HLA-typing - MolBiol.ru

HLA-typing
Точное HLA-типирование служит залогом успеха при трансплантации органов
и клеток костного мозга. Существенное значение оно имеет и для определения
причин раннего невынашивания беременности.
Недостаточная точность HLA-типирования ведёт к отторжению пересаженных
органов и увеличивает риск развития GVHD (Graft Versus Host Disease) – реакции
трансплантата против хозяина. Подобная реакция проявляется примерно в 60%
случаев неродственной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток (ТГК),
что определяет актуальность разработки наборов для HLA-типирования при
помощи секвенирования ДНК. Точнее – наборов праймеров, позволяющих
избирательно амплифицировать представляющие интерес для HLA-типирования
участки ДНК и определять их нуклеотидные последовательности.
Система генов тканевой совместимости человека (англ. HLA, Human Leucocyte
Antigens) расположена на 6-й хромосоме. Кодируемые ими антигены
подразделяются на 3 класса:
• HLA I (A, B, C и др.) - представляют пептиды из цитоплазмы на поверхности
клетки и присутствуют на поверхности всех типов клеток, за исключением
эритроцитов;
• HLA II (DP, DQ, DR и др.) – представляют антигены из окружающего
пространства в антигенпредставляющие клетки и находятся на поверхности Bлимфоцитов, активированных Т-лимфоцитов, моноцитов, макрофагов и
дендритных клеток;
• HLA III – кодируют компоненты системы комплемента, фактор некроза
опухолей (TNF) и некоторые другие белки.
Перечень типируемых HLA-антигенов, как правило, включает пять локусов –
A, B, C, DRB1 и DQB1. Наборы праймеров компании Roche (GS GType HLA MR &
HR Primer Sets) позволяют секвенировать от одного до трёх экзонов у десяти генов
HLA – A, В, С, DPB1, DQB1, DQA1 и DRB(1, 3, 4, 5). Такое расширение перечня
секвенируемых локусов способно несколько снизить нынешний чудовищно высокий
процент TRM (transplant-related mortality), но вряд ли следует ограничиваться
рошевской дюжиной генов. Очень уж велика цена ошибки. Показано, например, что
TRM может быть ассоциирована с некоторыми мутациями гена фактора некроза
опухоли (TNF, tumor necrosis factor).
В перспективе для точного HLA-типирования будет использоваться
полногеномное секвенирование, но его стоимость пока слишком высока (~5 тыс.$),
поэтому в ближайшие годы вполне оправданным будет использование селективного
секвенирования HLA-региона шестой хромосомы. Точнее – его наиболее значимых
участков, поскольку весь HLA-регион довольно обширен (~ 4 млн.п.о.).
Class I
Все HLA-антигены I класса имеют сходную структуру. Их гипервариабельные
участки локализованы в бороздке, образуемой двумя белковыми доменами (α1 и α2).
Кодирующая эти домены ДНК расположена во втором и третьем экзонах генов, но
информация о нуклеотидной последовательности третьего α-домена, кодируемого в
основном четвёртым экзоном, также может быть полезной.
http://freedownload.is/ppt/hla-dna-sequence-based-typing-2632657.html
Остальные экзоны менее информативны, хотя в одной из последних работ
авторы секвенировали у HLA-генов A, B и C по 7 экзонов, причём все они
вмещались на ампликонах длиной чуть больше 3 т.п.о..
www.pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas.1206614109
2
Участки HLA-генов, относящихся к I классу главного комплекса
гистосовместимости (MHC, Major Histocompatibility Complex), отличаются
повышенным содержанием GC и способны формировать тугоплавкие шпилечные
структуры, затрудняющие амплификацию ДНК с обычной Taq-полимеразой. Менее
чувствительные к подобным структурам полимеразы, используемые для проведения
LD-PCR, позволяют амплифицировать длинные фрагменты ДНК. Но если исходно
ориентироваться на использование ДНК-полимераз подобного типа, то можно не
слишком заботиться о минимизации размеров ампликонов. При таком подходе
выбор праймеров намного шире и их пары могут захватывать участки с тремя и
более экзонами HLA-генов.
Праймеры подбирались по последовательностям генов из базы данных NCBI Gene:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/
Их специфичность проверялась при помощи программы Primer-BLAST:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi?LINK_LOC=BlastHome
HLA-A
На рисунке показаны структура гена HLA-A (экзоны и интроны), локализация
известных мутаций (SNP), координаты последовательности, по которой проводился
подбор праймеров, и другая информация, отображаемая в графическом формате в
базе данных Gene. Границы ампликона и позиции праймеров отмечены красными
линиями и стрелками.
