезоксинуклеотидтрифосфата, 1-2 ед. Taq-полимеразы, 5 мМ MgCl2, 5 мкл однократного буфера для ПЦР следующего состава: 50 мМ KCl, 10 мМ Трис-HCl (pH 8,4). Затем добавляли 40-60 мкл вазелинового масла, прогревали смесь при 94˚С в течение 10 мин и проводили 35 циклов по следующей программе: - денатурация при 94˚С – 40 с - отжиг при 60-62 ˚С – 40 с 38 - элонгация при 72˚С – 30 с Финальную инкубацию проводили при 72˚С в течение 10 мин. Нуклеотидные последовательности и условия работы праймеров указаны в табл. 8. Продукты разделяли в 8%-ном денатурирующем ПААГ и окрашивали нитратом серебра. Хранение продуктов ПЦР для последующего анализа осуществлялось на +4 0С. Таблица 8. Нуклеотидные последовательности праймеров для определения мутаций в генах. Ген EGFR 21 экз EGFR 19 экз EGFR 19-Fam KRAS Нуклеотидная Температура последовательность отжига, 0С F agccataagtcctcgacgtg 61 R cctggtgtcaggaaaatgct F ccccagcaatatcagcctta 60 R cagctgccagacatgagaaa F catgtggcaccatctcaca 62 R FAM-cagctgccagacatgagaaa F gagtttgtattaaaaggtactggtgga 61 R tcatgaaaatggtcagagaaacc Размер продукта, п.н. 320 324 227 280 2.11. Обратная транскрипция. Обратная транскрипция микроРНК проводилась c помощью полиаденилирования 3'-конца микроРНК и последующим праймированием олигоdT праймерами, которые на своем 3'-конце имеют дегенеративный анкер, а на 5'конце универсальную концевую последовательность, по протоколам коммерческого набора «miScript II RT Kit» фирмы «QIAGEN», Германия, в термоциклере Veriti 96-Well Thermal Cycler фирмы «Applied Biosystems», США, по программе: - 37 0С – 60 мин - 95 0С – 5 мин По окончании реакции обратной транскрипции полученные кДНК незамедлительно анализировали. В случаях, когда проведение оказывалось невозможным, кДНК хранили при температуре -20 оС. анализа 39 2.12. ПЦР в режиме реального времени (Real time-ПЦР). Real time-ПЦР – это полимеразная цепная реакция с одновременной амплификацией, детекцией и количественным измерением определённой последовательности ДНК в образце в реальном времени после каждого цикла амплификации с построением кинетической кривой. 2.12.1 Real time-ПЦР для определения мутаций гена EGFR. Определение мутаций гена EGFR проводили помощью 2 технологий: аллель-специфической ПЦР и детекции амплификации с помощью молекул Scorpions по протоколам коммерческого набора «Therascreen EGFR RGQ PCR Kit» на приборе Rotor-Gene Q 5plex HRM («QIAGEN», Германия). Scorpions – это бифункциональные молекулы, состоящие из ПЦР праймера, связанного с пробой c флуорохромом и гасителем флуоресценции. В ходе амплификации происходит отделение флуорохрома от гасителя и детектируется амплификация. Рисунок 9. Молекула Scorpions и механизм работы. Примечание: brown.aspx. рисунок с ресурса http://research.chem.ox.ac.uk/professor-tom- 40 2.12.2 Real time-ПЦР для определения уровня экспрессии микроРНК. Определение экспрессии «зрелых» микроРНК проводили по технологии SYBR Green с помощью микроРНК специфичных праймеров «miScript Primer Assay» (табл. 9) по протоколам коммерческого набора «miScript SYBR Green PCR Kit» на приборе Rotor-Gene Q 5plex HRM («QIAGEN», Германия). SYBR Green – представляет собой интеркалирующий (встраивающийся в молекулу ДНК между двух пар оснований) флуоресцентный краситель. По флуоресценции этого красителя детектируется амплификация продукта. Таблица 9. Нуклеотидные последовательности праймеров для определения уровня экспрессии микроРНК. МикроРНК Hs_miR-155 Hs_miR-205 Hs_let-7a Нуклеотидная последовательность 5'-cuccuacauauuagcauuaaca 5'-gauuucaguggagugaaguuc 5'-cuauacaaucuacugucuuuc 2.13. Секвенирование. Продукты идентификацией ПЦР, объём которых предварительно установлен электрофорезом в 8% ПААГ, смешивали с 0,5 мкл одного олигопраймера с концентрацией 10 ЕД/мл и дистиллированной водой. Общий объем пробы не превышал 6 мкл. Далее проводили секвенирование на приборе Genetic Analyzer 3500xl «Applied Biosystems», США, по протоколам фирмы производителя. 2.14. Электрофорез в ПААГ. Электрофорез продуктов ПЦР, МЧ-ПЦР проводили в 8% ПААГ при 20-25˚С в течение 40- 60 минут и в 6% денатурирующем ПААГ в течении 2-4 часов. Состав 8% ПААГ: 7,25 мл 40% раствора АА (39:1), 1,7 мл 10х буфера ТВЕ, 25,5 мл дистилированной воды, 685 мкл 10% аммония персульфата (APS), 41 28 мкл ТЕМЕД. Состав 6% денатурирующего ПААГ: 6,77 мл 40% раствора АА (39:1), 2,25 мл 10х буфера ТВЕ, 12 мл дистилированной воды, 900 мкл 10% аммония персульфата (APS), 18,5 г мочевины, 10 мл формамида, 40 мкл ТЕМЕД. Визуальный ксиленцианола и контроль пробега бромфенолового ампликонов синего. Для проводили по смеси денатурирующего ПААГ использовалась денатурирующая смесь красок: 940 мкл формамида и по 30 мкл 10% ксиленцианола и бромфенолового синего. Для сохранения результатов ПААГ проводили сканирование гелей. 2.15. Ультратонкое окрашивание нитратом серебра. После электрофореза гель помещали в раствор 0,011 М AgNO3 и инкубировали в течение 7-15 минут, после чего дважды промывали в дистиллированной воде. Проявление проводили в модифицированном растворе проявителя (увеличена концентрация НСНО) следующего состава: 0,75 M NaOH; 0,5 M HCHO; доводили до 1 л дистиллированной водой, Гель в растворе проявителя инкубировали около 10-15 минут в зависимости от интенсивности проявления геля. 2.16. Флуоресцентная гибридизация in situ (FISH). Флуоресцентная гибридизация in situ (FISH) – это технология, позволяющая выявлять специфические нуклеотидные последовательности непосредственно в клетках на гистологических препаратах с сохранением морфологии ткани (Пальцев М., 2010) путем гибридизации меченого флуоресцентной меткой зонда с комплементарным участком на конкретной хромосоме. 42 FISH исследование транслокации гена ALK проводили по протоколам коммерческого набора «Vysis LSI ALK Dual Color Break Apart FISH Probe» фирмы «Abbot Molecular», США. 2.17. Программное обеспечение. Компьютерный анализ ДНК проводился с использованием следующих программ: 1) поиск полноразмерной нуклеотидной последовательности генов и микроРНК – по базам данных UCSC database, PUB MED; Ensemble Genome Browser, miRBase, microRNA.org; 2) анализ ДНК на наличие сайтов ферментов рестрикции – при помощи программ Genebank Pustell; 3) компьютерное конструирование олигонуклеотидных праймеров и подбор условий для проведения ПЦР – с использованием программы Primer Inrut (version 0.4.0) и Primer Design and Search Tool; MethPrimer; 4) анализ хроматограмм секвенированных последовательностей проводился с помощью программ Chromas, Finch TV, 4 Peaks. 2.18. Статистическая обработка данных. Статистическую обработку данных проводили при помощи программ Graph Pad Instat Version 3.1a и Microsoft Excel. Для выявления статистически достоверных ассоциаций между полученными молекулярно-генетическими изменениями и клинико-морфологическими параметрами пациентов, последних делили на группы по возрасту, полу, локализации опухоли, стадии опухолевого процесса, статусу курения, гистологическому типу, степени дифференцировки. В выделенных группах сравнивали частоты генетических и эпигенетических изменений по каждому гену и локусу с помощью двустороннего варианта точного критерия Фишера. Статистическую обработку данных об экспрессии микроРНК проводили с помощью одноконцевого парного и непарного теста Стьюдента. 43 Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ. 3.1. Аллельные нарушения при НМРЛ. Анализ семи микросателлитных повторов, расположенных в наиболее часто повреждаемых при НМРЛ локусах: 2p23.3, 2q35, 3p14.2, 3p22.2, 3p26.3, 9p22.1, 17p13.3 проводили на генетическом материале, полученном из опухолевой и смежной условно нормальной ткани на расстоянии 2 и 5 см от опухоли. Частоты аллельных нарушений в опухолевой ткани у пациентов с НМРЛ составили 47% для локуса 2p23.3, 43% для локуса 2q35, 60% для локуса 3p14.2, 52% для локуса 3p22.2, 52% для локуса 3p26.3, 47% для региона 9p22.1, 49% для региона 17p13.3 (Шикеева А.А, 2013). Итоговые частоты аллельных изменений приведены в табл. 10. В ходе нашей работы выявлено, что у 102 из 110 пациентов с НМРЛ (93%) обнаружена ПГ и/или МН, по крайней мере, по одному из маркёров. Электрофореграммы, демонстрирующие ПГ и МН исследуемых маркеров, показаны на рис. 10, 11. Таблица 10. Частоты аллельных нарушений в НМРЛ. Маркер D2S405 D2S164 D3S1300 D3S1768 D3S1539 D9S925 D17S938 Локализация 2p23.2 2q35 3p14.2 3p22.2 3p26.3 9p22.1 17p13.3 N/N информативн. случаев 50/106 44/103 61/101 55/105 54/104 51/108 48/98 % 47 43 60 52 52 47 49 Рисунок 10. Микросателлитный анализ локусов D3S1539 (А) и D3S1768 (Б). А. № 28 – аденокарцинома № 31 – плоскоклеточный рак легкого. T- опухоль; N2 – смежная условно нормальная ткань на расстоянии 2 см.; N5 – смежная условно нормальная ткань на расстоянии 5 см.; Дорожка 28T – микросателлитная нестабильность. 44 Б. № 13 – плоскоклеточный рак легкого № 14 – аденокарцинома T- опухоль; N2 – смежная условно нормальная ткань на расстоянии 2 см.; N5 – смежная условно нормальная ткань на расстоянии 5 см.; Дорожка 13T – микросателлитная нестабильность Рисунок 11. Микросателлитный анализ локусов D17S938 (А) и D9S925 (Б). А. № 1, 2 – плоскоклеточный рак легкого T- опухоль; N2 – смежная условно нормальная ткань на расстоянии 2 см.; N5 – смежная условно нормальная ткань на расстоянии 5 см.; Дорожка 1T – потеря гетерозиготности. Б. № 3 – плоскоклеточный рак легкого № 4 – аденокарцинома легкого T- опухоль; N2 – смежная условно нормальная ткань на расстоянии 2 см.; N5 – смежная условно нормальная ткань на расстоянии 5 см.; Дорожка 3T – потеря гетерозиготности. Наибольшая частота аллельных нарушений у пациентов с НМРЛ выявлена для микросателлита D3S1300 – 60%. Для локусов D3S1300, D9S925, D17S938 характерна только ПГ. МН в этих регионах не обнаружена. Аллельные нарушения в исследуемых хромосомных локусах могут быть как самостоятельными маркерами нестабильности генома, так и косвенным доказательством (использоваться для косвенной диагностики) вовлечения генов, расположенных в этих регионах/находящихся рядом с этими районами, в процессы канцерогенеза. 45 В данной работе частота ПГ/МН микросателлита D2S164 составила 43% (44/103). D2S164 находится в хромосомном районе 2q35. В локусе 2q35 располагаются такие гены-кандидаты как: XRCC5, IGFBP2, IGFBP5, PLCD4, USP37. Гены IGFBP2, IGFBP5 кодируют белки связывающиеся с инсулиноподобный фактором роста и ингибирующие ИФР-опосредованный рост и развитие клеток. Ген XRCC5 кодирует субъединицу АТФ-зависимой ДНК хеликазы II – белка системы репарации. Ген PLCD4 кодирует фосфолипазу С, белок участвующий в MAP-киназных сигнальных каскадах. Ген USP37 кодирует пептидазу, участвующую в регуляции клеточного цикла. По данным Tseng и соавторов ПГ в регионе D2S164 встречается в 50% НМРЛ (Tseng, 2005). В хромосомном участке 3p26 находится микросателлит D3S1539, частота аллельных нарушений которого в данной работе составила 52% (54/104). В этом хромосомном регионе располагаются такие кандидатные гены канцерогенеза как, ITPR1, кодирующий рецептор инозитол-1,4,5-трифосфата, участвующий в апоптозе, активируемом эндоплазматическим ретикулумом. Ген FANCD2 продукт которого участвует в гомологичной репарации ДНК. По данным Woenckhaus и соавторов, частота ПГ микросателлита D3S1539 у пациентов с НМРЛ составляет 60% (Woenckhaus, 2005). В настоящем исследовании рассматривался микросателлит D3S1300, локализующийся в хромосомном регионе 3р14.2, для которого выявлена наибольшая частота аллельных нарушений у пациентов с НМРЛ (60%). В этом же районе располагается ген FHIT. Микросателлит D3S1300 находится в регуляторной области этого гена. FHIT – ген-супрессор опухолевого роста, который является негативным регулятором клеточного цикла и препятствует пролиферации клеток. Ген FHIT, по данным разных авторов, поврежден в 70-90% случаев НМРЛ. Предполагается, что его инактивация является одним из ведущих механизмов возникновения и прогрессирования рака легкого (Sozzi, о данным 1998; Verri, 2009). FHIT включает в себя фрагильный сайт FRA3B, который чрезвычайно чувствителен к канцероген-индуцированным повреждениям. Фактически, воздействие канцерогенных факторов может приводить к разного 46 рода структурным и функциональным нарушениям в этом гене, тем самым, индуцируя канцерогенез (Woenckhaus, 2005). Согласно исследованиям Verri и соавторов, аллельные нарушения в районе 3р14.2 и гиперметилирование промотора гена FHIT приводят к его инактивации и уменьшению уровня экспрессии. Аллельные нарушения и аномальное метилирование промотора гена FHIT ассоциированы с ранним рецидивом заболевания и плохим прогнозом (Verri, 2009). Микросателлит D2S405 располагается в регионе 2p23. Частота ПГ/МН для этого маркера составила 47%. В этом хромосомном районе располагаются гены: DNMT3A, NCOA, ALK, TP53I, MAPRE3, BRE, GPN, CGREF1, ATRAID, CAPN14, которые могут быть вовлечены в механизмы канцерогенеза. Ген DNMT3A кодирует фермент ДНК-(цитозин-5)-метилтрансферазу, которая участвует в процессах метилирования ДНК de novo. Ген TP53I3 (p53-индуцирующий белок) участвует в p53-опосредованной гибели клеток. Ген GPN1 кодирует белок, участвующий в процессах репарации ДНК, а ген CAPN14 кодирует калпаин– кальций-чувствительную цистеиновую протеиназу, фермент участвующий в механизмах апоптоза и клеточного деления. Наиболее изученным в аспекте НМРЛ является ген ALK. Этот ген кодирует тирозинкиназный рецептор, принадлежащий суперсемейству инсулиновых рецепторов, и играет важную роль в развитии нервной системы. Амплификация, транслокации, мутации этого гена обнаружены в таких онкологических заболеваниях как анапластическая крупноклеточная лимфома, нейробластома и НМРЛ (Rodig S.J., 2009; Husain H., 2011). Транслокация этого гена обнаружена в среднем в 6% НМРЛ с железистой дифференцировкой и ассоциирована с чувствительностью к препаратам-игибиторам ALK (Rodig S.J., 2009 ). Микросателлит D9S925 располагается в хромосомном регионе 9p22.1. Частота ПГ/МН D9S925 составила 47% (51/108). Микросателлиты D2S405, D9S925 впервые использовались в исследовании Tseng и соавт. Для этих локусов показано высокая частота ПГ/МН в НМРЛ, которая составила 49 и 56% соответственно (Tseng et al., 2005). 