Коц Е.Д.

Исследование механизма каталитического гидролиза фермента Аспартоацилазы и его
мутантных аналогов методами компьютерного моделирования
Коц Екатерина Дмитриевна
Аспирант
Московский государственный университет им. М.В.Ломоносова, Химический факультет,
Москва, Россия
[email protected]
Аспартоацилаза (ASPA) – цинк-зависимый фермент класса карбоксипептидаз [Bitto, 2006,
pp. 456-451], расщепляющий пептидную связь N-ацетил-аспарагиновой кислоты (NAA)
[Surendran, 2003, pp. 604-610]. Нарушение уровня концентрации NAA в мозге служит
индикатором многих нейрональных дисфункций: отклонение его концентрации было
обнаружено при болезни Альцгеймера, болезни Канавана, шизофрении и др. [Jessen, 2013, pp.
197-205].
Модельная система для изучения механизма и функций ASPA – болезнь Канавана,
вызванная врождёнными мутациями в гене, кодирующем данный белок [Wijayasinghe, 2014,
pp. 4970-4988]. На данный момент в литературе существует лишь предполагаемый механизм
гидролиза NAA, не объясняющий роль самых распространённых мутаций в дезактивации
ASPA [Bitto, 2006, pp. 456-451]. Цель данной работы - расчёт профиля минимальной энергии
реакции гидролиза n-ASPA и ASPA(E285A) с последующим построением кинетической
схемы (включая образование белок-субстратного комплекса и выход продуктов) и сравнением
значений рассчитанных kcat и Km с экспериментальными данными. Литературные данные по
зависимости активности фермента от концентрации субстрата свидетельствуют о наличии
второго центра связывания и процесса самоингибирования [Le Coq, 2006, pp. 5878-5884].
Поэтому вторичная цель работы - =объяснение описанной экспериментальной кривой.
Для построения среза профиля минимальной энергии реакции гидролиза NAA с n-ASPA и
ASPA(E285A) был использован метод КМ/ММ (NwChem 6.5.), где квантовая частьбыла
описана методом ТФП c функционалом pbe0 (базис 6-31G(**)), ММ часть – с помощью
силового поля AMBER99. Свободная энергия образования белок субстратного комплекса,
выхода продуктов и побочного центра связывания были рассчитаны методом Umbrella
Sampling (NAMD2.9) Полученные данные были сопоставлены с экспериментальными
значениями kcat и Km [Le Coq, 2006, pp. 5878-5884].
Результаты:
1.
Установлен механизм гидролиза NAA ферментом ASPA и рассчитан профиль
минимальной энергии гидролиза и все сопутствующие барьеры.
2.
Методами молекулярной динамики рассчитаны константы связывания субстрата с
активным сайтов и выхода продуктов в раствор, и установлено, что лимитирующая стадия
реакции – выход продуктов раствор.
3.
Рассчитаны константы связывания для второго центра связывания для свободного
белка и для белок-субстратного комплекса. Полученные значения доказывают возможность
самоингибирования.
Список литературы.
1.
Bitto E., Bingman C.A., Wesenber G.E., McCoy J.G., Phillips G.N. Structures of
aspartoacylase , the brain enzyme impaired in Canavan disease. // PNAS.2007. V. 104. P. 456-461.
2.
Surendran S., Matalon K., Tyring S.K., Matalon R. Molecular basis of Canavan disease: from
human to mouse. // J. Child. Neurol. 2003. V. 18. P. 604-610.
3.
Jessen F., Fingerhut N., Sprinkart A.M., Petrovsky N., Maier W. et al. Nacetylaspartylglutamate (NAAG) and N-acetylaspartate (NAA) in patients with schizophrenia. //
Schizophrenia Bulletin. V. 39(1). P. 197-205.
4.
Le Coq J., An H.-J., Lebrilla C., Viola R.E. Characterization of Human Aspartoacylase: the
brain enzyme responsible for Canavan disease. // Biochem. V. 45(18). P. 5878-5884.