Фукоиданы

На правах рукописи
МАКАРЕНКОВА ИЛОНА ДАМИРОВНА
МОЛЕКУЛЯРНО-КЛЕТОЧНЫЕ МЕХАНИЗМЫ АКТИВАЦИИ
ВРОЖДЕННОГО ИММУНИТЕТА СУЛЬФАТИРОВАННЫМИ
ПОЛИСАХАРИДАМИ БУРЫХ ВОДОРОСЛЕЙ
14.03.09 – Клиническая иммунология, аллергология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание учёной степени
доктора медицинских наук
Москва – 2013
Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении
«Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Г.П.
Сомова» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук и
Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский
институт вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова» Российской академии медицинских
наук
Научные консультанты:
доктор медицинских наук
Семенова Ирина Борисовна
доктор медицинских наук, профессор
Леонова Галина Николаевна
Официальные оппоненты:
Киселевский Михаил Валентинович - доктор медицинских наук, профессор,
заведующий лабораторией клеточного иммунитета ФГБУ "Российский онкологический
научный центр им. Н. Н. Блохина" Российской академии медицинских наук
Калюжин Олег Витальевич – доктор медицинских наук, профессор кафедры
клинической иммунологии и аллергологии ГБОУ ВПО «Первый МГМУ им. И.М.
Сеченова» Министерства здравоохранения Российской Федерации
Прокопенко Владимир Дмитриевич - доктор медицинских наук, профессор
кафедры микробиологии и вирусологии Федерального государственного бюджетного
учреждения Высшего профессионального образования «Российский университет
дружбы народов»
Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение
«Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им.
Г.Н. Габричевского» Роспотребнадзора, г. Москва
Защита диссертации состоится 19 декабря 2013 года в 12 часов на заседании
диссертационного совета Д 001.035.01 в ФГБУ «Научно-исследовательский институт
вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова» Российской академии медицинских наук, по
адресу: г. Москва, Малый Казённый переулок, д. 5А.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «Научноисследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова» РАМН
Автореферат разослан «____» _____________ 2013 г.
Учёный секретарь
диссертационного совета
кандидат биологических наук
И.В. Яковлева
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы
Согласно современным представлениям, иммунная система человека, представлена
двумя интегрированными между собой компонентами - врожденным и адаптивным
иммунитетом, в основе функционирования которых лежат разные механизмы действия,
в целом обеспечивающие защиту организма. Активация врожденного иммунитета
является обязательным условием для формирования неспецифической резистентности к
инфекции и развития адаптивного иммунного ответа [Р. Меджитов, Ч. Джаневей, 2004;
F. Blasi, 2005; Б.Ф. Семенов, В.В. Зверев, 2007]
Эффекторные механизмы врожденного иммунитета многофакторны, однако
универсальная система их действия была сформулирована лишь в последние
десятилетия. Это касается ключевой роли рецепторного аппарата, и прежде всего Tolllike рецепторов (TLRs), которые являются первым звеном взаимодействия с лигандами
патогенных микроорганизмов и определяют дальнейшие пути развития иммунного
ответа [B. Beutler, 2009; T. Kawai, S. Akira, 2010; Л.В. Ковальчук и соавт., 2005 и 2011;
H. Kumar et al., 2011]. Установлена центральная роль дендритных клеток (ДК),
обеспечивающих
распознавание, процессинг и презентацию антигенов наивным Т-
лимфоцитам. Направленность пути активации ДК является важным элементом,
программирующим взаимодействие клеток и развитие иммунного ответа по Th-1 или
Th-2 типу [Р. Меджитов, Ч. Джаневей, 2004; М.В. Пащенков, Б.В. Пинегин, 2006].
Важным компонентом врожденного иммунитета являются и NK-клетки (natural killer),
основной
ключевой
функцией
которых
является
киллинг
инфицированных,
трансформированных и опухолевых клеток организма [K.Takeda, 2004; L.L. Lanier,
2008; М.С. Друцкая и соавт., 2011].
Одним
иммунитета
из
перспективных
является
направлений
использование
активации
системы
иммуномодулирующих
врожденного
препаратов
–
модификаторов эффекторных функций, изучение механизма действия которых на
молекулярном и клеточном уровнях позволит определить рациональный спектр их
дальнейшего использования при различных заболеваниях, связанных с развитием
иммунопатологических состояний [Б.Ф. Семенов, В.В. Зверев, 2007; Н.К. Ахматова,
М.В. Киселевский, 2008].
Приоритетным
направлением
в
изучении
механизма
действия
иммунобиологически активных веществ, является исследование их специфических
лиганд-рецепторных взаимодействий с TLRs, инициирующих развитие сигнального
каскада, активацию ядерных факторов и экспрессию генов иммунного ответа, что
позволит использовать их в качестве молекулярных адъювантов для создания
противоинфекционной защиты организма [И.О. Чикелева и соавт., 2010; S.K. Drexler,
B.M. Foxwell, 2010; G.C. Xie, Z.J Duan, 2012; V.D. Pradhan, 2012].
Среди большого числа природных и синтетических иммуномодуляторов особый
интерес для изучения представляют сульфатированные полисахариды - фукоиданы
бурых водорослей. Биологическое разнообразие водорослей в Мировом океане создает
неограниченный ресурс для создания новых активных соединений за счет уникальной
химической структуры, низкой токсичности и широкого полифункционального спектра
действия [T.N. Zvyagintseva et al., 2003; А.И. Усов, М.И. Билан, 2009; M.I. Bilan, 2010].
Установлено, что сульфатированные полисахариды за счет универсальных
углеводспецифических
взаимодействий
с
мембранными
рецепторами
иммунокомпетентных клеток, инициируют развитие различных внутриклеточных
биохимических
процессов,
что
приводит
к
активации,
морфологическим,
метаболическим и функциональным изменениям нейтрофилов и макрофагов [Т.С.
Запорожец 2006; Т.А. Кузнецова, 2009; T. Teruya et al., 2010; S.B. Park et al., 2010; Н.Н.
Беседнова, Т.С. Запорожец, 2011].
Несмотря на многочисленное количество исследований, имеющих фрагментарный
характер, механизм активации системы врожденного иммунитета под действием
сульфатированных полисахаридов остается мало изученным. Отсутствуют данные о
влиянии
фукоиданов
на
функциональную
активность
ключевых
эффекторов
врожденного иммунитета, обеспечивающих неспецифическую резистентность и
развитие адаптивного иммунного ответа, активацию транскрипционных ядерных
факторов при взаимодействии с TLRs,
практически отсутствуют исследования,
показывающие связь химической структуры с противовирусным действием фукоиданов.
Настоящая работа раскрывает механизмы активации системы врожденного
иммунитета сульфатированными полисахаридами бурых водорослей и является
экспериментальным обоснованием возможности конструирования на их основе
фармацевтических субстанций и лекарственных препаратов.
Цель исследования
Исследование молекулярных и клеточных механизмов активации врожденного
иммунитета различными по химической структуре фукоиданами из бурых водорослей
Fucus evanescens, Laminaria cichorioides и Laminaria japonica и оценка их влияния на
формирование противовирусной защиты.
Задачи исследования
1. Установить влияние фукоиданов из бурых водорослей F. evanescens, L.
cichorioides и L. japonica на экспрессию TLRs на иммунокомпетентных клетках (ДК и
МЛ) и их взаимодействие с TLRs на эукариотических линиях клеток эмбрионального
почечного эпителия человека.
2. Определить влияние фукоиданов из F. evanescens, L. cichorioides и L. japonica на
созревание (экспрессия маркеров активации и терминальной дифференцировки,
адгезивных, костимулирующих и антигенпредставляющих молекул) морфологию и
продукцию цитокинов дендритными клетками.
3. Провести сравнительное изучение влияния фукоиданов из F. evanescens, L.
cichorioides и L. japonica на субпопуляционный состав МЛ, продукцию цитокинов,
пролиферативную и цитотоксическую активности спленоцитов мышей в системах in
vitro и ex vivo.
4. Исследовать действие сульфатированных полисахаридов бурых водорослей на
морфологическую структуру первичных и вторичных органов иммуногенеза.
5. На экспериментальных вирусных моделях в системах in vitro и in vivo изучить
антиадсорбционное, вирусингибирующее и протективное действие различных по
влияние химической структуры сульфатированных полисахаридов бурых водорослей в
отношении вируса гриппа птиц А/H5N1, хантавируса и вируса клещевого энцефалита.
Научная новизна работы
Впервые установлено увеличение экспрессии TLR-2 и TLR-4 на поверхности
дендритных клеток и МЛ селезенки мышей,
что определяет дальнейшие пути
активации проводящих путей для передачи сигналов, индуцирующих экспрессию генов
провоспалительных цитокинов и интерферониндуцибельных генов.
Впервые доказано, что различные по химической структуре сульфатированные
полисахариды из бурых водорослей F. evanescens, L. cichorioides и L. japonica при
взаимодействии с ТLR-2, ТLR-2/6 и ТLR-4 на клеточных линиях эмбрионального
почечного эпителия человека HEK-293 активируют транскрипционный ядерный фактор
NF-kB через MyD88 сигнальный путь, а при взаимодействии с ТLR-4 дополнительно
через адаптерную пару TRIF/TRAM. Наибольшим действием обладает частично
ацетилированный фукоидан из F. evanescens. Отсутствие токсического действия и
содержания ЛПС грамотрицательных бактерий в их структуре исключает возможность
неспецифической активации NF-kB, и доказывает, что сульфатированные полисахариды
являются лигандами для ТLR-2, ТLR-4 и ТL-R2/6.
Впервые показано, что различные по химической структуре сульфатированные
полисахариды бурых водорослей обладают универсальным индуцирующим действием
на созревание ДК, о чем свидетельствуют характерные морфологические изменения
(клетки округлой неправильной формы с эксцентрично расположенным ядром,
вакуолизированной
цитоплазмой
и
многочисленными
цитоплазматическими
псевдоподиями разнообразной формы) и увеличение экспрессии маркеров связанных с
созреванием ДК (CD83, CD38, CD11с, CD40, CD86, MHC II класса). Различие в
действии фукоиданов установлено только при исследовании экспрессии молекулы
адгезии CD11с, наибольшей активностью по этому показателю обладал полностью
сульфатированный фукоидан из L. cichorioides.
Впервые
увеличивается
выявлено,
продукция
что
под
действием
сульфатированных
иммунорегуляторного
(IL-12)
и
полисахаридов
провоспалительных
цитокинов (TNF-α, IL-6, IL-1β) созревшими ДК. Установлено, что в системе ex vivo
фукоиданы увеличивают продукцию как Th1-цитокинов (IL-2, IL-12, IFNγ, TNFα,), так и
Тh2-цитокинов (IL-6), что способствует дифференцировке активированных Т-клеток в
эффекторные Т-клетки адаптивного иммунитета и поляризации развития иммунного
ответа по Th-1 типу. Наибольшим цитокининдуцирующим действием на продукцию
IFNγ обладал фукоидан из F. evanescens, а на продукцию IL-12 - фукоидан из L.
japonica,
которые
являются
частично
ацетилированными
сульфатированными
полисахаридами, но различаются по типу связи, соотношению моносахаридного состава
и молекулярной массе.
Впервые установлено, что под действием фукоиданов происходит изменение
морфологической структуры первичных и вторичных органов иммуногенеза (активация
гемопоэза, выраженная макрофагальная реакция, и пролиферация лимфоидных клеток).
В системах in vitro и ex vivo установлено, что фукоиданы оказывают
стимулирующее влияние на иммунофенотип МЛ селезенки (увеличение экспрессии
CD19, NK, NКТ, CD25, MHC II, TCR, TLR-2 и TLR-4), пролиферативный потенциал и
цитотоксическую активность спленоцитов мышей по отношению к NK-чувствительной
линии клеток эритробластного лейкоза человека K562. Данные цитологического
исследования подтверждают, что активированные фукоиданами спленоциты вызывают
лизис и деструкцию опухолевых клеток линии К562.
Впервые на моделях трех экспериментальных вирусных инфекциях установлена
противовирусная активность фукоиданов из F. evanescens, L. cichorioides и L. japonica,
которая связана с их химической структурой, схемой и дозой введения фукоиданов.
Установлено
вирусингибирующее
и
протективное
действие
частично
ацетилированного сульфатированного полисахарида из L. japonica в отношении
высокопатогенного варианта вируса гриппа А/H5N1. Присутствие в структуре
фукоидана
высокого
содержания
галактозы
обеспечивает
конкурентное
углеводспецифическое взаимодействие с гликопротеином вируса гриппа птиц,
распознающим специфические рецепторы галактозы и сульфатированные рецепторы.
При экспериментальной хантавирусной инфекции на моделях культуры клеток
Vero
E6
и
перитонеальных
макрофагов
мышей
показано,
что
наибольшим
антиадсорбционным и ингибирующим действием на развитие инфекционного процесса
обладают сульфатированные полисахариды из L. japonica и L. cichorioides, которые
являются 13--L-фуканами, но различаются по молекулярной массе, степени
сульфатирования и моносахаридному составу.
В системах in vitro и in vivo при экспериментальном клещевом энцефалите
установлено, что наибольшей ингибирующей активностью на адсорбцию вируса, и
протективным действием обладают частично ацетилированные фукоиданы из F.
evanescens и L. japonica.
Практическая значимость работы
Активация клеточных и молекулярных механизмов системы врожденного
иммунитета под действием сульфатированных полисахаридов бурых водорослей, с
учетом их химической структуры и механизмов действия, является экспериментальным
обоснованием
целесообразности
конструирования
на
их
основе
новых
фармакологических субстанций и лекарственных препаратов для коррекции различных
иммунопатологических процессов, в том числе при вирусных инфекциях.
Алгоритм
активации
ключевых
эффекторов
врожденного
иммунитета
сульфатированными полисахаридами бурых водорослей может быть применен для
скрининга
коррекции
новых иммунобиологически активных препаратов, предназначенных для
нарушений
иммунной
системы
и
активации
неспецифической
резистентности к инфекции.
По материалам диссертации получен патент РФ № 2304443 от 20.08.2007
«Средство, обладающее противовирусной активностью» Опубл.20.08.2007. Бюлл. № 23.
Материалы диссертации автора включены в научно-экспериментальную работу
лаборатории иммунологии ФГБУ «НИИЭМ им. Г.П. Сомова» СО РАМН и лаборатории
химии ферментов ФГБУН «ТИБОХ им. Г.Б. Елякова» ДВО РАН, в отчеты по грантам
РФФИ 09-04-00761а и программам фундаментальных исследований президиума РАН
«Молекулярная и клеточная биология» и «Фундаментальные науки медицины».
Результаты диссертационной работы использованы при
подготовке научно-
технической документации (ТИ и ТУ 9284-065-02698170-2005) на БАД “Фуколам” на
основе фукоидана из бурой водоросли F.evanescens Охотского моря (свидетельство
Федерального центра гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора о государственной
регистрации
№
77.99.23.3.У.739.1.06
от
30.01.06.).
Материалы
использованы для подготовки научно-технической документации
№4000 от 01.05.2010 г.
диссертации
к проекту МНТЦ
«Клинико-иммунологическая эффективность нового
синбиотического продукта категории функционального питания (кисломолочный
напиток с B. bifidum, обогащенный полисахаридами из бурой водоросли Fucus evanescens)».
Основные положения, выносимые на защиту
1. Увеличение экспрессии TLR-2 и TLR-4 под действием сульфатированных
полисахаридов бурых водорослей на поверхности дендритных клеток и активация
транскрипционного ядерного фактора NF-kB при взаимодействии фукоиданов из F.
evanescens, L. cichorioides и L. japonica с ТLR-2, гетеродимером ТLR-2/6 и ТLR-4 на
клеточных
линиях
эмбрионального
почечного
эпителия
человека
HEK-293
свидетельствуют о том, что фукоиданы являются лигандами и способствуют активации
сигнальной передачи для последующей индукции и экспрессии генов иммунного
ответа.
2. Фукоиданы из бурых водорослей F. evanescens, L. cichorioides и L. japonica
являются
индукторами
созревания
ДК,
о
чем
свидетельствуют
их
иммунофенотипические, морфологические и функциональные (увеличение продукции
иммунорегуляторного IL-12 и
провоспалительных цитокинов - IL-1β, IL-6, TNF-α)
характеристики, что определяет направленность дифференцировки и активации Тлимфоцитов и поляризации развития иммунного ответа по Th1 типу.
