человека на примере аудиогенной эпилепсии крыс

Генетические модели болезней
человека на примере аудиогенной
эпилепсии крыс
:
Полетаева И.И.
Кафедра ВНД, лаборатория физиологии и
генетики
е е
поведения
о еде
Биологический факультет МГУ
Эпилепсия – одно из наиболее распространенных
заболеваний ЦНС и встречается примерно у 1.5-2%
населения мира.
Эпилепсия – частое осложнение травмы мозга (в том
числе родовой),
й) нейроинфекции,
й
ф
интоксикаций.
й
Однако примерно 70% всех случаев эпилепсии человека
не связаны ни с травмой или опухолью мозга,
мозга ни с
родовой травмой и т.п. Это так называемая
идиопатическая эпилепсия.
эпилепсия
Известно, что значительный процент (до 30%) случаев
эпилепсии не поддаются медикаментозному лечению.
р у продолжения
р д
исследований
д
механизмов
Это требует
развития эпилептического процесса, в том числе и с
использованием генетических моделей.
Лабораторная модель психического заболевания на животных
должна отвечать трем требованиям:
1) иметь внешнее сходство
2) механизмы возникновения феноменов должны быть сходными
3) Модель должна иметь предсказательную силу
Модели эпилепсии, как заболевания человека, необходимы не
только для выявления биохимических и молекулярных
механизмов патологических процессов этого заболевания,
идентификации
ф
генов «эпилепсии», но и для оценки эффектов
фф
противосудорожных препаратов.
T. Burne et al.,, Big
g ideas for small brains: what can p
psychiatry
y
y learn
from worms, flies, bees and fish? Molecular Psychiatry (2011) 16, 7–
16
• Эпилептические(cудорожные) разряды – это
присущее нейронным сетям свойство, которое
определяется их структурной и функциональной
организацией
й связей
й между нейронами.
й
• Способность в норме
р
генерировать
р р
быстрые
р
осцилляции - еще одно свойство, присущее
нервным сетям. Именно эти осцилляции могут
играть ключевую роль в инициации (некоторых
типов)) ф
фокальных припадков.
р
д
Особенностью эпилепсии, как заболевания,
является наличие ПРИСТУПОВ или ПРИПАДКОВ
В интервалах между ними работа мозга
(по показателям ЭЭГ) находится в пределах нормы;
Приступ характеризуется пароксизмальными вспышками
синхронизированной активности и имеет внешние
проявления в виде судорог или состояния «абсанса».
б
Переход между этими состояниями происходит либо с
р д
((аура),
ур ), либо мгновенно
предвестниками
Генетические
основы
эпилепсии
z
Наиболее частые случаи
Полигенное наследование
Олигогенное наследование
z
z
z
z
z
z
z
z
ТИПЫ ЭПИЛЕПСИЙ
Менделевское наследование
Не-менделевское наследование
Аутосомное доминантное
Аутосомное-доминантное
Митохондриальное наследование
Аутосомно-рецессивное
Хромосомные аберрации
Сцеленное с Х доминантное
Сцепленное с Х рецессивное
Редкие случаи
Steinlein O.K.Genetics and epilepsy. Dialogues Clin Neurosci. 2008;10(1):29-38.
Большинство случаев генетически
детерминированной эпилепсии человека (и,
видимо, животных) относится к категории
“channelopathies”, аномалий каналов. Такие
аномалии возникают при мутациях генов,
генов
кодирующих белки потенциал-зависимых
ионных каналов. Такие аномалии, в свою
очередь, вызывают гипервозбудимость
нейронов в свою очередь,
нейронов,
очередь провоцирующую
развитие судорог.
Примеры CHANNELLOPATHIES у человека
• Мутации генов калиевых каналов (KCNQ2 and KCNQ3) описаны у
человека в случаях “доброкачественных” судорог новорожденных
• У мышей-нокаутов с выключением альфа-субъединицы потенциалзависимого калиевого канала ((Kv1.1)) в рраннем постнатальном
онтогенезе возникают периодические спонтанные судороги
• Аномалия
А
субъединицы
б
альфа
ф 4 никотинового ацетилхолинергического
рецептора обнаружена при ночных эпилептических припадках с
локализацией очага в лобной области.
области
• Аутосомная доминантная мутация (ADPEAF, MIM 600512) обнаружена
при редкой форме идиопатической латеральной височной эпилепсии (с
нарушениями слуха).
Heron S
S.E.,
E Scheffer I.E.,
I E Berkovic S
S.F.
F et al
al. Channelopathies in Idiopathic Epilepsy
// J. Amer. Soc. Exp. NeuroTher. 2007. Vol. 4. P. 295–304.
Примеры CHANNELLOPATHIES
z
z
z
z
z
Никотиновый ацетилхолиновый рецептор,
рецептор субъединица α4
(CHRNA4, 20q13.2-q13.3) - ночная эпилепсия с лобной
локализацией, тип 1, аутосомно-доминантное
наследование
Никотиновый ацетилхолиновый рецептор, субъединица β2
(CHRNB2 1q21) Ночная эпилепсия с лобной
(CHRNB2,
локализацией, тип 3, аутосомно-доминантное
наследование
ГАМК-A рецептор, субъединица α1 (GABRA1, 5q34-q35)
Миоклоническая эпилепсия юношеского возраста,
аутосомно-доминантное наследование
ГАМК-A рецептор, субъединица γ2 (GABRG2, 5q31.1q33.1)) Генерализованная
q
р
эпилепсия с ф
фебрильными
р
судорогами типа 3+
Изменены (повышены или понижены) уровни экспрессии
б
белков
SK1 SK2,
SK1,
SK2 SK3 подтипов кальций-зависмых
й
калиевых каналов из нейронах нижнего двухолмия крыс
линии GEPR-3.
Mulley et al., Channelopathies as a genetic cause of epilepsy. Curr Opin Neurol. 2003 Apr;16(2):171-6.
