022506 B1 022506 B1 (11) 022506

Евразийское
патентное
ведомство
(19)
(11)
022506
(13)
B1
(12)
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОМУ ПАТЕНТУ
(45)
Дата публикации и выдачи патента
(51) Int. Cl. G01J 3/00 (2006.01)
2016.01.29
(21)
Номер заявки
201070765
(22)
Дата подачи заявки
2008.12.19
(54)
АНАЛИЗ ЧАСТИЦ В АКУСТИЧЕСКОМ ЦИТОМЕТРЕ
B1
(72)
Изобретатель:
(74)
Представитель:
(57)
Здесь предусмотрены способы разделения частиц по размеру, способы содержат этапы, на которых
обеспечивают протекание частиц в струе потока; прилагают радиальное давление акустического
излучения к струе потока и акустически разделяют частицы по размеру. Также раскрыты устройства
для осуществления этих способов.
Кадучак Грегори, Уорд Майкл Д. (US)
Медведев В.Н. (RU)
B1
022506
(56) US-B1-6881314
US-A-5396588
US-B2-7052864
022506
(31) 61/008,422; 12/283,461; 12/283,491
(32) 2007.12.19; 2008.09.11; 2008.09.11
(33) US
(43) 2010.12.30
(86) PCT/US2008/087579
(87) WO 2009/086043 2009.07.09
(71)(73) Заявитель и патентовладелец:
ЛОС АЛАМОС НЭШНЛ
СЕКЬЮРИТИ, ЭлЭлСи (US)
022506
Ссылки на родственные заявки
По настоящей заявке испрашивается приоритет по предварительной патентной заявке США №
61/008422, поданной 19 декабря 2007 г., патентной заявке США № 12/283461, поданной 11 сентября 2008 г., и
патентной заявке США № 12/283491, поданной 11 сентября 2008 г., которые полностью включены в настоящее описание посредством ссылки.
Область техники
Настоящее изобретение относится, в целом, к области анализа частиц. Изобретение также относится, в целом, к цитометрам и акустике.
Уровень техники
В процессе развития проточной цитометрии было обнаружено, что угловая зависимость интенсивности света, рассеиваемого на частице, содержит много информации о состоянии, относящейся к внутренним и внешним свойствам частицы. Например, Mullaney и др. экспериментально продемонстрировали использование прямого рассеяния света от около 0,5 до около 2° для оценивания размера клетки. В
тот же период времени было обнаружено, что ориентация клетки относительно падающего светового
луча может вносить артефакты, влияющие на разрешение по заселенности и чувствительность инструмента для частиц, не обладающих осевой симметрией, параллельной направлению потока. Loken и др.
показали, что несферические частицы в форме фиксированных куриных эритроцитов дают бимодальное
распределение рассеяния, которое связано с боковым или фронтальным освещением структуры дискообразной клетки. Также были продемонстрированы эффекты рассеяния, зависящие от ориентации частиц,
обусловленные нарушениями симметрии, которые проявляются в сложной геометрической форме сперматозоидов. Некоторые исследователи предложили пассивные решения относительно ориентации частиц
за счет формирования форсунки для образца для внесения нарушений симметрии в поле скоростей потока системы гидродинамической оболочки. Было показано, что наиболее важным аспектом эффективного
разделения сперматозоидов X и Y при цитометрической сортировке потока является ориентация сперматозоида в плоскости оптического рассеяния. В последнее время новые геометрические формы форсунки
продемонстрировали правильную ориентацию до 60% головок сперматозоидов в плоскости оптического
рассеяния при скоростях анализа около 2000 частиц/с, что сильно влияет на эффективность сортировки.
Другие исследователи определяли нарушения симметрии частиц, собирая данные по большому массиву
углов рассеяния с использованием сканирующей проточной цитометрии (SFC) ценой снижения скорости
анализа частиц (около 400 частиц/с). Системы продемонстрировали непрерывные угловые данные рассеяния в пределах 70°, но данные берутся относительно произвольной ориентации частиц, что приводит
к большому разбросу полученных угловых спектров для асимметричных частиц.
Одна из наиболее ранних крупномасштабных демонстраций разделения биологических клеток с использованием акустических сил была произведена Doblhoff и др. В этой системе давление акустического
излучения использовали для избирательного удержания жизнеспособных клеток гибридомы в целях удаления нежизнеспособных клеток и более мелких продуктов распада клеток из 20-литрового биореактора.
Эта система базируется на конструкции многоплоскостного преобразователя и демонстрирует степень
удержания жизнеспособных клеток на уровне 99,5% при переменных результатах для удаления продуктов распада клеток. Более ранние системы требовали подвода большой мощности, обычно свыше 15 Вт,
в связи с чем необходим блок охлаждения для преобразователей возбуждения. Недавно, Feke с сотрудниками разработали новую стратегию разделения частиц, которая опирается на давление акустического
излучения и вторичные акустические силы. Высокопористая полиэфирная сетка (размер поры на два порядка величины больше размера частицы) в стоячей акустической волне служит собирающей матрицей,
благодаря чему частицы в узлах волны захватываются сеткой, и вторичные акустические силы формируют агломераты частиц и приводят к возникновению силы притяжения на поверхности сетки. В аналогичной демонстрации удержания клеток гибридомы была достигнута эффективность удержания около
95% с пренебрежимо малым влиянием на жизнеспособность клеток. С помощью этой системы удалось
достигнуть высокой концентрации клеток, около 1,5×108 клеток/мл при входной мощности порядка сотен милливатт.
