Диссертация Батенева Е. И. - Российский онкологический
advertisement
Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Российский онкологический научный центр имени Н.Н.Блохина» На правах рукописи БАТЕНЕВА ЕЛЕНА ИЛЬИНИЧНА Новая диагностическая панель для выявления наследственной предрасположенности к развитию рака молочной железы и рака яичников 14.01.12 — Онкология Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научные руководители: д.м.н. Любченко Л.Н. д.б.н. Трофимов Д.Ю. Москва — 2015 2 ОГЛАВЛЕНИЕ СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ………………………………………………….. 5 ВВЕДЕНИЕ………………………………………………………………....... 8 ГЛАВА 1. Обзор литературы. Наследственная предрасположенность к развитию рака молочной железы и рака яичников………………………... 17 1.1. Белки, вовлеченные в репарацию ДНК, их функции и взаимодействие………………………………………………………... 17 1.2. Cиндром наследственного рака молочной железы и рака яичников (гены BRCA1 и BRCA2) ………………………………………………. 22 1.2.1. Клинические и патоморфологические особенности BRCAассоциированного рака молочной железы и рака яичников…...……………………………………………………... 23 1.2.2. Популяционные особенности распределения герминальных мутаций в генах BRCA1 и BRCA2………………………………. 26 1.3. Редкие наследственные аутосомно-рецессивные синдромы, ассоциированные с раком молочной железы и раком яичников…... 29 1.3.1. Синдром Блума (ген BLM)……………………………………… 29 1.3.2. Атаксия-телеангиэктазия (ген ATM)…………………………… 34 1.3.3. Синдром Ниймеген (ген NBN)………………………………….. 36 1.3.4. Анемия Фанкони (гены FANC)…………………………………. 39 1.4. Синдром Ли-Фраумени-2 (ген CHEK2)………….……………...…... 1.5. Однонуклеотидные полиморфизмы в различных генах и 41 хромосомных локусах, ассоциированные с раком молочной железы и раком яичников…………………………………………….. 43 1.6. Практическое применение результатов генетических исследований………………………………………………………….. 48 3 ГЛАВА 2. Материалы и методы…………………………………………… 57 2.1. Формирование коллекций образцов крови………………………….. 57 2.2. Выделение геномной ДНК…………………………………………… 57 2.3. Дизайн и синтез олигонуклеотидов………………………………….. 59 2.4. ПЦР в режиме реального времени ……………...…………………… 60 2.5. Секвенирование ДНК по Сэнгеру…………………………………… 63 2.6. Создание контрольных образцов…………………………………….. 64 2.7. Методы статистического анализа……………………………………. 64 ГЛАВА 3. Результаты и обсуждение……………………………………….. 65 3.1. Оптимальный состав диагностической панели мутаций в генах BRCA1/2 для первичного генетического скрининга больных РМЖ и/или РЯ……………………………………………………………….. 3.2. Показания к проведению молекулярно-генетического тестирования с целью выявления мутаций в генах BRCA1/2……… 3.3. 65 71 Мутации со средней пенетрантностью в генах CHEK2, NBN, BLM – частоты встречаемости в группах больных РМЖ/РЯ и у 3.4. здоровых женщин………………........................................................... 76 3.3.1. Мутации в гене CHEK2 у больных РМЖ/РЯ………………….. 79 3.3.2. Мутация 657del5 в гене NBN у больных РМЖ/РЯ…………….. 80 3.3.3. Мутация Q548X в гене BLM у больных РМЖ/РЯ…………….. 81 Целесообразность включения мутаций в генах CHEK2, NBN, BLM в диагностическую панель для выявления наследственной предрасположенности к РМЖ и РЯ …………………………………. 3.5. 82 Клинико-морфологические характеристики опухолей молочной железы и яичников у носителей мутаций в генах BRCA1, BRCA2, CHEK2, NBN, BLM в сравнении с группой больных без мутаций… 3.6. 85 Двойная гетерозиготность по мутациям в разных генах предрасположенности к раку молочной железы и раку яичников… 92 4 3.7. Однонуклеотидные полиморфизмы в различных генах и хромосомных локусах – частоты встречаемости и ассоциации с риском развития РМЖ и РЯ………………………………………….. 93 3.7.1. Ассоциации однонуклеотидных полиморфизмов с риском развития РМЖ/РЯ в неотобранных группах больных………... 96 3.7.2. Ассоциации однонуклеотидных полиморфизмов с риском развития РМЖ в отобранной группе больных………………… 3.8. 99 Алгоритм проведения молекулярно-генетической диагностики для выявления наследственной предрасположенности к развитию РМЖ и РЯ…...………………………………………………………… 101 ВЫВОДЫ…………………………………………………………………….. 105 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ…………………………………………………… 107 5 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ АТ – атаксия-телеангиэктазия АТФ – аденозин трифосфат ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота ЖКТ – желудочно-кишечный тракт ЗНО – злокачественное новообразование МГК – медико-генетическое консультирование МРТ – магнитно-резонансная томография ННКРР – наследственный неполипозный колоректальный рак ПМЗН – первично-множественные злокачественные новообразования ППР – показатель полигенного риска ПЦР – полимеразная цепная реакция РМЖ – рак молочной железы РНК – рибонуклеиновая кислота РП – рецепторы прогестерона РПЖ – рак предстательной железы РЭ – рецепторы эстрогенов РЯ – рак яичников т.п.н. – тысяча пар нуклеотидов УЗИ – ультразвуковое исследование УЗКТ – ультразвуковая компьютерная томография ЦНС – центральная нервная система ATLD – Ataxia Telangiectasia-like disorder, атаксия-телеангиэктазия-подобное заболевание ATM – ataxia-telangiectasia mutated gene, атаксия-телеангиэктазия мутированный ген ATR – ataxia-telangiectasia and RAD3-related gene, атаксия-телеангиэктазия и RAD3-связанный ген BLM – Bloom syndrome gene, ген синдрома Блума 6 BIC – Breast Cancer Information Core, международная база данных по раку молочной железы BNC2 – basonuclin 2, базонуклин 2 BOADICEA – Breast and Ovarian Analysis of Disease Incidence and Carrier Estimation Algorithm, Анализ заболеваемости раком молочной железы и раком яичников и алгоритм оценки носительства BRCA1 – breast cancer 1 gene BRCA2 – breast cancer 2 gene BRCARPO – BRCA mutation carrier prediction model, модель предсказания носительства BRCA-мутаций BRCC – BRCA1/BRCA2 содержащий комплекс BRIP1/FANCJ – BRCA1-interacting protein 1, BRCA1-взаимодействующий белок 1 CA (15-3,125) – cancer antigen, опухолеассоциированный антиген CDH1 – cadherin 1, кадхерин 1 CHEK2 – checkpoint kinase 2, S. pombe, homolog of CTIP – RBBP8 (ретинобластома-связывающий белок 8), BRCA1-ассоциированный белок FANC (A—M) – гены, ассоциированные с анемией Фанкони FGFR2– fibroblast growth factor receptor 2, рецептор 2 фактора роста фибробластов GWAS – Genome-Wide Association Study, полногеномное ассоциативное исследование HDAC – histone deacetylase, гистон-деацетилаза HER2/neu (ERBB2) – V-ERB-B2 avian erythroblastic leukemia viral oncogene homolog 2 HGVS – Human Genome Variation Society, международное характеризующее геномные варианты HOX – homeobox, гомеобокс KRT (5,6) – keratin, кератин (5,6) LSP1– lymphocyte-specific protein, лимфоцит-специфический белок общество, 7 MAP3K1 – mitogen-activated kinase kinase kinase 1, митоген-активированная киназа киназа киназа 1 MLH (1,3) – mutL, E. coli, homolog of, 1 MMR – mismatch repair, гены репарации неспаренных оснований MRE11– meiotic recombination 11, S. cerevisiae, homolog of, A MSH (2,6) (3; 6) – mutS, E. coli, homolog of, 2 (3; 6) NBN– nibrin, нибрин NBS – Nijmegen breakage syndrome, синдром Ниймеген NF1 – neurofibromin 1, нейрофибромин 1 (O)MIM – (Online) Mendelian Inheritance in Man, электронная база данных о генетических заболеваниях «Менделевское наследование у человека» OR – odds ratio, отношение шансов PALB2/FANCN – partner and localizer of BRCA2, партнер и локализатор BRCA2 PARP– poly(ADP-ribose) polymerase, поли(АДФ-рибоза) полимераза PMS2– postmeiotic segregation increased, S. cerevisiae, 1 (2) POU5F1B – POU domain, class 5, transcription factor 1B, транскрипционный фактор 1B POU-домена класса 5 PTEN – phosphatase and tensin homolog RAD50 (51) – RAD50 (51), S. cerevisiae, homolog of RECQ – геликаза RECQ TOX3 – TOX high mobility group box family member 3 TP53– tumor protein p53 SNP – single nucleotide polymorphism, однонуклеотидный полиморфизм STK11– serine/threonine protein kinase 11, серин/треонин протеинкиназа 11 UICC – Union for International Cancer Control, Международный противораковый союз 8 ВВЕДЕНИЕ Актуальность проблемы Рак молочной железы (РМЖ) и рак яичников (РЯ) представляют собой важную социально-медицинскую проблему в связи с высокой заболеваемостью и смертностью среди женского населения. Ежегодно в мире выявляется около 1,7 млн случаев РМЖ [77]. В РФ в 2012 г. зарегистрированы 59 037 новых больных РМЖ, эта онкологическая патология занимает лидирующее положение как в структуре заболеваемости злокачественными новообразованиями женского населения (20,7%), так и в структуре смертности от них (17,1%). РЯ занимает восьмое место среди всех злокачественных новообразований у женского населения РФ (4,5%), в 2012 г. зарегистрированы 12 935 новых больных. В структуре смертности женщин от злокачественных новообразований РЯ занимает седьмое место (5,8%) [6]. За последние десятилетия во всем мире и в РФ отмечена отчетливая тенденция к росту заболеваемости РМЖ и РЯ [5, 77]. С целью снижения этих показателей необходимо внедрение в клиническую практику инновационных высокотехнологичных методов ранней, в том числе доклинической, диагностики, разработка индивидуальных лечебных и профилактических подходов с учётом генетических факторов риска. На сегодняшний день исходная стадия РМЖ или РЯ является определяющей для прогноза течения заболевания: чем позже ставится диагноз, тем выше стоимость лечения и ниже его эффективность. Согласно данным ВОЗ по РМЖ, при I стадии 5–летний срок переживают 90–95% больных; при IV – менее 10%. При РЯ 5–летняя выживаемость при I стадии составляет 70–80% и только 15% – при IV. В РФ запущенность (выявление III-IV стадий) при РМЖ остается высокой: в 2009 г. она составила 36,1%. Причинами высокой смертности от РЯ являются бессимптомное клиническое течение и несовершенство существующих методов диагностики. В РФ в 2009 г. 62,7% случаев РЯ выявлены на III–IV стадиях [5]. 9 Генетическая предрасположенность является существенным фактором риска развития РМЖ и РЯ: от 5 до 10% случаев РМЖ [7, 123], от 10 до 17% случаев РЯ [9, 105] являются наследственными. Синдром наследственного рака молочной железы и рака яичников, ассоциированный с мутациями в генах BRCA1 и BRCA2, – самое частое аутосомно-доминантное онкологическое заболевание с повышенным риском развития РМЖ и РЯ. На его долю приходится 30-50% наследственных форм РМЖ [66] и 90-95% – РЯ у женщин [105, 120]. Гены BRCA1 и BRCA2 крайне важны для поддержания геномной стабильности и являются классическими онкосупрессорами. Кодируемые ими белки играют ключевую роль в репарации двухцепочечных разрывов ДНК путем гомологичной рекомбинации [120]. Наследственные формы РМЖ и РЯ также могут быть обусловлены гетерозиготными мутациями в других генах, вовлечённых в репарацию ДНК: CHEK2, NBN, BLM, PALB2, ATM, BRIP1, RAD50. Эти мутации редко встречаются в популяции и характеризуются средней пенетрантностью [22, 29–32, 53, 82, 116, 131, 135, 151, 175]. Небольшой в процентном соотношении, но важный вклад в наследственную предрасположенность к РМЖ и РЯ вносят редкие аутосомно-доминантные синдромы (Ли-Фраумени, Пейтца-Егерса, Коудена и другие), они должны быть непременно учтены при проведении дифференциальной диагностики [22, 28, 111, 121, 135, 140, 171]. В популяционной генетике описан эффект основателя (founder effect) – преобладание нескольких мутаций, специфичных для определенной этнической группы или географического региона. Этот эффект находит отражение в спектре мутаций в генах наследственной предрасположенности к РМЖ и РЯ (BRCA1, BRCA2, CHEK2, NBN, BLM и других) во многих популяциях, в том числе в российской [29, 53, 57, 66, 151, 172]. Существование эффекта основателя делает возможным создание соответствующих скрининговых программ и значительно упрощает генетическое тестирование. 10 Исследования, посвящённые изучению частот встречаемости мутаций в различных генах предрасположенности и оценке ассоциированных рисков, проводятся, как правило, на преднамеренных выборках больных РМЖ/РЯ. В то время как именно широкомасштабный скрининг неотобранных групп больных позволяет выявить большинство случаев наследственных форм РМЖ и РЯ, оптимизировать программу лечения и наблюдения этих больных, выявить носителей мутаций в генах BRCA1 и BRCA2 среди родственников и направить усилия на раннюю диагностику онкологических заболеваний. Разработка диагностической панели, включающей распространённые в российской популяции мутации в различных генах, ассоциированные с развитием РМЖ/РЯ, и пригодной для проведения генетического скрининга в широких группах больных РМЖ/РЯ, является актуальной задачей практической онкологии. При проведении полногеномных ассоциативных исследований (GWAS) было идентифицировано множество однонуклеотидных полиморфизмов (SNP) в различных генах и хромосомных локусах, связанных с повышенным риском развития РМЖ и РЯ. Они обладают низкой пенетрантностью, но предполагается, что кумулятивный эффект при носительстве нескольких аллелей риска может быть достаточно выраженным. К однонуклеотидным полиморфизмам, ассоциированным с повышенным риском развития рака молочной железы, относятся, например, rs2981582 в гене FGFR2, rs3817198 в гене LSP1, rs889312 в локусе 5q11, rs13281615 в локусе 8q24, rs13387042 в локусе 2q35, rs3803662 в локусе 16q12 [48, 63, 110, 128, 154]; рака яичников – rs3814113 в локусе 9p22, rs2072590 в локусе 2q31 [78, 153]. Работ, посвященных выявлению ассоциаций однонуклеотидных полиморфизмов и мутаций в других (не BRCA1 и не BRCA2) генах с риском развития РМЖ и/или РЯ в России проведено немного [12, 34, 79, 150], хотя подобные исследования интерес. Дополнение представляют панели определённый научно-практический молекулярно-генетических маркёров, ассоциированных с риском развития РМЖ и/или РЯ, расширит возможности 11 выявления наследственной предрасположенности к этим заболеваниям, позволит проводить мероприятия, направленные на их профилактику и раннюю диагностику в группах генетического риска. Также, несмотря на накопленный научно-практический опыт в вопросах изучения распространённости и этиологии наследственных форм РМЖ и РЯ, в России до сих пор не выработано единого чёткого алгоритма проведения молекулярно-генетической диагностики. При формулировании подобного алгоритма является необходимым обобщение мирового опыта и результатов работы ведущих онкологических и научно-исследовательских центров России для учёта специфических особенностей российской популяции. Цель работы Повысить эффективность выявления наследственной предрасположенности к развитию рака молочной железы и рака яичников с помощью диагностической панели, включающей клинически значимые молекулярно-генетические маркёры. Задачи 1. Сформировать коллекции образцов крови и библиотеку ДНК больных раком молочной железы и/или раком яичников и здоровых женщиндоноров первичной кроводачи (контрольная группа). 2. Разработать реагенты для генотипирования известных мутаций в генах BRCA1 (185delAG, 4153delA, 5382insC, 3819delGTAAA, 3875delGTCT, 300T>G (C61G), 2080delA, 2963del10), BRCA2 (6174delT, 1528delAAAA, 9318delAAAA), CHEK2 (657delACAAA), BLM (1100delC, (1642C>T IVS2+1G>A, (Q548X)), I157T), NBN однонуклеотидных полиморфизмов rs2981582 в гене FGFR2, rs3817198 в гене LSP1, rs889312 в локусе 5q11, rs13281615 в локусе 8q24, rs13387042 в локусе 2q35, rs3803662 в локусе 16q12, rs3814113 в локусе 9p22, rs2072590 в локусе 2q31 методом ПЦР в режиме реального времени. 12 3. С помощью разработанных реагентов определить частоты выбранных мутаций/однонуклеотидных полиморфизмов в российской популяции у больных раком молочной железы и/или раком яичников и в контрольной группе; используя отсутствие статистические методы, выявить наличие или ассоциаций выбранных мутаций/однонуклеотидных полиморфизмов с развитием РМЖ и/или РЯ. 4. Определить оптимальный состав диагностической панели наиболее распространённых в российской популяции мутаций в генах BRCA1/2 для проведения молекулярно-генетического скрининга в различных группах больных РМЖ и РЯ и здоровых лиц. 5. Обосновать целесообразность включения в диагностическую панель других молекулярно-генетических маркёров (мутаций в генах CHEK2, NBN, BLM, полиморфных аллельных вариантов в различных генах и хромосомных локусах). 6. Сформулировать алгоритм проведения молекулярно-генетической диагностики для выявления наследственной предрасположенности к развитию РМЖ и РЯ с учётом характерных для РФ особенностей. Научная новизна Впервые разработана и апробирована панель из 24 молекулярно-генетических маркёров для выявления наследственной предрасположенности к развитию рака молочной железы и рака яичников методом ПЦР в режиме реального времени с помощью определения температуры плавления примыкающих олигонуклеотидных зондов, основанная на отечественной технологической базе. Впервые получены комплексные данные о частотах мутаций в генах BRCA1 (185delAG, 4153delA, 5382insC, 3819delGTAAA, 3875delGTCT, 300T>G (C61G), 2080delA, 2963del10), BRCA2 (6174delT, 1528delAAAA, 9318delAAAA), CHEK2 (1100delC, IVS2+1G>A, I157T), NBN (657delACAAA), BLM (1642C>T (Q548X)), полиморфных аллельных вариантов в генах FGFR2 (rs2981582), LSP1 (rs3817198), хромосомных локусах 5q11 (rs889312), 8q24 (rs13281615), 2q35 (rs13387042), 13 16q12 (rs3803662), 9p22 (rs3814113), 2q31 (rs2072590) в больших выборках больных РМЖ и/или РЯ и здоровых женщин в российской популяции. Впервые в России показаны высокая частота встречаемости мутации IVS2+1G>A в гене CHEK2 в группах больных РМЖ и РЯ и её статистически достоверная ассоциация с высоким риском развития рака молочной железы. Впервые в России показана ассоциация однонуклеотидного полиморфизма rs13281615 в локусе 8q24 с риском развития РМЖ. Практическая значимость Выполненная работа является прикладным исследованием, результаты которого имеют важное значение для клинической онкологии и генетики. Созданная в ходе работы диагностическая панель для определения распространённых в российской популяции мутаций в генах BRCA1 и BRCA2 зарегистрирована в МЗ РФ и внедрена в клиническую практику ФГБНУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина», ФГБУ «РНЦРР» и других специализированных научных и клинических центров РФ. Регистрационное удостоверение: №ФСР 2010/08415 от 22 июля 2010 г. на набор реагентов для определения генетических полиморфизмов, ассоциированных с риском развития онкопатологии, методом полимеразной цепной реакции (ОнкоГенетика) по ТУ 9398-030-46482062-2011 производства ООО «Научно-производственное объединение ДНК-Технология». Разработанный набор реагентов «ОнкоГенетика» может быть рекомендован для включения в наследственной национальные скрининговые предрасположенности к программы РМЖ и РЯ по выявлению с дальнейшей индивидуализацией профилактики, диагностики и лечения этих онкологических заболеваний. Издано пособие для врачей «Медико-генетическое консультирование и ДНКдиагностика при наследственной предрасположенности к раку молочной железы и раку яичников», содержащее рекомендации по проведению МГК и молекулярно-генетического тестирования, ведению пациентов из групп высокого 14 генетического риска (особенностях профилактики, ранней диагностики и лечения РМЖ и РЯ). Основные положения, выносимые на защиту 1. Разработана панель из 24 молекулярно-генетических маркёров для выявления наследственной предрасположенности к развитию рака молочной железы и рака яичников методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени с анализом кривых плавления, основанная на отечественной технологической базе. 2. Определён состав диагностической панели наиболее распространённых в российской популяции мутаций в генах BRCA1 и BRCA2: 5382insC, 300T>G, 4153delA, 2080delA, 185delAG, 3819delGTAAA, 3875delGTCT в гене BRCA1 и 6174delT в гене BRCA2. 3. Впервые показана ассоциация мутации IVS2+1G>A в гене CHEK2 с высоким риском развития рака молочной железы в российской популяции (отношение шансов (OR) = 11,22). 4. Рак молочной железы у носителей мутаций в гене CHEK2 в сравнении с носителями мутаций в гене BRCA1 характеризуется более поздним возрастом манифестации (50,1±12,4 года и 41,5±8,5 года, соответственно), меньшей частотой опухолей высокой степени злокачественности (18,4% и 55,3%, соответственно), более высокой частотой РЭ-позитивных (83,7% и 29,8%, соответственно), РП-позитивных (64,3% и 25,5%, соответственно) и HER2/neu-позитивных (40,0% и 11,9%, соответственно) опухолей (p<0,05). В группе больных РМЖ с мутациями в гене CHEK2 в сравнении с группой больных без мутаций достоверно хуже общая 12-летняя выживаемость (60,0% и 97,8%, соответственно, p<0,05). 5. Показаны ассоциации следующих однонуклеотидных полиморфизмов с риском развития рака молочной железы: rs3803662 в локусе 16q12, rs2981582 в гене FGFR2, rs13387042 в локусе 2q35 (максимальные риски в этой группе молекулярно-генетических маркёров: OR=1,30, OR=1,25 и 15 OR=1,19, соответственно), rs13281615 в локусе 8q24, rs889312 в локусе 5q11. Для полиморфизма rs13281615 в локусе 8q24 ассоциация с риском развития рака молочной железы в российской популяции показана впервые. 6. Оптимизирован алгоритм проведения молекулярно-генетической диагностики для выявления наследственной предрасположенности к развитию раку молочной железы и раку яичников: первым этапом является скрининговое исследование с помощью разработанной диагностической панели. Апробация работы Диссертация апробирована и рекомендована к защите 25 ноября 2014 г. на совместной научной конференции лаборатории клинической онкогенетики, отделения клинической фармакологии и химиотерапии, научно-консультативного отделения, отделения опухолей молочных желез, отделения реконструктивной и пластической онкологии, гинекологического отделения НИИ КО, лаборатории регуляции клеточных и вирусных онкогенов НИИ канцерогенеза ФГБНУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина», кафедры онкологии Первого МГМУ им. И.М. Сеченова. Материалы диссертационной работы были представлены и обсуждены на следующих российских и международных конгрессах, научно-практических конференциях и съездах: XV—XVIII Российских Онкологических Конгрессах (Москва, 2011–2014.), Седьмой Российской Конференции по Фундаментальной Онкологии «Петровские чтения» (Санкт-Петербург, 2011), 26th European Immunogenetics & Histocompatibilty Conference (Liverpool, 2012), Конференции с международным участием «Современная стратегия лечения ранних стадий рака молочной железы» (Москва, 2013), European Human Genetics Conference 2014 (Milan, 2014), VIII Съезде онкологов и радиологов стран СНГ (Казань, 2014), IV конференции «Общества специалистов онкологов по опухолям репродуктивной системы» (Москва, 2014). 16 Публикации По теме диссертации опубликованы 14 печатных работ, в том числе: 6 статей в научной печати, из них 4 в научных изданиях, рекомендованных ВАК РФ для публикации материалов докторских и кандидатских диссертаций, 1 пособие для врачей, 7 публикаций в материалах отечественных и международных конференций и конгрессов. Объем и структура диссертации Диссертация изложена на 126 страницах машинописного текста, содержит 23 таблицы, 8 рисунков. Диссертация состоит из следующих глав: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты и обсуждение», «Выводы», «Список литературы». Библиография включает 183 источника. Личный вклад автора Все использованные в работе данные получены при непосредственном участии автора: на этапах постановки цели и задач, сбора клинического материала, разработки реагентов для генотипирования, проведения молекулярногенетической диагностики, обработки, анализа и обобщения полученных результатов, написания и оформления рукописи. Соответствие диссертации паспорту научной специальности Научные положения диссертации соответствуют паспорту специальности 14.01.12 – онкология, конкретно пункту 3. 17 ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. Наследственная предрасположенность к развитию рака молочной железы и рака яичников Генетическая предрасположенность является одним из основных факторов риска развития РМЖ и РЯ, наследственные формы РМЖ и РЯ характеризуются выраженной генотипической и фенотипической гетерогенностью [105, 112, 169]. Семейную историю накопления случаев РМЖ и опухолей женской репродуктивной системы отмечают 25% заболевших женщин [112]. На сегодняшний день принята теория, согласно которой РМЖ и РЯ рассматриваются как сложные полигенные заболевания, в их основе лежит комбинированный эффект многих генетических вариантов с разной частотой встречаемости и пенетрантностью [105, 135, 169]. От 5 до 10% случаев РМЖ [7, 123], от 10 до 17% случаев РЯ [9, 105] наследуются по аутосомно-доминантному типу с высокой (неполной) пенетрантностью и более ранним (по сравнению со спорадическими формами) возрастом манифестации [7, 9, 105, 112, 169]. В этой главе будут рассмотрены основные гены наследственной предрасположенности к РМЖ и РЯ. В первую очередь к ним относятся гены, которые кодируют белки, участвующие в репарации ДНК. Основное внимание уделено тем наследственным синдромам и обусловливающим их герминальным дефектам, диагностика клинической практике; которых а уже также используется популяционным или перспективна особенностям в их распространения. 