Выявление мутаций в онкогенах

Персонализированная медицина — ключ к эффективной терапии
Выявление мутаций в онкогенах
Определение генетической предрасположенности
к развитию рака
Наиболее точный подбор лекарственных средств
Контроль эффективности терапии
www.interlabservice.ru
EGFR
KRAS
NRAS
BRAF
PI3K
UGT1A1
MGMT
MLH1
р16
Персонализированная медицина — ключ к эффективной терапии
Преимущества проведения молекулярной диагностики
В современной онкологии
молекулярно-генетические исследования являются неотъемлемой частью диагностики злокачественных новообразований
и выбора­лечебной тактики.
Постановка
диагноза
Персонифи­
цированная
медицина
Прогноз
Мониторинг
Идентификация
заболевания
Какой препарат
назначить?
Течение заболевания (степень
агрессивности)
Эффективность
лечения
Прогресс в области молекулярно-биологических исследований злокачественных образований привел к открытию присущих опухолевой клетке свойств
и пониманию многих ключевых механизмов развития опухоли, что привело к
созданию новых лекарственных средств — «таргетных» препаратов, действующих на конкретную «мишень». Таргетные препараты действуют непосредственно на молекулярную мишень в опухолевой клетке, не повреждая серьезным
образом другие органы и ткани пациента.
Применение «таргетных» препаратов требует обязательной идентифи­
кации генетических нарушений, определяющих эффективность терапии.
Низкомолекулярные ингибиторы EGFR (гефитиниб и эрлотиниб), применяемые
для терапии рака легкого, рекомендуется в первую очередь назна­чать тем больным, у которых обнаружена активирующая мутация данного рецептора. При лечении рака толстой кишки использование антител к рецептору эпидермального
фактора роста (EGFR) — Цетуксимаба и Панитумумаба — допуска­ется только в
том случае, если в опухоли отсутствует мутация в онкогене KRAS.
Компания
«ИнтерЛабСервис»
предлагает наборы
реагентов QIAGEN
для определения
мута­ций в онкогенах, в том
числе соматических, методами
аллель специфичной ПЦР —
технология ARMS Scorpions
и пиросеквени­рованием.
2
Известно, что присутствие определенных соматических мутаций в онкогенах также может определять скорость развития некоторых онкологических заболеваний. Так, при наличии соматических мутаций в онкогенах KRAS, BRAF
колоректальный рак развивается в кратчайшие сроки, быстро метастазирует
и плохо поддается химио- и радиотерапии.
Большое значение имеет выявление наследственно обусловленных форм
рака, вызванных мутациями, передающимися из поколения в поколение. Определение таких генетических нарушений у здоровых родственников больного
раком толстого кишечника, молочной железы и.т.д., необходимо для определения риска развития заболевания и возможной профилактики.
Молекулярные тесты уже внедрены в мировую онкологическую практику.
Их использование позволило увеличить клиническую эффективность применяемой терапии, а также снизить себестоимость лечения за счет сознательного
отказа от заведомо неэффективных вмешательств.
Выявление мутаций в онкогенах
Метод аллель специфичной ПЦР в режиме реального времени
Технология ARMS Scorpions
Позволяет быстро и качественно проводить определение соматических мутаций в онкогенах EGFR, KRAS, BRAF,
PI3K с целью определения схемы лечения и контроля эффективности терапии
Регистрационное удостоверение
№ ФСЗ 2012/12826 - Кат.№ 870111, 870001, 870201
Диапазон исследований
EGFR (29):G719X, 3SNP (18 экзон), 19 делеций (19 экзон), T790M, S768I, 3 инсерции (20 экзон), L858R, L861Q (21 экзон).
KRAS (7): Gly12Ala (GGT>GCT), Gly12Asp (GGT>GAT), Gly12Arg (GGT>CGT),
Gly12Cys (GGT>TGT), Gly12Ser (GGT>AGT), Gly12Val (GGT>GTT),
Gly13Asp (GGC>GAC.
