Опухолевые супрессоры и мутаторные гены
реклама
Опухолевые супрессоры и мутаторные гены Б.П.Копнин Российский онкологический научный центр им. Н.Н.Блохина РАМН, Москва Введение Ключевую роль в возникновении важнейших свойств неопластической клетки играют нарушения функции протоонкогенов, опухолевых супрессоров и так называемых мутаторных генов. Термином опухолевые супрессоры (другие названия - антионкогены, рецессивные опухолевые гены) принято обозначать гены, инактивация функции которых ведет к возникновению и/или прогрессии новообразований. И, наоборот, восстановление экспрессии некоторых из таких генов в опухолевых клетках может подавить их дальнейшее размножение. Мутаторными называют гены, нарушения функции которых тем или иным способом увеличивает темп возникновения мутаций и/или других генетических изменений. Следует заметить, что многие из опухолевых супрессоров являются одновременно и мутаторными генами. Инактивация таких генов столь сильно увеличивает вероятность появления различных онкогенных мутаций, что образование опухоли становится лишь делом времени. Действительно, врожденные мутации даже в одном из аллелей некоторых из опухолевых супрессоров/мутаторных генов делает очень вероятным возникновение в молодом возрасте определенных форм новообразований: сарком, лейкозов, опухолей мозга или раков молочной железы (синдром Ли-Фраумени) при мутациях р53; раков молочной железы и яичников - при мутациях генов BRCA1 и BRCA2; и т.д. (см. Табл. 1). Табл.1. Основные характеристики некоторых идентифицированных опухолевых супрессоров и мутаторных генов Ген Хромо- Новообразования* Функция белка сомная локализация p53 17p13 Синдром Ли-Фраумени (раздел Регуляция клеточного цикла, II.3.3.1) и большинство форм апоптоза, репарации ДНК; спорадических опухолей поддержание целостности генома INK4a** 9p21 Наследственная меланома Ингибирование Cdk4 (p16INK4a), имногие спорадические опухоли активация р53 (p14ARF) Rb 13q14 Наследственная ретинобластома Контролирует вход в S-фазу и и остеосаркома; многие формы дифференцировку клеток спорадических опухолей TbR-II 3p22 Наследственный и Рецептор второго типа для TGF- спорадический рак толстой β кишки SMAD2, 18q21 Рак толстой кишки, легкого, Передают SMAD 3 15q21- поджелудочной железы активирован-ных 18q21 от рецепторов TGF-β к Smad4 22 SMAD4/ сигнал Ювенильный гамартоматозный Транскрипционный фактор, полипоз желудка и кишечника; опосредует действие TGF-β DPC4 различные формы спорадических опухолей СDH1 16q24 Наследственный рак желудка и Участвует в межклеточных (Е- многие формы спорадические взаимодействиях, кадгерин) опухоли APC 5q21 активность β-катенина Наследственный аденоматозный Регулирует полипоз и стабильность спорадические транскрипционную опухоли толстой кишки AXIN регулирует 16p13.3 Гепатоцеллюлярный и активность β-катенина рак, - опухоли толстой кишки VHL 3р25-26 Синдром фон Хиппеля-Линдау Подавляет экспрессию гена (раздел II.3.8); светлоклеточная VEGF (фактора роста эндотелия карцинома почки) сосудов) и других генов, активируемых при гипоксии WT1 11p13 наследственная нефробластома Регуляция (опухоль Вилмса) PTEN/ MMAC1 дифференцировки 10q23.3 Болезнь Коудена, (раздел II.5.5), Стимуляция многие спорадические опухоли урогенитальной апоптоза, ингибирование входа в S-фазу клеточного цикла NF1 17q11.2 Нейрофиброматоз 1-го типа (нейро- Переводит гены ras из активной в неактивную форму фибромин) NF2 22q11.1 Нейрофиброматоз (мерлин) 2-го типа; Осуществляет связь мембраны с менингиома, мезотелиома и др. цитоскелетом, опухоли ATM обеспечивает контактное торможение деления 11q23.1 Атаксия-телеэктазия (разд.II.3.11) При повреждениях ДНК активи- спорадические рует р53, NBS1, BRCA1/2 и др. лимфолейкозы NBS1 8q21 Ниймегенский (разд.II.3.11), синдром При повреждениях ДНК спорадические активирует CHK2, BRCA1 и др. лимфолейкозы CHK2 22q Вариант синдрома Ли-Фраумени При повреждениях ДНК активирует р53 и BRCA1 BRCA1 17q21 Наследственные опухоли Модулирует активность многих молочной железы и яичников факторов транскрипции, участвует в репарации ДНК BRCA2 13q12 Наследственные опухоли Модулирует молочной железы и яичников транскрипцию генов, участвует в репарации ДНК Неполипозный MSH2, 2p-162 MSH6, p15-163 кишки MLH1, p21.37 PMS2 p22 и рак яичников; толстой Репарация неспаренных участков многие ДНК (mismatch repair) спорадические опухоли *Подчеркнуты наследственные формы заболеваний, возникающие при мутациях в половых клетках. ** Ген INK4a кодирует два белка: p16INK4a и p14ARF (Alternative Reading Frame) продукт альтернативной рамки считывания. Делеции и многие точечные мутации в гене INK4a вызывают одновременную инактивацию супрессорных активностей обоих этих белков. Доказательством причинной роли таких мутаций в канцерогенезе являются результаты экспериментов по созданию линий трансгенных мышей, во всех клетках которых инактивированы ("нокаутированы") один или оба аллеля какого-либо из опухолевых супрессоров или мутаторных генов. Если такие изменения не вызывают внутриутробную гибель, то у рождающихся животных возникает сильная предрасположенность к развитию определенных новообразований. Так, мыши с инактивированным р53 характеризуются почти 100%-ной вероятностью развития в молодом возрасте новообразований, спектр которых сходен с наблюдаемым при синдроме Ли-Фраумени. Геном человека содержит по меньшей мере несколько десятков опухолевых супрессоров и мутаторных генов. Более 30 из них уже идентифицированы, для многих известны выполняемые в клетке функции (см. Табл. 1). Кроме того, выявлено еще несколько десятков участков хромосом, потери которых обнаруживаются во многих случаях какойто определенной формы опухолей или в различных новообразованиях, что указывает на возможную локализацию в них потенциальных опухолевых супрессоров. Ниже будут рассмотрены основные сведения о функциях известных опухолевых супрессоров/мутаторных генах и возможных механизмах возникновения новообразований при их нарушениях. pRb - первый идентифицированный опухолевый супрессор Идентификация опухолевых супрессоров началась с обнаружения гена Rb, врожденные мутации которого вызывают развитие ретинобластом. В начале 1970-х г.г. Кнудсон, проводя эпидемиологические исследования, отметил, что около 40% ретинобластом возникает в младенческом возрасте (средний возраст 14 месяцев). Причем эти опухоли, как правило, билатеральные (возникают из сетчатки обоих глаз) и часто множественные (в среднем по 3 независимых опухоли на пациента). Если такие пациенты в результате хирургического вмешательства излечивались от ретинобластом, у многих из них в юношеском возрасте развивались остеосаркомы, а в зрелом возрасте - меланомы кожи. При этом во многих случаях отмечался наследственный характер заболевания. Кнудсон сформулировал гипотезу, согласно которой, если дети наследуют мутантный аллель гена, позже названного Rb, то вторая мутация, происходящая уже в ретинобласте, ведет к возникновению опухоли. Это довольно частое событие (происходит примерно у 95% пациентов с частотой около трех на пациента) и, поэтому, предрасположение к развитию болезни имеет доминантный характер наследования. Кнудсон предположил также, что дети, у которых ретинобластомы возникают в более позднем возрасте (частота таких опухолей невелика - 1 на 30000 индивидуумов), не наследуют мутантный аллель гена Rb. Вместо этого у них происходят две независимые мутации в одном из ретинобластов, что и приводит к развитию опухоли. Следовательно, согласно гипотезе Кнудсона, у первой группы пациентов имеется одна врожденная и одна приобретенная мутации, тогда как у второй группы больных обе мутации приобретенные. Так как при некоторых наследственных ретинобластомах обнаруживались небольшие делеции участка длинного плеча хромосомы 13 (13q14), было предположено, что ген "предрасположенности к ретинобластоме" (Rb) локализуется именно в этом участке генома. И действительно, с помощью позиционного клонирования был изолирован ген, оба аллеля которого инактивированы в клетках как наследственных, так и спорадических ретинобластом. При этом при наследственных формах заболевания все клетки организма имели врожденные мутации этого гена. Таким образом, стало ясно, что постулируемые Кнудсоном две мутации, необходимые для развития ретинобластом, происходят в разных аллелях одного и того же гена Rb. Инактивация гена Rb была обнаружена не только в ретинобластомах, но и в клетках некоторых других, ненаследственных новообразований: практически во всех случаях мелкоклеточного рака легкого, части случаев (20-40%) острого лейкоза, остеосаркомы, рака мочевого пузыря, простаты и др. Восстановление экспрессии этого гена в культивируемых in vitro клетках ретинобластом и остеосарком приводило к торможению их роста. Таким образом, впервые были получены веские доказательства существования генов, полная инактивация которых приводит к развитию новообразований и продукты которых способны подавить размножение неопластических клеток. Закономерности, выявленные при исследовании гена Rb, в частности ассоциация с наследственными формами опухолей и необходимость поражения обоих аллелей (рецессивный характер проявления мутаций), стали использоваться в качестве критериев при поиске и идентификации других опухолевых супрессоров. В настоящее время достигнут значительный прогресс в понимании нормальной функции продукта гена Rb (pRb) в клетке, охарактеризованы типы и местоположение мутаций в гене Rb при ретинобластомах и других новообразованиях, предложены высокоэффективные методы скрининга мутаций Rb у индивидуумов в группах риска. Функция pRb в клетке и ее нарушения при канцерогенезе pRb представляет собой фосфобелок c мол. массой 105кД, локализующийся в ядре и экспрессирующийся в большинстве типов клеток. Он дефосфорилирован в неделящихся клетках, а также в пролиферирующих клетках, находящихся в начале G1 фазы клеточного цикла. В таком состоянии pRb образует комплексы с рядом белков, в том числе с белками, вызывающими ремоделирование хроматина (гистоновые деацетилазы HDAC, комплексы SWI-SNF) и транскрипционными факторами семейства E2F, регулирующими активность генов, продукты которых необходимы для начала и прохождения S-фазы (циклин Е, циклин А, дигидрофолатредуктаза, тимидинкиназа, PCNA, ДНК-полимераза a и др). Транскрипция этих генов подавлена, если E2F связан с комплексами HDAC/pRb/SWISNF. При митогенных сигналах pRb в середине G1 фазы фосфорилируется по определенным аминокислотным остаткам циклинзависимой киназой циклин D/Сdk4(6), что вызывает отвязывание от него HDAC. Комплекс pRb/SWI-SN (без HDAC) не блокирует способность E2F транс-активировать ген циклина E, но репрессирует транскрипцию других E2F-регулируемых генов, в частности циклина А. В результате в конце G1 фазы происходит избирательная активация циклинзависимой киназы циклин Е/Cdk2, которая дополнительно фосфорилирует pRb по другим аминокислотным остаткам. Это вызывает высвобождение транскрипционного фактора E2F из комплексов с pRb/SWI-SNF и его активацию, приводящую к повышению экспрессии циклина А и других генов, продукты которых необходимы для синтеза ДНК (Рис. 1). Рис. 1. pRb регулирует активность транскрипционных факторов семейства E2F и циклинзависимых киназ, ответственных за вход и продвижение по S фазе клеточного цикла (объяснения в тексте). После завершения S фазы pRb переходит в дефосфорилированное состояние, в котором он блокирует активность E2F и вход в следующую S фазу (для ее инициации необходим новый митогенный стимул, активирующий комплексы циклин D/Cdk4). Таким образом, модулируя активность E2F и регулируемых им генов, pRb играет ключевую роль в контроле последовательности событий, обеспечивающих переход клетки из G0/G1 в S фазу и ее успешное завершение. В дополнение к E2F pRb связывает и модулирует активность ряда других транскрипционных факторов, большинство из которых тканеспецифичны и участвуют в регуляции определенных дифференцировочных программ. Так, он увеличивает транскрипционную активность некоторых представителей семейства bHLH (MyoD и др.), которые стимулируют мышечную дифференцировку и семейства C/EBP, играющих ключевую роль в моноцитарно-макрофагальной (NF-IL6) и адипоцитарной (C/EBP-b) дифференцировках. Кроме того, pRb связывает и репрессирует гомеобокс-содержащие транскрипционные факторы (Pax-3, Mhox, Chx10), определяющие судьбу клетки в