1.1. Белки, вовлеченные в репарацию ДНК, их функции и взаимодействие Главные гены наследственной предрасположенности к РМЖ и РЯ – BRCA1 (MIM 113705) и BRCA2 (MIM 600185) (от BReast Cancer Associated) – были идентифицированы в 1994–1995 годах [118, 182]. Ген BRCA1 локализуется на хромосоме 17q21 и включает 24 экзона. Общий размер кодирующих участков составляет 5592 нуклеотида, распределённых в геноме на протяжении более 80 т.п.н. Белок BRCA1 состоит из 1863 аминокислотных остатков [118, 125, 148]. Ген 18 BRCA2 локализуется на хромосоме 13q12-13, состоит из 27 экзонов, суммарный размер кодирующих участков – 10485 пар нуклеотидов – почти в два раза больше, чем в гене BRCA1; общая протяженность близка к размеру гена BRCA1 (около 80 т. п. н.). Кодируемый белок BRCA2 содержит 3418 аминокислотных остатков [125, 161, 181]. Гены BRCA1 и BRCA2 являются классическими онкосупрессорами и крайне важны для поддержания геномной стабильности. Кодируемые ими белки играют ключевую роль в репарации двухцепочечных разрывов ДНК путём гомологичной рекомбинации [59, 120]. Процесс нарушения нормальной репарации двунитевых разрывов ДНК с участием белков BRCA1/2 при потере их функциональной активности представлен на рис. 1. Вследствие ошибок репарации повреждений ДНК активизируются дальнейший рост гены клеток контроля с клеточного возникшими цикла, генетическими ингибирующие аномалиями и индуцирующие запрограммированную клеточную гибель – апоптоз. Накопление ошибок репарации, приводящих к нарушениям регуляции клеточного цикла, апоптоза и дифференцировки клетки, генетической нестабильности, является ключевым событием в процессе канцерогенеза. Функция белка BRCA2 заключается преимущественно в регуляции ядерной локализации RAD51 и его способности к связыванию ДНК – ключевых моментов инициирования процесса гомологичной рекомбинации [33, 120]. Белок BRCA1 взаимодействует со многими белками, участвующими в процессах репарации/рекомбинации ДНК, такими как RAD51, MRN-комплекс (Mre11/Rad50/Нибрин), геликаза Блума и белок FANCD2 [183]. Белок BRCA1 является мишенью для ATM- и ATR-фосфорилирования, функционирует как медиатор в регуляции клеточного цикла, играя важную роль в передаче сигнала о повреждении ДНК. Кроме того, белок BRCA1 участвует в выполнении некоторых других клеточных функций, важных для поддержания геномной целостности, включая сборку митотического веретена, дупликацию центросом, контроль клеточного цикла и ремоделирование хроматина в местах двухцепочечных 19 разрывов ДНК [33, 120]. BRCA1 участвует в активации остановки клеточного цикла как в S-, так и в G2/M-фазах после повреждения ДНК (в последнем случае требуется предварительное фосфорилирование BRCA1 киназой ATM) [182]. C-концевой домен BRCA1 является активатором транскрипции, связываясь с РНК-полимеразой II. Также роль BRCA1 в регуляции транскрипции и пролиферации осуществляется через ассоциации с CTIP, эстрогеновыми рецепторами (РЭ), HDAC, РНК-полимеразой II, циклином D1, и другими белками [33, 120]. Рисунок 1. Схематическое изображение функционирования генов BRCA1 и BRCA2 и нарушений при потере их функциональной активности [130, с модификациями]. Протеинкиназа ATM (кодируется геном ATM, 11q22.3) быстро активируется в точках двухцепочечных разрывов ДНК. Это двухэтапный процесс: сначала гомодимеры ATM диссоциируют на активные мономеры, затем они взаимодействуют с мультибелковым MRN-комплексом и белком BRCA1. MRNкомплекс связывается с ДНК, его биохимические свойства включают отрезание, 20 расплетение и образование мостиков между концами поврежденной двойной цепи ДНК. Белок BRCA1 участвует в негомологичном соединении концов ДНК. Вероятно, MRN-комплекс и BRCA1 требуются для эффективного привлечения и, возможно, удержания ATM в точках двухцепочечных разрывов ДНК. MRNкомплекс состоит из трёх белков, кодируемых генами MRE11, RAD50 и NBN (NBS1) [40]. Кратко схема белковых взаимодействий в процессе репарации ДНК представлена на рис. 2. Герминальные мутации в каждом из этих генов обнаружены у больных c редкими аутосомно-рецессивными синдромами, клинически перекрывающимися с атаксией-телеангиэктазией. Мутации в гене MRE11 приводят к АТ-подобному заболеванию (Ataxia Telangiectasia-like disorder, ATLD), мутации в гене NBN – к синдрому Ниймеген (Nijmegen breakage syndrome, NBS), мутации в гене RAD50 были обнаружены у одного пациента с симптомами синдрома Ниймеген. В то время как АТ-подобное заболевание не ассоциировано с повышением риска развития ЗНО, больные с синдромом Ниймеген предрасположены к лейкозам, меланоме, раку предстательной железы, РМЖ и РЯ [40]. Важность генов репарации ДНК для подавления развития ЗНО подчёркивается тем фактом, что множество онкосупрессоров функционально связаны с ATM и ответом на повреждение ДНК. Белки MRN-комплекса важны для активации ATM и эффективной передачи сигналов о повреждении ДНК другим молекулам-мишеням, таким как белки анемии Фанкони и p53. 21 Рисунок 2. Сеть белковых взаимодействий в процессе репарации ДНК. Сигнальная сеть, реагирующая на повреждение ДНК, связана с ДНКрепарационными комплексами. Ответ на повреждение ДНК, запущенный при активации ATM и ATR киназ, включает множественные пути. Компоненты ядерного комплекса анемии Фанкони, MRN-комплекса (Mre11/Rad50/Нибрин) и BRCA1/BRCA2 содержащего комплекса (BRCC) напрямую активируются сигнальными киназами. На схеме показаны наиболее значимые множественные парные взаимодействия между компонентами этих комплексов [40, адаптировано]. Белки, кодируемые генами анемии Фанкони, функционируют в составе репарационных комплексов, процессирующих связи между цепями ДНК. Восемь белков – FANCA, FANCB, FANCC, FANCE, FANCF, FANCG, FANCL и FANCM – являются компонентами ядерного белкового комплекса анемии Фанкони, функция которого заключается в присоединении убиквитинового компонента к белку FANCD2. Моноубиквитинизация FANCD2 позволяет ему связываться с 22 хроматином в точках повреждения ДНК и осуществлять репарацию. В этих точках FANCD2 локализуется совместно с ATR и геликазой, кодируемой геном BLM [40]. Эффекторные белки FANCD1 (BRCA2), FANCJ (BRIP1, BACH1), FANCN (PALB2), FANCO (RAD51C) и FANCP (SLX4), вероятно, напрямую участвуют в репарации ДНК путём локализации RAD51 в точках двухцепочечных разрывов. Многие гены, вовлечённые в репарацию ДНК, несут герминальные мутации при наследственных онкологических синдромах, что подтверждает ключевую роль репарации ДНК в поддержании генетической стабильности и супрессии опухолей. 1.2. Cиндром наследственного рака молочной железы и рака яичников (гены BRCA1 и BRCA2) Синдром наследственного РМЖ и РЯ, ассоциированный с мутациями в генах BRCA1 и BRCA2, – самое частое аутосомно-доминантное заболевание с повышенным риском развития РМЖ и РЯ. По данным многочисленных исследований мутациями в генах BRCA1 и BRCA2 обусловлены 30–50% наследственных форм РМЖ и 90–95% РЯ у женщин, а так же 4–40% РМЖ у мужчин [9, 66, 105, 120]. Наследственный синдром РМЖ и РЯ составляет 5–7% всех случаев РМЖ и 10– 15% случаев РЯ [3, 150]. Мутации в гене BRCA2 также могут быть ассоциированы с развитием рака предстательной железы, толстой кишки, поджелудочной железы, желчного пузыря и желчных протоков, желудка и меланомы [36]. Мутации в генах BRCA1 и BRCA2 значительно увеличивают индивидуальный риск развития наследственного РМЖ и РЯ. Средние кумулятивные риски для носителей мутаций в гене BRCA1 к возрасту 70 лет составляют 57–65% в отношении развития РМЖ и 39–40% – РЯ [49]. Риск развития РМЖ для носителей мутаций в гене BRCA2 составляет 45–49%, тогда как риск развития РЯ не превышает 11– 18% [19]. При отягощённом семейном анамнезе риски возрастают: для носителей мутаций в гене BRCA1 до 87% в отношении развития РМЖ и до 44% в отношении 23 развития РЯ [69], для носителей мутаций в гене BRCA2 – до 84% и 27% в отношении развития РМЖ и РЯ, соответственно [70]. При наследственном РМЖ и РЯ для инициации опухолевого роста, помимо герминальной мутации необходима инактивация второго аллеля, которая происходит в соматической клетке [130]. Инициирующим моментом инактивации может служить как соматическая мутация, так и ряд эпигенетических событий, таких как аномальное метилирование [2]. 1.2.1. Клинические и патоморфологические особенности BRCA-ассоциированного рака молочной железы и рака яичников Для наследственного РМЖ характерен более молодой возраст развития заболевания, чем для спорадического, причем для BRCA1-ассоциированного рака риск выше в пременопаузе. Средний возраст возникновения РМЖ, обусловленного герминальными мутациями в генах BRCA1 и BRCA2, равен 40–41 и 43–44 годам, соответственно (для спорадического РМЖ – 54 года). Признаки склерозирующего аденоза и микрокальцинаты, кисты и внутрипротоковые папилломы достоверно чаще встречаются в группах больных-носителей мутаций в генах BRCA1 и BRCA2, что обосновывает необходимость внимательного отношения к доброкачественной и фоновой патологии у пациентов из групп риска [9, 113]. Частота РМЖ, развившегося на фоне беременности и лактации, достоверно выше среди пациенток с наследственной предрасположенностью; в 17,5% случаев РМЖ, диагностированного на фоне второй и последующих беременностей и в процессе грудного вскармливания, обнаружены герминальные мутации в гене BRCA1 [9]. У больных РМЖ носителей мутаций в генах BRCA1 и BRCA2 кумулятивный риск развития опухолей контралатеральной молочной железы через 25 лет после постановки первичного диагноза составляет 47.4%. При этом риск в 1,6 раза выше у носителей мутаций в гене BRCA1. В этой группе больных при манифестации первичного РМЖ в возрасте до 40 лет риск развития двустороннего поражения составляет 62,9% [83]. 24 В исследовании, проведенном в ФГБНУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» в 2000– 2008 годах, герминальные мутации в генах BRCA1 и BRCA2 были выявлены у 37,3% больных двусторонним РМЖ и у 57,0% больных в возрасте до 41 года. Средний временной интервал между первичным и контралатеральным РМЖ составил 8,3 года. В 43,8% случаев у носителей мутаций в генах BRCA1 и BRCA2 был диагностирован синхронный двусторонний РМЖ (интервал между постановкой первичного РМЖ и рака контралатеральной молочной железы составляет до одного года) [9]. Гистологически большинство BRCA1-ассоциированных опухолей представлены инвазивным раком неспецифического типа (до 87%), около 5–15% классифицируются как медуллярный рак, характерна высокая (III) степень злокачественности, часто наблюдается выраженная лимфоцитарная инфильтрация. Большинство – 68,5— 80,0% – BRCA1-ассоциированных опухолей молочной железы являются трижды негативными (РЭ-, РП-, HER2/neu-) [9, 58, 113], в неотобранной группе больных с трижды негативными опухолями частота мутаций в гене BRCA1 составляет до 16% [71]. Трижды негативные опухоли с базальным фенотипом (экспрессия эпителиальных кератинов KRT5 и KRT6) чаще встречаются у носителей мутаций в гене BRCA1. BRCA2-ассоциированные опухоли не обладают специфическим патологическим фенотипом: большинство из них относятся к инвазивному раку неспецифического типа (76–83%), реже встречаются инвазивный дольковый рак (8,4%), медуллярный рак (2,2%) и другие [58, 113]. Большинство BRCA2-ассоциированных опухолей экспрессируют рецепторы эстрогенов, прогестерона, HER2/neu [113]. На основании данных мультицентрового исследования, включившего более 6000 случаев, определены клинико-морфологические характеристики инвазивного BRCA-ассоциированного РМЖ (табл. 1) [113]. 25 Таблица 1. Клинико-морфологические характеристики инвазивного BRCA- ассоциированного РМЖ [113] BRCA1 (n=3797) BRCA2 (n=2392) 40 лет 43 года 80% 83% Инвазивный дольковый рак 2,2% 8,4% Медуллярный рак 9,4% 2,2% Другие 8,6% 6,4% РЭ-позитивный 22% 77% РП-позитивный 21% 64% HER2-позитивный 10% 13% Трижды негативный 68% 16% I 3% 7% II 20% 43% III 77% 50% Медиана возраста манифестации РМЖ Морфология Инвазивный протоковый рак (инвазивный рак неспецифического типа по классификации ВОЗ 2012 г.) Рецепторный статус Степень злокачественности BRCA-статус является прогностическим фактором при наследственном РМЖ: позволяет достичь выраженного терапевтического эффекта при проведении предоперационного лечения [9]. BRCA-ассоциированные опухоли молочной железы у мужчин также характеризуются более ранним возрастом развития по сравнению со спорадическими (по данным разных авторов разница составляет около 10 лет), преобладанием инвазивного рака неспецифического типа (88–100%), высокой степенью злокачественности [9]. 26 Для наследственного BRCA1 (но не BRCA2)-ассоциированного РЯ также характерен более молодой в сравнении со спорадическим РЯ возраст развития заболевания – 48 и 56 лет, соответственно [9]. Гистологический тип наследственного РЯ чаще представлен серозной аденокарциномой (70–80%), редко (0–1%) встречаются муцинозные опухоли, наблюдается выраженный лечебный патоморфоз [9]. Не отмечено значительных различий в морфологии BRCA1- и BRCA2-ассоциированного РЯ [113]. 1.2.2. Популяционные особенности распределения герминальных мутаций в генах BRCA1 и BRCA2 Данные о мутациях и полиморфных вариантах в генах BRCA1 и BRCA2 и их функциональной значимости объединены в постоянно дополняющейся международной базе Breast Cancer Information Core (BIC) [35]. В популяционной генетике описан эффект основателя (“founder” эффект) – преобладание нескольких мутаций, специфичных для определенной этнической группы или географического региона. Эффект основателя наиболее заметен в географически, культурно или религиозно изолированных популяциях, в которых произошло распространение ограниченного количества предков, и, как следствие низкого генетического разнообразия, некоторые аллели стали более частыми. Этот эффект находит отражение и в спектре мутаций в генах BRCA1 и BRCA2 во многих популяциях [66]. Например, у ашкеназских евреев (субэтническая группа евреев, сформировавшаяся в Центральной Европе) превалируют три мутации: 185delAG и 5382insC в гене BRCA1 и 6174delT в гене BRCA2 [136], у жителей Исландии – мутация 999del5 в гене BRCA2 [165], в Польше и других странах Восточной Европы со славянским населением широко распространены мутации в гене BRCA1 – 5382insC, Cys61Gly, 4153delA [65, 80, 81, 168]. Знание эффективного популяционной подхода к генетической индивидуализации структуры и лежит повышению в основе доступности генетического тестирования, позволяет разработать оптимальный скрининговый протокол на уровне национального здравоохранения [65, 66, 80, 92, 168]. 27 Российская популяция характеризуется выраженным эффектом основателя. Превалируют мутации в гене BRCA1, они составляют около 80% от общего количества мутаций в генах BRCA1 и BRCA2. В гене BRCA1 намного чаще встречаются повторяющиеся мутации, в то время как мутации, идентифицированные в гене BRCA2 (за исключением 6174delT), уникальны [9, 10]. Соответственно, именно мутации в гене BRCA1 займут основное место при формировании панели для первичного генетического скрининга в российской популяции. Согласно целому ряду исследований, преобладающей в России является мутация 5382insC в гене BRCA1, она составляет около 70% всех мутаций в гене BRCA1 при РМЖ и около 60% при РЯ, также в гене BRCA1 часто встречаются мутации 4153delA, 300T>G (C61G), 185delAG; в нескольких российских исследованиях выявлены мутации 2080delA, 3819delGTAAA, 3875delGTCT в гене BRCA1 и мутация 6174delT в гене BRCA2 [3, 4, 9, 10, 14, 91]. В отдельных работах описываются редкие, ранее не идентифицированные мутации, например, 2963del10 (BRCA1), 1528delAAAA (BRCA2), 9318delAAAA (BRCA2), 2297delT, 3366delA и 3448insA (табл. 2) [4, 9, 162]. Cпектр мутаций в генах BRCA1 и BRCA2 в РФ также характеризуется региональными особенностями. Например, мутация 300T>G (C61G), обнаруженная в исследованиях, проведённых в г. Москве [3, 9, 13] и г. Новосибирске [1], ни разу не была выявлена у больных в г. СанктПетербурге (табл. 2). 28 Таблица 2. Мутации в генах BRCA1 и BRCA2, зарегистрированные у больных РМЖ и/или РЯ в различных регионах РФ Ген Наименование (номенклатура BIC, HGVS) BRCA1 5382insC, c.5266dupC BRCA1 4153delA, c.4034delA BRCA1 300T>G (p.Cys61Gly), c.181T>G BRCA1 2080delA, c.1961delA BRCA1 3819delGTAAA, c.3700_3704delGTAAA BRCA1 185delAG, c.68_69delAG BRCA1 3875delGTCT, c.3756_3759delGTCT BRCA1 3747insA, c.3627_3628insA BRCA1 2080insA, c.1961insA BRCA1 2963del10, c.2844_2853del10 BRCA1 2274insA BRCA1 R1203X BRCA1 2297delT BRCA1 3366delA BRCA1 3448insA BRCA2 6174delT, c.5946delT BRCA2 1528delAAAA, c.1300_1303delAAAA BRCA2 9318delAAAA, c.9090_9093delAAAA BRCA2 695insT BRCA2 S1099X г.СанктПетербург Сибирь (г.Томск, г.Новосибирск, г.Кемерово) [4, 152] [14, 162] [107, 152] нет нет [1] [3, 9, 10] [3] [91] [4, 91] нет нет [3, 9, 10, 107, 146] [3, 76] [152] [14] [4] нет [9] нет нет [9] нет нет [4] нет нет нет нет [9] [9] [9] [4] [4] нет нет нет нет нет нет нет нет [3, 9] нет [152] нет нет [162] нет нет [162] нет нет нет нет [162] [162] г.Москва [3, 9, 10, 76, 107] [3, 10, 13, 76] [3, 9, 10, 13] 29 1.3. Редкие наследственные аутосомно-рецессивные синдромы, ассоциированные с РМЖ и РЯ РМЖ и РЯ также могут быть ассоциированы с редкими аутосомнорецессивными синдромами (табл. 3), обусловленными гомозиготными мутациями в генах, вовлеченных (как и BRCA1/2) в репарацию ДНК: BLM, ATM, NBN, генах анемии Фанкони (рис. 2). Причём частота злокачественных новообразований повышена не только у больных, но и у носителей гетерозиготных мутаций в этих генах, их относят группе среднепенетрантных маркёров предрасположенности к РМЖ и РЯ [22, 135, 169, 175]. 1.3.1. Синдром Блума (ген BLM) Синдром Блума (MIM 210900) обусловлен мутациями в гене BLM (15q26.1, также известен как RECQL3) и характеризуется хромосомной нестабильностью, которая лежит в основе повышенной предрасположенности к онкологическим заболеваниям (табл. 3). Частота ЗНО у больных с синдромом Блума выше, чем у любых других генетически-определенных групп больных, при этом типы онкологических заболеваний и их локализация близки к популяционным. Около 30% представлены лейкозами и лимфомами (развиваются, как правило, в более молодом возрасте); приблизительно столько же – карциномами различных типов. У 10% больных диагностируются первично-множественные опухоли. Средний возраст развития ЗНО составляет 25 лет, онкологические заболевания – основная причина смерти этих больных, большинство из них умирает в возрасте до 30 лет. Пролиферирующие клетки больных с синдромом Блума демонстрируют значительные хромосомные аномалии: множественные хроматидные разрывы, петли, структурные перестройки. Эти структурные изменения происходят спонтанно, в отсутствие каких-либо внешних стимулов или кластогенов. Цитологические дефекты, ассоциированные с синдромом Блума, количественны по своей природе; подобные изменения наблюдаются и в клетках здоровых людей, но частота их намного ниже [40]. 30 Таблица 3. Редкие наследственные синдромы, ассоциированные с РМЖ и РЯ [28, 111, 121, 125, 135, 140, 159, 169, 171] Синдром (MIM) Ген (локализация) Основные клинические проявления Аутосомно-рецессивные BLM (15q26.1) Пропорциональная задержка роста, чувствительность к солнечной экспозиции, кожные проявления (телеангиэктазы, гипои гиперпигментация), иммунодефицит, злокачественные новообразования различных локализаций, в том числе РМЖ и РЯ Атаксиятелеангиэктазия (208900) ATM (11q22.3) Мозжечковая атаксия, телеангиэктазы, неврологические нарушения (глазодвигательная апраксия, дизартрия и другие), иммунодефицит, злокачественные опухоли лимфоидной ткани и солидные, в том числе меланома, РМЖ, РЯ, рак желудка Синдром Ниймеген (251260) NBN (8q21.3) Микроцефалия, задержка развития, комбинированный первичный иммунодефицит, повышенная чувствительность к ионизирующей радиации, ЗНО различных локализаций, в том числе опухоли лимфоидной ткани, головного мозга, РМЖ, РЯ, РПЖ, меланома Анемия Фанкони BRIP1/FANCJ (17q23.2), PALB2/FANCN (16p12.2) Апластическая анемия, аномалии развития различных систем органов (скелета, сердца, ЖКТ, урогенитального тракта), неврологические расстройства, острый миелоидный лейкоз, РМЖ, РЯ, опухоли головы и шеи, рак поджелудочной железы Аутосомно-доминантные Синдром Коудена (158350) PTEN (10q23.3) Множественные гамартомы (чаще в желудочно-кишечном тракте), доброкачественные и злокачественные опухоли молочной железы, щитовидной железы, эндометрия 30 Синдром Блума (210900) 31 Окончание таблицы 3. Синдром (MIM) Синдром ПейтцаЕгерса (175200) Ген (локализация) STK11 (19p13.3) Синдром ЛиTP53 (17p13.1) Фраумени-1 (151623) Основные клинические проявления Специфические пигментные пятна на губах, слизистой оболочке ротовой полости, множественные гамартоматозные полипы желудочнокишечного тракта, РМЖ, РЯ и другие злокачественные новообразования (яичек, поджелудочной железы, шейки матки) РМЖ, мягкотканные саркомы, остеосаркомы, опухоли головного мозга, лейкоз, рак коры надпочечников, РЯ CHEK2 (22q12.1) MSH2 (2p21), MSH6 (2p16.3), MLH1 (3p22.2), MLH3 (14q24.3), PMS2 (7p22.1) CDH1 (16q22.1) Рак толстой кишки, экстракишечные опухоли: рак эндометрия, РЯ, рак желудка, тонкой кишки, поджелудочной железы, желчных и мочевых путей, опухоли головного мозга; опухоли сальных желез (синдром Муир-Торре) Нейрофиброматоз I типа (162200) NF1 (17q11.12) Множественные доброкачественные опухоли (нейрофибромы), пятна на коже цвета «кофе с молоком», узелки Лиша на радужке глаза, костные аномалии, повышена частота ЗНО различных локализаций, в том числе РМЖ и РЯ Диффузный рак желудка, дольковый РМЖ, колоректальный рак 31 Синдром ЛиФраумени-2 (609265) Синдром Линча (наследственный неполипозный колоректальный рак) (120435) Наследственный диффузный рак желудка/семейный дольковый РМЖ (137215) 32 Процесс, который лежит в основе высокой частоты крупных хромосомных аберраций (и диагностический критерий синдрома Блума), – повышенная частота рекомбинации между гомологичными хромосомными регионами, а именно – между сестринскими хроматидами. Частота мутаций, происходящих на субмикроскопическом уровне, также повышена [40]. Ген BLM состоит из 22 экзонов, протяженность его около 100 т.п.н. и кодирует фермент, который принадлежит к семейству высококонсервативных ДНК- и РНК-геликаз. Эти ферменты катализируют АТФ-зависимое расплетение двойной цепи нуклеиновых кислот, крайне важное для основных клеточных процессов, включая репликацию и репарацию ДНК, транскрипцию РНК и трансляцию белков. Белок, кодируемый геном BLM, наиболее близок к подсемейству RECQгеликаз. Клонирование гена BLM и анализ гомологов в модельных организмах выявили критичную роль RECQ-геликаз в процессе гомологичной рекомбинации и поддержании генетической стабильности [40]. Thompson E.R. и соавт. провели полноэкзомное секвенирование 33 BRCA1/2негативных больных из 15 РМЖ-семей, были идентифицированы семьи с гетерозиготными делеторными мутациями в генах, участвующих в репарации ДНК: FANCC и BLM. Мутация в гене BLM (c.1993C>T, p.Gln645*), описанная при синдроме Блума, была обнаружена в одной семье у трёх больных РМЖ (диагноз поставлен в возрасте 39, 39 и 41 год) и ни у одной из двух здоровых сестёр. Косегрегация выявленных мутаций в этой семье согласовалась с ожидаемым риском для среднепенетрантных аллелей. При последующем скрининге всех экзонов гена BLM в 438 РМЖ-семьях было обнаружено 2 мутации в гене BLM, все они приводили к образованию укороченного белка. Ни одной мутации в гене BLM не было обнаружено в контрольной группе здоровых лиц [164]. Популяционные особенности Синдром Блума – крайне редкое заболевание (<1 / 1 000 000 [126]), но в некоторых изолированных популяциях он встречается значительно чаще, например, у ашкеназских евреев. Секвенирование гена BLM в группе ашкеназских евреев 33 подтвердило существование эффекта основателя, частота носительства мутации сдвига рамки считывания в 10-м экзоне гена BLM 2281delATCTGAinsTAGATTC (BLMAsh) в этой популяции составляет ~0,85% [52]. При секвенировании 95 больных РМЖ (с признаками, указывающими на наследственный характер заболевания) г. Санкт-Петербурга Соколенко А.