N’Gouemo P. et al. Protein expression of small conductance calcium-activated potassium channels is altered in
inferior colliculus neurons of the genetically epilepsy-prone rat. Brain Res. 2009 May 13; 1270: 107–111.
Локализация генов потенциалзависимых и лиганд-зависимых
каналов на хромосомах человека
Мутации генов, кодирующих белки ионных
каналов, относятся к двум фенотипическим
классам:
1. Мутации, вызывающие высокочастотные
ритмические разряды нейронов и повышение
возбудимости нейронных сетей
2. Мутации, вызывающие изменения в строении
ионных каналов
Эпилепсия человека и соответствующие
р
р
модели
д
лабораторные
П
Парциальная
эпилепсия
Г
Генерализованные
припадки
“джексоновские”
“абсансы”
припадки
припадки,
миоклонические
височная эпилепсия
судороги
Клоническиетонические судороги
(спонтанные и
рефлекторные)
Wag/Rij
g j rat strain
GAERS rat strain
Неврологические мутации
TOTTERING и STAGGERER
( ф
(дефекты
кальциевых
каналов), искусственные
мутации и нокауты.
Линии мышей и крыс,
предрасположенных к эпилепсии
Врожденная предрасположенность к аудиогенным
судорогам выражается по разному, в зависимости
от генотипических особенностей и животных и
средовых влияний.
й
Аудиогенные судороги разной степени тяжести
наблюдали у собак, кошек, коз, а также у грызунов
и зайцеобразных
М
Музыкогенная
эпилепсия человека - это частный
й
случай
у
рефлекорной
р ф
р
эпилепсии. Коррелирует
рр
ру с
наличием очага в височной области с преобладанием
аномалий ЭЭГ в правом полушарии
• При рефлекторной эпилепсии переход от спокойного состояния к
припадку провоцируется четким внешним стимулом (резкий звук,
звук
музыка, мелькающий свет, погружение в теплую воду и т.п.).
•Рефлекторная эпилепсия на мелькающий свет наиболее часто
встречается
с ре ае с у девочек-подростков
е о е о рос о (большой
(бо
ой генетический
е е ес й компонент).
о о е )
•В
В североафриканской
ф
й популяции павианов (P
(Papio
i papio)
i ) в ответ на
мелькающий свет развиваются приступы типа «абсансов» и клоникотонические судороги.
•У
У крыс линийй Wag/Rij
W /Rij и GAERS обнаружены
б
приступы, сходные с
«абсансами» человека. Они сопровождаются эпилептическими
разрядами в ЭЭГ и некоторыми внешними проявлениями ((замирание).
)
•Wakayama
W k
epileptic
il ti ratt (WER) – это еще одна генетическая модель. У
них обнаруживаются и спонтанные судороги, и “абсансы”
Аудиогенные судороги
(главным образом у лабораторных мышей и крыс)
Описаны две формы этой рефлекторной эпилепсии:
1 Врожденная предрасположенность к аудиогенным
1.
судорогам
2. Предрасположеннсть, которая формируется после
“
“процедуры
“прайминга”.
“
й
”
Эффективность
фф
“прайминга”
р
зависит от р
режима первичной
р
экспозиции действию звука и от генотипа.
Аудиогенные судороги у мышей впервые наблюдали в
лаборатории И.П Павлова
В опытах Н.П. Студенцова у мышей вырабатывали
пищевой условый рефлекс, гле условным сигналом был
сильный звук звонка.
звонка Неожиданно оказалось,
оказалось что у
некоторых животных в ответ на звук развивались
судороги.
Перое упоминание в литературе - И.А.
И А Васильев (1924).
(1924)
• В начале 1950 г.г. H.
H Frings
Fi
и M.
M Frings
Fi
начали селекцию белых мышей на
предрасположенность к аудиогенной
у
эпилепсии и на ее отсутствие.
• У мышей DBA/2J аудиоегнные судороги
были обнаружены в 1947 г (Hall, 1947).
• В начале 1990 гг. И.Г. Лильп и ее коллеги
обнаружили аудиогенную эпилепсию у
мышей линии 101/HY
Frings H., Frings M. Development of strains of albino mice with predictable susceptibilities to
audiogenic
g
seizures. Science. 1953 Mar 13;117(3037):283-4.
(
)
Предрасположенная к аудиогенной
эпилепсии линия крыс КМ
Леонид Викторович
Крушинский (1911-1984)
Людмила Николаевна
Молодкина (1920-1993)
(1920 1993)
Дмитрий Андрианович
Флесс (1921-2003)
На Биолого-почвенном ф-те
МГУ в 1947 году была начата
селекция крыс на
предрасположенность к
у
эпилепсии на
аудиогенной
основе популяции крыс Вистар.
Через несколько лет работа Л.В.
Крушинского, Л.Н. Молодкиной
и Д.А. Флесса увенчалась
успехом. Эта линия существует и
поныне и пользуется большой
популярностью у физиологов и
фармакологов, как генетическая
модель эпилепсии. Она
О
называется линия КрушинскогоМолодкиной или КМ.
Существующие линии крыс с
предрасположенностью к аудиогенным (AУД)
или спонтанным (СП) судорогам:
KM – линия Крушинского-Молодкиной (КМ)- АУД
GEPR - Genetically epilepsy prone rats – АУД, СП
WAR - Wistar audiogenic rats - АУД
GAERS - Genet. absence epilepsy rat strain - СП
WAG/Rij - Wistar – АУД, СП
WER - Wakayama epileptic rat - СП
IGER - Ihara
Ihara'ss genetically epileptic rat,
rat СП
Линии мышей со спонтанной и/или аудиогенной эпилепсией:
Инбредная линия EL- spontaneous
Инбредная линия DBA/2J -audiogenic
audiogenic
Инбредная линия 101/HY - audiogenic
Инбредная линия Rb1 (Frings strain) - audiogenic
Идентифицированные локусы:
Black Swiss - juvenile audiogenic seizures in mice (jams1)
Mouse audiogenic seizure susceptibility 1 (MASS1)
tottering locus (tg) spontaneous absences
Knockouts:
Нокауты по гену Vlgr1, audiogenic.