BRAF (3): V600E (GAG, GAA), V600D (GAT), V600K (AAG).
PIK3K (4): H1047R (3140 A>G), E542K (1624 G>A), E545D 1635 (G>T), E545K1633
(G>A).
Чувствительность и специфичность
Обнаружение очень низких концентраций всех значимых мутаций (1% мутантной ДНК)
Надежность
Получение валидного результата даже из образцов невысокого качества
Эффективность
Анализ нескольких локусов в одном образце с использованием минимального
количества пробирок
Достоверность данных
Наличие положительных контролей для каждой мутации (контроль ингибирования ПЦР)
Контроль расхода основных
реагентов
Оценка качества образца опухоли
Простота в использовании
Анализ в один этап (могут работать даже начинающие лаборатории)
Время анализа
3 – 4 часа
3
www.interlabservice.ru
Персонализированная медицина — ключ к эффективной терапии
Схема проведения анализа методом аллель-специфичной ПЦР
Выделение ДНК
ПЦР в режиме реального времени
(парафиновый блок опухолевой ткани,
(амплификатор Rotor-Gene Q 5plex HRM, замороженная ткань опухоли)
Rotor-Gene Q 6plex, ПО: версия 2.0.2)
Автоматическая идентификация
наличия или отсутствия мутаций
Реагенты для выделения ДНК
Этапы проведения ПЦР
Канал FAM
Канал HEX
набор реагентов «QIAamp DNA
ПЦР №1 — оценка качества образца
Контрольное
измерение
тотальной ДНК
в образце
Отрицательный
контроль
ПЦР №2 — определение мутаций
в онко­гене
Измерение
мутаций (праймеры: Scorpion
и для дискриминации ДНК дикого типа)
Внутренний
контроль (синтетическая
ДНК)
FFPE Tissue Kit», кат.№ 56404;
этанол ректификат (96–100%);
ксилол, чда.
Состав набора для проведения анализа методом аллель-специфичной ПЦР
Контрольная реакционная смесь
Позитивный контроль
Реакционные смеси для определения мутаций
ДНК-полимераза Tag DNA
Вода, свободная от нуклеаз
4
Выявление мутаций в онкогенах
Метод пиросеквенирования
Позволяет проводить количественное определение мутаций в режиме реального времени в онкогенах EGFR, KRAS,
BRAF, NRAS, MGMT, UGT1A1, MGMT, MLH1, CpG p16 с использованием наборов реагентов QIAGEN, а также наиболее
часто встречающиеся мутации в генах BRCA1 и BRCA2 с использованием набора реагентов BRCA-скрин, пр-во ФБУН
ЦНИИ Эпидемиологии).
Простота анализа
автоматическая интерпретация генотипов программным обеспечением
Чувствительность
Детекция < 5% мутантной ДНК на фоне дикого типа
Надежность
Получение достоверного результата из образцов невысокого качества. Минимальный риск контаминации
Эффективность
Анализ нескольких локусов в одном образце с использованием минимального количества пробирок
Достоверность
данных
Прямой метод определения нуклеотидной последовательности
Количественный
анализ
Анализ аллельного состояния, позволяет детектировать полиморфизмы в гомо- и гетерозиготном
состоянии
Информативность
Детекция смежных и мультивариабельных мутаций
Пропускная
способность
Одновременная пробоподготовка всех образцов, возможность одновременного секвенирования
24 образцов в течение 15–20 минут
Время анализа
3,5 часа
Схема проведения анализа методом пиросеквенирования
Nucleotide sequence
G
С
—
A
GG
CC
T
G
С
T
A
G
C
T
Nucleotide added
Выделение ДНК
ПЦР
(стандартный термоциклер)
Пробоподготовка
и пиросеквенировапние
(система генетического
Автоматическая иден­
тификация наличия или
отсутствия мутаций
анализа PyroMark Q24)
5
www.interlabservice.ru
Персонализированная медицина — ключ к эффективной терапии
Состав набора для проведения анализа методом пиросеквенирования
Праймеры для амплификации
Краситель CoralLoad, концентрат
Праймеры для секвенирования
Набор буферов для пробоподготовки
Реакционная смесь для проведения ПЦР
Смесь ферментов
Вода, свободная от нуклеаз
Смесь субстратов
Неметилированная контрольная
ДНК
Нуклеотиды (дАТФαS, дГТФ,
дЦТФ, дТТФ)
Материал для исследования: кровь, парафиновый блок опухолевой ткани, замороженная ткань опухоли
Процесс образования опухоли сопровождается активацией определенных
генов. В результате происходит запуск биохимических путей, которые участвуют в стимуляции активного деления (пролиферации), роста опухоли и метастазировании. Выбор мишеней потенциального воздействия возможен через
определение сигнальных путей, активированных в опухолевых клетках. Поиск
биомаркеров устойчивости или гиперчувствительности к лекарственным средствам осуществляется через исследование этих биохимических путей. Наличие
и появление новых соматических мутаций в генах может приводить к формированию устойчивости к лекарственным препаратам, а также ассоциироваться
со скоростью развития заболевания.
