Структурная организация и эволюция рибосомной ДНК
advertisement
На правах рукописи УДК 576.316.577.1 ВОРОНОВ АЛЕКСАНДР СЕРГЕЕВИЧ СТРУКТУРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ И ЭВОЛЮЦИЯ РИБОСОМНОЙ ДНК ЧЕШУЙЧАТЫХ РЕПТИЛИЙ ПОДОТРЯДА SAURIA Специальность 03.00.26 – «молекулярная генетика» АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва 2008 Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте биологии гена РАН, лаборатории организации генома Научный руководитель: Кандидат биологических наук Куприянова Н.С. Официальные оппоненты: Доктор медицинских наук, профессор Альтштейн А.Д. Доктор биологических наук, профессор Носиков В.В. Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН Защита диссертации состоится “22” октября 2008 года в 12 часов на заседании Диссертационного совета Д 002.037.01 при Учреждении Российской академии наук Институте биологии гена РАН по адресу: 119334, Москва, ул. Вавилова 34/5. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Институте молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта РАН по адресу: 119991, Москва В-334, ул. Вавилова 32. Автореферат разослан “……” ……………… 2008 года. Ученый секретарь Диссертационного совета канд. фарм. наук Грабовская Л.С. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. В настоящее время в молекулярной биологии быстрыми темпами идет накопление экспериментального материала по первичной структуре геномной и митохондриальной ДНК различных организмов. Одним из важнейших современных направлений в молекулярной биологии и генетике является изучение изменчивости генетического материала и поиск эволюционных связей между организмами. Однако интенсивные усилия, направленные на установление структуры и корней эукариотического древа путем филогенетического анализа нуклеотидных последовательностей, пока не привели к построению общепринятого варианта такого древа [Arisue et al., 2005]. Нет окончательной ясности и в вопросе филогении рептилий. Интерес к структурно-функциональной организации кластера рибосомных генов обусловлен центральной ролью рибосомной РНК в ряде важнейших клеточных процессов, а также особенностями строения рибосомной ДНК (рДНК). Для рДНК характерно чередование консервативных и вариабельных участков, которые удобно использовать для филогенетических исследований и поиска функционально значимых участков у организмов различной степени родства. Для изучения эволюционных связей часто используется участок рибосомного оперона, включающий внутренние транскрибируемые спейсеры ВТС1 и ВТС2 предшественников рибосомной РНК. В настоящее время в GenBank депонировано более 100 000 последовательностей ВТС2, подавляющее большинство этих видоспецифических последовательностей принадлежит беспозвоночным. Их использовали для филогении и эволюционных сравнений интенсивно и успешно растений, протистов и некоторых беспозвоночных. Очевидно, что ВТС2 можно использовать для филогении и эволюционных сравнений таксонов более высокого уровня, благодаря наличию высоко консервативных (консенсусных) последовательностей, 1 обеспечивающих консервативность вторичной структуры соответствующего участка пре-рРНК [Joseph, 1999; Coleman, 2007]. Цель и задачи исследования. Целью данного исследования являлось изучение структурной организации кластеров и эволюционной изменчивости отдельных участков рДНК у чешуйчатых рептилий подотряда Sauria. В работе были поставлены следующие задачи: 1. Методом блот-гибридизационного анализа картировать и определить размер мономерного звена рДНК у ряда представителей подотряда Sauria. 2. Определить степень представленности повторов рДНК в геномах различных представителей подотряда Sauria. 3. Клонировать, секвенировать и провести сравнительный анализ первичных и вторичных структур ВТС2 ящериц между собой и с представителями других позвоночных.. Научная новизна и практическая ценность работы. В данной работе впервые определены особенности организации кластеров рДНК представителей отряда Squamata. Показано, что повторяющаяся единица рДНК ящериц одна из самых коротких среди всех позвоночных (10 – 15 т.п.