раннем эмбрионенезе. Все это дало основание полагать, что основная физиологическая функция pRb заключается в детерминировании некоторых терминальных дифференцировок, для чего необходима остановка клеточного цикла (осуществляется за счет подавления функции E2F) и индукция экспрессии ряда специализированных белков (реализуется путем модификации активности тканеспецифичных транскрипционных факторов). Значительная часть мутаций гена Rb, обнаруживаемых в различных опухолях, вызывают либо делецию гена, либо сдвиг кодирующей рамки, либо ее преждевременную терминацию, либо нарушения сплайсинга мРНК. Все это приводит или к полной потере экспрессии белкового продукта, или к экспрессии неполноценных и нестабильных белков pRb. В части случаев наблюдаются миссенс-мутации, вызывающие замену одного из аминокислотных остатков. Такие мутации поражают домен, ответственный за связывание pRb c рядом клеточных белков и вирусными онкобелками - T-SV40, E1A аденовирусов и E7 HPV. По-видимому нарушение функции именно этого домена, вызываемое либо мутациями, либо его связыванием с вирусными онкобелками, является критичным для подавления супрессорной активности pRb. При мутациях обоих аллелей гена Rb, вызывающих отсутствие в клетке белка pRb или экспрессию его функционально неактивной формы, транскрипционный фактор E2F находится в перманентно активированном состоянии. Это, во-первых, уменьшает зависимость размножения клеток от ростовых факторов, а во-вторых, отменяет негативную регуляцию клеточной пролиферации при рост-ингибирующих сигналах. Кроме того, потеря функции pRb нарушает процессы клеточной дифференцировки. Все это резко увеличивают вероятность появления постоянно пролиферирующих клонов клеток, в которых будут накапливаться и другие онкогенные мутации, ведущие к злокачественной трансформации. При этом, пока остается неясным, почему при врожденной инактивации одного из аллелей гена Rb во всех клетках организма у пациента в юном возрасте развивается именно ретинобластома, а не какие-то другие новообразования. Интересно, что у трансгенных мышей с инактивацией одного из аллелей гена Rb (инактивация обоих аллелей несовместима с жизнью эмбрионов из-за нарушений эритропоэза и нейрогенеза) возникают не ретинобластомы, а медуллярные раки щитовидной железы или аденомы средней доли гипофиза, возникающие из меланофоров (в отличие от мышей у человека эта ткань в гипофизе атрофирована). Более того, ретинобластомы не развиваются и у химерных мышей, во всех клетках сетчатки которых инактивированы оба аллеля гена Rb. Отсутствие ретинобластом у таких химерных мышей может быть объяснено относительно небольшим, по сравнению с человеком, количеством клеток в сетчатке, что уменьшает вероятность возникновения в течение короткой жизни животного в одном из ретинобластов дополнительных генетических изменений, необходимых для развития новообразования. Меньшая вероятность таких событий может быть также связана с отсутствием у лабораторных мышей дополнительных канцерогенных факторов, таких как облучение клеток сетчатки солнечным светом, способствующему, очевидно, развитию ретинобластом в аналогичной ситуации у человека. В пользу предположения о необходимости для развития ретинобластом дополнитльных событий может свидетельствовать тот факт, что ретинобластомы возникают у трансгенных мышей, экспрессирующих вирусный онкобелок T-SV40, который связывает и инактивирует не только pRb, но и его гомологи (см. ниже), а также другой опухолевый супрессор - р53 (см. раздел 3.3). Гомологи pRb: p107 и Rb2/p130 Несколько позже, в начале 90-х гг. было идентифициоровано два гена, продукты которых, белки р107 и Rb2/p130, имеют структурное сходство и частично перекрывающиеся функции с pRb. Так, подобно pRb, они способны подавлять активность E2F-респонсивных генов и блокировать вход в фазу S. Вместе с тем, они имеют ряд отличий от pRb. В частности, они связывают только E2F4 и E2F5, тогда как рRb взаимодействует с E2F1, E2F2, E2F3 и E2F4. Возможно поэтому р107 и Rb2/p130, в отличии от pRb, не способны поддерживать длительное пребывание в G0 и дифференцировку некоторых типов клеток, например миоцитов. Нарушения функции гомологов pRb, по-видимому, не причастны к инициальным этапам развития каких-либо опухолей человека, так как пока не выявлены наследственные формы новообразований с врожденными герминальными мутациями генов р107 или Rb2/p130. Кроме того, у мышей с гетерозиготным нокаутом этих генов частота возникновения опухолей не повышается. В то же время соматические инактивирующие мутации гена Rb2/p130 характерны для части случаев лимфомы Беркита, рака носоглотки и мелкоклеточного рака легкого, причем, как правило, они выявляются на поздних стадиях заболевания. Вероятно, нарушения функции этого гомолога pRb обеспечивают прогрессию некоторых новообразований. р53 - многофункциональный опухолевый супрессор, чаще всего поражаемый в различных новообразованиях человека Типы опухолей, ассоциированные с аномалиями р53 Наиболее универсальным молекулярным изменением в различных новообразованиях человека является инактивация функции белка р53. Более чем в половине всех опухолей человека (50-60% новообразований более чем 50 различных типов) обнаруживаются мутации гена р53. В отличие от других опухолевых супрессоров, для которых характерны мутации, прекращающие синтез белка (делеции, образование стоп-кодонов, сдвиг кодирующей рамки, нарушения сплайсинга мРНК), подавляющее большинство (более 90%) мутаций р53 представляет собой миссенс-мутации, приводящие к замене одной из аминокислот в белковой молекуле на другую. Еще одной особенностью мутаций р53 в опухолевых клетках является то, что они, в отличие от мутаций других опухолевых супрессоров, часто являются гетерозиготными, т.е. поражают только один из двух аллелей гена. (Причины этих различий будут раскрыты ниже, при рассмотрении структурной организации и функций р53 - см. раздел 3.3.2.) Мутации обнаруживаются в разных участках молекулы р53, но чаще всего в его эволюционно консервативном ДНКсвязывающем домене, причем с наибольшей частотой в кодонах 175, 245, 248, 249, 273 и 282 (так называемые горячие точки) - см. Рис. 2. Интересно, что спектр мутаций несколько меняется в зависимости от гистогенеза опухоли и/или этиологического фактора. Например, мутации в кодоне 175 не встречаются в опухолях легких, а замены в другой горячей точке - кодоне 273 - не обнаруживаются при бластном кризе хронического миелоидного лейкоза. В то же время для раков легкого характерны мутации в кодоне 145, очень редко встречающиеся в других новообразованиях, а мутации в кодоне 249 обнаруживаются преимущественно в гепатокарциномах, вызванных специфическим канцерогеном - афлатоксином В. Очевидно, отражением действия канцерогенов с разными механизмами мутагенного действия являются и отличия в характере мутаций р53 в разных опухолях. Так, при опухолях лёгких, печени и лимфомах замена аминокислотных остатков в большинстве случаев обусловлена трансверсиями (в ДНК пуриновый нуклеотид заменен на пиримидиновый или наоборот), а при карциномах кожи, лимфоме Беркитта, Т-клеточном лейкозе - транзициями (заменой пуринового основания на другое пуриновое или пиримидинового на другое пиримидиновое). Герминальные (произошедшие в половой клетке и передающиеся по наследству) мутации в одном из аллелей гена р53 вызывают синдром Ли-Фраумени, заключающийся во врожденном предрасположении к развитию различных новообразований, в первую очередь сарком, рака молочной железы, лимфолейкозов. Нередко синдром Ли-Фраумени характеризуется возникновением первично-множественных опухолей. Примечательно, что у трансгенных мышей, несущих инактивирующие мутации в гене р53, наблюдается картина, очень напоминающая синдром Ли-Фраумени. Примерно у трети животных, у которых инактивирован один из двух аллелей р53, в течение 6-9 месяцев после рождения возникают новообразования, причем их спектр очень сходен с наблюдаемым при синдроме Ли-Фраумени. При этом в части этих опухолей, как и новообразований у пациентов с синдромом Ли-Фраумени, сохраняется экспрессия неповрежденного аллеля гена р53. При врожденной инактивации во всех клетках организма обоих аллелей гена р53 опухоли развиваются практически у всех животных. Примерно такая же картина наблюдается у трансгенных мышей, несущих дополнительный экзогенный аллель р53, кодирующий белок с миссенс-мутацией. Важно подчеркнуть, что мутации - не единственный путь нарушения функции белка р53 в опухолевых клетках. Так, для 10-20% рака молочной железы, а также для нейробластом характерно нарушение транспорта р53 из цитоплазмы в ядро, где он проявляет свою функциональную активность. В части остеосарком наблюдается амплификация клеточного онкогена MDM2, продукт которого связывает и инактивирует белок р53 (см. раздел 3.3.3). При раке шейки матки, ассоциированном с вирусами папиллом человека, происходит связывание р53 с вирусным онкобелком Е6), что вызывает деградацию белка р53, и т.д. Структурная организация и биохимические активности белка р53 Продукт гена р53 имеет мол. массу 53кДа и состоит из 392 аминокислотных остатков. Он образует тетрамерный комплекс, способный регулировать транскрипцию ряда генов, имеющих в своем составе специфические последовательности ДНК, так называемые р53респонсивные элементы. В молекуле р53 картировано несколько функциональнозначимых доменов, играющих важную роль в осуществлении или регуляции его активности (Рис. 2). N-концевой участок (аминокислоты 1-42) представляет собой домен, ответственный за транскрипционную активацию генов-мишеней. Он обладает способностью связываться с компонентами базальных факторов транскрипции, в частности с субъединицами hTAFII31, hTAF70 комплекса TFIID РНК-полимеразы II, а также с транскрипционным кофактором p300/CBP. Кроме того, этот домен участвует в белок-белковых взаимодействиях, регулирующих стабильность молекулы р53. И, наконец, в нем расположено несколько остатков серина и треонина, фосфорилирование которых регулирует активность р53. Рис. 2. Схематическое изображение функциональных доменов р53, предполагаемой модели приобретения белком транскрипционно активной конформации и частоты встречаемости в новообразованиях человека мутаций в разных участках молекулы р53. Центральный домен р53 (аминокислоты 120-290) непосредственно узнает и связывает специфические последовательности ДНК регулируемых генов, так называемые р53респонсивные элементы, состоящие из расположенных друг за другом последовательностей с обобщенной структурой типа PuPuC(A/T)(A/T)GPyPyPy (Pu пурин, Py - пиримидин). Именно в этом ДНК-связывающем домене локализуется большинство точечных мутаций, обнаруживаемых в различных опухолях человека (Рис. 2). Далее идут участки ответственные за ядерную локализацию (аминокислоты 305-323) и димеризацию/тетрамеризацию молекул р53 (аминокислоты 323-356). С-концевой участок р53 (аминокислоты 363-392) представляет собой так называемый ингибиторный домен. В немодифицированном состоянии он препятствует посадке ДНК-связывающего домена на специфическую последовательность регулируемого гена. Фосфорилирование и ацетилирование его определенных сайтов вызывают изменения конформации белковой молекулы и переход тетрамеров р53 из неактивного (латентного) состояния в активное. В результате ДНК-связывающие домены освобождаются от блокирующего влияния ингибиторных доменов и приобретают способность садиться на р53-респонсивные элементы. Таким образом, к респонсивным генам привлекаются базовые факторы транскрипции, связывающиеся с N-концевым участком р53, и стимулируется синтез РНК генов-мишеней. Помимо повышения транскрипции генов, содержащих специфические респонсивные элементы, белок р53 обладает также и рядом других активностей. В частности, он способен подавлять транскрипцию многих других генов, например протоонкогенов BCL2, JUN и FOS, гена фибронектина и т.д. В основе такой транс-репрессии лежит несколько механизмов: связывание и секвестрация активированным р53 ряда базовых факторов транскрипции (p300/CBP, TBP, CBF); способность связывать и рекрутировать к определенным генам гистоновые деацетилазы (HDAC), ремоделирующие хроматин; и т.