Сигнальный путь EGFR
Выявление соматических мутаций в гене EGFR рекомендовано Европейским Обществом
Медицинских Онкологов и
является показа­нием к применению ингибиторов тирозинкиназы EGFR
6
Одним из ключевых путей роста и прогрессирования опухолей является
сигнальный путь, запускаемый рецептором эпидермального фактора роста
(EGFR). EGFR — белок, расположенный на поверхности клетки. При связывании с факторами роста, EGFR активирует белок тирозинкиназу и запускает
внутриклеточные биохимические пути, в результате которых стимулируется
синтез ДНК и пролиферация клеток. В норме EGFR регулирует рост различных
клеток в орга­низме, в том числе и раковых клеток. Онкологические заболевания часто­ сопровождаются изменениями в генах, кодирующих EGFR и белки,
которые явля­ются звеньями сигнальных путей EGFR.
Выявление мутаций в онкогенах
KRAS
Ген KRAS кодирует один из белков в начале сигнального пути от EGFR (изоформа белка RAS). В норме белок,
который кодирует немутантный ген KRAS, активируется только в ответ на сигнал от EGFR и деактивируется
после передачи сигнала. Мутации в гене KRAS приводят к постоянной активации белка и к постоянной передаче сигнала, что способствует агрессивному росту опухолей, независимо от наличия или отсутствия сигналов от EGFR. Поэтому у пациентов с мутантным геном KRAS терапия, направленная на ингибирование EGFR
и / или тирозинкиназу является неэффективной. Мутации гена KRAS обнаружены у 30–40% пациентов с метастатическим колоректальным раком, у 15–30% пациентов с немелкоклеточным раком легкого, 59% с раком
поджелудочной железы, 18% с раком яичника, 20–30% с раком различных отделов кишечника, 15% с раком
щитовидной железы.
NRAS
Ген NRAS кодирует один из белков в начале сигнального пути от EGFR (изоформа белка RAS). Мутации в гене NRAS обнаружены у 54% пациентов с множественной миеломой, 50% пациентов с лейкемией,
10–25% пациентов со злокачественной меланомой, у 1% пациентов с немелкоклеточным раком легкого,
встречаются при колоректальном раке. Увели­чение активности белка RAS в результате мутаций в гене NRAS
приводят к развитию приобретенной резистентности к препаратам-ингибиторам BRAF (vemurafenib).
BRAF
Ген BRAF кодирует белок, который находится в сигнальном пути EGFR после белка RAS. Результатом наиболее часто встречающейся мутации в гене BRAF является 10-кратное возрастание активности белка, что
приводит к неэффективности анти-EGFR терапии. Мутантный ген BRAF встречается у 10% пациентов с колоректальным раком, у 27–70% пациентов со злокачественной меланомой. Также мутации в BRAF вовлечены
в развитие немелкоклеточного рака легкого и Ходжкинской лимфомы.