3. Влияние фукоиданов на субпопуляционный состав МЛ селезенки мышей
(экспрессия CD19, NK, NКТ, CD25, MHC II, TCR, TLR-2 и TLR-4), динамику продукции
провоспалительных и иммунорегуляторных цитокинов (увеличение уровня IFNγ, IL-2,
IL-12, TNF-α, IL-6), пролиферативную и цитотоксическую активности спленоцитов
мышей в системах in vitro и ex vivo свидетельствует об активации механизмов системы
врожденного иммунитета и реализации пути развития адаптивного иммунного ответа по
Th1 типу.
4. Сульфатированные полисахариды бурых водорослей способствуют активации
гемопоэза, выраженной макрофагальной реакции и пролиферации лимфоидных клеток в
первичных и вторичных органах иммуногенеза.
5. Сульфатированные полисахариды из бурых водорослей F. evanescens, L.
cichorioides и L. japonica при экспериментальных вирусных инфекциях обладают
антиадсорбционным, вирусингибирующим и протективным действием, в отношении в
отношении вируса гриппа птиц A/H5N1, хантавируса и вируса клещевого энцефалита в
системах in vitro и in vivo. Установлено, что противовирусная активность фукоиданов
при различных вирусных инфекциях связана с
особенностями их химического
строения.
Личный вклад автора
Автором лично выполнен анализ литературных данных по теме диссертации,
проведено исследование влияния сульфатированных полисахаридов бурых водорослей
на экспрессию TLR на ДК, активацию ядерного фактора NF-kB при взаимодействии с
TLRs
человека,
на
созревание
и
функциональные
характеристики
ДК,
субпопуляционный состав МЛ селезенки, морфологические изменения первичных и
вторичных органов иммуногенеза, пролиферативную и цитотоксическую активность
спленоцитов мышей, продукцию цитокинов и противовирусную активность, выполнена
статистическая обработка и анализ результатов диссертационной работы.
Апробация материалов диссертации
Результаты диссертационной работы были представлены на научно–практических
конференциях и симпозиумах международного, российского и регионального уровня:
International Symposium on Marine Drugs (Qingdao, China, 2004), IV Научнопрактической
конференции
«Инфекционная
патология
в
Приморском
крае»
(Владивосток, 2004), 6th International Conference on Hantaviruses (Seoul, Korea, 2004), IV
научно-практической конференции «Инфекционная патология в Приморском крае»
(Владивосток, 2004), II Объединенном иммунологическом форуме (IV Съезд
иммунологов
России,
XII
Всероссийский
Петербурге»,
Санкт-Петербург,
конференции
«Перспективы
2008),
форум
«Дни иммунологии в Санкт-
Международной
сотрудничества
научно-практической
государств-членов
ШОС
в
противодействии угрозе инфекционных болезней» (Новосибирск 2009), XV International
Scientific Conference «FAMILY HEALTH IN THE XXI CENTURE» (Torremolinos, Spain,
2011), VI Научно-практической конференции «Фундаментальная наука – медицине»
(Владивосток, 2011), X Региональной научно-практической конференции «Актуальные
вопросы аллергологии и иммунологии» (Владивосток, 2012), XIII Международной
научно-практической конференции «Актуальные вопросы науки и образования»
(Москва, 2012), VII Всероссийской конференции с международным участием
«Иммунологические чтения» (Челябинск, 2012).
По материалам диссертации опубликовано
27 научных работ, в том числе 20
статей в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ для публикации основных
положений диссертации, и получен 1 патент.
Апробация диссертации состоялась 29 мая 2013 г. на заседании Ученого совета
ФГБУ «НИИЭМ имени Г.П. Сомова» и 18 июня 2013 г. на заседании Ученого совета
ФГБУ «НИИВС им. И.И. Мечникова» РАМН.
Объём и структура диссертации
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов
исследования,
пяти
глав
собственных
исследований,
заключения,
выводов,
рекомендаций для внедрения в медицинскую науку и практику, списка литературы и
приложений. Диссертация изложена на 278 страницах машинописного текста,
иллюстрирована 29 таблицами и 43 рисунками. Список литературы включает 482
источника, из них 107 отечественных и 375 - иностранных.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Объекты и методы исследования
Экспериментальные исследования проведены в ФГБУ «НИИ эпидемиологии и
микробиологии имени Г. П. Сомова» СО РАМН, ФГБУ «НИИ вакцин и сывороток им.
И.И. Мечникова» РАМН, ФГБУ «НИИ эпидемиологии и микробиологии им. почетного
академика Н.Ф. Гамалеи» Минздравсоцразвития РФ, ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д.И.
Ивановского» Минздрава РФ, ГОУ ВПО «Пермская государственная медицинская
академия им. Е.А. Вагнера» Росздрава РФ, ФГБУН «ТИБОХ им. Г.Б. Елякова» ДВО
РАН с использованием современных методов исследования (табл.1)
Таблица. 1. Материалы и методы исследований
№
1
Материалы и
направление
исследования
Фукоиданы
2
Лабораторные
животные
3
Культуры клеток
Методы исследования
1. Фукоидан из бурой водоросли F. evanescens - частично ацетилированый
1→3;1→4-α-L-фукан (М.м. 40-60 кДа), сульфатированный в основном по
положениям С-2 и в меньшей степени по С-4 остатков фукозы.
Моносахаридный состав: Fuc:Gal:Xyl:Man в соотношении: 70:9:10:8 моль,
%). Соотношение фукозы и сульфатов (Fuc:SO42-) - 1:0,92 моль/моль.
2. Фукоидан из бурой водоросли L. cichorioides
- полностью
сульфатированный по положениям С-2 и по С-4 остатков фукозы (1→3)-α-Lфукан (М.м. 40-80 кДа), Fuc:SO42- - 1:1,7 моль/моль.
3. Фукоидан из бурой водоросли L. japonica - частично ацетилированным
1→3-α-L-фуканом, сульфатированный в основном по положению С-4 и в
меньшей степени по С-2 остатков фукозы (М.м. 10-30 кДа), отличается
высоким содержанием галактозы. Моносахаридный состав: Fuc:Gal:Man:
Xyl:Glc в соотношении 65:20:8:4:3, мол. %, Fuc:SO42- - 1:0,9 моль/моль [T.N.
Zvyagintseva et al., 2003].
Исследования проведены на 530 мышах линии СВА (питомник НЦ
Биомедицинских технологий «Андреевка», Московская область) и 2970
неинбредных мышах (питомник РАМН “Столбовая”) в соответствии с
рекомендациями Европейской конвенции по защите позвоночных животных
используемых в экспериментальных работах и согласно приложению №4 к
приказу Минздрава СССР № 755 от 12.08.1977 г.
В работе использовали линию клеток эритробластнго лейкоза человека
К562, культуру эпителиальных клеток почек эмбрионов свиней (CПЭВ),
4
5
6
7
8
9
культуру клеток Vero E6 (С1106-CRL-1586 American Type Collection).
Микроорганизмы Для моделирования вирусных инфекций использовали: высокопатогенный
штамм
вируса
гриппа
птиц
A/duck/Novosibirsk/02/05
H5N1
(Genbank DQ864711), выделен из органов домашней птицы во время
эпизоотии в Новосибирской области 2005 г. и депонирован в
государственную коллекцию вирусов (инфекционный титр вируса 10 8
ТЦИД50/1,0 мл); прототипный штамм 76-118 вируса Hantaan, выделен из
суспензии легких полевой мыши Apodemus agrarius koreae, Корея
(инфекционный титр вируса 105 ТЦИД50/0,2 мл) и штамм Рrimorye-73,
Дальневосточный субтип, выделен из мозга человека с очаговой формой
клещевого энцефалита (инфекционный титр вируса 107 ТЦИД50/0,2 мл,
107,5lg 10 LD50/0,2 мл и 108,5lg 5 LD50/0,2 мл).
Исследование
Экспрессию TLR-2, TLR-4 и TLR9 на ДК, генерированных из костного
влияния
мозга мышей определяли методом проточной цитофлюоримерии
фукоиданов на
(FacsCalibur, «Becton Dickinson» США) [Ахматова Н.К., 2006, Lutz M.В.,
экспрессию TLRs 1999].
Исследование
1. Взаимодействие фукоиданов с TLR-2, TLR-2/6, TL-R3, TLR-4, TLR-5,
активации
TLR-7, TLR-8 и TLR-9 изучали на эукариотических линиях клеток
NF-kB при
эмбрионального почечного эпителия человека HEK293 в геном которых
взаимодействии
генно-инженерным методом введены гены различных TLRs человека, ген
фукоиданов с
фермента β-галактозидазы или ген щелочной фосфатазы под контролем NFTLRs
kB зависимого промотера для детекции взаимодействия лиганда с
соответствующим TLR. Анализ активации транскрипционного ядерного
фактора NF-kB в клетках проводили на спектрофотометре iEMS Reader MF
(Thermolabsystems, США)
при длине волны 414 нм. В качестве
отрицательного контроля, использовали линии клеток не экспрессирующие
TLR [Щебляков Д.В., Логунов Д.Ю., 2008, Логунов Д.Ю., 2011].
2. Токсическое действие фукоиданов на клетки линии HEK293 определяли
на спектрофотометре при длине волны 540 нм и 620 нм.
3. Определение ЛПС в структуре фукоиданов проведено с использованием
ЛАЛ-теста - Kinetic QCL-1000 (Cambrex Bio Science, США) согласно
инструкции производителя, и методов газожидкостной хроматографии
(ГЖХ) и ГЖХ-масс-спектрометрии (хроматограф Agilent 6850 SERIENTS
GL SISTEMS, Германия, масс-спектрометр Hewlett Packard 5973, США).
Исследование
1. Имунофенотип ДК генерированных из костного мозга мышей и
действия
моноцитов переферической крови человека определяли методом проточной
фукоиданов на
цитофлюориметрии с использованием моноклональных антител против
созревание ДК
соответствующих антигенов CD34, CD11c, CD14, CD38, CD40, CD86, CD83,
MHC I и II класса (HLA-DR), F4/80 («Caltag Laboratories», «Beckman
Coulter», США) [Чкауда Г.З., 2002].
2. Цитологическое исследование ДК методом фазово-контрастной и
иммунофлюорисцентной микроскопии клеток проведено с использованием
компьютерной системы AxioVision 4 и фотосистемы Axiocam HS (Carl
Zeiss, Германия).
Исследование
Продукцию цитокинов (IL-1β, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-12, TNF-α, IFN-γ)
влияния СПС
определяли
методом
твердофазного
ИФА
с
использованием
на продукцию
диагностических тест-систем «Biosource» (Бельгия) и Вектор-Бест (Россия),
цитокинов ДК
согласно инструкции производителя.
Исследование
1. Субпопуляционный состав МЛ селезенки мышей линии СВА (CD3, CD4,
влияния
CD8, CD19, CD25, NK, CD3/NK, MHC I и II класса, TCR, TLR-2, TLR-4,
фукоиданов на
«Caltag Laboratories» США), через 72 часа после внутрибрюшинного
клеткивведения фукоиданов изучали методом проточной цитофлюориметрии
эффекторы
[Boyum A., 1968, Lutz M.В., 1999].
врожденного
2. Исследование влияния фукоиданов на морфологическую структуру
иммунитета и
первичных и вторичных органов иммуногенеза мышей линии СВА с
развитие
адаптивного
иммунного
ответа
10
Исследование
противовирусной
активности
фукоиданов
11
Статистический
анализ
использованием гистологических и гистохимических методов [Лилли Р.,
1969] проведено с использованием электронных компьютерных систем
(JEM-100CX, «LEOL», Япония; Axiocam HS, Carl Zeiss, Germany).
3. Продукцию цитокинов в сыворотке крови мышей линии СВА (IL-2, IL-6,
IL-12, IL-17, TNF-α, IFN-γ, TGFβ) при внутрибрюшинном введении
фукоиданов изучали методом ИФА с использованием тест-систем «Bender
MedSystems GmbH» (Австрия) согласно инструкции производителя.
4. Пролиферативную активность спленоцитов мышей в системах in vitro и ex
vivo исследовали в реакции бласттрансформации лимфоцитов [Самойлина
Н.Л., 1970, Петров Р.В. и соавт. 1984].
5. Цитотоксическую активность спленоцитов мышей в системах in vitro и ex
vivo исследовали в МТТ тесте с использованием NK-чувствительной линии
клеток К-562 [Рыкова М.П. и соавт. 1981].
6. Цитологическое исследование спленоцитов мышей проведено с
использованием компьютерной системы AxioVision 4 и фотосистемы
Axiocam HS (Carl Zeiss, Germany).
1. Цитотоксическое действие фукоиданов изучали на культуре клеток СПЭВ
и Vero Е-6.
2. Исследование вирусингибирующего действия и противовирусной
активности фукоидана из L. japonica в отношении вируса гриппа птиц
А/Н5N1 проведено на культуре клеток СПЭВ.
3. Скрининг биополимеров из морских гидробионтов, исследование
ингибирующего действия фукоиданов на адсорбцию хантавируса проведены
на культуре клеток Vero Е-6 и модели перитонеальных Мф мышей с
помощью непрямого метода флюоресцирующих антител
(НМФА)
[Ткаченко Е.А. соавт., 1982].
4. Исследование противовирусной активности фукоиданов при
экспериментальной хантавирусной инфекции в системе ex vivo проведено на
модели перитонеальных Мф мышей (НМФА).
5. Исследование вирусингибирующего действия фукоиданов в отношении
вируса КЭ в системе in vitro проведено на культуре клеток СПЭВ [Хабриев
Р.У., 2005].
6. Исследование протективного действия фукоиданов системе in vivo
проведено на модели экспериментального клещевого энцефалита мышей.
Статистическую обработку результатов проводили с помощью прикладных
программных пакетов Exel, «WinMdi 2.8», «Statistika 7», Primer of
Biostatistics (Version 4.03) используя W-критерий Шапиро-Уилка,
Fкритерий Фишера, t-критерий Стьюдента. Выживаемость животных
рассчитывали по С.А. Гланцу (1999).
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Влияние фукоиданов на экспрессию TLR-2, TLR-4 и TLR-9 дендритными
клетками мышей, костномозгового происхождения
Результаты исследования показали, что сульфатированные полисахариды из бурых
водорослей L. cichorioides и L. japonica (табл. 2) способствуют увеличению экспрессии
TLR-2 и TLR-4 на дендритных клетках, генерированных из костного мозга мышей
линии СВА по сравнению с незрелыми ДК, но не влияют на экспрессию TLR-9.
Полученные результаты свидетельствует об активации сигнального каскада для
реализации эффекторных механизмов врожденного иммунитета и формирования
защиты организма.
Таблица 2. Влияние фукоиданов на экспрессию Toll-рецепторов на дендритных клетках
Уровень
экспрессии TLRs, %
TLR2
Незрелые ДК
M±σ
14,80±0,53
TNF-а
M±σ
29,83±1,79
p=0,000
5,50±0,45
p=0,000
3,46±0,35
p=0,816
1,46±0,15
TLR4
3,53±0,30
TLR9
L. cichorioides
M±σ
26,50±1,80
p=0,000
8,13±0,15
p=0,000
2,10±0,17
p=0,002
L. japonica
M±σ
25,80±6,56
p=0,044
7,20±1,55
p=0,003
2,67±0,47
p=0,056
Примечание: M±σ - средняя арифметическая ± стандартное отклонение; p – достоверность полученных
значений по сравнению с контролем – незрелыми ДК (T-test, критерий Стьюдента).
Взаимодействие сульфатированных полисахаридов бурых водорослей с Tollподобными рецепторами человека в системе in vitro
Результаты исследования специфического взаимодействия фукоиданов из
F.
evanescens, L. japonica и L. cichorioides с TLRs на эукариотических клеточных линиях
эмбрионального почечного эпителия человека HEK293 показали, что сульфатированные
полисахариды инициируют экспрессию β-галактозидазы и способствуют активации
транскрипционного ядерного фактора NF-kB при взаимодействии с TLR-2, TLR-2/TLR6 и TLR-4, но не оказывают влияния на клетки HEK293-null, не экспрессирующие TLRs
и не вызывают активацию ядерного фактора при связывании с TLR-3, TLR-5, TLR-7,
TLR-8 и TLR-9. Наибольшим действием на активацию NF-kB обладает фукоидан из F.
evanescens.
