БЕЛОК ТЕПЛОВОГО ШОКА ПРЕСНОВОДНЫХ ПРОСТЕЙШИХ И

2006
ÖÈÒÎËÎÃÈß
Ò î ì 48, ¹ 6
ÁÅËÎÊ ÒÅÏËÎÂÎÃÎ ØÎÊÀ ÏÐÅÑÍÎÂÎÄÍÛÕ ÏÐÎÑÒÅÉØÈÕ
È ÅÃÎ Ó×ÀÑÒÈÅ Â ÀÄÀÏÒÀÖÈÈ Ê ÈÇÌÅÍÅÍÈÞ ÑÎËÅÍÎÑÒÈ ÑÐÅÄÛ ÎÁÈÒÀÍÈß
© À. Þ. Ïëåõàíîâ,1 À. Î. Ñìóðîâ,2, 3 Þ. È. Ïîäëèïàåâà,4
Ë. Î. Èâàíîâà,3 À. Â. Ãóäêîâ3, 4
À. Þ. Ïëåõàíîâ, À. Î. Ñìóðîâ è äð.
Áåëîê òåïëîâîãî øîêà ïðåñíîâîäíûõ ïðîñòåéøèõ
1
Ñ.-Ïåòåðáóðãñêèé èíñòèòóò ÿäåðíîé ôèçèêè èì. Á. Ï. Êîíñòàíòèíîâà ÐÀÍ, Ãàò÷èíà, Ëåíèíãðàäñêàÿ îáë.,
2 Çîîëîãè÷åñêèé èíñòèòóò ÐÀÍ, 3 Áèîëîãè÷åñêèé íàó÷íî-èññëåäîâàòåëüñêèé èíñòèòóò
Ñ.-Ïåòåðáóðãñêîãî ãîñóäàðñòâåííîãî óíèâåðñèòåòà è 4 Èíñòèòóò öèòîëîãèè ÐÀÍ,
Ñàíêò-Ïåòåðáóðã; ýëåêòðîííûé àäðåñ: [email protected]
Èññëåäîâàëè èçìåíåíèå óðîâíÿ áåëêà òåïëîâîãî øîêà (ÁÒØ) â êëåòêàõ ïðåñíîâîäíûõ ïðîñòåéøèõ — àìåáû Amoeba proteus è èíôóçîðèè Paramecium jenningsi — â îòâåò íà èçìåíåíèå ñîëåíîñòè ñðåäû. Ñòðåññîâûì âîçäåéñòâèåì íà êëåòêè ñ÷èòàëè ñìåíó îäíîé ñîëåíîñòè íà äðóãóþ. Ìåòîäîì èììóíîáëîòèíãà â òîòàëüíîì áåëêîâîì ýêñòðàêòå èíòàêòíûõ è ïîäâåðãíóòûõ ñîëåíîñòíîìó ñòðåññó êëåòîê àìåá
è èíôóçîðèé áûë âûÿâëåí ïîëèïåïòèäíûé àíòèãåí, ïåðåêðåñòíî ðåàãèðóþùèé ñ àíòèòåëàìè ê ÁÒØ70
êðóïíîãî ðîãàòîãî ñêîòà. Òîò æå ïîëèïåïòèäíûé àíòèãåí âûÿâëÿåòñÿ â êëåòêàõ À. proteus, ïîäâåðãíóòûõ
òåïëîâîìó øîêó; ýòî ïîçâîëÿåò ïðåäïîëàãàòü, ÷òî âûÿâëåííûé ïðè ñîëåíîñòíîì øîêå ïîëèïåïòèä ÿâëÿåòñÿ ÁÒØ, ðîäñòâåííûì ÁÒØ70 ïîçâîíî÷íûõ. Îáèòàíèå â ñðåäå ñ ñîëåíîñòüþ 2 O äëÿ ïðåñíîâîäíûõ
ïðîñòåéøèõ ìîæíî ðàññìàòðèâàòü êàê íåáëàãîïðèÿòíîå, ÷òî ìàðêèðóåòñÿ ïîâûøåííûì ñîäåðæàíèåì
ÁÒØ ó ïðîñòåéøèõ, àêêëèìèðîâàííûõ ê ïîâûøåííîé ñîëåíîñòè. Òàêèå àêêëèìèðîâàííûå ïðîñòåéøèå
ïðè ñòðåññîâîì âîçäåéñòâèè ïðåèìóùåñòâåííî ðàñõîäóþò íàêîïëåííûé ÁÒØ70. Cäåëàíî çàêëþ÷åíèå î
òîì, ÷òî ïðåñíîâîäíûå ïðîñòåéøèå, îáèòàþùèå â óñëîâèÿõ ïîâûøåííîé ñîëåíîñòè, ïî-âèäèìîìó, ïðåàäàïòèðîâàíû ê èçìåíåíèþ ôàêòîðîâ ñðåäû.
Ê ë þ ÷ å â û å ñ ë î â à: ñîëåíîñòíûå àäàïòàöèè, ïðåñíîâîäíûå ïðîñòåéøèå, Amoeba proteus, Paramecium jenningsi, áåëêè òåïëîâîãî øîêà.
uthen, 1980; McMullin, Hallberg, 1987; La Terza et al.,
2001; Hori, Fujishima, 2003), æãóòèêîíîñöåâ (Drzymalla
et al., 1996; Barque et al., 2000) è àìåá (Kalinina et al.,
1988; Podlipaeva, 2001).
Ñëåäóåò îòìåòèòü, ÷òî â ïîäàâëÿþùåì áîëüøèíñòâå
ñëó÷àåâ ôóíêöèè ÁÒØ70 ó ïðîñòåéøèõ èçó÷àþòñÿ â ñâÿçè ñ àäàïòàöèåé ýòèõ îðãàíèçìîâ ê èçìåíåíèÿì òåìïåðàòóðû îêðóæàþùåé ñðåäû. Îäíàêî ïîñêîëüêó ÁÒØ ÿâëÿþòñÿ óíèâåðñàëüíûìè öèòîïðîòåêòîðàìè, ëîãè÷íî ïðåäïîëàãàòü èõ ó÷àñòèå (â ÷àñòíîñòè, ó÷àñòèå ÁÒØ70) â
àäàïòàöèè ê ðàçëè÷íûì èíûì íåáëàãîïðèÿòíûì âîçäåéñòâèÿì.  ÷àñòíîñòè, áîëüøîé èíòåðåñ â ýòîì îòíîøåíèè
ïðåäñòàâëÿåò ïðèñïîñîáëåíèå ïðåñíîâîäíûõ ïðîñòåéøèõ ê èçìåíåíèþ ñîëåíîñòè âîäíîé ñðåäû, â êîòîðîé
îíè îáèòàþò.