47 В хромосомном районе 3p22 располагается микросателлит D3S1768, частота аллельных нарушений которого в нашем исследовании составила 52% (55/105). В регионе 3p22 находятся такие гены как: PDCD6IP, SNRK, GORASP1 (продукты этих генов являются регуляторами апоптоза), ген TRAK1, его продукт регулирует транспорт рецептора эпидермального фактора роста. В районе 17p13 находится микросателлит D17S938. В данной работе частота ПГ D17S938 составила 49% (49/98). В регионе 17p13 располагается один из основных генов канцерогенеза TP53 – ген-супрессор опухолевого роста, индуцирующий апоптоз и арест клеточного цикла. Мутации этого гена обнаружены в 40-60% раков легкого (Subramanian J, 2007; Wen J., 2011). Выявлено, что мутации этого гена чаще встречаются у курильщиков (26–71%), чем у некурящих пациентов с НМРЛ (10– 47%) (Husgafvel-Pursiainen K., 2000; Vahakangas K.H., 2001; Le Calvez F., 2005). Так же в этом регионе располагаются такие гены, как: RPA1, кодирует белок, играющий важную роль в процессах рекомбинации и репарации ДНК; ген TNFSF13, кодирует белок, участвующий в апоптозе, взаимодействуя с рецептором фактора некроза опухолей; ген PIK3R5, кодирующий субъединицу фосфатидилинозитол-3-киназы, фермента регулирующего пролиферацию и миграцию клеток; ген TNK1, который кодирует нерецепторную тирозиновую киназу, играющую роль супрессора клеточного роста, негативного регулятора RAS-MAP-киназной активности; ген BCL6B кодирует белок-репрессор транскрипции. В исследовании Sanchez-Cespedes M. и соавт. показано, что частота ПГ в регионе 3p и 17p для пациентов с аденокарциномой легкого составляет 37 и 45% соответственно (Sanchez-Cespedes M., 2001). Согласно работе Chmara и соавт., ПГ/МН локусов D3S1768 и D17S938 чаще встречается в плоскоклеточном раке легкого, чем в аденокарциномах (89% и 75% соответственно) (Chmara et all, 2004). Частота аллельных нарушений микросателлитов D3S1768 и D17S938 в исследовании Tseng R-C. и соавт. составила 53 и 55% соответственно (Tseng R-C. Et al., 2005). 48 Для сравнения частот ПГ/МН исследуемых локусов с клиническими характеристиками пациентов, последних делили на группы по следующим критериям: стадия заболевания, гистологический тип опухоли, статус курения (таблица 10). Для выявления корреляций между изученными генетическими изменениями и клиническими параметрами пациентов c НМРЛ применяли статистический анализ категориальных данных с использованием двустороннего варианта точного критерия Фишера. Выявлены статистически достоверные зависимости ПГ и/или МН исследуемых локусов от гистологического типа опухоли, стадии опухолевого процесса, статуса курения. Молекулярно-генетические изменения в регионах D9S925 (p = 0,005), D17S938 (p = 0,002) характерны для пациентов с плоскоклеточным раком легкого. ПГ и/или МН в локусах D3S1768 (p = 0,004), D17S938 (p = 0,032) ассоциированы с курением. Частые нарушения в районе D2S405 (p = 0,016) характерны для пациентов с I-II стадией опухолевого процесса, а изменения в локусе D3S1300 (p=0,019), ассоциированы с III-IV стадией заболевания (табл. 11) (Шикеева А.А., 2013). Полученные данные подтверждают результаты работ зарубежных исследователей о высокой частоте хромосомных перестроек в регионе 3p14, характерных для НМРЛ (Woenckhaus et al., 2005; Chmara et al., 2004). В нашей работе выявлено, что изменения в локусе D3S1300 ассоциированы с III-IV стадией НМРЛ (p = 0,019), что согласуется с данными Verri и соавт. о неблагоприятном прогнозе для пациентов с НМРЛ, имеющих нарушения в гене FHIT. По данным Tseng и соавторов, аллельные делеции в регионе D9S925 ассоциированы с плоскоклеточным раком легкого и курением (Tseng et al., 2005). Действительно, в нашей работе ПГ локуса D9S925 характерна для пациентов с плоскоклеточным раком легкого (р = 0,005), но не ассоциирована с курением. Вероятно, расхождение результатов можно объяснить неполными данными анамнеза пациентов с НМРЛ в нашем исследовании. В исследовании Tseng и соавторов, для региона D2S405 не показано каких-либо статистически 49 достоверных ассоциаций, однако по результатам нашего исследования выявлено, что ПГ/МН локуса D2S405 характерны для пациентов с I-II стадией заболевания (p = 0,016). Таблица 11. Частоты ПГ/МН в исследуемых локусах, ассоциированные с клинико-морфологическими параметрами. Клинический параметр Маркер Локализация Критерии ПГ/МН % Статистическая достоверность ПГ и/или МН/ N информативных случаев (%) АК 12/30 30 D9S925 9p22.1 p = 0,005 Гистологически ПКРЛ 33/47 71 й тип АК 9/40 23 D17S938 17p13.3 p = 0,002 ПКРЛ 36/48 75 I-II 19/51 37 D2S405 2p23.3 p = 0,016 III-IV 10/43 23 Стадия I-II 18/50 36 D3S1300 3p14.2 p = 0,019 III-IV 10/42 24 ДА 18/44 41 D3S1768 3p22.2 p = 0,004 НЕТ 12/44 27 Курение ДА 26/44 59 D17S938 17p13.3 p = 0,032 НЕТ 13/45 29 ПГ - потеря гетерозиготности; МН - микросателлитная нестабильность; АК аденокарцинома; ПКРЛ - плоскоклеточный рак; I, II, III, IV – стадии НМРЛ. Доказано, что развитие плоскоклеточного рака легкого ассоциировано с курением. По данным ВОЗ в анамнезе 60–80% пациентов с плоскоклеточным раком значится курение. Показано, что ПГ/МН в регионах 3p и 17p достоверно ассоциирована курением (p = 0,003 для обоих маркеров) (Sanchez-Cespedes M., 2001). В работе Tseng R-C. и соавторов, частота аллельных нарушений в D3S1768 выше у курильщиков, чем у некурящих пациентов (68 и 23% соответственно) (Tseng R-C., 2005). В нашем исследовании, ПГ и/или МН сателлитов D3S1768 и D17S938 составили 49 и 52% соответственно. Выявлена статистически достоверная ассоциация между курением и плоскоклеточным раком легкого (p = 0,003). Показано, что аллельный дисбаланс в исследуемых локусах характерен для курильщиков: D17S938 (p = 0,032), D3S1768 (p = 0,004), ПГ/МН в локусе D3S1768 также ассоциирована с плоскоклеточным раком легкого (p = 0,002) (табл. 11). 50 Полученные данные свидетельствуют о том, что в НМРЛ происходят многочисленные мутационные события, приводящие к повреждению различных участков генома. Найденные генетические изменения могут использоваться как молекулярные маркёры плоскоклеточного рака легкого, для дифференциальной диагностики в сложных случаях, в дополнении к данным морфологического исследования, а также могут оцениваться как маркеры прогноза. Аллельные нарушения в смежной с опухолью условно нормальной ткани на различном расстоянии. По данным ряда исследований, молекулярно-генетические изменения характерны не только для опухолевой ткани, но часто выявляются в смежных с опухолью условно нормальных тканях (Tang X., 2008; Yendamuri, 2008, ) однако в ходе нашей работы, в образцах смежной условно нормальной ткани на расстоянии 2 и 5 см от опухоли ПГ/МН не обнаружено. Вероятно, это можно объяснить тем, что структурные изменения не затрагивают смежные с опухолью нормальные ткани, а накапливаются только в опухоли. Однако, существуют исследования, показывающие наличие молекулярно-генетических изменений не только непосредственно в опухолевом эпителии но и в опухолевой строме (опухолевом микроокружении), а также в предопухолевых изменениях (дисплазия) и смежных с опухолью морфологически неизмененных тканях. В исследовании Tang X. и соавторов показано наличие структурных изменений, таких как мутации гена EGFR в опухолевом микроокружении, строме на расстоянии 5мм от опухоли (Tang X., 2008). В отечественной работе по определению аллельных нарушений и аномального метилирования ряда генов в раке предстательной железы показано наличие ПГ/МН в стромальном опухолевом микроокружении (Кекеева Т., 2008) Отсутствие аллельных нарушений в условно нормальной ткани на расстоянии 2 и 5 см в нашем исследовании, позволяет предположить, что, вероятно, при НМРЛ аллельные нарушения не затрагивают участки смежной с опухолью условно нормальной ткани на этом расстоянии. 51 3.2. Результаты анализа мутации генов EGFR, KRAS и транслокации гена ALK при НМРЛ. Для определения чувствительности опухоли к таргетным препаратам проводили анализ мутаций в генах EGFR, KRAS и транслокации гена ALK у 140 пациентов с НМРЛ с железистой дифференцировкой (аденокарцинома, аденоплоскоклеточный рак). Так как наличие транслокации ALK выявлено в случаях аденокарцином, имеющих дикий тип EGFR и KRAS, проводили последовательный анализ этих изменений, алгоритм исследования представлен на схеме 5. Средний возраст пациентов в исследовании составил 60 лет. Структурные изменения выявлены в 37% случаев не плоскоклеточного НМРЛ. Частота мутаций гена EGFR составила 19% (27/140), мутации в гене KRAS обнаружены в 17% (19/113) случаев, а транслокация гена ALK выявлена у 6% (6/94) пациентов. Рисунок 12. Схема проведения молекулярно-генетического исследования для определения чувствительности к таргетным препаратам. 52 По данным эпидемиологических исследований мутации гена EGFR встречаются в 15–40% аденокарцином легкого и 1% плоскоклеточного рака легкого (Cappuzzo F., 2008; Porta R., 2008; Gately K., 2012). При этом 85-90% всех мутаций составляют нарушения в 19, 21 экзонах, реже встречаются мутации в 18 и 20 экзонах гена EGFR (Lynch T.J., 2004; Paez J.G., 2004; Sharma S.V., 2007). В обзоре литературы рассказывалось, что мутации в любом из этих регионов определяют чувствительность к терапии низкомолекулярными ингибиторами EGFR: большинство мутаций в 19, 21 экзонах гена EGFR ассоциированы с чувствительностью к препаратам-ингибиторам EGFR, а мутации в 18, 20 экзонах с резистентностью к этим препаратам. Схема распределения мутаций в 18-21 экзонах гена EGFR представлена на рисунке 13. Рисунок 13. Спектр мутаций в гене EGFR. ТК домен Экстрацеллюлярный домен Регуляторный домен Экзоны Мутации ассоциированные с резистентностью Экзоны (кодоны) Мутации ассоциированные с чувствительностью Gately K., J Clin Pathol 2012 53 Как видно из рисунка, большую часть мутаций составляют делеции в 19 экзоне и мутаций p.L858R в 21 экзоне гена. В нашем исследовании 81% мутаций гена EGFR составили делеции в 19 экзоне (22/27). Выявлены следующие варианты делеций (Шикеева А.А., 2011): - p.E746_A750del - p.L747_A749 del,A750P - p.L747_S752 del - p.L747_A750 del - p.K745_E749del - p.A750_K754 del Определение мутаций проводили с помощью 3 различных методов: прямого секвенирования – «золотой стандарт» определения генетических нарушений (рис. 14); фрагментного анализа (для 19 экзона гена EGFR) – альтернативный вариант, экономически более выгодный (рис. 15); с помощью коммерческого набора «Therascreen EGFR RGQ PCR Kit» - способен выявлять мутантную ДНК при большом содержании ДНК дикого типа. Мутации в 21 экзоне гена EGFR составили 19% (5/27). У четырех пациентов выявлена мутация p.L858R, в одном случае обнаружена мутация p.L861Q. Сиквенсограммы приведены на рис. 16, 17. Все выявленные структурные нарушения в гене EGFR ассоциированы с чувствительностью к препаратам-ингибиторам EGFR. В ряде эпидемиологических исследований показано, что в 19, 21 экзонах крайне редко (< 1%) встречаются резистентные мутации p.D761Y и p.T854A (Gately K., 2012). Основное количество мутаций ассоциированных с резистентностью возникает в 20 экзоне гена EGFR. У больных с НМРЛ, не получавших терапию ингибиторами EGFR, мутации в 20 экзоне гена встречаются редко, примерно в 5% случаев и в основном это мутация p.T790M (Gately K., 2012). Показано, что у 40% пациентов, получавших таргетную терапию, в срок от 6 месяцев до 1 года развивается вторичная резистентность к препарату. В 50% случаев это связано с возникновением мутации p.T790M, в 22% – с амплификацией гена c-Met. 54 Рисунок 14. Сиквенсограмма участка 19 экзона гена EGFR. Место начала делеции Рисунок 15. Фрагментный анализ 19 экзона гена EGFR. Аллель с делецией Рисунок 16. Сиквенсограмма участка 21 экзона гена EGFR. p.L858R 55 Рисунок 17. Сиквенсограмма участка 21 экзона гена EGFR. p.L861Q Частота мутаций гена KRAS в нашем исследовании составила 17% (19/113). Как уже упоминалось в обзоре литературы, мутации в гене KRAS встречаются у 15–35% пациентов с НМРЛ (Roberts P.J., 2010). Мутации гена KRAS считаются неблагоприятным прогностическим маркером при НМРЛ поскольку большинство из них обуславливают резистентность к терапии препаратами-ингибиторами EGFR. В сигнальном пути Ras/Raf/Mek молекула KRAS находится ниже рецептора EGFR. При наличии мутации в гене KRAS, сигнальный Ras/Raf/Mek путь активируется не зависимо от того, заблокирован EGFR или нет. Поэтому назначение препаратов-ингибиторов EGFR пациентам с мутантным генотипом KRAS не целесообразно, так как сигнальный путь все равно уже активирован. Наиболее частыми являются мутации в 12 и 13 кодонах гена KRAS (>97%), реже встречаются мутации в 61 (<3%) кодоне этого гена (Reungwetwattana T., 2012). Показано, что мутации в 13 кодоне 1 экзона гена KRAS, в отличие от нарушений в 12 кодоне, ассоциированы с чувствительностью к ингибиторам EGFR. В настоящее время проходит ряд клинических испытаний препаратов ингибиторов MEK, у пациентов с мутациями в гене KRAS. В нашем исследовании частота мутаций гена KRAS составила 17% (19/113). Анализ мутаций 1 экзона гена KRAS проводили методом прямого секвенирования. Наиболее частые оказались мутации в 12 кодоне гена: p.G12V – 32% (6/19), p.G12D – 26% (5/19), p.G12C – 26% (5/19). Также выявлены мутации p.G12A, p.G12N, p.G13D. Сиквенсограммы демонстрирующие мутации в гене KRAS представлены на рис. 18-22. 