П. и соавт. обнаружили двух носителей мутации c.1642 C>T (Q548X) в гене BLM. При расширенном исследовании частота этого аллеля составила 17/1498 (1,1%) у больных РМЖ и 2/1093 (0,2%) здоровых женщин (p=0,004). Мутации в гене BLM чаще встречались (1) при наличии больных родственников первой степени родства (6/251 (2,4%) и 11/1247 (0,9%), p=0,05), (2) у больных с ранней манифестацией заболевания (12/762 (1,6%) и 5/736 (0,7%), p=0,14) и (3) у больных двусторонним РМЖ (2/122 (1,6%) и 15/1376 (1,1%), p=0,64). Авторы заключили, что мутация Q548X в гене BLM является повторяющейся у славян и может быть ассоциирована с риском развития РМЖ [151]. Эти результаты подтверждены в последующем исследовании, включавшем 3188 больных РМЖ и 2458 здоровых лиц из Башкортостана, Белоруссии, Украины, Казахстана. Максимальная частота мутации Q548X в гене BLM детектирована у больных из России (0,8%), но также она встречалась у больных из Белоруссии (0,5%) и Украины (0,6%) и отсутствовала в неевропейских субпопуляциях. В комбинированном анализе ассоциация мутации Q548X в гене BLM с РМЖ была статистически достоверна (OR=5,1; 95% CI: 1,2–21,9, p=0,03). Мета-анализ с предыдущим исследованием, проведенным в г. Санкт-Петербурге, подтвердил эти данные: OR=5,7 (95 % CI: 2,0–15,9, p=3,7×10-4). Мета-анализ со всеми опубликованными подобными исследованиями также поддерживает предположение об ассоциации мутаций в гене BLM с РМЖ, риск повышен в 2—5 раз (OR=3,3, 95 % CI: 1,9–5,6, p=1,9×10-5) [131]. 34 1.3.2. Атаксия-телеангиэктазия (ген ATM) Атаксия-телеангиэктазия (синдром Луи-Бар, MIM 208900) – редкий аутосомно-рецессивный синдром (1/40 000–1/100 000), характеризующийся гиперчувствительностью к ионизирующей радиации и выраженной предрасположенностью к онкологическим заболеваниям, чаще всего – опухолям лимфоидной ткани (около 85%), но также развиваются глиомы, медуллобластомы, рак желудка, РМЖ, РЯ, меланома (табл. 3) [40, 119, 158]. АТ связана с мутациями в гене ATM (11q22.3), вовлеченном в репарацию двухцепочечных разрывов ДНК. Клетки больных АТ обладают повышенной чувствительностью к ионизирующей радиации, вызывающей двухцепочечные разрывы ДНК, и резистентностью к ингибированию синтеза ДНК при облучении. Терапевтические дозы облучения, хорошо переносимые большинством онкологических больных, вызывают серьезные, часто опасные для жизни осложнения у больных атаксией-телеангиэктазией. Частично эти аберрантные эффекты наблюдаются и в клетках гетерозиготных носителей мутаций в гене ATM, к которым относятся около 1% популяции в целом [68]. В 1995 г. Shiloh Y. и соавт. идентифицировали герминальные мутации в гене ATM, они разнообразны по типу и распределены по всей кодирующей последовательности (65 экзонов). Большинство мутаций в гене ATM приводит к образованию укороченного белка. Больные АТ чаще всего являются т.н. сложными гетерозиготами – носителями двух различных мутаций в гене ATM [143]. Вскоре после клонирования гена ATM было высказано предположение, что носители гетерозиготных мутаций имеют повышенный риск развития ЗНО, в особенности – РМЖ. Однако данные о роли гетерозиготных мутаций в гене ATM в предрасположенности к РМЖ около 20 лет оставались противоречивыми. В различных исследованиях относительный риск варьировал от 1,3 до 12,7 [90, 93, 158]. В группе больных РМЖ с манифестацией заболевания в возрасте до 45 лет была обнаружена повышенная частота мутаций в гене ATM [37]. В последующем исследовании у 40% больных были диагностированы контралатеральные опухоли, 35 все они подверглись воздействию низкодозной радиации в молодом возрасте. В то же время в некоторых других работах частота мутаций в гене ATM у женщин с РМЖ в возрасте до 40 лет не отличалась от популяционной [47, 68]. Было высказано предположение, что повышение риска у носителей гетерозиготных мутаций в гене ATM минимально в отсутствие дополнительного воздействия. Однако в 2006 г. Renwick A. и соавт. при секвенировании гена ATM у 443 BRCA1/BRCA2негативных больных РМЖ из 440 семей и 521 человека из контрольной группы, обнаружили мутации в гене ATM у 12 больных РМЖ и у 2 здоровых женщин. Сегрегационный анализ показал, что относительный риск развития РМЖ у носителей гетерозиготных мутаций в гене ATM равен 2,37 и, таким образом, гетерозиготные мутации в гене ATM могут быть отнесены к группе среднепенетрантных маркёров предрасположенности к РМЖ [132]. Учитывая популяционную частоту встречаемости гетерозиготных мутаций в гене ATM, не проявляющихся фенотипически, и повсеместность маммографического скрининга, повышающего пенетрантность этих мутаций [159], идентификация этих генетических маркёров имеет важное клиническое значение. Популяционные особенности Telatar M. и соавт. идентифицировали самые распространённые мутации в гене ATM и их частоты у больных АТ в 10 популяциях с целью разработки скрининговых тестов, специфичных для отдельных этнических групп. Общее происхождение идентичных мутаций у различных пациентов (эффект основателя) было подтверждено гаплотипированием пациентов в большинстве случаев; процент спонтанных мутаций в гене ATM был минимален. С помощью разработанных тестов мутации в гене ATM были детектированы у 76% пациентов из Коста-Рики, 50% – из Норвегии, 25% – из Польши и 14% – из Италии [163]. В различных восточно-европейских популяциях обнаружена нонсенсмутация p.E1978X (c.5932G>T) в гене ATM. При комбинированном анализе результатов исследований, проведенных в Белоруссии, России и Польше, ассоциации мутации E1978X в гене ATM с РМЖ были статистически достоверны 36 (OR=5,6; 95% CI: 1,3–21,4, p=0,01). Ни в одном изолированном исследовании различия не достигали статистической значимости, что, вероятно, связано с низкой частотой встречаемости (0,2–0,5% у больных РМЖ) [29]. 1.3.3. Синдром Ниймеген (ген NBN) Синдром Ниймеген (MIM 251260) – редкое аутосомно-рецессивное заболевание с хромосомной нестабильностью (табл. 3). Высок риск развития ЗНО в молодом возрасте: к 20 годам они развиваются более чем у 40% этих больных [51]. Для синдрома Ниймеген типичны (и являются диагностическими признаками) хромосомные перестройки (инверсии и транслокации с вовлечением 7 и 14 хромосом) в периферических Т-лимфоцитах и чувствительность к ионизирующей радиации in vitro [40, 51]. Синдром Ниймеген обусловлен мутациями в гене NBN (8q21.3, также известен как NBS1), кодирующем нибрин. Нибрин входит в состав белкового MRN-комплекса (Mre11/Rad50/нибрин), участвующего в репарации двухцепочечных разрывов ДНК. Белки MRN-комплекса важны для активации ATM и эффективной передачи сигналов о повреждении ДНК другим молекуламмишеням. Кроме того, нибрин необходим для фосфорилирования киназы ATR [40, 51]. Популяционные особенности Синдром Ниймеген чаще всего встречается в странах Центральной и Восточной Европы: Чехии, Польше, России и Украине. Самой распространённой в славянских популяциях является мутация 657del5 в 6-м экзоне гена NBN [51, 96]. Например, в чешской популяции её частота составляет 1/106 (95% CI: 1/331–1/46) [62], а в трёх славянских популяциях (чешской, польской и украинской) в среднем – 1/177 [172]. Резник И.Б. и соавт. обнаружили мутацию 657del5 в гене NBN у 7 из 8 несвязанных российских больных с предполагаемым диагнозом синдром Ниймеген, 37 причем у 6 из них – в гомозиготном состоянии, у 1 пациента – в сложной гетерозиготе с мутацией 681delT [134]. Также этой группой авторов была идентифицирована мутация 657del5 в гене NBN у 2/68 детей с лимфоидными опухолями. У нескольких родственников одного из пациентов, носителей этой же мутации, диагностированы онкологические заболевания (острый лимфобластный лейкоз, РМЖ, опухоли ЖКТ) [133]. В 2003 г. в Польше Górski B. и соавт. были исследованы три группы больных РМЖ: (1) 150 больных гистологически-подтвержденным РМЖ, диагностированным в возрасте до 50 лет, (2) 80 больных РМЖ с отягощенным семейным анамнезом (РМЖ у родственников первой степени родства), (3) 530 случайных человек без РМЖ. Мутация 657del5 в гене NBN была обнаружена у 2/150 (1,3%) больных из первой группы; 3/80 (3,7%) больных из второй группы; у 3/530 (0,6%) здоровых. Исследование опухолевой ДНК выявило потерю гетерозиготности (дикого типа) во всех случаях. У большинства пробандов с мутацией в гене NBN был позитивный семейный анамнез РМЖ у родственников первой степени родства [82]. В работе Steffen J. и соавт. (изучено 562 неотобранных больных РМЖ из Центральной Польши) было обнаружено 11 (1,96%) носителей мутации 657del5 в гене NBN (OR=3,21, 95%CI: 1,36–7,61, p=0,0107). При этом у всех носителей мутации 657del5 в гене NBN семейный анамнез не был отягощен. При объединённом анализе группы этих пациентов и других обследованных больных из Центральной Польши, определены следующие риски для носителей мутации 657del5 в гене NBN: < 40 лет: 8,36; (95%CI: 2,57–27,27) p=0,0003; < 50 лет: 4,27 (95%CI: 1,67–10,89) p=0,003; ≥ 50 лет: 2,40 (95%CI: 0,91–6,35) p=0,1250; все возрасты: 3,13 (95% CI: 1,40–7,00) p=0,0066. Таким образом, показано, что носители мутации 657del5 в гене NBN имеют среднеповышенный, связанный с возрастом риск развития РМЖ; предположительно, в популяциях с высокой частотой носительства этой мутации она может вносить заметный вклад в 38 предрасположенность к РМЖ, особенно в более молодых возрастных группах [155]. В 2008 г. Bogdanova N. и соавт. было показано, что гетерозиготная мутация 657del5 в гене NBN ассоциирована с почти трёхкратным повышением риска развития РМЖ у женщин в Центральной и Восточной Европе: OR=3,1; 95% CI: 1,4–6,6 (комбинированные данные). Мутация 657del5 была идентифицирована у 15/1588 больных (0,9%) из Белоруссии и у 1/1076 больных (0,1%) из Германии; 1/1014 и 0/1017 в контрольных группах в Белоруссии и Германии, соответственно (p<0,01). При этом ни возраст постановки диагноза, ни отягощённость семейного анамнеза РМЖ не отличались значимо между носителями мутаций в гене NBN и другими больными РМЖ [31]. Huzarski T. и соавт. оценена 10-летняя выживаемость больных РМЖ с и без мутации 657del5 в гене NBN. Показано, что её носительство не ассоциировано с прогнозом РМЖ [89]. Соколенко А.П. и соавт. при исследовании больных РМЖ и РЯ г. СанктПетербурга показано, что мутации в генах CHEK2 и NBN относительно часто встречаются при РМЖ, однако сделано предположение, что они не играют заметной роли в патогенезе РЯ [150]. Мутация 657del5 в гене NBN была обнаружена у 2/173 (1,16%) больных двусторонним РМЖ, 5/700 (0,71%) больных односторонним РМЖ, 2/348 (0,57%) здоровых женщин среднего возраста и ни у одной (0/344) пожилой здоровой женщины [39]. Также показаны ассоциации мутации 657del5 в гене NBN с раком предстательной железы: в пилотном исследовании Cybulski C. и соавт. она была обнаружена у 5/56 (9,0%) больных семейным раком предстательной железы (OR=16; p<0,0001), 7/305 (2,2%) больных из неотобранной выборки РПЖ (OR=3,9; p=0,01), 9/1500 (0,6%) здоровых [54]. В последующем масштабном исследовании мутация 657del5 в гене NBN была идентифицирована у 53/3750 больных РПЖ (OR=2,5; p=0,0003). Предположительно, мутация 657del5 в гене NBN предрасполагает к агрессивному РПЖ (пятилетняя выживаемость больных с мутацией в гене NBN со- 39 ставила 49%, а в её отсутствие – 72%), что может быть использовано для проспективной индивидуализации лечения и профилактики РПЖ [56]. 1.3.4. Анемия Фанкони (гены FANC) Анемия Фанкони – это рецессивный наследственный синдром, к его клиническим признакам относятся апластическая анемия, аномалии развития различных систем органов, неврологические расстройства, онкологические заболевания (табл. 3). К 40 годам риск развития злокачественных опухолей составляет примерно 30%. Превалирующее онкологическое заболевание – острый миелоидный лейкоз, медиана возраста манифестации составляет 14 лет. Больные анемией Фанкони также предрасположены к солидным опухолям с медианой развития в возрасте 26 лет, включая опухоли головы и шеи, РМЖ, РЯ, аденокарциномы ЖКТ [40]. Анемия Фанкони – клинически гетерогенное заболевание, что затрудняет постановку диагноза. Культурированные клетки больных анемией Фанкони демонстрируют повышенный уровень хромосомных разрывов и делеций; также они чувствительны к агентам, приводящим к связыванию ДНК (деэпоксибутан, митомицин С). Полагают, что нарушение правильной репарации ДНК и разрушения поперечных сшивок ДНК напрямую приводят к появлению двухцепочечных разрывов ДНК. Спонтанные разрывы хромосом и чувствительность клеток больных анемией Фанкони к кластогенам – агентам, вызывающим хромосомные нестабильности; разрывы, предположительно, – это отдельный – прямая подтип генетической причина развития онкологических заболеваний [102]. В основе клинического разнообразия анемии Фанкони лежит генетическая гетерогенность. Выделяют более 10 групп комплементации в зависимости от клеточной гиперчувствительности к кластогенным эффектам ДНК-связывающих агентов. Были клонированы гены FANC, мутированные в этих группах (последняя буква в названии соответствует группе комплементации). Из них 5 – FANCD1 (BRCA2), FANCJ (BRIP1, BACH1), FANCN (PALB2), FANCO (RAD51C) и FANCP 40 (SLX4) – являются генами предрасположенности к РМЖ и РЯ, их относят (за исключением BRCA2) к группе среднепенетрантных маркёров (гетерозиготные мутации повышают риск развития РМЖ/РЯ в 2,0–2,4 раза) [40, 102, 135, 175]. Популяционные особенности Частота аллелей анемии Фанкони в популяции сравнительно высока – около 0,5%, выше – в замкнутых этнических группах. Например, в Западной Африке и у ашкеназских евреев она составляет ~1%. Для ашкеназских евреев типична мутация c.711+4A>T в гене FANCC [103]. В популяциях Центральной и Восточной Европы распространена мутация c.509_510delGA (p.R170fs) в гене FANCN (PALB2), приводящая к образованию укороченного нефункционального белка. Впервые она была идентифицирована в Польше, частота в случайной выборке больных РЯ и в группе больных семейным РМЖ составила 0,6% [57]. Она была также обнаружена у больных двусторонним РМЖ (Германия, Россия) [32]; у больных наследственным раком поджелудочной железы (европейские популяции), причем в семейном анамнезе были отмечены случаи РМЖ [145]. В 2014 г. при исследовании большой группы неотобранных больных РМЖ (всего 3924 пациентки) частота мутации c.509_510delGA в гене PALB2 составила 3/1008 (0,3%), 2/994 (0,2%) и 5/1922 (0,3%) в Германии, России и Белоруссии, соответственно. При этом только у 10% больных в семейном анамнезе были случаи РМЖ у родственников первой степени родства. Таким образом, частота мутации c.509_510delGA в гене PALB2 в Центральной и Восточной Европе составляет ~1/400, а незначительное накопление семейных случаев согласуется с её средней пенетрантностью [124]. Также в странах Центральной и Восточной Европы в нескольких исследованиях идентифицирована нонсенс-мутация c.1240С>T (p.R414X) в гене PALB2 [32, 145]. 41 1.4. Синдром Ли-Фраумени-2 Редкие аутосомно-доминантные синдромы (табл. 3), ассоциированные с РМЖ и РЯ, вносят небольшой в процентном соотношении, но важный вклад в наследственную предрасположенность к этим заболеваниям и должны быть непременно учтены при проведении дифференциальной диагностики [22, 28, 111, 121, 135, 140, 171]. Учитывая низкую популяционную встречаемость большинства этих синдромов (1—9/100 000-1 000 000) [126], в общем случае включение герминальных мутаций, их обусловливающих, в панель для первичного генетического скрининга не обосновано. Исключение составляет синдром Ли-Фраумени-2 (MIM 609265), ассоциированный с мутациями в гене CHEK2 (22q12.1) [27]. Ген CHEK2 кодирует киназу контрольной точки клеточного цикла 2, играющую важную роль в процессе репарации двухцепочечных разрывов ДНК. Риски развития онкологических заболеваний не так высоки, как у носителей мутаций в гене TP53 (синдром Ли-Фраумени-1, MIM 151623). Популяционные особенности Мутация 1100delC в 10-м экзоне гена CHEK2, приводящая к образованию нефункционального укороченного белка, ассоциирована не только с синдромом Ли-Фраумени [27], но и с РМЖ [45, 53, 104, 115, 116], РПЖ [53, 61, 142], раком ободочной и прямой кишки [53]. Она является достаточно редкой (около 1%), но встречается во многих странах: Великобритании, Польше, Нидерландах, Финляндии, Германии, Белоруссии, России, США, Австралии, странах Азии. Мутация 1100delC обнаружена у 4,5–5,1% больных РМЖ из семей с отягощенным онкологическим анамнезом (p≤0,0002). Анализ гаплотипов подтвердил, что все мутации 1100delC в гене CHEK2 имеют общее происхождение. Breast Cancer Case-Control Consortium проведено 10 исследований в пяти странах, в общей сложности было генотипировано 10860 больных РМЖ (без учёта семейного анамнеза, но в большинстве исследований был проведён отбор по возрасту манифестации заболевания) и 9065 здоровых женщин. Мутация 1100delC в гене CHEK2 была идентифицирована у 201 больной женщины (1,9%) и у 64 здоровых 42 (0,7%) – OR=2,34 (95% CI 1,72–3,20; p=0,00000001). Несколько чаще мутация 1100delC в гене CHEK2 встречалась при наличии больного родственника первой линии родства (OR=3,12, если больна 1 родственница; OR=4,17, если больны ≥2 родственниц) и у молодых женщин (OR=7,91 при постановке диагноза до 30 лет) [45]. При проведении мета-анализа (26000 больных РМЖ, 27000 здоровых человек) определены OR=2,7 (95% CI: 2,1–3,4) в неотобранной группе больных РМЖ и OR=4,8 (95% CI: 3,3–7,2) для семейного РМЖ (кумулятивный риск развития РМЖ в 70 годам составил в этой группе 37% (95% CI: 26–56%) [178]. Adank M.A. и соавт. показано, что у CHEK2-позитивных больных РМЖ повышена частота развития вторых первичных опухолей молочной железы (отношение рисков 2,1, 95% CI: 1,3-3,3, p=0,003) [15]. Показано, что у больных РМЖ с мутацией 1100delC в гене CHEK2 чаще развиваются опухоли контралатеральной молочной железы (отношение рисков 3,97, 95% CI: 2,59-6,07), хуже выживаемость (срок наблюдения 6 лет после постановки диагноза), отличий в чувствительности к адъювантной химиотерапии не отмечено [98]. Группой исследователей под руководством проф. Е.Н. Имянитова были определены частоты мутации 1100delC в гене CHEK2 в различных группах больных г. Санкт-Петербурга: 2,1% (14/660) и 5,2% (8/155) у больных односторонним и двусторонним РМЖ, соответственно; 0,8% (2/268) в неотобранной группе больных РЯ, 0,2% (1/448) у здоровых женщин среднего возраста, ни у одной пожилой женщины без ЗНО (0/373) [46, 100]. В популяциях Польши, Белоруссии, Германии описана также другая мутация в гене CHEK2, ассоциированная с риском развития РМЖ (OR=2,7—4,0) – IVS2+1G>A. Она приводит к нарушению сплайсинга и созданию стоп-кодона в экзоне 3 и, соответственно, образованию нефункционального белка [30, 53]. Миссенс-мутация Ile157Thr (rs17879961) в гене CHEK2 ассоциирована с синдромом Ли-Фраумени [27], РМЖ [53, 95, 104], РПЖ [53, 61, 142], раком ободочной и прямой кишки [53, 94]. Эта мутация достаточно распространена и встреча- 43 ется в популяции с частотой 4–5%. Замена изолейцина на треонин приводит к снижению функциональной активности белка. Кроме того, мутантный белок образует димеры с белком дикого типа, вероятно, снижая его активность [95]. Риски, связанные с мутацией Ile157Thr в гене CHEK2 несколько ниже: в работе Cybulski С. и соавт. (Польша) OR=1,4 [53]. Сходные результаты получены в Финляндии, OR=1,43 [95], хотя при генотипировании немецкой (996 пациенток) и белорусской (424 пациентки) групп больных РМЖ риски были выше – OR=4,5 и OR=3,6, соответственно [30]. В мета-анализе (26336 больных ЗНО и 44219 здоровых) риски, ассоциированные с мутацией Ile157Thr в гене CHEK2, составили OR=1,58 (95% CI: 1,42–1,75, p<0,00001) для РМЖ и OR=1,67 (95% CI: 1,24–2,26, p=0,0008) для колоректального рака [86]. 1.5. Однонуклеотидные полиморфизмы в различных генах и хромосомных локусах, ассоциированные с раком молочной железы и раком яичников В 2002 г. Antoniou A.C. и соавт. предположили, что наследственная предрасположенность к РМЖ у неносителей мутаций в генах BRCA1 и BRCA2 может быть главным образом объяснена в рамках полигенной модели с большим количеством низкопенетрантных аллелей, каждый из которых в отдельности незначительно повышает риск, но их кумулятивный эффект становится достаточно выраженным [18]. Была сформулирована гипотеза «распространённое заболевание – распространённый вариант» (common disease common variant), согласно которой наследственная предрасположенность к распространённым заболеваниям (в том числе онкологическим) обусловлена многими генетическими вариантами, часто встречающимися в популяции [87, 177]. Именно высокой популяционной частотой большинства этих аллелей объясняется значительная сложность их выявления. С развитием новых технологий стало возможным проведение полногеномных ассоциативных исследований (GenomeWide Association идентифицировано Studies, GWAS). множество С помощью однонуклеотидных этого подхода полиморфизмов было (single nucleotide polymorphism, SNP) в различных генах и хромосомных локусах, 44 ассоциированных с риском развития РМЖ и РЯ (некоторые из них приведены в табл. 4). Отношения шансов (OR) находятся в интервале 1,1–1,3 и 1,2–1,6 для гетеро- и гомозиготных генотипов, соответственно [63, 78, 141, 153, 154]. Впоследствии проведено множество дополнительных полногеномных ассоциативных исследований, в том числе мета-аналитических [48, 110, 128], многие ассоциации валидированы не только для европеоидных, но и азиатских, и африканских популяций [106, 109]. Выполнены исследования по валидации некоторых однонуклеотидных полиморфизмов и в российской популяции: так, Боярских У.А. и соавт. показали ассоциации полиморфизма rs2981582 в гене FGFR2 с развитием РМЖ в Западной Сибири, OR=1,46 (95% CI: Фарахтдиновой А.Р. (республика p=2*10-6) [34]; 1,30–1,62, Башкортостан, в исследованы работе этнически смешанные группы больных РМЖ и здоровых женщин) достоверные различия выявлены для однонуклеотидных полиморфизмов rs2981582 в гене FGFR2 (OR=1,33), rs13387042 в локусе 2q35 (OR=1,22), rs3803662 в локусе 16q12 (OR=1,18), rs889312 в локусе rs889312 (OR=1,18) [12]. Для ряда однонуклеотидных полиморфизмов изучены ассоциации с различными гистологическими типами РМЖ, а также риски у носителей мутаций в генах BRCA1 и BRCA2 (табл. 4). Полногеномные ассоциативные исследования проводятся, как правило, в три стадии: 1. изучаются ассоциации нескольких сотен тысяч однонуклеотидных полиморфизмов, подобранных так, чтобы маркировать блоки неравновесного сцепления во всем геноме, сравнением относительно небольших (сотни человек) групп больных (часто отобранных по критерию семейной отягощённости) и здоровых; 45 Таблица 4. Однонуклеотидные полиморфизмы – низкопенетрантные маркёры генетической предрасположенности к раку молочной железы и раку яичников Ген/ локус Функция белка Полиморфизм OR для минорного аллеля* Ассоциации в разных группах больных Модификация риска у носителей мутаций в генах BRCA1/2 [20, 21] BRCA1 BRCA2 Нет Да Нет Да Нет Да Да Да Рак молочной железы Рецептор для факторов роста фибробластов rs2981582 1,26 [63] LSP1 rs3817198 1,07 [63] MAP3K1 (5q11) Внутриклеточное связывание F-актина Интеграция клеточного ответа на митогенные и метаболические стимулы РМЖ в постменопаузе [88] Более сильные ассоциации с РЭ-позитивными и РПпозитивными опухолями молочной железы [75] Различия не показаны [75] rs889312 1,13 [63] Различия не показаны [75] TNRC9 (16q12) ДНК-зависимая регуляция транскрипции rs3803662 1,28 [154] Более сильные ассоциации с 1,20 [63] РЭ-позитивными опухолями молочной железы [154] 45 FGFR2 46 Окончание таблицы 4. Ген/ локус Функция белка Полиморфизм 2q35 – rs13387042 POU5F1B (8q24) Активация транскрипции rs13281615 OR для минорного аллеля* Ассоциации в разных группах больных BRCA1 BRCA2 Да Да Нет Нет Не изучено Не изучено Не изучено Не изучено 46 1,12 [154] Более сильные ассоциации с РЭ-позитивными опухолями молочной железы [154] 1,08 [63] Более сильные ассоциации с РЭ-позитивными и РПпозитивными опухолями молочной железы низкой степени злокачественности [75] Модификация риска у носителей мутаций в генах BRCA1/2 [20, 21] Рак яичников семейство HOX (2q31) BNC2 (9p22) Регуляция эмбрио- и органогенеза Регуляция транскрипции ДНК rs2072590 rs3814113 Более сильные ассоциации с серозным РЯ [78] 0,82 [153] Более сильные ассоциации с серозным РЯ [153] 1,16 [78] *показаны результаты первоначальных полногеномных ассоциативных исследований. 47 2. сравниваются частоты нескольких тысяч однонуклеотидных полиморфизмов (~5% от начального количества) в бόльших группах (тысячи человек); 3. изучаются несколько однонуклеотидных полиморфизмов во многих дополнительных исследованиях на десятках тысяч больных и здоровых. При этом уровень статистической значимости для полногеномных ассоциативных исследований равен p<10-7 [63]. Примечательным является тот факт, что хотя мутации в генах BRCA1, BRCA2, TP53, ATM, CHEK2 обусловливают повышенный риск развития РМЖ, Baynes С. и соавт. показали, что между однонуклеотидными полиморфизмами в этих генах (изолированно и в комбинации) и риском развития РМЖ ассоциаций нет [26]. Технологически подход принципиально отличается от изучения геновкандидатов, ассоциации часто обнаруживают не только для полиморфизмов в известных генах с установленными функциями, но и в хромосомных локусах вне известных генов – т.