молекулярно- генетические аспекты наследственной и
реклама
МОЛЕКУЛЯРНОГЕНЕТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ НАСЛЕДСТВЕННОЙ И СПОРАДИЧЕСКОЙ ФОРМ РАКА ТОЛСТОЙ КИШКИ Н.И. Поспехова, д.б.н. ФГБУ «Государственный научный центр колопроктологии» Минздрава РФ г. Москва, 2013 рак толстой кишки 2009 г.: • зарегистрировано 57 363 случаев РТК (Рак ободочной кишки+Рак прямой кишки) • Умерло: 38 343 больных • Прирост за 2004-2009 – 10% • В России - 2 место по заболеваемости среди ЗНО [Аксель, Давыдов, 2011 рак толстой кишки Проблемы: Диагностика - более 50% РТК диагностируются на 3-4 стадиях Основная причина смерти – метастатический РТК Генетика РТК • Наследственность • Изменчивость Наследственный РТК Наследственный Неполипозный Рак Толстой Кишки – ННПРТК, синдром Линча Семейный аденоматоз толстой кишки - САТК Наследственный неполипозный рак толстой кишки (ННПРТК) История открытия ННПРТК связана с именем американского ученого Генри Линча, который в 1966 г. описал 2 семьи на западе Соединенных Штатов, где в нескольких поколениях встречались больные РТК, в сочетании со злокачественными опухолями желудка и эндометрия. Данное наблюдение было названо «семейным раковым синдромом» В 2004 году на международной конференции в городе Bethesda описанный синдром был окончательно переименован в синдром Линча ННПРТК характеризуется преимущественно поражением правых отделов ободочной кишки На долю РТК при синдроме Линча приходится 1-3% всех случаев заболевания колоректальным раком Риск развития РТК при с-ме Линча составляет около 80% Высокий риск развития РТМ, РЖ и др. ННПРТК (Синдром Линча) Клинические критерии • • • • • Амстердамские критерии I (1991 г. ): 1. Молодой возраст возникновения заболевания (до 50 лет) 2. Наличие 3 или более родственников с морфологически верифицированным раком толстой кишки 3. Заболевание колоректальным раком более чем в 1 поколении 4. Не меньше чем один из заболевших, должен быть родственником первой степени родства по отношению к остальным 2 5. САТК должен быть исключен • Амстердамские критерии II (1999 г.): дополнительный критерий к Амстердамским критериям I — наличие 3 или более родственников с ННПРТК-ассоциированными опухолями (рак эндометрия, тонкой кишки, желудка, яичников, уретры, почечной лоханки) Критерии Bethesda (2004г.) • 1. Колоректальный рак, возникший в возрасте до 50 лет • 2. Наличие синхронных, метахронных опухолей толстой кишки или ННПРТК-ассоциированных опухолей, независимо от возраста • 3. Колоректальный рак с повышенным уровнем микросателлитной нестабильности, диагностированный в возрасте до 60 лет • 4. Рак толстой кишки, выявленный у 2 или более родственников первой или второй степени родства в любом возрасте • 5. Колоректальный рак, диагностированный у одного или более родственников первой степени родства в сочетании с ННПРТК-ассоциированной опухолью, при возникновении одного рака в возрасте до 50 лет Эффективность критериев У пациентов соответствующих Амстердамским критериям частота обнаружения наследственных мутаций около 50% У пациентов соответствующих критериям Bethesda эта частота колеблется от 10 до 20% 50% mut АК 15% mut Bethesda Генетика синдрома Линча Причина возникновения – наследственная мутация в одном из генов системы репарации неправильно спаренных