влияние гемцитабина и липосомального гемцитабина на клетки

ВЛИЯНИЕ ГЕМЦИТАБИНА И ЛИПОСОМАЛЬНОГО ГЕМЦИТАБИНА
НА КЛЕТКИ РАКА ПРЕДСТАТЕЛЬНОЙ ЖЕЛЕЗЫ
Е.В. Суколинская1, К. Унгер2
1
ГУ НИИ ОМР им. Н.Н.Александрова, г. Минск (Беларусь)
2
Клиника терапевтической онкологии клиники биологии опухолей
при Альберт-Людвиг университете, г. Фрайбург (Германия)
Ключевые
слова:
липосомы,
липосомальный
гемцитабин,
рак
предстательной железы.
В работе представлены данные о противоопухолевой активности
гемцитабина и его липосомальной формы в отношении клеток рака
предстательной железы in vitro. Изучена возможность создания липосомальной
формы гемцитабина, что актуально, учитывая быстрое разрушение препарата
ферментами сыворотки крови. Противоопухолевая активность гемцитабина и
его липосомальной формы оценивалась на гормоночувствительной линии
клеток LNCaP и гормонорезистентных клеточных линиях PC3 и DU-145.
В результате работы удалось создать оригинальную липосомальную
форму гемцитабина с эффективностью включения препарата 46±3% и размером
липосом – 36±3 нм. Установлено дозозависимое антипролиферативное
действие гемцитабина и его липосомальной формы во всех трёх исследованных
клеточных линиях. Не зафиксировано различий между гормоночуствительными
и гормонорезистентными клеточными линиями.
Сопоставимый
противоопухолевый
эффект
гемцитабина
и
его
липосомальной формы, полученный in vitro (концентрации препаратов в
пределах 10-20 нМ соответствуют IC50), делает актуальным проведение
экспериментов in vivo, где ожидается усиление эффекта липосомальной формы
гемцитабина, в связи с более длительным сохранением терапевтической
концентрации цитостатика в сыворотке и опухолевой ткани.
1
GEMCITABINE AND ITS LIPOSOME FORM INFLUENCE TO THE
PROSTATE CARCINOMA CELLS
E.Sukolinskaya, C.Unger
Key words: liposomes, gemcitabine liposome form, prostate carcinoma.
In the current paper the author presents data on the antitumoral activity of
gemcitabine and its liposome form regarding the prostate carcinoma cells in vitro.
The creation of the gemcitabine liposome form was thoroughly studied which is
relevant due to the rapid collapse of the agent by the enzymes of the blood serum.
Gemcitabine and its liposome form antitumoral activity was assessed at LNCaP
hormone-sensitive cell line and PC3 and DU-145 hormone-resistant cell lines.
The outcome of the study resulted in creation of the original gemcitabine
liposome form with the effectiveness level of agent inclusion of 46±3% and liposome
size – 36±3 нм. The dose-dependent anti-proliferative effect of the gemcitabine and
its liposome form was registered in all 3 studied cell lines. The difference between
hormone-sensitive and hormone-resistant cell lines was not stated.
Comparable antitumoral effect of gemcitabine and its liposome form received
in vitro (agent concentration within the range of 10-20 nM corresponding IC50),
ensures to carry out the experiments in vivo when the strengthening of the
gemcitabine liposome form effect is expected due to the prolonged preservation of
the therapeutic concentration of the cytostatic in blood serum and tumorous tissues.
ВВЕДЕНИЕ
Рак предстательной железы является наиболее часто встречающимся
злокачественным новообразованием у мужчин в западных странах [8,12]. Из
всего
количества
ежегодно
выявляемых
в
Германии
новых
случаев
заболеваемости злокачественными новообразованиями рак предстательной
железы составляет 22,3 % и занимает первое место [2].
В Республике Беларусь также отмечается стойкая тенденция к
увеличению заболеваемости данной патологией. С 1997 года по 2006 год
показатели заболеваемости увеличились в 2 раза - с 21,8 на 100 000 населения
2
до 40,3 на 100 000 населения. В структуре онкологической заболеваемости в
Республике Беларусь в 2006 году рак предстательной железы занимал 4-е место
(9,9%).