Ïîäîáíûå ðàáîòû â íàñòîÿùåå âðåìÿ ïðîâîäÿòñÿ
ïî÷òè èñêëþ÷èòåëüíî íà ìíîãîêëåòî÷íûõ îðãàíèçìàõ, è
àêòóàëüíîñòü íàñòîÿùåãî èññëåäîâàíèÿ îïðåäåëÿåòñÿ, â
÷àñòíîñòè, îñîáåííîñòüþ îðãàíèçàöèè ïðîñòåéøèõ, êîòîðûå ïðåäñòàâëÿþò ñîáîé îäíîâðåìåííî è êëåòêó, è
ïîëíîöåííûé îðãàíèçì. Ñëåäîâàòåëüíî, ðåàêöèþ ïðîñòåéøèõ íà ñòðåññ ìîæíî ðàññìàòðèâàòü êàê ìîäåëü áîëåå ïðîñòóþ, ÷åì ìíîãîêëåòî÷íûé îðãàíèçì, è íå îïîñðåäîâàííóþ ñïåöèôèêîé ôóíêöèîíèðîâàíèÿ êëåòîê
ðàçëè÷íûõ òêàíåé. Èçâåñòíî, ÷òî óðîâåíü ÁÒØ øîêà â
êëåòêàõ ðàçíûõ òêàíåé îäíîãî îðãàíèçìà, ïîäâåðãíóòîãî
Èçâåñòíî, ÷òî êëåòêè âñåõ æèâûõ îðãàíèçìîâ â îòâåò
íà äåéñòâèå ñòðåññîâûõ ôàêòîðîâ ðåàãèðóþò ñèíòåçîì
òàê íàçûâàåìûõ áåëêîâ òåïëîâîãî øîêà (ÁÒØ èëè HSP —
heat shock proteins) (Feder, Hofmann, 1999; Maðãóëèñ, Ãóæîâà, 2000). Îñíîâíàÿ ôóíêöèÿ ÁÒØ — öèòîïðîòåêòîðíàÿ. Îíè ñïîñîáñòâóþò àäàïòàöèè îðãàíèçìîâ è èõ êëåòîê ê íåáëàãîïðèÿòíûì âîçäåéñòâèÿì. ÁÒØ ïðåäñòàâëåíû ðÿäîì ñåìåéñòâ, ðàçëè÷àþùèõñÿ ïî ìîëåêóëÿðíîé
ìàññå, íóêëåîòèäíîé ïîñëåäîâàòåëüíîñòè ãåíîâ, êîòîðûìè îíè êîäèðóþòñÿ, è âûïîëíÿåìûì ôóíêöèÿì. Íàèáîëåå èçó÷åííûìè ÿâëÿþòñÿ ÁÒØ ñ ìîë. ìàññîé 70 êÄà —
ýòî òàê íàçûâàåìûå ÁÒØ70 (HSP70), îáëàäàþùèå âåñüìà íèçêîé âèäîñïåöèôè÷íîñòüþ (Ìàðãóëèñ, Ãóæîâà,
2000).
Ó îäíîêëåòî÷íûõ îðãàíèçìîâ ïî ñðàâíåíèþ ñ áàêòåðèÿìè è ìíîãîêëåòî÷íûìè æèâîòíûìè ÁÒØ70 èçó÷åíû
åùå ìàëî, ïðè÷åì ýòè èññëåäîâàíèÿ êàñàþòñÿ ãëàâíûì
îáðàçîì ðàçëè÷íûõ ïàðàçèòîâ, îáèòàþùèõ â òåëå òåïëîêðîâíûõ õîçÿåâ (Joshi et al., 1992; Requena et al., 1992;
Wallace et al., 1992; Field et al., 2000; Perez-Serrano et al.,
2000; Triana et al., 2000; Lloyd et al., 2002; Bakatselou
et al., 2003; Varadharajan et al., 2004, è äð.). Çíà÷èòåëüíî
ìåíüøå âíèìàíèÿ óäåëÿåòñÿ ÁÒØ70 ñâîáîäíîæèâóùèõ
ïðîñòåéøèõ. Ê íàñòîÿùåìó âðåìåíè èìååòñÿ ëèøü íåáîëüøîå ÷èñëî ïóáëèêàöèé, ïîñâÿùåííûõ ÁÒØ70 ó îòäåëüíûõ âèäîâ ñâîáîäíîæèâóùèõ èíôóçîðèé (Fink, Ze530
Áåëîê òåïëîâîãî øîêà ïðåñíîâîäíûõ ïðîñòåéøèõ
ñîëåíîñòíîìó ñòðåññó, ìîæåò áûòü ðàçëè÷íûì (Deane,
Wool, 2004).
Öåëüþ íàñòîÿùåãî èññëåäîâàíèÿ áûëî ïîëó÷åíèå
äàííûõ îá èçìåíåíèè êîíöåíòðàöèè áåëêà, èììóíîëîãè÷åñêè ðîäñòâåííîãî ÁÒØ70 ïîçâîíî÷íûõ æèâîòíûõ, â
êëåòêàõ ñâîáîäíîæèâóùèõ ïðåñíîâîäíûõ àìåá è èíôóçîðèé ïðè èçìåíåíèè ñîëåíîñòè ñðåäû èõ îáèòàíèÿ.
Ìàòåðèàë è ìåòîäèêà
 ðàáîòå áûëè èñïîëüçîâàíû ñâîáîäíîæèâóùèå ïðåñíîâîäíûå âèäû ïðîñòåéøèõ: ëîáîçíûå àìåáû Amoeba
proteus (øòàìì Val èç êîëëåêöèè Ëàáîðàòîðèè öèòîëîãèè îäíîêëåòî÷íûõ îðãàíèçìîâ Èíñòèòóòà öèòîëîãèè
ÐÀÍ) è èíôóçîðèè Paramecium jenningsi (øòàìì SR1-10
èç êîëëåêöèè êóëüòóð Ëàáîðàòîðèè çîîëîãèè áåñïîçâîíî÷íûõ ÁèÍÈÈ ÑÏáÃÓ). Êóëüòèâèðîâàíèå ïðîñòåéøèõ
îñóùåñòâëÿëè ïî ñòàíäàðòíûì ìåòîäèêàì: èíôóçîðèé —
íà ñàëàòíîé ñðåäå, èíîêóëèðîâàííîé Klebsiella aerogenes
(Sonneborn, 1970), àìåá — íà ìîäèôèöèðîâàííîì ìèíåðàëüíîì ðàñòâîðå Ïðåñêîòòà è Êýððèåðà (Prescott, Carrier, 1964). Àìåá êîðìèëè èíôóçîðèÿìè Tetrahymena pyriformis (øòàìì GL èç êîëëåêöèè Ëàáîðàòîðèè öèòîëîãèè
îäíîêëåòî÷íûõ îðãàíèçìîâ Èíñòèòóòà öèòîëîãèè ÐÀÍ).