нуклеотидов (mismatch repair - MMR) MLH1 PMS2 MSH2 MLH3 MSH6 PMS1 •аутосомно-доминантный тип наследования •неполная пенетрантность (до 80%) Частоты мутаций в генах MMR при наследственном неполипозном раке толстой кишки – InSiGHT database • MLH1 – 38% • MSH2 – 33% • MSH6 – 19% • PMS2 – 8% • MLH3 – 2% Май 2013 г. Зарегистрировано 2923 уникальных герминальных вариантов www.insight-group.org Система mismatch-репарации Мутации в генах, кодирующих любой из ферментов, участвующих в системе репарации ДНК у человека, сопровождаются формированием мутантного фенотипа, и как следствие, к накоплению соматических мутаций К злокачественной трансформации клеток приводят накопление критического числа мутаций в отсутствие адекватной системы репарации ДНК Экзонная структура генов MLH1 и MSH2 Экзоны гена MLH1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 ген расположен на участке хромосомы 3p21 Экзоны гена MSH2 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 расположен на участке хромосомы 2p16 Так как частых мутаций из более чем 1000 известных к настоящему времени в генах нет, приходится изучать все экзоны указанных генов Молекулярно-генетические методы • Выделение ДНК, РНК • Полимеразная цепная реакция - ПЦР • Полимеразная цепная реакция в реальном времени – ПЦР-РВ • Электрофорез в полиакриламидном геле - CSGE • Секвенирование Пример электрофоретического разделения амплифицированных фрагментов ДНК методом CSGE 15экзон 13экзон 11экзон 1 2 3 4 5 6 7 1,7, 10 лунки – вариант 2, 3, 5, 6, 8, 9 лунки – норма 8 9 10 Пример сиквенса фрагмента ДНК Стрелкой Стрелкойуказана указаназамена заменануклеотида нуклеотидаGG на С на С Молекулярно-генетическая диагностика ННПРТК 1 этап. Исследование микросателлитной нестабильности в опухоли – MSI: MSI-S (stable) или MSI-H (high) 2 этап. В случае MSI-H – определение соматической мутации в гене BRAF (V600E). 3 этап. При отсутствии BRAF-мутации – исследование генов MMR. Синдром Линча – опыт ГНЦК Пациент Возраст, диагноз Мутация Cемья М5 РТК, РЖ – 50 MLH1- р.R100X 5РТК, РЖ, ОГМ М35 2РТК – 25, 26 MLH1- р.Lys618del - М38 РТК - 42 MLH1- c.546-2A/G 3 РТК М63 3 РТК – 42, 60, 72 MLH1- c.1896+1G/C 3 РЖ, 2 РТК, РМЖ М64 РТК - 33 MLH1 – p.R100P 3 РТК М71 РТК - 41 MSH6 – p.I745N - М87 3 РТК – 37, 51, 60 MLH1 – p.680R РТМ, РМЖ М94 2 РТК, РПрЖ, Рмочет. – 42 - 60 MSH2 – c.942+3A/T 4 РТМ, РТК, 2 РЖ, РТМ, Ркожи, РШМ M107 РТК, РЖ – 43, 44 MLH1 – p.691delAT РТК Пример из практики ГНЦК Пациент м35 1 диагноз – местно-распространенный рак сигмовидной кишки (25 лет) 2 диагноз - рак прямой кишки (26 лет) ВОПРОС ОБ ОБЪЕМЕ ОПЕРАЦИИ Молекулярно-генетическое исследование Взятие биопсийного образца опухоли и образца крови 1. Исследование микросателлитной нестабильности: MSI-H - 5/5 маркеров 2. Поиск соматических мутаций в гене BRAF: BRAF3. Поиск наследственной мутации в генах: мутация c.1846_1848del в гене MLH1 семья м35 45 лет p.Lys618del 23 года 2 РТК-25, 26 лет p.Lys618del p.Lys618del Bethesda семья м5 РТК 55лет p.R100X РТК T3NxM0 РТК 50 лет р.R100X 35лет p.R100X РТК T2NxM0 АК1, Bethesda семья И.