Сущность изобретения
Вариант осуществления настоящего изобретения содержит аппарат, который акустически манипулирует частицей и останавливает поток частицы. Этот аппарат предпочтительно содержит капилляр для
протекания жидкости, содержащей частицы, преобразователь, создающий акустический сигнал, акустически манипулирующий частицей, и устройство остановки потока. Устройство остановки потока предпочтительно представляет собой насос или один или несколько клапанов. Этот вариант осуществления
может содержать сортировщик частиц, фракционизатор частиц и/или проточный цитометр. Этот вариант
осуществления может дополнительно содержать анализатор для анализа частицы и/или формирователь
изображения.
Один вариант осуществления настоящего изобретения содержит способ для акустической манипуляции одной или несколькими частицами. Этот вариант осуществления предпочтительно включает в себя этапы, на которых обеспечивают протекание жидкости, содержащей частицы, прикладывают давление
-1-
022506
акустического излучения к жидкости и акустически манипулируют одной или несколькими частицами,
останавливают жидкость, и наблюдают по меньшей мере одну из частиц. В этом варианте осуществления
настоящего изобретения наблюдение по меньшей мере одной из частиц может включать в себя этапы, на
которых анализируют по меньшей мере одну из частиц и/или сортируют по меньшей мере одну из частиц. Также можно обеспечивать протекание частиц через проточный цитометр.
Другой вариант осуществления настоящего изобретения содержит аппарат, который акустически
манипулирует частицей и обращает поток частицы. Этот аппарат предпочтительно включает в себя капилляр для протекания жидкости, содержащей частицы, преобразователь, создающий акустический сигнал, акустически манипулирующий частицей, и устройство обращения потока. Устройство обращения
потока предпочтительно содержит насос и/или один или несколько клапанов. Аппарат в соответствии с
этим вариантом осуществления может дополнительно содержать анализатор для анализа частицы и/или
формирователь изображения. Аппарат в соответствии с этим вариантом осуществления может в необязательном порядке содержать сортировщик, фракционизатор и/или проточный цитометр.
Другой вариант осуществления настоящего изобретения содержит способ акустической манипуляции одной или несколькими частицами. Этот вариант осуществления включает в себя этапы, на которых
обеспечивают протекание жидкости, содержащей частицы, прикладывают давление акустического излучения к жидкости и акустически манипулируют одной или несколькими частицами, обращают направление потока и наблюдают по меньшей мере одну из частиц, которые были обращены в потоке. В этом варианте осуществления обращение частиц может содержать этапы, на которых анализируют по меньшей
мере одну из частиц и/или сортируют по меньшей мере одну из частиц. Этот вариант осуществления
также может включать в себя этап, на котором обеспечивают протекание жидкости через проточный цитометр.
Еще один вариант осуществления настоящего изобретения содержит аппарат, который акустически
выравнивает и ориентирует частицу в струе потока. Этот аппарат предпочтительно содержит капилляр
для протекания жидкости, содержащей частицы, преобразователь, создающий акустический сигнал, акустически манипулирующий, выравнивающий и ориентирующий частицу, и анализатор частиц. Аппарат в
соответствии с этим вариантом осуществления предпочтительно содержит проточный цитометр, фракционизатор частиц и/или сортировщик частиц, причем сортировщик сортирует частицу на основании
размера. Аппарат может в необязательном порядке включать в себя формирователь изображения. Преобразователь, создающий акустический сигнал, в соответствии с этим вариантом осуществления предпочтительно выравнивает частицы в любом полярном направлении вокруг оси потока или выравнивает частицу в направлении потока. Частица в соответствии с этим вариантом осуществления может представлять собой эритроцит, тромбоцит или сперматозоид.
Еще один вариант осуществления настоящего изобретения содержит способ акустического выравнивания и ориентации частиц в струе потока анализатора частиц, содержащий этапы, на которых обеспечивают протекание частиц в струе потока, подвергают частицы давлению акустического излучения, акустически выравнивают частицы в струе потока анализатора частиц, и акустически ориентируют частицы
в струе потока анализатора частиц. В этом варианте осуществления анализатор частиц может быть проточным цитометром. Этот способ также может включать в себя поле, не обладающее осевой симметрией,
в котором частицы являются асимметричными. Кроме того, этот вариант осуществления, в необязательном порядке, содержит этап, на котором выбирают заранее определенную ориентацию частиц, причем
ориентация находится в плоскости оптического рассеяния. Этот вариант осуществления может содержать этап, на котором различают разные типы частиц на основании нарушений симметрии частиц. Этот
вариант осуществления может дополнительно содержать этапы, на которых обеспечивают повторяемые
ориентации кластеров частиц или сортируют частицы. Сортировка частиц может включать в себя этап,
на котором осуществляют оперативный предварительный анализ для разделения частиц на основании
размера. Кроме того, этот вариант осуществления может выравнивать частицы в полярном направлении
вокруг оси потока или выравнивать частицы в направлении потока. Кроме того, этот вариант осуществления может, в необязательном порядке, содержать этап, на котором фракционируют частицы. В этом
варианте осуществления частица может представлять собой эритроцит, тромбоцит или сперматозоид.