Äëÿ ïðîâåäåíèÿ îïûòîâ ÷àñòü èíôóçîðèé è àìåá, â íîðìå
ñîäåðæàâøèõñÿ â ïðåñíîé âîäå, áûëà àêêëèìèðîâàíà ê
2 O. Íåîáõîäèìóþ ñîëåíîñòü ñðåäû ñîçäàâàëè äîáàâëåíèåì â êóëüòóðàëüíóþ ñðåäó ðàñòâîðà èñêóññòâåííîé
ìîðñêîé ñîëè, ïðèãîòîâëåííîé ïî ïðîïèñè Øóáðàâîãî
(1983). Ñðîê àêêëèìàöèè îðãàíèçìîâ ñîñòàâëÿë íå ìåíåå
2 ìåñ ïðè êîìíàòíîé òåìïåðàòóðå (18—20 °Ñ).
Äëÿ îáîèõ âèäîâ ïðîñòåéøèõ îïðåäåëÿëè âåëè÷èíó
òîëåðàíòíîãî äèàïàçîíà. Áûë ñîñòàâëåí ðÿä òåñòîâûõ ñîëåíîñòåé îò ïðåñíîé âîäû (0 O ) äî ñðåäû ñîëåíîñòüþ
10 O ñ èíòåðâàëîì 0.5 O. Ìàêñèìàëüíóþ ñîëåíîñòü,
ïðè êîòîðîé àìåáû èëè èíôóçîðèè ìîãëè ïîääåðæèâàòüñÿ â êóëüòóðå íåîãðàíè÷åííî äîëãî, ïðèíèìàëè çà çíà÷åíèå òîëåðàíòíîé ãðàíèöû (Smurov, Fokin, 1998).  ðåçóëüòàòå ïðîâåäåííûõ èññëåäîâàíèé áûëè îïðåäåëåíû
ñîëåíîñòíûå òîëåðàíòíûå ãðàíèöû äëÿ P. jenningsi è
A. proteus, àêêëèìèðîâàííûõ ê ïðåñíîé ñðåäå, êîòîðûå
ñîñòàâëÿëè 3.25 è 2.5 O ñîîòâåòñòâåííî. Äëÿ êëåòîê, àêêëèìèðîâàííûõ ê 2 O, ñîëåíîñòíûå òîëåðàíòíûå ãðàíèöû ñîñòàâëÿëè: äëÿ P. jenningsi — 6 O, äëÿ A. proteus — 3.5 O.
Còðåññîâûì ñîëåíîñòíûì âîçäåéñòâèåì ñ÷èòàëñÿ ïåðåíîñ êëåòîê èç îäíîé ñîëåíîñòè â äðóãóþ: èç 0 â 2 O, è
íàîáîðîò. Ðàçíèöó â 2 O ìîæíî ñ÷èòàòü äëÿ ïðîñòåéøèõ
îáîèõ âèäîâ øîêîâîé, òàê êàê, ñ îäíîé ñòîðîíû, îíà íå
ÿâëÿåòñÿ äëÿ íèõ ëåòàëüíîé, íàõîäÿñü âíóòðè èõ èñõîäíîãî ñîëåíîñòíîãî òîëåðàíòíîãî äèàïàçîíà, à ñ äðóãîé —
âûçûâàåò ôèçèîëîãè÷åñêóþ ïåðåñòðîéêó îðãàíèçìà, êîòîðóþ ìîæíî òåñòèðîâàòü ïî ðàñøèðåíèþ òîëåðàíòíîãî
äèàïàçîíà ïðîñòåéøèõ ïîñëå îêîí÷àíèÿ èõ àêêëèìàöèè.
Äëÿ îñóùåñòâëåíèÿ ñîëåíîñòíîãî øîêà â êóëüòóðå
àìåá, âûðàùåííîé ïðè 0 O, èçìåíÿëè ñîëåíîñòü ñðåäû
äî âåëè÷èíû 2 O è âûäåðæèâàëè ïðè èçìåíåííîé ñîëåíîñòè â òå÷åíèå 2 ÷. Íàïðîòèâ, â êóëüòóðå àìåá, àêêëèìèðîâàííûõ ê ñîëåíîñòè 2 O, ñðåäó çàìåíÿëè íà ïðåñíóþ è òàêæå âûäåðæèâàëè â òå÷åíèå 2 ÷.  êà÷åñòâå
êîíòðîëÿ èñïîëüçîâàëè êóëüòóðû àìåá, ðàâíûå ïî ïëîòíîñòè îïûòíûì êóëüòóðàì.
Äëÿ îñóùåñòâëåíèÿ ñîëåíîñòíîãî øîêà ó èíôóçîðèé
äâå àëèêâîòû êóëüòóðû èíôóçîðèé, âûðàùåííûõ â ïðå-
531
ñíîé ñðåäå, ïîäâåðãàëè öåíòðèôóãèðîâàíèþ â òå÷åíèå
10 ìèí ïðè 400 g äëÿ îñàæäåíèÿ êëåòîê. Ê îñàæäåííûì
êëåòêàì äîáàâëÿëè âîäó ñ ñîëåíîñòüþ 2 O (îïûò) èëè
ñíîâà ïðåñíóþ âîäó (êîíòðîëü).  òàêîì ñîñòîÿíèè èíôóçîðèé âûäåðæèâàëè â òå÷åíèå 1 ÷. Àíàëîãè÷íî ïîñòóïàëè ñ èíôóçîðèÿìè, àêêëèìèðîâàííûìè ê ñîëåíîñòè
2 O.
Äëÿ ïîäòâåðæäåíèÿ ïðèíàäëåæíîñòè âûÿâëÿåìûõ
ïîñëå ñîëåâûõ øîêîâ ïîëèïåïòèäîâ ê ÁÒØ êóëüòóðû
àìåá, âûðàùåííûå êàê â ïðåñíîé ñðåäå, òàê è ïðè ñîëåíîñòè 2 O, ïîäâåðãàëè òåïëîâîìó øîêó (37 °Ñ, 1 ÷).