д. Кроме того, р53 связывается с белками, вовлеченными в репликацию или репарацию ДНК и, как следствие, модулирует эти процессы. Так, взаимодействуя с белком RP-A, он ингибирует его способность активировать ДНК-полимеразы a и d, результатом чего является подавление репликации ДНК. Связывая компоненты комплекса TFIIH (ERCC2, ERCC3 и др.), р53 активирует его функцию и стимулирует тем самым эксцизионную репарацию ДНК. Связывание р53 с белком Rad51 ведет к стимуляции рекомбинаций ДНК и повышению эффективности репарацию двунитевых разрывов ДНК. На участие р53 в репарации ДНК указывает также и его способность проявлять активность 3'-5'экзонуклеазы и узнавать участки одноцепочечной ДНК и/или неспаренные основания. Рис. 3. Схематическое изображение различных конформационных состояний р53, распознаваемых специфическими антителами. Онкогенные мутации вызывают необратимый переход молекулы в денатурированное состояние, при котором открывается ранее недоступный эпитоп и, наоборот, исчезают некоторые ранее доступные эпитопы. Характерные для опухолевых клеток миссенс-мутации приводят к резкому изменению конформации молекулы белка р53 (Рис. 3), что в значительной степени затрагивает все из вышеуказанных его активностей: происходит потеря или ослабление способности связывать и активировать гены с р53-респонсивными элементами, репрессировать другие специфические гены-мишени, ингибировать репликацию ДНК и стимулировать репарацию ДНК. Причем, так как р53 образует тетрамерные комплексы, мутации в одном аллеле гена р53 вызывают инактивацию и продукта второго, неповрежденного аллеля. Дело в том, что коэкспрессирующиеся нормальный и мутантный белок р53 образуют неактивные гетеромерные комплексы. Таким образом, мутантный белок ингибирует функции нормального белка р53 по доминантно-негативному механизму. По-видимому, именно эта особенность мутантных р53 в значительной мере ответственна за их онкогенный потенциал. В пользу этого свидетельствует тот факт, что введение в клетки короткого полипептида, соответствующего олигомеризационному домену р53, нарушает образование полноценных тетрамерных комплексов р53 и вызывает опухолевую трансформацию. Необходимо заметить, что помимо утраты нормальных функций р53, мутантные р53 с аминокислотными заменами в горячих точках (кодоны 175, 248 и др.) приобретают новые свойства, не свойственные белку р53 дикого типа (gain-of-function). Так, описано приобретение мутантными р53 способности активировать промоторы протоонкогенов MYC и ERB1, антиапоптотического гена BGL1 из семейства Bcl2, гена MDR1, детерминирующего множественную лекарственную устойчивость клеток и т.д. Предполагается, что это обусловлено способностью некоторых мутантных р53 связывать белки, в частности другие факторы транскрипции, с которыми нормальный р53 не взаимодействует, и модифицировать экспрессию генов, регулируемых этими транскрипционными факторами. Физиологические функции р53 и их нарушения в неопластических клетках Молекулы белка р53 могут находиться в различных конформационных состояниях, в которых они обладают разными биохимическими активностями и выполняют разные физиологические функции. В обычных условиях р53 находится в так называемой латентной форме, в которой он обладает слабой транскрипционной активностью. Такой р53, однако, связывает белки репарационной машины (см. выше), проявляет активность 3'-5'-экзонуклеазы и стимулирует рекомбинацию и репарацию ДНК. При различных стрессах и модификации, внутриклеточных в частности повреждениях фосфорилирование происходят и пост-трансляционные ацетилирование определенных аминокислот молекулы р53, определяющие ее переход в так называемую стрессовую конформацию. Такой р53 значительно более стабилен (т.е. резко увеличивается его количество в клетке) и эффективно транс-активирует и/или транс-репрессирует специфические гены-мишени, следствием чего является индукция в аномальных клетках либо остановки клеточного цикла, либо апоптоза. Кроме того, активация р53 ведет к изменению экспрессии генов некоторых секретируемых факторов, в результате чего может изменяться размножение и миграция не только поврежденной, но и окружающих клеток. При этом, находясь в стрессовой конформации, р53 в значительной степени утрачивает активности, стимулирующие рекомбинацию и/или репарацию ДНК. р53 дикого типа, в дополнение к латентной и стрессовой, может временно приобретать и так называемую мутантную конформацию, сходную с той, в которую молекула р53 необратимо переходит при онкогенных мутациях. Транзиторный переход р53 в мутантную конформацию происходит при воздействии определенных цитокинов и/или морфогенов (PDGF, тромбопоэтин, ретиноевая кислота и др.). Биологический смысл такого перехода пока неясен. Возможно, он заключается в полной инактивации ростингибирующих активностей р53 и/или изменении набора его генов-мишеней. Таким образом, р53 играет важную охранную роль, являясь по образному выражению D.Lane, "стражем генома". Его повседневная функция заключается, по-видимому, в распознавании и исправлении ошибок, неизменно возникающих в ходе репликации ДНК. При массивных повреждениях ДНК, других внутриклеточных нарушениях или угрозе их возникновения происходит переключение функций р53 (Рис. 4): приобретая транскрипционные активности и изменяя экспрессию генов-мишеней, он вызывает либо остановку размножения аномальных клеток (временную, для устранения повреждений, или необратимую), либо их гибель (факторы, определяющие судьбу клетки при активации р53 будут рассмотрены ниже). В результате устраняется возможность накопления в организме генетически измененных клеток. Механизмы активации р53 при стрессах и внутриклеточных повреждениях. Активация транскрипционных функций р53 наблюдается при самых разнообразных стрессах и внутриклеточных нарушениях: УФ- и g-облучении, присутствии в клетке разорванной ДНК, понижении внутриклеточного пула нуклеотидов, ингибировании ДНК- и РНКполимераз, гиперэкспрессии онкогенов, вирусной инфекции, гипоксии, оксидативном стрессе, гипо- и гипертермии, различных нарушениях клеточной архитектуры (увеличении числа ядер, изменениях цитоскелета и адгезии) и т.д. Ключевую роль в стабилизации белка р53 и повышении его транскрипционной активности играют изменения взаимодействия р53 с белком-ингибитором Mdm2, ген которого является потенциальным онкогеном. Белок Mdm2 связывается с N-концом молекулы р53 и, обладая активностями Е3 убиквитин-лигазы, стимулирует убиквитинизацию и, как результат, протеосомную деградацию белка р53. Поэтому, в норме уровень экспрессии р53 очень невелик, а время его жизни составляет всего около 30 минут. Кроме того, связываясь с N-концевым участком р53 в районе домена, взаимодействующего с базовыми факторами транскрипции, Mdm2 подавляет способность р53 транс-активировать гены-мишени. A) Б) Рис. 4. Охранные функции р53. А). Функции "латентной" и "стрессовой" форм р53. Б) Факторы, вызывающие транскрипционную активацию р53, гены-мишени активированного р53 и вызываемые изменениями их экспрессии биологические эффекты. При внутриклеточных нарушениях, в частности при повреждениях ДНК, происходит фосфорилирование р53 по сайтам (Ser15, Ser20, Ser33), расположенным в районе связывания с белком Mdm2. Такое фосфорилирование осуществляют специфические киназы (ATM, ATR, и их мишени - чекпойнткиназы CHK1, CHK2), которые активируются в ответ на разнообразные нарушения структуры ДНК (см. раздел 3.11.1). Кроме того, ATM фосфорилирует и белок Mdm2. В результате блокируется связывание р53 с Mdm2, что вызывает стабилизацию молекул р53 и повышение их транскрипционной активности. При некоторых других внутриклеточных изменениях, например при экпрессии в клетке активированных онкогенов RAS, также наблюдается нарушение взаимодействия р53 и Mdm2, но происходит оно из-за повышения экспрессии белка pARF, продукта альтернативной рамки считывания гена INK4a (см. раздел 3.4). Белок pARF обладает способностью связываться либо с N-концевым участком р53, либо с белком Mdm2, препятствуя, таким образом, их непосредственному взаимодействию друг с другом. Интересно, что ген MDM2 сам является транскрипционной мишенью активированного р53. В результате устанавливаются регуляторная петля, стимулирующая деградацию белка р53 после окончания действия факторов, вызывающих его фосфорилирование или связывание с белком pARF. Важную роль в приобретении молекулами р53 конформации, способной трансактивировать гены-мишени, играют также модификации С-концевого участка, а именно ацетилирование его определенных аминокислотных остатков. При повреждениях ДНК и экспрессии активированного онкогена RAS эти события инициируются связыванием освобождающегося от Mdm2 N-концевого участка p53 с базальным фактором транскрипции р300/CBP, ацетилирующим сначала ингибиторный домен р53 по лизинам 373 и 382, а затем (после связывания р53 с респонсивными элементами) и белки хроматина в области генов-мишеней. Таким образом, последовательные пост- трансляционные модификации N-концевого и С-концевого участков р53 вызывают увеличение количества белка р53 в клетке, приобретение им способности связывать р53респонсивные элементы и рекрутировать к генам мишеням базовые факторы транскрипции (компоненты комплекса TFIID РНК-полимеразы II и гистоновые ацетилазы p300/CBP, деконденсирующие хроматин), стимулируя тем самым транскрипцию их мРНК. При некоторых стрессах, в частности при гипоксии, наблюдаются пост-трансляционные изменения р53, вызывающие его переход не к классической стрессовой конформации, а к ее варианту. Такой р53 не транс-активирует гены, содержащие р53-респонсивные элементы, но подавляет транскрипцию других генов-мишеней. Эта, так называемая репрессионная, форма также фосфорилирована по N-концу, но ее С-концевой участок не ацетилирован и связывает репрессионные комплексы Sin3/HDAC, вызывающие конденсацию хроматина генов-мишеней. Гены-мишени р53 и их функции. В настоящее время, помимо Mdm2, обеспечивающего регуляцию самого р53 по принципу обратной связи (см. выше), идентифицировано более сотни генов, являющихся мишенями транскрипционных активностей р53. Они могут быть разделены на несколько групп, исходя из их физиологических функций (Рис. 4Б). Первую группу составляют гены, продукты которых регулируют клеточный цикл. Важнейшим из них является белок p21Waf1/Cip1 - ингибитор циклинзависимых киназ из семейства Cip/Kip. Повышение его экспрессии вызывает остановку клеточного цикла в поздней фазе G1, что обусловливается связыванием им комплексов циклин Е/Сdk2, подавлением их способности фосфорилировать белки семейства рRb и освобождать транскрипционные факторы E2F (см. раздел 3.2.2). Дублирующим механизмом остановки перехода из G1 в S является подавление активированным р53 транскрипции гена DP1 транскрипционного фактора, который связывается с E2F и образует активный комплекс, собственно и активирующий синтез продуктов, необходимых для входа в фазу S. Заслуживает также внимания способность р53 повышать экспрессию гена Siah1, продукт которого стимулирует деградацию b-катенина - транскрипционного фактора, активирующего транскрипцию гена циклина D и онкогена MYC (см. раздел 3.4.2), что вносит дополнительный вклад в индукцию остановки клеточного цикла в G1. Следует заметить, что р53 может подавлять активность Cdk2 не только в результате изменения своих транскрипционных функций, но и за счет белок-белковых взаимодействий, а именно непосредственного связывания циклина Н - компонента киназного комплекса CAK, осуществляющего активирующее фосфорилирование циклинзависимых киназ. Идентифицирован также ряд генов-мишеней р53, продукты которых вызывают остановку в фазе G2 (задержка в ней наблюдается в случае, когда р53 активировался уже после того как клетка прошла G1-чекпойнт, или в клетках с инактивированным G1-чекпойнтом). Активированный р53 подавляет функцию комплекса циклин B/Cdc2, играющего ключевую роль в переходе из G2 в митоз, по нескольким механизмам. Во-первых, он транс-активирует ген 14-3-3-s, белковый продукт которого связывает и секвестрирует комплексы циклин B/Cdc2 в цитоплазме, не давая возможности им попасть в ядро, где они и должны проявлять свою активность. Во-вторых, он транс-активирует ген GADD45, белковый продукт которого обладает способностью связывать Сdc2, разрушая таким образом комплексы циклин B/Cdc2. В-третьих, р53 репрессирует транскрипцию генов циклина B и Cdc2, что уменьшает синтез их продуктов. Следует заметить, что, как и в случае остановки клеточного цикла в G1, задержка в G2 при повреждениях ДНК наблюдается и в клетках с инактивированным р53: она происходит в результате