56 Рисунок 18. Сиквенсограмма участка 2 экзона гена KRAS. p.G12V Рисунок 19. Сиквенсограмма участка 2 экзона гена KRAS. p.G12D Рисунок 20. Сиквенсограмма участка 2 экзона гена KRAS. p.G12C Рисунок 21. Сиквенсограмма участка 2 экзона гена KRAS. p.G12A 57 Рисунок 22. Сиквенсограмма участка 2 экзона гена KRAS. p.G12N Рисунок 23. Сиквенсограмма участка 2 экзона гена KRAS. p.G13D Транслокация гена ALK обнаружена в 6% (6/94) случаев. Определение транслокации гена ALK проводили с помощью метода FISH (рис. 24). Генетические нарушения в этом гене приводят к постоянной активации рецептора ALK, который активирует MAP-киназный и PI3K-киназный и STAT3-зависимые сигнальные пути, ингибирующие апоптоз, стимулирующие клеточную пролиферацию и стромальную инвазию. По данным исследований при НМРЛ частота хромосомных перестроек гена ALK составляет 2-7% (Rodig S.J., 2009; Husain H., 2011). Согласно данным мировой статистики мутации в гене EGFR характерны для аденокарцином, чаще встречаются в азиатской популяции, у женщин, некурящих (Bell D.W., 2008; Cappuzzo F., 2010; Lee D., 2011). Мутации гена KRAS характерны для аденокарцином легкого, чаще встречаются у европеоидов и ассоциированы с курением (Herbst R.S., 2010; Li M., 2009; Riely G.J., 2008; Ihle N.T., 2012). 58 Мутации ALK практически никогда не сочетаются с мутациями EGFR и KRAS. Показано, что хромосомные перестройки ALK характерны для пациентов молодого возраста, некурящих, с поздней стадией заболевания, аденокарцином (Rodig S.J., 2009). Рисунок 24. Фотография FISH исследования. Ув. 1000. Транслокация Для выявления возможных ассоциаций клинико-морфологических характеристик с генетическими нарушениями в исследуемых генах, пациентов делили на группы по возрасту, полу, статусу курения. Деление пациентов на группы по гистологическому критерию не проводилось, т.к. все пациенты имели аденокарциному легкого. В нашем исследовании мутации гена EGFR чаще встречались у женщин – 26% (11/43), чем у мужчин – 13% (11/86). Других статистически достоверных ассоциаций между клиническими параметрами пациентов и мутациями в генах EGFR, KRAS, ALK не выявлено. Вероятно, это связано с небольшим объемом выборки и недостаточным количеством клинических данных. 3.3. Результаты аномального метилирования промоторов генов у пациентов с НМРЛ. Для оценки частоты эпигенетических изменений в образцах опухолевой ткани и смежной с ней нормальной ткани на разном расстоянии проведен анализ аномального метилирования промоторов генов, наиболее часто повреждаемых 59 при НМРЛ. Все гены, исследуемые в нашей работе, условно можно разделить на 3 основных группы: гены-супрессоры опухолевого роста: RASSF1A (3p21.3), FHIT (3p14.2), DAPK1 (9q21.33); гены, кодирующие белки межклеточного взаимодействия: CDH1 (16q22.1), CD44 (11p13), TIMP3 (22q12.3); ген системы репарации ДНК: MGMT (10q26.3). В ходе нашей работы выявлено, что у 104 из 110 (95%) пациентов с НМРЛ обнаружены эпигенетические изменения по крайней мере в одном из исследуемых генов. Частоты эпигенетических изменений в опухоли у пациентов с НМРЛ составили 70% для гена RASSF1A, 52% для гена FHIT, 17% для гена DAPK1, 61% для гена CDH1, 34% для гена CD44, 43% для гена TIMP3, 15% для гена MGMT (Шикеева А.А., 2013). Частоты аберрантного метилирования в образцах опухоли и образцах смежной условно нормальной ткани на расстоянии 2 и 5 см от опухоли по всем исследуемым генам приведены в табл. 11. Таблица 12. Частоты эпигенетических изменений исследуемых генов во всех образцах тканей. Гены RASSF1A FHIT DAPK1 CDH1 CD44 TIMP3 MGMT Опухоль N/Nобщ % 77/110 70 57/110 52 19/110 17 67/110 61 37/110 34 47/110 43 16/110 15 Смежн. ткань на 2 см. Смежн. ткань на 5 см. N/Nобщ N/Nобщ % % 35/110 32 22/110 20 23/110 21 18/110 16 0/110 0 0/110 0 33/110 30 12/110 11 14/110 13 9/110 8 26/110 24 0/110 0 0/110 0 0/110 0 Ген RASSF1A – ген-супрессор опухолевого роста, один из регуляторов апоптоза и клеточного цикла, располагается в регионе 3p21.3. Белок RASSF1A находится в микротрубочках и связан киназами MST1 и MST2, «запускающими» апоптоз. Ген FHIT – ген-супрессор опухолевого роста, располагается в хромосомном районе 3p14.2. FHIT – негативный регулятор клеточного цикла, препятствующий неконтролируемой пролиферации клеток. 60 Ген DAPK1 располагается в локусе 9p34.1, кодирует белок DAP-киназу – кальмодулин-зависимую серин/треониновую киназу. Этот белок ассоциирован с цитоскелетом клетки и является положительным регулятором IFN- опосредованного сигнального пути апоптоза (Bialik et al., 2006; Kawaguchi et al., 2004). Показано, что в результате метилирования промотора и/или наличия гомозиготной делеции региона 9q34 происходит уменьшение экспрессии DAPK. Ген CDH1 располагается в регионе 16q22.1 и кодирует мембранный белок E-кадгерин, гликопротеин из надсемейства кадгеринов. E-кадгерин вовлечён в механизмы регуляции межклеточной адгезии, клеточной подвижности и пролиферации эпителиальных клеток, а также играет потенциальную супрессорную роль в клеточной инвазивности. Гиперметилирование промотора этого гена приводит к его инактивации, и как следствие, угнетению формирования межклеточных контактов, увеличению подвижности и пролиферативной активности клеток, способствует инвазивному росту опухоли. Ген TIMP3 располагается в регионе 22q12.3, принадлежит к семейству генов кодирующих участвующих тканевые в ингибиторы процессах металлопротеиназ, деградации группы экстрацеллюлярного пептидаз, матрикса. Метилирование промотора это гена приводит к его инактивации и, как следствие, к активной работе тканевых металлопротеиназ, что в свою очередь приводит к разрушению тканевого матрикса и способствует инвазии опухоли в окружающие ткани. Интересным оказался тот факт, что эпигенетические изменения в гене TIMP3 наблюдались в опухоли и смежной с опухолью ткани на расстоянии 2 см (в 24% случаев) и не обнаружены в окружающей ткани на расстоянии 5 см от опухоли. Гиперметилирование промоторов генов DAPK1 и MGMT выявлено исключительно в опухолевой ткани. Проведен сравнительный анализ различных вариантов сочетания метилирования генов исследования. В 13 случаях НМРЛ (12%) во всех 3 исследуемых образцах выявлено метилирование регуляторных районов генов RASSF1A и FHIT. Частоты метилирования промоторов генов RASSF1A и FHIT 61 составили: в опухоли – 31%, в опухоли и смежной ткани на расстоянии 2 см – 16%, в опухоли, смежной ткани на расстоянии 2 и 5 см (во всех исследуемых образцах) – 12%. Электрофореграммы продуктов МЧ-ПЦР представлены на рис. 25. Рисунок 25. Электрофореграмма продуктов МЧ-ПЦР генов RASSF1A и FHIT. Примечание: 1 – отрицательный контроль; 9 – положительный контроль; 2 – контроль рестрикции; 4, 6, 8 – гидролизованные образцы; 3, 5, 7 – не гидролизованные образцы; 4 – метилирование. При проведении статистического анализа получено, что метилирование промоторов генов CDH1 (p = 0,002) и CD44 (p = 0,002) характерно для плоскоклеточного рака легкого. В девяти случаях эпигенетические изменения в гене CD44 обнаружены во всех трех образцах ДНК, и все девять имели плоскоклеточную природу и IIA стадию заболевания (Шикеева А.А, 2013). Электрофореграммы продуктов МЧ-ПЦР гена CD44 на рис. 26. Рисунок 26. Электрофореграмма продуктов МЧ-ПЦР гена CD44. Примечание: 1 – контроль рестрикции; 14 – положительный контроль; 3, 5, 7, 9, 11, 13 – гидролизованные образцы; 2, 4, 6, 8, 10, 12 – не гидролизованные образцы; 3, 5, 7, 9, 11, 13 – метилирование. При проведении статистического анализа выявлено, что сочетание гиперметилирования промоторов генов RASSF1A и FHIT в опухоли, в окружающей ткани на расстоянии 2 и 5 см от опухоли характерно для пациентов 62 на III-IV стадии заболевания с метастазами в регионарные лимфоузлы (p = 0,008) (табл. 13). В исследовании Maruyama R. и соавт. приводятся данные, что пациенты, у которых в опухоли выявлено гиперметилирование промотора гена FHIT имеют достоверно (p = 0,007) худшие показатели выживаемости по сравнению с аналогичной группой без эпигенетических нарушений в этом гене (Maruyama R., 2004). Похожие сведения, только относительно гиперметилирования промотора гена RASSF1A, описываются в работе Van Den Broeck A. и соавт. Авторы показали, что случаи НМРЛ, в которых выявлены эпигенетические изменения в гене RASSF1A, имеют гораздо более неблагоприятный прогноз (p = 0,003) по сравнению со случаями без метилирования этого гена. Согласно данным настоящего исследования, гиперметилирование промоторов генов RASSF1A и FHIT во всех трех исследуемых образцах характерно для пациентов с III-IV стадией заболевания с метастазами в регионарные лимфоузлы (p = 0,008), что косвенно свидетельствует о неблагоприятном прогнозе для данных пациентов и совпадает с результатами предыдущих работ. Однако отсутствие данных об отдаленных последствиях оперативного лечения и динамического наблюдения пациентов затрудняют оценку прогностического значения полученных данных. Показана статистически достоверная разница между частотой гиперметилирования промотора гена DAPK1 в группе пациентов с метастазами в регионарные лимфоузлы и без метастазов (p = 0,005). В группе пациентов с метастазами частота эпигенетических нарушений в исследуемом гене оказалась выше. Результаты нашего исследования подтверждают данные Ji M. и соавт о том, что гиперметилирование промотора гена DAPK1 ассоциировано с метастазированием, а эпигенетические изменения в гене CDH1 ассоциированы с плоскоклеточным раком легкого (Ji M., 2011). Сиквенсограмма участка гена CDH1 c метилированными CG – динуклеотидами представлена на рис. 27. В работе Gu J. соавт. гиперметилирование промоторов генов CDH1 и TIMP3 ассоциировано с благоприятным прогнозом течения заболевания (Gu J., 2006). 63 Таблица 13. Частоты эпигенетических изменений в исследуемых генах, ассоциированные с клинико-морфологическими параметрами. Клинический параметр Гистологический тип Метастазиро вание Ген Частоты % N метилиров. образцов/ N известных по данному параметру случаев 26/48 ПКРЛ CD44 11p13 13/55 АК+АПКРЛ 39/48 ПКРЛ CDH1 16q22.1 28/55 АК+АПКРЛ 14/45 N+ DAPK1 9q21.33 5/58 N0 54 24 81 51 31 9 совместно RASSF1A, FHIT Локализация 3p21.3, 3p14.2 Критерии N+ 14/23 61 N0 4/21 19 Статистическая достоверность p = 0,002 p = 0,002 p = 0,005 p = 0,008 Рисунок 27. Метил-специфическое секвенирование на примере гена CDH1. Примечание: Красные стрелки указывают на метилированные CG-динуклеотиды. Эпигенетические изменения в смежной с опухолью условно нормальной ткани на различном расстоянии. В нашем исследовании выявлены эпигенетические нарушения в образцах ткани на расстоянии 2 и 5 см от опухоли. Частоты гиперметилирования промоторов исследуемых генов составляют 0-33% для смежной условно нормальной ткани на расстоянии 2 см и 0-22% для смежной условно нормальной ткани на расстоянии 5 см (рис. 28, 29). Согласно результатам нашего исследования, метилирование промотора гена TIMP3 обнаружено в опухоли у 43% пациентов, в опухоли и смежной условно нормальной ткани на расстоянии 2 см в 24% случаев, а в образцах смежной с опухолью ткани на расстоянии 5 см вовсе отсутствовало. 64 Рисунок 28. Распределение частот эпигенетических изменений каждого гена в Частота эпигенетических изменений, % ряду опухоль – нормальная ткань 2 см – нормальная ткань 5 см от опухоли. 100 RASSF1A 80 DAPK1 FHIT 60 CD44 40 CDH1 20 TIMP3 MGMT 0 T N2 N5 Рисунок 29. Распределение частот эпигенетических изменений всех исследуемых генов вместе в ряду опухоль – смежная ткань на 2см – смежная ткань на 5см от Частота эпигенетических изменений, % опухоли. Показано, что гены-супрессоры опухолевого роста RASSF1A и FHIT имеют более высокие частоты гиперметилирования, чем гены, кодирующие белки межклеточного взаимодействия CD44, CDH1 в нормальной ткани на расстоянии 5 см. В гене TIMP3 метилирование смежной ткани на 5 см и вовсе отсутствует (табл. 12). Аномальное метилирование промотора гена CDH1 в образцах смежных с опухолью тканях на расстоянии 2 и 5 см составило 30 и 11% соответственно. Наличие эпигенетических нарушений в гене CDH1 в смежной с опухолью ткани, 65 как и в гене TIMP3, вероятно, свидетельствует о непосредственном участии опухолевого окружения в процессах канцерогенеза и о наличии «поля канцеризации». Однако, в отличие от эпигенетических изменений в гене TIMP3, аберрантное метилирование промотора гена CDH1 определяется в смежной ткани на расстоянии 5 см от опухоли. Говоря о частотах метилирования в образцах смежной с опухолью ткани, стоит отметить, наличие общей тенденции: в ряду опухоль опухолью ткань на расстоянии 2 см смежная с смежная с опухолью ткань на расстоянии 5 см частота эпигенетических нарушений по всем исследуемым генам снижается, т.е. чем удалённее от опухоли располагается окружающая ткань, тем меньше эпигенетических изменений она содержит. Вероятно, «эпигенетическое поле канцеризации» для легкого не заканчивается на 5см и необходимы дальнейшие исследования в этом направлении. В этой работе уже говорилось о том, что структурные нарушения ДНК, такие как ПГ и МН, определяются строго в опухоли и не затрагивают условно нормальные ткани окружающие опухоль. Исследование статуса аномального метилирования показало, что эпигенетические нарушения, а именно гиперметилирование промоторов исследуемых генов, характерно не только для опухоли, но и для морфологически нормальных тканей, окружающих опухоль. Наличие этих изменений в смежных с опухолью тканях свидетельствует о том, что аномальные молекулярно-генетические процессы распространяются за пределы опухолевой ткани. 