Установлено, что фукоидан из F. evanescens при взаимодействии с TLR-2 (рис. 1)
вызывает активацию NF-kB в концентрации от 1000 до 10 мкг/мл (2,432±0,06;
1,661±0,038 и 0,804±0,06 ОЕ соответственно), фукоидан из L. cichorioides в
концентрации 1000 и 100 мкг/мл (1,852±0,16 и 0,744±0,01), а фукоидан из L. japonica - в
дозе
1000
мкг/мл
(1,531±0,147)
по
сравнению
с
контролем
(0,423±0,02).
Функциональная активность рецептора подтверждена действием синтетического
липопептида (2,669±0,07 ОЕ).
Результаты взаимодействия сульфатированных полисахаридов с гетеродимером
TLR-2/TLR-6 (рис. 2) показали, что фукоидан из F. evanescens вызывает активацию NFkB в концентрации от 100 до 1 мкг/мл (2,282±0,06 и 1,746±0,049 ОЕ соответственно) по
сравнению с контролем (1,15±0,11), а фукоиданы из L. japonica и L. cichorioides в
концентрации 100 и 10 мкг/мл. Действие синтетического липопептида на активацию
NF-kB составила 2,679±0,156 ОЕ.
При взаимодействии сульфатированных полисахаридов с TLR-4 (рис. 3)
установлено, что фукоидан из F. evanescens вызывает активацию NF-kB в концентрации
от 1000 до 1,0 мкг/мл (1,784±0,04; 1,905±0,07; 1,407±0,029 и 0,890±0,013 ОЕ,
соответственно), фукоидан из L. cichorioides - от 1000 до 10 мкг/мл, а фукоидан из L.
japonica - в концентрации 1000 и 100 мкг/мл по сравнению с контролем (0,641±0,024) и
классическим лигандом - ЛПС E. coli (2,005±0,2 ОЕ).
Отсутствие токсического действия сульфатированных полисахаридов на клетки
линии HEK293-hTLRnull, HEK293-TLR-2/CD14, HEK293-TLR-2/TLR-6 и HEK293-TLR4/CD14-MD2 исключает возможность повышения уровня экспрессии β-галактозидазы и
неспецифической активации NF-kB.
Доказательством того, что сульфатированные полисахариды бурых водорослей
являются лигандами для TLRs и не содержат в своем составе ЛПС, который
специфически взаимодействует с TLR4 и TLR2 являются результаты ЛАЛ-теста Kinetic
QCL-1000 показавшие отсутствие примеси эндотоксинов грамотрицательных бактерий
(≤0,25 ЕЭ). Кроме того, результаты исследований с использованием методов ГЖХ и
ГЖХ-масс-спектрометрии показали отсутствие основного жирнокислотного компонента
ЛПС - 3-ОНС14 кислоты и других 3-гидроксижирных кислот в составе фукоидана из F.
evanescens, обладающего наибольшим действием на активацию NF-kB.
Таким образом, сульфатированные полисахариды из бурых водорослей L. japonica,
L. cichorioides и F. evanescens являются лигандами и специфически взаимодействуют с
TLR-2,
гетеродимером
TLR-2/6
и
TLR-4
человека,
вызывая
активацию
транскрипционного ядерного фактора NF-kB через MyD88 сигнальный путь или
адаптерную пару TRIF/TRAM, что индуцирует экспрессию генов цитокинового каскада,
необходимых для реализации эффекторных механизмов врожденного иммунитета и
поляризации развития адаптивного иммунного ответа по Th1 типу.
HEK293-hTLR2/6
HEK293-hTLR2/CD14
3
p=0,000
3
p=0,014
p=0,000
2,5
2,5
p=0,011
p=0,012
p=0,022
p=0,000
p=0,018
OD 414 нм
OD 414 нм
2
1,5
p=0,170
p=0,293
p=0,761
p=0,982
1
0,5
p=0,006
p=0,278
p=0,664
p=0,457
p=0,027
2
p=0,044
p=0,036
p=0,101
p=0,036
p=0,046
p=0,046
p=0,092
1,5
1
p=0,461
p=0,976
0,5
0
0
1000
100
10
L. japonica
1
0,1
1000
100
10
1
0,1
L. cichorioides
1000
100
10
1
0,1
К(-) К(+) мкг/мл
100
10
F. evanescens
1
100
L. japonica
Рисунок 1. Активация ядерного фактора NF-kB при
взаимодействии фукоиданов с TLR-2.
10
1
L. cichorioides
100
10
1
К (-)
К (+) мкг/мл
F. evanescens
Рисунок 2. Активация ядерного фактора NF-kB при
взаимодействии фукоиданов с HEK293-TLR2/TLR6.
Примечание: OD - оптическая плотность; К(-) - клетки линии HEK293, Примечание: OD - оптическая плотность; К(-) - клетки линии HEK293,
содержащие TLR2 и адаптерную молекулу CD14; К(+) - липопептид (10 содержащие гетеродимер TLR2/TLR6; К(+) - липопептид (10 нг/мл); p нг/мл); p - достоверность различий по отношению к отрицательному контролю.
достоверность различий по отношению к отрицательному контролю.
HEK293-hTLR4/CD14-MD2
2,5
p=0,021
p=0,003
ОD 414 нм
2
1,5
p=0,002
p=0,001
p=0,002
p=0,002
p=0,002
p=0,029
p=0,173
p=0,098
1
p=0,008
p=0,035
p=0,228
p=0,012
p=0,119
p=0,085
0,5
0
1000
100
10
1
0,1
L. japonica
1000
100
10
1
L. cichorioides
0,1
1000
100
10
1
0,1
К (-) К (+) мкг/мл
F. evanescens
Рисунок 3. Активация транскрипционного ядерного фактора NF-kB при взаимодействии фукоиданов с HEK293-TLR4/CD14-MD2.
Примечание: OD - оптическая плотность; К(-) - клетки линии HEK293, содержащие в своем геноме комплекс TLR4, адаптерную молекулу CD14 и
белок MD-2; К(+) - липополисахарид E.coli (10 нг/мл); p - достоверность различий по отношению к отрицательному контролю.
Влияние сульфатированных полисахаридов бурых водорослей
на созревание дендритных клеток
На двух альтернативных моделях, позволяющих непосредственно на клеточном
уровне установить биологическую активность сульфатированных полисахаридов из
бурых водорослей F. evanescens, L. cichorioides и L. japonica в проекции на организм
человека установлено, что фукоиданы индуцируют созревание ДК, генерированных из
костного мозга мышей (табл. 3) и моноцитов периферической крови человека (табл. 4),
о чем свидетельствовало выраженное увеличение экспрессии маркера терминальной
дифференцировки (CD83) при отрицательном контроле и снижение экспрессии маркера
незрелых ДК (CD34).
Увеличение
экспрессии
активационного
маркера
(CD38)
под
действием
фукоиданов и молекулы адгезии (CD11c), указывало на способность созревших ДК
взаимодействовать с Т-лимфоцитами, а повышение экспрессии костимулирующих
(CD86) и антигенпредставляющих молекул (MHC II класса) свидетельствовало о
способности ДК к дальнейшей активации наивных Т-клеток. При этом отмечено, что
фукоидан из L. cichorioides, способствовал выраженному увеличению экспрессии CD11c
по сравнению с фукоиданами, TNF-α и незрелыми ДК.
Присутствие F4/80 молекул и CD14 - маркера моноцитов на ДК указывало на
наличие в культуре определенного процента Мф, однако снижение их экспрессии под
действием фукоиданов подтверждало дифференцировку клеток в ДК.
Процесс
созревания
ДК
подтвержден
и
результатами
цитологического
исследования (рис. 4). Установлено, что фукоиданы (В-Д) как и TNF-α (Б) в процессе
культивирования вызывают морфологические изменения мононоцитов периферической
крови человека (А). Клетки приобрели крупную неправильную форму с эксцентрично
расположенным
базофильным
ядром,
вакуолизированную
цитоплазму
и
многочисленные цитоплазматические отростки.
Иммунофлюресцентное исследование ДК показало (рис. 5), что по сравнению с
контролем (А) и TNF-α (Б), фукоиданы (В, Г, Д) индуцируют экспрессию как CD1a, так
и CD14. Возможно, что подобно ЛПС, фукоиданы увеличивают не только экспрессию
ТLR-4 и костимулирующих молекул, но и CD14 на поверхности ДК.
Таким
образом,
различные
по
химической
структуре
сульфатированные
полисахариды бурых водорослей являются индукторами созревания ДК, о чем
свидетельствуют фенотипические и морфологические изменения клеток.
A
Б
В
Г
Д
Рисунок 4. Влияние сульфатированных полисахаридов бурых водорослей на
морфологию дендритных клеток.
Примечание: Фазовоконтрастная микроскопия с использованием системы AxioVision 4, А - первичная
культура МНК, Б - ДК созревшие под действием TNF-, В - ДК, созревшие под действием фукоидана из
F. evanescens, Г - ДК, созревшие под действием фукоидана из L. cichorioides, Д - ДК, созревшие под
действием фукоидана из L. japonica (ув. 400).
А
Б
В
Г
Д
Рисунок 5. Иммунофлюресцентное исследование ДК, созревших под действием
сульфатированных полисахаридов бурых водорослей.
Примечание: Флуоресцентная микроскопия ДК, меченных антителами к CD1а и CD14, с
использованием системы AxioVision 4, А - незрелые ДК на 6 сутки культивирования в присутствии
факторов роста GM-CSF и IL-4, Б - ДК созревшие под действием TNF-, В - ДК, созревшие под
действием фукоидана из F. evanescens, Г - ДК, созревшие под действием фукоидана из L. cichorioides, Д ДК, созревшие под действием фукоидана из L. japonica (ув. 400).
Таблица 3. Характеристика иммунофенотипа дендритных клеток, генерированных из костного мозга мышей линии СВА
Уровень
экспрессии
молекул, %
(n=30)
CD34
СD83
CD38
CD11c
CD40
CD86
МНС I
МНС II
F4/80
Контроль
Незрелые ДК
(GM-CSF и IL-4)
M± σ
Me (LQ-UQ)
23,23±1,42
23,5 (21,7-24,5)
0±0
0
5,43±0,25
5,4 (5,2-5,7)
43,13±0,96
43,3 (42,1-44,0)
5,23±0,87
5,0 (4,5-6,2)
4,0±0,2
4,0 (3,8-4,2)
2,13±0,11
2,2 (2,0-2,24)
19,07±1,10
19,0 (18,0-20,2)
47,46±3,61
47,2 (44-51,2)
Фукоидан
(L. cichorioides)
TNF-а
M± σ
Me (LQ-UQ)
0,19±0,27
0,07 (0,0-0,5)
27,5±2,11
26,7 (25,9-29,9)
68,70±10,86
65,50 (59,8-80,8)
47,47±2,67
47,10 (45,0-50,3)
9,76±1,46
9,60 (8,4-11,3)
11,67±1,27
11,90 (10,2-12,8)
8,30±1,11
8,50 (7,1-9,3)
8,43±1,06
8,60 (7,3-9,4)
12, 76±3,28
12,20 (9,8-16,3)
p
p=0,000
p=0,000
p=0,000
p=0,057
p=0,009
p=0,000
p=0,000
p=0,000
p=0,000
M± σ
Me (LQ-UQ)
0,66±0,57
0,5 (0,2-1,3)
10,27±1,10
10,2 (9,2-11,4)
58,0±6,68
57,3 (51,7-65,0)
73,63±3,87
74,50 (69,4-77)
7,53±2,05
7,50 (5,9-9,2)
16,20±2,20
16,2 (13,5-18,9)
3,43±0,38
3,10 (3,0-4,2)
41,80±5,04
41,0 (37,2-42,2)
24,33±6,95
24,5 (17,3-31,2)
Фукоидан
(L. japonica)
p
p=0,000
p=0,000
p=0,000
p=0,000
p=0,148
p=0,001
p=0,029
p=0,001
p=0,007
M± σ
Me (LQ-UQ)
0,24±0,24
0,2 (0,2-0,5)
16,13±2,51
17,0 (13,3-18,1)
63,67±6,65
62,0 (58,0-71,0)
48,76±3,27
49,8 (45,1-51,4)
7,97±1,55
8 (6,4-9,5)
16,17±3,35
16,2 (12,8-19,5)
3,57±0,81
3,70 (2,7-4,3)
44,03±11,25
45,8 (32,0-54-3)
33,0±4,33
30,5 (30,5-38)
p
p=0,000
p=0,000
p=0,000
p=0,046
p=0,100
p=0,003
p=0,038
p=0,018
p=0,011
Примечание: M±σ - средняя арифметическая±стандартное отклонение; Me - медиана значений, LQ-UQ - нижний и верхний квартили; p –
достоверность полученных значений по сравнению с контролем – незрелыми ДК (T-test, критерий Стьюдента).
Таблица 4. Влияние сульфатированных полисахаридов бурых водорослей на иммунофенотип дендритных клеток,
генерированных из моноцитов периферической крови человека
Уровень
экспрессии, %
CD34
Незрелые ДК
(GM-CSF и IL-4)
M±σ
4,54±0,64
CD83
0,5±0,09
CD14
31,40±2,18
CD11c
19,10±2,10
CD86
18,50±1,80
HLA-DR
14,60±1,44
TNF-α
M±σ
0,41±0,09
p=0,000
19,24±2,07
p=0,000
12,40±1,32
p=0,000
30,05±2,71
p=0,005
32,81±3,17
p=0,002
29,60±2,85
p=0,001
F. evanescens
M±σ
0,71±0,08
p=0,000
6,90±0,94
p=0,000
14,24±1,69
p=0,000
21,03±2,22
p=0,335
25,22±2,54
p=0,02
22,10±1,90
p=0,005
Фукоиданы
L. cichorioides
M±σ
1,40±0,15
p=0,001
12,50±1,29
p=0,000
16,91±1,03
p=0,000
41,20±3,36
p=0,000
36,80±3,78
p=0,001
37,80±3,31
p=0,000
L. japonica
M±σ
0,51±0,11
p=0,000
10,03±0,93
p=0,000
17,30±1,09
p=0,001
29,60±2,87
p=0,000
29,71±2,92
p=0,004
29,01±2,71
p=0,001
Примечание: M±σ - средняя арифметическая±стандартное отклонение; p – достоверность полученных значений по сравнению с контролем –
незрелыми ДК (T-test, критерий Стьюдента).
Характеристика профиля цитокинов, продуцируемых дендритными клетками,
под действием сульфатированных полисахаридов бурых водорослей
При исследовании влияния сульфатированных полисахаридов бурых водорослей
на продукцию дендритными клетками цитокинов, определяющих направление
дифференцировки и активацию субпопуляций эффекторных Т-клеток установлено
(табл. 5), что фукоиданы из L. cichorioides и L. japonica
продукции IL-12
увеличивали уровень
(в 2,23 и 2,38 раза соответственно), IL-6 (в 3,37 и 2,69 раза
соответственно), IL-1β (в 10,87 и 12,71 раз соответственно), TNF-α (в 5,58 и 5,93 раз
соответственно) и IL-10 (в 5,95 и 4,56 раза) по сравнению с незрелыми ДК.
Аналогичные результаты получены и при исследовании дендритных клеток,
генерированных из моноцитов периферической крови человека in vitro (табл. 6).
Установлено, что фукоиданы из F. evanescens, L. cichorioides и L. japonica достоверно
увеличивают продукцию IL-12 (в 2,83; 2,76 и 3,0 раза), IL-6 (в 2,36; 1,58 и 2 раза), TNF-α
(в 1,75; 2,0 и 1,67) и IL-10 (в 2,84; 2,98 и 2,2 раза соответственно) по сравнению с
контролем, но не оказывают влияние на продукцию IL-4.