PI3K
Ген PI3K кодирует один из белков на начальном этапе сигнального пути EGFR (PI3K — второй путь в каскаде EGFR). Мутации в гене PI3KСА (повышают активность белка и увеличивают скорость опухолевого роста)
встречаются у 30% пациентов с колоректальным раком, 40% c раком груди, 30% с раком яичников. Активирующие мутации в гене PIK3CA приводят к снижению эффективности анти-EGFR терапии.
UGT1A1 Ген UGT1A1 кодирует цитоплазматический белок, участвующий в детоксикации ряда метаболитов и ксенобиотиков. К числу его субстратов (т.е. веществ, дезактивируемых этим белком) относятся, в частности, билирубин и активный метаболит иринотекана — SN-38. Вариации в структуре TATA-бокса промоторной области
гена UGT1A1 (отличия от основного варианта (TA) 6TAA, в частности, полиморфизм UGT1A1*28 — (TA)5TAA)
ассоциированы с понижением уровня экспрессии данного гена и, соответственно, с накоплением в организме избыточного уровня его субстратов и могут вызывать транзиторную неонатальную гипербилирубинемию
(синдром Жильбера, синдром Кригглера-Найара) и повышение риска угрожающей токсичности иринотекана (тяжелой нейтропении и диареи). Наличие варианта первичной структуры в гене UGT1A1 ассоциировано с уменьшенной способностью метаболизировать иринотекан, вследствие чего может наблюдаться повышенная токсичность стандартных доз этого препарата. Соответствующий лабораторный тест, направленный
на выявление подобных индивидуумов и влекущий за собой необходимость снижения стартовой дозировки
препарата на 20-25%, уже рекомендован к применению FDA [Innocenti and Ratain, 2004; Innocenti et al., 2006].
7
www.interlabservice.ru
Персонализированная медицина — ключ к эффективной терапии
Метилирование ДНК в злокачественных опухолях
В качестве причин возникновения практически всех онкологических заболеваний все большая роль отводится эпигенетической регуляции активности генов, основанной на аномальном метилировании/ деметилировании. Во всех опухолевых клетках существует дисбаланс метилирования — аномальное метилирование/деметилирование. С одной стороны,
он заключается в общем гипометилировании генома опухолевой клетки, с другой — в локальном гиперметилировании
промоторов ряда генов, вовлеченных в регуляцию клеточного цикла, процессы дифференцировки и апоптоза. Тотальное
гипометилирование генома опухолевой клетки может вызывать несколько эффектов, которые имеют существенный вклад
в процессы злокачественной трансформации и может служить одним из маркеров, имеющим прогностическое значение.
В промоторных районах участвующих в регуляции клеточного цикла генов в сочетании­ с гипометилированием генома­ также происходит аномальное метилирование CpG-островков, что приводит к их полной инактивации. К ним также относят­
ся гены, участвующие в апоптозе, ангиогенезе, дифференцировке, репарации ДНК, метастазировании, передаче сигнала,
детоксикации, лекарственной резистентности и др. Таким образом, при отсутствии каких-либо структурных измене­ний
нуклеотидной последовательности гена он полностью теряет свою активность. Гиперметилирование промотор­ной области рецептора эстрогена обнаруживается в 40–70% колоректальных раков, в 20–30% РМЖ, в 60–70% острых лейкозов.
8
MGMT
Ген MGMT кодирует ядерный белок, играющий ключевую роль в репарации повреждений в ДНК, вызываемых алкилирующими агентами. Ген MGMT является геном-супрессором опухолевого роста. Примерно в 15%
случаев злокачественных опухолей человека этот ген инактивируется (преимущественно путем гиперметилирования промоторной области) — большинство этих случаев приходится на злокачественные глиомы, меланому, нейроэндокринные опухоли брюшной полости, колоректальный рак, плоскоклеточный рак головы и шеи
и некоторые гемобластозы. Описано использование гиперметилированного варианта гена MGMT в качестве
маркера для неинвазивного мониторинга опухолевого присутствия. Прогностическое значение инактивации
гена MGMT до конца не выяснено. Однако показано, что эта инактивация ассоциирована с потенциальной чувствительностью опухолевых клеток к простым алкилирующим агентам — как метилирующим (темозоломид,
дакарбазин, прокарбазин), так и этилирующим (производные нитрозомочевины). Соответствующие данные
были получены для злокачественных глиом, нейроэндокринных опухолей, меланомы и в самое последнее
время — для колоректального рака.