н.). Установлена степень повторности мономеров рДНК у ряда представителей рептилий, показано что у ряда ящериц она значительно меньше, чем у всех ранее исследованных позвоночных. Показано, что у Uta stansburiana (Iguanidae) рДНК локализована на одной хромосоме. Впервые у 15 представителей отряда Squamata определена полная нуклеотидная последовательность ВТС2. Сравнительный анализ полученных последовательностей между собой выявил различия в размерах и характерные особенности организации этого элемента рДНК у представителей инфраотряда Iguania и семейства Lacertidae. Показано, что увеличение размеров ВТС2 у исследованных рептилий является следствием коротких инсерций и локальных дупликаций. Результаты исследования имеют ценность для выявления закономерностей эволюции рДНК и их взаимосвязи с эволюцией биологических видов. Данные, 2 представленной диссертационной работы, являются новым научным материалом, необходимым для восполнения общего объема информации, на основании которой могут быть сделаны выводы о механизмах эволюции рДНК Рибосомная ДНК рептилий, имеющая, как выяснилось, наименьший размер повторяющегося звена при наименьшей степени повторности, представляет интересную модель для изучения механизмов поддержания необходимого уровня экспрессии генов рРНК. Полученные результаты могут найти применение в изучении возможных вариаций в способах регуляции транскрипции генов рРНК, необходимый уровень присутствия которой при абсолютной точности процессинга жизненно важен для любой клетки. Таким образом, наша работа, кроме результатов по молекулярной структуре и эволюционной изменчивости рДНК рептилий, содержит информацию, имеющую важное прикладное значение в области общей биологии как способствующая разработке систематики рептилий на основе филогенетически значимых молекулярных маркеров. Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены на 12-ом Международном герпетологическом конгрессе (С. - Петербург, 1216 августа 2003 г.), на III съезде ВОГИС, (Москва, 6- 12 июня 2004 г.), на Международной конференции «Вычислительная филогенетика и геносистематика» (Москва, 16-19 ноября 2007 г.) и на межлабораторном семинаре ИБГ РАН (2008 г.). Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 печатных работ. Структура и объем работы. Диссертация изложена на 97 страницах, включает 15 рисунков, 4 таблицы и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов, обсуждения результатов, выводов и списка литературы, включающего 149 источников. 3 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 1 Структурная организация рДНК ящериц 1.1 Рестрикционное картирование рДНК ящериц В рДНК позвоночных эндонуклеаза рестрикции EcoRI дает два константных разрыва: за 220 п.н. до 3’ конца 18S рДНК и за 585 п.н. до 3’ конца 28S рДНК (Рис. 1). В случае отсутствия дополнительных EcoRI сайтов при гидролизе образуется два фрагмента, один из которых содержит 3’ конец 18S рДНК, внутренний транскрибируемый спейсер1 (ВТС1), 5,8S рДНК, внутренний транскрибируемый спейсер 2 (ВТС2) и основную часть 28S рДНК (внутренний фрагмент). Второй, внешний фрагмент, содержит рибосомный межгенный спейсер (рМГС), несущий на 5’ конце остаток 28S рДНК, а на 3’ конце – практически полноразмерную 18S рДНК. На основании нуклеотидных последовательностей, прилежащих с обеих сторон к консервативным EcoRI сайтам, изготовлялись маркерные олигонуклеотидные пробы RI – RIV таким образом, что RI и RIII могли служить маркерами для внутреннего фрагмента рДНК, а RII и RIV – для внешнего (Рис. 1). Рис. 1. Схема организации повтора рДНК позвоночных. Вертикальными линиями показаны консевативные сайты рестрикции EcoRI, синими квадратами – положение гибридизационных зондов RI-RIV. Pезультаты блот-гибридизационного анализа геномной ДНК D. raddei и D. armeniaca (рис. 2) позволяют заключить, что размер повторяющейся единицы рДНК у этой ящерицы составляет примерно 15 т.п.н., т.к. расщепление геномной ДНК под 4 действием трех рестриктаз (BamHI, BglII и KpnI) из четырех приводит к образованию единственного, одинакового по размеру фрагмента, гибридизующегося как с пробой RII (Рис. 2а), так и с пробами RI, RIII и RIV (данные не приведены). Совместная обработка ДНК D. raddei рестриктазой EcoRI в сочетании с любой из рестриктаз, перечисленных в скобках (PstI , SalGI, AccI, BglII, EcoRV, NotI и XhoI) и последовательная гибридизация с мечеными маркерами (RI-RIV) показывает, что сумма всех гибридизующихся фрагментов в каждой из дорожек составляет 15 т.п.н. (Рис. 2б-д). Рис. 2. Блот-гибридизационный анализ ДНК Darevskia raddei. а) Гидролиз эндонуклеазами рестрикции BamH I (1), BglII (2), EcoRI (3), KpnI (4), гибридизация с меченым олигонуклеотидным зондом RII; б-д) Гидролиз эндонуклеазой рестрикции EcoRI (1) совместно с PstI (2), SalGI (3), AccI (4), BglII (5), EcoRV (6), NotI (7), XhoI (8), гибридизация c мечеными олигонуклеотидными зондами RI (б), RIII (в), RII (г), RIV (д). Аналогичная серия гибридизаций была проведена для представителя инфраотряда Iguania – Laudakia caucasia. Расщепление геномной ДНК четырьмя рестриктазами (BglII, BamHI, KpnI или HindIII) из шести приводит к образованию единственного фрагмента размером около 10 т.п.