Один вариант осуществления настоящего изобретения содержит аппарат, который анализирует частицу. Аппарат в соответствии с этим вариантом осуществления предпочтительно содержит капилляр для
протекания жидкости, содержащей частицы, преобразователь, создающий радиальный акустический
сигнал, который акустически ориентирует не обладающие осевой симметрией частицы в капилляре, устройство переноса, которое переносит частицы через точку опроса, и анализатор частиц. В этом варианте
осуществления преобразователь, создающий радиальный акустический сигнал, предпочтительно выравнивает частицу в капилляре и концентрирует частицы в капилляре. Преобразователь, создающий радиальный акустический сигнал, также может создавать акустическое поле, которое выравнивает частицу.
Этот вариант осуществления также может, в необязательном порядке, включать в себя гидродинамическую оболочку, которая выравнивает частицу. Аппарат в соответствии с этим вариантом осуществления
может дополнительно содержать формирователь изображения.
Другой вариант осуществления настоящего изобретения содержит способ анализа частиц в анали-2-
022506
заторе частиц. Этот способ предпочтительно содержит этапы, на которых обеспечивают протекание частиц в струе потока, прилагают радиальное давление акустического излучения к струе потока, акустически ориентируют не обладающие осевой симметрией частицы в струе потока, переносят частицы через
точку опроса и анализируют частицы. Этот вариант осуществления также может включать в себя этап, на
котором выравнивают частицы в струе потока с помощью либо акустического поля, либо гидродинамического фокуса. Этот способ также предпочтительно содержит этап, на котором концентрируют частицы
в струе потока.
Другой вариант осуществления настоящего изобретения содержит аппарат, который анализирует
частицу в жидкости. Аппарат в соответствии с этим вариантом осуществления предпочтительно содержит капилляр для протекания жидкости, содержащей частицы, преобразователь, создающий акустический сигнал, который акустически поддерживает фокус частиц в капилляре независимо от скорости потока, и анализатор частиц для анализа частицы. Этот аппарат может дополнительно содержать устройство остановки потока и/или устройство обращения потока. Аппарат в соответствии с этим вариантом
осуществления также предпочтительно содержит формирователь изображения.
Еще один вариант осуществления настоящего изобретения содержит способ анализа одной или нескольких частиц в струе потока. Этот вариант осуществления предпочтительно содержит этапы, на которых маркируют частицы лантаноидом, обеспечивают протекание частиц в струе потока, прилагают давление акустического излучения к струе потока для поддержания фокуса частиц независимо от скорости
потока и анализируют частицы с лантаноидом. Этот вариант осуществления также может включать в
себя этап, на котором останавливают и/или обращают струю потока.
Еще один вариант осуществления настоящего изобретения содержит аппарат, который сортирует
частицы по размеру. Этот аппарат предпочтительно содержит капилляр для протекания жидкости, содержащей частицы, и преобразователь, создающий радиальный акустический сигнал, акустически сортирующий и разделяющий частицы в капилляре по размеру. Этот вариант осуществления может дополнительно содержать проточный цитометр и/или анализатор частиц и/или формирователь изображения.
Аппарат также предпочтительно содержит сортировщик частиц.
Дополнительный вариант осуществления настоящего изобретения содержит способ сортировки частиц по размеру. Этот способ предпочтительно содержит этапы, на которых обеспечивают протекание
частиц в струе потока, прилагают радиальное давление акустического излучения к струе потока и акустически сортируют и разделяют частицы по размеру. Этот способ также предпочтительно содержит
этап, на котором переносят более крупные частицы из разделенных частиц в проточный цитометр и анализируют более крупные частицы. На этапе переноса этого варианта осуществления предпочтительно
переносить более крупные зависимые частицы к центральной оси струи потока. Этот вариант осуществления также предпочтительно содержит оперативную сортировку.
Краткое описание чертежей
Прилагаемые чертежи, входящие в состав и образующие часть описания изобретения, иллюстрируют один или несколько вариантов осуществления настоящего изобретения и совместно с описанием
служат для пояснения принципов изобретения. Чертежи предназначены только для иллюстрации одного
или нескольких предпочтительных вариантов осуществления изобретения и не призваны ограничивать
изобретение.
На чертежах
фиг. 1 - вариант осуществления настоящего изобретения, иллюстрирующий капилляр линейного
возбуждения, где частицы акустически фокусируются на центральную ось капилляра;
фиг. 2А - график плотности потенциала акустической силы в поперечном сечении круглого капилляра, возбуждаемого линейным источником согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения;
фиг. 2В - принудительное вращение частицы с целью ее размещения в плоскости устойчивого равновесия согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения;
фиг. 3 - вариант осуществления настоящего изобретения, иллюстрирующий линейно возбуждаемый
акустический фракционизатор, где крупные частицы переносятся к оси капилляра, а более мелкие частицы не подвергаются воздействию акустического поля;
фиг. 4А и 4В - поток частиц через капилляр в произвольной ориентации в отсутствие акустического
поля с последующим выравниванием частиц с осью капилляра при возбуждении акустического поля согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения;
фиг. 5А-5С - избирательное фракционирование частиц размером около 1 пм и около 10 пм в капилляре линейного возбуждения согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения;
фиг. 6 - вариант осуществления настоящего изобретения, иллюстрирующий ввод образца в проточный цитометр, где образец концентрируется с сокращением его объема и, таким образом, сокращением
времени анализа в применениях проточной цитометрии.