Кроме того, следует отметить, что у 28,3% пациентов заболевание
диагностируется в IV стадии когда возможности хирургического лечения и
лучевой
терапии
резко
органичны
из-за большой
распространенности
опухолевого процесса. Хорошо известно, что общепринятым методом лечения
распространенного рака предстательной железы является гормонотерапия. Но,
как правило, с течением времени первичноандрогенчувствительные клоны
опухолевых клеток становятся гормональнорефрактерными [10]. Основным
методом лечения в данной группе пациентов является химиотерапия. К
сожалению, большинство исследователей отмечает низкую чувствительность
гормонорезитентного распространенного рака предстательной железы к
химиотерапии [9].
В настоящее время лишь немногие химиопрепараты показали свою
эффективность в лечении данного заболевания [15]. Это делает актуальным
поиск цитостатиков, эффективных при раке предстательной железы, и
разработку способов доставки химиопрепаратов в опухолевую ткань. Многими
исследователями отмечается возможность использования в онкологии липосом
как транспортных систем для различных веществ [13]. Липофильные вещества
могут включаться в неполярную часть липидного бислоя, тогда как
гидрофильные вещества могут транспортироваться в полярной внутренней
среде липосом. Высокий интерес онкологов к липосомам обусловлен их
способностью более интенсивно накапливаться в опухолевой ткани. Так как
опухолевые клетки растут очень быстро, полноценного развития эндотелия
стенок кровеносных сосудов не происходит [5,6]. Поэтому в опухолевых
кровеносных сосудах образуются поры величиной 0,4 – 0,6 мкм [16], через
которые липосомы легко проникают в опухолевую ткань [4]. В этом процессе
так
же
играет
определенную
роль
незначительная
выраженность
3
лимфатических сосудов в солидных опухолях, в результате элиминация
липосом из опухолевой ткани затруднена [7]. Кроме того, величина
межклеточного интервала в опухолевой ткани также больше, чем в здоровых
тканях. Вследствие этого липосомы
с диаметром < 400-600 нм могут
проникать в опухолевую ткань и там накапливаться, что в здоровых тканях
практически невозможно. Этот процесс известен как EPR-эффект (Enhanced
Permeability and Retention) – эффект повышенной проницаемости и накопления
[11].
Рисунок 1 – EPR-эффект в опухолевой ткани приводит к пассивному
накоплению липосом в опухоли
Использование липосом как средств транспорта наиболее актуально для
цитостатиков, имеющих очень короткий период полураспада в плазме крови.
Одним из таких препаратов является гемцитабин, антиметаболит пиримидина.
Применение гемцитабина может быть эффективным при лечении опухолей,
обладающих
мультидрагрезистентностью
(MDR).
Результаты
новых
исследований [1] демонстрируют, что клеточные культуры, обладающие
мультидрагрезистентностью, оказываются чувствительны к гемцитабину, при
этом чувствительность к нему даже несколько повышена. Гемцитабин не
4
приводит к индукции P-гликопротеин-MDR механизма и не ведёт к
формированию перекрестной резистентности к другим цитостатикам. Поэтому
он, несомненно, подходит для включения в схемы комбинированной
химиотерапии.
Однако, согласно данным ряда исследователей, применение гемцитабина
при распространенном раке предстательной железы неэффективно [3].
Существует мнение, что данные отрицательные результаты обусловлены
быстрым разрушением препарата в сыворотке крови, в результате чего он не
достигает опухолевой ткани в терапевтической концентрации. Проведенные
исследования [14] показали, что благодаря включению гемцитабина в
липосомы
можно
увеличить
длительность
его
периода
полураспада
приблизительно с 9 минут до 13 часов, при этом концентрация в плазме
увеличивается с 47.6 мг*ч/мл (AUC - Area under the Curve) до 1680 мг*ч/мл.