Ïî îêîí÷àíèè ýêñïåðèìåíòà êëåòêè ïðîñòåéøèõ
îñàæäàëè öåíòðèôóãèðîâàíèåì ïðè 400 g â òå÷åíèå
10 ìèí è îáðàáàòûâàëè àöåòîíîì ñ öåëüþ ïðåêðàùåíèÿ
æèçíåäåÿòåëüíîñòè, ïðåöèïèòàöèè áåëêîâ è ïåðìåàáèëèçàöèè ìåìáðàí. Ïðîìûòûé àöåòîíîì ìàòåðèàë îñàæäàëè
öåíòðèôóãèðîâàíèåì ïðè 3000 g â òå÷åíèå 10 ìèí è ïîäñóøèâàëè äî èñ÷åçíîâåíèÿ çàïàõà àöåòîíà. Çàòåì ê ïðîáàì äîáàâëÿëè áóôåð äëÿ ðàçâåäåíèÿ ïðîá ïî Ëýììëè
(Laemmli, 1970) è ïðîãðåâàëè èõ íà êèïÿùåé âîäÿíîé
áàíå â òå÷åíèå 2 ìèí. Ïîäãîòîâëåííûå òàêèì îáðàçîì
ïðîáû ïîäâåðãàëè ýëåêòðîôîðåçó â 13%-íîì ïîëèàêðèëàìèäíîì ãåëå â ñèñòåìå ñ äîäåöèëñóëüôàòîì íàòðèÿ
(ÄÄÑ-Na) ïî Ëýììëè (Laemmli, 1970).
Ïî çàâåðøåíèè ýëåêòðîôîðåçà ðàçäåëåííûå áåëêè
ïåðåíîñèëè èç ãåëÿ íà íèòðîöåëëþëîçíóþ ìåìáðàíó
(Synpor èëè Amersham ECL) ìåòîäîì ýëåêòðîáëîòèíãà
(Towbin et al., 1979) èëè îñóùåñòâëÿëè ïîâåðõíîñòíûé
áëîòèíã (Plekhanov, 1996). Ðåïåðû ìîëåêóëÿðíîé ìàññû
îêðàøèâàëè íà ìåìáðàíå 0.5%-íûì ðàñòâîðîì àìèäî÷åðíîãî 10 â 10%-íîé óêñóñíîé êèñëîòå, ïðèãîòîâëåííîé íà 40%-íîì ýòàíîëå, è äèôôåðåíöèðîâàëè â 5%-íîé
óêñóñíîé êèñëîòå ñ äîáàâëåíèåì àíèîíîîáìåííîé ñìîëû
Ñôåðîí-ÄÝÀÝ (Skl*arny Kavaier, Âîòèöå, ×åõèÿ).
 êà÷åñòâå ðåïåðîâ ìîëåêóëÿðíîé ìàññû èñïîëüçîâàëè ôîñôîðèëàçó  (94 êÄà), áû÷èé ñûâîðîòî÷íûé àëüáóìèí (66 êÄà), ÿè÷íûé àëüáóìèí (45 êÄà) è êàðáîàíãèäðàçó (30 àÄà); âñå — ïðîèçâîäñòâà Sigma (ÑØÀ). Çàâèñèìîñòü äëèíû ïðîáåãà ðåïåðà îò åãî ìîëåêóëÿðíîé ìàññû
àïïðîêñèìèðîâàëè ê ëèíåéíîé ìåòîäîì íàèìåíüøèõ
êâàäðàòîâ è ïîëó÷åííîå ëèíåéíîå óðàâíåíèå èñïîëüçîâàëè äëÿ îïðåäåëåíèÿ îòíîñèòåëüíîé ìîëåêóëÿðíîé ìàññû ÁÒØ ïðîñòåéøèõ.
Áåëêè, èììóíîëîãè÷åñêè ðîäñòâåííûå ÁÒØ70 ïîçâîíî÷íûõ, âûÿâëÿëè èììóíîõèìè÷åñêè. Äëÿ ýòîãî ïîñëå ñîðáöèè áåëêîâ îñòàòî÷íóþ ñîðáöèîííóþ ñïîñîáíîñòü íèòðîöåëëþëîçíîé ìåìáðàíû èñ÷åðïûâàëè èíêóáàöèåé åå â ìîëîêå («Ïåòìîë», æèðíîñòü 0.5 %), çàòåì
ìåìáðàíó âûäåðæèâàëè â ðàñòâîðå àíòèòåë ïðîòèâ ÁÒØ70
èç ìûøö áûêà (àíòèòåëà ïðåäîñòàâëåíû Á. À. Ìàðãóëèñîì, Èíñòèòóò öèòîëîãèè ÐÀÍ), ïðèãîòîâëåííîì â ðàçâåäåíèè 1 : 150 íà ôèçèîëîãè÷åñêîì ôîñôàòíî-áóôåðíîì
ðàñòâîðå (PBS) â òå÷åíèå íî÷è ïðè êîìíàòíîé òåìïåðàòóðå. Äàëåå ìåìáðàíó ïðîìûâàëè â PBS è âûäåðæèâàëè
â ðàñòâîðå áåëêà À çîëîòèñòîãî ñòàôèëîêîêêà, ìå÷åííîãî ïåðîêñèäàçîé õðåíà (â êà÷åñòâå âòîðè÷íûõ àíòèòåë)
(ÍÈÈÝÌ èì. Ïàñòåðà, ðàçâåäåíèå 1 : 2), ïðèãîòîâëåííîì
íà ÔÁÐ, â òå÷åíèå 1 ÷ ïðè 37 °Ñ. Ïî îêîí÷àíèè èíêóáàöèè ìåìáðàíó ïðîìûâàëè â ÐBS 3 ðàçà ïî 10 ìèí, îïîëàñêèâàëè âîäîé, ïîñëå ÷åãî âûÿâëÿëè ïåðîêñèäàçíóþ àêòèâíîñòü áåíçèäèíîì èëè ìåòîäîì óñèëåííîé õåìèëþìèíåñöåíöèè (ECL), êîòîðûé îáëàäàåò áîëüøåé ÷óâñòâèòåëüíîñòüþ.
 ñëó÷àå ïðèìåíåíèÿ ìåòîäà óñèëåííîé õåìèëþìèíåñöåíöèè ìåìáðàíó âûäåðæèâàëè â òå÷åíèå 1 ìèí â
532
À. Þ. Ïëåõàíîâ, À. Î. Ñìóðîâ è äð.
êîììåð÷åñêîé ñìåñè ðåàêòèâîâ ECL (Amersham) è íàêëàäûâàëè íà ëèñòîâóþ ôîòîïëåíêó (Amersham ) ÷åðåç
òîíêóþ ïîëèýòèëåíîâóþ ïëåíêó. Âðåìÿ ýêñïîçèöèè ïîäáèðàëè â èíòåðâàëå îò 15 ñ äî 15 ìèí. Ôîòîïëåíêó ïðîÿâëÿëè â ñòàíäàðòíîì ïðîÿâèòåëå äëÿ ÷åðíî-áåëûõ ôîòîáóìàã è ôèêñèðîâàëè â 20%-íîì Na2S2O3. Ïîñëå îñóùåñòâëåíèÿ ECL áëîò äâàæäû îïîëàñêèâàëè âîäîé è äîïîëíèòåëüíî ïðîÿâëÿëè áåíçèäèíîì.