н. «генных пустынях». Важные вопросы для дальнейших исследований – (1) установление функциональных генетических вариантов в блоках неравновесного сцепления; (2) определение их роли в канцерогенезе, а так же взаимодействия однонуклеотидных полиморфизмов и других генетических и средовых факторов риска [141]. Учитывая высокие частоты встречаемости однонуклеотидных полиморфизмов и межпопуляционные отличия, необходимым этапом валидации их как аллелей предрасположенности являются репликативные исследования в различных популяциях/этнических группах [141]. Показано, что у женщин из семей с BRCA-ассоциированным РМЖ риск развития РМЖ выше, чем среднепопуляционный, даже в отсутствие высокопенетрантных герминальных мутаций [147]. Antoniou A.C. и Easton D.F. выдвинули гипотезу о том, что риск развития РМЖ у носителей мутаций в генах BRCA1 и BRCA2 модифицируется генетическими факторами [17]. 48 Мультицентровые исследования, проведенные Antoniou A.C. и соавт. и включавшие суммарно более 25000 носителей мутаций в генах BRCA1 и BRCA2 [20, 21], показали модифицирующую роль тех же распространённых низкопенетрантных генетических вариантов, которые связаны с риском развития РМЖ в популяции в целом (табл. 4) [63, 154]. Важно, что относительный риск для этих генетических вариантов в группе больных с мутациями в генах BRCA1 и BRCA2 сопоставим с риском для популяции в целом. Таким образом, полученные данные наиболее точно укладываются в простую мультипликативную модель взаимодействия, в которой эффект каждого варианта независим; точная оценка риска производится с учётом вклада высокопенетрантных мутаций [16]. Генетический риск является кумулятивным, и для носителей высокопенетрантных мутаций эффект, который является лишь умеренным в популяции в целом, может стать критичным [41, 50, 55]. По данным Консорциума исследователей модификаторов BRCA1/2 (Consortium of Investigators of Modifiers of BRCA1/2), семь однонуклеотидных полиморфизмов ассоциированы с риском развития РМЖ у носителей мутаций в гене BRCA2 и два – у носителей мутаций в гене BRCA1; при этом вероятность развития РМЖ для 5% носителей мутаций в гене BRCA2 с максимальным генетическим риском была оценена как 80–96%, а для 5% с минимальным риском – 42–50% [50]. 1.6. Практическое применение результатов генетических исследований На сегодняшний день принята теория, согласно которой РМЖ и РЯ рассматриваются как сложные полигенные заболевания, в их основе лежит комбинированный эффект нескольких генетических вариантов [105, 135, 169]. Различные маркёры предрасположенности к РМЖ и РЯ, идентифицированные как при поиске генов-кандидатов, так и в полногеномных ассоциативных исследованиях, и возможности их практического применения представлены в табл. 5. Предрасположенность реализуется в результате взаимодействия 49 генетических факторов и факторов окружающей среды, что является сегодня предметом активного изучения учёных всего мира. Таблица 5. Группы генетических маркёров предрасположенности к РМЖ/РЯ и их практичеcкое применение Распространённость в популяции Пенетрантность Практическое применение Мутации в генах BRCA1, BRCA2, TP53, PTEN, STK11, CDH1, MLH1, MSH2, PMS6, NF1 Низкая Высокая Медикогенетическое консультирование, индивидуализация профилактики, диагностики и лечения Мутации в генах CHEK2, NBN, BLM, ATM, RAD50, генах анемии Фанкони: FANCJ (BRIP1), FANCN (PALB2), FANCO (RAD51C), FANCP (SLX4) Низкая Средняя Медикогенетическое консультирование Однонуклеотидные полиморфизмы в различных генах и хромосомных локусах (FGFR2, LSP1, 16q12, 5q11, 2q35, 8q24, 9p22, 2q31 и других) Высокая Низкая На сегодняшний день отсутствует Группа генетических маркёров Молекулярно-генетическая диагностика с целью выявления высокопенетрантных мутаций, ассоциированных с риском развития РМЖ и РЯ, внедрена в клиническую практику во многих странах мира. Определены критерии отбора пациентов для генетического тестирования, разработаны модели для оценки вероятности носительства мутаций в этих генах и риска развития РМЖ у членов семей с отягощенным онкологическим анамнезом (BRCARPO, Myriad II, BOADICEA, Manchester score, Penn II и другие) [127]. Национальные руководства в странах Западной Европы и США регламентируют порядок проведения генетического 50 тестирования и дальнейшего наблюдения пациентов [25, 72, 122]. Для носителей мутаций в генах BRCA1 и BRCA2 валидированы методы профилактики, ранней диагностики ЗНО и индивидуализации лечения (хирургического, химиотерапевтического) [25, 60, 84, 108, 122]. Так, рекомендации для ранней диагностики РМЖ и РЯ у носителей мутаций в генах BRCA1 и BRCA2 включают в себя: 1. самообследование молочных желез – 1 раз в месяц с 18 лет; 2. консультации гинеколога и маммолога – 1 раз в 6–12 месяцев с 18 лет; 3. маммография в сочетании с магнитно-резонансной томографией (МРТ) молочных желёз – 1 раз в год с 25 лет (или иного возраста с учётом семейного анамнеза); 4. трансвагинальное ультразвуковое исследование (УЗИ) органов малого таза (возможно в сочетании с допплерографией) – 1 раз в 6 месяцев с 30 лет (или иного возраста с учётом семейного анамнеза); 5. определение уровня опухолеассоциированного антигена СА-125 (маркёра рака яичников) – 1 раз в 6 месяцев с 30 лет. Дополнительно могут использоваться: 1. ультразвуковая компьютерная томография (УЗКТ) молочных желез – 1 раз в год с 25 лет; 2. определение уровня опухолеассоциированного антигена CA-15-3 (маркёра рака молочной железы) – 1 раз в 6 месяцев с 25 лет. В плане лечения больных РМЖ с мутациями в генах BRCA1 и BRCA2 предпочтительны больший объем операции (радикальная мастэктомия) и дополнительное комплексное лечение (полихимиотерапия, гормонотерапия) с целью снижения частоты возникновения рецидивов: показано, что в этой категории больных выше частота развития вторых первичных ипсилатеральных и контралатеральных опухолей молочных желез по сравнению с пациентками из общей популяции – 39% и 7%, соответственно (p<0,001) [129]. Перед выполнением оперативного вмешательства по поводу РМЖ при наличии мутации в гене BRCA1 или BRCA2 51 представляется целесообразным обсудить с больной возможность проведения профилактической операции на контралатеральной молочной железе. Проведение профилактических хирургических мероприятий должно осуществляться в высокоспециализированных онкологических клинических центрах. ФГБНУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» получено разрешение на применение новой медицинской технологии «Профилактическая мастэктомия с одномоментной реконструкцией» (ФС №2011/009 от 03.02.2011 г., см. приложение №3), которая используется в рутинной хирургической практике клиники. BRCA-статус потенциально может быть использован как предиктивный маркер при проведении химиотерапевтического лечения. Показана высокая эффективность неоадъювантной терапии с антрациклинами и таксанами у носителей мутаций в генах BRCA1 и BRCA2 [23, 44]. В ряде исследований выявлено, что у больных BRCA1-ассоциированным РМЖ эффективна неоадъювантная терапия цисплатином, выраженная реакция на препарат независимо связана с трижды негативным фенотипом и с наличием мутации в гене BRCA1 [42, 144]. Однако масштабные клинические испытания пока не проведены, и на сегодняшний день убедительных данных в пользу включения соединений платины в состав адъювантной и неоадъювантной терапии больных РМЖ-носителей мутаций в гене BRCA1 не получено [43]. Cовременной альтернативой стандартным лечебным подходам является таргетная терапия: показано, что BRCA1/2-дефицитные опухолевые клетки селективно гибнут при использовании PARP-ингибиторов (PARP1 – фермент, катализирующий поли-АДФ-рибозилирование; участвует в репарации ДНК). Последние стадии клинических испытаний проходит препарат, специально предназначенный для адъювантной терапии больных РМЖ и/или РЯ с мутациями в генах BRCA1 и BRCA2 – (AZD2281) олапариб (AstraZeneca). В странах Западной Европы и США проходят клинические испытания и другие экспериментальные препараты группы PARP-ингибиторов: велипариб (ABT-888), инипариб (BSI-201), рукапариб (CO338), MK-4827, BMN-673, CEP-9722, E7016 (приведены аббревиатуры, обозначаю- 52 щие экспериментальные препараты группы PARP-ингибиторов производства различных фармакологических компаний) [101]. Для лекарственной профилактики РМЖ может использоваться тамоксифен: показано, что он значительно снижает риск контралатерального РМЖ у пациенток с BRCA-ассоциированным РМЖ [84]. В мировой онкологической практике показан хороший эффект профилактических операций – двусторонних мастэктомии и сальпинго-овариэктомии, которые снижают и заболеваемость, и смертность от РМЖ и РЯ. Профилактическая мастэктомия исключительно эффективна, она снижает риск развития РМЖ на 90–95%. Двусторонняя сальпинго-овариэктомия снижает риск развития РЯ, рака фаллопиевых труб, первичного перитонеального рака и РМЖ. Она особенно показана носительницам мутаций в генах BRCA1 или BRCA2 по окончании репродуктивного периода (оптимальный возраст – 35– 40 лет), т. к. эффективные методы скрининга РЯ пока не разработаны [60, 84]. В РФ законодательная база проведения таких операций на сегодняшний день, к сожалению, отсутствует. Для носителей высокопенетрантных мутаций в других генах (TP53, PTEN, STK11, CDH1, MLH1, MSH2, PMS6) также выработаны рекомендации по наблюдению и лечению, учитывающие специфику ассоциированных наследственных синдромов [28, 111, 140, 171]. Внедрение в рутинную клиническую практику определения других генетических вариантов (со средней и низкой пенетрантностью), ассоциированных с повышенным риском развития РМЖ и РЯ, на сегодняшний день является предметом широких дискуссий. Накоплен большой массив данных, в первую очередь – для групп больных семейным РМЖ и РЯ. Но пока на основании наличия/отсутствия этих генетических маркёров клинические решения приниматься не могут [67, 114, 180]. В настоящее время молекулярно-генетическая диагностика мутаций со средней пенетрантностью уже применяется клиническими генетиками для оценки индивидуального риска в семьях с отягощённым наследственным анамнезом, однако конкретные рекомендации для дальнейшего ведения/лечения на сегодняшний 53 день не разработаны. В перспективе носительство этих мутаций может быть использовано для оптимизации терапии (в том числе применения таргетных препаратов): показано, что PALB2-дефицитные клетки чувствительны к PARPингибиторам [38]. Данные, полученные в рамках проекта Объединённого онкологического исследовании генов и факторов окружающей среды (Collaborative Oncological Gene–environment Study, COGS), показали, что около 28% семейного РМЖ обусловлены распространёнными низкопенетрантными вариантами [116]. Учитывая интенсивное развитие технологий и снижение стоимости генотипирования однонуклеотидных полиморфизмов, уже возможна разработка доступных диагностических наборов, которые могут быть использованы в дополнение к стандартным моделям оценки риска [114]. Проведено несколько исследований, посвящённых разработке модели оценки риска развития РМЖ с учётом распространённых генетических вариантов. Традиционно для предсказания риска используется модель Гейла (Gail’s model), суммирующая информацию о репродуктивном анамнезе женщины (возраст менархе, возраст первых родов), семейном анамнезе (РМЖ у родственников первой степени родства) и предыдущих биопсиях молочной железы. Для повышения точности также учитываются маммографическая плотность молочных желез и атипическая гиперплазия в анамнезе [73]. Высокий риск, определённый с помощью модели Гейла, является одним из показаний к хемопрофилактике тамоксифеном [74]. В ряде работ продемонстрировано, что дополнение стандартной модели распространёнными генетическими факторами риска повышает, хоть и незначительно, её точность. Так, Wacholder S. и соавт. провели сравнение различных логистических регрессионных моделей, учитывающих как общепринятые клинические, так и генетические факторы риска (10 однонуклеотидных полиморфизмов). В исследовании участвовали 5590 больных РМЖ и 5998 здоровых женщин (возраст 50–79 лет). Самой эффективной была комбинированная модель, включающая 54 все факторы риска: 61,8% vs 58,0% для модели Гейла. Авторы сделали вывод о том, что добавленная точность (3,8%) не настолько высока, чтобы достаточно дорогостоящие генетические тесты могли быть использованы в рутинной клинической практике [173]. Сопоставимый результат получен в исследовании, проведённом в японской популяции (697 больных РМЖ, 1394 здоровых женщин) Sueta A. и соавт.: в логистическую регрессионную модель был добавлен показатель полигенного риска (ППР) (polygenic risk score, PRS), учитывающий генотипы по семи полиморфизмам, что повысило её точность на 2,8% [156]. При создании подобных моделей критичным является тщательный отбор значимых однонуклеотидных полиморфизмов для расчёта ППР. Включение полиморфизмов с неподтверждённой на полногеномном уровне значимостью снижает точность такой модели [176]. Установлено, что идентификация распространённых генетических вариантов с низкой пенетрантностью может существенно повысить эффективность оценки риска развития РМЖ у женщин с семейной отягощённостью. Sawyer S. и соавт. рассчитали ППР на основании 22 однонуклеотидных полиморфизмов у 1143 женщин из группы высокого риска с отягощённым семейным анамнезом. ППР был значимо ассоциирован с ранним возрастом манифестации (до 35 лет) и риском развития рака контралатеральной молочной железы [138]. Таким образом, показатель полигенного риска мог бы быть использован: 1. для выявления молодых женщин с отягощённым РМЖ семейным анамнезом в категорию риска, подлежащую интенсивному скринингу РМЖ и хемопрофилактике тамоксифеном; 2. для оценки риска развития опухолей контралатеральной молочной железы у больных РМЖ и оптимизации тактики хирургического лечения. Внедрение подобного генетического теста в клиническую практику позволит оптимизировать в этих группах пациенток стратегию скрининга, профилактики и лечения РМЖ [114]. Перспективным для клинического применения является 55 определение однонуклеотидных полиморфизмов, модифицирующих риск у носителей мутаций в генах BRCA1 и BRCA2, т.к. (1) оно позволит уточнить риск развития РМЖ и РЯ с индивидуализацией ведения пациентов, (2) релевантно для небольшой группы больных РМЖ и РЯ, (3) для этих групп пациентов валидированы клинические программы [50, 135]. Тактика проведения молекулярно-генетической диагностики больных РМЖ/РЯ в настоящее время является многоступенчатой: на первом этапе проводится поиск мутаций в генах BRCA1 и BRCA2, затем, если мутации не обнаружены, проводится расширенное исследование с анализом структуры других генов, ассоциированных с развитием РМЖ/РЯ. В популяциях с выраженным эффектом основателя в первую очередь проводится скрининг распространённых мутаций и только в их отсутствие – полный анализ кодирующих последовательностей генов. Знание популяционной генетической структуры лежит в основе эффективного подхода к индивидуализации и повышению доступности генетического тестирования, позволяет разработать оптимальный скрининговый протокол на уровне национального здравоохранения [65, 66, 80, 92, 168]. В ближайшем будущем, когда стоимость и время проведения секвенирования будут снижены до приемлемого уровня, полный анализ структуры всех генов, вовлечённых в репарацию ДНК и другие РМЖ/РЯ-ассоциированные пути, станет доступным и экономически оправданным для членов семей с отягощённым анамнезом [67, 135]. В исследовании Walsh T. и соавт. проведено массивное параллельное секвенирование 21 гена у 360 больных РЯ, перитонеальным раком, раком фаллопиевых труб; частота обнаружения мутаций в различных генах суммарно составила 24%. Более 30% носителей не отмечали семейной истории РМЖ или РЯ, более 35% относились к возрастной группе 60 лет и старше. Был сделан вывод о целесообразности масштабного генетического тестирования больных РЯ, перитонеальным раком, раком фаллопиевых труб независимо от семейного анамнеза и возраста манифестации [174]. 56 Внедрение персонализированной оценки генетического риска в клиническую практику является сложной задачей. Критический вопрос заключается в том, каким образом имеющаяся информация может быть интегрирована в единую модель: как определяется взаимодействуют итоговый различные генетический генетические риск развития варианты, как онкологических заболеваний [167]. В будущем, вероятно, индивидуальный генетический риск будет определять скрининговые программы, например, модифицируя возраст начала и интервалы проведения маммографии, необходимость включения МРТ в программы наблюдения и профилактических хирургических операций. Оптимальным вариантом является интенсивный скрининг у женщин из групп высокого риска и снижение частоты потенциально-опасного скрининга в группах с низким генетическим риском. Тем не менее, клиническая ценность такого генетически-обоснованного индивидуального подхода должна быть валидирована как для индивидуума, так и для популяции с точки зрения системы здравоохранения [139]. Должны быть разработаны многокомпонентные модели предсказания индивидуального риска, учитывающие семейный анамнез, средовые факторы, образ жизни, репродуктивное поведение и генотип пациента. Такой подход позволит персонализировать профилактические, диагностические и лечебные мероприятия и, как результат, снизить смертность от РМЖ и РЯ [135]. 57 ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 2.1. В Формирование коллекций образцов крови исследование были включены больные и здоровые женщины, идентифицирующие себя как русские и постоянно проживающие на территории РФ. Сбор материала был проведён на базе клинических подразделений ФГБНУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» (больные РМЖ и/или РЯ) в 2010—2014 гг. и в отделении трансфузиологии ФГБНУ «РНЦХ им. акад. Б.В. Петровского» (доноры первичной кроводачи) в 2012—2013 гг. Перед взятием материала у больных РМЖ/РЯ и доноров первичной кроводачи было получено информированное добровольное согласие на проведение исследования. В ходе выполнения работы сформированы коллекции образцов цельной периферической крови и ДНК групп больных РМЖ и/или РЯ, контрольной группы здоровых женщин-доноров первичной кроводачи. В качестве дополнительной контрольной группы в некоторых случаях использовали смешанную по полу группу доноров первичной кроводачи (1197 человек, из них 591 женщина и 606 мужчин). При формировании неотобранных групп больных РМЖ и РЯ единственным критерием включения в исследование служил подтвержденный гистологически диагноз РМЖ и РЯ. Для включения больных РМЖ и РЯ в отобранную группу использовали критерии, свидетельствующие о вероятной наследственной природе заболевания (онкологически отягощённый семейный анамнез, первично- множественные онкологические заболевания, возраст до 50 лет). Характеристики групп больных РМЖ/РЯ и основной контрольной группы здоровых женщин представлены в табл. 6. 2.2. Выделение геномной ДНК Выделение ДНК из образцов цельной периферической крови проводили с помощью сорбентной Технология», Россия). методики («ПРОБА-ГС-ГЕНЕТИКА», ООО «ДНК- 58 Таблица 6. Характеристика групп больных РМЖ/РЯ и контрольной группы Группа Неотобранная группа Возраст n Критерии отбора Средний Медиана Диагноз (и/или) Другие (и/или) 963 49,6±11,5 49,0 РМЖ Нет 202 52,5±12,0 52,0 РЯ Нет 306 41,6±10,2 40,5 РМЖ Отягощённый1 семейный анамнез РЯ ПМЗН2 больных РМЖ Неотобранная группа больных РЯ Отобранная группа 58 больных РМЖ и РЯ Возраст до 50 лет включительно Контрольная группа 591 Всего 2062 36,5±12,4 37,0 Здорова Нет 1 как минимум один родственник первой степени родства с РМЖ и/или РЯ; 2 в том числе сочетание РМЖ и РЯ, двусторонний РМЖ и опухоли других локализаций в сочетании с РМЖ/РЯ. 59 2.3. Дизайн и синтез олигонуклеотидов При разработке олигонуклеотидов использовали базы данных нуклеотидных последовательностей GenBank, dbSNP (сервер NCBI (National Center for Biotechnology Information), http://www.ncbi.nlm.nih.gov) и программное обеспечение Oligo 6.0. Синтез праймеров и флуоресцентно- меченых зондов для ПЦР в реальном времени проводили на синтезаторах ДНК ASM-102, ASM-800 и ASM-2000 (Биоссет, Россия). Использовали коммерчески доступные (отечественные) флуорофоры (FAM, HEX, Cy5) и гаситель флуоресценции (BHQ1). Олигонуклеотиды очищали методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (Phenomenex, США). Чистоту полученных олигонуклеотидов контролировали масс- спектрометрическим методом на приборе Microflex™ LT (Bruker Daltonik GmbH). Генотипирование проводили модифицированным методом примыкающих проб (adjacent/kissing probes), используя оригинальные олигонуклеотиды. Метод основан на определении температуры плавления флуоресцентно- меченых зондов, которая напрямую зависит от наличия/отсутствия нуклеотидных замен в матрице ДНК в области гибридизации зондов. В реакционную смесь помимо флуоресцентно-меченого типирующего зонда добавляется тугоплавкий олигонуклеотидный зонд с гасителем флуоресценции (BHQ1), который гибридизуется на матрице ДНК в непосредственной близости к типирующему зонду (примыкает к нему). При низкой температуре происходит гибридизация зондов с амплифицированной в ходе ПЦР ДНК, в результате чего флуоресцентный краситель оказывается рядом с гасителем флуоресценции. По увеличению флуоресцентного сигнала при повышении температуры можно определить температуру плавления типирующего зонда и, следовательно, определить наличие изменения последовательности ДНК (делеции/инсерции нескольких нуклеотидов или однонуклеотидного полиморфизма). Для повышения надёжности генотипирования, что особенно важно во время клинических исследований, в данной работе использован метод одновременной гибридизации с двумя альтернативными типирующими зондами, меченными различными флуорофорами (FAM и HEX) [8, 11]. Дополнительно в состав 60 смесей для амплификации включена система для амплификации фрагмента геномной ДНК человека, которая позволяет контролировать количество ДНК в амплификационной пробирке и исключить ошибки генотипирования. Система для амплификации геномной ДНК человека включает ДНК-зонд, который содержит флуоресцентную метку (Су5) и гаситель флуоресценции (BHQ1). При образовании специфичного продукта ДНК–зонд разрушается, уровень флуоресценции возрастает. С помощью данной технологии было создано 24 системы для генотипирования известных мутаций в генах BRCA1 (185delAG, 4153delA, 5382insC, 3819delGTAAA, 3875delGTCT, 300T>G (C61G), 2080delA, 2963del10), BRCA2 (6174delT, 1528delAAAA, 9318delAAAA), CHEK2 (1100delC, IVS2+1G>A, I157T), NBN (657del5), BLM (Q548X), однонуклеотидных полиморфизмов rs2981582 в гене FGFR2, rs3817198 в гене LSP1, rs889312 в локусе 5q11, rs13281615 в локусе 8q24, rs13387042 в локусе 2q35, rs3803662 в локусе 16q12, rs3814113 в локусе 9p22, rs2072590 в локусе 2q31. Их перечень и значения температур плавления олигонуклеотидных зондов для возможных аллельных вариантов приведены в табл. 7. 2.4. ПЦР в режиме реального времени Для постановки ПЦР в режиме реального времени использовали реагенты «НПФ ДНК-Технология» (Россия), в том числе Taq-ДНК-полимеразу ТехноTaqAT, позволяющую осуществить реализацию «горячего старта» без применения парафина. Полимеразную цепную реакцию и определение температур плавления олигонуклеотидных проб проводили с помощью детектирующего амплификатора «ДТпрайм» (ООО «НПО ДНК-Технология», Россия). Программное обеспечение к прибору «ДТпрайм» определяет температуру плавления зондов по максимуму функции dF/dT, полученной путём дифференцирования экспериментальной зависимости флуоресценции от температуры после 61 Таблица 7. Температурные характеристики (оС) типирующих зондов для детекции мутаций и однонуклеотидных полиморфизмов в различных генах и хромосомных локусах Ген/локус BRCA1 Тривиальное название мутации (номенклатура BIC, HGVS) 185delAG, c.68_69delAG 300T>G (p.Cys61Gly), c.181T>G 2080delA, c.1961delA 2963del10, c.2844_2853del10 BRCA2 rs-номер А1 A2 Зонд A2 (HEX) A1 A2 A1 A2 rs80357713 AG delAG 56,4 49,3 44,4 57,8 rs28897672 T G 58,7 46,2 55,2 59,7 rs80357522 A delA 52,9 47,2 46,4 не определен AGGCTCTAGG del10 58,1 53,6 52,5 52,2 57,5 rs80357609 GTAAA delGTAAA 54,7 43,2 37,2 53,7 rs80357868 GTCT delGTCT 60,1 50,2 50,1 57,2 rs80357711 rs80357906 A delC delA C 53,0 52,9 46,6 41,6 46,0 46,9 52,6 53,1 1528delAAAA, c.1300_1303delAAAA не определен AAAA delAAAA 55,0 49,0 48,0 55,0 6174delT, c.5946delT rs80359550 delT 51,3 40,8 40,8 49,8 9318delAAAA, c.9090_9093delAAAA не определен AAAA delAAAA 57,3 52,4 52,0 57,0 T 61 3819delGTAAA, c.3700_3704delGTAAA 3875delGTCT, c.3756_3759delGTCT 4153delA, c.4034delA 5382insC, c.5266dupC Зонд A1 (FAM) Аллель 62 Окончание таблицы 7. Ген/локус CHEK2 BLM NBN Зонд A1 (FAM) Аллель rs-номер А1 A2 Зонд A2 (HEX) A1 A2 A1 A2 50,2 57,0 45,4 52,5 53,0 IVS2+1G>A c.470 T>C (p.Ile157Thr) 1100delC c.1642C>T (p.Q548Х) 657del5, c.657_661delACAAA (p.K219fsX19) не определен rs17879961 не определен не определен G T C C A C delC T 51,5 54,8 49,5 54,4 45,3 49,9 36,2 44,5 41,3 47,1 34,9 45,0 не определен ACAAA delACAAA 49,9 48,6 43,0 c.109+906T>C c.