Таким образом, сульфатированные полисахариды бурых водорослей обладают
индуцирующим действием на функциональную активность дендритных клеток, которые
синтезируют широкий спектр Th-1 и Th-2 цитокинов (IL-12, IL-1β, IL-6, TNF-α, INFγ,
IL-10). Выраженное увеличение продукции иммунорегуляторных (IL-12 и IFN-γ) и
провоспалительных (IL-1β, IL-6, TNF-α) цитокинов свидетельствуют о потенциале ДК
поляризовать развитие иммунного ответа по Th1 типу, и является необходимым
условием для активации и дифференцировки Т-лимфоцитов.
Таблица 5. Влияние сульфатированных полисахаридов бурых водорослей на продукцию цитокинов дендритными клетками,
генерированными из костного мозга мышей линии СВА (пкг/мл)
ДК
(n=30)
Незрелые ДК
TNF
L. cichoriodes
L. japonica
IL-1β
IL-2
IL-4
IL-6
IL-10
IL-12
TNF-a
IFN-γ
M±σ
M±σ
M±σ
M±σ
M±σ
M±σ
M±σ
M±σ
1,03+0,29
W=0,78
15,78+1,81
p=0,000*
W=0,98
11,21+1,32
p=0,000*
W=0,97
13,12±0,81
p=0,000*
W=0,87
11,52+1,21
W=0,97
11,71+1,3
p=0,855
W=0,99
12,8+1,6
p=0,324
W=0,98
10,58±1,5
p=0,466
W=0,97
18,78+0,33
W=0,89
7,08+0,64
p=0,000*
W=0,95
12,16+1,22
p=0,001*
W=0,94
13,75±1,54
p=0,005*
W=0,94
14,31+1,52
W=0,99
56,3+3,21
p=0,000*
W=0,98
48,18+3,44
p=0,000*
W=0,99
38,31±2,81
p=0,000*
W=0,98
2,32+0,42
W=0,92
13,4+1,22
p=0,000*
W=0,86
13,67+0,54
p=0,000*
W=0,89
10,51±2,73
p=0,007*
W=0,99
34,20+2,11
W=0,99
116,5+5,5
p=0,000*
W=0,99
76,40+4,64
p=0,000*
W=0,98
81,31±5,35
p=0,000*
W=0,99
33,40+2,31
W=0,99
240,14+4,3
p=0,000*
W=0,98
186,32+5,82
p=0,000*
W=0,99
198,04±6,40
p=0,000*
W=0,99
3,41+0,70
W=0,97
7,18+1,13
p=0,007*
W=0,97
5,26+0,51
p=0,019*
W=0,87
4,49±1,20
p=0,244
W=0,98
Примечание: M±σ – средняя арифметическая±стандартное квадратичное отклонение; *p – достоверность полученных значений по сравнению с
незрелыми ДК (T-test, критерий Стьюдента); W - Shapiro-Wilk - уровень значимости, соответствующий данному критерию W (при p<0,05 параметр
имеет отклонение от нормального распределения).
Таблица 6. Влияние фукоиданов на продукцию цитокинов дендритными клетками, генерированных
из моноцитов периферической крови человека (пкг/мл)
ДК
(n=10)
Незрелые ДК
TNF
F. evanescens
L. cichorioides
L. japonica
IL-1β
IL-4
M±σ
M±σ
Me (LQ-UQ)
Me (LQ-UQ)
1,31±0,31
4,05±0,77
1,28 (0,95-1,8) 3,92 (2,96-4,9)
W=0,94
W=0,94
1,94±0,28**
2,81±0,75*
1,92 (1,6-2,38) 2,98 (1,96-3,73)
p1≤0,05
p1=0,138
W=0,96
W=0,92
1,28±0,27
3,72±0,65
1,24 (0,98-1,72) 3,97 (2,97-4,31)
p1=0,893
p1=0,500
W=0,90
W=0,95
1,33±0,37
3,78±0,57
1,31 (0,87-1,9) 3,82 (2,97-4,48)
p1=0,685
p1=0,500
W=0,92
W=0,98
1,73±0,26*
3,40±0,86
1,79 (1,35-2,0) 3,61 (2,22-4,5)
p1≤0,05
p1=0,345
W=0,93
W=0,98
IL-6
M±σ
Me (LQ-UQ)
16,84±4,96
15,36 (41,5-54,24)
W=0,96
46,23±5,03***
45,93 (40,5-52,15)
p1≤0,05
W=0,93
39,82±3,87***
40,15 (34,84-44,5)
p1≤0,05
W=0,97
26,64±5,33***
26,1 (20,36-34,42)
p1≤0,05
W=0,98
35,21±4,05***
34,83 (30,2-40,0)
p1≤0,05
W=0,95
IL-10
M±σ
Me (LQ-UQ)
2,63±0,58
2,48 (2,0-3,21)
W=0,93
6,74±0,41***
6,75 (6,3-7,2)
p1≤0,05
W=0,97
7,47±0,56***
7,33 (6,9-8,05)
p1≤0,05
W=0,97
7,83±0,93***
8,00± (6,9-8,8)
p1≤0,05
W=0,88
5,81±0,5***
5,97 (5,29-6,3)
p1≤0,05
W=0,94
IL-12
M±σ
Me (LQ-UQ)
17,65±2,75
18,38 (14,2-20,73)
W=0,93
58,82±4,79***
59,95 (51,8-64,56)
p1≤0,05
W=0,98
49,91±4,57***
50,58 (45,4-54,96)
p1≤0,05
W=0,97
48,71±3,38***
49,52 (44,95-52,4)
p1≤0,05
W=0,88
54,72±5,32***
55,84 (47,43-60,3)
p1≤0,05
W=0,94
TNFα
M±σ
Me (LQ-UQ)
20,59±3,94
20,08 (16,5-25,72)
W=0,92
59,72±5,41***
59,41 (53,38-67,4)
p1≤0,05
W=0,98
36,19±5,0***
35,42 (30,8-42,59)
p1≤0,05
W=0,93
42,72±4,82***
41,75 (37,57-49,3)
p1≤0,05
W=0,94
34,33±4,20***
34,72 (29,8-39,95)
p1≤0,05
W=0,94
Примечание: M±σ - средняя арифметическая± стандартное отклонение; Me – медиана; LQ-UQ - нижний и верхний квартили; p – достоверность
полученных значений по сравнению с незрелыми ДК (критерий Стьюдента), * p≤0,05, ** p≤0,01, ***p≤0,001; p1- Wilcoxon Test (p-level<0,05); W Shapiro-Wilk - уровень значимости, соответствующий данному критерию W (при p<0,05 параметр имеет отклонение от нормального распределения).
Влияние сульфатированных полисахаридов бурых водорослей на клеткиэффекторы врожденного иммунитета и развитие адаптивного иммунного ответа
При исследовании субпопуляционного состава МЛ селезенки мышей установлено
(табл. 7), что как при однократном, так и пятикратном внутрибрюшинном введении
фукоиданов из F. evanescens, L. cichorioides и L. japonica снижается количество CD8+, не
изменяется количество CD3+ и CD4+ Т-клеток, но увеличивается содержание В-клеток
(CD19) по сравнению с контролем.
Об активации сульфатированными полисахаридами процессов пролиферации и
дифференцировки
Т- и В-лимфоцитов свидетельствовало выраженное увеличение
маркеров CD25 в среднем в 5,1 и 7,4 раза, NK 1.1. - в 7,5 и 9,2 раз и NКТ (клеток
CD3+/NK) в 2,8 и 4,3 раза соответственно.
Результаты
исследования
влияния
сульфатированных
полисахаридов
на
экспрессию антигенпредставляющих молекул показали, что как при однократной
стимуляции, так и при введении в течение 5 дней, фукоиданы не оказывали влияния на
экспрессию MHC I, но увеличивали
уровень MHC II класса в 2,26 и 2,4 раза, а
экспрессию TCR в 1,65 и 1,74 раза. Увеличение экспрессии MHC II класса и TCR
свидетельствует о влиянии фукоиданов на процессы пролиферации и дифференцировки
Т-клеток за счет взаимодействия комплекса антигенного пептида с молекулой МНС II
класса и рецепторным комплексом TCR/CD3/CD4.
Кроме того, все сульфатированные полисахариды способствовали увеличению
экспрессии TLRs на поверхности клеток. Наибольшим индуцирующим действием
обладал фукоидан из F. evanescens. Установлено, что однократное и многократное
введение фукоидана из F. evanescens увеличивало экспрессию TLR-2 в 4,1 и 4,5 раза по
сравнению с контролем, а фукоиданов из L. cichorioides и L. japonica - в среднем в 3,2 и
3,7 раза соответственно. Аналогичные результаты получены и при исследовании TLR.4. Установлено, фукоидан из F. evanescens увеличивал экспрессиюTLR-4 в 2,85 и 4,07
раза по сравнению с контролем, а фукоиданы из L. cichorioides и L. japonica в среднем в
1,79 и 2,4 раза соответственно.
Таким образом, сульфатированные полисахариды из бурых водорослей F.
evanescens, L. cichorioides и L. japonica способствуют процессам дифференцировки
иммунокомпетентных клеток и активации механизмов клеточного и гуморального
иммунного ответа, что необходимо для формирования адаптивного иммунного ответа.
Таблица 7. Влияние сульфатированных полисахаридов бурых водорослей на уровень
экспрессии поверхностных молекул МЛ селезенки мышей линии СВА
Фукоиданы (5 мг/кг)
Контроль
F. evanescens
L. cichorioides
L. japonica
1
1
1
M±σ
M±σ/
M±σ/
M±σ/
2
2
2
M±σ
M±σ
M±σ
CD3
19,64±2,19 19,6±2,14; p=0,984
20,07±2,58; p=0,838 19,38±1,82; p=0,885
19,2±2,55; p=0,836
19,97±2,32; p=0,868 19,00±2,45; p=0,755
CD4
26,31±2,62 26,25±2,84; p=0,977 25,12±3,19; p=0,643 26,01±2,47; p=0,890
26,54±2,8; p=0,922
25,87±3,7; p=0,871 26,23±3,21; p=0,975
CD8
7,67±1,3*; p=0,049
6,0±1,38*; p=0,034 6,54±1,05*;p=0,038
10,53±2,0
5,88±1,4*; p=0,03
4,94±1,1*; p=0,013
5,43±1,25*; p=0,02
CD19
24,4±2,74*; p=0,008 27,76±2,5*; p=0,002 25,90±2,4*; p=0,003
14,87±1,92
27,6±2,28*; p=0,049 30,12±3,2*; p=0,019 28,93±2,83*;p=0,031
CD25
5,10±0,2*;p=0,000
4,85±0,35*; p=0,000 5,24±0,3*; p=0,000
0,99±0,1
7,37±1,38*; p=0,000
7,0±1,16*; p=0,000 7,67±1,53*; p=0,000
NK1.1.
7,22±1,26*; p=0,000 6,47±1,41*; p=0,000 6,34±1,30*; p=0,000
1,26±0,25
8,75±1,44*; p=0,000 9,81±1,58*; p=0,000 8,39±1,36*; p=0,000
CD3/
3,75±0,51*;p=0,000
3,0±0,2*;p=0,000
3,29±0,62*;p=0,000
1,07±0,14
NK
4,81±0,2*; p=0,000
4,77±0,37*; p=0,000 4,29±0,4*; p=0,000
MHC I
0,47±0,05;p=0,101
0,5±0,05;p=0,116
0,4±0,0;p=0,374
0,37±0,06
0,53±0,05*; p=0,024
0,5±0,0*; p=0,016
0,47±0,05; p=0,101
MHC II
41,18±4,26*;p=0,001 42,34±4,1*; p=0,001 44,43±4,55*; =0,000
18,84±2,65
44,0±4,9*; p=0,001
45,6±5,67*; p=0,002 47,96±5,4*; p =0,001
TCR
0,67±0,11*; p=0,003
0,6±0,1*; p=0,024
0,57±0,05*; p=0,013
0,37±0,06
0,7±0,1*; p=0,003
0,63±0,05*; p=0,005
0,6±0,1*; p=0,007
TLR-2
0,7±0,1*; p=0,001
0,57±0,05*; p=0,001 0,53±0,05*; p=0,002
0,17±0,05
0,77±0,05*; p=0,001 0,67±0,05*; p=0,001 0,53±0,11*; p=0,001
TLR-4
0,77±0,05*; p=0,001
0,5±0,1*; p=0,025
0,47±0,05*; p=0,013
0,27±0,05
1,1±0,17*; p=0,001
0,7±0,1*; p=0,002
0,6±0,1*; p=0,007
1
p ≤0,05
Примечание: M±σ - средняя арифметическая ± стандартное отклонение; 1M±σ/2M±σ – однократное и
CD (%)
пятикратное введение фукоиданов;*p – достоверность значений по сравнению с контролем (T-test,
критерий Стьюдента); p 1 – достоверность значений между сульфатированными полисахаридами.
Влияние фукоиданов из бурых водорослей на морфологическую
характеристику лимфоидных органов мышей
Результаты морфологического исследования
показали, что под действием
сульфатированных полисахаридов в красном костном мозге мышей линии СВА (рис. 6А) происходит процесс активного кроветворения. Определяются все промежуточные
формы миелоидного кроветворения и многочисленные мегакариоциты (Б).
А
Б
Рисунок 6. Влияние сульфатированных полисахаридов на красный костный мозг.
Примечание: А – красный костный мозг интактных мышей, Б – красный костный мозг мышей после
введения фукоидана, окр. по Ван Гизону; ув. 600.
В дольках тимуса по сравнению с интактными животными (рис. 7-А) площадь
коркового вещества расширена, а мозговое вещество имеет вид вкраплений (Б).
Определяются крупные тельца Гассаля (Г) многочисленные Мф, клетки стромы (Д) и
полнокровные сосуды крупных размеров (В).
А
Б
В
Г
Д
Рисунок 7. Влияние сульфатированных полисахаридов на структуру тимуса.
Примечание: А – тимус интактных мышей: Б, В, Г, Д – тимус, после введения фукоидана; А, В, Г–
окр. гематоксилином и эозином, Б, Д – окр. по Ван Гизону; А, Б – ув. 100; В, Д – ув. 200; Г – ув. 1000.
В селезенке происходит увеличение площади белой пульпы, лимфоидные узелки
сливаются в конгломераты (рис. 8-Б, В), различаются мантийная и маргинальная зоны,
реактивные центры и расширенные периартериальные муфты (В, Г). В красной пульпе
выявляются многочисленные лимфоциты, Мф и плазматические клетки, а эритроциты
находятся как внутри, так и вне венозных синусов (В, Г, Д).
А
Б
В
Г
Д
Рисунок 8. Влияние сульфатированных полисахаридов на структуру селезенки.
Примечание: А – селезёнка интактных животных; Б, В, Г, Д – селезёнка мышей после введения
фукоидана; А, Б, Д – окр. гематоксилином и эозином; В, Г – окр. по Ван Гизону; А, Б, В – ув. 100; Г –
ув. 200; Д - ув. 400.
По сравнению с интактными животными (рис. 9-А), корковое вещество под
действием фукоиданов занимает практически весь лимфатический узел, межузелковые
пространства заполнены клетками лимфоидного ряда (В), Т- и В-зависимые зоны не
различимы, так как периферическая кора и паракортикальная зона представляют собой
единый конгломерат (Б). Субкопсулярный лимфатический (В, Г) и промежуточные
синусы мозгового вещества содержат большое количество бластных форм (В), клеток
макрофагального ряда (Г, Д) и большое количество жировых клеток (Б).
А
Б
В
Г
Д
Рисунок 9. Влияние сульфатированных полисахаридов на структуру
лимфатических узлов
Примечание:а – лимфатический узел интактной мыши; А, В, Д – окр. гематоксилином и эозином; Б, Г
– окр. по Ван Гизону; А – ув. 200; Б – ув. 100; Г – ув. 600; В, Д – ув. 1000.
Таким образом, сульфатированные полисахариды бурых водорослей способствуют
активации лимфоидного и миелоидного кроветворения в красном костном мозге,
выраженной макрофагальной реакции и пролиферативным процессам в лимфоидной
ткани первичных и вторичных органов иммуногенеза.
Влияние фукоиданов из бурых водорослей на динамику продукции цитокинов
в сыворотке крови мышей линии СВА
Результаты исследования показали, что фукоиданы способствуют увеличению в
динамике уровня как Th1-, так и Th2 цитокинов, что обеспечивает взаимосвязь между
врожденным и адаптивным иммунитетом.