н., гибридизующегося как с пробой RII (Рис. 3а), так и с пробами RI, RIII и RIV (данные не приведены). Совместная обработка ДНК D. raddei рестриктазой EcoRI в сочетании с любой из рестриктаз, перечисленных в скобках (PstI, SalGI, AccI, 5 BglII, EcoRV, NotI и XhoI) и последовательная гибридизация с мечеными маркерами (RIRIV) показывает, что сумма всех гибридизующихся фрагментов в каждой из дорожек составляет 10 т.п.н. (Рис. 3 б-д). Рис. 3. Блот-гибридизационный анализ ДНК Laudakia caucasia. а) Гидролиз эндонуклеазами рестрикции EcoRI (1), BglII (2), BamHI (3), PvuII (4), KpnI (5), HindIII (6), гибридизация с меченым олигонуклеотидным зондом RII; б-д) Гидролиз эндонуклеазой рестрикции EcoRI (1) совместно с PstI (2), SalGI (3), AccI (4), BglII (5), EcoRV (6), NotI (7), XhoI (8), гибридизация c мечеными олигонуклеотидными зондами RI (б), RIII (в), RII (г), RIV (д). Сходные размеры мономера рДНК были получены еще для восьми видов рептилий отряда Squamata (табл.1). Рестрикционный анализ показал, что рДНК исследованных рептилий содержит два консервативных EcoR I сайта рестрикции, типичных для всех позвоночных. Полученные результаты указывают на стандартную организацию рДНК ящериц при необычно малой для позвоночных (~10 – 15 т.п.н.) длине мономера рДНК. У человека эта величина составляет около 43 т.п.н. при степени повторности 200-300 [Gonzalez et al.,1995], у Xenopus laevis – 20-25 т.п.н. при степени повторности 600 [Long et al.,1980], костистой рыбы вьюн (Misgurus fossilis L.) имеется два типа мономеров рДНК – длинный – 20-25 т.п.н. с числом повторов 250 и короткий – 15 т.п.н., составляющий около 10% от 6 основного [Куприянова и др., 1981], а у дрожжей S. cerevisiae эта величина составляет около 11 т.п.н при повторности 140 [Long et al.,1980]. инфраотряд Varanoidea Iguania Sauria Squamata Reptilia Scincomorpha подотряд отряд класс Таблица 1. Размер мономеров рДНК у разных видов ящериц. вид Размер мономера в т.п.н. Darevskia armeniaca Darevskia raddei ~15 ~15 Scincidae Darevskia valentini Lacerta agilis Zootoca vivipara Eulamprus murrayi ~15 ~12 ~12 ~12 Varanidae Varanus exant ~ 11 Iguana iguana ~ 11 Uta stansburiana ~15 Laudakia caucasia ~10 семейство Lacertidae Iguanidae Agamidae 1.2 Определение количества мономеров в кластерах рДНК Скрининг фильтров, содержащих упорядоченные колонии 2x BAC-библиотеки ящерицы Uta stansburiana, выявил 12 клонов-кандидатов: из них четыре колонии, давали интенсивный сигнал и восемь – слабый сигнал (Рис. 4). Рис. 4. Гибридизация одного из 12 фильтров геномной библиотеки Stansburiana с зондом Стрелками RII. Uta олигонуклеотидным и цифрами обозначены клоны дающие интенсивный сигнал (1), клоны дающие слабый позитивный сигнал (2). 7 Методом блот-гибридизационного анализа показано, что только восемь клонов из 12 содержат рДНК. Четыре клона дают интенсивную гибридизацию со всеми четырьмя олигонуклеотидными зондами (рис. 5 б-д, дорожки 1-4), а еще четыре – слабую гибридизацию только с олигонуклеотидным зондом RIII (Рис. 5 г, дорожки 6, 8, 11 и 12). Эти результаты показывают, что клоны 1-4 содержат центральные области кластеров рДНК, а в клонах 6, 8, 11 и 12, по-видимому, присутствуют сегменты, имеющие гомологию с 3’ – концевым участком 18S рДНК. Зная среднюю длину вставки в BAC клоне (120 т.п.н.) и длину мономера рДНК (15 т.п.н.), определенную с помощью блотгибридизационного анализа (рис. 5б-д), можно предположить, что каждый из четырех клонов (1-4) содержит не более восьми мономеров рДНК. Поскольку работа проводилась с двукратной библиотекой диплоидного организма полученные результаты позволяют предположить, что в гаплоидном геноме ящерицы Uta stansburiana присутствует не более 8 мономеров рДНК, расположенных на одной хромосоме. Гибридизация с мечеными пробами RII и RIV выявила наличие внутригеномного полиморфизма в коллинеарно расположенных повторах рДНК (Рис. 5 г-д). Положение проб RII и RIV на карте рДНК с большой степенью вероятности указывает на то, что полиморфные участки локализуются в рМГС. Рис. 5. Рестрикционно-гибридизационная характеристика клонов, содержащих рДНК, из BAC библиотеки Uta stansburiana. а) УФвизуализация рестрикционных фрагментов; б-д) Блот-гибридизация фрагментов, полученных в результате обработки ВАСклонов, содержащих рДНК, эндонуклеазой рестрикции Меченные EcoRI. олигонуклеотидные пробы RI (б), RII (в), RIII (г), RIV (д). местоположение Звездочками обозначено слабогибридизующихся фрагментов (дорожки 6, 8, 11 и 12). 8 Оценку содержания повторов рДНК в геномах шести представителей отряда Squamata проводили методом ПЦР в реальном времени. В качестве контрольного образца использовали геномную ДНК человека (размер генома 3х109 п.