*13+200T>C g.176177905A>C g.217041109A>G g.56736057C>A g.127343372A>G g.16915023T>C g.52552429A>G rs2981582 rs3817198 rs2072590 rs13387042 rs889312 rs13281615 rs3814113 rs3803662 C T G A A A T C T C T G C G C T 52,9 54,8 58,0 54,7 52,5 54,0 54,9 52,4 49,8 50,3 45,2 46,2 44,0 44,6 47,7 45,9 44,7 47,1 47,1 44,5 44,3 44,5 50,3 45,3 57,3 57,0 56,2 55,7 52,8 52,8 56,8 54,2 62 FGFR2 LSP1 2q31 2q35 5q11 8q24 9p22 16q12 Тривиальное название мутации (номенклатура BIC, HGVS) 63 аппроксимации кубическими сплайнами (метод наименьших квадратов) [11]. После внесения в параметры анализа температур плавления олигонуклеотидных зондов (табл. 7) генотипирование выполняется автоматически (модуль «Анализ полиморфизмов, плавление»), рис. 3. Рисунок 3. Анализ кривых плавления и определение генетических полиморфизмов в программном обеспечении к прибору «ДТпрайм». Дополнительный контроль результатов ПЦР в реальном времени осуществляли методом электрофореза в 2% агарозном геле. 2.5. Результаты Секвенирование ДНК по Сэнгеру генотипирования подтверждали путем секвенирования продуктов амплификации по Сэнгеру [137]. Cеквенирование проводили на автоматическом капиллярном секвенаторе ДНК «ABI PRISM 3100» (Applied Biosystems, США). 64 2.6. Создание контрольных образцов При разработке наборов реагентов были клонированы все аллельные варианты для использования в качестве положительных контрольных образцов (Евроген, Россия). 2.7. Статистическая обработка результатов Оценку соответствия выявленных в контрольной группе частот генотипов закону Харди-Вайнберга проводили по критерию χ2-квадрат в сравнении с ожидаемыми частотами генотипов равновесного распределения [85]. Статистическую ошибку распределения частот аллелей вычисляли по формуле: sp = sqrt(p(1 – p)/2N) (1) где р – частота аллеля, N – число индивидов в группе. Для сравнения частот аллелей в группах больных и контрольной применяли анализ таблиц сопряжённости с использованием двустороннего точного критерия Фишера. Различие групп полагали статистически значимым при p<0,05. Отношение шансов (OR – odds ratio) рассчитывали по формуле: OR = (c|A)/(nc|A) / (c|B)/(nc|B) (2) где с – число аллелей A1, nc – число аллелей А2, A – группа больных, B – контрольная группа. Для оценки выживаемости больных РМЖ и РЯ в зависимости от наличия мутаций использовали интервальный метод построения таблиц дожития ”Lifetable” по Каплану-Мейеру, рекомендованный для применения Международным противораковым союзом (UICC). Срок прослеженности оценивался на момент 01.01.2015. Для сравнения таблиц выживаемости использовали тест Cox’s F-test и Wilcoxon. Достоверность различия в определенный момент времени рассчитывали по критерию Стьюдента. Достоверными считали различия с вероятностью не менее 95%, т.е. p<0,05. Обработку полученных результатов проводили в программном пакете StatSoft Statistica 7.0. 65 ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ В ходе данной работы созданы и апробированы оригинальные реагенты для определения молекулярно-генетических маркёров, ассоциированных с риском развития РМЖ и/или РЯ. Получены комплексные данные о частотах мутаций в генах BRCA1 (185delAG, 4153delA, 5382insC, 3819delGTAAA, 3875delGTCT, 300T>G, 2080delA, 2963del10), BRCA2 (6174delT, 1528delAAAA, 9318delAAAA), CHEK2 (1100delC, IVS2+1G>A, I157T), NBN (657del5), BLM (Q548X), полиморфных аллельных вариантов в генах FGFR2 (rs2981582), LSP1 (rs3817198), хромосомных локусах 5q11 (rs889312), 8q24 (rs13281615), 2q35 (rs13387042), 16q12 (rs3803662), 9p22 (rs3814113), 2q31 (rs2072590) в больших выборках больных РМЖ и/или РЯ и здоровых женщин в российской популяции. 3.1. Оптимальный состав диагностической панели мутаций в генах BRCA1/2 для первичного генетического скрининга больных РМЖ и/или РЯ Для определения оптимального состава диагностической панели мутаций в генах BRCA1 и BRCA2 был проведён молекулярно-генетический скрининг в неотобранных группах больных РМЖ (963 человека) и РЯ (202 человека). Мутации в генах BRCA1 и BRCA2 были обнаружены у 58 больных раком молочной железы (6,0%) и 46 больных раком яичников (22,8%). Частоты и спектр мутаций в генах BRCA1 и BRCA2 у больных РМЖ и РЯ представлены в табл. 8 и на рис. 4. В спектре обнаруженных мутаций и у больных РМЖ, и у больных РЯ преобладала мутация 5382insC (BRCA1) – её доля составила 72,4% и 58,7%, соответственно. Это согласуется с результатами многочисленных исследований, проведённых в различных регионах Российской Федерации, в которых было показано превалирование мутации 5382insC в гене BRCA1 [3, 4, 9, 14, 107, 160, 162]. 66 Таблица 8. Частоты мутаций в генах BRCA1 и BRCA2 в неотобранных группах больных раком молочной железы и больных раком яичников Ген Наименование (номенклатура BIC) Принадлежность скрининговой панели РМЖ (n=963) РЯ (n=202) Число носителей Частота в группе (%) Частота в спектре мутаций (%) Число носителей Частота в группе (%) Частота в спектре мутаций (%) 5382insC + 42 4,4 72,5 27 13,4 58,7 BRCA1 4153delA + 7 0,7 12,1 5 2,5 10,9 BRCA1 300T>G + 2 0,2 3,4 4 2,0 8,7 BRCA1 2080delA + 2 0,2 3,4 5 2,5 10,9 BRCA1 185delAG + 1 0,1 1,7 2 1,0 4,3 BRCA1 3819delGTAAA + 1 0,1 1,7 0 0 0 BRCA1 3875delGTCT + 1 0,1 1,7 0 0 0 BRCA2 6174delT + 2 0,2 3,4 3 1,5 6,5 BRCA1 2963del10 – 0 0 0 0 0 0 BRCA2 1528delAAAA – 0 0 0 0 0 0 BRCA2 9318delAAAA – 0 0 0 0 0 0 58 6,0 100,0 46 22,8 100,0 Всего 66 BRCA1 67 Шесть мутаций – 185delAG, 4153delA, 5382insC, 300T>G, 2080delA в гене BRCA1 и 6174delT в гене BRCA2 – были зарегистрированы и у больных РМЖ, и у больных РЯ (табл. 8), каждая из них обнаружена ранее в российской популяции более чем в одном исследовании (табл. 2) [3, 4, 9, 13, 76, 91, 107, 160]. Мутации 3819delGTAAA и 3875delGTCT в гене BRCA1 были найдены только у больных РМЖ, их отсутствие в группе больных РЯ может быть связано с меньшим размером выборки. Рисунок 4. Спектр обнаруженных мутаций в генах BRCA1 и BRCA2 у больных РМЖ (А) и у больных РЯ (Б) (неотобранные группы). 68 Мутации 5382insC, 4153delA и 300T>G (C61G) в гене BRCA1 обусловлены эффектом основателя и встречаются во многих странах со славянским населением (Белоруссии, Литве, Латвии, Польше, Венгрии, Греции, Германии) [24, 65, 97, 166, 168, 170]. Мутации 3819delGTAAA, 3875delGTCT и 2080delA в гене BRCA1 распространены не так широко, однако найдены ранее в России более чем в одном исследовании [4, 9, 76, 91]. Мутации, типичные для ашкеназских евреев – 185delAG (BRCA1) и 6174delT (BRCA2), так же зарегистрированы ранее в исследованиях групп пациентов из разных регионов Российской Федерации [9, 13, 14]. Мутации 2963del10 в гене BRCA1 и 1528delAAAA, 9318delAAAA в гене BRCA2 не были обнаружены. Поскольку в работах, сообщающих об этих мутациях [4, 162], случаи их обнаружения единичны, можно предположить, что они являются уникальными и для скрининга не значимы. В целом, один и тот же набор мутаций из числа изученных формирует предрасположенность и к РМЖ, и к РЯ. Спектры мутаций в генах BRCA1 и BRCA2 при раке молочной железы и раке яичников (рис. 4) характеризуются некоторыми различиями в долевом соотношении выявленных мутаций. Доля превалирующей мутации 5382insC в гене BRCA1 при РМЖ выше, чем при РЯ (72,4% vs 58,7%). При раке яичников чаще, чем при раке молочной железы отмечены мутации 2080delA (10,9% vs 3,4%) и 300T>G (8,7% vs 3,4%) в гене BRCA1. Высокая частота мутации 2080delA в гене BRCA1 именно при раке яичников уже была отмечена ранее, было высказано предположение, что она обладает специфическими свойствами, обусловливающими предрасположенность к развитию в основном рака яичников [10]. Аналогичное предположение в отношении мутации 4153delA в гене BRCA1 [10] не подтверждено (12,1% при РМЖ vs 10,9% при РЯ), что согласуется с результатами других авторов [99]. Однако мы не исследовали структуру генов BRCA1 и BRCA2 полностью, что вносит определённую погрешность в значения частот изученных мутаций и их долевое распределение. 69 Определены частоты мутаций в генах BRCA1 и BRCA2 в отобранной группе больных РМЖ и/или РЯ. Из мутаций, представленных в разработанной диагностической панели, в этой группе больных были обнаружены пять: 5382insC, 4153delA, 300T>G, 2080delA и 3819delGTAAA в гене BRCA1 (табл. 9). Была также детектирована одна дополнительная клинически значимая мутация – 2080insA в гене BRCA1. В общей сложности мутации в гене BRCA1 были обнаружены у 30 больных РМЖ/РЯ из отобранной группы (9,8% группы). Таблица 9. Частоты мутаций в генах BRCA1 и BRCA2 в отобранной группе больных раком молочной железы и/или раком яичников (n=306) Ген Наименование (номенклатура BIC) ПринадлежЧисло Частота в ность носителей группе скрининговой (%) панели Частота в спектре мутаций (%) BRCA1 5382insC + 18 5,9 60,0 BRCA1 4153delA + 1 0,3 3,3 BRCA1 300T>G + 6 2,0 20,0 BRCA1 2080delA + 3 1,0 10,0 BRCA1 185delAG + 0 0 0 BRCA1 3819delGTAAA + 1 0,3 3,3 BRCA1 3875delGTCT + 0 0 0 BRCA2 6174delT + 0 0 0 BRCA1 2080delA – 1 0,3 3,3 BRCA1 2963del10 – 0 0 0 BRCA2 1528delAAAA – 0 0 0 BRCA2 9318delAAAA – 0 0 0 30 9,8 100,0 Всего В контрольной группе была обнаружена 1 мутация 5382insC в гене BRCA1 у женщины 38 лет, в семейном анамнезе – РМЖ в молодом возрасте. При обследовании смешанной по полу группы доноров первичной кроводачи 70 суммарная частота мутаций в гене BRCA1 составила 0,3% (3 на 1000 человек), что согласуется с данными Анисименко М.С. и соавт., полученными для российской популяции (Западная Сибирь) [1]. Частоты мутаций в генах BRCA1 и BRCA2 в популяции, вероятно, несколько выше в силу присутствия в ней больных– носителей мутаций, которые в контрольную группу не вошли. Проанализированы частоты и спектр мутаций в генах BRCA1 и BRCA2 у больных РМЖ и РЯ в РФ, критерием включения в диагностическую панель служило выявление мутации как минимум в трёх независимых исследованиях. В состав диагностической панели вошли восемь наиболее распространённых в российской популяции мутаций: 1. 5382insC (BRCA1), 2. 300T>G (C61G) (BRCA1), 3. 4153delA (BRCA1), 4. 2080delA (BRCA1), 5. 185delAG (BRCA1), 6. 3819delGTAAA (BRCA1), 7. 3875delGTCT (BRCA1), 8. 6174delT (BRCA2). Получено регистрационное удостоверение №ФСР 2010/08415 от 22 июля 2010 г. на набор реагентов для определения генетических полиморфизмов, ассоциированных с риском развития онкопатологии, методом полимеразной цепной реакции (ОнкоГенетика) по ТУ 9398-030-46482062-2011 производства ООО «Научно-производственного объединения ДНК-Технология». Разработанный набор реагентов «ОнкоГенетика» может быть рекомендован для включения в наследственной национальные скрининговые предрасположенности к программы РМЖ и РЯ по выявлению с дальнейшей индивидуализацией профилактики, диагностики и лечения этих онкологических заболеваний. 71 3.2. Показания к проведению молекулярно-генетического тестирования с целью выявления мутаций в генах BRCA1/2 Детальный сбор клинической информации в скрининговом исследовании представлял значительную сложность, учитывая большой объём выборок, и проводился в первую очередь для носителей мутаций в генах BRCA1 и BRCA2. В этих группах средний возраст постановки диагноза РМЖ (для 57 больных) и РЯ (для 46 больных) составил 41,4±8,4 и 47,3±8,7 года, соответственно. Распределение больных РМЖ и РЯ по возрасту манифестации заболевания представлено в табл. 10. Таблица 10. Распределение носителей мутаций в генах BRCA1 и BRCA2 по возрасту манифестации заболевания Возраст манифестации заболевания Больные РМЖ Больные РЯ абс. % абс. % До 40 лет включительно 25 43,9 9 19,6 41—50 лет 23 40,3 22 47,8 51 год и старше 9 15,8 15 32,6 Всего 57 100,0 46 100,0 Частота обнаружения мутаций в генах BRCA1 и BRCA2 у больных раком яичников в нашем исследовании была высокой и составила 22,8% неотобранной выборки (табл. 8). Высокая частота мутаций в генах BRCA1 и BRCA2 в этой группе в сочетании с особенностями распределения больных РЯ по возрасту (у 32,6% пациенток диагноз был поставлен в возрасте 51 год и старше) не даёт оснований ограничивать генетическое тестирование какими-либо возрастными рамками. Таким образом, наши данные подтверждают целесообразность проведения генетического скрининга с целью обнаружения повторяющихся мутаций в генах BRCA1 и BRCA2 всем больным раком яичников [157]. В работе Walsh T. и соавт. (выполнено массивное параллельное секвенирование 21 гена у 360 больных РЯ, перитонеальным раком, раком фаллопиевых труб) герминальные 72 мутации в генах-онкосупрессорах, связанные с потерей функции белка, были обнаружены у 24% пациенток (18% – в генах BRCA1 и BRCA2). Более 30% носителей не отмечали семейной истории РМЖ или РЯ, более 35% относились к возрастной группе 60 лет и старше: был сделан вывод о целесообразности масштабного генетического тестирования больных из этой категории независимо от семейного анамнеза и возраста манифестации [174]. В неотобранной группе больных РМЖ мутации в генах BRCA1 и BRCA2 были обнаружены у 6,0% пациенток. Такая частота предполагает применение дополнительных критериев отбора больных для проведения молекулярногенетического тестирования. Чаще всего для этого используют признаки, свидетельствующие о вероятной наследственной природе заболевания (онкологически отягощенный семейный анамнез, ПМЗН, молодой возраст). Проведено медико-генетическое консультирование 53 больных-носителей мутаций в генах BRCA1 и BRCA2 из неотобранной группы больных РМЖ. У 28 больных из этой группы (52,8%) отмечалось два и более случаев РМЖ и/или РЯ в семье (с учётом самой пациентки, т. е. как минимум один больной родственник), в том числе у 22 больных был диагностирован РМЖ/РЯ у родственника первой степени родства. Случаи других опухолей в семейном анамнезе зарегистрированы у 15 пациенток (28,3%). У 10 пробандов (18,9%) семейный анамнез не был онкологически отягощен по данным МГК: эти больные не вошли бы в группу высокого риска по носительству мутаций в генах BRCA1 и BRCA2, если бы в качестве критерия включения в неё использовался только отягощённый семейный анамнез. Ранее Любченко Л.Н. при изучении российской группы больных РМЖ было показано, что средний возраст постановки диагноза у пациентов-носителей мутаций в генах BRCA1 и BRCA2 составил 41,7±2,9 года и 44,7± 2,7 года, соответственно [9]. В нашем исследовании у 40,3% пациенток с мутациями в генах BRCA1 и BRCA2 РМЖ был диагностирован в возрасте 41—50 лет, а в возрасте до 50 лет включительно – у 84,2% больных (табл. 10). Таким образом, 73 проведение генетического тестирования с целью обнаружения частых мутаций в генах BRCA1 и BRCA2 является целесообразным в возрастной группе больных РМЖ до 50 лет. При анализе различных критериев отбора больных РМЖ из неотобранной группы показано, что наиболее эффективным вариантом выборочного тестирования больных РМЖ явилось бы использование любого из следующих клиникоанамнестических признаков или их сочетания: 1. Онкологически отягощённый семейный анамнез (при этом под отягощённостью понимается наличие в семье двух и более случаев РМЖ, РЯ или других ЗНО независимо от степени родства и возраста их развития); 2. Двусторонний РМЖ, сочетание РМЖ и ЗНО другой локализации; 3. Возраст манифестации РМЖ до 50 лет включительно. При таком подходе были бы выявлены 98,1% (52/53) больных РМЖносителей мутаций в генах BRCA1 и BRCA2. Однако необходимо принимать во внимание тот факт, что сбор семейного анамнеза может быть недостаточно информативен в силу объективных (малый размер семей, передача мутации преимущественно мужчинами, неполная пенетрантность) и субъективных причин. При исследовании отобранной группы больных РМЖ/РЯ была оценена значимость критериев отбора. Частота мутаций в гене BRCA1 в этой группе больных РМЖ и/или РЯ составила 9,8% (30/306) (табл. 9). Если рассматривать подгруппы преднамеренной выборки согласно критериям отбора отдельно (2—4), то максимальная частота обнаружения мутаций в гене BRCA1 наблюдалась при отягощённом РМЖ/РЯ семейном анамнезе (учитывались только родственники первой степени родства) – 19,7% (13/66); у больных ПМЗН она составила 19,0% (11/58); минимальная 7,3% (18/246) (табл. 11). – у больных в возрасте до 50 лет – 74 Таблица 11. Частота мутаций в гене BRCA1 в различных подгруппах преднамеренной выборки больных РМЖ/ РЯ Критерий отбора Число больных Число Частота в больных с группе мутацией (%) 2. Диагноз РМЖ 224 12 5,4 РЯ 24 7 29,2 ПМЗН 58 11 19,0 117 16 13,7 РМЖ/РЯ без учёта других ЗНО 66 13 19,7 Другие ЗНО без РМЖ/РЯ 51 3 5,9 28 6 21,4 Сочетание РМЖ и РЯ 12 4 33,3 Сочетание РМЖ/РЯ и других ЗНО 18 1 5,6 5. Возраст до 50 лет включительно 246 18 7,3 Сочетание критериев (2—4) 33 13 39,4 Всего 306 30 9,8 3. Онкологически отягощённый семейный анамнез1 4. Первично-множественные онкологические заболевания Двусторонний РМЖ, второй первичный РМЖ 1 в таблице учтены только родственники первой степени родства Наиболее значимыми в отношении обнаружения мутаций в гене BRCA1 критериями отбора больных в нашем исследовании были: 1. у пробанда: а) рак яичников, в том числе в сочетании с РМЖ, б) двусторонний и второй первичный РМЖ, 2. РМЖ или РЯ у родственника первой степени родства. 75 При сочетании нескольких критериев (как минимум один из групп 2—4) частота выявления мутаций в гене BRCA1 составила 39,4% (13/33). Таким образом, при изучении этой группы пациентов подтверждена высокая значимость онкологически отягощённого семейного анамнеза и ПМЗН как критериев отбора больных для молекулярно-генетического исследования. Как дополнительный критерий отбора для генетического тестирования также используется рецепторный статус опухоли: показано, что около 68,5% BRCA1ассоциированных опухолей молочной железы являются трижды негативными (РЭ-, РП-, HER2/neu-) [72, 113, 122]. В нашем исследовании рецепторный статус опухоли был определён в общей сложности у 840 больных РМЖ. Из них у 53 больных были обнаружены мутации в гене BRCA1, при этом у 31 пациентки (58,5%) опухоли являлись трижды негативными. Доля носителей мутаций в гене BRCA1 среди пациенток с трижды негативными опухолями молочной железы была высока и составила в среднем 30,4% (табл. 12). Вероятно, истинная частота ниже, погрешность может быть обусловлена: (1) самим способом формирования отобранной группы больных РМЖ/РЯ; (2) первоочередным определением рецепторного статуса у носителей мутаций в генах BRCA1 и BRCA2 в неотобранной группе больных РМЖ. Согласно литературным данным, мутации в гене BRCA1 обнаруживают в 16% случаев трижды негативных опухолей МЖ [71]. Таблица 12. Доля носителей мутаций в гене BRCA1 среди пациенток с трижды негативными опухолями молочной железы Трижды негативные опухоли молочной железы Носители мутаций в гене BRCA1 абс. доля Неотобранная группа больных РМЖ (n=78) 24 30,8% Отобранная группа больных РМЖ (n=24) 7 29,2% Всего 31 30,4% Также мутации в гене BRCA1 чаще встречаются при редкой морфологической форме РМЖ – медуллярном раке [58, 64, 113]. В неотобранной 76 группе больных РМЖ в нашем исследовании медуллярный рак был диагностирован всего у 9 пациенток, из них 3 являлись носителями мутаций в гене BRCA1. Таким образом, с учётом результатов нашего исследования и анализа мировых данных определены следующие показания к проведению молекулярногенетического тестирования с целью выявления мутаций в генах BRCA1 и BRCA2: 1. Рак яичников в любом возрасте; 2. ПМЗН, в том числе двусторонний РМЖ, сочетание РМЖ и РЯ; 3. Онкологически отягощённый семейный анамнез (наличие в семье двух и более случаев РМЖ, РЯ); 4. РМЖ в возрасте до 50 лет включительно; 5. Медуллярный РМЖ; 6. Трижды негативный (РЭ-, РП-, HER2/neu-) рецепторный статус опухоли молочной железы. Для более полного выявления наследственных форм РМЖ и РЯ проведение генетического скрининга с использованием включающей наиболее распространённые мутации диагностической панели, в генах BRCA1 и BRCA2, оправдано для всех больных РМЖ и РЯ, учитывая простоту и невысокую стоимость этого исследования. 3.3. Мутации со средней пенетрантностью в генах CHEK2, NBN, BLM – частоты встречаемости в группах больных РМЖ/РЯ и у здоровых женщин В ходе исследования определены частоты среднепенетрантных маркёров наследственной предрасположенности к раку молочной железы и раку яичников – мутаций в генах CHEK2 (1100delC, IVS2+1G>A, I157T), NBN (657del5) и BLM (Q548X) в группах больных и здоровых (табл. 13, рис. 5). 77 Таблица 13. Частоты среднепенетрантных маркёров наследственной предрасположенности к РМЖ и РЯ в группах больных и здоровых Ген Мутация Неотобранная группа больных РМЖ (n=963) Неотобранная группа больных РЯ (n=202) Отобранная группа больных РМЖ и РЯ (n=306) Контрольная группа (n=591) % абс. % абс. % абс. % абс. 0,21 2 0,50 1 0,65 2 0 0 IVS2+1G>A 0,93* 9 1,00 2 0,98* 3 0 0 I157T 5,71 55 4,95 10 8,17 25 6,60 39 NBN 657del5 0,93 9 0,50 1 0,98 3 0,34 2 BLM Q548X 0,21 2 1,00 2 0,98 3 0,34 2 2,28 22 2,97 6 3,59 11 0,68 4 CHEK2 1100delC Всего1 *достоверные различия с контрольной группой (p<0,05); 1 за исключением мутации I157T в гене CHEK2. Частота мутаций в генах CHEK2, NBN и BLM (за исключением более распространённой мутации I157T в гене CHEK2) составила 0,21—1,00% в группах больных РМЖ/РЯ и 0—0,34% в контрольной группе здоровых женщин. Суммарная частота редких мутаций (1100delC и IVS2+1G>A в гене CHEK2, 657del5 в гене NBN, Q548X в гене BLM) составила 2,28% в неотобранной группе больных РМЖ (22/963) и 2,97% – в неотобранной группе больных РЯ (6/202). В отличие от мутаций в генах BRCA1 и BRCA2, которые намного чаще встречаются у больных РЯ, чем у больных РМЖ (22,8% vs 6,0% в неотобранных группах в нашем исследовании), распространённость мутаций в генах CHEK2, NBN и BLM в нашем исследовании была сопоставима у больных РМЖ и больных РЯ. Для проверки этого исследования. наблюдения требуются дополнительные расширенные 78 Наиболее распространёнными из выбранных для анализа редких генетических маркёров со средней пенетрантностью в группах больных РМЖ и/или РЯ являются мутации IVS2+1G>A в гене CHEK2 и 657del5 в гене NBN. Рисунок 5. Частоты и спектр обнаруженных редких мутаций в генах CHEK2, NBN и BLM в неотобранных группах больных РМЖ и РЯ. Статистически достоверные различия с контрольной группой показаны для мутации IVS2+1G>A в гене CHEK2 – для неотобранной группы больных РМЖ (p=0,0068) и отобранной группы больных РМЖ/РЯ (p=0,0284). Частота мутации IVS2+1G>A в гене CHEK2 в неотобранной группе больных РЯ также 79 была высока (1,0%), однако различия с контрольной группой не достигли статистической значимости (p=0,0563). Для остальных мутаций различия с контрольной группой не были достоверны, что, предположительно, связано с низкой популяционной встречаемостью этих генетических маркёров; а в случае с мутацией I157T в гене CHEK2 – с её невысокой пенетрантностью. 3.3.1. Мутации в гене CHEK2 у больных РМЖ/РЯ В нашем исследовании частота мутации 1100delC в гене CHEK2 была достаточно низкой: в группах больных она не превышала 1%, в контрольной группе мутация не была обнаружена. Различия с контрольной группой не были статистически значимы. Мутация 1100delC в гене CHEK2 распространена во многих странах и является наиболее активно изучаемой во всём мире, её клиническая значимость подтверждена. Согласно данным Breast Cancer Case-Control Consortium (10860 больных РМЖ) частота мутации 1100delC в гене CHEK2 составляет 1,9%, но следует отметить, что в большинстве исследований, включенных в анализ, был проведён отбор по возрасту манифестации. В среднем OR=2,34 (95% CI: 1,72– 3,20; p=0,00000001), намного выше – OR=7,91 в группе молодых женщин (при постановке диагноза до 30 лет) [45]. По результатам мета-анализа (26000 больных РМЖ, 27000 здоровых человек) OR=2,7 (95% CI: 2,1–3,4) в неотобранной группе больных РМЖ и OR=4,8 (95% CI: 3,3–7,2) для семейного РМЖ (кумулятивный риск развития РМЖ в 70 годам составил в этой группе 37% (95% CI: 26– 56%) [178]. В г. Санкт-Петербурге были определены частоты мутации 1100delC в гене CHEK2 в различных группах больных: 2,1% (14/660) и 5,2% (8/155) у больных односторонним и двусторонним РМЖ, соответственно; 0,8% (2/268) в неотобранной группе больных РЯ, 0,2% (1/448) у здоровых женщин среднего возраста, ни у одной пожилой женщины без ЗНО (0/373) [46, 100]. 80 В нашем исследовании впервые в России показана высокая частота встречаемости мутации IVS2+1G>A в гене CHEK2 (0,93—1,00%) во всех группах больных РМЖ и РЯ, её ассоциация с риском развития РМЖ статистически достоверна. Мутация IVS2+1G>A в гене CHEK2 описана для популяций Польши, Белоруссии, Германии (OR=2,7—4,0), как и мутация 1100delC, она приводит к образованию нефункционального белка [30, 53]. В контрольной группе здоровых женщин не было обнаружено ни одной носительницы редких мутаций в гене CHEK2 (1100delC и IVS2+1G>A). При обследовании смешанной по полу группы доноров первичной кроводачи (1197 человек, из них 591 женщина и 606 мужчин) было обнаружено 2 носителя мутации 1100delC и 1 носитель мутации IVS2+1G>A в гене CHEK2, таким образом, популяционная частота оценена как 0,17% и 0,08%, соответственно. В сравнении с этой группой были рассчитаны риски для мутации IVS2+1G>A в гене CHEK2: для РМЖ OR=11,22 (95% CI: 9,16-13,29; p=0,0068) и для РЯ OR=11,91 (95% CI: 9,50-14,31; p=0,0563). Для мутации 1100delC в гене CHEK2 и при сравнении со смешанной группой доноров различия для неотобранных групп больных РМЖ и РЯ не были достоверны. Достаточно высокой была частота мутации I157T в гене CHEK2 – как в группах больных РМЖ и РЯ (4,95—8,17%), так и в контрольной группе (6,60%). Мутация I157T снижает функциональную активность белка CHEK2, пенетрантность её ниже: OR=1,40 для польской популяции [53], OR=1,58 при проведении мета-анализа [86]. В нашем исследовании при сравнении отобранной группы больных РМЖ (n=282) OR=1,36 (p=0,4126), различия статистически недостоверны. Предположительно, это связано именно с невысокой пенетрантностью мутации I157T в гене CHEK2. 