Подробное описание иллюстративных вариантов осуществления
Употребление единственного числа означает один или несколько.
Используемый здесь термин "капилляр" означает проточный канал или камеру, имеющий(ую) фор-3-
022506
му, выбранную из прямоугольной, эллиптической, овальной, круглой, восьмиугольной, семиугольной,
шестиугольной, пятиугольной и треугольной.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения давление акустического излучения предпочтительно фокусирует частицы к центру капилляра. Этот вариант осуществления позволяет в корне
изменить способ анализа или обработки отдельных клеток или частиц в струе потока. Этот вариант осуществления подачи образца расширяет возможности анализа проточной цитометрии за счет улучшения
анализа и/или предварительного анализа при подготовке и очистке образца.
На фиг. 1 показан неограничительный вариант осуществления устройства акустической фокусировки частиц. Это устройство предпочтительно содержит акустически возбуждаемый капилляр 10, где акустическая ловушка для частиц, ориентированная параллельно направлению потока, содержит линейный
источник 12 и жидкость 18 с частицами/клетками 16. Этот вариант осуществления позволяет удалять
высокоскоростной оболочечный поток, связанный с гидродинамической фокусировкой, и допускает увеличение времени прохождения частиц в области оптического опроса одновременно с поддержанием высокой скорости анализа частиц благодаря присущему ему эффекту оперативного сосредоточения частиц.
Кроме того, акустическая фокусировка струи частиц обеспечивает возможность останавливать и обращать направление потока без дефокусировки струи частиц, в то же время, поддерживая регистрацию частиц. Увеличение времени прохождения частиц дает возможность осуществлять высокочувствительные
оптические измерения с использованием маломощных источников света и менее чувствительных оптических компонентов. Управление направлением и скоростью потока позволяет повторно анализировать
цели высокой важности и, таким образом, минимизировать неопределенности в данных рассеяния, связанных с флуктуациями системного уровня.
Дополнительное свойство акустически возбуждаемой проточной камеры состоит в возможности создания не обладающего осевой симметрией силового поля в струе потока. Нарушения симметрии силы в
проточной камере ориентируют несферические клетки или частицы таким образом, что согласованные
сигнатуры рассеяния, которые обычно невозможны в стандартных системах гидродинамического потока,
можно создавать, размещая асимметричные частицы в заранее определенной ориентации в плоскости
оптического рассеяния. В этом варианте осуществления оптические данные рассеяния, связанные с конкретной ориентацией частиц, позволяют, например, различать разные типы бактерий на основании нарушений симметрии частиц и улучшать анализ и сортировку необычных типов клеток, например эритроцитов и сперматозоидов. Асимметричное силовое поле также может порождать повторяемые ориентации
кластеров частиц, которые образуются в результате объединения множественных микросфер или клеток,
например "гантелеобразные" формы, обусловленные агглютинацией двух частиц. Различение кластеров
частиц можно облегчать за счет анализа формы импульсов и интерпретации углового рассеяния благодаря уникальной вынужденной ориентации кластера относительно плоскости рассеяния, например вынужденная ориентация может приводить к тому, что центральная ось "гантели" располагается параллельно
оси потока.
Капилляр с акустическим линейным возбуждением согласно варианту осуществления настоящего
изобретения может обеспечивать новые режимы анализа частиц и клеток для системы обнаружения проточного цитометра и может быть реализован в разделении частиц или клеток для оперативной подготовки образца. Основное преимущество давления акустического излучения состоит в том, что его можно
использовать в достаточно больших камерах с высоким объемным расходом. Акустическое поле действует аналогично на большинство биологических частиц и, таким образом, обладает внутренней несферичностью, благодаря чему большинство биологических частиц переносится в одно и то же место в пространстве. Однако величина поля сильно зависит от размера, благодаря чему давление акустического
излучения весьма пригодно в применениях, которые требуют высокой скорости потока, осуществления
оперативного предварительного анализа для разделения частиц на основании размера, например, сперматозоидов от вагинальных клеток в судебном анализе, вирусов от бактерий или неповрежденных клеток
от продуктов распада клеток. В вышеприведенном описании капилляр линейного возбуждения с цилиндрической геометрией можно использовать в качестве устройства акустической фокусировки, но устройства обычной геометрии (квадратной, прямоугольной, эллиптической, овальной и т.д.), которые используют давление акустического излучения для позиционирования частиц, можно использовать в применениях разделения частиц, удаления продуктов распада, выравнивания частиц и очистки образца.