Äëÿ ïðîÿâëåíèÿ áåíçèäèíîì ìåìáðàíó ñ ñîðáèðîâàííûì íà íåé èììóíîïåðîêñèäàçíûì êîìïëåêñîì âûäåðæèâàëè â ðàñòâîðå, ñîäåðæàùåì 0.05 % áåíçèäèíà, 0.03 %
H2O2, 0.002 M ëèìîííîé êèñëîòû è 0.004 Ì Na2HPO4
(pH 5) (Plekhanov, 1996). Áåíçèäèí äîáàâëÿëè, èñïîëüçóÿ
5%-íûé ñïèðòîâîé ðàñòâîð ñ íàãðåâàíèåì åãî äî ïðîçðà÷íîñòè è ïîñëåäóþùèì îõëàæäåíèåì äî êîìíàòíîé
òåìïåðàòóðû. Ïîñëå ïðîÿâëåíèÿ çîí ìåìáðàíó ïðîìûâàëè ãîðÿ÷åé äèñòèëëèðîâàííîé âîäîé äëÿ îñòàíîâêè ïðîÿâëåíèÿ.
 ñëó÷àå èíôóçîðèé P. jenningsi äëÿ âûÿâëåíèÿ áåëêîâ, èììóíîëîãè÷åñêè ðîäñòâåííûõ ÁÒØ70 ïîçâîíî÷íûõ, âìåñòî ýëåêòðîôîðåçà ïðèìåíÿëè òåõíèêó äîò-áëîòèíãà. Ñ ýòîé öåëüþ îñàæäåííûõ öåíòðèôóãèðîâàíèåì è
ïðîìûòûõ àöåòîíîì ïðîñòåéøèõ ðàñòâîðÿëè â ìèíèìàëüíîì îáúåìå 1%-íîãî ÄÄÑ-Na, ñîäåðæàùåãî 1 ìÌ
ÝÄÒÀ è 1 ìÌ ÔÌÑÔ; çàòåì 1—2 ìêë ïîëó÷åííîãî ýêñòðàêòà íàíîñèëè â òî÷êó íà íèòðîöåëëþëîçíóþ ìåìáðàíó.
Ìåìáðàíó âûñóøèâàëè è èñêîìûé àíòèãåí âûÿâëÿëè èììóíîõèìè÷åñêè, êàê îïèñàíî âûøå.
Ðåçóëüòàòû è îáñóæäåíèå
Ìåòîäîì èììóíîáëîòèíãà â òîòàëüíîì áåëêîâîì ýêñòðàêòå àìåá À. proteus âûÿâëÿåòñÿ ïîëèïåïòèäíûé àíòèãåí ñ ìîë. ìàññîé îêîëî 84 êÄà, ïåðåêðåñòíî ðåàãèðóþùèé
ñ àíòèòåëàìè ê ÁÒØ70 êðóïíîãî ðîãàòîãî ñêîòà (ðèñ. 1;
2, á).
 òîòàëüíîì áåëêîâîì ýêñòðàêòå èíôóçîðèè P. jenningsi âûÿâëÿåòñÿ ïîëèïåïòèäíûé àíòèãåí ñ òîé æå ìîëåêóëÿðíîé ìàññîé, ÷òî è ó A. proteus, êîòîðûé òàêæå ïåðåêðåñòíî ðåàãèðóåò ñ àíòèòåëàìè ê ÁÒØ70 êðóïíîãî ðîãàòîãî
ñêîòà (ðèñ. 2, â; 3). Êðîìå òîãî, â êëåòêàõ P. jenningsi ïðè
ïîìîùè âûñîêî÷óâñòâèòåëüíîãî ìåòîäà ECL îáíàðóæèâàþòñÿ äîïîëíèòåëüíûå ìèíîðíûå ïîëèïåïòèäû ñ ìîë.
ìàññàìè îêîëî 95 è 60 êÄà, êîòîðûå òàêæå ïåðåêðåñòíî
ðåàãèðóþò ñ àíòèòåëàìè ïðîòèâ ÁÒØ70 (ðèñ. 2, â). ßâëÿþòñÿ ëè ýòè ìèíîðíûå ïîëèïåïòèäû íàòèâíûìè èëè àðòåôàêòíûìè, ïîêàæóò äàëüíåéøèå èññëåäîâàíèÿ.
Ðàíåå (Podlipaeva, 2001) óæå ñîîáùàëîñü î íàëè÷èè ó
àìåáû A. proteus (øòàìì Da èç êîëëåêöèè Ëàáîðàòîðèè
öèòîëîãèè îäíîêëåòî÷íûõ îðãàíèçìîâ Èíñòèòóòà öèòîëîãèè ÐÀÍ) ïîëèïåïòèäíîãî àíòèãåíà, ïåðåêðåñòíî ðåàãèðóþùåãî ñ ïîëèêëîíàëüíûìè íåêîììåð÷åñêèìè êðîëè÷üèìè àíòèòåëàìè, òàêæå ïîëó÷åííûìè îò Á. À. Ìàðãóëèñà (Ëàáîðàòîðèÿ çàùèòíûõ ìåõàíèçìîâ êëåòêè
Èíñòèòóòà öèòîëîãèè ÐÀÍ) è âûðàáîòàííûìè ïðîòèâ ÁÒØ70 êðóïíîãî ðîãàòîãî ñêîòà. Ïîçèöèÿ, çàíèìàåìàÿ âûÿâëåííûì ïîëèïåïòèäîì íà áëîòå îòíîñèòåëüíî
ìîëåêóëÿðíîãî ìàðêåðà 66 êÄà, ïîçâîëèëà ñäåëàòü âûâîä
î òîì, ÷òî äàííûé áåëîê ïðèíàäëåæèò ê ñåìåéñòâó
ÁÒØ70 è ÿâëÿåòñÿ áåëêîì òåïëîâîãî øîêà íà îñíîâàíèè
åãî ñðîäñòâà ê íóêëåîòèäàì ïî ðåçóëüòàòàì àôôèííîé
õðîìàòîãðàôèè, îäíàêî òî÷íîãî îïðåäåëåíèÿ è ðàñ÷åòà
åãî ìîëåêóëÿðíîé ìàññû íå ïðîâîäèëè (Podlipaeva,
2001).