Нокаут по гену серот. рецептора 5-HT2C receptors, audiogenic
Н
Нокаут
по гену interleukin-6
i
l ki 6 (IL
(IL-6)
6) audiogenic
di
i
“Fragile X” нокаут (fmr-1 ) audiogenic
Мутация в локусе KCNA1 (калиевый канал) audiogenic
Роль аномалий слуха
у
Феноменология аудиогенного
у
приступа
р
у у крыс
р и
мышей сходна.
Может ли эта патология быть связана с дефектами в
слуховой системе (анатомическими и/или
физиологическими аномалиями внутреннего
ф
ур
ууха?
Да! У грызунов с предрасположенностью к
аудиогенной эпилепсией структура внутреннего
уха и острота слуха бывают нарушены.
нарушены
Аномалии слуха
z
z
z
В афферентных и эфферентных путях слуховой
системы имеются ГАМК-ергические
ГАМК
звенья.
В нормальном процессе развития органа слуха
крысы есть фаза повышенной экспрессии NMDA
и AMPA рецепторов.
Поскольку в ЦНС предрасположенных к
аудиогенной эпилепсии животных и ГАМК
ГАМКергическая, и глутаматергическая системы
аномальны, можно полагать, что это связано с
данным признаком
Ухо
млекопитающего
Cross section of the cochlear
duct.
ДЕФЕКТЫ СЛУХА ((ВП)) крыс GEPR:
У крыс линии GEPR-9 пороги реакции на щелчок и ЛП ряда пиков были
значительно выше по сравнению с исходной популяцией Спрэг
Спрэг-Доули.
Доули.
В линии GEPR-3 время центрального проведения было длиннее, чем в
норме.
р
У GEPR-9 и GEPR-3 было умеренное снижение слуха.
УЛЬТРАСТРУКТУРНЫЕ АНОМАЛИИ КОРТИЕВА ОРГАНА У
ЛИНИЙ GEPR :
™Нарушение структуры stereocilia наружных и/или
внутренних волосковых клеток;
™Отсутствие 10-15% внутренних волосковых клеток;
™Отсутствие в некоторых областях всех наружных
волосковых клеток;
™В одном из экспериментов в улитках чувствительных крыс
наружных волосковых клеток было гораздо больше, чем в
контроле.
Дефекты слуха
Дефект слуховой системы у крыс вызывали :
• 8 min действием сильного звука (125 dB) на 14 день
жизни;
ц
((100 mg/kg)
g g) на 9-12 дни жизни; or
• введением канамицина
• введением больших доз канамицина на 9-12 дни жизни.
Во взрослом возрасте у всех крыс были аудиогенные
судороги (эффект прайминга).
Однако у крыс после малой дозы канамицина и ранней
экспозиции звуку волосковые клетки сохранялись
Т сенситизация слуховой
Т.о.,
й системы - не обязательное
б
условие возникновения аудиогенных судорог
Pierson & Li, Hear. Res. 1996 Nov 1;101(1-2):7-13
ДЕФЕКТЫ СЛУХА
™ Мыши линии RB/1bg (инбредная линия, выведенная на основе
линии Frings) - предрасположены к аудиогенной эпилепсии. У нее
пороги слуховых ВП выше, чем у нечувствительной линии RB/3bg, а у
F1 гибридов обнаруживался гетерозис по функции улитки.
™Мыши Black Swiss сильно предрасположены к аудиогенной
эпилепсии («пик» чувствительности в 21 день). Но у них не
обнаружено
б
генетических корреляцийй слуховых порогов в «юности» с
судорогами или с изменениями этих порогов во взрослом возрасте.
.
™Критически важным для развития аудиогенной эпилепсии считается
повышение чувствительности слуховой системы в раннем возрасте.
возрасте
Однако у мышей BALB/c можно индуцировать аудиогенные судороги
путем экспозиции их звуку во взрослом возрасте.
возрасте
В афферентных
фф р
и эфферентных
фф р
путях
у слуховой
у
системы
имеются ГАМК-ергические и глутаматергические «звенья».
В нормальном процессе развития органа слуха крысы есть
фаза повышенной экспрессии NMDA и AMPA рецепторов.
Возможно, что это ко-факторы, связанные с данным
признаком
ПРОЦЕДУРА «ПРАЙМИНГА»
В 1967 гг. К
К. Хенри описал эффект прайминга в АЭ
АЭ.
Молодых мышей линии C57BL/6J в «критический период»
подвергали действию сильного звука (акустическая
травма) после чего у них изменялась реакция на звук –
травма),
возникали аудиогенные судороги и сильная акустическая
стартл-реакция.
N d epileptic
Noda
il ti ratt (NER) - мутантная линия в Crj-колонии
Cj
Вистар. Для них характерны спонтанные тоникоклонические судороги с 14-нед. возраста. После
«прайминга (в возрасте 3 нед) в возрасте 9 нед у 100%
животных обнаруживаются
ру
типичные аудиогенные
уд
судороги.
Аудиогенные судороги можно вызвать у “нормальных”
мышей и крыс
р
ряда
р д линий,, если в течение критического
р
периода вызвать у них травму улитки.
К
Критический
й период - возраст 14-18
14 18 дней
й
Травму можно индуцировать сильным звуком или слуховой
депривацией (с последующей интенсивной звуковой
стимуляцией).
стимуляцией)
Путем “прайминга” можно вызвать эпилептические
судороги у:
• крыс Long-Evans (аутбредная линия)
• линии NODA
• линии WER
• ряда линий
й мышей
й (e.g.
(
C57BL/6J)
• мышей-нокаутов по Fyn-киназе
ПРОЦЕДУРА «ПРАЙМИНГА»
Способность к развитию АЭ после “прайминга”
прайминга также
имеет генетическую составляющую.
Дж Фуллер провел быструю успешную селекцию на:
Дж.