MLH1
Ген MLH1. Продукт этого гена участвует в репарации неспаренных оснований, возникающих в результате
ошибок ДНК полимеразы. Инактивация MLH1 ведет к накоплению мутаций в коротких повторяющихся (микросателлитных) последовательностях. Его мутации обнаруживают у больных наследственным неполипозным
раком толстой и прямой кишки. В случае спорадической формы этого рака потеря функциональной активности гена MLH1 часто связана с метилированием его CpG-островка. Установлено, что микросателлитная
нестабильность при спорадической форме рака толстого кишечника, эндометрия и желудка в большинстве
случаев также обусловлена этой причиной (см. обзор Herman 1999).
Выявление мутаций в онкогенах
р16
Ген р16 (INK4A) кодирует ингибитор циклинзависимой киназы, блокирующий сигнальный путь cyclin D — Rb.
Утрата этого белка или его инактивация ведут к тому, что клетка теряет контроль над клеточным циклом:
циклинзависимая киназа фосфорилирует Rb, в результате чего из неактивного комплекса высвобождаются
факторы транскрипции B2F. В итоге активируются гены, обусловливающие вхождение клетки в фазу S клеточного цикла. При этом повреждение данного сигнального пути происходит практически во всех опухолях,
путем нарушения функций либо гена р16, либо гена Rb1, но никогда сразу обоих названных генов. Случаи гиперметилирования CpG-островка в 5'-области гена р16 составляют от 20 до 67% солидных опухолей человека
разной локализации (см. обзор Baylin et al. 1998).
Информация для заказа
Наборы реагентов QIAGEN для определения генетических нарушений
методом аллель-специфичной ПЦР
Наименование
Therascreen EGFR RGQ PCR Kit (24) СЕ
Кат. номер
Клинический
материал
870111
РУ № ФСЗ 2012/12826 от 05 сентября 2012
EGFR PCR Kit (25)/EGFR PCR Kit (100)
871101 / 871105
KRAS RGQ PCR Kit (24)
870001
РУ № ФСЗ 2012/12826 от 05 сентября 2012
KRAS PCR Kit (25/ 100)
871001 / 871005
BRAF RGQ PCR KIT (24)
870201
опухолевая
ткань
(парафиновый
блок)
PK-01 / PK-02
НКРЛ, рак мозга, толстой кишки,
желудка, рак яичника, рак молочной
и предстательной желез, плоскоклеточная карцинома головы и шеи
Колоректальный рак, рак легкого,
поджелудочной железы, рак яичника,
рак щитовидной железы
Меланома, рак щитовидной железы,
колоректальный рак
РУ № ФСЗ 2012/12826 от 05 сентября 2012
PI3K Mutation Test Kit
Ассоциация с типом рака
ДНК человека
Рак груди; рак матки, колоректальный рак
9
www.interlabservice.ru
Персонализированная медицина — ключ к эффективной терапии
Наборы реагентов для определения генетических нарушений
методом пиросеквенирования
Наименование
Кат. номер
Клинический
материал
Ассоциация с типом рака
EGFR Pyro Kit (24)
970480
НКРЛ, рак мозга, толстой кишки, желудка, рак
яичника, рак молочной и предстательной желез,
плоскоклеточная карцинома головы и шеи
BRAF Pyro Kit (24)
970470
Меланома, рак щитовидной железы, колоректальный рак
PIK3CA Pyro Kit (24)
970490
Рак груди; рак матки, колоректальный рак
KRAS Pyro Kit (24)
970460
Колоректальный рак, рак легкого, поджелудочной
железы, рак яичника, рак щитовидной железы
NRAS Pyro Kit (24)
970530
UGT1A1 Pyro Kit (24)
970540
PyroMark Q24 KRAS v2.0 (4 x 24)
970452
ДНК человека
РУ № ФСЗ 2011/08860
MGMT Pyro Kit (48)
BRCA-скрин (АмплиСенс®)
РУ № ФСР 2012/13246 от 19 марта 2012г.