Структура гена HLA-A
DNA file: NC_000~1.SEQ [4440] >gi|224589818|ref|NC_000006.11|:29909511-29913950 Homo sapiens chromosome 6, G
OPTIMAL ANNEALING TEMP.: 65.7°
Product length: 2415 bp; 63.1% GC
Upper:479 (30) ->------Lower:2863 (31) -------<╔═══════╤════════╤════════╤════════╤══════╗
║ Oligo │ Tm [°C]│ nmol/OD│ µg/OD'│ Mr ║
╠═══════╪════════╪════════╪════════╪══════╣
║ Upper │
69.5│
3.28│
30.8│ 9394║
║ Lower │
70.1│
3.87│
36.0│ 9294║
╚═════════════════════════════════════════╝
U_HLA-A:
TGGGCCAAGACTCAGGGAGACATTGAGACA
L_HLA-A:
CCTTCTCCACCTGAGCTCTTCCTCCTCCACA
3
HLA-B
Ген HLA-B с прилегающей областью хромосомы и позициями праймеров
DNA file: NC_000~1.SEQ [4344] >gi|224589818|ref|NC_000006.11|:31322494-31326837 Homo sapiens chromosome 6, G
OPTIMAL ANNEALING TEMP.: 64.8°
Product length: 2814 bp; 60.4% GC
Upper:441 (30) ->------Lower:3219 (36) -------<╔═══════╤════════╤════════╤════════╤══════╗
║ Oligo │ Tm [°C]│ nmol/OD│ µg/OD'│ Mr ║
╠═══════╪════════╪════════╪════════╪══════╣
║ Upper │
70.9│
3.37│
31.3│ 9268║
║ Lower │
69.1│
2.67│
30.1│ 11300║
╚═════════════════════════════════════════╝
U_HLA-B:
ACAACTGCTAGGACAGCCAGGCCAGCAACA
L_HLA-B:
TCAGGGTGGGGAATGAAGATAATTTTAAATGCAACA
HLA-C
Участок гена HLA-С с прилегающей областью хромосомы и позициями праймеров
DNA file: NC_000~1.SEQ [4324] >gi|224589818|ref|NC_000006.11|:31236997-31241320 Homo sapiens chromosome 6, G
OPTIMAL ANNEALING TEMP.: 65.7°
Product length: 2491 bp; 63.0% GC
Upper:732 (34) ->------Lower:3193 (30) -------<╔═══════╤════════╤════════╤════════╤══════╗
║ Oligo │ Tm [°C]│ nmol/OD│ µg/OD'│ Mr ║
╠═══════╪════════╪════════╪════════╪══════╣
║ Upper │
71.1│
3.47│
35.4│ 10201║
║ Lower │
69.7│
3.73│
34.3│ 9205║
╚═════════════════════════════════════════╝
U_HLA-C:
TCACCCCTTCCCTACCTGAGCTCTTCCTCCTACA
L_HLA-C:
CTTGGGGTCTCTCCCTGGTTTCCACAGACA
4
Class II
У HLA-антигенов II класса зона вариабельности кодируется преимущественно
вторым экзоном субъединиц β1, но иногда полиморфность встречается и у
субъединиц α1.
http://freedownload.is/ppt/hla-dna-sequence-based-typing-2632657.html
Обоснование выбора генов и экзонов лучше оставить на совести специалистов
компании Roche, разработавших наборы праймеров для HLA-типирования при
помощи геномного секвенатора. Предложенный ими перечень ампликонов
перекрывает вторые экзоны у генов DPB1, DQA1, DRB1, DRB3, DRB4 и DRB5. У
гена DQB1 ампликоны перекрывают как второй, так и третий экзоны. Специалисты,
использующие традиционные методы HLA-типирования, могут счесть такой набор
избыточным, но производительность современных технологий секвенирования тоже
избыточна, а дополнительная информация о вариабельности малоизученных
локусов может оказаться очень полезной. Поэтому лучше не вдаваться рассуждения,
а просто скопировать предложенный рошевцами перечень секвенируемых участков.
Тем более что это позволит сравнивать данные, получаемые с использованием
разных праймерных наборов.