н.; число копий рДНК на гаплоидный геном – 200-300) [www.genomesize.com]. Пробы ДНК, взятые у трех индивидов (по 100 нг), достигали C(Т) к 18,5му±0,3 циклу. Образцы, содержащие аналогичное количество (100 нг) геномной ДНК разных видов ящериц, достигали С(Т) к 17му- 20му циклам (Табл. 2). На основании данных о размерах геномов [www.genomesize.com], о числе повторов рДНК в контрольном геноме и полученных значений C(T), можно приблизительно рассчитать количество повторов рДНК в геномах исследуемых рептилий. Например, С(Т) L .cau отстает от С(Т) H. sap на полтора цикла, следовательно количество субстрата, участвующее в ПЦР, у L. cau в 21,5, т.е. в 3 раза больше, чем у человека. При этом размер генома L. cau ~ в 1,6 раза меньше размера генома человека. Следовательно, количество повторов рДНК в геноме L. cau приблизительно в 5 раз меньше, чем в геноме человека (Табл. 2). Таблица 2. Оценка количества мономеров рДНК в геномах ящериц методом ПЦР в реальном времени. Объект C(Т) Размер генома (п.н.) Кол-во рДНК повторов на гаплоидный геном H.sap ~18,5 3 х109 L.val ~19 ~2 х109* 200-300 80-120 9 L.agi ~19 1,6-2,1 х10 80-120 E.mur ~18 ~2 х109* 120-200 L.cau ~20 1,9 х109 40-60 I.igu ~20 ~2 х109* 40-60 V.exa ~17 1,7-2,4 х109 200-300 *среднее по семейству [www.genomesize.com] 9 Таким образом, полученные нами данные указывают на необычно малый для позвоночных размер повторяющейся единицы рДНК (~10– 15 т.п.н.) у исследованных видов ящериц, при этом количество копий рДНК в их геномах достаточно сильно варьирует: от ~10 у U. stansburiana до 300 у V. exant. в расчете на гаплоидный геном, оставаясь, тем не менее, близким в пределах отдельных подсемейств. 2. Структурная организация и изменчивость ВТС2 чешуйчатых рептилий 2.1 Сравнительный анализ первичной структуры Нами проведено клонирование, секвенирование и сравнительное исследование рибосомного внутреннего транскрибируемого спейсера 2 (ВТС2) у 15 видов ящериц, принадлежащих к трем инфраотрядам: Scincomorpha, Varanоidea и Iguania. Анализ последовательности ВТС2 показал, размер исследуемых последовательностей варьирует от 301 у Iguana iguana до 713 у Lacerta strigata (таб. 3). Анализ первичной структуры ВТС2 показал, что во всех нуклеотидных последовательностях ВТС2 ящериц различные основания представлены неравномерно, содержание GC составляет 78-80%, что характерно для других позвоночных, и содержат пять консервативных участков, аналогичных тем, которые были выявлены при построении обобщенной консенсусной вторичной структуры ВТС-2 позвоночных [Joseph et al., 1999]. В ходе сравнительного анализа было обнаружено, что у ящериц с «длинными» ВТС2 консервативные элементы расположенные в 3’- половине проявляют некоторое сходство с нуклеотидными блоками 5’- половины. Мы провели выравнивание «коротких» ВТС2 двух ящериц инфраотряда Iguania L. caucasia, I. iguania и амфибии X. laevis c 5’- и 3’- половинами «длинных» ВТС2 ряда других ящериц. Был выявлен ряд регулярно чередующихся нуклеотидных блоков (столбцов) с высокой (65-80%) степенью сходства (рис.6). 10 инфраотряд семейство Lacertidae Varanоidea Scincidae Varanidae вид сокращенное обозначение п.н. Acc. N Darevskia armeniaca D.arm 683 AY696809 Darevskia nairensis D.nai 701 DQ184944 Darevskia valentini D.val 680 DQ184945 Darevskia rostombekovi D.ros 686 DQ184946 Darevskia portschinskii D.por 696 DQ184947 Darevskia mixta D.mix 700 DQ343131 Lacerta media L.med 711 DQ343129 Lacerta agilis L.agi 709 DQ343130 Lacerta strigata L.str 713 AY646810 Gallotia sp. G.sp 550 DQ184943 E.mur 469 DQ184940 V.exa 569 DQ184942 Eulamprus murrayi Varanus exant Iguana iguana Iguania Sauria Squamata Scincomorpha подотряд отряд Таблица 3. Размеры ВТС2 чешуйчатых рептилий. I.igu 301 DQ184939 Iguanidae Uta stansburiana Agamidae Laudakia caucasia 11 U.sta L.cau 357 337 DQ184941 AY643402 Рис.6. Сравнительный анализ «коротких» ITS2 X. laevis и представителей инфраотряда Iguania с 5’- и 3’- частями «длинных» ITS2 других ящериц. 2.2 Сравнительный анализ предполагаемых вторичных структур ВТС2 всех позвоночных складывается из 3-5 высоко термодинамически устойчивых шпилек, разделенных относительно короткими однонитевыми участками. Длина шпилек может заметно различаться у разных организмов, причем наиболее консервативные последовательности локализуются между шпильками и вблизи их основания [Joseph et al., 1999; Michot et al., 1999]. Основываясь на данной схеме, мы 12 провели коррекцию выравнивания ВТС2, полученного с помощью пакета программ GeneBee Service и Multalin, в результате чего удалось совместить консенсусные последовательности. В результате было показано, что несмотря на достаточно большие различия в длине ВТС2, расположение шпилек и консенсусных последовательностей у всех исследуемых ящериц соответствует схеме предложенной Джозефом [Joseph et al., 1999] (рис. 7). Рис. 7. Схема потенциальной вторичной структуры ITS2 позвоночных [Joseph et al., 1999;]. А, В, С, D – двуспиральные домены; DI – DIV – вариабельные участки двуспиральных доменов; a, b1, b2, c, d – консервативные участки. Изучение вторичной структуры ВТС-2, показало, что размер первой шпильки (D.I) незначительно варьирует у представителей амфибий, рептилий и млекопитающих: от 30 п.