Давление акустического излучения
Сила, действующая на частицу, обусловленная давлением акустического излучения, зависит от частоты возбуждения, амплитуды давления в среде и контрастности плотности/сжимаемости между частицей и средой-носителем. В стоячей акустической волне существует усредненная по времени отклоняющая сила, которая переносит частицы в положение узла или пучности. Потенциал U силы акустического
излучения, действующей на сферическую частицу в стоячей акустической волне, выражается в виде
Здесь α - радиус частицы, β0 - сжимаемость окружающей жидкости и ρ0 - плотность окружающей
-4-
022506
жидкости. Давление и скорость акустического поля в отсутствие частицы обозначены ρ и v соответственно, и скобки соответствуют величине, усредненной по времени. Коэффициенты f1 и f2 - это коэффициенты контрастности, определяющие, насколько механические свойства частицы отличаются от фоновой среды. Они задаются в виде
Нижний индекс ρ соответствует внутренним свойствам частицы. Сила F, действующая на частицу,
связана с градиентом потенциала силы
Частицы предпочтительно находятся в положениях, где потенциал U демонстрирует минимум. Для
капилляра круглого поперечного сечения минимум потенциала совпадает с осью капилляра, образуя ловушку для частиц на фиг. 1 при возбуждении в дипольном режиме. Существуют другие режимы, предпочтительные для пространственного позиционирования частиц вне оси капилляра для некоторых применений.
Капилляр с акустическим линейным возбуждением
Силы, обусловленные давлением акустического излучения, предпочтительны в качестве эффективного средства размещения частиц в конфигурации, аналогичной гидродинамической фокусировке без
необходимости в оболочечных жидкостях. Капилляр линейного возбуждения, соответствующий настоящему изобретению, может быть эффективной заменой оболочки. Капилляр с апертурой источника, превышающей линейный контакт, может давать аналогичные результаты. Этот вариант осуществления демонстрирует акустически возбуждаемые капилляры с апертурами источника, имеющими большую длину
контакта по окружности капилляра, которая охватывает более чем около 45°. Его можно построить из
капилляра, возбуждаемого пьезокерамическим источником, контактирующим с его внешней стенкой.
Вибрация структуры создает локализованный узел давления вдоль центральной оси, где сформирована
аксиальная ловушка для частиц. Схема этого устройства приведена на фиг. 1. Частицы в разведенной
взвеси поступают в устройство сверху и испытывают действие радиальной силы, которая переносит их к
узлу давления по мере их протекания через систему. Согласно варианту осуществления настоящего изобретения частицы, содержащиеся в образце, одновременно концентрируются и выравниваются друг за
другом, поскольку они затем переносятся через лазер опроса. Частицы переносятся через лазер опроса
различными устройствами переноса, включая, но без ограничения, насос и/или один или несколько клапанов.
Реализация акустической фокусировки частиц предпочтительно позволяет развивать новые методы
и способы проточной цитометрии благодаря коренным изменениям в позиционировании частиц в клетке
образца. Концентрические струи потока с разными скоростями течения не требуются в отличие от традиционных оболочечных систем гидродинамической фокусировки. Акустически фокусируемые струи
образца можно останавливать, замедлять, обращать или проводить комбинацию таких действий, не
ухудшая выравнивание струи частиц в проточной камере. Увеличенное время нахождения в акустическом поле обеспечивает протекание частиц с фактически улучшенной фокусировкой. Кроме того, поток
можно обращать без неблагоприятных последствий для выравнивания частиц в проточной камере, что
позволяет повторно анализировать редкие цели, или останавливать для углубленного анализа, например
спектрального разложения сигнатуры рассеяния/флуоресценции.
Одной из уникальных возможностей потока согласно настоящему изобретению может быть способность выбирать скорость подачи образца. Сокращение времени прохождения клеток/частиц, например, примерно в 20-100 раз по сравнению с традиционными системами позволяет обеспечить оптические
измерения более высокой чувствительности и измерять фотонные события, требующие увеличенного
времени опроса, например люминесценцию.
Ориентация частиц в поле стоячей акустической волны
Известная ориентация частицы при ее прохождении через область опроса позволяет измерять рассеяние света или флуоресценцию или оба эти явления, что обеспечивает углубленное понимание клеточной структуры и внутренних оптических свойств. Устранение нескольких вращательных степеней свободы обеспечивает очень полезный инструмент для проточной цитометрии благодаря увеличению значения текущего измеренного рассеяния света за счет их калибровки относительно конкретной ориентации клетки/частицы и возможности адекватного рассмотрения новых углов рассеяния в качестве измеряемых параметров. Капилляр с акустическим линейным возбуждением, соответствующий настоящему
изобретению, и другие способы введения давления акустического излучения в клетку в потоке являются
активным средством вращения и выравнивания частиц как в направлении потока, так и в полярных направлениях вокруг оси потока для обеспечения угловых калиброванных данных рассеяния для несферических частиц. Сила, действующая на частицу в акустически возбуждаемой трубке, обычно не обладает
осевой симметрией в поперечном сечении плоскости потока. Распределение акустической силы является
-5-
022506
дипольным по природе для фокусировки частиц к оси трубки, обеспечивая зеркальную симметрию силы
в плоскости. Вычисление потенциала U акустической силы для частицы в линейно возбуждаемой трубке
в дипольном режиме в порядке одного примера этого способа показано на фиг. 2А, где акустическую
силу Fu можно получить по формуле
Поток направлен на тонкий лист. Потенциал силы в плоскости обладает зеркальной симметрией относительно двух плоскостей, пересекающих центральную ось. Первая плоскость симметрии пересекает
центральную ось 20 и линейный возбудитель 22, и вторая плоскость симметрии перпендикулярна первой. Хотя существует две плоскости симметрии в отображаемом двухмерном потенциале акустической
силы, только одна из них дает положение устойчивого равновесия 24 в отношении вращения частицы.