5
HLA-DPB1
DNA file: NC_000~1.SEQ [810] >gi|224589818|ref|NC_000006.11|:33048200-33049009 Homo sapiens chromosome 6, G
OPTIMAL ANNEALING TEMP.: 64.9°
Product length: 607 bp; 62.1% GC
Upper:80 (26)
->------Lower:665 (22) -------<╔═══════╤════════╤════════╤════════╤══════╗
║ Oligo │ Tm [°C]│ nmol/OD│ µg/OD'│ Mr ║
╠═══════╪════════╪════════╪════════╪══════╣
║ Upper │
70.1│
4.19│
33.5│ 7997║
║ Lower │
72.3│
5.47│
36.3│ 6633║
╚═════════════════════════════════════════╝
U_HLA-DPB1:
GGCTCTGCGACCCGCTTAGGACCACA
L_HLA-DPB1:
CCCCGCGCTCGCTCCCCTGACA
HLA-DQB1
DNA file: NC_000~1.SEQ [8854] >gi|224589818|ref|NC_000006.11|:32626634-32635487 Homo sapiens chromosome 6, G
OPTIMAL ANNEALING TEMP.: 61.6°
Product length: 4924 bp; 47.1% GC
Upper:2232 (33) ->------Lower:7126 (30) -------<╔═══════╤════════╤════════╤════════╤══════╗
║ Oligo │ Tm [°C]│ nmol/OD│ µg/OD'│ Mr ║
╠═══════╪════════╪════════╪════════╪══════╣
║ Upper │
70.9│
2.93│
30.6│ 10421║
║ Lower │
71.7│
3.46│
32.4│ 9377║
╚═════════════════════════════════════════╝
U_HLA-DQB1:
GGAGGAAGCTTTTGGAAAGGAGCCAGTGAGACA
L_HLA-DQB1:
GTGCTGAGGGAAGCTGACTGGCTGACCACA
6
HLA-DQA1
DNA file: NC_000~1.SEQ [8122] >gi|224589818|ref|NC_000006.11|:32604244-32612365 Homo sapiens chromosome 6, G
OPTIMAL ANNEALING TEMP.: 60.3°
Product length: 2800 bp; 43.4% GC
Upper:3627 (36) ->------Lower:6393 (34) -------<╔═══════╤════════╤════════╤════════╤══════╗
║ Oligo │ Tm [°C]│ nmol/OD│ µg/OD'│ Mr ║
╠═══════╪════════╪════════╪════════╪══════╣
║ Upper │
71.3│
2.63│
29.4│ 11180║
║ Lower │
70.6│
3.27│
33.4│ 10211║
╚═════════════════════════════════════════╝
U_HLA-DQA1:
AGAAAAACAACAGACCACTGCAAAGACCAGGGAACA
L_HLA-DQA1:
CCACTTCCCAATTCCCCTACAACTTTCAACCACA
HLA-DRB1
DNA file: NC_000~1.SEQ [14324] >gi|224589818|ref|NC_000006.11|:32544891-32559214 Homo sapiens chromosome 6, G
OPTIMAL ANNEALING TEMP.: 60.3°
Product length: 2393 bp; 47.1% GC
Upper:6586 (34) ->------Lower:8943 (36) -------<╔═══════╤════════╤════════╤════════╤══════╗
║ Oligo │ Tm [°C]│ nmol/OD│ µg/OD'│ Mr ║
╠═══════╪════════╪════════╪════════╪══════╣
║ Upper │
70.0│
3.20│
32.7│ 10214║
║ Lower │
67.1│
2.82│
31.0│ 11005║
╚═════════════════════════════════════════╝
U_HLA-DRB1:
CCTAAACCTTCACCCCAACCACACACACCTTACA
L_HLA-DRB1:
CACACAGCCAATATTTAACACAGCCAGTATTTCACA
7
HLA-DRB3
DNA file: NT_113~1.SEQ [16993] >gi|224515577|ref|NT_113891.2|:3932164-3949156 Homo sapiens chromosome 6 genom
OPTIMAL ANNEALING TEMP.: 63.1°
Product length: 1574 bp; 53.7% GC
Upper:6775 (35) ->------Lower:8314 (35) -------<╔═══════╤════════╤════════╤════════╤══════╗
║ Oligo │ Tm [°C]│ nmol/OD│ µg/OD'│ Mr ║
╠═══════╪════════╪════════╪════════╪══════╣
║ Upper │
70.4│
2.97│
32.3│ 10866║
║ Lower │
72.2│
2.85│
30.9│ 10832║
╚═════════════════════════════════════════╝
U_HLA-DRB3:
CTTGCTCGGGATTGAGAGGATTCTAAATGCTCACA
L_HLA-DRB3:
CAGAAGCACACGTCGCCAATAAGAGCTCTGAGACA
HLA-DRB4
DNA file: NT_167~1.SEQ [19463] >gi|224515579|ref|NT_167246.1|:3843799-3863261 Homo sapiens chromosome 6 genom
OPTIMAL ANNEALING TEMP.: 60.2°
Product length: 2781 bp; 45.4% GC
Upper:6500 (31) ->------Lower:9245 (36) -------<╔═══════╤════════╤════════╤════════╤══════╗