Таким образом, вопрос достижения терапевтической концентрации в опухоли
может быть решен созданием липосомальной формы препарата, но для
решения
вопроса
о
возможности
применения
гемцитабина
при
раке
предстательной железы необходимо оценить чувствительность клеток рака
предстательной железы к данному препарату.
Цель работы состояла в оценке противоопухолевой активности
гемцитабина (Gem) и его липосомальной формы (GemLip) в отношении клеток
рака предстательной железы in vitro.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В рамках данной работы была создана оригинальная липосомальная
форма гемцитабина с эффективностью включения препарата 46 ± 3% и очень
маленьким размером липосом – 36 ± 3 нм.
Антипролиферативное
действие
(метод
WST-1)
действие
(метод
гемцитабина
и
BrdU)
и
цитотоксическое
липосомального
гемцитабина
оценивали на клетках рака предстательной железы (гормоночувствительная
линия клеток LNCaP и гормонорезистентные клеточные линии PC3 и DU-145).
5
Концентрации Gem и GemLip были следующими: 0 (контроль); 6,25; 12,5; 50,0;
125,0 нМ; (1250,0 нМ в отдельных случаях). Влияние Gem и GemLip на клетки
рака предстательной железы определялось через 48 часов после добавления
препаратов.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Угнетение in vitro пролиферации клеток рака предстательной железы
при применении гемцитабина и его липосомальной формы
Влияние Gem и GemLip на пролиферативную активность клеток трех
клеточных линий рака предстательной железы после 48 часов инкубации
представлено на рисунках 2 и 3.
Brdu Gem48h
120,0%
90,0%
0nM
6,25nM
12,5nM
50,0nM
125,00
60,0%
30,0%
0,0%
PC-3
LNCaP
Du145
Рисунок 2 – Влияние гемцитабина на пролиферативную активность
различных клеточных линий рака предстательной железы (PC3, LNCaP,
DU-145)
BrdU48hGemLip
120,0%
90,0%
0nM
6,25nM
12,5nM
50,0nM
125,0nM
60,0%
30,0%
0,0%
PC-3
LNCaP
Du145
Рисунок 3 – Влияние липосомального гемцитабина на пролиферативную
активность различных клеточных линий рака предстательной железы
(PC3, LNCaP, DU-145)
6
Пролиферативная активность была оценена после 48 часов инкубации с
помощью метода BrdU. На рисунках показана пролиферативная активность в
процентах при воздействии различных концентраций (6,25; 12,5; 50,0; 125,0нМ)
гемцитабина и липосомального гемцитабина по сравнению с контролем (100
%).
Проведенные эксперименты продемонстрировали, что гемцитабин и его
липосомальная форма оказывают выраженное дозозависимое действие на все
три клеточные линии рака предстательной железы, при этом не зафиксировано
различий между гормоночуствительными – LNCaP и гормонорезистентными
клеточными линиями – PC-3 и DU-145. Во всех случаях показатели IC50
(концентрация, при которой in vitro у 50 % клеток угнетается пролиферация)
примерно соответствуют концентрации 12,5 нМ. Начиная с концентрации 50
нМ во всех клеточных линиях наблюдается быстрое и полное угнетение
пролиферации. Более точная информация о степени влиянии Gem и GemLip на
пролиферативную активность клеток рака предстательной железы и значениях
IC50 представлена графически на рисунке 4 и в таблице 1. Все показатели IC50
находятся в пределах концентраций 10-20 нМ для Gem и GemLip. Не было
установлено достоверной разницы в угнетении пролиферативной активности
при применении Gem и GemLip.