подавления функции фосфатаз Cdc25 (Cdc25A при остановке в G1 и Cdc25C при остановке в G2), активирующих соответствующие цикдинзависимые киназы. Однако в клетках с нарушенной функцией р53 происходит лишь кратковременная задержка в чекпойнтах, а активация р53 обеспечивает длительную остановку клеточного цикла, предотвращающую размножение вплоть до исправления дефекта. Следующая группа р53-регулируемых генов кодирует белки, индуцирующие апоптоз. При этом р53 контролирует синтез компонентов обоих основных путей индукции апоптоза: и митохондриального, и стимулируемого "рецепторами смерти". Так, он регулирует активность белков семейства Bcl2, репрессируя ген анти-апоптотического белка Bcl2 и активируя гены про-апоптотических белков Bax, Puma и Noxa. Повышение проницаемости митохондриальной мембраны для цитохрома С и белка AIF достигается и транс-активацией гена p53AIP1 (его продукт локализуется в митохондриальной мембране и уменьшает мембранный потенциал) и гена PIG3 (кодирует оксиредуктазу, которая вовлечена в образование радикалов кислорода, повреждающих мембраны митохондрий и стимулирующих выброс их содержимого). Стимуляция апоптоза, запускаемого рецепторами смерти достигается транс-активацией генов двух из таких рецепторов - Fas и Killer/DR5 (рецептор для TRAIL). Еще одной такой мишенью является ген недавно идентифицированного белка Pidd, который содержит домен смерти и при гиперэкспрессии индуцирует апоптоз. Выявлены и другие р53-респонсивные гены (IGFBP3, PAG608, p85, циклин G), продукты которых стимулирует апоптоз, однако механизмы их апоптогенного действия пока исследованы довольно плохо. Кроме того, р53 может индуцировать апоптоз и через другие механизмы, несвязанные с его способностью изменять экспрессию генов-мишеней. Так, мутантные р53, утратившие транскрипционную активность (в результате делеции С-концевого участка или мутаций в кодонах 22-23), сохраняют тем не менее способность индуцировать апоптоз в некоторых (но не во всех) типах клеток. Предполагается, что этот эффект обусловлен белокбелковыми взаимодействиями р53. Таким образом, при повышении функциональной активности р53 может происходить активация сразу многих путей индукции апоптоза, что, по-видимому, обеспечивает надежность его реализации. Так как р53 контролирует активность генов, продукты которых способны вызвать как остановку клеточного цикла в различных его фазах, так и апоптоз, возникает вопрос, отчего зависит выбор судьбы клетки при активации р53. Выяснилось, что он определяется множеством факторов: гистогенетическим типом клеток (например, в нормальных фибробластах, как правило, наблюдается остановка клеточного цикла, тогда как в лимфоцитах - апоптоз), степенью активации р53 (с увеличением уровня его экспрессии повышается вероятность апоптоза), функциональной активностью сигнального пути pRb- E2F (в фибробластах c инактивированным pRb или гиперэкспрессированным E2F, наблюдается не остановка в G1, а апоптоз) и т.д. Недавно обнаружено, что еще одним фактором, определяющим выбор между остановкой клеточного цикла и апоптозом, является характер модификации самих молекул р53 и/или их белок-белковых взаимодействий. Так р53, фосфорилированный по Ser15/20 и ацетилированный по Сконцу, способен транс-активировать ген p21Waf1/Cip1 и вызывать остановку в G1, тогда как дополнительное фосфорилирование по Ser46 придает ему способность транс- активировать наряду с геном p21Waf1/Cip1 и ген белка р53AIP1, а в этом случае уже наблюдается апоптоз. Причем вероятность фосфорилирования Ser46 повышается с увеличением интенсивности повреждений ДНК. Кроме того, способность р53 избирательно транс-активировать проапоптотические гены (BAX и др.) увеличивается при его связывании с белками семейства ASPP (ASPP1 и ASPP2), потеря экспрессии которых характерна для значительной части случаев рака молочной железы. Третьей большой группой генов-мишеней р53 являются гены, продукты которых регулируют морфологию и/или миграцию клеток (Рис. 4Б). Так, р53 транс-активирует гены обоих представителей семейства рассеивающих (Scatter) факторов - HGF/SF и HGF1/MSP, а также ген одного из членов семейства эпидермальных факторов роста HBEGF (гепарин-связывающий EGF) (продукты всех этих генов являются одновременно и митогенами, и мотогенами). При этом, р53 транс-активирует также гены рецепторов этих факторов - HGF/SF-R (Met) и EGF-R. р53-респонсивными также являются гены хемокина фракталкина, гладкомышечного a-актина, коллагенов II1 и Vl1 типов, ингибитора плазминогена PAI-1. С другой стороны р53 репрессирует гены фибронектина и металлопротеиназы I типа. Физиологическое значение такой регуляции пока не установлено. Возможно, оно заключается, по крайней мере частично, в привлечении к клеткам с активированным р53 окружающих клеток определенных типов для ремоделирования/восстановления структуры ткани в месте возможного апоптоза. Не исключено участие такой регуляции и в процессах морфогенеза. В особую группу генов-мишеней р53 можно выделить гены, контролирующие ангиогенез. Ключевую роль в неоангиогенезе играет VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor; стимулирует размножение и миграцию эндотелицитов), экспрессия которого повыщается при гипоксии или активации некоторых онкогенов. р53 репрессирует транскрипцию как гена VEGF, так и гена HIF-1 (Hypoxia Inducing Factor 1) - транскрипционного фактора, обеспечивающего повышение экспрессии VEGF и его рецепторов в ответ на уменьшение содержания кислорода (кроме этого HIF-1 изменяет экспрессию генов, контролирующих транспорт глюкозы и гликолиз, что обеспечивает адаптацию клеток к условиям гипоксии). Одновременно р53 может транс-активировать гены белков, ингибирующих ангиогенез тромбоспондинов (Tsp)-1, -2 (связывая специфические рецепторы на поверхности эндотелиоцитов, они вызывают в них апоптоз) и BAI-1. Таким образом клетки с активированным р53 хуже переносят недостаток кислорода, перестают секретировать VEGF и начинают секретировать ингибиторы ангиогенеза, что препятствует образованию новых сосудов. Данные функции являются, по-видимому, еще одной составляющей опухоль-супрессирующего действия р53, так как они предотвращает адаптацию к гипоксии и прорастание сосудов в центр опухоли. Выявлено еще несколько десятков генов-мишеней р53. Среди них следует отметить ген каталитической субъединицы теломеразы (TERT), который репрессируется р53 (таким образом, р53 участвует, по-видимому, и в обеспечении репликативного старения клеток. По-видимому, р53 принимает участие и в процессах созревания клеток, так как некоторые из транс-активируемых им генов кодируют белки репертуара той или иной дифференцировки (мышечная креатинкиназа и др.). Последствия нарушений функции р53. Характерные для опухолевых клеток аномалии р53 отменяют или ослабляют все важнейшие функции опухолевого супрессора р53. Делеция обоих аллелей гена р53, т.е. его полная инактивация, вызывает ослабление G1- и G2чекпойнтов клеточного цикла, подавление индукции апоптоза, уменьшение эффективности репарации ДНК, более эффективную адаптацию к гипоксии и стимуляцию неоангиогенеза, ослабление контроля за длиной теломер, ингибирование дифференцировки и другие характерные свойства неопластической клетки. Особо следует отметить возникновение в клетках с инактивированным р53 сильной генетической нестабильности, являющейся мотором дальнейшей опухолевой прогрессии. Потеря функциональной активности р53 значительно увеличивает темп появления размножающихся клеток с самыми разными генетическими аномалиями - измененным числом и перестройками хромосом, генными мутациями, амплификацией отдельных участков генома. Сходные последствия наблюдаются и при самых частых в новообразованиях человека аномалиях р53 - миссенс-мутациях, ведущих к синтезу неактивного белка, обладающего доминантно-негативным эффектом в отношении продукта неповрежденного аллеля. Следует заметить, однако, что степень проявления доминантно негативного эффекта мутантного р53 варьирует в зависимости от конкретной аминокислотной замены, типа клеток и ингибируемой функции р53 дикого типа. Поэтому нередко селективное преимущество получают клоны клеток, в которых в результате дополнительных генетических событий происходит делеция или мутация и второго аллеля гена р53. В то же время, опухолевые клетки, как правило, сохраняют экспрессию хотя бы одного мутантного аллеля гена р53. Очевидно, это связано с тем, что появляющиеся в результате миссенс-мутаций новые активности мутантных р53 вносят дополнительный вклад в повышение онкогенного потенциала клетки. Так, приобретая способность транс-активировать онкоген MYC, мутантный р53 вызывает, очевидно, более сильные нарушения регуляции клеточного цикла, чем те, которые наблюдаются при делециях гена р53. Новые активности мутантных белков р53 ответственны также за дополнительное ослабление индукции апоптоза и развитие устойчивости к действию химиопрепаратов. В основе подавления апоптоза лежит несколько механизмов: трансактивация мутантным р53 гена антиапоптотического белка Bag1 (член семейства Bcl2), способность мутантных р53 связывать и инактивировать гомолог р53, белок р73 (см. следующий раздел) и т.д. Возникновение устойчивости к определенным противоопухолевым цитостатикам может быть связано также со способностью некоторых мутантных р53 повышать транскрипцию гена MDR1 (Multi-Drug Resistance 1 - см. раздел XII.2.1.1) и гена дУТФ-азы, продукт которого блокирует действие 5-фторурацила и ряда других антиметаболитов. Следует заметить, что характерные для опухолей человека мутации дифференциально влияют на возникновение вышеуказанных активностей. Так, замены в кодонах 175 и 248 придают способность активировать ген дУТФ-азы, тогда как мутации в кодоне 273 не вызывают приобретения такого свойства. Поэтому, использование мутаций р53 в качестве критерия для предсказания чувствительности к той или иной химиотерапии может быть основано лишь на точной идентификации аминокислотных замен, а не на гистохимической детекции "нормального" или "мутантного" р53 с помощью конформационно-специфических антител. Таким образом, мутации и другие изменения активности р53 вызывают одновременное появление целого набора характерных чувствительности к свойств различным неопластической клетки, рост-супрессирующим таких сигналам как (в понижение том числе генерируемым перманентной экспрессией активированных онкогенов), иммортализация, повышение способности выживать в неблагоприятных условиях, генетическая нестабильность, стимуляция неоангиогенеза, блокирование клеточной дифференцировки и т.д. Это, очевидно, и является объяснением такой частой встречаемости мутаций р53 в самых разных новообразованиях - они позволяют за один шаг преодолеть сразу несколько этапов опухолевой прогрессии. Причем, мутации р53 могут являться как инициальным событием (синдром Ли-Фраумени) или детерминировать начальные этапы канцерогенеза, так и возникать и отбираться уже в ходе роста опухоли, обеспечивая приобретение новых агрессивных свойств и устойчивости к терапии. Гомологи р53: р63 и р73 Недавно были обнаружены два гена, р63 и р73, продукты которых имеют достаточно высокую степень гомологии с белком р53 в участках транс-активационного, ДНКсвязывающего и олигомеризационного доменов, но значительно отличающиеся от него по C-концу. Однако, в отличие от гена р53, кодирующего по существу один белковый продукт, подвергающийся, правда, самым разным пост-трансляционным модификациям, гены р63 и р73 продуцируют по несколько белков. Дело в том, что мРНК каждого из них может синтезироваться с двух промоторов и далее подвергаться альтернативному сплайсингу. В результате образуется по 6 изоформ белков р63 и р73, обладающие (ТАформы) или не обладающие (ΔDN-формы) транс-активационным доменом. Причем формы, содержащие транс-активационный домен способны активировать р53- респонсивные гены и вызывать, в частности, апоптоз. Кроме того, ТА-формы р63 и р73 могут транс-активировать и ряд других генов, содержащих близкие по структуре респонсивные элементы, которые не являются, тем не менее, мишенями р53. В частности, они транс-активируют гены белков Jag1 и Jag2 - лигандов для рецепторов Notch, активация которых играет ключевую роль в выборе судьбы клетки при выборе направления ее дифференцировки. Существует еще ряд отличий между р53 и его гомологами. Так, если р53 экспрессируется в клетках практически всех тканей, то его гомологи экспрессируются только в некоторых типах клеток. Например, р63 преимущественно экспрессируется в эмбриональных клетках, а также стволовых и недифференцированных эпителиальных клетках взрослого организма, причем в виде транскрипционно-неактивных ΔDN-форм. Предполагается, что экспрессия ΔDN-форм р63 обеспечивает недифференцированное состояние клетки. При нокауте гена р63 у мышей наблюдается пренатальная или постнатальная гибель эмбрионов вследствие полного отсутствия кожи и других эпителильных тканей (предполагается, что это связано с преждевременной дифференцировкой стволовых клеток эпителия и исчерпанием их запаса к моменту рождения животных). Далее, если р53 активируется в ответ на самые разные стрессы, то его гомологи только на некоторые из них, причем за счет совершенно других механизмов. Наконец, если р53 выполняет функции опухолевого супрессора и для новообразований характерна его инактивация, то его гомологи не имеют таких функций. Об этом свидетельствует две группы фактов. Во-первых, у мышей гомозиготный нокаут гена р73 не вызывает повышения частоты возникновения опухолей (нокаут гена р63 не совместим с жизнью эмбрионов - см. выше). Во-вторых, в опухолях человека не выявляется потеря экспрессии или мутации генов р63 и р73. Наоборот, в них нередко отмечается повышение экспрессии этих белков, причем, как правило, транскрипционнонеактивных ΔDN-форм (т.