║ Oligo │ Tm [°C]│ nmol/OD│ µg/OD'│ Mr ║
╠═══════╪════════╪════════╪════════╪══════╣
║ Upper │
70.3│
3.34│
31.4│ 9405║
║ Lower │
68.2│
2.72│
30.5│ 11200║
╚═════════════════════════════════════════╝
U_HLA-DRB1:
CTCCCACAACAGCCACACAGACAAATCCACA
L_HLA-DRB1:
TGAGTAGAAGCCAGGGACACTGCTAAAGAACCTACA
8
HLA-DRB5
DNA file: NC_000~1.SEQ [16716] >gi|224589818|ref|NC_000006.11|:32483220-32499935 Homo sapiens chromosome 6, G
OPTIMAL ANNEALING TEMP.: 61.0°
Product length: 2301 bp; 47.2% GC
Upper:5176 (36) ->------Lower:7449 (28) -------<╔═══════╤════════╤════════╤════════╤══════╗
║ Oligo │ Tm [°C]│ nmol/OD│ µg/OD'│ Mr ║
╠═══════╪════════╪════════╪════════╪══════╣
║ Upper │
69.2│
2.88│
32.1│ 11139║
║ Lower │
71.9│
3.98│
33.9│ 8525║
╚═════════════════════════════════════════╝
U_HLA-DRB5:
TACTTGGGGTGCTTATGCCTAGGAAAATCCCTAACA
L_HLA-DRB5:
TGCTTCCCCCGTTTTGCCCAAACAGACA
Дополнения
Потенциальные возможности современных секвенаторов позволяют
определять в одной пробе нуклеотидные последовательности десятков тысяч
ампликонов, что значительно превышает возможности мультиплексной ПЦР,
нацеленной на одновременную амплификацию десятков или сотен фрагментов ДНК.
Частично компенсировать это несоответствие позволяет индексация библиотек ДНК
и одновременное секвенирование десятков или сотен проб. Тем не менее,
вышеперечисленной дюжины HLA-ампликонов, как правило, будет недостаточно
для полной загрузки прибора даже при одновременном секвенировании десятков
проб. Это позволяет значительно расширить количество анализируемых
ампликонов.
Естественно, дополнительные пары праймеров в комплекте, предназначенном
для HLA-типирования, должны быть нацелены на гены, имеющие хотя бы
косвенное отношение к проблемам трансплантологии. Таких генов не так уж и мало,
но в комплекте их не должно быть слишком много. Для начала будет достаточно и
одной дюжины.
HFE (HLA-H)
Данный ген хорошо известен медицинским генетикам, но не потому, что
кодируемый им белок относится к HLA-антигенам I класса. Некоторые его мутации
вызывают наследственный гемохроматоз. Данная болезнь имеет рецессивный
характер. Отмечается не у всех гомозиготных носителей мутантных аллелей, но
может проявляться в самых различных формах – от повреждения отдельных органов
до мертвенно-бронзового оттенка кожных покровов, облысения и потери интереса к
сексу. Что касается вариабельности антигеных свойств ответственного за эти
последствия белка и его влияния на гистосовместимость, то этот вопрос
практически не изучен.
9
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/3077
The protein encoded by this gene is a membrane protein that is similar to MHC class I-type proteins and
associates with beta2-microglobulin (beta2M). It is thought that this protein functions to regulate iron
absorption by regulating the interaction of the transferrin receptor with transferrin. The iron storage
disorder, hereditary haemochromatosis, is a recessive genetic disorder that results from defects in this
gene. At least nine alternatively spliced variants have been described for this gene. Additional variants
have been found but their full-length nature has not been determined.
