Молекулярная биология Скоблов Михаил Юрьевич Лекция 1
реклама
Молекулярная биология Лекция 1. Введение в курс. Скоблов Михаил Юрьевич Часть 1. Что изучает молекулярная биология?…. Что изучает молекулярная биология? Молекулярная биология изучает связь между генетической информацией и признаками организма, которые реализуются с помощью белков. Основными процессами, которые исследуются данным разделом генетики, являются репликация, транскрипция и трансляция. Именно благодаря им происходит передача и реализация наследственной информации, и потомки получают те же признаки, что и родители. Что изучает молекулярная биология? Объект – живые организмы: многоклеточные эукариотические вирусы Клетка Что и как в ней работает? - одноклеточные прокариотические Состав клетки Неорганические • • Вода – 75-85% Неорганические соли, кислоты – 1-1,5% Вещества в клетке Органические Малые молекулы Биополимеры • Моносахариды (макромолекулы) • Аминокислоты • Полисахариды 0,5% • Нуклеотиды (углеводы) - 0,2-2% • Другие • Белки - 10-20% • Липиды • Нуклеиновые (жиры) – 1-5% кислоты (ДНК, РНК) - 1-2% Методы исследования состава клетки • Неорганические вещества • Малые органические молекулы • • • • Хроматография Спектрометрия Масс-спектрометрия Рентгеноструктурный анализ • • Хроматография Спектрометрия • Липиды • • • Полисахариды • Белки • • Нуклеиновые кислоты • • • • Полимеразноцепная реакция Секвенирование Гибридизация Электрофорез Ультрацентрифуги рование • • • • • Хроматография Массспектрометрия Иммунологические Секвенирование Рентгеноструктурн ый анализ Электрофорез Ультрацентрифугир ование Белки – классический (любимый) объект молекулярной биологии… Оказалось, что их очень много и они очень разные Они состоят из разных элементов вторичных структур Они определяют миллионы взаимодействий, образуя генные сети… 1957 г. Центральная догма молекулярной биологии. Francis Crick Самые часто используемые методы исследования природных биомолекул • ДНК – секвенирование • РНК – секвенирование • Белок – секвенирование, масспектрометрия А где гены? У каждого живого организма есть наследственный материал Есть свои гены Историческая справка 1906 г: термин «генетика» 1865 г: «наследственные признаки» содержащиеся в половых клетках Уильям Бэтсон Грегор Иоганн Мендель 1909 г: термин «ген» Вильгельм Людвиг Иогансен Определения понятия «ген» Ген — структурная и функциональная единица наследственности живых организмов Ген — это структурная и функциональная единица наследственности, контролирующая образование какого-либо признака, представляющая собой отрезок молекулы дезоксирибонуклеиновой кислоты Ген - участок молекулы ДНК (в некоторых случаях РНК), в котором закодирована информация о биосинтезе одной полипептидной цепи с определенной аминокислотной последовательностью История определения гена • Определение 1860 – 1900х: «Ген – это дискретная единица наследственности» (Wilhelm Johannsen) • Определение 1910х: «Ген – это отдельный локус» (Thomas Hunt Morgan) • Определение 1940х: «Ген – это чертеж белка» (Beadle and Tatum) • Определение 1950х: «Ген – это физическая молекула» (Griffith) • Определение 1960х: «Ген – это транскрибируемый код» (Watson and Crick) • Определение 1970х-1980х: «Ген – это открытая рамка считывания (open reading frame – ORF) части последовательности» (Doolittle) Гены находятся на хромосоме Найти ген – значит картировать РНК на ДНК, проанатировать эту последовательность. Биоинформатика B-cell neoplasia associated gene with multiple splicing (BCMS): the candidate BCLL gene on 13q14 comprises more than 560 kb covering all critical regions. Wolf S. et al., Human Molecular Genetics, 2001 Определение гена 2000х: «Аннотированная структурная единица генома, зарегистрированная в одной из баз данных» p53 p53 Структура гена р53 и кодирующие изоформы p53 Современное определение гена формулируется так: «Ген – это совокупность геномных последовательностей, кодирующих сцепленный набор потенциально перекрывающихся функциональных продуктов». В нем не упоминаются сложные аспекты регуляции и транскрипции и утверждается, что с одним геном могут быть ассоциированы группы функциональных продуктов гена (а не промежуточные транскрипты). Количество генов человека в базе данных Gene 50000 45000 40000 35000 30000 25000 20000 15000 10000 5000 0 9277 в ручную аннотированных генов продуцируемых 14,880 транскриптов 1957 г. Центральная догма молекулярной биологии. Francis Crick Транскриптом совокупность всех транскриптов, синтезируемых