3.4. Результаты экспрессии зрелых микроРНК в НМРЛ. Проведен анализ экспрессии микроРНК: let-7a, miR-155, miR-205 у пациентов с НМРЛ в опухолевой ткани и смежной с опухолью нормальной ткани на расстоянии 2 и 5 см. Исследование проводилось на 57 образцах операционного материала (парафиновые блоки) полученных от 19 пациентов с НМРЛ: 7 пациентов с плоскоклеточным раком легкого, 7 случаев аденокарциномы легкого и 5 случаев аденоплоскоклеточного рака легкого. Для количественной оценки уровня экспрессии микроРНК использовали метод относительных определений 66 количественных значений 2 −ΔΔCt . В качестве эндогенного контроля принимали значения экспрессии малой ядерной РНК – RNU6 («QIAGEN», Германия). Количественное определение экспрессии микроРНК в исследуемых тканях проводили относительно уровня экспрессии этих микроРНК в калибраторе. В нашей работе в качестве калибратора изначально использовались следующие образцы: смежная условно нормальная ткань на расстоянии 5 см от пациентов исследования, морфологически неизмененная ткань легкого пациентов с другими онкологическими заболеваниями, морфологически неизмененная ткань легкого пациентов с неспецифическими хроническими заболеваниями легких (НХЗЛ). Лучшая воспроизводимость и робастность результатов показана для группы пациентов с НХЗЛ. Таким образом в нашем исследовании в качестве калибратора использовались образцы морфологически нормальной ткани, полученной от пациентов с НХЗЛ. Для оценки воспроизводимости полученных результатов, каждый образец исследовали в двух параллелях. Для удобства представления полученных результатов вычисляли значение логарифма Log2 2 −ΔΔCt для каждой пробы. После этого высчитывали среднее значение и стандартную ошибку. Для статистической обработки полученных результатов применяли одноконцевой парный и непарный тесты Стьюдента. Для выявления статистически значимых ассоциаций полученных результатов экспрессии микроРНК с клинико- морфологическими параметрами пациентов, последних делили на группы по возрасту, стадии процесса, гистологическому типу и степени дифференцировки опухоли. Средний возраст пациентов в данном эксперименте составил 63 года. МикроРНК Let-7a – микроРНК, кодирующая последовательность которой располагается в регионе 9q22.32, принадлежащая к группе микроРНК let-7. Впервые экспрессия этой микроРНК выявлена у Caenorhabditis elegans в качестве регулятора клеточного цикла (Reinhart B.J., 2000). В работах по исследованию функций let-7 у человека показано, что микроРНК этой группы имеют функции супрессора опухоли. При раке легкого выявлены частые повреждения хромосомных регионов, где располагаются кодирующие последовательности микроРНК этой группы (Calin G.A., 2004). Let-7 является негативным 67 регулятором многочисленных онкогенов, таких как RAS, MYC, HMGA2 и регуляторов клеточного цикла CDC25A, CDK6 и cyclin D2 (Johnson S.M., 2005; Kumar M.S., 2007; Lee Y.S., 2007; Johnson C.D., 2007). МикроРНК MiR-155 – микроРНК, которая кодируется геном домашнего хозяйства MIR155 и располагается в районе 21q21.3. MIR155 впервые обнаружена в B-клеточных-лимфомах (Tam W., 1997). Показано, что в норме miR-155 экпрессируется в активированных B- и T-лимфоцитах, а также в моноцитах/макрофагах (Elton T.S., 2013). В настоящее время miR-155 является одной из самых изученных микроРНК в молекулярной биологии, и результаты последних исследований показывают, что miR-155 играет важную роль в многочисленных физиологических и патологоческих процессах, таких как гемопоэтическая дифференцировка клеток, иммунный ответ, воспаление, онкологические и сердечно-сосудистые заболевания, синдром Дауна (Calame K., 2007; Faraoni I., 2009; Tili E., 2009; O'Connell R.M., 2012; Elton T.S., 2013). В настоящий момент выявлено, что мишенями miR-155 являются около 140 генов, среди них гены, участвующие в процессах гемопоэза (AICDA, ETS1, JARID2, SPI1), воспаления (BACH1, FADD, IKBKE, INPP5D, MYD88, RIPK1, SPI1, SOCS) и гены-супрессоры опухолевого роста (CEBPβ, IL17RB, PCCD4, TCF12, ZNF652, TP53INP1) (Neilsen P.M., 2013). Показано, что НМРЛ характеризуется гиперэкспрессией miR-155 (Yanaihara N., 2006). В ряде работ выявлена прогностическая значимость экспрессии let-7a и miR-155 у пациентов с НМРЛ (Takamizawa J., 2004; Yanaihara N., 2006; Raponi M., 2009). Кодирующая последовательность микроРНК miR-205 находится в хромосомном локусе 1q32.2. Впервые экспрессия этой микроРНК выявлена у рыб и мышей. Показано, что miR-205 участвует в процессах клеточной дифференцировки, пролиферации и апоптозе. Мишенями miR-205 являются такие гены как PTEN, ERBB3, E2F1, E2F5, ZEB1, ZEB2, VEGF-A, IL24, IL32. Гиперэкспрессия miR-205 показана для клеточных линий опухолей головы и шеи, по сравнению с опухолями легкого, молочной железы, простаты и 68 колоректального рака (Jiang J., 2005). У пациентов с НМРЛ выявлена гиперэкспрессия miR-205 (Markou A., 2008). В нашей работе проводился анализ экспрессии let-7a, miR-155, miR-205 в опухолевой и смежной условно нормальной ткани на различном расстоянии с помощью ПЦР в режиме реального времени. Рисунок 30. Экспрессия исследуемых микроРНК у пациентов с НМРЛ. let7a mi155 mi205 Уровень экспрессии микроРНК (значение Log2 2 –ddCt) 10 8 6 4 2 0 5T 7T 10T 20T 14T 4T 9T 11T 12T 15T 2T 21T -2 -4 -6 -8 -10 Пациенты с НМРЛ На рис. 30 представлены значения уровней экспрессии let-7a, miR-155, miR205 в опухоли у каждого пациента. Как видно из диаграммы, в опухоли экспрессия let-7a снижена у большинства пациентов. Однако, для двух других микроРНК: miR-155, miR-205 изменение уровня экспрессии не столь очевидно. Для более удобного представления полученных данных вычисляли среднее значение экспрессии со стандартной ошибкой для каждой микроРНК в опухоли и смежных условно нормальных тканях на расстоянии 2 и 5 см. Для определения статистической достоверности полученных результатов применяли одноконцевой парный и непарный тесты Стьюдента. На рис. 31 представлены средние значения экспрессии микроРНК со стандартной ошибкой, указанной на гистограмме. За статистически достоверный результат принимали значение критерия * - p< 0,05. 69 Рисунок 31. Экспрессия микроРНК let-7a, miR-155, miR-205. Анализ экспрессии трех микроРНК во всех исследуемых образцах показал, что уровень экспрессии микроРНК let-7a значительно снижен в опухоли по сравнению с условно нормальной тканью как на расстоянии 2 см (р = 0,025), так и на расстоянии 5 см (p = 0,012) от опухоли (рис. 31). Статистически достоверных изменений уровня экспрессии miR-155, miR-205 в опухоли относительно смежной условно нормальной ткани не выявлено. Для выявления статистически достоверных ассоциаций полученных данных и гистологическим типом опухоли, выделяли 3 группы НМРЛ: АК, ПКРЛ, АПКРЛ. Проанализированы средние значения экспрессии микроРНК let-7a, miR155, miR-205 в опухолях и смежной условно нормальной ткани на различном расстоянии при разделении опухолей по гистологическим типам. В нашем исследовании статистически значимых различий между экспрессией микроРНК в разных гистологических типах не выявлено. Также не оказалось различий между экспрессией исследуемых микроРНК в смежной условно нормальной ткани на расстоянии 2 и 5 см разных гистологических типов. Для выявления статистически значимых ассоциаций данных об экспрессии микроРНК и возрастом пациентов, последних делили на две группы: моложе 63 и старше 63 лет. Анализ экспрессии микроРНК в группе пациентов старше 63 лет не показал различий в уровне экспрессии исследуемых микроРНК между 70 опухолью и смежной условно нормальной тканью, в то время как в группе пациентов моложе 63 выявлены достоверные различия. На рис. 32 представлены средние значения уровня экспрессии исследуемых микроРНК у пациентов моложе 63 лет в опухоли и смежной условно нормальной ткани на расстоянии 2 и 5 см. За статистически достоверный результат принимали значение критерия * - p< 0,05. В группе пациентов моложе 63 лет в опухолевой ткани экспрессия микроРНК let-7a и miR-155 значительно снижена (p = 0,015; p = 0,048 соответственно) по сравнению со смежной условно нормальной тканью (рис. 32) Рисунок 32. Экспрессия микроРНК let-7a, miR-155, miR-205 у пациентов моложе 63 лет. Одним из критериев злокачественности новообразования является стадия опухолевого процесса. В нашей работе все пациенты поделены по стадии опухолевого процесса на 2 группы: пациенты с I-II стадией и группа пациентов с III-IV стадией заболевания. Проводили анализ экспрессии микроРНК let-7a, miR155, miR-205 в выделенных группах. На рис. 33 представлены средние значения экспрессии микроРНК в let-7a, miR-155, miR-205 в исследуемых образцах. За статистически значимый результат принимали значение критерия * - p< 0,05. 71 Рисунок 33. Экспрессия исследуемых микроРНК у пациентов с III-IV стадией НМРЛ. Выявлено снижение уровня экспрессии микроРНК let-7a и miR-155 (p = 0,03; p = 0,023, соответственно) в опухолевой ткани относительно смежной условно нормальной ткани на расстоянии 2 и 5 см от опухоли в группе пациентов с III-IV стадии заболевания (рис. 33). У пациентов с I-II стадией заболевания достоверных изменений уровня экспрессии исследуемых микроРНК не обнаружено. При разделении пациентов по степени дифференцировки опухоли выделено 2 группы: дифференцированные (высоко и умереннодифференцированные) и низкодифференцированные опухоли. В выделенных группах проводили анализ экспрессии исследуемых микроРНК во всех образцах тканей (опухолевой и смежной условно нормальной). В группе дифференцированных опухолей не выявлено статистически значимых изменений экспрессии исследуемых микроРНК. На рис. 34 приведены данные об экспрессии (средние значения) let-7a, miR155, miR-205 в группе низкодифференцированных опухолей. За статистически значимый результат принимали значение критерия * - p< 0,05. Показано, что низкодифференцированных уровень опухолях экспрессии микроРНК статистически let-7a достоверно в снижен 72 значительно сильнее (p = 0,013) по сравнению смежной условно нормальной тканью на расстоянии 5 см (рис.34). Рисунок 34. Экспрессия микроРНК let-7a, miR-155, miR-205 в низкодифференцированных опухолях у пациентов с НМРЛ. Снижение экспрессии микроРНК let-7a относительно смежной условно нормальной ткани на расстоянии 2см статистически не значимо, однако наблюдается явная тенденция (p = 0,06), и, вероятно, при увеличении выборки возможно появление достоверных отличий. В группе низкодифференцированных опухолей достоверной разницы экспрессии miR-155 и miR-205 в опухолевой ткани и смежной с ней нормальной ткани на различном расстоянии не выявлено. Для оценки изменения уровня экспрессии микроРНК let-7a, miR-155, miR205 в зависимости от статуса курения, выделены 2 группы: курящие и некурящие пациенты. Проводили сравнительный анализ данных экспрессии микроРНК в образцах опухоли и образцах смежной условно нормальной ткани в выделенных группах. В группе курящих пациентов не выявлено статистически значимых различий экспрессии let-7a, miR-155, miR-205 в опухоли и смежной ткани. На рис. 35 представлены средние значения экспрессии исследуемых микроРНК со стандартной ошибкой в группе некурящих пациентов. За статистически значимый результат принимали значение критерия * - p< 0,05. 73 Рисунок 35. Средние значения экспрессии микроРНК let-7a, miR-155, miR-205 в опухолях у некурящих пациентов. Как видно из диаграммы, экспрессия микроРНК let-7a значительно снижена (p = 0,044) в опухолях у некурящих пациентов относительно смежной нормальной ткани (рис. 35). В этой группе не выявлено достоверных различий экспрессии микроРНК miR-155, miR-205 в опухолевой ткани и смежной с ней условно нормальной ткани. Определение уровня экспрессии микроРНК let-7a, miR-155, miR-205 в смежной условно нормальной ткани на различном расстоянии. Проведен сравнительный анализ экспрессии исследуемых микроРНК в образцах смежной условно нормальной ткани на расстоянии 2 и 5 см от опухоли. На рис. 36 представлены средние значения экспрессии каждой и выбранных микроРНК во всех исследуемых образцах. Из рисунка видно, что для микроРНК let-7a и miR-155 в ряду опухоль смежная с опухолью ткань на расстоянии 2см смежная с опухолью ткань на расстоянии 5 см происходит увеличение среднего значения экспрессии. Мы также сравнивали средние значения экспрессии микроРНК let-7a, miR155, miR-205 в образцах смежной условно нормальной ткани на расстоянии 2 и 5 см от опухоли во всех выделенных клинико-морфологических группах пациентов: по гистологическому типу (АК, ПКРЛ, АПКРЛ), по возрасту (моложе и старше 63 лет), по стадии заболевания (I-II стадия и III-VI стадия ), по статусу курения 74 (курящие и некурящие пациенты), по степени дифференцировки опухоли (дифференцированные и низкодифференцированные). Рисунок 36. Среднее значение экспрессии let-7a, miR-155, miR-205 во всех исследуемых образцах. Let-7a 5 см Экспрессия снижена 2 см Экспрессия слабо изменена Tumor -1,65 miR-205 5 см 0,39 0,48 Экспрессия повышена miR-155 5 см 2 см 2 см Tumor 2,1 Tumor 0,76 1,39 1,37 1,54 2,1 Выявлены достоверные различия экспрессии исследуемых микроРНК в смежной условно нормальной ткани на расстоянии 5 см от опухоли в зависимости от степени дифференцировки опухоли и статуса курения. В остальных группах статистически значимых отличий экспрессии let-7a, miR-155, miR-205 не выявлено. На рис. 37 представлены средние значения экспрессии микроРНК let-7a, miR-155, miR-205 в смежной условно нормальной ткани на 5 см от опухоли в группах курящих и не курящих пациентов. За статистически значимый результат принимали значение критерия * - p< 0,05. Из рисунка видно, что экспрессия let-7a достоверно ниже (p = 0,038) в смежной нормальной ткани на 5 см от опухоли у курящих пациентов. Разница средних значений экспрессии для miR-155 в смежной нормальной ткани в группах курящих/некурящих пациентов не достоверна, однако, определенно существует тенденция к статистической значимости подобных отличий (p = 0,07). Для miR-205 статистически достоверные отличия в экспрессии не выявлены. 