Установлено, что фукоиданы увеличивали продукцию IL-2 через 2 и 4 часа после
однократного и многократного введения (табл. 8-10). Максимальное увеличение TNFα наблюдалось в течение 2 и 4 часов после введения фукоиданов, с последующим
снижением продукции через 24 часа до значений в контроле.
Особое значение в механизме действия сульфатированных полисахаридов имеет их
влияние на продукцию иммунорегуляторных цитокинов (IL-12 и IFN-γ), которые
способствуют
активации
эффекторных
функций
иммунокомпетентых
клеток,
усиливают антимикробную и цитотоксическую активность и отвечают за развитие
иммунного ответа по Th1 типу.
Установлено, что сульфатированные полисахариды способствовали увеличению
уровня IL-12 через 2-4 часа после введения, а пик продукции зарегистрирован через 24
и 72 часа. Наибольшим действием обладал фукоидан из L. japonica, максимальное
увеличение IL-12 при однократном введении наблюдалось через 8-72 часа (в 30,4-17,8
раз соответственно), а при многократном введении через 24 и 72 часа (в 9,5 и 18 раз) по
сравнению с контролем.
При изучении IFN-γ установлено, что фукоиданы способствуют увеличению его
продукции через 8 часов после однократного и через 4 часа после пятикратного
введения. Наибольшим действием обладал фукоидан из F. evanescens, максимальное
увеличение IFN-γ в 6,5 раз зарегестрировано через 8 часов после однократной
стимуляции, а при введении в течение 5 дней через 24 и 72 часа (в 12,8 и 10 раз
соответственно) в сравнении с контролем.
Изучение продукции IL-6 показало, что фукоидан из F. evanescens способствует его
увеличению через 2 и 4 часа после однократной стимуляции (в 7,5 и 3,17 раза), а при
многократном введении
через 2, 4 и 24 часа (в 4,1-3 раза). Увеличение IL-6 под
действием фукоиданов из L. japonica) и L. cichorioides установлено через 2 и 4 часа (в
среднем в 3,98 и 1,98 раза и 3,3 и 1,95 раза соответственно).
Следует отметить, что на фоне увеличения уровня IL-6, фукоиданы оказывают
ингибирующее действие на синтез TGF-β, который играет важную роль в генерации
клеток памяти и обладает мощным противовоспалительным действием.
При исследовании провоспалительного цитокина IL-17, который продуцируется
Тh17 типа и обладает уникальным действием на Т-лимфопоэз установлено, что только
5-кратное введение фукоиданов из F. evanescens (в 1,87 и 5,74 раз), L. japonica (в 2,6
раза) и L. cichorioides (в 6,1 раз) способствует его увеличению на определенных этапах
исследования по сравнению с контролем.
Таким образом, сульфатированные полисахариды бурых водорослей оказывают
индуцирующее действие на продукцию провоспалительных (IL-2, IL-6, IL-17, TNF-α) и
иммунорегуляторных
(IL-12,
IFN-γ)
противовоспалительного цитокина
цитокинов,
но
ингибируют
секрецию
(TGF-β), что свидетельствует об активации
механизмов, поляризующих развитие иммунного ответа по Th1 типу.
.
Таблица 8. Влияние фукоидана из F. evanescens на динамику продукции цитокинов в сыворотке крови мышей линии СВА
Время
исследования (ч)
2
4
F. evanescens
1-кратно
(5 мкг/кг)
8
24
72
2
4
F. evanescens
5 кратно
(5 мкг/кг)
8
24
72
Контроль
IL-2
M±σ
42,86±2,51*
p=0,000
38,72±2,9*
p=0,001
25,15±3,28
p=0,348
22,98±1,16
p=0,761
23,44±1,83
p=0,765
45,86±3,38*
p=0,000
38,48±2,75*
p=0,000
30,0±2,24*
p=0,007
23,87±0,79
p=0,276
23,84±1,58
p=0,274
23,21±1,79
TNF-α
M±σ
385,4±5,13*
p=0,000
170,96±3,35*
p=0,000
90,42±4,21*
p=0,000
51,84±3,36
p=0,942
64,38±3,0*
p=0,004
180,1±5,06*
p=0,000
143,5±3,97*
p=0,000
92,65±2,24*
p=0,000
77,65±3,74*
p=0,000
65,38±3,32*
p=0,005
52,91±2,62
IL-12
M±σ
17,34±2,69*
p=0,034
25,68±2,99*
p=0,002
52,12±3,47*
p=0,000
109,24±3,57*
p=0,000
224,82±5,52*
p=0,000
17,98±2,55*
p=0,024
27,68±2,53*
p=0,000
43,78±3,64*
p=0,000
108,48±4,35*
p=0,000
176,84±4,43*
p=0,000
12,22±1,78
IFN-γ
M±σ
12,34±1,75
p=0,218
14,87±2,18
p=0,064
72,00±4,57*
p=0,000
42,64±3,58*
p=0,000
35,28±2,79*
p=0,000
12,42±1,04
p=0,357
26,12±3,33*
p=0,002
61,28±3,12*
p=0,000
141,32±4,65*
p=0,000
110,54±3,24*
p=0,000
11,02±1,36
IL-6
M±σ
417,8±2,64*
p=0,000
175,4±4,18*
p=0,000
120,8±2,95*
p=0,000
115,5±2,67*
p=0,000
69,42±1,86*
p=0,003
227,58±3,8*
p=0,000
169,42±2,7*
p=0,000
102,46±3,1*
p=0,000
174,86±2,2*
p=0,000
79,64±2,39*
p=0,000
55,29±3,14
TGF-β
M±σ
44,56±3,67*
p=0,001
34,68±2,69*
p=0,000
39,24±2,2*
p=0,000
38,45±4,42*
p=0,000
45,02±3,91*
p=0,000
47,22±3,42*
p=0,001
28,54±2,24*
p=0,000
26,52±3,99*
p=0,000
43,24±3,01*
p=0,000
42,32±3,38*
p=0,000
65,48±2,33
IL-17
M±σ
20,0±1,8*
p=0,04
61,48±2,9
p=0,004*
10,7±0,9
Примечание: M±σ – средняя арифметическая ± стандартное квадратичное отклонение; *p - достоверность различий по сравнению с контролем (T-test,
критерий Стьюдента); n=15 (в каждой группе).
Таблица 9. Влияние фукоидана из L. japonica на динамику продукции цитокинов в сыворотке крови мышей линии СВА
Время
исследования (ч)
2
L. japonica
1 кратно
(5 мкг/кг)
4
8
24
72
2
4
L. japonica
5 кратно
(5 мкг/кг)
8
24
72
IL-2
M±σ
41,44±1,79*
p=0,000
31,98±1,88*
p=0,004
24,35±3,46
p=0,436
23,08±2,55
p=0,610
23,98±1,60
p=0,784
42,26±3,04*
p=0,000
36,72±4,26*
p=0,008
27,16±2,62
p=0,061
25,73±2,68
p=0,188
24,86±1,35
p=0,114
23,21±1,79
TNF-α
M±σ
343,96±5,64*
p=0,000
126,98±4,55*
p=0,000
53,84±3,14
p=0,781
53,27±2,24
p=0,923
52,84±2,75
p=0,658
176,5±4,15*
p=0,000
102,7±2,92*
p=0,000
60,28±1,73*
p=0,014
52,87±3,34
p=0,719
50,68±1,29
p=0,167
52,91±2,62
IL-12
M±σ
30,76±1,97*
p=0,000
157,92±4,12*
p=0,000
371,48±3,63*
p=0,000
224,85±5,45*
p=0,000
210,23±3,37*
p=0,000
20,72±1,81*
p=0,002
44,26±3,32*
p=0,000
84,96±2,84*
p=0,000
115,98±3,54*
p=0,000
219,78±5,05*
p=0,000
12,22±1,78
IFN-γ
M±σ
12,22±0,67
p=0,224
12,82±1,10
p=0,129
23,12±2,79*
p=0,002
28,52±2,35*
p=0,000
12,34±1,63
p=0,234
12,44±0,68
p=0,205
25,68±2,67*
p=0,001
29,87±3,41*
p=0,001
36,42±3,21*
p=0,000
20,82±2,58*
p=0,005
11,02±1,36
IL-6
M±σ
231,75±3,08*
p=0,000
102,96±1,83*
p=0,000
59,80±1,52
p=0,127
86,85±3,63*
p=0,000
62,38±2,02*
p=0,028
209,3±3,7*
p=0,000
115,9±4,34*
p=0,000
78,94±3,57*
p=0,001
59,84±1,40
p=0,114
71,46±2,30*
p=0,002
55,29±3,14
TGF-β
M±σ
46,48±2,7*
p=0,000
51,62±2,32*
p=0,002
32,38±3,62*
p=0,000
28,56±4,19*
p=0,000
24,22±3,39*
p=0,000
40,82±4,27*
p=0,000
21,34±2,63*
p=0,000
31,58±3,54*
p=0,000
22,72±2,41*
p=0,000
21,87±3,03*
p=0,000
65,48±2,33
IL-17
M±σ
28,5±2,2*
p=0,044
-
Контроль
10,7±0,9
Примечание: M±σ – средняя арифметическа ± стандартное квадратичное отклонение; *p - достоверность различий по отношению к показателям в
контроле (T-test, критерий Стьюдента); n=15 (в каждой группе).
Таблица 10. Влияние фукоидана из L. cichorioides на динамику продукции цитокинов в сыворотке крови мышей линии СВА
Время
исследования (ч)
2
4
L. cichorioides
1 кратно
(5 мкг/кг)
8
24
72
2
4
L. cichorioides
5 кратно
(5 мкг/кг)
8
24
72
IL-2
M±σ
34,87±2,24*
p=0,002
28,48±1,57*
p=0,02
23,72±2,83
p=0,909
22,20±3,06
p=0,697
23,42±2,06
p=0,902
39,86±3,73*
p=0,001
30,42±3,54*
p=0,035
25,62±2,48
p=0,278
23,68±1,34
p=0,879
23,73±1,97
p=0,812
23,21±1,79
TNF-α
IL-12
M±σ
M±σ
203,32±5,54* 14,86±1,34
p=0,000
p=0,134
102,47±4,15* 20,46±1,61*
p=0,000
p=0,002
62,98±3,41* 49,70±2,32*
p=0,015
p=0,000
56,36±2,96
49,56±4,0*
p=0,138
p=0,000
51,28±3,61 126,76±4,62*
p=0,678
p=0,000
154,36±4,6*
13,98±1,48
p=0,000
p=0,177
104,34±5,2* 20,46±1,61*
p=0,000
p=0,002
61,3±2,53*
29,92±3,63*
p=0,014
p=0,001
56,24±1,79
45,56±3,51*
p=0,126
p=0,000
49,26±2,75
95,72±3,18*
p=0,251
p=0,000
52,91±2,62
12,22±1,78
IFN-γ
M±σ
12,24±0,82
p=0,811
19,48±2,64*
p=0,007
20,72±2,16*
p=0,003
12,36±1,93
p=0,164
12,24±0,82
p=0,354
12,00±1,29
p=0,511
12,24±0,73
p=0,317
29,12±2,24*
p=0,000
14,72±2,67
p=0,077
14,42±2,54
p=0,082
11,02±1,36
IL-6
M±σ
79,54±5,02*
p=0,002
169,42±2,54*
p=0,000
55,62±2,55
p=0,961
52,48±1,81
p=0,244
78,48±4,68*
p=0,002
182,7±3,83*
p=0,000
107,98±3,4*
p=0,000
54,97±2,32
p=0,902
60,86±3,54
p=0,085
82,34±1,98*
p=0,000
55,29±3,14
TGF-β
M±σ
59,38±2,42*
p=0,043
40,92±2,91*
p=0,000
51,48±3,45*
p=0,003
35,96±2,76*
p=0,000
33,27±2,59*
p=0,000
33,24±2,09*
p=0,000
41,22±2,67*
p=0,000
33,52±2,97*
p=0,000
31,44±2,68*
p=0,000
31,11±2,71*
p=0,000
65,48±2,33
IL-17
M±σ
65,4±2,6*
p=0,000
-
Контроль
10,7±0,9
Примечание: Me±σ – средняя арифметическая ± стандартное квадратичное отклонение; *p - достоверность различий по отношению к показателям в
контроле (T-test, критерий Стьюдента); n=15 (для каждой группы).
Влияние сульфатированных полисахаридов на пролиферативную и
цитотоксическую активность спленоцитов мышей линии СВА
Установлено, что сульфатированные полисахариды в системах in vitro и ex vivo
способствуют повышению пролиферативной активности спленоцитов мышей (табл. 11),
о чем свидетельствует увеличение индекса стимуляции и преобладание в культуре
бластных форм и крупных клеток типа пролимфоцитов. Наибольшим стимулирующим
действием по сравнению с фукоиданами из L. cichorioides и L. japonica обладал
фукоидан из F. evanescens.
Таблица 11. Пролиферативная активность сульфатированных полисахаридов
Пролиферативная активность (бластные формы %)
Фукоиданы
M±σ
Me (LQ-UQ)
ИС
in vitro
100 мкг/мл 65,32±1,81* (p 1≤0,001)
65,60 (63,4-67,0)
3,94
F. evanescens
1
50 мкг/мл
53,80±1,90* (p ≤0,001)
54,0 (51,8-55,6)
3,25
10 мкг/мл
32,73±1,30*
32,80 (31,4-34,0)
1,98
100 мкг/мл
38,47±1,92*
38,80 (36,4-40,2)
2,32
L. cichorioides
50 мкг/мл
31,67±1,60*
31,80 (30,0-33,2)
1,91
10 мкг/мл
29,07±2,14*
28,60 (27,2-31,4)
1,76
100 мкг/мл
35,20±2,75*
34,60 (28,2 -32,8)
2,12
L. japonica
50 мкг/мл
30,53±2,12*
30,20 (28,6-32,8)
1,84
10 мкг/мл
21,67±2,53**
22,60 (18,8-23,6)
1,31
ex vivo
1
F. evanescens
5 мг/кг
34,93±4,0*
36,40 (30,40-38,0)
2,12
1
L. cichorioides
5 мг/кг
38,19±2,75*
38,40 (35,8-41,2)
2,31
1
L. japonica
5 мг/кг
31,14±2,77*
31,40 (28,8-34,2)
1,88
2
1
F. evanescens
5 мг/кг
50,60±2,31* p ≤0,05
50,80 (48,2-52,8)
3,05
2
L. cichorioides
5 мг/кг
44,74±2,0*
44,60 (42,8-46,8)
2,70
2
L. japonica
5 мг/кг
39,92±2,38*
39,20 (38,0-42,6)
2,41
Контроль
16,54±0,70*
16,60 (15,80-17,2)
Примечание: M±σ - средняя арифметическая ± стандартное отклонение; Me - медиана средних
значенийи; LQ-UQ - нижний и верхний квартили; p – достоверность значений по сравнению с
контролем, *p≤0,001 и ** p≤0,05 (T-test, критерий Стьюдента); ИС - индекс стимуляции по
отношению к М; 1 - однократное введение фукоиданов; 2 – пятикратное введение фукоиданов; p 1 –
достоверность различий между сульфатированными полисахаридами..
.
При исследовании цитотоксической активности в системах in vitro и ex vivo (табл.
12) установлено, что фукоиданы дозозависимо повышают уровень цитотоксичности
спленоцитов по отношению к NK-чувствительной линии клеток К562. Наибольшим
стимулирующим действием полностью сульфатированный фукоидан из L cichorioides, в
структуре которого отсутствуют моносахаридные фрагменты и ацетильные группы, но
достоверное различие в его действии установлено только по отношению к фукоидану из
L. japonica. Цитологическое исследование показало (рис. 10), что активированные
фукоиданами спленоциты вызывают лизис и деструкцию опухолевых клеток K562, что
свидетельствует об увеличении их цитотоксического потенциала.