одной клеткой или группой клеток, включая мРНК и некодирующие РНК Белок-кодирующие РНК Белок-некодирующие РНК 80% генома человека 1,5% генома человека Малые: • miRNA • rasiRNA • piRNA • …. Большие: • antisense • pseudogenes • regulatory • …. Классическая структура мРНК эукариот 5’ UTR CDS 3’UTR polyA CAP Регуляция трансляции Регуляция транскрипции Экспериментатор получает нуклеотидную последовательность транскрипта (РНК)…. Определение кодирующего потенциала РНК происходит с помощью биоинформатического анализа. Критерии трансляции: 1. Кодирующая рамка более 300 нуклеотидов 2. Консервативность аминокислотной последовательности 3. Удовлетворять условию NMD. Экспериментальная проверка – очень долгий путь…. ~40% случаев изменений концентрации белка может быть объяснено за счет знания о количестве mRNA Цель проекта Протеом: инвентаризация всех белков человека и выяснение взаимодействий между ними. Российская часть проекта – определение протеома 18-й хромосомы человека. Результат: из 300 белок кодирующих генов с помощью масспектрометрических подходов идентифицировано 80% белков. Парадокс количества и сложности: “Эволюционное качество” достигается не количеством генов, а их регуляцией.” Регуляторные РНК • miRNA (microRNA) • у Homo sapiens на сегодня найдено 1600 штук. • miRNA способна участвовать в регуляции тысячи генов • Экспрессия одного гена может регулироваться десятками различных miRNA. • Антисмысловые транскрипты • каждый 5 ген человека потенциально вовлечен в антисмысловую регуляцию • вопреки широко распространённому мнению антисмысловая регуляция может быть как позитивной так и негативной • Последнее может быть установлено лишь экспериментальна. Куда сегодня все движется: •Способность РНК транслироваться является одной из её возможностей, и не факт что главной • Наблюдаемый уровень экспрессии гена является совокупностью всех возможных влияний на мРНК • Мы видим результирующую, но не знаем пока о всех составляющих этой результирующей. Часть 2. Интересные примеры реализации молекулярной биологии…. Молекулярная биология – фундаментальная наука Она дала мощный толчок к появлению и развитию таких прикладных направлений в: биотехнологии генной инженерии диагностики и т.д. … Журнал "Молекулярная биология" освещает проблемы молекулярной, клеточной и компьютерной биологии, включая структурную и функциональную геномику, транскриптомику, протеомику, биоинформатику, биомедицину, молекулярную энзимологию, молекулярную вирусологию и иммунологию, теоретические основы биотехнологии, физику и физическую химию белков и нуклеиновых кислот, касается проблем молекулярной эволюции. Стоимость секвенирования генома человека 1988 3 млрд $ 2001 200’000’000 $ 2004 20’000’000 $ 2005 1’000’000 $ 2008 100’000 $ 2013 1’000 $ Sanger NGS Все начиналось с них… Nature 24 september 2009 Не только люди, но и дьяволы… Заболевание приводит к появлению на морде дьяволов больших опухолей, которые мешают животным нормально пить и питаться. Впервые рак тасманийских дьяволов был идентифицирован в 1996 году, а к настоящему моменту им заражено около 60 процентов популяции животных. Заболевание переносится непосредственно раковыми клетками, когда животные кусают друг друга или спариваются. Так как дьяволы весьма агрессивны, болезнь распространяется с высокой скоростью. Авторы новой работы расшифровали геномы двух животных - дьявола по кличке Седрик, отловленного на северо-западе Тасмании, и самку сумчатого млекопитающего Спирит, которая была найдена на юговостоке острова. Седрик долгое время считался устойчивым к раку инъекции двух линий опухолевых клеток не приводили к развитию болезни, однако после инъекции третьей линии он заболел. Животное умертвили в сентябре 2010 года. Когда специалисты обнаружили Спирит, она была при смерти из-за рака, и скончалась вскоре после того, как ее доставили в лабораторию. Ученые сравнили ДНК Спирит, Седрика и ДНК клеток раковой опухоли Спирит. Исследователи обнаружили в геноме Седрика три мутации в генах, контролирующих деление клеток. Специалисты полагают, что эти гены могут хотя бы отчасти влиять на устойчивость животных к раку. В настоящее время ученые пытаются спасти популяцию дьяволов, выращивая здоровых животных в лаборатории. Авторы новой работы показали, что генетическое разнообразие дьяволов чрезвычайно низко - оно составляет около 20 процентов от уровня генетического разнообразия людей. Резкое сокращение числа генетических вариаций стало следствием массового истребления