н. у X. laevis до 45 п.н. у R. nor, за одним исключением – семейство Lacertidae, где шпилька D.I имеет размер почти втрое больше (82-107 п.н.). Размер шпильки D.II более вариабелен: от 30 п.н. у X. laevis до 126 п.н. у G. Gallus. Самый большой размер шпильки D.II среди исследованных ящериц имеют так же представители семейства Lacertidae (109-115 п.н.). Интересно отметить, что у последних в консенсусном участке, входящем в правую половину шпильки D.II, пара gt, консервативная у всех других сравниваемых организмов, замещена на ga (рис. 8). Эта специфичная для лацертид замена является компенсаторной и усиливает потенциальную способность к образованию вторичной структуры в основании D.II. Значительные размеры D.II у представителей семейства Lacertidae обусловлены дополнительными 13 вставками на 5`-конце. Большинство этих вставок обладают внутренней комплементарностью и могут быть сложены в стабильные шпильки D.II`, которые являются характерной особенностью этого семейства (рис. 9). Нуклеотидная последовательность между шпильками D.II и D.III является одной из наиболее важных консенсусных областей в ВТС2 позвоночных. Она образована 20-24 п.н., и в ней локализуется сайт процессинга для 8S предшественника 5.8S рРНК. Шпилька D.III отсутствует у представителей инфраотряда Iguania, как и у всех известных на сегодняшний день представителей птиц и амфибий. Небольшая (60-76 п.н.) шпилька D.III обнаружена у всех остальных исследованных ящериц. У млекопитающих, напротив, она весьма велика, например, у мыши в D.III содержится 418 п.н (рис.10). Шпильки D.IV самые протяженные и наиболее вариабельные у всех позвоночных, а для образуемых ими потенциальных вторичных структур характерна высокая степень ветвления. В этой области ВТС-2 можно выделить консервативные элементы. У мыши внутри последовательности (5’-CGTCCG^TGCGCCGA-3’) в шпильке D.IV находится сайт процессинга, который обеспечивает образование предшественника 12S для 5.8S рРНК [Michot et al., 1999]. Аналогичный участок с помощью компьютерного моделирования был определен для рыб, амфибий, птиц и млекопитающих. У всех исследованных организмов этот сайт находится в центральной части D.IV [Joseph et al., 1999]. В ходе сравнительного анализа шпильки D.IV у всех ящериц был обнаружен участок d (рис. 12). 14 аналогичный консервативный Рис.8. Сравнительный анализ ВТС2 позвоночных. Цифрами указано число нуклеотидов вариабельных участков DI – DIV. Зеленым цветом выделены нуклеотиды формирующие характерную левостороннюю шпильку DII’. a, b1, b2, c, d – консервативные участки. Синим цветом выделены первые нуклеотиды в основаниях шпилек DI и DII. 15 Рис. 9. Потенциальная вторичная структура А и В доменов ВТС2 ящериц и некоторых позвоночных. В прямоугольнике выделена шпилька DII’ характерная для истинных ящериц. 16 Рис.10. Потенциальная вторичная структура C доменов ВТС2 ящериц и некоторых позвоночных. 1 – E. murayi, 2 – V. exant, 3 – G. gallotia, 4 – D. portschinskii, 5 – D. armeniaca, 6 – D. mixta, 7 – D. nairensis, 8 – D. rostombekovi, 9 – D. valentine, 10 – L. agilis, 11 – L. strigata, 12 – L. media, 13 – R. norvegicus, 14 – M. musculus, 15 – H. sapiens. 17 Рис. 11. Потенциальная вторичная структура D доменов ВТС2 ящериц и некоторых позвоночных. 1– E. murayi, 2 – V. exant, 3 – G. gallotia, 4 – D. portschinskii, 5 – D. armeniaca, 6 – D. mixta, 7 – D. nairensis, 8 – D. rostombekovi, 9 – D. valentine, 10 – L. сaucasia, 11- I. Iguana, 12 – U. stansburiana, 13 - L. agilis, 14 – L. strigata, 15 – L. media, 16 – R. norvegicus, 17 – M. musculus, 18 – H. sapiens. 18 ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ Ранее было показано, что нуклеотидные последовательности ВТС2 всех изученных эукариот содержат пять консервативных (консенсусных) элементов и обладают потенциальной способностью свертываться в три-пять шпилек различной длины (D.I – D.V), исходящих из центральной петли [Joseph et al., 1999; Coleman, 2005]. Нами детально охарактеризованы аналогичные шпильки для ВТС2 рептилий. Проведенное сравнение новых последовательностей с ортологичными участками амфибий и млекопитающих показало, что размеры отдельных шпилек D.I - D.V и всего ВТС2 в целом, значительно варьируют между разными таксонами. Из всех организмов, участвующих в сравнении, самыми короткими вариабельными доменами D.I и D.II в ВТС2 ядерной рДНК обладают амфибия X. laevis, ящерицы инфраотряда Iguania и млекопитающие (Рис. 9). Домен D.II у всех чешуйчатых рептилий имеет близкие размеры. Наиболее короткие и наиболее длинные домены D.II обнаруживаются у амфибий, демонстрируя удивительно высокий разброс по длине (от 8 п.