3.3.2. Мутация 657del5 в гене NBN у больных РМЖ/РЯ В нашем исследовании мутация 657del5 в гене NBN была одним из наиболее распространённых генетических маркёров со средней пенетрантностью. Её 81 максимальная частота отмечена в отобранной группе больных РМЖ/РЯ (0,98%), высока частота и в неотобранной группе больных РМЖ (0,93%), но ни для одной из групп больных различия не достигли статистической значимости в сравнении с контрольной группой (0,34%). У 38,5% (5/13) больных РМЖ/РЯ с мутацией 657del5 в гене NBN диагноз был поставлен в возрасте старше 50 лет. Высокая частота мутации 657del5 в гене NBN характерна для славянских популяций – 0,57% (1/177) по усреднённым данным Varon R. и соавт. для Чехии, Польши и Украины [172]. В неотобранных группах больных РМЖ она составляет от 0,91% (Белоруссия) [31] до 1,96% (Польша) [155]. В России (г. СанктПетербург) мутация 657del5 в гене NBN была обнаружена у 2/173 (1,16%) больных двусторонним РМЖ, 5/700 (0,71%) больных односторонним РМЖ, 2/348 (0,57%) здоровых женщин среднего возраста и ни у одной (0/344) пожилой здоровой женщины [39]. Bogdanova N. и соавт. показано, что ни возраст постановки диагноза, ни отягощённость семейного анамнеза РМЖ не отличались значимо между носителями мутаций в гене NBN и другими больными РМЖ [31]. При исследовании польской популяции семейный анамнез не был отягощён у всех носителей мутации (11 человек) [155]. При сравнении частот встречаемости в неотобранных группах больных и контрольной группе нами получены оценки ассоциированных рисков: для РМЖ OR=2,76 (p=0,22), для рака яичников OR=1,46 (p=1). По данным других авторов при исследовании больных РМЖ из этнически близких популяций для мутации 657del5 в гене NBN OR=3,1 (1,47,0) [31, 155]. 3.3.3. Мутация Q548X в гене BLM у больных РМЖ/РЯ В нашем исследовании частота мутации Q548X в гене BLM составила 1,00% в группе больных РЯ. В неотобранной группе больных РМЖ она была невысока (0,21%); в отобранной группе (учтены только больные РМЖ, n=282) частота была выше – 1,06%. У 85,7% (6/7) пациенток диагноз РМЖ/РЯ был поставлен в возрасте до 50 лет. При сравнении отобранной группы (учтены только больные 82 РМЖ) и контрольной группы OR=3,16 (p=0,35), что соотносится с данными метаанализа для РМЖ – OR=3,3 (95% CI: 1,9–5,6, p=1,9×10-5) [131]. Мутация Q548X в гене BLM распространена в славянских популяциях [131]. В российском исследовании (г. Санкт-Петербург) частота встречаемости мутации c.1642 C>T (Q548X) в гене BLM составила 1,13% (17/1498) у больных РМЖ и 0,18% (2/1093) у здоровых женщин (p=0,004). При этом частота была выше (1) при наличии больных родственников первой степени родства (2,4% vs 0,9%), (2) у больных с ранней манифестацией заболевания (1,6% vs 0,7%) и (3) у больных двусторонним РМЖ (1,6% vs 1,1%) [151]. 3.4. Целесообразность включения мутаций в генах CHEK2, NBN и BLM в диагностическую панель для выявления наследственной предрасположенности к РМЖ и РЯ В табл. 14 суммирована информация о рисках развития РМЖ и РЯ, ассоциированных с носительством мутаций в генах CHEK2, NBN, BLM. Представлены собственные данные для неотобранных групп больных РМЖ/РЯ и результаты исследований этнически близких славянских популяций. Эта информация может быть использована для оценки рисков развития РМЖ/РЯ при проведении медико-генетического консультирования. В нашем исследовании показаны парадоксально высокие риски для мутации IVS2+1G>A в гене CHEK2, что позволяет сделать вывод о её важной роли в развитии РМЖ и РЯ в российской популяции; наши результаты должны быть верифицированы в последующих исследованиях. Оценки рисков, определённые нами для остальных изученных мутаций при сравнении частот в неотобранных группах больных РМЖ/РЯ с контрольной группой, статистически недостоверны, точность их сомнительна. При проведении медико-генетического консультирования следует ориентироваться на достоверные результаты исследований больных РМЖ, полученные Cybulski C., Steffen J., Prokofyeva D. и соавторами [53, 131, 155], а также российских исследователей [39, 151]. 83 Таблица 14. Риски развития РМЖ и РЯ, ассоциированные с мутациями в генах CHEK2, NBN, BLM (неотобранные группы больных) OR Ген CHEK2 Мутация РМЖ славянские популяции РЯ российская популяция (собственные данные) 1100delC 2,3* [53] 1,2 (p=1) 3,0 (p=0,37) IVS2+1G>A 2,7* [53] 11,2* (p=0,007) 11,9 (p=0,056) I157T 1,4* [53] 0,9 (p=0,51) 0,7 (p=0,50) NBN 657del5 3,1* [155] 2,8 (p=0,22) 1,5 (p=1) BLM Q548X 3,3* [131] 0,6 (p=0,64) 2,9 (p=0,64) *достоверный риск. Следует отметить, что близкие по значению риски получены в нашем исследовании для мутаций 1100delC в гене CHEK2, 657 в гене NBN и Q548X в гене BLM при анализе частот их встречаемости в неотобранной группе больных раком яичников (OR=1,5—3,0). Данные статистически недостоверны, что, вероятно, связано с относительно небольшим размером исследованной группы больных РЯ; однако позволяют предположить, что эти мутации играют определённую роль и в развитии РЯ в российской популяции. Для уточнения рисков развития РМЖ и РЯ, ассоциированных с мутациями в генах CHEK2, NBN, BLM в российской популяции, необходимы масштабные мультицентровые исследования. Учитывая доказанную в многочисленных исследованиях клиническую значимость всех изученных среднепенетрантных мутаций и подтвержденную нами их распространённость в российской популяции, их включение в диагностическую панель для выявления наследственной предрасположенности к РМЖ и РЯ безусловно является обоснованным. Ассоциированные риски выше для редких мутаций, приводящих к образованию укороченных нефункциональных белков, – 1100delC и IVS2+1G>A в гене CHEK2, 657del5 в гене NBN и Q548X в гене BLM. 84 Пенетрантность мутации I157T в гене CHEK2 ниже, необходимо принимать во внимание этот факт при проведении медико-генетического консультирования. Генетическое тестирование следует проводить в первую очередь у больных РМЖ и РЯ с признаками наследственной отягощённости (случаи РМЖ/РЯ в семейном анамнезе, ПМЗН, молодой возраст манифестации) [15, 45, 82, 151, 155]. Для некоторых мутаций показаны более высокие риски в этих группах больных. Так, для мутации 1100delC в гене CHEK2 OR=7,9 в группе молодых женщин (при постановке диагноза РМЖ до 30 лет) [45], а у больных семейным РМЖ OR=4,8 [178]. Молекулярно-генетический скрининг с использованием диагностической панели, включающей редкие мутации в генах CHEK2, NBN, BLM, позволит выявить до 3,0% носителей в неотобранных группах больных РМЖ/РЯ. Особенно показано проведение молекулярно-генетического тестирования для выявления мутаций IVS2+1G>A в гене CHEK2 и 657del5 в гене NBN в широких группах больных РМЖ и РЯ с учётом их распространённости в российской популяции и высоких рисков, ассоциированных с мутацией IVS2+1G>A в гене CHEK2. Результаты этого раздела нашего исследования позволяют сделать следующие выводы: Впервые показана ассоциация мутации IVS2+1G>A в гене CHEK2 с высоким риском развития рака молочной железы (отношение шансов: OR=11,22) в российской популяции. Частоты встречаемости мутаций 1100delC, IVS2+1G>A, I157T в гене CHEK2, 657del5 в гене NBN, Q548X в гене BLM в российской популяции обусловливают целесообразность дальнейшего изучения их роли в развитии рака молочной железы и рака яичников в масштабных мультицентровых исследованиях. 85 3.5. Клинико-морфологические характеристики опухолей молочной железы и яичников у носителей мутаций в генах BRCA1, BRCA2, CHEK2, NBN, BLM в сравнении с группой больных без мутаций В табл. 15 представлены клинико-морфологические характеристики опухолей молочной железы у носителей мутаций в генах BRCA1, CHEK2 в сравнении с группой больных без мутаций, входящих в состав диагностической панели. Средний возраст манифестации РМЖ в неотобранной группе у носителей мутаций в гене BRCA1 составил 41,5±8,5 года, у носителей мутаций в гене CHEK2 – 50,1±12,4 года, у больных без мутаций – 50,3±11,4 года. Доля женщин с мутациями в гене BRCA1, заболевших в возрасте до 40 лет, была достоверно выше, чем среди больных с мутациями в гене CHEK2 и в группе без мутаций (44,4%, 18,4% и 18,8%, соответственно, p<0,01), а доля женщин, заболевших в возрасте ≥ 51 года – ниже (16,7%, 42,9% и 47,9%, соответственно, p<0,01). В группе больных РМЖ с мутациями в гене BRCA1 по сравнению с группой больных с мутациями в гене CHEK2 и группой без мутаций была достоверно ниже частота опухолей in situ (3,8%, 19,3% и 20,5%, соответственно, p<0,05) и выше частота опухолей высокой степени злокачественности (55,3%, 18,4% и 21,3%, соответственно, p<0,01). Во всех группах больных РМЖ преобладал инвазивный рак неспецифического типа, однако у больных с мутациями в гене BRCA1 частота его была достоверно выше по сравнению с группой без мутаций (90,6% и 75,4%, соответственно, p<0,05), инвазивный дольковый рак в этой группе встречался реже (1,9% и 16,7%, соответственно, p<0,01). У носителей мутаций в гене CHEK2 в 85,2% случаев диагностирован инвазивный рак неспецифического типа, в 13,0% случаев – инвазивный дольковый РМЖ. Частота редкого морфологического типа – медуллярного рака молочной железы – достоверно выше у больных с мутациями в гене BRCA1 (5,7% и 0,7% в группе без мутаций, p<0,05). 86 Таблица 15. Клинико-морфологические характеристики опухолей молочной железы в зависимости от наличия мутаций Носители мутаций в гене BRCA1 % абс. Носители мутаций в гене CHEK2 % абс. Группа больных без мутаций % абс. Возраст манифестации Средний возраст 41,5±8,5 года 50,1±12,4 года 50,3±11,4 года До 40 лет 44,4%* 24/54 18,4%** 9/49 18,8% 123/654 41—50 лет 38,9% 21/54 38,8% 19/49 33,3% 218/654 51 год и старше 16,7%* 9/54 42,9%** 21/49 47,9% 313/654 T in situ 3,8%* 2/52 19,3%** 11/57 20,5% 164/799 T1 32,7% 17/52 33,3% 19/57 28,4% 227/799 T2 46,2% 24/52 28,1% 16/57 33,7% 269/799 T3 5,8% 3/52 7,0% 4/57 5,0% 40/799 T4 11,5% 6/52 12,3% 7/57 12,4% 99/799 N0 51,9% 27/52 46,4% 26/56 58,7% 471/803 N1 25,0% 13/52 32,1% 18/56 23,7% 190/803 N2 15,4% 8/52 16,1% 9/56 11,0% 88/803 N3 7,7% 4/52 5,4% 3/56 6,7% 54/803 M0 M1 88,7% 11,3% 47/53 49/59 10/59 89,9% 10,1% 729/811 6/53 83,1% 16,9% — 0/38 13,2% 5/38 10,0% 48/480 TNM-классификация 82/811 Степень злокачественности низкая умеренная 44,7%* 17/38 68,4% 26/38 68,8% 330/480 высокая 55,3%* 21/38 18,4%** 7/38 21,3% 102/480 87 Окончание таблицы 15. Носители мутаций в гене BRCA1 Носители мутаций в гене CHEK2 % абс. Инвазивный рак неспецифического типа 90,6%* 48/53 85,2% 46/54 75,4% 516/684 Инвазивный дольковый рак 1,9%* 1/53 13,0% 7/54 16,7% 114/684 Медуллярный рак 5,7%* 3/53 — 0/54 0,7% 5/684 Другие 1,9% 1/53 1,9% 1/54 7,2% 49/684 РЭ-позитивный 29,8%* 14/47 83,7%** 36/43 75,5% 417/552 РП-позитивный 25,5%* 12/47 64,3%** 27/42 65,5% 353/539 11,9%* 5/42 40,0%** 22/55 28,9% 183/634 61,5%* 24/39 2,4%** 1/41 11,6% 53/457 % абс. Группа больных без мутаций % абс. Морфология Рецепторный статус HER2/neuпозитивный Трижды негативный * достоверные различия с группой больных без мутаций (p<0,05); ** достоверные различия с группой носителей мутаций в гене BRCA1 (p<0,05). Рак молочной железы у носителей мутаций в гене BRCA1 в сравнении с носителями мутаций в гене CHEK2 и группой без мутаций характеризуется более низкой частотой РЭ-позитивных (29,8%, 83,7% и 75,5%, соответственно), РПпозитивных (25,5%, 64,3% и 65,5%, соответственно) и HER2/neu-позитивных (11,9%, 40,0% и 28,9%, соответственно) опухолей (p<0,05). Трижды негативный рецепторный статус опухоли МЖ достоверно чаще отмечен в неотобранной группе больных с мутациями в гене BRCA1 в сравнении с носителями мутаций в гене CHEK2 и группой без мутаций (61,5%, 2,4% и 11,6%, соответственно, p<0,001). Все опухоли молочной железы в нашем исследовании у носителей мутации Q548X в гене BLM (n=5) относились к инвазивному раку неспецифического типа. У больных РМЖ носителей мутации 657del5 в гене NBN (n=10) отмечено 88 наибольшее в этой группе молекулярно-генетических маркёров разнообразие морфологических типов, в том числе: 1. Инвазивный рак неспецифического типа – 6 пациенток (у 1 пациентки – в сочетании с внутрипротоковым угревидным раком); 2. Инвазивный дольковый рак – 3 пациентки (у 1 пациентки – в сочетании с раком Педжета); 3. Папиллярный рак – 1 пациентка. Учитывая небольшой размер выборки, клиническая ценность этих данных незначительна и, вероятно, не отражает истинную закономерность. Большинство опухолей молочной железы у носителей мутации 657del5 в гене NBN в нашем исследовании являлись РЭ-позитивными (87,5%, 7/8), РПпозитивными (75,0%, 6/8), HER2/neu-негативными (100%, 6/6), что в целом согласуется с данными Huzarski T. и соавт. [89]. Выявление характерных клинико-морфологических признаков опухолей молочной железы, ассоциированных с мутациями в генах NBN и BLM, представляет сложность в связи с их относительно низкой популяционной встречаемостью и требует дальнейшего изучения. Клинико-морфологические характеристики опухолей яичников у носителей мутаций в генах BRCA1 и CHEK2 в сравнении с группой больных без мутаций, входящих в состав диагностической панели, представлены в табл. 16. Средний возраст манифестации рака яичников у носителей мутаций в гене BRCA1 составил 47,5±8,6 года, у носителей мутаций в гене CHEK2 – 53,3±14,6 года, у больных без мутаций – 54,2±12,3 года. Доля женщин с мутациями в гене BRCA1, заболевших в возрасте 41—50 лет, была достоверно выше, чем среди больных без мутаций (48,8% и 21,3%, соответственно, p<0,001), а доля женщин, заболевших в возрасте ≥ 51 года – ниже (30,2% и 64,5%, соответственно, p<0,001). Доля носителей мутаций в генах BRCA1 и CHEK2, у которых РЯ был диагностирован в возрасте ≥ 51 года, была высока – 30,2% и 89 58,3%, соответственно, что не позволяет ограничивать молекулярно-генетическое тестирование этими возрастными рамками. Преобладающий морфологический тип во всех группах больных РЯ – серозная аденокарцинома (86,8—96,4%). Таблица 16. Клинико-морфологические характеристики опухолей яичников в зависимости от наличия мутаций Носители мутаций в гене BRCA1 % абс. Возраст манифестации Средний возраст 47,5±8,6 года До 40 лет 20,9% 9/43 41—50 лет 48,8%* 21/43 51 год и старше 30,2%* 13/43 Морфология Серозная аденокарцинома Эндометриоидная аденокарцинома Муцинозная аденокарцинома Светлоклеточная аденокарцинома Носители мутаций в гене CHEK2 Группа больных без мутаций абс. % 53,3±14,6 года 16,7% 2/12 25,0% 3/12 58,3% 7/12 % абс. 54,2±12,3 года 14,2% 20/141 21,3% 30/141 64,5% 91/141 96,4% 27/28 90,9% 10/11 86,8% 85/98 3,6% 1/28 — 0/11 10,2% 10/98 — 0/28 — 0/11 2,0% 2/98 — 0/28 9,1% 1/11 1,0% 1/98 * достоверные различия с группой больных без мутаций (p<0,05). Установление морфологических особенностей рака яичников, ассоциированного с мутациями в генах CHEK2, NBN, BLM, требует дальнейшего изучения. Для оценки выживаемости больных РМЖ и РЯ в зависимости от наличия мутаций (табл. 17, рис. 6) использовали интервальный метод построения таблиц дожития ”Life-table” по Каплану-Мейеру, рекомендованный для применения Международным противораковым оценивался на момент 01.01.2015. союзом (UICC). Срок прослеженности Кумуляитвная доля выживших Годы (А) больные раком молочной железы 90 Кумулятивная доля выживших 90 Годы (Б) больные раком яичников Рисунок 6. Общая выживаемость больных РМЖ и больных РЯ в зависимости от наличия мутаций. Больные без мутаций, входящих в состав диагностической панели Носители мутаций в гене BRCA1 Носители мутаций в гене CHEK2 91 Таблица 17. Общая выживаемость больных РМЖ в зависимости от наличия мутаций Общая выживаемость, % Больные раком молочной железы 3-летняя 5-летняя 10-летняя 12-летняя Носители мутаций в гене BRCA1 (n=53) 97,6±1,8 97,6±1,8 97,6±1,8 97,6±1,8 Носители мутаций в гене CHEK2 (n=55) 100,0 100,0 80,0±11,8 (p< 0,3) 60,0±18,3* (p< 0,05) Больные без мутаций в генах BRCA1, BRCA2, CHEK2, NBN, BLM (n=55) 100,0 100,0 97,8±1,9 97,8±1,9 * достоверные различия с группой больных без мутаций (p<0,05). Таблица 18. Общая выживаемость больных РЯ в зависимости от наличия мутаций Общая выживаемость, % Больные раком яичников 3-летняя 5-летняя 10-летняя 12-летняя Носители мутаций в гене BRCA1 (n=35) 92,7±3,1 85,8±7,6 71,5±14,7 71,5±14,7 Носители мутаций в гене CHEK2 (n=9) 100,0 100,0 100,0 100,0 Больные без мутаций в генах BRCA1, BRCA2, CHEK2, NBN, BLM (n=52) 100,0 100,0 100,0 71,4±13,5 При сравнении таблиц выживаемости различий между группами не выявлено. Однако для больных РМЖ с мутациями в гене CHEK2 показана тенденция к худшей выживаемости, 12-летняя общая выживаемость в этой группе достоверно хуже в сравнении с группой без мутаций – 60,0% и 97,8%, соответственно (p<0,05), табл. 17. Это согласуется с данными других исследователей: показано, что носительство мутаций в гене CHEK2 у больных РМЖ является негативным прогностическим критерием, несмотря на формально благоприятный фенотип опухолей [15, 98]. Различия в общей выживаемости больных РЯ в зависимости от наличия мутаций в нашем исследовании не показаны (рис. 6, табл. 18). 92 3.6. Двойная гетерозиготность по мутациям в разных генах предрасположенности к раку молочной железы и раку яичников В ходе нашего исследования (всего 1471 больных) были идентифицированы 5 больных (0,34%), являющихся двойными гетерозиготами по мутациям в разных генах предрасположенности к РМЖ и РЯ. Среди носителей мутаций в генах BRCA1, BRCA2, CHEK2, NBN, BLM частота двойной гетерозиготности составила 1,91% (5/262). Детальная информация об этих клинических случаях представлена в табл. 19. Таблица 19. Клинические случаи с двойной гетерозиготностью по мутациям в разных генах предрасположенности к РМЖ и РЯ Паци ентка Мутация (ген) Диагноз Возраст манифес тации Гистология РМЖ/РЯ Семейный анамнез РМЖ/РЯ 1.94 657del5 (NBN) I157T (CHEK2) ПМЗН (РМЖ, рак шейки матки) 48 Инвазивный Неизвестен дольковый рак 2.172 Q548X (BLM) I157T (CHEK2) РЯ 40 Серозная папиллярная цистаденокар цинома Отягощён 3.68 3819del5 (BRCA1) РМЖ I157T (CHEK2) 24 Неизвестна Отягощён 3.160 5382insC (BRCA1) РЯ 657del5 (NBN) 62 Неизвестна Неизвестен 3.187 5382insC (BRCA1) Двусторон Q548X (BLM) ний РМЖ Инвазивный рак неспецифичес кого типа Отягощён В двух случаях (1.94, 3.187) 44; 48 отмечены первично-множественные злокачественные новообразования (синхронные РМЖ и рак шейки матки, метахронный двусторонний РМЖ), у обеих пациенток диагноз РМЖ поставлен в возрасте старше 40 лет. В трёх случаях семейный анамнез отягощён РМЖ, РЯ и 93 другими ЗНО в молодом возрасте (2.172, 3.68, 3.187), в двух – неизвестен. Несмотря на носительство двух мутаций, в том числе высокопенетрантной мутации 5382insC в гене BRCA1, рак яичников у пациентки 3.160 диагностирован в возрасте 62 лет. В работе Соколенко А.П. и соавт. при анализе распространённых мутаций в генах BRCA1, CHEK2, ATM, NBN и BLM у больных РМЖ частота двойной гетерозиготности составила 0,32% (17/5391). Средний возраст манифестации и частота двустороннего РМЖ у этих больных не отличались от таковых у носителей одной мутации [149]. Выявление молекулярно-генетических маркёров со средней пенетрантностью следует проводить одномоментно с анализом генов BRCA1 и BRCA2, учитывая возможность носительства двух мутаций в разных генах предрасположенности к РМЖ и РЯ. 3.7. Однонуклеотидные полиморфизмы в различных генах и хромосомных локусах – частоты встречаемости и ассоциации с риском развития РМЖ и РЯ С применением разработанных реагентов для генотипирования были определены частоты встречаемости однонуклеотидных полиморфизмов rs2981582 в гене FGFR2, rs3817198 в гене LSP1, rs889312 в локусе 5q11, rs13281615 в локусе 8q24, rs13387042 в локусе 2q35, rs3803662 в локусе 16q12, rs3814113 в локусе 9p22, rs2072590 в локусе 2q31 в группах больных РМЖ/РЯ и здоровых женщин. Распределение частот генотипов для всех однонуклеотидных полиморфизмов в контрольной группе соответствовало закону Харди-Вайнберга. Определённые частоты и значения критерия χ2 в сравнении с ожидаемыми частотами генотипов равновесного распределения приведены в табл. 20 (все данные) и на рис. 7 (только больные РМЖ). Подтверждена независимость полиморфизмов (r=0,003—0,045). изученных однонуклеотидных 94 Таблица 20. Частоты однонуклеотидных полиморфизмов в группах больных РМЖ/РЯ и контрольной группе Ген/ локус rs-номер Минорный аллель Неотобранная группа больных РМЖ (n=963) Неотобранная группа больных РЯ (n=202) Отобранная группа больных РМЖ (n=282)1 Контрольная группа (n=591) χ2 Частота минорного аллеля T 0,42±0,01* 0,37±0,02 0,36±0,01 0,10 LSP1 rs3817198 C 0,35±0,01 0,35±0,02 0,34±0,01 0,04 2q35 rs13387042 A 0,61±0,01* 0,59±0,02 0,56±0,01 2,89 5q11 rs889312 C 0,28±0,01 0,32±0,02* 0,28±0,01 0,37 8q24 rs13281615 G 0,46±0,01 0,50±0,02* 0,45±0,01 0,49 16q12 rs3803662 T 0,36±0,01* 0,37±0,02* 0,30±0,01 0,08 2q31 rs2072590 T 0,38±0,02 0,35±0,01 0,56 9p22 rs3814113 C2 0,39±0,02 0,40±0,01 0,61 * достоверные различия с контрольной группой (p<0,05); 1 в группу включены все больные РМЖ, в том числе в составе ПМЗН; 2протективный аллель. 94 FGFR2 rs2981582 95 Рисунок 7. Частоты однонуклеотидных полиморфизмов в группах больных РМЖ и контрольной группе (*достоверные различия с контрольной группой (p<0,05)). В табл. 21 представлены частоты минорных аллелей исследованных однонуклеотидных полиморфизмов в различных популяциях (контрольных группах), в том числе данные из первоначальных полногеномных исследований [63, 154]. Таблица 21. Частоты минорных аллелей исследованных однонуклеотидных полиморфизмов в различных популяциях Частота минорного аллеля Ген/ локус rs-номер Европей- Европей- Азиатская Минор Российская ская ская популяция ный аллель популяция популяция популяция (HapMap(наши (GWAS) (HapMapHCB) данные) CEU) FGFR2 rs2981582 T 0,36 0,38 [63] 0,46 0,30 LSP1 rs3817198 C 0,34 0,30 [63] 0,33 0,11 2q35 rs13387042 A 0,56 0,48 [154] 0,56 0,12 5q11 rs889312 C 0,28 0,28 [63] 0,31 0,50 96 Окончание таблицы 21. Частота минорного аллеля 8q24 Европей- Европей- Азиатская Минор Российская ская ская популяция rs-номер ный аллель популяция популяция популяция (HapMap(наши (GWAS) (HapMapHCB) данные) CEU) rs13281615 G 0,45 0,40 [63] 0,46 0,56 16q12 rs3803662 T 0,30 0,27 [154] 0,25 0,72 2q31 rs2072590 T 0,35 нет 0,36 0,27 9p22 rs3814113 C 0,40 0,32 [153] 0,37 0,21 Ген/ локус Частоты минорных аллелей всех однонуклеотидных полиморфизмов, определённые нами в российской популяции, близки к европейским. 3.7.1. Ассоциации однонуклеотидных полиморфизмов с риском развития РМЖ/РЯ в неотобранных группах больных Отношения шансов для однонуклеотидных полиморфизмов, ассоциированных с развитием РМЖ, выявленные в нашем исследовании для неотобранной группы больных, близки значениям, полученным при проведении полногеномных ассоциативных исследований (табл. 22) [63, 154]. При сравнении частот в неотобранной группе больных РМЖ и контрольной группе достоверные различия выявлены для однонуклеотидных полиморфизмов: 1. rs2981582 в гене FGFR2 (OR=1,25, 95% CI: 1,10—1,40; p=0,003); 2. rs13387042 в локусе 2q35 (OR=1,19, 95% CI: 1,04—1,34; p=0,020); 3. rs3803662 в локусе 16q12 (OR=1,30, 95% CI: 1,14—1,45; p=0,001). Как видно из табл. 22, риски, связанные с этими тремя полиморфизмами по данным полногеномных ассоциативных исследований, максимальны в этой группе низкопенетрантных генетических маркёров предрасположенности к РМЖ (OR=1,20–1,28). 97 Таблица 22. Отношения шансов для минорных аллелей однонуклеотидных полиморфизмов в российской и европейских популяциях Отношение шансов (OR) для минорного аллеля Ген/ локус Российская популяция (наши данные) rs-номер FGFR2 rs2981582 LSP1 rs3817198 2q35 rs13387042 5q11 rs889312 8q24 rs13281615 16q12 rs3803662 Неотобранная группа больных РМЖ (n=963) Европейская популяция (полноОтобранная геномное Ссылки группа исследование; больных n=4544 [154]; РМЖ (n=282) n=26258 [63]) 1,25* (1,10—1,40) 1,04 (0,89—1,19) 1,01 (0,81—1,22) 1,01 (0,80—1,22) 1,26* (1,23—1,30) 1,07* (1,04—1,11) [63] 1,19* (1,04—1,34) 0,99 (0,83—1,15) 1,06 (0,91—1,21) 1,13 (0,93—1,34) 1,25* (1,03—1,46) 1,24* (1,04—1,44) 1,20* (1,14-1,26) 1,13* (1,10—1,16) 1,08* (1,05—1,11) [154] 1,30* (1,14—1,45) 1,38* (1,17—1,59) 1,28* (1,21—1,35) [154] [63] [63] [63] * достоверные различия с контрольной группой (p<0,05). Частоты однонуклеотидных полиморфизмов rs3817198 в гене LSP1, rs889312 в локусе 5q11 и rs13281615 в локусе 8q24 в неотобранной группе больных РМЖ достоверно не отличались от частот в группе здоровых женщин. Отношения шансов для этих полиморфизмов, определённые в полногеномных ассоциативных исследованиях (табл. 22), ниже, чем для первой группы маркёров. Вероятно, мощность нашего исследования была недостаточна для валидации этих отличий. Сходные результаты получены в работе Фарахтдиновой А.