Ю. РТК 30 лет РТК 39, 51 год РТК - 42 года (c.546-2A>G) АК1, Bethesda РТК – 40 лет семья м63 РЖ 56 лет РЖ 58 лет РЖ 57 лет РТК 55 лет 3 РТК с 40 лет (c.1896+1G>C) РТК - 42 года РМЖ – 45 лет (c.1896+1G>C) АК1, АК2, Bethesda 40 лет Мутация не обнаружена РИСК РАЗВИТИЯ РАКОВ РАЗНОЙ ЛОКАЛИЗАЦИИ У НОСИТЕЛЕЙ МУТАЦИИ В ГЕНЕ MMR H. F. A. Vasen Guidelines for the clinical management of Lynch syndrome (hereditary non-polyposis cancer), 2007 Протокол ведения пациентов с синдромом Линча • Колоноскопия у здоровых носителей мутации (с 20-25 лет до 80 лет, 1 раз в 2-3 года) • раннее выявление опухоли • снижает риск смерти от РТК • Для пациентов с синдромом Линча и диагностированным РТК сообщается об увеличении продолжительности жизни и снижении риска развития 2-ой опухоли в толстой кишке при выполнении субтотальной колэктомии. Но учитывая значимое снижение качества жизни после операции, объем оперативного вмешательства необходимо обсудить с пациентом. H.F.A. Vasen Guidelines for the clinical management of Lynch syndrome (hereditary non-polyposis cancer), 2007 Критерии отбора • Для всех пациентов со спорадическим РТК в возрасте до 43-50 лет необходимо исследование микросателлитной нестабильности • Для всех пациентов с РТК с семейноотягощенным анамнезом необходимо исследование микросателлитной нестабильности • В случае MSI-H статуса опухоли – дальнейшая ДНК-диагностикa генов MMR Семеный аденоматоз толстой кишки САТК • Тяжелое наследственное заболевание, характеризующееся поражением толстой кишки множественными аденоматозными полипами и 100% индексом их малигнизации. • Приблизительно 1% от всех случаев рака толстой кишки обусловлен этим заболеванием. • Выделяют тяжелую, классическую и ослабленную формы САТК. • Другие опухоли: эпидермоидная киста, доброкачественная остеома, аденомы верхнего ЖКТ, десмоиды, опухоли щитовидной железы и головного мозга. Классическая и тяжелая формы полипоза • Развитие сотен и даже тысяч полипов • Рост полипов может начинаться уже с первой декады жизни • Средний возраст развития рака толстой кишки у больных составляет около 30 - 35 лет • У превалирующего числа больных заболевание обусловлено наследственными мутациями в гене APC • Тип наследования аутосомнодоминантный Ослабленная форма полипоза • Наличие менее 100 аденоматозных полипов • Нижняя граница числа полипов – не определена • Более поздние сроки возникновения и озлокачествления полипов • Для данной формы свойственен скудный семейный анамнез • Часть случаев заболевания связана с наследственными мутациями в гене АРС • Часть случаев заболевания связана с наследственными мутациями в гене MYH • Тип наследования аутосомнорецессивный (поражены обе хромосомы) однако некоторые ученые отмечают большое значении для развития заболевания именно гетерозиготных мутаций в гене MYH Структура гена APC Ген APC содержит 15 кодирующих экзонов (8535 нуклеотидных пар) и кодирует белок, состоящий из 2843 аминокислотных остатков (310кДа) Экзон 15 составляет более 75% кодирующей последовательности ДНК гена APC и является наиболее частой мишенью для наследуемых и соматических мутаций Функционирование гена АРС в Wnt-пути Раковые клетки толстой кишки, мутантные по гену АРС, имеют высокий уровень свободного β-катенина. Считают, что накопление свободного β-катенина является ранним, и, возможно, инициирующим событием канцерогенеза в кишечном тракте млекопитающих Типы патогенных мутаций в гене АРС Sarah E. Kerr APC Germline Mutations in Individuals Being Evaluated for Familial Adenomatous