н. у X. laevis до 108 п.н. у Rana nigramaticulata). Этот результат, по-видимому, отражает чрезвычайно высокую степень дивергенции ВТС2 в геномах амфибий. Очень короток домен D.II в ВТС2 млекопитающих, крысы, мыши и человека (15-29 п.н.). У истинных ящериц (Lacertidae) D.II содержит заметные левосторонние шпильки (D.II’), позиции которых совпадают с позицией короткой не спаренной области (4-8 н.) в D.II других позвоночных (Рис.8 и Рис.9) [Joseph et al., 1999; Воронов и др., 2006]. В ходе сравнительного анализа первичных структур у ящериц с «длинными» ВТС2 в 3’- половине спейсера был обнаружен ряд консервативных сегментов, проявляющих высокую степень сходства с консенсусами Джозефа, и перемежающимися с менее гомологичными областями (Риc. 6). Возникает вопрос, какие механизмы лежат в основе увеличения размера ВТС2. В настоящее время полагают, что гомогенизация в мультигенных семействах происходит в 19 процессах репликации и репарации ДНК. Недавние генетические исследования показали, что в согласованной эволюции может играть существенную роль генная конверсия [Liao, 2000; Hashimoto et al., 2003]. В то же время, приблизительно двукратное эволюционное увеличение ВТС2 у истинных ящериц по сравнению с Iguania, а также обнаружение в его 3’-половине цепи сегментов ДНК, гомологичных консенсусным, указывает на возможность дупликации 5’-половины ВТС2, скорее всего за счет рекомбинации. В то же время, большой вклад в дивергенцию ортологичных участков ВТС2 позвоночных вносят инсерции/делеции коротких нуклеотидных последовательностей. Известно, что сам ВТС2 впервые появился как интрон, некогда внедрившийся в 28S рДНК прокариотической клетки и отделивший 5.8S рДНК, прежде являвшуюся началом гена, от остальной его части [Jacq, 1981; Nazar, 1980]. Поэтому нельзя исключить возможность повторного внедрения в него по механизму ретропозиции и более протяженных элементов ВТС2. На рисунке 12 приводится сравнение расширенных вариантов консенсусных последовательностей ВТС2 (а, с и d) у представителей различных классов позвоночных. Известно, что участки ВТС2, представленные в боксах а, с и d участвуют (в составе пре-рРНК) в связывании с РНК-шейперонами и/или нуклеазами процессинга. Сравнение характера замещений нуклеотидов в пределах консенсусов и сравнение типов замещений у представителей различных таксонов позволяет выявить интересные закономерности. Например, в положении 3 бокса a обнаруживается два варианта оснований: «C» или «A». Наличие основания «C» в этом положении объединяет такие далекие (если судить по их современным представителям) таксоны, как амфибии, млекопитающие и представителей инфраотряда Iguania. В то же время, у всех исследованных представителей инфраотряда Scincomorpha и у Varanus exant в данной позиции присутствует «A». В качестве другого примера можно привести наличие основания «A» в позиции 5 a-бокса, которое неожиданно оказывается общим для млекопитающих, птиц и 20 аллигатора, тогда как у всех включенных в сравнение ящериц, относящихся к инфраотрядам Iguania, Scincomorpha и Varanoidea, данную позицию занимает «G». Приведенные различия, возможно, маркируют этапы расхождения древних организмов на группы, каждая из которых впоследствии дала начало большому числу современных таксонов. а X.lae H.sap M.mus R.nor G.gal A.mis I.igu U.sta L.cau C.cha E.mur V.exa G.sp D.mix D.arm L.agi с gacg*tccatcg gccgatcaatcg gacgatcaatcg gacgatcaatcg gcc*atcaatcg gacgatcaatcg gacggtcaatcg gacggtcaatcg gacggtcaatcg gacggtcaatcg gaaggtcaatcg gaaggtcaatcg gaaggtcaatcg gaaggtcaatcg gaaggtcaatcg gaaggtcaatcg Рис. 12. d ccc*aaggcc*agaccc ccctaagcgc*agaccc cccgaagttc*agacgt cc*gaagttc*agacgt ccctaagtgc*agatcc ccctaagtgc*agacac cc*gaagcgc*agatcc ccc*aagcgc*agaccc cccgaagtcc*agaccc ccc*aagtcg*agaccc ccc*aaggcc*agacсc ccc*aaggcgcagaccc ccc*aagtcc*agaccc ccc*aagtcc*agaccc ccc*aagtcc*agaccc ccc*aagtcc*agaccc Сравнение нуклеотидных c*cggcggctgtctgtg ggccgcggc*g*ccggg cgccgcggc*gtccgtg cgccgcggc*gtccgtg ggc*gcggctgccggtg cgc*gcggctgtctgtg cgc*gcggctgtctgtg cgc*gcggctgtctgtg cgc*gcggctgtctgtg cgc*gcggctgtctgtg cgc*gcggctgtctgtg cgc*gcggctgtctgtg cgc*gcggctgtctgtg cgc*gcggctgtctgtg cgc*gcggctgtctgtg cgc*gcggctgtctgtg последовательностей консервативных (консесусных) областей ВТС2 ответственных за: связывание с U3РНК (a), процессинг 8S предшественника 5.8S рРНК (c), процессинг предшественника 28S рРНК у представителей различных классов позвоночных (d). Результаты сравнительного анализа консенсусных последовательностей (Рис. 12) позволяют предположить, что эволюция по отдельным консенсусам происходила с различной скоростью для разных таксонов. Например, у грызунов (мыши и крысы) в боксе c нуклеотиды в позициях 4, 9, 16 и 17 выбиваются из ряда всех сравниваемых в этом столбце последовательностей, тогда как в боксах a и d специфические для грызунов вариации отсутствуют. 