О ВЫДЕЛЕНИИ ДНК ИЗ СЛЕДОВ РАЗЛИЧНОГО

О ВЫДЕЛЕНИИ ДНК ИЗ СЛЕДОВ РАЗЛИЧНОГО
БИОЛОГИЧЕСКОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ
С ПОМОЩЬЮ НАБОРА
QIAamp DNA Investigator (QIAGEN)
Г.В. Червоная
г. Барнаул
Методам экстракции и очистки ДНК в нашем отделении
всегда уделялось особое внимание, так как для использования ДНК в идентификационных целях необходимо, прежде всего, получить ее в достаточном количестве и чистом
виде, свободном от нуклеаз и сопутствующих примесей,
пригодной для дальнейшего идентификационного анализа.
В последний год нами апробирован и внедрен в практику
набор для выделения ДНК из образцов малых размеров и
объемов – QIAamp DNA Investigator (QIAGEN), позволяющий выделять ДНК из ничтожно малого количества биологического материла, что особенно актуально, так как экспертный материал по уголовным делам чаще представлен в
следовых количествах. Набор предназначен для выделения
и очистки суммарной (геномной и митохондриальной) ДНК
из множества образцов: буккальных соскобов, пятен сухой
крови, пятен биологических жидкостей (слюны, спермы),
жевательной резинки, сигаретных окурков, остриженных
ногтей и волос, бумаги, тканей, костей и зубов. Причем для
каждого из указанных образцов имеется индивидуальный
протокол выделения.
Набор содержит готовые к применению и тщательно оптимизированные по составу буферы и ферменты, предназначенные для лизиса исходного материала, стабилизации
нуклеиновых кислот; центрифужные колонки, содержащие
матрицу из силики, предназначенную для сорбции ДНК;
буферы и растворы для удаления примесей и элюирования
нуклеиновых кислот с носителя; дополнительные реагенты, необходимые для проведения быстрого и качественного
выделения.
312
Выделение основано на процедуре лизиса клеточных стенок с последующим связыванием ДНК с мембраной (силикой)
в миницентрифужной колонке при соответствующей ионной
силе и pH.
Ход работы с QIAamp DNA Investigator состоит из 4 этапов:
1) лизис: проба лизируется при денатурирующих условиях с
протеиназой К; 2) связывание: ДНК связывается с мембраной,
а загрязнители проходят насквозь; 3) промывка: вымываются
остаточные загрязнители; 4) элюция: очищенная концентрированная ДНК элюируется из мембраны.
ДНК, элюированная буфером ATE, сразу же готова для использования в реакции амплификации или для хранения при
температуре –20°C. Очищенная ДНК свободна от белков, нуклеаз и других ингибиторов. Процедура разработана так, чтобы обеспечить отсутствие перекрестного загрязнения от пробы
к пробе.
Наборы QIAamp DNA Investigator содержат новейший готовый к употреблению раствор протеиназы К, который поставляется в специально приготовленном буфере для хранения.
Протеиназа К стабильна в течение одного года после доставки,
даже при хранении при комнатной температуре. Набор оснащен РНК-носителем, который при необходимости может быть
добавлен в лизирующий буфер. РНК-носитель усиливает связывание ДНК мембранами колонок QIAamp MinElute, особенно при наличии незначительного количества молекул-мишеней, что значительно повышает эффективность всего процесса.
В качестве примера приводим случаи из экспертной практики, проведенные с использованием вышеуказанного набора.
В помещении магазина «Холди-дискаунтер» в г. Барнауле,
гр-н К. изнасиловал молодую девушку и пытался ее задушить.
Ошибочно полагая, что девушка мертва, он унес ее за гаражи.