Предрасположенность к АЭ,
Чувствительность к праймингу,
праймингу
Умеренную чувствительность к праймингу,
Устойчивость к судорогам
Селекция “пошла”, но было ясно, что эти признаки нельзя
приписать действию одного рецессивного гена.
Анализ селекции на чувствительность к «праймингу» реализованная наследуемость
р
ду
равна
р
0.2-0.3.
Мыши, селектированные на разную чувствительность к
праймингу
р
у не отличались по ур
уровню “базовой”
подверженности АЭ.
Т.е., акустический прайминг и истинная АЭ контролируются
разными системами генов.
СЛУХ У МЫШЕЙ ПОСЛЕ ПРАЙМИНГА
• Влияние травматического повреждения барабанной перепонки на
выраженность аудиогенной эпилепсии у мышей. Сравнивали мышей (2
поколения селекции),
селекции) чувствительных к эффектам прайминга,
прайминга а также
чувствительных и нечувствительных к звуку.
• Травма не повлияла на чувствительных и умеренно чувствительных к
эффекту прайминга мышей. У других линий - судороги усилились.
Вывод: Появление судорог обусловлено развитием
сверхчувствительности
р у
к звуку
у у в восходящих слуховых
у
путях
у
вследствие снижения афферентного потока (один из возможных
путей генеза чувствительности).
z
МЕТАФИТ
z
Последовательность фаз аудиогенного приступа, сходная
у крыс и мышей разных генотипов
Приступ начинается с
фазы быстрого бега
(двигательное
возбуждение), за которым
о у следовать
с едо а
могут
клонические, а затем
тонические судороги.
судороги У
мышей судороги чаще
кончаются смертью
смертью.
ФЕНОТИП ПРИСТУПА У КРЫС ЛИНИИ КМ
Селекция крыс КМ на высокий уровень предрасположенности к
АЭ привела к созданию популяции животных со стабильным
проявлением аудиогенного приступа. Стадия двигательного
возбуждения (быстрый бег) начинается у них через 1-3
1 3 сек
после включения звука,
звука а тонические судороги (высшая
интенсивность припадка) - примерно через 10 сек после
включения звука.
у
В настоящее время линия крыс КМ высоко генетически гомогенна,
насчитывает около 40 поколений инбридинга.
Фенотип аудиогенного приступа
Линии предрасположенных к АЭ крыс GEPR были
выведены (из
( аутбредной
б
й линии Sprague-Dowley)
S
D l )
в Аризонском университете. Приступы обнаружиобнаружи
ваются примерно у 86% животных.
Есть две линии:
GEPR 9 – более
GEPR-9
б
высокочувствительная
(тонические судороги)
GEPR-3 – умеренно чувствительная
(двигательное возбуждение).
Фенотип аудиогенного приступа
С
Селекция
крыс в Бразилии (Garcia-Cairasco
(G
C
et al)) дала
довольно быстрый ответ.
ответ
С 3-го по 17-е поколения селекции средняя
интенсивность судорог возросла с 37 усл. баллов до
83.
83
ЛП в среднем изменился с 23 сек до 8 сек
сек.
Пространственно временные особенности распро
Пространственно-временные
распространения аудиогенного приступа в мозге после включения звука исследовали у крыс KM, GEPR and WAR,
используя ряд экспериментальных подходов:
1. Разрушение
ру
и стимуляция
у ц р
ряда
д структур
ру ур мозга
2. ЭЭГ
3. Топография экспрессии ранних генов
4 Интенсивность мозгового метаболизма в разных
4.
отделах мозга
Результаты были сходными
Стадия двигательного возбуждения (wild run) высокоспецифична
именно для АЭ
АЭ.
Ее называют “wild running clonus” (Fehr et al., 2003), полагая, что она
отражает распространение судорожного разряда на стволовые структуры,
связанные со стереотипными движениями бега и прыжков.
Физиологическая природа «двигательного возбуждения»
Поведение избегания?
Специфическая двигательная аура (предвестник)?
Особая форма клонических судорог?
Двигательное возбуждение – это и интенсивная реакция
избегания, и начало эпилептического припадка.
Эту фазу
Э
ф
можно воспроизвести у нечувствительных крыс
введением бикуккулина (GABA-A antagonist) в нижнее двухолмие
Интенсивность аудиогенного приступа
Двигательное возбуждение (у мышей и крыс) имеет либо одну
«волну», либо две волны с тормозной фазой между ними.
Интенсивность приступа оценивают в условных баллах.
• Для линии КМ используется 5 бальная шкала.
• У GEPR - 9 бальная шкала.
шкала
• У WAR интенсивность приступа измеряют в единицах
от 1 до 90.
Э
Электрофизиология
ф
Изменения электирической активности мозга в момент припадка
одинаковы у всех предрасположенных к АЭ животных. Первые
записи ЭЭГ в момент приступа были
б
сделаны А.Ф.
А Ф Семиохиной,
С
й В.М.
ВМ
Васильевой и К.Г. Гусельниковой в конце 50-х годов ХХ века.
Во время фазы двигательного возбуждения в отведениях от
продолговатого мозга регистрировали эпилептиформные разряды
типа «пик-волна». Активность одиночных нейронов продолговатого
мозга при действии звука усиливалась.
Первичный очаг возбуждения, по этим данным, располагался в
нижних отделах ствола мозга.
Суммарная ЭЭГ при аудиогенных судорогах
Двигательное возбуждение – тета-волны
тета волны во всех
отведениях.
Клонико-тонические судороги - вспышки высокочастотных
волн в стволе мозга и подкорковых ганглиях.
В новой коре и гиппокампе – отсутствие эпилептиформной
активности!
Изменения в ЭЭГ сходны у животных всех генотипов
генотипов,
подверженных аудиогенной эпилепсии.