Р. (республика Башкортостан, исследованы этнически смешанные группы больных РМЖ (n=977) и здоровых женщин однонуклеотидных (n=1069)): полиморфизмов достоверные rs2981582 различия в гене выявлены для FGFR2 (OR=1,33), 98 rs13387042 в локусе 2q35 (OR=1,22), rs3803662 в локусе 16q12 (OR=1,18), rs889312 в локусе rs889312 (OR=1,18) [12]. Достоверные различия в частотах однонуклеотидных полиморфизмов rs2072590 в локусе 2q31 и rs3814113 в локусе 9p22 между неотобранной группой больных РЯ и контрольной группой не обнаружены, предположительно, из-за небольшого размера группы больных. Статус эстрогеновых и прогестероновых рецепторов был определён у 543 больных РМЖ из неотобранной группы (табл. 23). Таблица 23. Отношения шансов для минорных аллелей однонуклеотидных полиморфизмов в неотобранной группе больных РМЖ в зависимости от рецепторного статуса (РЭ, РП) Ген/ локус Отношение шансов (OR) для минорного аллеля rs-номер FGFR2 rs2981582 LSP1 rs3817198 5q11 rs889312 2q35 rs13387042 8q24 rs13281615 16q12 rs3803662 РЭ+ (n=373) РЭ– (n=170) РП+ (n=397) РП– (n=235) 1,25* (1,06—1,43) 1,09 (0,90—1,28) 1,06 (0,85—1,26) 1,26* (1,07—1,45) 1,04 (0,86—1,23) 1,31* (1,12—1,51) 1,08 (0,83—1,33) 0,85 (0,59—1,12) 0,80 (0,51—1,08) 1,11 (0,86—1,35) 0,98 (0,74—1,22) 1,09 (0,83—1,35) 1,21* (1,02—1,39) 1,11 (0,92—1,30) 1,05 (0,85—1,25) 1,26* (1,07—1,44) 1,05 (0,87—1,23) 1,39* (1,20—1,58) 1,26* (1,04—1,48) 0,84 (0,61—1,07) 0,84 (0,59—1,09) 1,11 (0,90—1,33) 1,02 (0,80—1,23) 1,03 (0,80—1,27) * достоверные различия с контрольной группой (p<0,05). Наши результаты в целом согласуются с данными мультицентрового исследования Garcia-Closas M. и соавт. о более сильных ассоциациях большинства изученных полиморфизмов в РЭ-позитивными и РП-позитивными опухолями молочной железы [75], хотя различия не были достоверны (небольшой 99 размер исследованных групп). В большинстве случаев достоверные различия с контрольной группой отмечены только для больных с РЭ-позитивными и РПпозитивными опухолями, что объясняется как более сильными ассоциациями, так и недостаточной по размеру выборкой. Примечательно, что для полиморфизма rs2981582 в гене FGFR2 ассоциации с РМЖ были высоки и статистически достоверны независимо от статуса РП, что расходится с данными других авторов [20, 21]; требуется валидация в более масштабном исследовании. 3.7.2. Ассоциации однонуклеотидных полиморфизмов с риском развития РМЖ в отобранной группе больных Из отобранной группы больных РМЖ и РЯ частоты изучаемых однонуклеотидных полиморфизмов определены только у больных РМЖ, в том числе в составе ПМЗН, для сравнения с частотами в контрольной группе и неотобранной группе больных РМЖ (табл. 20). При сравнении частот в отобранной группе больных РМЖ и контрольной группе достоверные различия выявлены для однонуклеотидных полиморфизмов: 1. rs3803662 в локусе 16q12 (OR=1,38, 95% CI: 1,17—1,59; p=0,003); 2. rs13281615 в локусе 8q24 (OR=1,24, 95% CI: 1,03—1,44; p=0,040); 3. rs889312 в локусе 5q11 (OR=1,25, 95% CI: 1,03—1,46; p=0,049). Частоты этих полиморфизмов были выше (статистически недостоверно) в отобранной группе больных РМЖ по сравнению с неотобранной группой. Интересные результаты получены при сравнении частоты минорного аллеля полиморфизма rs2981582 в гене FGFR2 в неотобранной и отобранной группах больных РМЖ: в неотобранной группе частота была достоверно выше (p=0,036). Это может быть связано с отличиями в возрастном составе этих групп: доля женщин в возрасте 55 лет и старше составляет 33,2% vs 12,5% в неотобранной и отобранной группе больных РМЖ, соответственно. Hunter D.J. и соавт. в полногеномном ассоциативном исследовании показали, что однонуклеотидные полиморфизмы во втором интроне гена FGFR2 (находящиеся в одном блоке 100 неравновесного сцепления с rs2981582) ассоциированы с риском развития «спорадического» РМЖ у женщин постменопаузального возраста [88]. Резюмировать результаты этого раздела нашего исследования можно следующим образом: 1. Однонуклеотидные полиморфизмы rs2981582 в гене FGFR2, rs13387042 в локусе 2q35, rs3803662 в локусе 16q12, rs13281615 в локусе 8q24, rs889312 в локусе 5q11 ассоциированы с риском развития РМЖ в российской популяции. Для полиморфизма rs13281615 в локусе 8q24 ассоциация с риском развития РМЖ в российской популяции показана впервые. 2. Максимальные риски (отношения шансов приведены для неотобранной группы больных РМЖ) показаны для однонуклеотидных полиморфизмов rs3803662 в локусе 16q12 (OR=1,30, 95% CI: 1,14—1,45; p=0,001), rs2981582 в гене FGFR2 (OR=1,25, 95% CI: 1,10—1,40; p=0,003), rs13387042 в локусе 2q35 (OR=1,19, 95% CI: 1,04—1,34; p=0,020). Эти полиморфизмы являются наиболее перспективными для включения в диагностическую панель для уточнения генетического риска развития РМЖ, в том числе у носителей мутаций в генах BRCA1 и BRCA2. 3. Для всех изученных полиморфизмов показана тенденция к более сильным ассоциациям с РЭ-позитивными опухолями молочной железы, для большинства (за исключением rs2981582 в гене FGFR2) – с РП-позитивными опухолями МЖ. 4. Ассоциации однонуклеотидных полиморфизмов rs2072590 в локусе 2q31 и rs3814113 в локусе 9p22 с риском развития РЯ и rs3817198 в гене LSP1 с риском развития РМЖ в нашем исследовании не выявлены. 101 3.8. Алгоритм проведения молекулярно-генетической диагностики для выявления наследственной предрасположенности к развитию РМЖ и РЯ Молекулярно-генетическая диагностика для выявления наследственной предрасположенности к развитию РМЖ и РЯ проводится в рамках медикогенетического консультирования. С учётом результатов нашего исследования и анализа мировых данных [25, 72, 122] определены следующие показания к проведению молекулярногенетического тестирования с целью выявления мутаций в генах BRCA1 и BRCA2: 1. Рак яичников в любом возрасте; 2. ПМЗН, в том числе двусторонний РМЖ, сочетание РМЖ и РЯ; 3. Онкологически отягощённый семейный анамнез (наличие в семье двух и более случаев РМЖ, РЯ); 4. РМЖ в возрасте до 50 лет включительно; 5. Трижды негативный (РЭ-, РП-, HER2/neu-) рецепторный статус опухоли молочной железы, медуллярный РМЖ. Кроме того, показаниями являются: 6. РМЖ у мужчин (в личном и/или семейном анамнезе); 7. Рак фаллопиевых труб, первичный перитонеальный рак; 8. Этническая принадлежность (ашкеназские евреи). Дополнительно можно использовать различные модели для оценки вероятности носительства мутации в генах BRCA1 и BRCA2 (BRCARPO, Myriad II, BOADICEA, Manchester score, Penn II и другие), основанные на семейном онкологическом анамнезе (РМЖ и РЯ с учетом злокачественных новообразований других локализаций). Перед проведением генетического тестирования должно быть получено информированное добровольное согласие пациента (статья 20, ФЗ № 323 «Об основах охраны здоровья граждан в Российской Федерации» от 21.11.2011 г.). Одним из главных принципов МГК является его недирективность, но в данном случае следует особенно внимательно отнестись к убеждению пациента в необходи- 102 мости информирования родственников [179]. При отказе от проведения молекулярно-генетической диагностики пациентки из группы высокого риска развития наследственного РМЖ и/или РЯ остаются под динамическим наблюдением в условиях онкодиспансера. После получения результатов молекулярно-биологического анализа необходима повторная консультация врача-генетика: пациентке сообщают результаты молекулярно-генетической диагностики, обсуждаются альтернативные варианты наблюдения, лечения и профилактики, оценивается прогноз здоровья потомства, предлагается обследование родственников I степени родства. Генетическое тестирование у родственников должно проводиться добровольно по достижении совершеннолетия или 25 лет (возраста начала скрининговых исследований с целью ранней диагностики РМЖ и РЯ) [25, 72, 122]. Для носителей высокопенетрантных мутаций (в генах BRCA1/2 и других) валидированы методы профилактики, ранней диагностики РМЖ/РЯ и индивидуализации лечения (хирургического, химиотерапевтического) [23, 28, 44, 84, 101, 111, 129, 140, 171]. Схематично алгоритм проведения молекулярно-генетической диагностики для выявления наследственной предрасположенности к РМЖ и/или РЯ, рекомендуемый в настоящее время, представлен на рис. 8. В российской популяции, учитывая выраженный эффект основателя, обоснованным с медицинской и экономической точек зрения является проведение первичного генетического скрининга с использованием диагностической панели, включающей распространённые мутации в генах, ассоциированных с развитием РМЖ и РЯ. Разработанные и апробированные в ходе нашего исследования диагностические панели (набор реагентов «ОнкоГенетика» (восемь мутаций в генах BRCA1/2) и реагенты для определения популяционно-специфических мутаций в генах CHEK2, NBN, BLM) могут успешно применяться на первом этапе молекулярно-генетического тестирования. Учитывая технологичность и относительно невысокую стоимость данного исследования, оправданным является его использование в широких группах боль- 103 ных и здоровых лиц. Определение низкопенетрантных генетических маркёров на сегодняшний день в клинической практике не используется, хотя перспективность оценки полигенного риска уже показана [138]. Рисунок 8. Алгоритм проведения молекулярно-генетической диагностики для выявления наследственной предрасположенности к РМЖ и РЯ (*перспективный этап). В скором будущем, когда стоимость и время проведения секвенирования будут снижены до приемлемого уровня, полный скрининг всех генов, вовлеченных 104 в репарацию ДНК и другие РМЖ/РЯ-ассоциированные пути, станет доступным и экономически оправданным для членов семей с отягощённым анамнезом [67, 135]. В перспективе будут разработаны комплексные модели определения индивидуального риска, учитывающие семейный анамнез, средовые факторы, образ жизни и доступную генетическую информацию. Такой подход позволит перcонализировать профилактические, диагностические и лечебные мероприятия и, как результат, снизить смертность от рака молочной железы и рака яичников [135]. 105 ВЫВОДЫ 1. Определён состав диагностической панели наиболее распространённых в российской популяции мутаций в генах BRCA1 и BRCA2: 5382insC, 300T>G, 4153delA, 2080delA, 185delAG, 3819delGTAAA, 3875delGTCT в гене BRCA1 и 6174delT в гене BRCA2. 2. Впервые показана ассоциация мутации IVS2+1G>A в гене CHEK2 с высоким риском развития рака молочной железы (отношение шансов (OR) = 11,22) в российской популяции. 3. Частоты встречаемости мутаций 1100delC, IVS2+1G>A, I157T в гене CHEK2, 657delACAAA в гене NBN, Q548X в гене BLM в российской популяции обусловливают целесообразность дальнейшего изучения их роли в развитии рака молочной железы и рака яичников в масштабных мультицентровых исследованиях. 4. Рекомендовано одномоментное выявление молекулярно-генетических маркёров в различных генах предрасположенности к раку молочной железы и раку яичников в связи с вероятностью двойной гетерозиготности. 5. Рак молочной железы у носителей мутаций в гене CHEK2 в сравнении с носителями мутаций в гене BRCA1 характеризуется более поздним возрастом манифестации (50,1±12,4 года и 41,5±8,5 года, соответственно), меньшей частотой опухолей высокой степени злокачественности (18,4% и 55,3%, соответственно), более высокой частотой РЭ-позитивных (83,7% и 29,8%, соответственно), РП-позитивных (64,3% и 25,5%, соответственно) и HER2/neuпозитивных (40,0% и 11,9%, соответственно) опухолей (p<0,05). В группе больных РМЖ с мутациями в гене CHEK2 в сравнении с группой больных без мутаций достоверно хуже общая 12-летняя выживаемость (60,0% и 97,8%, соответственно, p<0,05). 6. Показаны ассоциации следующих однонуклеотидных полиморфизмов с риском развития рака молочной железы: rs3803662 в локусе 16q12, 106 rs2981582 в гене FGFR2, rs13387042 в локусе 2q35 (максимальные риски в этой группе молекулярно-генетических маркёров: OR=1,30, OR=1,25 и OR=1,19, соответственно), rs13281615 в локусе 8q24, rs889312 в локусе 5q11. Для полиморфизма rs13281615 в локусе 8q24 ассоциация с риском развития рака молочной железы в российской популяции показана впервые. 7. Оптимизирован алгоритм проведения молекулярно-генетической диагностики для выявления наследственной предрасположенности к развитию раку молочной железы и раку яичников: первым этапом является скрининговое исследование с помощью разработанной диагностической панели. 107 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Анисименко, М.С. Распространенность мутаций, связанных с наследственными формами рака молочной железы, среди жителей г.Новосибирска / Анисименко М.С. // Материалы XIV Российского Онкологического Конгресса. – 2010. – C. 82-84. 2. Артамонов, В.В. Системы ДНК-маркеров для проспективной диагностики высокого риска развития рака молочной железы / Артамонов В.В., Михайленко Д.С., Любченко Л.Н. и соавт. // В кн. «Системы генетических и эпигенетических маркеров в диагностике онкологических заболеваний» под ред. М.А. Пальцева и Д.В. Залетаева. – М. : Изд-во «Медицина», 2009. – С. 318-348. 3. Батенева, Е.И. Частота одиннадцати мутаций генов BRCA1 и BRCA2 в неотобранной выборке больных раком молочной железы россиянок / Батенева Е.И., Мещеряков А.А., Любченко Л.Н. и соавт. // Уральский Медицинский Журнал. – 2011. – Т. 3. – С. 69-73. 4. Грудинина, Н.А. Преобладание широко распространенных мутаций в гене BRCA1 у больных семейными формами рака молочной железы СанктПетербурга / Грудинина Н.А., Голубков В.И., Тихомирова О.С. и соавт. // Генетика. – 2005. – Т. 41. – С. 405-410. 5. Давыдов, М.И. Статистика злокачественных новообразований в России и странах СНГ в 2009 году / Давыдов М.И., Аксель Е.М. // Вестник РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН. – 2011. – Т. 22 – № 3 (прил.1). 6. Злокачественные новообразования в России в 2012 году (заболеваемость и смертность). Под ред. А.Д. Каприна, В.В. Старинского, Г.В. Петровой. – М. : ФГБУ «МНИОИ им. П.А. Герцена» Минздрава России. – 2014. – 250 с. 7. Имянитов, Е.Н. Наследственный рак молочной железы / Имянитов Е.Н. // Практическая Онкология. – 2010. – Т. 11. – С. 258-266. 8. Кофиади, И.А. Методы детекции однонуклеотидных полиморфизмов: аллель-специфичная ПЦР и гибридизация с олигонуклеотидной пробой / Ко- 108 фиади И.А., Ребриков Д.В. // Генетика. – 2006. – Т. 42. – С. 22-32. 9. Любченко, Л.Н. Наследственный рак молочной железы и/или яичников: ДНК-диагностика, индивидуальный прогноз, лечение и профилактика : дис. … д-ра мед. наук. – М., 2009. – 295 с. 10.Поспехова, Н.И. Комплексный анализ наследственной формы рака молочной железы и/или рака яичников: молекулярно-генетические и фенотипические характеристики : дис. … д-ра биол. наук. – М., 2011. – 260 с. 11.Трофимов, Д.Ю. Создание отечественной инновационной технологической платформы для решения актуальных фундаментальных и прикладных задач современной иммунологии на основе ПЦР в реальном времени : дис. … д-ра биол. наук. – М., 2009. – 236 с. 12.Фарахтдинова, А.Р. Молекулярно-генетическое изучение рака молочной железы : дис. … канд. биол. наук. – Уфа, 2012. – 193 с. 13.Федорова, О.Е. Использование биочипов при изучении распространенных мутаций в генах BRCA1/2 и CHEK2 у больных органоспецифическим раком яичников и первично-множественными злокачественными новообразованиями с поражением яичников (российская популяция) / Федорова О.Е., Любченко Л.Н., Паяниди Ю.Г. и соавт. // Молекулярная биология. – 2007. – Т. 41. – С. 37-42. 14.Часовникова, О.Б. Анализ встречаемости девяти мутаций в генах BRCA1 и BRCA2 у больных раком молочной железы в Сибирском регионе / Часовникова О.Б., Митрофанов Д.В., Демченко Д.О. и соавт. // Сибирский Онкологический Журнал. – 2010. – Т. 5. – С. 32-35. 15.Adank, M.A. Excess breast cancer risk in first degree relatives of CHEK2∗1100delC positive familial breast cancer cases / Adank M.A., Verhoef S., Oldenburg R.A., et al. // Eur. J. Cancer. – 2013. – V. 49. – P. 1993-1999. 16.Antoniou, A.C. Common breast cancer susceptibility alleles and the risk of breast cancer for BRCA1 and BRCA2 mutation carriers: implications for risk prediction / Antoniou A.C., Beesley J., McGuffog L. et al. // Cancer Res. – 2010. – V. 70. – 109 P. 9742-9754. 17.Antoniou, A.C. Models of genetic susceptibility to breast cancer / Antoniou A.C., Easton D.F. // Oncogene. – 2006. – V. 25. – P. 5898-5905. 18.Antoniou, A.C. A comprehensive model for familial breast cancer incorporating BRCA1, BRCA2 and other genes / Antoniou A.C., Pharoah P.D., McMullan G. et al. // Br. J. Cancer. – 2002. – V. 86. – P. 76-83. 19.Antoniou, A. Average risks of breast and ovarian cancer associated with BRCA1 or BRCA2 mutations detected in case Series unselected for family history: a combined analysis of 22 studies / Antoniou A., Pharoah P.D., Narod S. et al. // Am. J. Hum. Genet. – 2003. – V. 72. – P. 1117-1130. 20.Antoniou, A.C. Common variants in LSP1, 2q35 and 8q24 and breast cancer risk for BRCA1 and BRCA2 mutation carriers / Antoniou A.C., Sinilnikova O.M., McGuffog L., et al. // Hum. Molec. Genet. – 2009. – V. 4442-4456. 21.Antoniou, A.C. Common breast cancer-predisposition alleles are associated with breast cancer risk in BRCA1 and BRCA2 mutation carriers / Antoniou A.C., Spurdle A.B., Sinilnikova O.M., et al., Easton D.F.; CIMBA. // Am. J. Hum. Genet. – 2008. – V. 82. – P. 937-948. 22.Apostolou, P. Hereditary breast cancer: the era of new susceptibility genes / Apostolou P., Fostira F. // Biomed. Res. Int. – 2013. – V. 2013. – Article ID 747318. 23.Arun, B. Response to Neoadjuvant Systemic Therapy for Breast Cancer in BRCA Mutation Carriers and Noncarriers: A Single Institution Experience / Arun B., Bayraktar S., Liu D.D. et al. // J. Clin. Oncol. – 2011. – V. 29. – P. 3739-3746. 24.Backe, J. Frequency of BRCA1 mutation 5382insC in German breast cancer patients / Backe J., Hofferbert S., Skawran B. et al. // Gynecol. Oncol. – 1999. – V. 72. – P. 402-406. 25.Balmaña, J. BRCA in breast cancer: ESMO Clinical Practice Guidelines / Balmaña J., Diez O., Rubio I., Castiglione M.; ESMO Guidelines Working 110 Group. // Ann. Oncol. – 2010. – S.5: v20-2. 26.Baynes, C. Common variants in the ATM, BRCA1, BRCA2, CHEK2 and TP53 cancer susceptibility genes are unlikely to increase breast cancer risk / Baynes C., Healey C.S., Pooley K.A. et al. // Breast Cancer Res. – 2007. – V. 9. – R27. 27.Bell, D.W. Heterozygous germ line hCHK2 mutations in Li-Fraumeni syndrome / Bell D.W., Varley J.M., Szydlo T.E., et al. // Science. – 1999. – V. 286. – P. 2528-2531. 28.Blumenthal, G.M. PTEN hamartoma tumor syndromes / Blumenthal G.M., Dennis P.A. // Europ. J. Hum. Genet. – 2008. – V. 16. – P.1289-1300. 29.Bogdanova, N. A nonsense mutation (E1978X) in the ATM gene is associated with breast cancer / Bogdanova N., Cybulski C., Bermisheva M. et al. // Breast Cancer Res. Treat. – 2009. – V. 118. – P. 207–211. 30.Bogdanova N. Association of two mutations in the CHEK2 gene with breast cancer / Bogdanova N., Enssen-Dubrowinskaja N., Feshchenko S. et al. // Int. J. Cancer. – 2005. – V. 116. – P. 263-266. 31.Bogdanova, N. Nijmegen Breakage Syndrome mutations and risk of breast cancer / Bogdanova N., Feshchenko S., Schürmann P. et al. // Int. J. Cancer. – 2008. – V. 122. – P. 802-806. 32.Bogdanova, N. PALB2 mutations in German and Russian patients with bilateral breast cancer / Bogdanova N., Sokolenko A.P., Iyevleva A.G. et al. // Breast Cancer Res. Treat. – 2011. – V. 126. – P. 545-550. 33.Boulton, S.J. Cellular functions of the BRCA tumour-suppressor proteins / Boulton S.J. // Biochem. Soc. Trans. – 2006. – V. 34. – P. 633-645. 34.Boyarskikh, U.A. Association of FGFR2 gene polymorphisms with the risk of breast cancer in population of West Siberia / Boyarskikh U.A., Zarubina N.A., Biltueva J.A. et al. // Eur. J. Hum. Genet. – 2009. – V. 17. – P. 1688-1691. 35.Breast Cancer Information Core (BIC) [Электронный ресурс]. – Режим доступа: http://research.nhgri.nih.gov/projects/bic/. 111 36.Breast Cancer Linkage Consortium. Cancer risks in BRCA2 mutation carriers // J. Natl. Cancer Inst. – 1999. – V. 91. – P. 1310-1316. 37.Broeks, A. ATM-heterozygous germline mutations contribute to breast cancer susceptibility / Broeks A., Urbanus J.H., Floore A.N. et al. // Am. J. Hum. Genet. – 2000. – V. 66. – P. 494–500. 38.Buisson, R. Cooperation of breast cancer proteins PALB2 and piccolo BRCA2 in stimulating homologous recombination / Buisson R., Dion-Côté A.M., Coulombe Y. et al. // Nat. Struct. Mol. Biol. – 2010. – V. 17. – P. 1247-1254. 39.Buslov, K.G. NBS1 657del5 mutation may contribute only to a limited fraction of breast cancer cases in Russia / Buslov K.G., Iyevleva A.G., Chekmariova E.V. et al. // Int. J. Cancer. – 2005. – V. 114. – P. 585–589. 40.Bunz, F. Principles of Cancer Genetics / Bunz F. // 2008. – P. 325. 41.Byrnes, G.B. Are the so-called low penetrance breast cancer genes, ATM, BRIP1, PALB2 and CHEK2, high risk for women with strong family histories? / Byrnes G.B., Southey M.C., Hopper J.L. // Breast Cancer Res. – 2008. – V. 10. – P. 208. 42.Byrski, T. Response to neoadjuvant therapy with cisplatin in BRCA1-positive breast cancer patients / Byrski T., Huzarski T., Dent R. et al. // Breast Cancer Res. Treat. – 2009. – V. 115. – P. 359–363. 43.Carey, L.A. Targeted chemotherapy? Platinum in BRCA1-dysfunctional breast cancer / Carey L.A. // J. Clin. Oncol. – 2010. – V. 28. – P. 361-363. 44.Chappuis, P.O. A significant response to neoadjuvant chemotherapy in BRCA1/2 related breast cancer / Chappuis P.O., Goffin J., Wong N. et al. // J. Med. Genet. – 2002. – V. 39. – P. 608-610. 45.CHEK2 Breast Cancer Case-Control Consortium. CHEK2*1100delC and susceptibility to breast cancer: a collaborative analysis involving 10,860 breast cancer cases and 9,065 controls from 10 studies // Am. J. Hum. Genet. – 2004. – V. 74. – P. 1175-1182. 112 46.Chekmariova, E.V. CHEK2 1100delC mutation is frequent among Russian breast cancer patients / Chekmariova E.V., Sokolenko A.P., Buslov K.G. et al. // Breast Cancer Res. Treat. – 2006. – V. 100. – P. 99-102. 47.Chen, J. The role of ataxiatelangiectasia heterozygotes in familial breast cancer / Chen J., Birkholtz G.G., Lindblom P. et al. // Cancer Res. – 1998. – V. 58. – P. 1376–1379. 48.Chen, M.B. Association of a LSP1 gene rs3817198T>C polymorphism with breast cancer risk: evidence from 33,920 cases and 35,671 controls / Chen M.B., Li C., Shen W.X., et al. // Mol. Biol. Rep. – 2010. – V. 38. – P. 4687-4695. 49.Chen, S. Meta-analysis of BRCA1 and BRCA2 penetrance / Chen S., Parmigiani G. // J. Clin. Oncol. – 2007. – V. 25. – P. 1329-1333. 50.Chenevix-Trench, G. An international initiative to identify genetic modifiers of cancer risk in BRCA1 and BRCA2 mutation carriers: the Consortium of Investigators of Modifiers of BRCA1and BRCA2 (CIMBA) / Chenevix-Trench G., Milne R.L., Antoniou A.C. et al. // Breast Cancer Res. – 2007. – V. 9. – P. 104. 51.Chrzanowska, K.H. Nijmegen breakage syndrome (NBS) / Chrzanowska K.H., Gregorek H., Dembowska-Bagińska B. et al. // Orphanet J. Rare Dis. – 2012. – V. 7. – P. 13. 52.Cleary, S.P. Heterozygosity for the BLM(Ash) mutation and cancer risk / Cleary S.P., Zhang W., Di Nicola N. et al. // Cancer Res. – 2003. – V. 63. – P. 17691771. 53.Cybulski, C. Selected aspects of inherited susceptibility to prostate cancer and tumours of different site of origin / Cybulski C. // Hered. Cancer Clin. Pract. – 2007. – V. 5. – P. 164-179. 54.Cybulski, C. NBS1 is a prostate cancer susceptibility gene / Cybulski C., Górski B., Debniak T. et al. // Cancer Res. – 2004. – V. 64. – P. 1215-1219. 113 55.Cybulski, C. Risk of breast cancer in women with a CHEK2 mutation with and without a family history of breast cancer / Cybulski C., Wokolorczyk D., Jakubowska A. et al. // J. Clin. Oncol. – 2011. – V. 29. – P. 3747-3752. 56.Cybulski, C. An inherited NBN mutation is associated with poor prognosis prostate cancer / Cybulski C., Wokołorczyk D., Kluźniak W. et al; Polish Hereditary Prostate Cancer Consortium. // Br. J. Cancer. – 2013. – V. 108. – P. 461-468. 57.Dansonka-Mieszkowska, A. A novel germline PALB2 deletion in Polish breast and ovarian cancer patients / Dansonka-Mieszkowska A., Kluska A., Moes J. et al. // BMC Med. Genet. – 2010. – V. 11. – P. 20. 58.Da Silva, L. Pathology of hereditary breast cancer / Da Silva L., Lakhani S.R. // Mod. Pathol. – 2010. – V. 23(Suppl 2). – S46-S51. 