Ðèñ. 1. ÁÒØ â êëåòêàõ àìåá Amoeba proteus øòàììà Val, êóëüòèâèðóåìûõ â ñðåäå ñ ðàçíîé ñîëåíîñòüþ, ïîäâåðãíóòûõ ñîëåíîñòíîìó è òåïëîâîìó øîêàì.
Èììóíîáëîòèíã ïîñëå ýëåêòðîôîðåçà â 13%-íîì ÏÀÀÃ. à — ìàðêåðû
ìîëåêóëÿðíîé ìàññû; á — êîíòðîëüíàÿ êóëüòóðà àìåá, 0 O; â — àìåáû
èç ïðåñíîé ñðåäû, ïîäâåðãíóòûå òåïëîâîìó øîêó (37 °Ñ, 1 ÷), ÷åðåç 3 ÷
ïîñëå âîçäåéñòâèÿ; ã — àìåáû èç ïðåñíîé ñðåäû, ïîäâåðãíóòûå ñîëåíîñòíîìó øîêó (2 O, 2 ÷), ÷åðåç 3 ÷ ïîñëå âîçäåéñòâèÿ; ä — êóëüòóðà àìåá,
àêêëèìèðîâàííûõ ê 2 O, íå ïîäâåðãàâøàÿñÿ øîêîâûì âîçäåéñòâèÿì;
å — êóëüòóðà àìåá, àêêëèìèðîâàííûõ ê 2 O, ïîäâåðãíóòàÿ òåïëîâîìó
øîêó (37 °Ñ, 1 ÷), ñðàçó ïîñëå âîçäåéñòâèÿ; æ — êóëüòóðà àìåá, àêêëèìèðîâàííûõ ê 2 O, ïîäâåðãíóòàÿ òåïëîâîìó øîêó (37 °Ñ, 1 ÷), ÷åðåç 3 ÷
ïîñëå âîçäåéñòâèÿ; ç — êóëüòóðà àìåá, àêêëèìèðîâàííûõ ê 2 O, ïîäâåðãíóòàÿ ñîëåíîñòíîìó øîêó (0 O, 2 ÷), ÷åðåç 3 ÷ ïîñëå âîçäåéñòâèÿ.
Îòìåòèì òàêæå, ÷òî ó ïðåñíîâîäíûõ èíôóçîðèé Tetrahymena áûë îáíàðóæåí áåëîê, íàçâàííûé ÁÒØ90
(HSP90), îáëàäàþùèé ìîë. ìàññîé 82—85 êÄà è ÿâëÿþùèéñÿ áåëêîì òåïëîâîãî øîêà (Frankel et al., 2001). Â
ïåðâè÷íîé ñòðóêòóðå ýòîãî áåëêà íå áûëî îáíàðóæåíî
ñêîëüêî-íèáóäü âûñîêîé ãîìîëîãèè ñ ÁÒØ70 ïîçâîíî÷íûõ, â òî âðåìÿ êàê â íàñòîÿùåé ðàáîòå ðå÷ü èäåò î áåëêå, èìåþùåì îáùèå àíòèãåííûå äåòåðìèíàíòû ñ ÁÒØ70
ïîçâîíî÷íûõ, ÷òî ìîæåò óêàçûâàòü íà íàëè÷èå ñóùåñòâåííîé ãîìîëîãèè â ïåðâè÷íîé ñòðóêòóðå ïîñëåäíèõ.
Ïî-âèäèìîìó, ÁÒØ90 è ÁÒØ70 ïðîñòåéøèõ ÿâëÿþòñÿ
ðàçëè÷íûìè ïîëèïåïòèäàìè.
Ïðè ïîâûøåíèè ñîëåíîñòè ñðåäû îò 0 äî 2 O êîíöåíòðàöèÿ îáíàðóæåííîãî íàìè àíòèãåíà ñïóñòÿ 3 ÷ ïîñëå âîçäåéñòâèÿ ó àìåá çàìåòíî âîçðàñòàëà (ðèñ. 1, ã).
Î÷åâèäíî, ÷òî ðå÷ü, êàê è â ñëó÷àå ÁÒØ70 ïîçâîíî÷íûõ,
èäåò î ïðîäóêòå «ðàííåãî» ãåíà, ýêñïðåññèÿ êîòîðîãî
òåìïîðàëüíî (è, ïî-âèäèìîìó, ôóíêöèîíàëüíî) ïðåäøåñòâóåò îñíîâíûì èçìåíåíèÿì â ñèíòåçå áåëêîâ, ÷òî â
ñâîþ î÷åðåäü ñîñòàâëÿåò îñíîâó ÿâëåíèÿ ôèçèîëîãè÷åñêîé àäàïòàöèè (àêêëèìàöèè) ê èçìåíèâøèìñÿ óñëîâèÿì
ñðåäû.
Ïðè òåïëîâîì øîêå ó àìåá, âûðàùåííûõ â ïðåñíîé
ñðåäå, ïîâûøàåòñÿ óðîâåíü òîãî æå ñàìîãî àíòèãåíà, ÷òî
è ïðè ñîëåíîñòíîì øîêå (ðèñ. 1, â). Òàêèì îáðàçîì, îáíàðóæåííûé íàìè àíòèãåí ìîæåò áûòü îõàðàêòåðèçîâàí
êàê ðàííèé áåëîê ñòðåññà, èììóíîëîãè÷åñêè ðîäñòâåííûé ÁÒØ70 ïîçâîíî÷íûõ è, ïî âñåé âèäèìîñòè, ÿâëÿþùèéñÿ åãî àíàëîãîì.
Àìåáû, àêêëèìèðîâàííûå ê ñîëåíîñòè 2 O, äåìîíñòðèðóþò âûñîêèé êîíñòèòóòèâíûé óðîâåíü îáíàðóæåííîãî íàìè àíòèãåíà (ðèñ. 1, ä ). Ïîâûøåííîå ñîäåðæàíèå
ÁÒØ â ñîëåíîñòè, áëèçêîé ê ãðàíèöå òîëåðàíòíîãî äèàïàçîíà äàííîãî øòàììà (2.5 O), ñ îäíîé ñòîðîíû, ïîäòâåðæäàåò ïîâðåæäàþùèé õàðàêòåð ýòèõ óñëîâèé ñðåäû,
Áåëîê òåïëîâîãî øîêà ïðåñíîâîäíûõ ïðîñòåéøèõ
533
Ðàíåå â õîäå èññëåäîâàíèé òåìïåðàòóðíûõ àäàïòàöèé ó àìåá A. proteus óæå áûëî âûÿâëåíî, ÷òî ýòè ïðîñòåéøèå îáëàäàþò çàìåòíûì êîíñòèòóòèâíûì óðîâíåì
ÁÒØ70 (Podlipaeva, 2001), è àâòîð ïðåäëàãàåò ðàññìàòðèâàòü ýòî êàê ïðåàäàïòàöèþ ê èçìåíåíèþ òåìïåðàòóðû
ñðåäû îáèòàíèÿ.