е. р63 и р73 являются скорее протоонкогенами). В связи с этим приобретает популярность гипотеза, согласно которой ΔDN-формы белков р63 и р73 функционируют как природные ингибиторы р53, подавляющие его функцию по доминантно-негативному механизму. Действительно, их транскрипционно-неактивные тетрамеры могут конкурировать с р53 за места посадки на ДНК генов-мишеней, а мономеры/димеры - секвестрировать р53 путем связывания его молекул и образования неактивных комплексов. Это не исключает, однако, что при нарушениях функции р53 происходит активация транскрипционной функции его гомологов (показано, что р53 репрессирует транскрипцию гена р73), которая может частично компенсировать утрату функции р53 и обеспечивать, например, нормальное развитие мышей с гомозиготным нокаутом гена р53. Эти предположения, как и другие аспекты биологических функций гомологов р53, требуют дальнейшего исследования. Продукты гена INK4a - p16INK4a и pARF - регулируют активность pRb и р53 Следующим после р53 по частоте изменений в различных новообразованиях человека является ген INK4a, расположенный в коротком плече хромосомы 9 (сегмент 9р21). Его исключительной особенностью является одновременное кодирование двух негомологичных ядерных белков - p16INK4a и pARF (продукты альтернативных рамок считывания), каждый из которых выполняет супрессорные функции (Рис. 5). Рис. 5. Ген INK4a кодирует два негомологичных белка, выполняющих разные функции. p16INK4a связывает циклин-зависимые киназы Cdk4 и Cdk6 и препятствует образованию их функционально активных комплексов с циклинами D, которые, фосфорилируя pRb, инициируют вход в S фазу клеточного цикла. pARF обладает способностью стабилизировать и активировать белок р53, нарушая его взаимодействие с белком Mdm2 (см. раздел 3.3). Кроме того, у него выявлены и р53-независимые функции. Так, он может также непосредственно взаимодействовать с основной мишенью pRb - белком E2F и блокировать его активность. Кроме того, он понижает стабильность транскрипционного фактора HIF-1 (см. 3.3.2 и 3.5.3), связывая его a-субъединицу. Активность p16INK4a и pARF повышается при экспрессии ряда вирусных (E1A) или клеточных (RAS, RAF, MYC и др.) онкогенов. Такой эффект обусловлен присутствием в гене INK4a респонсивных элементов для транскрипционного фактора E2F, активируемого многими онкогенами. Таким образом, нормальное функционирование продуктов гена INK4a эффективно предотвращает дальнейшее размножение клеток, в которых произошла активация какого-либо из представителей большой группы онкогенов. Кроме того, экспрессия p16INK4a повышается при образовании межклеточных контактов, что обеспечивает контактное торможение размножения клеток. У трансгенных мышей с гомозиготной нокаутом гена INK4a, вызывающим потерю экспрессии обоих его белковых продуктов, наблюдается высокая частота возникновения в молодом возрасте различных новообразований, преимущественно фибросарком и лимфом (также как у мышей с инактивированным р53). Интересно, что практически такая же картина наблюдается и у мышей с перестройкой гена INK4a, приводящей к потере экспрессии только белка pARF. В отличие от этого у мышей, утративших экспрессию p16INK4a, но сохранивших экспрессию pARF, нет существенного повышения частоты возникновения опухолей (отмечается лишь редкое возникновение меланом, не наблюдаемое в родительских линиях мышей). В культурах in vitro мышиные фибробласты, не экспессирующие оба продукта гена INK4a, как и фибробласты, в которых инактивирован только pARF, легко трансформируются онкогенами семейства RAS. В то же время для Ras-индуцированной трансформации клеток, не экспрессирующих только p16INK4a, необходимо дополнительное действие кооперирующих онкогенов, таких как MYC или E1, подобно тому, как это наблюдается в случае нормальных клеток. У людей герминальные мутации в одном из двух аллелей гена INK4a ассоциированы с наследственной предрасположенностью к развитию меланом кожи (синдром диспластических невусов). Часть из этих мутаций инактивирует только p16 INK4a, не нарушая функцию pARF. В связи с этим предполагается, что синдром диспластических невусов связан с нарушением функции именно p16 INK4a. В клетках наследственных и спорадических меланом обнаруживаются изменения обоих аллелей гена INK4a, т.е. данный ген ведет себя как классический опухолевый супрессор. Чаще всего вторая (соматическая) мутация представляет собой делецию гена INK4a, ведущую к инактивации как p16INK4a, так и pARF. Мутации, делеции и метилирование гена INK4a, вызывающие потерю экспрессии одного или обоих его белковых продуктов, часто наблюдаются не только в наследственных и спорадических меланомах, но и в большой группе других ненаследственных новообразований: раке поджелудочной железы, пищевода, желчных путей, мочевого пузыря, Т- и В-клеточных острых лимфолейкозах, мезотелиомах, анапластических астроцитомах, глиобластомах и др. Опухолевый супрессор PTEN регулирует клеточный цикл и апоптоз, модулируя сигнальный путь PI3K-PKB/Akt К опухолевым супрессорам, часто поражаемым в различных новообразованиях человека, относится и ген PTEN. Его герминальные мутации вызывают болезнь Коудена, заключающуюся в наследственном предрасположении к развитию гамартом, чаще всего в мозге, молочной и щитовидной железах. Инактивация PTEN характеризует также и значительную часть различных ненаследственных опухолей - глиомы, менингиомы, меланомы, раки почки, матки, молочной и предстательной желез. При этом на начальных стадиях заболевания выявляется, как правило, делеция только одного из аллелей гена PTEN, тогда как в опухолях, находящихся на поздних стадиях развития, чаще инактивированы оба аллеля. У трансгенных мышей с нокаутом одного аллеля гена PTEN отмечается развитие в молодом возрасте самых разных новообразований: аденокарцином кишечника, лейкозов, лимфосарком, герминальных опухолей и др. Белковый продукт гена PTEN состоит из 403 аминокислот и имеет высокую степень гомологии с фосфатазами двойной специфичности (дефосфорилируют и тирозиновые, и серин/треониновые аминокислотные остатки). Его особенностью является способность дефосфорилировать не только белки, но и липиды, в частности фосфатидилинозит(3,4,5)трифосфат (PIP-3) - важнейшую мишень фосфатидил-инозитид-3'-киназы (PI3K), участвующую в регуляции клеточного цикла и апоптоза. Именно эта активность белка PTEN ответственна, по-видимому, за его супрессорную функцию. Об этом свидетельствует в частности тот факт, что большинство мутаций, обнаруживаемых в опухолевых клетках, картируются в фосфатазном домене и отменяют дефосфорилирование PIP-3, ингибируя таким образом сигнальный путь PI3K-PKB/Akt. Так как онкоген PKB/Akt подавляет митохондриальный путь индукции апоптоза по нескольким механизмам (ингибирует Bad, активирует Bcl2 и т.д.), потеря функции PTEN делает клетки менее чувствительными ко многим апоптогенным стимулам. В клетках с инактивированным PTEN наблюдается также и стимуляция клеточной пролиферации (повышение экспрессии PKB/Akt увеличивает уровень циклина D). Восстановление функции PTEN в опухолевых клетках приводит, в зависимости от клеточного контекста, либо к апоптозу (рак простаты), либо к остановке клеточного цикла в G1 (глиобластома, рак почки). Следует заметить, что клетки глтобластомы и рака почки становятся при этом сенсибилизированными к действию дополнительных апоптогенных стимулов. PTEN участвует, по-видимому, и в регуляции адгезии и миграции клеток. Его N-концевой домен гомологичен тензину - белку, взаимодействующему в фокальных контактах с актиновым цитоскелетом. Дефосфорилируя тирозиновые остатки киназы фокальных контактов FAK, PTEN может ингибировать образование фокальных контактов и распластывание клеток, а также их движение. Е-кадгерин, АРС и аксин - супрессоры, контролирующие сигнальный путь βкатенин/Cdk/pRb Наследственные и спорадические опухоли желудочно-кишечного тракта довольно часто ассоциированы с мутациями в генах Е-кадгерина, β-катенина, АРС и аксина (Табл. 1). Так, гемизиготные герминальные мутации Е-кадгерина обусловливают развитие наследственных форм рака желудка. Врожденные мутации одного из аллелей гена βкатенина или гена APC ведут к развитию семейного аденоматозного полипоза кишечника (у большинства пациентов наблюдаются мутации APC, реже встречаются мутации βкатенина). В основе онкогенного эффекта всех этих мутаций лежит повышение транскрипционной функции протоонкобелка β-катенина, вызывающего активацию циклинзависимых киназ и инактивирующего тем самым супрессорную функцию pRb (см. раздел 3.2.2). Такая функция β-катенина обусловлена его способностью транслоцироваться в ядро, связываться с транскрипционными факторами семейства TCF/LEF и активировать гены, имеющие в своем составе TCF/LEF-респонсивные элементы, в частности ген циклина D1 и онкоген MYC. Е-кадгерин - представитель семейства трансмембранных гликопротеинов, осуществляющий адгезионные межклеточные контакты типа "зона слипания" (zona adhaerence). Его внутриклеточный домен связывается с рядом белков, в первую очередь с b-катенином. В этом случае, происходит переключение функции β-катенина: он перестает функционировать в качестве транскрипционного фактора, а взаимодействует с актиновыми микрофиламентами и участвует в регуляции реорганизации цитоскелета. Характерные для опухолей желудочно-кишечного тракта, рака молочной железы, яичника и ряда других новообразований изменения гена Е-кадгерина (мутации, делеции, метилирование) вызывают потерю экспрессии белка или изменение его локализации в клетке, что имеет два важных для онкогенеза последствия. Во-первых, нарушаются межклеточные контакты и морфогенетические реакции клетки, а, во-вторых, происходит накопление β-катенина в ядре и повышение его транскрипционной активности (Рис. 6). В результате стимулируется размножение клеток и увеличивается их способность к инвазии. Восстановление экспрессии Е-кадгерина в раковых клетках с помощью введения генноинженерных конструкций вызывает резкое замедление пролиферации и переход от инвазивного к неинвазивному фенотипу. Причем рост-супрессирующий эффект Екадгерина обусловливается его способностью связывать и секвестрировать b-катенин, и не зависит от того, происходит ли при этом восстановление межклеточных контактов. Рис. 6. Регуляция транскрипционной активности β-катенина и ее нарушения в опухолевых клетках (объяснения в тексте). В несвязанном с Е-кадгерином состоянии β-катенин очень нестабилен. Ключевую роль в регуляции его времени жизни и транскрипционной активности играют опухолевые супрессоры APC и аксин (Рис. 6А). АРС связывает одновременно и b-катенин и аксин, в результате чего образуется сложный комплекс, к которому рекрутируется GSK-3b (киназа-3b гликогенсинтетазы). Фосфорилируя определенные сериновые остатки βкатенина, GSK-3b индуцирует связывание его с Е2-убиквитин-лигазой. Убиквитинированный b-катенин направляется в протеосомы, где происходит его деградация. При стрессах, вызывающих активацию