Все правильные частицы будут быстро поворачиваться, возвращаясь в положение устойчивого равновесия 24 при малых возмущениях в поле потока, как показано на фиг. 2B.
Добавление третьего измерения в расчет силового поля (аксиальный компонент) налагает дополнительное ограничение на вращательные степени свободы частицы, индуцированные акустическим силовым полем. Расчеты показывают, что стержнеобразные частицы (частицы с двумя одинаковыми малыми
осями и одной главной осью) обычно выравнивают свою главную ось с осью капилляра. Частицы с двусторонней симметрией, например эритроциты, обычно выравнивают одну главную ось параллельно оси
потока и другую главную ось параллельно неподвижной плоскости симметрии, обозначенной белой
пунктирной линией на фиг. 2А.
Акустическое разделение клеток и продуктов распада клеток
Для обеспечения переноса частиц в акустически возбуждаемой камере согласно одному варианту
осуществления настоящего изобретения акустическая сила должна быть достаточно велика для преодоления броуновского движения частиц в подвешивающей среде. Величина силы давления акустического
излучения, действующей на частицу, прямо пропорциональна объему частицы, уровню возбуждения
акустического поля, механическим свойствам среды и частицы и пространственному градиенту акустического поля. По этой причине (в силу кубической зависимости от радиуса частицы) более крупные частицы могут переноситься в акустическом поле при более низких амплитудах давления и частотах возбуждения (меньших градиентах), чем более мелкие частицы. Это обычно справедливо для частиц, имеющих также более высокую относительную разность механических свойств относительно фоновой среды.
Один аспект одного варианта осуществления системы акустического разделения настоящего изобретения состоит в том, что она может работать без засорения (без фильтра) с почти нулевым перепадом
давления на блоке. В силу зависимости от размера, присущей силе акустического излучения и тепловому
движению частицы, вариант осуществления настоящего изобретения может разделять образцы на переднем конце струи потока на основании размера частицы и механической контрастности. Акустические
силы используются для очистки образцов путем концентрации интересующих аналитов в указанном положении для избирательного сбора, оставляя фоновые продукты распада неизменными. Такая система
сокращает время анализа для образцов с высоким содержанием фоновых частиц на проточном цитометре
благодаря значительному снижению отсчета частиц и повышению качества данных. Например, Bossuyt
показал, что продукты распада клеток в образцах цельной крови, подготовленными некоторыми способами лизиса, могут обеспечивать события рассеяния, которые составляют до 80% всех событий при отсчете клеток CD45 на проточном цитометре. Macey указывает, что некоторые способы лизиса цельной
крови для подготовки лимфоцитов для проточного цитометрического анализа могут приводить к низкому разрешению прямого и бокового рассеяния в силу присутствия остаточных фрагментов клеток. В одном варианте осуществления настоящего изобретения устройство оперативной очистки, например капилляр линейного возбуждения, расположенный непосредственно перед входом для образцов проточного цитометра, как показано на фиг. 3, используется для переноса крупных частиц 30, представляющих
интерес, например лимфоцитов, к центральной оси 32 струи образца, тогда как более мелкие частицы 34,
например продукты распада клеток и белки, содержащиеся в лизате, остаются нетронутыми. Это особенно справедливо для продуктов распада клеток с меньшей механической контрастностью, чем частицы,
представляющие интерес. Затем сердцевина струи образца направляется в проточный цитометр, а оставшийся лизат выбрасывается для устранения большой концентрации частиц из образца. Заметим, что этот
способ подготовки образца можно использовать как этап очистки образца для любого типа анализа частиц/клеток, где предпочтительно снижать отсчет фоновых частиц.
Ориентация частиц в поле стоячей акустической волны
Пример 1.
Для демонстрации влияния акустического поля на обеспечение определенной ориентации частиц
были проведены эксперименты с использованием частиц с аспектным отношением больше единицы и
капилляра линейного возбуждения. В одном примере капилляр был выполнен из стекла и имел внутренний диаметр около 500 мкм и внешний диаметр около 1000 мкм. Акустический источник был присоединен к внешней поверхности капилляра, параллельно оси капилляра и работал на частоте около 1,78 МГц
и напряжении около 10 Врр. Взвесь углеродных волокон в виде круглого цилиндра в деионизированной
-6-
022506
воде переносилась по трубке шприцевым насосом. Затем создавали изображения частиц с помощью микроскопа. Волокна имели размер по малой оси около 8 мкм при изменяющихся размерах по главной оси.
На фиг. 4А показан образец, текущий слева направо через капилляр. Волокна показаны в произвольных ориентациях, поскольку они были введены в жидкость и переносились по системе в отсутствие
акустического поля. После акустического возбуждения капилляра, волокна переносились и вращались
для согласованного выравнивания параллельно оси капилляра, см. фиг. 4В. Показанное здесь выравнивание обусловлено силой давления акустического излучения, выравнивающей главную ось частиц вдоль
оси капилляра.