Òàêèì îáðàçîì, ïðåàäàïòàöèÿ ïðåñíîâîäíûõ ïðîñòåéøèõ, àêêëèìèðîâàííûõ â ñðåäå ñ ïîâûøåííîé ñîëåíîñòüþ ê âîçìîæíûì èçìåíåíèÿì ôàêòîðîâ ñðåäû, ïî-âèäèìîìó, ÿâëÿåòñÿ îáùèì ïðàâèëîì. Äàëüíåéøèå èññëåäîâàíèÿ ñ ïðèâëå÷åíèåì ïðåñíîâîäíûõ ïðîñòåéøèõ èç
äðóãèõ òàêñîíîìè÷åñêèõ ãðóïï ïîçâîëÿò ïðîâåðèòü
ñïðàâåäëèâîñòü ýòîé ãèïîòåçû.
Àâòîðû âûðàæàþò ãëóáîêóþ ïðèçíàòåëüíîñòü Á. À. Ìàðãóëèñó çà ïðåäîñòàâëåíèå àíòèòåë ïðîòèâ ÁÒØ70.
Ðàáîòà âûïîëíåíà ïðè ôèíàíñîâîé ïîääåðæêå Ðîññèéñêîãî ôîíäà ôóíäàìåíòàëüíûõ èññëåäîâàíèé (ïðîåêòû 04-04-49811 è 03-04-48062).
Ðèñ. 2. ÁÒØ â êëåòêàõ àìåá Amoeba proteus øòàììà Val è èíôóçîðèé Paramecium jenningsi øòàììà SR1, êóëüòèâèðóåìûõ â
ïðåñíîé ñðåäå.
Èììóíîáëîòèíã ïîñëå ýëåêòðîôîðåçà â 13%-íîì ÏÀÀÃ. à — ìàðêåðû
ìîëåêóëÿðíîé ìàññû, á — àìåáû, â — èíôóçîðèè.
à ñ äðóãîé — ñîãëàñóåòñÿ ñ ðàíåå ïîëó÷åííûìè äàííûìè
ïî òåìïåðàòóðíîìó âîçäåéñòâèþ íà àìåá äðóãîãî øòàììà òîãî æå âèäà (Podlipaeva, 2001).
Ëþáîïûòíî, ÷òî ïðè äîïîëíèòåëüíîì ñòðåññîâîì
âîçäåéñòâèè (ïåðåíîñ êëåòîê, àêêëèìèðîâàííûõ ê ýòîé
ñîëåíîñòè, â ïðåñíóþ ñðåäó (ðèñ. 1, ç), à òàêæå òåïëîâîé
øîê (ðèñ. 1, å, æ)) óðîâåíü ÁÒØ70 ñíèæàåòñÿ. Ýòî ìîæåò îçíà÷àòü, ÷òî íàêîïëåííûé áåëîê ðàñõîäóåòñÿ ïðè
ñòðåññîâîì âîçäåéñòâèè. Èíûìè ñëîâàìè, ïðåñíîâîäíûå
àìåáû, àêêëèìèðîâàííûå ê ïîâûøåííîé ñîëåíîñòè, ïðåàäàïòèðîâàíû ê âîçìîæíîìó ñòðåññîâîìó âîçäåéñòâèþ,
à ñâîéñòâà èõ øàïåðîííîé ñèñòåìû â ïðîöåññå àäàïòàöèè èçìåíÿþòñÿ.
Àíàëîãè÷íàÿ êàðòèíà âûÿâëÿåòñÿ ìåòîäîì äîò-áëîòèíãà è ó ïðåñíîâîäíûõ èíôóçîðèé P. jenningsi: óðîâåíü
ÁÒØ70 íåçíà÷èòåëåí â êëåòêàõ, âûðàùåííûõ â ïðåñíîé
ñðåäå (ðèñ. 3, à), è ïîâûøàåòñÿ ïðè ñîëåíîñòíîì øîêå
(ðèñ. 3, â). Íàïðîòèâ, èíôóçîðèè, àêêëèìèðîâàííûå ê ñîëåíîñòè 2 O, äåìîíñòðèðóþò âûñîêèé êîíñòèòóòèâíûé
óðîâåíü ÁÒØ70 (ðèñ. 3, á), êîòîðûé ñíèæàåòñÿ (ðàñõîäóåòñÿ) ïðè ñòðåññîâîì âîçäåéñòâèè (ñîëåíîñòíîì øîêå)
(ðèñ. 3, ã).
Ðèñ. 3. ÁÒØ â êëåòêàõ èíôóçîðèé Paramecium jenningsi øòàììà SR1, êóëüòèâèðóåìûõ â ñðåäå ñ ðàçíîé ñîëåíîñòüþ è ïîäâåðãíóòûõ ñîëåíîñòíûì øîêàì.
Èììóíîõèìè÷åñêàÿ îêðàñêà äîò-áëîòîâ òîòàëüíîãî áåëêîâîãî ýêñòðàêòà
èíôóçîðèé. à — êîíòðîëüíàÿ êóëüòóðà èíôóçîðèé, 0 O; á — êóëüòóðà
èíôóçîðèé, àêêëèìèðîâàííûõ ê 2 O; â — ñîëåíîñòíûé øîê 0 D 2 O;
ã — ñîëåíîñòíûé øîê 2 D 0 O.
Ñïèñîê ëèòåðàòóðû
Ìàðãóëèñ Á. À., Ãóæîâà È. Â. 2000. Áåëêè ñòðåññà â ýóêàðèîòè÷åñêèõ êëåòêàõ. Öèòîëîãèÿ. 42 (4) : 323—342.
Øóáðàâûé Î. È. 1983. Àêâàðèóì ñ èñêóññòâåííîé ìîðñêîé
âîäîé äëÿ ñîäåðæàíèÿ ïðèìèòèâíîãî ìíîãîêëåòî÷íîãî îðãàíèçìà Trichoplax è äðóãèõ ìåëêèõ áåñïîçâîíî÷íûõ. Çîîë. æóðí.
62 (4) : 618—621.
Bakatselou C., Beste D., Kadri A. O., Somanath S., Clarka C. G. 2003. Analysis of genes of mitochondrial origin in the genus Entamoeba. J. Eukar. Microbiol. 50 : 210—214.
Barque J. P., Schedler P., Floch E., Bonaly J. 2000. In Euglena gracilis, a heat-shock protein related to hsc73 is constitutive and
stress inducible. Arch. Biochem. Biophys. 378 : 1—5.