75 Рисунок 37. Средние значения экспрессии let-7a, miR-155, miR-205 в смежной условно нормальной ткани на 5 см в группах курящих и не курящих пациентов. На рис. 38 представлены средние значения экспрессии let-7a, miR-155, miR205 в смежной условно нормальной ткани на расстоянии 5 см от опухоли в группах пациентов с дифференцированными/низкодифференцированными опухолями. За статистически значимый результат принимали значение критерия * - p< 0,05. Рисунок 38. Средние значения экспрессии микроРНК let-7a, miR-155, miR-205 в смежной нормальной ткани на 5 см в группах пациентов с дифференцированными и низкодифференцированными опухолями. Анализ показал, что смежная условно нормальная ткань на расстоянии 5 см в группах пациентов с дифференцированными и низкодифференцированными опухолями имеет противоположные профили экспрессии let-7a, miR-155, miR-205 76 (рис. 38). У пациентов с дифференцированными опухолями (высоко и умереннодифференцированные) уровень экспрессии исследуемых микроРНК снижен, а в группе пациентов с низкодифференцированным раком уровень экспрессии микроРНК let-7a, miR-155, miR-205 наоборот повышен. Статистически значимыми оказались отличия в значениях экспрессии miR-155 (p = 0,046) и miR-205 (p = 0,043) в смежной условно нормальной ткани на расстоянии 5 см от опухоли между выделенными группами пациентов. При сравнении уровня экспрессии miR-155 и miR-205 в смежной с опухолью нормальной ткани в группах пациентов с различной степенью дифференцировки опухоли выявлено, что в низкодифференцированных опухолях экспрессия этих микроРНК выше. В ряде работ показано, что гиперэкспрессия miR-205 характерна для плоскоклеточного НМРЛ с чувствительностью и специфичностью 96 и 90% соответственно (Lebanony D., 2009; Bishop J.A., 2010). Статистически достоверных отличий экспрессии микроРНК miR-205 в опухоли относительно смежной с опухолью условно нормальной ткани на расстоянии 2 и 5 см от опухоли, а также возможных ассоциаций с клинико-морфологическими параметрами пациентов не выявлено. В работах на клеточных линиях НМРЛ показано, что экспрессия let-7a ассоциирована с ингибированием пролиферации и инвазии опухолевых клеток (Wang Y., 2013). Показано, что let-7 ингибирует процессы пролиферации и инвазии путем регуляции трансляции таких генов, как KRAS и HMGA2. В работе Johnson C.D. и соавторов показано, что гиперэкспрессия let-7a ингибирует рост клеток и тормозит клеточный цикл (Johnson C.D., 2007), а интраназальное применение let-7 на ксенографтных мышиных моделях подавляет рост аденокарциномы легкого (Esquela-Kerscher A., 2008). Кроме того, уменьшение экспрессия let-7a у пациентов с НМРЛ ассоциировано с неблагоприятным прогнозом (Takamizawa J., 2004; Yanaihara N., 2006). В исследовании Yanaihara N. и соавторов выявлено, что высокий уровень экспрессии miR-155 и низкий уровень экспрессии let-7a коррелирует со снижением средней выживаемости 77 пациентов с аденокарциномой легкого (Yanaihara N., 2006). Показано, что гиперэкспрессия miR-155 и miR-146 ассоциирована со снижением выживаемости в группе пациентов с плоскоклеточным НМРЛ (Raponi M., 2009). В настоящее время не найдено работ, характеризующих профили экспрессии микроРНК в смежных с опухолью условно нормальных тканях при НМРЛ. Следовательно, сравнить полученные результаты по экспрессии исследуемых микроРНК в смежной с опухолью нормальной ткани на расстоянии 5 см не представляется возможным. Проведенное исследование показало, что, во-первых, экспрессия let-7a снижена в опухолевой ткани, относительно смежной условно нормальной ткани. Во-вторых, снижение уровня экспрессии let-7a и miR-155 в опухоли характерно для относительно молодых (моложе 63 лет), некурящих пациентов, поздней стадии опухолевого процесса, низкодифференцированных опухолей. В-третьих, уровни экспрессии let-7a, miR-155, miR-205 в смежных с опухолью условно нормальных тканях на расстоянии 5 см различны в группах курящих/некурящих пациентов, пациентов с различной дифференцировкой опухоли. Показано, что у относительно молодых пациентов онкологические заболевания обычно протекает более агрессивно, чем у пациентов старше. Это явление может объяснить тот факт, что в нашем исследовании снижение уровня экспрессии микроРНК, выполняющих функции супрессоров опухоли, let-7a и miR155 в опухолевой ткани ассоциировано с молодым возрастом, III-VI стадией заболевания и низкой степенью дифференцировки. Результаты нашего исследования показывают обратную корреляцию между уровнем экспрессии двух микроРНК (в большей степени let-7a, в меньшей – miR-155) и злокачественностью опухолевого процесса. Этот факт позволяет предположить использование прогностических микроРНК маркеров благоприятности прогноза. let-7a и опухоли, miR-155 вероятно, в перспективе в качестве свидетельствующих о не 78 3.5. Анализ генетических и эпигенетических изменений в опухолевом окружении. В опухоли и смежной с ней тканях происходят различные патологические физиологические процессы, такие как, местное воспаление, отеки, нарушение кровоснабжения, гипоксические повреждения, приводящие к прогрессированию предопухолевых и опухолевых изменений эпителия. В процессе формирования опухоли происходит отклонение клетки от обычного пути морфофункционального развития. В ходе канцерогенеза, клетки приобретают новые морфологические и биологические свойства, не присущие им при нормальном развитии. Для определения степени злокачественности опухоли и прогноза течения заболевания важное значение имеют не только признаки клеточной патологии (катаплазии), но и состояние клеточных и внеклеточных компонентов стромы, лимфоидная инфильтрация и многие другие морфологические характеристики, дающие оценку не только непосредственно опухолевой ткани, но и окружающим её тканям. Все эти патоморфологические изменения, как правило, располагающиеся вокруг опухоли, объединяют термином «опухолевое поле». В 1953г. английский патологоанатом R.A. Willis сформулировал теорию «опухолевого поля». Согласно этой теории, злокачественная опухоль возникает не из одной клетки, а из множества рядом расположенных клеток, подвергшихся воздействию канцерогенных факторов. Эти группы клеток формируют множественные очаговые пролифераты, которые и составляют «опухолевое поле». При этом, опухолевая трансформация очаговых пролифератов происходит последовательно из центра к периферии до слияния очагов малигнизации в один опухолевый узел. В этом же году (1953 г.) D. Slaughter предложил теорию «полей канцеризации». Согласно этой теории, на формирование и прогрессирование опухоли влияют не только молекулярно-генетические нарушения, происходящие непосредственно в потенциально злокачественных клетках-предшественницах и приводящие к их опухолевой трансформации, но также большое влияние имеют 79 генетические изменения, происходящие в опухолевой строме и условно нормальных тканях, окружающих опухоль, так называемых «полях канцеризации» (Slaughter D., 1953). Суть обеих сформулированных теорий одинакова, и говорит о важном значении опухолевого окружения для формирования, развития, характера течения опухоли. В теории «опухолевого поля» ведущее значение придается наличию морфологических изменений в смежных с опухолью тканях. В слизистой пищевода «поля канцеризации» выявлены на расстоянии 7-10 см от очага плоскоклеточного рака, тогда как по данным морфологического исследования эти участки имели нормальную структуру (Braakhuis, B. J., 2003). Важное клиническое значение имеет тот факт, что «поля канцеризации» часто остаются после хирургического лечения первичной опухоли и могут привести к новым опухолевым образованиям, определяемым теперь клиницистами как «вторая первичная опухоль» или «местный рецидив» в зависимости от точного места и временного интервала. Диагноз и лечение эпителиальных опухолей должны быть сосредоточены не только на опухоли, но также и на области, смежной с нею (Guo M., 2004; Braakhuis, B.J., 2003). Наличие «полей канцеризации» описано для многих локализаций, не только для опухолей головы и шеи (полость рта, ротоглотка и гортань), но и для легкого, вульвы, пищевода, шейки матки, молочной железы, кожы, толстого кишечника, желудка и мочевого пузыря (Braakhuis, B. J., 2003; Nakajima, T., Oda, I., 2006; Nakajima, T., Maekita, T., 2006; Partridge M., 2000; Wistuba I.I., 2006; Wistuba I.I., 2000; Miyazaki M., 2002; Hafner C., 2002; Eads, C. A., 2000). Под термином «поле канцеризации» чаще подразумевают участок смежной с опухолью ткани, клетки которого содержат структурные генетические нарушения, такие как потеря гетерозиготности, микросателлитная нестабильность и мутации. Однако показано, что помимо структурных генетических нарушений эпигенетические нарушения также обнаруживаются в «полях канцеризации» при новообразованиях различной локализаций: опухолях желудка, печени, толстого кишечника, пищевода, легких, 80 молочной железы и почек (Nakajima, T., Maekita, T., 2006; Guo M., 2004; Issa J.P., 2001; Kondo Y., 2000; Arai E., 2006; Shen L., 2005; Yan P.S., 2006). В зависимости от этапа формирования злокачественной опухоли морфологические изменения смежных с опухолью тканей обнаруживаются в определенных пределах, тогда как пределы распространения молекулярногенетически изменений для НМРЛ изучены крайне мало. 81 ЗАКЛЮЧЕНИЕ. В работе изучены аллельные нарушения в опухолевой ткани и смежной с ней нормальной ткани у пациентов с НМРЛ. Проведен микросателлитный анализ хромосомных районов 12p23.3, 2q35, 3p14.2, 3p22.2, 3p26.3, 9p22.1, 17p13.3. Обнаружена высокая частота исследуемых генетических нарушений в НМРЛ (в среднем частота составила 50%). ПГ/МН в смежной с опухолью условно нормальной ткани на расстоянии 2 и 5 см от опухоли не обнаружено. Выявлены достоверные ассоциации между ПГ и/или МН регионов D9S925, D17S928 и плоскоклеточным раком легкого (p = 0,005; p = 0,002). ПГ и/или МН районов D3S1768, D17S938 достоверно ассоциированы с курением (p = 0,004; p = 0,032). Выявлено, что частые нарушения в регионе D2S405 ассоциированы с I-II стадией опухолевого процесса (p = 0,016), а изменения в локусе D3S1300 (p = 0,019) характерны для III-IV стадии заболевания. Проведен анализ мутаций генов EGFR, KRAS и транслокации гена ALK у пациентов с не плоскоклеточным НМРЛ для определения чувствительности опухоли к таргетным препаратам. Структурные изменения выявлены в 37% случаев. Частота мутаций гена EGFR составила 19%, мутации в гене KRAS обнаружены в 17% случаев, а транслокация гена ALK выявлена у 6% пациентов. Изучены эпигенетические изменения в опухолевой ткани и смежной с ней нормальной ткани на различном расстоянии у пациентов с НМРЛ. Проведен анализ аномального метилирования генов RASSF1A (3p21.3), FHIT (3p14.2), DAPK1 (9q21.33), CDH1 (16q22.1), CD44 (11p13), TIMP3 (22q12.3), MGMT (10q26.3). В среднем частота эпигенетических изменений в опухоли у пациентов с НМРЛ составила 43%, в смежной условно нормальной ткани на расстоянии 2 см 17%, в смежной условно нормальной ткани на расстоянии 5 см 8%. У 104 из 110 пациентов с НМРЛ (95%) обнаружены эпигенетические изменения по крайней мере в одном из исследуемых генов. Частоты эпигенетических изменений в опухоли у пациентов с НМРЛ составили 70% для гена RASSF1A, 52% для гена FHIT, 17 % для гена DAPK1, 61% для гена CDH1, 34% для гена CD44, 43% для гена TIMP3, 15% для гена MGMT. Выявлены статистически значимые ассоциации 82 между метилированием промоторов генов CDH1 (p = 0,002) и CD44 (p = 0,002) и плоскоклеточным раком, между гиперметилированием промоторов генов RASSF1A и FHIT во всех трех исследуемых образцах и поздней стадией заболевания (III-IV) с метастазами в регионарные лимфоузлы (p = 0,008). Показано, что эпигенетические изменения в гене DAPK1 ассоциированы с метастазированием (p = 0,005). Найденные в опухоли эпигенетические изменения промоторов генов RASSF1A и FHIT могут рассматриваться как маркеры неблагоприятного прогноза течения заболевания, а наличие гиперметилирования промотора гена DAPK1, как маркер, ассоциированный с метастазированием. Определены уровни экспрессии микроРНК let-7a, miR-155, miR-205 в опухолевой ткани и смежной с опухолью условно нормальной ткани на расстоянии 2 и 5 см от опухоли. Показано, что экспрессия let-7a снижена в опухолевой ткани, относительно смежной условно нормальной ткани. Снижение уровня экспрессии микроРНК let-7a и miR-155 в опухоли характерно для относительно молодых (моложе 63 лет), некурящих пациентов, поздней стадии опухолевого процесса, низкодифференцированных опухолей. Впервые проведен анализ молекулярно-генетических изменений в смежных с опухолью условно нормальных тканях на расстоянии 2 и 5 см. Данные настоящего исследования свидетельствуют о том, что в смежных морфологически нормальных тканях на расстоянии 2 и 5 см от опухоли происходят многочисленные изменения, характеризующие молекулярно-генетический профиль смежных с опухолью тканей. Показано, что структурные изменения генома, такие как ПГ/МН не характерны для смежных нормальных тканей пациентов с НМРЛ. Эпигенетические изменения, наоборот, характерны не только для опухоли, но и для морфологически условно нормальных тканей на расстоянии 2 и 5 см от опухоли. При этом в направлении опухоль – смежная условно нормальная ткань на расстоянии 2 см – смежная условно нормальная ткань на расстоянии 5 см происходит уменьшение частоты эпигенетических изменений. 83 Уровни экспрессии микроРНК let-7a, miR-155, miR-205 в смежных с опухолью условно нормальных тканях на расстоянии 5 см от опухоли отличны в группах курящих/некурящих пациентов, пациентов с разной степенью дифференцировки опухоли. Суммируя генетических многочисленные нарушений, следует данные отметить, исследования что НМРЛ молекулярнохарактеризуется структурными и эпигенетическими нарушениями генома, и эти изменения имеют высокую частоту. Смежные с опухолью, морфологически неизмененные ткани формируют «опухолевое окружение», изменения в котором в свою очередь, вероятно, значительно влияют на поведение самой опухоли. 84 ВЫВОДЫ. 1. Частоты аллельных нарушений локусов D2S405, D2S164, D3S1300, D3S1768, D3S1539, D9S925, D17S938 в НМРЛ составили 47%, 43%, 60%, 52%, 52%, 47%, 49%, соответственно. Потери гетерозиготности и/или микросателлитной нестабильности в смежных с опухолью условно нормальных тканях на 2 и 5 см от опухоли не обнаружено. 2. Частоты аномального метилирования промоторов генов RASSF1A, FHIT, DAPK1, CDH1, CD44, TIMP3, MGMT в НМРЛ составили 70%, 52%, 17%, 61%, 34%, 43% и 15%, соответственно. В смежных с опухолью условно нормальных тканях на 2 и 5 см от опухоли выявлены эпигенетические изменения, частота которых снижается при удалении от опухолевого очага. 3. Частота мутаций гена EGFR составила 19%: 81% мутаций гена EGFR составляют делеции 19 экзона, 19% приходится на однонуклеотидные замены в 21 экзоне. Мутации в гене KRAS обнаружены в 17% случаев, из них 84% мутаций в 12 кодоне гена. Транслокация гена ALK выявлена у 6% пациентов. 