Таблица 12. Цитотоксическая активность сульфатированных полисахаридов
Цитотоксическая активность (ЦИ, %)
M±σ
Me (LQ – UQ)
p
in vitro
100 мкг/мл
64,47±3,68*
64,34 (60,86-68,22)
0,000
F. evanescens
50 мкг/мл
55,39±2,62*
55,46 (52,74-57,98)
0,000
10 мкг/мл
49,62±3,06*
49,48 (46,64-52,76)
0,001
100 мкг/мл
70,70±3,39* (p 1≤0,05)
70,32 (67,52-74,28)
0,000
L. cichorioides
1
50 мкг/мл
60,55±3,64* (p ≤0,05)
60,46 (56,97-64,24)
0,000
10 мкг/мл
49,97±2,64*
49,12 (47,86-52,94)
0,000
100 мкг/мл
59,92±2,74*
60,42 (56,94-62,38)
0,000
L. japonica
50 мкг/мл
52,36±2,32*
52,18 (49,78-54,42)
0,000
10 мкг/мл
47,19±3,32*
47,36 (43,78-50,42)
0,002
ex vivo
F. evanescens 1
5 мг/кг
64,68±3,0*
64,38 (61,84-67,82)
0,000
1
L. cichorioides
5 мг/кг
67,95±2,70*
67, 57 (65,24-70,68)
0,000
L. japonica1
5 мг/кг
61,36±1,92*
61,12 (59,58-63,38)
0,000
2
F. evanescens
5 мг/кг
75,30±2,81*
74,38 (73,08-78,46)
0,000
L. cichorioides2
5 мг/кг
77,95±3,18* (p 1≤0,05)
77,19 (75,23-81,44)
0,000
2
L. japonica
5 мг/кг
69,34±2,71*
69,57 (66,53-71,92)
0,000
Контроль
29,41±2,76*
28,64 (27,12-32,48)
Примечание: M±σ - средняя арифметическая±стандартное отклонение; Me - медиана значений; LQ-UQ
- нижний и верхний квартили; p – достоверность значений по сравнению с контролем, *p≤0,001 (T-test,
критерий Стьюдента); ЦИ – цитотоксический индекс; 1 - однократное введение фукоиданов; 2 –
пятикратное введение; p 1 – достоверность значений между фукоиданами.
Фукоиданы
А
Б
В
Г
Д
Рисунок 10. Цитотоксическая активность сульфатированных полисахаридов.
Примечание: клетки эритробластного лейкоза К-562 до (А) и после (Б) добавления спленоцитов
мышей; клетки линии К-562 с добавлением спленоцитов мышей при введении ex vivo фукоиданов из L.
japonica (В), F. evanescens (Г) и L. cichorioides (Д); соотношение клеток мишень/эффектор 1:5;
микрофотографии культуральной взвеси сделаны с использованием системы AxioVision4 (ув. 400).
Противовирусная активность фукоидана из бурой водоросли L. japonica в
отношении вируса гриппа птиц А/Н5N1 in vitro
Важным критерием эффективности противовирусной активности препаратов
является их способность непосредственно влиять на инфекционные свойства вирусов.
Установлено, что фукоидан из L. japonica в дозах от 500 до 2500 мкг/мл не вызывает
цитодеструктивных изменений клеток
СПЭВ и обладает вирусингибирующим
действием (табл. 13), достоверно снижая титр вируса гриппа птиц А/H5N1 на 3,0-4,0 lg
ТЦИД50 по сравнению с контролем, в зависимости от времени предварительного
взаимодействия с вируссодержащим материалом.
Таблица 13. Вирусингибирующее действие фукоидана из L. japonica в отношении
вируса гриппа птиц А/H5N1
Время экспозиции
Титр вируса А/H5N1 (lg ТЦИД50/мл)
вируса с
Контроль вируса Фукоидан (500 мкг/мл)
p
фукоиданом
Me±σ
Me±σ
0 мин.
8,0 ± 0,5
5 мин.
10 мин.
30 мин
Примечание: Me±σ - медиана значений и стандартное
8,0 ±0,29
5,0±0,57
4,5±0,50
4,0±0,29
0,643
0,003
0,001
0,000
квадратичное отклонение; p - достоверность
полученных значений по сравнению с контролем (T-test, критерий Стьюдента).
Исследование противовирусной активности фукоидана из L. japonica на культуре
клеток СПЭВ показало (табл. 14), что предварительное взаимодействие полисахарида с
монослоем клеток за час до заражения высокопатогенным вариантом вируса гриппа
A/duck/Novosibirsk/02/05 H5N1 в дозе 0,1 ТЦИД50 снижает титр вируса на 2,5–3,0 lg
ТЦИД50 по сравнению с контролем (7,0 lg), а при одномоментном введении - на 1,5-2,5
lg ТЦИД50. Протективного действия фукоидана при введении через час после заражения
клеток не выявлено. При инфицировании вирусом в дозе 0,01 ТЦИД50 установлено, что
преинкубация
клеток
с
фукоиданом
в
течение
часа
полностью
ингибирует
инфекционную активность вируса по сравнению с контролем (6,5 lg ТЦИД50), при
одновременном введении - титр вируса снижается на 2,0-3,0 lg ТЦИД50, а в высокой
концентрации фукоидан подавляет развитие инфекции. Эффективность действия
высокой концентрации фукоидана выявлена и через час после инфицирования клеток.
Учитывая, что для вируса гриппа птиц А/H5N1 существенным является
распознавание рецепторов галактозы и сульфатированных рецепторов [А.С. Гамбарян,
2007], а фукоидан из L. japonica отличается высоким содержанием галактозы, мы
полагаем, что его противовирусное действие реализуется за счет связывания с
определенными мембранными рецепторами на клеточной поверхности и конкурентного
углеводспецифического взаимодействия с гликопротеином вируса гриппа птиц A/H5N1.
Таблица 14. Противовирусная активность фукоидана из L. japonica в отношении вируса гриппа птиц А/H5N1
Время
введения
фукоидана
в культуру
клеток СПЭВ
За 1 час до
инфицирования
В момент
инфицирования
Через 1 час
после
инфицирования
Доза
вируса
(ТЦИД50)
Контроль
вируса
Мe±σ
Титр вируса гриппа птиц А/H5N1 (lg ТЦИД50/мл)
Концентрация фукоидана мкг/мл
125
250
500
1000
Мe±σ
Мe±σ
Мe±σ
Мe±σ
0,1
7,0±0,57
7,0±0,29
4,5±0,57**
4,0±0,57**
4,0±0,5***
4,0±0,0***
0,01
6,5±0,5
6,5±0,29
0***
0***
0***
0***
0,1
7,0±0,57
6,5±0,5
6,0±0,29*
5,5±0,5*
4,5±0,5**
4,5±0,29***
0,01
6,5±0,5
6,5±0,5
6,5±0,29
4,5±0,57**
3,5±0,5**
0***
0,1
7,0±0,57
7,0±0,29
6,5±0,29
6,5±0,5
6,0±0,5*
6,0±0,0*
0,01
6,5±0,5
6,5±0,29
6,5±0,5
6,0±0,5
6,0±0,0
0***
2500
Мe±σ
Примечание: Me±σ - медиана значений ± стандартное квадратичное отклонение; p - достоверность полученных значений по сравнению с
контролем (T-test, критерий Стьюдента); * - p≤0,05; ** - p≤0,01; *** - p≤0,001.
Противовирусная активность фукоиданов из бурых водорослей при
экспериментальной хантавирусной инфекции
Предварительный
скрининг
биополимеров
из
морских
гидробионтов
на
чувствительной к хантавирусу культуре клеток Vero E6 дал основание для изучения
противовирусного действия сульфатированных полисахаридов бурых водорослей.
Установлено, что наибольшим действием обладал фукоидан из L. japonica, снижавший
титр вируса при предварительной обработке клеток Vero Е6 и непосредственном
взаимодействии с вирусом на 2,0-3,0 lg ТКИД50 (p=0,001 и 0,004) по сравнению с
контролем (5,0 lg). Действие фукоидана из L. cichorioides составило 2,0-2,5 lg (p=0,003 и
0,013), а фукоидана из F. evanescens - 1,5-2,0 lg ТКИД50 (p=0,004 и 0,011) соответственно.
На модели перитонеальных Мф (табл. 15) предварительное взаимодействие
фукоидана из L. japonica с вирусом в течение 30 мин. и 1 часа снижало количество
инфицированных клеток в 7,09 и 10,64 раз, а при экспозиции с Мф - в 3,37 и 3,32 раза
по сравнению с контролем. Фукоидан из L. cichorioides подавлял адсорбцию вируса в
3,97 и 6,4 раз, а при контакте с Мф - в 2,57 и 3,46 раза. Наименьшим действием обладал
фукоидан из F. evanescens (в 2,7 и 3,48 раза и 1,69 и 2,32 раза соответственно).
Таблица 15. Ингибирующее действие фукоиданов на адсорбцию хантавируса
Фукоиданы
(1000 мкг/мл)
L. japonica
L. cichorioides
F. evanescens
L. japonica
L. cichorioides
F. evanescens
Контроль
Макрофаги
Вирус
М±σ
М±σ
М±σ
(СКК/100 Мф)
(СКК/100 Мф)
(СКК/100 Мф)
Предварительная экспозиция 30 минут
9,43±1,53 (p=0,002)
4,45±2,05 (p=0,001)
31,65±5,16
12,34±2,28 (р=0,004)
7,99±1,36 (р=0,001)
18,72±3,47 (р=0,022)
11,80±2,53 (р=0,004)
Предварительная экспозиция 1 час
7,85±1,51 (р=0,001)
2,77±0,81 (р=0,000)
26,02±3,87
7,52±3,03 (р=0,002)
4,08±1,37 (р=0,000)
11,21±4,77 (р=0,013)
7,48±3,50 (p=0,003)
Примечание: М±σ – средняя арифметическая ± стандартное отклонение; p - достоверность полученных
значений по сравнению с контролем (T-test, критерий Стьюдента); СКК/100 Мф - среднее количество
антигенсодержащих светящихся клеток на100 макрофагов.
Учитывая
полученные
результаты,
для
дальнейшего
антиадсорбционного действия, в зависимости от дозы полисахарида
исследования
и времени
взаимодействия, мы выбрали фукоидан из L. japonica. Количество антигнсодержащих
Мф оценивали по ярко зеленому люминесцентному свечению клеток. Установлено, что
противовирусная активность полисахарида зависит от концентрации и времени его
действия в процессе всего периода адсорбции хантавируса на клетках-мишенях (табл.
16). Наибольшее ингибирующее действие выявлено при взаимодействии фукоидана с
Мф и вирусом в концентрации 1000 мкг/мл, что способствовало ингибированию
адсорбции в 7,52±0,75 и 3,54±0,55 раза соответственно по сравнению с контролем.
Таблица 16. Изучение ингибирующего действия фукоидана из L.japonica
Время
Контроль
взаимодействия с
(СКК/100 Мф)
фукоиданом
М±σ
15 мин.
37,60±8,88
Макрофаги
Вирус
30 мин.
27,97±4,03
1 час
21,87±4,64
15 мин.
37,60±8,88
30 мин.
27,97±4,03
1 час
21,87±4,64
L.japonica (концентрация - мкг/мл)
100
500
1000
М±σ
М±σ
М±σ
15,67±1,04
15,28±4,41
9,04±2,23
p = 0,013
p = 0,017
p = 0,006
12,52±3,42
10,78±3,21
8,42±2,63
p = 0,007
p = 0,004
p = 0,002
9,64±0,95
7,73±1,29
6,98±1,92
p = 0,012
p = 0,007
p = 0,006
8,74±0,77
5,79±1,33
5,07±1,74
p = 0,003
p = 0,004
p = 0,003
7,87±4,46
5,02±2,42
3,36±1,18
p = 0,004
p = 0,001
p = 0,000
6,34±3,41
4,53±1,76
3,20±1,91
p = 0,009
p = 0,003
p = 0,002
Примечание: М±σ – средняя арифметическая ± стандартное отклонение; p - достоверность
полученных значений по сравнению с контролем (T-test, критерий Стьюдента); СКК/100 Мф - среднее
количество антигенсодержащих светящихся клеток на100 макрофагов.
.
Несмотря на то, что у инфицированных животных отмечается бессимптомное
течение хантавирусной инфекции с длительной персистенцией вируса, представляло
интерес изучить в динамике действие фукоиданов на инфекционный процесс.
Установлено, что на начальном этапе инфекционного процесса фукоиданы из L.
japonica и L. cichorioides способствуют снижению количества инфицированных Мф в
5,7 и 3,15 раза, а действие фукоидана из F. evanescens было не эффективно (табл.17).
Выраженное ингибирующее действие всех полисахаридов, выявлено через 4-6
часов
после
заражения.
Так,
фукоидан
из
L.
japonica
снижал
количество
инфицированных Мф в среднем в 2,2 раза, а фукоиданы из L. cichorioides и F.
evanescens - в 1,64 и 1,5 раза. Результаты исследования инфекционного процесса в
период выраженной виремии (с 7 по 21 день) показали, что фукоиданы из L. japonica и
L. cichorioides способствуют снижению инфицированных Мф в среднем в 2,3 и 1,7 раза
соответственно, тогда как фукоидан из F. evanescens оказывает протективное действие
только на 10 и 14 день (в 1,6 раз). В отдаленные сроки развития инфекции (на 35 день),
снижение инфицированных Мф под действием фукоиданов из L. japonica и L.
cichorioides составило 1,5 раза, а из F. evanescens - 1,2 раза по сравнению с контролем.
Таблица 17. Влияние сульфатированных полисахаридов бурых водорослей на
показатель инфицирования макрофагов при хантавирусной инфекции
Время с
момента
инфицирования
30 минут
57,10±3,64
1 час
49,0±5,09
2 часа
16,25±2,68
4 часа
61,00±5,57
6 часов
50,24±3,68
24 часа
33,30±3,79
72 часа
24,10±4,37
7 дней
54,03±4,15
10 дней
59,00±4,95
14 дней
50,43±5,00
21 день
23,54±4,28
35 дней
Контроль
L. japonica
L. cichorioides
F. evanescens
Количество антигенсодержащих макрофагов (M±σ)
35,42±4,84
10,07±2,28*
p=0,000
25,94±4,48*
p=0,004
11,00±2,30
p=0,062
25,28±4,31*
p=0,000
26,32±3,19*
p=0,001
33,00±3,28
p=0,922
19,98±4,04
p=0,307
39,98±3,73*
p=0,012
20,50±4,0*
p=0,000
28,34±4,55*
p=0,005
10,20±3,00*
p=0,011
23,37±4,20*
p=0,031
18,12±2,78*
p=0,000
47,24±4,91
p=0,667
19,27±3,15
p=0,271
39,98±4,92*
p=0,008
28,45±3,52*
p=0,002
52,24±4,27*
p=0,004
21,12±4,13
p=0,445
43,03±3,84*
p=0,028
33,38±4,76*
p=0,003
25,72±4,33*
p=0,003
16,19±3,75
p=0,089
22,54±4,12*
p=0,024
53,98±3,39
p=0,349
53,30±4,95
p=0,365
10,34±2,43
p=0,047
39,20±3,96*
p=0,005
36,16±3,62*
p=0,009
47,98±4,0*
p=0,009
27,00±4,42
p=0,461
42,17±3,71*
p=0,021
33,44±4,73*
p=0,002
33,63±4,79*
p=0,013
30,27±4,62
p=0,137
29,31±4,54
p=0,186
Примечание: M±σ – средняя арифметическая ± стандартное отклонение; *p - достоверность
полученных значений по сравнению с контролем (T-test, критерий Стьюдента).
Таким образом, ингибирующее действие фукоиданов может быть связано как с
конкурентым лиганд-рецепторным взаимодействием с гликопротеинами хантавируса,
так и за счет связывания с мембранными рецепторами Мф, что приводит к
конформационным изменениям и является препятствием для адсорбции и пенетрации
хантавируса в клетки. Высокая противовирусная активность фукоиданов в разгар
инфекционного процесса, по-видимому, связана с их иммуномодулирующим действием.
Следует отметить, что наибольшей противовирусной активностью обладают
частично ацетилированнй фукоидан из L. japonica и полностью сульфатированный
фукоидан из L. cichorioides, которые являются 13--L-фуканами. Фукоидан из F.
evanescens отличается по типу связи между остатками фукозы и является
низкосульфатированным, частично ацетилированным 13;14-α-L-фуканом, что
возможно оказывает влияние на противовирусную активность полисахарида.