Потерпевшая осталась жива, благодаря оказанной медицинской помощи, после ее обнаружения прохожими. Она была
обнаружена за гаражами в платье и без нижнего белья. Экспертами нашего отделения в содержимом влагалища потерпевшей
была обнаружена сперма. Следует отметить, что экспертам
313
ЭКЦ УВД выделить ДНК спермы из содержимого влагалища
с использованием анионообменной смолы Chelex 100 не удалось. Повторно экспертиза была назначена в судебно-биологическое отделение краевого бюро СМЭ. Из практически израсходованного материала содержимого влагалища девушки,
используя протокол выделения ДНК из вещественных доказательств сексуального насилия, позволяющий проводить процедуру дифференциального лизиса клеток для отделения сперматозоидов от возможной примеси биологического материала
потерпевшей, выделен препарат ДНК спермы с вероятностью
происхождения ее от подозреваемого К. – 99,9999999 %.
Кроме того, на лицевой передней поверхности платья девушки, в верхней части, используя высоко чувствительный тест
Seratec PSA Semiquant, обнаружены следы спермы в следовых
количествах с примесью слюны и рвотных масс (PSA тест определяет наличие простатоспецифического антигена, а не сперматозоидов, необходимых для выделения хромосомной ДНК).
Используя вышеуказанный протокол, удалось выделить два препарата ДНК: эпителиального происхождения (женской половой
принадлежности) и спермального происхождения (мужской
половой принадлежности), в достаточном для использования в
качестве амплификационной матрицы количестве. Установлено происхождение слюны и рвотных масс от потерпевшей, а
спермы – от подозреваемого К. с вероятностью 99,9999999%,
что позволило следствию сделать вывод о совершении полового акта и в извращенной форме – ротовую полость.
При прохождении пограничного контроля на контрольнопропускном пункте «Кулунда» федеральной трассы Алейск
– Павлодар, в сумке, принадлежащей гр-ну Узбекистана И.,
было обнаружено и изъято наркотическое средство. В ходе
проведения оперативно-розыскных мероприятий в наркотическом средстве был найден фрагмент волоса длиной 6,5 см.
Экспертом биологом установлено, что волос происходит с
головы человека и содержит единичные фрагменты влагалищных оболочек. Применяя протокол выделения ДНК из волос,
из объекта-улики выделен препарат ДНК мужской половой
314
принадлежности. В качестве объекта сравнения исследовался
волос с головы гр-на И.. Проведение идентификационного анализа позволило высказаться о происхождении волоса, изъятого
в наркотическом средстве, с головы гр-на И. с вероятностью
99,9999999 %.
За период использования набора нами проведено более 120
исследований биологического материла самого различного происхождения и степени сохранности. И практически во всех случаях было осуществлено качественное экстрагирование ДНК
с успешным последующим ее типированием с помощью ПЦР.
В большинстве случаев исследовалось ничтожно малое количество биологического материала, вплоть до единичных клеток. Принцип высаждения ДНК на сорбенте, запрессованном
в микроколонку, и использование нескольких стадий отмывки
сорбента с локализованной на его поверхности ДНК органическими растворителями, позволил эффективно очищать ДНК
от сопутствующих ей белков и посторонних примесей, избавляться от прежде неустранимого влияния предмета-носителя,
что особенно актуально при исследовании вещественных доказательств сильно загрязненных, гнилостно измененных, окрашенных агрессивными красителями. Положительные результаты были получены при выделении ДНК из костной ткани, даже
с выраженными признаками термического воздействия.
Опыт показал, что набор QIAamp DNA Investigator позволяет получить высокомолекулярный препарат ДНК высокой
чистоты, пригодный для дальнейшего идентификационного
анализа из различного биологического материала малых объемов и размеров, процедура полностью стандартизирована и
проста в исполнении, компонентный состав набора тщательно
оптимизирован для работы со строго определённым типом исходного материала, набор обладает небольшой токсичностью,
гарантированный срок его хранения 1 год. Все это позволяет
использовать его в повседневной работе судебно-медицинских
экспертов молекулярно-генетических лабораторий.