ЭЭГ при аудиогенных судорогах у
крыс КМ
Пикротоксиновые судороги (ЭЭГ новой
коры)) у мыши C57BL без
б АЭ
ЭЭГ новой коры при АЭ у мыши
Действие звука (то же животное)
Физиология аудиогенного приступа
Хирургическое удаление двигательной зоны коры
не предотвращает развитие аудиогенного судорожного припадка (крысы
(
KM)
KM).
РД в новой коре не предотвращает развития судосудо
рог при аудиогенном припадке (KM, GEPR, WAR).
Подробнее:
НИЖНЕЕ ДВУХОЛМИЕ - структура, критически важная
для развития аудиогенных судорог
судорог. Активация его ней
нейронов предшествует развитию судорог (данные по крысам GEPR).
Физиология аудиогенного приступа
Особенности цитоархитектоники нижнего двухолмия
(крысы GEPR).
У чувствительных крыс больше
б
мелких ГАМКГАМК
ергических
р
нейронов
р
Эта картина присутствует уже у 10-дн. крысят GEPR
(т.е. это не компенсация состояния при повторных
припадках).
р
д )
У гибридов F1 повышенное число таких клеток
коррелировало с наличием АЭ.
«СХЕМА» распростанения приступа при
АУДИОГЕННОЙ ЭПИЛЕПСИИ
центральное ядро н.
двухолмия
Двойное
иммуногистохимичеиммуногистохимиче
ское мечение нейронов
четверохолмия
р
у крыс
р
после клоникотонических
аудиогенных судорог
.
-
глубокое серое
ядро в. двухолмия
Каналопатии при аудиогенной эпилепсии
z
z
z
В настоящее время известно, что
эпилептические разряды и моторные
судороги определяются, в частности,
дефектами ионных каналов, которые
называются «каналопатиями». Такие
нарушения обнаруживаются и при
р
эпилепсии
посттравматической
Повышенная судорожная готовность
Г
Генетические
основы эпилепсии
Каналопатии при аудиогенной эпилепсии
Биология кальциевых каналов
Молекулярной основой усиления кальциевых токов в нейронах нижнего
двухолмия связанных с АС
двухолмия,
АС, может быть генетически или эпигенетически
детерминированное усиление экспрессии отдельных субъединиц (белков)
кальциевого канала.
Кальциевые токи активируют
калиевый ток
ток, который,
который в
свою очередь, вызывает
реполяризацию потенциала
действия и
гиперполяризацию
Калиевый канал,
активируемый кальцием,
восстанавливает состояние
покоя и поддерживает
нормальный уровень
физиологической
возбудимости
Изменения чувствительности к кальцию в зависимых от
Ca2+ калиевых каналах может лежать в основе
изменений возбудимости мембран нейронов
Аудиогенный киндлинг (раскачка)
Повторная ежедневная экспозиция крыс KM, GEPR и WAR
( но не мышей!) действию звука вызывает формирование
судорог иного типа - аудиогенных миоклонических судорог
(аудиогенный киндлинг).
М
Миоклонус
- это парциальные судороги (у
( крыс – ритмическое
сокращение лицевых и шейных мышц,
мышц с распространением на
передние конечности).
конечности)
•
Аудиогенный киндлинг
• Миоклонические судороги развиваются после клонических и
тонических судорог (у
( крыс КМ) или в середине
д
судорожного
приступа (WAR
(WAR, GEPR).
GEPR)
• Миоклонические судороги можно получить и у крыс с
невысокой предрасположенностью к АЭ (Aug/Sto, Wag/Sto, и их
F1 с KM)
KM).
• Развитие аудиогенного миоклонуса захватывает
лимбическую систему (миндалина и гиппокамп). ЭЭГ
проявления эпилепсии обнаруживаются и в новой коре.
Удаление новой коры предотвращает этих судороги.
Селекция на быстрое и медленное
формирование миоклонуса
™И
™Изменения
электрическойй активности и экспрессия ранних
генов в миндалине (крысы GEPR).
GEPR)
™Аудиогенный миоклонус (как и миоклонус,
миоклонус вызванный
электростимуляцией
р
у ц
лимбической системы)) в большей
степени, чем судороги других типов, сходен с височной
эпилепсией человека
™(т.е. заболеванием при локализации очага в области
височной доли (и гиппокампа).
ЭЭГ во время аудиогенного миоклонуса
ГЕНЕТИКА
То, что предрасположенность к АЭ имеет
генетическую основу, было известно очень давно, с
первых работ, посвященных этому явлению (Hall,
1947).
Исследования генетической основы аудиогенной
эпилепсии у крыс и мышей дали разные
результаты.
Генетика аудиогенного приступа у мышей
У разных линий мышей был обнаружен разный
р
р наследования признака.
р
характер
Например, у мышей линии Rb/1bm был открыт локус
mass-1 (mouse audiogenic seizure sensitivity, Skradski
ett al.,
l 2001),
2001) который
йб
был картирован на хромомсоме
13 мыши.
мыши
Мутация этого локуса у линии Rb/1 вызвала
появление у них АЭ.
ГЕНЕТИКА
Белок MASS1 – это часть другой более крупной
молекулы - Very Large G-coupled Receptor-1
(VLGR1).
мРНК VLGR1 экспрессируется главным образом в
нейроэпителии
р
развивающегося
р
щ
мозга мыши.
Его транскрипты - VLGR1d и VLGR1e - это
секреторные белки, а не белки ионных каналов
У нокаутов по Vlgr1 (отсутствие экзонов 2-4)
обнаруживалась аудиогенная эпилепсия.
эпилепсия
ГЕНЕТИКА
Обнаруживаются параллели:
1) Ген мыши VLGR1/MASS1 (мутация которого дала
аудиогенную эпилепсию в линии Rb/1).
2) Ген LGI1 человека – (мутация которого вызывает
доминантно-аутосомную эпилепсию (с
( участием слуховой
й
системы).
Оба гена кодируют не связанные с ионными каналами
белки, у них гомологичен 7 раз повторяющийся участок
из 44 аминокислотных остатков.