DNA file: NC_000~1.SEQ [10351] >gi|224589818|ref|NC_000006.11|:26086312-26096662 Homo sapiens chromosome 6, G
OPTIMAL ANNEALING TEMP.: 61.1°
Product length: 3067 bp; 48.0% GC
Upper:4434 (36) ->------Lower:7463 (38) -------<╔═══════╤════════╤════════╤════════╤══════╗
║ Oligo │ Tm [°C]│ nmol/OD│ µg/OD'│ Mr ║
╠═══════╪════════╪════════╪════════╪══════╣
║ Upper │
68.8│
2.88│
31.7│ 11022║
║ Lower │
70.4│
2.87│
33.5│ 11691║
╚═════════════════════════════════════════╝
U_HFE:
ACCAACTCCTGAGTTCAACTACCATGGCTAGACACA
L_HFE:
GCCTGCTTTAGGACCTCATGGGGTCTTCTTTAACTACA
TNF
Входит в число генов HLA III класса. Некоторые мутантные варианты
ассоциированы с GVHD при трансплантации гемопоэтических клеток:
Petersdorf E.W., Hansen J.A. New Advances in Hematopoietic Cell Transplantation /Curr.
Opin. Hematol. – 2008. – Vol.15, №6. – P.549–554.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/7124
This gene encodes a multifunctional proinflammatory cytokine that belongs to the tumor necrosis factor
(TNF) superfamily. This cytokine is mainly secreted by macrophages. It can bind to, and thus functions
through its receptors TNFRSF1A/TNFR1 and TNFRSF1B/TNFBR. This cytokine is involved in the
regulation of a wide spectrum of biological processes including cell proliferation, differentiation,
apoptosis, lipid metabolism, and coagulation. This cytokine has been implicated in a variety of diseases,
including autoimmune diseases, insulin resistance, and cancer. Knockout studies in mice also suggested
the neuroprotective function of this cytokine.
10
DNA file: NC_000~1.SEQ [3594] >gi|224589818|ref|NC_000006.11|:31542935-31546525 Homo sapiens chromosome 6, G
OPTIMAL ANNEALING TEMP.: 64.0°
Product length: 2304 bp; 55.5% GC
Upper:104 (28) ->------Lower:2376 (32) -------<╔═══════╤════════╤════════╤════════╤══════╗
║ Oligo │ Tm [°C]│ nmol/OD│ µg/OD'│ Mr ║
╠═══════╪════════╪════════╪════════╪══════╣
║ Upper │
71.2│
3.86│
33.3│ 8631║
║ Lower │
73.2│
3.39│
33.5│ 9902║
╚═════════════════════════════════════════╝
U_TNF:
CGGGGTTCAGCCTCCAGGGTCCTACACA
L_TNF:
TTTGGGAAGGTTGGATGCTCGTCCTCCTCACA
CCR5
Наиболее распространенной мутацией этого гена является небольшая (32 п.о.)
делеция, приводящая к сдвигу рамки трансляции и синтезу дефектного
укороченного белка (rs333). Гомозиготные носители этой делеции невосприимчивы
к вирусу HIV. Трансплантация ГСК от таких доноров ВИЧ-инфицированным
реципиентам позволяет добиться их полного излечения. Первая, и пока
единственная, попытка такого лечения, проведённая в Германии, оказалась
успешной: Evidence for the cure of HIV infection by CCR5D32/D32 stem cell transplantation / Allers
K. et al. // Blood. – 2011. – Vol.117. – P.2791-2799.
В США ведутся работы по анализу частоты встречаемости генотипа CCR5
∆32/∆32 и поиску подходящих для лечения СПИДа донорских клеток в банках
пуповинной крови: Identification and frequency of CCR5D32/D32 HIV-resistant cord blood units
from Houston area hospitals / Gonzalez G. et al. // HIV Medicine. – 2011. – Vol.12. – P.481–486.