4. Экспрессия микроРНК let-7a достоверно снижена в опухолевой ткани, относительно смежной условно нормальной ткани. Снижение уровня экспрессии let-7a и miR-155 в опухоли характерно для относительно молодых, некурящих пациентов, III-VI стадии заболевания, низкодифференцированных опухолей. Уровни экспрессии микроРНК let-7a, miR-155, miR-205 в условно нормальных тканях на расстоянии 5 см от опухоли различны в группах курящих/некурящих пациентов, пациентов с различной степенью дифференцировки опухоли. 5. В качестве маркеров неблагоприятного прогноза могут рассматриваться аллельные нарушения локусов D2S405, D3S1300, гиперметилирование промоторов генов RASSF1A, FHIT, DAPK1, снижение экспрессии микроРНК let-7a и miR-155 в опухолевой ткани. В качестве маркеров дифференциальной диагностики плоскоклеточного рака легкого – потеря 85 гетерозиготности и/или микросателлитная нестабильность локусов D9S925, D17S938, аномальное метилирование промоторов генов CDH1 и CD44. 6. В смежных с опухолью морфологически неизмененных тканях на расстоянии 2 и 5 см от опухоли происходят такие эпигенетические изменения как, гиперметилирование промоторов генов и изменение экспрессии микроРНК. Выявленные эпигенетические изменения характеризуют «опухолевое окружение» выявленное на расстоянии 5 см от опухолевого очага. ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ. 1. Выявленные молекулярные повреждения: аллельный дисбаланс локусов D2S405, D3S1300, метилирование генов RASSF1A, FHIT, DAPK1, снижение экспрессии микроРНК let-7a и miR-155 в опухолевой ткани могут использоваться в качестве маркеров прогноза НМРЛ в комплексе с другими клиническими показателями. 2. Аллельные нарушения локусов D9S925, D17S938, аномальное метилирование промоторов генов CDH1 и CD44 могут быть использованы в качестве диагностических маркеров плоскоклеточного рака легкого. 3. Определение мутаций генов EGFR, KRAS и транслокации гена ALK у пациентов с не аденоплоскоклеточный плоскоклеточным рак) рекомендовано чувствительности к таргетной терапии. НМРЛ (аденокарцинома, для определения 86 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ. 1. Горбунова В.Н. Введение в молекулярную диагностику и генотерапию наследственных заболеваний / В.Н. Горбунова, В.С.Баранов. – СПб, «Специальная литература». – 1997. –286 с. 2. Залетаев Д.В. Системы генетических и эпигенетических маркёров в диагностике онкологических заболеваний / Д.В. Залетаев, М.А. Пальцев.- М.: ОАО Издательство «Медицина», 2009. – 384 с. 3. Кекеева Т.В. Молекулярно-генетические изменения при раке предстательной железы. / Кекеева Татьяна Владимировна – М. – 2008. 4. Кекеева Т.В. Потеря гетерозиготности и микросателлитная нестабильность в стромальных и эпителиальных клетках рака предстательной железы / Т.В. Кекеева, О.П. Попова, Л.Э. Завалишина, П.В. Шегай, Б.Я. Алексеев, Ю.Ю. Андреева, Д.В. Залетаев, М.В. Немцова // Молекулярная биология. – 2008, – № 42, – С. 96-109. 5. Чиссов В.И. Злокачественные новообразования в России в 2011 году (заболеваемость и смертность) – М.: ФГБУ «МНИОИ им. П.А.Герцена» Минздавсоцразвития России. – 2012. – 260 с. 6. Чиссов В.И. Онкология / В.И. Чиссов, С.Л. Дарьялова – М.: ГЭОТАР-Медиа, – 2007. – 560 с. 7. Шикеева А.А. Аллельные нарушения у пациентов с немелкоклеточным раком легкого / А.А. Шикеева, Т.В. Кекеева, Л.Э. Завалишина, Ю.Ю. Андреева, Г.А. Франк // Архив Патологии. – 2013. – № 2. – Том 75. – С. 3-8. 8. Шикеева А.А. Анализ молекулярно-генетических изменений в гене EGFR у пациентов с НМРЛ / А.А. Шикеева, Т.В. Кекеева, Л.Э. Завалишина, Ю.Ю. Андреева, Г.А. Франк // Онкохирургия. – 2011. – № 2. – Том 3, – С. 87-88. 9. Шикеева А.А. Эпигенетические изменения при немелкоклеточном раке легкого / А.А. Шикеева, Т.В. Кекеева, Л.Э. Завалишина, Ю.Ю. Андреева, Г.А. Франк // Онкология. Журнал им. П.А. Герцена. – 2013, – №5, – С. 19-25. 87 10. Шикеева А.А. Молекулярно-генетические аспекты немелкоклеточного рака легкого / А.А. Шикеева, Т.В. Кекеева, Л.Э. Завалишина, Ю.Ю. Андреева, Г.А. Франк // Онкология. Журнал им. П.А. Герцена. – 2013. – №5. – С. 62-67. 11. Ahrendt S.A. Microsatellite instability at selected tetranucleotide repeats is associated with p53 mutations in non-small cell lung cancer / S.A. Ahrendt, P.A. Decker, K. Doffek, B. Wang, L. Xu, M.J. Demeure et al. // Cancer Res. – 2000. – Vol. 60(9). – P. 2488-2491. 12. Aisner D.L. Molecular pathology of non–small cell lung cancer. A Practical Guide / D.L. Aisner, C.B. Marshall // Am J Clin Pathol – 2012. – Vol. 138. – P. 332-346 13. Arai E. Regional DNA hypermethylation and DNA methyltransferase (DNMT) 1 protein overexpression in both renal tumors and corresponding nontumorous renal tissues / E. Arai, Y. Kanai, S. Ushijima, H. Fujimoto, K. Mukai, S. Hirohashi // Int Journal Cancer – 2006. – Vol. 119. – P. 288-296. 14. Bandi N. Mir-15a and Mir-16 are implicated in cell cycle regulation in a Rbdependent manner and are frequently deleted or down-regulated in non-small cell lung cancer / S. Zbinden, M. Gugger, et al. // Cancer Res – 2009. – Vol. 69. – P. 5553–5559. 15. Bartel D.P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function / D.P. Bartel // Cell. – 2004. – Vol. 116. – P. 281-297. 16. Baylin S.B., DNA hypermethylation in tumorigenesis: epigenetics joins genetics / S.B. Baylin, J.G. Herman // Trends Genet. – 2000. – Vol. 16. – P. 168–174. 17. Bean J. Acquired resistance to epidermal growth factor receptor kinase inhibitors associated with a novel T854A mutation in a patient with EGFR-mutant lung adenocarcinoma / G.J. Riely, M. Balak, et al. // Clin Cancer Res. – 2008. – Vol. 14(22). – P. 7519–7525. 18. Bean J. MET amplification occurs with or without T790M mutations in EGFR mutant lung tumors with acquired resistance to gefitinib or erlotinib / J. Bean, C. Brennan, J-Y. Shih, et al. // Proc Natl Acad Sci USA. – 2007. – Vol. 104(52). – P. 20932–20937. 88 19. Begum S. An epigenetic marker panel for detection of lung cancer using cell-free serum DNA / S. Begum, M. Brait, S. Dasgupta, K.L. Ostrow, M. Zahurak, A.L. Carvalho, J.A. Califano, N. Steven, S.N. Goodman, H. William, W.H. Westra, M.O. Hoque, D. Sidransky // Clin Cancer Res. – 2011. – Vol. 17(13). – P. 4494– 503. 20. Bell D.W. Increased prevalence of EGFR-mutant lung cancer in women and in East Asian populations: analysis of estrogen-related polymorphisms / B.W. Brannigan, K. Matsuo, et al. // Clin Cancer Res. – 2008. – Vol. 14. – P. 4079–84. 21. Bergethon K. ROS1 rearrangements define a unique molecular class of lung cancers / K. Bergethon, A.T. Shaw, S.H. Ou, et al. // J Clin Oncol. – 2012. – Vol. 30. – P. 863-870. 22. Bishop J.A. Accurate classification of non-small cell lung carcinoma using a novel microRNA-based approach / J.A. Bishop, H. Benjamin, H. Cholakh, A. Chajut, D.P. Clark, W.H. Westra // Clin Cancer Res. – 2010. – Vol. 16. – P. 610– 619. 23. Brown M.T. Regulation, substrates and functions of Src / M.T. Brown, J.A. Cooper // Biochim Biophys Acta. – 1996. – Vol. 1287. – P. 121–149. 24. Buckingham L. PTEN, RASSF1 and DAPK site-specific hypermethylation and outcome in surgically treated stage I and II non-small cell lung cancer patients / L. Buckingham, L. Penfield Faber, A. Kim, et al. // Int J Cancer. – 2010. – Vol. 126. – P. 1630–1639. 25. Calame K. MicroRNA-155 function in B-Cells / K. Calame // Immunity. – 2007. – Vol. 27(6). – P. 825–827. 26. Calin G.A. Human microRNA genes are frequently located at fragile sites and genomic regions involved in cancers / G.A. Calin, C. Sevignani, C.D. Dumitru, T. Hyslop, E. Noch, S. Yendamuri, M. Shimizu, S. Rattan, F. Bullrich, M. Negrini, C.M. Croce // Proc Natl Acad Sci USA. – 2004. – Vol. 101. – P. 2999–3004. 27. Cappuzzo F. Erlotinib as maintenance treatment in advanced non-small-cell lung cancer: a multicentre, randomised, placebo-controlled phase 3 study / F. Cappuzzo, 89 T. Ciuleanu, L. Stelmakh, et al. // Lancet Oncol. – 2010. – Vol. 11(6). – P. 521– 529. 28. Carnero A. The pten/pi3k/Akt signaling pathway in cancer, therapeutic implications / A. Carnero, C. Blanco–Aparicio, O. Renner, W. Link, J.F. Leal // Curr Cancer Drug Targets. – 2008. – Vol. 8. – P. 187–198. 29. Cha S.T. MicroRNA-519c suppresses hypoxia-inducible factor-1alpha expression and tumor angiogenesis / S.T. Cha, P.S. Chen, G. Johansson, et al. // Cancer Res. – 2010. – Vol. 70. – P. 2675–2685. 30. Chang Y.L. Clonality and prognostic implications of p53 and epidermal growth factor receptor somatic aberrations in multiple primary lung cancers / Y.L. Chang, C.T. Wu, S.C. Lin, C.F. Hsiao, Y.S. Jou, Y.C. Lee // Clin Cancer Res. – 2007. – Vol. 13. – P. 52–58. 31. Chen H. Aberrant methylation of FBN2 in human non-small cell lung cancer / H. Chen, M. Suzuki, Y. Nakamura, et al. // Lung Cancer. – 2005. – Vol. 50. – P. 43– 49. 32. Chmara M. Loss of Heterozygosity at Chromosomes 3p and 17p in Primary Nonsmall Cell Lung Cancer / M. Chmara, A. Wozniak, K. Ochman, G. Kobierska, R. Dziadziuszko, K. Sosinska-Mielcarek, et al. // Anticancer Res. – 2004. – Vol. 24(6). – P. 4259-4263. 33. Crawford M. MicroRNA 133B targets pro-survival molecules MCL-1 and BCL2L2 in lung cancer / M. Crawford, K. Batte, L. Yu, et al. // Biochem Biophys Res Commun. – 2009. – Vol. 388. – P. 483–489. 34. Davies K.D. Identifying and targeting ROS1 gene fusions in non-small cell lung cancer / K.D. Davies, A.T. Le, M.F. Theodoro, et al. // Clin Cancer Res. – 2012. – Vol. 18(17). – P. 4570-4579. 35. Eads C.A. Fields of aberrant CpG island hypermethylation in Barrett’s esophagus and associated adenocarcinoma / C.A. Eads, R.V. Lord, S.K. Kurumboor, K. Wickramasinghe, M.L. Skinner, et al. // Cancer Res. – 2000. – Vol. 60. – P. 50215026. 90 36. Elton T.S. Regulation of the MIR155 host gene in physiological and pathological processes / T.S. Elton, H. Selemon, S.M. Elton, N.L. Parinandi // Gene. – 2013. – Vol. 532(1). – P. 1-12. 37. Engelman J.A. MET amplification leads to gefitinib resistance in lung cancer by activating ErbB3 signaling / J.A. Engelman, K. Zejnullahu, T. Mitsudomi, et al. Science. – 2007. – Vol. 316. – P.1039–1043. 38. Engelman J.A. PF00299804, an irreversible pan-ErbB inhibitor, is effective in lung cancer models with EGFR and ERBB2 mutations that are resistant to gefitinib / J.A. Engelman, K. Zejnullahu, C.M. Gale, et al. // Cancer Res. – 2007. – Vol. 67. – P. 11924–11932. 39. Esquela-Kerscher A. The let-7 microRNA reduces tumor growth in mouse models of lung cancer / A. Esquela-Kerscher, P. Trang, J.F. Wiggins, L. Patrawala, A. Cheng, L. Ford, et al. // Cell Cycle. – 2008. – Vol. 7. – P. 759–764. 40. Faraoni I. MiR-155 gene: a typical multifunctional microRNA / I. Faraoni, F.R. Antonetti, J. Cardone, E. Bonmassar // Biochim Biophys Acta. – 2009. – Vol. 1792(6). – P. 497–505. 41. Gallardo E. Mir-34a as a prognostic marker of relapse in surgically resected nonsmall-cell lung cancer / E. Gallardo, A. Navarro, N. Vinolas, et al. // Carcinogenesis. – 2009. – Vol. 30. – P. 1903–1909. 42. Gately K. The role of the molecular footprint of EGFR in tailoring treatment decisions in NSCLC / K. Gately, J. O’Flaherty, F. Cappuzzo, R. Pirker, et al. // J Clin Pathol. – 2012. – Vol. 65. – P. 1-7. 43. Gazdar A.F., Multifocal lung cancers-clonality vs field cancerization and does it matter? / A.F. Gazdar, J.D. Minna // J Natl Cancer Inst. – 2009. – Vol. 101. – P. 3541–543. 44. George R.E. Activating mutations in ALK provide atherapeutic target in neuroblastoma / R.E. George, T. Sanda, M. Hanna, et al. // Nature. – 2008. – Vol. 455. – P. 975-978. 45. Geurts-Giele W. R. Molecular diagnostics of a single multifocal non-small cell lung cancer case using targeted next generation sequencing / W.R. Geurts-Giele, 91 A. Dirkx-van der Velden, N.M. Bartalits, L.C. Verhoog, W.E. Hanselaar, W.N. Dinjens // Virchows Arch. – 2012. – Vol. 10. – P. 1346–1354. 46. Girard L. Genomewide allelotyping of lung cancer identifies new regions of allelic loss, differences between small cell lung cancer and non-small cell lung cancer, and loci clustering / L. Girard, S. Zöchbauer-Müller, A.K. Virmani, A.F. Gazdar, J.D. Minna // Cancer Res. – 2000. – Vol. 60(17). – P. 4894–4906. 47. Girard N. Genomic and mutational profiling to assess clonal relationships between multiple non-small cell lung cancers / N. Girard, I. Ostrovnaya, C. Lau, B. Park, M. Ladanyi, D. Finley, et al. // Clin Cancer Res. – 2009. – Vol. 15. – P. 5184–5190 48. Grepmeier U. Deletions at chromosome 2q and 12p are early and frequent molecular alterations in bronchial epithelium and NSCLC of long-term smokers / U. Grepmeier, W. Dietmaier, J. Merk, P.J. Wild, et al. // Int J Oncol. – 2005. – Vol. 27(2). – P. 481–488. 49. Greulich H. Oncogenic transformation by inhibitor-sensitive and -resistant EGFR mutants / H. Greulich, T.H. Chen, W. Feng, et al. // PLoS Med. – 2005. – Vol. 2(11). – P. 313. 50. Gu J. Aberrant Promoter Methylation Profile and Association with Survival in Patients with Non−Small Cell Lung Cancer / J. Gu, D. Berman, C. Lu, I.I. Wistuba, J.A. Roth, M. Frazier, M.R. Spitz, X. Wu // Clin Cancer Res. – 2006. – Vol. 12. – P. 7329-7338. 51. Guo M. Promoter hypermethylation of resected bronchial margins: a field defect of changes? / M. Guo, M.G. House, C. Hooker, Y. Han, E. Heath, E. Gabrielson, S.C Yang, S.B. Baylin, et al. // Clin Cancer Res. – 2004. – Vol. 10. – P. 51311513. 52. Hafner C. Clonality of multifocal urothelial carcinomas: 10 years of molecular genetic studies / C. Hafner, R. Knuechel, R. Stoehr, A. Hartmann // Int J Cancer. – 2002. – Vol. 101. – P. 1-6. 92 53. He X. Let-7a elevates P21(WAF1) levels by targeting of NIRF and sup- presses the growth of A549 lung cancer cells / X. He, C. Duan, J. Chen, et al. // FEBS Lett. – 2009. – Vol. 583. – P. 3501–3507. 54. Heller G. Lung cancer: from single-gene methylation to methylome profiling / G. Heller, C.C. Zielinski, S. Zochbauer-Muller // Cancer Metastasis Rev. – 2010. – Vol. 29. – P. 95–107. 