ГЕНЕТИКА
Мыши Black Swiss сильно предрасположены к АЭ. Эта
чувствительность проявляется максимально в возрасте 21
день а затем ослабевает.
день,
ослабевает
У мышей BLACK-SWISS ген, ответственный за аудиогенные
судороги, локализован. Это jams1 (juvenile audiogenic
monogenic seizures) картирован на хромосоме 10.
Большая часть последовательности синтенна той области
р
19 человека,, где
д локализован ген семейной
хромосомы
формы детских фебрильных судорог (familial form of juvenile
febrile convulsions).
ГЕНЕТИКА
Мыши линии DBA/2J также чувствительна к звуку, и у нее
(как у Black-Swiss) максимум чувствительности приходится
на третью декаду дней жизни.
жизни Для анализа наследования
этого признака был использован метод РИЛ (батарея из 23
рекомбинантных инбредных линий – потомков
скрещивания DBA/2 и C57BL/6J).
C57BL/6J) П
Показано, что есть при
локуса,
у
связанные с АЭ:
1. Asp-1 - audiogenic seizure prone- хромосома 12
2. Asp-2 – хромосома 4
3. Asp
Asp-3,
3, хромосома 7.
Мыши-нокауты по гену 5-HT2C
М
5 HT2C (серотониновый
(
й
рецептор) имеют высокую предрасположенность к
аудиогенной
й эпилепсии ((проявляется к возрасту 2
23 мес.).
М
Мыши
нокауты по гену fmr1
f 1 (fragile
(f il Х mental
t l
retardation syndrome 1) обнаруживают аудиогенную
эпилепсию.
У «двойных» мутантов по fmr1 и по RGS4(regulator
of G-protein signaling protein, система ГАМК)
аудиогенных судорог практически не было.
Данные диаллельного скрещивания –график варианс
и коварианс признака для животных разных
генотипов
Анализ аудиогенной
эпилепсии у крыс КМ
методом диаллельного
скрещивания показал,
что признак
определяется полигенно
с аддитивным эффектом
Выраженность признака
определяли у всех
гибридов F1 от
скрещивания крыс 5
генотипов (KM, Aug,
WAG MC,
WAG,
MC и дикие серые
крысы).
Анализ варианс и
коварианс этих величин
показал, что аллели,
р д
щ признак
р
определяющие
рецессивны.
Селекционный эксперимент по выведению
крыс непредрасположенных к АЭ
крыс,
У
гибридов
F1
от
скрещивания
крыс
КМ
с
непредрасположенными к АЭ Вистар только 10%
животных обнаружили АЭ с баллом «4». Среди двух
поколений беккроссов на крыс КМ их было уже 50%.
Данные
реакции
на
звук
у
этих
крыс-гибридов
крыс гибридов
соответствовали дигенной модели определения АЭ (с
неполной пенетрантностью).
Распределение
признака
в
эксперименте
отличалась от теоретически рассчитанного.
Федотова и др., Генетика, 2004.
не
Селекционный эксперимент по выведению
крыс непредрасположенных к АЭ
крыс,
% of rats
s with "
"0" reac
ction
45
Wistar parents- 100%
40
35
30
25
20
15
10
5
0
1
2
KM parents 0%
3
4
5
6
7
8
9
Generations of selection
10
НЕЙРОХИМИЧЕСКИЕ
ОСОБЕННОСТИ при АЭ
У МЫШЕЙ и КРЫС с наследственной
предрасположенностью к АЭ изменен
уровень мозговых моноаминов
(норадреналин, дофамин, серотонин)
АМИНОКИСЛОТЫ-НЕЙРОМЕДИАТОРЫ
крысы КМ с сравнении с непредрасположенными Вистар, ФОН
АСПАРТАТ и ГЛУТАМАТ в продолг.мозге - ВЫШЕ
ТАУРИН в новой
й коре - ВЫШЕ
ТАУРИН в продолговатом мозге - НИЖЕ
ГЛИЦИН в продолговатом мозге и коре – ВЫШЕ
Глицин
ц в гиппокампе – НИЖЕ
ГАМК – в стриатуме и коре – ВЫШЕ
ГАМК в продолговатом мозге - НИЖЕ
Glutamate
Aspa
artate
СНИЖЕНИЕ уровней ГАМК в:
продолговатом мозге
стриатуме
гиппокампе
височной коре
Снижение уровней ГЛУТАМАТА в:
продолговатом мозге
стриатуме
гиппокампе
Снижение уровня АСПАРТАТА в
продолговатом мозге
Taurine
Wistar -100%
Glyycine
160
140
120
100
80
60
40
20
0
GABA
G
АМИНОКИСЛОТЫНЕЙРОМЕДИАТОРЫ (КМ) НА
ВЫСОТЕ ПРИСТУПА
Brain aminoacids level background and during
seizures in KM rats
KM background
KM seizures
Raevsky et al., 1995
Моноамины мозга у линий GEPR
• Микровведение в средний мозг 6-OHDA (расщепление
норадреналина) вызывало пропорциональное
усиление интенсивности судорог.
• Билатеральное введение крысам GEPR-9 в верхнее
двухолмие веществ, усиливающих
норадренергическую трансмиссию
трансмиссию, вызывало
снижение интенсивности судорог. Предполагается
участие α1-рецепторов (как и у мышей).
АМИНОКИСЛОТЫ-НЕЙРОМЕДИАТОРЫ
Д
у крыс GEPR
Повышена возбудимость глутаматергической системы
снижена функция ГАМК-ергической системы
Локальные изменения уровней ГАМК,
ГАМК ГЛУТАМАТА
ГЛУТАМАТА,
НОРАДРЕНАЛИНА
Д
и СЕРОТОНИНА
(введением в мозг агонистов или антагонистов)
модулировало проявления АЭ
Аминокислоты нейротрансмиттеры и
Аминокислоты-нейротрансмиттеры
аудиогенная эпилепсия у крыс GEPR
Микроинъекции в нижнее двухолмие (наружная
область коры и центральное ядро) антагониста
NMDA-рецепторов CPP снижало интенсивность
аудиогенных приступов.