21 Обращает на себя внимание высокая скорость эволюции в сравниваемых областях ВТС2 у высших приматов. У человека (высших приматов с идентичной последовательностью ВТС2) имеются характерные замены оснований во всех трех боксах, особенно в боксе d по позициям 1, 11 и 15. Интересно, что в каждом из боксов имеется по одной общей вариации, характерной только для человека (приматов) и кур (птиц). Это позиции 2 в боксе a, 4 – в боксе c и 1 – в боксе d. Нуклеотиды в позициях 14-17 бокса c также практически идентичны у человека и кур (ACCC/ATCC), но сильно отличаются от ортологичных нуклеотидов у мыши и крысы (ACGT). У всех чешуйчатых рептилий, включая крокодила, полностью идентичны ортологичные последовательности из блока d. Следы эволюционных ветвлений рептилий отмечаются в блоке a, где в позиции 5 присутствует «G» у всех рептилий, кроме крокодила, которого объединяет с группами птиц и млекопитающих наличие «A» в данной позиции. Вариабельность по позиции 3 в боксе a, а именно замена «C» на «A» у группы рептилий, по-видимому, сопутствует формированию ветви истинных ящериц. Для бокса c характерно присутствие замен, специфических для таксонов современных рептилий. Например, в положении 8-10 у всех представителей семействa Lacertidae – TCC, I. iguana и U. Stansburiana – CGC, L. caucasia – TCC, E. murrayi – GCC, V. exant – GCG. Вероятно, вариабельность по этим позициям не влияет на точность процессинга пре-рРНК, и поэтому носит мозаичный характер. Обращают на себя внимание одинаковые замены нуклеотидов, часто встречающиеся в сравниваемых боксах у приматов, кур и крокодила. Это, по-видимому, свидетельствует в пользу схемы, согласно которой птицы и рептилии произошли от общего эволюционного корня, а также указывает на существование в прошлом общего предка у класса Aves и отряда Crocodilian к моменту, когда ящерицы уже образовали свою эволюционную ветвь. Очень неожиданной оказывается идентичность замещений нуклеотидов (пять позиций) у приматов и птиц на 22 фоне замещений, специфических только для грызунов. Возможно, в ходе эволюции могли возникать предковые формы не только внутри таксонов, но и между близкими таксонами. Опытным путем установлено, что филогенетические деревья, построенные на основе различных сегментов генома, могут отличаться друг от друга, поскольку в ранней эволюции хордовых имели место частые геномные дупликации [McLysagt et al., 2002]. Избыточные гены, образовавшиеся в процессе полиплоидизации, затем могли быть подвергнуты элиминации, гомогенизации их нуклеотидных последовательностей, внедрению повторов и эпигенетическим изменениям [Blanc and Wolfe, 2004]. Предпринятые попытки построить филогенетические деревья на основании последовательностей отдельно взятых боксов (а, с и d) также не привели к получению однозначных результатов. Однако основываясь на наиболее консервативном консенсусе d все последовательности можно разделить на четыре группы, соответствующие четырем классам – амфибии, рептилии, птицы и млекопитающие. По консенсусу a ящерицы кластеризуются на две группы Iguania и Scincomorpha в соответствии с морфологической классификацией. Таким образом, данные участки можно использовать для поиска эволюционных взаимосвязей только в комплексе и при наличии значительной выборки. Результаты полноразмерного секвенирования новых геномов, принадлежащих разным представителям животного царства, позволяют подробно и последовательно изучать эволюционные связи между организмами. Недавно проведен сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей генов, кодирующих надсемейство белков серпинов, у рыб Danio rerio, Takifugu ribripes и Tetraodon nigroviridis, амфибии Xenopus tropicalis, птицы Gallus gallus, и млекопитающих Canis Familians, Rattus norvegicus, Mus musculus, Pan troglodytes и Homo sapiens. Исследование показало, что ген Serpinb12, содержащий дополнительный экзон 8 и обнаруженный в геномах представителей всех классов позвоночных, среди рыб присутствует только у Danio rerio [Kaiserman and Bird, 2005]. Особенности организации генов серпина у различных позвоночных позволяют 23 предположить существование общих эволюционных корней у млекопитающих и отдельных видов рыб. Внутренняя митохондриальная мембрана млекопитающих содержит белок UCP1, от наличия которого полностью зависит поддержание постоянной температуры тела. Удивительно, что ген UCP1 присутствует в геномах рыб, амфибий и млекопитающих, но отсутствует в геномах птиц и ящериц [Mezentseva et al, 2008]. Возможным объяснением является отсутствие на сегодняшний день данных о геномах рыб, лишенных гена UCP1, которые могли сформироваться в результате дивергенции их общего предка с некоторыми пресмыкающимися и птицами. Полученные нами данные о необычно маленьком единицы рДНК у ящериц размере повторяющейся (~10– 15 т.