р53, включается дополнительный механизм деградации β-катенина (Рис. 6А). В этом случае происходит повышение экспрессии белка Siah1, который рекрутирует другой тип комплексов Е2-убиквитинлигазы также и к нефосфорилированному по N-концу b-катенину. Таким образом достигается, по-видимому, более эффективная деградация несвязанного с кадгеринами βкатенина. Вероятно, при онкогенных мутациях Е-кадгерина свободного β-катенина становится так много, что системы его деградации не справляются и часть β-катенина оказывается в ядре, где он проявляет свою транскрипционную активность (Рис. 6Б). В клетках новообразований часто реализуется и другой путь повышения транскрипционных активностей β-катенина, связанный с нарушениями работы систем его деградации. Так, в клетках опухолей толстой кишки, печени, простаты часто обнаруживаются либо мутации β-катенина в участках, которые фосфорилируются GSK-3b и взаимодействуют с убиквитин-лигазой, либо мутации опухолевого супрессора APC, нарушающие его взаимодействие с b-катенином. либо (значительно реже) мутации аксина, отменяющие его связывание с АPC или GSK-3b. (При этом мутации APC блокируют работу обоих систем деградации β-катенина, тогда как указанные мутации самого β-катенина или аксина нарушает только одну из этих систем). В результате всех этих событий b-катенин активирует транскрипцию гена циклина D и протоонкогена MYC, что вызывает стимуляцию клеточной пролиферации. Е-кадгерин и АРС являются классическими опухолевыми супрессорами - у пациентов с семейными формами соответственно рака желудка и аденоматозного полипоза кишечника в опухолевых клетках наблюдается инактивация обоих аллелей данных генов. Произошедшие еще в половой клетке наследуемые изменения одного из аллелей представляют собой точечные инактивирующие мутации или микроделеции. Второй аллель инактивируется уже в соматической клетке. Подавление активности второго аллеля гена Е-кадхерина нередко связано с его метилированием, а второй аллель гена АРС чаще всего инактивируется в результате делеции участка длинного плеча хромосомы 5, содержащего данный ген, или утраты всей хромосомы 5. Ключевая роль герминальных мутаций APC в генезе аденоматозного полипоза толстой кишки подтверждается тем, что у трансгенных мышей с гомозиготным нокаутом этого гена также развиваются множественные полипы, причем не только в толстом, но и в тонком кишечнике. Недавно выявлена еще одна важная биологическая функция опухолевого супрессора АРС. Во время митоза он связывается с белками кинетохора и участвует в организации веретена деления. При инактивации APC нарушается взаимодействие микротрубочек с кинетохором, результатом чего является частые ошибки сегрегации хромосом, т.е. нестабильность генома. Это, вероятно, может служить объяснением более частой встречаемости мутаций APC по сравнению с мутациями β-катенина: помимо более эффективного блокирования работы систем деградации β-катенина они ведут также и к генетической нестабильности, что придает клеткам дополнительные селективные преимущества. Компоненты сигнальных путей TGFb-Smad Как опухолевые супрессоры классифицированы и некоторые компоненты сигнальных путей, регулируемых TGF-β. Этот цитокин, в зависимости от типа клеток-мишеней и их микроокружения, может вызывать остановку размножения, стимуляцию дифференцировки, а в некоторых случаях и апоптоз. Свои антипролиферативные и дифференцировочные эффекты (они наблюдаются в нормальных эпителиальных, эндотелиальных и гемопоэтических клетках) TGF-β реализует по следующему механизму. Его связывание с RII-субъединицей рецептора, обладающей серин-треонин киназной активностью, вызывает рекрутирование и фосфорилирование второй субъединицы рецептора - RI, также являющейся серин-треониновой киназой. Основной мишенью киназы Tb-RI являются, в зависимости от типа клеток, белки Smad2 или Smad3 - так называемые рецепторные Smad. Их фосфорилированные формы образуют комплекс с белком Smad4, который транспортируется в ядро и, образуя еще более сложные комплексы с другими транскрипционными кофакторами, функционирует в качестве активаторов транскрипции одних генов и репрессоров других генов. В частности, он репрессирует ген MYC и транс-активирует гены ингибиторов циклинзависимых киназ (CKIs) p15Ink4b, p27Kip1 и p21Waf1/Cip1, что ведет к ингибированию функции Cdk4, Cdk2 и остановке клеточного цикла в G1. При этом, репрессия MYC играет ключевую роль в проведении антипролиферативного сигнала TGF-β, так как именно она "разрешает" стимуляцию транскрипции генов CKI комплексом Smad2(3)/Smad4/Sp1 (предполагается, что Myc закрывает места посадки этого комплекса в генах p15 Ink4b, p27Kip1 и p21Waf1/Cip1). При гиперэкспрессии онкогена МYC, которая характерна для многих новообразований человека, TGF-β не способен вызвать понижение его экспрессии, достаточное для "разрешения" стимуляции транскрипции генов CKI, и в результате TGF-β не оказывает антипролиферативного действия. Инактивирующие мутации компонентов этого сигнального пути, а именно рецептора TGF-β (TbR-II), Smad2 и Smad4 характерны для опухолей толстого кишечника, рака поджелудочной железы, желчного пузыря, легкого, а также некоторых других новообразований. Герминальные мутации в одном из аллелей генов TbR-II или Smad4 ассоциированы с развитием семейных форм рака толстого кишечника и желудка. Интересно, что у трансгенных мышей с повреждением одного из аллелей гена TbR-II, Smad2 или Smad4 частота развития опухолей не повышается, однако гетерозиготная инактивация одновременно и гена Smad4 и гена APC резко увеличивает вероятность развития инвазирующих опухолей кишечника. Сходная картина наблюдается у мышей с нокаутом одного из аллелей гена Smad3. В этом случае наблюдается развитие в молодом возрасте множественных метастазирующих колоректальных карцином. Опухолевый супрессор VHL регулирует реакцию на гипоксию и ингибирует ангиогенез Наследование инактивированного аллеля гена VHL вызывает предрасположение к развитию синдрома фон Хиппеля-Линдау. Эта болезнь характеризуется возникновением опухолей различной локализации - гемангиобластом центральной нервной системы, ангиом сетчатки, феохромоцитом, карцином почки, рака поджелудочной железы и др. Инактивация гена VHL характерна и для ряда форм ненаследственных опухолей. Так, мутации и/или гиперметилирование обоих аллелей гена VHL наблюдаются примерно в 80% светлоклеточных раков почки. Белковый продукт гена VHL, состоит из 213 аминокислотных остатков и образует комплекс с рядом белков (включает элонгины A, B, С, куллин, Rbx-1), обладающий активностями E3-убиквитин-лигазы. Специфической мишенью этого комплекса является транскрипционный фактор HIF-1, гены-мишени которого обеспечивают адаптацию к гипоксии и стимуляцию ангиогенеза. В присутствии кислорода VHL связывает гидроксилированные пролины a-субъединицы HIF-1, что вызывает убиквитинизацию и деградацию HIF-1. При гипоксии HIF-1 не гидроксилируется и не связывается с VHL. В результате содержание HIF-1 в клетке увеличивается, что ведет к повышению транскрипции его генов-мишеней, кодирующих VEGF, эритропоэтин, транспортеры глюкозы, гликолитические энзимы, TGF-a и др. В клетках с инактивированным VHL наблюдается перманентное повышение экспрессии этих генов, что вызывает понижение их чувствительности к гипоксии и секрецию ими ангиогенных факторов (VEGF и др.). Последнее и объясняет, по-видимому, образование гемангиом и сильную васкуляризацию других VHL-ассоциированных опухолей, в частности светлоклеточных раков почки. NF1/нейрофибромин и NF2/мерлин - гены нейрофиброматоза Опухолевый супрессор NF1 кодирует белок нейрофибромин, состоящий из 2818 аминокислот. В клетках, происходящих из нервного гребня, он регулирует активность онкобелков семейства Ras, осуществляя перевод их функционально-активных ГТФсвязанных форм в неактивные ГДФ-связанные. Врожденные инактивирующие мутации в одном из аллелей гена NF1 (как правило, эти мутации прекращают синтез белка) вызывают развитие нейрофиброматоза I типа (болезни Реклингаузена) - наследственного заболевания, поражающего примерно 1 из 3500 индивидуумов. Оно характеризуется возникновением опухолей периферической нервной системы, дефектами развития и нередко возникновением множественных новообразований различных типов в нескольких органах, в клетках которых действительно отмечается повышение активности онкобелков Ras. Мутации гена NF1 соответствуют двухударной модели Кнудсона: в опухолевых клетках наблюдается поражение и второго аллеля, что ведет к полному отсутствию в клетке белкового продукта. У трансгенных мышей гетерозиготный нокаут этого гена (NF1+/-) вызывают не нейрофиброматоз, а феохромоцитомы и миелоидные лейкозы заболевания, наблюдающиеся у 1% пациентов с нейрофиброматозом I типа. Врожденные мутации другого опухолевого супрессора, NF2, вызывают нейрофиброматоз II типа - наследственное заболевание, поражающее 1 из 40000 индивидуумов. Несмотря на название, при нем развиваются не нейрофибромы, а шванномы, менингиомомы и эпендимомы. Наиболее характерным является возникновение двухсторонних шванном акустического нерва. NF2 ведет себя как классический опухолевый супрессор - его гомозиготные мутации, прекращающие синтез полноценного белка, наблюдаются не только при наследственных, но и при спорадических шванномах и менингиомах. У трансгенных мышей с нокаутом одного из аллелей гена NF2 резко увеличивают вероятность развития во второй половине жизни различных опухолей. Их спектр сильно отличается от наблюдаемого у пациентов с нейрофиброматозом II типа - образуются не шванномы и менингиомы, а метастазирующие остеосаркомы, фибросаркомы, аденокарциномы легкого и другие новообразования. В то же время у мышей с гетерозиготными мутациями гена NF2, аналогичным тем, которые наблюдаются у пациентов с нейрофиброматозом II типа, развиваются шванномы. Продукт гена NF2 белок мерлин (другое название - шванномин) имеет высокую степень гомологии с эзрином, радиксином и моэзином - представителями семейства белков ERM, соединяющими интегральные мембранные белки с актиновым цитоскелетом. Мерлин играет, по-видимому, важную роль в реализации контактного торможения размножения клеток. При образовании контактов клеток друг с другом и с компонентами внеклеточного матрикса происходит повышение экспрессии мерлина, его дефосфорилирование и переход в другую конформационную форму. В таком состоянии он перестает связывать эзрин и моэзин, но остается связанным с внутриклеточным доменом рецептора гиалуроновой кислоты (CD44), что ведет к блокированию проведения митогенного сигнала как от рецепторов ростовых факторов (вероятно, они ингибируются освободившимися белками ERM), так и от СD44. Кроме СD44 и белков ERM, мерлин может также связывать b1-интегрин, bII-спектрин, HGS (субстрат тирозинкиназы, активируемой HGF/SF) и др. Ген WT1 и опухоль Вилмса Герминальные гетерозиготные мутации гена WT1 (Wilms' Tumor 1) вызывают дефекты развития мочеполовой системы, в части случаев сопровождающиеся возникновением в детском возрасте нефробластом (опухолей Вилмса). Нарушения функции гена WT1 ответственны за 10-15% всех опухолей Вилмса (остальные случаи связаны с изменениями других генов - WT2, WT3 и др., продукты которых не идентифицированы). Ген WT1 ведет себя как классический опухолевый супрессор, инактивирующийся по двухударному механизму. Инактивация одного из аллелей гена WT1 у мышей также приводит к дефектам развития мочеполовой системы, но частота возникновения опухолей при этом не повышается. Ген WT1 имеет очень сложную регуляцию. Его мРНК подвергается альтернативному сплайсингу, редактированию и имеет несколько альтернативных сайтов инициации трансляции. В результате образуется 24 изоформы белков WT1, многие из которых функционирует как транскрипционные факторы, способные вызывать как активацию, так и репрессию транскрипции генов. Пока достоверно идентифицирована лишь одна специфическая мишень транскрипционной функции WT1: некоторые его продукты трансактивируют ген амфирегулина, представителя семейства EGF (факторов роста эпидермиса), регулирующего размножение и дифференцировку клеток. Связываясь с рецептором EGF (EGF-R или протоонкоген ErbB1) амфирегулин вызывает в одних типах клеток стимуляцию размножения, а в других, в частности в эмбриональных эпителиальных клетках почки - ингибирование пролиферации и индукцию специфической дифференцировки. Кроме того, некоторые