В России насчитывается более полумиллиона ВИЧ-инфицированных. Их
количество быстро увеличивается в результате новых случаев заражения (~10% в
год). Быстро растёт и количество пациентов, получающих высокоактивную
антиретровирусную терапию (ВААРТ). Увеличение продолжительности их жизни
также отражается на данных статистики. Отсюда следует, что в ближайшее
десятилетие вирусоносителями могут стать более миллиона россиян, и, если не
появятся более эффективные способы лечения, то все они будут нуждаться в
трансплантации гемопоэтических стволовых клеток с генотипом CCR5 ∆32/∆32.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/1234
This gene encodes a member of the beta chemokine receptor family, which is predicted to be a seven
transmembrane protein similar to G protein-coupled receptors. This protein is expressed by T cells and
macrophages, and is known to be an important co-receptor for macrophage-tropic virus, including HIV, to
enter host cells. Defective alleles of this gene have been associated with the HIV infection resistance.
11
Позиция ∆32 (rs333) отмечена сиреневой линией (праймеров – красными).
DNA file: NC_000~1.SEQ [7886] >gi|224589815|ref|NC_000003.11|:46410721-46418606 Homo sapiens chromosome 3, G
OPTIMAL ANNEALING TEMP.: 60.2°
Product length: 496 bp; 46.8% GC
Upper:3837 (36) ->------Lower:4297 (36) -------<╔═══════╤════════╤════════╤════════╤══════╗
║ Oligo │ Tm [°C]│ nmol/OD│ µg/OD'│ Mr ║
╠═══════╪════════╪════════╪════════╪══════╣
║ Upper │
70.1│
2.71│
30.5│ 11239║
║ Lower │
69.4│
2.80│
31.3│ 11179║
╚═════════════════════════════════════════╝
U_CCR5:
TGATAAACTGCAAAAGGCTGAAGAGCATGACTGACA
L_CCR5:
GTTTTTAGGATTCCCGAGTAGCAGATGACCATGACA
TP53
Нарушения синтеза и функций белка p53, кодируемого геном TP53, являются
одной из наиболее частых причин развития лейкозов, при которых необходима
трансплантация гемопоэтических стволовых клеток. Информация об этих
нарушениях может быть полезной для выяснения причин возникновения лейкозов и
снижения риска их развития при размножении стволовых клеток в организме
реципиента.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/7157#
This gene encodes tumor protein p53, which responds to diverse cellular stresses to regulate target genes
that induce cell cycle arrest, apoptosis, senescence, DNA repair, or changes in metabolism. p53 protein is
expressed at low level in normal cells and at a high level in a variety of transformed cell lines, where it's
believed to contribute to transformation and malignancy. p53 is a DNA-binding protein containing
transcription activation, DNA-binding, and oligomerization domains. It is postulated to bind to a p53binding site and activate expression of downstream genes that inhibit growth and/or invasion, and thus
function as a tumor suppressor. Mutants of p53 that frequently occur in a number of different human
cancers fail to bind the consensus DNA binding site, and hence cause the loss of tumor suppressor
activity.
12
DNA file: NC_000~1.SEQ [24892] >gi|224589808|ref|NC_000017.10|:7568845-7593736 Homo sapiens chromosome 17, GR
OPTIMAL ANNEALING TEMP.: 62.9°
Product length: 4140 bp; 53.1% GC
Upper:7747 (40) ->------Lower:11857 (30) -------<╔═══════╤════════╤════════╤════════╤══════╗
║ Oligo │ Tm [°C]│ nmol/OD│ µg/OD'│ Mr ║
╠═══════╪════════╪════════╪════════╪══════╣
║ Upper │
69.6│
2.59│
31.8│ 12278║
║ Lower │
70.7│
3.15│
30.0│ 9539║
╚═════════════════════════════════════════╝
U_TP53_1:
CAGGCAAAGTCATAGAACCATTTTCATGCTCTCTTTAACA
L_TP53_1:
GAAGAGAATGGGCAGGTGAGCGGTGAGACA
OPTIMAL ANNEALING TEMP.: 62.1°
Product length: 2103 bp; 51.1% GC
Upper:3880 (30) ->------Lower:5946 (37) -------<╔═══════╤════════╤════════╤════════╤══════╗
║ Oligo │ Tm [°C]│ nmol/OD│ µg/OD'│ Mr ║
╠═══════╪════════╪════════╪════════╪══════╣
║ Upper │
70.4│
3.65│
32.9│ 8994║
║ Lower │
69.3│
2.74│
31.1│ 11360║
╚═════════════════════════════════════════╝
U_TP53_2:
ACTCCCCATCCTCCTCCCCACAACAAAACA
L_TP53_2:
AGCCAACATGGTGAAACCCCGTCTCTACTAAAATACA
Группы крови ABO
13