110,0%
100,0%
90,0%
y = -0,0135x + 0,8562
Gem
LNCap
80,0%
70,0%
Gem
DU145"
60,0%
Gem
PC3
50,0%
40,0%
GemLip
LNCap
30,0%
GemLip
DU145
20,0%
10,0%
GemLip
PC3
0,0%
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
Рисунок 4 – Показатели IC50 для Gem и GemLip в клеточных линиях рака
предстательной железы РС3, LNCaP, DU-145 (линии показывают
7
местоположение на графике средних значений IC50 для каждой клеточной
линии и действующего вещества)
Таблица 1 – Показатели IC50 для Gem и GemLip в клеточных линиях рака
предстательной железы РС3, LNCaP, DU-145
Клеточная
GEMLIP
линия
48h
GEM
48h
PC3
21,5±1,6 нМ
14,9±1,1 нМ
LNCaP
16,0±0,5 нМ
11,0±0,5 нМ
DU145
20,5±3,3 нМ
11,9±3,1 нМ
В таблице приведены средние показатели и стандартное отклонение,
полученные после 48 часов инкубации в двух независимых экспериментах (4-х
кратное определение).
Токсичность in vitro гемцитабина и его липосомальной формы по
отношению к клеткам рака предстательной железы.
Цитотоксическое действие Gem и GemLip (метод WST-1) на три
клеточные линии рака предстательной железы через 48 часов инкубации
представлено на рисунках 5 и 6.
120,0%
90,0%
WST-1
Gem 48h
0nM
6,25nM
12,5nM
60,0%
50,0nM
125,0nM
1.250,0nM
30,0%
0,0%
PC-3
LNCaP
Du145
Рисунок 5 – Цитотоксическая активность гемцитабина на различные
клеточные линии рака предстательной железы (PC3, LNCaP, DU-145)
8
120,0%
90,0%
WST-1 48h
0nM
6,25nM
12,5nM
50,0nM
60,0%
125,0nM
1.250,0nM
30,0%
0,0%
PC-3
LNCaP
Du145
Рисунок 6 – Цитотоксическая активность липосомального гемцитабина на
различные клеточные линии рака предстательной железы (PC3, LNCaP,
DU-145)
Цитотоксическое действие Gem и GemLip оценено после 48 часов
инкубации с помощью метода WST-1. На рисунках показано количество
жизнеспособных клеток в процентах при воздействии различных концентраций
(6,25; 12,5; 50,0; 125,0 нМ) гемцитабина и липосомального гемцитабина по
сравнению с контролем (100 %).
Цитотоксические эффекты гемцитабина и его липосомальной формы по
отношению к клеткам трех клеточных линий рака предстательной железы
объективно
менее
выражены
по
сравнению
с
эффектами
угнетения
пролиферативной активности. Максимальная доза цитостатика в данных
экспериментах была увеличена в 10 раз до 1250 нМ. Несмотря на это, для
клеточных линий PC3 и LNCaP не было достигнуто значение LD50 (то есть,
концентрация, при которой in vitro ингибируется жизнеспособность 50%
клеток). Для клеток линии DU-145 значения LD50 находились в интервале от
12,5 нМ для Gem и от 50 нМ для GemLip. Концентрации гемцитабина и его
липосомальной формы выше 50,0 нМ были почти полностью токсичны для
клеток DU-145. Все три клеточные линии демонстрируют несколько меньшую
чувствительность клеток к действию липосомальной формы гемцитабина по
сравнению со свободным гемцитабином (при максимальной концентрации Gem
и GemLip равной 1250 нМ отмечалось снижение жизнеспособности клеточных
9
линий PC-3 и LNCaP на 30% при применении гемцитабина и на 15% – при
применении его липосомальной формы). Графическая оценка показателя LD50
не приводится в связи с малой информативностью.
ВЫВОДЫ
1. Разовое введение гемцитабина и липосомального гемцитабина оказывает
сравнимое противоопухолевое действие на клетки рака предстательной железы.
Показатели
IC50
достигаются
при
концентрациях
гемцитабина
и
липосомального гемцитабина в пределах 10-20 нМ.
2.
Дозозависимое
антипролиферативное
действие
гемцитабина
и
его
липосомальной формы регистрируется во всех трёх клеточных линиях рака
предстательной железы, при этом не зафиксировано различий между
гормоночуствительными – LNCaP и гормонорезистентными клеточными
линиями – PC-3 и DU-145.
3. В экспериментах in vitro цитотоксические эффекты гемцитабина и его
липосомальной формы по отношению к клеткам рака предстательной железы
объективно
менее
выражены
по
сравнению
с
эффектами
угнетения
пролиферации.