изоформы белка WT1 связываются с р53, что может приводить к изменению активности р53-респонсивных генов. Механизмы канцерогенеза при нарушениях функции WT1 изучены плохо. Мутаторные гены Нарушения функций вышерассмотренных белков, контролирующих апоптоз и/или клеточный цикл (p53, pRb, p16INK4a, pARF и др.) отменяют запрет на пролиферацию клеток с различными аномалиями, в том числе и с генетическими изменениями, что увеличивает вероятность появления онкогенных клеточных клонов. Эту группу белков принято называть "gatekeepers" - "сторожи". Наряду с этим идентифицирован ряд компонентов специализированных систем распознавания и репарации повреждений ДНК, дисфункция которых также вызывает генетическую нестабильность, предопределяющую развитие новообразований. Они получили название "caretakers" - "смотрители". Эта вторая группа белков и является предметом рассмотрения данного раздела. В зависимости от типа повреждений ДНК могут активироваться три типа репарационных систем: а) системы репарации двунитевых разрывов ДНК; б) системы репарации неспаренных оснований ("mismatch repair"); и, в) системы эксцизионной репарации. Описаны наследственные формы новообразований, связанные с врожденными мутациями генов, продукты которых обеспечивают активацию и функционирование каждой из этих систем. Причем, некоторые из этих белков (ATM, CHK2, р53, BRCA1) активируют также и молекулы, ответственные за остановку клеточного цикла и индукцию апоптоза, выполняя, таким образом, одновременно функции и "смотрителя", и "сторожа". АТМ, ATR, NBS1, CHK1 и CHK2 - компоненты систем проведения сигналов от поврежденной ДНК к различным эффекторам Ключевую роль в интеграции сигналов от поврежденной ДНК и их дальнейшей передаче к разнообразным эффекторам играют специфические протеинкиназы ATM (AtaxiaTelangiectasia Mutated), ATR (ATM Related), NBS1, CHK1 и CHK2 (чекпойнткиназы 1, 2) Рис. 7. Белок ATM, имеющий структурное сходство с фосфатидилинозит-3-киназой (PI3K), накапливается в местах повреждений и приобретает киназную активность, связывая фосфорилированные белки хроматина (H2AX и др.) и белки-сенсоры нарушений структуры ДНК. Причем, ATM активируется в ответ на возникновение двунитевых разрывов ДНК (вызываются g-облучением, ингибиторами топоизомераз и т.д.), тогда как другие нарушения структуры ДНК (например, сшивки оснований, вызываемые УФоблучением или повреждения, индуцируемые алкилирующими соединениями) не активирует ATM. В этих случаях, как и при ингибировании синтеза ДНК, наблюдается функциональная активация гомолога ATM, белка ATR. Активированные формы ATM и ATR фосфорилируют ряд своих мишеней, в частности р53 (см. раздел 3.3.3), Mre11, NBS1, CHK1, CHK2 и BRCA1 (Рис. 7). Рис. 7. Схема сигнальных путей, регулирующих реакции клетки на повреждения ДНК. Выделены компоненты, герминальные мутации которых ответственны за наследственные синдромы, характеризующиеся предрасположенностью к развитию определенных новообразований. Причем для фосфорилирования CHK2 необходимо предварительное фосфорилирование белков комплекса Mre11/NBS1/Rad50, который, локализуясь в местах повреждений, рекрутирует к ним различные молекулы, в том числе CHK2, BRCA1, E2F и PCNA. Привлечение PCNA вызывает переключение с репликативного синтеза ДНК на репарационный и остановку клеточного цикла в S фазе; к блокированию входа и продвижения по S ведет и подавление функции E2F (см. 3.2.2). Фосфорилированные чекпойнткиназы CHK1/2, в свою очередь, фосфорилируют и инактивируют белки семейства Cdc25, что вызывает подавление активности регулируемых ими циклинзависимых киназ и быструю остановку клеточного цикла в G1 (если Cdc25A не активирует Cdk2) или в G2 (когда Cdc25C не активирует Cdc2). Кроме того, CHK1 и CHK2 амплифицируют сигналы к р53 и BRCA1, что способствует длительной задержке в G1 или G2 (см. разделы 3.3.3 и 3.11.2) и, кроме того, активизирует системы репарации ДНК (см. следующие разделы) - Рис.7. Герминальные инактивирующие мутации обоих аллелей гена ATM вызывают атаксиютелангиэктазию (АТ) - тяжелое заболевание, характеризующееся нейродегенерацией, иммунодефицитом и повышенным риском возникновения новообразований. Примерно у 10% пациентов с АТ в молодом возрасте развиваются лимфоидные опухоли из Т- или Вклеток (лимфосаркомы, лимфогрануломатоз, различные формы лейкозов), а также рак молочной железы. Соматические гомозиготные мутации гена АТМ характерны и для некоторых форм ненаследственных лимфолейкозов (Т-клеточного пролимфоцитарного лейкоза, В-клеточного хронического лимфолейкоза и др.). Гомозиготный нокаут гена ATM у мышей также значительно увеличивает вероятность развития лимфоидных неоплазий. У индивидуумов с герминальными мутациями только одного из двух аллелей гена АТМ несколько повышена частота возникновения рака молочной железы. Онкогенный потенциал мутаций АТМ связан, очевидно, с нарушениями реакций клетки на повреждения ДНК и возникающей в связи с этим генетической нестабильностью. Так, после g-облучения в клетках с дефектным АТМ не происходит полноценной активации чекпойнтов и остановки клеточного цикла в G1, S или G2. Кроме того, в них блокирована активизация системы репарации двунитевых разрывов ДНК. В результате при инактивации АТМ резко увеличивается вероятность размножения клеточных вариантов с различными генетическими нарушениями. Сходные последствия наблюдаются и при инактивации одной из важнейших мишеней АТМ - белка NBS1. Герминальные гомозиготные мутации гена NBS1 вызывают Ниймегенский синдром иммунодефицитом, (Nijmegen генетической Breakage Syndrome), нестабильностью характеризующийся и повышенной предрасположенностью к развитию лимфоидных новообразований (в отличие от мутаций АТМ, мутации NBS1 не вызывают атаксию и телангиэктазию). Соматические мутации гена NBS1 выявляются в 10-20% случаев ненаследственных форм острого лимфобластного лейкоза. В клетках с инактивацией NBS1 наблюдается отмена остановки в S после g-облучения и понижение эффективности работы систем репарации двунитевых разрывов ДНК вследствие нарушения функционирования комплекса Rad50/Mre11/NBS1, обеспечивающего оба механизма исправления таких повреждений - гомологичную рекомбинацию ДНК и воссоединение концов разорванной ДНК. Потенциальным онкогенным эффектом обладают, по-видимому, и нарушения функции белка ATR. Гетерозиготный нокаут гена ATR у мышей приводит к увеличению частоты возникновения лимфосарком, фибросарком, раков печени и яичника (инактивация обоих аллелей гена ATR, в отличие от гомозиготного нокаута гена ATM, вызывает внутриутробную гибель). У людей наследственного предрасположения к развитию какихлибо новообразований, связанного с врожденными мутациями ATR пока не выявлено, но соматические мутации этого гена нередко выявляются в клетках некоторых опухолей, в частности рака желудка. Увеличение риска развития новообразований наблюдается и при врожденных мутациях чекпойнткиназы CHK2. Оказалось, что у части пациентов с клиническими проявлениями синдрома Ли-Фраумени (см. раздел 3.3.1), но не имеющих мутаций р53, выявляются герминальные гетерозиготные мутации гена CHK2. Этот факт свидетельствует о ключевой роли нарушений сигнального пути CHK2-p53, контролирующего реакции клетки на повреждения ДНК, в возникновении сильной предрасположенности к развитию самых разных новообразований. Соматические инактивирующие мутации чекпойнткиназ CHK2 и CHK1 обнаруживаются в части случаев наиболее распространенных опухолей: рака легкого, толстой кишки, матки и др. BRCA1 и BRCA2 контролируют репарацию ДНК и размножение клеток Гены BRCA1 и BRCA2 были впервые идентифицированы как гены, врожденные мутации которых ассоциированы с наследственными формами рака молочной железы. У женщин с герминальными мутациями одного из аллелей гена BRCA1 риск развития в течение жизни рака молочной железы составляет около 85% (этот риск несколько варьирует в зависимости от местоположения и/или типа мутаций). Для опухолей яичника такой риск несколько меньше - около 50%. У носителей врожденных мутаций гена BRCA1 выше также вероятность развития опухолей толстого кишечника и простаты. При герминальных мутациях гена BRCA2 риск развития опухолей молочной железы несколько ниже, чем при мутациях BRCA1. Отличительными чертами мутаций BRCA2 являются более частое возникновение рака молочной железы у мужчин и меньший риск развития опухолей яичника. Гены BRCA1 и BRCA2 ведут себя как классические опухолевые супрессоры: для инициации опухолевого роста помимо врожденной мутации в одном из аллелей необходима и инактивация второго аллеля, которая происходит уже в соматической клетке. Как правило, мутации в генах BRCA1 и BRCA2 ведут к прекращению синтеза полноразмерного белка. Особенностью мутаций генов BRCA1 и BRCA2 является то, что они характерны для наследственных форм новообразований и значительно реже обнаруживаются в ненаследственных опухолях той же локализации. Гены BRCA1 и BRCA2 кодируют ядерные фосфобелки (соответственно 1863 и 3495 аминокислот), которые за счет разнообразных белок-белковых взаимодействий участвуют в регуляции репарации ДНК и размножения клеток. Так, белок BRCA1 связывает белки, ответственные за гомологичную рекомбинацию и репарацию двунитевых разрывов ДНК (Rad50, Rad51, BRCA2), компоненты систем репарации неспаренных оснований ДНК (MSH2, MSH6, MLH1, ATP-MSH2 и др.), транскрипционные факторы (базальные - HDAC, р300/CBP, SWI/SNF; и сиквенс-специфические - p53, Myc, E2F, ZBRK1, ATF, рецептор эстрогенов, рецептор андрогенов), а также ряд других белков - pRb (см. II.3.2), BARD1 (опосредует убиквитинирование), BAP1 (ответственен за деубиквитинирование), Nm23 (компонент центросомы) и т.д. Транскрипционная функция BRCA1 заключается в его способности репрессировать одни сиквенс-специфические факторы транскрипции (Myc, E2F, рецептор эстрогенов и др.) и активировать другие (р53 и др.) и модулировать таким образом активность генов, регулируемых этими факторами. При генотоксических стрессах (g-облучение и др.) транскрипционная функция BRCA1 направлена на индукцию остановки клеточного цикла по нескольких механизмам. Так, она обеспечивает усиление активности р53; включение дублирующих, р53-независимых, путей активации некоторых р53-респонсивных генов (p21Waf1/Cip1, GADD45), вызывающих задержку соответственно в G1 и G2 (см. раздел 3.3.3); подавление активности Myc, E2F и т.д. Одновременно активированный BRCA1, взаимодействуя с белками репарационных систем, стимулирует восстановление нормальной структуры ДНК. Рекрутируя комплексы Rad50/Mre11/NBS1, он стимулирует процессирование концов разорванной ДНК, подготавливая их либо для гомологичной рекомбинации, либо для воссоединения "конец в конец" - двух основных путей репарации двунитевых разрывов ДНК. Взаимодействуя с комплексом Rad51/BRCA2, он увеличивает эффективность процесса гомологичной рекомбинации ДНК. Связываясь с белками MSH2, MSH3, MSH6 и др., BRCA1 участвует, очевидно, также и в работе системы репарации неспаренных оснований (исправляет ошибки репликации ДНК и неправильную репарацию двунитевых разрывов ДНК) - см. раздел 3.11.3. Помимо контроля повреждений ДНК и поддержания целостности генома BRCA1 выполняет и ряд других функций. Так, он связывает рецептор эстрогенов и репрессирует его транскрипционную функцию, сдерживая, таким образом, избыточную пролиферацию клеток молочной железы и других эстроген-зависимых органов, в частности при половом созревании и беременности. Кроме того, BRCA1, взаимодействуя с компонентами центросом (Nm23 и др.), принимает участие в обеспечении правильной сегрегации хромосом во время митоза. Исходя из столь многочисленных функций BRCA1, становятся понятными последствия его инактивации. В клетках с дефектным BRCA1 наблюдается сильная генетическая нестабильность, т.е. повышение частоты возникновения спонтанных или индуцированных мутагенами генетических изменений - генных мутаций, хромосомных транслокаций, анеуплоидии и т.