п.н.), подтверждают данное предположение, поскольку аналогичный размер мономера встречается только у рыб. При этом количество копий рДНК в их геномах достаточно сильно варьирует: от ~10 у U. stansburiana до 300 у V. exant, в расчете на гаплоидный геном, оставаясь, тем не менее, близким в пределах отдельных подсемейств. Вероятно, дупликации рДНК в различных классах позвоночных происходили независимо. В настоящее время завершается расшифровка нуклеотидной последовательности генома хордового sea squirt (Ciona intestinalis). Исследователи прочли пока около 95% генома этой актинии. Геном имеет размер около 450 млн пар оснований и содержит примерно 18 000 белок-кодирующих генов, что вполне сопоставимо с геномами другими животными. Одним из следствий расшифровки является следующий неожиданный факт: геном человека оказался в целом гораздо более похожим на геном актинии, чем геномы мухи и червя. Сходство затрагивает не только набор генов, но и порядок их расположения в хромосомах [Putnam.et al., 2007; Dunn et al., 2008]. В свете новых данных более правдоподобным кажется предположение, согласно которому для отдельных классов, а возможно и отрядов современных организмов 24 существовали свои одинаково древние предковые формы, на уровне полиплоидных хордовых. Из всего выше сказанного видно, насколько сложна и далека от завершения проблема поиска эволюционных связей между позвоночными и их связей с более древними организмами. Эта проблема может быть разрешена только путем сравнения нуклеотидных последовательностей ортологичных областей все новых и новых геномов. Одним из удачных подходов к изучению эволюционных связей является сравнительное исследование первичных и вторичных структур внутренних транскрибируемых спейсеров генов рибосомной РНК. 25 ВЫВОДЫ 1. Впервые определены размеры мономеров, образующих кластеры рибосомной ДНК в геномах 10 видов чешуйчатых рептилий, которые варьировали от 10 до 15 т.п.н. 2. Установлена степень повторности мономеров рДНК у ряда представителей рептилий, показано, что у ряда ящериц она значительно меньше, чем у всех ранее исследованных позвоночных. 3. Показано, что у Uta stansburiana (Iguania) рДНК локализована на одной хромосоме. 4. Сравнение нуклеотидных последовательностей ВТС2 15 представителей отряда Squamata между собой выявило различия в размерах и характерные особенности организации этого элемента рДНК у представителей семейства Iguania и Lacertidae 5. Показано, что увеличение размеров ВТС2 у исследованных рептилий является следствием коротких инсерций и локальных дупликаций. 26 СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Воронов А.С., Шибалев Д.В., Рысков А.П., Куприянова Н.С. Эволюционная изменчивость внутреннего транскрибируемого спейсера (ВТС-2) рибосомной ДНК у ящериц. Молекулярная биология 2006, 40(1): 45-51. 2. Voronov A.S., Voronova G.A., Kupriyanova N.S., Ryskov A.P. Molecular-genetic characteristics of lizard ribosomal DNA. Herpetologica Petropolitana. Proc. of the 12th Ord. Gen. Meeting Soc. Eur. Herpetol., August 12-16, 2003, Ananjeva N. and Tsinenko O. (eds.), St. Petersburg. 2005, 105-108 3. Воронов А.С., Шибалев Д.В., Куприянова Н.С. Особенности организации кластеров рибосомной ДНК у чешуйчатых рептилий. Генетика, 2008, том 44, №11, с.1-6 4. Voronov A.S., Voronova G.A., Kupriyanova N.S., Ryskov A.P. Molecular-Genetic characteristics of lizard ribosomal DNA..12th Ordinary General Meeting of SocietasEuropaea Herpetologica, St. Petersburg, Russia (12-16 August 2003) Abstracts, p. 170. 5. Воронов А.С., Воронова Г.А., Шибалев Д.В., Куприянова Н.С. Генно-инженерное получение и характеристика рибосомной ДНК ящериц. Генетика в XXI веке: современное состояние и перспективы развития. III съезд ВОГИС, Москва, Россия (6- 12 июня 2004 г.). Тезисы, стр. 325. 6. А.С.Воронов, Д.В.Шибалев, Н.С.Куприянова. Эволюционная дивергенция рибосомного межгенного сейсера 2 (ВТС2) рептилий в контексте общей эволюционной изменчивости ВТС2 позвоночных. Вычислительная филогенетика и геносистематика. Москва, Россия (16-19 ноября 2007 г.). Тезисы, стр.44-51 27