Противовирусная активность сульфатированных полисахаридов при
экспериментальном клещевом энцефалите в системах in vitro и in vivo
Результаты
изучения
противовирусной
активности
сульфатированных
полисахаридов на культуре клеток СПЭВ, инфицированных высокопатогенным
штаммом вируса клещевого энцефалита (КЭ) показали (табл. 18), что снижение титра
вируса при предварительном взаимодействии в течение часа с фукоиданом из L.
japonica в зависимости от концентрации составило от 4,7 до 3,0 lg ТЦИД50 по
сравнению с контролем. Фукоидан из F. evanescens во всех исследуемых концентрациях
способствовал снижению титра вируса на 4,7-4,0 lg ТЦИД50, а
фукоидан из L.
cichorioides только в дозе 1000 и 500 мкг/мл - на 3,0 lg.
При предварительном взаимодействии клеток СПЭВ с фукоиданами из L. japonica
и F. evanescens установлено, что полисахариды снижают титр вируса на 4,0 lg ТЦИД50
(1000 и 500 мкг/мл) и на 2,0 и 3,0 lg ТЦИД50 (100 мкг/мл). Снижение титра вируса под
действием фукоидана из L. cichorioides составило 3,0 и 2,0 lg ТЦИД50 по сравнению с
контролем.
Изучение
способности
полисахаридов
защищать
клетки
СПЭВ
от
цитодеструктивного действия вируса КЭ (табл. 19) показало, что введение фукоиданов
из F. evanescens и L. japonica через 1 час после инфицирования препятствовало
развитию инфекционного процесса и снижало титр вируса на 4,0-3,0 lg по сравнению с
контролем, а фукоидана из L. cichorioides на 1-2,0 lg.
Таким образом, сульфатированные полисахариды бурых водорослей в системе in
vitro обладают противовирусной активностью, способствуя статистически значимому
ингибированию (∆>2 lg) цитодеструктивного действия вируса КЭ.
Таблица 18. Вирусингибирующее действие сульфатированных полисахаридов в
отношении вируса клещевого энцефалита
Фукоиданы
концентрация
(мкг/мл)
1000 мкг/мл
L. japonica
500 мкг/мл
100 мкг/мл
1000 мкг/мл
L. cichorioides
500 мкг/мл
100 мкг/мл
1000 мкг/мл
500 мкг/мл
F. evanescens
100 мкг/мл
Контроль
Титр вируса КЭ после предварительного
взаимодействия с фукоиданами в течение 1 часа
(∆, lg ТЦД50/мл)
Вирус КЭ
Культура клеток СПЭВ
M±σ/Me
M±σ/Me
1,6±0,5*/2,0 (p=0,000)
2,0±1,0*2,0 (p=0,000)
1,6±0,5*/2,0 (p=0,000)
2,3±0,3*/2,0 (p=0,001)
3,3±0,5*/3,0 (p=0,003)
4,0±1,0*/4,0 (p=0,025)
3,0±1,0*/3,0 (p=0,007)
3,3±0,5*/3,0 (p=0,003)
3,3±0,5*/3,0 (p=0,003)
3,3±0,5*/3,0 (p=0,003)
5,3±0,5/5,0 (p=0,101)
4,0±1,0*/4,0 (p=0,025)
1,6±0,5*/2,0 (p=0,000)
2,0±0,0*/2,0 (p=0,000)
2,0±0,0*/2,0 (p=0,000)
2,0±1,0*/2,0 (p=0,003)
2,3±0,5*/2,0 (p=0,001)
3,3±0,5*/3,0 (p=0,003)
6,3±0,5/6,0
Примечание: M±σ – средняя арифметическая ± среднее квадратичное отклонение; Me – медиана
значений; *p – достоверность значений по сравнению с контролем (T-test, критерий Стьюдента).
Таблица 19. Протективное действие сульфатированных полисахаридов в отношении
вируса клещевого энцефалита через 1 час после инфицирования культуры клеток СПЭВ
Фукоиданы
1000 мкг/мл
L. japonica
500 мкг/мл
100 мкг/мл
1000 мкг/мл
L. cichorioides
500 мкг/мл
100 мкг/мл
1000 мкг/мл
500 мкг/мл
F. evanescens
100 мкг/мл
Контроль вируса КЭ
Титр вируса КЭ
(∆, lg ТЦИД50/мл)
M±σ/Me
2,33±0,57*/2,0 (p=0,001)
2,66±0,57*/3,0 (p=0,001)
3,0±0,0*/3,0 (p=0,000)
3,66±0,57*/4,0 (p=0,005)
4,33±1,0*/5,0 (p=0,013)
5,33±0,57/5,0 (p=0,116)
1,6±1,0*/2,0 (p=0,000)
2,33±0,57*/2,0 (p=0,001)
2,66±0,57*/3,0 (p=0,001)
6,3±0,5/6,0
Примечание: M±σ – средняя арифметическая ± среднее квадратичное отклонение; Me - медиана
значений; *p – достоверность значений по сравнению с контролем (T-test, критерий Стьюдента).
Исследование противовирусной активности фукоиданов при экспериментальном
КЭ мышей показало, что летальность животных в контрольной группе зараженной
вирусом (10 LD50) на 11 день эксперимента составила 100%, а СПЖ=9,98 дней.
При изучении протективного действия фукоидана из L. japonica (табл. 20)
установлено, что 3-х и 5-кратное внутримышечное введение полисахарида в дозе 20
мг/кг через 1 час после инфицирования (лечебная схема), способствовало 20 и 30%
выживаемости животных (а=0,045 и 0,041 соответственно), СПЖ=12,16 и 12,24 дней, а
увеличение СПЖ (УСПЖ) - 20,83%. Однократное введение фукоидана было не
эффективным
При профилактической схеме введения фукоидана из L. japonica за 24 часа до
инфицирования вирусом КЭ протективный эффект наблюдался в дозе 5 мг/кг.
Однократное введение фукоидана способствовало 20% (а=0,044) выживаемости
(СПЖ=12,7 дней, УСПЖ - 27,25%), а пятикратное введение - 30% (а=0,038)
выживаемости животных (СПЖ=12,6 дней, УСПЖ=26,2%). В дозе 20 мг/кг фукоидан не
оказывал защитного действия.
Исследование фукоидана из F. evanescens показало (табл. 21), что многократное
введение полисахарида по лечебной схеме способствовало достоверной выживаемости
животных на протяжении всего эксперимента. Так, 3-кратное введение полисахарида в
дозе 20 мг/кг обеспечивало 40% (а=0,032) выживаемость (СПЖ=13,34 дней,
УСПЖ=33,67%), а 5-кратное введение в дозе 5 и 20 мг/кг способствовало 30 и 40%
(а=0,041 и 0,048) выживаемости (СПЖ=12,86 и 12,44 дней, а УСПЖ - 28,86 и 24,65%
соответственно). Введение фукоидана в течение 10 дней было менее эффективным.
При профилактической схеме установлено, что обе схемы введения фукоидана из
F. evanescens в дозе 5 мг/кг способствовали 40 и 30% (а=0,025 и 0,049) выживаемости
животных (СПЖ=13,16 и 12,33 дней, УСПЖ=31,86 и 23,55%), а в дозе 20 мг/кг только
многократное введение фукоидана способствовало 20% выживаемости мышей
(СПЖ=12,16 дней и УСПЖ=21,84%).
В аналогичных исследованиях фукоидан из L. cichorioides не защищал
инфицированных животных от цитодеструктивного действия вируса КЭ.
Следует отметить, что противовирусная активность фукоидана из F. evanescens
была сопоставима с действием циклоферона, введение которого по лечебной схеме в
концентрации 6 и 60 мг/кг способствовало 30 и 40% (а=0,039 и 0,012) выживаемости
мышей (СПЖ=12,53 и 14,34 дней, УСПЖ=27,45 и 43,69%). Профилактическая схема
введения показала, что только в концентрации 60,0 мг/кг препарат способствовал 30%
(a=0,031) выживаемости животных (СПЖ=12,23 дня, УСПЖ=22,45%).
Протективное
действие
исследуемых
фукоиданов
установлено
и
при
инфицировании животных меньшей дозой вируса КЭ. Летальность мышей в
контрольной группе зараженной вирусом КЭ (5 LD50) к окончанию эксперимента
составила 60%, а СПЖ=13,07 дней. Наибольшей противовирусной активностью обладал
фукоидан из F. еvanescens, который при введении по лечебной и профилактической
схемам способствовал 90% выживаемости животных (СПЖ в среднем составила
18,9±3,07 и 19,05±0,22 дней, а УСПЖ - 44,61±3,87 и 45,75±1,73%).
При введении фукоидана из L. japonica эффективным было многократное введение
полисахарида, что способствовало до 80% выживаемости животных (СПЖ в среднем
составила 18,4±0,27 и 18,3±0,32 дней, а УСПЖ - 40,81±2,06 и 40,0±2,46%). Однократное
введение было менее эффективным. Фукоидан из L. cichorioides только при
многократном введении в концентрации 20 мг/кг оказывал протективное действие,
(СПЖ=18,0±0,5 и 18,04±0,22 дней, а УСПЖ - 37,75±3,84 и 38,02±0,44%).
Мы полагаем, что противовирусная активность фукоиданов в системе in vitro при
экспериментальном
КЭ
обусловлена
конкурентным
углевод-специфическим
взаимодействием с гликопротеином вируса и рецепторами клеток, что препятствует
адсорбции и слиянию клеточной и вирусной мембран, а в системе ex vivo непосредственно и с активацией факторов врожденного и адаптивного иммунитета,
способствующих формированию защиты у инфицированных животных.
Следует отметить, что наибольшим действием в отношении вируса КЭ обладают
частично ацетилированные фукоиданы из F. evanescens и L. japonica, которые
различаются по типу связи и моносахаридному составу. Возможно, что низкая
противовирусная
активность
полностью
сульфатированного
фукоидана
из
L.
cichorioides связана с отсутствием ацетильных групп, моносахаридных фрагментов и
высокой молекулярной массой.
Таким образом, на трех экспериментальных вирусных инфекциях показано, что
противовирусная активность сульфатированных полисахаридов бурых водорослей
зависит от их химического строения, а также от совокупности факторов патогенности
возбудителей, процессов их взаимодействия с клетками-мишенями и инфицирующей
дозы вируса.
Таблица 20. Протективное действия фукоидана из L. japonica при экспериментальном клещевом энцефалите
Фукоидан
Доза и кратность введения
1- кратно 5 мг/кг
1- кратно 20 мг/кг
3-кратно 5 мг/кг
3-кратно 20 мг/кг
5-кратно 5 мг/кг
5-кратно 20 мг/кг
10-кратно 5 мг/кг
L. japonica
10-кратно 20 мг/кг
Выживаемость %
1-кратно 5 мг/кг
1-кратно 20 мг/кг
5-кратно 5 мг/кг
5-кратно 20 мг/кг
10-кратно 5 мг/кг
10-кратно 20 мг/кг
-7,5
Контроль (10 lg, 10 LD50/0,2 мл)
20
0
30
10
20
10
0
10
10
10
20
10
30
0
20
СПЖ(M±σ)
Лоранговый критерий – Z
Лечебная схема
11,83±0,19; p=0,005*
Z=1,555; a=0,121
11,39±0,32; p=0,017*
Z=1,038; a=0,300
11,37±0,38; p=0,022*
Z=1,315; a=0,189
12,16±0,36; p=0,004*
Z=2,014; a=0,045**
11,59±0,81; p=0,046*
Z=1,214; a=0,225
12,24±0,20; p=0,002*
Z=2,051; a=0,041**
10,44±0,52; p=0,352
Z=0,350; a=0,726
11,74±0,67; p=0,024*
Z=1,108; a=0,268
Профилактическая схема
12,70±0,68; p=0,005*
Z=2,018; a=0,044**
10,78±0,14; p=0,067
Z=0,622; a=0,534
12,60±0,32; p=0,002*
Z=2,075; a=0,038**
11,23±0,35; p=0,028*
Z=1,101; a=0,271
11,97±0,64; p=0,014*
Z=1,094; a=0,274
11,08±0,31; p=0,037*
Z=0,711; a=0,477
9,98±0,53
Примечание: M±σ – средняя арифметическая и стандартное отклонение; СПЖ – средняя продложительность жизни животных.*p – достоверность
полученных значений СПЖ по сравнению с контролем (T-test, критерий Стьюдента); Z – лоранговый критерий выживаемости с поправкой Йейтса
(≥1,960); **а – уровень достоверности различий между опытом и контролем (<0,05) при сравнении кривых выживаемости по С. Гланцу.
Таблица 21. Протективное действие фукоидана из F. evanescens при экспериментальном клещевом энцефалите
Фукоидан
Доза и кратность введения
1- кратно 5 мг/кг
1- кратно 20 мг/кг
3-кратно 5 мг/кг
3-кратно 20 мг/кг
5-кратно 5 мг/кг
5-кратно 20 мг/кг
10-кратно 5 мг/кг
F. evanescens
10-кратно 20 мг/кг
Выживаемость %
1-кратно 5 мг/кг
1-кратно 20 мг/кг
5-кратно 5 мг/кг
5-кратно 20 мг/кг
10-кратно 5 мг/кг
10-кратно 20 мг/кг
7,5
Контроль (10 lg, 10 LD50/0,2 мл)
40
10
30
20
10
20
0
10
0
20
40
30
30
10
20
СПЖ(M±σ)
Лоранговый критерий - Z
Лечебная схема
10,94±0,56; p=0,100
Z =0,362; a=0,718
10,47±0,81; p=0,431
Z =0,374; a=0,709
11,54±0,60; p=0,03*
Z=1,213; a=0,226
13,34±0,35; p=0,000*
Z=2,151; a=0,032*
12,86±0,30; p=0,001*
Z=2,051; a=0,041*
12,44±0,49; p=0,004*
Z=1,983; a=0,048*
10,97±0,53; p=0,085
Z=0,803; a=0,423
12,00±0,35; p=0,005*
Z=1,792; a=0,074
Профилактическая схема
13,16±0,42; p=0,001*
Z=2,248; a=0,025**
11,32±0,61; p=0,046*
Z=0,871; a=0,384
12,33±0,47; p=0,005*
Z=1,976; a=0,049**
12,16±0,49; p=0,007*
Z=1,494; a=0,136
11,42±0,68; p=0,045*
Z=1,094; a=0,274
12,10±0,72; p=0,015*
Z=1,461; a=0,145
9,98±0,53
-
Примечание: M±σ – средняя арифметическая и стандартное отклонение; СПЖ – средняя продложительность жизни животных.*p – достоверность
полученных значений СПЖ по сравнению с контролем (T-test, критерий Стьюдента); Z – лоранговый критерий выживаемости с поправкой Йейтса
(≥1,960); **а – уровень достоверности различий между опытом и контролем (<0,05) при сравнении кривых выживаемости по С. Гланцу.
В свете современных представлений о врожденном иммунитете, представленные
результаты
диссертационной
полисахариды
бурых
работы
водорослей
свидетельствуют,
индуцируют
что
генетически
сульфатированные
детерминированные
биохимические процессы, направленные на активацию эффекторных функций
врожденного иммунитета и формирование развития адаптивного иммунного ответа
(рис.11). Изучение и установление связи между структурой и функцией фукоиданов,
определение
специфических рецепторов для них на клетках иммунной системы
способствуют детальному пониманию аспектов механизма их действия, и создает
основу для создания новых иммунобиологических препаратов – модификаторов
функций врожденного иммунитета, способствующих формированию защиты организма
против патогенов различных таксономических групп.
Сульфатированные
полисахариды
Дендритные клетки
Экспрессия TLRs на дендритных клетках. Активация NF-kB при взаимодействии с TLR2, TLR2/TLR6 и
TLR4. Экспрессия генов провоспалительных цитокинов и интерферониндуцибельных генов
Созревание дендритных клеток. Увеличение экспрессии маркера терминальной
дифференцировки, активационного маркера, костимулирующих, адгезивных и MHC молекул
Активация дендритных клеток.
Продукция иммунорегуляторного (IL-12)
и провоспалительных (IL-6, IL-1β, TNF-α)
Взаимодействие с наивными Т-лимфоцитами.
Презентация антигена CD4+Т-клеткам.