д. Кроме того, отменяется сдерживание пролиферации эстрогензависимых клеток, что и объясняет, очевидно, возникновение опухолей именно молочной железы и яичника. Функции белка BRCA2 изучены хуже. Как и BRCA1 он обладает репарационными и транскрипционными активностями. Связывая Rad51 (гомолог бактериального белка RecA), BRCA2 увеличивает его способность катализировать рекомбинации ДНК, обеспечивающие репарацию двунитевых разрывов ДНК. Транскрипционная функция BRCA2 связана, очевидно, со способностью рекрутировать P/CAF (p300/CBP Associated Factors), ацетилирующие гистоны и ремоделирующие хроматин. Однако физиологические гены-мишени BRCA2 пока не идентифицированы. Тем не менее о важности транскрипционной активности BRCA2 для его супрессорной функции может свидетельствовать тот факт, что обнаруживаемые в опухолях молочной железы мутации поражают именно транскрипционный домен. У мышей гомозиготный нокаут резко уменьшает жизнеспособность эмбрионов, а у выживших животных развиваются злокачественные тимомы. На клеточном уровне инактивация BRCA2 приводит к гиперчувствительности к различным генотоксическим агентам (УФ- и g-облучению, химическию мутагенам), повышению частоты встречаемости незарепарированных двунитевых разрывов ДНК и различных перестроек хромосом. Механизмы специфического возникновения у пациентов с герминальными мутациями BRCA2 опухолей молочной железы, яичника и простаты пока не установлены. MSH2, MSH6, MLH1 и PMS2 - компоненты систем репарации неспаренных оснований ДНК Риск развития новообразований значительно повышается и при врожденных дефектах системы репарации неспаренных оснований (mismatch repair), исправляющей главным образом ошибки репликации ДНК и неточности репарации двунитевых разрывов. В результате таких ошибок и потери комплементарности нитей ДНК возникают петли, которые распознаются комплексами белков MSH2/MSH6 или MSH2/MSH3 (они отличаются по способности узнавать разные типы петель, образующиеся при замене оснований, инсерциях и делециях). Эти комплексы рекрутируют к местам с нарушенной структурой ДНК комплексы белков MLH1/PMS2 или MLH1/MLH3, которые, в свою очередь, привлекают экзо- и эндонуклеазы, осуществляющие эксцизию аномального фрагмента ДНК, а также факторы репликации (PCNA, ДНК-полимеразы), обеспечивающие застройку бреши и восстановление нормальной структуры ДНК. Врожденные гетерозиготные мутации по меньшей мере четырех из компонентов этой системы - MSH2, MLH1, MSH6 и PMS2 - вызывают синдром Линча. Главной чертой этого синдрома является развитие в молодом возрасте опухолей толстой кишки (так называемый наследственный неполипозный колоректальный рак) и/или опухолей яичника. Преимущественное возникновение опухолей кишечника, вероятно, связано с высочайшим пролиферативным потенциалом клеток на дне кишечных крипт, что естественно ведет и к более частому появлению ошибок репликации, которые должны исправляться именно системами репарации неспаренных оснований. Естественно, что бурно размножающиеся полустволовые (амплифицирующие) клетки кишечного эпителия накапливают необходимый для развития опухолей набор мутаций быстрее, чем медленно размножающиеся клетки. Возникновение опухолей при дисфункции MSH2, MLH1, MSH3 или PMS2 связано, очевидно, с повышенной вероятностью мутаций в протоонкогенах и опухолевых супрессорах. Действительно, при мутациях гена MSH2 или MLH1 частота точечных мутаций во всех локусах увеличивается на 1-2 порядка, а в наследственных колоректальных раках, как правило, обнаруживаются точечные мутации в генах bкатенина, АРС, TbR-II, Smad2, Smad4 и т.д., которые, по-видимому, и являются причиной развития новообразований. Маркером инактивации любого из генов репарации неспаренных оснований является легко выявляемая нестабильность микросателлитных последовательностей ДНК. Нарушения функции генов MSH2, MLH1, MSH3, MSH6 и PMS2, приводящие к нестабильности микросателлитов, характерны и для некоторых форм спорадических (ненаследственных) опухолей: они обнаруживаются в 13-15% опухолей толстой кишки, рака желудка и эндометрия, но значительно реже (<2%) в других новообразованиях. Описаны единичные случаи герминальных мутаций обоих аллелей гена MLH1, которые приводили к развитию еще во внутриутробном возрасте лимфосарком, лейкозов и нейрофиброматоза. Это объясняется видимо тем, что при полной инактивации системы репарации ошибок репликации ДНК и бурном размножении в эмбриогенезе клеток всех тканей, необходимое для образования опухоли количество мутаций успевает накопиться в каких-то клетках задолго до рождения, тогда как при гетерозиготных мутациях темп мутирования ниже и накопление мутаций до критического уровня продолжается в интенсивно размножающихся клетках взрослого организма. С этой точки зрения пока непонятно, почему у мышей как с гетерозиготным, так и с гомозиготным нокаутом гена MSH2 или гена MLH1, также развиваются лимфомы и саркомы, а не опухоли кишечника. (Впрочем, следует заметить, что мыши сильно отличаются от человека и по типу спонтанно развивающихся опухолей: у человека большую часть новообразований представляют различные формы рака, возникающие из эпителиоцитов, тогда как у мышей такие опухоли достаточно редки, а возникают, как правило, лимфомы и саркомы). Природу таких различий еще предстоит выяснить. 3.11.4.Компоненты системы эксцизионной репарации ДНК и пигментная ксеродерма Система эксцизионной репарации узнает и исправляет сшивки оснований (тиминовые димеры и др.), образующиеся, например, после УФ-облучения или оксидативного стресса. Она включает множество компонентов. Распознавание тиминовых димеров осуществляется белковым комплексом XPC-hHR23, который вызывает рекрутирование к месту повреждения фактора TFIIH - сложного белкового комплекса, состоящего из 9 субъединиц и обладающего разными активностями, в том числе хеликазной и транскрипционной. Привлеченный фактор TFIIH катализирует раскрытие поврежденного участка ДНК и способствует сборке репарационного комплекса. Затем к дефектному участку последовательно рекрутируются белки XPG, XPA, комплекс RPA и, наконец, белки XPF-ERCC1, являющиеся эндонуклеазами. Именно они и осуществляют эксцизию поврежденного участка ДНК (обычно вырезается 24-32 нуклеотида) и инициируют застройку бреши по неповрежденной матрице и восстановление нормальной структуры ДНК. Герминальные гетерозиготные мутации компонентов системы эксцизионной репарации, в частности генов XPA, XPB, XPC, XPD, XPF, XPG, ведут к возникновению пигментной ксеродермы - наследственного заболевания, характеризующегося повышенной чувствительностью к ультрафиолетовому облучению и развитием множественных опухолей кожи на местах, подвергающихся солнечному облучению. Интересно, что, несмотря на участие эксцизионной репарации в исправлении дефектов, вызванных не только УФ-облучением, но и мутагенами/канцерогенами, частота возникновения других форм опухолей при пигментной ксеродерме почти не увеличивается. При этом у трансгенных мышей с аналогичными дефектами системы эксцизионной репарации отмечается повышение частоты индукции новообразований химическими канцерогенами. Преимущественное возникновение у пациентов с пигментной ксеродермой исключительно опухолей кожи может указывать на незначительную роль химических факторов, загрязняющих окружающую среду, в развитии опухолей внутренних органов у человека. Литература. 1. Копнин Б.П. Мишени действия онкогенов и опухолевых супрессоров: ключ к пониманию базовых механизмов канцерогенеза. Биохимия, 2000, 65, 5-33. 2. Чумаков П.М. Функция гена р53: выбор между жизнью и смертью. Биохимия, 2000, 65, 34-47. 3. The Genetic Basis of Human Cancer. Eds Vogelstein B., Kinzler, K.W. McGraw Hill, New York, 1998. 4. Gray, J. W. & Collins, C. Genome changes and gene expression in human solid tumors. Carcinogenesis, 2000, 21, 443-452. 5. Hanahan D., Weinberg R.A. The hallmarks of cancer. Cell, 2000, 100, 57-70. 6. Levine A. J. The tumour suppressor genes. Annu. Rev. Biochem., 1993, 62, 623-651. 7. Weinberg R.A. The molecular basis of oncogenes and tumor suppressor genes. Ann. N.Y. Acad. Sci., 1995, 758, 331-338. 8. Hooper M.L. Tumour suppressor gene mutations in humans and mice: parallels and contrasts. EMBO J., 1998, 17, 6783-6789. 9. Ghebranious N., Donehower L.A. Mouse models in tumor suppression. Oncogene, 1998, 17, 3385-3400. 10. Knudson, A. G. Mutation and cancer: statistical study of retinoblastoma. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 1971, 68, 820-823. 11. Grana X., Garriga J., Mayol X. Role of the retinoblastoma protein family, pRb, p107 and p130 in the negative control of cell growth. Oncogene, 1998, 17, 3365-3383. 12. Lipinski M.M., Jacks T. The retinoblastoma gene family in differentiation and development. Oncogene, 1999, 18, 7873-7882. 13. Harbour J.W., Dean D.C. The Rb/E2F pathway: expanding roles and emerging paradigms. Genes Dev., 2000, 14, 2393-2409. 14. Paggi M.G., Giordano A. Who is the boss in the retinoblastoma family? The point of view of Rb2/p130, the little brother. Cancer Res., 2001, 61, 4651-4654. 15. Vogelstein B., Lane D., Levine A. Surfing the p53 network. Nature, 2000, 408, 307-310. 16. Levine A.J. p53, the celular gatekeeper for growth and division. Cell, 1997, 88, p.323 - 331. 17. Woods, D. B. & Vousden, K. H. Regulation of p53 function. Exp. Cell Res., 2001, 264, 5666. 18. Prives, C. and Hall, P.A. The p53 pathway. J. Path., 1999, 187, 112-126. 19. Sionov R.V., Haupt, Y. The cellular response to p53: the decision between life and death. Oncogene, 1999, 18, 6145 - 6157. 20. Yang A, McKeon F. p63 and p73: p53 mimics, menaces and more. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol., 2000, 1, 199-207. 21. Sherr C. J. & Weber, J. D. The ARF/p53 pathway. Curr. Opin. Genet. Dev., 2000, 10, 94-99. 22. Ruas M., Peters G. The p16INK4a/CDKN2A tumor suppressor and its relatives. Biochem. Biophys. Acta, 1998, 1378, F115-F177. 23. Sherr C. J. Parsing Ink4a/Arf: "pure" p16-null mice. Cell, 2001, 106, 531-534. 24. Maehama, T. & Dixon, J. E. PTEN: a tumour suppressor that functions as a phospholipid phosphatase. Trends Cell Biol., 1999, 9, 125-128. 25. Bonneau, D. & Longy, M. Mutations of the human PTEN gene. Hum. Mutat., 2000, 16, 109122. 26. Polakis P. The adenomatous polyposis coli (APC) tumor suppressor. Biochim.Biophys. Acta, 1997, 1332, F127-F147. 27. Polakis P. The oncogenic activation of b-catenin. Curr. Opin. Genet. Dev., 1999, 9, 15-21. 28. Polakis P. Wnt Signaling and cancer. Genes Dev., 2000, 14, 1837-1851. 29. Polakis P. More than one way to skin a catenin. Cell, 2001, 105, 563-566. 30. Taipale J., Beachy P.A. The Hedgehog and Wnt signaling pathways in cancer. Nature, 2001, 411, 3503-354. 31. Bienz M., Clevers H. Linking colorectal cancer to Wnt signaling. Cell, 2000, 103, 311-320. 32. Massague J., Blain S.W., Lo R.S. TGFb signaling in growth control, cancer, and heritable disorders. Cell, 2000, 103, 295-309. 33. Massague J. How cells read TGF-? signals. Nature Rev. Mol. Cell Biol., 2000, 1, 169-178. 34. Blagosklonny M.V. Do VHL and HIF-1 mirror p53 and Mdm-2? Degradation-transactivation loops of oncoproteins and tumor suppressors. Oncogene, 2001, 20, 395-398. 35. Gutmann D.H., Hirbe A.C., Haipek C.A. Functiomal analysis of neurofibromatosis 2 (NF2) missense mutations. Hum. Mol.Genet., 2001, 10, 1519-1529. 36. Kinzler, K. W. & Vogelstein, B. Gatekeepers and caretakers. Nature 386, 1997, 761-763. 37. Zhou B.-B.S., Elledge S.J. The DNA damage response: putting checkpoints in perspective. Nature, 2000, 408, 433-439. 38. Lengauer C., Kinzler K.W., Vogelstein B. Genetic instabilities in human cancers. Nature, 1998, 396, 643-649. 39. Ponder B.A.J. Cancer genetics. Nature, 2001, 411, 336-341. 40. Shiloh, Y. Ataxia-telangiectasia and the Nijmegen breakage syndrome: related disorders but genes apart. Annu. Rev. Genet., 1997, 31, 635-662. 41. Kastan M.B., Lim D.S. The many substrates and functions of ATM. Nature Rev. Mol. Cell. Biol., 2000, 1, 179-186. 42. Walworth N.C. Cell-cycle checkpoint kinases: checking in on the cell cycle. Curr. Opin. Cell Biol., 2000, 12, 697-704. 43. Welsh P.A., King M.-C. BRCA1 and BRCA2 and the genetics of breast and ovarian cancer. Hum. Mol.Genet., 2001, 10, 705-713. 44. Zheng L., Li S., Boyer T.G., Lee W.-H. Lessons learned from BRCA1 and BRCA2. Oncogene, 2000, 19, 6159-6175. 45. Wang Q., Zhang H., Fishel R., Greene M.I. BRCA1 and cell signaling. Oncogene, 2000, 19, 6152-6158. 46. Kolodner R.D., Marsischky G.T. Eukaryotic DNA mismatch repair. Curr. Opin.Genet. Dev., 1999, 9:89-96. 47. de Laat W.L., Jaspers N.G.J., Hoeijmakers J.H.J. Molecular mechanism of nucleotide excision repair. Gen. Dev., 1999, 13, 768-785. 48. Lehman A.R. The xeroderma pigmentosum group D (XPD) gene: one gene, two functions, three diseases. Gen. Dev., 2001, 15, 15-23.