Введение антагонистов ГАМК-системы
вызывало усиление интенсивности судорог.
Моноамины в мозге мышей
•
У мышей линии DBA/2J аудиогенные
у
приступы
р
у
причинно связаны с отклонениями в числе
и/или чувствительности α1 адренорецепторов
( не α2(но
2 или β-адренорецепторами).
β
)
•
У этих мышей снижен обмен NA и DA.
DA При
повышении его интенсивности снижается
интенсивность АЭ.
Моноамины в мозге мышей
• Предрасположенность к АЭ у мышей C57BL/10/Bg
и DBA/1Bg их гибридов F1 отрицательно
коррелировала с ууровнем активности
тирозингидроксилазы.
• От возраста 13-15 дней к 21-23 дням у DBA/2J и
C57 B1/6 снижено число мест связывания 5HT2A
в среднем
р д
мозге,, гиппокампе и области моста.
• У DBA/2J была выше плотность мест связывания
5-HT2 типа в новой коре.
Другие биохимические отклонения
Крысы КМ отличаются от крыс Вистар (без АЭ) в некоторых
фракциях липидов мембран клеток мозга (которые содержат
эндогенные антиоксиданты).
При аудиогенных судорогах происходит существенное
повышение ур
уровня свободных
д
радикалов
р д
и перекисных
р
ф
форм
р
липидов, тогда как антиоксидантная активность липидов после
судорог снижается.
Эти изменения происходят в структурах ствола, таламуса и
гиппокампа но не в новой коре
гиппокампа,
коре.
Моноаминоксидазы – важная группа ферментов
ЦНС. На крысах КМ показано, что особенности
каталитической
й активности мембранно-связанной
б
й
МАО-А
МАО
А (связанные с механизмом перекисного
окисления липидов) могут способствовать
повышению судорожной готовности.
Может быть именно эта особенность лежит в
ос о е множественных
основе
о ес е
отклонений
о о е й в мозге,
оз е
наблюдаемых при аудиогенной эпилепсии (в
частности, сходных у разных генетических
моделей АЭ).
Каталептические состояния
Каталепсия – длительная
д
непроизвольная
обездвиженность с
пластическим тонусом
мускулатуры и
арефлексией. Животное в
состояние каталепсии
способно длительное время
сохранять приданную ему
неудобную
б
позу.
Постиктальная каталепсия у крыс КМ
♂ ♀
♂
Интенсивность
аудиогенного
припадка у крыс
ряда генетических
групп
♀
Беспородные
р
Сублиния «0»
КМ
Сублиния «4»
Вистар
90
%
80
70
50
40
30
20
10
ро
дн
ые
бе
сп
о
"0
"
Су
бл
ин
ия
р
Ви
ст
а
Су
бл
ин
ия
"4
"
0
КМ
Интенсивность каталепсии
через 10 мин
после аудиогенного
припадка
60
Постиктальная каталепсия
z
z
z
z
Это каталептическое состояние после АС описано
у крыс WAR и КМ (cелекция из популяции Вистар).
У крыс GEPR припадок заканчивается длительным
возбуждением (не каталепсией).
Можно предполагать, что после припадка
развиваются «гомологи» реакции избегания – либо
замирание (каталепсия),
(
) либо
б бегство
б
(затяжное
(
возбуждение).
М ф
Морфологически
развитие каталепсии
характеризуется «подключением» структур
переднего мозга – стриатума.
стриатума
У крыс линии КМ (и грызунов других генотипов с АЭ)
обнаружен дисбаланс основных нейротрансмиттерных
систем.
Является ли этот дисбаланс ПРИЧИНОЙ
предрасположенности к аудиогенной
й
эпилепсии?
Или этот дисбаланс развивается вследствие
каких-то отклонений в развитии, т.е. является
СЛЕДСТВИЕМ аудиогенной эпилепсии?
Все,, что известно сегодня,, дает возможность делать
только, к сожалению, тривиальные заключения.
Генетические и физиологические механизмы аудиогенной
эпилепсии связаны с генетическими аномалиями генов (или
систем генов),
генов) которые экспрессируются во внутреннем ухе и
слуховых путях. Важно исследовать особенности развития
этих структур, поскольку, повидимому, эпилептические
феномены формируются как следствие объединенного
эффекта таких аномалий.
Эпилептический разряд распространяется, захватывая
вышележащие структуры мозга. Поскольку эти структуры
также аномально возбудимы
б
(особенности
( б
генотипа)) –
развивается эпилептическийй припадок.
Гены которые определяют такие свойства,
Гены,
свойства по всей
видимости кодируют белки ионных каналов (e.g.
(e g mass1,
mass1
калиевые каналы),
каналы) особенности функции системы МАО
МАО-А
А,
а также,, возможно,, связаны с аномальным развитием
р
клеток-предшественниц в слуховой системе.
За развитие АЭ могут отвечать дефекты
развия ЦНС в раннем эмбриогенезе.
z
z
z
Etheridge S. L. et al.,
Murine Dishevelled 3 Functions in Redundant
Pathways with Dishevelled 1 and 2 in Normal
Cardiac Outflow Tract, Cochlea, and Neural
T b D
Tube
Development
l
t
PLoS Genetics | www.plosgenetics.org 1
November 2008 | Volume 4 | Issue 11 |
e1000259
За развитие АЭ могут отвечать дефекты
развия ЦНС в раннем эмбриогенезе.
эмбриогенезе
Одновременное выключение трех транскрипционных факторов (DBP, albumin Dsite-binding
it bi di protein
t i proline,
li
HLF hepatic
HLF,
h
ti lleukemia
k i ffactor,
t TEF,
TEF thyrotroph
th t h embryonic
b
i
factor), определяющих циркадные ритмы (семейство bZin), вызывает у мышей как
спонтанные судороги, так и тяжелую аудиогенную эпилепсию.