55. Herbst R.S. Phase II selection design trial of concurrent chemotherapy and cetuximab versus chemotherapy followed by cetuximab in advanced-stage nonsmall-cell lung cancer: Southwest Oncology Group study S0342 / R.S. Herbst, K. Kelly, K. Chansky, et al. // J Clin Oncol. – 2010. – Vol. 28. – P. 4747–4754. 56. Hirao T. Tobacco smoke-induced DNA damage and an early age of smoking initiation induce chromosome loss at 3p21 in lung cancer / T. Hirao, H.H. Nelson, T.D. Ashok, J.C. Wain, E.J. Mark, et al. // Cancer Res. – 2001. – Vol. 61(2). – P. 612–615. 57. Husain H. ALK-targeted therapy for lung cancer: ready for prime time / H. Husain, C.M. Rudin // Oncology (Williston Park). – 2011. – Vol. 25(7). – P. 597601. 58. Husgafvel-Pursiainen K. P53 mutations and exposure to environmental tobacco smoke in a multicenter study on lung cancer / L. Husgafvel-Pursiainen, P. Boffetta, A. Kannio, F. Nyberg, G. Pershagen, A. Mukeria, V. Constantinescu, C. Fortes, S. Benhamou // Cancer Res. – 2000. – Vol. 60. – P. 2906–2911. 59. Ihle N.T. Effect of KRAS oncogene substitutions on protein behavior: implications for signaling and clinical outcome / N.T. Ihle, L.A. Byers, E.S. Kim, et al. // J Natl Cancer Inst. – 2012. – Vol. 104. – P. 228–239. 60. Ihle N.T. Mutations in the phosphaidylinositol-3-kinase pathway predict for antitumour activity of the inhibitor PX-866 whereas oncogenic Ras is a dominant predictor for resistance / N.T. Ihle, R. Lemos Jr., P. Wipf, et al. // Cancer Res. – 2009. – Vol. 69. – P. 143–150. 61. Irby R.B. Role of Src expression and activation in human cancer / R.B. Irby, T.J. Yeatman // Oncogene. – 2000. – Vol. 19. – P. 5636–5642. 93 62. Issa J.P. Accelerated age-related CpG island methylation in ulcerative colitis / J.P. Issa, N. Ahuja, M. Toyota, M.P. Bronner, T.A. Brentnall // Cancer Res. – 2001. – Vol. 61. – P. 3573-3577. 63. Ji M. Association of promoter methylation with histologic type and pleural indentation in non-small cell lung cancer (NSCLC) / M. Ji, Y. Zhang, B. Shi, P. Hou // Diagnostic Pathol. – 2011. – Vol. 6. – P. 48. 64. Jiang J. Real-time expression profiling of microRNA precursors in human cancer cell lines / J. Jiang, E.J. Lee, Y. Gusev, et al. // Nucleic Acids Res. – 2005. – Vol. 33. – P. 5394–5403. 65. Johnson C.D. The let-7 microRNA represses cell proliferation pathways in human cells / C.D. Johnson, A. Esquela-Kerscher, G. Stefani, M. Byrom, K. Kelnar, D. Ovcharenko, et al.// Cancer Res. – 2007. – Vol. 67. – P. 7713–7722. 66. Johnson S.M. RAS is regulated by the let-7 microRNA family / S.M. Johnson, H. Grosshans, J. Shingara, M. Byrom, R. Jarvis, et al. //Cell. – 2005. – Vol. 120. – P. 635–647. 67. Junker K. HER2/neu expression and amplification in non-small cell lung cancer prior to and after neoadjuvant therapy / K. Junker, U. Stachetzki, D. Rademacher, et al. // Lung Cancer. – 2005. – Vol. 48. – P. 59-67. 68. Kawano O. PIK3CA mutation status in Japanese lung cancer patients / O. Kawano, H. Sasaki, K. Endo, et al. // Lung Cancer. – 2006. – Vol. 54. – P. 209215. 69. Keedy V.L. American Society of Clinical Oncology provisional clinical opinion: epidermal growth factor receptor (EGFR) mutation testing or patients with advanced non-small-cell lung cancer considering first-line egfr tyrosine kinase inhibitor therapy / V.L. Keedy, S. Temin, M.R. Somerfield, et al. // J Clin Oncol. – 2011. – Vol. 29. – P. 2121–2127. 70. Kim L.C. Src kinases as therapeutic targets for cancer / L.C. Kim, L. Song, E.B. Haura // Nat Rev Clin Oncol. – 2009. – Vol. 6. – P. 587–595. 94 71. Kobayashi S. EGFR mutation and resistance of non–small-cell lung cancer to gefitinib / S. Kobayashi, T.J. Boggon, T. Dayaram, et al. // N Engl J Med. – 2005. – Vol. 352(8). – P. 786–792. 72. Kondo Y. Genetic instability and aberrant DNA methylation in chronic hepatitis and cirrhosis--A comprehensive study of loss of heterozygosity and microsatellite instability at 39 loci and DNA hypermethylation on 8 CpG islands in microdissected specimens from patients with hepatocellular carcinoma / Y. Kondo, Y. Kanai, M. Sakamoto, M. Mizokami, R. Ueda, S. Hirohashi // Hepatology. – 2000. – Vol. 32. – P. 970-979. 73. Kumar M.S. Impaired microRNA processing enhances cellular transformation and tumorigenesis / M.S. Kumar, J. Lu, K.L. Mercer, et al. // Nat Genet. – 2007. – Vol. 39. – P. 673–677. 74. Kwak E.L. Anaplastic lymphoma kinase inhibition in non-small cell lung cancer / E.L. Kwak, Y.J. Bang, D.R. Camidge, et al. // N Engl J Med. – 2010. – Vol. 363. – P. 1693–7103. 75. Le Calvez F. TP53 and KRAS mutation load and types in lung cancers in relation to tobacco smoke: distinct patterns in never, former, and current smokers / F. Le Calvez, A. Mukeria J.D. Hunt, et al. // Cancer Research. – 2005. – Vol. 65. – P. 5076–5083. 76. Lebanony D. Diagnostic assay based on hsa-miR-205 expression distinguishes squamous from nonsquamous non-small-cell lung carcinoma / D. Lebanony, H. Benjamin, S. Gilad, M. Ezagouri, A. Dov, K. Ashkenazi, N. Gefen, S. Izraeli, G. Rechavi, H. Pass, et al. // J Clin Oncol. – 2009. – Vol. 27. – P. 2030–2037. 77. Lee D. Phase II study of erlotinib for chemotherapy-naïve patients with advanced or metastatic non-small cell lung cancer who are ineligible for platinum doublets / D. Lee, S-W. Kim, C. Suh, Y. Han, J-S. Lee // Cancer Chemother Pharmacol. – 2011. – Vol. 67(1). – P. 35–39. 78. Lee Y.S. The tumor suppressor microRNA let-7 represses the HMGA2 oncogene / Y.S. Lee, A. Dutta // Genes Dev. – 2007. – Vol. 21. – P. 1025–1030. 95 79. Leonhardt H. DNA methylation, nuclear structure, gene expression and cancer / H. Leonhardt, M.C. Cardoso // J Cell Biochem Suppl. – 2000. – Vol. (Suppl 35). – P. 78–83. 80. Li C. Lung adenocarcinomas with HER2-activating mutations are associated with distinct clinical features and HER2/EGFR copy number gains / C. Li, Y. Sun, R. Fang, et al. // J Thorac Oncol. – 2012. – Vol. 7. – P. 85-89. 81. Li M. The status of KRAS mutations in patients with non-small cell lung cancers from mainland China / M. Li, L. Liu, Z. Liu, et al. // Oncol Rep. – 2009. – Vol. 22. – P. 1013–1020. 82. Lin P-Y., Yu S.L., Yang P.C. MicroRNA in lung cancer. Br J Cancer. – 2010. – Vol. 103(8). – P. 1144-1148. 83. Lin Q. RASSF1A, APC, ESR1, ABCB1 and HOXC9, but not P16ink4a, DAPK1, PTEN and MT1G genes were frequently methylated in the stage I non-small cell lung cancer in China / Q. Lin, J. Geng, K. Ma, et al. // J Cancer Res Clin Oncol. – 2009. – Vol. 135. – P. 1675–1684. 84. Linardou H. Assessment of somatic K-ras mutations as a mechanism associated with resistance to egfr-targeted agents: a systematic review and meta-analysis of studies in advanced non-small-cell lung cancer and metastatic colorectal cancer / H. Linardou, I.J. Dahabreh, D. Kanaloupiti, et al. // Lancet Oncology. – 2008. – Vol. 9. – P. 962–972. 85. Liu B. Mir-126 restoration down-regulate VEGF and inhibit the growth of lung cancer cell lines in vitro and in vivo / B. Liu, X.C. Peng, X.L. Zheng, et al. // Lung Cancer. – 2009. – Vol. 66. – P. 169–175. 86. Liu X. MicroRNA-31 functions as an oncogenic microRNA in mouse and human lung cancer cells by repressing specific tumor suppressors / X. Liu, L.F. Sempere, H. Ouyang, et al. // J Clin Invest. – 2010. – Vol. 120. – P. 1298–1309. 87. Lynch T.J. Activating mutations in the epider- mal growth factor receptor underlying responsiveness of non–small-cell lung cancer to gefitinib / T.J. Lynch, D.W. Bell, R. Sordella R, et al. // N Engl J Med. – 2004. – Vol. 350(21). – P. 2129–2139. 96 88. M. Gefitinib or chemotherapy for non-small-cell lung cancer with mutated EGFR / M. Maemondo, A. Inoue, K. Kobayashi, et al. // N Engl J Med. – 2010. – Vol. 362. – P. 2380–2388. 89. Marchetti A. Clinical features and outcome of patients with non-small-cell lung cancer harboring BRAF mutations / A. Marchetti, L. Felicioni, S. Malatesta, et al. // J Clin Oncol. – 2011. – Vol. 29. – P. 3574-3579. 90. Markou A. Prognostic value of mature microRNA-21 and microRNA-205 overexpression in non-small cell lung cancer by quantitative real-time RT-PCR / A. Marlou, E.G. Tsaroucha, L. Kaklamanis, et al. // Clin Chem. – 2008. – Vol. 54(10). – P. 1696-1704. 91. Marsit C.J. Alterations of 9p in squamous cell carcinoma and adenocarcinoma of the lung: association with smoking, TP53, and survival / C.J. Marsit, J.K. Wiencke, H.H. Nelson, D.H. Kim, et al. // Cancer Genet Cytogenet. – 2005. – Vol. 162(2). – P. 115–121. 92. Maruyama R. Hypermethylation of FHIT as a prognostic marker in non-small cell lung carcinoma / R. Maruyama, K. Sugio, I. Yoshino, Y. Maehara, A.F. Gazdar // Cancer. – 2004. – Vol. 100. – P. 1472–1477. 93. McDermott U. Genomic alterations of anaplastic lymphoma kinase may sensitize tumors to anaplastic lymphoma kinase inhibitors / U. McDermott, A.J. Iafrate, N.S. Gray, et al. Cancer Res. – 2008. – Vol. 68. – P. 3389–3395. 94. Miller V.A. Phase IIb/III double-blind randomized trial of afatinib (BIBW 2992, an irreversible inhibitor of egfr/her1 and her2) + best supportive care (bsc) versus placebo + bsc in patients with nsclc failing 1–2 lines of chemotherapy and erlotinib or gefitinib (lux-Lung 1) (abstract LBA1) / V.A. Miller, V. Hirsh, J. Cadranel, et al. // Ann Oncol. – 2010. – Vol. 21(suppl 8). – P. 1–12. 95. Mirsadraee S, Oswal D, Alizadeh Y, Caulo A, van Beek E Jr. The 7th lung cancer TNM classification and staging system: Review of the changes and implications. World J Radiol. – 2012. – Vol. 4(4). – P. 128-34. 97 96. Mitchell P.S. Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancer detection / P.S. Mitchell, R.L. Parkin, E.M. Kroh, et al. // Proc Natl. Acad Sci USA. – 2008. – Vol. 105. – P. 10513-10518. 97. Mitsudomi T. Gefitinib versus cisplatin plus docetaxel in patients with non-smallcell lung cancer harboring mutations of the epidermal growth factor receptor (WJTOG3405): an open label, randomised phase 3 trial / T. Mitsudomi, S. Morita, Y. Yatabe, et al. // Lancet Oncol. – 2010. – Vol. 11(2). – P. 121–128. 98. Mitsuuchi Y. Cytogenetics and molecular genetics of lung cancer / Y. Mitsuuchi, J.R. Testa // Am. J. Med. Genet. – 2002. – Vol. 115. – P. 183-188. 99. Miyazaki M. The relation of alcohol consumption and cigarette smoking to the multiple occurrence of esophageal dysplasia and squamous cell carcinoma / M. Miyazaki, S. Ohno, M. Futatsugi, H. Saeki, et al. // Surgery. – 2002. – Vol. 131. – P. 7-13. 100. Mok T.S. Gefitinib or carboplatin–paclitaxel in pulmonary adenocarcinoma / T.S. Mok, Y-L. Wu, S. Thongprasert, et al. // N Engl J Med. – 2009. – Vol. 361(10). – P. 947–957. 101. Mossé Y.P. Identification of ALK as a major familial neuroblastoma predisposition gene / Y.P Mossé, M. Laudenslager, L. Longo, et al. // Nature. – 2008. – Vol. 455. – P. 930-935. 102. Nakajima, T. Higher methylation levels in gastric mucosae significantly correlate with higher risk of gastric cancers / T. Nakajima, T. Maekita, I. Oda, T. Gotoda, et al. // Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. – 2006. – Vol. 15. – P. 23172321. 103. Nakajima, T. Metachronous gastric cancers after endoscopic resection: how effective is annual endoscopic surveillance? / T. Nakajima, I. Oda, T. Gotoda, H. Hamanaka, T. Eguchi, C. Yokoi, D. Saito // Gastric Cancer. – 2006. – Vol. 9. – P. 93-98. 104. Nakayama M. Hypermethylation of the human Glutation S-Transferase-π gene (GSTP1) CpG island is present in a subset of proliferative inflammatory atrophy lesions but not in normal or hyperplastic epitelium of the prostate / M. 98 Nakayama, C.J. Bennett, J.L. Hicks, et al. // Am J Pathol. – 2003. – Vol. 163(3). – P. 923-933. 105. Naoki K. Missense mutations of the BRAF gene in human lung adenocarcinoma / K. Naoki, T.H. Chen, T.H., W.G. Richards, et al. // Cancer Res. – 2002. – Vol. 62. – P. 7001–7003. 106. Navarro A. MicroRNAs expressed during lung cancer development are expressed in human pseudoglandular lung embryogenesis / A. Navarro, R.M. Marrades, N. Vinolas, et al. // Oncology. – 2009. – Vol. 76. – P. 162–169. 107. Neilsen P.M. Mutant p53 drives invasion in breast tumors through up- regulation of miR-155 / P.M. Neilsen, J.E. Noll, S. Mattiske, C.P. Bracken, P.A. Gregory, et al. // Oncogene. – 2013. – Vol. 32(24). – P. 2992-3000. 108. Ou S.I. Comparison of crizotinib (PF-02341066) pharmacokinetics between Asian and non-Asian patients with advanced malignancies / S.I Ou, R. Salgia, J.W. Clark, et al. // J Thorac Oncol. – 2010. – Vol. 5(suppl 5). – P. 382. 109. Paez J.G. EGFR Mutations in lung cancer: correlation with clinical response to gefitinib therapy / J.D. Paez, P.A. Jänne, J.C. Lee, et al. // Science. – 2004. – Vol. 304(5676). – P. 1497–1500. 110. Paik P.K. Clinical characteristics of patients with lung adenocarcinomas harboring BRAF mutations / P.K. Paik, M.E. Arcila, M. Fara, et al. // J Clin Oncol. – 2011. – Vol. 29. P. 2046-2051. 111. Pan H. Loss of heterozygosity patterns provide fingerprints for genetic heterogeneity in multistep cancer progression of tobacco smoke-induced non-small cell lung cancer / H. Pan, J. Califano, J.F. Ponte, et al. // Cancer Res. – 2005. – Vol. 65(5). – P. 1664–1669. 112. Pao W. Acquired resistance of lung adenocarcinomas to gefitinib or erlotinib is associated with a second mutation in the EGFR kinase domain / W. Pao, V.A. Miller, K.A. Politi, et al. // PLoS Med. – 2005. – Vol. 2. – P. 73. 113. Partridge M. A case-control study confirms that microsatellite assay can identify patients at risk of developing oral squamous cell carcinoma within a field 99 of cancerization / M. Partridge, S. Pateromichelakis, E. Phillips, G.G. Emilion, et al. // Cancer Res. – 2000. – Vol. 60. – P. 3893-3898. 114. Porta R. Erlotinib customization based on epidermal growth factor receptor (EGFR) mutations in stage IV non-small-cell lung cancer (NSCLC) patients / R. Porta, C. Queralt, F. Cardenal, et al. // J Clin Oncol. – 2008. – Vol. 26. – P. 8038. 