Deane E. E., Wool N. Y. 2004. Differential gene expression associated with euryhalinity in sea bream (Sparus sarba). Amer. J.
Physiol. 287 : R1054—R1063.
Drzymalla C., Schroda M., Beck C. F. 1996. Light-inducible gene HSP70B encodes a chloroplast-localized heat shock protein in Ñhlamydomonas reinhardtii. Plant Mol. Biol. 31 : 1185—
1194.
Feder M. E., Hofmann G. E. 1999. Heat-shock proteins molecular chaperones, and the stress response: evolutionary and ecological physiology. Ann. Rev. Physiol. 61 : 243—282.
Field J., Van Dellen K., Ghosh S. K., Samuelson J. 2000. Responses of Entamoeba invadens to heat shock and encystations are
related. J. Eukar. Microbiol. 47 : 511—514.
Fink K., Zeuthen E. 1980. Heat shock proteins in Tetrahymena
studied under growth conditions. Exp. Cell Res. 128 : 23—30.
Frankel J., Williams N. F., Nelsen E. M., Keeling P. J. 2001.
An evaluation of Hsp90 as a mediator of cortical patterning in Tetrahymena. J. Eukar. Microbiol. 48 : 147—160.
Hori M., Fujishima M. 2003. The endosymbiotic bacterium
Holospora obtusa enhances heat-shock gene expression in the host
Paramecium caudatum. J. Eukar. Microbiol. 50 : 293—298.
Joshi B., Biswas S., Sharma Y. D. 1992. Effect of heat-shock
on Plasmodium falciparum viability, growth and expression of
the heat-shock protein «PFHSP70-I» gene. FEBS Lett. 312 : 91—
94.
Kalinina L. V., Khrebtukova I. A., Podgornaya O. L., Wasik A., Sikora J. 1988. Heat shock proteins in Amoeba. Eur. J. Protistol. 24 : 64—68.
La Terza A., Papa G., Miceli C., Luporini P. 2001. Divergence
between two antarctic species of the ciliate Euplotes, E. focardii
and E. nobilii, in the expression of heat-shock protein 70 genes.
Mol. Ecol. 10 : 1061—1067.
Laemmli U. K. 1970. Cleavage of structural proteins during the
assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 : 680—685.
À. Þ. Ïëåõàíîâ, À. Î. Ñìóðîâ è äð.
534
Lloyd D., Ralphs James R., Harris Janine C. 2002. Giardia intestinalis, a eukaryote without hydrogenosomes, produces hydrogen. Microbiology. 148 : 727—733.
McMullin Th. W., Hallberg R. L. 1987. A normal mitochondrial
protein is selectively synthesized and accumulated during heat shock
in Tetrahymena thermophila. Mol. Cell. Biol. 7 : 4414—4423.
Perez-Serrano J., Martinez J., Perez B., Bernadina W. E.,
Rodriguez-Caabeiro F. 2000. In vitro shock response to different
stressors in free living and pathogenic Acanthamoeba. Int. J. Parasitol. 30 : 829—835.
Plekhanov A. Y. 1996. Immunoreplica from the gel surface: rapid and sensitive blot plus intact gel. Anal. Biochem. 239 :
110—111.
Podlipaeva Y. I. 2001. Heat shock protein of 70 kDa in Amoeba proteus. Protistology. 2 : 123—129.
Prescott D. M., Carrier R. F. 1964. Experimental procedures
and cultural methods for Euplotes eurystomus and Amoeba proteus.
In: Methods in cell physiology. New York; London: Acad. Press.
1 : 85—95.
Requena J. M., Jimee-Ruiz H., Soto M., Assiego R., Santaren J. F., Lopez A., Pataroyo E., Alonso C. 1992. Regulation of
HSP70 expression in Trypanosoma cruzi by temperature and growing phase. Mol. Biochem. Parasitol. 53 : 201—211.
Smurov A. O., Fokin S. I. 1998. Resistance of Paramecium caudatum infected with endonuclear bacteria Holospora against salinity impact. Proc. Zool. Inst. 276 : 175—178.
Sonneborn T. M. 1970. Methods in Paramecium research.
Meth. Cell Physiol. 4 : 241—339.
Towbin H., Staeheln T., Gordon J. 1979. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets:
procedure and some applications. Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 76 :
4350—4354.
Triana O., Galanti N., Olea H., Wernstedt L. H., Medina C.,
Toro G. C. 2000. Chromatin and histones from Giardia lamblia: a
new puzzle in primitive eukaryotes. J. Cell. Biochem. 82 : 573—
582.
Varadharajan S., Chandrashekar B. K. S., Rangarajan P. N.,
Govindarajan P. 2004. Localization of ferrochelatase in Plasmodium falciparum. Biochem. J. 384 : 429—436.
Wallace G. R., Ball A. E., Mac Farlane J., el Safi S. H., Miles M. A., Kelly J. M. 1992. Mapping of visceral leishmaniasis-specific immunodominant B-cell epitope of Leishmania donovani
Hsp70. Infection and Immunity. 60 : 2688—3693.
Ïîñòóïèëà 29 XI 2005
HEAT SHOCK PROTEINS OF FRESHWATER PROTISTS AND THEIR INVOLVEMENT
IN ADAPTATION TO CHANGES IN THE ENVIRONMENTAL SALINITY
A. Yu. Plekhanov,1 A. O. Smurov,2, 3 Yu. I. Podlipaeva,4 L. O. Ivanova,3 A. V. Goodkov3, 4
1
St. Petersburg Nuclear Physics Institute RAS, 2 Zoological Institute RAS,
3 Biological Research Institute, St. Petersburg State University, and
4 Institute of Cytology RAS, St. Petersburg;
e-mail: [email protected]
Changes in the level of heat shock proteins (HSP) in cells of freshwater protists, amoebae Amoeba proteus
and ciliates Paramecium jenningsi, in response to changes in the environmental salinity were investigated.
Changes in salinity levels were considered as a stress factor. The immunoblotting method revealed a polypeptide antigen cross-reacting with antibodies against bovine HSP70 in total protein extracts of both intact cells and
cells subjected to salinity stress. The same polypeptide antigen was revealed in A. proteus cells subjected to heat
shock. Therefore, it may be supposed that the polypeptide revealed after salinity shock is a heat shock protein related to the vertebrate HSP70. Under the impact of stress factor, well acclimated protists mostly spend their own
previously accumulated HSP70. A conclusion is made that freshwater protists, living under conditions of increased salinity, appear to be preadapted to changes in environmental factors.
K e y w o r d s: salinity adaptation, freshwater protists, Amoeba proteus, Paramecium jenningsi, heat shock
proteins.