Выбор размера частицы на основе поля для оперативной очистки образца
и разделения/концентрации
Варьируя напряжение возбуждения и/или частоту возбуждения акустического источника в акустически возбуждаемом капилляре, можно добиться двоичного фракционирования частиц по размеру. Этот
эффект является результатом того, что на более мелкие частицы действует меньшая акустическая сила в
силу кубичной зависимости акустической силы от радиуса частицы. В конкретном применении более
крупные частицы, содержащиеся в сердцевине капилляра, подают в меньший, коаксиальный капилляр,
отбрасывая концентрическое поле потока, содержащее малые частицы. Очищенный образец можно использовать на дальнейших этапах подготовки образца или подавать в реальном времени в проточный
цитометр или другое средство анализа. В зависимости от применения, жидкость вне сердцевины также
можно считать ценным образцом, собираемым и используемым для анализа.
Пример 2.
Результаты предварительных экспериментов, демонстрирующих возможность выбора размера как
функцию уровня возбуждения, проиллюстрированы на фиг. 5А-5С. В этом примере акустически возбуждаемый капилляр колебался с частотой около 1,78 МГц. Взвесь латексных микросфер, содержащая флуоресцентные сферы диаметром около 1 мкм и нефлуоресцентные сферы диаметром около 10 мкм, прокачивали через возбуждаемый капилляр. Объемная фракция частиц составляла около 2,5×10-5. Капилляр
определяется внутренним диаметром около 500 мкм и внешним диаметром около 1000 мкм.
На фиг. 5А показана фотография, сделанная с помощью флуоресцентного микроскопа, где частицы
диаметром около 10 мкм наблюдаются как крупные круглые включения и частицы диаметром около 1
мкм наблюдаются как зернистый фон. Сигнал флуоресценции от частиц диаметром около 1 мкм слишком низок, чтобы его можно было зарегистрировать в рабочих условиях эксперимента. При низком
уровне акустического возбуждения около 7 Врр (фиг. 5В) частицы диаметром около 10 мкм быстро переносились к оси капилляра. Частицы диаметром около 1 мкм оставались произвольно распределенными.
Удвоение напряжения возбуждения до около 16 Врр привело к эффективному переносу частиц обоих
размеров к центральной оси капилляра, см. фиг. 5С. Яркая линия вдоль оси цилиндра была результатом
большого локального увеличения флуоресценции вследствие концентрации флуоресцентных частиц
диаметром около 1 мкм в этом месте.
Акустическая фокусировка/ориентация, например влияние зеркальной симметрии на параметры
оптического рассеяния в проточной камере с акустической фокусировкой
Вариант осуществления настоящего изобретения рассматривает угловое рассеяние, связанное с частицами, выровненными в плоскости оптического рассеяния, как результат давления акустического излучения. Замена гидродинамического оболочечного потока акустически возбуждаемым выравниванием
частиц в поточной кювете предпочтительно приводит к улучшению данных рассеяния света и обеспечивает новые параметры, зависящие от геометрии и ориентации частиц. Помимо важности ориентации
асимметричных биологических частиц, например эритроцитов, сперматозоидов и бактерий в проточном
цитометрическом анализе, сложные геометрические формы, которые образуются в результате объединения множественных микросфер или клеток, например, "гантелеобразные" формы, обусловленные агглютинацией двух частиц, также обусловлены ориентацией частиц. Кластеры частиц предпочтительно легче
различать, если они имеют фиксированную ориентацию в плоскости рассеяния. Ориентация "дублетов"
микросфер для создания повторяющихся и уникальных сигнатур рассеяния в силу того, что они пересекают плоскость рассеяния, будет обеспечивать средство для изоляции их вклада в оптические данные
рассеяния для выбраковки данных или принятия данных путем использования решения проблемы обратного рассеяния для контактирующих сфер. Также возможно применение акустически ориентируемых
частиц в струе потока к области построения изображения, где наблюдение выбранных ориентации частиц ценно при определении клеточной морфологии, определения положения компонентов клеток или
других характеристик частицы/клетки.
Расширенные возможности обнаружения в условиях замедления потока, остановки потока
и обращения потока в проточных камерах с акустической фокусировкой
Другой вариант осуществления настоящего изобретения дополнительно рассматривает эффекты
замедления потока, остановки потока, обращения потока и увеличения времени анализа в проточной цитометрии, обусловленные заменой оболочечного потока акустическим выравниванием частиц. В первом
примере возможность останавливать и обращать направление потока струи образца позволяет повторно
анализировать частицы. Поток останавливается и/или обращается с использованием различных уст-7-
022506
ройств остановки потока и обращения потока, включая, но без ограничения, насос или один или несколько клапанов. Распределенные пики (увеличенные CV) и точки данных, которые являются выпадающими в плоскости анализа, представляют собой системно-зависимые величины, которые являются
функцией стабильности лазера, качества выравнивания частиц, электронного шума, шума детектора, надежность анализа (частоты переключения и т.д.) и т.д. Благодаря неоднократному анализу важной частицы можно повысить качество данных, особенно в случае переходных артефактов, и можно минимизировать статистические неопределенности при анализе редких событий.
Выбор размера частицы на основе акустического поля для оперативной очистки образца и изоляции
частиц.