Polyposis, 2013 Корреляция генотип-фенотип при САТК Классическая и тяжелая формы 5ʹ- начало Кодоны: 168 5ʹ- начало 3ʹ- конец 1250 1464 1580 Ослабленная форма Кодоны: 163 334 5ʹ- начало Кодоны: 3ʹ- конец 1596 2644 Десмоидная болезнь 1395 3ʹ- конец 2000 Ген MYH • Расположен на 1 хромосоме • Ген включает 16 кодирующих экзонов • Продукт гена MYH участвует в репарации окислительных повреждений ДНК • Биаллельные (расположенные на обеих родительских хромосомах) мутации этого гена являются генетической причиной аутосомнорецессивной формы заболевания, однако для некоторых популяций описана значимость для заболевания и гетерозиготных мутаций • Для данного гена характерны миссенс-мутации (аминокислотные замены), которые в основном встречаются в 7 и 13 экзонах (Y165C и G382D) Пациенты Отобраны 56 образцов крови больных САТК, наблюдавшиеся в ГНЦК 32 - с классической или тяжелой формой 24 пробанда с ослабленной формой САТК Проведена ДНК-диагностика всех кодирующих экзонов генов APC и MYH Проведено молекулярно-генетическое обследование кровных родственников в нескольких семьях, где у обследованных пациентов были выявлены мутации Пациенты с классической или тяжелой формой полипоза Средний возраст 26 лет, 2 родственника Родословная пациента с классической формой полипоза 51 год c.646-1G>A 28 лет 24 года c.646-1G>A 18 лет c.646-1G>A c.646-1G>A Особенности расположения наследственных мутаций в гене APC у российских пациентов • Расположение мутаций: кодоны 213 - 1344 5ʹ- начало кодоны 213 3ʹ- конец 1344 5ʹ- начало Классическая форма кодоны 168 1580 3ʹ- конец Новые мутации в гене APC • Из 22 найденных герминальных мутаций 9 описаны впервые: p.Q260X, p.Y1183X, p.289del4 , p.589del11, p.864delC, p.903del7, p.1100del4, p.1114delC, p.Q1191X • Частота новых мутаций составила 40,9% 1 Результаты молекулярно-генетического исследования генов MYH и APC у пациентов с ослабленной формой полипоза • Частота мутаций в генах MYH и APC: 25% (6/24) • В гене MYH обнаружены варианты: p.D382D p.G382D, p.G169D (дважды) • В гене APC дважды обнаружен вариант: p.I1307K • Мутации выявлены только среди пациентов, у которых количество полипов было более 20 (p=0,003) Алгоритм исследования генетической предрасположенности к разным формам САТК у пациентов с классической или тяжелой формой заболевания – исследование гена APC У больных с ослабленной формой в первую очередь исследовать ген MYH и концевые области гена АРС Молекулярно-генетическое исследование имеет смысл проводить у пациентов с количеством полипов более 20 Семейный колоректальный рак X типа • Риск развития рака толстой кишки умеренно высокий • Возраст возникновения рака 50-60 лет • Локализация рака - дистальные отделы • Риск развития раков другой локализации – не высокий • Опухоли микросателлитно стабильны • Наследственные мутации не обнаружены • Нормальная экспрессия генов MMR Редкие синдромы с РТК Синдром Пейтца-Егерса (PJS) Синдром Коудена Семейный ювенильный полипоз (FJP) Синдром Ли-Фраумени STK11 PTEN SMAD4 BMPR1A MADH4 PTEN ТР53 Наследственный РТК – до 5% всех случаев Аспекты изменчивости: рак толстой кишки • Микросателлитная нестабильность • Соматические мутации в генах • Изменение экспрессии генов и микроРНК Микросателлитная нестабильность miсrosatellite instability - MSI TTAACCTTTTTCAGgtaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaggg ген MSH2 27a TTAACCTTTTTCAGgtaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaggg MSI возникает вследствие отсутствия белка системы MMR Фрагментный анализ BAT25 BAT26 NR21 NR24 NR27 пример: маркёр BAT25 Микросателлитная нестабильность MSI По результатам анализа РТК подразделяют на MSI-H (high): 2/5 и более маркеров MSH-L (low): 1/5 маркеров MSS (stable): 0/5 В MSI-H опухолях нарушена система репарации MMR Синдром Линча соматическая инактивация генов MMR часто ассоциированы с мутацией в гене BRAF Микросателлитная нестабильность MSI MSI-H опухоли: • не склонны к метастазированию, имеют благоприятный прогноз. • для метастатического РТК отмечена более высокая эффективность терапии 5-фторурацилом и лейковорином Соматические мутации в генах В большинстве опухолей мутированы гены APC и TP53 KRAS – 35-45% BRAF– 5-15% PIK3CA– 10-20% NRAS – 2-4% AKT1, ABL1, MET, EGFR Предиктивное и прогностическое значение мутационного статуса опухоли Ген KRAS мутации в 12,13,61 кодонах– 35-45% Ретроспективный анализ результатов лечения в исследованиях CRYSTAL и OPUS, проспективное исследование PRIME - наличие мутации в гене KRAS сопровождается резистентностью к таргетным препаратам цетуксимабу и панитумумабу (антитела к EGFR) С 2009 г. оценка статуса KRAS - обязательна перед назначением анти-EGFR антител Мутации в 13 кодоне – противоречивые данные. ген BRAF мутация V600E (15 экзон) частота мутаций 5-15% больные с мутацией в гене BRAF разделяются на 2 группы с противоположными клиническими характеристиками: BRAF-mut + MSI-H благоприятный прогноз BRAF-mut + MSS очень плохой прогноз – резистентны к цетуксимабу и химиотерапии Безрецидивная выживаемость (II и III стадия РТК): при наличии мутации 7,5 мес. при отсутствии мутации – 25,2 мес. [Roth A. et al., JCO,2010] ген PIK3CA Большая часть мутаций в 20 и 9 экзонах частота – 5-20% • При мутации в PIK3CA – устойчивость к цетуксимабу • в случае PIK3CA-mut прием аспирина увеличивает выживаемость Ретроспектиное исслеование 964 пациента Liao et al. Aspirin use, tumor PIK3CA mutation, and colorectal-cancer survival . N Engl J Med. 2012 ген NRAS NRAS - гомолог KRAS. Частота мутаций NRAS в аденокарциномах толстой кишки менее 5%. Мутации в 12, 13 кодонах Существуют свидетельства, что мутации в NRAS аналогичны по своей предиктивной значимости с мутациями в KRAS. предсказательные маркеры при лечении антителами к EGFR – цетуксимаб, панатумумаб R. Wong и D. Cunningham, AJCM 2008 в перспективе для отбора пациентов на таргетную терапию анти-EGFR антителами помимо KRAS-тестирования в стандарты обследования больных с метастатическим РТК будет включено тестирование генов BRAF, NRAS, PIK3CA Перспективные направления в онкогенетике Экспрессия определённых генов в опухоли Метод ПЦР в реальном времени ColoPrint® - панель экспрессии 18 генов Идентифицирует пациентов с высоким и низким риском рецидива (стадия II/IIIA) MCTP1 LAMA3 CTSC PYROX D1 IL2RB ZNF697 SLC6A11 IL2RA CYFIP2 PIM3 LIF PLIN3 HSD3B1 ZBED4 PPARA THNSL2 CA4388O2 Пример экспрессионного анализа генов и микроРНК опухолях толстой кишки miR-155 Опухоли с ЭМП CDH1 PDGFR TH VIMEN ZEB2 ZEB1 -2 0 2 4 6 lg -3 -2 -1 0 1 lg СПАСИБО ЗА ВНИМАНИЕ • Телефон: 8 (499) 199 34 92 • E-Mail: [email protected]