Ген-мишень этого семейства регуляторных факторов - pyridoxal kinase (Pdxk)
(превращение производных витамина И6 в пиридоксальфосфат). Он, в свою
р д , – коэнзим многих ф
ферментов
р
метаболизма нейротрансмиттеров.
р р
р
очередь,
У тройных нокаутов снижены уровни пиридоксальфосфата, серотонина,
дофамина
Pdxk экспрессируется в мозге, в том
числе в стволе и
нижнем двухолмии
Gachon F. et al., GENES & DEVELOPMENT 2004, 18:1397–1412
Эндофенотип «аудиогенная
у
эпилепсия грызунов
у
z
z
z
z
z
z
Четкая, специфическая картина (паттерн)
Четкая
судорожного припадка
С о с о паттерна
Сходство
а ер а припадка
р а а у крыс,
р с
селектированных из разных популяций
Характерная для постсудорожного состояния
каталепсия
Изменения МНОГИХ нейрохимических
показателей
Аномалия соотношения ГАМК-глутаматергических
систем в мозге и в периферическом отделе
слухового анализатора
Трудности в выведении крыс с «0»
0
предрасположенностью к звуку
Не следует искать то,
что Вам
В нужно, там,
где просто светлее!
Спасибо за
внимание!
The search for genetic basis of this pathological
trait should include this approach but not the
traditional interstrain comparisons of brain
characteristics
Light microscope photo of cochlea in crosssection
Кортиев орган расположен на базилярной
мембране, над ним текториальная мембрана
Movements between these surfaces generates fluid
currents, which convey to the hair cells the auditory
vibrations
ibrations
Detail of the hair cells from the organ of Corti.
A side view off the organ off C
Corti.
At ppresent it is established that different audiogenic
g
epilepsy models have many common features.
This make it possible to use the molecular-genetic
approachh ffor the
h searchh off the
h genes responsible
ibl on the
h
basis of syntheny data and on the basis of cross-species
knock-out technologies.
g
.
Anatomical substrates
Brain lesion data evidence that:
anatomical structures,, involved in audiogenic
g
fit ppropagation
p g
include: lateral lemniscus (LL)
inferior colliculi (IC)
connections between inferior colliculli and
periaqueductal gray
ANATOMY
The analysis
y of “priming
p
g neuroanatomy”
y showed that
networks of inferior colliculli are of primary importance
network
t k participates
ti i t iin audiogenic
di
i fit
S b
Substancia
i nigra
i
propagation its role is contradictory in different models.
propagation,
DATA on GEPR strains:
Increase in single unit activity in inferior colliculi preceed the start of wild run.
As the excitation reached the reticular pontine nucleus
and periaqueductal gray the clonic
clonic-tonic
tonic seizure starts
starts.
After the seizure fit the electrical activity in all recording was depressed.
BRAIN MONOAMINE DISBALANCE IN KM
RATS
The background levels of serotonine in temporal cortex,
hippocampus and medulla were higher that in nonsusceptible Wistar rats.
rats During tonic seizure it decreased in
neocortex,, increased in hippocampus
pp
p and did not changed
g in
medulla (from where the spread of epileptic discharge is
though to start). stage of audiogenic fit.
The background striatal noradrenaline level in KM rats was
lower than in Wistars but it increased during tonic seizures.
seizures
Онтогенез
*У крыс КМ в возрасте 1 мес уже проявляется АЭ.
АЭ И
интенсивность и временные параметры приступа у молодых
интенсивность,
животных неустойчивы. До 3 мес. возраста у них редко
обнаруживается тоническая фаза.
*Стабильная картина приступа (короткий ЛП и высокая
интенсивность)) устанавливается к возрасту 44-55 мес.
ОНТОГЕНЕЗ
Линии GEPR
Припадки начинаются в возрасте 14 дней
Максимальная интенсивность припадков
устанавливается к 32-34 дню жизни.
Э
Этот
уровень сохраняется на протяжении всей
й
жизни животного.
In vitro показано, что свойственное взрослым
животным снижение амплитуды ТПСП,
обнаруживается в срезах мозга 12 дневных
крысят, т.е. опыт припадков – не важен.
The work on KM strain genetics –
th selection
the
l ti ffor the
th decreased
d
d
seizure susceptibility - as well as
the maintaining of the strain was
supported by RFBF grants and by
IP5 №12245 (Swiss national
F
Foundation).
d ti )
APPENDIX:
Наиболее известные мутации домовой мыши со
спонтанными судорогами (и с другими
неврологическими отклонениями):
jimpy,
quaking,
quaking
weaver,
opisthotonus,
opisthotonus
jittery и несколько других
Для мутации tottering характерны генерализованные
судороги и “абсансы”
При
р tottering
g изменены кальциевые каналы
(“альфа1А субъединица” гена потенциал-зависимого
кальциевого канала).
Однако фенотипические особенности при мутации
tottering много сложнее
Таких мутаций не менее 25,
25
эпилептиформные припадки у мышей можно будет обнаружить при искусственных мутациях
более 1000 генов (описано более 20).
According to Krushinsky’s hypothesis the sequence of events after
the sound onset was the following:
The hyperexitability of the brain makes it possible for the excitation
process to spread upward from the brain stem. This irradiation
i d d th
induced
the inhibition
i hibiti process which
hi h could
ld bbe noticed
ti d
in some animals as the inhibitory pause during wild run.
This inhibition is not very strong and it is exhausted quickly and the
seizure discharge proceeds. Finally the «overthreshold» inhibition
develops and the fit stops.
This hypothesis
yp
of two «macroprocesses»
p
interplay
p y duringg audiogenic
g
fit were confirmed by the pharmacological data.
Bromide was
shown to increase the inhibition ( the inhibitory pause
APPENDIX
appearedd dduring
i wild
ild run)) while
hil caffeine
ff i increased
i
d the
th excitation
it ti ((while
hil
caffeine eliminated this pause).
The decrease of exitation intensity was indicated by increased latencies
and the decrease in fit intensity.