4.
Сопоставимый
противоопухолевый
эффект
гемцитабина
и
его
липосомальной формы, полученный в экспериментах с клетками рака
предстательной железы in vitro, делает актуальным проведение экспериментов
in vivo, в которых можно ожидать усиления эффекта липосомальной формы
гемцитабина, связанного с замедленной иннактивацией препарата и более
длительным сохранением терапевтической концентрации цитостатика в
сыворотке и опухолевой ткани.
Список использованных источников
1. Bergman, A.M. Increased sensitivity to gemcitabine of P-glycoprotein and multidrug
resistance-associated protein-overexpressing human cancer cell lines/ A.M. Bergman [ et al.]
// British Journal of Cancer. – 2003. – Vol. 88, – P. 1963 - 1970.
10
2. Bertz, J. Krebs in Deutschland. Häufigkeiten und Trends / J.Bertz [ et al.] / Robert Koch
Institut – In (RKI) Saarbrücen, 2006 – Gesellschaft der epidemiologischen Krebsregister in
Deutschland e.V(GEKID) & Robert Koch Institut (RKI).
3. Carmichael, J. The role of Gemcitabine in the treatment of other tumors / J.Carmichael // Br.
J. Cancer. – 1998. – №78 – Suppl. 3. – Р. 21-25.
4. Dvorak, H.F. Vascular permeability factor/vascular endothelial growth factor, microvascular
hyperpermeability and angiogenesis/ H.F. Dvorak //Am. J. Pathol. – 1995. – Vol. 146, – P.
1029-1039.
5. Folkman, J. Angiogenesis in cancer, vascular, rheumatoid and other disease / J.Folkman //
Nature Medicine. –1995. – №1. – P. 27-31.
6. Gastl, G. Angiogenesis as a target for tumor treatment / G. Gastl, T. Hermann, M. Steurer
//Oncology. –1997. – №54. – P. 177-184.
7. Gerlowski, L.E. Microvascular permeability of normal and neoplastic tissue / L.E. Gerlowski,
R.K. Jain // Microvasc. Res. – 1986. – №31. – P. 288-305.
8. Greenlee, R.T. Cancer statistics / R.T.Greenlee [ et al.] // CA. Cancer J. Clin. –2001. – №51.
– P. 15-36.
9. Heidenreich, A. Diagnostik und Therapie des hormonrefraktären Prostatakarzinoms / A.
Heidenreich // J. Urol. Urogenäkol. – 2004. – №6. – P. 15-19.
10. Isaacs, J.T. The biology of hormone refractory prostate cancer. Why does it develop?/ J.T.
Isaacs // Urol. Clin. North Am. – 1999. – №26. – P. 263–273.
11. Jain, R.K. Transport of molecules across tumor vasculature / R.K.
Jain // Cancer
Metastasis Rev. – 1987. – №6. – P. 559-593.
12. Jemal, A. Cancer statistics / A. Jemal [ et al.] // CA. Cancer. J. Clin. – 2002. –№52. – P.
23-47.
13. Massing, U. Liposomal formulations of anticancer drugs: selectivity and effectiveness / U.
Massing, S. Fuxius // Drug Resist. Updat. – 2000. – №3. – P. 171-7.
14. Moog, R. Change in pharmacokinetic and pharmacodynamic behaviour of gemcitabine in
human tumor xenografts upon entrapment in vesicular phospholipid gels / R. Moog [ et al.] //
Cancer Chemother. Pharmacol. – 2002. –№49. – P. 356-66.
15. Tannock, I.F. Docetaxel plus prednisolon or mitoxantrone plus prednisolon for advanced
prostate Cancer / I.F. Tannock [et al.] // N. Engl. J. Med. – 2004. – №15. – P. 1502-1512.
16. Yuan, F. Vascular permeability in a human tumor xenograft: molecular size dependence and
cutoff size / F. Yuan, M. Dellian, D. Fukumara // Cancer Res. –1995. – №55. – P. 3752-3756.
11