Хотя акустическая фокусировка полезна для анализа частиц или клеток благодаря замене оболочечного потока в системе обнаружения, еще один вариант осуществления настоящего изобретения распространяет применение акустических сил в акустически возбуждаемых капиллярах на разделение частиц и/или клеток для предварительной оперативной подготовки образца в системах проточной цитометрии или общей подготовки и очистки образца. На фиг. 6 показано использование настоящего изобретения для акустического фракционирования размеров и концентрирования образцов по размеру частицы
и/или механической контрастности относительно фоновой среды в реальном времени на входе проточного цитометра до стадии анализа. Прямое фракционирование на основании размера частицы/механических свойств снижает необходимость в трудоемких этапах подготовки образца, которые
включают в себя центрифугирование и фильтрацию. Для применений проточной цитометрии полезно
для уменьшения фона, связанного с продуктами распада клеток, белками и другими молекулярными
компонентами в пробах цельной крови, и, в частности, непромытых пробах, которые включают в себя
клеточный лизис. Подготовка образца, включающая в себя этап удаления продуктов распада клеток до
подачи образца в проточный цитометр, может значительно уменьшать артефакты, связанные с рассеянием/флуоресценцией из продуктов распада.
Хотя изобретение было подробно описано с конкретной ссылкой на эти предпочтительные варианты осуществления, другие варианты осуществления могут приводить к таким же результатам. Специалисты в данной области техники могут предложить различные изменения и модификации настоящего изобретения, которое призвано охватывать все подобные модификации и эквиваленты. Полное раскрытие
всех ссылок, заявок, патентов и публикаций, упомянутых выше и/или в применениях, и соответствующих заявок, таким образом, включено в настоящее описание посредством ссылки.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Способ разделения частиц по размеру, содержащий этапы, на которых
создают поток частиц в капилляре, имеющем форму, выбранную из эллиптической, овальной или
круглой, и связанном с пьезокерамическим источником, который находится в контакте с внешней стенкой капилляра, причем угловая апертура этого контакта составляет более чем 45°,
возбуждают указанный пьезокерамический источник, в результате чего в потоке возникают радиальные силы, обусловленные давлением акустического излучения, разделяющие частицы по размеру.
2. Способ по п.1, дополнительно содержащий этап, на котором переносят более крупные частицы из
разделенных частиц в проточный цитометр; и альтернативно дополнительно содержащий этап, на котором анализируют более крупные частицы, и/или на котором на этапе переноса переносят более крупные
частицы к центральной оси потока.
3. Способ по п.1, дополнительно содержащий этап, на котором оперативно разделяют частицы.
4. Аппарат для анализа частиц, содержащий
капилляр для протекания жидкости, содержащей частицу, причем капилляр имеет форму, выбранную из эллиптической, овальной или круглой,
пьезокерамический источник, находящийся в контакте с внешней стенкой капилляра, служащий
преобразователем, создающим акустический сигнал для возбуждения радиальных сил, обусловленных
давлением акустического излучения для ориентации асимметричных частиц под влиянием акустического
поля в упомянутом капилляре, причем указанный пьезокерамический источник имеет угловую апертуру
более чем 45°,
устройство переноса для переноса упомянутых частиц через точку опроса и анализатор частиц.
5. Аппарат по п.4, дополнительно содержащий по меньшей мере один из следующих признаков:
в котором упомянутый преобразователь, создающий акустический сигнал, выполнен с возможностью концентрирования частиц в упомянутом капилляре;
в котором упомянутый преобразователь, создающий акустический сигнал, выполнен с возможностью создания акустического поля, выравнивающего частицу.
6. Способ анализа частиц в анализаторе частиц, содержащий этапы, на которых
создают поток частиц в капилляре, имеющем форму, выбранную из эллиптической, овальной или
круглой, и связанном с пьезокерамическим источником, который находится в контакте с внешней стенкой капилляра, причем угловая апертура этого контакта составляет более чем 45°;
-8-
022506
возбуждают указанный пьезокерамический источник, в результате чего в потоке возникают радиальные силы, обусловленные давлением акустического излучения, ориентирующие асимметричные частицы в потоке;
переносят каждую частицу через точку опроса и
анализируют каждую из частиц.
7. Способ по п.6, дополнительно содержащий этап, на котором выравнивают частицы в потоке, альтернативно в котором выравнивание осуществляют посредством акустического поля или гидродинамического фокуса; и/или
дополнительно содержащий этап, на котором концентрируют частицы в потоке.
8. Способ приложения давления акустического излучения при анализе одной или нескольких частиц в потоке, содержащий этапы, на которых
маркируют одну или несколько частиц лантаноидом,
создают поток частиц в капилляре, имеющем форму, выбранную из эллиптической, овальной или
круглой, и связанном с пьезокерамическим источником, который находится в контакте с внешней стенкой капилляра, причем угловая апертура этого контакта составляет более чем 45°,
возбуждают указанный пьезокерамический источник, в результате чего в потоке возникают радиальные силы, обусловленные давлением акустического излучения, выравнивающие частицы в направлении потока, и
анализируют по меньшей мере часть частиц, маркированных лантаноидом.
9. Способ по п.8, дополнительно содержащий этап, на котором останавливают поток и/или обращают поток.
Фиг. 1
Фиг. 2А
-9-
022506
Фиг. 2В
Фиг. 3
Фиг. 4А
Фиг. 4В
Фиг. 5А
Фиг. 5В
- 10 -
022506
Фиг. 5С
Фиг. 6
Евразийская патентная организация, ЕАПВ
Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2
- 11 -