59.Deng, C.X. Roles of BRCA1 in DNA damage repair: a link between development and cancer / Deng C.X. & Wang R.-H. // Hum. Mol. Genet. – 2003. – V.12. – P.113-123. 60.Domchek, S.M. Association of risk-reducing surgery in BRCA1 or BRCA2 mutation carriers with cancer risk and mortality / Domchek S.M., Friebel T.M., Singer C.F. et al. // JAMA. – 2010. – V. 304. – P. 967-975. 61.Dong, X. Mutations in CHEK2 associated with prostate cancer risk / Dong X., Wang L., Taniguchi K. et al. // Am. J. Hum. Genet. – 2003. – V. 72. – P. 270280. 62.Drábek, J. Frequency of 657del(5) mutation of the NBS1 gene in the Czech population by polymerase chain reaction with sequence specific primers / Drábek J., Hajdúch M., Gojová L. et al. // Cancer Genet. Cytogenet. – 2002. – V. 138. – P. 157-159. 63.Easton, D.F. Genome-wide association study identifies novel breast cancer susceptibility loci / Easton D.F., Pooley K.A., Dunning A.M. et al. // Nature. – 2007. – V. 447. – P. 1087-1093. 114 64.Eisinger, F. Mutations at BRCA1: the medullary breast carcinoma revisited / Eisinger F., Jacquemier J., Charpin C. et al. // Cancer Res. –1998. – V. 58. – P. 1588–1592. 65.Elsakov, P. The contribution of founder mutations in BRCA1 to breast and ovarian cancer in Lithuania / Elsakov P., Kurtinaitis J., Petraitis S. et al. // Clin. Genet. – 2010. – V. 78. – P. 373-376. 66.Ferla, R. Founder mutations in BRCA1 and BRCA2 genes / Ferla R., Calò V., Cascio S. et al. // Ann. Oncol. – 2007. – V. 18. – P. 93-98. 67.Filippini, S.E. Breast cancer genes: beyond BRCA1 and BRCA2 / Filippini S.E., Vega A. // Front Biosci. (Landmark Ed.). – 2013. – V. 18. – P. 1358-1372. 68.FitzGerald, M.G. Heterozygous ATM mutations do not contribute to earlyonset of breast cancer / FitzGerald M.G., Bean J.M., Hegde S.R. et al. // Nature Genet. – 1997. – V. 15. – P. 307–310. 69.Ford, D. Risks of cancer in BRCA1-mutation carriers. Breast Cancer Linkage Consortium / Ford D., Easton D.F., Bishop D.T. et al. // Lancet. – 1994. – V. 343. – P. 692-695. 70.Ford, D. Genetic heterogeneity and penetrance analysis of the BRCA1 and BRCA2 genes in breast cancer families. The Breast Cancer Linkage Consortium / Ford D., Easton D.F., Stratton M. et al. // Am. J. Hum. Genet. – 1998. – V. 62. – P. 676-689. 71.Fostira, F. Prevalence of BRCA1 mutations among 403 women with triplenegative breast cancer: implications for genetic screening selection criteria: a Hellenic Cooperative Oncology Group Study / Fostira F., Tsitlaidou M., Papadimitriou C. et al. // Breast Cancer Res. Treat. – 2012. – V. 134. – P. 353-362. 72.Gadzicki, D. Genetic testing for familial/hereditary breast cancer-comparison of guidelines and recommendations from the UK, France, the Netherlands and Germany / Gadzicki D., Evans D.G., Harris H. et al. // J. Community. Genet. – 2011. – V. 2. – P. 53-69. 115 73.Gail, M.H. Validation studies on a model for breast cancer risk / Gail M.H., Benichou J. // J. Natl. Cancer Inst. – 1994. – V. 86. – P. 573-575. 74.Gail, M.H. Weighing the risks and benefits of tamoxifen treatment for preventing breast cancer / Gail M.H., Costantino J.P., Bryant J., et al. // J. Natl. Cancer Inst. –1999. – V. 91. – P. 1829-1846. 75.Garcia-Closas, M. Heterogeneity of breast cancer associations with five susceptibility loci by clinical and pathological characteristics / Garcia-Closas M., Hall P., Nevanlinna H., et al. // PLoS Genet. – 2008. 4(4):e1000054. 76.Gayther, S.A. Frequently occurring germ-line mutations of the BRCA1 gene in ovarian cancer families from Russia / Gayther S.A., Harrington P., Russell P. et al. // Am. J. Hum. Genet. – 1997. – V. 60. – P. 1239-1242. 77.Globocan 2012: Estimated Cancer Incdence, Mortality and Prevalence Worldwide in 2012 [Электронный ресурс]. – Режим доступа: http://globocan.iarc.fr/ 78.Goode, E.L. A genome-wide association study identifies susceptibility loci for ovarian cancer at 2q31 and 8q24 / Goode E.L., Chenevix-Trench G., Song H. et al. // Nat. Genet. – 2010. – V. 42. – P. 874-879. 79.Gorodnova, T.V. Distribution of FGFR2, TNRC9, MAP3K1, LSP1, and 8q24 alleles in genetically enriched breast cancer patients versus elderly tumor-free women / Gorodnova T.V., Kuligina E.Sh., Yanus G.A. et al. // Cancer Genet. Cytogenet. – 2010. – V. 199. – P. 69-72. 80.Górski, B. Founder mutations in the BRCA1 gene in Polish families with breastovarian cancer / Górski B., Byrski T., Huzarski T. et al. // Am. J. Hum. Genet. – 2000. – V. 66. – P. 1963-1968. 81.Górski, B. Breast cancer predisposing alleles in Poland / Górski B., Cybulski C., Huzarski T. et al. // Breast Cancer Res. Treat. – 2005. – V. 92. – P. 19-24. 82.Górski, B. Germline 657del5 mutation in the NBS1 gene in breast cancer patients / Górski B., Debniak T., Masojć B. et al. // Int. J. Cancer. – 2003. – V. 106. – P. 379-81. 83.Graeser, M.K. Contralateral breast cancer risk in BRCA1 and BRCA2 mutation 116 carriers / Graeser M.K., Engel C., Rhiem K. et al. // J. Clin. Oncol. – 2009. – V. 27. – P. 5887-5892. 84.Gronwald, J. Tamoxifen and contralateral breast cancer in BRCA1 and BRCA2 carriers: an update / Gronwald J., Tung N., Foulkes W.D. et al. // Int. J. Cancer. – 2006. – V. 118. – P. 2281-2284. 85.Guo, S. Performing the exact test of Hardy-Weinberg proportion for multiple alleles / Guo S., Thompson E. // Biometrics. – 1992. – V.48. – P.361-372. 86.Han, F.F. The effect of CHEK2 variant I157T on cancer susceptibility: evidence from a meta-analysis / Han F.F., Guo C.L., Liu L.H. // DNA Cell Biol. – 2013. – V. 32. – P. 329-335. 87.Hirschhorn, J.N. Genome-wide association studies for common diseases and complex traits / Hirschhorn J.N., Daly M.J. // Nat. Rev. Genet. – 2005. – V. 6. – P. 95-108. 88.Hunter, D.J. A genome-wide association study identifi es alleles in FGFR2 associated with risk of sporadic postmenopausal breast cancer / Hunter D.J., Kraft P., Jacobs K.B., et al. // Nat. Genet. – 2007. – V. 39. – P. 870-874. 89.Huzarski, T. Clinical characteristics of breast cancer in patients with an NBS1 mutation / Huzarski T., Cybulski C., Jakubowska A. et al.; Polish Breast Cancer Consortium. // Breast Cancer Res. Treat. – 2013. – V. 141. – P. 471-476. 90.Inskip, H.M. Risk of breast cancer and other cancers in heterozygotes for ataxiatelangiectasia / Inskip H.M., Kinlen L.J., Taylor A.M. et al. // Br. J. Cancer. – 1999. – V. 79. – P. 1304–1307. 91.Iyevleva, A.G. Non-founder BRCA1 mutations in Russian breast cancer patients / Iyevleva A.G., Suspitsin E.N., Kroeze K. et al. // Cancer Lett. – 2010. – V. 298. – P. 258-263. 92.Janavičius, R. Founder BRCA1/2 mutations in the Europe: implications for hereditary breast-ovarian cancer prevention and control // EPMA J. – 2010. – V. 1. – P. 397-412. 93.Janin, N. Breast cancer risk in ataxia telangiectasia (AT) heterozygotes: 117 haplotype study in French AT families / Janin N., Andrieu N., Ossian K. et al. // Br. J. Cancer. – 1999. – V. 80. – P. 1042-1045. 94.Kilpivaara, O. CHEK2 I157T associates with familial and sporadic colorectal cancer / Kilpivaara O., Alhopuro P., Vahteristo P. et al. // J. Med. Genet. – 2006. – V. 43. – e34. 95.Kilpivaara, O. CHEK2 variant I157T may be associated with increased breast cancer risk / Kilpivaara O., Vahteristo P., Falck J. et al. // Int. J. Cancer. – 2004. – V. 111. – P. 543-547. 96.Kondratenko, I. Nijmegen breakage syndrome/ Kondratenko I., Paschenko O., Polyakov A., Bologov A. // Adv. Exp. Med. Biol. – 2007. – V. 601. – P. 61-67. 97.Konstantopoulou, I. Greek BRCA1 and BRCA2 mutation spectrum: two BRCA1 mutations account for half the carriers found among high-risk breast/ovarian cancer patients / Konstantopoulou I., Rampias T., Ladopoulou A. et al. // Breast Cancer Res. Treat. – 2008. – V. 107. – P. 431-441. 98.Kriege, M. Survival and contralateral breast cancer in CHEK2 1100delC breast cancer patients: impact of adjuvant chemotherapy / Kriege M., Hollestelle A., Jager A. et al. // Br. J. Cancer. – 2014. – V. 111. – P. 1004-1013. 99.Krylova, N.Y. BRCA1 4153delA founder mutation in Russian ovarian cancer patients / Krylova N.Y., Lobeiko O.S., Sokolenko A.P. et al. // Hered. Cancer Clin. Pract. – 2006. – V. 4. – P. 193-196. 100. Krylova, N.Y. CHEK2 1100 delC mutation in Russian ovarian cancer patients / Krylova N.Y., Ponomariova D.N., Sherina N.Y. et al. // Hered. Cancer Clin. Pract. – 2007. – V. 5. – P. 153-156. 101. Kummar, S. Advances in using PARP inhibitors to treat cancer / Kummar S., Chen A., Parchment R.E. et al. // BMC Med. – 2012. – V. 10. – P. 25. 102. Kupfer, G.M. Fanconi anemia: a signal transduction and DNA repair pathway // Yale J. Biol. Med. – 2013. – V. 86. – P. 491-497. 103. Kutler, D.I. Fanconi anemia in Ashkenazi Jews / Kutler D.I., Auerbach A.D. // Fam. Cancer. – 2004. – V. 3. – P. 241-248. 118 104. Kuusisto, K.M. Screening for BRCA1, BRCA2, CHEK2, PALB2, BRIP1, RAD50, and CDH1 mutations in high-risk Finnish BRCA1/2-founder mutationnegative breast and/or ovarian cancer individuals / Kuusisto K.M., Bebel A., Vihinen M. et al. // Breast Cancer Res. – 2011. – V. 13. – R20. 105. Lalwani, N. Histologic, molecular, and cytogenetic features of ovarian cancers: implications for diagnosis and treatment / Lalwani N., Prasad S.R., Vikram R., et al. // Radiographics. – 2011. – V. 31. – P. 625-646. 106. Liang, J. Genetic variants in fibroblast growth factor receptor 2 (FGFR2) contribute to susceptibility of breast cancer in Chinese women / Liang J., Chen P., Hu Z., et al. // Carcinogenesis. – 2008. – V. 29. – P. 2341-2346. 107. Loginova, A.N. Spectrum of mutations in BRCA1 gene in hereditary forms of breast and ovarian cancer in Russian families / Loginova A.N., Pospekhova N.I., Lyubchenko L.N. et al. // Bull. Exp. Biol. Med. – 2003. – V. 136. – P. 276-278. 108. Long, K.C. Hereditary ovarian cancer: recent molecular insights and their impact on screening strategies / Long K.C., Kauff N.D. // Curr. Opin. Oncol. – 2011. – V. 23. – P. 526-530. 109. Long, J. Evaluating genome-wide association study-identified breast cancer risk variants in African-American women / Long J., Zhang B., Signorello L.B. et al. // PLoS One. – 2013. – V. 8. – e58350. 110. Lu, P.H. Association between mitogen-activated protein kinase kinase kinase 1 rs889312 polymorphism and breast cancer risk: evidence from 59,977 subjects / Lu P.H., Yang J., Li C. et al. // Breast Cancer Res. Treat. – 2011. – V. 126. – P. 663-670. 111. Lynch, H.T. Phenotypic and genotypic heterogeneity in the Lynch syndrome: diagnostic, surveillance and management implications / Lynch H.T., Boland C.R., Gong G. et al. // Europ. J. Hum. Genet. – 2006. – V. 14. – P. 390-402. 112. Lynch, H.T. Hereditary breast cancer: practical pursuit for clinical translation / Lynch H.T., Snyder C., Lynch J. // Ann. Surg. Oncol. – 2012. – V. 19. – P. 1723-1731. 119 113. Mavaddat, N. Pathology of breast and ovarian cancers among BRCA1 and BRCA2 mutation carriers: results from the Consortium of Investigators of Modifiers of BRCA1/2 (CIMBA) / Mavaddat N., Barrowdale D., Andrulis I.L. et al. // Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. – 2012. – V. 21. – P. 134–147. 114. Maxwell, K.N. Common breast cancer risk variants in the post-COGS era: a comprehensive review / Maxwell K.N., Nathanson K.L. // Breast Cancer Res. – 2013. – V. 15. – P. 212. 115. McInerney, N.M. Evaluation of variants in the CHEK2, BRIP1 and PALB2 genes in an Irish breast cancer cohort / McInerney N.M., Miller N., Rowan A. et al. // Breast Cancer Res. Treat. – 2010. – V. 121. – P. 203-210. 116. Meijers-Heijboer, H. CHEK2-breast cancer consortium: low-penetrance susceptibility to breast cancer due to CHEK2(*)1100delC in noncarriers of BRCA1 or BRCA2 mutations / Meijers-Heijboer H., van den Ouweland A., Klijn J. et al. // Nat. Genet. – 2002. – V. 31. – P. 55–59. 117. Michailidou, K. Large-scale genotyping identifies 41 new loci associated with breast cancer risk / Michailidou K., Hall P., Gonzalez-Neira A. et al. // Nat. Genet. – 2013. – V. 15. – P. 353–361. 118. Miki, Y. A strong candidate for the breast and ovarian cancer susceptibility gene BRCA1 / Miki Y., Swensen J., Shattuck-Eidens D. et al. // Science. – 1994. – V. 266. – P. 66-71. 119. Morrell, D. Mortality and cancer incidence in 263 patients with ataxiatelangiectasia / Morrell D., Cromartie E., Swift M. // J. Natl. Cancer Inst. – 1986. – V. 77. – P. 89-92. 120. Narod, S.A. BRCA1 and BRCA2: 1994 and beyond / Narod S.A., Foulkes W.D. // Nat. Rev. Cancer. – 2004. – V. 4. – P. 665–676. 121. Nathanson, K.L. Breast cancer genetics: what we know and what we need / Nathanson K.L., Wooster R., Weber B.L. // Nat. Med. – 2001. – V. 7. – P. 552556. 122. National Comprehensive Cancer Network. Clinical practice guidelines in on- 120 cology genetic/familal high-risk assessment: breast and ovarian. Version 1. 2012. 123. Newman, B. Inheritance of human breast cancer: evidence for autosomal dominant transmission in high-risk families / Newman B., Austin M.A., Lee M., King M.C. // Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. – 1988. – V. 85. – P. 3044-3048. 124. Noskowicz, M. Prevalence of PALB2 mutation c.509_510delGA in unselected breast cancer patients from Central and Eastern Europe / Noskowicz M., Bogdanova N., Bermisheva M. et al. // Fam. Cancer. – 2014. – V. 13. – P. 137142. 125. Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM) [Электронный ресурс]. – Режим доступа: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/omim/. 126. Orpha.net (The portal for rare diseases and orphan drugs) [Электронный ресурс]. – Режим доступа: http://www.orpha.net/consor/cgi-bin/index.php. 127. Panchal, S.M. Selecting a BRCA risk assessment model for use in a familial cancer clinic / Panchal S.M., Ennis M., Canon S., Bordeleau LJ. // BMC Med. Genet. – 2008. – V. 9. – P. 116. 128. Peng, S. Genetic polymorphisms and breast cancer risk: evidence from metaanalyses, pooled analyses, and genome-wide association studies / Peng S., Lü B., Ruan W. et al. // Breast Cancer Res Treat. – 2011. – V. 127. – P. 309-324. 129. Pierce, L.J. Ten-year multi-institutional results of breast-conserving surgery and radiotherapy in BRCA1/2-associated stage I/II breast cancer / Pierce L.J., Levin A.M., Rebbeck T.R. et al. // J. Clin. Oncol. – 2006. – V. 24. – P. 24372443. 130. Prat, J. Hereditary ovarian cancer / Prat J., Ribe A., Gallardo A. // Hum. Pathol. - 2005. - V.36. - P. 861– 870. 131. Prokofyeva, D. Nonsense mutation p.Q548X in BLM, the gene mutated in Bloom's syndrome, is associated with breast cancer in Slavic populations / Prokofyeva D., Bogdanova N., Dubrowinskaja N. et al. // Breast Cancer Res. Treat. – 2013. – V. 137. – P. 533-539. 121 132. Renwick, A. ATM mutations that cause ataxia-telangiectasia are breast cancer susceptibility alleles / Renwick A., Thompson D., Seal S. et al. // Nat. Genet. – 2006. – V. 38. – P. 873– 875. 133. Resnick, I.B. 657del5 mutation in the gene for Nijmegen breakage syndrome (NBS1) in a cohort of Russian children with lymphoid tissue malignancies and controls / Resnick I.B., Kondratenko I., Pashanov E. et al. // Am. J. Med. Genet A. – 2003. – V. 120. – P. 174-179. 134. Resnick, I.B. Nijmegen breakage syndrome: clinical characteristics and mutation analysis in eight unrelated Russian families / Resnick I.B., Kondratenko I., Togoev O. et al. // J. Pediatr. – 2002. – V. 140. – P. 355-361. 135. Ripperger, T. Breast cancer susceptibility: current knowledge and implications for genetic counselling / Ripperger T., Gadzicki D., Meindl A., Schlegelberger B. // Eur. J. Hum. Genet. – 2009. – V. 17. – P. 722-731. 136. Roa, B.B. Ashkenazi Jewish population frequencies for common mutations in BRCA1 and BRCA2 / Roa B.B., Boyd A.A., Volcik K., Richards C.S. // Nat. Genet. – 1996. – V. 14. – P. 185-187. 137. Sanger, F. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors / Sanger F., Niclein S., Coulson A.R. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 1977. – V.74. – P.54635467. 138. Sawyer, S. A role for common genomic variants in the assessment of familial breast cancer / Sawyer S., Mitchell G., McKinley J., et al. // J. Clin. Oncol. – 2012. – V. 30. – P. 4330-4336. 139. Scheuner, M.T. Delivery of genomic medicine for common chronic adult diseases: a systematic review / Scheuner M.T., Sieverding P., Shekelle P.G. // JAMA. – 2008. – V. 299. – P. 1320-1334. 140. Schrader, K. Hereditary diffuse gastric cancer / Schrader K., Huntsman D. // Cancer Treat. Res. – 2010. – V. 155. – P. 33-63. 141. Seng, K.C. The success of the genome-wide association approach: a brief story of a long struggle / Seng K.C., Seng C.K. // Eur. J. Hum. Genet. – 2008. – 122 V.16. – P.554-564. 142. Seppälä, E.H. CHEK2 variants associate with hereditary prostate cancer / Seppälä E.H., Ikonen T., Mononen N. et al. // Br. J. Cancer. – 2003. – V. 89. – P. 1966-1970. 143. Shiloh Y. The ATM-mediated DNA-damage response: taking shape // Trends Biochem. Sci. – 2006. – V. 31. – P. 402-410. 144. Silver, D.P. Efficacy of neoadjuvant cisplatin in triple-negative breast cancer / Silver D.P., Richardson A.L., Eklund A.C. et al. // J. Clin. Oncol. – 2010. – V. 28. – P. 1145-1153. 145. Slater, E.P. PALB2 mutations in European familial pancreatic cancer families / Slater E.P., Langer P., Niemczyk E. et al. // Clin. Genet. – 2010. – V. 78. – P. 490-494. 146. Smirnova, T.Y. High incidence of mutations in BRCA1 and BRCA2 genes in ovarian cancer / Smirnova T.Y., Pospekhova N.I., Lyubchenko L.N. et al. // Bull. Exp. Biol. Med. – 2007. – V. 144. – P. 83–85. 147. Smith, A. Phenocopies in BRCA1 and BRCA2 families: evidence for modifier genes and implications for screening / Smith A., Moran A., Boyd M.C. et al. // J. Med. Genet. – 2007. – V. 44. – P. 10-15. 148. Smith, T.M. Complete genomic sequence and analysis of 117 kb of human DNA containing the gene BRCA1 / Smith T.M., Lee M.K., Szabo C.I. et al. // Genome Res. – 1996. – V. 6. – P. 1029-1049. 149. Sokolenko, A.P. Double heterozygotes among breast cancer patients analyzed for BRCA1, CHEK2, ATM, NBN/NBS1, and BLM germ-line mutations / Sokolenko A.P., Bogdanova N., Kluzniak W. et al. // Breast Cancer Res. Treat. – 2014. – V. 145. – P. 553-562. 150. Sokolenko, A.P. Hereditary breast-ovarian cancer syndrome in Russia / Sokolenko A.P., Iyevleva A.G., Mitiushkina N.V. et al. // Acta Naturae. – 2010. – V. 2. – P. 31–35. 151. Sokolenko, A.P. High prevalence and breast cancer predisposing role of the 123 BLM c.1642 C>T (Q548X) mutation in Russia / Sokolenko A.P., Iyevleva A.G., Preobrazhenskaya E.V. et al. // Int. J. Cancer. – 2012. – V. 130. – P. 2867-2873. 152. Sokolenko, A.P. Founder mutations in early-onset, familial and bilateral breast cancer patients from Russia / Sokolenko A.P., Rozanov M.E., Mitiushkina N.V. et al. // Fam. Cancer. – 2007. – V. 6. – P. 281–286. 153. Song, H. A Genome-Wide Association Study Identifies A New Ovarian Cancer Susceptibility Locus On 9p22.2 / Song H., Ramus S.J., Tyrer J. et al. // Nat. Genet. – 2009. – V. 41. – P. 996–1000. 154. Stacey, S.N. Common variants on chromosomes 2q35 and 16q12 confer susceptibility to estrogen receptor-positive breast cancer / Stacey S.N., Manolescu A., Sulem P. et al. // Nat. Genet. – 2007. – V. 39. – P. 865-869. 155. Steffen, J. Germline mutations 657del5 of the NBS1 gene contribute significantly to the incidence of breast cancer in Central Poland / Steffen J., Nowakowska D., Niwińska A. et al. // Int. J. Cancer. – 2006. – V. 15. – P. 472475. 156. Sueta, A. A genetic risk predictor for breast cancer using a combination of low-penetrance polymorphisms in a Japanese population / Sueta A., Ito H., Kawase T. et al. // Breast Cancer Res. Treat. – 2012. – V. 132. – P. 711–721. 157. Suspitsin, E.N. High frequency of BRCA1, but not CHEK2 or NBS1 (NBN), founder mutations in Russian ovarian cancer patients / Suspitsin E.N., Sherina N.Y., Ponomariova D.N. et al. // Hered. Cancer Clin. Pract. – 2009. – V. 7. – P. 5. 158. Swift, M. Incidence of cancer in 161 families affected by ataxia-telangiectasia / Swift M., Morrell D., Massey R.B., Chase C.L. // N. Engl. J. Med. – 1991. – V. 325. – P. 1831-1836. 159. Swift, M. Breast and other cancers in families with ataxia-telangiectasia / Swift M., Reitnauer P.J., Morrell D., Chase C.L. // N. Engl. J. Med. – 1987. – V. 316. – P. 1289-1294. 160. Szabo, C.I. Population genetics of BRCA1 and BRCA2 / Szabo C.I., King M.C. // Am. J. Hum. Genet. – 1997. –V. 60. – P. 1013-1020. 124 161. Tavtigian, S.V. The complete BRCA2 gene and mutations in chromosome 13q-linked kindreds / Tavtigian S.V., Simard J., Rommens J. et al. // Nature Genet. – 1996. – V. 12. – P. 333-337. 162. Tereschenko, I.V. BRCA1 and BRCA2 mutations in Russian familial breast cancer / Tereschenko I.V., Basham V.M., Ponder B.A., Pharoah P.D. // Hum. Mutat. – 2002. – V. 19. – P. 184. 163. Telatar, M. Ataxia-telangiectasia: identification and detection of foundereffect mutations in the ATM gene in ethnic populations / Telatar M., Teraoka S., Wang Z., et al. // Am. J. Hum. Genet. – 1998. – V. 62. – P. 86-97. 164. Thompson, E.R. Exome sequencing identifies rare deleterious mutations in DNA repair genes FANCC and BLM as potential breast cancer susceptibility alleles / Thompson E.R., Doyle M.A., Ryland G.L. et al. // PLoS Genet. – 2012. – V. 8. – e1002894. 165. Thorlacius, S. A single BRCA2 mutation in male and female breast cancer families from Iceland with varied cancer phenotypes / Thorlacius S., Olafsdottir G., Tryggvadottir L. et al. // Nat. Genet. – 1996. – V. 13. – P. 117-119. 166. Tikhomirova, L. High prevalence of two BRCA1 mutations, 4154delA and 5382insC, in Latvia / Tikhomirova L., Sinicka O., Smite D. et al. // Fam. Cancer. – 2005. – V. 4. – P. 77-84. 167. Trainer, A.H. BRCA and beyond: a genome-first approach to familial breast cancer risk assessment / Trainer A.H., Thompson E., James P.A. // Discov. Med. – 2011. – V. 12. – P. 433-443. 168. Uglanitsa, N. The contribution of founder mutations in BRCA1 to breast cancer in Belarus / Uglanitsa N., Oszurek O., Uglanitsa K. et al. // Clin. Genet. – 2010. – V. 78. – P. 377-380. 169. van der Groep, P. Pathology of hereditary breast cancer / van der Groep P., van der Wall E., van Diest P.J. // Cell. Oncol. (Dordr.). – 2011. – V. 34. – P. 7188. 170. Van Der Looij, M. Prevalence of founder BRCA1 and BRCA2 mutations 125 among breast and ovarian cancer patients in Hungary / Van Der Looij M., Szabo C., Besznyak I. et al. // Int. J. Cancer. – 2000. – V. 86. – P. 737-740. 171. Van Lier, M.G. High cancer risk in Peutz-Jeghers syndrome: a systematic review and surveillance recommendations / Van Lier M.G., Wagner A., MathusVliegen E.M. et al. // Am. J. Gastroenterol. – 2010. – V. 105. – P. 1258-1264. 172. Varon, R. Nijmegen Breakage Syndrome mutations and risk of breast cancer / Varon R., Dörk T. // Int. J. Cancer. – 2008. – V. 122. – P. 802-806. 173. Wacholder, S. Performance of Common Genetic Variants in Breast-Cancer Risk Models / Wacholder S., Hartge P., Prentice R. et al. // N. Engl. J. Med. – 2010. – V. 362. – P. 986-993. 174. Walsh, T. Mutations in 12 genes for inherited ovarian, fallopian tube, and peritoneal carcinoma identified by massively parallel sequencing / Walsh T., Casadei S., Lee M.K. et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. – 2011. – V. 108. – P. 18032-18037. 175. Walsh, T. Ten genes for inherited breast cancer / Walsh T., King M.C. // Cancer Cell. – 2007. – V. 11. – P. 103-105. 176. Wang, W.Y. Genome-wide association studies: theoretical and practical concerns / Wang W.Y., Barratt B.J., Clayton D.G., Todd J.A. // Nat. Rev. Genet. – 2005. – V. 6. – P. 109-118. 177. Wang, X. A review of cancer risk prediction models with genetic variants / Wang X., Oldani M.J., Zhao X. et al. // Cancer Inform. – 2014. – V. 13(Suppl 2). – P. 19-28. 178. Weischer, M. CHEK2*1100delC genotyping for clinical assessment of breast cancer risk: meta-analyses of 26,000 patient cases and 27,000 controls / Weischer M., Bojesen S.E., Ellervik C. et al. // J. Clin. Oncol. – 2008. – V. 26. – P. 542-548. 179. WHO. Report of counsultants to WHO. Wertz D.C., Fletcher J.C., Berg K. Review of Ethical Issues in Medical Genetics – 2001. WHO/HGN/ETH/00.4. – 103 p. 126 180. Willems P.J. Susceptibility genes in breast cancer: more is less // Clin. Genet. – 2007. – V. 72. – P. 493–496. 181. Wooster, R. Identification of the breast cancer susceptibility gene BRCA2 / Wooster R., Bignell G., Lancaster J. et al. // Nature. – 1995. – V. 378. – P. 789792. 182. Xu, B. Involvement of Brca1 in S-phase and G2-phase checkpoints after ionizing irradiation / Xu B., Kim S.T., Kastan M.B. // Mol. Cell. Biol. – 2001. – V. 21. – P. 3445-3450. 183. Yun, M.H. Understanding the functions of BRCA1 in the DNA damage response / Yun M.H., Hiom K. // Biochem. Soc. Trans. – 2009. – V. 37. – P. 597604.