Активация и дифференцировка клеток
по Тh-1 типу
Развитие иммунного ответа
по Тh-1 типу. Активация
иммунокомпетентных клеток,
увеличение цитотоксической и
пролиферативной активности.
Продукция цитокинов
(IFNγ, IL-2, IL-12, IL-6, TNF-α).
Рисунок 11. Алгоритм механизмов активации клеток-эффекторов врожденного
иммунитета сульфатированными полисахаридами бурых водорослей.
Выводы
1. Комплексное изучение на молекулярном и клеточном уровнях различных по
химической структуре фукоиданов из бурых водорослей F. evanescens, L. cichorioides и
L. japonica раскрывает механизмы активации системы врожденного иммунитета, и
является экспериментальным обоснованием возможности конструирования на их
основе новых фармакологических субстанций и лекарственных препаратов.
2. Различные по химической структуре сульфатированные полисахариды бурых
водорослей являются лигандами Тoll-рецепторов, о чем свидетельствуют:
-
увеличение
экспрессии
ТLR-2
и
ТLR-4
на
дендритных
клетках
и
мононуклеарных лейкоцитах селезенки мышей;
- активация транскрипционного ядерного фактора NF-kB
через MyD88-
зависимый путь и адаптерную пару TRIF/TRAM при специфическом взаимодействии с
ТLR-2, ТLR-2/6 и ТLR-4 человека;
-
отсутствие
токсического
действия
и
содержания
эндотоксинов
грамотрицательных бактерий в структуре фукоиданов является подтверждением
специфического лигандрецепторного взаимодействия с TLRs.
3. Сульфатированные полисахариды бурых водорослей являются индукторами
созревания дендритных клеток, о чем свидетельствуют иммунофенотипические и
морфлолгические характеристики:
- ДК, генерированные из костного мозга мышей, характеризуются фенотипом:
CD34-/+, CD38+, CD11c+, CD40+, CD86+, CD83+, MHC II+, F4/80; ДК, генерированные из
моноцитов периферической крови человека: CD34-/+, CD14-/+, CD83+, CD11c+, HLA-DR+;
- созревшие ДК имеют округлую неправильную форму с эксцентрично
расположенным
ядром,
вакуализированную
цитоплазму,
многочисленные
цитоплазматические псевдоподии разнообразной формы по сравнению с незрелыми ДК.
4. Сульфатированные полисахариды бурых водорослей усиливают продукцию
созревшими дендритными клетками иммунорегуляторного (IL-12) и провоспалительных
цитокинов
(IL-1β,
IL-6,
экспрессию
TNF-α),
костимулирующих
и
антигенпредставлющих молекул, что является необходимым условием для активации и
дифференцировки Т-лимфоцитов.
46
5. Сульфатированные полисахариды бурых водорослей способствуют активации
гемопоэза, выраженной макрофагальной реакции и пролиферации лимфоидных клеток в
первичных и вторичных органах иммуногенеза.
6. Изменение субпопуляционного состава мононкулеарных лейкоцитов селезенки
мышей под действием фукоиданов (экспрессия CD19, NK, NКТ, CD25, MHC II, TCR,
TLR-2, TLR-4), увеличение пролиферативной и цитотоксической активностей,
продукции цитокинов (IL-2, IL-12, IL-6, IFNγ, TNF-α) в системах in vitro и ex vivo
свидетельствуют о процессах дифференцировки и активации эффекторных механизмов
врожденного иммунитета и развитии адаптивного иммунного ответа по Th1 типу.
7. При экспериментальных вирусных инфекциях (хантавирусная инфекция,
клещевой энцефалит, грипп птиц),
установлена существенная противовирусная
активность сульфатированных полисахаридов из бурых водорослей F. evanescens, L.
cichorioides и L. japonica, и показана связь их протективного действия с химической
структурой:
-
установлено
вирусингибирующее
и
протективное
действие
частично
ацетилированного сульфатированного полисахарида из L. japonica, который отличается
высоким содержанием галактозы, в отношении высокопатогенного варианта вируса
гриппа птиц А/H5N1 распознающим рецепторы галактозы и сульфатированные
рецепторы, что обеспечивает конкурентное углеводспецифическое взамодействие;
- на модели экспериментальной хантавирусной инфекции в системах in vitro и ex
vivo показано, что фукоиданы различаются по степени ингибирующего действия на
процесс адсорбции и развитие инфекционного процесса, наибольшей противовирусной
активностью обладают сульфатированные полисахариды из L. japonica и L. cichorioides,
которые являются 13--L-фуканами.
-
установлена
вирусингибирующая
активность
и
протективное
действие
фукоиданов при экспериментальном клещевом энцефалите, наиболее выраженное у
частично ацетилированных, низкомолекулярных фукоиданов из F. evanescens и L.
japonica, которые различаются по типу связи и моносахаридному составу.
Список научных работ, опубликованных по теме диссертации
1. Активация эффекторных функций нейтрофилов биополимерами морских
гидробионтов /Запорожец Т.С., Макаренкова И.Д., Гажа А.К., Кузнецова Т.А.
47
Молчанова В.Н., Звягинцева Т.Н., Беседнова Н.Н., Эпштейн Л.М. // Медицинская
иммунология. - 2003. - Том 5. - № 1-2. - С.149-156.
2. Study of marine polysaccharides effect to Hantaan virus adsorbtion / Kompanets G.,
Makarenkova I., Zvyagintceva T., Zaporozhets T. //2004 International Symposium on
Marine Drugs (ISMD 2004). - Proceedings 18-22 October 2004, Qingdao, China. - P..121.
3. Влияние полисахаридов морского происхождения на адсорбцию Хантавирусов in
vitro / Компанец Г.Г., Макаренкова И.Д. //Тезисы докладов IV научно-практической
конференции «Инфекционная патология в Приморском крае», г. Владивосток. – 2004 г.
– С. 90-91.
4. Study of effect of brown algae Fucoidans of Hantaan virus adsorbtion in vitro /
Makarenkova I., Kompanets G., Zvyagintceva T. //The 6th International Conference on
Hantaviruses (HFRS and HPS). – 23-25.06.2004. - Seoul. Korea. - P. 106.
5. Ингибирование адгезии патогенных микроорганизмов на эукариотических
клетках / Макаренкова И.Д., Компанец Г.Г., Запорожец Т.С. // Журнал
микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 2006. - № 3. - С. 121-125.
6. Скрининг биополимеров из морских гидробионтов, влияющих на адсорбцию
вируса Хантаан / Макаренкова И.Д., Компанец Г.Г., Беседнова Н.Н., Слонова Р.А.,
Звягинцева Т.Н., Шевченко Н.М. // Вопросы вирусологии. - 2007. - № 2. - С. 29-32.
7. Ингибирующее действие фукоиданов на адсорбцию вируса Хантаан на модели
перитонеальных макрофагов / Макаренкова И.Д., Компанец Г.Г., Беседнова Н.Н.,
Шевченко Н.М. Звягинцева Т.Н. // Вопросы вирусологии. - 2008. - № 3. – С. 12-15.
8. Влияние сульфатированных полисахаридов из морских бурых водорослей на
функциональную активность дендритных клеток, костномозгового происхождения /
Макаренкова И.Д., Ахматова Н.К., Семенова И.Б., Звягинцева Т.Н., Беседнова Н.Н. //
Российский иммунологический журнал. - 2008. - Т. 2. - № 2-3. - С. 122.
9. Противовирусная активность фукоиданов природного происхождения при
экспериментальной инфекции, вызванной хантавирусом / Максема И.Г., Макаренкова
И.Д. //Тихоокеанский медицинский журнал. - 2008. - № 2. - С. 86-89.
10. Антивирусное действие сульфатированных полисахаридов / Макаренкова
И.Д., Беседнова Н.Н., Запорожец Т.С. // Антибиотики и химиотерапия. - Т.54. - № 12. - 2009. - С. 56-62.
11. Антивирусное действие фукоидана из морской бурой водоросли L. japonica на
вирус гриппа Н5N1 in vitro / Макаренкова И.Д., Дерябин П.Г., Львов Д.К., Беседнова
Н.Н., Звягинцева Т.Н.//Материалы международной научно-практической конференции
«Перспективы сотрудничества государств-членов ШОС в противодействии угрозе
инфекционных болезней». 114-15 мая 2009 г. Новосибирск, Россия. С. 251-254.
12. Сульфатированные полисахариды из морских бурых водорослей – индукторы
созревания дендритных клеток / Макаренкова И.Д., Ахматова Н.К., Семенова И.Б.,
Беседнова Н.Н., Звягинцева Т.Н. //Тихоокеанский медицинский журнал. - 2009. - № 3.
- С. 36-39.
13. Протективное действие фукоидана из морской бурой водоросли L. japonica при
экспериментальном клещевом энцефалите / Макаренкова И.Д., Крылова Н.В., Леонова
Г.Н., Беседнова Н.Н., Звягинцева Т.Н., Шевченко Н.М. //Тихоокеанский медицинский
журнал. - 2009. - № 3. - С. 83-86.
14. Противовирусная активность сульфатированного полисахарида из бурой
водоросли Laminaria japonica в отношении инфекции культур клеток, вызванной
48
вирусом гриппа A птиц (H5N1) / Макаренкова И.Д., Дерябин П.Г., Львов Д.К.,
Звягинцева Т.Н., Беседнова Н.Н. // Вопросы вирусологии. – 2010. - №1. - С. 41-45.
15. Продукция цитокинов дендритными клетками костного мозга мышей под
воздействием сульфатированных полисахаридов из морских бурых водорослей /
Макаренкова И.Д., Ахматова Н.К., Семенова И.Б., Беседнова Н.Н., Звягинцева Т.Н.,
Шевченко Н.М. // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. -2010.
- № 5. - С. 34-39.
16. Биологически-активные вещества из морских гидробионтов – источник новых
фармакологических субстанций и лекарств / Беседнова Н.Н., Крыжановский С.П.,
Запорожец Т.С., Макаренкова И.Д. // Пробл. стандартизации в здравоохранении. 2011. - № 9-10. - С. 27-33.
17. Исследование взаимодействия фукоиданов бупых водорослей с Толлподобными рецепторами in vitro / Макаренкова И.Д., Логунов Д.Ю., Тухватулин А.И.,
Семенова И.Б., Беседнова Н.Н., Звягинцева Т.Н., Ермакова С.П.// FAMILY HEALTH IN
THE XXI CENTURE. Procceedings of the XV International Scientific Conference. Part II.
Torremolinos (Spain) – Perm (Russia)/ - 2011. - P. 44-45.
18. Сульфатированные полисахариды водорослей - модификаторы функций
врожденного иммунитета при бактериальных, вирусных и паразитарных инфекциях /
Беседнова Н.Н., Запорожец Т.С., Макаренкова И.Д., Ермакова С.П., Звягинцева Т.Н. //
Успехи современной биологии. - 2011. - Т. 131. - № 5. - C. 503-517.
19. Sulfated Polysaccharides of Brown Seaweeds are Ligands of Toll-Like Receptors /
Makarenkova I.D., Logunov D.Yu., Tukhvatulin A.I., Semenova I.B., Zvyagintseva T.N.,
Gorbach V.I., Ermakova S.P., Besednova N.N. // Biomedical Chemistry. – 2012. - Vol. 6. № 1. - P. 75–80.
20. Противовирусная активность сульфатированных полисахаридов из бурых
водорослей при экспериментальном клещевом энцефалите: связь структуры и функции /
Макаренкова И.Д., Леонова Г.Н., Майстровская О.С., Звягинцева Т.Н., Имбс Т.И.,
Ермакова С. П., Беседнова Н.Н. // Тихоокеанский медицинский журнал. - 2012. - №1.
- С-61-63.
21 Изучение лиганд-рецепторного взаимодействия фукоиданов бурых водорослей с
Толл-подобными рецепторами in vitro / Макаренкова И.Д., Логунов Д.Ю., Тухватулин
А.И., Семенова И.Б., Звягинцева Т.Н., Горбач В.И., Ермакова С.П., Беседнова
Н.Н.//Сборник статей и тезисов X Региональной научно-практической конференции
«Актуальные вопросы аллергологии и иммунологии» г. Владивосток. - 2012 г. - С.66.
22. Anti-Inflammatory effects of sulfated polysaccharides Extracted from Brown Algae /
Besednova N.N., Zaporozhets T.S., Makarenova I.D., Kuznetsova T.A., Kryzhanoskii S.P.,
Zvyagintseva T.N., Mel’nikov V.G. // Biology Bulletin Reviews. – 2012. - Vol. 2. - № 6. - P.
525–532.
23. Исследование пролиферативной и цитотоксической активности фукоиданов из
бурых водорослей in vitro / Макаренкова И.Д., Семенова И.Б., Ахматова Н.К.,
ЗвягинцеваТ.Н., Ермакова С.П. // Международный журнал экспериментального
образования. - 2012. - №6. - C. 16-17.
24. Interactions between sulfated polysaccharides from sea brown algae and Toll-like
receptors on HEK293 eukaryotic cells in vitro / Makarenkova I.D., Logunov D.Y.,
Tukhvatulin A.I., Semenova I.B., Besednova N.N., Zvyagintseva T.N.//Bulletin of
Experimental Biology and Medicine - 2012. - Vol. 154. - № 2. - P. 241-244.
49
25. Влияние фукоиданов из бурых водорослей на созревание дендритных клеток,
генерированных из моноцитов периферической крови in vitro / Макаренкова И.Д.,
Ахматова Н.К., Семенова И.Б., Звягинцева Т.Н., Беседнова Н.Н. // Российский
иммунологический журнал. - 2012. - Т.6 (14). - №3 (1). - С.105-106.
26. Влияние сульфатированных полисахаридов из бурых водорослей на
пролиферативную и цитотоксическую активность спленоцитов мышей / Макаренкова
И.Д., Семенова И.Б., Ахматова Н.К., Беседнова Н.Н., Звягинцева Т.Н., Ермакова С.П. //
Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 2012. - №6. - С.68-75.
27. Влияние сульфатированных полисахаридов бурых водорослей на динамику
продукции цитокинов в сыворотке крови мышей линии СВА / Макаренкова И.Д. //
Цитокины и воспаление. - 2012. - Т. 11. - № 4. - С.34-41.
28. Патент - «Средство, обладающее противовирусной активностью». Патент РФ
№ 2304443 от 20.08.2007. Авторы: Макаренкова И.Д., Компанец Г.Г., Беседнова Н.Н.,
Звягинцева Т.Н., Шевченко Н.М. Заявители и патентообладатели: Тихоокеанский
институт биоорганической химии Дальневосточного отделения Российской академии
наук, Государственное учреждение Научно-исследовательский институт эпидемиологии
и микробиологии Сибирского отделения Российской академии медицинских наук. Рег.
№ заявки 2006100574/15. Заявл. 10.01.2006. Опубл.20.08.2007. Бюлл. № 23.
Список сокращений
кДа - килодальтон - единица массы
ЛПС - липополисахарид
МЛ - мононуклеарные лейкоциты
М.м. – молекулярная масса
МТТ – 3‫( ـ‬4,5‫ـ‬диметилтиазол-2- ил) ‫ ـ‬1,5‫ ـ‬дифенилтетразолия бромид
ТЦИД50 - 50% инфекционная доза в тканевой культуре
CD - (cell differentiation antigen), антигены кластеров дифференцировки клеток
GM-CSF - гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор
HLA-DR - (human leukocyte antigens), антигены лейкоцитов человека
IFN - (interferon), интерферон
IL - (interleukin), интерлейкин
LD50 - (lethal dose, 50%), полулетальная средняя доза, или доза вызывающая гибель
половины испытуемой группы животных
MHC - (major histocompability complex), главный комплекс гистосовместимости
NF-kB - (nuclear fator-kB), транскрипционный ядерный фактор
NKT - Т-лимфоциты с функцией натуральных киллерных клеток
PAMP - (pathogen associated molecular pattern), патоген-ассоциированные молекулярные
паттерны (структуры)
TCR - (T-cell receptor), Т‫ ـ‬клеточный рецептор
TNF - (tumor necrosis factor), фактор некроза опухолей
TGF - трансформирующий фактор роста
Th-1 и Th-2 - (T-helper-1 и 2), субпопуляции CD4+ Т-лимфоцитов (хелперов)
50