115. Pulford K. The emerging normal and disease-related roles of anaplastic lymphoma kinase / K. Pulford, L. Lamant, E. Espinos, et al. // Cell Mol Life Sci. – 2004. – Vol. 61. – P. 2939-2953. 116. R.M. MicroRNA regulation of inflammatory responses / R.M. O'Connell, D.S. Rao, D. Baltimore // Annu Rev Immunol. – 2012. – Vol. 30. – P. 295–312. 117. Ramalingam S.S. Randomized phase 2 study of PF299804, an irreversible human epidermal growth factor receptor (egfr) inhibitor, versus erlotinib in patients with advanced non-small cell lung cancer (nsclc) after chemotherapy failure: quantitative and qualitative benefits / S.S. Ramalingam, M. Boyer, K. Park, et al. // Ann Oncol. – 2010. – Vol. 21(suppl 8). – P. 122. 118. Ramieri M.T. Detection of HER2 amplification using the SISH technique in breast, colon, prostate, lung and ovarian carcinoma / M.T. Ramieri, R. Murari, C. Botti, et al. // Anticancer Res. – 2010. – Vol. 30. – P. 1287-1292. 119. Raponi M. MicroRNA classifiers for predicting prognosis of squamous cell lung cancer / M. Raponi, L. Dossey, T. Jatkoe, et al. // Cancer Res. – 2009. – Vol. 69. – P. 5776–5783. 120. Reinhart B.J. The 21-nucleotide let-7 RNA regulates developmental timing in Caenorhabditis elegans / B.J. Reinhart, F.J. Slack, M. Basson, A.E. Pasquinelli, J.C. Bettinger, A.E Rougvie, H.R. Horvitz, G. Ruvkun // Nature. – 2000. – Vol. 403. – P. 901–906. 121. Reungwetwattana T. Oncogenic pathways, molecularly targeted therapies, and highlighted clinical trials in non-small-cell lung cancer (NSCLC) / T. Reungwetwattana, S.J. Weroha, J.R. Molina // Clin Lung Cancer. – 2012. – Vol. 13(4). – P. 252-266. 100 122. Riely G.J. Frequency and distinctive spectrum of KRAS mutations in never smokers with lung adenocarcinoma / G.J. Riley, M.G. Kris, D. Rosenbaum, et al. // Clin Cancer Res. – 2008. – Vol. 14. – P. 5731–5734. 123. Rimkunas V.M. Analysis of receptor tyrosine kinase ROS1-positive tumors in non-small cell lung cancer: identification of a FIG-ROS1 fusion / V.M. Rimkunas, K.E. Crosby, D. Li, et al. // Clin Cancer Res. – 2012. – Vol. 18(16). – P. 4449-4457. 124. Roberts P.J. Personalized medicine in non-small-cell lung cancer: is KRAS a useful marker in selecting patients for epidermal growth factor receptor–targeted therapy? / P.J. Roberts, T.E. Stinchcombe, C.J. Der, M.A. Socinski // J Clin Oncol. – 2010. Vol. 28. – P. 4769–4777. 125. Rodig S.J. Unique clinicopathologic features characterize ALK-rearranged lung adenocarcinoma in the Western populations / S.J. Rodig, M. Mino-Kenudson, S. Dacic, et al. // Clin Cancer Res. – 2009. – Vol. 15. – P. 5216-5223. 126. Rosell R. Erlotinib versus chemotherapy (CT) in advanced non-small cell lung cancer (NSCLC) patients (p) with epidermal growth factor receptor (EGFR) mutations: Interim results of the European Erlotinib Versus Chemotherapy (EURTAC) phase III randomized trial / R. Rosell, R. Gervais, A. Vergnenegre, et al. // J Clin Oncol. – 2011. – Vol. 29. – P. 7503. 127. Salomon D.S. Epidermal growth factor–related peptides and their receptors in human malignancies / D.S. Salomon, R. Brandt, F. Ciardiello, N. Normanno // Crit Rev Oncol Hematol. – 1995. – Vol. 19. – P. 183–232. 128. Sanchez-Cespedes M. Chromosomal alterations in lung adenocarcinoma from smokers and nonsmokers / M. Sanchez-Cespedes, S.A. Ahrendt, S. Piantadosi, R. Rosell, et al. // Cancer Res. – 2001. – Vol. 61(4). – P. 1309–1313. 129. Sekido Y. Molecular genetics of lung cancer / Y. Sekido, K.M. Fong, J.D. Minna // Ann. Rev. Med. – 2003. – Vol. 54. – P. 73-87. 130. Sequist L.V. First-line gefitinib in patients with advanced non-small-cell lung cancer harboring somatic EGFR mutations / L.V. Sequist, R.G. Martins, D. Spigel, et al. // J Clin Oncol. – 2008. – Vol. 26. – P. 2442–2449. 101 131. Sequist L.V. Randomized Phase II study of erlotinib plus tivantinib versus erlotinib plus placebo in previously treated non–small-cell lung cancer / L.V. Sequist, J. von Pawel, E.G. Garmey, et al. // J Clinical Oncology. – 2011. – Vol. 29(24). – P. 3307–3315. 132. Sharma S.V. Epidermal growth factor receptor mutations in lung cancer / S.V. Sharma, D.W. Bell, J. Settleman, D.A. Haber // Nat Rev Cancer. – 2007. – Vol. 7(3). – P. 169–181. 133. Shen L. MGMT promoter methylation and field defect in sporadic colorectal cancer / L. Shen, Y. Kondo, G.L. Rosner, L. Xiao, N.S. Hernandez, J. Vilaythong, P.S. Houlihan, et al. // P.J Natl Cancer Inst. – 2005. – Vol. 97. – P. 1330-1338. 134. Shepherd F.A. Erlotinib in previously treated non–small-cell lung cancer / F.A. Shepherd, J. Rodrigues Pereira, T. Ciuleanu, et al. // N Engl J Med. – 2005. – Vol. 53(2). – P. 123–132. 135. Shigematsu H. Somatic mutations of the HER2 kinase domain in lung adenocarcinomas / H. Shigematsu, T. Takahashi, M. Nomura, et al. // Cancer Res. – 2005. Vol. 65. – P. 1642-1646. 136. Shimizu S. High frequency of clonally related tumors in cases of multiple synchronous lung cancers as revealed by molecular diagnosis / S. Shimizu, Y. Yatabe, T. Koshikawa, N. Haruki, S. Hatooka, et al. // Clin Cancer Res. – 2000. – Vol. 6. – P. 3994–3999 137. Slaughter D.P. Field cancerization in oral stratified squamous epithelium; clinical implications of multicentric origin / D.P. Slaughter, H.W. Southwick, W. Smejkal // Cancer. – 1953. – Vol. 6(5). – P. 963–968. 138. Soda M. Identification of the transforming EML4–ALK fusion gene in non-small-cell lung cancer / M. Soda, Y.L. Choi, M. Enomoto, et al. // Nature. – 2007. – Vol. 448. – P. 561–566. 139. Soria J.C. Efficacy of everolimus (RAD001) in patients with advanced nsclc previously treated with chemotherapy alone or with chemotherapy and egfr 102 inhibitors / J.C. Soria, F.A. Shepherd, J.Y. Douillard, et al. // Ann Oncol. – 2009. – Vol. 20. P. 1674–1681. 140. Sos M.L. Genetic insight and therapeutic targets in squamous-cell lung cancer / M.L. Sos, R.K. Thomas // Oncogene. – 2012. – Vol. 23. – P. 640. 141. Sozzi G. Loss of FHIT function in lung cancer and preinvasive bronchial lesions / G. Sozzi, U. Pastorino, L. Moiraghi, E. Tagliabue, et al. // Cancer Res. – 1998. – Vol. 58(22). – P. 5032–5037. 142. Spigel D.R. Final efficacy results from OAM4558g, a randomized phase II study evaluating MetMAb or placebo in combination with erlotinib in advanced NSCLC / D.R. Spigel, T.J. Ervin, R. Ramlau, et al. // J Clin Oncol. – 2011. – Vol. 29(Suppl 15). – P. 7505. 143. Steele N.L. A phase 1 pharmacokinetic and pharmacodynamic study of the histone deacetylase inhibitor belinostat in patients with advanced solid tumour / N.L. Steele, J.A. Plumb, L. Vidal, et al. // Clin Cancer Res. – 2008. – Vol. 14. – P. 804–810. 144. Subramanian J. Lung cancer in never smokers: a review / J. Subramanian, R. Govindan // J Clin Oncol. – 2007. – Vol. 25. – P. 561–570. 145. Summy J.M. Src family kinases in tumor progression and metastasis / J.M. Summy, G.E. Gallick // Cancer Metastasis Rev. – 2003. – Vol. 22. – P. 337–358. 146. Sun Y. Mir-126 inhibits non- small cell lung cancer cells proliferation by targeting EGFL7 / Y. Sun, Y. Bai, F. Zhang, et al. // Biochem Biophys Res Commun. – 2010. – Vol. 391. – P. 1483–1489. 147. Takamizawa J. Reduced expression of the Let-7 microRNAs in human lung cancers in association with shortened postoperative survival / J. Takamizawa, H. Konishi, K. Yanagisawa, et al. // Cancer Research. – 2004. – Vol. 64. – P. 3753– 3756. 148. Takamochi K. Clonality status of multifocal lung adenocarcinomas based on the mutation patterns of EGFR and KRAS / K. Takamochi, S. Oh, J. Matsuoka, K. Suzuki // Lung Cancer. – 2012. – Vol. 75. – P. 313–320. 103 149. Tam W. bic, a novel gene activated by proviral insertions in avian leukosis virus-induced lymphomas, is likely to function through its noncoding RNA / W. Tam, D. Ben-Yehuda, W.S. Hayward // Mol Cell Biol. – 1997. – Vol. 17(3). – P. 1490–1502. 150. Tang J.M. Phosphorylated Akt overexpression and loss of PTEN expression in non-small cell lung cancer confers poor prognosis / J.M. Tang, Q.Y. He, R.X. Guo, X.L. Chang // Lung Cancer. – 2006. – Vol. 51. – P. 151–191. 151. Tang X. Epidermal growth factor receptor abnormalities in the pathogenesis and progression of lung adenocarcinomas / X. Tang, M. VarellaGarcia, A.C. Xavier, E. Massarelli, et al. // Cancer Prev Res. – 2008. – Vol 1. – P. 192-200. 152. Tessema M. Concomitant promoter methylation of multiple genes in lung adenocarcinomas from current, former and never smokers / M. Tessema, Y.Y. Yu, C.A. Stidley, et al. // Carcinogenesis. – 2009. – Vol. 30. – P. 1132–1138. 153. Tili E. MiR-155: on the crosstalk between inflammation and cancer / E. Tili, C.M. Croce, J.J. Michaille // Int Rev Immunol. – 2009. – Vol. 28(5). – P. 264–284. 154. Tomizawa K. Prognostic and predictive implications of HER2/ERBB2/neu gene mutations in lung cancers / K. Tomizawa, K. Suda, R. Onozato, et al. // Lung Cancer. – 2011. – Vol. 74. – P. 139-144. 155. Tseng R.C. Genomewide loss of heterozygosity and its clinical associations in non small cell lung cancer / R.C. Tseng, J.W. Chang, F.J. Hsien, Y.H. Chang, C.F. Hsiao, J.T. Chen, et al. // Int J Cancer. – 2005. – Vol. 117(2). – P. 241–247. 156. Vahakangas K.H. P53 and k-ras mutations in lung cancers from former and never-smoking women / K.H. Vahakangas, W.P. Bennett, K. Castren, et al. // Cancer Res. – 2001. – Vol. 61. – P. 4350–4356. 157. Vaissiere T. Quantitative analysis of DNA methylation profiles in lung cancer identifies aberrant DNA methylation of specific genes and its association with gender and cancer risk factors / T. Vaissierre, R.J. Hung, D. Zaridze, et al. // Cancer Res. – 2009. – Vol. 69. – P. 243–252. 104 158. Van Den Broeck A. Lung cancer. A modified epigenome / A. Van Den Broeck, P. Ozenne, B. Eymin, S. Gazzeri // Cell Adhesion & Migration. – 2009. – Vol. 4(1) – P. 107-113 159. Verri C. Fragile histidine triad gene inactivation in lung cancer. The European early lung cancer project / C. Verri, L. Roz, D. Conte, T. Liloglou, A. Livio, A. Vesin, et al. // Am J Respir Crit Care Medicine. – 2009. – Vol. 179(5). – P. 396-401. 160. Wang Y.Y. MicroRNA let-7a inhibits the proliferation and invasion of nonsmall cell lung cancer cell line 95D by regulating K-Ras and HMGA2 gene expression / Y.Y. Wang, T. Ren, Y.Y. Cai, X.Y. He // Cancer Biother Radiopharm. – 2013. – Vol. 28(2). – P. 131-137. 161. Warth A. Clonality of multifocal nonsmall cell lung cancer: implications for staging and therapy / A. Warth, S. Macher-Goeppinger, T. Muley, M. Thomas, H. Hoffmann, P.A. Schnabel et al. // Eur Respir J. – 2012. – Vol. 39. – P. 1437– 1442 162. Weir B.A. Characterizing the cancer genome in lung adenocarcinoma / B.A. Weir, M.S. Woo, G. Getz, et al. // Nature. – 2007. – Vol. 450(7171). – P. 893–898. 163. Weiss J. Frequent and focal FGFR1 amplification associates with therapeutically tractable FGFR1 dependency in squamous cell lung cancer / J. Weiss, M.L. Sos, D. Seidel, et al. // Sci Transl Med. – 2010. – Vol. 2. – P. 93. 164. Wen J. Genetic and epigenetic changes in lung carcinoma and their clinical implications / J. Wen, J. Fu, W. Zhang, M. Guo // Modern Pathology. – 2011. – Vol. 24(7). – P. 932–943. 165. Willis R.A. Epithelial tumor of the urinary passages. Pathology of Tumors. London. – 1967. – Ch. 28. – P. 471–485. 166. Willis R.A. Pathology of tumors. London: Butterwoeth, 1953. 167. Wistuba I.I. High resolution chromosome 3p allelotyping of human lung cancer and preneoplastic/preinvasive bronchial epithelium reveals multiple, discontinuous sites of 3p allele loss and three regions of frequent breakpoints / I.I. 105 Wistuba, C. Behrens, A.K. Virmani, et al. // Cancer Res. – 2000. – Vol. 60. – P. 1949–1960. 168. Wistuba I.I. Lung cancer preneoplasia / I.I.Wistuba, A.F. Gazdar // Annu Rev Pathol. – 2006. – Vol. 1. – P. 331–348. 169. Woenckhaus M. Multitarget FISH and LOH analyses at chromosome 3p in non–small cell lung cancer and adjacent bronchial epithelium / M Woenckhaus, U. Grepmeier, P.J. Wild, et al. // Am J Clin Pathol. – 2005. – Vol. 123(5). – P. 752761. 170. World Health Organization. World health statistics 2013. – ISBN. – 2013. 171. Wrage M. Genomic profiles associated with early micrometastasis in lung cancer: relevance of 4q deletion / M. Wragee, S. Ruosaari, P.P. Eijk, J.T. Kaifi, et al. // Clin Cancer Res. – 2009. – Vol. 15(5). – P. 1566–1574. 172. Yan P.S. Mapping geographic zones of cancer risk with epigenetic biomarkers in normal breast tissue / P.S. Yan, C. Venkataramu, A. Ibrahim, J.C. Liu, R.Z. Shen, N.M. Diaz, et al // Clin Cancer Research. – 2006. – Vol. 12. – P. 6626-6636. 173. Yanaihara N. Unique microRNA molecular profiles in lung cancer diagnosis and prognosis / N. Yanaihara, N. Caplen, E. Bowman, M. Seike, et al. // Cancer Cell. – 2006. – Vol. 9. – P. 189–198. 174. Yendamuri S. 3p22.1 and 10q22.3 deletions detected by fluorescence in situ hybridization (FISH): a potential new tool for early detection of non-small cell lung cancer (NSCLC) / S. Yendamuri, A.A. Vaporciyan, T. Zaidi, et al. // J Thorac Oncol. – 2008. – Vol. 3(9). – P. 979–984. 175. Yu S.L. MicroRNA signature predicts survival and relapse in lung cancer / S.L. Yu, H.Y. Chen, G.C. Chang, et al. // Cancer Cell. – 2008. – Vol. 13. – P. 48– 57. 176. Zhou C. Erlotinib versus chemotherapy as first-line treatment for patients with advanced EGFR mutation- positive non-small-cell lung cancer (OPTIMAL, CTONG-0802): a multicentre, open-label, randomised, phase 3 study / C. Zhou, YL. Wu, G. Chen, et al. // Lancet Oncol. – 2011. – Vol. 12(8). – P. 735–742. 106 177. Zienolddiny S. Loss of heterozygosity is related to p53 mutations and smoking in lung cancer / S. Zienolddiny, D. Ryberg, M.O. Arab, V. Skaug, A. Haugen // Br J Cancer. – 2001. – Vol. 84(2). – P. 226-231. 178. Zochbauer-Muller S. Molecular pathogenesis of lung cancer / S. Zochbauer-Muller, A.F. Gazdar, J.D. Minna // Ann Rev Physiol. – 2002. – Vol. 64. – P. 681-708.