дьяволов фермерами, которые опасались за свой скот. Колоссальный научно-технический прогресс! Как оно было Как оно стало Продолжительность >3650 дней 3 дня Стоимость 3 000 000 000 $ 2 000 $ Участники Сотни лабораторий 1 человек Качество 1 прочтение 100 прочтений Нынешняя реальность The Beijing Genomics Institute (BGI) The next generation sequencing technology platform currently has 137 Illumina HiSeq 2000, and 27 AB SOLiDTM 4.0 Systems. Of each system already has internationally recognized sequencing for DNA, small RNA, transcriptome, digital expression profiling, ChIP-Seq, DNA methylation, target region capture, metagenomics sequencing, etc.. These techniques put scientific research, practice, service and other applications as a whole, and cover most of the important area in the genome science. Its sequencing output is expected to soon surpass the equivalent of more than 15,000 human genomes per year. Применение метода массивного параллельного секвенирования Геномное • • • • Секвенирование de novo Ресеквенирование Секвенирование экзома Таргетное секвенирование • Метагеномное Транскриптомное • Исследование разнообразия (нормализованная РНК) • Исследование профиля экспрессии (количественное) • Секвенирование малых РНК (miRNA) Эпигеномное • Chip-seq (транскрипционные факторы, модифицированные гистоны) • Анализ метилирования Технологии NGS существуют всего лишь несколько лет, и активно развиваются Что будет лет через 10? Клонирование - «получение идентичных копий»… Копий – чего? Клонирование генов, фрагментов ДНК… Генетическая инжене́рия (генная инженерия) — совокупность приёмов, методов и технологий получения рекомбинантных РНК и ДНК, выделения генов из организма (клеток), осуществления манипуляций с генами и введения их в другие организмы. ПЦР Как результат: «Технология включения генов» 1. Фундаментальные исследования – исследования экспрессии генов in vivo и in vitro 2. Прикладные исследования – триумфальное шествие генномодифицированных организмов, разработка подходов генной терапии Клонирование организмов Долли. 1996г. Клонирование организмов Клонирование организмов Сиси (СС - english) от слова “copycat”… Отличия в результате: соматических мутаций, эпигенетических изменений в ДНК, влияния окружающей среды и случайных отклонений, возникающих в ходе онтогенеза Лилу, сверхсущество 200 тысяч хромосом «Технология выключения генов» The Nobel Prize in Physiology or Medicine 2006: "for their discovery of RNA interference - gene silencing by double-stranded RNA" Andrew Z. Fire & Craig C. Mello Nature 382, 713 - 716 (22 August 1996); Repression of gene expression in the embryonic germ lineage of C. elegans Geraldine Seydoux*†, Craig C. Mello‡§, Jonathan Pettitt§ , William B. Wood , James R. Priess‡ & Andrew Fire* The distinction between soma and germline was recognized more than a century ago: somatic cells form the body of an organism, whereas germ cells serve to produce future generations1. In Caenorhabditis elegans, the separation of soma and germline occurs through a series of asymmetrical divisions, in which embryonic germline blastomeres divide unequally to produce one somatic daughter and one germline daughter2. Here we show that after each asymmetrical division, embryonically transcribed RNAs are detected in somatic, but not germline, blastomeres. This asymmetry depends on the activity of the germline-specific factor, PIE-1. In the absence of PIE-1, embryonically transcribed RNAs are detected in both somatic and germline blastomeres. Furthermore, ectopic expression of PIE-1 in somatic blastomeres can significantly reduce the accumulation of new transcripts in these cells. Taken together, these results suggest that germ-cell fate depends on an inhibitory mechanism that blocks new gene expression in the early embryonic germ lineage. Как результат: 1. Фундаментальные исследования – возможность подавления экспрессии изучаемых генов, исследования их функции как in vivo и in vitro Очень успешно! - Более 50 тысяч публикаций! 2. Прикладные исследования – разработка подходов генной терапии Офтальмологические заболевания Инфекционные заболевания (гепатит, грипп, СПИД) Генетические заболевания Метаболические заболевания (Диабет II типа, ожирение) Респираторные заболевания (астма) Рак Возрастная макулярная дегенерация – первый удачный опыт. Индуцированные стволовые клетки Индуцированные стволовые клетки for the discovery that mature cells can be reprogrammed to become pluripotent