10
970061
ДНК человека
(кровь или
парафиновый
блок)
Рак крови, рак кожи, обнаружены у пациентов
с множественной миеломой, лейкемией, злокачественной меланомой, колоректальным раком
Синдром Жильбера, синдром Кригле­ра-Найара
I и II типов; для подбора индивидуальной дозы Иринотекана и оценки тяжести ожидаемых побочных
эффектов
ДНК человека
(кровь или
парафиновый
блок)
PMQ-005-50-F Кровь
человека
Колоректальный рак, также наблюдаются при раке
легкого, поджелудочной железы, раке яичника,
раке щитовидной железы
Определение степени метилирования в 4 CpG сайтах в экзоне 1 гена MGMT
Рак молочной железы и/или яичников
Выявление мутаций в онкогенах
Наименование
PyroMark Q24 CpG LINE-1 (4х24)
Кат. номер
Клинический
материал
970042
Определение степени метилирования мобильных
генетических элементов
970032
Рак мозга, толстой кишки, легкого, груди, определение степени метилирования мобильных генетических элементов
РУ № ФСЗ 2011/08860
PyroMark Q24 CpG MGMT (4х24)
Ассоциация с типом рака
РУ № ФСЗ 2011/08860
ДНК человека
PyroMark Q24 CpG MLH1 (4х24)
970022
Рак кишечника, определение степени метилирования мобильных генетических элементов
970012
Меланомы, лимфобластный лейкоз, определение
степени метилирования мобильных генетических
элементов
978746
ДНК человека, Определение степени метилирования практически
мыши
любого участка CpG в геноме мыши или человека
РУ № ФСЗ 2011/08860
PyroMark Q24 CpG p16 (4х24)
РУ № ФСЗ 2011/08860
PyroMark CpG Assay (200)
Дополнительные наборы реагентов для определения
генетических нарушений методом пиросеквенирования
Наборы реагентов для выделения ДНК
Кат. номер
QIAamp DNA FFPE Tissue Kit (50)
56404
QIAamp DNA Blood Mini Kit
51104
АмплиПрайм ДНК-сорб-Б
102-20
Комплект реагентов для пробоподготовки «ПИРО-преп» (1000)
(АмплиСенс®) РУ № ФСЗ 2012/13246 от 19 марта 2012
PMQ-P
Образец
Парафиновый блок
Кровь
11
www.interlabservice.ru
Персонализированная медицина — ключ к эффективной терапии
Дополнительные наборы реагентов для определения генетических
нарушений методом пиросеквенирования
Набор реагентов бисульфитной об­
работки и амплификацией ДНК
Кат. номер
Образец, процедура
EpiTect Plus DNA Bisulfite Kit (48)
59124
EpiTect Plus FFPE Bisulfite Kit (48)
59144
EpiTect Plus LyseAll Bisulfite Kit (48)
59164
Выделение ДНК из крови, клеток, тканей и бисульфитная обработка
EpiTect Whole Bisulfitome Kit (25/100)
59203
59205
ДНК после бисульфитной обработки
PyroMark PCR Kit (200 /800)
978703
978705
115035, Россия, г. Москва,
ул. Садовническая, д. 20/13, стр. 2
Тел.: +7 (495) 664 2884
Факс: +7 (495) 664 2889
www.interlabservice.ru
[email protected]
Применение
ДНК, полученная с использованием наборов реагентов Кат. №№ 59144, 59164
Для проведения Выделение ДНК из срезов парафиновых бисульфитной
блоков и бисульфитная обработка
конверсии
Амплификация Набор реагентов для амплификации генома
ДНК после бисульфитной обработки­,
оптимизированный для анализа Pyro­
sequencing®